KR20210141945A - Akt 경로를 표적으로 하는 신경보호 유전자 요법 - Google Patents

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KR20210141945A
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Abstract

망막 변성의 치료를 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 일 양상에서, AAV 역 말단 반복(ITR) 서열, 인간 단백질 키나제 B(AKT) 암호 서열, 및 숙주 세포에서 AKT의 발현을 유도하는 발현 제어 서열을 포함하는 벡터 게놈이 캡시드화되어 있는 AAV 캡시드를 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터가 본 명세서에 제공된다.

Description

AKT 경로를 표적으로 하는 신경보호 유전자 요법
색소성 망막염(RP)은 전 세계적으로 약 3000 내지 7000명 중 1명으로 추정되는 개체에게 영향을 미치는 유전성 망막 이영양증의 집합이다. 임상 발병은 간상체 광수용체의 기능 장애 후 사망과 동시에 암반(야간) 시력의 장애를 특징으로 한다. 이 과정이 확대됨에 따라 주변 시력이 파괴되고 중심 망막의 원추형 광수용체의 변성으로 인해 완전한 실명에 이르게 된다. 많은 경우에, 이 표현형은 간상체 광전달, 구조 또는 항상성에 필수적인 유전자 내의 무효(null) 돌연변이로부터 초래되어, 이 광수용체 아형의 손실에 대한 직접적인 설명을 제공한다. 그러나, 이러한 돌연변이는 전형적으로 후기 질환에서 원추체의 점진적인 악화에 대해 설명하지 못한다.
필요한 것은 RP 및 다른 안구 장애-관련 망막 변성에 대한 이를 필요로 하는 대상체의 치료법이다.
본 발명은 AKT의 발현을 위한 벡터의 전달이 광수용체의 수, 구조 및 시각 기능의 극적인 보존을 촉진한다는 것을 입증하는 하기 실시예에 의해 예시된다.
일 양상에서, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus: AAV) 역 말단 반복(inverted terminal repeat: ITR) 서열, 인간 단백질 키나제 B(AKT) 암호 서열, 및 숙주 세포에서 AKT의 발현을 유도하는 발현 제어 서열을 포함하는 벡터 게놈이 캡시드화되어 있는 AAV 캡시드를 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터가 제공된다. 일 실시형태에서, AKT 암호 서열은 AKT1, AKT2 또는 AKT3 암호 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 암호 서열은 서열번호 9이다.
또 다른 양상에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 적어도 본 명세서에 기재된 AKT 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또 다른 양상에서, 망막 변성을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 본 명세서에 기재된 AAV 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 망막하 또는 유리체내로 투여된다.
또 다른 양상에서, AAV 벡터를 생산하기 위한 플라스미드가 제공된다. 특정 실시형태에서, 플라스미드는 서열번호 1의 nt 1253 내지 5070 또는 서열번호 3의 nt 1253 내지 3868, 또는 이에 대해 적어도 80% 동일성을 공유하는 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 재조합 AAV(rAAV)를 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 유전자 발현 카세트 바이러스 게놈을 감염성 AAV 엔벨로프 또는 캡시드 내로 패키징할 수 있도록 하기에 충분한 바이러스 서열의 존재 하에 서열번호 1의 nt 1253 내지 5070 또는 서열번호 3의 nt 1253 내지 3868을 포함하는 패키징 세포를 배양하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열번호 1의 nt 1253 내지 5070 또는 서열번호 3의 nt 1253 내지 3868을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다.
또 다른 양상에서, 바이러스 벡터는 5' ITR, CMV 인핸서, 닭 베타-액틴 프로모터, Kozak 서열, AKT 암호, bGH 폴리 A, 및 3' ITR을 포함하는 벡터 게놈을 포함한다.
또 다른 양상에서, 바이러스 벡터는 5' ITR, GRK1 프로모터, SV40 인트론, Kozak 서열, AKT 암호 서열, bGH 폴리 A, 및 3' ITR을 포함하는 벡터 게놈을 포함한다.
또 다른 양상에서, 망막 변성을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 AAV 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상 및 이점은 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1A 내지 도 1H는 AAV7m8 벡터의 설계 및 특성화를 나타낸다. 벡터 발현 카세트의 개략(도 1A). 미처리 대조군과 비교된 84-31 세포의 형질도입 후 Rheb mRNA(도 1B) 및 AKT3 mRNA(도 1C) 발현의 정량화. 데이터는 평균±SD(N=3)로 나타냈다. ****P<0.0001. AAV7m8.eGFP(2×109 vg)의 망막하 전달 후 마우스 망막의 대표적인 안저 이미지(도 1D). 망막하 주사 후 AAV7m8의 망막 향성(도 1E). 미처리(도 1F) 및 AAV.AKT3(1×109 vg) 및 AAV.eGFP(1×109 vg)가 공동주입된(도 1G 및 도 1H) AKT에 대해 지향성인 항체로 염색된 PN45rd10 망막 플랫마운트(flatmount).
도 2A 내지 도 2G는 caRheb 증강이 광수용체 변성을 약화시키지 못함을 보여준다. PN13-14에서 AAV.eGFP 또는 AAV.caRheb(+ AAV.eGFP)의 망막하 주사 후 PN45에서의 Pde6brd10 망막 횡단면(도 2A). AAV.eGFP, AAV.caRheb/AAV.eGFP로 처리되거나 미처리된 Pde6brd10 망막의 총 ONL 두께의 정량화(도 2B). AAV.eGFP 단독(2×109 vg) 또는 AAV.eGFP(1×109 vg) 및 AAV.caRheb(1×109 vg)가 공동주입으로 처리된 눈으로부터 200㎛당 GFP+ ONL 세포의 정량화(도 2C). 시력을 평가하기 위한 광운동 반사(opto-kinetic reflex: OKR) 우/좌 비율(도 2d). 상이한 치료에 대한 혼합 간상체-원추체 A-파 진폭(도 2E), 혼합 간상체-원추체 B-파 진폭(도 2F), 및 원추체 B707 파 진폭(도 2G)의 망막전위도(ERG) 측정. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. 지수는 데이터 막대 내의 수치 값으로 표시된다.
도 3A 내지 도 3h는 AKT3 유전자 전달이 광수용체 생존 및 구조적 보존을 촉진한다는 것을 보여준다. PN30에서 미처리된(도 3A) 및 AAV.AKT3/AAV.eGFP로 처리된(도 3B) Rd10 마우스 망막을 로돕신(RHO)에 대한 항체로 염색한 대표적인 이미지. eGFP와 공동국재화(도 3C). PN30에서 미처리된(도 3D) 및 AAV.AKT3/AAV.eGFP로 처리된(도 3E) Rd10 망막을 원추체 어레스틴(cone arrestin: CAR)에 대해 지향성인 항체로 염색한 대표적인 이미지. eGFP와 공동-국재화(도 3F). PN45에서 망막의 미처리 부분과 망막하 수포 사이의 전이 영역의 대표적인 이미지(도 3G). PN30 및 PN45에서 처리 그룹 사이의 ONL 두께 정량화(도 3H). 데이터는 평균±SEM으로 표시했다. **P <0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001; ns(non-significant, 유의미하지 않음).
도 4A 내지 도 4D는 Pde6brd10 망막에서 망막 및 시각 기능에 대한 AKT3 유전자 전이 효과를 보여준다. 미처리, AAV.eGFP 및 AAV.AKT3 처리된 망막 간의 혼합 간상체-원추체 α-파 진폭의 평가(도 4A). 처리 사이의 혼합 막대 간상체 원추체 b-파 진폭의 평가(도 4B). 처리 그룹 사이의 명소시(photopic)(원추체) b-파 진폭(도 4C). 광운동 반응(OKR)에 의해 조사된 시력의 우안/좌안 비율(도 4D). 우안(right eye)은 AAV7m8.eGFP 단독(2×109 vg)으로 처리하거나 AAV.AKT3과 조합하여 처리한 반면, 좌안(left eye)은 처리하지 않았다. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. *P<0.05; ***P<0.001. 지수는 막대 내의 수치 값으로 표시했다.
도 5A 내지 도 5H는 AKT3-유도된 신경보호가 mTOR 활성화와 관련이 있음을 보여준다. AAV.AKT3/AAV.eGFP로 처리되고 mTORC2 활성화 마커인 포스포-AKTSer에 대해 지향성인 항체로 염색된 Rd10 망막의 대표적인 이미지(도 5A). 망막하 전달 영역을 표시하는 eGFP와의 공동국재화(도 5B). mTORC2 마커로 염색된 고 배율의 AAV.AKT3/AAV.eGFP 형질도입된 절편(도 5C). AAV.eGFP 단독으로 처리되고 mTORC2 마커로 염색된 Pde6brd10 망막(도 5D). AAV.AKT3/AAV.eGFP로 처리되고 표준 mTORC1 활성화 마커인 포스포-S6Ser240/244에 대해 염색된 Pde6brd10 망막의 대표적인 이미지(도 5E). eGFP와의 공동국재화(도 5F). mTORC1 마커로 염색된 고 배율의 AAV.AKT3/AAV.eGFP 형질도입된 절편(도 5G). AAV.eGFP 단독으로 처리되고 mTORC1 마커로 염색된 Pde6brd10 망막(도 5H).
도 6A 내지 도 6I는 AKT3 과발현이 광수용체 정지(photoreceptor quiescence)를 깨뜨리지 않지만 뮐러(muller) 세포를 활성화한다는 것을 보여준다. 미처리된(도 6A 내지 도 6C), AAV7m8.eGFP 단독(2×109 vg)으로 처리된(도 6D 내지 도 6F), 또는 AAV7m8.AKT3(1×109 vg) 및 AAV7m8.eGFP(1×109 vg)로 공동주입된(도 6G 내지 도 6I) Pde6brd10 망막 횡단면의 대표적인 이미지. 절편은 GFAP(뮐러 세포 마커) 및 Ki67(세포 증식 마커)에 대해 지향성인 항체로 염색한다.
도 7A 내지 도 7K는 장기간 AKT3 유전자 전이가 야생형 망막에서 만성 뮐러 세포 신경교증을 자극한다는 것을 보여준다. PN125에서 미처리된(도 7A 내지 도7C), AAV7m8.eGFP(2×109 vg)로 처리된(도 7D 내지 도 7F), 및 AAV7m8.AKT3(1×109 vg) 및 AAV7m8.eGFP(1×109 vg)로 공동주입된(도 7G 내지 도 7I) 야생형 망막의 대표적인 현미경 사진. 절편은 Ki67 및 GFAP에 대해 지향성인 항체로 염색했다. 미처리 및 AAV.eGFP 처리 망막 절편 사이의 전이 영역(도 7J). 미처리 영역과 AAV.AKT3/AAV.eGFP 처리된 영역 사이의 전이 영역(도 7K).
도 8A 내지 도 8F는 AKT3의 광수용체-특이적 발현이 Pde6brd10 망막에서 신경보호를 매개함을 보여준다. 벡터 발현 카세트의 묘사(도 8A). AKT3 전이유전자는 광수용체 특이적 GRK1 프로모터에 의해 조절된다. 처리 그룹 사이의 혼합 a-파(도 8B), 혼합 b-파(도 8B), 및 원추체 b-파(도 8C)에 대한 ERG 반응의 정량화. AAV7m8.GRK1.AKT3(1×109 vg)으로 처리된 PN45 Pde6brd10의 대표적인 횡단면(도 8E). AKT 항체로 표지된 AKT3의 광수용체 특이적 발현. 처리 그룹 사이 PN45에서 ONL 두께의 정량화(도 8F). 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 9A 내지 도 9H는 AAV.GRK1.AKT3이 Pde6brd10 망막에서 반응성 신경교증을 자극하지 않는다는 것을 보여준다. 뮐러 세포에 대한 표준 마커(GFAP) 및 세포 증식에 대한 표준 마커(Ki67)로 염색된 PN45에서의 미처리 마우스 망막의 대표적인 이미지(도 9A 내지 도 9C). AAV7m8.GRK1.AKT3(1×109 vg) 및 AAV7m8.eGFP(1×109 vg)로 공동 처리된 PN45 Pde6brd10 망막의 대표적인 현미경 사진(도 9D 내지 도 9F). Pde6brd10 망막의 미처리 부위와 주입 부분 사이의 전이 영역(도 9G) 및 eGFP 추적자와의 공동국재화(도 9H).
도 10A 내지 도 10B는 AAV.caRheb가 시험관내에서 mTORC1 활성을 자극하지만 광수용체에서는 그렇지 않음을 보여준다. 미처리 84-31 세포 또는 AAV.eGFP 또는 AAV.caRheb로 처리된 세포로부터 pS6Ser240/244, S6 및 GAPDH(로딩 대조군)의 발현을 평가하는 웨스턴 블롯(도 10A). 수치 값은 각 처리 조건에 대한 생물학적 반복물을 나타낸다. AAV7m8.eGFP 단독(2×109 vg)(상부 패널)이 주입되거나 AAV7m8.caRheb(1×109 vg) 및 AAV7m8.eGFP(1×109 vg)가 공동주입되고(하단 패널) pS6Ser240/244에 대해 지향성인 항체에 의해 염색된 망막 절편의 대표적인 현미경 사진(도 10B).
도 11A 내지 도 11D는 야생형 동물에서 장기간 AKT3 유전자 전이가 망막 손상을 야기한다는 것을 보여준다. C57Bl/6(야생형) 마우스는 PN13에서 망막하 주사를 받았다. PN125에서의 망막 조직학은 AAV7m8.eGFP 단독(2×109 vg)으로 처리된 동물에서 정상적인 광수용체 구조를 나타낸다(도 11A 내지 도 11B). AAV7m8.AKT3(1×109 vg)과 조합으로 AAV7m8.eGFP(1×109 vg)가 공동주입된 동물은 망막 층의 광범위한 손상 및 광수용체 수 및 구조의 손실을 나타낸다(도 11C 내지 도 11D).
도 12는 pAAV.CAG.Myr.HA.hAKT3(p1116)(서열번호 1)에 대한 벡터 지도를 보여준다.
도 13은 pAAV.GRK1.Myr.HA.hAKT3(p1294)(서열번호 3)에 대한 벡터 지도를 보여준다.
도 14는 p618.Hopt.AKT3(서열번호 5)에 대한 벡터 지도를 보여준다.
도 15A 및 도 15B는 hAKT3 천연(서열번호 7) 및 hAKTopt(서열번호 13) 서열의 정렬을 나타내고, 도 15C는 이 정렬에 대한 동일성 퍼센트 행렬을 보여준다.
인간 단백질 키나제 B(AKT)를 암호화하는 핵산 서열을 전달하기 위한, AAV 캡시드를 갖는 재조합, 복제-결손성 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 및 이를 함유하는 조성물이 본 명세서에 기재된다. 또한, 이들 조성물이 안구 장애의 치료를 위해 사용되는 용도가 제공된다.
하기에 기재되는 바와 같이, 기존의 유전자 증강 전략을 사용한 mTOR 신호전달 경로의 자극은 광수용체 사망을 지연시키고 유전성 시력 상실의 예비임상 모델에서 시각 기능을 보존한다. AKT1 또는 RAC-알파 세린/트레오닌-단백질 키나제라고도 하는 단백질 키나제 B는 p53, FoxO/FH 전사 인자 및 CREB를 포함한 다양한 단백질 표적의 인산화를 통한 세포 생존 및 생합성 반응에 책임이 있다. AKT는 AKT 키나제라고 하는 3개의 밀접하게 관련된 세린/트레오닌-단백질 키나제(AKT1, AKT2 및 AKT3)로 구성되며, 이는 대사, 증식, 생존, 성장 및 혈관신생을 포함한 많은 세포 과정을 조절한다.
본 명세서에 사용된 용어 "AKT"는 AKT1, AKT2 또는 AKT3을 지칭한다. 용어 "hAKT"는 인간 AKT에 대한 암호 서열을 지칭한다. 특정 실시형태에서, AKT는 AKT1을 지칭한다. 특정 실시형태에서, AKT는 AKT2를 지칭한다. 특정 실시형태에서, AKT는 AKT3을 지칭한다. 또한, 용어 AKT는 본 명세서에서 단백질 또는 이 단백질을 암호화하는 핵산을 지칭하기 위해 사용된다. hAKT1 핵산 서열은 서열번호 9에서 찾아볼 수 있다. hAKT1 아미노산 서열은 서열번호 10에서 찾아볼 수 있다. hAKT2 핵산 서열은 서열번호 11에서 찾아볼 수 있다. hAKT2 아미노산 서열은 서열번호 12에서 찾아볼 수 있다. hAKT3 핵산 서열은 서열번호 7에서 찾아볼 수 있다. hAKT3 아미노산 서열은 서열번호 8에서 찾아볼 수 있다. 특정 실시형태에서, hAKT 암호 서열은 조작된 서열, 예를 들어 서열번호 13에서 발견되는 hAKT3 암호 서열(때때로 "hAKTopt"로 지칭됨)이다.
본 명세서에는 hAKT를 암호화하는 핵산 서열이 제공된다. 일 실시형태에서, 서열번호 10에서 발견되는 hAKT1 아미노산 서열을 암호화하는 핵산이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 12에서 발견되는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 8에서 발견되는 hAKT3 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열이 제공된다. AKT의 다른 아이소폼(isoform)은 본 기술분야에 공지되어 있고, 본 명세서에 유용하다.
본 명세서에는 안구 장애 및 이와 관련된 망막 변성의 치료를 위해 포유류 대상체에게 인간 단백질 키나제 B(AKT)를 암호화하는 핵산을 전달하기 위한 조성물 및 방법이 기재된다. 특정 실시형태에서, 이러한 조성물은 서열번호 13에 제공된 것과 같은 조작된 AKT 암호 서열을 포함한다. 전이유전자 카세트의 이러한 최적화는 천연 서열에 의해 생성될 수 있는 수준에 비해 실험 단백질의 생산 수준을 최대화할 것으로 예상된다. 그러나, 본 명세서에는 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 7에 각각 제공된 천연 AKT1, AKT2 또는 AKT3 암호 서열을 포함하는 조성물도 포함된다. 일 실시형태가 AKT1, AKT2, 및 AKT3 중 임의의 것에 대해 기술할 때, 유사한 실시형태가 다른 것들에서도 언급되는 것으로 의도된다는 점이 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적인 기술자, 및 본 기술분야의 기술자에게 본 출원에 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공하는 공개된 텍스트를 참조하여 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 함유된 정의는 본 명세서의 성분 및 조성물을 설명할 때 명확성을 위해 제공된 것이며 청구된 발명을 제한하려는 것이 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 명세서에 사용된 용어 "대상체"는 인간, 수의학적 또는 농장 동물, 가축 또는 애완동물, 및 임상 연구에 일반적으로 사용되는 동물을 포함한, 포유 동물을 의미한다. 일 실시형태에서, 이러한 방법 및 조성물의 대상체는 인간이다. 또 다른 적합한 대상체는 뮤린, 래트, 개, 고양이과, 돼지, 소, 양, 비인간 영장류 및 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 "환자"와 호환 가능하게 사용된다.
