CN111630170A - 眼部疾病的细胞模型及用于眼部疾病的疗法 - Google Patents

眼部疾病的细胞模型及用于眼部疾病的疗法 Download PDF

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Abstract

提供眼睛疾病的细胞模型、用于治疗眼睛疾病的方法及组合物。

Description

眼部疾病的细胞模型及用于眼部疾病的疗法
相关申请案的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119(e)主张2017年7月31日申请的名称为“CELLULARMODELS OF AND THERAPIES FOR OCULAR DISEASES”的美国申请第62/539,473号的优先权。以上申请的整个内容在此以引用的方式并入。
【背景技术】
发明背景
结晶样视网膜色素变性(或称为结晶样视网膜变性，或Bietti结晶营养不良，Bietti's Crystalline Dystrophy，BCD)
结晶样视网膜色素变性(BCD，又名结晶样角膜视网膜变性(Bietti CrystallineCorneoretinal Dystrophy)、结晶样视网膜病变(Bietti Crystalline Retinopathy)、Bietti视网膜变性(Bietti's Retinal Dystrophy)(OMIM 210370))为一种罕见的常染色体隐性且致盲的视网膜变性，其特征在于在视网膜的后极存在许多细小闪光的黄白色晶体样沉积物，与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)的萎缩、色素凝块(pigment clumps)及脉络膜硬化相关。其在1937年由G.B.Bietti博士首次发现。BCD患者的眼底照片及SD-OCT影像显示，结晶状沉积物主要位于视网膜色素上皮(RPE)的视网膜侧。(H.Kojima,A.Otani,K.Ogino等人,“Outer retinal circular structures in patientswith Bietti crystalline retinopathy”,British Journal of Ophthalmology,第96卷,第390-393页,2012)。角膜缘(corneal limbus)中的结晶状沉积物被估计发生于具有BCD的人的四分之一至三分之一中(Kaiser-Kupfer等人Clinical biochemical and pathologiccorrelations in Bietti's crystalline dystrophy,Am J Ophthalmol.,1994,118:569-82)。在一些情况下，亦在晶状体中观测到晶体沉积物(Chung等人,J Ophthalmol.57:447-450,2013)。在晚期阶段，BCD患者具有晚期脉络膜硬化，结晶状沉积物减少或不存在，且视网膜血管变薄(Wada等人Am J Ophthalmol 2005；139:894-9)。在BCD中亦存在异常的ERG及视网膜变薄。
在临床上，BCD为进行性的且与RPE的变性及退化相关。常见同一患者的双眼间存在显著的不对称。疾病发作年龄及进程随BCD患者而异，即使是在同一家族内。大部分患者会发展出夜盲症、视野收缩、色觉(color vision)差、黄斑退化且在生命的第2个与第4个十年间视力下降，并在生命的第3个与第6个十年间进行至法定盲(legal blindness)。
RPE位于脉络膜毛细管层血管与光感受器的感光外部区段之间，其为与光感受器(视锥及视杆)密切地相互作用以维持视觉功能的单层色素细胞。RPE的主要功能为供给营养，且从光感受器去除废物，光感受器为感觉神经视网膜。RPE的其他功能包括但不限于：光吸收、上皮运输、空间离子缓冲(spatial ion buffering)、视觉周期(visual cycle)、吞噬作用、分泌及免疫调节(Strauss,2005,The retinal pigment epithelium in visualfunction.Physiol Rev 85:845-81)。因此，RPE的功能障碍及退化引起导致视力丧失的光感受器功能障碍及退化。考虑到BCD是与RPE的进行性变性及退化相关，RPE对于研究及治疗BCD而言至关重要。
BCD为罕见疾病。一个资料来源估计BCD发病率为1:67,000(万维网(World WideWeb)上的ghr.nlm.nih.gov/condition/bietti-crystalline-dystrophy#statistics)。另一个资料来源估计BCD流行率为所有RP患者的2.5％(121名RP指标性患者(indexpatients)中有3名BCD指标性患者，参见Mataftsi等人,Retina.24:416-426,2004)。基于此估计且考虑到RP发病率被估计为1:4000(Hartong等人,Lancet.368:1795-1809,2006)，BCD发病率被估计为1:160,000。因为BCD症状相似于其他进行性地破坏视网膜的眼睛病症的症状，所以有时一般被诊断为视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)(Mataftsi A等人Bietti's crystalline corneoretinal dystrophy:a cross-sectionalstudy.Retina.2004；24:416-426)。虽然世界不同地区都报导有BCD患者，包括亚洲、非洲、欧洲、中东、北美洲及南美洲，但是BCD被报导较常见于具有东亚血统的人中，尤其是在中国及日本的族群中(Hu 1983,Ophthalmic genetics in China.Ophthal Paed Genet 2:39-45；Li等人,Am J Hum Genet.2004年5月；74(5):817-826)。
目前尚无经核准用于BCD的治疗，且患者最终会失明。对于为患有此罕见疾病的患者开发能改变生活的治疗选项，存在有强烈未满足的医疗需求。
CYP4V2
CYP4V2(细胞色素P450，家族4，亚家族V，多肽2，(OMIM 608614)，同义词：CYP4AH1)为在细胞色素P450超家族中的蛋白质之一且为血红素硫醇盐细胞色素P450亚家族4(CYP4)的成员。细胞色素P450(CYP)为重要的含血红素的蛋白质，以它们的单加氧酶反应闻名。它们参与异生物质及内源性化合物(诸如类固醇及脂肪酸)的代谢。人类CYP为位于线粒体的内膜中或细胞的内质网中的主要膜相关蛋白。P450蛋白质可以借由它们的特征序列元件(signature sequence element)FxxGxxxCxG(SEQ ID NO:30)来鉴定，其中加底线的半胱氨酸是作为血红素铁的轴向配位体(axial ligand)。P450蛋白质的另一特征序列元件为ExxR(SEQ ID NO:31)。人类基因组计划(Human Genome Project)已将人类P450基因的数目设定为57。作为参考，有103个小鼠P450基因及89个大鼠P450基因。(Guengerich&Cheng,Pharmacological Reviews,2011年9月,63(3)684-699)。
人类CYP4家族由12个基因及10个伪基因组成。人类CYP4V2基因(HGNC:23198)位于4q35处且具有11个外显子。CYP4V2基因中的突变导致BCD(Li等人,Am J Hum Genet.74:817-826,2004)。虽然CYP4V2在几乎所有的组织中表达，但是其在视网膜及RPE中以高水平表达且在角膜中以稍微低的水平表达，这些组织显示BCD的主要临床发现(clinicalfinding)(Li等人,Am J Hum Genet.74:817-826,2004；Nakano M,Kelly EJ,Rettie AE:Expression and Characterization of CYP4V2 as a Fatty Acid omega-Hydroxylase.Drug Metab Dispos 2009；Nakano M,Kelly EJ,Wiek C,Hanenberg H,Rettie AE:CYP4V2 in Bietti's crystalline dystrophy:ocular localization,metabolism of omega-3-polyunsaturated fatty acids,and functional deficit ofthe p.H331P variant.Mol Pharmacol 2012；82:679-686)。
因为CYP4V2为P450家族的相对较新的成员且BCD为罕见疾病，所以CYP4V2的功能尚未被广泛地研究。先前的研究显示，CYP4V2蛋白质主要活跃于脂肪酸代谢中。已证实，在BCD患者的血清、淋巴细胞及皮肤成纤维细胞中存在脂肪酸及其代谢的异常(Lee J,JiaoX,Hejtmancik JF等人:The metabolism of fatty acids in human Bietti crystallinedystrophy.Invest Ophthalmol Vis Sci 2001；42:1707-1714；Lai T,Chu KO,Chan KP等人:Alterations in serum fatty acid concentrations and desaturase activitiesin Bietti crystalline dystrophy unaffected by CYP4V2 genotypes.InvestOphthalmol Vis Sci 2010；51:1092-1097)。另一研究显示，CYP4V2为ω-3-多元不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)羟化酶且为在经转化人类RPE细胞系ARPE-19中高度表达P450(Nakano M,Kelly EJ,Wiek C,Hanenberg H,Rettie AE:CYP4V2 in Bietti's crystalline dystrophy:ocular localization,metabolism of omega-3-polyunsaturated fatty acids,and functional deficit of the p.H331Pvariant.Molecular pharmacology 2012；82:679-686)。
已在CYP4V2基因中鉴定到诸多突变且这些突变引起BCD，其中在基因的11个外显子中各有至少一个突变。BCD患者中最常见的CYP4V2突变为c.802-8_810del17insGC(是指17个碱基缺失且二个碱基(GC)插入于从CYP4V2基因的内含子6的末端起距离8个碱基的位置中，亦称为IVS6-8del/insGC，参见SEQ ID NO:46，其显示包含c.802-8_810del17insGC突变的人类CYP4V2基因组DNA区域的序列；以及SEQ ID NO:47，其显示相应的野生型序列)。c.802-8_810del17insGC突变展示于以下显示人类CYP4V2内含子6-外显子7接合的序列中。内含子6序列以小写字母显示且外显子7序列以大写字母显示。17bp缺失及GC插入是在括号内：caa aca gaa gca tgt gat tat cat tca aa(tca tac agG TCA TCG CT)(GC)GAA CGGGCC AAT GAA ATG AAC GCC AAT GA(SEQ ID NO:46)，导致跳过(skipping)外显子7。(Xiao等人,Biochem Biophys Res Commun.409:181-6,2011；Meng等人,2014,Mol.Vis.,20:1806-14；Wada等人,Am J Ophthalmol.139:894-9,2005；Jiao等人,EuropeanJournal ofHuman Genetics(2017)25,461-471)。最近的研究估计c.802-8_810del17insGC突变的存在时间(age)在中国族群中为1,040至8,200世代(generations)且在日本族群中为300至1100世代。参见Jiao等人,European Journal of Human Genetics(2017)25,461-471。
多种类型的CYP4V2突变被发现与BCD相关，包括但不限于误义(missense)、重复、剪接位、框移、删除、插入、插入或缺失(indel)、无意义、多态性(例如单核苷酸多态性)及提前终止(premature termination)，以及CYP4V2基因整个缺失。在人类BCD患者中挑选出的CYP4V2突变的概述提供于本文表1且可在各种出版物及在线数据库中找到，例如LOVD(万维网上的databases.lovd.nl/shared/genes/CYP4V2)、OMIM(万维网上的omim.org/allelicVariant/608614)及ClinVar(万维网上的ncbi.nlm.nih.gov/clinvar？term＝608614[MIM])。
表1：在BCD患者中挑选出的CYP4V2突变
Figure BDA0002437005560000051
Figure BDA0002437005560000061
Figure BDA0002437005560000071
这仅是一个选择清单，且可能未包含迄今为止所鉴定及所报导的所有在BCD患者中的病理性CYP4V2突变/变异体。突变是相对于参考序列(NM_207352.3)及(NP_997235.3)而言。在BCD患者中不断地鉴定出新的CYP4V2病理性突变。所有与BCD相关的已鉴定的及未来将鉴定的病理性CYP4V2突变/变异体均以引用的方式并入本文中。
遗传性视网膜退化(Inherited Retinal Degeneration，IRD)
遗传性视网膜退化(IRD)为失明的主要原因。目前已知IRD及相关病症涉及超过200个基因。在人类中，视网膜色素变性(RP)为IRD的主要形式。RP有三种一般遗传模式(常染色体显性、常染色体隐性及X性联)。估计全世界RP的发病率为4000分之1，其中常染色体隐性RP占RP的50％-60％(Hartong DT,Berson EL,Dryja TP.Retinitispigmentosa.Lancet.2006；368:1795-809)。欧洲的一项研究估计，BCD流行率为所有RP患者的2.5％且为具有非症候群型常染色体隐性RP的人的约10％(Mataftsi A,Zografos L,MilláE,Secrétan M,Munier FL.Bietti's crystalline corneoretinal dystrophy:across-sectional study.Retina.2004；24:416-26)。同一项研究亦指出，BCD常常被普遍地诊断为是RP。因此，BCD可能一直缺乏良好诊断(under-diagnosed)。BCD为世界性疾病，但是其在东亚中最为常见，尤其是在中国及日本族群中(Li等人,Am J Hum Genet.2004年5月；74(5):817-826)。
关于表1突变的参考文献：
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【发明内容】
发明概要
细胞系权利要求
细胞系及疾病模型权利要求
细胞系组合物
在一个方面中，提供一种细胞疾病模型，其包括细胞系。此类疾病模型包括(a)由受试者提供的干细胞或从由受试者提供的细胞所重编程(reprogrammed)的干细胞，或(2)细胞，其衍生自由受试者提供的干细胞或衍生自从由受试者提供的细胞所重编程的干细胞，其在靶基因中包含一个或多个突变。
在一些实施方案中，干细胞为诱导性多能干(induced pluripotent stem，iPS)细胞。在一些实施方案中，干细胞为胚胎干(embryonic stem，ES)细胞、体(或成体)干细胞或间质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。在一些实施方案中，由受试者提供的细胞属于任何细胞类型和/或来自受试者的任何组织。在一些实施方案中，由受试者提供的细胞为皮肤细胞、成纤维细胞或血细胞。在一些实施方案中，其中由受试者提供的细胞为皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。在一些实施方案中，由受试者提供的细胞为尿路细胞(urinary cell)、肾上皮细胞、毛囊或真皮乳头细胞(dermal papilla cell)。
在一些实施方案中，衍生自干细胞的细胞为眼部细胞(ocular cell)。在一些实施方案中，眼部细胞为视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器细胞(photoreceptor cell，PRC，包括视杆细胞、视锥细胞及光感受器祖细胞)、视网膜细胞、角膜细胞、角膜上皮细胞(corneal epithelial cell，CEC)、视神经细胞、晶状体细胞、脉络膜内皮(choroidalendothelial，CE)细胞、视神经细胞或脉络膜细胞。在一些实施方案中，衍生自干细胞的细胞为神经元细胞。
在一些实施方案中，该突变对受试者而言为内源性的。在一些实施方案中，该突变对受试者而言为外源性的。在一些实施方案中，该突变经由基因编辑(genetic editing)或基因操作(genetic manipulation)而人工引入。在一些实施方案中，细胞系包含多个对受试者而言为内源性和/或外源性的突变。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。
在一些实施方案中，靶基因包含表4中所阐述的基因。在一些实施方案中，靶基因包含突变的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。在一些实施方案中，靶基因为CYP4V2。
在一些实施方案中，细胞系包含iPS细胞。在一些实施方案中，细胞系包含iPS-RPE细胞。在一些实施方案中，细胞系包含iPS-光感受器(iPS-PRC)细胞、iPS-角膜上皮细胞(iPS-CEC)、iPS-脉络膜内皮(CE)细胞、iPS-角膜细胞、iPS-脉络膜细胞、iPS-视神经细胞、iPS-眼部细胞或iPS-神经元细胞。在一些实施方案中，细胞系中的CYP4V2突变对受试者而言为内源性的。在一些实施方案中，受试者在CYP4V2基因中或在CYP4V2基因的直系同源物(ortholog)中具有病理性突变。
在一些实施方案中，受试者具有表1中所阐述的至少一个突变。在一些实施方案中，受试者具有遗传性视网膜退化(IRD)或视网膜色素变性(RP)。在一些实施方案中，受试者具有结晶样视网膜色素变性(BCD，又名结晶样角膜视网膜变性、结晶样视网膜病变、Bietti视网膜变性)或处于罹患BCD的风险中。
在一些实施方案中，细胞系包含CYP4V2突变，该突变对受试者而言为外源性的且是经由基因编辑或基因操作而人工引入。
在一些实施方案中，细胞系包含iPS细胞、ES细胞、MSC或成体干细胞，或是衍生自iPS细胞、ES细胞、MSC或成体干细胞的RPE细胞、光感受器细胞、角膜上皮细胞、脉络膜内皮(CE)细胞或脉络膜细胞。在一些实施方案中，iPS细胞或其他类型的干细胞的特征在于以下的一者或多者：a.iPS、ES或MSC的独特形态；b.一种或多种多能性标记物，诸如Oct-4、Sox-2、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、NANOG及AP；c.分化成所期望的细胞类型(例如，RPE)的能力；和/或d.畸胎瘤分析(terotoma assay)。
在一些实施方案中，iPS-RPE细胞或衍生自其他类型的干细胞的RPE细胞的特征在于：a.形态：色素及六角形，和/或b.以下生物标记物中的一者或多者：视黄醛结合蛋白1(retinaldehyde-binding protein 1，RLBP1，别名：CRALBP)、RPE65、斑萎蛋白-1(BESTROPHIN-1)、MITF、LRAT、RDH5、PAX6、MERTK、TYR、ZO-1和/或黏着斑蛋白(VINCULIN)。
在另一方面中，提供BCD人类细胞模型或CYP4V2功能细胞模型。此类模型包括包含衍生自BCD患者的细胞或细胞系或衍生自具有人工产生的CYP4V2突变的细胞或细胞系的iPS细胞或iPS细胞系，或iPS-RPE细胞或iPS-RPE细胞系。
在一些实施方案中，该细胞系相比于健康对照组的相应细胞系在以下化合物群组中的一种或多种化合物具有异常生化谱(biochemical profile)：(i)脂肪酸、(ii)神经酰胺、(iii)鞘磷脂、(iv)神经鞘氨醇、(v)二氢鞘氨醇或(vi)羟基-脂肪酸。在一些实施方案中，该细胞系相比于健康对照组的相应细胞系在表2中所阐述的一种或多种化合物具有异常生化谱。
制作细胞疾病模型的方法：
在另一方面中，提供制作由iPS衍生的BCD疾病模型的方法。此类方法包括：从在CYP4V2基因中具有内源性突变的受试者获得细胞，或是获得在CYP4V2基因中无内源性突变但是在此阶段或以下任一阶段经由基因编辑或基因操作而人工引入外源性CYP4V2突变的细胞；诱导这些细胞中的多能性或重编程这些细胞以产生iPSC；在引起iPSC分化成所期望的眼部细胞的条件下培养iPSC，从而产生由iPS衍生的眼部细胞系。
在一些实施方案中，从受试者获得的细胞为体细胞。在一些实施方案中，从受试者获得的细胞为皮肤细胞、成纤维细胞、血细胞、外周血单核细胞(PBMC)或眼部细胞。在一些实施方案中，从受试者获得的细胞为尿路细胞、肾上皮细胞、毛囊或真皮乳头细胞。在一些实施方案中，眼部细胞为视网膜色素上皮(RPE)细胞、角膜上皮细胞(CEC)、光感受器细胞(PRC)、脉络膜内皮(CE)细胞、视神经细胞、视网膜细胞、角膜细胞或脉络膜细胞。在一些实施方案中，使用OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC转录因子中的一者或多者，诱导多能性或重编程细胞。
在一些实施方案中，突变为病理性的。在一些实施方案中，细胞系包含表1中所阐述的突变中的一种或多种突变。在一些实施方案中，细胞系对于突变而言为杂合(heterozygous)的。在一些实施方案中，细胞系对于突变而言为纯合(homozygous)的。
在一些实施方案中，相比于健康对照组的相关细胞系中的水平，细胞疾病模型显示来自以下化合物群组的一种或多种化合物的异常水平：(i)脂肪酸、(ii)神经酰胺、(iii)鞘磷脂、(iv)神经鞘氨醇、(v)二氢鞘氨醇或(vi)羟基-脂肪酸。在一些实施方案中，相比于健康对照组的相关细胞系中的表2中所阐述的一种或多种化合物的水平，细胞疾病模型显示异常水平。
生化分析方法：
在一个方面中，提供一种发现疾病细胞模型中的异常或表型的方法。此类方法通常包括在患者细胞系(或经基因编辑或操作而在该基因中包含引起该疾病的外源性突变的细胞系)与健康对照组的细胞系之间评估及比较一种或多种化合物的水平，其中一种或多种化合物选自下组：(i)脂肪酸、(ii)神经酰胺、(iii)鞘磷脂、(iv)神经鞘氨醇、(v)二氢鞘氨醇和/或(vi)羟基-脂肪酸。
在一些实施方案中，所评估的化合物中的一者或多者阐述于表2中。在一些实施方案中，使用LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS、GC-MS/MS和/或FIA-MS/MS进行化合物水平的鉴定和/或评估。在一些实施方案中，疾病细胞模型包含表4中所阐述的突变的或有缺陷的基因。在一些实施方案中，疾病细胞模型包含以下基因中的突变的或有缺陷的基因：CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
使用BCD细胞模型(药物、剂量及装置筛选)的方法
在另一方面中，提供一种筛选用于针对BCD的治疗功效的测试剂的方法。此类方法通常包括：使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的细胞或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的细胞与测试剂接触；及针对以下各者评估这些细胞：相比于接触该测试剂之前，表2中所阐述的一种或多种化合物的水平的标准化；这些细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；这些细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；和/或改良的细胞结构、形态或功能；其中相比于用该测试剂处理之前，表2中所阐述的一种或多种化合物的水平的标准化；这些细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；这些细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；和/或改良的细胞结构、形态或功能，表明测试剂展现针对BCD的治疗功效。
在一些实施方案中，测试剂选自由以下组成的群：核酸或其类似物、含有核酸序列或编码多肽的载体、多肽或其类似物、抗体、化学物质、小分子和/或其任何组合。在一些实施方案中，这些细胞使用PCR技术、免疫分析、测序、生化分析、功能分析、显微术或其组合来评估。
在另一方面中，提供一种筛选包含用于BCD的测试剂的制剂、载体或构建体的功效或效率的方法。此类方法通常包括：使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的多个细胞样品或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的多个细胞样品与配制或包装于各种制剂、载体或构建体中的测试剂接触；及针对以下各者评估这些细胞样品：相比于用该测试剂处理之前和/或相比于用相同的但配制或包装于不同制剂、载体或构建体中的测试剂处理的细胞样品，表2中所阐述的一种或多种化合物的水平的标准化；这些细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；这些细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；改良的细胞结构、形态或功能；和/或细胞耐受性或死亡，用以测定及比较该制剂、载体或构建体的效率或功效；其中这些细胞使用PCR技术、免疫分析、测序、生化分析、细胞活力分析、显微术或其组合来评估。
在一个方面中，提供一种筛选用于BCD的测试剂的有效及安全剂量范围的方法。此类方法通常包括：使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的多个细胞样品或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的多个细胞样品与测试剂以针对各细胞样品的不同剂量接触；针对以下各者评估这些细胞样品：相比于用该测试剂处理之前和/或相比于用相同测试剂但用不同剂量处理的细胞样品，表2中所阐述的一种或多种化合物的水平的标准化；这些细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；这些细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；改良的细胞结构、形态或功能和/或细胞耐受性或死亡，用以测定及比较不同剂量的有效性及安全性，从而确定恰当的剂量范围；其中这些细胞使用PCR技术、免疫分析、测序、生化分析、细胞活力分析、功能分析、显微术或其组合来评估。
在另一方面中，提供一种筛选用于向视网膜或视网膜细胞递送治疗剂的递送装置或方法或评估其功效或效率的方法。此类方法通常包括：(i)在不采用该递送装置或方法的情况下，使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的细胞样品或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的细胞样品与测试剂接触；(ii)采用该递送装置或方法，使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的另一个细胞样品或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的另一个细胞样品与跟(i)中相同剂量的该测试剂接触；(iii)针对以下各者评估及比较来自(i)及(ii)的细胞样品：相比于在用该测试剂处理和/或用相同剂量的相同测试剂但是不采用该递送装置或方法进行处理之前，表2中所阐述的一种或多种化合物的水平的标准化；这些细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；这些细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；改良的细胞结构、形态或功能；细胞耐受性或死亡；和/或该测试剂在这些细胞中的水平，从而测定该递送装置或技术的功效或效率；其中这些细胞使用PCR技术、免疫分析、测序、生化分析、功能分析、显微术或其组合来评估。
在一些实施方案中，视网膜细胞为RPE细胞。
CRISPR基因编辑疗法
在一个方面中，提供一种组合物，其包括：(a)靶向距离CYP4V2基因100bp或100bp内的核酸序列(“靶序列”)的CRISPR引导RNA，及(b)功能性CRISPR相关蛋白(Cas)。在一些实施方案中，此类组合物可以进一步包括(c)供体核酸序列，该供体核酸序列包含该CYP4V2基因的野生型序列或功能序列的全部或一部分，其用于校正、破坏或替代CYP4V2基因或其一部分。
在一些实施方案中，其一种或多种组分按以下形式提供：编码该组分的DNA分子、编码该组分的mRNA分子、RNA分子、多肽和/或核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)或蛋白质-RNA复合物。在一些实施方案中，其二种或更多种组分在单独的分子中或组合于一个分子或一个复合物中、在单独的载体中或组合于一个载体中、在一个或多个核酸复合物中、在一个或多个RNP复合物中。在一些实施方案中，供体核酸序列以单链供体寡核苷酸(single-stranded donor oligonucleotide，ssODN)或载体形式提供。在一些实施方案中，载体为质粒、重组AAV载体、重组慢病毒载体和/或其组合。
在一些方面中，提供一种包括具有病理性CYP4V2突变的细胞的组合物，其包含本文中所描述的组合物中的任一者。在一些实施方案中，(a)该CRISPR引导RNA包含(i)CRISPRRNA(crRNA)，其包含与距离靶基因(“靶基因”)100bp或100bp内的靶序列互补的原型间隔区元件序列(protospacer element sequence)及对应于反式活化crRNA(tracrRNA)的互补区的序列，及(ii)tracrRNA，其包含与该crRNA的对应区域互补的区域及与CRISPR相关蛋白9(Cas9)相互作用的序列，且(b)该功能性CRISPR相关蛋白包含Cas9。
在一些实施方案中，原型间隔区元件为约20个碱基、约19个碱基、约21个碱基、约19-21个碱基、约18-22个碱基或约16-24个碱基。在一些实施方案中，crRNA及tracrRNA在单独的分子中。在一些实施方案中，将crRNA及tracrRNA组合成单引导RNA(single guideRNA，sgRNA)。在一些实施方案中，sgRNA为约88-150bp。
在一些实施方案中，Cas9包含Cas9直系同源物或突变型Cas9，其选自：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(SpCas9)、SpCas9切口酶(nickase)(Cas9n D10A)、SpCas9(D1135E)、eSpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9 VRER、SpCas9 VQR、SpCas9EQR、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SaCas9)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria Meningitidis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumnoniae)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、犬支原体(mycoplasma canis)及粪肠球菌(enterococcusfaecalis)。在一些实施方案中，CRISPR相关蛋白Cas9或Cpf1进一步包括一个、二个、三个或更多个位于N端和/或C端的核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)，和/或选择标记物，其包括但不限于GFP或EGFP。
在一些实施方案中，(a)CRISPR引导RNA包含crRNA，该crRNA包含与距离靶基因100bp或100bp内的靶序列互补的原型间隔区元件序列，且(b)功能性CRISPR相关蛋白包含Cpf1。在一些实施方案中，原型间隔区元件为约20个碱基、约21个碱基、约22个碱基、约23个碱基、约24个碱基、约19-25个碱基、约18-26个碱基或约16-28个碱基。
在一些实施方案中，原型间隔区元件序列选自由SEQ ID NO:48至52组成的群，或与SEQ ID NO:48至52中之一者共用至少85％序列同一性，其用于与具有NGG作为原型间隔区相邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)的Cas蛋白质一起使用以靶向CYP4V2基因的c.802-8_810del17insGC突变。在一些实施方案中，供体核酸序列选自SEQ ID NO:56及57(此为二个供体模板序列)或与SEQ ID NO:56及57或其互补序列中之一者共用至少90％序列同一性，其用于校正、破坏或替代CYP4V2基因的c.802-8_810del17insGC突变。
CRISPR基因疗法的方法权利要求
在另一方面中，提供一种治疗或预防具有突变的CYP4V2基因的受试者或细胞中的BCD的方法。此类方法包括(i)经由测序鉴定该受试者或该细胞中的病理性突变；(ii)找出跨度为距离参与该突变的第一个核苷酸的上游约100bp至距离参与该突变的最后一个核苷酸的下游约100bp的区域内的Cas相关PAM位点；(iii)鉴定与(ii)中所鉴定的各PAM位点有关的各种靶向该CYP4V2序列的原型间隔区元件序列；(iv)基于该原型间隔区元件序列及PAM，评定包含(iii)中所鉴定的原型间隔区元件序列的各CRISPR引导RNA的活性水平及脱靶编辑谱(off-target editing profile)；(v)基于(iv)选择一个或多个CRISPR引导RNA设计；(vi)基于同源定向修复(homology-directed repair，HDR)设计一个或多个供体核酸序列，用于校正、破坏或替代所靶向的CYP4V2突变；(vii)构建如组合物权利要求1至18中所提供的该CRISPR引导RNA、Cas及供体核酸序列；(viii)任选地在从该受试者分离的细胞、或衍生自该受试者的iPS细胞或从衍生自该受试者的干细胞分化的细胞、或从该受试者分离的基因组DNA或自其分离或衍生的细胞中，验证并进一步选择(vii)的这些组分，以评定该活性水平和/或脱靶编辑谱；以及(ix)经由选自由以下组成的群的递送系统向该受试者或该细胞施用(viii)中的这些组分：核糖核蛋白或蛋白质-RNA复合物、载体、蛋白质、核酸分子、纳米颗粒、脂质体、微胞、病毒体、核酸复合物和/或其组合，其中该递送借由电穿孔或经由脂质介导的转染或核转染或病毒转导或注射或其组合进行；(x)其中关于体外细胞中的处理，任选地在(viii)中的这些组分中添加或加上选择标记物，其包括但不限于GFP、EGFP或嘌呤霉素(puromycin)抗性。
在一个方面中，提供一种基因编辑组合物，其用于在受试者体内或在体外细胞中校正或替代CYP4V2基因中的c.802-8_810del17insGC突变。此类组合物通常包括：(i)CRISPR引导RNA，其包含选自SEQ ID NO:48至52中之一者或与SEQ ID 48至52中的序列中之一者共用至少80％序列同一性的原型间隔区元件序列；(ii)供体核酸序列，其选自SEQ IDNO:56及57中之一者，或与SEQ ID NO:56及57或其互补序列中之一者共用至少90％序列同一性；及(iii)Cas9蛋白质(示范性序列显示于SEQ ID NO:58中)，其任选地含有1、2、3个或更多个NLS，和/或选择标记物，其包括但不限于GFP或EGFP。
在一些实施方案中，在原型间隔区元件序列之前添加任选的核苷酸G。在一些实施方案中，CRISPR引导RNA包括crRNA(示范性序列(不包括5'原型间隔区元件序列)显示于SEQID NO:53中)及tracrRNA(示范性序列显示于SEQ ID NO:54中)；且原型间隔区元件序列包含于该crRNA中。在一些实施方案中，CRISPR引导RNA包括含有原型间隔区元件序列的单引导RNA(sgRNA)(示范性sgRNA序列(不包括5'原型间隔区元件序列)显示于SEQ ID NO:55中)。
在一些实施方案中，(i)、(ii)及(iii)的一种或多种组分按以下形式提供：编码该组分的DNA分子、编码该组分的mRNA分子、核酸分子、载体、RNA分子、多肽、核糖核蛋白(RNP)或蛋白质-RNA复合物和/或其组合。
BCD细胞疗法、眼部疾病自体细胞疗法及组合的治疗权利要求
BCD细胞疗法
针对BCD的无基因修复的同种异体(allogenic)细胞疗法或自体细胞疗法
在一些方面中，提供一种治疗或预防受试者的眼睛疾病的方法，其中该疾病与CYP4V2基因中的病理性遗传或表观遗传改变相关。此类方法通常包括向受试者施用细胞组合物，其中该细胞组合物包括：视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器或光感受器祖细胞(PRC)、角膜上皮细胞(CEC)、脉络膜内皮(CE)细胞和/或其他衍生自干细胞的眼部细胞。
在一些实施方案中，干细胞为胚胎干(ES)细胞、iPC细胞、MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。在一些实施方案中，干细胞来自或衍生自一个或多个不具有BCD或不具有病理性CYP4V2基因的受试者。在一些实施方案中，干细胞来自或衍生自一个或多个在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者。在一些实施方案中，受试者为人类个体。
针对BCD的基因修复的自体细胞疗法
在另一方面中，提供一种细胞组合物，其包括(a)从分离自患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者的细胞重编程的干细胞或从该受试者分离的干细胞，或(b)从干细胞分化的细胞，该干细胞分离自患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者或从分离自该受试者的细胞重编程。
在一些实施方案中，从分离自该受试者的细胞重编程的干细胞为iPC细胞。在一些实施方案中，iPS细胞从该受试者的任何组织的任何细胞重编程。在一些实施方案中，iPS细胞从皮肤细胞、血细胞、尿路细胞、毛发细胞、成纤维细胞、外周血单核细胞(PBMC)、肾上皮细胞、毛囊或真皮乳头细胞重编程。在一些实施方案中，从受试者分离的干细胞为MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。在一些实施方案中，从干细胞分化的细胞为眼部细胞。在一些实施方案中，从干细胞分化的细胞为RPE细胞、PRC、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、CEC或CE细胞。在一些实施方案中，从干细胞分化的细胞为iPS-RPE、iPS-PRC、iPS-CEC或iPS-CE细胞。
在一些实施方案中，对以下细胞进行基因修复以改善突变的CYP4V2基因的影响：(i)从患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者分离以用于重编程成iPSC的细胞；(ii)从患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者分离的干细胞或从分离自该受试者的细胞重编程的iPS细胞；或(iii)从分离自患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者的干细胞分化的细胞或由从分离自该受试者的细胞重编程的iPS细胞分化的细胞。在一些实施方案中，基因修复在重编程成iPS细胞之前进行。在一些实施方案中，基因修复在重编程成iPS细胞之后进行。在一些实施方案中，基因修复在干细胞或iPS细胞的分化之前进行。在一些实施方案中，基因修复在干细胞或iPS细胞的分化之后进行。在一些实施方案中，基因修复经由基因转移疗法。在一些实施方案中，基因修复经由基因转移疗法，借由使用基因疗法权利要求中任一项的任何组合物或方法。在一些实施方案中，基因修复经由基因编辑。在一些实施方案中，基因修复经由基因编辑，借由使用CRiSPR基因疗法权利要求中任一项的任何组合物或方法。
在另一方面中，提供一种治疗或预防患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性遗传或表观遗传改变的受试者的眼睛疾病的方法。此类方法通常包括向受试者施用本文中所描述的CYP4V2自体细胞组合物中的任一者，其中该细胞组合物包括：视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器或光感受器祖细胞(PRC)、角膜上皮细胞(CEC)、脉络膜内皮(CE)细胞和/或其他衍生自受试者的干细胞的眼部细胞。
在一些实施方案中，干细胞为iPC细胞、MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。在一些实施方案中，iPS细胞使用OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC转录因子中的一者或多者重编程。在一些实施方案中，基因修复的细胞相比于在进行基因修复之前展现以下中的一者或多者：表2中所阐述的一种或多种化合物的水平的标准化；这些细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；这些细胞中的功能性CYP4V2多肽的量的增加；和/或改良的细胞结构、形态或功能。
在一些实施方案中，在单次给药中所施用的细胞的量为约1,000至约1亿个细胞。在一些实施方案中，经由注射给药。在一些实施方案中，经由视网膜下注射给药。在一些实施方案中，经由玻璃体内注射给药。在一些实施方案中，经由直接视网膜注射给药。在一些实施方案中，经由角膜注射给药。在一些实施方案中，借由任何其他有效地将细胞递送至受试者眼睛的视网膜下位置、后段或角膜的给药方法来给药。在一些实施方案中，经由注射细胞悬浮液来施用细胞。在一些实施方案中，细胞作为层片(sheet)、基质、支架或组织的一部分施用。
在一些实施方案中，使用天然和/或合成支架来施用RPE细胞以产生功能性RPE单层。在一些实施方案中，受试者为人类受试者。
针对眼部疾病的基因修复的自体细胞疗法
在另一方面中，提供一种细胞组合物，其包括(a)从分离自受疾病影响的受试者的细胞重编程的干细胞或从该受试者分离的干细胞，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病，或(b)从干细胞分化的细胞，该干细胞从受疾病影响的受试者分离或从分离自该受试者的细胞重编程，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病。
在一些实施方案中，从分离自该受试者的细胞重编程的干细胞为iPS细胞。在一些实施方案中，iPS细胞从该受试者的任何组织的任何细胞重编程。在一些实施方案中，iPS细胞从皮肤细胞、血细胞、尿路细胞、毛发细胞、成纤维细胞、外周血单核细胞(PBMC)、肾上皮细胞、毛囊或真皮乳头细胞重编程。在一些实施方案中，从受试者分离的干细胞为MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。
在一些实施方案中，该基因涉及引起眼部疾病或为引起眼部疾病的风险因素的眼部发育或功能和/或其突变。在一些实施方案中，该基因涉及引起神经退化性疾病或为引起神经退化性疾病的风险因素的神经元的发育或功能和/或其突变。在一些实施方案中，该基因为细胞色素P450基因。在一些实施方案中，该基因为表4中所阐述的基因。
在一些实施方案中，该基因包括突变的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
在一些实施方案中，从干细胞分化的细胞为任何类型的细胞。在一些实施方案中，从干细胞分化的细胞为眼部细胞。在一些实施方案中，从干细胞分化的细胞为RPE细胞、PRC、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、CEC、CE细胞或视神经细胞。在一些实施方案中，从干细胞分化的细胞为iPS-RPE、iPS-PRC、iPS-CEC或iPS-CE细胞。在一些实施方案中，从干细胞分化的细胞为神经元。
在一些实施方案中，对以下细胞进行基因修复以改善突变的或有缺陷的基因的影响：(i)从受疾病影响的受试者分离以用于重编程成iPSC的细胞，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病；(ii)从受疾病影响的受试者分离的干细胞或从分离自该受试者的细胞重编程的iPS细胞，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病；或(iii)从分离自受疾病影响的受试者的干细胞分化的细胞或由从分离自该受试者的细胞重编程的iPS细胞分化的细胞，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病。
在一些实施方案中，基因修复在重编程成iPS细胞之前进行。在一些实施方案中，基因修复在重编程成iPS细胞之后进行。在一些实施方案中，基因修复在干细胞或iPS细胞的分化之前进行。在一些实施方案中，基因修复在干细胞或iPS细胞的分化之后进行。在一些实施方案中，基因修复经由基因转移疗法。在一些实施方案中，基因修复经由基因转移疗法，借由使用与基因疗法相关的权利要求中任一项的任何组合物或方法。在一些实施方案中，基因修复经由基因编辑疗法。在一些实施方案中，基因修复经由基因编辑疗法，借由使用与CRiSPR基因疗法相关的权利要求中任一项的任何组合物或方法。
在另一方面中，提供一种治疗或预防受疾病影响的受试者的疾病的方法，该受试者患有由表4中所阐述的突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病。此类方法通常包括向受试者施用如本文中所描述的自体细胞组合物，其中该细胞组合物包括：视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器或光感受器祖细胞(PRC)、角膜上皮细胞(CEC)、神经元、脉络膜内皮(CE)细胞和/或其他衍生自该受试者的干细胞的眼部细胞，且其中该细胞组合物中的该突变的或有缺陷的基因已经基因修复。
在另一方面中，提供一种自体治疗受试者的方法。此类方法通常包括(i)提供来自具有眼睛疾病的受试者的细胞；(ii)在来自该受试者的细胞中诱导多能性以产生iPSC；(iii)基因修复衍生自该受试者的iPSC中于表4中所阐述的突变的或有缺陷的基因中之一个或多个突变；(iv)将iPSC分化成眼部细胞；(v)作为步骤(iii)的替代方案，经由基因转移疗法基因修复iPS-眼部细胞；以及(vi)将iPS-眼部细胞引入该受试者中，从而自体治疗具有眼睛疾病的受试者。
在一些实施方案中，干细胞为iPC细胞、MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。在一些实施方案中，iPS细胞使用OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC转录因子中的一者或多者来重编程。在一些实施方案中，基因修复的细胞，相比于在进行基因修复之前，展现以下中的一者或多者：这些细胞中的无缺陷的靶基因核酸序列的增加；这些细胞中由该靶基因编码的功能性多肽的量的增加；改良的细胞结构、形态或功能；和/或这些细胞中改良的或标准化的生化功能。在一些实施方案中，在单次给药中所施用的细胞的量为约1,000至约1亿个细胞。
在一些实施方案中，经由注射给药。在一些实施方案中，借由视网膜下注射给药。在一些实施方案中，借由玻璃体内注射给药。在一些实施方案中，借由直接视网膜注射给药。在一些实施方案中，借由角膜注射给药。在一些实施方案中，借由任何其他有效地将细胞递送至受试者眼睛的视网膜下位置、后段或角膜的给药方法来给药。在一些实施方案中，经由注射细胞悬浮液来施用细胞。在一些实施方案中，细胞作为层片、基质、支架或组织的一部分施用。在一些实施方案中，使用天然和/或合成支架来施用RPE细胞以产生功能性RPE单层。在一些实施方案中，受试者为人类受试者。
在一些实施方案中，该疾病与受试者中的遗传或表观遗传改变或风险因素相关。在一些实施方案中，该疾病为光感受器退化、视网膜色素上皮细胞退化、视网膜退化、角膜退化和/或脉络膜病症。在一些实施方案中，该疾病为遗传性视网膜退化(IRD)。在一些实施方案中，该疾病为视网膜色素变性(RP)。在一些实施方案中，该疾病为结晶样视网膜色素变性(亦称为结晶样角膜视网膜变性；BCD)。在一些实施方案中，该疾病与神经退化相关。在一些实施方案中，该疾病为角膜变性。在一些实施方案中，该受试者具有BCD或处于罹患BCD的风险。
在一些实施方案中，这些细胞为成纤维细胞、血细胞或眼部细胞。在一些实施方案中，这些细胞从尿液或从毛发或毛囊获得。在一些实施方案中，眼部细胞为视网膜色素上皮(RPE)细胞、角膜上皮细胞(CEC)、脉络膜内皮(CE)细胞或光感受器细胞(PRC)。
在一些实施方案中，遗传或表观遗传改变选自由以下组成的群：突变、插入、单核苷酸多态性、不当甲基化、不当脱甲基化及其组合。在一些实施方案中，遗传或表观遗传改变为突变。在一些实施方案中，受试者的iPS-眼部细胞中的遗传或表观遗传改变已使用基因编辑进行基因修复。在一些实施方案中，基因编辑法利用锌指核酸酶、TALEN技术或CRISPR技术。在一些实施方案中，受试者的iPSC-眼部细胞中的遗传或表观遗传改变已使用基因转移进行基因修复。在一些实施方案中，基因转移法利用重组AAV载体或另一病毒载体或非病毒载体将靶基因的健康拷贝(例如，cDNA)递送至待移植的细胞。
在一些实施方案中，给药步骤发生在疾病症状发作之前或发生在疾病症状发作之后。在一些实施方案中，向眼睛或向另一个包含神经元的器官或组织给药。在一些实施方案中，借由注射给药。在一些实施方案中，借由视网膜下或玻璃体内注射给药。在一些实施方案中，借由直接视网膜注射给药。在一些实施方案中，借由角膜注射给药。在一些实施方案中，借由任何其他有效地将细胞递送至受试者眼睛的视网膜下位置、后段或角膜的给药方法来给药。
在一些实施方案中，该方法进一步包括：在给药或移植之前，对细胞进行基因型分析，以鉴定在表4中所阐述的一个或多个基因中存在或不存在遗传或表观遗传改变。在一些实施方案中，遗传或表观遗传改变为突变。在一些实施方案中，突变在CYP4V2核酸分子中。在一些实施方案中，该方法进一步包括：在给药之前，评估该受试者的眼睛以鉴定受损的或残留的光感受器、视网膜细胞或角膜细胞的区域及程度。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在给药之后监测该受试者。在一些实施方案中，监测包含进行非侵入性视网膜成像、角膜测试、视野测量、ERG、OCT、视敏度测试和/或功能研究。在一些实施方案中，监测包含评估受试者的免疫响应。在一些实施方案中，该方法进一步包括：在给药之后，评估该受试者的眼睛以鉴定受损的或残留的光感受器、视网膜细胞或角膜细胞的区域及程度。
细胞疗法-RNP权利要求
RNP权利要求
在另一方面中，提供一种组合物，其包括在核糖核蛋白(RNP)或蛋白质-RNA复合物中的：(a)靶向距离靶基因(“靶基因”)100bp或100bp内的核酸序列(“靶序列”)的CRISPR引导RNA，及(b)功能性CRISPR相关蛋白。
在一些实施方案中，该组合物进一步包括(c)供体核酸序列，该供体核酸序列包括靶基因的野生型序列或功能序列的全部或一部分，其用于校正或替代该靶基因或其一部分。在一些实施方案中，该靶基因涉及眼部发育或功能和/或其突变引起眼部疾病或为引起眼部疾病的风险因素。在一些实施方案中，该靶基因涉及神经元的发育或功能和/或其突变引起神经退化性疾病或为引起神经退化性疾病的风险因素。
在一些实施方案中，该靶基因为细胞色素P450基因。在一些实施方案中，该靶基因包括表4中所阐述的基因，该基因为突变的或有缺陷的，或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质。在一些实施方案中，供体核酸序列以单链供体寡核苷酸(ssODN)或载体形式提供。
在一些实施方案中，(a)该CRISPR引导RNA包括(i)CRISPR RNA(crRNA)，其包括与距离靶基因100bp或100bp内的靶序列互补的原型间隔区元件序列及对应于反式活化crRNA(tracrRNA)的互补区的序列，及(ii)tracrRNA，其包括与该crRNA的对应区域互补的区域及与CRISPR相关蛋白9(Cas9)相互作用的序列，且(b)该功能性CRISPR相关蛋白包含Cas9。
在一些实施方案中，原型间隔区元件为约20个碱基、约19个碱基、约21个碱基、约19-21个碱基、约18-22个碱基或约16-24个碱基。在一些实施方案中，crRNA及tracrRNA在不同的核酸分子中。在一些实施方案中，将crRNA及tracrRNA组合成单引导RNA(sgRNA)。在一些实施方案中，sgRNA为约88-150bp。
在一些实施方案中，Cas9包含Cas9直系同源物或突变型Cas9，其选自：酿脓链球菌(SpCas9)、SpCas9切口酶(Cas9n D10A)、SpCas9(D1135E)、eSpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9VRER、SpCas9 VQR、SpCas9EQR、金黄色葡萄球菌(SaCas9)、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜热链球菌、肺炎链球菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、变形链球菌、多杀性巴氏杆菌、长双歧杆菌、史氏芽孢杆菌、齿垢密螺旋体、犬支原体及粪肠球菌。
在一些实施方案中，(a)CRISPR引导RNA包含crRNA，该crRNA包含与距离靶基因100bp或100bp内的靶序列互补的原型间隔区元件序列，且(b)功能性CRISPR相关蛋白包含Cpf1。在一些实施方案中，原型间隔区元件为约20个碱基、约21个碱基、约22个碱基、约23个碱基、约24个碱基、约19-25个碱基、约18-26个碱基或约16-28个碱基。在一些实施方案中，CRISPR相关蛋白Cas9或Cpf1进一步包含一个、二个、三个或更多个位于N端和/或C端的核定位序列(NLS)，和/或选择标记物，其包括但不限于GFP或EGFP。