일 실시형태에서, 대상체는 아동, 즉, 18세 미만이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 어린 아동, 즉, 8세 이하이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 유아, 즉, 3세 이하이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 영아, 즉, 1세 이하이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 신생아(newborn) 또는 신생아(neonate), 즉, 생후 1개월 이하이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 성인, 즉, 노인 또는 더 노령이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 나이든 성인, 즉, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85세 이상이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 대상체는 본 발명의 성분, 조성물 및 방법이 치료하도록 설계된 "안구 장애"를 갖는다. 특정 실시형태에서, 대상체는 망막 변성이 있거나 망막 변성의 위험이 있으며, 이는 안구 장애와 관련이 있거나 관련이 없을 수 있다. 본 명세서에 사용된 "안구 장애"는 스타가르트(Stargardt)병(상염색체 우성 또는 상염색체 열성), 색소성 망막염 및 무늬 이영양증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 망막 질환 및 원추체-간상체 이영양증을 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는 색소성 망막염이 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 색맹이 있다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 맥락막혈증 또는 X-연관 유전성 망막 변성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 안구 장애와 관련된 망막 변성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 안구 장애와 관련되지 않은 망막 변성을 갖는다. 이러한 안구 질환의 임상 징후에는 주변 시력 감소, 중심(읽기) 시력 감소, 야간 시력 감소, 색 지각 상실, 시력 감소, 광수용체 기능 감소, 색소 변화 및 궁극적으로 실명이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다.
망막 변성은 망막 세포의 점진적인 사망에 의해 유발되는 망막 악화로 이루어지는 망막병증이다. 망막 변성의 이유로는 동맥 또는 정맥 폐쇄, 당뇨병성 망막병증, R.L.F./R.O.P.(수정체후 섬유증/미숙아 망막병증), 또는 질병(일반적으로, 유전성)을 포함한 여러 가지가 있다. 망막 변성의 징후 및 증상으로는 시력 손상, 야맹증, 망막 박리, 광민감성, 터널 시력 및 주변 시력 상실 내지 완전한 시력 상실을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 망막 변성 및 재구성(remodeling)은 색소성 망막염(RP)과 같은 유전성 망막 질환, 유전자 질환 및 환경 질환, 예컨대, 연령 관련 황반 변성(AMD) 및 외상 및 망막 박리를 포함한 눈/망막에 대한 기타 손상에 의해 개시되는 분자 수준, 세포 수준 및 조직 수준에서의 병리상태 그룹을 포함한다. 이러한 망막 변화 및 명백한 가소성은 유전자 발현의 변경, 새로운 신경생성 및 새로운 시냅스의 형성을 포함하는 신경 재배선(rewiring) 및 재프로그래밍 이벤트를 초래하여 수지상 나무 및 과잉 축삭 성장의 변경을 통해 양극성 세포에 손상 회로(corruptive circuitry)를 생성한다. 또한, 뮐러 세포주를 따라 망막의 수직축 전체에 걸쳐 뉴런 이동이 일어나 변경된 대사 신호를 보여주며, 망막 색소 상피(RPE)가 망막에 침범해 RP 질환의 고전적인 임상 소견이었던 착색된 골 침상을 형성한다(예를 들어, 문헌[Retinal Degeneration, Remodeling and Plasticity by Bryan William Jones, Robert E. Marc and Rebecca L. Pfeiffer] 참조).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 대상체에게 이익을 주는, 즉, 안구 질환, 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 양상의 완화, 발병 지연, 중증도 또는 빈도 감소, 또는 예방을 산출할 수 있는 사용된 임의의 방법을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 치료는 증상의 발병 전, 동안 및/또는 발병 후에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 치료는 대상체가 통상적인 요법을 받은 후에 일어난다. 본 명세서에 사용된 용어 "치료하는"은 병태의 진행을 폐지, 실질적으로 저해, 둔화 또는 역전시키거나, 상태의 임상적 또는 미적 증상을 실질적으로 개선하거나, 상태의 임상적 또는 미적 증상의 출현을 실질적으로 예방하거나, 또는 안구 질환, 장애 또는 상태로 인한 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 빈도를 감소시키는 것을 포함한다.
핵산 또는 아미노산 서열 또는 단백질과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "외인성(exogenous)"은 핵산 또는 아미노산 서열 또는 단백질이 염색체 또는 숙주 세포에 존재하는 위치에서 자연적으로 발생하지 않는 것을 의미한다. 외인성 핵산 서열은 또한 동일한 숙주 세포 또는 대상체로부터 유래되고 삽입된 서열을 지칭하지만, 이는 비-자연 상태, 예를 들어, 상이한 카피 수, 또는 다른 조절 인자의 제어 하에 존재한다.
핵산 서열 또는 단백질을 기술하는 데 사용된 용어 "이종(heterologous)"은 핵산 또는 단백질이 발현되는 숙주 세포 또는 대상체보다 상이한 유기체 또는 동일한 유기체의 상이한 종으로부터 핵산 또는 단백질이 유래되었음을 의미한다. 플라스미드, 발현 카세트 또는 벡터에서 단백질 또는 핵산과 관련하여 사용될 때의 용어 "이종"은 문제의 단백질 또는 핵산이 자연에서 동일한 관계로 발견되지 않는 다른 서열 또는 하위서열과 함께 단백질 또는 핵산이 존재한다는 것을 나타낸다.
핵산 서열의 상황에서 "서열 동일성", "서열 동일성 백분율" 또는 "동일성 백분율"이라는 용어는 최대 상응도로 정렬되었을 때 동일한 두 서열 내의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교 길이는 AKT 암호 서열의 전체 길이, 또는 적어도 약 100 내지 150개의 뉴클레오타이드의 단편, 또는 필요한 만큼일 수 있다. 그러나, 더 작은 단편, 예를 들어 약 9개 이상의 뉴클레오타이드, 일반적으로 약 20개 내지 24개 이상의 뉴클레오타이드, 약 28개 내지 32개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 약 36개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드가 또한 바람직할 수 있다. 핵산 서열에 대해 다중 서열 정렬 프로그램이 또한 사용될 수 있다. 이러한 프로그램의 예로는 "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP" 및 "MEME"가 있으며, 이들은 인터넷에서 웹 서버를 통해 접속할 수 있다. 이러한 프로그램에 대한 다른 소스는 본 기술분야의 기술자에게 알려져 있다. 대안적으로, Vector NTI 유틸리티도 사용된다. 또한, 전술한 프로그램에 함유된 것을 포함하여 뉴클레오타이드 서열 동일성을 측정하는 데 사용할 수 있는 본 기술분야에 공지된 다수의 알고리즘이 있다. 다른 예로서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인 Fasta™를 사용하여 비교할 수 있다. 일반적으로 사용가능한 서열 분석 소프트웨어, 보다 구체적으로 BLAST 또는 공공 데이터베이스에서 제공하는 분석 도구를 사용할 수도 있다. 유사하게, "서열 동일성 퍼센트" 등은 단백질의 전체 길이 또는 이의 단편에 걸친 아미노산 서열에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 적합하게는, 단편은 길이가 약 8개 이상의 아미노산이고 최대 약 450개 아미노산일 수 있다.
"단리된"이라는 용어는 물질이 원래 환경(예를 들어, 자연적으로 발생한다면, 자연 환경)에서 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리되지 않지만, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 후속적으로 자연계로 재도입되더라도 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된 것일 수 있다.
"조작된(engineered)"이란, 예를 들어, 비바이러스성 전달 시스템(예를 들어, RNA 기반 시스템, 네이키드 DNA 등)을 생성하기 위해 또는 패키징 숙주 세포에서 바이러스 벡터를 생성하기 위해 및/또는 대상체에서 숙주 세포로 전달하기 위해, 내부에 함유된 AKT 서열을 숙주 세포로 전달하는 임의의 적합한 유전 요소, 예를 들어, 네이키드 DNA, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피솜 등에 조립 및 배치되는 본 명세서에 기재된 AKT 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 일 실시형태에서, 유전 요소는 플라스미드이다. 이러한 조작된 작제물을 제조하는 데 사용되는 방법은 핵산 조작의 기술자에게 알려져 있으며 유전자 조작, 재조합 조작 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)] 참조.
본 명세서에 사용된 용어 "전이유전자"는 본 명세서에 기술된 발현 카세트, rAAV 게놈, 재조합 플라스미드 또는 생산 플라스미드, 벡터, 또는 숙주 세포에서 프로모터 또는 발현 제어 서열의 제어 하에 있는 외인성 또는 조작된 단백질-암호화 핵산 서열을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 기능적 AKT 단백질을 암호화하는 인간 단백질 키나제 B(AKT) 서열이다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 8에 제시된 AKT 아미노산 서열을 암호화하는 핵산이다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 7에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 10에 제시된 AKT 아미노산 서열을 암호화하는 핵산이다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 9에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 12에 제시된 AKT 아미노산 서열을 암호화하는 핵산이다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 11에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 13에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 7, 9, 11 또는 13과 적어도 70% 동일성을 공유하는 서열인 조작된 AKT 암호 서열이다. 예를 들어, 서열번호 13은 서열번호 7과 약 75% 동일성을 공유한다(도 15A 내지 도 15C에 제공된 정렬 및 동일성 퍼센트 행렬 참조). 본 명세서에 기재된 바와 같은 천연 서열에 대한 추가 변형은 본 발명에 의해 고려된다.
일 실시형태에서, AKT를 암호화하는 핵산 서열은 여기에 공유적으로 연결된 태그 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 태그 폴리펩타이드는 myc 태그 폴리펩타이드, 글루타치온-S-트랜스퍼라제 태그 폴리펩타이드, 녹색 형광 단백질 태그 폴리펩타이드, myc-피루베이트 키나제 태그 폴리펩타이드, His6 태그 폴리펩타이드, 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 태그 폴리펩타이드, 플래그 태그 폴리펩타이드, myr(미리스토일화) 폴리펩타이드, 및 말토스 결합 단백질 태그 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 공지된 "에피토프 태그"로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3에서 발견되는 MYR 태그를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "벡터"는 외인성 또는 이종성 또는 조작된 핵산 전이유전자가 삽입될 수 있는 핵산 분자이며, 이는 이후에 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 복제 기점(origin), 및 재조합 DNA가 삽입될 수 있는 하나 이상의 부위를 갖는다. 벡터는 종종 벡터가 있는 세포가, 예를 들어 약물 내성 유전자를 암호화하는 것 없이, 선택될 수 있는 편리한 수단을 종종 갖고 있다. 일반적인 벡터는 플라스미드, 바이러스 게놈 및 "인공 염색체"(주로 효모 및 박테리아에서)를 포함한다. 특정 플라스미드는 본 명세서에 기술되어 있다.
"바이러스 벡터"는 외인성 또는 이종성 AKT 핵산 전이유전자(들)를 함유하는 복제 결함 바이러스로 정의된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 카세트는 숙주 세포로의 전달 및/또는 바이러스 벡터의 생산을 위해 사용되는 플라스미드 상에 조작될 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 바람직하게는 복제 결손성이고 안구 세포를 표적으로 하는 것들 중에서 선택된다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스; 헤르페스 바이러스; 렌티바이러스; 레트로바이러스; 파보바이러스 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 유전자 요법에 적합한 임의의 바이러스를 포함할 수 있다. 그러나, 이해의 용이를 위해, 아데노 관련 바이러스는 본 명세서에서 예시적인 바이러스 벡터로서 언급된다.
"복제-결손 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프에 패키징되어 있는 합성 또는 재조합 바이러스 입자를 지칭하며, 여기서 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프 내에 패키징된 임의의 바이러스 게놈 서열도 복제 결손성이다; 즉, 자손 비리온은 생성할 수 없지만 표적 세포를 감염시키는 능력은 보유한다. 일 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하지 않지만[게놈은 인공 게놈 증폭 및 패키징에 필요한 신호가 측면에 있는 관심 전이유전자만을 함유하는 "무기력(gutless)"성인 것으로 조작될 수 있다], 이러한 유전자는 생산 중에 공급될 수 있다. 따라서, 복제에 필요한 바이러스 효소가 존재하지 않는 한 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 일어날 수 없으므로 유전자 요법에 사용하기에 안전한 것으로 판단된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 것을 포함하는 발현 카세트는 재조합 AAV 게놈을 생성하는 데 이용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 재조합 AAV가 생산 플라스미드로부터 생산되는 패키징 세포주를 지칭할 수 있다. 대안적으로, 용어 "숙주 세포"는 전이유전자의 발현이 요구되는 임의의 표적 세포를 지칭할 수 있다. 따라서, "숙주 세포"는 임의의 수단, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사, 형질전환, 바이러스 감염, 형질감염, 리포솜 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA 코팅 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합에 의해 세포 내로 도입된 외인성 또는 이종 DNA를 함유하는 원핵 또는 진핵 세포를 지칭한다. 본 명세서의 특정 실시형태에서, 용어 "숙주 세포"는 본 명세서에 기재된 조성물의 시험관내 평가를 위해 다양한 포유류 종의 안구 세포의 배양물을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "숙주 세포"는 안구 질환에 대해 생체내 치료되는 대상체의 안구 세포를 언급하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "안구 세포"는 눈에 있거나 눈의 기능과 관련된 임의의 세포를 지칭한다. 이 용어는 간상 광수용체, 원추 광수용체 및 감광성 신경절 세포를 포함하는 광수용체 세포, 망막 색소 상피(RPE) 세포, 뮐러 세포, 맥락막 세포, 양극성 세포, 수평 세포 및 무축삭 세포를 포함하는 광수용체 세포 중 어느 하나를 지칭할 수 있다. 일 실시형태에서, 안구 세포는 광수용체 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 안구 세포는 RPE 세포이다.
"플라스미드"는 일반적으로 본 기술분야의 기술자에게 익숙한 표준 명명 규칙에 따라 소문자 p가 선행되고, 및/또는 대문자 및/또는 숫자가 후속되어 본 명세서에서 지정된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 많은 플라스미드 및 기타 클로닝 및 발현 벡터는 잘 알려져 있고 본 기술분야의 기술자에게 용이하게 이용가능하다. 또한, 기술자는 본 발명에 사용하기에 적합한 임의의 수의 다른 플라스미드를 쉽게 작제할 수 있다. 본 발명에서 이러한 플라스미드 뿐만 아니라 다른 벡터의 특성, 작제 및 용도는 본 개시내용으로부터 본 기술분야의 기술자라면 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "전사 조절 서열" 또는 "발현 조절 서열"은 작동 가능하게 연결된 핵산 서열을 암호화하는 단백질의 전사를 유도, 저해 또는 다르게 제어하는 개시인자 서열, 인핸서 서열 또는 프로모터 서열과 같은 DNA 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "작동 가능하게 결합된"은 AKT를 암호화하는 핵산 서열과 인접한 발현 제어 서열 및/또는 전사 및 발현을 제어하기 위해 트랜스로(in trans) 또는 거리를 두고 작용하는 발현 제어 서열을 모두 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "AAV" 또는 "AAV 혈청형"은 수십 개의 자연 발생이며 입수용이한 아데노 관련 바이러스, 뿐만 아니라 인공 AAV를 지칭한다. 인간 또는 비-인간 영장류(NHP)로부터 단리 또는 조작되고 잘 특성규명된 AAV 중에서, 인간 AAV2는 유전자 전달 벡터로서 개발된 최초의 AAV이며; 이것은 상이한 표적 조직 및 동물 모델에서 효율적인 유전자 전달 실험에 널리 사용되었다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 AAV 캡시드, ITR 및 기타 선택된 AAV 성분은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7M8 및 AAVAnc80을 제한없이 포함하는 임의의 AAV, 임의의 공지되거나 언급된 AAV의 변이체, 또는 아직 발견되지 않은 AAV 또는 이의 변이체 또는 혼합물 중에서 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO 2005/033321 참조. 또 다른 실시형태에서, AAV 캡시드는 양극성 세포를 우선적으로 표적으로 삼는 AAV8bp 캡시드이다. 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO 2014/024282 참조. 특정 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV7m8 캡시드이며, 이는 외부 망막으로 우선적인 전달을 보여주었다. 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Dalkara et al, In Vivo-Directed Evolution of a New Adeno-Associated Virus for Therapeutic Outer Retinal Gene Delivery from the Vitreous, Sci Transl Med 5, 189ra76 (2013)] 참조. 일 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 또 다른 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 또 다른 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV5 캡시드이다. 또 다른 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV2 캡시드이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, AAV를 언급할 때, 용어 변이체는 아미노산 또는 핵산 서열 상에서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 공유하는 것을 포함한, 공지된 AAV 서열에서 유래되는 임의의 AAV 서열을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, AAV 캡시드는 임의의 기재되거나 공지된 AAV 캡시드 서열로부터 약 10% 이하의 변이를 포함할 수 있는 변이체를 포함한다. 즉, AAV 캡시드는 본 명세서에 제공되고/되거나 본 기술분야에 공지된 AAV 캡시드에 대해 약 90% 동일성 내지 약 99.9% 동일성, 약 95% 내지 약 99% 동일성 또는 약 97% 내지 약 98% 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV 캡시드와 적어도 95% 동일성을 공유한다. AAV 캡시드의 동일성 퍼센트를 결정할 때, 비교는 임의의 가변 단백질(예를 들어, vp1, vp2 또는 vp3) 상에서 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV8 vp3과 적어도 95% 동일성을 공유한다. 또 다른 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV2 캡시드와 적어도 95% 동일성을 공유한다. 다른 실시형태에서, 자기-상보적 AAV가 사용된다.