在一些实施方案中，原型间隔区元件与靶序列100％互补或含有1、2、3、4或5个对应于靶序列的核苷酸错配。在一些实施方案中，crRNA序列进一步包含G核苷酸，该G核苷酸任选地添加至crRNA序列紧接在原型间隔区元件之前。在一些实施方案中，CRISPR引导RNA、crRNA和/或tracrRNA或sgRNA经化学修饰。
在一些实施方案中，对于以ssODN提供的供体核酸序列，该供体核酸序列不超过约1kb、800bp、600bp、500bp、400bp、300bp、280bp、260bp、240bp、220bp或200bp；且对于以载体提供的供体核酸序列，该供体核酸序列不超过约30kb、25kb、20kb、15kb、10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4.5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、0.5kb、0.2kb或0.1kb。在一些实施方案中，靶基因的野生型形式编码酶。
在一些实施方案中，靶基因包括突变的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
在一些实施方案中，其任何一种或多种组分，包括CRISPR引导RNA、CRISPR相关蛋白和/或供体核酸序列，单独地和/或额外地以能够转录和/或翻译成该组分的载体、DNA和/或mRNA提供。在一个方面中，提供一种包括本文中所描述的组合物中的任一者的药学制剂。
在另一方面中，提供一种治疗受试者的由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因所引起的疾病的方法。此类方法包括借由向受试者施用本文中所描述的组合物中的任一者来破坏、校正或替代该基因。
在另一方面中，提供一种治疗受试者的由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因所引起的眼部疾病或改善与其相关的风险因素的方法。此类方法包括借由向受试者施用本文中所描述的组合物中的任一者来破坏、校正或替代该基因。
在另一方面中，提供一种治疗受试者的由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因所引起的神经退化性疾病或改善与其相关的风险因素的方法。此类方法包括借由向受试者施用本文中所描述的组合物中的任一者来破坏、校正或替代该基因。
在另一方面中，提供一种治疗受试者的由突变的或有缺陷的细胞色素P450基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的细胞色素P450基因所引起的疾病或改善与其相关的风险因素的方法。此类方法包括借由向受试者施用本文中所描述的组合物中的任一者来破坏、校正或替代该基因。
在一些实施方案中，被破坏、校正或替代的突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因为表4中所阐述的基因的突变的或有缺陷的形式，或表4中所阐述的基因的编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的形式。在一些实施方案中，突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因存在于成纤维细胞、血细胞、RPE细胞、光感受器细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、眼部细胞、视神经细胞、神经元细胞或干细胞或任何类型的衍生自干细胞的细胞中。
在一些实施方案中，将其中的组合物递送至成纤维细胞、血细胞、RPE细胞、光感受器细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、眼部细胞、视神经细胞、神经元细胞或干细胞或任何类型的衍生自干细胞的细胞。在一些实施方案中，递送借由电穿孔或经由脂质介导的转染或核转染或病毒转导或注射或其组合来进行。在一些实施方案中，其任何一种或多种组分，包括CRISPR引导RNA、CRISPR相关蛋白和/或供体核酸序列，经由选自由以下组成的群的递送系统向该受试者或向这些细胞施用：核糖核蛋白或蛋白质-RNA复合物、纳米颗粒、脂质体、微胞、病毒体、核酸复合物和/或其组合。
在一些实施方案中，该处理是对受试者体内进行的。在一些实施方案中，该处理是在以下细胞中体外进行的：成纤维细胞、血细胞、RPE细胞、光感受器细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、眼部细胞、视神经细胞、神经元细胞或干细胞或任何类型的衍生自干细胞的细胞。在一些实施方案中，将经处理的细胞体内移植至受试者，或若经处理的细胞为干细胞，则使该干细胞分化成用于移植的所期望类型的细胞，然后将经分化的细胞体内移植至受试者中。
在一些实施方案中，突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因被替代。在一些实施方案中，突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因中有一个或多个突变被校正或替代。在一些实施方案中，突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因被破坏。
在一些实施方案中，突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因中有1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-1000、1001-10000个碱基对的核苷酸或突变被破坏、校正或替代。在一些实施方案中，突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因的区域被破坏、校正或替代。在一些实施方案中，突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因的小于约10、8、6、4、2或1kb的区域被破坏、校正或替代。
在一些实施方案中，经由插入和/或删除核苷酸来破坏、校正或替代突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因。在一些实施方案中，在一个等位基因或二个等位基因中破坏、校正或替代突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因。在一些实施方案中，使用二种或更多种不同的CRISPR引导RNA、CRISPR相关蛋白和/或供体核酸序列来破坏、校正或替代突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能的蛋白质的基因中的一个或多个突变或缺陷。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，该方法改善眼的发育或功能，或预防眼、视网膜或角膜的退化。在一些实施方案中，该方法改善神经的发育或功能，或预防神经退化。在一些实施方案中，该方法改善P450酶的表达或功能。
在一些实施方案中，以供体核酸序列为基础的同源定向修复得到靶基因的内含子和/或外显子。在一些实施方案中，以供体核酸序列为基础的同源定向修复得到靶基因的剪接受体(splice acceptor)。此类方法可以进一步包括(c)包含表4中所阐述的靶基因的全部或一部分的供体核酸序列，其具有用于产生突变的或改变的靶基因或其一部分的突变或改变。
在一些方面中，提供一种产生由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因所引起的疾病的细胞疾病模型的方法，该方法借由在该基因中产生突变。此类方法包括经由本文中所描述的组合物中的任一者将此类基因递送至健康形式的细胞。在一些实施方案中，递送借由电穿孔或经由脂质介导的转染或核转染或病毒转导或显微注射或其组合进行。在一些实施方案中，这些细胞为成纤维细胞、血细胞、RPE细胞、光感受器细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、眼部细胞、视神经细胞、神经元细胞或干细胞或任何类型的衍生自干细胞的细胞。
在另一方面中，提供一种组合物，其包括含有表4中所阐述的突变的或有缺陷的基因的细胞。
在另一方面中，提供一种组合物，其包括含有以下基因的细胞：突变的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，该组合物包含本文中的权利要求中任一项的组合物。
在一些实施方案中，载体为AAV载体。在一些实施方案中，原型间隔区元件序列选自由SEQ ID NO:48至52组成的群，或与SEQ ID NO:48至52中之一者共用至少80％序列同一性，其用于与具有NGG作为原型间隔区相邻基序(PAM)的Cas蛋白质一起使用以靶向CYP4V2基因的c.802-8_810del17insGC突变。在一些实施方案中，供体核酸序列选自SEQ ID NO:56及57，或与SEQ ID NO:56及57或其互补序列中之一者共用至少90％序列同一性，其用于校正、破坏或替代CYP4V2基因的c.802-8_810del17insGC突变。
基因疗法权利要求
密码子最佳化的序列相关权利要求：
在一个方面中，提供一种核酸分子，其包括SEQ ID NO:2的编码人类CYP4V2蛋白质的核酸序列或与SEQ ID NO:2的核酸序列共用至少90％序列同一性的核酸序列。
在另一方面中，提供一种表达盒，其包括如本文中所描述的核酸分子及一个或多个可操作地连接至核酸序列的调节序列。在另一方面中，提供一种载体，其包括如本文中所描述的核酸分子或如本文中所描述的表达盒。
在一些实施方案中，载体为病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自由以下组成的群：重组腺病毒载体、重组慢病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体、重组仙台病毒载体(recombinant sendai virus vector)及重组逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体为重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体或质粒。在一些实施方案中，载体为质粒或非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体选自由裸核酸(nakednucleic acid)、脂质体、树状体(dendrimer)及纳米颗粒组成的群。
在一些实施方案中，宿主细胞包括本文中所描述的核酸分子中的任一者和/或本文中所描述的组合物中的任一者。在一些实施方案中，宿主细胞为细菌细胞、大肠杆菌细胞(E.Coli cell)、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为HEK293、希拉细胞(HeLa)、Vero、V27、A549、K562、B50、WI38、Hep G2或BHK细胞。
在另一方面中，使用本文中所描述的核酸分子中的任一者、本文中所描述的表达盒中的任一者或本文中所描述的载体中的任一者，在下列中表达由此类核酸分子所编码的产物：细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、RPE细胞、光感受器或光感受器祖细胞(PRC)、视网膜细胞、角膜细胞、眼部细胞、神经元、神经元细胞、血细胞、上皮细胞、体细胞、iPS细胞、ES细胞、MSC、成体干细胞、干细胞或任何衍生自干细胞的细胞。
EFS和/或SPA相关权利要求
在另一方面中，提供一种自身互补型腺相关病毒(self-complementary adeno-associated virus，scAAV)载体，其包括可操作地连接至编码多肽的核酸分子、干扰RNA分子或寡核苷酸的延伸因子1α短型(elongation factor 1αshort，EFS)启动子和/或小多腺苷酸化(polyadenylation，polyA)信号(SPA)。在一些实施方案中，EFS启动子由与SEQ IDNO:35具有至少80％序列同一性的核酸序列所组成且SPA由与SEQ ID NO:36具有至少80％序列同一性的核酸序列所组成。
在一些实施方案中，将scAAV载体递送至一细胞，使得由核酸分子所编码的产物在该细胞中表达。在一些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞为视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、眼部细胞、脑细胞、神经元、神经元细胞、iPS细胞、ES细胞、MSC、干细胞或任何衍生自干细胞的细胞。
在一个方面中，提供一种用以降低对病毒载体的免疫响应且保持基因疗法中的转导效率和/或使对具有同一种遗传疾病的不同患者的治疗效果最大化的方法。此类方法包括(a)建立多于一种重组病毒载体(例如，rAAV)的库，这些重组病毒载体在该基因疗法所针对的靶细胞类型中具有足够的转导效率。该病毒载体的库可以借由产生具有抗原区突变的变异体或在这些病毒载体的衣壳上产生其他突变或变异体来扩增，且这些突变或变异体经确认在与疾病有关的靶细胞中(例如，对针对BCD的CYP4V2基因疗法而言，是在iPS-RPE细胞系中)具有足够的转导效率；(b)检测需要该基因疗法的受试者中预先存在的针对不同病毒载体血清型和/或衣壳突变或变异体的中和抗病毒载体抗体(neutralizing anti-viralvector antibodies，NAb)，和/或测试及比较衍生自该受试者的患者特异性细胞(例如，iPS-RPE细胞)中的不同病毒载体；(c)从该病毒载体的库中选择具有足够的转导有效性且与该受试者中预先存在的NAb具有最低的交叉反应性的病毒载体和/或在受试者的患者特异性细胞中具有最佳表型拯救结果的一种病毒载体，该病毒载体的库包含不同血清型及衣壳经修饰的病毒载体(例如，包括但不限于衣壳突变型AAV和/或衣壳蛋白变异型AAV)；(d)使用选自(c)的病毒载体向该受试者给药；及(e)每当该受试者需要施用基因疗法时，重复以上的(b)至(d)(仅重复与预先存在的NAb相关的部分)，包括但不限于向同一只眼睛进行后续给药或向对侧眼睛或向其它器官给药。
在另一方面中，提供一种用于治疗或预防受试者的疾病的组合物，其包括有效量的载体及药学上可接受的载剂。该载体通常包括可操作地连接至调节序列的编码非突变型或功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子或其非病原性变异体。
在一些实施方案中，该疾病为结晶样视网膜色素变性(亦称为结晶样角膜视网膜变性；BCD)。在一些实施方案中，该疾病与受试者中的遗传或表观遗传改变相关。在一些实施方案中，该疾病为光感受器退化、视网膜色素上皮细胞退化、视网膜退化、角膜退化或脉络膜退化。在一些实施方案中，视网膜退化为视网膜色素变性(RP)。在一些实施方案中，视网膜退化为遗传性视网膜退化(IRD)。在一些实施方案中，该疾病为BCD。在一些实施方案中，该疾病为角膜变性。在一些实施方案中，该受试者具有BCD或处于罹患BCD的风险。
在一个方面中，提供一种载体，其包括可操作地连接至调节序列的编码非突变型或功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子或其非病原性变异体。
在一些实施方案中，载体为病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自由以下组成的群：腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、仙台病毒载体及逆转录病毒载体。在一些实施方案中，AAV为重组AAV(rAAV)。在一些实施方案中，rAAV包含AAV基因组或其衍生物，和/或AAV衣壳蛋白或其衍生物。在一些实施方案中，rAAV为嵌合AAV、重排AAV(shuffled AAV)或衣壳经修饰的AAV。
在一些实施方案中，AAV基因组或AAV衣壳蛋白来自以下中的任一者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV的另一天然衍生的血清型或分离株或分支(Glade)、或其任何衍生物或杂合体。在一些实施方案中，rAAV为假型化AAV(pseudotyped AAV)(例如，AAV2/5、AAV2/8、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/12、AAV2/10及AAV2/9)。在一些实施方案中，rAAV为杂合AAV(例如，AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9)。在一些实施方案中，rAAV经由定向进化(directed evolution)和/或合理设计来开发(例如，AAV 7m8或AAV-PHP.B)。
在一些实施方案中，该rAAV包含一个或多个衣壳突变(例如，Y-F、K-R、T-A、S-A和/或T-V突变(例如，AAV2具有Y444F、Y500F、Y730F、Y252F、Y272F、Y700F、Y704F及T491V中的一个或多个衣壳突变，或针对不同AAV血清型的相应突变(例如，AAV2/8(Y733F)、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)及AAV2(四Y-F+T-V(quadY-F+T-V)))))。在一些实施方案中，rAAV的血清型选自由以下组成的群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Anc80、rh10及ShH10。在一些实施方案中，rAAV载体选自由以下组成的群：AAV2/5、AAV2/8、AAV2/8(Y733F)、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/9、AAV2/6、AAV2/7、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV12、Anc80、AAV 7m8、AAV-DJ、ShH10、AAV-PHP.B，或其杂合体、衍生物或变异体。
在一些实施方案中，rAAV载体为单链AAV载体或自身互补型AAV(scAAV)载体。在一些实施方案中，载体为质粒或非病毒载体(例如，裸核酸、脂质体、树状体及纳米颗粒)。
在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含：(i)人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)；(ii)人类CYP4V2蛋白质或功能性CYP4V2蛋白质的变异体(例如，改变氨基酸和/或剪接变异体)(例如，SEQ ID NO:5)；(iii)功能性CYP4V2蛋白质的一个或多个片段(例如，SEQ ID NO:6)；(iv)来自其他物种的CYP4V2直系同源物中的一者或多者的序列的全部或一部分；(v)来自一种或多种其他P450蛋白质的序列的全部或一部分，其他P450蛋白质包括但不限于其他CYP4蛋白质及CYP46A1；(vi)能够改善、治疗或遏制患者细胞(例如，BCD患者的iPS-RPE细胞)中的表4中所列基因中的一者或多者的一种或多种生化异常的多肽；和/或(vii)以上各者的组合。
在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含SEQID NO:4、5或6中所示的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含选自由以下组成的群的氨基酸序列的全部或一部分：CYP4V2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1及CYP46A1(SEQ ID NO:4-18)及其衍生物、杂合体、变异体和/或片段。在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含选自由以下组成的群的氨基酸序列中的全部或部分：黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、蛙、马、兔及果蝇的CYP4V2(或CYP4V2的直系同源物)(SEQ ID NO:19-29)、及其衍生物、杂合体、变异体和/或片段。
在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含与选自由SEQ ID NO:4-29组成的群的序列中的任意者具有至少80％氨基酸序列同一性(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的多肽。在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含FxxGxxxCxG及ExxR(SEQ ID NO:30及31)的序列元件。在一些实施方案中，非突变型或功能性CYP4V2蛋白质为能够改善、治疗或遏制患者细胞(例如，BCD患者的iPS-RPE细胞)中的表4中所列基因中的一者或多者的一种或多种生化异常的化合物或试剂。
在一些实施方案中，核酸分子编码根据权利要求43至50中任一项的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质。在一些实施方案中，核酸分子编码包含SEQ ID NO:4、5或6中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4、5或6中的任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质。在一些实施方案中，核酸分子与SEQ ID NO:1、2或3中的序列中的任意者具有至少60％序列同一性。在一些实施方案中，核酸分子与SEQ ID NO:1、2或3中的序列中的任意者具有至少70％序列同一性。在一些实施方案中，核酸分子与SEQ IDNO:1、2或3中的序列中的任意者具有至少75％序列同一性。在一些实施方案中，核酸分子与SEQ ID NO:1、2或3中的序列中的任意者具有至少76％序列同一性。在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:1、2或3中所示的序列。
在一些实施方案中，调节序列包含启动子。在一些实施方案中，启动子为RPE细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、角膜细胞特异性启动子、眼部细胞特异性启动子或组成型启动子(constitutive promoter)。在一些实施方案中，启动子为哺乳动物β肌动蛋白启动子或病毒启动子。
在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的群：CAG启动子(杂合CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白启动子，亦称为CAGGS启动子、CB启动子或CBA启动子)、鸡β肌动蛋白启动子、小CBA(smCBA)启动子、CBSB启动子或CBh启动子、诸如人类β肌动蛋白启动子的另一β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短型(EFS)启动子、延伸因子1α短型(EF-1α)启动子、CMV启动子、PGK启动子、UBC启动子、GUSB启动子、UCOE启动子、VMD2(卵黄状黄斑变性2(vitelliformmacular dystrophy 2)；亦称为BEST1)启动子、RPE65启动子或其杂合体或衍生物。
在一些实施方案中，启动子为CAG启动子(杂合CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白启动子，亦称为CAGGS启动子、CB启动子或CBA启动子)、延伸因子1α短型(EFS)启动子、延伸因子1α短型(EF-1α)启动子或CMV启动子或其衍生物或杂合体。在一些实施方案中，调节序列包含增强子。
在一些实施方案中，增强子为病毒增强子，包括但不限于WPRE增强子、HPRE增强子、CTE增强子，或其衍生物或杂合体。在一些实施方案中，调节序列包含多腺苷酸化(polyA)信号。在一些实施方案中，polyA信号为牛生长激素多腺苷酸化信号(bGH polyA)、小polyA信号(SPA)、人类生长激素多腺苷酸化信号(hGH polyA)、SV40 polyA信号、SV40晚期polyA信号或其衍生物或杂合体。在一些实施方案中，调节序列包含科札克序列(Kozaksequence)(SEQ ID NO:37或38)。
在一些实施方案中，组合物与适合用于特定给药途径的载剂及额外组分来配制。
在另一方面中，提供一种宿主细胞，其包括本文中所描述的载体中的任一者。
在另一方面中，提供一种治疗或预防受试者的眼睛疾病的方法，该方法包括向该受试者施用载体，其中该载体包含可操作地连接至调节序列的编码人类CYP4V2蛋白质或功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子或其非病原性变异体。
在一个方面中，提供一种预防、遏制或减缓进展或改善眼部细胞的功能障碍、变性、病症、退化和/或死亡的方法，该方法包括向眼部细胞递送载体，其中该载体包含可操作地连接至调节序列的编码人类CYP4V2蛋白质或功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子或其非病原性变异体。
在一些实施方案中，疾病为结晶样视网膜色素变性(亦称为结晶样角膜视网膜变性；结晶样视网膜病变；Bietti视网膜变性；BCD)。在一些实施方案中，受试者患有其他由CYP4V2基因突变引起的眼科临床定义的病状(例如，遗传性视网膜退化(IRD)、视网膜色素变性(RP)或角膜变性)。在一些实施方案中，眼睛疾病为光感受器退化、视网膜色素上皮细胞退化、视网膜退化、角膜变性或BCD。
在一些实施方案中，载体为病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自由以下组成的群：重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体、重组仙台病毒载体及重组逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体为rAAV载体。在一些实施方案中，rAAV载体包含选自以下任何血清型的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV的另一天然衍生的血清型或分离株或分支、或其杂合体、变异体或衍生物。
在一些实施方案中，rAAV载体5'AAV ITR选自以下中的任一者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV的另一天然衍生的血清型或分离株或分支、或其突变、嵌合体、变异体或融合物。在一些实施方案中，rAAV载体3'AAVITR选自以下中的任一者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV的另一天然衍生的血清型或分离株或分支、或其突变、嵌合体、变异体或融合物。在一些实施方案中，rAAV为嵌合AAV、重排AAV或衣壳经修饰的AAV。在一些实施方案中，rAAV为假型化AAV(例如，AAV2/5、AAV2/8、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/12、AAV2/10及AAV2/9)。在一些实施方案中，rAAV为杂合AAV(例如，AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9)。在一些实施方案中，rAAV经由定向进化和/或合理设计来开发(例如，AAV 7m8或AAV-PHP.B)。
在一些实施方案中，该rAAV包含一个或多个衣壳突变(例如，Y-F、K-R、T-A、S-A和/或T-V突变(例如，AAV2具有Y444F、Y500F、Y730F、Y252F、Y272F、Y700F、Y704F及T491V中的一个或多个衣壳突变，或针对不同AAV血清型的相应突变(例如，AAV2/8(Y733F)、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)及AAV2(四Y-F+T-V))))。在一些实施方案中，rAAV的血清型选自由以下组成的群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Anc80、rh10及ShH10。在一些实施方案中，rAAV载体选自由以下组成的群：AAV2/5、AAV2/8、AAV2/8(Y733F)、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/9、AAV2/6、AAV2/7、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV12、Anc80、AAV 7m8、AAV-DJ、ShH10、AAV-PHP.B，或其杂合体、衍生物或变异体。
在一些实施方案中，rAAV载体为单链AAV载体或自身互补型AAV(scAAV)载体。在一些实施方案中，载体为质粒或非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体选自由裸核酸、脂质体、树状体及纳米颗粒组成的群。
在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含：(i)人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)；(ii)人类CYP4V2蛋白质或功能性CYP4V2蛋白质的变异体(例如，改变氨基酸和/或剪接变异体)(例如，SEQ ID NO:5)；(iii)功能性CYP4V2蛋白质的一个或多个片段(例如，SEQ ID NO:6)；(iv)来自其他物种的CYP4V2直系同源物中的一者或多者的序列的全部或一部分；(v)来自一种或多种其他P450蛋白质的序列的全部或一部分，其他P450蛋白质包括但不限于其他CYP4蛋白质及CYP46A1；(vi)能够改善、治疗或遏制患者细胞(例如，BCD患者的iPS-RPE细胞)中的表4中所列一个或多个基因中的一种或多种生化异常的多肽；和/或(vii)以上各者的组合。
在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含SEQID NO:4、5或6中所示的氨基酸序列的全部或一部分。在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含选自由以下组成的群的氨基酸序列的全部或一部分：CYP4V2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1及CYP46A1(SEQ ID NO:4-18)及其衍生物、杂合体、变异体和/或片段。
在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含选自由以下组成的群的氨基酸序列中的部分的全部：黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、蛙、马、兔及果蝇的CYP4V2(或CYP4V2的直系同源物)(SEQ ID NO:19-29)、及其衍生物、杂合体、变异体和/或片段。在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含与选自由SEQ ID NO:4-29组成的群的序列中的任意者具有至少80％氨基酸序列同一性(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的多肽。
在一些实施方案中，由核酸序列编码的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质包含FxxGxxxCxG及ExxR(SEQ ID NO:30及31)的序列元件。在一些实施方案中，非突变型或功能性CYP4V2蛋白质为能够改善、治疗或遏制患者细胞(例如，BCD患者的iPS-RPE细胞)中的表4中所列基因中的一者或多者的一种或多种生化异常的化合物或试剂。在一些实施方案中，核酸分子编码根据权利要求91至97中任一项的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质。在一些实施方案中，核酸分子编码包含SEQ ID NO:4、5或6中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4、5或6中的任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的非突变型或功能性CYP4V2蛋白质。在一些实施方案中，编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子具有SEQ ID NO:1、2或3中所示的核酸序列。在一些实施方案中，编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子与SEQ ID NO 1、2或3中的任一者具有至少60％的序列同一性。
在一些实施方案中，调节序列包含启动子。在一些实施方案中，启动子为RPE细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、角膜细胞特异性启动子或眼部细胞特异性启动子。在一些实施方案中，启动子为组成型启动子。在一些实施方案中，启动子为哺乳动物β肌动蛋白启动子或病毒启动子。
在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的群：CAG启动子(杂合CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白启动子，亦称为CAGGS启动子、CB启动子或CBA启动子)、鸡β肌动蛋白启动子、小CBA(smCBA)启动子、CBSB启动子或CBh启动子、诸如人类β肌动蛋白启动子的另一β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短型(EFS)启动子、延伸因子1α短型(EF-1α)启动子、CMV启动子、PGK启动子、UBC启动子、GUSB启动子、UCOE启动子、VMD2(卵黄状黄斑变性；亦称为BEST1)启动子、RPE65启动子或其杂合体或衍生物。在一些实施方案中，启动子为CAG启动子(杂合CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白启动子，亦称为CAGGS启动子、CB启动子或CBA启动子)、延伸因子1α短型(EFS)启动子、延伸因子1α短型(EF-1α)启动子或CMV启动子或其衍生物或杂合体。
在一些实施方案中，调节序列包含增强子。在一些实施方案中，增强子为病毒增强子，其包括但不限于WPRE增强子、HPRE增强子、CTE增强子，或其衍生物或杂合体。在一些实施方案中，调节序列包含多腺苷酸化(polyA)信号。在一些实施方案中，polyA信号为牛生长激素多腺苷酸化信号(bGH polyA)、小polyA信号(SPA)、SV40 polyA信号、人类生长激素多腺苷酸化信号(hGH polyA)、SV40晚期polyA信号或其衍生物或杂合体。在一些实施方案中，调节序列包含科札克序列(SEQ ID NO:37或38)。
在一些实施方案中，对于体外治疗，以约1×103GC/细胞至约1×106GC/细胞的剂量(MOI)感染靶细胞(GC：基因组拷贝，测量含有基因组的AAV颗粒(又名载体基因组(vectorgenome，vg)或基因组颗粒(genome particle，gp))。在一些实施方案中，对于向受试者的眼睛的体内给药，单次给药可为大概约从1×106至2×1013GC的量级(例如，约1×1011GC至约1×1012GC的高剂量范围、约1×1010GC至约1×1011GC的中等剂量范围、约1×109GC至约1×1010GC的低剂量范围、约1×106GC至约1×109GC的极低剂量范围及约1×1012GC至约2×1013GC的极高剂量范围)，或在这些范围内的足够提供所期望的效果的任何剂量。
在一些实施方案中，施用步骤发生在疾病症状发作之前或发生在疾病症状发作之后。在一些实施方案中，向眼睛给药。在一些实施方案中，借由视网膜下注射给药。在一些实施方案中，借由玻璃体内注射给药。在一些实施方案中，借由直接视网膜注射给药。在一些实施方案中，借由任何其他有效地将载体递送至受试者的视网膜下位置、眼睛后段、角膜或RPE细胞、光感受器细胞或角膜上皮细胞的给药方法来给药。
在一些实施方案中，借由角膜递送给药。在一些实施方案中，借由经由血流递送而达成眼睛给药。在一些实施方案中，经由滴眼剂给药。在一些实施方案中，借由递送至晶状体来给药。在一些实施方案中，给药至视网膜下腔、角膜、晶状体中或给药至玻璃体中。在一些实施方案中，眼部细胞选自由以下组成的群：视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器细胞(PRC)、角膜上皮细胞(CEC)、脉络膜内皮(CE)细胞、视网膜细胞、角膜细胞、晶状体细胞、神经节细胞、视神经细胞和/或脉络膜细胞，以及衍生自干细胞(包括但不限于iPSC、ES细胞、MSC、成体干细胞和/或组织特异性干细胞)的这些类型的细胞。
在一些实施方案中，本文中所描述的方法可以进一步包括鉴定具有BCD或处于罹患BCD的风险的受试者。
EFS和/或SPA在包含编码Cas的核酸序列的rAAV载体中的用途相关权利要求
在一个方面中，提供一种组合物，其包括重组腺相关病毒(rAAV)载体，该载体包含可操作地连接至编码CRISPR相关蛋白(Cas)的核酸分子的延伸因子1α短型(EFS)启动子和/或小多腺苷酸化(polyA)信号(SPA)。
在一些实施方案中，EFS启动子由与SEQ ID NO:35具有至少80％序列同一性的核酸序列所组成，且SPA由与SEQ ID NO:36具有至少80％序列同一性的核酸序列所组成。在一些实施方案中，由可操作地连接至EFS启动子和/或SPA的核酸序列所编码的Cas是Cas9或Cpf1。
提供包括如本文中所描述的rAAV的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为细菌细胞、大肠杆菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞为体细胞或干细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、眼部细胞、脑细胞、神经元、神经元细胞、iPS细胞、ES细胞、MSC、成体干细胞、组织特异性细胞、干细胞或任何衍生自干细胞的细胞。在一些实施方案中，将rAAV载体递送至宿主细胞，使得由核酸分子所编码的Cas在细胞中表达。在一些实施方案中，宿主细胞包含根据权利要求131至134中任一项的任何细胞。
本发明的其他特征及优势根据实施方式、附图说明及实施例以及权利要求将变得显而易见。本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目及其他参考文献均以全文引用的方式并入。
【附图说明】
在以下图示及图式中进一步说明本发明，这些图示及图式不限制权利要求中所描述的本发明的范畴。
细胞系专利：
图1：衍生自BCD患者的iPS细胞系
(a)由BCD患者的皮肤活检样品的成纤维细胞产生的iPS细胞：
(i)患者1(P1)iPS细胞
(ii)患者2(P2)iPS细胞
(iii)以Oct-4、Sox-2及SSEA-4标记物特征化P1及P2 iPS细胞系
(iv)以Nanog及Tra-1-60标记物特征化P1及P2 iPS细胞系
(b)由BCD患者及健康对照组产生的来自血液样品的外周血单核细胞(PBMC)的iPS细胞：
(i)iPS细胞系的相位差影像(phase contrast image)
(ii)iPS细胞系的AP染色结果
(c)由BCD患者衍生的iPS细胞核型影像，显示了显然正常的人类核型。
图2：衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系：
(a)衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的光场照片，显示了RPE独特形态-六角形、色素沉着及单层：
(i)P1 iPS-RPE细胞
(ii)P2 iPS-RPE细胞
(b)BCD患者的iPS-RPE细胞的RPE标记物结果，显示RPE特异性标记物RPE65、CRALBP及MITF的存在。
图3：iPS-RPE样品中的CYP4V2表达的qRT-PCR结果。WT(对照组)。WT AVE(对照组的平均值)。P1(BCD患者1)。P1-AAV8(经AAV8.CYP4V2fv以MOI＝1.5×10e4 GC/细胞处理的P1样品)。
图4：iPS-RPE样品中的CYP4V2op表达的qRT-PCR结果。WT(对照组)。WT AVE(对照组的平均值)。P1及P2(BCD患者1及患者2)。P1-AAV2(经AAV2.CYP4V2op以2×10e4 GC/细胞的MOI处理的P1样品)。P2-AAV2(经AAV2.CYP4V2op以2×10e4 GC/细胞的MOI处理的P2样品)。P2-scAAV1(经scAAV1.CYP4V2op以2×10e4 GC/细胞的MOI处理的P2样品)。
图5：未暴露于蓝光的iPS-RPE样品的细胞活力影像。WT(对照组)。P1及P2(BCD患者1及患者2)。红色(死/病细胞)；绿色(活/健康细胞)。图5(a)：只有红色。图5(b)：红色及绿色。
图6：iPS-RPE样品在暴露于蓝光1小时后的细胞活力影像。WT(对照组)。P1及P2(BCD患者1及患者2)。红色(死/病细胞)；绿色(活/健康细胞)。图6(a)：只有红色。图6(b)：红色及绿色。
基因疗法：
图7：示范性CYP4V2表达盒及重组AAV(rAAV)载体的示意图及对其的注释。
(a)包装于单链AAV(ssAAV)载体中的CYP4V2表达盒(含增强子)
(b)包装于单链AAV(ssAAV)载体中的CYP4V2表达盒(无增强子)
(c)包装于自身互补型AAV(self-complementary AAV，scAAV)或ssAAV载体中的CYP4V2表达盒。
注释：可以将CYP4V2表达盒(如图所示，侧接有AAV ITR)包装于具有来自任何AAV血清型或其杂合体或变异体的衣壳的rAAV载体中。ITR：反向末端重复序列(Invertedterminal repeats)(可为AAV2 ITR或来自其他AAV血清型的ITR)。示范性AAV2 ITR序列显示于SEQ ID NO:42及43中。CYP4V2：编码人类CYP4V2蛋白质或其功能变异体的cDNA，例如编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)的CYP4V2st(SEQ ID NO:1)或CYP4V2op(SEQ ID NO:2)，或编码功能性CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:5)的CYP4V2fv(SEQ ID NO:3)。紧接在CYP4V2cDNA序列的前插入科札克序列(序列显示于SEQ ID NO:37或38中)。CAG：杂合CAG启动子(示范性序列显示于SEQ ID NO:32中)。亦可使用本文中所论述的其他启动子，包括但不限于CMV启动子(示范性序列显示于SEQ ID NO:40中)或EF-1α启动子(示范性序列显示于SEQ IDNO:41中)。WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(示范性序列显示于SEQ ID NO:33中)。bGH polyA：牛生长激素多腺苷酸化信号(示范性序列显示于SEQ ID NO:34中)。可以使用替代性polyA信号，例如SV40晚期poly A信号(示范性序列显示于SEQ ID NO:39中)。EFS：延伸因子1α短型(EFS)核心启动子。示范性序列显示于SEQ ID NO:35中。SPA：小polyA信号。示范性序列显示于SEQ ID NO:36中。突变/截短ITR：scAAV载体中所用的两个ITR中之一者为突变/截短ITR(显示为ITR*)。示范性序列显示于SEQ ID NO:44中。增强子在CYP4V2表达盒中是可选的。
图8：BCD患者衍生的iPS-RPE样品在暴露于蓝光1小时后的细胞活力影像(无AAV.CYP4V2处理对比用AAV2.CYP4V2op或scAAV1.CYP4V2op以1×10e5 GC/细胞的MOI处理)。P1及P2(BCD患者1及患者2)。红色(死/病细胞)；绿色(活/健康细胞)。图8(a)：只有红色。图8(b)：红色及绿色。
图9：BCD患者衍生的iPS-RPE样品在暴露于蓝光1小时后的细胞活力影像(无AAV.CYP4V2处理对比用AAV5.CYP4V2op、AAV5.CYP4V2st或AAV8.CYP4V2fv以1×10e5 GC/细胞的MOI处理)。P1(BCD患者1)。红色(死/病细胞)；绿色(活/健康细胞)。图9(a)：只有红色。图9(b)：红色及绿色。
图10：BCD患者衍生的iPS-RPE样品在暴露于蓝光1小时后的细胞活力影像(无AAV.CYP4V2处理对比用AAV5.CYP4V2op、scAAV1.CYP4V2op或scAAV5.CYP4V2op以1×10e4GC/细胞的MOI处理)。P2(BCD患者2)。红色(死/病细胞)；绿色(活/健康细胞)。图10(a)：只有红色。图10(b)：红色及绿色。
图11：BCD患者衍生的iPS-RPE样品在暴露于蓝光1小时后的细胞活力影像(无AAV.CYP4V2处理对比用scAAV9.CYP4V2op以1×10e5 GC/细胞的MOI处理)。P1(BCD患者1)。红色(死/病细胞)；绿色(活/健康细胞)。图11(a)：只有红色。图11(b)：红色及绿色。
细胞疗法：
图12显示CYP4V2序列的区域及引导RNA(guide RNA，gRNA)相对于c.802-8_810del17insGC突变设计的位置及用于gRNA活性分析的引物(橘色箭头)
图13显示体外surveyor分析。泳道1：扩增子+Cas9；泳道2：扩增子+g1+Cas9；泳道3：扩增子+g2+Cas9；泳道4：扩增子+g3+Cas9；泳道5：扩增子+g4+Cas9；泳道6：扩增子+g5+Cas9；泳道7：仅扩增子；泳道M：1kb DNA标记物。
图14为序列比较，确认surveyor分析中所用的DNA来源。上方：未经处理的扩增子；中间：来自经g2处理的扩增子的片段；下方：CYP4V2基因座，指出了突变位点。
图15为gRNA载体建构的图解说明。
图16为gRNA(以g1为例)、Cas9及PuroR共表达质粒pX459-hSpCas9-2A-Puro的载体图谱。
图17显示在pX459-hSpCas9-2A-Puro质粒中，gRNA(以g1为例)相对于U6启动子的位置。U6启动子与gRNA之间的“G”核苷酸用于增强由U6启动子驱动的转录效率。当使用不同启动子时或当gRNA始于“G”核苷酸时，其为任选的而非必需的。
定义
应理解，如本说明书及权利要求中所使用的“一个(a)”或“一种(an)”可以视其所处的上下文而意谓一个或多个。因此，举例而言，提及“一个细胞”时意谓“至少一个细胞”或“多于一个细胞”。
术语“约”或“大约”或符号“～”是指在给定值或状态的正或负10％(包括端值)范围内。除非上下文另有明确说明，否则本文中所提供的所有数值均由术语约来修饰。
术语“AAV.CYP4V2”是指包含编码功能性CYP4V2蛋白质的多核苷酸的重组腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体。
术语“CYP4V2基因疗法”是指将功能性CYP4V2蛋白质或编码功能性CYP4V2蛋白质的多核苷酸引入细胞和/或受试者中。参见本揭示内容中的详述论述。
术语“有效量”或“有效剂量”或“治疗有效剂量”是指化合物(例如，载体)和/或细胞在向需要治疗的受试者施用时足以实现和/或适合实现此治疗的量。有效量将视所使用的治疗剂的具体活性、患者的疾病病况的严重程度及受试者的年龄、身体状况、其他疾病病况的存在情况及营养状况而变化。另外，患者正在接受的其他药物和/或治疗亦将影响待施用治疗剂的有效量的确定。关于更详细的论述，参见本文中的说明。
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指为了包括下列的目的而施用如本文中所揭示的组合物(例如，包含转基因的AAV和/或细胞)至受试者：1)预防疾病或病状或提供保护以免患上该疾病或病状，亦即使得临床症状不发展；2)抑制疾病或病状，亦即遏制、减缓、改善或抑止临床症状的发展；3)减轻疾病或病状，亦即引起临床症状消退；和/或4)替代受疾病影响的的细胞、组织和/或器官和/或恢复其丧失的功能。在一些实施方案中，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指减轻疾病或病状；亦即引起临床症状消退。在一些实施方案中，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”交替地或另外地是指有需要的受试者的防治性治疗(prophylactic treatment)。防治性治疗可借由向具有受病痛影响的风险的受试者提供适当剂量的治疗剂，从而实质上避免病痛发作来实现。熟习此项技术者应理解，因为最重要的诱导事件可能是未知的或潜在的，或患者可能直到事件出现很久之后才被确诊，所以并不总能区分“预防”与“抑止”。因此，如本文所用的术语“防治(prophylaxis)”意欲作为“治疗”的要素以涵盖如本文中所定义的“预防”及“抑止”两者。
术语“受试者”是指动物，诸如哺乳动物，例如人类。本文中所描述的方法可以适用于人类治疗、临床前及兽医应用。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物，且在一些实施方案中，受试者为人类。
“变异体”为与参考生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白质，其保留该生物活性蛋白的至少一部分治疗和/或生物活性。举例而言，与参考生物活性蛋白相比，变异蛋白可以具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性。术语“生物活性蛋白”包括经过故意修饰的蛋白质，如例如借由定点诱变、插入或偶然经由突变来进行修饰。“变异体”包括“片段”，其为天然或非天然生物活性蛋白的保留至少一部分治疗和/或生物活性的截短形式。
术语“核酸”在本文中用以指所有形式的核酸、多核苷酸及寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。核酸包括基因组DNA、cDNA及RNA。多核苷酸包括天然产生的、合成的及经故意修饰或改变的多核苷酸。多核苷酸可为单链体、双链体或三链体，线性或环状，且可为任何长度。特定多核苷酸的序列或结构在本文中可以根据以5'至3'方向提供序列的惯例来描述。
术语“序列变异体”意谓相比于其天然或初始序列已借由一个或多个核苷酸或氨基酸插入、缺失和/或取代而修饰的基因或多肽。插入可以位于基因或蛋白质的任一端或两端，和/或可以定位于核苷酸序列或氨基酸序列的内部区域内。在缺失变异体中，如本文中所描述的基因或多肽中的一个或多个核苷酸或氨基酸残基被去除。在取代变异体中，基因或多肽的一个或多个核苷酸或氨基酸残基被去除且用替代性残基替代。在一个方面中，取代本质上为保守的，且此类型的保守取代为此项技术中所熟知的。
如本文中所使用的术语“疗法”或“治疗”可以体内施用于受试者或体外施用于细胞中。
如本文中所使用的质粒为一种类型的载体。
如本文中所使用的术语“经基因修复的”或“基因修复”是指一细胞最初在基因中携带遗传缺陷(例如，突变或病理性改变)，但经由基因校正或破坏细胞的基因组DNA或mRNA(本文中被定义为“基因编辑”、“基因编辑疗法”或“基因校正”)，或经由将表达对应于有缺陷的基因的功能蛋白的外源核酸分子基因转移至该细胞或向该细胞补充该外源核酸分子(本文中定义为“基因转移疗法”或“基因疗法”)，其遗传缺陷已被修复。
如本文中所使用的术语“序列同一性百分比”或“序列同一性”应如下测定及计算。在计算序列同一性(百分比)时，排比两个序列并确定该两个序列之间相同匹配的核苷酸或氨基酸残基的数目。相同匹配的数目除以排比区域的长度(亦即，所排比的核苷酸或氨基酸残基的数目)并乘以100，得到序列同一性百分比数值(且上舍入至下一个较高的整数(例如，65.01％将上舍入至66％且出于本文的目的视为66％))。应了解，排比区域的长度可为一个或两个序列的一部分至较短序列的整个净长度(不施加空位(gap))大小。为了确定两个蛋白质编码核苷酸序列之间的相同匹配并计算序列同一性，应该在提交两个序列用于排比及计算序列同一性之前先去除任何非编码核苷酸序列(例如但不限于内含子、UTR、科札克序列、启动子、增强子或其他调节序列)。为了确定两个序列之间的核苷酸或氨基酸残基的相同匹配的数目而进行的两个序列的排比可以借由使用双序列排比(PairwiseSequence Alignment)EMBOSS Needle来进行，该双序列排比EMBOSS Needle使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(可在欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute，EMBL-EBI)获得及在万维网：ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html上获得关于核苷酸排比及ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/获得关于蛋白质排比)及使用默认参数(关于核苷酸序列，使用：矩阵：EDNAFULL。空位开放罚分(Gap Open Penalty)：10。空位扩展罚分(Gap Extend Penalty)：0.5。输出格式：一对。末端空位罚分(End Gap Penalty)：假的。末端空位开放罚分(End Gap OpenPenalty)：10。末端空位扩展罚分(End Gap Extend Penalty)：0.5。关于蛋白质序列，使用：矩阵：EBLOSUM62。空位开放罚分：10。空位扩展罚分：0.5。输出格式：一对。末端空位罚分：假的。末端空位开放罚分：10。末端空位扩展罚分：0.5)来创建两个序列的最佳全局排比(global alignment)。