ITR 또는 다른 AAV 구성요소는 AAV로부터 본 기술분야의 기술자에게 이용가능한 기술을 사용하여 용이하게 단리되거나 조작될 수 있다. 이러한 AAV는 학술적, 상업적 또는 공공적 출처[예를 들어, 버지니아주 머내서스에 소재하는 미국모식균배양수집소(American Type Culture Collection)]에서 단리, 조작되거나 수득될 수 있다. 대안적으로, AAV 서열은 문헌 또는 데이터베이스, 예컨대, GenBank, PubMed 등에서 입수가능한 것과 같은 공개된 서열을 참조하여 합성 또는 다른 적절한 수단을 통해 조작될 수 있다. AAV 바이러스는 통상적인 분자 생물학 기술에 의해 조작될 수 있어, 이러한 입자를 핵산 서열의 세포 특이적 전달, 면역원성 최소화, 안정성 및 입자 수명 조정, 효율적인 분해, 핵으로의 정확한 전달 등을 위해 최적화할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "인공 AAV"는 제한 없이 비-자연 발생의 캡시드 단백질을 갖는 AAV를 의미한다. 이러한 인공 캡시드는 선택된 AAV 서열(예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 상이한 선택된 AAV, 동일한 AAV의 비-인접 부위, 비-AAV 바이러스 출처 유래, 또는 비-바이러스 출처 유래로부터 수득할 수 있는 이종 서열과 조합으로 사용하여 임의의 적합한 기술에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV는 제한 없이 슈도타입(pseudotyped) AAV, 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드, 또는 "인간화된" AAV 캡시드일 수 있다. 하나의 AAV의 캡시드가 이종 캡시드 단백질로 대체된 슈도타입 벡터는 본 발명에 유용하다. 일 실시형태에서, AAV2/5 및 AAV2/7m8은 예시적인 슈도타입 벡터이다.
"자기-상보적(self-complementary) AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 운반된 암호 영역이 분자내 이중 가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계된 발현 카세트를 갖는 플라스미드 또는 벡터를 지칭한다. 감염 시, 제2 가닥의 세포 매개 합성을 기다리기 보다는 scAAV의 2개의 상보성 절반은 결합하여 즉각적인 복제 및 전사를 위해 준비된 하나의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 단위를 형성할 것이다. 예를 들어, 문헌[D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254] 참조. 자기-상보성 AAV는 예를 들어 미국 특허 제6,596,535호; 제7,125,717호; 및 제7,456,683호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
"투여" 또는 "투여 경로"는 선택된 조성물의 전달에 적합하고 안구 질환에 의해 특성화된 선택된 표적 세포에 유효량을 전달할 수 있는 임의의 공지된 투여 경로를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 투여 경로는 경구, 비경구, 정맥내, 비강내, 설하, 안내 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 데포(depot) 제형 또는 장치를 통해, 점안액을 통해, 흡입 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 RPE, 광수용체 세포, 및/또는 다른 안구 세포에 망막하 주사에 의해 조성물을 전달하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 안구 세포에 대한 유리체내 주사가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 안구 세포에 대한 안검 정맥을 통한 주사가 사용된다. 또 다른 투여 방법은 본 개시내용에 따라 본 기술분야의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 원하는 경우 투여 경로는 조합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 주기적으로 반복된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 임의의 적합한 경로 또는 상이한 경로의 조합에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하도록 설계된다. 본 명세서에 기재된 핵산 분자 및/또는 벡터는 단일 조성물 또는 다중 조성물로 전달될 수 있다. 선택적으로, 2 이상의 상이한 AAV 또는 다중 바이러스가 전달될 수 있다[예를 들어, WO20 2011/126808 및 WO 2013/049493 참조]. 또 다른 실시형태에서, 다중 바이러스는 상이한 복제-결손 바이러스(예를 들어, AAV 및 아데노바이러스)를 단독으로 또는 단백질과 조합으로 함유할 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 조성물은 인간 AKT를 암호화하는 서열을 제공하는 단리된, 또는 합성적으로 조작된 또는 재조합적으로 조작된 핵산 서열이다. 일 실시형태에서, 인간 AKT를 암호화하는 단리되거나 조작된 핵산 서열이 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열은 에피토프 태그와 같은 마커의 추가를 허용하는 하나 이상의 추가 제한 부위를 포함한다. 천연 핵산 서열과 정렬될 때, AKT를 암호화하는 조작된 서열은 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 동일성 퍼센트를, 임의의 이들 범위 사이의 임의의 정수를 포함해서 가질 수 있다. 일 실시형태에서, AKT를 암호화하는 조작된 서열은 천연 서열과 적어도 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성 퍼센트를 갖는다.
AKT 단백질의 발현을 위해 서열번호 7을 사용하는 다양한 발현 카세트가 제공된다. 일 실시형태에서, 이러한 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 예는 서열번호 1에 제시된다. 일 실시형태에서, 이러한 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 예는 서열번호 3에 제시된다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 Myr 태그를 포함하지 않는다. AKT 단백질의 발현을 위해 서열번호 13을 사용하는 발현 카세트는 서열번호 5에 제시된다.
본 명세서에 사용된 "발현 카세트"는 AKT 단백질의 암호 서열, 프로모터를 포함하고, 이를 위한 다른 조절 서열을 포함할 수 있는 핵산 분자를 지칭하며, 이러한 카세트는 유전 요소 또는 플라스미드 내로 조작될 수 있고, 및/또는 바이러스 벡터(예를 들어, 바이러스 입자)의 캡시드 내로 패키징될 수 있다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 AKT를 암호화하는 조작된 핵산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 숙주 세포에서 AKT 암호 서열 및/또는 유전자 산물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된 AKT 암호 서열을 포함한다.
"재조합 AAV" 또는 "rAAV"는 2개의 요소인, AAV 캡시드 및 이 AAV 캡시드 내에 패키징된 적어도 비-AAV 암호 서열을 함유하는 벡터 게놈을 함유하는 DNAse-저항성 바이러스 입자이다. 달리 명시되지 않는 한, 이 용어는 "rAAV 벡터"라는 어구와 호환 가능하게 사용될 수 있다. rAAV는 임의의 기능적 AAV rep 유전자 또는 기능적 AAV cap 유전자가 결핍되어 자손을 생성할 수 없기 때문에 "복제-결손 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"이다. 특정 실시형태에서, 유일한 AAV 서열은 유전자 및 조절 서열이 AAV 캡시드 내에 패키징될 ITR들 사이에 위치하도록 하기 위해, 전형적으로 벡터 게놈의 5' 및 3' 극단에 위치하는 AAV 역 말단 반복 서열(ITR)이다.
본 명세서에 사용된 "벡터 게놈"은 바이러스 입자를 형성하는 rAAV 캡시드 내부에 패키징된 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 핵산 서열은 AAV 역 말단 반복 서열(ITR)을 함유한다. 본 명세서의 실시예에서, 벡터 게놈은 5'에서 3'쪽으로, 최소한 AAV 5' ITR, 암호 서열(들), 및 AAV 3' ITR을 함유한다. 캡시드와 다른 출처의 AAV인 AAV2의 ITR, 또는 전체 길이 외에 다른 ITR이 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, ITR은 생산 동안 rep 기능을 제공하는 AAV와 동일한 AAV 출처에서 유래하거나 또는 상호보완(transcomplementing) AAV에서 유래한다. 또한, 다른 ITR이 사용될 수 있다. 또한, 벡터 게놈은 유전자 산물의 발현을 유도하는 조절 서열을 함유한다.
rAAV 벡터를 생성하는데 사용하기 위한 다양한 플라스미드는 본 기술분야에 공지되어 있고, 이는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용하다. 생산 플라스미드는 AAV 캡 및/또는 rep 단백질을 발현하는 숙주 세포에서 배양된다. 숙주 세포에서, 각 rAAV 게놈은 구제(rescue)되고 캡시드 단백질 또는 엔벨로프 단백질 내에 패키징되어 감염성 바이러스 입자를 형성한다. 일 실시형태에서, 생산 플라스미드는 본 명세서에 기재된 것, 또는 본 명세서에 참조에 의해 원용된 WO2012/158757에 기재된 것이다.
생산 플라스미드의 일 유형은 서열번호 1 및 도 12에 제시된 것이며, pAAV.CAG.myr.hAKT3으로 명명된다. 또 다른 생산 플라스미드는 서열번호 2 및 도 13에 제시된다. 또 다른 생산 플라스미드는 서열번호 3 및 도 14에 제시된다. 이러한 플라스미드는 5' AAV ITR 서열; 선택된 프로모터; 폴리A 서열; 및 3' ITR을 함유하는 것이다. AKT를 암호화하는 핵산 서열은 선택된 프로모터와 폴리A 서열 사이에 삽입된다. 특정 실시형태에서, 생산 플라스미드는 벡터 플라스미드 생산 효율을 최적화하도록 변형된다. 이러한 변형은 본 명세서에서 고려된다. 다른 실시형태에서, 종결인자 및 다른 서열이 플라스미드에 포함된다.
또 다른 실시형태에서, 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터는 본 명세서에 기재된 AKT 작제물 및 서열을 전달하기 위해 제공된다. AAV 벡터는 AAV 캡시드 및 AAV 역 말단 반복(ITR) 서열 및 인간 단백질 키나제 B(AKT)를 암호화하는 핵산 서열, 및 숙주 세포에서 AKT의 발현을 유도하는 발현 조절 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 아데노-관련 바이러스(AAV) 바이러스 벡터는 표적 세포로 전달하기 위한 핵산 서열이 패키징된 AAV 단백질 캡시드를 갖는 AAV DNase-저항성 입자이다. AAV 캡시드는 선택된 AAV에 따라 대략 1:1:10 내지 1:1:20의 비율로 20면체 대칭으로 배열된 60개의 캡시드(cap) 단백질 서브유닛, VP1, VP2 및 VP3으로 구성된다. AAV는 위에 명시된 바와 같은 AAV 바이러스 벡터의 캡시드에 대한 출처로서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터에 사용하기 위한 AAV 캡시드는 전술한 AAV 캡시드 또는 이의 암호화 핵산 중 하나의 돌연변이유발(즉, 삽입, 결실 또는 치환에 의해)에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 전술한 AAV 캡시드 단백질 중 2개 또는 3개 또는 4개 이상에 유래하는 도메인을 포함하는 키메라성이다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 2개 또는 3개의 상이한 AAV 또는 재조합 AAV로부터의 vp1, vp2, 및 vp3 단량체의 모자이크이다. 일부 실시형태에서, rAAV 조성물은 하나보다 많은 상기 언급된 캡시드 단백질을 포함한다.
발현 카세트 또는 rAAV 게놈 또는 생산 플라스미드를 비리온 내로 패키징하기 위해 ITR은 전이유전자와 동일한 작제물에서 시스(cis)로 요구되는 유일한 AAV 구성요소이다. 일 실시형태에서, 복제(rep) 및/또는 캡시드(cap)를 위한 암호 서열은 AAV 게놈으로부터 제거되어 트랜스로 공급되거나 또는 패키징 세포주에 의해 공급되어 AAV 벡터를 생성한다. 예를 들어, 위에서 설명한 바와 같이, 슈도타입 AAV는 AAV 캡시드의 출처와 상이한 출처의 ITR을 함유할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 키메라성 AAV 캡시드가 활용된다. 또 다른 AAV 구성요소가 선택될 수 있다. 이러한 AAV 서열의 출처는 본 명세서에 기재되어 있으며 학술적, 상업적 또는 공공적 출처(예를 들어, 버지니아주 머내서스에 소재하는 미국모식균배양수집소)로부터 단리되거나 입수하여 조작될 수도 있다. 대안적으로, AAV 서열은 예를 들어 GenBank®, PubMed® 등과 같은 데이터베이스 또는 문헌에서 입수가능한 것과 같은 공개된 서열을 참조하여 합성 또는 다른 적절한 수단을 통해 수득할 수 있다.
대상체로의 전달에 적합한 AAV 바이러스 벡터를 생성 및 단리하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7790449호; 미국 특허 제7282199호; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; 및 미국 특허 제7588772호 B2 참조. 하나의 시스템에서, 생산자 세포주는 ITR이 측면에 있는 전이유전자를 암호화하는 작제물, 및 rep 및 cap을 암호화하는 작제물(들)에 의해 일시적으로 형질감염된다. 제2 시스템에서 rep 및 cap을 안정적으로 공급하는 패키징 세포주는 ITR이 측면에 있는 전이유전자를 암호화하는 작제물에 의해 일시적으로 형질감염된다. 이들 시스템 각각에서 AAV 비리온은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 감염에 대한 반응으로 생성되며, 이는 오염 바이러스로부터 rAAV의 분리를 필요로 한다. 보다 최근에는 AAV를 복구하기 위해 헬퍼 바이러스 감염을 필요로 하지 않는 시스템이 개발되었다 - 필요한 헬퍼 기능(즉, 아데노바이러스 E1, E2a, VA 및 E4 또는 헤르페스바이러스 UL5, UL8, UL52 및 UL29, 및 헤르페스바이러스 폴리머라제)은 그 시스템에 의해 트랜스로 공급되기도 한다. 이러한 새로운 시스템에서 헬퍼 기능은 필요한 헬퍼 기능을 암호화하는 작제물에 의한 세포의 일시적인 형질감염에 의해 공급될 수 있거나, 또는 세포는 헬퍼 기능을 암호화하는 유전자를 안정적으로 함유하도록 조작될 수 있으며, 이의 발현은 전사 또는 전사후 수준에서 제어될 수 있다.
또 다른 시스템에서, ITR 및 rep/cap 유전자가 측면에 있는 전이유전자는 바큘로바이러스 기반 벡터로의 감염에 의해 곤충 세포 내로 도입된다. 이러한 생산 시스템에 대한 리뷰는 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929]을 참조하고, 이 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 이들 및 다른 AAV 생산 시스템을 제조하고 사용하는 방법은 또한 다음 미국 특허들에 설명되어 있으며, 그 각각의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다: 제5,139,941호; 제5,741,683호; 제6,057,152호; 제6,204,059호; 제6,268,213호; 제6,491,907호; 제6,660,514호; 제6,951,753호; 제7,094,604호; 제7,172,893호; 제7,201,898호; 제7,229,823호; 및 제7,439,065호. 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Grieger & Samulski, 2005, "Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology", J. Gene Med. 10:717-733]; 및 아래에 인용된 참고 문헌을 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 발명의 임의의 실시형태를 작제하기 위해 사용된 방법은 핵산 조작의 기술자에게 공지되어 있고 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)] 참조. 이와 유사하게, rAAV 비리온을 생성하는 방법은 잘 알려져 있고 적절한 방법의 선택은 본 발명에 대한 제한이 아니다. 예를 들어, 문헌[K. Fisher et al, (1993) J. Virol., 70:520-532] 및 미국 특허 제5,478,745호 참조.
본 명세서에 제공되는 rAAV 벡터는 AAV 캡시드 및 상기 기재된 것과 같은 AKT를 암호화하는 서열을 갖는 AAV 발현 카세트를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV 발현 카세트는 AAV 역 말단 반복 서열 및 AKT를 암호화하는 핵산 서열, 및 숙주 세포에서 암호된 단백질의 발현을 유도하는 발현 제어 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, rAAV 발현 카세트는 인트론, Kozak 서열, 폴리A, 및 전사후 조절 요소 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 눈으로 전달하기 위한 약제학적 조성물에 사용하기 위한 이러한 rAAV 벡터는 본 명세서에 기술된 것을 포함하여 많은 공지된 AAV 중 임의의 것의 캡시드를 사용할 수 있다.
본 명세서에 제공된 발현 카세트 및 벡터의 다른 통상적인 성분은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 코돈 최적화를 포함하는, 본 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 특정 종에 대해 최적화될 수 있다. 카세트, 벡터, 플라스미드, 바이러스, 또는 본 명세서에 기재된 기타 조성물의 성분은 발현 조절 서열의 일부로서 프로모터 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 세포 특이적이다. 용어 "세포 특이적"은 재조합 벡터를 위해 선택된 특정 프로모터가 특정 안구 세포 유형 또는 유형들에서 AKT 전이유전자의 발현을 유도할 수 있음을 의미한다. 일 실시형태에서, 프로모터는 광수용체 세포에서 전이유전자의 발현에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 간상체 및 원추체에서의 발현에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 간상체에서의 발현에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 원추체에서의 발현에 특이적이다. 일 실시형태에서, 광수용체-특이적 프로모터는 인간 로돕신 키나제 프로모터이다. 로돕신 키나제 프로모터는 간상체 및 원추체 모두에서 활성인 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 문헌[Sun et al, Gene Therapy with Promoter Targeting Both Rods and Cones Rescues Retinal Degeneration Caused by AIPL1 Mutations, Gene Ther. 2010 January; 17(1): 117-131]을 참조하고, 이 문헌은 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일 실시형태에서, 프로모터는 클로닝을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 제한 부위를 추가하도록 변형된다.
또 다른 실시형태에서, 프로모터는 인간 로돕신 프로모터이다. 일 실시형태에서, 프로모터는 클로닝을 위해 말단에 제한부위를 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 문헌[Nathans and Hogness, Isolation and nucleotide sequence of the gene encoding human rhodopsin, PNAS, 81:4851-5 (August 1984)]을 참조하고, 이 문헌은 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 인간 로돕신 프로모터의 일부 또는 단편이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 인간 로돕신 프로모터의 변이체이다.