术语“腺相关病毒载体(adeno-associated virus vector)”是指衍生自以下的核酸：任何AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12血清型，或任何其他在其衣壳蛋白序列方面与AAV血清型的衣壳蛋白享有同源性的病毒或血清型。术语“重组腺相关病毒”或“rAAV”是指由封装所关注的核酸分子的AAV蛋白质外壳构成的传染性复制缺陷型病毒，在该核酸分子的一侧或两侧侧接有AAV ITR。如本文中所使用，提及特定AAV血清型时意谓具有该AAV血清型的至少一种衣壳蛋白的AAV。举例而言，术语“AAV2”是指具有至少一种AAV血清型2衣壳蛋白的AAV。
术语“CYP4V2”是指细胞色素P450 4V2或细胞色素P450家族4亚家族V多肽2(有时称为CYP4AH1)，及其于其他物种中的直系同源物(orthologues)。CYP4V2中的突变与BCD(参见例如Li等人,Am J Hum Genet.74:817-826,2004)及视网膜色素变性(参见例如Wang等人,PLOS ONE 7:e33673,2012)相关。全长基因组人类CYP4V2基因的长度为约22,053bp且可以例如在万维网genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝CYP4V2&keywords＝CYP4V2上找到该基因。如本文中所使用的术语“hCYP4V2”是指人类CYP4V2基因或蛋白质。应理解，hCYP4V2及CYP4V2可以指含有遗传或表观遗传改变的基因或蛋白质或不含遗传或表观遗传改变的基因或蛋白质。
如本文中所使用的术语“功能性CYP4V2”是指能够有效地向个体(例如，在CYP4V2分子中具有遗传或表观遗传改变的个体)提供治疗益处(例如，改善或拯救靶细胞中的异常脂肪酸水平(例如，DHA水平))的蛋白质或在表达时产生该蛋白质的核苷酸分子。功能性CYP4V2分子可以对应于野生型hCYP4V2序列或其天然产生的变异体(例如，多态性变异体；例如不含病理性改变的变异体)或最佳化序列。在一些实施方案中，功能性CYP4V2分子为来自另一物种(例如，另一哺乳动物，诸如啮齿动物、兔、狗、猪或非人类灵长类动物)的与人类CYP4V2享有相似直系同源性(orthology)的CYP4V2分子。举例而言，人类CYP4V2序列的直系同源物为鼠类mCyp4v3序列。在一些实施方案中，功能性CYP4V2分子为另一P450分子(例如，CYP4蛋白质)。
术语“眼部细胞”是指眼中或与眼功能相关的任何细胞，包括但不限于视网膜细胞、视网膜双极细胞、光感受器细胞或光感受器祖细胞(包括视杆和/或视锥，统称“PRC”)、神经节细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、脉络膜上皮(CE)细胞、角膜上皮细胞(CEC)、脉络膜细胞或角膜细胞或视神经细胞。
术语“功能丧失”或“功能障碍”是指细胞功能(例如，光感受器功能、光感受器细胞功能、视网膜色素上皮细胞功能、晶状体功能、脉络膜功能或角膜功能)相比于正常非受疾病影响的细胞或相比于另一只眼睛或同一只眼睛在较早时间点时有所下降或丧失。如本文中所使用的“退化”、“萎缩”、“病症”、“疾病”和/或“变性(dystrophy)”在功能丧失方面可以同义地使用。术语“增加的功能”意谓相比于受疾病影响的的眼睛(具有相同眼部疾病)、同一只眼睛在较早时间点时、同一只眼睛的未治疗部分或同一名患者的对侧眼睛，改善功能(例如，光感受器、光感受器细胞、视网膜色素上皮细胞、脉络膜细胞或角膜细胞的功能)或增加功能性光感受器或细胞(例如，光感受器细胞、视网膜色素上皮细胞、脉络膜细胞或角膜细胞)的数目或百分比。
术语“转基因(transgene)”是指意欲引入或已引入细胞或生物体中的供体核酸。转基因包括任何基因，诸如表4中所阐述的基因或cDNA。
术语“药学上可接受的制剂”及“生理学上可接受的制剂”及“药学上可接受的载剂”意谓生物学上可接受的制剂、气体、液体或固体或其混合物，其适合一种或多种给药途径、体内递送、体外递送或接触，且可包括针对其他疾病的疗法(例如针对其他眼部疾病的基因疗法或细胞疗法)中所用的制剂或载剂。“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”组合物为一种非在生物学上或其他方面非所欲的材料，例如该材料可施用至个体而不引起实质性非所欲的生物效应。因此，此药学组合物可用于例如施用蛋白质、多核苷酸、质粒、病毒载体或纳米颗粒至细胞或受试者。这些组合物包括但不限于与药物施用或体内或体外接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳剂(例如，水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散及悬浮介质、包衣、等张剂及吸收促进剂或延迟剂。水性及非水性溶剂、溶液及悬浮液可以包括悬浮剂、润滑剂及增稠剂。这些药学上可接受的载剂包括锭剂(有包衣或无包衣)、胶囊(硬的或软的)、微珠、粉末剂、颗粒剂及晶体。亦可在组合物中掺入补充性活性化合物(例如，防腐剂、抗细菌剂、抗病毒剂及抗真菌剂及免疫抑制剂)。如本文中所阐述或熟习此项技术者所知，可以将药学组合物配制成与特定的给药或递送途径相容。因此，药学组合物包括适合于借由各种途径给药的载剂、稀释剂或赋形剂。
术语“crRNA”是指CRISPR RNA，其含有原型间隔区元件(protospacer element)及与tracrRNA互补的额外核苷酸两者。
术语“tracrRNA”是指反式活化crRNA(transactivating crRNA)，其与crRNA杂合并结合于Cas9蛋白质，活化复合物以在基因组序列内的特异性位点创造双链断裂。
术语“sgRNA”是指单引导RNA(single-guide RNA)，其将crRNA与tracrRNA组合成单一RNA构建体，该crRNA及tracrRNA为酿脓链球菌(S.pyogenes)中的天然CRISPR/Cas9系统中的单独的分子。
术语“PAM”是指“原型间隔区相邻基序(protospacer adjacent motif)”，其为被CRISPR核酸酶识别为切割位点的基因组任一链中的短序列。PAM随核酸酶(例如，Cas9、Cpf1等)而变。原型间隔区元件序列通常直接位于PAM位点上游。
术语“原型间隔区元件”(亦称为“引导RNA”或“CRISPR gRNA”或“gRNA”或g1、g2、g3、g4、g5等)是指crRNA(或sgRNA)的与基因组DNA靶序列互补的部分。
DHA：二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid)，一种多元不饱和ω-3脂肪酸，亦称为22:6(ω-3)或C22:6n3。
AA：花生四烯酸(Arachidonic Acid)，一种多元不饱和ω-6脂肪酸，亦称为20:4(ω-6)或C20:4n6或ARA。
PBS(+)：含钙与镁的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)。
PBS(-)：不含钙或镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
【具体实施方式】
较佳实施方案的详细说明
用于BCD细胞疾病模型的方法及组合物
开发恰当的BCD疾病模型并确定BCD的分子水平表型对于BCD相关的研究、针对BCD的药物及治疗选项的开发及测试至关重要。其对CYP4V2功能的研究亦很重要。如本文背景部分中所概述，自80年前以来，已经特征化、建立并研究了BCD的临床表型，对导致BCD的遗传突变的鉴定已超过十年。然而，临床表型(例如，BCD患者的视网膜中的晶体样沉积物)与潜在的CYP4V2突变之间仍存在差距。
先前关于BCD的研究发现，在BCD患者中，包括在成纤维细胞、淋巴细胞及血清中，脂肪酸水平异常。举例而言，在Lee等人,The Metabolism of Fatty Acids in HumanBietti Crystalline Dystrophy,Invest Ophthalmol Vis Sci.2001年7月；42(8):1707-14中，研究人员使用脉冲追踪法(pulse-chase method)来研究BCD患者的成纤维细胞及淋巴细胞中的异常。将BCD患者及正常对照组的成纤维细胞及淋巴细胞与[(14)C]18:3n-3或[(14)C]18:2n-6一起孵育。来自具有BCD的患者的成纤维细胞显示，18:3n-3转化成多元不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的转化相比于正常受试者而言降低，但18:2n-6的转化未降低。在另一项研究(Lai等人,Alterations in Serum Fatty AcidConcentrations and Desaturase Activities in Bietti Crystalline DystrophyUnaffected by CYP4V2 Genotypes,Invest Ophthalmol Vis Sci 2010；51:1092-7)中，研究人员使用GC-MS来分析BCD患者及对照组的血清样品中的血清脂肪酸浓度。该研究发现，在BCD患者的血清中，十八酸(18:0)的浓度比对照组受试者中高，而且十八碳二烯酸(18:1n-9)的浓度比对照组受试者中低。此外，BCD中的总单不饱和脂肪酸浓度显著低于对照组中的。然而在不使用BCD患者样品作为研究受试者的另一项研究(Nakano等人,CYP4V2 inBietti’s Crystalline Dystrophy:Ocular Localization,Metabolism ofomega-3-Polyunsaturated Fatty Acids,and Functional Deficit of the p.H331P Variant,MolPharmacol 82:679-686,2012)中，结果表明，CYP4V2酶具有对ω-3-PUFA的ω-羟化酶活性。
重要的是确认BCD患者的成纤维细胞及血清中所发现的异常脂肪酸水平是否实际上存在于BCD患者的RPE细胞中，RPE细胞为BCD的致病细胞。因此，需要一种能允许直接研究BCD患者的RPE细胞的BCD疾病模型来对BCD疾病病理学及CYP4V2功能获得更多了解，以及评定潜在治疗选项的功效。然而，鉴于RPE的位置及BCD的罕见性，从BCD患者获得天然RPE细胞是不实际的。
本揭示内容提供BCD细胞模型及用以产生BCD细胞模型的方法。BCD细胞模型由BCD患者特异性干细胞(包括但不限于诱导性多能干细胞(iPSC)、胚胎干(ES)细胞、体(或成体)干细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC))及衍生自BCD患者的任何干细胞的眼部细胞(包括但不限于RPE细胞、光感受器(视杆或视锥)细胞、光感受器祖细胞、角膜上皮细胞、晶状体细胞和/或脉络膜细胞)所组成。除了患者特异性干细胞之外，BCD细胞模型亦可借由在没有BCD的受试者的细胞中创建人工CYP4V2突变来产生，且这些细胞可为ES细胞、iPS细胞或其他干细胞或任何可以被重编程成为干细胞的细胞或任何眼部细胞(无论是否衍生自干细胞)。
诱导性多能干细胞技术为动物模型的疾病模型化提供了另一种选择。然而，并非所有疾病都能使用iPSC成功模型化。(Urbach,A.,Bar-Nur,O.,Daley,G.Q.&Benvenisty,N.Differential Modeling of Fragile X Syndrome by Human Embryonic Stem Cellsand Induced Pluripotent Stem Cells.Cell Stem Cell 6,407-411(2010))。此外，鉴于所报导的与BCD相关的脂肪酸合成代谢，尚不清楚是否可以借由iPS技术产生BCD患者特异性iPS或患者特异性iPS-RPE细胞。
A.诱导多能性
诱导性多能干细胞(iPSC)的制造方法为本发明所属技术领域中已知的。几乎所有类型的体细胞都可被用作iPSC重编程的源细胞。简言之，iPSC可以借由将特定的一组蛋白质(例如，编码特定的一组蛋白质的核酸或借由蛋白质的直接递送)引入细胞中而制得。熟习此项技术者应理解，一种示范性非限制性方法是借由引入一个或多个编码OCT4、SOX2、KLF4和/或c-MYC中的一者或多者的转基因(例如，“山中因子(Yamanaka factors)”)。在一些实施方案中，重编程使用所有四个转录因子。在一些实施方案中，可以使用一个、两个或三个转录因子。Li等人,Stem Cells,2009；27:2992-3000。Zhu等人,Cell Stem Cell 2010；7:651-655。在一些实施方案中，iPSC可以借由直接递送重编程蛋白而产生。Kim等人,CellStem Cell.2009；4(6):472-6。实施例部分提供使用非整合方法，例如借由仙台病毒(Sendai virus)(实施例1)或借由附加型方法(实施例2)产生iPSC的方法。然而，任何产生iPSC的方法被思量于本揭示内容的范畴内。
可使用各种方法(例如，仙台病毒、附加型方法、具有或不具有小分子)产生iPSC，参见实施例部分，亦参见例如Hubbard等人,J.Vis.Exp.,2014,92:52009。此外，本发明所属技术领域中已知从多种不同细胞类型制造iPSC的方法。参见例如Hayashi等人,2012,PLoSOne,7(9):e45435；Poon等人2015,PLoS One,10(7):e0131288；Lamba等人2010,PLoS One,5(1):e8763。iPSC通常表达可检测水平的至少一种标记物，其包括但不限于Oct-4、Sox-2、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、AP和/或NANOG。
可以使用任何类型的干细胞产生本文中所描述的BCD细胞模型，其包括但不限于诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(hematopoetic stem cell，HSC)、胚胎干(ES)细胞、间充质干细胞、成体干细胞或组织特异性干细胞。用于本文中所描述的方法中的干细胞可为多能(pluripotent)、多潜能(multipotent)或全能(totipotent)干细胞。
如本文中所使用的术语“多能”是指细胞至少能够发育成外胚层、内胚层及中胚层细胞中之一者。在一个实施方案中，术语“多能”是指细胞为全能的及多潜能的。如本文中所使用的术语“全能”细胞是指细胞能够发育成所有谱系的细胞。如本文中所使用的术语“多潜能”是指未发生终末分化(terminally differentiated)的细胞。本文中揭示内容的多能细胞可为任何干细胞，或使用本发明所属技术领域中已知的诱导、去分化及核转移方法，由非多能细胞(诸如成纤维细胞)所产生。本文中所描述的多能细胞无论是干细胞还是由非多能细胞所产生，都可以来自具有BCD或具有CYP4V2突变的受试者，或来自不具有BCD以用作对照组或用于创建人工CYP4V2突变的健康受试者。
几乎任何类型的细胞都可以被重编程成为iPS细胞。参见本文标题为“细胞起源”的小节中的论述。
B.iPSC的分化
将BCD患者iPS细胞分化成iPS-RPE细胞(或另一类型的眼部细胞(例如，iPS-CEC、iPS-CE细胞或iPS-PRC)。将iPSC分化成RPE细胞或另一类型的眼部细胞(例如，CEC及PRC)的方法为已知的。参见例如实施例部分；Hayashi等人,2012,PLoS One,7(9):e45435；Songstad等人,Investigative Ophthalmology&Visual Science 2015年12月,第56卷,8258-8267；及Lamba等人,PLoS One.2010年1月20日；5(1):e8763。举例而言，可以产生从细胞重编程的诱导性多能干细胞(iPSC)并将这些细胞进一步分化成例如RPE细胞(本文中称为“iPS-RPE”)、角膜上皮细胞(本文中称为“iPS-CEC”)、光感受器细胞(或光感受器祖细胞；本文中称为“iPS-PRC”)或iPS-脉络膜内皮(CE)细胞(称为“iPS-CE”)。
测试经分化的细胞(例如iPS-RPE细胞)的生化功能(如本文中及实施例部分中所描述)，以相比于健康对照组的iPS-RPE细胞评定其生化缺陷/异常。
如本文中所描述般产生的iPS-RPE细胞系展现能指示RPE细胞的形态(例如，色素沉着及六角形)和/或表达一种或多种能指示RPE细胞的生物标记物。RPE细胞(及iPS-RPE细胞)的生物标记物为已知的且包括但不限于RLBP1(又名CRALBP)、RPE65、斑萎蛋白-1(BESTROPHIN-1)、MITF、黏着斑蛋白(VINCULIN)、LRAT、RDH5、PAX6、MERTK、TYR和/或ZO-1中的一者或多者，且可用以判定或确认RPE分化已经发生。同样地，CEC(及iPS-CEC)及PRC(及iPS-PRC)的生物标记物为已知的且包括例如针对角膜上皮细胞的细胞角蛋白12(cytokeratin 12)及细胞角蛋白3；及针对光感受器的Crx、针对视杆及视锥的恢复蛋白(recoverin)及针对视杆的Nrl。
经由如实施例部分中所描述的iPS重编程及RPE分化方法，BCD患者特异性iPS及iPS-RPE细胞可被成功地产生。
C用以鉴定BCD患者的iPS-RPE细胞中的生化缺陷/异常的生化分析及用以评定RPE萎缩的细胞活力分析
一组生化分析被开发并被使用来评定及测定BCD患者特异性iPS-RPE细胞中的表型。
首先，我们的生化分析中包括了较为完整的脂肪酸列表。在先前的研究中已鉴定到BCD患者中的异常的血清脂肪酸水平，测试样品中的以下脂肪酸：16:0、16:1、18:0、18:1n-9、18:2n-6、18:3n-3、20:3n-6、20:4n-6、22:5n-3、22:6n-3、24:0及24:1。该研究发现，在BCD患者的血清中，十八酸(18:0)的浓度比对照组个体中高，而且十八碳二烯酸(18:1n-9)的浓度比对照组个体中低。为了判定在BCD患者特异性iPS-RPE细胞中是否存在相同的脂肪酸异常及是否有更多其他脂肪酸的异常，使用LC-MS开发一项涵盖更多脂肪酸的生化分析(参见表2)。
此外，为了判定BCD患者特异性iPS-RPE细胞是否携带除了脂肪酸之外的其他异常，在该分析中包括其他脂质种类，包括神经酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)及神经鞘氨醇及二氢鞘氨醇(SOSA)，以便分析BCD疾病模型中的表型并测定CYP4V2蛋白质的生化功能。参见表2的用以测试BCD患者特异性iPS-RPE细胞的生化分析中所包括的不同种类及化合物的列表。
出人意料地，测试结果(参见实施例部分)显示，BCD患者特异性iPS-RPE细胞具有一种脂肪酸异常谱(fatty acids abnormality profile)，其不同于BCD患者的血清中所发现的。
眼睛为人体的感光器官。BCD始于RPE萎缩，RPE萎缩继而引起光感受器死亡及视觉丧失。RPE的关键功能为光吸收(Strauss,2005,The retinal pigment epithelium invisual function.Physiol Rev 85:845-81)。暴露于环境光可能影响人类视网膜退化的发展及进展，人类视网膜退化诸如年龄相关性黄斑退化(age-related maculardegeneration，AMD)及视网膜色素变性(RP)。在眼部疾病模型中暴露于光的使用为适合研究视网膜退化的模型系统。包括暴露于蓝光在内的暴露于光已广泛用于视网膜研究中(Dual roles of polyunsaturated fatty acids in retinal physiology andpathophysiology associated with retinal degeneration,Masaki Tanito&RobertAnderson(2009)Clinical Lipidology,4:6,821-827.Seko等人,Graefes Arch Clin ExpOphthalmol.2001年1月；239(1):47-52.Blue light-induced apoptosis in culturedretinal pigment epithelium cells of the rat.Narimatsu等人,Exp Eye Res.2015年3月；132:48-51.Blue light-induced inflammatory marker expression in the retinalpigment epithelium-choroid of mice and the protective effect of a yellowintraocular lens material in vivo)。蓝光存在于环境光中，诸如阳光及人工照明(例如，办公室照明)，以及来自电子显示装置，诸如TV、显示器、智能手机、笔记本电脑及平板电脑(Moon等人,Blue light effect on retinal pigment epithelial cells by displaydevices,Integr Biol(Camb).2017,22；9(5):436-443.doi:10.1039/c7ib00032d)。
在此研究中，细胞活力分析发现了BCD细胞模型中的RPE萎缩。暴露于(蓝色)光在BCD患者的iPS-RPE样品中引起的细胞死亡显著高于在对照组样品中所引起的。BCD的临床表型(亦即RPE萎缩)在BCD细胞模型中为明显的。AAV.CYP4V2在BCD细胞模型中展现出拯救RPE萎缩的功效。
D.BCD细胞模型的应用
除了评定与BCD相关的细胞水平表型之外，BCD细胞模型亦可用于疾病模型的其他应用，包括但不限于药物筛选、开发治疗剂或装置、测定剂量范围、安全性及毒性测试、针对BCD或其他与CYP4V2相关的病状测试不同制剂、或研究CYP4V2功能及用途，包括但不限于开发及筛选包含或表达CYP4V2蛋白质的药物，例如CYP4V2基因疗法。此外，BCD患者特异性iPS-RPE(及其他由BCD患者特异性干细胞衍生的眼部细胞，其包括但不限于iPS-光感受器细胞、iPS-角膜细胞)可以用作细胞疗法，以未经修饰的形式使用或在基因修复(例如，借由如本文中所描述的基因转移或基因编辑)之后使用。实施例部分提供BCD细胞模型应用的非限制性实例的实例。
E.筛选化合物的方法
值得注意的是，本文中所描述的iPSC-RPE细胞系可以提供人类细胞疾病模型(例如，BCD、视网膜色素变性、IRD)。可被统称为“iPSC-眼部细胞”的这些iPSC-RPE细胞、iPSC-CEC细胞或iPSC-PRC细胞，可用于BCD患者或视网膜色素变性患者或具有另一类型的遗传性视网膜疾病的患者的诊断、预后、预测疾病发作、严重程度及进展率。举例而言，这些iPSC-眼部细胞系亦可用于筛选出测试化合物中可能具有治疗或预防与CYP4V2核酸中的遗传或表观遗传改变相关的疾病(例如，BCD)的治疗功效的化合物。
本文中所描述的多能细胞，尤其是由在CYP4V2中具有遗传或表观遗传改变的受试者或具有眼睛疾病(例如，BCD)的受试者产生的多能细胞，可以作为研究工具用于鉴定能作为用于治疗、诊断、预后或预防眼睛疾病(例如，BCD)的治疗候选者的化合物的方法中。应理解，测试化合物可以是任何类型的化合物。其可具有天然来源或可以借由化学合成产生。其可为一具有下列的库(library)：结构限定的化合物、未特征化的化合物或物质或化合物混合物。熟习此项技术者应了解，测试化合物可为，但不限于，核酸或其类似物、多肽或其类似物、抗体、化学制品及小分子。
可以在存在或不存在测试化合物的情况下评估本文中所描述的细胞的生长能力及其在动物模型中(例如，在动物模型的眼睛中)的功能并评估其形成肿瘤的倾向或没有这种倾向。可以使用多种方法来评估细胞，其包括但不限于PCR技术、免疫分析和/或脂质/脂肪酸代谢分析。
用于细胞疗法的方法及组合物
如本文中所论述，CYP4V2基因疗法展现出校正BCD患者特异性iPS-RPE细胞中的生化异常的功效。然而，基因疗法在体内起作用的前提条件是受试者仍有一些RPE及光感受器细胞留在正被治疗的眼睛中。关于眼中只留下少量或没留下RPE细胞或光感受器细胞的晚期BCD患者，细胞疗法可以作为替代方案或与基因疗法组合使用，作为一种治疗选项。
细胞疗法涉及移植新细胞来替代死细胞或退化细胞。关于BCD，新细胞可为RPE细胞、光感受器细胞(视锥和/或视杆)、光感受器祖细胞、脉络膜细胞、角膜上皮细胞、晶状体细胞或其他类型的眼部细胞，这取决于受试者中哪种类型的细胞显示出退化并需要替代。以下说明及本文中的实施例使用iPS-RPE细胞来说明这些方法及过程。可将其应用于其他类型的眼部细胞。
针对BCD及其他类型的眼部疾病的细胞疗法可以如下分类，其他类型的眼部疾病包括但不限于遗传性视网膜疾病(IRD)、视网膜色素变性(RP)、黄斑退化(包括年龄相关性黄斑退化(AMD))。
(1)同种异体移植：
在一个实施方案中，可以在同种异体移植中使用来自健康供体的RPE细胞、PRC、CEC、CE细胞及其他衍生自胚胎干细胞(ESC)或iPSC的眼部细胞作为BCD的细胞疗法。其涉及将来自健康个体(亦即不含CYP4V2突变者)的健康ESC或iPSC分化成RPE细胞及将该ESC-RPE细胞移植至BCD患者的眼睛。本文在实施例部分中提供重编程iPSC及将ESC或iPSC分化成RPE的方法。在先前的研究中，胚胎干细胞(ESC)衍生的RPE细胞已被使用来治疗年龄相关性黄斑退化(AMD)，参见Schwartz等人,Investigative Ophthalmology&Visual Science2016年4月,第57卷,ORSFc1-ORSFc9。同种异体移植物(allo-graft)或同种异体移植的优点是它比自体移植便宜，因为一共同来源可用于治疗多位患者。然而，其亦有显著的缺点，诸如宿主受试者的免疫排斥可能显著地影响其功效及持续时间。此外，其需要长期免疫抑制剂，这可能导致严重的全身性副作用。最后，使用ESC可能会产生道德问题。
(2)无基因修复的自体移植：
在一个实施方案中，可以在针对BCD的细胞疗法中使用自体细胞。一个此类自体来源为衍生自BCD患者的iPS细胞及iPS-RPE细胞，其可被移植至该BCD患者的眼睛。BCD为相对晚发性疾病。BCD患者的症状通常在生命的第2、第3或甚至第4个十年间出现。此外，iPS重编程方法对iPS细胞及衍生自iPS细胞的细胞具有一定程度的“重置时钟(reset the clock)”作用。因此，衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞及其他iPS-眼部细胞可以作为细胞疗法使用而移植至BCD患者，甚至不需要对iPS-RPE细胞中的CYP4V2突变进行任何基因修复。提供iPS重编程及RPE分化方法于本文中的实施例部分中。作为预防措施，无论iPS重编程及RPE分化过程期间是否产生任何致病突变，都可以进行全基因组测序来比较iPS或iPS-RPE细胞中的基因组DNA与源细胞(例如，成纤维细胞或血细胞)中的基因组DNA。
(3)用于针对BCD及其他类型的IRD及RP的细胞疗法的经基因修复的患者自体细胞
本揭示内容在此提供用于产生供细胞疗法用的经基因修复的自体细胞的方法及组合物。如本文中所使用的“经基因修复的”或“基因修复”是指经由基因编辑患者的基因组(例如，直接在染色体上使用例如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、锌指、TALEN)或经由将通常不整合至基因组中的CYP4V2基因的健康拷贝(cDNA、RNA或其他形式)基因转移至患者细胞中(例如，如文本中所描述的CYP4V2基因疗法)或校正或补偿患者细胞中的有缺陷的mRNA来校正CYP4V2突变。
至于由遗传突变引起的疾病，用于在针对BCD或另一IRD或RP的细胞疗法中使用的自体细胞理想地应该在移植之前就已修复其遗传缺陷(亦即CYP4V2突变)和/或其功能异常性CYP4V2蛋白质。在一个实施方案中，该基因修复可以借由如本文中所论述的基因转移疗法来达成，包括但不限于编码及表达功能性CYP4V2蛋白质的核酸序列的AAV介导的基因疗法转移。本文中提供CYP4V2基因转移疗法的组合物及方法，参见本文中的详细描述及实施例部分。BCD患者特异性源细胞iPS或iPS-RPE细胞可以用AAV.CYP4V2(如本文中所提供)处理，接着进行iPS重编程和/或RPE分化(若适用)及验证改良的生化功能(如本文中所提供)，然后移植至原患者的眼睛。在另一实施方案中，该基因修复可以借由基因编辑来达成，例如校正BCD患者细胞中的基因组或RNA中的CYP4V2突变。除了作为细胞疗法的一部分在体外施用之外，该基因编辑亦可作为基因疗法直接在体内施用。该基因编辑可以对患者的源细胞(例如，成纤维细胞或血细胞)、iPS、iPS-RPE或其他类型的iPS-眼部细胞进行。用于产生患者特异性iPS及iPS-RPE的iPS重编程及RPE分化可以在基因修复(例如，基因转移疗法或基因编辑)之前或之后进行。
本揭示内容在此提供经由基因编辑校正CYP4V2突变的组合物及方法。本文实施例部分中的描述说明了使用CRISPR/Cas9构建体校正BCD患者中最常见的突变c.802-8_810del17insGC突变的组合物及方法。其亦可用于其他基因编辑方法(例如，CRISPR/Crp1、TALEN、锌指)及其他IRD突变(例如，但不限于，表1中的其他CYP4V2突变)，与本发明所属技术领域中已知的方法相组合。
BCD患者中最常见的CYP4V2突变为c.802-8_810del17insGC(是指17个碱基缺失且两个碱基(GC)插入于从CYP4V2基因的内含子6的末端起8个碱基的位置中，亦称为IVS6-8del/insGC，参见SEQ ID NO:46，其显示包含c.802-8_810del17insGC突变的人类CYP4V2基因组DNA区域的序列，及SEQ ID NO:47，其显示相应的野生型序列)。c.802-8_810del17insGC突变展示于以下显示人类CYP4V2内含子6-外显子7接合(human CYP4V2intron 6-exon 7junction)的序列中。内含子6序列以小写字母显示且外显子7序列以大写字母显示。17bp缺失及GC插入位于括号内)：caa aca gaa gca tgt gat tat cat tca aa(tca tac agG TCA TCG CT)(GC)GAA CGG GCC AAT GAA ATG AAC GCC AAT GA(SEQ ID NO:46)，导致预测其跳过外显子7。(Xiao等人,Biochem Biophys Res Commun.409:181-6,2011；Meng等人,2014,Mol.Vis.,20:1806-14；Wada等人,Am J Ophthalmol.139:894-9,2005；Jiao等人,European Journal of Human Genetics(2017)25,461-471)。最近的研究估计，c.802-8_810del17insGC突变的存在时间在中国族群中为1,040至8,200世代且在日本族群中为300至1100世代。参见Jiao等人,European Journal of Human Genetics(2017)25,461-471。
细胞疗法(cell therapy)(亦称为细胞疗法(cellular therapy)或细胞疗法(cytotherapy))可如本文中所描述般使用，用于治疗或预防受试者的眼睛疾病。如本文所描述，本文中所提及的BCD、某些RP、IRD及其他眼睛疾病系与CYP4V2核酸序列中的遗传或表观遗传改变相关。
细胞疗法一般涉及注射、植入、移植或以其他方式递送包括细胞的组合物至受试者(例如，至患者的组织或器官(例如，眼睛)中)。本文中所描述的方法是独特的，因为其允许了对具有眼睛疾病的受试者的经基因修复的自体细胞疗法。
本文中所描述的方法包括：从具有眼睛疾病(例如，与CYP4V2核酸序列中的遗传或表观遗传改变相关)的受试者获得细胞并使用例如基因编辑来修复CYP4V2核酸(例如，DNA或RNA)内的突变，或经由递送编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸序列来修复(例如，基因转移)。在将细胞施用返回至受试者中(例如，至受试者的眼中)之前，可以使细胞变成多能细胞(例如，借由诱导多能性，例如以制造iPSC)且可以将其分化成一个或多个眼部细胞(例如，iPS-RPE、iPS-CEC、iPS-PRC)。应了解，可以在细胞变成多能细胞之前或之后或在细胞分化成眼部细胞之后对细胞进行基因修复。
A.细胞起源
在一些情况下，可以在本文中所描述的细胞疗法方法中使用自体细胞(例如，受试者(例如，患者)-特异性细胞)。举例而言，可以从受试者获得诸如成纤维细胞或外周血单核细胞(PBMC)的细胞且使用这些细胞产生iPSC，如实施例部分中所描述。几乎所有类型的细胞都可用于产生iPSC，因此都可用作源细胞。在一些情况下，可以使用从尿液(参见例如Zhou等人,2012,Nat.Protoc.,7:2080-9)或毛囊或真皮乳头细胞(dermal papilla cells)(参见例如Muchkaeva等人,2014,Acta Naturae,6:45-53)获得的细胞来产生iPSC。
B.诱导多能性
诱导性多能干细胞(iPSC)的制造方法为本发明所属技术领域中已知的。简言之，iPSC可以借由将特定的一组蛋白质(例如，编码特定的一组蛋白质的核酸)引入细胞中而制得。熟习此项技术者应理解，一种示范性非限制性方法是借由引入一个或多个编码OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC(例如，“山中因子”)的转基因。在一些实施方案中，重编程使用所有四个转录因子。在一些实施方案中，可以使用一个、两个或三个转录因子。Li等人,Stem Cells,2009；27:2992-3000。Zhu等人,Cell Stem Cell 2010；7:651-655。在一些实施方案中，iPSC可以借由直接递送重编程蛋白而产生。Kim等人,Cell Stem Cell.2009；4(6):472-6。实施例部分提供使用非整合方法，例如借由仙台病毒(实施例1)或借由附加型方法(实施例2)产生iPSC的方法。然而，任何产生iPSC的方法被思量于本揭示内容的范畴内。
可使用各种方法(例如，仙台病毒、附加型方法、具有或不具有小分子)产生iPSC，参见实施例部分，亦参见例如Hubbard等人,J.Vis.Exp.,2014,92:52009。此外，本发明所属技术领域中已知从多种不同细胞类型制造iPSC的方法。参见例如Hayashi等人,2012,PLoSOne,7(9):e45435；Poon等人2015,PLoS One,10(7):e0131288；Lamba等人2010,PLoS One,5(1):e8763。iPSC通常表达可检测水平的至少一种标记物，其包括但不限于Oct-4、Sox-2、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、AP和/或NANOG。
可以在本文中所描述的细胞疗法方法中使用任何类型的干细胞，其包括但不限于诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)、胚胎干(ES)细胞、间充质干细胞、成体干细胞或组织特异性干细胞。用于本文中所描述的方法中的干细胞可为多能、多潜能或全能干细胞。
如本文中所使用的术语“多能”是指细胞至少能够发育成外胚层、内胚层及中胚层细胞中之一者。在一个实施方案中，术语“多能”是指细胞为全能的及多潜能的。如本文中所使用的术语“全能”细胞是指细胞能够发育成所有谱系的细胞。如本文中所使用的术语“多潜能”是指未发生终末分化的细胞。本发明的多能细胞可为任何干细胞，或使用本发明所属技术领域中已知的诱导、去分化及核转移方法，由非多能细胞(诸如成纤维细胞)所产生。本文中所描述的多能细胞，无论是干细胞还是由非多能细胞所产生者，都可以来自具有BCD或具有CYP4V2突变的受试者或健康个体。
iPSC可借由以下中的一者或多者来特征化：a.iPSC的独特形态；b.一种或多种多能性标记物，诸如Oct-4、Sox-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog及AP；c.分化成所欲细胞类型(例如，RPE细胞)的能力；和/或d.畸胎瘤分析。以上各者并非全部都是特征化iPSC及验证多能性所必须的(例如，畸胎瘤(teratoma)；参见例如Buta等人,2013,Stem CellRes.,11(1):552-562)。
C.基因编辑
在本文中所描述的方法中可以使用多种基因编辑技术来修复受试者的CYP4V2核酸中所存在的遗传或表观遗传改变。基因编辑可以使用任何数目的技术进行，这些技术包括成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)技术(参见例如美国专利第8,697,359号；第8,889,418号；第8,999,641号；及US 2014/0068797)、转录活化因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALEN)技术(参见例如Li等人,2011,NucleicAcids Res.,39(14):6315-25)或锌指核酸酶技术(参见例如Wright等人,2005,The PlantJ.,44:693-705)。
为了使用CRISPR技术完成基因编辑，可以将编码核酸酶(例如，时常是Cas9核酸酶，但亦可以使用其他核酸酶(例如，其他Cas核酸酶，例如Cpf1，或非Cas核酸酶))的核酸并入一个或多个载体中，并如本文中所描述的施用于受试者。仅举例而言，本文中所描述的细胞(例如，在重编程成iPSC前的受试者细胞、在分化成RPE、角膜上皮细胞或光感受器细胞之前或在分化成RPE、角膜上皮细胞或光感受器细胞之后的受试者iPSC(本文中称为“iPSCs-RPE”、“iPSC-CEC”或“iPSC-PRC”))可以用一种或多种含有和/或编码至少一种引导RNA(gRNA)、至少一种CRISPR相关蛋白(例如，Cas9或Cpf1)及至少一种供体模板核酸的构建体(例如，载体、RNP、mRNA)转导或转染。在一些实施方案中，不需要供体模板核酸，例如当经由敲除(knock out)达成基因修复时。
同样地，为了使用TALEN技术完成基因编辑，可以将编码TALEN(例如，二聚转录因子/核酸酶)的核酸并入载体中并如本文中所描述的施用于受试者。同样，为了使用锌指核酸酶技术完成基因编辑，可以将编码定制DNA核酸内切酶(custom DNA endonuclease)(例如，异二聚体，其中各亚基含有锌指域(zinc finger domain)及FokI核酸内切酶域(FokIendonuclease domain))的核酸并入一个或多个载体中并如本文中所描述的施用于受试者。
进行这些技术中的每一者所需的组分可在商业上获得且可针对特定靶序列定制。参见例如Caribou Biosciences；GenScript,CRISPR Therapeutics；Editas Medicine；Cellectis Bioresearch；Life Technologies；Sangamo BioSciences；或Sigma AldrichChemical Co.。
在适当情况下，可以发生基因编辑，使得受试者的CYP4V2核酸中的遗传或表观遗传改变被修复，从而使功能性CYP4V2蛋白质被表达。当CYP4V2核酸(例如，CYP4V2 mRNA)的存在被恢复、CYP4V2蛋白质的存在被恢复、或CYP4V2蛋白质的功能被恢复时，CYP4V2核酸序列得到修复。同样地，“修复”或“校正”可以指将受影响序列(例如，遗传或表观遗传改变)恢复为如本文中所描述的野生型序列或另一非突变序列。
可能有一些欲使用基因编辑将一个或多个突变引入细胞中(例如，CYP4V2核酸中)的情况。这是一种可创建疾病(例如，BCD)的细胞模型的方式。举例而言，可以对胚胎干细胞(ES细胞)进行基因编辑以产生具有人工CYP4V2突变的细胞系，然后将这些细胞系分化成RPE细胞。或者，可以对来自健康受试者(例如，非BCD受试者)的iPS细胞系或对RPE细胞系(例如，ARPE-19细胞系)进行基因编辑以产生CYP4V2突变型iPS或RPE细胞系。
在一些情况下，在基因编辑步骤完成之后筛选细胞(例如，使用全基因组测序)以确认所靶向的突变已被修复且未发生显著的脱靶编辑(off-target editing)是所欲的。
CRISPR及CRISPR相关蛋白9(Cas9)被称为CRISPR-Cas9，由RNA引导的核酸酶(RNA-guided nuclease)(Cas9)及引导RNA(guide RNA)组成，产生位点特异性DNA断裂，这些断裂借由内源性细胞机制来修复。该方法的可能结果包括经由诱变性非同源性末端接合(non-homologous end-joining，NHEJ)使特异性位点突变、在断裂位点产生插入或缺失(插入缺失(indels))、及使用从外源引入的供体模板经由同源重组(homologous recombination，HR)精确改变基因组序列。CRISPR引导RNA由两个RNA构成，这两个RNA被称为CRISPR靶向RNA(crRNA，在本文中又称为CRISPR RNA)及反式活化crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)。crRNA通常为约20个核苷酸(nt)长。其借由沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)与靶DNA序列杂交且引导Cas核酸内切酶切割靶基因组DNA。
为了经由基因编辑基因修复最常见的CYP4V2突变，各种CYP4V2突变CRISPR校正构建体(参见实施例部分)被开发。使用CRISPR是因为其实施起来较为简单且其编辑效率高于其他形式的基因编辑，诸如TALEN及锌指核酸酶。CRISPR构建体含有经过最佳化及体外验证的gRNA序列及不同的构建体选项，其可以很容易地用于校正BCD患者细胞系中的c.802-8_810del17insGC突变，产生可用于针对BCD的细胞疗法中的经基因修复的细胞，该细胞疗法包括但不限于自体细胞疗法。
CRISPR基因编辑疗法涉及使用CRISPR相关蛋白(Cas)，其为核酸酶及CRISPR引导RNA。CRISPR引导RNA的作用为将Cas引导至被CRISPR引导RNA靶向的序列，其是经由CRISPR引导RNA中所含的与靶序列互补(或对靶序列具有特异性)的原型间隔区元件。为了使Cas(例如，Cas9或Crf1)结合至及切割靶序列或靶序列附近，亦需要存在原型间隔区相邻基序(PAM)序列。PAM序列为一短延伸DNA(short stretch of DNA)(通常为2-6个核苷酸)，其供作为Cas的结合信号。不同的Cas可以具有不同的PAM及切割模式。举例而言，对于酿脓链球菌Cas9(SpCas9)，典型的PAM序列为NGG。对于金黄色葡萄球菌(SaCas9)，PAM序列为NGRRT或NGRRN。对于脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis，NM)及齿垢密螺旋体(Treponemadenticola，Td)，PAM序列分别为NNNNGATT及NAAAAC。经工程改造或突变的Cas亦能引起PAM序列改变。举例而言，SpCas9 VQR变异体(D1135V、R1335Q及T1337R)的PAM序列为NGAN或NGNG。SpCas9 EQR变异体(D1135E、R1335Q及T1337R)的PAM序列为NGAG。SpCas9 VRER变异体(D1135V、G1218R、R1335E及T1337R)的PAM序列为NGCG。对于Cpf1，PAM序列为TTTN。Cas通常产生双链断裂(double-stranded break，DSB)，但被改变的Cas则会引起单链断裂(例如，SpCas9切口酶(SpCas9 Nickase)(Cas9n D10A))或不引起断裂(dCas9)。Cas9在PAM位点上游3nt处产生平末端(blunt end)，而Cpf1则以交错方式切割，在远离PAM 18-23个碱基处产生5核苷酸5'突出端(overhang)。
Cas9的CRISPR引导RNA通常包含CRISPR RNA(crRNA)及反式活化crRNA(tracrRNA)。crRNA包含被设计成与所靶向的用于校正、破坏或替代的基因内至靠近该基因的所靶向序列互补(或对所靶向序列具有特异性)的原型间隔区元件序列，以及对应于tracrRNA的互补区的序列。tracrRNA包含与crRNA的对应区域互补的区域及与CRISPR相关蛋白9(Cas9)相互作用的序列。Cpf1不需要tracrRNA。
原型间隔区元件的长度通常为约20个核苷酸。亦可使用较长或较短的原型间隔区元件序列(约16-24nt)。原型间隔区元件可以与靶序列100％互补或可以含有与靶序列的错配。在一些实施方案中，可以任选地在原型间隔区元件序列的起点添加“G”核苷酸。
在DNA分子被Cas切割之后，其可被两种方式中的一种修复。易错的非同源性末端接合(NHEJ)修复可导致插入缺失突变，该插入缺失突变会破坏由该基因编码的蛋白质的功能。NHEJ可用于在细胞系中产生人工突变。在一些实施方案中，其可用于在没有内源性CYP4V2突变的细胞系(例如，ES细胞、iPS细胞或ARPE-19细胞系)的CYP4V2基因中产生突变(例如，外显子或剪接受体区域中的插入缺失)，由此产生疾病细胞模型(例如，BCD细胞模型)。此外，可以一起使用另外两个CRISPR引导RNA来敲除靶基因的被靶向区域或整个靶基因，从而产生敲除模型。在一些实施方案中，使用基于CRISPR的基因沉默来破坏(或沉默)或缺陷基因，例如治疗显性遗传疾病。在基因沉默期间，细胞尝试修复断裂的DNA，但是NHEJ在这么做时常常伴随破坏基因的错误因而有效地沉默该基因。在一些实施方案中，NHEJ亦可能造成对突变的校正，例如尤其是当突变为单核苷酸变异(single nucleotidevariation)或不超过约10个核苷酸时。或者，若供体核酸序列可供使用，则DNA断裂可以借由同源定向修复(HDR)来修复以用于校正或替代靶基因。供体核酸序列可以单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)，或单链寡DNA核苷酸(single-stranded oligo DNAnucleotide，ssODN)或载体形式提供。在一些实施方案中，对于以ssODN形式提供的供体核酸序列，该供体核酸序列不超过约1kb、800bp、600bp、500bp、400bp、300bp、280bp、260bp、240bp、220bp或200bp。在一些实施方案中，对于以载体形式提供的供体核酸序列，该供体核酸序列不超过约25kb、20kb、15kb、10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4.5kb、4kb、3.5kb或3kb。在一些实施方案中，供体核酸序列为对称的。在一些实施方案中，供体核酸序列为不对称的。在一些实施方案中，供体核酸序列的长度可以为了较高的HRD率而被调整。在一些实施方案中，若CRISPR基因编辑中所使用的Cas所靶向的PAM亦存在于供体核酸序列中，则可以使其突变(变为不同核苷酸)，使得PAM不再存在于供体核酸序列中，从而避免供体模板或由供体模板修复的DNA序列被Cas切割及破坏。除了校正或替代突变的或有缺陷的基因或其一部分之外，HDR亦可用于在没有内源性CYP4V2突变的细胞系(例如，ES细胞、iPS细胞或ARPE-19细胞系)的CYP4V2基因中产生人工突变(例如，在外显子或剪接受体区域(splice acceptorregion)中插入突变)，由此产生疾病细胞模型(例如，BCD细胞模型)。
CRISPR基因编辑疗法中所使用的CRISPR引导RNA及Cas可以载体(例如，质粒(例如pX330、pX458、pX459)、重组AAV载体或重组慢病毒载体(recombinant lentivirusvector))或编码此类组分的mRNA和/或RNA及蛋白质的形式提供。
供体模板可以ssDNA(例如，ssODN)形式提供或克隆于质粒或其他类型的载体(例如，AAV载体(例如，AAV2或AAV6))中以便用于HDR中。
可以使用多种组合物及方法来改善中靶编辑(on-target editing)或修复效率和/或降低潜在脱靶。举例而言，可以使用不同的Cas(例如，Cas9或Cpf1)或不同物种的Cas(例如，SpCas9、SaCas9、NMCas9)或变异体(SpCas9、SpCas9VQR)来拓宽可供靶序列使用的PAM选择，从而增强特异性。若靶序列区域缺乏用于SpCas9的NGG PAM位点但是富含AT，则可以改为考虑Cpf1。Cas9切口酶(例如，Cas9 D10A)在靶DNA中仅产生单链断裂，因此需要两个配对的CRISPR引导RNA来产生双链断裂。此需求显著增加了目标特异性，因为不太可能在足够接近的范围内产生两个脱靶切口(off-target nick)而造成DSB。此外，不对称供体模板能够增强HDR率。催化活性丧失(catalytically inactive)的dCas9不会切割靶DNA，但仍然可以实现序列替代而不会出现通常伴随Cas9切割的任何易错修复。参见Richardson等人,Nature Biotechnology 34,339-344(2016)。
达成靶向基因校正且同时避免或最小化脱靶编辑为基因编辑的两个目的。先前的研究揭示了由基因编辑技术引起的脱靶突变，这些基因编辑技术包括但不限于CRISPR及TALEN，参见例如Tsai等人,Nature Biotechnology 33,187-197(2015)；Wang等人,NatureBiotechnology 33,175-178(2015)；Wu,W.H.等人CRISPR repair reveals causativemutation in a preclinical model of retinitis pigmentosa.Mol.Ther.24,1388-1394(2016)。对于在体内或在细胞疗法中(例如，先体外在细胞中，然后将细胞移植于体内)使用的基因编辑，第二个目的，避免或最小化脱靶编辑与达成靶向基因校正一样重要，因为脱靶编辑可能会造成疾病或诱导肿瘤形成。应注意的是，并非所有的脱靶编辑都可以用计算机软件或算法来预测。
因此，使用了精心的设计、验证及改良来开发及验证CYP4V2突变CRISPR基因校正构建体：
(1)以含有c.802-8_810del17insGC突变的突变型CYP4V2核酸序列为基础，产生多个候选gRNA；
(2)使用以下标准选出前5个gRNA(参见SEQ ID NO:48-52，表5及图12)：
a.gRNA切割位点与修饰位点的靠近程度，及
b.gRNA的脱靶谱(off-target profile)；
(3)在具有纯合c.802-8_810del17insGC突变的BCD患者的基因组DNA中验证前5个gRNA的活性(参见图13)；
(4)根据(2)及(3)选择三个gRNA。将3个gRNA中的每一者与编码Cas9的核酸序列及嘌呤霉素抗性基因(Puro)一起克隆至pX459质粒中(参见图15及18)，以便使用嘌呤霉素选择经转染的细胞。
(5)产生提供HDR供体核酸序列的两个供体模板(正反均互补)。借由IDT合成含有供体模板序列的ssODN(参见SEQ ID NO:56及57)。
(6)除了质粒构建体之外，亦开发CRISPR RNP构建体。RNP构建体具有某些优于其他构建体的优点。详述论述提供于下文及实施例部分中。
(7)在衍生自具有纯合c.802-8_810del17insGC突变的BCD患者的iPS细胞中验证CYP4V2 CRISPR校正构建体。
(8)在未经修饰的细胞及借由CYP4V2突变CRISPR校正构建体基因修复的iPS细胞中进行全基因组测序以确认c.802-8_810del17insGC突变的校正并评定脱靶编辑。
提供用以确定在iPSC中转染的最佳条件及用于选择经转染的细胞的方法。详细说明参见实施例部分。可预期的是，这些构建体不仅可以用于体外治疗BCD患者特异性iPS细胞，而且还能用于体外治疗源细胞(例如，成纤维细胞或PBMC)或iPS-RPE、iPS-PRC、iPS-CE细胞或iPS-CEC细胞或其他衍生自BCD患者特异性iPS细胞的眼部细胞，并且可以用于具有c.802-8_810del17insGC突变的患者的体内。在一个实施方案中，可以直接使用构建体的组分。在一些实施方案中，构建体中的组分可以经修饰，或克隆至不同载体中以达成较高体内转导效率或对靶细胞类型的较高特异性或达成其他目的。举例而言，可以将Cas9修饰为Cas9切口酶(Cas9n D10A)，其含有允许核酸内切酶产生单链切口而非双链断裂的突变。将具有SpCas9切口酶的两个相对(opposite facing)的gRNA序列配对为一种能防止形成不合需要的插入缺失的有效基因编辑方法。除了质粒之外，用于包装CRISPR组分的其他常见载体包括慢病毒载体及腺相关病毒(AAV)载体。当使用AAV载体时，可使用金黄色葡萄球菌Cas9直系同源物(SaCas9)作为核酸内切酶，因为SaCas9比SpCas9短大约1kb，且提供对AAV包装限制的额外灵活性。
对CRISPR RNP构建体进行了各种改良。使用合成sgRNA而非IVT sgRNA或crRNA:tracrRNA双链体。合成gRNA具有比IVT sgRNA高的纯度，因此能够降低由sgRNA中的杂质引起的脱靶编辑的风险。此外，对sgRNA施加化学修饰以防止sgRNA发生细胞内降解，这可以提高编辑效率。更多细节可参见实施例部分。
可预期的是，除了本文中所描述的质粒构建体及CRISPR RNP构建体之外，亦可以使用包含Cas9编码mRNA及引导RNA寡核苷酸的mRNA构建体。
在用CYP4V2突变CRISPR校正构建体转染BCD患者特异性iPS细胞之后，使用嘌呤霉素选择经转染的细胞。应理解，可以将诸如GFP等的其他标记物并入构建体中并将其用作代替嘌呤霉素的标记物或用作除了嘌呤霉素之外的标记物。在选择后进行单细胞克隆，之后从单细胞克隆收集一些细胞用于测序。在测序结果确认中靶基因编辑成功且未发现致病基因编辑之后，相同克隆的剩余细胞被用于分化成所期望的眼部细胞类型，例如iPS-RPE细胞。
D.iPSC的分化
将经基因修复的BCD患者iPS细胞分化成iPS-RPE细胞(或另一类型的眼部细胞(例如，iPS-CEC、iPS-CE细胞或iPS-PRC)。将iPSC分化成RPE细胞或另一类型的眼部细胞(例如，CEC及PRC)的方法为已知的。参见例如Hayashi等人,2012,PLoS One,7(9):e45435；Songstad等人,Investigative Ophthalmology&Visual Science 2015年12月,第56卷,8258-8267；及Lamba等人,PLoS One.2010年1月20日；5(1):e8763。举例而言，可以产生从细胞重编程的诱导性多能干细胞(iPSC)并将这些细胞进一步分化成例如RPE细胞(本文中称为“iPS-RPE”)、角膜上皮细胞(本文中称为“iPS-CEC”)、光感受器细胞(或光感受器祖细胞；本文中称为“iPS-PRC”)或iPS-脉络膜内皮(CE)细胞(称为“iPS-CE”)。
测试经分化的细胞(例如iPS-RPE细胞)的生化功能(如实施例部分中所描述)，以确认其生化功能相比于无基因修复的患者的iPS-RPE细胞已改良。
如本文中所描述般产生的iPSC-RPE细胞系展现能指示RPE细胞的形态(例如，色素沉着及六角形)和/或表达一种或多种能指示RPE细胞的生物标记物。RPE细胞(及iPS-RPE细胞)的生物标记物为已知的且包括但不限于RLBP1(又名CRALBP)、RPE65、斑萎蛋白-1、MITF、黏着斑蛋白、LRAT、RDH5、PAX6、MERTK、TYR和/或ZO-1中的一者或多者，且可用以判定或确认RPE分化已经发生。同样地，CEC(及iPS-CEC)及PRC(及iPS-PRC)的生物标记物为已知的且包括例如针对角膜上皮细胞的细胞角蛋白12及细胞角蛋白3；及针对光感受器的Crx、针对视杆及视锥的恢复蛋白及针对视杆的Nrl。
E.给药/递送
经基因修复的iPS-RPE细胞可以用于自体移植至衍生出该iPS-RPE细胞的患者中。具有BCD或另一种由于CYP4V2突变所引起的眼科病状的患者可以用本文中所提供的细胞疗法方法治疗。同样地，该方法可用于提供一种针对其他由一个或多个遗传突变引起的眼部疾病的经基因修复的自体细胞疗法。
施用或递送细胞的方法为已知的，且施用或递送细胞至眼睛的方法为已知的，参见例如Wert等人,J Vis Exp.2012；(69):4286；WO 2016/179496；Schwartz等人,Investigative Ophthalmology&Visual Science 2016年4月,第57卷,ORSFc1-ORSFc9。在一个实施方案中，眼部细胞可以经由注射细胞悬浮液(例如RPE细胞悬浮液)来移植。在另一实施方案中，细胞可以作为层片或支架的一部分来移植，例如使用天然和/或合成支架来产生极化的功能性RPE单层的体外组织。
施用于眼睛的细胞的治疗有效量为熟习此项技术者所知且将随以下各者而变化：待移植细胞的类型、待移植细胞之成熟度及是否期望在移植后分裂、所靶向的进行替代的区域大小或细胞数目、及待治疗受试者(例如，待治疗受试者的年龄、性别、体重、疾病及病状的发展阶段)；给药途径；及所需方案。在单次给药中，眼部细胞疗法中所用细胞的治疗有效量可以在约1*103至约1*108个细胞的范围内。
虽然可以为了单独的受试者产生iPSC细胞系，但亦可以产生具有共同HLA单倍型(或其中HLA单倍型已经过基因操作)的iPSC细胞库，其将被设计成能与大部分患者群体达成免疫匹配。参见例如Turner等人,Cell Stem Cell,13:382-384,2013。此外，iPSC细胞系可被产生为免疫沉默的，无论受试者的基因型为何(参见例如Riolobos等人,Mol.Ther.,21:1232-41,2013)。当与这些方法组合时，患者特异性iPS细胞及iPS-眼部细胞不仅可以用于狭义自体上，而且亦可以用于移植至其他患者。
细胞疗法施用步骤通常发生在疾病症状发作之后或受试者已经显示出视网膜退化或角膜变性的迹象之后(若适用)。在一个实施方案中，本文中所提供的眼部细胞疗法可以独立地用于治疗眼部疾病(例如，BCD)。在另一实施方案中，本文中所提供的眼部细胞疗法可以与一种或多种其他治疗选项组合使用，其他治疗选择包括但不限于本文中所提供的CYP4V2基因转移疗法和/或CYP4V2 CRISPR基因编辑疗法。
同样地，给药可以发生一次或多次(例如，在几周、几个月或几年之内)且可以施用至同一只眼睛或至对侧眼睛。此外，一种或多种类型的细胞可以按单次给药或分开给药来施用。
治疗后评定可以使用本文CYP4V2基因疗法部分中所描述的方法，其包括但不限于经由眼睛检查，诸如视觉功能，例如如借由视敏度、视野、暗适应、视觉功能和/或光学相干断层扫描(Optical Coherence Tomography，OCT，例如谱域-OCT(Spectral Domain-OCT，SD-OCT))及ERG来测量。
在眼部细胞疗法及基因疗法中使用CRISPR RNP的方法
CRISPR RNP为一种基因编辑核糖核蛋白(RNP)复合物，其包括与Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)复合的引导RNA。引导RNA由两个被称为CRISPR RNA(crRNA)及反式活化crRNA(tracrRNA)的RNA构成。在一个实施方案中，crRNA及tracrRNA以两个单独的核酸分子被提供。在另一实施方案中，crRNA及tracrRNA可以组合于嵌合单引导RNA(chimeric singleguide RNA，sgRNA)中。sgRNA的长度可为约100个核苷酸(nt)，或根据需要或必要时，可以更短或更长。5'端处二十个nt(crRNA)借由沃森-克里克碱基配对与靶DNA序列杂交且引导Cas核酸内切酶切割靶基因组DNA，3'侧剩余的双链结构用于Cas9识别。
与传统的Cas9/gRNA构建体(例如，并入有CRISPR引导RNA及Cas9蛋白质的核酸序列的质粒构建体)相比，CRISPR RNP具有优点及缺点。举例而言，引导RNA(crRNA及tracrRNA)及Cas9蛋白质可以作为完整复合物递送至靶细胞中，从而不需要细胞自身的转录机制来表达CRISPR组分。因此，CRISPR RNP能够在转染后迅速编辑。此外，CRISPR组分从细胞中消耗得更快，此可降低脱靶编辑的可能性。此外，其可降低由质粒引起的整合诱变的可能性。鉴于这些优势，RNP在体内基因编辑中也是有利的。然而，另一方面，由于RNP经由蛋白质降解从细胞中快速清除，所以RNP的中靶编辑效率可能低于在细胞中的表达持续时间较久的质粒构建体。
为了评估上述假设并证明CRISPR RNP构建体是否能够达成眼部细胞疗法中所欲的基因编辑及基因疗法这两个目的，设计两组构建体。一个构建体为质粒构建体，而另一个为RNP构建体。两个构建体均使用同一位BCD患者的iPS细胞进行转染，接着对其进行测序以分析各构建体之中靶基因修复及脱靶编辑。借由与来自同一位患者的未经修饰的成纤维细胞的基因组DNA进行比较来确定脱靶编辑。可以比较来自质粒构建体及RNP构建体的结果。
关于RNP、RNP的形成方法及使用RNP构建体来为BCD患者产生经基因修复的细胞(iPS及iPS-RPE细胞)的详细说明提供于实施例部分中。
应注意，可以使用类似的CRISPR RNP构建体来校正或失活BCD的其他突变及其他RP及IRD的突变。在一个方面中，将本文中所用的crRNA序列改为另一个特异性靶向不同的靶突变序列的crRNA序列。在另一方面中，RNP构建体中的引导RNA或sgRNA可经修饰以增强基因编辑效率。参见Hendel等人,Nat Biotechnol.2015年9月；33(9):985-989。在一些实施方案中，CRISPR RNP构建体可以使用电穿孔转染。在一些实施方案中，CRISPR RNP构建体可以使用脂质体转染(lipofection)或核转染(nucleofection)来转染。在一些实施方案中，CRISPR RNP构建体可以经由显微注射来递送。
除了体外基因修复及治疗患者细胞之外，CRISPR RNP构建体亦可用于体内治疗由遗传突变引起的眼部疾病且在体内应用中具有优于其他类型的CRISPR构建体(例如，编码CRISPR组分的质粒和/或mRNA)的优势。举例而言，与体外转录的Cas9 mRNA及sgRNA相比，CRISPR RNP构建体具有更高的效力，更低的脱靶风险和/或更低的毒性或先天性免疫响应活化。在一个实施方案中，可以将包含与靶向突变DNA序列区域的引导RNA复合的Cas9蛋白质的CRISPR RNP构建体直接注射至受试者的眼睛中(例如，视网膜下注射、玻璃体内注射或注射至角膜)。在另一实施方案中，可以使用经工程改造而具有多个SV40核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)的Cas9变异体，其已显示在体内脑细胞中的编辑效率提高(Staahl等人,Nat Biotechnol.2017年5月；35(5):431-434)，以在眼部细胞中达成较高的编辑效率。具有一个或多个NLS(在N端和/或C端)的Cas9蛋白质可从各种诸如IDT及Feldan的CRO商业上获得。在一些实施方案中，CRISPR RNP构建体“按原样(as is)”递送。在一些实施方案中，CRISPR RNP构建体在递送时与药学上可接受的载剂一起配制。在一些实施方案中，CRISPR RNP构建体以包装形式递送，例如在纳米颗粒中递送。
应理解，CRISPR RNP组分(例如，引导RNA及Cas9蛋白质)之间的比率可以借由在体外或体内治疗之前在体外测试患者细胞系中的不同比率(例如，BCD患者特异性iPS细胞或iPS-RPE细胞)来调整及最佳化。CRISPR RNP构建体可以独立使用或与另一CRISPR构建体组合使用，另一CRISPR构建体包括但不限于编码CRISPR引导RNA或crRNA的质粒或载体、或Cas蛋白质或其组合；Cas9编码mRNA；引导RNA寡核苷酸；另一CRISPR RNP构建体；或其组合或杂合体。此外，CRISPR RNP构建体可用于校正或失活与一种或多于一种眼部疾病相关的一个或多于一个突变。
基因疗法与细胞疗法组合治疗
本文的揭示内容为BCD及其他由CYP4V2突变引起的眼部疾病提供多种治疗选项，其包括但不限于CYP4V2基因转移疗法及CYP4V2 CRISPR基因编辑疗法。CYP4V2基因转移疗法及CYP4V2基因编辑疗法可以在体内或体外使用或在体内及体外均可以使用。当在体内实施时，CYP4V2基因转移疗法和/或CYP4V2 CRISPR基因编辑疗法可以作为基因疗法治疗受BCD影响的剩余眼部细胞。当在体外实施于患者细胞或由患者衍生的细胞中时，作为细胞疗法，可以将经过CYP4V2基因转移疗法和/或CYP4V2 CRISPR基因编辑疗法治疗的细胞移植到患者中，以替代死亡的或退化的眼部细胞。值得注意的是，本文中所提供的基因疗法及细胞疗法组合物及方法可以组合，从而为患者提供通过单独使用基因疗法或细胞疗法所无法达成的额外益处。“组合治疗”亦可扩大合格的患者基数。举例而言，对于没有留下或几乎没有留下光感受器或RPE细胞的晚期患者，基因疗法不如在早期患者中那般有效。在此情况下，细胞疗法可以借由提供新细胞(例如，RPE或光感受器细胞)来获益，而基因疗法可以借由拯救剩余的RPE或光感受器细胞和/或借由改善脉络膜细胞(其健康影响眼部细胞的状况)的病状来改善细胞疗法的效果。组合基因疗法与细胞疗法各自的“拯救”与“替代”效果，使得组合治疗成为基因疗法或细胞疗法的改良。此组合治疗方法可施用于其他由一种或多种遗传突变引起的眼部疾病。
用于CYP4V2基因疗法的方法及组合物
本揭示内容是关于包含编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子的各种组合物及利用这些组合物来治疗眼部细胞和/或眼部疾病的各种方法。在一个实施方案中，功能性CYP4V2蛋白质可以直接用于治疗目的。在一些实施方案中，使用编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子。在一些实施方案中，使用表达盒来引导及控制核酸分子的产物的表达，该表达盒包含与一个或多个调节序列可操作地连接的此类编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子。在一些实施方案中，使用载体来包装此包含编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子及一个或多个调节序列的CYP4V2表达盒，以便增强对靶细胞的递送及达成此CYP4V2编码核酸分子的产物及表达盒的所期望的表达。
在一些实施方案中，载体为重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中，载体为质粒。在一些实施方案中，载体为另一类型的病毒载体或非病毒载体。治疗方法包含将有效量(或有效浓度)的这些载体施用或递送至受试者的眼睛和/或靶细胞。在一个实施方案中，该治疗直接在体内施用。在另一实施方案中，该治疗包含靶细胞(例如，眼部细胞)中的离体治疗及将经治疗的靶细胞移植至受试者中(例如，移植至受试者的眼睛)。这些治疗方法针对眼部疾病及其他与CYP4V2突变相关的病状。在一个实施方案中，眼部疾病为结晶样视网膜色素变性(BCD)。
A.功能性CYP4V2蛋白质及编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸
CYP4V2(细胞色素P450，家族4，亚家族V，多肽2，(MIM 608614)，同义词：CYP4AH1)为细胞色素P450超家族(P450)中的蛋白质之一且为细胞色素P450亚家族4(CYP4)的成员。细胞色素P450(CYP)为重要的含血红素的蛋白质(heme-containing protein)，以其作为氧化酶的角色而为人所知。术语P450衍生自酶在处于还原态时且与一氧化碳复合时的最大吸收波长(450nm)下的分光光度峰。其参与异生物质及内源性化合物的代谢，诸如类固醇及脂肪酸。已经在所有生物界中鉴定到CYP酶：动物、植物、真菌、原生生物、细菌、古细菌，以及甚至病毒。然而，其并非无所不在；例如，尚未在大肠杆菌中发现CYP酶。
P450蛋白质担当结构中的关键要素。举例而言，P450蛋白质可以借由其特征序列元件FXXGXXXCXG(SEQ ID NO:30)来鉴定，其中半胱氨酸充当血红素铁的轴向配位体。P450蛋白质中的序列同一性相对为低，但其一般形貌(topography)及结构折叠为高度保守的。保守的核心由称为‘meander’的线圈(coil)、四螺旋束(four-helix bundle)、螺旋J与K以及两组β-片层构成。这些构成血红素结合环(haem-binding loop)(具有绝对保守的半胱氨酸，其充当血红素铁的第5配位体)、质子转移槽(proton-transfer groove)及螺旋K中的保守的EXXR基序(SEQ ID NO：31)。P450蛋白质为位于细胞的线粒体内膜中或内质网中的主要膜相关蛋白。
除了结构相似性之外，P450蛋白质亦享有功能相似性。由P450酶催化的最常见的反应为单加氧酶反应，例如将一个氧原子插入有机底物(RH)的脂肪族位置而其他氧原子则被还原为水：
RH+O2+NADPH+H+→ROH+H2O+NADP+
许多羟基化反应(插入羟基)使用P450酶。许多P450酶具有类固醇和/或脂肪酸作为底物。
人类CYP4V2蛋白质(NCBI RefSeq:NP_997235.3)具有525个氨基酸(氨基酸序列显示于SEQ ID NO:4中)。存在有人类CYP4V2蛋白质的变异体，包括病理性变异体(亦即突变)(关于BCD患者中的CYP4V2突变的选择列表，参见本文中的表1)及非病理性(亦即功能性)变异体。
在一个方面中，功能性CYP4V2蛋白质为人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)。在其他方面中，功能性CYP4V2蛋白质为人类CYP4V2蛋白质的功能性变异体或片段，包括但不限于具有如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的蛋白质。
功能性CYP4V2蛋白质亦可为另一功能性CYP4V2蛋白质的变异体。以下是基于改变本文中所描述的多肽的氨基酸以产生等同或甚至改良的第二代分子的讨论。举例而言，在蛋白质结构中，某些氨基酸可经取代为其他氨基酸，而不会明显丧失与诸如例如底物分子上的结合位点(例如脂肪酸的结合位点)的结构的相互结合能力。因为是蛋白质的相互作用能力及性质决定了蛋白质的生物功能活性，所以可以在蛋白质序列及其基础(underlying)DNA或RNA编码序列中进行某些氨基酸取代，但仍然产生具有相似特性的蛋白质。因此可预期的是，可以在功能性CYP4V2蛋白质的氨基酸序列或基因的DNA或RNA序列或其编码区中作出各种改变，而不会明显丧失其生物学效用或活性，如本文中所论述。举例而言，SEQ IDNO:5为CYP4V2蛋白质变异体的氨基酸序列，其相比于SEQ ID NO:4中所示的人类CYP4V2蛋白质序列有一个氨基酸改变。
可以使用各种技术、算法、软件及工具来设计或工程改造功能性CYP4V2蛋白质(例如人类CYP4V2蛋白质)的功能衍生物、变异体和/或片段。举例而言，各种多肽的结构及功能或改变可以借由NMR、x射线结晶学或电脑模型化(例如ClustalW、SWISS-MODEL服务器、Swiss-Pdb Viewer、Polyphen-2、PROVEAN、SIFT、Condel、MutationAssessor及FatHMM)来模型化、解决或预测。
功能性CYP4V2蛋白质亦可为功能性CYP4V2蛋白质的片段或衍生自其片段。举例而言，人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)及其变异体(SEQ ID NO:5)均具有在从N端起约第13个氨基酸残基与约第35个残基之间的跨膜结构域(transmembrane domain)。人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)的骨架位于约36-525aa之间。因此，功能性CYP4V2可以衍生自人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:6)中前面约35个氨基酸的缺失及用替代性跨膜结构域序列替代此缺失。功能性CYP4V2蛋白质的另一来源为功能性CYP4V2蛋白质的剪接变异体。
预测的CYP4V2跨膜区段位于N端附近，其后为CYP450家族典型的球状域(globulardomain)。CYP4V2的球状域包括18个螺旋及β结构区段。血红素基团位于蛋白质表面附近，与朝向蛋白质内部的I螺旋及表面上的L螺旋配位(coordinate)。Li等人,Am J HumGenet.74:817-826,2004。CYP4V2蛋白质主要活跃于脂肪酸代谢中。许多其他P450酶亦参与脂肪酸代谢。CYP4V2在几乎所有组织及器官中遍在地表达。在心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、视网膜、视网膜色素上皮、角膜及淋巴细胞中发现了CYP4V2的表达(Li等人,Am J Hum Genet.74:817-826,2004)。然而，大部分其他P450酶不存在于眼部细胞中。举例而言，CYP4V2及CYP1B1为ARPE-19细胞系中仅有的以高水平表达的P450酶；CYP2E1、CYP2J2及CYP3A4仅以低水平(CYP4V2 mRNA表达的5％)转录，且检测不到CYP4A11、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3及CYP4F12的转录物(Nakano等人,Mol Pharmacol 2012；82:679-686)。事实上，CYP4V2突变的症状局限于眼睛，在眼睛中，CYP4V2为除了CYP1B1之外表达的唯一的主要P450酶及唯一表达的P450亚家族4(CYP4)酶，而在CYP4V2与其他P450酶一起存在的器官中不显示这些症状，表明其他P450酶，特别是CYP4酶，可用于取代CYP4V2的全部或部分功能。实际上，已发现CYP4亚家族在脂肪酸代谢中具有共同作用，包括但不限于作为PUFA的羟化酶。参见Hardwick,Biochem.Pharmacol.,75(12):2263-75；Fer等人,J.Lipid Res.,49(11):2379-89；Nakano等人,Mol.Pharmacol.,2012,82:679-686。人类CYP4蛋白质的蛋白质序列显示于SEQ ID NO:8-18中。
除了与CYP4亚家族的其他蛋白质共用底物及功能之外，计算分析显示CYP4V2由CYP46A(SEQ ID NO:7)的祖先复制形成，其然后经复制产生整个CYP4家族。Pan等人,Int.J.Mol.Sci.,2016,17(7)pii:E1020.doi:10.3390/ijms17071020。
此外，许多物种中的CYP4V2基因(或CYP4V2基因的直系同源物，例如小鼠的Cyp4v3)为保守的，包括但不限于人类、黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、蛙、马、兔及果蝇(SEQ ID NO:19-29)。已在196种生物体中发现了含有人类基因CYP4V2的直系同源物。
功能性CYP4V2蛋白质可以包含以下或由以下设计、工程改造或衍生者，包括但不限于：
(i)人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)；
(ii)人类CYP4V2蛋白质或功能性CYP4V2蛋白质的变异体(例如，改变氨基酸和/或剪接变异体)(例如，SEQ ID NO:5)；
(iii)功能性CYP4V2蛋白质的一个或多个片段(例如，SEQ ID NO:6)；
(iv)其他物种的CYP4V2(或直系同源物)；
(v)另一CYP4蛋白质或CYP46A1；
(vi)能够改善、治疗或遏制患者细胞(例如，BCD患者的iPS-RPE细胞)中的表2中所列一种或多种化合物中的一种或多种生化异常的多肽；和/或
(vii)以上(i)至(vi)中的任何一者或多者的衍生物、杂合体或变异体。
可预期的是，本文中所揭示的组合物及方法可用于表达如上所述的任何功能性CYP4V2蛋白质。在一个实施方案中，功能性CYP4V2蛋白质为包含SEQ ID NO:4、5或6中所示的氨基酸序列中的全部或一部分的多肽。在一些实施方案中，功能性CYP4V2蛋白质为包含选自由以下组成的群的氨基酸序列中的全部或一部分的多肽：CYP4V2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1及CYP46A(SEQID NO:4-18)，及黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、蛙、马、兔及果蝇的CYP4V2(SEQ IDNO:19-29)，及其衍生物、杂合体、变异体和/或片段。在一些实施方案中，功能性CYP4V2蛋白质可以与选自由SEQ ID NO:4-29组成的群的序列中的任意者具有至少80％氨基酸序列同一性(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。在一个实施方案中，功能性CYP4V2蛋白质为包含FxxGxxxCxG及ExxR(SEQ ID NO:30及31)的序列元件的多肽。
在一些实施方案中，功能性CYP4V2蛋白质为能够改善、治疗或遏制患者细胞(例如，BCD患者的iPS-RPE细胞)中的一种或多种生化异常的化合物或药剂。
在一个实施方案中，功能性CYP4V2蛋白质可以直接用于治疗BCD，类似于针对其他疾病的以蛋白质为基础的药物。在另一实施方案中，使用编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子以在所靶向细胞中表达功能性CYP4V2蛋白质。在一个实施方案中，核酸分子为RNA。在另一实施方案中，核酸分子为DNA，包括但不限于互补DNA(complementary DNA，cDNA)，用于长期表达。cDNA可为正义(positive-sense)或负义(negative-sense)、单链或双链。在一些实施方案中，编码功能性CYP4V2蛋白质之核酸与一个或多个调节序列可操作地连接以形成CYP4V2表达盒。在一些实施方案中，这种表达盒被包装于载体中以增强递送和/或表达效率。
密码子由一组三个核苷酸组成且编码特定的氨基酸或造成翻译终止(亦即终止密码子)。绝大部分氨基酸(通常是除了甲硫氨酸之外的所有氨基酸)都由多个密码子编码。因此，可以用不同的核酸序列表达相同的蛋白质。编码相同蛋白质序列的两个核酸分子之间的序列同一性可以在0％至超过99％的范围内。举例而言，均能编码人类CYP4V2蛋白质(SEQID NO:4)的一核酸序列(SEQ ID NO:1)与另一核酸序列(SEQ ID NO:2)仅共用77％的序列同一性。
核酸序列的密码子最佳化可以改善和/或稳定蛋白质表达而不改变所编码的氨基酸序列。密码子最佳化为将核酸序列中所存在的密码子用编码相同氨基酸的较佳密码子替代，例如对于哺乳动物表达而言较佳的密码子。在密码子最佳化中可以使用各种策略及参数，包括但不限于密码子使用偏好、GC含量、CpG二核苷酸含量、mRNA二级结构、隐蔽剪接位点(cryptic splicing site)、早期PolyA位点(premature PolyA site)、内部χ位点(internal chi site)及核糖体结合位点、负CpG岛(negative CpG island)、RNA不稳定基序(RNA instability motif，ARE)、重复序列(正向重复(direct repeat)、反向重复(reverse repeat)及双向重复(Dyad repeat))及可能干扰克隆的限制性位点。密码子最佳化方法为本发明所属技术领域中已知的，例如美国专利第6,114,148号及US20110081708。给定氨基酸序列或编码多肽的核酸序列的密码子最佳化核酸序列可以借由本文中所描述的方法和/或借由使用各种密码子最佳化软件产生，包括经由在线软件产生。
应了解，视所使用的密码子最佳化方法、配置、算法或软件而定，可以产生编码相同蛋白质的不同密码子最佳化核酸序列。然而，密码子最佳化并不总是引起改良的表达，相比于野生型未经修饰的核酸序列。参见Alexeyev MF,Winkler HH:Gene synthesis,bacterial expression and purification of the Rickettsia prowazekii ATP/ADPtranslocase.Biochim Biophys Acta.1999,1419:299-306.10.1016/S0005-2736(99)00078-4；Curran KA,Leavitt JM,Karim AS,Alper HS:Metabolic engineering ofmuconic acid production in Saccharomyces cerevisiae.Metab Eng.2013,15:55-66；Agashe D,Martinez-Gomez NC,Drummond DA,Marx CJ:Good codons,Bad transcript:large reductions in gene expression and fitness arising from synonymousmutations in a Key enzyme.Mol Biol Evol.2013,30(3):549-560.10.1093/molbev/mss273.doi:10.1093/molbev/mss273。
本文中提供编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)的密码子最佳化核酸序列(SEQID NO:2)。SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2均编码同一种人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)。密码子最佳化核酸序列(SEQ ID NO:2)的密码子适应指数(codon adaptation index，CAI)为0.95，相比于SEQ ID NO:1中所示的核酸序列的CAI 0.94有所改良。在所期望的表达生物体中，CAI 1.0视为完美。应理解，本揭示内容涵盖所有形式及类型的密码子最佳化核酸序列，如由SEQ ID NO:2中所示的cDNA序列表示，包括对应于此cDNA序列或由其衍生的任何RNA序列或DNA序列或其他核酸序列，且其可为呈单链或双链形式的本文中所提供的序列，和/或正义、负义、反义(anti-sense)或互补有义(complementary-sense)于本文中所提供的序列。
除了密码子最佳化之外，亦可使用其他方法来改良翻译性能。举例而言，可以使用科札克序列或夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarno Sequence)来提高翻译起始效率。可以使用不同的终止密码子(例如，TGA)来提高翻译终止效率。除了ORF序列之外，编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸序列亦可包括一个或多个非编码序列(诸如UTR)和/或一个或多个内含子来改良蛋白质表达。可以紧接在编码cDNA的CYP4V2之前插入科札克序列(示范性序列显示于SEQ ID NO:36中)以增强表达。
如本文中所论述，可预期的是，可以采用人类CYP4V2蛋白质的功能变异体和/或片段。编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)的功能性变异体(SEQ ID NO:5)的核酸序列提供于SEQ ID NO:3中。
在一些实施方案中，CYP4V2核酸分子为编码任何功能性CYP4V2蛋白质的多核苷酸分子，功能性CYP4V2蛋白质包括但不限于SEQ ID NO:4-30，或编码与SEQ ID NO:4-30中所示的序列中的任意者具有至少80％氨基酸序列同一性的多肽。在一些实施方案中，CYP4V2核酸分子为与SEQ ID NO:1、2或3中的任一者共有至少60％序列同一性的多核苷酸。
如本文中所描述的载体(例如，病毒载体或非病毒载体)及CYP4V2表达盒通常含有一个或多个CYP4V2核酸分子或其片段。应理解，核酸分子可以采用多种形式，包括但不限于DNA或RNA、单链核酸(例如，ssDNA、ssRNA)、双链核酸(例如，dsDNA、dsRNA)、正链(plus-strand)或负链(minus-strand)核酸、互补DNA(cDNA)、基因组DNA、信使RNA(messengerRNA，mRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和/或DNA引导RNA干扰(DNAdirected RNA interference，ddRNAi)。核酸分子亦可以包括一种或多种核苷酸类似物或骨架修饰。此外，应理解，cDNA可在由逆转录酶催化的反应中由mRNA模板合成，或可以其欲编码的蛋白质为基础进行设计及合成，包括但不限于密码子最佳化cDNA，或可由另一核酸分子经由诱变合成。亦应理解，cDNA可以只含外显子，或可以含有外显子加其他序列，例如非翻译区(untranslated region，UTR)和/或内含子。在一些情况下，本文中所描述的载体及CYP4V2表达盒可以包括具有编码人类CYP4V2蛋白质或其功能变异体或片段的序列的核酸分子。
合适的核酸序列可为任何编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸序列。此核酸序列可以含有或可以不含非编码元件，诸如UTR、内含子或科札克序列。其可以包括野生型序列或合成序列或经修饰序列(例如，密码子最佳化的序列)。编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸序列可以如本文中所描述般产生或借由本发明所属技术领域中已知的其他方法产生。
具有如SEQ ID NO:1中所示编码人类CYP4V2蛋白质的序列的核酸分子在本文中称为“CYP4V2st”。具有如SEQ ID NO:2中所示编码人类CYP4V2蛋白质的密码子最佳化的序列的核酸分子在本文中称为“CYP4V2op”。具有SEQ ID NO:3中所示编码人类CYP4V2蛋白质的功能变异体的序列的核酸分子在本文中称为“CYP4V2fv”。在一些实施方案中，编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸序列与SEQ ID NO 1、2或3中之一者具有至少60％的序列同一性。
功能性CYP4V2蛋白质及编码此功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子可以用本发明所属技术领域中已知的方法合成或分离、纯化及检测。此外，蛋白质合成或分离、纯化及检测亦可经由包括Wuxi Apptec(Shanghai,China)及GenScript(Piscataway,New Jersey)的CRO商业上获得。核酸分子合成或分离、纯化克隆及检测可经由包括GenScript(Piscataway,New Jersey)及Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)的CRO商业上获得。
可以合成(例如，经由重组蛋白质表达或化学合成)或分离多肽。如本文中所使用的“经纯化的”多肽为已从天然伴随其的细胞组分分离或纯化的多肽。通常，当多肽以干重计至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或99％)不含与其天然联合的多肽及天然产生的分子时，认为该多肽为“经纯化的”。因为化学合成的多肽本质上与天然伴随其的组分是分离的，所以合成多肽为“经纯化的”。
多肽可以借由已知方法，诸如DEAE离子交换、凝胶过滤及羟磷灰石层析法(hydroxyapatite chromatography)，从天然来源(例如，生物样品)纯化。多肽亦可以例如借由表达在表达载体中的核酸来纯化。此外，经纯化的多肽可以借由化学合成获得。多肽的纯度可以使用任何适当的方法，例如柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量。
多肽通常使用抗体来检测。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、蛋白质印迹法(Western blot)、免疫沉淀法及免疫荧光法。抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。对多肽或多肽的一部分具有特异性结合亲和力的抗体可以使用本发明所属技术领域中熟知的方法产生。可使用本发明所属技术领域中已知的方法将抗体附接至固体支撑体，诸如微量滴定板。在多肽存在下，形成抗体-多肽复合物。
“经分离的”核酸分子通常指不含以下序列的核酸分子：天然侧接在衍生出该经分离的核酸分子的生物体的基因组中的核酸的一端或两端的序列(例如，借由PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA或基因组DNA片段)。一般将此类经分离的核酸分子引入构建体(例如，克隆构建体或用于基因疗法中的表达构建体)中，通常是为了方便操作、用于表达蛋白质、用于产生融合蛋白、或出于其他目的，包括但不限于用于包装至载体(例如，病毒载体或非病毒载体)中。
核酸可以使用本发明所属技术领域中的常规技术分离。举例而言，核酸可以使用任何方法分离，包括但不限于重组核酸技术、位点特异性诱变、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和/或其他基因工程改造方法。一般的PCR技术描述于例如PCR Primer:A Laboratory Manual,Dieffenbach&Dveksler编,Cold Spring HarborLaboratory Press,1995中。重组核酸技术包括例如限制酶消化及连接(ligation)，其可用于分离核酸。诱变方案描述于例如In Vitro Mutagenesis Protocols,Braman编,HumanaPress,2002中。
经分离的核酸亦可以单一核酸分子形式或以一系列寡核苷酸形式化学合成。
含有核酸的构建体为本发明所属技术领域中已知的。构建体，包括克隆构建体及表达构建体，可以在商业上定制或可以借由本发明所属技术领域中的常规重组DNA技术产生。构建体可以具有可操作地连接于待表达的核酸的调节序列，且可以进一步包括序列，诸如编码可选标记物(例如，抗生素抗性基因)的序列。本文中论述了调节序列。含有核酸的构建体可以编码嵌合或融合多肽(亦即，可操作地连接于异源多肽的多肽，异源多肽可位于该多肽的N端或C端)。代表性异源多肽为可以在所编码多肽的纯化或检测中使用的多肽(例如，6×His标签、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)、CFP、Fc、FLAG、HA、Myc、RFP、Strep、VSV、GFP及YFP)。
可以将携带核酸序列的构建体引入宿主细胞中。如本文中所使用的“宿主细胞”是指要引入核酸的特定细胞且亦包括此类细胞的携带该构建体的子代。宿主细胞可为任何原核细胞或真核细胞。举例而言，宿主细胞可为细菌细胞，诸如大肠杆菌细胞，或昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)、COS细胞、HEK293细胞、HeLa、Vero、V27、A549、K562、B50、WI38及BHK细胞)。其他宿主细胞包括但不限于iPS细胞、ES细胞、RPE细胞、iPS-RPE细胞、iPS-光感受器细胞、ES-RPE细胞、ARPE-19细胞、角膜细胞、光感受器细胞、脉络膜细胞、视神经细胞、本文中所论述的任何其他类型的眼部细胞、神经元细胞、上皮细胞、血细胞、成纤维细胞、淋巴细胞及由干细胞衍生的细胞。许多用于将携带核酸转基因的核酸或载体或表达盒体内及体外引入宿主细胞中的方法是本发明所属技术领域中具有通常知识者所熟知的，且这些方法包括但不限于电穿孔、声致穿孔(sonoporation)、磷酸钙沉淀、聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)转化、热休克、脂质体转染、显微注射及病毒介导的核酸转移。
核酸可以使用任何数目的扩增技术(参见例如PCR Primer:A LaboratoryManual,1995,Dieffenbach&Dveksler编,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY；及美国专利第4,683,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；及第4,965,188号)，用一对适当的寡核苷酸(例如，引物)来检测。已对原始PCR开发出许多修改版本，且可以使用这些修改版本检测核酸。核酸亦可以使用杂交来检测。核酸之间的杂交详细论述于Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；章节7.37-7.57、9.47-9.57、11.7-11.8及11.45-11.57)中。Sambrook等人揭示了小于约100个核苷酸的寡核苷酸探针的合适的DNA印迹(Southern blot)条件(章节11.45-11.46)及大于约100个核苷酸的寡核苷酸探针的合适的DNA印迹条件(参见章节9.47-9.54)。
B.载体
在一些实施方案中，借助于载体，将编码功能性CYP4V2蛋白质或其片段的核酸分子递送至需要治疗的眼部细胞。关于递送至眼部细胞，所欲的治疗载体为无毒的且可有效将核酸分子(例如，DNA、RNA)递送至靶细胞中。基因疗法载体为本发明所属技术领域中已知的且可为病毒载体或非病毒载体。
一种用于将核酸体内引入细胞中的方法是借由使用含有核酸分子(例如cDNA)的病毒载体。用病毒载体感染细胞的优势是，大部分的靶细胞能够接收到核酸分子。进一步，病毒载体内所编码的分子(例如由病毒载体中所含的cDNA)可有效地在已接受含有核酸分子的病毒载体的细胞中表达。
可以使用的病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、疱疹病毒(herpes virus，HV)载体，诸如单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)载体、乳头瘤病毒载体、痘病毒载体、人类泡沫病毒(human foamy virus，HFV)载体、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)载体、痘疮病毒载体、仙台病毒载体及逆转录病毒载体。亦可使用质粒将核酸分子递送至靶细胞中。在一些情况下，病毒载体为重组病毒载体，诸如重组AAV(rAAV)载体。熟习此项技术者应理解，某些载体将整合或较倾向于整合至宿主细胞(例如，受试者的细胞)的基因组中，而其他载体将不整合或不太倾向于整合至宿主细胞的基因组中(例如，染色体外表达)。
重组AAV(rAAV)载体常用于基因疗法方法中。AAV属于细小病毒科且各自含有单链DNA。rAAV载体为目前认为在哺乳动物细胞中最安全且最有效的基因转移平台(Salganik等人,2015,Microbiol.Spectr.,3(4):doi:10.1128/microbiolspec.MDNA3-0052-2014)。迄今为止，已从人类及非人类灵长类动物组织样品(参见例如Gao等人,2005,Curr.GeneTher.,5:285-97)及其他物种中分离出12种AAV血清型(AAV1至AAV12)及超过100种变异体。天然产生的及经修饰的AAV类型均可以用于本文中所描述的方法中。
野生型AAV含有封入衣壳内的线性单链DNA基因组，衣壳由三种蛋白质VP1、VP2及VP3构成。在重组AAV(rAAV)中，来自野生型AAV基因组的rep及cap基因通常用侧接有用于包装所需的AAV反向末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)的转基因表达盒来替代。如本文中所使用的“rAAV载体”是指含有一种或多种AAV病毒的或衍生自一种或多种AAV病毒的一个或多个衣壳元件的重组AAV载体。
虽然AAV及其他病毒载体介导的基因疗法有这些优势，但是并非所有病毒载体及并非所有AAV类型皆适合治疗特定疾病。使用病毒载体(例如，AAV载体)的基因疗法面临着两个主要挑战。首先，期望AAV载体在靶向治疗的细胞类型中有足够的转导效率。其次，需要考虑由病毒载体触发的潜在免疫响应。参见Madsen等人,Adeno-associated virusserotype 2induces cell-mediated immune responses directed against multipleepitopes of the capsid protein VP1.J Gen Virol 90,2622-2633(2009)；Mingozzi等人,CD8(+)T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans.Nat Med13,419-422(2007)。虽然与大多数其他器官及组织相比，眼睛被认为是相对于许多其他器官的免疫豁免器官(immune-privileged organ)且眼中由AAV介导的基因疗法中的免疫响应可以借由使用免疫抑制剂来控制，但是在大型动物中，在眼睛的AAV转导中，诸如中和抗体(neutralizing antibody，NAB)的免疫响应的作用尚不清楚。此外，玻璃体内AAV给药比视网膜下给药更容易与免疫系统相互作用。因此，眼部基因疗法中所用的病毒载体将触发极小的或不触发免疫响应，由此避免潜在副作用并确保病毒载体的转导/表达效率基本上不会因为免疫响应(例如受试者中预先存在的NAB)而降低，和/或由此降低rAAV载体的剂量。
可以使用与AAV载体设计及选择相关的各种组合物及方法来解决这些挑战。关于使用CYP4V2基因疗法治疗BCD，当靶向治疗的细胞主要为RPE细胞时，在RPE细胞中具有足够的转导效率的载体是所欲的。当治疗BCD患者的角膜细胞时，在角膜细胞中具有足够的转导效率的载体是所欲的。在一些实施方案中，使用在RPE细胞具有足够的转导效率的载体。在一些实施方案中，使用在角膜细胞中具有足够的的转导效率的载体。在一些实施方案中，使用在RPE及光感受器细胞中具有足够的转导效率的载体。在一些实施方案中，使用在RPE、光感受器及脉络膜细胞中具有足够的转导效率的载体。在一些实施方案中，使用在视网膜细胞中具有足够的的转导效率的载体。在一些实施方案中，使用在眼部细胞具有足够的转导效率的载体。在一些实施方案中，使用在眼部细胞和/或血细胞中具有足够的转导效率的载体。为了解决潜在的免疫响应(例如，针对基因疗法载体的NAB及基于细胞的免疫响应)，可以使用不同的AAV血清型及变异体、经修饰的AAV载体和/或免疫抑止方案。
本文中所用的rAAV载体可以基于或衍生自野生型AAV(例如，从人类或其他物种分离的AAV1至AAV12或其他野生型AAV变异体中的一者，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV12)或经修饰的AAV。经修饰的AAV可以许多不同方式产生，包括但不限于假型化AAV(例如，AAV2/5、AAV2/8、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/9、AAV2/12、AAV8/2)、嵌合AAV(例如，AAV-DJ)、衣壳经修饰的AAV(例如，衣壳突变型AAV(例如，具有Y-F、K-R、T-A、S-A和/或T-V突变的AAV，及AAV-DJ/8或AAV-DJ/9，其为来自AAV-DJ的衣壳突变型AAV)、衣壳变异型AAV(例如，AAV 7m8及衍生物)、祖先AAV(ancestral AAV，例如，Anc80)、包括天然产生的AAV或变异体的基因组和/或衣壳的任何改变的重组AAV，及其任何组合。应理解，可以用不同的方式来提及经修饰的AAV，包括但不限于人工的、经修饰的、经合成的、经重建构的、经工程改造的、经进化的、经设计的、经衍生的或增强的AAV，或经由合理设计和/或定向进化和/或DNA重排(DNA shuffling)产生的AAV，或AAV变异体。与未经修饰的AAV相比，使用经修饰的AAV可具有某些优势，包括但不限于更高的转导效率、更高的组织或细胞特异性、更少的免疫响应和/或更适合于某些类型的给药(例如，玻璃体内注射或经由血流递送)。
在一些实施方案中，本文中所用的经修饰的AAV载体为假型化AAV。AAV假型化是指混合来自不同病毒血清型的衣壳及基因组。这些血清型用斜线表示，因此AAV2/5表示含有包装于血清型5的衣壳中的血清型2的基因组(例如，ITR)的病毒。在一些实施方案中，AAV载体为AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/6、AAV2/9、AAV2/4、AAV2/7、AAV2/10或AAV2/12载体。
在一些实施方案中，本文中所用的经修饰的AAV载体为嵌合(有时亦称为杂合或经重排的)AAV，其衍生自不同AAV血清型，包括从不同物种分离的不同AAV血清型。在一些实施方案中，AAV载体为AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9。AAV-DJ为借由DNA重排方法由八种血清型的AAV杂合体库产生的AAV变异体。Grimm,D.等人(2008).J.Virol.82:5887-5911。其能够有效转导包括眼部细胞在内的广泛细胞类型。此外，嵌合AAV比天然产生的AAV具有更强的避开免疫中和的能力，因此可以有效地递送更高数量的治疗性转基因。可以进一步修饰杂合AAV。举例而言，AAV-DJ/8及AAV-DJ/9借由在AAV-DJ的肝素结合域(heparin bindingdomain，HBD)中制造点突变而产生。Grimm,D.等人(2008).J.Virol.82:5887-5911。
在一些实施方案中，本文中所用的经修饰的AAV为衣壳突变型AAV。其涉及在AAV衣壳蛋白中产生一个或多个突变(例如，点突变)。相比于未经修饰的AAV，衣壳突变型AAV具有优势。举例而言，AAV衣壳蛋白的表面暴露的酪氨酸(Y)残基的点突变被报导为一种用于避开磷酸化及随后的泛素化(ubiquitination)的简单且有效的方法，在体外及体内均致使更高的转导效率(Zhong等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105(22):7827-32；Markusic等人,Mol Ther.2010；18(12):2048-56；Li等人,Hum Gene Ther.2010年11月；21(11):1527-1543)。举例而言，借由苯丙氨酸残基取代达成的七个AAV2衣壳酪氨酸残基(Y252、Y272、Y444、Y500、Y700、Y704及Y730)中的每一者的定点诱变可引起载体转导及转基因表达增加，其借由在体外人类细胞及体内鼠类肝细胞中避开EGFR-PTK磷酸化及泛素-蛋白酶体途径(Zhong等人,Virology.2008年11月25日；381(2):194-202)。亦有报导称，AAV衣壳上在特定酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)及赖氨酸(K)残基处的点突变在体外及体内均可显著改良转导(Gabriel等人,Hum Gene Ther Methods.2013；24(2):80-93；Sen等人,HumGene Ther Methods.2013；24(2):104-16；Sen等人,Sci Rep.2013；3:1832；Wu等人,JVirol.2006；80(22):11393-7)。亦可对经修饰的AAV进行衣壳突变以产生另一经修饰的AAV。举例而言，AAV-DJ/8及AAV-DJ/9借由在AAV-DJ的肝素结合域(heparin bindingdomain，HBD)中制造点突变而产生，AAV-DJ为一种杂合AAV。Grimm,D.等人(2008).J.Virol.82:5887-5911。衣壳突变亦能使AAV避开NAB并产生较少免疫响应。此外，某些衣壳突变能使AAV更加适合于玻璃体内递送。Kay等人,PLoS One,8:e62097,2013。在一些实施方案中，本文中所用的AAV载体为具有一个或多个衣壳突变的经修饰的AAV，这些突变包括但不限于酪氨酸突变为苯丙氨酸(Y-F)、苏氨酸突变为缬氨酸(T-V)、赖氨酸突变为精氨酸(K-R)、苏氨酸突变为丙氨酸(T-A)、丝氨酸突变为丙氨酸(S-A)，和/或影响AAV的肝素结合域(HBD)的突变，和/或在其抗原区中的突变，包括但不限于在位置459、493及551处的突变。在一些实施方案中，AAV载体为具有Y444F、Y500F、Y730F、Y252F、Y272F、Y700F、Y704F及T491V中之一种或多种衣壳突变的AAV2，其中数字(例如，444)表示AAV衣壳的点突变位置。在一些实施方案中，AAV载体为具有Y263F及Y719F中之一种或多种衣壳突变的AAV5。在一些实施方案中，AAV载体为具有Y447F、Y733F及T494V中之一种或多种衣壳突变的AAV8。在一些实施方案中，AAV载体为具有Y731F的衣壳突变体的AAV1。在一些实施方案中，AAV载体为具有Y445F及Y731F中之一种或多种衣壳突变的AAV6。在一些实施方案中，AAV载体为具有Y731F的衣壳突变的AAV9。在一些实施方案中，AAV载体为具有K137R、T251A及S503A中的一种或多种衣壳突变的AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9。
在一些实施方案中，经修饰的AAV载体为具有变异型AAV衣壳蛋白的AAV。变异型AAV衣壳蛋白为本发明所属技术领域中已知的。在一些实施方案中，非天然产生的衣壳蛋白可以包括与异源序列(例如，从不同经选择的AAV血清型、相同AAV血清型的非连续部分、从非AAV病毒来源或从非病毒来源所获得的序列)组合的经选择的AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)。在一些实施方案中，经修饰的AAV载体在衣壳蛋白GH环中包括一个或多个氨基酸插入(例如，约5个氨基酸至约11个氨基酸)。相比于非变异型AAV(例如，野生型AAV)对视网膜细胞的感染性，变异型AAV衣壳蛋白可赋予增加的视网膜细胞感染性。在一些实施方案中，经修饰的AAV为能够穿过血眼屏障(blood-ocular barrier，BOB)递送转基因的一者，此特性使其适合经由血流递送，从而为眼部基因疗法中所用的习知给药方式(例如，视网膜下注射或玻璃体内注射)提供了替代性给药/递送途径。在一些实施方案中，具有变异型AAV衣壳蛋白的AAV为AAV 7m8或其衍生物或变异体(Dalkara等人,Science TranslationMedicine,5:189ra76,2013；PCT申请第PCT/US2012/034413号、PCT申请第PCT/US2014/039015号、美国申请第14/214,011号及美国申请第13/899,481号)。在一些实施方案中，具有变异型AAV衣壳蛋白的AAV为AAV-PHP.B。
在一些实施方案中，可以经由重建构病毒革命谱系(viral revolutionarylineage)来重建构或合成AAV载体。该重建构可以产生祖先、古代或亲代AAV。在一个实施方案中，AAV载体为Anc80(AAV1、2、8及9的祖先)或其衍生物。Zinn等人,Cell Rep.2015年8月11日；12(6):1056-68。
在一些实施方案中，一个或多个AAV和/或其他病毒载体可以借由本发明所属技术领域中已知的技术(包括例如“定向进化”和/或“合理设计”)为手段来修饰(例如，针对玻璃体内递送、增强靶细胞类型(例如，RPE细胞)中的转导或针对经由血流的递送而进行最佳化)。参见例如Asuri等人,Mol Ther.20:329-338,2012及Yang等人,Methods MolBiol.709:127-139,2011。可以将经修饰的AAV或其他病毒载体描述为例如经“工程改造”、“杂合”、“进化”、“增强”或“设计”的载体。这些修饰可以例如改良载体靶向(例如，改良玻璃体内递送或经由血流递送的适合性)、转导效率和/或降低免疫响应，致使例如较低的所需剂量。在一些实施方案中，rAAV载体为AAV血清型rh10(EP 20100178940)或ShH10。在一些实施方案中，rAAV载体为AAV-PHP.B(US 20150079038)。
在一些实施方案中，AAV载体可以产生于和/或选自于多于一种本文中所述的策略的组合。举例而言，AAV-DJ/8及AAV-DJ/9借由在AAV-DJ的肝素结合域(HBD)中制造点突变而产生，AAV-DJ为一种杂合AAV。
本发明所属技术领域中已知，某些AAV可能比一些其他AAV更适合玻璃体内递送。许多此类用于玻璃体内递送的AAV涉及经由突变修饰AAV衣壳蛋白(例如，AAV2(四Y-F+T-V)(Kay等人,PLoS One.2013年4月26日；8(4))或变异型AAV衣壳蛋白(例如，AAV 7m8)。此外，存在适合经由血流递送的AAV，例如AAV-PHP.B。然而，这些AAV的使用不限于玻璃体内递送或经由血流递送，例如其亦可作为AAV载体用于视网膜下及其他给药途径。
在一些实施方案中，使用自身互补型AAV载体(scAAV)。野生型AAV具有单链DNA基因组。AAV的一个缺点为其单链DNA基因组。因为单链AAV基因组依赖细胞的DNA复制机制来合成互补链，所以转基因表达延迟且不如双链DNA稳健。关于CYP4V2基因疗法，我们开发了一种scAAV设计(参见图7)来避开习知单链AAV载体中的限速第二链合成并促进稳健的转基因表达。scAAV.CYP4V2包含分子内自身互补型CYP4V2 DNA结构，其消除了对宿主细胞DNA合成的需求并且在转导时导致更快且更稳健的表达。然而，scAAV的自身互补型结构将scAAV载体的包装限制从ssAAV的约4.7-5.0kb降低至scAAV的约2.4-2.5kb。因此，在scAAV设计中需要较短长度的调节序列(例如，启动子、增强子和/或polyA信号)。为了确保表达盒不超过载体包装限制并且视cDNA及所使用的其他调节序列的长度而定，可能需要从scAAV构建体中排除某些可选择性的调节序列，诸如增强子。scAAV设计中的两个ITR中之一者为经截短的ITR且在末端解析位点(terminal resolution site，TRS)具有突变。关于scAAV结构、纯化及产生的详述论述，参见McCarthy,Molecular Therapy,第16卷,第10期,第1648-1656页,2008年10月。