다른 예시적인 프로모터는 인간 G-단백질-커플링된 수용체 단백질 키나제 1(GRK1) 프로모터(Genbank 수탁 번호 AY327580)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 GRK1 프로모터의 292 nt 단편(위치 1793-2087)이다(문헌[Beltran et al, Gene Therapy 2010 17:1162-74] 참조, 이 문헌은 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 3의 nt 1427-1790의 GRK1 프로모터이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 프로모터는 인간 광수용체간 망막양-결합 단백질 근접(IRBP) 프로모터이다. 일 실시형태에서, 프로모터는 hIRBP 프로모터의 235 nt 단편이다. 일 실시형태에서, 프로모터는 RPGR 근접 프로모터이다(Shu et al, IOVS, May 2102, 이는 그 전체가 참조에 의해 원용됨). 본 발명에 유용한 다른 프로모터는 제한 없이 간상체 옵신 프로모터, 적색-녹색 옵신 프로모터, 청색 옵신 프로모터, cGMP-β-포스포다이에스터라제 프로모터(Qgueta et al, IOVS, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Dec; 41(13):4059-63), 마우스 옵신 프로모터(상기 인용된 Beltran et al 2010), 로돕신 프로모터(Mussolino et al, Gene Ther, July 2011, 18(7):637-45); 원추체 트랜스듀신의 알파-서브유닛(Morrissey et al, BMC Dev, Biol, Jan 2011, 11:3); 베타 포스포다이에스터라제(PDE) 프로모터; 색소성 망막염(RP1) 프로모터(Nicord et al, J. Gene Med, Dec 2007, 9(12):1015-23); NXNL2/NXNL1 프로모터(Lambard et al, PLoS One, Oct. 2010, 5(10):e13025), RPE65 프로모터; 망막 변성 슬로우/페리페린(slow/peripherin) 2(Rds/perph2) 프로모터(Cai et al, Exp Eye Res. 2010 Aug;91(2):186-94); 및 VMD2 프로모터(Kachi et al, Human Gene Therapy, 2009 (20:31-9))를 포함한다. 이들 문서 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 인간 인간 EF1α 프로모터, 로돕신 프로모터, 로돕신 키나제, 광수용체간 결합 단백질(IRBP), 원추체 옵신 프로모터(적색-녹색, 청색), 적색-녹색 원추체 유전자좌 제어 영역을 함유하는 원추체 옵신 상류 서열, 원추체 형질도입 및 전사 인자 프로모터[신경 망막 류신 지퍼(Nrl) 및 광수용체 특이적 핵 수용체 Nr2e3, bZIP]로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 프로모터는 편재적 또는 구성적 프로모터이다. 적합한 프로모터의 예는 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 요소를 가진 혼성 닭 β-액틴(CBA) 프로모터이다. 또 다른 실시형태에서, CMV 인핸서 서열을 가진 닭 베타 액틴 프로모터는 서열번호 1의 nt 1443-3104이다. 또 다른 실시형태에서, CMV 인핸서 서열을 가진 닭 베타 액틴 프로모터는 서열번호 5의 nt 1493 내지 2075이다. 또 다른 실시형태에서, 프로모터는 CB7 프로모터이다. 다른 적합한 프로모터는 인간 β-액틴 프로모터, 인간 연장 인자-1α 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40 프로모터, 및 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Damdindorj et al, (August 2014) A Comparative Analysis of Constitutive Promoters Located in Adeno-Associated Viral Vectors. PLoS ONE 9(8): e106472] 참조. 또 다른 적합한 프로모터는 바이러스 프로모터, 구성적 프로모터, 조절성 프로모터를 포함한다(예를 들어, WO 2011/126808 및 WO 2013/04943 참조). 대안적으로, 생리학적 단서에 반응성인 프로모터는 본 명세서에 기재된 발현 카세트, rAAV 게놈, 벡터, 플라스미드 및 바이러스에서 활용될 수 있다. 일 실시형태에서, 프로모터는 AAV 벡터의 크기 제한으로 인해 1000 bp 미만의 작은 크기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 400bp 미만이다. 다른 프로모터는 본 기술분야의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, AKT 작제물은 CMV 인핸서 요소를 갖는 CBA 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, AKT 작제물은 GRK1 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, GRK1 프로모터는 서열번호 3, nt 1427 내지 1790에 제시된 것이다.
특정 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터는 라파마이신/라팔로그 프로모터, 엑디손 프로모터, 에스트로겐 반응성 프로모터, 및 테트라사이클린 반응성 프로모터를 포함하는 공지된 프로모터, 또는 이종이량체 저해인자 스위치로부터 선택될 수 있다. 문헌[Sochor et al, An Autogenously Regulated Expression System for Gene Therapeutic Ocular Applications. Scientific Reports, 2015 Nov 24;5:17105 및 Daber R, Lewis M., A novel molecular switch. J Mol Biol. 2009 Aug 28;391(4):661-70, Epub 2009 Jun 21]을 참조하고, 이 두 문헌 모두가 본 명세서에 전체적으로 참조에 의해 원용된다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 카세트, 벡터, 플라스미드 및 바이러스 작제물은 다른 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화(폴리A) 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; TATA 서열; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 콘센서스 서열); 인트론; 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 암호화된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 함유한다. 발현 카세트 또는 벡터는 본 명세서에 기재된 임의의 요소를 전혀 함유하지 않거나, 하나 이상 함유할 수 있다. 적합한 폴리A 서열의 예는, 예를 들어, SV40, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리A, 및 TK 폴리A를 포함한다. 적합한 인핸서의 예는 무엇보다도, 예를 들어, CMV 인핸서, RSV 인핸서, 알파 태아단백질 인핸서, TTR 최소 프로모터/인핸서, LSP(TH-결합 글로불린 프로모터/알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서)를 포함한다. 일 실시형태에서, Kozak 서열은 정확한 개시 코돈으로부터 해독을 향상시키기 위해 전이유전자 암호 서열의 상류에 포함된다. 또 다른 실시형태에서, CBA 엑손 1 및 인트론은 발현 카세트에 포함된다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 혼성 닭 β 액틴(CBA) 프로모터의 제어 하에 배치된다. 이 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 인핸서, 근접 닭 β 액틴 프로모터 및 인트론 1 서열이 측면에 있는 CBA 엑손 1로 구성된다.
특정 실시형태에서, Kozak 서열은 GCCGCCACC(서열번호 1, nt 3121 내지 3129)이다.
특정 실시형태에서, 발현 카세트는 5' ITR, CBA 프로모터, CMV 인핸서, 인간 AKT3 암호 서열(서열번호 7), bGH 폴리 A, 및 3' ITR을 함유한다.
특정 실시형태에서, 발현 카세트는 5' ITR, hGRK1 프로모터, 인간 AKT3 서열(서열번호 7), bGH 폴리A, 및 3' ITR을 함유한다.
특정 실시형태에서, 발현 카세트는 5' ITR, CBA 프로모터, CMV 인핸서, 조작된 인간 AKT3 서열(서열번호 13), bGH 폴리A, 및 3' ITR을 함유한다.
특정 실시형태에서, 발현 카세트는 5' ITR, hGRK1 프로모터, 조작된 인간 AKT3 서열(서열번호 13), bGH 폴리A, 및 3' ITR을 함유한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 이들 핵산 서열, 벡터, 발현 카세트, 또는 rAAV 바이러스 벡터는 약제학적 조성물에 유용하며, 이 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 완충액, 희석제 및/또는 보조제 등을 추가로 포함한다. 이러한 약제학적 조성물은, 예를 들어, 재조합적으로 조작된 AAV 또는 인공 AAV에 의한 전달을 통해 안구 세포에서 AKT를 발현시키는데 사용된다.
핵산 서열, 벡터, 발현 카세트 및 rAAV 바이러스 벡터를 함유하는 이러한 약제학적 조성물을 제조하기 위해, 서열 또는 벡터 또는 바이러스 벡터는 바람직하게는 통상적인 방법에 의해 오염에 대해 평가한 다음, 눈에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로 제형화한다. 이러한 제형은 약제학적으로 그리고/또는 생리학적으로 허용 가능한 비히클 또는 담체, 특히 눈에 투여하기에 적합한 것, 예컨대, 적절한 생리학적 수준에서 pH를 유지하기 위한 완충 식염수 또는 다른 완충액, 예를 들어, HEPES, 및 선택적으로 다른 약제, 약제학적 제제, 안정화제, 완충액, 담체, 보조제, 희석제 등의 사용을 수반한다. 주사용인 경우, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 예시적인 생리학적으로 허용 가능한 담체는 발열원이 없는 멸균수 또는 발열원이 없는 멸균 인산염 완충 식염수를 포함한다. 이러한 공지된 다양한 담체는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제7,629,322호에 제공되어 있다. 일 실시형태에서, 담체는 등장성 염화나트륨 용액이다. 또 다른 실시형태에서, 담체는 평형 염 용액이다. 일 실시형태에서, 담체는 트윈(tween)을 포함한다. 바이러스가 장기간 보관되어야 한다면, 글리세롤 또는 Tween20의 존재 하에 동결될 수 있다.
하나의 예시적인 특정 실시형태에서, 담체 또는 부형제의 조성물은 0.0001% 내지 0.01% Pluronic F68(PF68)과 함께 180mM NaCl, 10mM NaPi, pH 7.3을 함유한다. 완충액의 식염수 성분의 정확한 조성은 160mM 내지 180mM NaCl 범위이다. 선택적으로, 다른 pH 완충액(잠재적으로, HEPES, 중탄산나트륨, TRIS)이 구체적으로 기술된 완충액 대신에 사용된다. 또 다른 대안으로, 0.9% NaCl을 함유하는 완충액이 유용하다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은 rAAV 및/또는 변이체 및 담체(들) 외에, 보존제 또는 화학적 안정화제와 같은 다른 통상적인 약제학적 성분을 함유한다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 소르브산칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
AAV 바이러스 벡터의 경우, 게놈 카피("GC"), 벡터 게놈("VG"), 또는 바이러스 입자의 정량은 제형 또는 현탁액에 함유된 용량의 척도로서 사용될 수 있다. 본 기술분야에 공지된 임의의 방법은 본 발명의 복제-결손 바이러스 조성물의 게놈 카피(GC) 수를 결정하는 데 사용될 수 있다. AAV GC 수 적정을 수행하는 한 가지 방법은 다음과 같다: 정제된 AAV 벡터 샘플을 먼저 DNase로 처리하여 캡시드화되지 않은 AAV 게놈 DNA 또는 생산 과정으로부터의 오염 플라스미드 DNA를 제거한다. 그 다음, DNase 저항성 입자를 열처리하여 캡시드로부터 게놈을 방출시킨다. 방출된 게놈은 그 다음 바이러스 게놈(일반적으로 폴리 A 신호)의 특정 영역을 표적으로 하는 프라이머/프로브 세트를 사용하여 실시간 PCR에 의해 정량한다. 다른 방법에서, AKT 전이유전자를 암호화하는 핵산 서열을 운반하는 재조합 아데노-관련 바이러스의 유효 용량은 전체가 참조에 의해 원용되는 문헌[S.K. McLaughlin et al, 1988 J. Virol., 62:1963]에 기술된 바와 같이 측정된다.
본 명세서에 사용된 용어 "투여량"은 치료 과정에서 대상체에게 전달된 총 투여량, 또는 단일 단위(또는 다중 단위 또는 분할 투여량) 투여로 전달된 양을 지칭할 수 있다. 약제학적 바이러스 조성물은 약 1.0×109 GC 내지 약 1.0×1015 GC 범위 내이며, 이 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 AKT를 암호화하는 핵산 서열을 보유하는 복제-결손 바이러스의 양을 함유하는 투여량 단위로 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 또는 9×109 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 또는 9×1010 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 또는 9×1011 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 또는 9×1012 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 또는 9×1013 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1014, 2×1014, 3×1014, 4×1014, 5×1014, 6×1014, 7×1014, 8×1014, 또는 9×1014 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1015, 2×1015, 3×1015, 4×1015, 5×1015, 6×1015, 7×1015, 8×1015, 또는 9×1015 GC를 함유하도록 제형화된다. 일 실시형태에서, 인간 적용예의 경우 용량은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 1×1010 내지 약 1×1012 GC 범위일 수 있다. 모든 투여량은, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2): 115-25.doi: 10.1089/hgtb.2013.131]에 기재된 바와 같은 qPCR 또는 디지털 액적 PCR(ddPCR)에 의해 측정되는 것을 포함하여, 임의의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
이러한 상기 용량들은 치료할 영역의 크기, 사용된 바이러스 역가, 투여 경로 및 방법의 원하는 효과에 따라서, 범위 내의 모든 수를 포함하여 약 25 내지 약 1000 마이크로리터 범위의 다양한 부피의 담체, 부형제 또는 완충액 제형으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 담체, 부형제 또는 완충액의 부피는 적어도 약 25㎕이다. 일 실시형태에서, 부피는 약 50㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 75㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 100㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 125㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 150㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 175㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 200㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 225㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 250㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 275㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 300㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 325㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 350㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 375㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 400㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 450㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 500㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 550㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 600㎕이다. 다른 실시형태에서, 부피는 약 650㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 700㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 700 내지 1000㎕이다.
특정 실시형태에서, 바이러스 작제물은 마우스와 같은 작은 동물 대상체에 대해 약 1㎕ 내지 약 3㎕의 부피에 약 1×109 내지 약 1×1011 GC의 용량으로 전달된다. 인간의 눈과 거의 같은 크기의 눈을 가진 더 큰 수의학적 대상체의 경우, 상기 언급된 더 큰 인간 투여량 및 부피가 유용하다. 다양한 수의학적 동물에 물질을 투여하기 위한 우수 사례에 대한 논의는, 예를 들어, 문헌[Diehl et al, J. Applied Toxicology, 21:15-23(2001)]을 참조한다. 이 문서는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
독성, 망막 이형성증 및 박리와 같은 바람직하지 않은 효과의 위험을 줄이기 위해서는 바이러스 또는 기타 전달 비히클의 가장 낮은 유효 농도를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 범위의 또 다른 투여량은 치료되는 대상체, 바람직하게는 인간의 신체 상태, 대상체의 연령, 특정 안구 장애 및 장애가 진행성인 경우 발병 정도를 고려하여 주치의에 의해 선택될 수 있다.
특정 양상에서, 본 명세서에는 안구 장애가 있거나 발병 위험이 있는 포유동물 대상체에서 실명의 진행을 치료, 지연 또는 정지시키는 방법이 기술된다. 일 실시형태에서, 대상체는 망막 변성을 갖고 있다. 특정 실시형태에서, 바람직하게는 생리학적 화합성 담체, 희석제, 부형제 및/또는 보조제에 현탁된, AKT 서열을 운반하는 rAAV가 원하는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여된다. 이 방법은 핵산 서열, 발현 카세트, rAAV 게놈, 플라스미드, 벡터, 또는 rAAV 벡터, 또는 이들을 함유하는 조성물 중 임의의 것을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 망막하로 전달된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 유리체내로 전달된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 안검 정맥 또는 다른 정맥내 또는 통상적인 투여 경로를 통한 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 안구 질환의 치료에 적합한 투여 경로의 조합을 사용하여 전달된다.
이들 방법에 사용하기 위해, 각 투여량의 부피 및 바이러스 역가는 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 개별적으로 결정되고, 동일하거나 반대측 눈에 수행되는 다른 치료와 동일하거나 상이할 수 있다. 투여량, 투여 및 요법은 본 명세서의 교시를 감안하여 주치의에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 상기 열거된 것들로부터 선택되는 단일 투여량으로 투여되고 이환된 단일 눈에 투여된다. 다른 실시형태에서, 조성물은 이환된 양쪽 눈에 동시에 또는 순차적으로 상기 열거된 것 중에서 선택된 단일 투여량으로 투여된다. 순차 투여는 몇 분, 몇 시간, 며칠, 몇 주 또는 몇 개월의 간격으로 한쪽 눈에서 다른 쪽 눈으로 투여하는 시간 간격을 의미할 수 있다. 다른 실시형태에서, 방법은 조성물을 2 이상의 투여량(예를 들어, 분할 투여량)으로 눈에 투여하는 것을 수반한다. 또 다른 실시형태에서, 다중 주사는 동일한 눈의 상이한 부분에 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 선택된 발현 카세트(예를 들어, AKT 함유 카세트)를 포함하는 rAAV의 2차 투여는 이후 시점에서 수행된다. 이러한 시점은 1차 투여 후 몇 주, 몇 달 또는 몇 년이 될 수 있다. 이러한 2차 투여는, 일 실시형태에서, 1차 투여의 rAAV와 상이한 캡시드를 갖는 rAAV로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1차 및 2차 투여를 위한 rAAV는 동일한 캡시드를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 단일 조성물 또는 다중 조성물로 전달된다. 선택적으로, 2 이상의 상이한 AAV 또는 다중 바이러스가 전달된다[예를 들어, WO 2011/126808 및 WO 2013/049493 참조]. 또 다른 실시형태에서, 다중 바이러스는 상이한 복제-결손 바이러스(예를 들어, AAV 및 아데노바이러스)를 함유한다.
특정 실시형태에서, 치료를 위해 표적화되는 눈의 영역(예를 들어, 간상체 및 원추체 광수용체)을 확인하기 위해 비침습성 망막 이미지화 및 기능적 연구를 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 망막하 주사(들)에 대한 정확한 위치(들)를 결정하기 위해 임상 진단 테스트가 사용된다. 이러한 테스트로는, 예를 들어, 망막전위도(ERG), 시야측정법, 공초점 스캐닝 레이저 검안경검사(cSLO) 및 광간섭 단층촬영(OCT)을 통한 망막 층의 지형 매핑 및 망막 층 두께 측정, 적응 광학(AO)을 통한 원추체 밀도의 지형 매핑, 기능적 눈 검사 등을 포함하며, 이는 치료되는 대상체의 종, 신체 상태, 및 투여량에 따라 달라진다. 수행된 이미지화 및 기능적 연구의 관점에서, 특정 실시형태에 따르면, 이환된 눈의 상이한 영역을 표적화하기 위해 동일한 눈에서 1회 이상의 주사가 수행된다. 각 주사의 부피 및 바이러스 역가는 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 개별적으로 결정되며, 동일한 눈 또는 반대측 눈에서 수행되는 다른 주사와 동일하거나 상이할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 전체 눈을 치료하기 위해 단일의 더 큰 부피 주사가 이루어진다. 일 실시형태에서, rAAV 조성물의 부피 및 농도는 손상된 안구 세포의 영역만이 영향을 받도록 선택된다. 또 다른 실시형태에서, rAAV 조성물의 부피 및/또는 농도는 손상되지 않은 광수용체를 포함한 눈의 더 큰 부분으로 도달하도록 하기 위한 더 많은 양이다.