可以采用许多其他载体设计。举例而言，可使用双重载体系统(例如，基于AAV的双重载体系统，例如反式剪接(trans-splicing)或杂合双重AAV载体)来表达核酸序列(例如，CYP4V2核酸序列)。参见例如Colella等人,Gene Ther.21,450-456,2014。举例而言，双重载体系统可以包括(i)第一AAV载体多核苷酸，在该多核苷酸的各端(5'端及3'端)具有反向末端重复序列，且在反向末端重复序列之间具有合适的启动子，其可操作地连接于编码由所关注的核酸序列编码的蛋白质的N端部分的部分编码序列；及ii)第二AAV载体多核苷酸，在该多核苷酸的各端(5'端及3'端)具有反向末端重复序列，且在反向末端重复序列之间具有编码由所关注的核酸序列编码的蛋白质的C端部分的部分编码序列，随后为多腺苷酸化(pA)信号序列。
为了我们的研究，设计并产生了各种rAAV载体，包括scAAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、scAAV2/5、AAV2/8、scAAV2/9及AAV2/2(Y444F+Y500F+Y730F)(参见本文图7中的示意图及注释)。其证明，各种载体设计的rAAV载体可用于CYP4V2基因疗法中。此外，鉴于患者群体中对抗某些AAV类型的预先存在中和抗体及其他个体免疫响应，包含多种rAAV载体作为选项可以帮助减少CYP4V2基因疗法中的潜在免疫响应。若需要对同一只眼睛进行后续给药或对同一受试者的对侧眼睛给药，则其亦将提供更多选项。
用以产生病毒递送载体，包括使用无辅助系统(helper-free system)产生病毒递送载体的方法为本发明所属技术领域中已知的。参见例如PCT/US2007/010055；第6458587号专利；第US 6428988B1号专利。基因疗法中所用的各种载体的制造，包括但不限于AAV载体、腺病毒载体、慢病毒载体及逆转录病毒载体的制造，亦可经由委外研究机构(contractresearch organization，CRO)及合同制造组织(contract manufacturing organization，CMO)，例如Vector Biolabs(Malvern,PA)及Cell Biolabs,Inc.(San Diego,CA)，商业上获得。
在一些实施方案中，适用于本文中所描述的方法中的重组AAV载体可以借由培养含有以下各者的宿主细胞(例如，HEK293细胞)而产生：编码AAV血清型衣壳蛋白的核酸分子或其片段；rep基因；小基因(minigene)，其最少包含AAV反向末端重复序列(ITR)及所关注的核酸分子(例如，具有CYP4V2核酸序列)；及足以允许将所关注的核酸包装到AAV衣壳蛋白中的辅助功能。需要在宿主细胞中被培养以将核酸包装于AAV衣壳中的组分可以顺式或反式提供给宿主细胞。或者，所需组分(例如，所关注的核酸分子、rep序列、cap序列和/或辅助功能)中的任何一者或多者可以由经工程改造而含有所需组分中的一者或多者的稳定的宿主细胞提供。这些组分中的任一者可以选自任何合适的血清型。举例而言，rAAV载体借由用以下各者共同转染生产细胞(producer cell)(例如，HEK 293细胞)而产生：(a)质粒(AAV顺式质粒)，其含有由所关注基因(例如，编码CYP4V2的cDNA)及其他所欲的侧接有两个AAVITR的调节序列构成的经克隆的重组AAV基因组；(b)在反式AAV病毒Rep及Cap基因中表达的另一构建体；(c)腺病毒辅助因子，其借由将提供这些腺病毒辅助因子的第三质粒经由腺病毒感染或转染至生产细胞中来提供。除了HEK293细胞之外，亦可使用其他细胞系来产生rAAV载体，包括但不限于HeLa、Vero、A549、B50、WI38及BHK细胞。
在一些实施方案中，病毒递送载体为rAAV2病毒、rAAV2/5病毒、rAAV2/8病毒、rAAV2/1病毒、rAAV2/4病毒、rAAV2/6病毒、rAAV2/9病毒、rAAV2/12病毒或具有来自AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9和/或AAV12病毒中的一者或多者的衣壳元件的rAAV病毒。在一个实施方案中，病毒递送载体为具有一个或多个Y-F突变的rAAV病毒，包括但不限于AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)或AAV8(Y733F)。
在一些实施方案中，病毒递送载体为单链rAAV(ssAAV)病毒。在一些实施方案中，病毒递送载体为自身互补型rAAV(scAAV)病毒。
除了AAV载体之外，亦可在CYP4V2基因疗法中使用其他病毒载体。举例而言，腺病毒载体亦已被证明适用于基因递送。举例而言，Mori等人,2002.IOVS,43:1610-1615揭示了一种腺病毒载体的用途，该腺病毒载体为E-1缺失、部分E-3缺失的5型Ad，其中转基因(绿色荧光蛋白)由CMV启动子驱动。在注射107至108个病毒颗粒后展现峰值表达水平，视网膜下注射提供比玻璃体内注射更高水平的表达。
在一些实施方案中，递送载体为含有编码人类CYP4V2蛋白质或其功能变异体或片段的核酸分子的质粒。
非病毒载体亦可用于CYP4V2基因疗法中。非病毒载体的实例包括但不限于裸核酸、树状体、脂质体(例如，阳离子或阴离子脂质体)、聚合物(例如，聚合复合物(polyplex))、脂质-聚合物系统及纳米颗粒(例如，无机或合成纳米颗粒)。举例而言，Farjo等人,2006,PLoS 1:e38使用压实的DNA纳米颗粒(compacted DNA nanoparticles)作为用于非病毒基因转移至眼部组织的系统，证实了有效的非病毒眼部基因转移。作为概念验证，使用pZEEGFP5.1(5,147bp)表达构建体，其编码由CMV立即早期启动子(CMV immediate-early promoter)及增强子转录控制的增强型绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)cDNA。DNA纳米颗粒借由将质粒DNA与CK3OPEG10K混合来配制，CK3OPEG10K为具有N端半胱氨酸的30-mer赖氨酸肽，其使用已知方法经由马来亚酰胺键与10kDa聚乙二醇共轭。将纳米颗粒在盐水中浓缩至4mg/ml的DNA。将压实的DNA以0.6μg剂量递送至玻璃体腔。借由PCR及显微术观察晶状体、视网膜及色素上皮/脉络膜/巩膜中的GFP表达。
此外，关于眼部基因转移方法已颁布了多项专利，包括但不限于美国专利第7,144,870号，其提供玻尿酸介导的腺病毒转导方法；美国专利第7,122,181号及第6,555,107号，其提供慢病毒载体及其介导眼部基因递送的用途；美国专利第6,106,826号，其提供单纯疱疹病毒载体及其介导眼部基因递送的用途；及美国专利第5,770,580号，其提供DNA表达载体及其介导眼部基因递送的用途。
在本文实施例部分中提供一种从不同载体中筛选及选择适合用于CYP4V2基因疗法中的载体的方法。实例使用不同的AAV载体来说明该方法。应理解，熟习此项技术者亦可用该方法在不同类型的载体中做出比较及选择，例如病毒载体对比非病毒载体、腺病毒对比AAV、慢病毒对比AAV、HSV对比AAV等。
C.CYP4V2表达盒及调节序列
本发明亦提供一种表达盒，其包含编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸序列(例如，SEQ ID NO:1、2或3的核酸序列)及可操作地连接于CYP4V2编码核酸序列的表达控制序列。除了编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸分子之外，CYP4V2基因疗法中所用的表达盒的其他关键元件包括一个或多个用以控制该核酸分子的表达的调节序列。在一些实施方案中，将表达盒包装于递送载体中(例如，侧接有AAV ITR的rAAV载体中)以增强递送、转导和/或表达效率。在本文中所描述的方法中可以使用任何AAV ITR。本文实施例中所描述的ssAAV载体含有两个AAV2 ITR，各自约141bp(示范性序列显示于SEQ ID NO40中)。实施例中所描述的scAAV载体含有两个AAV2 ITR，其中一个为经截短的ITR(示范性序列显示于SEQ ID NO 41中)。视所使用的亲代载体而定，AAV2 ITR通常具有约132至约167bp的长度。
如本文中所使用的术语“调节序列”是指任何能够对核酸序列的复制或表达(转录或翻译)发挥调节作用或以其他方式指导、影响和/或调节核酸序列的表达的基因元件(例如，多核苷酸序列)。常见的表达控制序列包括启动子、多腺苷酸化(polyA)信号、增强子、上游调节域(upstream regulatory domains)、内含子、UTR、反应元件或诱导元件、复制起点、内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)、转录起始序列、终止序列、RNA加工序列，诸如剪接及多腺苷酸化(polyA)序列、稳定细胞质mRNA的序列、增强翻译效率的序列(亦即科札克共同序列)、增强蛋白质稳定性的序列或增强所编码蛋白质的分泌的序列。调节序列可为细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或病毒来源的调节序列、或可为其衍生物、杂合体或变异体、或可为合成的，且载体可以含有来自不同来源的调节序列的组合。举例而言，调节序列相对于由这些调节序列调节表达的编码序列(例如，CYP4V2基因)可为异源的(例如，具有不同来源或来自不同基因；例如来自非CYP4V2基因)或同源的(例如，来自同一个基因；例如来自CYP4V2基因)。如本文中所使用的“可操作地连接”意谓启动子和/或其他调节序列相对于核酸编码序列以能够指导、影响或调节该核酸编码序列的表达这样的方式定位。调节序列可与同一载体中或不同载体中的核酸编码序列“可操作地连接”。一个或多个可操作地连接于核酸编码序列的调节序列可为连续的和/或可以反式或以一定距离起作用以指导、影响或调节核酸编码序列的表达。在调节序列中，启动子为必需的，而其他调节序列如增强子、内含子及终止子，可为有益的，但是是可选择性的。
可以使用各种启动子序列来驱动核酸编码序列的表达。一些启动子为组成型启动子(constitutive promoter)，其指导几乎所有组织及大多数细胞类型中的表达，而其他启动子则受到更多控制。受调节的启动子可能仅在某些组织或细胞中起作用(亦即组织或细胞特异性启动子)或在发育的某些时间起作用(亦即发育阶段特异性启动子)和/或可取决于环境条件或外部刺激，诸如化学、氧气水平、热或光(亦即诱导型启动子)。
在一些情况下，可能需要使用组成型启动子(或泛在启动子(ubiquitouspromoter))。示范性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(Gray等人,HumGene Ther.2011年9月；22(9):1143-1153；Norman等人,PLoS ONE 5(8):e12413,2010年8月)、鸡β-肌动蛋白启动子、衍生自CMV/鸡β肌动蛋白/兔β-球蛋白的杂合CAG(又名CAGGS、CBA或CB)启动子(Miyazaki J,Takaki S,Araki K,Tashiro F,Tominaga A,Takatsu K,Yamamura K.1989.Expression vector system based on the chickenβ-actin promoterdirects efficient production of interleukin-5.Gene 79:269-277；Acland,G.M.等人MoI Then,2005,12:1072-1082)、小CBA(smCBA)启动子(～953bp，参见Mah等人2003,Hum.Gene Ther.14:143-152；Haire等人2006IOVS,2006,47:3745-3753)、CBh启动子(～800bp，参见Gray等人,Hum Gene Ther.2011年9月；22(9):1143-1153)、人类β-肌动蛋白启动子(ACTB)(Norman等人,PLoS ONE 5(8):e12413,2010年8月)、延伸因子1α(EF-1alpha)启动子(参见Gill等人,Gene Ther.2001；8(20):1539-1546；Norman等人,PLoS ONE 5(8):e12413,2010年8月)、磷酸甘油酸激酶(PGK，人类或小鼠)启动子(Norman等人,PLoS ONE 5(8):e12413,2010年8月)、泛素C(UBC)启动子(Norman等人,PLoS ONE 5(8):e12413,2010年8月)、GUSB(葡糖醛酸糖苷酶β)启动子、GUSB最小启动子(hGBp)(Husain,Gene Therapy(2009)16,927-932)、UCOE启动子、延伸因子1α短型(EFS)启动子、猿猴病毒40(Simianvirus 40，SV40)启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)启动子。关于各种启动子的一般性比较及论述，参见例如Powell,Discov Med.2015年1月；19(102):49-57。应理解，在一些情况下，“组成型”或“泛在”启动子可能倾向于沉默或促进所选细胞类型中的差异表达强度，参见例如McCown等人,Brain Res.1996；713(1-2):99-107；Gray等人,HumGene Ther.2011；22:1143-1153。
在一些情况下，使用细胞特异性或组织特异性启动子是所欲的，其指导核酸编码序列在特定类型的细胞或组织中的表达。基于本文中的揭示内容，应了解，细胞特异性或组织特异性启动子可对眼部细胞或组织或对淋巴细胞具有特异性。眼部细胞类型包括但不限于视网膜细胞、视网膜双极细胞、光感受器细胞、视杆细胞及视锥细胞、神经节细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、脉络膜细胞或角膜上皮细胞。因此，如本文中所描述的细胞特异性启动子可为视网膜特异性启动子(例如，RPE特异性、光感受器特异性(例如，视锥特异性和/或视杆特异性)和/或脉络膜特异性)或角膜特异性启动子。示范性眼部细胞特异性启动子包括但不限于人类G蛋白偶联受体蛋白激酶1又名视紫质激酶1(GRK1)启动子(Genbank登录号AY327580)、GRK1启动子的292nt片段(位置1793-2087)(参见Beltran等人,Gene Therapy17:1162-74,2010)、人类光感受器间类视色素结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)近端启动子、hIRBP启动子的235nt片段、RPGR近端启动子、红色视蛋白启动子、红色-绿色视蛋白启动子、蓝色视蛋白启动子、小鼠视蛋白启动子(长型及短型两种，Le等人,Molecular Vision 2006；12:389-398；Beltran等人,Gene Therapy 17:1162-74,2010)、视紫质(Rho)启动子(Mussolino等人,Gene Therapy,18:637-45,2011)、视锥转导蛋白的α-亚基(Morrissey等人,BMC Dev,Biol,11:3,2011)、β磷酸二酯酶(PDE)启动子、视网膜色素变性(RP1)启动子(Nicord等人,J.Gene Vied.9:1015-23,2007)、NXNL2/NXNL1启动子(Lambard等人,PLoS One,5:el3025,2010)、RPE65启动子(Li等人,Investigative Ophthalmology&Visual Science,2002年12月,第43卷,3640)、视网膜退化缓慢/外周蛋白2(retinal degeneration slow/peripherin 2，Rds/perphZ)启动子(Cai等人,Exp Eye Res,91:186-94,2010)、VMD2启动子(卵黄状黄斑变性2(vitelliform maculardystrophy 2)，又名BEST1，Kachi等人,Human Gene Therapy,20:31-9,2009)、IRBP/GNAT2启动子(与视锥转导蛋白α启动子融合的hIRBP增强子)、Rds(视网膜退化缓慢)启动子、hPDE6b启动子或VEcad启动子(VE-钙黏附蛋白(VE-cadherin)/钙黏附蛋白5(CDH5)/CD144启动子)。应了解，基于本文中所提供的基本原理及论述，本发明所属技术领域中已知的其他启动子可以代替或加于本文中所提供的任何示范性启动子而使用。
示范性诱导型启动子包括但不限于钙敏感启动子(例如，NFAT启动子，参见GeneTher.2013年3月；20(3):248-54)、锌诱导型绵羊金属硫蛋白(zinc-inducible sheepmetalioihionine，MX)启动子、地塞米松(dexamethasone，Dex)诱导型小鼠乳房肿瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统、蜕皮激素昆虫启动子、四环素阻遏系统(tetracycline-repressible system)、四环素诱导系统、RU486诱导系统、雷帕霉素(rapamycin)诱导系统、多种商业上可获得的诱导型启动子及由特定生理状态(例如温度、急性期(acute phase)、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)调节的诱导型启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子为对特定眼部细胞类型严格调节并具有特异性的启动子。
启动子可为另一启动子和/或另一调节序列的杂合体、或其经截短/经缩短或经修饰的版本或以其他方式衍生自另一启动子和/或另一调节序列者，例如CAG启动子为CMV立即早期增强子、鸡β肌动蛋白启动子及兔β-球蛋白基因的杂合体，smCBA启动子为CBA启动子的经截短的版本。启动子可以含有其他元件，例如内含子、外显子和/或增强子，例如CAG启动子。可以在表达盒中一起使用多于一个启动子。
在一些情况下，为了增加表达和/或将表达稳定在高于由于启动子而发生的表达，使用增强子序列是所欲的。代表性增强子序列包括但不限于转录后调节元件(例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(又名WPRE)或乙型肝炎病毒转录后调节元件(又名HPRE或HBVPRE，Donello等人,J Virol.1998年6月；72(6):5085-92；Sun等人,DNA Cell Biol.2009年5月；28(5):233-240)，或各种缩短、突变或经修饰的WPRE，例如含有极少WPRE的γ及α元件的～247bp缩短的WPRE(Choi等人,Mol Brain.2014；7:17；Donello等人,J Virol.1998年6月；72(6):5085-5092；Zanta-Boussif等人,Gene Therapy(2009)16,605-619)，或1RBP增强子(Nicord等人,J.Gene Vied.9:1015-23,2007)、组成型运输元件(constitutivetransport element，CTE)增强子(例如，梅森-菲舍猴病毒(Mason-Pfizer Monkey Virus)CTE或禽白血病病毒CTE)、巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子、衍生自免疫球蛋白基因的增强子或SV40增强子，或小鼠近端启动子中所鉴定到的顺式作用元件、内含子调节序列，例如衍生自SV-40的称为SD-SA的小内含子(mini-intron)剪接供体/剪接受体，内部核糖体进入位点(IRES)，其可用于从单一基因转录物产生多于一个多肽，例如含有多于一个多肽链的蛋白质或两个不同蛋白质，可为脊髓灰白质炎病毒(poliovirus)内部核糖体进入序列，其支持RPE、光感受器及神经节细胞中的转基因表达。
转录物的多腺苷酸化对于核输出、翻译及mRNA稳定性是重要的。因此，转录物多腺苷酸化的效率对于转基因表达很重要。代表性PolyA信号序列包括但不限于SV40 polyA信号、SV40晚期polyA信号、SV40早期polyA信号、牛生长激素多腺苷酸化(bovine growthhormone polyadenylation，bGH polyA)信号、小polyA或人类生长激素多腺苷酸化信号(hGH polyA)。在一些情况下，可使用上游增强子(upstream enhancer，USE)序列来提高polyA信号的效率，例如SV40晚期2xUSE、HIV-1USE(人类免疫缺陷病毒1)、GHV USE(地松鼠肝炎病毒(Ground squirrel hepatitis virus))、腺病毒(L3)USE(腺病毒)、hTHGB USE(人类凝血酶原)或hC2 USE(人类C2补体基因)(Schambach A,Galla M,Maetzig T,Loew R,Baum C.Improving transcriptional termination of self-inactivating gamma-retroviral and lentiviral vectors.Mol Ther.2007；15(6):1167-1173)。
如启动子序列一般，表达盒中使用的其他调节序列可为调节序列的杂合体、调节序列的经缩短/经截短、经修饰或以其他方式衍生的版本。例如，经缩短的WPRE、SV40晚期2×USE、SV40晚期polyA。除了本文中所描述的元件之外，表达盒亦可含有其他调节序列，例如内含子、UTR及连接序列。已经证明，包含剪接位点(亦即，侧接有两个内含子的外显子)适用于增加来自表达盒的蛋白质的基因表达。
本发明所属技术领域中已知，调节序列或杂合调节序列经常具有多种版本且具有不止一个名称。举例而言，各种启动子、增强子及polyA信号具有多种版本，其包括但不限于CMV启动子、EF1α启动子、WPRE增强子及SV40polyA信号。CAG启动子具有多个替代名称，其包括但不限于CBA启动子、CB启动子或CAGGS启动子。此外，本发明所属技术领域中亦已知，调节序列可以缩短、经修饰或与其他序列组合，以产生衍生物或变异体，例如CAG(又名CBA、CB或CAGGS)启动子为CMV立即早期增强子、鸡β肌动蛋白启动子及兔β-球蛋白基因的杂合体，smCBA启动子为经截短的CAG启动子，CBSB启动子为缩短的CAG启动子，在CMV立即早期增强子的5'端相差约152bp。此外，调节序列可以有不同的称谓，例如诸如HPRE或WPRE的转录后调节元件亦可被称作增强子。本文中所描述的任何调节序列均涵盖此调节序列的所有变体、衍生物和/或杂合体。本文中所提供的与调节序列相关的任何示范性序列在本质上为示范性的且并不将此调节序列的定义或范畴限于示范性序列中所示者。
在一些实施方案中，可以在表达盒设计中使用微小RNA(miRNA)技术以达成靶向表达特异性，例如经由阻遏脱靶转基因表达，仅举例而言且不限制，可以紧接在CYP4V2 cDNA的下游添加miR181(一种已证明仅在神经节细胞及内视网膜中表达的miRNA)的靶序列来抑制表达盒介导的CYP4V2蛋白质在神经节细胞及内视网膜细胞中的合成。同样地，仅在某些细胞类型中表达的miRNA的靶序列可用于阻遏这些类型的细胞中由表达盒介导的CYP4V2蛋白质表达，以达成靶向的组织或细胞特异性表达。
D.设计用于CYP4V2基因疗法的有效表达盒及递送载体
关于CYP4V2表达盒及递送载体设计方法及这些研究的各种设计的详细论述提供于本文实施例部分中。
使用EFS启动子和/或小PolyA信号(SPA)治疗眼部疾病
如本文中所论述，基因递送载体具有包装大小限制。举例而言，单链AAV载体的包装限制为约4.7-5.0kb，超过此大小，转导及表达效率将显著下降。对于自身互补型AAV(scAAV)，包装限制减半至约2.4-2.5kb。因此，对于由载体介导的基因递送及基因疗法而言，大小很重要。对于双链自身互补型载体，使用小尺寸调节序列来为转基因(例如，cDNA)留出足够的空间是所欲的并且有时是关键的。因为此大小限制，大启动子亦不适合于与scAAV一起使用。关于CYP4V2基因疗法，鉴于cDNA的大小为约1578bp且AAV ITR(含突变)为约258bp，故仅剩下约500-600bp留给调节序列。因为CYP4V2几乎遍在地表达，所以在一些实施方案中，使用组成型启动子来驱动CYP4V2转基因表达是所欲的。然而，没有空间留给我们在单链AAV设计中所用的约1.7kb的组成型CAG启动子或约953bp的缩短的CBA启动子(smCBA)或约800bp的CBh启动子，对于许多其他组成型启动子，例如约600bp的CMV启动子，同样如此。可以改为使用长度较短的EFS启动子(示范性序列显示于SEQ ID NO:34中)用于scAAV设计。相同的大小限制适用于其他调节序列，例如polyA信号。bGH Poly A为约225bp，SV40 polyA为约240bp及SV40晚期polyA为约120bp。其中任一者都将占据留给包括启动子的调节序列的～500bp长度的大部分。因此，scAAV设计使用小polyA信号(SPA)，其仅约54bp(示范性序列显示于SEQ ID NO:35中)。
使用EFS启动子及SPA的设计仅占据约300bp且与AAV ITR一起总共占据约600bp，从而留下约1.8-1.9kb的剩余包装空间给编码所欲的蛋白质的核酸序列及为scAAV设计的表达盒中的任何其他序列，并留下约4.1-4.4kb的剩余包装空间给编码所欲的蛋白质的核酸序列及为ssAAV设计的表达盒中的任何其他序列。因此，相比于使用较大的启动子及polyA信号序列，包括但不限于CMV启动子、CAG启动子、smCBA启动子、CBh启动子、EF1α启动子、bGH polyA、SV40 polyA及SV40晚期polyA，可以在含有EFS启动子及SPA的rAAV载体中包装大小较大的cDNA和/或其他序列。
包含EFS启动子及SPA的表达盒的示意图提供于图4b中。图7b中所示的构建体包括CYP4V2 cDNA。为了用于其他转基因表达的表达盒，CYP4V2 cDNA可以用另一所关注的基因替代。
在此研究中测试在表达盒及递送载体中使用EFS启动子及SPA来驱动核酸编码序列以治疗眼部疾病。产生含有EFS启动子、CYP4V2 cDNA及SPA的scAAV2/1载体，称为scAAV1.EFS.CYP4V2op.SPA。在BCD患者的iPS-RPE细胞中施用scAAV1-EFS-CYP4V2op-SPA。尽管EFS启动子及SPA的长度很短，但是scAAV1-EFS-CYP4V2op-SPA在短短4天之内就在BCD患者的iPS-RPE细胞中显示出快速且稳健的作用(参见表3)。这表明，EFS启动子和/或SPA为非常适用于眼部基因疗法的scAAV系统中的小尺寸调节序列。此外，scAAV载体的稳健表达使得scAAV设计亦适合于除了视网膜下递送之外的其他给药途径(例如，玻璃体内递送)。
EFS启动子和/或SPA的使用不限于CYP4V2基因疗法或scAAV构建体中。其可用于涉及其他基因的基因疗法，其中转基因大小和/或scAAV设计需要使用长度较短的启动子及polyA信号来驱动快速且足够的蛋白质表达。
E.治疗选项、受试者选择及给药
CYP4V2基因疗法可以多种方式施用。在一些情况下，可经由将含有CYP4V2表达盒的递送载体有效递送至受试者的靶向治疗的细胞、组织或器官，例如RPE、光感受器、脉络膜、角膜、淋巴细胞、视网膜或眼睛，从而在受试者(例如，BCD患者)体内施予治疗。在一些情况下，可在体外在所靶向细胞(例如，患者iPS-RPE细胞、患者iPS-光感受器细胞、iPS-光感受器祖细胞、iPS-CEC、淋巴细胞)中施予治疗。然后可以将经治疗的细胞移植至有需要的受试者(例如，BCD患者)。在一些情况下，可经由组合体内方法与体外方法两者来施予治疗。在一些情况下，CYP4V2基因疗法可以独立地使用。在一些情况下，CYP4V2基因疗法可以与另一治疗选项一起使用。
作为本发明治疗方法的候选者的受试者包括经诊断患有BCD的受试者。患有其他由CYP4V2基因突变引起的眼科临床定义病状(例如，遗传性视网膜退化(IRD)、视网膜色素变性(RP)或角膜变性)的受试者亦可使用本文中所描述的方法治疗。由CYP4V2基因中的突变引起的BCD、IRD、RP、角膜变性或另一眼科病状的诊断可以使用本发明所属技术领域中已知的方法进行。本文中所描述的方法可以包括：鉴定具有BCD或由CYP4V2基因中的突变引起的另一眼科病状或怀疑具有BCD或由CYP4V2基因中的突变引起的另一眼科病状(例如，根据存在病状症状且没有其他明显的病因)的受试者，例如儿童、青少年或成年受试者；及从该受试者获得包含基因组DNA的样品，使用已知的分子生物学方法检测CYP4V2基因中突变的存在。
已在CYP4V2基因中鉴定到诸多突变且这些突变引起BCD，其中在基因的11个外显子中各有至少一个突变。基因型分析显示，BCD患者中最常见的CYP4V2突变为c.802-8_810del17insGC(是指17个碱基缺失且两个碱基(GC)插入于从CYP4V2基因的内含子6的末端起8个碱基的位置中，亦称为IVS6-8del/insGC；此插入-缺失突变位于内含子6-外显子7接合处且17bp缺失包括外显子7剪接受体位点，引起编码62个氨基酸的外显子7的框内缺失)，导致跳过外显子7。(Xiao等人,Biochem Biophys Res Commun.409:181-6,2011；Meng等人,2014,Mol.Vis.,20:1806-14；Wada等人,Am J Ophthalmol.139:894-9,2005；Jiao等人,European Journal of Human Genetics(2017)25,461-471)。在与BCD相关的CYP4V2突变中发现了各种类型的突变，包括但不限于错义、剪接位点、框移、缺失、插入、插入缺失、无义、多态性(例如，单核苷酸多态性)及提前终止。人类BCD患者中的选择CYP4V2突变的汇总提供于表1中且可在各种出版物及在线数据库中找到，例如LOVD(万维网上的databases.lovd.nl/shared/genes/CYP4V2)、OMIM(万维网上的omim.org/allelicVariant/608614)及ClinVar(万维网上的ncbi.nlm.nih.gov/clinvar？term＝608614[MIM])。
应注意，表1中的人类CYP4V2突变并不详尽。未来可能会鉴定到更多CYP4V2突变。应理解，并非所有相对于参考序列的变异都是突变。一些变异为非病理性的。确认遗传变异是否是病理性变异(亦即是否是突变)的方法为本发明所属技术领域中已知的，包括但不限于将变异与先前临床上鉴定的已知突变进行比较，和/或判定是否存在相应的功能改变。举例而言，确定遗传变异是否为病理性变异(亦即突变)的一种方法为测试衍生自如本文中所描述的受试者的iPS-RPE细胞系的生化功能，并与健康对照组的iPS-RPE细胞系的生化功能相比，评定是否存在任何异常。
可以使用本文中所描述的方法治疗的具有BCD或由于CYP4V2突变引起的另一眼科病状的患者较佳保留若干光感受器及视觉功能，例如如借由视敏度、视野、视觉功能和/或光学相干断层扫描(OCT，例如谱域-OCT(SD-OCT))所测量。
在给药之前，最终产物将经历一连串步骤(例如，超纯化)以满足临床级标准。临床级生产可经由各种GMP设施商业上获得，包括但不限于NIH基因疗法资源计划(GeneTherapy Resource Program，GTRP)及合同制造组织(CMO)中的设施。
在给药之前，受试者可以测试预先存在的针对受试者将要接受给药的AAV载体类型的中和抗体(NAb)。在一个实施方案中，若受试者受试者具有预先存在的针对此AAV类型的NAb，则可以使用对受试者的预先存在的NAb具有低交叉反应性的替代性AAV载体或具有经修饰的衣壳结构的AAV载体来向该受试者给药，从而降低免疫响应并保留足够的经由AAV载体的转导效率。使免疫响应最小化的其他方法为本发明所属技术领域中已知的，包括但不限于在治疗前、在治疗期间和/或在治疗后施予免疫抑止剂及方案。
病毒载体或非病毒载体或其组合(例如，杂合载体)可以使用一种或多种物理手段递送至受试者的眼部细胞中。如本文中所使用的眼部细胞是指(但不限于)视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器细胞、角膜上皮细胞、视网膜细胞、视网膜双极细胞、视杆细胞、视锥细胞、神经节细胞、脉络膜细胞和/或晶状体细胞。除此之外或作为进一步一种选择，可将载体递送至附近或邻近细胞或可与所靶向的细胞接触的细胞中，包括但不限于脑中的细胞或视神经中的细胞或血细胞。
体外治疗可以使用可有效地将载体递送至靶向治疗的细胞(例如，BCD患者的iPS-RPE细胞)的任何方法或多种方法和/或药剂的组合。体外治疗可以经由一轮或多于一轮的感染来进行。在一些情况下，直接在所培养的细胞中施予载体以转染或转导这些细胞。在一些情况下，可以使用其他的递送至细胞中和/或增强细胞中的转染/转导效率的方法，包括但不限于多重转染/转导、电穿孔、磁性转染(magnetofection)或声致穿孔。用载体或表达盒感染/转染细胞时所用的方法及药剂为本发明所属技术领域中已知的，包括但不限于如本文实施例部分中所述的。
接着可将经过体外治疗的细胞移植至受试者的眼睛。举例而言，可将经基因修复的来自BCD患者的iPS-RPE细胞经由视网膜下注射移植至患者。将细胞移植至眼睛所用的方法、药剂及装置为本发明所属技术领域中已知的，参见例如Wert等人,J Vis Exp.2012；(69):4286；WO 2016/179496；Schwartz等人,Investigative Ophthalmology&VisualScience 2016年4月,第57卷,ORSFc1-ORSFc9。
关于体内治疗，载体和/或表达盒可以递送至所靶向进行体内治疗的细胞(例如，经由施用于需要治疗的受试者的眼睛，从而递送至靶向治疗的细胞)。向靶眼部细胞体内递送核酸分子、表达盒、载体的方法为本发明所属技术领域中已知的。举例而言，对眼睛给药可以根据靶向治疗的细胞使用任何可有效地将载体而递送至视网膜、视网膜下空间、脉络膜或通常是眼后段、角膜、晶状体或玻璃体的方法(或多种方法和/或药剂的组合)。给药可以经由任何合适的手段，包括但不限于注射(例如，视网膜下注射、玻璃体内注射、直接视网膜注射、直接注射至眼后部脉络膜上腔中)、滴眼剂，且可以与其他递送技术(例如，电辅助递送至角膜上皮)组合施予。亦可使用例如DNA颗粒撞击(例如，借由基因枪)、流体动力基因转移(hydrodynamic gene transfer)、滴眼剂、电穿孔、磁性转染或声致穿孔，将CYP4V2核酸、表达盒和/或递送载体引入细胞中。对眼睛的给药及递送方法及技术为本发明所属技术领域中已知的。仅举例而言，参见(但不限于)Wert等人,J Vis Exp.2012；(69):4286；WO2016/179496；Mohan等人,Prog Retin Eye Res.2012年1月；31(1):43-64。
除了使用视网膜下注射对RPE细胞进行习知的递送之外，本文中所论述的方法的一个方面为玻璃体内递送核酸分子(例如，具有非突变CYP4V2核酸序列)来治疗或预防眼睛疾病。一些载体(例如，AAV2(四Y-F+T-V)及AAV7m8)经由玻璃体内给药显示出在视网膜中有效转导的特殊前景。此外，AAV或其他病毒载体可以借由本发明所属技术领域中已知的技术手段进行修饰，包括例如“定向进化”及“合理设计”，从而改良或最佳化其作为以不同于习知视网膜下注射的方式基因递送至一种或多种类型的细胞或组织(例如，玻璃体内注射)的载体的适合性。除了视网膜下递送之外，亦可在玻璃体内递送中使用scAAV载体，因为其迅速且稳健的表达谱(expression profile)。因为CYP4V2几乎遍在地分布且在视网膜中具有特别高的表达，所以CYP4V2的遗传及表观遗传改变特别适合经由玻璃体内施用一种或多种载体来进行修复。目前的基因疗法方法通常需要在视网膜下施用载体。因此，借由本文中所揭示的材料及方法达成的技术进展之一为玻璃体内递送核酸序列(例如，野生型或非突变型核酸序列，或编码基因编辑多肽的核酸序列)和/或多肽来治疗及预防与CYP4V2的核酸序列中的遗传或表观遗传改变相关的眼睛疾病。
可以使用某些技术及药剂来促进给药或递送过程。非限制性实例包括使用润滑剂，以避免载体黏附至递送媒介(例如，针)。此外，在给药或递送过程之前、期间和/或之后使用免疫抑制药物能够增加感染或转导效率。
可以使用各种药学上和/或生理学上可接受的媒介赋形剂、稀释剂和/或载剂来配制用于递送至受试者的眼部细胞中的载体。适合对眼睛给药的媒介赋形剂、稀释剂和/或载剂可称作药学上可接受的载剂，其实例包括无菌无热原水及无菌无热原缓冲盐水(例如，使用磷酸盐或其他缓冲剂缓冲的盐水，诸如保持pH在适当的生理水平的HEPES)、等张氯化钠溶液、平衡盐溶液、乳剂(例如，油/水乳剂)及各种类型的润湿剂。在一些情况下，制剂可以包括其他药剂(medicinal agent)、医药剂(pharmaceutical agent)、稳定剂、缓冲剂、载剂、佐剂及稀释剂。在一些情况下，制剂可以包括DBPS、甘油或Tween20用于长期储存。
确定最有效的给药手段及治疗有效剂量的方法为熟习此项技术者已知的且将随以下各者而变化：载体、其衣壳结构、载体设计(例如，ssAAV对比scAAV)、表达盒的组成、载体的表达水平、启动子、其他调节序列或核酸分子、载体滴度、靶细胞类型、靶表达水平、所靶向细胞的区域大小或数目及待治疗的受试者(例如，待治疗受试者的年龄、性别、体重、疾病及病状的发展阶段及潜在免疫响应)；给药途径；靶向治疗的细胞的位置(例如，视网膜对比角膜)；相关基因在野生型细胞和/或组织中的性质及表达水平；及所需方案。治疗有效剂量可以在疾病模型(例如，BCD细胞模型(例如，来自BCD患者的iPS-RPE细胞系)或动物模型)中测定及评估，且借由临床试验确认或改良。关于细胞的体外治疗，剂量通常用MOI表示，然后MOI乘以待治疗细胞的数目。MOI一般在约1×103GC/细胞至约1×106GC/细胞的范围内或感染MOI为约100至约10,000GC/细胞(GC：基因组拷贝，测量含有基因组的AAV颗粒(又名载体基因组(vg)或基因组颗粒(gp))。关于体内治疗，除了以上所描述的因素之外，实际给药剂量亦会受到给药期间每个患者特有的个体情况影响，例如在下文所描述的无脉络膜症(Choroideremia)的情况下，患者6在视网膜下给药期间的剂量减小。因此，体内单次给药的治疗有效剂量可为大概约1×106至2×1013GC且包括端值(例如，约1×1011GC至约1×1012GC的高剂量范围、约1×1010GC至约1×1011GC的中等剂量范围、约1×109GC至约1×1010GC的低剂量范围、约1×106GC至约1×109GC的极低剂量范围及约1×1012GC至约2×1013GC的极高剂量范围)，或在这些范围内的足够提供所欲效果的任何剂量。在一个实施方案中，组合物以约1×106至2×1013GC的剂量施用。在另一实施方案中，体内给药剂量借由靶向治疗的细胞的数目乘以目标MOI(例如，1×103GC/细胞至约1×106GC/细胞)来确定。在对眼睛的任何单次给药中含有rAAV载体的药剂的体积可以在约1μL(0.001mL)至约1000μL(1mL)的范围内。
如本文中所描述的组合物可以配制成单剂量或多个剂量。同样地，给药可以发生一次或多次(例如，在几周、几个月或几年之内)且可以施用于同一只眼睛或对侧眼睛。在多次给药的情况下，可以考虑相同或不同的AAV血清型和/或给药途径。给药亦可用于治疗不同的组织及细胞，例如一个给药靶向RPE且另一个给药靶向角膜。
用于基因疗法(包括眼部基因疗法)中的病毒载体产生方法、GMP产生方法、纯化方法、配制方法及剂量为熟习此项技术者已知的，且病毒载体的制备方法可借由任何如下文关于LCA-2的各组基因疗法研究中所显示的多个公司及多种方法进行。可以将本文中所提供的表达盒插入任何下文所列的示范性病毒载体中。或者，可以根据下文所提供的实例产生病毒载体。参见Bainbridge等人,2008.N Engl J Med.358:2231-9；Maguire等人,2008.NEngl J Med.358:2240-8；Hauswirth等人,Hum Gene Ther.2008年10月；19(10):979-990。
举例而言，在Bainbridge研究中，使用tgAAG76载体进行基因递送，该载体为血清型2的重组腺相关病毒载体。该载体含有人类RPE65编码序列，其由人类RPE65启动子驱动且借由牛生长激素多腺苷酸化位点终止，如其他地方所述。该载体由Targeted GeneticsCorporation根据良好生产规范(Good Manufacturing Practice)准则产生，使用B50包装细胞系、含有tgAAG76载体基因组的腺病毒-腺相关病毒杂合穿梭载体(adenovirus-adeno-associated virus hybrid shuttle vector)及腺病毒5辅助病毒。将该载体以1×1011个载体颗粒/毫升的滴度填充于缓冲盐水溶液中，并在-70℃下以1ml等分试样冷冻。
Maguire使用重组AAV2.hRPE65v2病毒载体，其为含有RPE65 cDNA的复制缺陷型AAV载体，据记载，在犬LCA2模型中在单次视网膜下注射AAV2.RPE65之后，其能提供长期持久(>7.5年，持续观察)的视觉功能恢复。用于产生AAV2.RPE65的顺式质粒含有康霉素(kanamycin)抗性基因。该病毒由细胞与分子治疗中心(The Center for Cellular andMolecular Therapeutics)在三重转染HEK293细胞之后制造且借由微流体化、过滤、阳离子交换层析法(POROS 50HS；GE Healthcare,Piscataway,N.J.)、密度梯度超速离心法及在PBS中透滤(diafiltration)来分离及纯化。此组合能提供最佳纯度的AAV载体产物，包括有效去除空衣壳及残留的氯化铯。以PF68 NF Prill泊洛沙姆(Poloxamer)188(PF68；BASF,Ludwigshafen,Germany)补充一部分的产物以防止载体随后于产物接触表面的损失。接着使用60-ml无菌注射器及针筒过滤器使含有或不含PF68的经纯化病毒通过0.22-μm过滤器，并将其冷冻(-80℃)储存于无菌管中直至使用。将1.5×1010个AAV2.hRPE65v2载体基因组于体积为150μl的补充有Pluronic F-68NF Prill泊洛沙姆188的磷酸盐缓冲盐水中的注射剂施用于视网膜下腔中。
Hauswirth所使用的病毒载体为重组腺相关病毒血清型2(rAAV2)载体，其经改变以携带人类RPE65基因(rAAV2-CBSB-hRPE65)，先前已在具有RPE65缺乏的动物模型中被证实能够恢复视力。RPE65-LCA病毒载体借由视网膜下注射递送(150μl中5.96×1010个载体基因组)。
治疗剂(例如，蛋白质、核酸分子、表达盒、基因疗法载体、细胞)的给药方法及方案，包括但不限于对眼睛给药，及其他程序及方案(包括但不限于免疫学测试、眼睛检查及免疫抑制剂)，为本发明所属技术领域中已知的。举例而言，下面为MacLaren在治疗无脉络膜症时使用的视网膜下注射AAV载体的实例。手术首先使用平衡盐溶液(AlconLaboratories,Fort Worth,TX,USA)经由41G特氟龙插管(Teflon cannula)(DORCInternational BV,Zuidland,Netherlands)将视网膜剥离。一旦视网膜目标区域从下方的视网膜色素上皮剥离，将含有1×1010个AAV2.REP1基因组颗粒的固定体积(0.1mL)经由新的注射器注射至在前五位患者中创建的视网膜下腔中。在患者6中注射至多6×109个基因组颗粒的降低剂量。经由相同的视网膜切开处(retinotomy)缓慢注射载体，造成该剥离进一步地扩大。在前五位患者中，手术并不困难复杂，但在患者6中，视网膜难以从周围黄斑剥离，使得必需诱导从靠近中央凹的点剥离，这导致乳头黄斑束(papillomacular bundle)的可见拉伸。因为担心具有6/7·5视力的患者中这种重要结构的拉伸相关的损伤，在第二个步骤中注射较小体积的载体(最多0.06mL)。在所有患者中，注射器中存留的剩余载体经由插管排出至聚丙烯小瓶中，然后冷冻。之后在转导人源HT1080细胞系之后，用蛋白质印迹法测试此剩余载体的效力。用10天去氢皮质醇(prednisolone)口服疗程治疗患者，从术前2天开始，连续7天以1mg/kg(70-100mg)，然后减少至40mg服用1天，20mg服用1天及10mg服用1天。在术前及在术后1周与术后5-6周，获取血液样品进行免疫测试。参见MacLaren等人,Lancet.2014年3月29日；383(9923):1129-1137。
在Hauswirth研究中，给药进行如下。在轻度静脉内镇静后，手术眼接受眼球后麻醉(retrobulbar anesthesia)，然后以标准无菌方式准备及覆盖。进行标准的三端口23号核心(three-port 23-gauge core)及周边玻璃体切除术。用Westcott剪刀及0.3镊子解剖右侧巩膜切开处(sclerotomy)的结膜。借由橡皮擦尖端烧灼术(eraser-tipped cautery)保持止血。用20号MVR刀片扩大巩膜切开处，使得视网膜下插管可以容易地插入眼睛中。将载体吸入39号注射插管(Synergetics,O'Fallon,MO)并引入视网膜下腔中。在手术结束时，用7.0Vicryl缝合线固定巩膜切开部，并用间断缝合线闭合结膜。结膜下施用抗生素及类固醇。手术后，局部使用抗生素及类固醇20天。参见Hauswirth等人,Hum Gene Ther.2008年10月；19(10):979-990。
关于体外CYP4V2基因疗法治疗，治疗后评定可以比较患者细胞的细胞形态和/或生化功能障碍，例如比较治疗前及治疗后在BCD患者的iPS-RPE细胞(或iPS-PRC或iPS-CEC细胞，若适用)中显示异常的化合物的水平，以评定在治疗之后细胞的形态和/或生化功能是否改良。
关于体内CYP4V2基因疗法治疗，治疗后评定可以使用本发明所属技术领域中关于视网膜及角膜疾病已知的眼睛及视网膜检查(及角膜测试，若适用)，包括但不限于暗适应、对比敏感度、视野测试、视敏度测试、色觉测试、ERG、OCT、眼底成像、角膜检查、诸如移动性的功能测试等。功效可借由以下各者中之一者来验证：视力改善、疾病进展停止或比预期的视网膜退化或视力丧失的速率慢。
由病毒载体介导的基因疗法的一项挑战为接受该基因疗法的受试者的免疫响应。除了习知与受试者相关的风险之外，免疫响应亦会显著降低病毒载体的转导效率和/或造成无法确立长期的转基因表达。Mingozzi F,Meulenberg JJ,Hui DJ,Basner-TschakarjanE,Hasbrouck NC,Edmonson SA,Hutnick NA,Betts MR,Kastelein JJ,Stroes ES,HighKA,AAV-1-mediated gene transfer to skeletal muscle in humans results in dose-dependent activation of capsid-specific T cells.Blood.2009年9月3日；114(10):2077-86。
或许，部分是因为眼睛独特的免疫环境，所以各种重组病毒载体(例如，AAV、慢病毒、腺病毒)在眼部基因疗法中的免疫效应似乎相当良性。尽管如此，在眼内施用腺病毒之后，仍然会发展出显著的细胞介导的免疫响应。但AAV及慢病毒均不会引发细胞介导的反应，因此是用于治疗慢性眼部(视网膜)疾病的有前景的载体。J Bennett,Immune responsefollowing intraocular delivery of recombinant viral vectors,Gene Therapy(2003)10,977-982.doi:10.1038/sj.gt.3302030。然而，另一方面，先前的研究显示，玻璃体内施用AAV载体引起非人类灵长类动物的玻璃体液以及血清中的抗AAV抗体水平增加。此外，猴子血清中预先存在的中和抗体滴度的存在情况与玻璃体内施用AAV后的弱转基因表达、衰退的转基因表达或无转基因表达强烈相关。Kotterman等人,AntibodyNeutralization Poses a Barrier to Intravitreal Adeno-Associated Viral VectorGene Delivery to Non-Human Primates,Gene Ther.2015年2月；22(2):116-126。因此，降低眼部基因疗法中的免疫响应是所欲的，尤其是中和抗体(NAb)的免疫响应，从而保持所欲的转导效率和/或长期转基因表达。
历史上，基因疗法领域的公司的常见做法是使用一种血清型的AAV载体。通常使用在其他基因疗法的动物研究和/或临床试验中具有良好转导效率及大量安全数据的载体类型。举例而言，AAV2为临床试验中最常用于眼部基因疗法的AAV血清型。然而，由于免疫系统的个体差异，例如在预先存在的抗AAV抗体方面的个体差异，对某位患者而言最佳的血清型对于另一位患者而言未必总是最佳的。举例而言，针对特定AAV血清型的预先存在的抗AAV中和抗体的流行率在各国家及各群体中是不同的。此外，免疫响应会显著降低转导效率，这会降低所施予的基因疗法的功效和/或需要施用更高的剂量。
本文中提供一种用以在病毒载体介导的基因疗法中降低对病毒载体的免疫响应、保持转导效率、降低病毒载体和/或免疫抑制剂剂量和/或使针对具有同一种遗传疾病的不同患者的治疗效果达到最大的方法，其包含：
(a)建立在该基因疗法所针对的靶细胞类型中具有足够的转导效率的多于一个重组病毒载体(例如，rAAV)的库。可以借由产生具有抗原区突变的变异体或在这些病毒载体的衣壳上产生其他突变或变异体，在确认这些突变或变异体在与该疾病有关的靶细胞中(例如，对针对BCD的CYP4V2基因疗法而言，是在iPS-RPE或RPE细胞系中)具有足够的转导效率后，扩增该病毒载体的库。
(b)检测需要该基因疗法的受试者中预先存在的针对不同病毒载体血清型和/或衣壳突变或变异体的中和抗病毒载体抗体(NAb)，和/或测试及比较衍生自该受试者的患者特异性疾病靶细胞(例如，iPS-RPE细胞)中的不同病毒载体。
(c)从该病毒载体的库中选择病毒载体，该病毒载体(i)在这些疾病靶细胞中具有足够的转导效率及(ii)与该受试者中的这些预先存在的Nab具有低交叉反应性，和/或(iii)在该受试者的患者特异性疾病靶细胞(例如，对于针对BCD的CYP4V2基因疗法而言，为患者特异性iPS-RPE或RPE细胞系)中具有良好的表型拯救结果，其中该病毒载体的库包含不同血清型和/或衣壳经修饰的病毒载体(例如，包括但不限于衣壳突变型AAV和/或衣壳蛋白变异型AAV)。
(d)使用选自(c)的病毒载体向该受试者给药。
(e)每当该受试者需要施用基因疗法时，包括但不限于向同一器官(例如，眼睛或对侧眼睛)或向其它器官进行后续给药，重复以上的(b)至(d)(仅重复与预先存在的NAb相关的部分)。
此方法的潜在益处包括：免疫抑制剂的使用减少，rAAV载体的剂量较低，转导效率较高且转基因表达期间较长，和/或适合该基因疗法的患者的百分比较高。
应了解，此方法可以结合其他病毒载体使用。此外，此方法可以用于所有类型的眼部基因疗法及非眼部基因疗法中，无论该疗法与CYP4V2基因相关还是与其他基因相关。
预先存在的抗AAV抗体的检测方法为本发明所属技术领域中已知的。值得注意的是，抗AAV抗体包括中和抗体及非中和抗体两种。用以检测预先存在的抗AAV抗体及其他针对AAV的免疫响应的方法为本发明所属技术领域中已知的。Melvin Y Rincon等人,JMIRRes Protoc.2016年4月至6月；5(2):e102；Hauswirth等人,Hum Gene Ther.2008年10月；19(10):979-990。虽然中和抗体的作用最显著，但是即使是非中和抗体亦能借由免疫系统触发载体清除。非中和抗体可以借由ELISA检测。Boutin S,Monteilhet V,Veron P,LeborgneC,Benveniste O,Montus MF,Masurier C,Prevalence of serum IgG and neutralizingfactors against adeno-associated virus(AAV)types 1,2,5,6,8,and 9in thehealthy population:implications for gene therapy using AAV vectors.Hum GeneTher.2010年6月；21(6):704-12。
除非进一步定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语，与标的方法及组合物所属领域之一般技术者通常所理解者具有相同的含义。除了本文中所提供的术语定义之外，分子生物学中的常见术语的定义亦可见于以下各者中：Glossary of Genetics:Classical and Molecular,Rieger等人,1991,第5版,Springer-Verlag；CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel等人编,1998年增刊,Greene PublishingAssociates,Inc.及John Wiley&Sons,Inc.；Current Protocols in Cell Biology,Bonifacino等人编,1999年增刊,John Wiley&Sons,Inc.；及Current Protocols inNeuroscience,Crawley等人编,1999年增刊,John Wiley&Sons,Inc.。
本文中描述了代表性方法及材料；本发明所属技术领域中已知的其他合适的方法及材料亦可以使用。这些方法及材料仅为说明性的且不意欲为限制性的。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制本发明及权利要求的范畴。
这些研究由映像生物有限公司(“映像生物”)(Reflection BiotechnologiesLimited(“ReflectionBio”))发起、设计、组织并赞助，其为一家由患有罕见视网膜疾病的患者及家庭创建与推动的生物技术公司。罕见疾病患者承担着人类遗传突变的不可避免的机率，但往往被社会所忽视，而且公共资源支持不足。作为一家由患者推动的生物技术公司，映像生物(ReflectionBio)采用“源于患者，造福患者(By Patients,For Patients)”的方式为患者提供联合力量，并在推动罕见疾病及其他具有挑战性的疾病的科学及医学研发方面发挥更积极的作用。
在此研究中包括经诊断患有BCD且具有不同的双等位基因CYP4V2突变(包括纯合CYP4V2突变或复合杂合(compound heterozygous)CYP4V2突变)的患者。特定言之，一位患者(本文中称为患者1、P1或RB001)具有纯合c.802-8_810del17insGC突变。c.802-8_810del17insGC突变引起编码62个氨基酸的外显子7的框内缺失。c.802-8_810del17insGC突变为BCD患者中最常见的突变。患者2(P2或RB002)具有复合杂合CYP4V2突变，这些突变中的每一者为在525个氨基酸长的CYP4V2蛋白质中仅引起一个氨基酸发生改变的单一核苷酸改变。
获得知情同意书。程序遵循赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)指南，且经由机构审查委员会批准。
BCD人类细胞疾病模型实施例
临床上，BCD与RPE萎缩相关，RPE萎缩继而引起光感受器死亡及视觉丧失。因此，建立并使用一种人类RPE模型来研究BCD及开发针对BCD的治疗至关重要。
实施例1-产生及特征化衍生自BCD患者的诱导性多能干细胞(iPSC)
在该研究中，使用无整合方法从BCD患者产生iPSC。用于iPSC重编程的传统技术(例如，慢病毒、逆转录病毒)整合至靶细胞的基因组中。所得iPSC及从那些iPSC分化的细胞将含有外源DNA且可能不安全并且在细胞疗法及药物发现应用中使用时可能存在问题。此外，整合可能发生在基因组的关键区域，导致无关的发育过程出现问题。与传统的重编程方法相比，无整合重编程方法产生不含可检测载体或转基因的iPSC，从而使其更适合用于细胞疗法及药物发现应用。
在该研究中，使用两种不同的无整合重编程方法从BCD患者产生iPSC，一种采用仙台病毒，另一种采用附加型载体(episomal vector)。使用两种不同类型的样品，一种为皮肤样品(皮肤成纤维细胞)，且另一种为血液样品(外周血单核细胞(PBMC))。这两种方法均可用于从皮肤、血液或其他样品(诸如尿液及毛发样品)产生BCD患者特异性iPSC。
A.从皮肤样品进行iPSC重编程
对BCD患者进行皮肤活检，且从该活检获得人类成纤维细胞。然后使用仙台病毒将BCD患者特异性成纤维细胞重编程成iPS细胞系，仙台病毒为一种无痕的RNA病毒，其没有改变宿主基因组的风险。其他载体，包括但不限于慢病毒，亦可用于iPS重编程，但具有整合至宿主细胞基因组中的风险。关于衍生自BCD患者的iPS细胞的照片，参见图1。来自健康个体的成纤维细胞亦以相同方式重编程以产生野生型(或对照组)iPS细胞系。
为了产生iPSC，将5×104个成纤维细胞涂板并培养在12孔盘中直至这些细胞发生附着(约12小时)并且有约70％-80％汇合。去除培养基，且用表达Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的仙台病毒(CytoTuneTM-iPS 2.0仙台重编程试剂盒，A16517，Life Technologies)以5:5:3:5的MOI在500μl成纤维细胞培养基中转染细胞。将细胞在37℃及5％CO2下孵育过夜，之后去除含有病毒的培养基且用KO-DMEM培养基(敲除DMEM，15％敲除血清替代品、1份L-谷氨酰胺、1份非必需氨基酸、1份青霉素-链霉素、0.1mMβ-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)10ng/ml)替代。将经转染细胞孵育约7天，每天更换培养基。
将经转染细胞在PBS中洗涤，暴露于胰蛋白酶(例如，TrypLE Express，于37℃达4分钟)，且再悬浮于含有10μM ROCK抑制剂的2ml KO-DMEM培养基中。然后将细胞涂板在经丝裂霉素-C(mitomycin-C)处理的MEF饲养层上，并恢复至37℃及5％CO2。24小时后及之后的每一天，去除培养基并用KO-DMEM培养基(不含ROCK抑制剂)替代。传代后7-14天可见集落。用含有10μM ROCK抑制剂的KO-DMEM培养基简单处理后，将每个iPS集落显微切割成约100-150个细胞的块，然后在KO-DMEM培养基中在37℃及5％CO2下再培养一周。
iPSC特征化是使用多能标记物的第一抗体来进行：OCT4 Santa Cruz sc-9081兔poly、SOX2 R&D Systems 245610小鼠IgG、TRA-1-60Millipore(Chemicon)MAB4381小鼠IgM、SSEA4 Millipore(Chemicon)MAB4304小鼠IgG、Nanog R&D Systems AF1997山羊poly。通常，为了使用标记物进行特征化，将细胞洗涤，阻断(例如，用3％血清及0.1％Triton X)，暴露于第一抗体(1:200)并在室温下孵育2-3小时。再次洗涤细胞，将其暴露于第二抗体并在室温下孵育60分钟。然后对细胞进行核复染(例如，在PBST中使用1:10000Dapi)。
关于由BCD受试者的成纤维细胞产生的iPSC及借由Oct-4、Sox-2、SSEA-4、Nanog及Tra-1-60标记物达成的特征化，参见图1(a)。
B.从血液样品进行iPSC重编程
除了皮肤活检样品之外，亦由BCD患者及健康对照组的血液样品产生iPSC。使用附加型方法，由外周血单核细胞(PBMC)产生iPSC。方案描述如下。
T细胞活化：
a)解冻冷冻的PBMC，并使用戴诺磁珠(Dynabeads)(人类T活化因子，CD3/CD28，Thermo Fisher，目录号11132D)根据制造商的方案对约50万个活细胞进行T细胞活化。
b)然后使活化的T细胞在血细胞培养基中扩增10-14天。
重编程：
a)为了产生iPSC株，使用Neon转染系统(目录号MPK10096，Invitrogen)根据制造商的说明书将活化的T细胞与戴诺磁珠解离并用附加型iPSC重编程载体(Episomal iPSCReprogramming Vectors，目录号A14703，Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)电穿孔。
b)将两组经电穿孔的细胞涂板于两组35mm培养皿上，这两组培养皿经过CF1 MEF饲养器(目录号ASF-1213，Applied StemCell,Milpitas,CA,USA)预培养。每天用人类iPSC生长培养基饲养细胞。
c)2-3周后，挑取人类ESC样iPSC集落，并将其转移至涂有基质胶(matri-gel)的24孔板进行扩增。
d)然后使患者特异性人类iPSC株在人类iPSC无饲养细胞生长培养基(mTeSRTM1，目录号05850，StemCell Technologies Inc.,Vancouver,Canada)中于基质胶(Matrigel)(Corning目录号354277)上生长及传代，再传代2-3次，直至获得足够的细胞数目，然后冷冻保存。
碱性磷酸酶：
a)关于碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色，将iPSC固定，然后用碱性磷酸酶染色溶液(萘酚/固红紫，Sigma)染色。
b)使用Olympus显微镜(IX51，Olympus,Tokyo,Japan)捕获细胞影像。
关于由BCD患者及健康对照组的血液样品的外周血单核细胞(PBMC)产生的iPSC的相位差影像及AP染色结果，参见图1(b)。
关于由BCD患者衍生的iPS核型影像，参见图1(c)，该图显示明显正常的人类核型。
实施例2-BCD患者的iPSC分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞
BCD患者及健康对照组的所有iPSC株的iPSC分化皆始于第3至6代。关于分化，前14天在经过1:50稀释的基质胶(CORNING,356230)预处理的6孔培养皿(Costar,Corning,Corning,NY)中的分化培养基中培养iPS集落至汇合(confluence)，该分化培养基由敲除(KO)DMEM(Thermo Fisher Scientific，10829018)、15％KO血清替代品(Thermo FisherScientific，10829028)、1％非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific，11140050)、2mmol/L谷氨酰胺(Thermo Fisher Scientific，35050061)、50U/ml青霉素-链霉素(ThermoFisher Scientific，10378016)及10mmol/L烟酰胺(Sigma-Aldrich，N0636)组成。在分化的第15天至第28天期间，给分化培养基补充100ng/ml人类活化素-A(PeproTech，120-14)。从第29天起，去除活化素-A，直至分化完成。8-10周后，形成呈现颜色的簇，手动挑取这些簇并将其涂板于涂有基质胶的培养皿上。将那些细胞维持在以MEM(α修饰，Sigma-Aldrich，M-4526)为基础的RPE培养基中，该培养基含有N1补充剂(每500ml培养基5ml)、牛磺酸(每500ml培养基125mg)、氢化可的松(Hydrocortisone)(每500ml培养基10μg)、三碘甲状腺氨酸(Triiodo-thyronin)(每500ml培养基0.0065μg)(皆来自Sigma-Aldrich)、2mmol/L谷氨酰胺、50U/ml青霉素-链霉素、1％非必需氨基酸及5％胎牛血清(皆来自GIBCO-BRL)。将细胞再培养6-8周，使其形成功能性单层用于功能分析。
在光学显微镜下观察从BCD患者的iPSC分化的RPE细胞，看到不同的RPE色素及六角形细胞形状(参见图2)。除形态差异外，来自BCD患者的由iPS衍生的RPE细胞亦借由RPE特异性标记物RPE65、CRALBP及MITF的存在来验证。关于BCD患者的iPS-RPE细胞的RPE标记物结果，参见图2(b)，该图显示RPE特异性标记物RPE65、CRALBP及MITF的存在。
可以使用多种方案将iPSC分化成RPE细胞。本文中所描述的RPE分化方案为扩展方案，其通常需要超过3个月。其他方案所需时间较少，例如少于2个月。虽然较短方案与扩展方案均能将iPSC分化成RPE细胞，但是在由不同方案产生的iPSC-RPE细胞中肿瘤发生的风险方面可能存在差异。与iPSC分化相关的肿瘤发生的风险归因于在方案结束时一部分iPS细胞保持未分化或未完全分化，并且扩展方案可能有助于不形成肿瘤，因为iPSC完全分化成了成熟的RPE细胞。长期方案用于确保为生化分析及其他分析及功能研究而产生的iPS-RPE细胞系的纯度，并支持iPSC-RPE细胞用于细胞疗法的安全性，细胞疗法包括但不限于自体移植。
实施例3-BCD细胞模型的生化分析、细胞活力分析及其他分析以及CYP4V2功能研 究
脂质分析：
先前关于BCD及CYP4V2酶功能的研究集中在脂肪酸上。在此研究中，使用更多的脂质分析来分析BCD疾病模型中的生化异常/表型并分析CYP4V2蛋白质的生化功能，这些脂质分析不仅包括脂肪酸，而且包括神经酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)及神经鞘氨醇及二氢鞘氨醇(SOSA)。
游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)、神经酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)及神经鞘氨醇及二氢鞘氨醇(SOSA)的生化分析在哥伦比亚大学(Columbia University)(New York,NY,USA)的生物标记物核心实验室(Biomarkers Core Laboratory)基于其相关分析及方案而进行。
游离脂肪酸(FFA)、神经酰胺、神经鞘氨醇及二氢鞘氨醇借由使用氯仿:甲醇来提取。简言之，将约100万个iPS-RPE细胞在150μL水中均质化。将100μL匀浆与含有内标(棕榈酸-D31、C12神经酰胺、C25神经酰胺、C17神经鞘氨醇、C17二氢鞘氨醇)的3mL氯仿:甲醇(v:v＝2:1)混合。将样品充分涡旋并添加0.5mL水以进行相分离。将混合物再次涡旋并在4℃下以3,000g离心10分钟。使用巴斯德吸管(Pasteur pipette)将下层有机相转移至另一个干净的玻璃管中。向残留的水相中添加2ml氯仿，然后涡旋混合并再次离心以提取任何剩余的脂质。合并下层有机相且在氮气下在37℃下蒸发。将所提取的脂质在50μl甲醇:乙腈(v:v＝1:1)中重构，并转移至LC自动进样器小瓶用于注射。鞘磷脂与其他脂质一样，亦借由氯仿:甲醇提取，但仅放置2μL细胞匀浆用于鞘磷脂的样品制备。所有分析皆在Waters Xevo TQMS ACQUITY UPLC系统(Waters,Milford,MA,USA)上进行。用100mm Waters ACQUITY UPLCHSS C18柱洗提FFA。神经酰胺、神经鞘氨醇、二氢鞘氨醇、鞘磷脂在100mm Waters ACQUITYUPLC BEH苯基柱上分离。FFA借由使用阴性SIR方法监测，而其他脂质借由阳性MRM采集来监测。
生化分析中所测试的化合物的列表提供于下表2中。购买某些化合物用作此研究中的标准品(如表2中所注释，Nu-Chek：Nu-Chek Prep,Inc.,Elysian,MN,USA；Cayman：Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI,USA)。其他化合物使用可在哥伦比亚大学(NewYork,NY,USA)的生物标记物核心实验室获得的现有标准品。所有FFA皆由单一MS检测，而其他类型的化合物借由MS/MS检测。
Figure BDA0002437005560001221
Figure BDA0002437005560001231
Figure BDA0002437005560001241
羟基-脂肪酸分析：
此外，使用LC-MS/MS来检测iPS-RPE细胞中的羟基-脂肪酸，包括16-HEPE、17-HEPE、18-HEPE、19-HEPE、20-HEPE、17-HDHA、18-HDHA、19-HDHA、20-HDHA、21-HDHA、22-HDHA、19(20)-EpDPA(正式名称：(±)19,20-环氧-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-二十二碳五烯酸，又名(±)19,20EDP、(±)19,20-环氧二十二碳五烯酸、(±)19,20-环氧DPA、(±)19,20-EpDPE)及19(20)-DiHDPA(正式名称：(±)19,20-二羟基-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-二十二碳五烯酸，又名：(±)19,20-DiHDoPE)。相应地，HDHA化合物为DHA的羟基代谢物且HEPE化合物为EPA的羟基代谢物。19(20)-EpDPA为DHA环氧化酶代谢物，经由DHA的ω-3双键的环氧化衍生而来。19(20)-DiHDPA亦为DHA的代谢物。DHA为对脑及视网膜而言重要的脂肪酸且为最丰富的ω-3脂肪酸。先前的研究指出，CYP4V2为ω-3脂肪酸的羟化酶，尤其是DHA。
材料：羟基-脂肪酸标准品(±)18-HEPE(商品编号32840)、(±)20-HDHA(商品编号33750)、(±)19(20)-EpDPA(商品编号10175)及(±)19(20)-DiHDPA(商品编号10007001)购自Cayman Chemical Company(Ann Arbor,MI,USA)。内标氘化棕榈酸(C16-D31脂肪酸)购自C/D/N Isotopes Inc.(#D-2002,Quebec,Canada)。
应理解，除了上文所描述的LC-MS或LC-MS/MS方法之外，该研究中所测试的化学物质及化合物亦可借由使用其他方法来检测和/或定量。举例而言，对于具有甲基化预处理的FFA，存在GC-MS或GC-MS/MS方法。对于Cer及SM，可以使用FIA-MS/MS或GC-MS/MS。
细胞活力分析：
暴露于蓝光：将iPS-RPE细胞接种于3.5cm培养皿及4孔室培养皿中。2个月后，使它们在含有10μg/ml葡萄糖的PBS(+)中以1.5mW/cm2暴露于430±20nm(蓝)光1小时。所有细胞系使用相同接种密度。在暴露于蓝光之后，用新鲜的RPE培养基饲养经处理细胞且使这些细胞在5％CO2及37℃的培养箱中恢复过夜。
除了1小时外，亦可使用更短或更长的暴露于光的持续时间，例如不暴露、暴露30分钟、45分钟、75分钟、90分钟或120分钟等。同样地，亦可暴露于不同波长或较宽光谱的光。此外，可以使用不同培养天数(例如，在RPE培养物中2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)的iPS-RPE样品，例如以研究衰老的影响。
细胞活力分析：活/健康细胞用细胞渗透染料钙黄绿素AM(Thermo FisherScientific，目录号：C3099，USA)标记，最终浓度为3μmol/ml PBS(+)(每个3.5cm培养皿1ml，或每个室200μl)，且死/病细胞用碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)(Thermo FisherScientific，目录号：P3566，USA)标记，最终浓度为2μg/ml PBS(+)(每个3.5cm培养皿1ml，或每个室200μl)，在室温下达1小时。由于PI为结合DNA的且对活细胞不具有渗透性，因此其通常用于检测群体中的死细胞。然后在用PBS(-)洗涤之后，观测细胞荧光水平，并借由倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse Ts2R)以20倍放大率拍摄照片。在用ImageJ(Fiji)处理照片后，计算死/活细胞比率。
除了生化分析及细胞活力测试之外，亦可以在BCD患者iPS-RPE细胞中进行RPE功能测试，诸如吞噬活性、跨上皮电阻。
CYP4V2表达：
进行实验以检测及比较对照组及BCD患者特异性iPS-RPE细胞中的CYP4V2表达水平。可以借由抗CYP4V2抗体(蛋白质印迹法)或借由定量PCR来评定细胞系中的CYP4V2表达。
CYP4V2蛋白质印迹法：将来自每个iPS-RPE样品的45μg全细胞蛋白质在7.5％十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS page)凝胶上跑胶，然后湿式转移至膜上。将膜用PBST中的5％BSA在室温下封闭1小时，然后与第一抗体(产生于兔中的抗CYP4V2，SigmaAldrich目录号：SAB 1410565，USA)一起以1:1000的浓度在5％BSA中在4℃下孵育过夜。用PBST洗涤3×10分钟。然后将膜与第二抗体山羊抗兔IgG HRP(Santa Cruz目录号：sc-2004，USA)一起以1:3000的浓度在5％BSA中在4℃下孵育4小时。用PBST最后洗涤3×10分钟。GAPDH用作上样对照组(loading control)。
CYP4V2蛋白质印迹法在对照组的iPS-RPE样品中检测到CYP4V2蛋白质表达，但是在BCD患者iPS-RPE样品中未检测到该表达。在用AAV.CYP4V2处理后，在BCD患者特异性iPS-RPE样品中检测到CYP4V2蛋白质。
实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)及相对mRNA定量：收集健康对照组(WT)的、BCD患者的、BCD患者的经AAV.CYP4V2处理的iPS-RPE样品，且将其用TRIZOL试剂(Invitrogen)溶解。根据制造商的说明书分离总RNA。然后进行DNase I(Invitrogen)处理以防止基因组DNA污染。借由Superscript III逆转录试剂盒进行逆转录反应，且使用随机六聚物(random hexamer)(Invitrogen)产生cDNA。使用Maxima SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix(Fisher Scientific)以StepOne Real-time PCR系统(Invitrogen)进行Real-time PCR方法来定量基因表达水平(38个循环)。使用分别对CYP4V2外显子7区域及CYP4V2op具有特异性的引物。使用肌动蛋白作为管家基因(housekeeping gene)。
结果：进行定量PCR以测试CYP4V2及CYP4V2op在iPS-RPE细胞样品中的表达。CYP4V2及CYP4V2op的转录水平分别由患者样品及对照组样品标准化。对于CYP4V2，所有非患者对照组样品中的CYP4V2表达水平相似，比患者样品中的CYP4V2表达水平高几百倍。在AAV.CYP4V2处理后，患者样品CYP4V2表达水平增加超过100倍，达到与非患者对照组样品相当的水平(图3)。对于CYP4V2op，与未处理的样品相比，所有经AAV处理的样品的表达水平要高得多(图4)。这些结果证明AAV载体能够将CYP4V2 cDNA递送至BCD患者的iPS-RPE细胞中，并且表达盒能够表达该基因。
实施例4-BCD细胞模型中的表型及关于CYP4V2功能的发现
脂质测试结果：
为了确定BCD细胞模型(例如，BCD患者iPS-RPE细胞)中是否存在生化缺陷/异常(亦即表型)及存在哪些生化缺陷/异常(亦即表型)，使用实施例3中所描述的生化分析来检测及定量衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞中的脂肪酸、神经酰胺、鞘磷脂、神经鞘氨醇、二氢鞘氨醇及羟基-脂肪酸，与衍生自健康对照组的iPS-RPE细胞中的相比较。
测试前，如下收集细胞。将衍生自BCD患者的大约100万个iPS-RPE细胞用PBS洗涤两次，然后借由塑料细胞铲(cell lifter)与培养皿脱离并使用1ml移液器转移至1.5ml微量离心管(Eppendorf tube)中。在测试前，将微量离心管放置在-80℃冰箱中。以相同方式收集健康对照组iPS-RPE细胞。生化分析结果显示于下表3中：
Figure BDA0002437005560001271
Figure BDA0002437005560001281
Figure BDA0002437005560001291
表3的注脚：
WT：野生型对照组iPS-RPE。P1：患者1iPS-RPE。P2：患者2iPS-RPE。
患者未经处理及经AAV处理的样品为培养日及克隆匹配的。
P1 AAV2.op及P2 AAV2.op样品用AAV2.CYP4V2op(1天，MOI：5×104GC/细胞)处理且在处理后10天收集。P2 AAV2trip.op样品用AAV2tri(Y-F).CYP4V2op(1天，MOI：5×104GC/细胞)处理且在处理后10天收集。P2 AAV8.fv样品用AAV8.CYP4V2fv(1天，MOI：2×105GC/细胞)处理且在处理后10天收集。P2 scAAV1.op样品用scAAV1.CYP4V2op(1天，MOI：2×105GC/细胞)处理且在处理后4天收集。
结果显示，BCD患者iPS-RPE细胞样品具有与对照组不同的脂肪酸谱(fatty acidprofile)。特定言之，BCD患者样品具有比对照组高得多的DHA(22:6n3)水平及omega-3(ω-3或n3)脂肪酸总水平(C18:3n3α、C20:5n3 EPA、C22:6n3 DHA及C22:5n3 DPA的总量)。这证实了先前研究中所提出的CYP4V2影响ω-3脂肪酸代谢。
出人意料地，除了n3脂肪酸水平异常之外，BCD患者iPS-RPE细胞亦显示较高水平的C20:4n6(花生四烯酸或AA)。先前与BCD相关的研究中尚未报导过AA水平异常。
有趣的是，在测试BCD患者的血清中的脂肪酸水平的先前研究中，没有发现n3脂肪酸(包括DHA)及n6脂肪酸(包括AA)的异常。BCD患者iPS-RPE细胞及血清的不同脂肪酸谱支持以下假设：CYP4V2的功能被非视网膜或非RPE细胞中的其他CYP4酶取代，其中许多在其他器官及组织中与CYP4V2一起表达，只不过CYP4V2为唯一在RPE细胞中具有相对较高表达水平的CYP4酶。
除了脂肪酸之外，BCD患者iPS-RPE细胞亦可以具有在其他化合物或化合物类别中的表型。进行实验以筛选其他化合物类别中的表型，这些化合物类别包括但不限于皮质类固醇、鞘脂及磷脂，包括鞘磷脂、神经酰胺、神经鞘氨醇及二氢鞘氨醇，以及脂质信号传导中的表型。此外，在BCD患者的iPS-RPE细胞中进行同位素示踪实验及蛋白质组学分析(例如，基于质谱的蛋白质组学分析)。
此外，先前的研究发现，CYP4V2为ω-3脂肪酸(DHA及EPA)羟化酶。有趣的是，使用LC-MS/MS在健康对照组或BCD患者的iPS-RPE细胞中均未检测到实施例3中所描述的羟基-DHA或羟基-EPA。CYP4V2的酶功能可能在活细胞中与在先前研究中进行的活细胞外的化学反应中不同，或者羟基脂肪酸为在活细胞中快速转化成其他化合物或其他形式的中间体，或者羟基脂肪酸处于痕量水平而只有在样品含有非常大量的细胞时才能被检测到。
细胞活力分析结果：
临床上，BCD与RPE萎缩相关，RPE萎缩继而引起光感受器死亡及视觉丧失。细胞活力分析(如上文实施例3中所描述)揭示了BCD患者的iPS-RPE细胞样品中的RPE萎缩。关于对照组及BCD患者的iPS-RPE样品之间的细胞活力比较，参见图5及6(图5-不暴露于蓝光；图6-在暴露于蓝光1小时后)。
值得注意的是，这些影像揭示：
(1)在暴露于光后，在衍生自BCD患者(P1及P2)的iPS-RPE样品中显示出比对照组(WT1及WT2)中高得多的显著的细胞死亡水平(参见图6)。举例而言，P1 iPS-RPE的死/活细胞比率为20.87％，而WT2 iPS-RPE为3.0％。BCD的临床表型RPE萎缩在BCD细胞模型中是明显的。
(2)在BCD P1与P2 iPS-RPE样品之间观察到不同水平的RPE萎缩。P1 iPS-RPE显示比P2 iPS-RPE高的细胞死亡水平。
(3)即使没有暴露于蓝光，BCD患者iPS-RPE样品(P1)亦显示出RPE萎缩(图5)。
BCD患者的疾病发作年龄及进展相差很大。BCD发作的范围为从早期十几岁到生命的第3个十年或甚至超过第3个十年；导致在生命的第3个十年到第6个十年期间出现法定盲。此外，具有相同CYP4V2突变的BCD同胞患者(sibling patients)可能在疾病发作年龄及进展方面有实质差异。以前对于这些差异没有解释。不同BCD患者的iPS-RPE样品之间RPE萎缩水平的差异在细胞层级上提供了关于BCD患者中疾病发作及进展的差异的指引。
在此研究的BCD细胞模型中发现了多种表型(分子层级表型，诸如生化(例如，脂质)异常，及细胞层级表型，诸如细胞活力)，包括BCD的临床表型(亦即RPE萎缩)。
实施例5-使用来自BCD受试者的iPS及iPS-RPE细胞筛选候选药物及剂量范围，研 究BCD及CYP4V2功能及细胞疗法，并评定患者特异性反应
作为BCD疾病人类细胞模型，来自BCD患者的iPS及iPS-RPE细胞具有广泛范围的应用，包括但不限于研究BCD及CYP4V2功能(例如参见以上实施例3及4)；筛选用于BCD及相关疾病的候选药物及剂量范围(参见本文中的实施例)。
在本文中的实施例中详细描述使用BCD细胞模型(例如，BCD患者特异性iPS-RPE细胞系或具有人工产生的CYP4V2突变的iPS-RPE细胞系)的方法及实施例，这些实施例与BCD细胞模型在基因疗法及细胞疗法中的用途相关。除了测试基因疗法及作为细胞疗法的细胞基础之外，此BCD细胞模型亦可用于以与本文中的实施例中详细描述的方式相同或相似的方式筛选以下各者并测试其功效和/或安全性：用于治疗BCD、IRD或RP的其他治疗剂(例如，候选药物)及其剂量、制剂及载体(病毒载体或非病毒载体)或装置或递送机制。
在使用BCD细胞模型时，治疗剂的功效可以借由比较在以此治疗剂治疗前及治疗后以上实施例3及4及本文中的其他实施例中所描述的各种物种中的化合物水平及RPE萎缩来评定，并评定这些化合物的水平是否异常及在治疗后BCD细胞模型中的RPE萎缩是否改善。同样地，可以使用BCD细胞模型比较治疗剂的不同剂量、制剂(例如，化合物制剂、活性医药成分或用于基因疗法的载体类型和/或衣壳或用于基因编辑的载体类型)或关键构建体(例如，基因疗法表达盒中的启动子或其他调节序列)。此外，BCD细胞模型亦可用于测试医疗装置或方法的功效，包括但不限于在将治疗剂递送至眼部细胞方面或在改善转导或转染效率方面的功效。将被理解的是，经处理细胞可以与未处理细胞或在暴露于化合物之前的相同细胞进行比较。可用不同剂量确定有效剂量范围(以每个细胞、每100万个细胞或每50万个细胞等测量)。与健康对照组的RPE或iPS-RPE细胞中的数据相比，与BCD患者的iPS-RPE细胞(治疗后对比未治疗)中的在以上实施例3及4中所述的不同脂肪酸化合物及其他化合物的水平及RPE萎缩相关的数据可用于评定治疗效果及有效剂量范围。
此外，可使用BCD患者特异性iPS细胞系、iPS-RPE细胞系及其他由iPS衍生的细胞系来评定此患者对治疗剂、剂量或装置的个体反应。患者特异性iPS细胞、iPS-RPE细胞及其他由iPS衍生的细胞具有特异性针对每个患者的性状，包括但不限于免疫响应(例如，细胞内免疫、RPE免疫)、基因型(例如，患者之间可能导致不同反应的不同突变)。这种应用可用于开发及筛选针对相同疾病的不同患者的个体化治疗剂(例如，不同的AAV载体血清型或衣壳突变)或个人化最佳剂量。此方法可用于其他疾病，包括但不限于其他眼部疾病。
因为BCD患者特异性iPS-RPE在BCD患者中显示出个体差异，其可用于评定个体化最佳剂量并开发个人化用药。例如，如在下面的基因疗法实施例中所见，在相同的1×10e5MOI剂量下，AAV2.CYP4V2op在P1及P2的iPS-RPE之间对RPE萎缩达成不同的拯救水平(亦即不同的功效水平)。此为BCD细胞模型优于动物模型的优势。
BCD患者特异性iPS-RPE细胞(亦即BCD细胞模型)可用于借由以下来评定及建议用于体内治疗的治疗有效剂量：在BCD细胞模型中确定的体外最佳剂量水平(例如，表示为体外基因疗法的MOI)乘以所估计的体内靶向治疗的眼部细胞(例如，RPE细胞)的数目，由此推导出用于体内的基因疗法载体(例如，GC或gp)的剂量水平。此载体剂量水平借由乘数来调整(例如，1至10(例如，对于视网膜下注射，1至5；或对于玻璃体内注射，5至10)；影响待应用的乘数的其他因素包括：所靶向细胞的区域大小或数目，及待治疗的受试者(例如，待治疗受试者的年龄、体重、疾病及病状的发展阶段及潜在的免疫响应(亦即预先存在的NAb)；靶向治疗的细胞的位置及密度)，从而提出供用于体内治疗的治疗有效剂量范围，其可以借由临床试验来确认或进一步改良。该方法亦可用于评定或提出个体患者的用于体内治疗的个人化最佳剂量。
实施例6-具有人工产生的CYP4V2突变的BCD细胞模型
因为BCD为一种罕见疾病，所以很难获得患者样品。为了解决这个困难，可以借由使用诸如CRISPR的基因编辑技术来产生BCD细胞模型以在非BCD患者细胞中的CYP4V2基因中建立人工突变，该非BCD患者细胞诸如来自无BCD的受试者的胚胎干(ES)细胞系或iPS细胞。
举例而言，如本文实施例中所显示，sgRNA 1、sgRNA2、sgRNA 3、sgRNA4或sgRNA5(关于sg$NA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4及sgRNA5中的每一者的原型间隔区元件序列，分别参见SEQ ID NO:48至52；关于IVT sgRNA的额外序列，参见SEQ ID NO:55及59)与SpCas9蛋白质组合使用，以在BCD患者的基因组DNA的含有c.802-8_810del17insGC突变的CYP4V2基因区域中引起切割，该突变为BCD患者中最常见的CYP4V2突变。其中，sgRNA 3、sgRNA 4及sgRNA5对c.802-8_810del17insGC突变序列没有特异性，且因此会在健康细胞(例如，没有CYP4V2突变的ES或iPSC)的CYP4V2基因中引起双链DNA断裂(DSB)。特定言之，在转染后，sgRNA 4及Cas9会在CYP4V2基因的外显子7中引起DSB，其可导致当DNA在细胞中经由非同源末端连接(NHEJ)修复时，在外显子7中(一个或两个等位基因中)产生突变，例如由NHEJ产生的插入缺失错误(indel error)会引起框码突变。因此，一些细胞具有人工产生的CYP4V2突变且可以用作BCD细胞疾病模型或用于产生BCD细胞模型(例如将ES或iPS细胞分化成RPE细胞以产生含有CYP4V2突变的ES-RPE或iPS-RPE细胞)。同样地，可以使用用以在CYP4V2基因的不同区域引起DSB的两组gRNA设计以在CYP4V2基因内产生大缺失或敲除突变或敲除细胞中的整个CYP4V2基因，从而产生含有CYP4V2突变的BCD细胞模型。关于如何使用CRISPR系统来切割和/或校正靶序列及如何验证结果的更详细的论述提供于实施例及其中的揭示内容中。
这些具有人工产生的CYP4V2突变的BCD细胞模型可用于在研究BCD及CYP4V2功能时以及在如本文中所论述的相关应用中模拟BCD患者特异性细胞模型，相关应用包括但不限于测试及比较候选药物，确定剂量范围及测试医疗装置或递送方法。
同一方法亦可用于产生针对眼部疾病或其他疾病的具有人工产生的突变的细胞疾病模型，其他疾病包括与表4中所阐述的一个或多个基因中的突变或遗传缺陷相关的疾病。
实施例7-用于眼部疾病的等基因对照组的产生及使用
突变经校正的等基因型患者特异性iPS细胞系和/或衍生自其的其他细胞系(例如，iPS-RPE细胞、iPS-RPC、iPS-CEC、iPS-CE细胞或其他iPS-眼部细胞)可以作为等基因对照组用于研究特定突变或有缺陷的基因的疾病和/或影响。衍生自ES或另一个体的习知对照组(例如，细胞系，例如ES-RPR或iPS-RPE细胞系)具有个体差异，除了疾病相关基因的差异之外，亦包括与患者的遗传差异。此实施例提供一种用于消除对照组与由此产生的“背景噪声”之间的个体差异的方法。其包含产生并使用来自患者的突变经校正的等基因对照组，将其与同一患者的携带该突变的细胞系相比较。由于衍生自同一患者的患者特异性疾病模型及突变经校正的等基因对照组没有任何个体差异，因此可以对其进行分析及比较，以精确鉴定与患者的突变或有缺陷的基因相关的表型、生化异常以及其他结构缺陷及功能缺陷。突变经校正的等基因对照组可以借由使用基因编辑技术产生，基因编辑技术包括但不限于CRISPR、ZFN及TALEN。关于如何使用CRISPR基因编辑来校正BCD患者中的最常见突变c.802-8_810del17insGC突变，从而从BCD患者产生等基因对照组的具体实例提供于本文实施例中。同一方法亦可用于产生其他眼部疾病的等基因对照组。等基因对照组具有优于习知对照组的显著优势且在研究具有隐蔽表型(例如，年龄相关性黄斑退化(AMD))的眼部疾病时是必不可少的。此外，等基因对照组可用于比较及鉴定多种遗传风险因素、突变和/或多个基因在眼部疾病中的影响差异，其借由产生具有遗传风险因素、突变或经校正基因中的每一者的等基因对照组并将此等基因对照组与疾病模型进行比较，以确定相关风险因素、突变或基因在眼部疾病及其他疾病中的影响，其他疾病包括与表4中所阐述的一个或多个基因中的突变或遗传缺陷相关的疾病。
可以比较等基因对照组与患者特异性细胞疾病模型来鉴定与遗传突变和/或相关的有缺陷的蛋白质相关的表型、生化异常及其他结构缺陷及功能缺陷。关于如何使用生物分析来鉴定患者细胞系与对照组之间的生化异常/表型的特定非限制性实例及论述在本文中提供于以上实施例3及4中，包括但不限于脂质组学(lipidomics)、蛋白质组学(proteomics)及同位素示踪。
有关BCD人类细胞疾病模型的论述
鉴于BCD为罕见疾病，经由活检从BCD患者获得显示出疾病的人类RPE细胞是不切实际的。缺乏可行的BCD人类疾病模型使得先前对BCD的研究仅限于使用非BCD致病细胞(例如，成纤维细胞及淋巴细胞，其并非眼睛的部分)及来自BCD受试者的血清作为研究对象。这些研究的结果集中在脂肪酸合成代谢上。
在本文中所描述的研究中，成功体外产生了衍生自BCD患者的iPS细胞系并用其产生携带BCD疾病表型的患者特异性BCD疾病RPE细胞。直接在BCD患者特异性iPS-RPE细胞中鉴定BCD表型，该BCD患者特异性iPS-RPE细胞为受BCD影响的原代细胞类型。在本研究之前，尚不清楚iPS细胞系及iPS-RPE细胞系是否能够成功产生，部分原因在于与BCD相关的脂肪酸合成代谢。
生化测试显示，来自BCD患者的iPS-RPE细胞相比于健康对照组的iPS-RPE细胞具有异常的脂肪酸水平，包括先前的BCD研究中尚未报导的那些。BCD疾病特异性iPS-RPE细胞的体外表型为由CYP4V2调节的途径及BCD的发病机制提供了更多的见解，并为BCD的发病机制及CYP4V2蛋白质的功能提供了宝贵的见解，并进一步支持使用来自BCD患者的iPS-RPE细胞系作为可行且稳健的BCD人类疾病模型。
来自BCD患者的iPS细胞系、iPS-RPE细胞系及其他iPS-眼部细胞系具有其他应用，诸如用于药物筛选、开发新颖的治疗剂或测定剂量范围，以及用于细胞疗法中。
除了BCD患者特异性iPS、iPS-RPE及其他iPS-眼部细胞系之外，亦可经由基因编辑在衍生自非BCD个体的ES细胞或iPS细胞的其他细胞系中人工产生病理性CYP4V2突变，而开发出BCD人类疾病细胞模型，该其他细胞系包括但不限于ES细胞系、iPS细胞系及RPE细胞系。
此外，提供用于产生眼部疾病的等基因对照组的方法。等基因对照组与患者特异性疾病模型没有个体差异。因此，等基因对照组在研究眼部疾病方面有优于习知对照组的优势。
CYP4V2基因疗法
实施例8-编码人类CYP4V2蛋白质及功能性CYP4V2蛋白质的cDNA
在该研究中使用三个cDNA。具有SEQ ID NO:1中所示的序列的cDNA(本文中称为CYP4V2st)及具有SEQ ID NO:2中所示的序列的cDNA(本文中称为CYP4V2op)均编码人类CYP4V2蛋白质(氨基酸序列显示于SEQ ID NO:4中，NP_997235.3)。具有SEQ ID NO:3中所示的序列的cDNA(本文中称为CYP4V2fv)编码人类CYP4V2蛋白质的功能变异体(氨基酸序列显示于SEQ ID NO:5中)。
SEQ ID NO:5为人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)的功能变异体的氨基酸序列。这两种蛋白质(SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5)均为如本文中所定义的功能性CYP4V2蛋白质。SEQ ID NO:5中所示的功能性CYP4V2蛋白质与SEQ ID NO:4中所示的人类CYP4V2蛋白质具有一个氨基酸改变。SEQ ID NO:3中所示的编码功能性CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:5)的cDNA与SEQ ID NO:1中所示的编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)的cDNA具有两个核苷酸差异。SEQ ID NO:2中所示的密码子最佳化的cDNA及SEQ ID NO:1中所示的cDNA均编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)且共用77％的序列同一性。
本文中提供编码SEQ ID NO:5的功能性CYP4V2蛋白质的密码子最佳化的cDNA(CYP4V2fv-op)，其包含CYP4V2op的cDNA序列(SEQ ID NO:2)，但CYP4V2 fv-op序列在SEQID NO:1与3之间保留有一个或两个核苷酸差异。
除了CYP4V2op及CYP4V2fv-op之外，其他编码人类CYP4V2蛋白质或功能性CYP4V2蛋白质(例如，SEQ ID NO:4至29中的任一者)的密码子最佳化的cDNA或核酸序列可以借由本发明中所描述的方法产生。编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)或功能性CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:5，或SEQ ID No:6至29中的任一者)的密码子最佳化的核酸分子可以在BCD患者特异性iPS-RPE细胞系(或具有人工产生的CYP4V2突变的RPE细胞)中测试以测定和/或确认其表达效率及治疗BCD的拯救功能。这些测试包括但不限于蛋白质表达(例如，对其所编码的功能性CYP4V2蛋白质具有特异性的蛋白质印迹法)、用以检测相关基因表达的PCR和/或本文中所提供的组合物(例如，在表达盒和/或载体中)及方法拯救BCD患者特异性iPS-RPE细胞系中的生化异常及RPE萎缩的功效。
SEQ ID NO:1(CYP4V2st cDNA，1578bp)
Figure BDA0002437005560001371
SEQ ID NO:2(CYP4V2op cDNA，1578 bp)
Figure BDA0002437005560001381
SEQ ID NO:3(CYP4V2fv cDNA，1578 bp)
Figure BDA0002437005560001382
Figure BDA0002437005560001391
SEQ ID NO:4(人类CYP4V2蛋白质，NP_997235.3，525aa)
Figure BDA0002437005560001392
SEQ ID NO:5(人类CYP4V2蛋白质的功能变异体；525aa)
Figure BDA0002437005560001393
SEQ ID NO:6(CYP4V2的不含跨膜结构域的片段；490aa)
Figure BDA0002437005560001394
实施例9-设计用于CYP4V2基因疗法的有效表达盒及递送载体
如本文中所描述，表达盒及递送载体包含各种元件。根据不同的设计，结果会有很大差异。鉴于每个重要元件都有大量选项，包括但不限于下面所列出者及其多种组合，故为了CYP4V2基因疗法的成功，需要经过深思熟虑的设计的有效表达盒及递送载体。此外，设计方法需要考虑疾病表型及特征(例如，靶向治疗的细胞/组织的类型)及安全性(例如，毒性、免疫响应)。最后，需要在合理的疾病模型中测试及验证设计。
(a)递送载体的类型；
(b)载体血清型及衣壳设计/选择；
(c)额外载体设计，例如ssAAV对比scAAV；
(d)cDNA设计；
(e)启动子设计/选择；
(f)polyA信号设计/选择；及
(g)任何其他调节序列，例如增强子，或接合/连接序列。
关于(a)，选择病毒载体以在靶细胞(例如，人类RPE)中达成高转导效率。在各种类型的病毒载体中，选择AAV载体，因为其安全谱及CYP4V2编码核酸(例如，CYP4V2 cDNA)的大小符合AAV载体的包装限制。具有较大包装限制的载体，例如HSV载体、慢病毒载体、杆状病毒或腺病毒载体，亦可用于CYP4V2基因疗法。除了病毒载体之外，非病毒载体，例如纳米颗粒，包括但不限于脂质体纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体鱼精蛋白/DNA脂质复合物(LPD)，亦可用于CYP4V2基因疗法。
关于(b)，因为RPE细胞为针对BCD的CYP4V2基因疗法中靶向治疗的原代细胞类型，所以在RPE细胞中具有足够的转导效率的AAV血清型较佳。此外，考虑以下因素。因为在各种人类组织及器官中，例如在心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、视网膜、RPE、角膜及淋巴细胞中，皆能广泛地观测到CYP4V2的表达，且除了RPE之外，BCD亦影响脉络膜、光感受器且在一些患者中亦影响角膜，且先前已报导过BCD患者的皮肤成纤维细胞、淋巴细胞及血清中的异常，除了在RPE细胞中具有良好转导效率的AAV血清型及衣壳结构之外，亦可以设计和/或选择不会将AAV转导仅限制在RPE细胞中，反而亦能转导其他细胞/组织(例如光感受器、脉络膜和/或角膜)的AAV血清型及衣壳结构。因此，广泛范围的AAV血清型及衣壳结构为合适的且可以使用。选择AAV2、AAV5、AAV8、AAV1、AAV9及衣壳突变型AAV载体(AAV2(Y444F+Y500F+Y730F))用于研究。除了转导效率之外，另一个考虑因素为预先存在的针对一般群体中的不同AAV血清型的NAB以及患者之间的其他潜在个体差异(包括但不限于其他类型的免疫响应(例如，细胞内免疫或RPE免疫)或由于基因型的差异(例如，不同的突变))。在此设计中，使用并测试了多种AAV类型，包括与NAB具有低交叉反应性以降低潜在免疫响应并最大化对不同患者的治疗效果的AAV类型。
关于(c)，因为全长CYP4V2 cDNA为1578bp(包括起始密码子及终止密码子)，所以ssAAV及scAAV设计均可以用于CYP4V2基因疗法中。ssAAV及scAAV设计各自有其自身的优缺点，如本文中所描述。相比于ssAAV，scAAV设计提供快速表达及较高的DNA稳定性。然而，其包装限制(约2.4-2.5kb)限制了较大尺寸且可能活性更大的调节序列(例如，启动子、PolyA信号)的使用。此外，视所用启动子的大小而定，scAAV设计可能需要缩短或不需要一些任选的调节序列(例如，增强子)。ssAAV及scAAV载体均是为了用于CYP4V2基因疗法中而设计并产生的。产生各种假型化AAV，其含有AAV2基因组(例如，AAV2 ITR(SEQ ID NO:42及43))及来自以上在(b)中所描述的AAV类型中的每一者的衣壳。关于scAAV，两个AAV2 ITR中之一者为截短/突变的(SEQ ID NO:44)。
关于(d)，如本文中所论述，存在多种功能性CYP4V2蛋白质。此外，多个核酸序列能编码同一种蛋白质。在该研究中产生三(3)个cDNA：第一个(SEQ ID NO:1，称为CYP4V2st)编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)，第二个为编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)的经过密码子最佳化的cDNA(SEQ ID NO:2，称为CYP4V2op)，且第三个(SEQ ID NO:3，称为CYP4V2fv)编码人类CYP4V2蛋白质的功能变异体(SEQ ID NO:5)。在cDNA起始密码子之前插入科札克序列(示范性序列显示于SEQ ID NO:37或38中)。
关于(e)，类似于(b)中的基本原理，启动子需要很好地起作用来驱动靶细胞(例如，当用于治疗的靶细胞类型为RPE时，靶细胞为RPE细胞；当靶细胞类型为角膜细胞时，靶细胞为角膜细胞)中的表达。启动子为基因疗法载体的表达盒中的主要元件。最佳启动子选择能够增强目标特异性及基因表达。视靶向治疗的细胞或组织类型而定，CYP4V2基因疗法中所用的启动子可为组成型启动子或细胞特异性启动子(例如，对RPE细胞具有特异性的启动子、对RPE及光感受器均具有特异性的启动子、对RPE细胞及脉络膜细胞具有特异性的启动子、对RPE、光感受器及脉络膜细胞具有特异性的启动子、对角膜细胞具有特异性的启动子、对RPE、光感受器、脉络膜及角膜细胞具有特异性的启动子或对眼部细胞具有特异性的启动子)。因为CYP4V2几乎遍在地表达且BCD影响多种细胞类型(主要的细胞类型为RPE，其他细胞类型包括例如角膜、视网膜、淋巴细胞)，所以在此设计中选择组成型启动子来拓宽表达盒及递送载体在多种组织及细胞类型中的作用。关于ssAAV载体中所用的表达盒，使用强组成型启动子，长度为～1.7kb的CAG启动子(示范性序列显示于SEQ ID NO:32中)。CAG启动子(亦称为CBA、CAGGS或CB启动子)为强合成启动子。CAG启动子由以下调节元件构成：(C)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件；(A)鸡β-肌动蛋白基因的启动子区域及第一外显子，及来自鸡β-肌动蛋白基因及兔β-球蛋白基因的嵌合内含子；及(G)兔β-球蛋白基因的剪接受体。使用CAG启动子是因为其具有比CMV启动子(示范性序列显示于SEQ ID NO:40中)更强且持续时间更久的活性，CMV启动子为最常用于在哺乳动物细胞中驱动表达的组成型启动子。关于scAAV载体中所用的表达盒，由于scAAV的包装大小限制，因此使用短得多的组成型启动子：延伸因子1α短型(EFS)启动子(示范性序列显示于SEQ ID NO:35中)。EFS启动子为EF-1α启动子(～1.2Kb，示范性序列显示于SEQ ID NO:41中)的小型化版本。EF-1α启动子为衍生自人类延伸因子-1α(EF-1α)的组成型启动子。EFS启动子亦可用于ssAAV的表达盒设计中。除了CAG启动子、CMV启动子、EF1α启动子及EFS启动子之外，亦可以使用其他组成型启动子，包括但不限于另一病毒启动子，诸如CMV启动子；CAG(又名CBA、CAGGS或CB启动子)的衍生物或变异体，诸如smCBA启动子、CBSB启动子或CBh启动子；另一β-肌动蛋白启动子，诸如人类β肌动蛋白启动子；EF-1α启动子的衍生物或变异体；PGK启动子；UBC启动子；GUSB启动子；UCOE启动子或本文中所描述的其他启动子。此外，可以使用细胞特异性启动子，包括但不限于本文中所描述的眼部细胞特异性启动子，例如VMD2(又名BEST1)启动子或RPE65启动子，用于驱动RPE中的表达。
关于(f)，ssAAV中所用的表达盒设计使用bGH polyA(示范性序列显示于SEQ IDNO:34中)，且scAAV中所用的表达盒设计使用较短的polyA信号，小polyA(SPA)(示范性序列显示于SEQ ID NO:36中)。SPA亦可用于ssAAV的表达盒中。亦可改为使用其他polyA信号(包括衍生物或变异体)，包括但不限于SV40 polyA信号、SV40晚期polyA信号(示范性序列显示于SEQ ID NO:39中)或如本文中所描述的其他polyA信号，包括但不限于与上游增强子(USE)组合使用的polyA信号。
关于(g)，ssAAV中所用的表达盒使用WPRE增强子(示范性序列显示于SEQ ID NO:33中)。关于scAAV中所用的表达盒设计，鉴于大小限制，故不包括增强子。然而，应注意，增强子在scAAV和scAAV CYP4V2表达盒中都是任选的。但是还应注意，在scAAV CYP4V2表达盒中，可能包括短长度增强子序列，例如含有WPRE的最小γ及α元件的经缩短的WPRE，与小尺寸启动子及polyA信号组合。除WPRE之外，亦可使用如本文中所描述的其他增强子，诸如HPRE增强子或CTE增强子。
在一些情况下，CYP4V2表达盒包括启动子(例如，CAG(又名CBA、CAGGS、CB)启动子、EF-1α启动子、smCBA启动子、CBh启动子、EFS启动子、人类β-肌动蛋白启动子、CMV启动子、VMD2启动子或RPE65启动子)、编码功能性CYP4V2蛋白质的核酸序列(例如，编码人类CYP4V2蛋白质或其功能变异体或片段的cDNA)，任选地与增强子序列(例如，WPRE增强子、HPRE增强子或经缩短的WPRE或HPRE增强子)及polyA信号(例如，bGH polyA、SPA或SV40 PolyA，或其片段或衍生物，例如SV40晚期polyA)及其他调节序列(例如，科札克序列)连接。示范性序列参见SEQ ID NO:1-41。
应理解，(i)SEQ部分中所提供的各种调节序列的示范性序列在本质上为示范性的且这些调节序列存在能够达成相同或形似功能的不同形式；及(ii)这些序列存在亦可使用的不同变异体、片段和/或衍生物，例如经截短的CAG启动子、经缩短的WPRE增强子、SV40晚期polyA。
基于上文所描述的设计方法，产生了多种用于CYP4V2基因疗法中的CYP4V2 cDNA、CYP4V2表达盒及rAAV载体，包括：
(1)三个CYP4V2 cDNA，分别如SEQ ID NO:1、2及3中所示。CYP4V2st(SEQ ID NO:1)及CYP4V2op(SEQ ID NO 2)均编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)。CYP4V2fv(SEQ IDNO:3)编码人类CYP4V2蛋白质的功能变异体(SEQ ID NO:5)；
(2)两个CYP4V2表达盒(CYP4V2表示编码人类CYP4V2蛋白质或功能性CYP4V2蛋白质的核酸序列。示意图参见图7)：
(i)CAG-CYP4V2-WPRE-bGH polyA
(ii)EFS-CYP4V2-SPA
(3)将以上所提及的CYP4V2 cDNA及CYP4V2表达盒包装于六个不同的AAV载体(AAV2、AAV5、AAV8、AAV1、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)及AAV9)中以产生以下含有CYP4V2cDNA及表达盒的rAAV载体，包括ssAAV及scAAV载体构建体两种：
(i)重组AAV2/2-CAG-CYP4V2op-WPRE-bGH polyA(本文中称为AAV2.CYP4V2op)，
(ii)重组AAV2/2(Y444F+Y500F+Y730F)-CAG-CYP4V2op-WPRE-bGH PolyA(本文中称为AAV2tri(Y-F).CYP4V2op或AAV2tri.CYP4V2op)，
(iii)重组AAV2/5-CAG-CYP4V2op-WPRE-bGH PolyA(本文中称为AAV5.CYP4V2op)，
(iv)重组AAV2/5-CAG-CYP4V2st-WPRE-bGH polyA(本文中称为AAV5.CYP4V2st)，
(v)重组AAV2/8-CAG-CYP4V2fv-WPRE-bGH polyA(本文中称为AAV8.CYP4V2fv)，
(vi)重组自身互补型AAV2/1-EFS-CYP4V2op-SPA(本文中称为scAAV1.CYP4V2op)，
(vii)重组自身互补型AAV2/5-EFS-CYP4V2op-SPA(本文中称为scAAV5.CYP4V2op)，及
(viii)重组自身互补型AAV2/9-EFS-CYP4V2op-SPA(本文中称为scAAV9.CYP4V2op)。
当包装于rAAV载体中时，表达盒侧接两个AAV2 ITR(SEQ ID NO:42及43)。关于scAAV，AAV2 ITR中之一者为截短/突变的(SEQ ID NO:44)。应理解，非AAV2基因组，包括非AAV2 ITR，亦可用于包装表达盒。紧接在CYP4V2 cDNA之前插入科札克序列(SEQ ID NO:37或38)。示意图参见图7，该图显示这些表达盒的设计。应了解，CYP4V2 cDNA可以包装于不同表达盒中且CYP4V2表达盒可以包装于不同AAV载体中。举例而言，CAG-CYP4V2-WPRE-bGHPolyA表达盒及EFS-CYP4V2-SPA表达盒中均可以使用CYP4V2op cDNA。CAG-CYP4V2-WPRE-bGH PolyA表达盒或EFS-CYP4V2-SPA表达盒可以包装于任何合适的AAV载体中，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV5、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV6、AAV7、AAV4、AAV12、AAV-PHP.B及其他载体。scAAV设计可以用于任何合适的AAV载体中以产生重组scAAV载体，例如scAAV1、scAAV2、scAAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、scAAV5、scAAV8、scAAV8(Y733F)、scAAV3、scAAV4、scAAV6、scAAV7、scAAV9、scAAV12等。
应理解，在设计用于CYP4V2基因疗法的其他载体(例如，慢病毒载体或质粒)时，可以使用类似的设计方法。视载体类型而定，以上所描述的某些元件可能不是必需的，或者可能需要相应地调整，例如启动子序列。
除了本文中指定的cDNA、调节序列及AAV类型及设计之外，亦可使用用于CYP4V2表达盒及递送载体的各关键元件的其他设计选项。关于如何比较在靶细胞类型中的各种AAV类型的转导效率及不同启动子的强度的实施例在本文中提供于实例部分中。可以使用类似的方法来评定及比较用于表达盒及递送载体的其他关键元件的设计选项，例如cDNA、增强子、polyA信号、ssAAV对比scAAV、AAV对比HSV等。此外，如本文中所提供，CYP4V2表达盒及递送载体的效率可以经由在BCD细胞模型中，例如在BCD患者的iPS-RPE细胞中，用本文中所描述的方法和/或其他用以评定生化异常、RPE功能或萎缩的方法的测试来评定及比较。