본 명세서에 기재된 방법의 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 1회 안내 전달, 예를 들어 AKT 발현 카세트의 AAV 전달은 안구 장애 또는 망막 변성의 발병 위험이 있는 대상체에서 시력 상실 및 실명을 예방하는 데 유용하다.
특정 실시형태에서, 조성물은 질병 발병 전에 투여된다. 다른 실시형태에서, 조성물은 시력 손상 또는 상실의 개시 전에 투여된다. 다른 실시형태에서, 조성물은 시력 손상 또는 상실의 개시 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 비-이환 눈(예를 들어, 반대쪽 눈)과 비교하여 간상체 및/또는 원추체 또는 광수용체의 90% 미만이 기능성이거나 유지될 때 투여된다.
특정 실시형태에서, 방법은 치료의 효능을 결정하기 위해 추가 연구, 예를 들어 기능성 및 이미지화 연구를 수행하는 것을 포함한다. 동물의 경우, 이러한 테스트는 간상체 및 원추체 광수용체 기능을 관찰하는 망막전위도(ERG), 광운동성 안진, 동공 측정, 수중 미로 검사, 명암 선호도, 광간섭 단층촬영(다양한 망막 층의 두께 측정), 조직학(망막 두께, 외부 핵층의 핵 열, 전이유전자 발현을 문서화하는 면역형광, 원추형 광수용체 계수, 원추형 광수용체 외피를 식별하는 땅콩 응집소에 의한 망막 절편 염색)을 통한 망막 및 시각 기능 평가를 포함한다.
특히 인간 대상체의 경우, 본 명세서에 기재된 조성물의 투여량을 투여한 후, 대상체는 간상체 및 원추체 광수용체 기능을 검사하는 망막전위도(ERG), 동공계측 시력 평가, 대비 감도 색각 테스트, 시야 테스트(Humphrey 시야/Goldmann 시야), 시야측정 이동성 테스트(장애물 코스) 및/또는 읽기 속도 테스트를 사용하여 치료 효능에 대해 테스트한다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물에 의한 치료 후 대상체가 노출되는 다른 유용한 치료 후 효능 테스트로는 기능성 자기 공명 영상술(fMRI), 전영역 광감도 테스트, 광간섭 단층촬영을 포함한 망막 구조 연구, 안저 사진촬영, 안저 자가형광(FAF), 적응 광학 레이저 스캐닝 검안경 검사, 이동성 테스트, 읽기 속도 및 정확도 테스트, 미세시야측정 및/또는 검안경 검사를 포함한다. 이러한 효능 테스트 및 기타 효능 테스트는 미국 특허 제8,147,823호 및 동시 계류 중인 국제 특허 출원 공개 WO 2014/011210 또는 WO 2014/124282에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
또 다른 실시형태에서, 임의의 상기 기재된 방법은 또 다른 또는 2차 요법과 조합으로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 이들 안구 질환의 치료 방법은 항생제 치료, 통증 완화 치료 등과 같은 또 다른 요법과 조합하여 본 명세서에 상세히 기재된 조성물로 대상체를 치료하는 것을 수반한다. 추가 요법은 이러한 돌연변이 또는 결함, 또는 이와 관련된 임의의 효과를 예방, 정지 또는 개선하는 데 도움이 되는 현재 알려져 있거나 아직 알려져 있지 않은 임의의 요법일 수 있다. 2차 요법은 상기 기재된 조성물의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 2차 요법은 신경영양 인자, 항산화제, 항아폽토시스제의 투여와 같은 망막 세포의 건강을 유지하기 위한 비특이적 접근법을 수반한다. 비특이적 접근법은 단백질, 재조합 DNA, 재조합 바이러스 벡터, 줄기 세포, 태아 조직 또는 유전자 변형 세포의 주입을 통해 달성된다. 후자는 캡슐화된 유전자 변형된 세포를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 재조합 rAAV를 생성하는 방법은 상기 기재된 바와 같은 AAV 발현 카세트를 함유하는 플라스미드를 수득하고, AAV 바이러스 게놈이 감염성 AAV 엔벨로프 또는 캡시드 내로 패키징되도록 하기에 충분한 바이러스 서열의 존재 하에 플라스미드를 운반하는 패키징 세포를 배양하는 것을 포함한다. rAAV 벡터 생성의 특정 방법은 상기에 기재되어 있고, 상기에 기술되고 하기 실시예에 기술되는 발현 카세트 또는 벡터 게놈을 전달할 수 있는 rAAV 벡터를 생성하는데 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 임의의 발현 카세트를 포함하는 벡터가 제공된다. 상기 기재된 바와 같이, 이러한 벡터는 다양한 기원의 플라스미드일 수 있고, 특정 실시형태에서 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같은 재조합 복제 결손 바이러스의 생성에 유용하다.
단수 표현의 용어는 하나 이상을 지칭한다는 점에 유의해야 한다. 이와 같이, "단수 표현", "하나 이상" 및 "적어도 하나"라는 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. "포함한다(comprise)", "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"이라는 단어는 배타적이 아니라 포괄적으로 해석되어야 한다. "이루어진다(consist)", "이루어진(consisting)" 및 이의 변형은 포괄적이기보다는 배타적으로 해석되어야 한다. 명세서의 다양한 실시형태가 "포함하는"이라는 언어를 사용하여 제시되지만, 다른 상황에서 관련 실시형태는 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"이라는 언어를 사용하여 해석되고 기술되는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용된 용어 "약"은 달리 명시되지 않는 한 주어진 참조값으로부터 10%의 가변성을 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "조절" 또는 이의 변형은 생물학적 경로의 하나 이상의 성분을 저해하는 조성물의 능력을 지칭한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 그리고 본 출원에 사용된 많은 용어들에 대한 일반적인 가이드를 본 기술분야의 기술자에게 제공하는 공개된 텍스트를 참조하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
하기 실시예는 예시일 뿐이며 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
실시예
유전성 망막 변성과 관련이 있는 것으로 알려진 유전자로는 250개가 넘는 유전자 내의 돌연변이가 있다. RPE65 돌연변이로 인한 선천성 실명에 대한 유전자 대체 요법 후의 임상적 성공은 유전성 안구 질환의 다른 형태를 표적으로 하는 하류 치료법의 개발을 위한 플랫폼을 확립한다. 불행히도, 복잡한 질병 병리와 관련된 몇 가지 문제 및 현재의 유전자 전달 기술의 한계는 유전성 망막 변성의 각각의 특정 형태에 대한 관련 전략의 개발을 방해한다. 여기서 본 발명자들은 광수용체의 생존 및 구조 유지에 필수적인 동화작용 대사의 특징을 자극하여 망막 변성을 지연시키는 유전자 증강 전략을 기술한다. 본 발명자들은 색소성 망막염의 마우스 모델에서 AAV-매개된 유전자 증강을 이용하여 표준 인슐린/AKT/mTOR 경로 중 2개의 중요한 조절점을 표적으로 삼았다. 세린/트레오닌 키나제, AKT3을 발현하는 AAV 벡터는 광수용체의 수, 구조, 및 부분적 시각 기능의 극적인 보존을 촉진한다. 이러한 보호 효과는 세포 성장 및 생존과 관련된 경로쪽으로 광수용체 대사의 성공적인 재프로그래밍과 관련되었다. 종합하면, 이러한 발견은 광수용체 생존 및 유지에서 동화작용 대사와 관련된 AKT 활성 및 하류 경로의 중요성을 강조한다.
실시예 1: 재료 및 방법
동물
C57Bl/6 및 Pde6brd10 마우스는 잭슨 연구소에서 얻었고 12시간 명암 주기로 사육했다. 동물은 기관 및 연방 규정뿐만 아니라 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 ARVO 지침에 따라 펜실베니아 대학에서 수용했다.
AAV 벡터
N-말단 미리스토일화(MYR) 및 HA 태그를 함유하는 인간 AKT3 cDNA 서열을 암호화하는 플라스미드는 William Sellers(addgene 플라스미드 #9017)에서 호의적으로 제공되었다. MYR-HA-hAKT3 서열을 증폭시키고 In-Fusion HD 클로닝 시스템(Clonetech)을 사용하여 AAV 프로바이러스 발현 플라스미드에 클로닝시켰다. 인간 Rheb cDNA 클론은 Origene에서 얻었다. 역 PCR 돌연변이유발을 사용하여 다음 프라이머 서열: 5' [포스포]CACGTGGGGAAATCCTCATTGAC 3'(S16H 정방향)(서열번호 14) 및 5' CCGGTAGCCCAGGAT 3'(서열번호 15) 프라이머 서열로 S16H 돌연변이를 생성했다. 그 다음, S16H 돌연변이를 함유하는 인간 Rheb cDNA를 In-Fusion HD 클로닝 시스템을 사용하여 AAV 프로바이러스 발현 플라스미드에 클로닝했다. 바이러스 벡터의 생산을 위해 AAV7m8 Cap을 발현하는 헬퍼 플라스미드는 John Flannery와 David Schaffer(addgene 플라스미드 #64839)에 의해 호의적으로 제공되었다. AAV7m8-AKT3 및 AAV7m8-eGFP 벡터는 이전에 설명된 방법46을 사용하여 생성했고 CAROT(Center for Advanced Retinal and Ocular Therapeutics) 연구 벡터 코어(미국 펜실베니아주에 소재하는 펜실베니아 대학)에서 CsCl 구배 초원심분리로 정제했다.
세포 배양 및 AAV 형질도입
84-31 세포는 제임스 윌슨 박사(펜실베니아 대학)로부터 친절하게 제공받았고, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM-GlutaMax에서 배양했다. AAV 형질도입을 위해 84-31 세포를 6-웰 접시에서 2.5×105 세포/웰의 밀도로 플레이팅했다. 그 후, 세포는 1×106 감염 다중도(MOI)에서 AAV7m8 벡터로 즉시 형질도입시켰다. 세포는 5% CO2 하에 37℃에서 유지시켰다.
RNA 분리 및 유전자 발현 분석
RNA는 Macherey-Nagel Nucleospin RNA 키트를 사용하여 단리했다. 제1 가닥 cDNA 합성은 SuperScript III 제1 가닥 합성 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 500ng의 총 RNA로 수행했다. 실시간 PCR은 Applied Biosystems 7500 Fast 시스템으로 Power SYBR green PCR 마스터 믹스(Invitrogen)를 사용하여 수행했다. 다음 프라이머 서열이 사용되었다: 5' CCACTCCTCCACCTTTGAC 3'(인간 GAPDH 정방향; 서열번호: 16), 5' ACCCTGTTGCTGTAGCCA 3'(인간 GAPDH 역방향; 서열번호: 17), 5' ACTCCTACGATCCAACCATAGA 3'(인간 Rheb 정방향; 서열번호 18), 5' TGGAGTATGTCTGAGGAAAGATAGA 3'(인간 Rheb 역방향; 서열번호 19), 5' AGGATGGTATGGACTGCATGG 3'(인간 AKT3 정방향; 서열번호: 20), 및 5' GTCCACTTGCAGAGTAGGAAAA 3'(인간 AKT3 역방향; 서열번호 21). 상대적인 유전자 발현은 ΔΔCT 방법으로 정량화하고 GAPDH로 정규화했다.
망막하 주사
망막하 주사는 이전에 설명한 대로 수행했다. 각 망막은 1uL의 벡터 제조물을 받았다. AAV.eGFP 벡터만 받은 눈에 2×109 벡터 게놈을 투약하였다. AAV.eGFP와 AAV.AKT3 또는 AAV.caRheb의 조합을 받은 눈에는 벡터당 1×109 벡터 게놈을 투약했다(2×109 총 벡터 게놈).
망막전위도
마우스는 마취하고 이전에 설명한 대로 유지했다. 동공은 1% 트로피카미드로 확장시켰다(Alcon Laboratories, 텍사스주 포트 워스 소재). 백금 와이어가 내장된 투명 플라스틱 콘택트렌즈를 사용하여 광 반응을 기록하고, 백금 와이어 루프를 동물의 입에 넣어 기준 전극으로 사용했다. ERG는 Espion E2 시스템(Diagnosys, 매사추세츠주 로웰 소재)으로 기록했다. 3개의 ERG 반응은 다음 매개변수: 암반 반응(어둠 적응, 0.01 scot cd s m-2 자극), 최대 혼합 간상체-원추체 반응(어둠 적응, 500 scot cd s m-2 자극), 최대 원추체 반응으로 기록했다.
광운동 반응
시력은 OptoMotry 소프트웨어 및 장치(Cerebral Mechanics, Inc, Medicine Hat, 캐나다 앨버타주)를 이전에 설명한 대로 사용하여 광운동 반응(OKR)을 측정하여 평가했다. 기록은 실험 치료에 대해 알지 못하는 조사자가 수행했다.
면역조직화학
눈을 적출하고, 수확하고, 이전에 설명된 바와 같이 동결 절편으로 준비했다[Dooley SJ, et al. (2018). Spliceosome-mediated pre-mRNA trans-splicing can repair CEP290 mRNA. Mol Ther Nucleic Acids 12: 294-308]. 절편은 인산염 완충 식염수(PBS), 10% 정상 염소 혈청(CST) 및 2% Triton X-100을 함유하는 차단 완충액에서 1시간 동안 실온에서 항온처리했다. 그 후, 절편은 앞서 기술된 성분 및 하기 항체의 조합을 함유하는 가습 챔버 내에서 1차 항체 용액에서 밤새 항온처리했다: 토끼 항-원추체 어레스틴(1:400; Millipore #ab15282), 토끼 항-포스포-S6-Ser240/244(1:100; CST #5364), 토끼 항-포스포-AKT-Ser273(1:100; CST #4060), 마우스 항-로돕신(1:400; Abcam #ab5417), 토끼 항-HA(1:100; CST #3724), 토끼 항-Ki67 (1:400; Abcam #ab15580), 마우스 항-PCNA(1:400; Abcam #ab29), 닭 항-GFAP(1:400; Abcam #ab4674), 토끼 항 AKT(1:100; CST #4691). 1차 항체 항온처리 후, 절편은 PBS로 3회 세척하고, PBS, 10% 정상 염소 혈청, 2% Triton X-100 및 하기 2차 항체의 조합을 함유하는 가습 챔버 내에서 실온에서 2시간 동안 2차 항체 용액에서 항온처리했다: 알렉사 플루오르(alexa fluor)-594 염소 항-닭(1:500; Abcam #ab150176), 알렉사 플루오르-594 염소 항-마우스(1:500; #ab150116), 알렉사 플루오르-594 염소 항-토끼(1:500; Abcam #ab150080), Cy5-접합 염소 항토끼(1:500; KPL #072-02-15-16). 2차 항체 항온처리 후 절편을 제거하고 PBS로 3회 세척했다. 인산화된 항원의 존재에 대해 염색된 절편을 항온처리하고 PBS 대신 TBS(Tris-buffered saline)를 함유하는 용액에서 세척했다.
ONL 측정
전체 망막 절편은 EVOS FL Auto 2 세포 이미지화 시스템을 가지고 40X 대물렌즈를 사용하여 타일링했다. 각 이미지에서 ONL 두께는 75 내지 100㎛ 이격된 3개의 등거리 지점에서 측정했다. 이 측정값을 모든 이미지 간에 평균을 내어 절편의 평균 ONL 두께를 나타냈다. 샘플당 3개의 망막 절편에서 평균을 냈다. 벡터로 형질도입된 망막의 특정 영역으로부터의 ONL 수는 200㎛ 면적당 GFP+ ONL 세포의 수를 계수하여 정량했다. 다시 한번, 이러한 측정값을 얻기 위해 샘플당 3개의 망막 절편에서 평균을 냈다.
웨스턴 블로팅
단백질 샘플은 NuPage 전기영동 시스템(Thermo Fisher)으로 분리했다. 샘플을 70℃에서 가열하고 4-12% Bis-Tris 단백질 겔(Thermo Fisher)에 로딩했다. 그 다음, 분리된 단백질을 XCell II 블롯 모듈(Thermo Fisher)을 사용하여 35볼트에서 1.5시간 동안 PVDF 막으로 전달시켰다. 단백질 전달 후, 막은 0.1%(v/v) Tween 20(BioRad)(TBST) 및 5%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA; Sigma-Aldrich)을 함유하는 tris-완충 식염수에서 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 그 후, 다음 1차 항체를 함유하는 전술한 용액에서 블롯을 항온처리했다: 토끼 항-498 포스포-S6-Ser240/244(1:1000; CST #5364), 토끼 항-S6(1:1000; CST #2217), 토끼 항-GAPDH(1:1000; CST #5174). 1차 항체 항온처리는 4℃에서 밤새 일어났다. 1차 항체 용액에서 블롯을 제거하고 각각 5분 동안 TBST에서 3회 세척하였다. 이후 TBST, 5% BSA, HRP-접합된 항토끼 ECL(1:10,000; GE Healthcare)로 구성된 2차 항체 용액에서 1시간 동안 실온에서 방치하였다. 막을 TBST에서 3회 세척한 후, ECL2(Thermo Fisher)와 함께 제조업체의 지침에 따라 5분 동안 항온처리했다. 마지막으로, 화학발광 환경과 Amersham Imager 600(GE Healthcare)을 사용하여 막을 이미지화했다.
통계
모든 데이터는 달리 표시되지 않는 한, 평균±SEM으로 표시된다. 두 치료 그룹 간의 차이는 독립 스투던트 t-검정을 사용하여 비교했다. 3개 이상의 실험 그룹 간의 차이는 일원 ANOVA에 이어 Tukey의 정직한 유의적인 차이 테스트(Tukey's honest significant difference test)를 사용하여 비교했다. 통계적 유의성에 대한 계산은 GraphPad Prism 7.0을 사용하여 결정했다. 차이는 P < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주했다.
실시예 2: 안구 질환의 치료를 위한 AKT3 유전자 요법
색소성 망막염의 Pde6b rd10 (rd10) 마우스 모델에서 AKT3 또는 caRheb 과발현의 효과
rd10 마우스 모델의 질병은 간상체 포스포다이에스터라제(PDE)의 β-서브유닛을 암호화하는 유전자의 점 돌연변이로 인해 발생하며, 이는 PDE 복합체를 비기능적으로 만들고 간상체 광변환 캐스케이드에서 차단을 생성한다. 또한, PDE는 cGMP를 GMP로 재순환하는 데 중요한 역할을 하여 전압-게이트 이온 채널의 폐쇄를 촉진한다. PDE 복합체 활성의 손실은 Na+ 및 Ca2+ 이온의 구성적 유입과 세포사 캐스케이드의 활성화를 촉진한다. Rd10 마우스는 출생 후 18일(PN18) 즈음에 시작하는 광수용체 외부 핵층(ONL)의 점진적인 박막화를 나타낸다. PN30까지 망막의 중심 및 주변 영역에서 상당한 광수용체 손실이 있으며 전형적으로 PN45에서 중심 망막에 비정상적인 원추 세포체의 일 층이 남아 있다. 아래에 설명된 연구에서는 시각 기능, 구조적 형태 및 광수용체 보존에 대한 AKT3 또는 Rheb 전달의 신경보호 가능성을 평가했다. 본 발명자들은 mTOR 활성화를 나타내는 마커의 발현을 조사하여 신경보호 효과의 잠재적 메커니즘을 추가로 조사했다. 또한, 본 발명자들은 AKT3 또는 Rheb 과발현이 망막 뉴런의 발암성 증식에 미치는 가능성과 관련하여 장기 안전성을 조사했다.
AAV7m8 벡터의 설계 및 특성화
AAV에서 유래한 유전자 전달 벡터는 신경 조직을 표적화하기 위한 최적의 유전자 전달 플랫폼으로 부각되었다. AAV7m8은 생체내 선택을 통해 생성된 AAV2의 변이체이며 향상된 망막 및 세포 형질도입 특성을 나타낸다. 본 발명자들은 인간 AKT3의 과활성 버전(AAV.AKT3), 구성적으로 활성인 Rheb 돌연변이체(AAV.caRheb), 및 대조군으로서 향상된 녹색 형광 단백질 리포터(AAV.eGFP)를 암호화하는 AAV7m8 벡터를 생성했다(도 1A). AKT3 전이유전자는 N-말단 미리스토일화(MYR) 서열을 함유하여 막 표적화 및 국재화를 향상시킨다. caRheb 전이유전자는 TSC 매개의 GTPase 활성화 단백질(GAP) 활성에 대한 저항성을 부여하는 표준 S16H 돌연변이를 함유한다. AAV.caRheb 또는 AAV.AKT3 벡터로 형질도입된 84-31 세포는 미처리 대조군과 비교하여 표적 유전자 mRNA의 강력한 발현을 나타낸다(도 1B 내지 도 1C). AAV7m8의 망막하 전달은 마우스 망막에서 광수용체, 망막 색소 상피(RPE), 및 뮐러 세포의 강력한 표지화를 초래한다(도 1D 내지 도 1E). 리포터 벡터와 실험 벡터의 공동주입은 처리된 망막 영역의 적절한 식별을 허용하는 망막하 전달 영역에 특이적으로 전이유전자 발현의 국재화를 초래한다(도 1G 내지 도 1H).
caRheb 유전자 전달은 Pde6brd10 마우스에서 망막 변성을 약화시키지 못한다
본 발명자들은 Pde6brd10 망막에서 caRheb 유전자 증강 효과를 조사했다. 동물은 간상체 사망이 시작되기 전의 시점인 PN13-14에서 eGFP를 함유하는 AAV와 함께 실험 전이유전자를 운반하는 AAV의 일측 망막하 주사를 받았다. 대조군으로는 eGFP 함유 AAV 단독 주사 또는 AAV 무주사를 포함했다. 주사 후 시각 기능은 망막전위도(ERG) 및 광운동 반응(OKR)으로 측정했다. 광수용체 생존에 대한 AAV.caRheb의 효과를 결정하기 위해 PN45에서 망막 조직학을 조사하였다(도 2A 내지 도 2C). 망막당 총 ONL 두께의 정량은 실험 처리 대 대조군 처리(미처리 또는 AAV.eGFP 단독 주사)에서 남아 있는 광수용체 세포체의 수에 있어서 유의미한 차이를 나타내지 않았다(도 2B). 총 ONL 두께 외에도 본 발명자들은 AAV.eGFP 단독으로 형질도입되거나 AAV.caRheb와 공동 형질도입된 망막 영역의 200㎛ 절편당 GFP+ ONL 세포의 수를 측정했다. 다시 한 번, 본 발명자들은 이들 그룹 사이의 ONL 세포 수에 있어서 통계적으로 유의미한 변화를 관찰하지 못했다(도 2C). 또한, AAV.caRheb는 각각 ERG(도 2d 내지 도 2F) 및 OKR(도 2G)로 측정 시, 대조군과 비교하여 망막 또는 시각 기능을 보존하지 못했다. 종합적으로, 이러한 데이터는 caRheb 유전자 전달이 Pde6brd10 마우스 망막에서 광수용체 신경보호를 촉진하지 않음을 시사한다.
AKT3 유전자 증강은 Pde6brd10 망막에서 광수용체 생존 및 구조적 보존을 촉진한다
본 발명자들은 Pde6brd10 망막에서 광수용체 생존 및 구조적 완전성에 대한 AKT3 유전자 증강 효과를 조사했다. PN13-14에서 AAV.AKT3을 주사한 후 PN30 및 PN45에서 망막 구조의 조직학적 분석은 특히 eGFP로 공동표지된 망막 영역에서 광수용체에 대한 강력한 신경보호 효과(치료군 사이의 면역염색 및 ONL 측정에 의해 반영됨)를 나타냈다(도 3C). 임의의 시점에서 미처리된 눈과 비교하여 AAV.GFP 주사된 눈에서 조직학적 구제의 증거는 없었다. 유지된 특정 유형의 광수용체를 탐침하기 위한 면역염색은 AAV.AKT3 벡터로 형질도입된 망막 영역에서 원추체 광수용체의 보존(원추체 어레스틴에 대한 염색에 의해 평가됨)을 나타내었다(도 3D 내지 도 3F). 유사하게, 로돕신에 대한 면역염색은 AAV.AKT3-형질도입된 영역에서 간상체 광수용체의 보존을 나타내었다(그러나 망막 또는 AAV.eGFP의 미노출 영역 또는 미처리된 대조군 망막에서는 나타나지 않음).
놀랍게도, 로돕신에 대한 면역염색은 또한 대조군과 비교하여 PN30 수확 지점에서 간상체 외부 분절의 향상된 보존을 나타내었고, 이는 간상체 광수용체 초미세구조의 생존 및 유지를 매개하는데 있어서 이 경로의 중요성을 시사한다(도 3A 내지 도 3C).
Pde6brd10 망막에서 망막 및 시각 기능에 대한 AKT3 유전자 전달의 효과
본 발명자들은 각각 망막전위도(ERG) 및 광운동 반응(OKR) 측정으로 PN30 및 PN45 시점에서 망막 및 시각 기능을 평가했다. AAV.AKT3으로 처리된 눈으로부터 혼합 간상체-원추체 반응의 분석은 PN30에서 미처리 대조군 및 AAV.eGFP 처리 대조군 둘 다에 비해 개선된 a-파 진폭(도 4A)을 나타냈다. 또한, AAV.AKT3으로 처리된 눈의 자극은 또한 AAV.eGFP 처리된 눈에 비해 증가된 혼합 b-파 반응(도 4B)을 유도했지만, 이 시점에서 미처리된 눈에 비해서는 증가된 보존에 대한 경향만을 나타냈다. 하지만, PN45에서 처리군 사이에 이러한 결과 측정에서 유의미한 차이는 없었다(도 4A 내지 도 4B). 본 발명자들은 또한 원추체 특이적 b-파 반응을 측정했지만 테스트된 임의의 시점에서도 처리 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이는 관찰되지 않았다(도 4C). 본 발명자들은 광운동 반응(OKR)을 측정하여 유전자 전달에 대한 반응으로 시력을 조사했다. 데이터는 미처리된 좌안이 동물내 대조군으로서 역할을 하는 반면, 우안은 AAV.eGFP 단독 또는 AAV.AKT3과의 조합으로 처리된 기록들의 우안/좌안 비율을 나타낸다. AAV.AKT3/AAV.eGFP를 사용한 처리는 임의의 시점에서 AAV.eGFP 대조군에 비해 시력을 보존하지 않았다(도 4D). 종합적으로, 이 데이터는 AKT3 유전자 전달이 초기-중기 질환 동안 세포 생존 및 일부 기능을 연장시키지만 장기간 유지에는 불충분할 수 있음을 나타낸다.
AKT3 유전자 증강은 생합성 및 세포 생존 경로를 자극한다
본 발명자들은 AKT3 유도 신경보호 반응이 동화작용 및 세포 생존과 관련된 경로를 활성화한다고 가정했다. 이 가능성을 평가하기 위해 본 발명자들은 mTOR 활성화를 나타내는 표준 하류 마커에 대해 지향성인 항체로 망막 절편을 면역염색했다(도 5A 내지 도 5H). AAV.AKT3으로 특이적으로 형질도입된 망막 영역은 미노출 또는 미처리 망막에 비해 인산화된 리보솜 단백질 S6(pS6)의 향상된 발현을 입증한다(도 5E 내지 도 5H). 흥미롭게도, 본 발명자들은 또한 AAV.AKT3에 특이적으로 노출된 영역 내에서 mTORC2 마커(pAKTS473)의 증가된 발현을 관찰했으며, 이는 세포 생존 및 스트레스 저항성과 관련된 추가 기능의 자극을 시사한다(도 5A 내지 도 5D). 미처리 및 AAV.GFP 대조군으로부터 수득된 망막 절편은 상기 마커들의 향상된 발현을 나타내지 않았고, 이는 AKT3-유도된 신경보호가 적어도 부분적으로 mTORC1 및 mTORC2 경로 둘 모두에 의해 유도됨을 암시한다(도 5D 및 도 5H).
AKT3 과발현은 광수용체 정지를 깨뜨리지 않지만 뮐러 세포 활성화를 자극한다
조절되지 않는 AKT 신호전달은 많은 인간 암의 일반적인 특징이다. 본 발명자들은 세포 증식의 표준 마커로 면역염색하여 망막 정지에 대한 AKT3 유전자 전달의 효과를 조사했다. Ki67의 발현은 미처리 및 AAV.eGFP 처리된 Pde6brd10 망막에서 신경절 세포층을 차지하고 있는 세포에 제한되었다.
GFAP에 대한 항체를 사용한 공동염색은 이 Ki67+ 세포 집단을 뮐러 신경교(Muller glia)로서 식별했다. 항상성 조건에서 이들 세포는 신경영양 인자 방출, 세포외 이온 균형 조절 및 파편 제거를 매개하여 다른 망막 세포 유형에 구조적 및 대사적 지원을 제공한다. 중요하게는, ONL을 차지하는 세포는 Ki67 마커에 대해 양성 면역반응성을 나타내지 않았으며, 이는 AKT3-유도된 보호 반응이 광수용체 정지 탈출의 부산물이 아니었음을 시사한다(도 6H 및 도 6I). 흥미롭게도, AAV.AKT3으로 특이적으로 형질도입된 망막 영역 내의 뮐러 세포는 GFAP 발현의 상향 조절 및 상이한 망막 층 전반에 걸친 신경 과정의 확장과 같은 성상교세포증을 나타내는 형태학적 변화를 입증한다(도 6G 내지 도 6I). 유사하게, 본 발명자들은 우리의 벡터 패널이 주입된 야생형 동물에서 이들 마커의 발현을 조사했다. 야생형 동물은 PN13에서 망막하 주사를 받았고 PN125에서 조직학적 분석에 대해 추적조사되었다. 본 발명자들은 리포터 벡터 단독의 장기간 과발현을 보유하는 동물에서 구조적 또는 세포적 변화를 관찰하지 못했다(도 11A 내지 도 11B). 이와 반대로, 편재적인 AAV.AKT3 벡터로 처리된 동물은 광범위한 망막 분열 및 광수용체 구조 마커의 손실을 나타낸다(도 11 내지 도 11D). 또한, AAV.AKT3 벡터로 특이적으로 형질도입된 영역은 또한 미처리 망막 및 AAV.eGFP 처리된 망막과 비교하여 뮐러 세포의 만성 활성화를 나타낸다(도 7A 내지 도 7K).
AKT3의 광수용체-제한된 발현은 Pde6b rd10 망막에서 신경보호 효과를 매개한다
본 발명자들은 이전에 기술된 GRK1 프로모터에 의해 구동되는 AAV 벡터를 생성함으로써 광수용체 내에서 AKT3 매개 신경보호의 효과를 구체적으로 조사했다(도 8A). Pde6brd10 망막 내에서 이들 벡터의 적용은 편재적인 CAG 프로모터에 의해 구동되는 전술한 벡터와 유사한 망막 기능에 대한 효과를 발휘했다(도 8B 내지 도 8D). 특히, AAV.GRK1.AKT3 처리는 PN30에서 혼합 a-파 및 b-파 진폭을 보존했지만 PN45에서 진행기 변성에서는 보존되지 않았다. 이전 발견과 유사하게, 이들 벡터는 대조군 처리와 비교하여 원추체-특이적 b파 진폭의 보존을 매개하지 않았다. 조직학 수준에서, 이들 벡터는 광수용체 내에서 특정 전이유전자 발현을 입증한다(도 8E). 더욱이, AAV.GRK1.AKT3은 또한 미처리 및 AAV.eGFP 처리 대조군 눈에 비해 광수용체 생존을 개선시켰다(도 8F).
광수용체 특이적 프로모터에 의해 조절되는 AKT3 벡터는 Pde6b rd10 망막에서 반응성 신경교증을 자극하지 않는다
본 발명자들은 GRK1 구동 벡터를 가지고 광수용체 층에 AKT3 전이유전자 발현을 제한하는 것이 이전에 관찰했던 만성 뮐러 세포 활성화를 편재적 CAG 프로모터에 의해 조절되는 AKT3 벡터로 약화시킬 수 있다고 가정했다. 다시 한번, 본 발명자들은 AAV.GRK1.AKT3 및 추적자 벡터가 공동주입된 PN45 Pde6brd10 마우스에서 유래된 망막 절편을 GFAP 및 Ki67에 대해 지향성인 항체로 면역염색했다(도 9A 내지 도 9H). AAV.GRK1.AKT3에 의한 처리는 미처리 샘플과 비교하여 Pde6brd10에서 뮐러 세포의 비정상적인 활성화 및 이동을 나타내지 않았다(도 9A 내지 도 9F).
또한, 미처리 망막 영역과 망막하 주사 부위 사이의 전이 영역은 유사한 조직학적 발견을 나타내는데, 이는 광수용체-제한된 AKT3 유전자 전달이 편재적 벡터 시스템으로 이전에 관찰된 뮐러 세포의 만성 활성화를 완화시킨다는 것을 추가로 시사한다(도 9G 및 도 9H). 이러한 결과는 신경보호 유전자 전달 전략과 관련된 잠재적으로 해로운 표적외 효과를 우회하는 세포 및 조직 특이적 프로모터의 중요성을 강조한다.
실시예 3: AAV-매개 유전자 전달에 의한 mTOR 경로의 자극
상기 실시예 2에 기술된 연구는 AAV-매개 유전자 전달에 의한 mTOR 경로의 자극 후 RP의 동물 모델에서 세포 대사를 재프로그래밍하는 치료 가능성을 입증한다. 신경퇴행성 질환의 맥락에서 mTOR 신호전달의 정확한 역할은 논쟁의 주제로 남아 있다. 표준 mTOR 저해제인 라파마이신으로의 치료를 통한 mTOR 활성의 하향 조절은 파킨슨병, 헌팅턴병 및 알츠하이머병을 비롯한 여러 신경변성 모델에서 병리학적 메커니즘을 약화시킬 수 있다. 반대로, 다른 조사는 인슐린/AKT/mTOR 축의 자극이 관련 신경변성 질환 모델에서 유익한 결과를 중재할 수 있음을 시사한다. 위에서 설명한 연구에서 2개의 별개의 조절 지점에서 mTOR 경로를 표적으로 하는 것은 광수용체 생존, 구조적 완전성 및 망막 기능에 대한 다양한 효과를 야기했다.
여러 이전 연구는 신경변성 질환 모델의 상황에서 치료 결과를 개선하기 위해 Rheb 활성화를 표적으로 하는 보호 가능성을 강조했다. 그러나, caRheb 유전자 전달로 이 하류 조절 지점에서 mTOR 경로를 자극하는 것은 Pde6brd10 망막에서 보호 효과를 매개하지 않았다. 흥미롭게도, AAV.caRheb 벡터는 시험관내에서 mTORC1 활성의 강력한 자극을 입증하였으며, 이는 표준 mTORC1 활성화 마커인 pS6의 향상된 발현을 나타낸다. 이 활성은 caRheb 전이유전자를 과발현하는 망막 절편에서 pS6에 대한 음성 면역염색에 의해 나타나는 바와 같이 생체내에서 해독되지 않았다. 이는 광수용체 내에서 mTORC1을 자극하는 caRheb의 능력을 저해하는 고유 메커니즘의 존재를 시사한다(도 10A 및 10b). 이러한 관찰은 caRheb 유전자 전달이 다양한 뉴런 집단 내에서 mTORC1 활성을 자극하고 파킨슨병, 헌팅턴병 및 시신경 외상 모델에서 스트레스 저항성을 부여한 이전 연구에서 보고된 것과 다르다. 다른 계통의 증거는 Rheb가 다양한 형태의 세포 스트레스에 대한 반응으로 세포 사망 신호전달 프로그램을 촉진하는 데 경쟁적인 역할을 할 수 있음을 시사한다. Rheb 과발현과 조합된 UV 또는 TNFα 유도 세포 스트레스는 시험관내 아폽토시스 신호전달을 향상시킨 반면, Rheb 녹다운 또는 라파마이신 처리는 이러한 세포독성제로부터 부분적인 보호를 제공했다. 망막 변성의 상황에서, 망막 신경절 세포(RGC)의 광-유도 손상은 변성 전에 아폽토시스 마커의 증가와 관련된 Rheb 발현의 상향 조절을 초래했다. 종합하면, Rheb의 보호 기능 또는 아폽토시스 촉진 기능은 문제의 특정 병리학을 통해 도출된 메커니즘에 의해 결정될 가능성이 있다. 또한, 유전자 전달에 의한 Rheb 활성의 증폭은 특정 질병 상황에 따라 세포 생물학에 대한 다양한 효과를 조절할 가능성이 있다.