在BCD患者特异性人类iPS-RPE细胞系中测试以上所描述的CYP4V2 cDNA、表达盒及递送载体，并在以下实施例中显示并讨论结果。
此外，各种调节序列之间(包括但不限于ITR与启动子之间、增强子与polyA信号之间或polyA信号与ITR之间)或调节序列与cDNA之间(包括但不限于启动子与cDNA之间、cDNA与增强子之间或cDNA与polyA信号之间)的接合/连接序列亦可在调节靶基因(例如，CYP4V2)的表达的过程中起作用。该研究中所用的不同CYP4V2表达盒的序列(包括ITR及接合/连接序列)列于以下实施例11中。
本实施例中所论述的某些调节序列及ITR序列的示范性序列提供如下：
SEQ ID NO:32(CAG启动子，1715bp)
Figure BDA0002437005560001461
SEQ ID NO:33(WPRE增强子，589bp)
Figure BDA0002437005560001462
SEQ ID NO:34(bGH polyA，225bp)
Figure BDA0002437005560001463
SEQ ID NO:35(EFS启动子，235bp)
Figure BDA0002437005560001471
SEQ ID NO:36(SPA，54bp)
Figure BDA0002437005560001472
SEQ ID NO:37(科札克序列，6bp)
Figure BDA0002437005560001473
SEQ ID NO:38(科札克序列，5bp)
Figure BDA0002437005560001474
SEQ ID NO:39(SV40晚期PolyA，120bp)
Figure BDA0002437005560001475
SEQ ID NO:40(CMV启动子，576bp)
Figure BDA0002437005560001476
SEQ ID NO:41(EF-1α启动子，1184bp)
Figure BDA0002437005560001477
SEQ ID NO:42(AAV2 5'左侧-ITR，141bp)
Figure BDA0002437005560001481
SEQ ID NO:43(AAV2 3'右侧-ITR，141bp)
Figure BDA0002437005560001482
SEQ ID NO:44(scAAV构建体中的突变型AAV2 5'ITR，117bp)
Figure BDA0002437005560001483
SEQ ID NO:45(scAAV构建体中的AAV2 3'ITR，141bp)
Figure BDA0002437005560001484
实施例10-使用BCD细胞模型测试、比较及筛选CYP4V2基因疗法中的AAV血清型及 衣壳结构、启动子及其他调节序列活性及cDNA表达水平以及载体的总体功效及剂量水平并 评定不同患者的个人化最佳载体及剂量的方法
BCD细胞模型(例如，BCD患者特异性iPS-RPE细胞系或具有人工产生的CYP4V2突变的ES-RPE、iPS-RPE或RPE细胞系)可用于药物及剂量筛选。使用BCD患者特异性iPS-RPE样品测试、比较及筛选CYP4V2基因疗法的各种组分及剂量，包括载体类型(例如，AAV血清型及衣壳结构)、启动子、增强子、polyA信号及CYP4V2表达盒及CYP4V2 cDNA中的其他序列，以及载体的总体功效及剂量水平。表型拯救用于测试及比较功效。
不同的血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9)或衣壳(例如，具有衣壳突变的AAV，例如AAV2对比AAV2tri(Y-F))或结构(例如，scAAV对比ssAAV)的载体可以借由使用具有相同表达盒的不同载体来测试、比较。例如，AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op皆具有相同的表达盒，但是AAV血清型/衣壳不同。scAAV1.CYP4V2op、scAAV5.CYP4V2op及scAAV9.CYP4V2op皆共用相同的表达盒，但是AAV血清型不同。表型拯救结果可用于测试及比较AAV血清型/衣壳(例如，AAV2对比AAV2tri(Y-F)对比AAV5)及结构(例如，scAAV5对比ssAAV5)在将CYP4V2 cDNA转导及递送至BCD患者RPE细胞时的效率差异。
同一方法可用于借由测试相同构建体(但测试及比较的元件不同)的rAAV载体的表型拯救功效来测试及比较不同表达盒、cDNA或调节序列或其他序列(例如，接合/连接序列)的活性水平。
此外，如本文实施例中所述，可以向同一患者的iPS-RPE样品施加不同剂量(例如，1×10e4及1×10e5)的同一种载体(例如，rAAV载体，例如scAAV1.CYP4V2op)以评定治疗有效剂量范围(借由MOI/细胞测量)。
此外，鉴于BCD细胞模型显示个体差异，其亦可用于单独地评定及探索各患者的个人化最佳剂量及载体构建体。
更多相关论述参见本文的相关实施例及揭示内容。
实施例11-产生各种携带功能性CYP4V2编码核酸序列及表达盒的重组腺相关病毒 (rAAV)载体
针对此研究设计的各种AAV.CYP4V2载体(参见本文中的实施例)，包括AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op、AAV5.CYP4V2st、AAV5.CYP4V2op、AAV8.CYP4V2fv及scAAV1.CYP4V2op，借由Vector BioLabs(Malvern,PA,USA)定制。来自Vector BioLabs的重组AAV载体无辅助。制造方法涉及：(1)克隆pAAV顺式质粒，其为含有AAV2 ITR的质粒，其包括相关CYP4V2 cDNA(亦即CYP4V2st、CYP4V2op或CYP4V2fv)及CYP4V2表达盒的调节序列；(2)借由使用Qiagen Endo-free Mega Prep试剂盒，大规模制备pAAV顺式质粒及互补质粒(携带相关AAV Rep-Cap基因的质粒及提供从腺病毒分离的辅助基因的质粒)；(3)将以上所描述的三个质粒大规模共同转染至HEK293细胞培养板中；(4)在转染后两天，收集细胞沉淀(cell pellet)，并使用三个冻融循环释放出病毒。使用CsCl梯度超速离心纯化AAV病毒，然后脱盐；及(5)使用Real-time PCR测定病毒滴度(基因组拷贝(GC)/ml)。将经纯化的rAAV载体储存在-80℃下直至使用。
包装于各种AAV.CYP4V2载体中用于研究的不同CYP4V2表达盒的序列(包括ITR及接合/连接序列)列出如下。
SEQ ID NO:60-AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op中的CYP4V2表达盒的序列：
左侧ITR：1-141
CAG启动子：237-1951
CYP4V2op cDNA：2002-3579
WPRE增强子：3736-4324
bGH polyA：4350-4574
右侧ITR 4659-4799
Figure BDA0002437005560001501
Figure BDA0002437005560001511
Figure BDA0002437005560001521
SEQ ID NO:61-AAV5.CYP4V2st中的CYP4V2表达盒的序列。AAV5.CYP4V2st与AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op(SEQ ID NO:60)具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)，但是CYP4V2 cDNA及接合/连接序列不同：
左侧ITR：1-141
CAG启动子：166-1880
CYP4V2st cDNA：1938-3515
WPRE增强子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右侧ITR：4399-4539
Figure BDA0002437005560001522
Figure BDA0002437005560001531
SEQ ID NO:62-AAV8.CYP4V2fv中的CYP4V2表达盒的序列。AAV8.CYP4V2fv与AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO:61)具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及接合/连接序列，且只有CYP4V2 cDNA序列不同：
左侧ITR：1-141
CAG启动子：166-1880
CYP4V2fv cDNA：1938-3515
WPRE增强子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右侧ITR：4399-4539
Figure BDA0002437005560001541
Figure BDA0002437005560001551
SEQ ID NO:63-AAV5.CYP4V2op(新)中的CYP4V2表达盒的序列。AAV5.CYP4V2op(新)与AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO:61)及AAV8.CYP4V2fv(SEQ ID NO:62)具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的接合/连接序列，但是CYP4V2 cDNA序列不同：
左侧ITR：1-141
CAG启动子：166-1880
CYP4V2op cDNA：1938-3515
WPRE增强子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右侧ITR：4399-4539
Figure BDA0002437005560001561
Figure BDA0002437005560001571
SEQ ID NO:64-scAAV1.CYP4V2op、scAAV5.CYP4V2op及scAAV9.CYP4V2op中的CYP4V2表达盒的序列：
左侧ITR(截短)：1-117
EFS启动子：130-364
CYP4V2op cDNA：520-2097
SPA：2116-2169
右侧ITR：2263-2403
Figure BDA0002437005560001572
Figure BDA0002437005560001581
为了评定CYP4V2st cDNA与CYP4V2op cDNA在CYP4V2基因疗法中的功效差异，使用本文中所描述的细胞活力分析，比较两个AAV5载体在拯救由BCD患者衍生的iPS-RPE中的RPE萎缩的功效，这两个载体具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的接合/连接序列，一个携带CYP4V2st cDNA(AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO:61))且另一个携带CYP4V2op cDNA(AAV5.CYP4V2op(新)(SEQ ID NO:63))。
为了评定SEQ ID NO:60及SEQ ID NO:63中所用的不同接合/连接序列是否会影响CYP4V2 cDNA或表达盒的表达，使用本文中所描述的细胞活力分析，比较两个AAV5载体(AAV5.CYP4V2op(SEQ ID NO:60)及AAV5.CYP4V2op(新)(SEQ ID NO:63))在拯救由BCD患者衍生的iPS-RPE中的RPE萎缩的功效，这两个载体具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的CYP4V2 cDNA(CYP4V2op(SEQ ID NO:2))，但是接合/连接序列不同。
应理解，可以在本文中所描述的任何CYP4V2表达盒中使用不同的CYP4V2 cDNA(SEQ ID No:1、2、3或其他的)代替本文中所提供的用于CYP4V2基因疗法中的表达盒序列中所含的CYP4V2 cDNA。亦应理解，本文中所描述的各CYP4V2表达盒可以包装于用于CYP4V2基因疗法中的各种血清型/衣壳的rAAV载体中，包括不同于此研究中所用的载体的载体(例如，AAV1、AAV2、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV5、AAV8及AAV9)。此外，在将scAAV构建体中所用的突变型AAV ITR改为ssAAV构建体中所用的非突变型AAV ITR之后，包装于此研究中所用的scAAV载体中的CYP4V2表达盒亦可包装于用于CYP4V2基因疗法中的ssAAV载体中。此外，本文中所描述的CYP4V2 cDNA或表达盒(含或不含AAV ITR)可以包装于用于CYP4V2基因疗法中的其他病毒载体(亦即非AAV载体，诸如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒及单纯疱疹病毒或其他病毒载体)或非病毒载体(例如，质粒、纳米颗粒或基于脂质的纳米粒子(例如，脂质体-鱼精蛋白-DNA复合物(LPD))中。
实施例12-用AAV.CYP4V2处理由BCD患者衍生的iPS-RPE细胞
在无血清RPE培养基中用上文所描述的各种AAV.CYP4V2载体感染衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞。1天后，用新鲜的含血清RPE培养基替代含病毒培养基以继续RPE培养。为了评定不同剂量的治疗效果，测试不同的感染复数(MOI，基因组拷贝(GC)/细胞)。
实施例13-用以评定AAV.CYP4V2基因疗法的作用的分析
在AAV.CYP4V2感染之后，在RPE培养基中培养BCD患者的iPS-RPE细胞，对于scAAV培养至少4天，或对于ssAAV培养至少10天，然后收集细胞进行测试。如先前所述，遵循细胞收集方案及样品制备方案。
本文实施例中所描述的用于检测脂肪酸、神经酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)及神经鞘氨醇及二氢鞘氨醇(SOSA)的生化测试在经过AAV.CYP4V2处理的BCD患者iPS-RPE细胞上进行且遵循使用LC-MS的同一生化测试方案。上表3显示健康对照组iPS-RPE细胞、无AAV.CYP4V2处理及AAV.CYP4V2处理后的BCD患者iPS-RPE细胞的结果。
结果证明，AAV.CYP4V2基因疗法改善或校正了BCD患者iPS-RPE细胞中的表型(例如，异常脂肪酸水平(例如，DHA、AA及总n3脂肪酸)，相比于对照组而言)。这确立了AAV.CYP4V2基因疗法在由BCD患者衍生的iPS-RPE细胞系中的功效。因为BCD主要由RPE退化引起，所以AAV.CYP4V2基因疗法在BCD患者特异性iPS-RPE细胞系中的功效确立了AAV.CYP4V2基因疗法对BCD患者的功效。
值得注意的是，scAAV1.CYP4V2op治疗在很短的时间内(治疗后仅4天)就达成了最显著的改善。这证明scAAV起效快，因为其不需要细胞机制来合成互补DNA链。出于相同的原因，预期AAV.CYP4V2处理与为了测试而进行的细胞收集之间较长的时间窗口能够产生更显著的结果改善，特别是对于包装于ssAAV载体中的CYP4V2基因疗法而言。
scAAV载体在人类RPE细胞中所达成的快速且稳健的结果确定scAAV载体尤其适用于拯救早发性疾病和/或RPE或视网膜退化的晚期人类患者。此外，scAAV载体的稳健的表达谱使其亦适合经由玻璃体内给药而递送至视网膜。
用AAV.CYP4V2拯救RPE萎缩
将由BCD患者衍生的iPS-RPE样品暴露于蓝光1小时，然后在次日在样品上进行细胞活力分析，如本文先前所描述。
本文中的图中显示了细胞活力影像，这些影像比较无AAV.CYP4V2处理与有AAV.CYP4V2处理的患者iPS-RPE样品。
与未经处理的患者样品相比，AAV2.CYP4V2op及scAAV1.CYP4V2op处理各自显示出能拯救由BCD患者衍生的iPS-RPE样品中的RPE萎缩(图8。MOI＝1×10e5 GC/细胞)。有趣的是，AAV2.CYP4V2op及scAAV1.CYP4V2op在1×10e5 MOI下的拯救功效在P2 iPS-RPE中比在P1 iPS-RPE中高。这表明，使用AAV.CYP4V2基因疗法治疗BCD的最佳剂量会根据患者之间的个体差异而有所不同，且BCD患者特异性iPS-RPE为适用于评定不同患者的个人化最佳剂量的工具。
与未经处理的患者样品相比，AAV5.CYP4V2op、AAV5.CYP4V2st及AAV8.CYP4V2fv处理各自拯救由BCD患者衍生的iPS-RPE样品中的RPE萎缩(图9。MOI＝1×10e5)。
与未经处理的患者样品相比，AAV5.CYP4V2op、scAAV1.CYP4V2op及scAAV5.CYP4V2op处理各自拯救由BCD患者衍生的iPS-RPE样品中的RPE萎缩(图10。MOI＝1×10e4)。
与未经处理的患者样品相比，scAAV9.CYP4V2op处理拯救由BCD患者衍生的iPS-RPE样品中的RPE萎缩(图11。MOI＝1×10e5。处理后2周)。
值得注意的是，较低剂量(MOI＝1×10e4)的AAV.CYP4V2处理在P2样品中所达成的结果与较高剂量(MOI＝1×10e5 GC/细胞)的同一载体处理在P1样品中所达成的结果类似或比它更好。这证明在细胞水平上，为了在拯救RPE萎缩方面达成相同或类似的功效，不同患者可能需要不同剂量。换言之，对于同一种疾病的所有患者，一种载体及一个类似剂量水平可能不是基因治疗的最具医学或经济效益的方法。BCD细胞模型及其他眼部疾病的类似细胞模型可以为个人化最佳剂量提供指引。
亦测试其他AAV.CYP4V2载体且这些载体显示能改善BCD患者iPS-RPE样品中的RPE萎缩，包括AAV2tri(Y-F).CYP4V2op处理(MOI为1×10e4)及AAV5.CYP4V2op(新)(SEQ IDNO:63)，采用不同的MOI水平(1×10e4及1×10e5 GC/细胞)。
另外，用ImageJ(Fiji)处理细胞活力影像以计数iPS-RPE样品中的死细胞及活细胞的数目。每个样品使用四个不同区域/影像来计数且对同一样品的多个影像的死/活细胞比率求平均。死/活细胞比率证明AAV.CYP4V2处理能拯救由BCD患者衍生的iPS-RPE中的RPE细胞萎缩。举例而言，关于死/活细胞比率，WT2为3.0％，P1(无AAV.CYP4V2处理)为20.87％，且经AAV5.CYP4V2st处理的P1为9.69％。其他AAV.CYP42载体的处理亦能减小BCD患者iPS-RPE样品中的死/活细胞比率。
这些结果表明：
(1)各种AAV.CYP4V2载体、表达盒及CYP4V2 cDNA均能拯救BCD中的RPE萎缩；
(2)自身互补型AAV载体(scAAV)能快速达成拯救功效；
(3)可以在不同剂量水平下达成功效。
实施例14-AAV.CYP4V2载体的安全性及用于临床使用的GMP制造
先前的研究表明，CYP4V2在人类器官中几乎遍在地表达且眼内在视网膜中的表达水平高。此外，已在其他疾病的基因疗法研究及临床试验中确立了AAV载体的安全性。因此，可以合理地预期AAV.CYP4V2载体可安全地用于基因疗法中。
在此研究中，使用各种AAV.CYP4V2载体以高剂量(例如，1×10e5 MOI)治疗人类iPS-RPE样品。除了如以上实施例中所述AAV.CYP4V2能拯救由BCD患者衍生的iPS-RPE样品中的RPE萎缩之外，在未经处理的样品与经AAV.CYP4V2处理的样品之间在细胞死亡方面未观测到实质差异。这确立了AAV.CYP4V2载体的安全性且证明经转导的CYP4V2编码基因能够达成高水平表达而没有显著的毒性证据。
除了在细胞系中测试之外，AAV.CYP4V2基因疗法的安全性亦可在动物中，例如在小鼠、大鼠或非人类灵长类动物中，和/或经由人类临床试验来测试。
可用各种制造方法及平台来产生供人类临床使用的重组AAV载体。举例而言但不限制，rAAV载体的GMP制造可以使用双质粒转染法或三质粒转染法，可以使用哺乳动物细胞系，诸如HEK293、A459或293T，或昆虫细胞系，诸如杆状病毒/Sf9细胞平台，可以使用附着或悬浮细胞培养。此外，各种方法、制程和/或平台，包括但不限于基于单纯疱疹病毒(HSV)的生产系统、一次性生物反应器(例如，iCELLis)、HYPERStack、滚瓶及柱层析法，均可用于增加产量或滴度，或改良纯度，和/或避免潜在污染。这些rAAV载体临床产生方法、制程、技术及平台为本发明所属技术领域中已知的且在商业上可经由合同制造组织(CMOs)或学术GMP设施获得，例如Lonza(USA)、Cobra Biologics(UK)、全国儿童医院(Nationwide Children’s Hospital)(NCH.Ohio,USA)、费城儿童医院(Children's Hospital of Philadelphia)(CHOP.USA)、WuXi Biologics(China及USA)。用于人类临床使用的AAV.CYP4V2载体可以使用本文中所提及的和/或其他在本发明所属技术领域中已知的或未来将开发的方法、制程、技术、平台及GMP设施中的任何一者或多者来制造。
实施例15-受试者选择及体内施用AAV.CYP4V2以治疗BCD
AAV.CYP4V2人类临床试验的示范性受试者合格标准列出如下：
入选标准
若受试者满足以下所有入选标准，则其有资格参与研究。
1.愿意并能够提供参与研究的知情同意书。
2.年龄≥18岁。
3.遗传上已确诊有双等位基因CYP4V2突变。
4.在研究眼的黄斑区域内具有临床可见的明显疾病。
5.在研究眼中具有34-73ETDRS字母的最佳矫正视敏度(best corrected visualacuity，BCVA)(相当于比20/40Snellen敏锐度差或等于该敏锐度，但优于或等于20/200Snellen敏锐度)。
排除标准
若受试者满足以下任何排除标准，则其没有资格参与研究。
1.有资格的眼睛有弱视史。
2.若以AAV治疗时，不愿意使用为期3个月的屏障避孕法。
3.在首次就诊后3个月内在研究眼中进行了预先眼内手术。
4.具有任何其他显著的眼部或非眼部疾病/病症，该疾病/病症在研究者看来可能会使该受试者因为参与研究而处于危险之中，或者可能影响研究结果或该受试者参加研究的能力。这包括但不限于以下受试者：
·具有口服皮质类固醇(例如去氢皮质醇/强的松(prednisone))的禁忌症
·具有有临床意义的白内障
·根据研究研究者的临床意见，不适合作为外科手术(例如，视网膜下手术)的候选者。
5.已参与在过去12周内涉及研究产品的另一项研究，或者之前任何时候接受过基于基因/细胞的疗法。
关于用AAV.CYP4V2来治疗BCD，患者应该经遗传或分子确诊有BCD，亦即经由基因测试(单基因测试，或若有医疗必要，亦可多基因检测组合(multi gene panel)测试)确认双等位基因CYP4V2突变。因为BCD有时会被诊断为是遗传性视网膜病症(IRD)、视网膜退化(RD)或视网膜色素变性(RP)，所以AAV.CYP4V2亦可用于治疗经遗传确认有双等位基因CYP4V2突变的IRD、RD或RP患者。
关于体内AAV.CYP4V2治疗，患者应该具有活的视网膜细胞，其借由光学相干断层扫描(OCT)和/或检眼镜检查法所测定。较佳地，患者应该具有一些视力(例如，最佳矫正视敏度(BCVA)优于或等于20/200(待治疗眼中的小数0.1))。
可以使用多种给药手段/给药途径来将AAV.CYP4V2载体体内递送至靶细胞(例如，视网膜或角膜细胞)，包括但不限于，视网膜给药可以经由视网膜下注射、玻璃体内注射(使用适合于玻璃体内递送的AAV载体，例如AAV2(Y444F+Y500+Y730F)、AAV 7m8或其衍生物)或经由血流递送(使用能够穿透血液-视网膜屏障的AAV载体，例如AAV9或AAV-PHP.B)来进行。此外，AAV.CYP4V2载体亦可封装于装置中，该装置将被经玻璃体内植入以作为一种给药方式。
与基因疗法相关的手术/给药方法以及某些用以改良递送/转导效率的技术(例如，内界膜(internal limiting membrane，ILM)剥离及玻璃体切除术(VIT))为本发明所属技术领域中已知的。免疫抑制剂，例如皮质类固醇，可在AAV给药以最小化免疫响应之前、在此期间和/或在此之后使用。
除了体内治疗患者之外，CYP4V2基因疗法(包括AAV.CYP4V2基因疗法)可用于体外治疗靶细胞(例如，BCD患者的iPS衍生的RPE细胞、视网膜细胞、角膜上皮细胞或角膜细胞)，然后将这些细胞移植至患者中，作为一种细胞疗法。使用AAV.CYP4V2载体治疗BCD患者iPS-RPE细胞的方法提供于实施例及本文的揭示内容中。细胞植入/移植方法为本发明所属技术领域中已知的，例如植入/移植至视网膜及角膜。举例而言，可以使用相同或类似的用以将ES-RPE细胞移植至视网膜的方法及手术技术来移植BCD患者的iPS-RPE细胞。
治疗有效剂量可以在疾病模型(例如，BCD细胞模型(例如，衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系)或动物模型)中测定及评估，且借由临床试验确认或改良。关于细胞的体外治疗，剂量通常用MOI表示，然后MOI乘以待治疗细胞的数目。MOI一般在约1×103GC/细胞至约1×106GC/细胞的范围内或感染MOI为约100至约10,000GC/细胞(GC：基因组拷贝，测量含有基因组的AAV颗粒(又名载体基因组(vg)或基因组颗粒(gp))。关于体内治疗，确定剂量时应该考虑典型的临床因素，诸如给药途径；所靶向细胞的区域大小或数目；及待治疗的受试者(例如，待治疗受试者的年龄、体重、疾病及病状的发展阶段及潜在免疫响应)；靶向治疗的细胞的位置(例如，视网膜对比角膜)。此外，亦应该考虑正使用的AAV.CYP4V2载体的转导效率及拯救功效。最后，若有可能，则亦应该考虑患者之间在细胞水平上最佳剂量方面的个体差异，这种差异可以在患者特异性iPS-RPE细胞中评定。因此，向眼睛体内单次局部给药的治疗有效剂量可为大概从约1×106至约2×1013GC且包括端值(例如，约1×1011GC至约1×1012GC的高剂量范围、约1×1010GC至约1×1011GC的中等剂量范围、约1×109GC至约1×1010GC的低剂量范围、约1×106GC至约1×109GC的极低剂量范围及约1×1012GC至约2×1013GC的极高剂量范围)，或在这些范围内的足够提供所期望的效果的任何剂量。在一个实施方案中，组合物以约1×106至2×1013GC的剂量施用。在另一实施方案中，体内给药剂量借由靶向治疗的细胞的数目乘以目标MOI(例如，约1×103GC/细胞至约1×106GC/细胞)来确定。任何向眼睛的单次局部给药中含有rAAV载体的药剂的体积可以在约1μL(0.001mL)至约1000μL(1mL)范围内。经由血流递送来治疗需要高得多的剂量且该剂量可以在每公斤体重约1×106至约2×1014GC的范围内。
关于更多说明，参见“E.治疗选项、受试者选择及给药”及本文中的其他揭示内容。
实施例16-治疗后评估
因为BCD的临床症状类似于许多其他类型的IRD、RD及RP的临床症状，例如视敏度丧失，视野受限，夜盲症，暗适应性、对比敏感度及色觉下降，视网膜(及一些患者的角膜)改变，及视网膜电图(ERG)上的反应减弱，所以可以使用相关的衡量指标来评定BCD患者在治疗前及治疗后的疾病状态及进展，从而评估治疗结果。这些衡量指标及相关的检查与测试为视网膜及角膜疾病的技术中已知的。举例而言但不限制，最佳矫正视敏度(使用视敏度表)可用作BCD基因疗法的主要结果衡量指标，以下一者或多者作为次要结果衡量指标：微观测量(microperimetry)(敏感度变化)、眼底自发荧光(fundus autofluorescence，AF)(AF变化)、光学相干断层扫描(OCT)(椭圆体带及视网膜厚度)、对比敏感度(Pelli-Robson图)、色觉(Farnsworth-Munsell 100色相测试)及ERG(ERG变化)。此外，诸如移动性测试的功能测试亦可用作主要或次要结果衡量指标。可以在治疗后的不同时间点进行评估，例如治疗后2周、1个月、2个月、3个月、6个月及12个月。结果可用于评估治疗结果。功效可以表达为以下之一：主要或次要结果衡量指标中的一者或多者的改善、疾病进展停止，或比预期的视网膜退化或视力丧失的速率低(必要时借由使用自然史研究的数据)。
实施例17：用以减少基因疗法中的免疫响应并解决个体差异的方法
病毒载体介导的基因疗法可以触发细胞免疫响应、局部免疫响应或全身免疫响应，可能存在安全风险。免疫响应亦会降低转导效率，从而减弱病毒载体介导的基因疗法的治疗效果。免疫响应可以按识别淋巴或血液中的抗原或病原体的体液反应(或抗体介导的反应)和/或细胞介导的免疫的形式发生。为了最小化免疫响应，常常结合基因疗法给药使用诸如皮质类固醇的免疫抑制剂。免疫抑制药物具有例如可能引起眼内压升高、白内障及其他不良事件(例如，长期使用免疫抑制剂可能增加癌症风险)的作用。除了免疫响应之外，患者之间亦存在其他个体差异，例如，对于不同类型(例如，不同血清型或不同衣壳突变/结构)的载体的反应，或对于相同剂量的相同载体的反应。
一种用以在病毒载体介导的基因疗法中降低对病毒载体的免疫响应、保持转导效率、降低病毒载体和/或免疫抑制剂剂量和/或使针对具有同一种遗传疾病的不同患者的治疗效果达到最大的方法，其包含：
(a)建立在该基因疗法所针对的靶细胞类型中具有足够的转导效率的多于一个重组病毒载体(例如，rAAV)的库。可以借由产生具有抗原区突变的变异体或在这些病毒载体的衣壳上的其他突变或变异体来扩增该病毒载体的库，其在确认这些突变或变异体在与该疾病有关的靶细胞中(例如，对针对BCD的CYP4V2基因疗法而言，是在iPS-RPE或RPE细胞系中)具有足够的转导效率后。
(b)检测需要该基因疗法的受试者中预先存在的针对不同病毒载体血清型和/或衣壳突变或变异体的中和抗病毒载体抗体(NAb)，和/或测试及比较衍生自该受试者的患者特异性疾病靶细胞(例如，iPS-RPE细胞)中的不同病毒载体。
(c)从该病毒载体的库中选择病毒载体，该病毒载体(i)在疾病靶细胞中具有足够的转导效率且(ii)与该受试者中预先存在的NAb具有低交叉反应性和/或(iii)在受试者的患者特异性疾病靶细胞(例如，对针对BCD的CYP4V2基因疗法而言，为患者特异性iPS-RPE或RPE细胞系)中具有良好表型拯救结果，其中该病毒载体的库包含不同血清型和/或衣壳经修饰的病毒载体(例如，包括但不限于衣壳突变型AAV和/或衣壳蛋白变异型AAV)。
(d)使用选自(c)的病毒载体向该受试者给药。
(e)每当该受试者需要施用基因疗法时重复以上的(b)至(d)(仅重复与预先存在的NAb相关的部分)，其包括但不限于向同一器官(例如，眼睛或对侧眼睛)或向其它器官进行后续给药，。
具体而言，产生并测试多种rAAV载体来评定在此研究中不同患者的细胞系之间的差异，这些rAAV载体包括五种不同的AAV(AAV1、AAV2、AAV5、AAV8及AAV9)血清型及一种衣壳突变AAV(AAV2.tri(Y-F))。
实施例18：使用scAAV快速拯救视网膜疾病及在scAAV或AAV载体中使用EFS和/或 SPA来治疗眼部疾病
如以上实施例13中所表明，scAAV.CYP4V2治疗在很短的时间内(仅4天)在BCD患者iPS-RPE细胞中达成了稳健的生化表型拯救。
此外，scAAV.CYP4V2在AAV治疗后两周在BCD患者iPS-RPE细胞系中显示RPE萎缩拯救(参见图11)。人类iPS-RPE细胞中由scAAV载体中的EFS启动子(示范性序列显示于SEQ IDNO:35中)及SPA(示范性序列显示于SEQ ID NO:36中)驱动的快速且稳健的表达表明，EFS启动子和/或SPA适合驱动人类眼部细胞中的转基因表达并治疗人类眼部疾病。借由含有EFS启动子及SPA的scAAV载体达成的快速拯救使其尤其适用于治疗快速进展的疾病或疾病晚期患者。
此外，该研究证明了scAAV设计在人类视网膜细胞中快速且稳健的表达。这使得scAAV介导的基因疗法特别有助于治疗早发性视网膜疾病患者或治疗需要快速拯救的晚期患者。
关于CYP4V2基因疗法的论述
BCD为罕见的致盲性眼睛疾病，其目前尚无经过批准的治疗方法可用。在涉及使用BCD患者特异性iPS-RPE细胞系的临床研究中，多种AAV.CYP4V2载体及表达盒设计在拯救BCD患者特异性iPS-RPE细胞中的表型方面的功效在此研究中被证实，如经由脂肪酸及脂质分析所评定。此外，测试不同剂量(MOI)，其可用作确定体内治疗剂量范围的指引。最后，没有充分的证据表明存在与AAV.CYP4V2基因疗法相关的毒性。
细胞疗法及CRISPR基因编辑疗法实例
实施例19-在细胞疗法中使用来自BCD受试者的iPSC、iPS-RPE或iPS-眼部细胞
BCD为相对晚发性疾病。BCD患者的症状通常在生命的第2、第3或甚至第4个十年间出现。此外，iPS重编程方法可能有一些“重置时钟”作用。因此，衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞及其他iPS-眼部细胞可以作为细胞疗法使用用于移植至BCD患者，甚至不需要对iPS-RPE细胞中的CYP4V2突变进行任何基因修复。
或者，衍生自BCD患者的iPSC、iPS-RPE细胞、iPS-PRC、iPS-CE细胞、iPS-CEC和/或其他iPS-眼部细胞可以在细胞疗法移植之前进行基因修复。基因修复可以借由如以上实施例中所述的CYP4V2基因疗法或借由基因编辑来达成。关于基因编辑的更详细描述，参见本文中的实施例。
实施例20-用于眼部细胞疗法的经基因修复的患者自体细胞
患者特异性iPSC衍生的细胞(例如，iPS-RPE细胞、iPS-CEC、iPS-CE细胞、iPS-PRC或iPS-眼部细胞)可以作为自体细胞源用于在针对眼部疾病的细胞疗法中的移植，该眼部疾病包括但不限于视网膜及角膜疾病。相比于由同种异体来源产生的细胞，诸如另一个体的ES细胞(例如，ES-RPE细胞、ES-CEC或ES-PRC，及由这些ES衍生的细胞构成的组织)或iPS细胞，这些患者特异性iPS衍生的自体细胞及由这些细胞构成的组织通常几乎不需要对患者进行免疫抑制，且没有与ES及ES衍生的细胞的使用相关的道德问题。
然而，由患者源细胞(例如，成纤维细胞或血细胞)产生的iPSC及衍生自这些患者特异性iPSC的细胞及组织(例如，患者特异性iPS-RPE细胞、iPS-PRC、iPS-CEC、iPS-CE细胞及iPS-眼部细胞)仍然具有致病突变及相关表型。为了产生由健康患者衍生的细胞和/或组织，可以用基因编辑技术来基因修复或校正病理性突变，基因编辑技术包括但不限于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)，其可经设计以校正患者细胞中的目标突变。这些经基因修复的健康iPSC然后可用于产生各种不再携带患者的病理性突变的细胞类型(例如，iPS-RPE细胞、iPS-CEC、iPS-CE细胞、iPS-PRC或其他iPS-眼部细胞)。
此外，此概念验证研究表明，这些经基因校正的iPSC和/或经基因校正的iPS衍生的细胞(例如，iPS-RPE细胞)不再具有如来自患者的(未校正的)iPS衍生的细胞中所见的表型(例如，借由生物分析所评定的异常生化谱，例如脂质组学和/或蛋白质组学)。因此，这些经基因校正的细胞充当可使用作为细胞疗法中的替代细胞的再生性经基因修复的自体细胞的来源。与经基因校正的患者自体细胞相关的组合物及方法详细描述于本文及以下实施例中。
另一类型的经基因修复的患者细胞为经过如上文所描述的基因补充疗法(例如，CYP4V2基因疗法)处理的患者iPSC或iPS衍生的细胞(例如，iPS-RPE细胞、iPS-PRC、iPS-CE细胞、iPS-CEC及iPS-眼部细胞、iPS-神经元细胞)。在基因疗法处理后，患者特异性细胞具有突变基因的健康拷贝(例如，cDNA)和/或表达由健康转基因编码的功能蛋白。此外，经基因疗法处理的患者特异性细胞显示出经改善或标准化的在未经处理的患者细胞中所看到的生化谱或其他表型。因此，它们亦可用作经基因修复的自体细胞的来源，这些自体细胞供使用作为细胞疗法中的替代细胞，例如经CYP4V2基因疗法处理的BCD患者特异性iPS-RPE细胞、iPS-PRC、iPS-CEC、iPS-CE细胞及iPS-眼部细胞作为供使用于针对BCD的细胞疗法中的经基因修复的患者自体细胞。与经CYP4V2基因疗法处理的BCD患者特异性细胞相关的组合物及方法详细描述于上文实施例中。下文中的论述着重于借由校正基因组DNA中的突变所达成的基因修复的类型。
用于与遗传突变相关的眼及视网膜退化性疾病的自体细胞替代是取决于借由经由基因编辑基因校正突变来修复患者的病理性突变或在移植前修复该突变或减轻该突变的后果(例如，经由递送相对于疾病基因的转基因的健康拷贝，例如CYP4V2基因疗法)的能力。此处，产生来自具有最常见的CYP4V2突变(c.802-8_810del17insGC)的BCD患者的患者特异性iPSC，且开发CRISPR基因编辑组分(CRISPR引导RNA及供体模板)及各种构建体(质粒及RNP)来校正此突变。虽然本文中使用CRISPR/Cas9作为基因编辑手段，但是期望可以使用其他CRISPR系统(例如，Cpf1)及其他基因编辑技术来达成相同或类似的结果，这些基因编辑技术包括但不限于TALEN以及新兴的及未来的基因编辑技术，诸如CRISPR/Cpf1。亦期望基因编辑不仅可以应用于iPSC，而且可以应用于将要用于产生iPSC的原始源细胞以及由iPSC产生的细胞，从而校正这些细胞中的病理性突变。
虽然iPS衍生的细胞系是在患者特异性基础上产生的，但是其在细胞疗法中的应用不一定必须具有患者特异性。限制基于iPSC的细胞疗法的广泛使用的关键因素为人类个体之间的免疫学差异。解决此问题的方法有很多。举例而言，一种方法为开发多个细胞库，这些细胞库含有有限数目的具有常见HLA单倍型的细胞系，它们经设计用于与大部分患者群体达成免疫学匹配。此类细胞库可以借由从具有所选择的单倍型的患者产生iPSC或借由HLA基因型的基因操作而产生。另一方法为产生无论患者的基因型如何都将免疫沉默的细胞类型。
下面描述关于以下的方法：如何产生经基因修复的患者特异性自体细胞、如何评定基因修复在这些细胞中的作用及如何在细胞疗法中使用这些细胞。本文中提供的实施例与从具有CYP4V2基因中的c.802-8_810del17insGC突变的BCD患者产生经基因修复的患者自体细胞有关，该突变为BCD患者中最常见的突变。同一方法可用于从以下患者产生经基因修复的患者自体细胞：具有CYP4V2中的不同突变的患者，或具有与眼部疾病相关的另一基因中的突变的患者，或具有与其他类型的疾病相关的基因中的突变的患者，该突变于包括但不限于表4中所含的任何基因中。
表4
靶基因列表
ABCA4、ABCC6、ABHD12、ADAM9、AHI1、AIPL1、ALMS1、ARL13B、ARL6、ARMS2、ATXN7、BBS1、BBS10、BBS12、BBS2、BBS4、BBS5、BBS7、BBS9、BEST1、C1QTNF5、C2、C2orf71、C3、C5orf42、C8orf37、CA4、CABP4、CACNA1F、CACNA2D4、CAPN5、CC2D2A、CDH23、CDH3、CDHR1、CEP164、CEP290、CEP41、CERKL、CFB、CFH、CHM、CHR2、CIB2、CLN3、CLN5、CLN6、CLN8、CLRN1、CNGA1、CNGA3、CNGB1、CNGB3、CNNM4、COL11A1、COL2A1、COL9A1、CRB1、CRX、CYP4V2、DFNB31、DHDDS、EFEMP1、ELOVL4、ERCC6、EYS、FAM161A、FBLN5、FLVCR1、FSCN2、FZD4、GNAT1、GNAT2、GNPTG、GPR143、GPR179、GPR98、GRK1、GRM6、GRN、GUCA1A、GUCA1B、GUCY2D、HARS、HMCN1、HTRA1、IDH3B、IFT140、IFT80、IMPDH1、IMPG2、INPP5E、INVS、IQCB1、ITM2B、JAG1、KCNJ13、KCNV2、KCTD7、KIF11、KLHL7、LCA5、LRAT、LRIT3、LRP5、LZTFL1、MAK、MERTK、MFN2、MFRP、MFSD8、MKKS、MKS1、MT-ND4、MTTP、MYO7A、NDP、NEK4、NEK8、NMNAT1、NPHP1、NPHP3、NPHP4、NR2E3、NRL、NUB1、NYX、OA1、OAT、OCA1、OCA2、OFD1、OPA1、OPA3、OPN1LW、OPN1MW、OPN1SW、OTX2、PANK2、PAX2、PCDH15、PDE6A、PDE6B、PDE6C、PDE6G、PDE6H、PDGF、PDZD7、PEX1、PEX10、PEX14、PEX16、PEX19、PEX2、PEX5、PEX6、PEX7、PGK1、PHYH、PITPNM3、PLA2G5、PPT1、PRCD、PROM1、PRPF3、PRPF31、PRPF6、PRPF8、PRPH2、RAB28、RAX2、RBP3、RBP4、RD3、RDH12、RDH5、RDS、RGR、RGS9、RGS9BP、RHO、RIMS1、RLBP1、ROM1、RP1、RP1L1、RP2、RP9、RPE65、RPGR、RPGRIP1、RPGRIP1L、RS1、SAG、SDCCAG8、SEMA4A、SLC24A1、SLC45A2、SNRNP200、SPATA7、TEAD1、TIMM8A、TIMP3、TLR3、TLR4、TMEM126A、TMEM231、TMEM237、TMEM67、TOPORS、TPP1、TREX1、TRIM32、TRPM1、TSPAN12、TTC21B、TTC8、TTPA、TULP1、TYR、TYRP1、UNC119、USH1C、USH1G、USH2A、VCAN、VPS13B、WDPCP、WDR19、WFS1、WHRN、ZNF423、ZNF513、ACO2、AFG3L2、AUH、C12orf65、CISD2、CYP1B1、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPTN、PAX6、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、ATXN2、ROBO3、PHOX2A、HOXA1、SALL4、CHN1、TUBB3、KIF21A、HOXB1、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1、CYP46A1
以具有CYP4V2突变的疾病BCD为例，从携带BCD患者的特异性突变的患者特异性细胞产生iPSC。用CRISPR引导RNA(gRNA)、Cas9核酸内切酶及供体同源模板转染患者特异性iPSC。CYP4V2基因拷贝显示突变已校正且转化为野生型等位基因。经校正的iPSC然后用以产生经基因校正的iPS-RPE细胞。然后测试经基因校正的iPS-RPE细胞以确认其不再具有表型(例如，异常生化谱(例如，脂肪酸谱))。这些经基因修复的患者自体细胞可以移植(直接移植(例如，细胞悬浮液)或采用其他形式，诸如作为层、层片、基质、支架或组织的一部分)至原患者作为针对BCD的自体细胞疗法。
(i)产生BCD患者特异性iPSC株：
iPSC由来自携带CYP4V2基因中的纯合c.802-8_810del17insGC突变的BCD患者的患者特异性细胞产生，如本文中所描述。关于患者特异性iPSC的产生方法，参见实施例1。BCD患者的突变借由测序来鉴定
(ii)设计、筛选及选择靶向该突变的CRISPR基因编辑组分及构建体：
CRISPR基因编辑疗法的详细说明参见本文中的实施例。
(选择CRISPR gRNA以最小化脱靶编辑及最大化直接集中于突变位点的靶序列的特异性。筛选对含有患者特异性CYP4V2突变的区域具有高特异性的多个gRNA。将候选gRNA分别插入亦含有负责介导靶DNA切割的Cas9核酸内切酶的表达载体中并转染至293细胞系中。使用针对CYP4V2区域的引物，借由PCR扩增患者基因组DNA，且分析PCR产物的DNA切割活性。使用调查分析评定哪些候选gRNA对突变位点具有相对较高的活性。将具有最高切割效率的gRNA用于基因编辑。)
(iii)iPSC中的基因编辑：
CRISPR基因编辑疗法的详细说明参见以下实施例。
对于如BCD的遗传隐性疾病，一个等位基因或突变中的基因校正足矣。可使用靶向不同突变的多个CRISPR构建体来校正细胞所携带的多种突变。
(iv)从经基因校正的iPSC产生iPS-RPE细胞或其他iPS-眼部细胞：
在经由测序确认精确校正病理性突变且没有或只有最小的脱靶编辑之后，借由基因编辑校正的iPSC用于分化成并产生iPS-RPE细胞或另一种类型的受如本文中所描述的相关疾病影响的iPS-眼部细胞(例如，iPS-PRC、iPS-CEC或iPS-CE细胞)。衍生自BCD患者的经校正的iPS-RPE细胞然后经历相同的RPE命运确认(例如，不同的RPE形态(例如，色素和/或六角形)及或RPE特异性标记物)。
(v)用以确认没有表型的生物分析
生物分析用来确认这些经基因校正的iPSC和/或经基因校正的iPS衍生的细胞(例如，iPS-RPE细胞)不再具有如来自患者的(未校正的)iPS衍生的细胞中所见的表型。生物分析可为任何类型的能够鉴定及评定患者细胞中与特定疾病相关的细胞和/或分子水平表型的生物学分析。举例而言，其可以包括但不限于脂质组学、蛋白质组学、蛋白质表达和/或其他生化测试。对于BCD，生物分析包括如本文实施例中所述的脂肪酸及神经酰胺测试。结果指出，衍生自BCD患者的这些经基因校正的iPS-RPE细胞不再具有如衍生自BCD患者的未校正的iPS-RPE细胞中所见的相关的生化缺陷/功能障碍。这证明，经基因校正的iPS-RPE细胞没有表型，且因此为适合用于细胞疗法的替代细胞的来源。
(vi)移植：
这些经基因修复的患者自体细胞(例如，iPS-RPE细胞、iPS-PRC、iPS-CE细胞、iPS-CEC及其他iPS-眼部细胞)可以移植(直接移植或作为层、层片、基质、支架或组织的一部分移植)至原患者，作为针对BCD的细胞疗法。
实施例21-针对眼部疾病的CRISPR基因编辑疗法的特定实施例
当gRNA正确地设计时，CRISPR/Cas9具有高特异性，但是特异性及脱靶编辑仍为主要问题，特别是当CRISPR的临床用途仍在开发中。以下实施例详细描述用以开发用于治疗眼部疾病的具有高中靶特异性及低脱靶编辑风险的CRISPR基因编辑疗法构建体的方法。此外，c.802-8_810del17insGC突变代表所有已知的CYP4V2突变及其他遗传性眼部疾病中最难以校正的突变之一。尽管大部分CYP4V2突变为单一核苷酸改变、插入或缺失(参见表1：选择BCD患者中的CYP4V2突变)，然而c.802-8_810del17insGC突变涉及17bp缺失及2bp插入，且涉及内含子及外显子两种。
设计及构建几组用以校正最常见的病理性CYP4V2突变(c.802-8_810del17insGC突变)的CRISPR基因编辑疗法构建体。以下为关于使用这些CRISPR CYP4V2基因编辑构建体校正突变并治疗BCD的设计、组合物及方法的详细说明。
(a)分析突变
c.802-8_810del17insGC突变涉及内含子与外显子及缺失与插入，且其影响剪接受体位点。
c.802-8_810del17insGC突变是指17个碱基缺失且两个碱基(GC)插入于从CYP4V2基因的内含子6的末端起距离8个碱基的位置中，亦称为IVS6-8del/insGC；参见SEQ ID NO:46，其显示包含c.802-8_810del17insGC突变的人类CYP4V2基因组DNA区域的序列，及SEQID NO:47，其显示相应的野生型序列。c.802-8_810del17insGC突变展示于以下显示人类CYP4V2内含子6-外显子7接合的序列中。内含子6序列以小写字母显示且外显子7序列以大写字母显示。17bp缺失及GC插入位于括号内：caa aca gaa gca tgt gat tat cat tca aa(tca tac agG TCA TCG CT)(GC)GAA CGG GCC AAT GAA ATG AAC GCC AAT GA，预测其导致跳过外显子7。野生型CYP4V2具有以下序列：CAA ACA GAA GCA TGT GAT TAT CAT TCA AA(TCAT ACA GGT CAT CGC T)GA ACG GGC CAA TGA AAT GAA CGC CAA TGA(SEQ ID NO:47)，而c.802-8_810del17insGC突变型CYP4V2具有以下序列：CAA ACA GAA GCA TGT GAT TAT CATTCA AA(G C)GA ACG GGC CAA TGA AAT GAA CGC CAA TGA(SEQ ID NO:46)。野生型序列中加括号的核苷酸为缺失的17个核苷酸且突变序列中加括号的核苷酸为在17个碱基对缺失之后插入的2个核苷酸。
为了用CRISPR达成良好修复率，期望Cas产生尽可能靠近突变序列的切割。含有c.802-8_810del17insGC突变的CYP4V2基因组DNA区域具有多个SpCas9 PAM位点(NGG)。因此，可以使用常规的SpCas9来校正此突变。或者，可使用其他物种的Cas9、突变的Cas9或其他具有不同PAM(例如，对于存在于突变序列中的Cpf1，为TTTN)的CRISPR核酸酶(例如，Cpf1)来校正c.802-8_810del17insGC突变和/或其他突变。
(b)CRISPR gRNA设计及选择
基于CYP4V2基因的c.802-8_810del17insGC突变区域中所存在的各种PAM位点，使用DeskGen软件筛选多个相关的原型间隔区元件序列(本文中称为gRNA，长度通常为20nt，但是可以采用不同长度，例如与Cas9一起使用时为17-22nt)。使用以下标准选择五(5)个候选gRNA：a)gRNA/Cas9切割位点与靶校正位点的靠近程度；及b)所预测的gRNA的脱靶谱(参见表5及图12；gRNA序列参见SEQ ID NO:48至52)。
表5.候选gRNA的序列
gRNA 脱靶评分 序列
CYP4V2 g1 87 5'-TGA TTA TCA TTC AAA GCG AA CGG-3'
CYP4V2 g2 98 5'-GAT TAT CAT TCA AAG CGA AC GGG-3'
CYP4V2 g3 73 5'-GAT AAT CAC ATG CTT CTG TT TGG-3'
CYP4V2 g4 70 5'-TTC ATT GGC GTT CAT TTC AT TGG-3'
CYP4V2 g5 32 5'-CAC ATG CTT CTG TTT GGA CT TGG-3'
用粗体突出对应于各候选gRNA的PAM位点。为了避免混淆，PAM序列不是gRNA(原型间隔区元件)序列的一部分。
(c)使用患者基因组DNA进行gRNA验证
使用具有纯合c.802-8_810del17insGC突变的BCD患者(P1)的基因组DNA来选择及验证gRNA。使用引物(参见表6及图12)来制备侧接含有突变位点及各种靶位点的CYP4V2区域的DNA扩增子。将DNA扩增子、借由体外转录(in vitro transcription，IVT)制备的单引导RNA(sgRNA)(各自包含gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4或gRNA5中之一者)及SpCas9蛋白质混合且在37℃下孵育1小时。活性sgRNA介导Cas9蛋白质在扩增子中产生双链断裂且展示各种片段模式(表7)。加载反应物并在1.5％琼脂糖凝胶上解析DNA片段(图13)。
表6.gRNA验证中所用的引物
Figure BDA0002437005560001761
表7.所预测的借由活性gRNA产生的DNA片段
Figure BDA0002437005560001762
为了确认片段实际上源自扩增子，对未经处理的扩增子的DNA样品(图16，最上组(Top panel))及经g2处理的最小片段(图16，中间组(middle panel))进行桑格测序(Sanger sequencing)(图14)。5个gRNA全部显示出所预测的切割活性。
除了验证携带突变的患者基因组DNA之外或作为其替代，亦可验证患者细胞中的gRNA活性，患者细胞包括但不限于体细胞、干细胞、iPSC或衍生自干细胞的细胞。
(d)gRNA表达载体的构建
将三个具有最高活性及最高脱靶评分的gRNA(g1、g2及g3)借由插入各活性gRNA的双链寡核苷酸盒(double-stranded oligo cassette)而克隆至pX-U6-CBh-Cas9-PurogRNA表达载体中。各盒基于g1、g2及g3的gRNA序列之一者而合成。图15及图16中提供了示意图，其显示出表达载体的构建体及gRNA的插入位点。更详细的图解说明(以g1为例)参见图17，该图显示在U6启动子之后的整个IVT sgRNA序列(SEQ ID NO:55(不包括原型间隔区元件序列或任选地存在的“G”))。插入在各原型间隔区元件(gRNA)序列起始处的“G”核苷酸(SEQ ID NO:59)为任选地存在的。其主要用以增强U6启动子的转录效率。若原型间隔区元件序列以“G”残基开始或若使用非UT启动子(例如，H1启动子)，则不需要该“G”核苷酸。借由限制酶消化及测序验证所有gRNA构建体。
开发三个质粒，其各自表达顶部gRNA(g1、g2或g3)且共同表达hSpCas9及嘌呤霉素抗性基因，即pX459-hSpCas9-2A-Puro(图15及16)，且这三个质粒被包括作为用于基因校正c.802-8_810del17insGC突变的构建体中之一者(参见下表8)。
应理解，引导RNA、Cas蛋白质和/或选择标记物(例如，嘌呤霉素抗性基因和/或GFP、EGFP或RFP)可以包装于一个质粒中或单独的质粒中。此外，当使用多于一个gRNA时(以校正多种突变或校正同一种突变，例如用于与Cas9切口酶一起使用的配对gRNA)，其可以包装于同一载体中或单独的载体中。
除了本文中所描述的质粒载体之外，亦可使用各种其他载体来包装CRISPR基因编辑组分(引导RNA和/或Cas蛋白质)和/或选择标记物，包括但不限于pX458质粒载体、腺相关病毒(AAV)载体和/或慢病毒载体。除了编码CRISPR组分的DNA构建体之外，亦可直接使用或在mRNA构建体或RNP构建体中使用引导RNA、Cas蛋白质和/或选择标记物。
(e)CRISPR RNP的构建及验证
除了载体(例如，如上所述的pX459质粒)中的DNA构建体之外，开发CRISPR核糖核蛋白(RNP)构建体用于g1、g2、g3、g4及g5中的每一者(参见表5及8)。各RNP构建体包含(i)包含相关原型间隔区元件的嵌合单引导RNA(sgRNA)(参见表5及8及本文中的详细说明)；及(ii)形成核糖核蛋白(RNP)复合物的SpCas9蛋白质。在患者基因组DNA中验证各种RNP构建体(sgRNA1:Cas9、sgRNA2:Cas9、sgRNA3:Cas9、sgRNA4:Cas9、sgRNA5:Cas9)在CYP4V2基因的靶位点的切割活性(参见图12、13及14)，如上文在段落(c)中所述。
sgRNA的长度通常为约100nt，但其长度可以变化，包含17nt-22nt原型间隔区元件序列。sgRNA可为IVT衍生的或合成的。如上所述产生及验证对应于g1、g2、g3、g4及g5的IVTsgRNA。如下所述从Synthego(Silicon Valley,CA,USA)定制对应于g1及g2的合成sgRNA。
代替sgRNA，crRNA(示范性序列在SEQ ID NO:53中)及tracrRNA(示范性序列在SEQID NO:54中)双链体可以与Cas蛋白质(例如，Cas9)一起使用，形成CRISPR RNP复合物(crRNA:tracrRNA:Cas9)。当使用Cpf1蛋白质时，不需要tracrRNA。