또한, AAV 매개 AKT3 유전자 전달은 광수용체 생존 및 형태학적 보존에 대한 강력한 신경보호 효과를 자극했다. 이 보호 효과는 AAV.AKT3 벡터로 특이적으로 형질도입된 망막 영역에서 mTORC1 및 mTORC2의 자극과 관련이 있었다. 우리의 발견은 광수용체 신경보호와 관련된 mTORC2 신호전달 활성의 상향조절을 보고한 것 사례이다. 이 데이터는 mTORC2 활성이 Pten의 트랜스제닉 절제 후 감소했고 Pde6brd1 마우스 망막에서 원추체 생존을 향상시켰다는 점에서 Venkatesh et al.(2015)의 이전 관찰과 차이가 있다.
AKT3 유전자 전달에 의해 매개되는 극적인 세포 보존에도 불구하고 본 발명자들은 망막전위도 및 OKR에 의한 평가 후 기능적 보존에 대한 차별적인 효과를 관찰했다. 본 발명자들은 PN30 측정에서 CAG 또는 GRK1 프로모터 구동 AKT3 벡터로 처리된 눈에서 혼합 간상체-원추체 a-파 및 일부 경우에 b-파 반응의 통계적으로 유의미한 보존을 관찰했지만, 후기 변성 중에는 보존되지 않았다. AKT3 전이유전자 발현이 있는 원추체 구조의 형태학적 보존에도 불구하고, 본 발명자들은 테스트된 임의의 시점에서 대조군과 비교하여 원추체-특이적 광 반응의 개선을 관찰하지 못했다. 이 발견은 유사한 질병 모델에서 원추체 광수용체 신경보호 전략을 검사한 이전 조사와 차이가 있다. 이러한 차이는 전이유전자 카세트뿐만 아니라 벡터 용량, 주사 경로, 모델 시스템과 관련된 변성 동역학 및 벡터 전달 시기에 대한 연구 설계의 변경에 의해 설명될 수 있다. 현재 연구에서 벡터는 광수용체 사망이 시작되기 직전 시점에 주사되었지만, 이전 조사에서는 출생 직후와 망막 성숙 및 질병 메커니즘이 시작되기 전에 실험적 개입을 시행했다. 실험 설계의 이러한 차이는 망막 커버리지(coverage), 벡터 모집의 동역학 및 신경변성 기전의 시작과 관련된 발현 및 궁극적으로 치료 결과 측정에 적절한 중요한 하류 연루성이 있을 가능성이 있다.
세포 대사를 재프로그래밍하는 전략에 기반한 유전자 요법의 발전은 임상 해독에 앞서 매우 엄격한 안전 기준을 충족해야 한다. 본 발명자들은 종양 형성의 증거를 관찰하지 못했지만 야생형 동물에서 편재적 프로모터에 의해 조절된 AKT3의 장기간 과발현은 광범위한 망막 분열과 궁극적으로 광수용체의 손실을 초래했다. 이 표현형은 야생형 및 Pde6brd10 동물에서 관찰되는 편재적 벡터로 특이적으로 형질도입된 망막 영역에서 뮐러 세포의 만성 활성화에 상응했다. 반응성 신경교증은 전형적으로 이러한 세포가 활성화되기 시작하고 증식하여 조직 리모델링, 신경영양 인자 방출, 세포 파편 소거를 비롯한 다양한 기능을 매개하는 조직 손상과 관련된 반응이다. 이 반응은 추가의 망막 손상을 억제하기 위한 것이지만, 만성 활성화는 이웃 세포에 해로울 수 있고 망막 항상성을 방해할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 뮐러 세포는 종양 괴사 인자(TNF) 및 단핵구 화학유인 단백질(MCP-1)을 비롯한 다양한 전염증성 분자의 발현 및 분비를 상향조절하는 것으로 관찰되었다.
또한, 이들은 인접 세포에 손상을 줄 수 있는 자유 라디칼을 생성하는 산화질소(NO)를 과량으로 분비하는 것으로 알려져 있다41. 이 발견은 세포가 정확한 생리학적 요구를 수용하기 위해 이러한 대사 성분의 섬세한 균형을 필요로 하고 그러한 경로의 과도한 자극이 세포 생존에 해로운 영향을 줄 가능성이 있기 때문에 놀랍지 않았다. 유전자 증강 또는 침묵 전략에 의해 이러한 균형을 결정하고 달성하는 것은 이러한 접근 방식을 임상으로 해독하는 데 있어 엄청난 도전일 것이다.
세포 특이적 프로모터(여기에 나타낸 것으로서), 스트레스 반응 프로모터 또는 유도성 시스템과 같은 추가 조절 요소는 강력한 대사 경로를 자극하는 신경보호 유전자 전달 전략의 임상 개발에서 중요한 역할을 할 것이다.
종합적으로, 이 조사는 유전성 망막 변성 모델에서 유전자 증강 후 광수용체 생존력 및 구조에 대한 광범위한 보호 효과를 입증한다. 이러한 발견은 광수용체 생존 및 유지에서 동화작용 대사와 관련된 AKT 활성 및 하류 경로의 중요성을 강조한다. 또한, 이 결과는 재프로그래밍 세포 대사의 복잡하고 섬세한 특성뿐만 아니라 "보편적" 유전자 요법 전략에 의해 복잡한 신경변성 질환의 진행을 저해하는 데 있어서 중요한 안전 문제를 역설한다.
(서열 목록 자유 텍스트)
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본 명세서에 언급된 모든 문서는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 2019년 3월 4일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/813,587호 및 2019년 3월 21일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/821,705호는 이들의 서열 목록과 함께 그 전문이 참조에 의해 원용된다. "18-8380PCT_ST25.txt"라는 표지가 붙은 본 명세서와 함께 제출된 서열 목록과 그 안의 서열 및 텍스트는 참조에 의해 원용된다. 본 발명은 특정 실시형태를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 사상을 벗어남이 없이 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 수정은 첨부된 청구항의 범위에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> NEUROPROTECTION GENE THERAPY TARGETING THE AKT PATHWAY <130> 18-8380PCT <140> PCT/US2020/020832 <141> 2020-03-03 <150> US 62/813,587 <151> 2019-03-04 <150> US 62/821,705 <151> 2019-03-21 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11670 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1253)..(1382) <223> 5' ITR <220> <221> misc_feature <222> (1443)..(3104) <223> CMV/CBA Hybrid Promoter <220> <221> misc_feature <222> (3121)..(3129) <223> Kozak <220> <221> misc_feature <222> (3130)..(3156) <223> Myr tag <220> <221> misc_feature <222> (3175)..(3201) <223> HA <220> <221> CDS <222> (3214)..(4653) <223> hAKT3 (isoform 1) <220> <221> misc_feature <222> (4672)..(4893) <223> BGH PolA <220> <221> misc_feature <222> (4941)..(5070) <223> 3' ITR <400> 1 tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata 60 ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 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Met Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn Ile Gly Glu 115 120 125 130 gaa gag atg gat gcc tct aca acc cat cat aaa aga aag aca atg aat 2470 Glu Glu Met Asp Ala Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys Thr Met Asn 135 140 145 gat ttt gac tat ttg aaa cta cta ggt aaa ggc act ttt ggg aaa gtt 2518 Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly Lys Val 150 155 160 att ttg gtt cga gag aag gca agt gga aaa tac tat gct atg aag att 2566 Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Lys Ile 165 170 175 ctg aag aaa gaa gtc att att gca aag gat gaa gtg gca cac act cta 2614 Leu Lys Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr Leu 180 185 190 act gaa agc aga gta tta aag aac act aga cat ccc ttt tta aca tcc 2662 Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe Leu Thr Ser 195 200 205 210 ttg aaa tat tcc ttc cag aca aaa gac cgt ttg tgt ttt gtg atg gaa 2710 Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Val Met Glu 215 220 225 tat gtt aat ggg ggc gag ctg ttt ttc cat ttg tcg aga 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tac aac cag gac cat gag aaa ctt 3094 Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys Leu 340 345 350 ttt gaa tta ata tta atg gaa gac att aaa ttt cct cga aca ctc tct 3142 Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg Thr Leu Ser 355 360 365 370 tca gat gca aaa tca ttg ctt tca ggg ctc ttg ata aag gat cca aat 3190 Ser Asp Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys Asp Pro Asn 375 380 385 aaa cgc ctt ggt gga gga cca gat gat gca aaa gaa att atg aga cac 3238 Lys Arg Leu Gly Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile Met Arg His 390 395 400 agt ttc ttc tct gga gta aac tgg caa gat gta tat gat aaa aag ctt 3286 Ser Phe Phe Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp Lys Lys Leu 405 410 415 gta cct cct ttt aaa cct caa gta aca tct gag aca gat act aga tat 3334 Val Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr Arg Tyr 420 425 430 ttt gat gaa gaa ttt aca gct cag act att aca ata aca cca cct gaa 3382 Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr Pro Pro Glu 435 440 445 450 aaa tat 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ccatgcatca 540 tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagtggca taaattccgt cagccagttt 600 agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac 660 aactctggcg catcgggctt cccatacaag cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca 720 ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc 780 ctcgacgttt cccgttgaat atggctcata ttcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 840 tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 900 ataggggtca gtgttacaac caattaacca attctgaaca ttatcgcgag cccatttata 960 cctgaatatg gctcataaca ccccttgttt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc 1020 tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggactcc 1080 ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact 1140 gggcctttcg cccgggctaa ttagggggtg tcgcccttat tcgactctat agtgaagttc 1200 ctattctcta gaaagtatag gaacttctga agtggggtcg acttaattaa ggctgcgcgc 1260 tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 1320 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 1380 cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta cttatctacg tagcaagcta gctagttatt 1440 aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 1500 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 1560 taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 1620 agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 1680 cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 1740 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt aacatggtcg 1800 aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt 1860 tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc 1920 gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg 1980 cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc 2040 ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac gctgccttcg 2100 ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt 2160 actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt 2220 ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg 2280 ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg tggggagcgc 2340 cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg 2400 tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg 2460 gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg 2520 tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag ttgctgagca 2580 cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg ccgtgccggg 2640 cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg ccggggaggg 2700 ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg cggcgagccg 2760 cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt tgtcccaaat 2820 ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc gcggggcgaa 2880 gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt cgccgcgccg 2940 ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct gccttcgggg 3000 gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta gacaattgta 3060 ctaaccttct tctctttcct ctcctgacag gttggtgtac actagcggcc gccacc atg 3119 Met 1 agc gac gtg acc att gtg aag gaa ggc tgg gtg cag aag cgg gga gag 3167 Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg Gly Glu 5 10 15 tac atc aag aac tgg agg cct cgg tac ttt ctg ctt aag acc gat ggc 3215 Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Thr Asp Gly 20 25 30 tcc ttt atc ggt tac aag gaa aag ccg cag gac gtg gac ctt ccg tac 3263 Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val Asp Leu Pro Tyr 35 40 45 cct ctg aac aac ttc tcc gtg gca aag tgt cag ctt atg aaa acc gaa 3311 Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln Leu Met Lys Thr Glu 50 55 60 65 cgc ccc aag ccg aac acg ttt atc att cga tgc ctg cag tgg acc acc 3359 Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp Thr Thr 70 75 80 gtg att gaa cgg acc ttc cat gtg gat acc cca gag gag aga gaa gag 3407 Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Thr Pro Glu Glu Arg Glu Glu 85 90 95 tgg aca gaa gcc atc cag gca gtg gct gat cgg ctg cag aga cag gaa 3455 Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val Ala Asp Arg Leu Gln Arg Gln Glu 100 105 110 gag gaa cgg atg aac tgc tca ccc act tca caa atc gac aat atc gga 3503 Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn Ile Gly 115 120 125 gag gag gag atg gac gcc agc acc acc cac cac aag aga aag acc atg 3551 Glu Glu Glu Met Asp Ala Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys Thr Met 130 135 140 145 aac gac ttc gac tac ctg aag ctc ctg ggc aaa ggg acc ttc gga aag 3599 Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly Lys 150 155 160 gtc atc ctg gtc cgg gaa aag gcc tcc gga aag tac tac gcc atg aag 3647 Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Lys 165 170 175 atc ctg aag aag gag gtc atc att gcc aag gac gaa gtg gcc cac act 3695 Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr 180 185 190 ctg act gag tcc agg gtc ctc aag aac act cgg cac ccc ttc ctc acc 3743 Leu Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe Leu Thr 195 200 205 tcg ctg aag tac agc ttc caa acc aag gat aga ctg tgc ttc gtg atg 3791 Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Val Met 210 215 220 225 gaa tac gtc aac gga ggg gag ctg ttc ttc cac ctt tcc cgc gaa cgg 3839 Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu Arg 230 235 240 gtg ttc tca gaa gat cgc acc cgg ttc tac ggt gcc gag att gtt tcc 3887 Val Phe Ser Glu Asp Arg Thr Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val Ser 245 250 255 gcg ttg gac tac ctc cac tcg gga aag atc gtg tac cgg gac ctg aag 3935 Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Gly Lys Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys 260 265 270 ctg gaa aac ctc atg ctc gac aag gat ggc cac atc aag atc acc gac 3983 Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr Asp 275 280 285 ttc ggc ctg tgc aag gaa ggg atc act gac gcg gca act atg aaa acc 4031 Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Thr Asp Ala Ala Thr Met Lys Thr 290 295 300 305 ttc tgt ggc acc cct gaa tac ctc gcg ccg gaa gtg ctg gag gat aac 4079 Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp Asn 310 315 320 gac tat gga cgc gct gtg gat tgg tgg ggc ctg gga gtc gtg atg tac 4127 Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met Tyr 325 330 335 gag atg atg tgc gga cgc ttg ccc ttc tac aac cag gac cac gag aag 4175 Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys 340 345 350 ctg ttc gaa ttg atc ctg atg gag gat atc aag ttc ccg cgc act ctg 4223 Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg Thr Leu 355 360 365 tcg tcc gac gct aaa agc ctg ctg agc gga ctg ctg atc aag gac cct 4271 Ser Ser Asp Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys Asp Pro 370 375 380 385 aac aag cgc ctc gga ggt ggt cct gac gat gcc aag gag att atg cgg 4319 Asn Lys Arg Leu Gly Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile Met Arg 390 395 400 cac tcc ttc ttc tcg ggc gtg aat tgg cag gat gtg tac gac aag aag 4367 His Ser Phe Phe Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp Lys Lys 405 410 415 ctc gtg ccg cca ttc aag ccc caa gtc act tcc gaa acg gac act cgg 4415 Leu Val Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr Arg 420 425 430 tac ttc gac gag gag ttc acc gcc caa acc atc act att acc ccc ccc 4463 Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr Pro Pro 435 440 445 gag aaa tac gac gag gat ggg atg gac tgc atg gac aac gaa cgc cgg 4511 Glu Lys Tyr Asp Glu Asp Gly Met Asp Cys Met Asp Asn Glu Arg Arg 450 455 460 465 cca cat ttt ccg caa ttc tcc tat tct gcc tcc gga agg gag tga 4556 Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Arg Glu 470 475 agatctgcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 4616 ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 4676 gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 4736 aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg actcgagttc tacgtagata 4796 agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc 4856 cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg 4916 gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ccttaattaa cctaaggaaa 4976 atgaagtgaa gttcctatac tttctagaga ataggaactt ctatagtgag tcgaataagg 5036 gcgacacaaa atttattcta aatgcataat aaatactgat aacatcttat agtttgtatt 5096 atattttgta ttatcgttga catgtataat tttgatatca aaaactgatt ttccctttat 5156 tattttcgag atttattttc ttaattctct ttaacaaact agaaatattg tatatacaaa 5216 aaatcataaa taatagatga atagtttaat tataggtgtt catcaatcga aaaagcaacg 5276 tatcttattt aaagtgcgtt gcttttttct catttataag gttaaataat tctcatatat 5336 caagcaaagt gacaggcgcc cttaaatatt ctgacaaatg ctctttccct aaactccccc 5396 cataaaaaaa cccgccgaag cgggttttta cgttatttgc ggattaacga ttactcgtta 5456 tcagaaccgc ccagggggcc cgagcttaac ctttttattt gggggagagg gaagtcatga 5516 aaaaactaac ctttgaaatt cgatctccag cacatcagca aaacgctatt cacgcagtac 5576 agcaaatcct tccagaccca accaaaccaa tcgtagtaac cattcaggaa cgcaaccgca 5636 gcttagacca aaacaggaag ctatgggcct gcttaggtga cgtctctcgt caggttgaat 5696 ggcatggtcg ctggctggat gcagaaagct ggaagtgtgt gtttaccgca gcattaaagc 5756 agcaggatgt tgttcctaac cttgccggga atggctttgt ggtaataggc cagtcaacca 5816 gcaggatgcg tgtaggcgaa tttgcggagc tattagagct tatacaggca ttcggtacag 5876 agcgtggcgt taagtggtca gacgaagcga gactggctct ggagtggaaa gcgagatggg 5936 gagacagggc tgcatgataa atgtcgttag tttctccggt ggcaggacgt cagcatattt 5996 gctctggcta atggagcaaa agcgacgggc aggtaaagac gtgcattacg ttttcatgga 6056 tacaggttgt gaacatccaa tgacatatcg gtttgtcagg gaagttgtga agttctggga 6116 tataccgctc accgtattgc aggttgatat caacccggag cttggacagc caaatggtta 6176 tacggtatgg gaaccaaagg atattcagac gcgaatgcct gttctgaagc catttatcga 6236 tatggtaaag aaatatggca ctccatacgt cggcggcgcg ttctgcactg acagattaaa 6296 actcgttccc ttcaccaaat actgtgatga ccatttcggg cgagggaatt acaccacgtg 6356 gattggcatc agagctgatg aaccgaagcg gctaaagcca aagcctggaa tcagatatct 6416 tgctgaactg tcagactttg agaaggaaga tatcctcgca tggtggaagc aacaaccatt 6476 cgatttgcaa ataccggaac atctcggtaa ctgcatattc tgcattaaaa aatcaacgca 6536 aaaaatcgga cttgcctgca aagatgagga gggattgcag cgtgttttta atgaggtcat 6596 cacgggatcc catgtgcgtg acggacatcg ggaaacgcca aaggagatta tgtaccgagg 6656 aagaatgtcg ctggacggta tcgcgaaaat gtattcagaa aatgattatc aagccctgta 6716 tcaggacatg gtacgagcta aaagattcga taccggctct tgttctgagt catgcgaaat 6776 atttggaggg cagcttgatt tcgacttcgg gagggaagct gcatgatgcg atgttatcgg 6836 tgcggtgaat gcaaagaaga taaccgcttc cgaccaaatc aaccttactg gaatcgatgg 6896 tgtctccggt gtgaaagaac accaacaggg gtgttaccac taccgcagga aaaggaggac 6956 gtgtggcgag acagcgacga agtatcaccg acataatctg cgaaaactgc aaataccttc 7016 caacgaaacg caccagaaat aaacccaagc caatcccaaa agaatctgac gtaaaaacct 7076 tcaactacac ggctcacctg tgggatatcc ggtggctaag acgtcgtgcg aggaaaacaa 7136 ggtgattgac caaaatcgaa gttacgaaca agaaagcgtc gagcgagctt taacgtgcgc 7196 taactgcggt cagaagctgc atgtgctgga agttcacgtg tgtgagcact gctgcgcaga 7256 actgatgagc gatccgaata gctcgatgca cgaggaagaa gatgatggct aaaccagcgc 7316 gaagacgatg taaaaacgat gaatgccggg aatggtttca ccctgcattc gctaatcagt 7376 ggtggtgctc tccagagtgt ggaaccaaga tagcactcga acgacgaagt aaagaacgcg 7436 aaaaagcgga aaaagcagca gagaagaaac gacgacgaga ggagcagaaa cagaaagata 7496 aacttaagat tcgaaaactc gccttaaagc cccgcagtta ctggattaaa caagcccaac 7556 aagccgtaaa cgccttcatc agagaaagag accgcgactt accatgtatc tcgtgcggaa 7616 cgctcacgtc tgctcagtgg gatgccggac attaccggac aactgctgcg gcacctcaac 7676 tccgatttaa tgaacgcaat attcacaagc aatgcgtggt gtgcaaccag cacaaaagcg 7736 gaaatctcgt tccgtatcgc gtcgaactga ttagccgcat cgggcaggaa gcagtagacg 7796 aaatcgaatc aaaccataac cgccatcgct ggactatcga agagtgcaag gcgatcaagg 7856 cagagtacca acagaaactc aaagacctgc gaaatagcag aagtgaggcc gcatgacgtt 7916 ctcagtaaaa accattccag acatgctcgt tgaagcatac ggaaatcaga cagaagtagc 7976 acgcagactg aaatgtagtc gcggtacggt cagaaaatac gttgatgata aagacgggaa 8036 aatgcacgcc atcgtcaacg acgttctcat ggttcatcgc ggatggagtg aaagagatgc 8096 gctattacga aaaaattgat ggcagcaaat accgaaatat ttgggtagtt ggcgatctgc 8156 acggatgcta cacgaacctg atgaacaaac tggatacgat tggattcgac aacaaaaaag 8216 acctgcttat ctcggtgggc gatttggttg atcgtggtgc agagaacgtt gaatgcctgg 8276 aattaatcac attcccctgg ttcagagctg tacgtggaaa ccatgagcaa atgatgattg 8336 atggcttatc agagcgtgga aacgttaatc actggctgct taatggcggt ggctggttct 8396 ttaatctcga ttacgacaaa gaaattctgg ctaaagctct tgcccataaa gcagatgaac 8456 ttccgttaat catcgaactg gtgagcaaag ataaaaaata tgttatctgc cacgccgatt 8516 atccctttga cgaatacgag tttggaaagc cagttgatca tcagcaggta atctggaacc 8576 gcgaacgaat cagcaactca caaaacggga tcgtgaaaga aatcaaaggc gcggacacgt 8636 tcatctttgg tcatacgcca gcagtgaaac cactcaagtt tgccaaccaa atgtatatcg 8696 ataccggcgc agtgttctgc ggaaacctaa cattgattca ggtacaggga gaaggcgcat 8756 gagactcgaa agcgtagcta aatttcattc gccaaaaagc ccgatgatga gcgactcacc 8816 acgggccacg gcttctgact ctctttccgg tactgatgtg atggctgcta tggggatggc 8876 gcaatcacaa gccggattcg gtatggctgc attctgcggt aagcacgaac tcagccagaa 8936 cgacaaacaa aaggctatca actatctgat gcaatttgca cacaaggtat cggggaaata 8996 ccgtggtgtg gcaaagcttg aaggaaatac taaggcaaag gtactgcaag tgctcgcaac 9056 attcgcttat gcggattatt gccgtagtgc cgcgacgccg ggggcaagat gcagagattg 9116 ccatggtaca ggccgtgcgg ttgatattgc caaaacagag ctgtggggga gagttgtcga 9176 gaaagagtgc ggaagatgca aaggcgtcgg ctattcaagg atgccagcaa gcgcagcata 9236 tcgcgctgtg acgatgctaa tcccaaacct tacccaaccc acctggtcac gcactgttaa 9296 gccgctgtat gacgctctgg tggtgcaatg ccacaaagaa gagtcaatcg cagacaacat 9356 tttgaatgcg gtcacacgtt agcagcatga ttgccacgga tggcaacata ttaacggcat 9416 gatattgact tattgaataa aattgggtaa atttgactca acgatgggtt aattcgctcg 9476 ttgtggtagt gagatgaaaa gaggcggcgc ttactaccga ttccgcctag ttggtcactt 9536 cgacgtatcg tctggaactc caaccatcgc aggcagagag gtctgcaaaa tgcaatcccg 9596 aaacagttcg caggtaatag ttagagcctg cataacggtt tcgggatttt ttatatctgc 9656 acaacaggta agagcattga gtcgataatc gtgaagagtc ggcgagcctg gttagccagt 9716 gctctttccg ttgtgctgaa ttaagcgaat accggaagca gaaccggatc accaaatgcg 9776 tacaggcgtc atcgccgccc agcaacagca caacccaaac tgagccgtag ccactgtctg 9836 tcctgaattc attagtaata gttacgctgc ggccttttac acatgacctt cgtgaaagcg 9896 ggtggcagga ggtcgcgcta acaacctcct gccgttttgc ccgtgcatat cggtcacgaa 9956 caaatctgat tactaaacac agtagcctgg atttgttcta tcagtaatcg accttattcc 10016 taattaaata gagcaaatcc ccttattggg ggtaagacat gaagatgcca gaaaaacatg 10076 acctgttggc cgccattctc gcggcaaagg aacaaggcat cggggcaatc cttgcgtttg 10136 caatggcgta ccttcgcggc agatataatg gcggtgcgtt tacaaaaaca gtaatcgacg 10196 caacgatgtg cgccattatc gcctggttca ttcgtgacct tctcgacttc gccggactaa 10256 gtagcaatct cgcttatata acgagcgtgt ttatcggcta catcggtact gactcgattg 10316 gttcgcttat caaacgcttc gctgctaaaa aagccggagt agaagatggt agaaatcaat 10376 aatcaacgta aggcgttcct cgatatgctg gcgtggtcgg agggaactga taacggacgt 10436 cagaaaacca gaaatcatgg ttatgacgtc attgtaggcg gagagctatt tactgattac 10496 tccgatcacc ctcgcaaact tgtcacgcta aacccaaaac tcaaatcaac aggcgcttaa 10556 gactggccgt cgttttacaa cacagaaaga gtttgtagaa acgcaaaaag gccatccgtc 10616 aggggccttc tgcttagttt gatgcctggc agttccctac tctcgccttc cgcttcctcg 10676 ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 10736 gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 10796 ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 10856 cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 10916 ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 10976 accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 11036 catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 11096 gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 11156 tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 11216 agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtgggctaa ctacggctac 11276 actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 11336 gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 11396 aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 11456 gggtctgacg ctcagtggaa cgacgcgcgc gtaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 11516 gcttgcgccg tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgcttt 11556 <210> 6 <211> 479 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Thr Asp 20 25 30 Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val Asp Leu Pro 35 40 45 Tyr Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln Leu Met Lys Thr 50 55 60 Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp Thr 65 70 75 80 Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Thr Pro Glu Glu Arg Glu 85 90 95 Glu Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val Ala Asp Arg Leu Gln Arg Gln 100 105 110 Glu Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn Ile 115 120 125 Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys Thr 130 135 140 Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly 145 150 155 160 Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met 165 170 175 Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala His 180 185 190 Thr Leu Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe Leu 195 200 205 Thr Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Val 210 215 220 Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu 225 230 235 240 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cca gag gtg tta gaa gat 960 Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp 305 310 315 320 aat gac tat ggc cga gca gta gac tgg tgg ggc cta ggg gtt gtc atg 1008 Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met 325 330 335 tat gaa atg atg tgt ggg agg tta cct ttc tac aac cag gac cat gag 1056 Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu 340 345 350 aaa ctt ttt gaa tta ata tta atg gaa gac att aaa ttt cct cga aca 1104 Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg Thr 355 360 365 ctc tct tca gat gca aaa tca ttg ctt tca ggg ctc ttg ata aag gat 1152 Leu Ser Ser Asp Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys Asp 370 375 380 cca aat aaa cgc ctt ggt gga gga cca gat gat gca aaa gaa att atg 1200 Pro Asn Lys Arg Leu Gly Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile Met 385 390 395 400 aga cac agt ttc ttc tct gga gta aac tgg caa gat gta tat gat aaa 1248 Arg His Ser Phe Phe Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp Lys 405 410 415 aag ctt gta cct cct ttt aaa cct caa gta aca tct gag aca gat act 1296 Lys Leu Val Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr 420 425 430 aga tat ttt gat gaa gaa ttt aca gct cag act att aca ata aca cca 1344 Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr Pro 435 440 445 cct gaa aaa tat gat gag gat ggt atg gac tgc atg gac aat gag agg 1392 Pro Glu Lys Tyr Asp Glu Asp Gly Met Asp Cys Met Asp Asn Glu Arg 450 455 460 cgg ccg cat ttc cct caa ttt tcc tac tct gca agt gga cga gaa taa 1440 Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Arg Glu 465 470 475 <210> 8 <211> 479 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Thr Asp 20 25 30 Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val Asp Leu Pro 35 40 45 Tyr Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln Leu Met Lys Thr 50 55 60 Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp Thr 65 70 75 80 Thr Val Ile Glu 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gct att gtg aag gag ggt tgg ctg cac aaa cga ggg 48 Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 gag tac atc aag acc tgg cgg cca cgc tac ttc ctc ctc aag aat gat 96 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 ggc acc ttc att ggc tac aag gag cgg ccg cag gat gtg gac caa cgt 144 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 gag gct ccc ctc aac aac ttc tct gtg gcg cag tgc cag ctg atg aag 192 Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 acg gag cgg ccc cgg ccc aac acc ttc atc atc cgc tgc ctg cag tgg 240 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 acc act gtc atc gaa cgc acc ttc cat gtg gag act cct gag gag cgg 288 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95 gag gag tgg aca acc gcc atc cag act gtg gct gac ggc ctc aag aag 336 Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110 cag gag gag gag gag atg 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gag tac gcc aac ggg ggc gag ctg ttc ttc cac ctg tcc 720 Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240 cgg gag cgt gtg ttc tcc gag gac cgg gcc cgc ttc tat ggc gct gag 768 Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 att gtg tca gcc ctg gac tac ctg cac tcg gag aag aac gtg gtg tac 816 Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270 cgg gac ctc aag ctg gag aac ctc atg ctg gac aag gac ggg cac att 864 Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile 275 280 285 aag atc aca gac ttc ggg ctg tgc aag gag ggg atc aag gac ggt gcc 912 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala 290 295 300 acc atg aag acc ttt tgc ggc aca cct gag tac ctg gcc ccc gag gtg 960 Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320 ctg gag gac aat gac tac ggc cgt gca gtg gac tgg tgg ggg ctg ggc 1008 Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335 gtg gtc atg tac gag atg atg tgc ggt cgc ctg ccc ttc tac aac cag 1056 Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln 340 345 350 gac cat gag aag ctt ttt gag ctc atc ctc atg gag gag atc cgc ttc 1104 Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe 355 360 365 ccg cgc acg ctt ggt ccc gag gcc aag tcc ttg ctt tca ggg ctg ctc 1152 Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380 aag aag gac ccc aag cag agg ctt ggc ggg ggc tcc gag gac gcc aag 1200 Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400 gag atc atg cag cat cgc ttc ttt gcc ggt atc gtg tgg cag cac gtg 1248 Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val 405 410 415 tac gag aag aag ctc agc cca ccc ttc aag ccc cag gtc acg tcg gag 1296 Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu 420 425 430 act gac acc agg tat ttt gat gag gag ttc acg gcc cag atg atc acc 1344 Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln 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Glu Val Ala Val Ser Lys Ala Arg 130 135 140 gct aaa gtg acc atg aat gac ttc gac tat ctc aaa ctc ctt ggc aag 480 Ala Lys Val Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys 145 150 155 160 gga acc ttt ggc aaa gtc atc ctg gtg cgg gag aag gcc act ggc cgc 528 Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Thr Gly Arg 165 170 175 tac tac gcc atg aag atc ctg cgg aag gaa gtc atc att gcc aag gat 576 Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Arg Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp 180 185 190 gaa gtc gct cac aca gtc acc gag agc cgg gtc ctc cag aac acc agg 624 Glu Val Ala His Thr Val Thr Glu Ser Arg Val Leu Gln Asn Thr Arg 195 200 205 cac ccg ttc ctc act gcg ctg aag tat gcc ttc cag acc cac gac cgc 672 His Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ala Phe Gln Thr His Asp Arg 210 215 220 ctg tgc ttt gtg atg gag tat gcc aac ggg ggt gag ctg ttc ttc cac 720 Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His 225 230 235 240 ctg tcc cgg gag cgt gtc ttc aca gag gag cgg gcc cgg ttt tat ggt 768 Leu Ser Arg Glu 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Claims (38)

  1. 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus: AAV) 벡터로서, 아데노-관련 바이러스(AAV) 역 말단 반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열, 인간 단백질 키나제 B(AKT) 암호 서열, 및 숙주 세포에서 AKT의 발현을 유도하는 발현 제어 서열을 포함하는 벡터 게놈이 캡시드화되어 있는 AAV 캡시드를 포함하는, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AKT 암호 서열이 AKT1, AKT2, 또는 AKT3 암호 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 AKT 암호 서열이 서열번호 8(AKT3), 서열번호 10(AKT1), 또는 서열번호 12(AKT2)의 아미노산 서열을 암호화하는, AAV 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AKT 암호 서열이 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, AKT를 암호화하는 상기 서열이 서열번호 8을 포함하고, 상기 발현 제어 서열이 CMV 인핸서를 갖는 닭 베타-액틴 프로모터를 포함하는, AAV 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CMV 인핸서 서열과 함께 닭 베타-액틴 프로모터가 서열번호 1의 nt 1443-3104 또는 서열번호 5의 nt 1493 내지 2075인, AAV 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 소 성장 호르몬(bGH) 폴리(A) 신호 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AKT 암호 서열이 서열번호 8을 포함하고, 상기 발현 조절 서열이 GRK1 프로모터를 포함하는, AAV 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 서열번호 3의 nt 1427-1790의 GRK1 프로모터를 포함하는, AAV 벡터.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 CMV/CBA 프로모터, GRK1 프로모터, 또는 hCAR 프로모터를 포함하는, AAV 벡터.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 안구 세포-특이적 프로모터를 포함하는, AAV 벡터.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 인간 EF1α 프로모터, 대사성 글루타메이트 수용체 6(mGluR6) 프로모터, 로돕신 프로모터, 원추체 옵신 프로모터 및 전사 인자 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, AAV 벡터.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 및 조직 특이적 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함하는, AAV 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프로모터가 라파마이신/라팔로그 프로모터, 엑디손 프로모터, 에스트로겐 반응성 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터 및 이종이량체 저해인자 스위치로부터 선택되는 유도성 프로모터인, AAV 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론, Kozak 서열, 폴리A 서열 및 전사후 조절 요소 중 하나 이상을 추가로 포함하는, AAV 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 캡시드가 AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7m8 및 이들의 변이체로부터 선택되는, AAV 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡시드가 AAV7m8 캡시드인, AAV 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 서열이 상기 캡시드 단백질을 공급하는 것과 상이한 AAV로부터 유래하는, AAV 벡터.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 서열이 AAV2로부터 유래하는, AAV 벡터.
  20. 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터 또는 제20항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 망막 변성을 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 AAV 벡터 또는 약제학적 조성물이 망막하 또는 유리체내로 투여되는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 대상체가 포유류인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 다른 요법과 조합으로 투여되는 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 약 107 내지 약 1013 벡터 게놈(VG)의 투여량으로 투여되는 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 약 100㎕ 내지 약 500㎕의 부피로 투여되는 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 1회 초과로 투여되는 방법.
  29. AAV 벡터를 생산하기 위한 플라스미드로서, 서열번호 1의 nt 1253 내지 5070 또는 서열번호 3의 nt 1253 내지 3868, 또는 이에 대해 적어도 80% 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 플라스미드.
  30. 유전자 발현 카세트를 감염성 AAV 엔벨로프 또는 캡시드 내로 패키징하기에 충분한 바이러스 서열의 존재 하에 제29항의 플라스미드를 운반하는 패키징 세포를 배양하는 것을 포함하는 재조합 AAV(rAAV) 바이러스를 생성하는 방법.
  31. 제30항의 방법에 따라 생산된 재조합 AAV.
  32. 서열번호 4의 nt 1253 내지 3868 또는 서열번호 3의 nt 1253 내지 5070을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터.
  33. 5' ITR, CMV 인핸서, 닭 베타-액틴 프로모터, Kozak 서열, AKT3 암호 서열, bGH 폴리 A, 및 3' ITR을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터.
  34. 5' ITR, GRK1 프로모터, SV40 인트론, Kozak 서열, AKT3 암호 서열, bGH 폴리A 및 3' ITR을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터.
  35. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는, 망막 변성을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물.
  36. 색맹 치료용 약제의 제조에 사용되는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터의 용도.
  37. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터를 포함하는, 망막 변성을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물.
  38. 망막 변성 치료용 약제의 제조에 사용되는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터의 용도.
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