sgRNA或crRNA:tracrRNA可经化学修饰以避免细胞内RNA降解。举例而言，经化学修饰的合成RNA可以在gRNA(Synthego(Silicon Valley,CA,USA))的5'端及3'端三个碱基处含有2'-O-甲基类似物及3'硫代磷酸酯核苷酸间键合。以给定原型间隔区元件序列(例如，CRISPR g1、g2、g3、g4或g5(参见SEQ ID NO:48至52))为基础的合成sgRNA或crRNA及tracrRNA可在商业上购得，例如购自Synthego Corporation(Silicon Valley,CA,USA)或IDT，且有化学修饰可供选择。
(f)构建供体模板
在同源定向修复(HDR)中，使用供体模板来提供校正靶基因的突变序列所需的供体核酸序列。以单链寡聚脱氧核苷酸(single-stranded Oligo DeoxyNucleotide，ssODN)形式产生两个用于HDR的单独的供体模板。第一个称为CPY4V2供体模板1或CYP4V2 ssODN 1(SEQ ID NO:56)，含有17bp校正且具有如下序列：5'-AGA AAA ATA AAT GAA AGA AAC TAGCAT ATT TTA TAA GAA AAT GTG TTA ACT AGG GTG CAT CCA AGT CCA AAC AGA AGC ATGTGA TTA TCA TTC AAA TCA TAC AGG TCA TCG CTG AAC GGG CCA ATG AAA TGA ACG CCAATG AAG ACT GTA GAG GTG ATG GCA GGG GCT CTG CCC CCT CCA AAA ATA AAC GCA GGGCCT TT-3'；而第二供体模板称为CYP4V2供体模板2或CYP4V2 ssODN 2(SEQ ID NO:57)，为CYP4V2供体模板1的反向互补序列。
任一供体模板均可以与上文所描述的任何gRNA或sgRNA(g1、g2、g3、g4或g5)及Cas9蛋白质一起使用，以产生同源定向修复(HDR)，从而校正目标CYP4V2(c.802-8_810del17insGC)突变。
本文中所提供的供体模板的长度为200nt。可以使用各种长度的供体模板。供体模板相对于靶位点可为对称的或不对称的。供体模板可由含有或编码供体核酸序列的ssDNA、ssODN或载体(例如，质粒或AAV载体)提供。若供体模板具有与CRISPR引导RNA中的原型间隔区元件互补的完整序列及Cas蛋白质所靶向的PAM序列，则为了避免此供体模板在细胞中被Cas蛋白质(例如，Cas9)降解，可以使供体模板突变，例如使供体模板中的Cas9PAM“NGG”突变且将其改为“NGT”或另一非PAM序列。然而，若意欲借由供体模板引入的PAM突变在编码区内，则需要注意确保其为沉默突变。
供体模板可以合成方式制得且可在商业上购得。举例而言，给测序列的DNA寡核苷酸可以定制(
Figure BDA0002437005560001791
DNA寡核苷酸，Integrated DNA Technologies(IDT),Coralville,Iowa,USA)。
(g)Cas蛋白质及选择标记物
CRISPR相关蛋白/核酸酶(Cas)(例如，Cas9或Cpf1)可在商业上购得，包括但不限于由质粒编码或作为重组蛋白质用于RNP构建体中。Cas蛋白质亦可包括一个、两个或更多个核定位序列(NLS)(例如，目录号：1074182，Integrated DNA Technologies(IDT),Coralville,Iowa,USA；目录号：A034a-a-1000，Feldan(Quebec,Canada)；Cpf1：目录号：1076158(IDT))且亦可与选择标记物融合(例如，与EGFP融合的SpCas9蛋白质，目录号：PR-137211-E(Novatein Biosciences,Woburn,MA,USA))。
当将CRISPR基因编辑构建体体外转染于细胞中时，选择标记物可用于评估转染率和/或帮助挑取用于下一步加工的细胞。该过程中可以使用各种选择标记物，包括但不限于荧光(例如，GFP、EGFP、RFP)和/或嘌呤霉素。选择标记物可以与CRISPR构建体的任何组分整合或可以在转染过程中个别提供。举例而言，荧光标记可以与tracrRNA(IDT)或Cas9蛋白质(Novatein Biosciences，目录号：PR-137211-E)组合以方便成像及手动分选或FACS分选经转染细胞。可以在与CRISPR构建体共同转染的载体中提供嘌呤霉素抗性基因以便使用嘌呤霉素进行选择。使用嘌呤霉素所进行的选择在实施例中加以说明。各种类型的选择标记物，诸如抗生素选择标记物(例如，嘌呤霉素)或荧光标记，可在商业上购得且可以整合至CRISPR组分(例如，Cas9蛋白质或CRISPR引导RNA)中或个别地提供(例如，表达嘌呤霉素抗性基因的表达质粒)，包括但不限于：IDT、Sigma Aldrich、Novatein Biosciences、Clonetech Laboratories及InvivoGen。
(h)构建体及推荐方案
下表(表8)显示针对3个gRNA(gRNA1、gRNA2及gRNA3)中的每一者而产生的CRISPR基因编辑构建体(质粒及RNP)。它们含有三个gRNA质粒构建体或相应的sgRNA、两个供体模板(正向及反向互补)及SpCas9蛋白质。
表8.用于CYP4V2突变(c.802-8_810del17insGC)CRISPR基因校正疗法的质粒及RNP构建体1
Figure BDA0002437005560001801
1用于校正BCD患者中最常见的CYP4V2突变c.802-8_810del17insGC突变的构建体。用于校正其他CYP4V2突变的CRISPR gRNA及构建体可以借由使用如本文中所描述的方法来设计及验证。除了质粒及RNP构建体之外，亦可使用其他构建体来提供/表达一个或多个CRISPR组分，其他构建体包括但不限于mRNA及病毒载体。
2编码CRISPR组分(sgRNA及SpCas9蛋白质)及作为选择标记物的嘌呤霉素(Puro)抗性基因的pX459质粒。参见图17，该图显示编码sgRNA的DNA构建体及序列(以g1为例，且图15及16为载体构建体及图谱)。各sgRNA序列含有(a)20nt原型间隔区元件(g1、g2及g3分别为SEQ ID NO:48、49或50)及(b)82nt序列(SEQ ID NO:55(序列以DNA形式显示，包括于质粒DNA中；对于RNA序列，使用“U”替代DNA序列中的“T”)。pX459载体含有“G”核苷酸(SEQ IDNO:59及图17)，该核苷酸紧接在人类U6启动子序列之后且在原型间隔区元件序列之前，用以增强由U6启动子驱动的转录效率，其亦包括于IVT衍生的sgRNA中。亦可将CRISPR组分(gRNA及Cas蛋白质)克隆于其他载体中，包括但不限于诸如慢病毒载体或AAV载体的病毒载体。CRISPR gRNA及Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)可以克隆于单独的载体中或一个载体中。
3基于各种原型间隔区元件的sgRNA(CYP4V2 g1、CYP4V2 g2或CYP4V2 g3，分别参见表5及SEQ ID NO:48、49或50)。IVT sgRNA参见以上说明。除了IVT sgRNA之外，亦可从Synthego Corporation(Silicon Valley,CA,USA)订购具有化学修饰的合成sgRNA。可以使用crRNA(包含CYP4V2 g1、g2或g3的20nt原型间隔区序列及crRNA的剩余序列(示范性序列显示于SEQ ID NO:53中))及tracrRNA(示范性序列显示于SEQ ID NO:54中)双链体来替代sgRNA。
4用于同源定向修复(HDR)的供体模板。亦可使用不同长度的供体模板，且这些供体模板可以不同形式构建，其包括但不限于以ssODN形式或以载体形式(例如，腺相关病毒(AAV)载体(例如，AAV2或AAV6))。
各试剂的浓度为约1000(ng/μL)。
以下方案用于经由电穿孔及核转染将CYP4V2突变CRISPR基因修复构建体递送至患者iPSC。亦可使用其他方法，包括但不限于脂质体转染、病毒载体转导(例如，慢病毒或AAV载体(例如，使用AAV6来递送供体模板)或显微注射。使用第11代至第14代P1 iPSC。
1号方案(使用质粒电穿孔)：
1.根据
Figure BDA0002437005560001811
转染系统(Life Technologies)说明书，将含有2.5μg(2.5μl储备液)pX459.gRNA(项目#1或2或3。不组合gRNA)及2.5μg(2.5μl储备液)ssODN(项目#7或8)的混合物用于约100万个细胞。
2.施加电穿孔(EP)条件：a)1100V，30ms，1个脉冲；或b)1200V，30ms，1个脉冲。
3.在EP之后，将细胞均匀地分至含有Rock抑制剂(10μM)的6孔板的3个孔中。
4.在涂板后两天，添加嘌呤霉素，如表9中所指示。
5.在添加嘌呤霉素后两天，用新鲜的无嘌呤霉素培养基替换用过的培养基。
6.将培养物维持2周，然后挑取集落。
表9.用于受疾病影响的iPSC的条件及嘌呤霉素浓度水平
Figure BDA0002437005560001821
2号方案(使用RNP电穿孔)：
1.使用冰桶。在冰上解冻一个sgRNA(项目#4或5或6；不组合gRNA)、一个ssODN供体模板(项目#7或8)及SpCas9蛋白质(项目#9)以及Cas9-Puro表达载体。Cas9-Puro表达载体用作选择标记物。其为pX459-hSpCas9-2A-Puro质粒且具有图15中所示的结构，但其不克隆至gRNA中。
2.清楚地标记1.7ml微量离心管及6孔板。为各样品准备一个微量离心管及1个孔。向各孔中添加3ml培养基(来自StemCell Technologies的TeSR-E8(目录号05940))。
3.准备一个含有25ml PBS的10cm培养皿以洗涤
Figure BDA0002437005560001822
尖端。
4.制备6孔板用于涂板经电穿孔的细胞。向各孔中添加3ml培养基。
5.在各微量离心管中，添加4μg(4μl储备液)sgRNA(项目4、5或6。不组合sgRNA)及10μg(10μl储备液)SpCas9蛋白质(项目#9)，使管在室温下达至少10分钟。
6.在各管中添加5μg(5μl储备液)ssODN(项目#7或8)及2.5μg(2.5μl储备液)Cas9-Puro表达载体。
7.将细胞再悬浮于适当的
Figure BDA0002437005560001831
EP缓冲液R中，达到1×107个细胞/毫升的最终密度。
8.将105μL细胞悬浮液等分且添加至含有CRISPR RNP混合物的各微量离心管中。
9.向
Figure BDA0002437005560001832
移液器中添加3ml缓冲液E2且将
Figure BDA0002437005560001833
移液器置于
Figure BDA0002437005560001834
移液器放置台上。
10.使用100μL
Figure BDA0002437005560001835
尖端。从各微量离心管吸出100μL EP混合物且将其插入
Figure BDA0002437005560001836
移液器中。
11.施加上表9中的一种EP条件且遵循上文1号方案的步骤3至6。
注意：若iPSC生长的不好，则推荐条件培养基。收集用过的培养基(无嘌呤霉素)并过滤该培养基，以除去细胞碎片。以1:1的比率混合用过的培养基与新鲜培养基。推荐使用基质胶(Corning目录号354277)及来自StemCell Technologies的培养基TeSR-E8(目录号05940)在整个基因编辑过程中于无饲养条件下培养人类iPSC。在EP后涂板细胞时向培养基中添加Rock抑制剂(最终浓度10μM)达48小时将有助于保持细胞活力。
3号方案(使用RNP核转染)：
1.Lonza 4D-核转染，参数设置：Lonza程序，DS-150
2.分开制备RNP(cas9+gRNA)及ssODN(使体积最大为10μL)，使用前混合。参见表10。
(1)gRNA1+CYP4V2正向ssODN(2)gRNA2+CYP4V2正向ssODN
(3)gRNA1+CYP4V2反向ssODN(4)gRNA2+CYP4V2反向ssODN
表10
Figure BDA0002437005560001837
试剂盒缓冲液/各组 体积(μL)/样品 4个样品(μL)
溶液 16.4 65.6
补充剂 3.6 14.4
3.收集并计数细胞：5*105个iPS细胞
4.借由轻轻地上下移液3-5次，用RNP+ssODN(10μL)悬浮细胞
5.向细胞悬浮液中添加Lonza试剂盒缓冲液20μL，将核转染前的孵育时间降到最低。
6.将混合物(30μL)加载至Lonza试剂盒孔中。检查阻抗。
7.使用设置参数(DS150)对细胞进行电穿孔。
8.借由将70μL mTeSR(含有Rock抑制剂)直接加入试剂盒孔中，轻轻地再悬浮经电穿孔的细胞。
9.将细胞涂板在6孔板的一个孔中的传代培养基中。
10.在电穿孔后24小时观测细胞活力，并用培养用的培养基替换培养基。
注意：此方案不使用选择标记物。挑取核转染存活细胞进行单细胞扩增。除了Lonza DS-150程序之外，亦可使用诸如CB-150的其他参数。
实施例22-产生经基因修复的患者细胞系且在产生经基因修复的患者细胞系时及 在眼部细胞疗法中使用RNP
含有CRISPR g1或g2(项目#1或2)的表达质粒构建体及含有sgRNA1或sgRNA2(项目#4或5，Synthego,Silicon Valley,CA,USA)及SpCas9(项目#9，目录号：A034a-a-1000，来自Feldan(Quebec,Canada)，或来自Synthego(例如，酿脓链球菌Cas9核酸酶2NLS)的CRISPRRNP构建体以及CYP4V2供体模板(项目#7或#8，ssODN，Ultramer DNA寡核苷酸，IntegratedDNA Technologies(IDT),Coralville,Iowa,USA)中的每一者，皆用于转染携带c.802-8_810del17insGC突变的患者iPSC。
借由同源定向修复(HDR)评定基因校正：
在转染后，收集所挑取的细胞进行PCR，然后进行靶向扩增子测序，以评定含有c.802-8_810del17insGC突变的CYP4V2区域中的基因校正。经转染细胞的深度测序显示，读段含有精确的突变校正，借由插入17bp“TCATACAGGTCATCGCT”且缺失“GC”，促使将突变校正为野生型序列(SEQ ID NO:47)。任何未转染的对照组iPSC中看不到突变校正。结果亦能供作为经转染细胞中的HDR频率的指示。
获得具有最小脱靶编辑或没有脱靶编辑的iPS克隆：
在评定HDR之后，再次在携带c.802-8_810del17insGC突变的患者iPSC中进行转染。经转染细胞经历单细胞克隆及扩增。然后经由测序评定确认具有中靶HDR的克隆细胞系的脱靶编辑。对于临床应用，使用全基因组测序(60×覆盖率)来比较同一患者的经编辑及未转染的细胞系。选择没有脱靶编辑或脱靶编辑最小且在基因组中已知没有重大不利后果的经编辑克隆iPS细胞系。
将经基因校正的iPS分化成所期望类型的细胞
然后将所选择的iPS克隆细胞系分化成iPS-RPE细胞(参见本文中的实施例)。所选择的iPS克隆细胞系可以分化成期望在细胞疗法中使用的其他类型的细胞(例如，iPS-RPE细胞、iPS-PRC、iPS-CE细胞、iPS-CEC或其他iPS-眼部细胞)。
用以确认经基因修复的iPS或iPS衍生的细胞不再具有表型的生物分析
测试经基因校正(或经基因修复)的iPS-RPE细胞的生化功能(参见本文中的实施例)并确认其不再具有如未经处理的患者iPS-RPE细胞中所看到的表型。检测经基因修复的患者iPS-RPE细胞中的CYP4V2表达。
不同于引起所编码的CRISPR组分(例如，gRNA、Cas核酸酶和/或供体模板)的持久表达的质粒或其他载体构建体(例如，AAV、慢病毒)，CRISPR RNP构建体起效快(fast on)且停止作用亦快(fast off)。RNP构建体的组分在经转染细胞中相对较快地降解。因此，与质粒及其他构建体相比，使用RNP构建体能降低脱靶编辑风险。这使得RNP构建体特别适合临床应用，诸如用于产生适合移植的经基因修复的患者细胞，以及体内治疗(例如，将RNP构建体注射至受试者的眼睛进行体内基因校正)。除了治疗BCD之外，本文中所提供的CRISPRRNP构建体及方法亦可用于治疗其他疾病，包括与表4中所阐述的突变的或有缺陷的基因相关的疾病。
实施例23：在眼部细胞疗法中使用经基因修复的细胞
可以将经基因修复的iPS-RPE细胞、iPS-PRC、iPS-CEC、iPS-CE细胞或其他iPS-眼部细胞移植至患者的眼睛作为一种眼部细胞疗法。举例而言，它们可用作BCD患者中的死的或退化的RPE细胞、光感受器或其他眼部细胞的自体替代细胞。经基因修复的细胞可以直接移植(例如，细胞悬浮液)或以其他形式移植，包括但不限于作为层、层片、基质、支架或组织的一部分。移植中所用的经基因修复的细胞的量视以下因素而定：靶向替代的细胞类型、需要替代细胞的区域的大小及待治疗的受试者(例如，待治疗受试者的年龄、性别、体重、疾病及病状的发展阶段)；给药途径；移植位置(例如，视网膜对比角膜)；移植形式(例如，细胞悬浮液对比作为层、层片、基质、支架或组织的一部分)；及所需的摄生法。单次移植给一只眼睛的指定细胞类型(例如RPE细胞、光感受器、CEC或CE细胞)的细胞的量可以在约1,000个细胞至1000万个细胞的范围内。
必要时，可以在用于临床使用的GMP设施中制造细胞。用于细胞疗法产品的GMP设施可经由研究机构、合同制造组织(CMO)及合同研究机构(CRO)而在商业上获得，例如经由凯斯西储大学(Case Western Reserve University)的细胞疗法综合服务(CellularTherapy Integrated Services)、贝勒医学院(Baylor College of Medicine)的细胞及基因疗法中心(Center for Cell and Gene Therapy)、CELLforCURE、纽约干细胞基金会(NewYork Stem Cell Foundation)及Lonza获得。
对于视网膜退化疾病，包括受RPE退化影响的疾病，诸如年龄相关性黄斑退化(AMD)，患者特异性自体给药可以使用与在同种异体眼部细胞疗法(例如，胚胎干细胞衍生的RPE(ES-RPE)移植)中所用的相同的给药/递送方法。此类给药/手术方法为此项技术中已知的。
实施例24-针对眼部疾病的基因疗法及细胞疗法组合治疗
本文中的揭示内容描述了在针对BCD的基因疗法及细胞疗法中使用的组合物及方法。对于眼部疾病，基因疗法及细胞疗法各自有其自身的优缺点。一方面，基因疗法在疾病早期至中期，当患者仍留有大量视网膜(或眼部)细胞来接受基因疗法治疗并得到基因疗法治疗的拯救时，效果较好。然而，基因疗法对于没有剩下相关眼部细胞(例如，RPE或PRC)的晚期患者效果不好或根本不起作用。另一方面，细胞疗法提供替代细胞来替代患者眼中的死的或退化的细胞，且相对于基因疗法，有其自己的优势，特别是对于晚期患者及显性遗传性疾病而言。然而，细胞疗法不能拯救患者眼中剩余的“原始”细胞，这些细胞的存活不仅能保留患者的剩余视力，而且有助于整合替代细胞。
为了解决基因疗法及细胞疗法的限制并给患者带去最大益处，开发一种针对BCD的基因疗法及细胞疗法组合治疗方法，其亦可用于其他眼部疾病。
该方法包含：
(a)在体内在患者的眼睛中施加基因疗法(例如，AAV.CYP4V2基因疗法或CRISPR基因校正疗法)；及
(b)体外产生经基因修复的患者特异性自体iPS-眼部细胞(例如，iPS-RPE细胞、iPS-PRC、iPS-CE细胞、iPS-CEC或其他类型的受该疾病影响的眼部细胞)且将这些细胞移植至患者的眼睛中。
其中(a)及(b)可以依序施加(先(a)后(b)，或先(b)后(a))或同时施加(例如，在一次给药中注射基因疗法载体及细胞)。(a)或(b)各自可向同一只眼睛施加一次或多次。视疾病、疾病阶段及患者的个体情况而定，(a)及(b)可以靶向相同类型或不同类型的眼部细胞。举例而言，在BCD的情况下，由泛在启动子驱动的基因疗法载体能引起RPE细胞、光感受器及其他视网膜细胞中的CYP4V2表达，而细胞疗法则可集中于提供经再生的RPE细胞和/或光感受器。
在此情况下，细胞疗法可以借由提供新细胞(例如，RPE或光感受器细胞)来获益，而基因疗法可以借由拯救剩余的RPE或光感受器细胞和/或借由改善脉络膜细胞的状况来改善细胞疗法的效果，脉络膜细胞的健康影响眼部细胞的状况。基因疗法与细胞疗法各自对应的“拯救”与“替代”作用的组合使组合治疗变成了基因疗法或细胞疗法的改良方案。此组合治疗方法可应用于由一个或多个遗传突变引起的眼部疾病及其他疾病，包括但不限于与表4中所阐述的突变的或有缺陷的基因相关的疾病。
应理解，虽然本文中已结合多个不同方面描述了标的方法及组合物，但是以上对各个方面的描述是意欲用以说明而非限制标的方法及组合物的范畴。其他方面、优势及修改在所附权利要求的范畴内。
所公开的为可用于、可联合用于、可用于制备或作为所公开方法及组合物的产品的方法及组合物。本文中公开这些及其他材料，且应理解，本文亦公开了这些方法及组合物的组合、子集、相互作用、群组等。亦即，虽然这些组合物及方法的每种不同个体及集体组合及变更的具体参照可能未被明确公开，但在本文中具体考量并描述了每一者。举例而言，若公开并论述了特定标的组合物或特定方法且论述了多种组合物或方法，则这些组合物及这些方法的每一种组合及变更都是经过具体考量的，除非有特别指出相反的情况。同样地，这些的任何子集或组合亦经具体考量并公开。
序列
序列表
*除非另外注释，否则序列中所用的所有参考编号均为NCBI参考编号。
第I部分：基因疗法序列
A.cDNA及功能性CYP4V2蛋白质序列
SEQ ID NO:1-编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)的cDNA序列(1578bp)，本文中称为CYP4V2st。
SEQ ID NO:2-编码人类CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:4)的密码子最佳化的cDNA序列(1578bp)，本文中称为CYP4V2op。
SEQ ID NO:3-编码功能性CYP4V2蛋白质(SEQ ID NO:5)的cDNA序列(1578bp)，本文中称为CYP4V2fv。
SEQ ID NO:4-人类CYP4V2蛋白质(NP_997235.3)的氨基酸序列(525aa)
SEQ ID NO:5-人类CYP4V2蛋白质的功能变异体的氨基酸序列(525aa)
SEQ ID NO:6-人类CYP4V2蛋白质的不含跨膜结构域的片段(490aa)
SEQ ID NO:7-人类CYP46A1的氨基酸序列
SEQ ID NO:8-人类CYP4A11的氨基酸序列
SEQ ID NO:9-人类CYP4A22的氨基酸序列
SEQ ID NO:10-人类CYP4B1的氨基酸序列
SEQ ID NO:11-人类CYP4F2的氨基酸序列
SEQ ID NO:12-人类CYP4F3的氨基酸序列
SEQ ID NO:13-人类CYP4F8的氨基酸序列
SEQ ID NO:14-人类CYP4F11的氨基酸序列
SEQ ID NO:15-人类CYP4F12的氨基酸序列
SEQ ID NO:16-人类CYP4F22的氨基酸序列
SEQ ID NO:17-人类CYP4X1的氨基酸序列
SEQ ID NO:18-人类CYP4Z1的氨基酸序列
SEQ ID NO:19-黑猩猩CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:20-恒河猴CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:21-狗CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:22-牛CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:23-家鼠CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:24-挪威大鼠(Norway rat)CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:25-鸡CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:26-热带爪蛙CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:27-马CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:28-兔CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:29-果蝇CYP4V2的氨基酸序列
SEQ ID NO:30-P450特征元件序列
SEQ ID NO:31-P450特征元件序列
B.示范性调节序列及ITR序列
SEQ ID NO:32-CAG启动子序列
SEQ ID NO:33-WPRE增强子序列
SEQ ID NO:34-bGH PolyA序列
SEQ ID NO:35-EFS启动子序列
SEQ ID NO:36-小polyA(SPA)序列
SEQ ID NO:37-科札克序列
SEQ ID NO:38-科札克序列
SEQ ID NO:39-SV40晚期PolyA序列
SEQ ID NO:40-CMV启动子序列
SEQ ID NO:41-EF-1α启动子序列
SEQ ID NO:42-AAV2 5'左侧-ITR序列
SEQ ID NO:43-AAV2 3'右侧-ITR序列
SEQ ID NO:44-scAAV中所用的突变型AAV2 5'ITR序列
SEQ ID NO:45-scAAV中所用的AAV2 3'ITR序列
第II部分.细胞疗法序列
SEQ ID NO:46-含有c.802-8_810del17insGC突变的人类CYP4V2基因区域
SEQ ID NO:47-不含c.802-8_810del17insGC突变的野生型人类CYP4V2基因区域
SEQ ID NO:48-gRNA1
SEQ ID NO:49-gRNA2
SEQ ID NO:50-gRNA3
SEQ ID NO:51-gRNA4
SEQ ID NO:52-gRNA5
SEQ ID NO:53-crRNA示范性序列
SEQ ID NO:54-tracrRNA示范性序列
SEQ ID NO:55-sgRNA示范性序列
SEQ ID NO:56-供体模板1序列
SEQ ID NO:57-供体模板2序列
SEQ ID NO:58-SpCas9氨基酸序列
SEQ ID NO:59-在质粒构建体中及在IVT sgRNA中紧接在U6启动子序列之后且在原型间隔区元件序列之前插入的额外核苷酸
第III部分：CYP4V2表达盒序列(包括AAV ITR及接合/连接序列)。
SEQ ID NO:60-AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op中的CYP4V2表达盒的序列。
SEQ ID NO:61-AAV5.CYP4V2st中的CYP4V2表达盒的序列。AAV5.CYP4V2st与AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op(SEQ ID NO:60)具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)，但是CYP4V2 cDNA及接合/连接序列不同。
SEQ ID NO:62-AAV8.CYP4V2fv中的CYP4V2表达盒的序列。AAV8.CYP4V2fv与AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO:61)具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及接合/连接序列且仅CYP4V2 cDNA序列不同。
SEQ ID NO:63-AAV5.CYP4V2op(新)中的CYP4V2表达盒的序列。AAV5.CYP4V2op(新)与AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO:61)及AAV8.CYP4V2fv(SEQ ID NO:62)具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的接合/连接序列，但是CYP4V2 cDNA序列不同。
SEQ ID NO:64-scAAV1.CYP4V2op、scAAV5.CYP4V2op及scAAV9.CYP4V2op中的CYP4V2表达盒的序列。
序列
SEQ ID NO:1(CYP4V2st cDNA，1578bp)
Figure BDA0002437005560001911
SEQ ID NO:2(CYP4V2op cDNA，1578bp)
Figure BDA0002437005560001921
SEQ ID NO:3(CYP4V2fv cDNA，1578bp)
Figure BDA0002437005560001922
SEQ ID NO:4(人类CYP4V2蛋白质，NP_997235.3，525aa)
Figure BDA0002437005560001923
SEQ ID NO:5(人类CYP4V2蛋白质的功能变异体；525aa)
Figure BDA0002437005560001924
SEQ ID NO:6(CYP4V2的功能片段(缺乏跨膜结构域；490aa)
Figure BDA0002437005560001931
SEQ ID NO:7(CYP46A1，NP_006659，500 aa)
Figure BDA0002437005560001932
SEQ ID NO:8(CYP4A11，NP_000769，519 aa)
Figure BDA0002437005560001933
SEQ ID NO:9(CYP4A22，NP_001010969，519 aa)
Figure BDA0002437005560001934
SEQ ID NO:10(CYP4B1，NP_000770，511 aa)
Figure BDA0002437005560001935
SEQ ID NO:11(CYP4F2，NP_001073，520 aa)
Figure BDA0002437005560001936
SEQ ID NO:12(CYP4F3，NP_000887，520 aa)
Figure BDA0002437005560001941
SEQ ID NO:13(CYP4F8，NP_009184，520 aa)
Figure BDA0002437005560001942
SEQ ID NO:14(CYP4F11，NP_067010，524 aa)
Figure BDA0002437005560001943
SEQ ID NO:15(CYP4F12，NP_076433，524 aa)
Figure BDA0002437005560001944
SEQ ID NO:16(CYP4F22，NP_775754，531 aa)
Figure BDA0002437005560001945
SEQ ID NO:17(CYP4X1，NP_828847，509 aa)
Figure BDA0002437005560001951
SEQ ID NO:18(CYP4Z1，NP_835235，505aa)
Figure BDA0002437005560001952
SEQ ID NO:19(细胞色素P450 4V2同功型(isoform)X1[黑猩猩(Pantroglodytes)(黑猩猩(chimpanzee))]，XP_001165629.1，525aa)
Figure BDA0002437005560001953
SEQ ID NO:20(细胞色素P450 4V2[猕猴(恒河猕猴、恒河猴)]，NP_001180767.1，525aa)
Figure BDA0002437005560001954
SEQ ID NO:21(细胞色素P450 4V2[家犬(狗)]，XP_013975571.1，539aa)
Figure BDA0002437005560001955
SEQ ID NO:22(细胞色素P450 4V2[牛(Bos taurus)(牛(cattle))]，NP_001029545，527aa)
Figure BDA0002437005560001961
SEQ ID NO:23(Cyp4v3，细胞色素P450 4V2[小家鼠(家鼠)]，NP_598730.1，525aa)
Figure BDA0002437005560001962
SEQ ID NO:24(Cyp4v3，细胞色素P450 4V2[褐家鼠(挪威大鼠)]，NP_001129072，525aa)
Figure BDA0002437005560001963
SEQ ID NO:25(细胞色素P450 4V2[原鸡(Gallus gallus)(鸡)]，NP_001001879，530aa)
Figure BDA0002437005560001964
SEQ ID NO:26(细胞色素P450家族4亚家族V成员2[热带爪蟾(热带爪蛙)]，NP_001072667.1，523aa)
Figure BDA0002437005560001965
SEQ ID NO:27(细胞色素P450 4V2[马(Equus caballus)(马(horse))]，XP_014592182.1，469aa)
Figure BDA0002437005560001971
SEQ ID NO:28(细胞色素P450 4V2[穴兔(兔)]，XP_002709379.1，524aa)
Figure BDA0002437005560001972
SEQ ID:29(细胞色素P450-4c3[黑腹果蝇(果蝇)]，NP_524598，535aa)
Figure BDA0002437005560001973
SEQ ID NO:30(P450特征元件，“x”表示任何氨基酸)
FxxGxxxCxG
SEQ ID NO:31(P450特征元件，“x”表示任何氨基酸)
ExxR
SEQ ID NO:32(CAG启动子，1715bp)
Figure BDA0002437005560001974
Figure BDA0002437005560001981
SEQ ID NO:33(WPRE增强子，589bp)
Figure BDA0002437005560001982
SEQ ID NO:34(bGH polyA，225bp)
Figure BDA0002437005560001983
SEQ ID NO:35(EFS启动子，235bp)
Figure BDA0002437005560001984
SEQ ID NO:36(SPA，54bp)
Figure BDA0002437005560001985
SEQ ID NO:37(科札克序列，6bp)
GCCACC
SEQ ID NO:38(科札克序列，5bp)
CCACC
SEQ ID NO:39(SV40晚期PolyA，120bp)
Figure BDA0002437005560001986
SEQ ID NO:40(CMV启动子，576bp)
Figure BDA0002437005560001987
SEQ ID NO:41(EF-1α启动子，1184bp)
Figure BDA0002437005560001991
SEQ ID NO:42(AAV2 5'左侧-ITR，141bp)
Figure BDA0002437005560001992
SEQ ID NO:43(AAV2 3'右侧-ITR，141bp)
Figure BDA0002437005560001993
SEQ ID NO:44(scAAV构建体中的突变型AAV2 5'ITR，117bp)
Figure BDA0002437005560001994
SEQ ID NO:45(scAAV构建体中的AAV2 3'ITR，141bp)
Figure BDA0002437005560001995
SEQ ID NO:46(含有c.802-8_810del17insGC突变的人类CYP4V2基因区域)
Figure BDA0002437005560001996
SEQ ID NO:47(不含c.802-8_810del17insGC突变的野生型人类CYP4V2基因区域)
Figure BDA0002437005560001997
SEQ ID NO:48(g1原型间隔区元件，RNA序列，20nt)
Figure BDA0002437005560001998
SEQ ID NO:49(g2原型间隔区元件，RNA序列，20nt)
Figure BDA0002437005560001999
SEQ ID NO:50(g3原型间隔区元件，RNA序列，20nt)
Figure BDA00024370055600019910
SEQ ID NO:51(g4原型间隔区元件，RNA序列，20nt)
Figure BDA00024370055600019911
SEQ ID NO:52(g5原型间隔区元件，RNA序列，20nt)
Figure BDA0002437005560002001
SEQ ID NO:53(crRNA示范性序列(不包括5'原型间隔区元件序列，16nt)
Figure BDA0002437005560002002
SEQ ID NO:54(tracrRNA示范性序列，67nt)
Figure BDA0002437005560002003
SEQ ID NO:55(sgRNA示范性序列，不包括5'原型间隔区元件序列及在原型间隔区元件前任选地存在的“G”。序列以DNA形式显示，如在质粒构建体中。对于呈RNA形式的序列，使用“U”替代“T”，82nt)
Figure BDA0002437005560002004
SEQ ID NO:56(CYP4V2供体模板1序列，200bp)
Figure BDA0002437005560002005
SEQ ID NO:57(CYP4V2供体模板2序列，CYP4V2供体模板1序列的反向互补序列，200bp)
Figure BDA0002437005560002006
SEQ ID NO:58(SpCas9示范性氨基酸序列(1368aa))
Figure BDA0002437005560002007
SEQ ID NO:59(在质粒构建体中及在IVT sgRNA中紧接在U6启动子序列之后且在原型间隔区元件序列之前插入的额外核苷酸，1nt)
Figure BDA0002437005560002008
SEQ ID NO:60-AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op中的CYP4V2表达盒的序列：
左侧-ITR：1-141
CAG启动子：237-1951
CYP4V2op cDNA：2002-3579
WPRE增强子：3736-4324
bGH polyA：4350-4574
右侧-ITR 4659-4799
Figure BDA0002437005560002011
Figure BDA0002437005560002021
Figure BDA0002437005560002031
SEQ ID NO:61-AAV5.CYP4V2st中的CYP4V2表达盒的序列。AAV5.CYP4V2st与AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op(SEQ ID NO:60)具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)，但是CYP4V2 cDNA及接合/连接序列不同：
左侧-ITR：1-141
CAG启动子：166-1880
CYP4V2st cDNA：1938-3515
WPRE增强子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右侧-ITR：4399-4539
Figure BDA0002437005560002032
Figure BDA0002437005560002041
Figure BDA0002437005560002051
SEQ ID NO:62-AAV8.CYP4V2fv中的CYP4V2表达盒的序列。AAV8.CYP4V2fv与AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO:61)具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及接合/连接序列且仅CYP4V2 cDNA序列不同：
左侧-ITR：1-141
CAG启动子：166-1880
CYP4V2fv cDNA：1938-3515
WPRE增强子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右侧-ITR：4399-4539
Figure BDA0002437005560002061
Figure BDA0002437005560002071
SEQ ID NO:63-AAV5.CYP4V2op(新)中的CYP4V2表达盒的序列。AAV5.CYP4V2op(新)与AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO:61)及AAV8.CYP4V2fv(SEQ ID NO:62)具有相同的启动子(CAG)、增强子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的接合/连接序列，但是CYP4V2 cDNA序列不同：
左侧-ITR：1-141
CAG启动子：166-1880
CYP4V2op cDNA：1938-3515
WPRE增强子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右侧-ITR：4399-4539
Figure BDA0002437005560002081
Figure BDA0002437005560002091
SEQ ID NO:64-scAAV1.CYP4V2op、scAAV5.CYP4V2op及scAAV9.CYP4V2op中的CYP4V2表达盒的序列。
左侧-ITR(截短)：1-117
EFS启动子：130-364
CYP4V2op cDNA：520-2097
SPA：2116-2169
右侧-ITR：2263-2403
Figure BDA0002437005560002092
Figure BDA0002437005560002101
Figure BDA0002437005560002111

Claims (334)

1.一种用于治疗或预防人类受试者的眼部疾病的组合物，其包含载体，所述载体包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至一个或多个调节序列的编码功能性或非突变型CYP4V2蛋白质的核酸分子或其非病原性变异体，其中该疾病与眼部细胞的功能障碍、变性、病症、退化、萎缩和/或死亡相关。
2.一种用于预防、遏制、减缓进展、治疗或改善眼部细胞的功能障碍、变性、病症、退化、萎缩和/或死亡的组合物，其包含载体，该载体包含表达盒，该表达盒包含可操作地连接至一个或多个调节序列的编码功能性或非突变型CYP4V2蛋白质的核酸分子或其非病原性变异体。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中该眼部疾病或眼部细胞退化为在CYP4V2基因中存在双等位基因突变的遗传性视网膜退化(IRD)或视网膜色素变性(RP)。
4.根据权利要求1、2或3的组合物，其中该疾病或该眼部细胞退化与结晶样视网膜色素变性(亦称为结晶样角膜视网膜变性；BCD)相关。
5.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其中该载体为病毒载体、质粒或非病毒载体。
6.根据权利要求5的组合物，其中该病毒载体选自由以下组成的群：腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体及逆转录病毒载体。
7.根据权利要求5或6的组合物，其中该载体为重组AAV载体(rAAV)。
8.根据权利要求5、6或7的组合物，其中该rAAV中的AAV基因组或AAV衣壳蛋白来自以下中的任一者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV的另一血清型或分离株或分支、或其任何衍生物、变异体或杂合体。
9.根据权利要求5至8中任一项的组合物，其中该rAAV为假型化AAV(例如，AAV2/5、AAV2/8、AAV2/1、AAV2/9、AAV2/6、AAV2/4、AAV2/6、AAV5/2、AAV8/1、AAV8/2、AAV2/7、AAV2/12及AAV2/10)或杂合AAV(例如，AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9)。
10.根据权利要求5至9中任一项的组合物，其中该rAAV包含一个或多个衣壳突变(例如，Y-F、K-R、T-A、S-A和/或T-V突变(例如，AAV2具有Y444F、Y500F、Y730F、Y252F、Y272F、Y700F、Y704F及T491V中的一个或多个衣壳突变，或针对不同AAV血清型的相应突变(例如，AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV2(四Y-F+T-V(quadY-F+T-V))或AAV2/8(Y733F))))。
11.根据权利要求5至10中任一项的组合物，其中该rAAV的血清型选自或衍生自由以下组成的群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Anc80、rh10和/或ShH10。
12.根据权利要求5至11中任一项的组合物，其中该rAAV选自或衍生自由以下组成的群：AAV2/5、AAV2/8、AAV2/2、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV2/1、AAV2/9、AAV2/8(Y733F)、AAV2/6、AAV2/4、AAV2/7、AAV5、AAV2、AAV8、AAV1、AAV9、AAV6、AAV10、AAV4、AAV7、AAV12、Anc80、AAV 7m8、AAV-DJ、ShH10、AAV-PHP.B，或其杂合体、衍生物或变异体。
13.根据权利要求5至12中任一项的组合物，其中该rAAV载体为单链AAV载体或自身互补型AAV(scAAV)载体。
14.根据权利要求5的组合物，其中该载体为质粒、裸核酸、脂质体(例如，阳离子或阴离子脂质体)、树状体、纳米颗粒、聚合物(例如，聚合复合物)、脂质-聚合物系统、固体脂质纳米颗粒或脂质体鱼精蛋白/DNA脂质复合物(LPD)。
15.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中由该核酸序列编码的该功能性或非突变型CYP4V2蛋白质包含多肽，该多肽与选自由SEQ ID NO:4-6组成的群的序列中的任意者具有至少80％氨基酸序列同一性(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。
16.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该核酸分子与SEQ ID NO:1、2或3中的序列中的任意者具有至少75％序列同一性。
17.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该核酸分子与SEQ ID NO:1、2或3中的序列中的任意者具有至少80％序列同一性。
18.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该核酸分子包含SEQ ID NO:1、2或3中所示的序列。
19.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该核酸分子包含密码子最佳化的序列，其编码包含选自SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列的蛋白质。
20.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该调节序列包含启动子。
21.根据权利要求20的组合物，其中该启动子为RPE细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、角膜细胞特异性启动子、眼部细胞特异性启动子或组成型启动子。
22.根据权利要求20的组合物，其中该启动子为β肌动蛋白启动子或病毒启动子或其杂合体。
23.根据权利要求20的组合物，其中该启动子选自由以下组成的群：CAG启动子(杂合CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白启动子，亦称为CAGGS启动子、CB启动子或CBA启动子)、鸡β肌动蛋白启动子、小CBA(smCBA)启动子、CBSB启动子或CBh启动子、诸如人类β肌动蛋白启动子的另一β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短型(EFS)启动子、延伸因子1α(EF-1α)启动子、CMV启动子、PGK启动子、UBC启动子、GUSB启动子、UCOE启动子、VMD2(卵黄状黄斑变性2；亦称为BEST1)启动子、RPE65启动子、或其杂合体、变异体或衍生物。
24.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该调节序列为选自由以下组成的群的多腺苷酸化(polyA)信号：牛生长激素多腺苷酸化信号(bGH polyA)、小polyA信号(SPA)、人类生长激素多腺苷酸化信号(hGH polyA)、SV40polyA信号、SV40晚期polyA信号、或其衍生物、杂合体及变异体。
25.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该调节序列包含科扎克序列。
26.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该调节序列包含增强子。
27.根据权利要求26的组合物，其中该增强子为病毒增强子，包括但不限于WPRE增强子、HPRE增强子、CTE增强子，或其衍生物或杂合体或变异体。
28.一种用于治疗或预防BCD或用于制造用于治疗或预防BCD的组合物的组合物，其包含与SEQ ID NO:60至64中的CYP4V2表达盒序列中的任意者共用至少80％序列同一性的核酸分子。
29.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该组合物以药学上可接受的载剂及适合用于特定给药途径的额外组分来配制。
30.一种治疗或预防人类受试者的眼部疾病的方法，该方法包含向该受试者施用载体，其中该载体包含表达盒，该表达盒包含可操作地连接至一个或多个调节序列的编码功能性或非突变型CYP4V2蛋白质的核酸分子或其非病原性变异体，其中该疾病与眼部细胞的功能障碍、变性、病症、退化、萎缩和/或死亡相关。
31.一种预防、遏制、减缓进展、治疗或改善眼部细胞的功能障碍、变性、病症、退化、萎缩和/或死亡的方法，该方法包含递送载体至该眼部细胞，其中该载体包含表达盒，该表达盒包含可操作地连接至一个或多个调节序列的编码功能性或非突变型CYP4V2蛋白质的核酸分子或其非病原性变异体。
32.根据权利要求30或31的方法，其中所述眼部细胞为视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器细胞和/或脉络膜上皮细胞。
33.根据权利要求30或31的方法，其中该眼部疾病或眼部细胞退化为在CYP4V2基因中存在双等位基因突变的遗传性视网膜退化(IRD)或视网膜色素变性(RP)。
34.根据权利要求30或31的方法，其中该疾病或该眼部细胞退化与结晶样视网膜色素变性(亦称为结晶样角膜视网膜变性；BCD)相关。
35.根据权利要求30至34中任一项的方法，其中该载体为病毒载体、质粒或非病毒载体。
36.根据权利要求35的方法，其中该病毒载体选自由以下组成的群：腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体及逆转录病毒载体。
37.根据权利要求36的方法，其中该载体为重组AAV载体(rAAV)。
38.根据权利要求37的方法，其中该rAAV包含AAV基因组或其衍生物，和/或AAV衣壳蛋白或其衍生物或变异体。
39.根据权利要求37或38的方法，其中该rAAV为嵌合AAV、改组AAV或衣壳经修饰的AAV。
40.根据权利要求36、37、38或39的方法，其中该rAAV中的AAV基因组或AAV衣壳蛋白来自以下中的任一者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV的另一血清型或分离株或分支、或其任何衍生物、变异体或杂合体。
41.根据权利要求37至40中任一项的方法，其中该rAAV为假型化AAV(例如，AAV2/5、AAV2/8、AAV2/1、AAV2/9、AAV2/6、AAV2/4、AAV2/6、AAV5/2、AAV8/1、AAV8/2、AAV2/7、AAV2/12及AAV2/10)或杂合AAV(例如，AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9)。
42.根据权利要求37至41中任一项的方法，其中该rAAV包含一个或多个衣壳突变(例如，Y-F、K-R、T-A、S-A和/或T-V突变(例如，AAV2具有Y444F、Y500F、Y730F、Y252F、Y272F、Y700F、Y704F及T491V中的一个或多个衣壳突变，或针对不同AAV血清型的相应突变(例如，AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV2(四Y-F+T-V)或AAV2/8(Y733F))))。
43.根据权利要求37至42中任一项的方法，其中该rAAV的血清型选自或衍生自由以下组成的群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Anc80、rh10和/或ShH10。
44.根据权利要求37至43中任一项的方法，其中该rAAV选自或衍生自由以下组成的群：AAV2/5、AAV2/8、AAV2/2、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV2/1、AAV2/9、AAV2/8(Y733F)、AAV2/6、AAV2/4、AAV2/7、AAV5、AAV2、AAV8、AAV1、AAV9、AAV6、AAV10、AAV4、AAV7、AAV12、Anc80、AAV 7m8、AAV-DJ、ShH10、AAV-PHP.B，或其杂合体、衍生物或变异体。
45.根据权利要求37至44中任一项的方法，其中该rAAV载体为单链AAV载体或自身互补型AAV(scAAV)载体。
46.根据权利要求30至34中任一项的方法，其中该载体为质粒、裸核酸、脂质体(例如，阳离子或阴离子脂质体)、树状体、纳米颗粒、聚合物(例如，聚合复合物)、脂质-聚合物系统、固体脂质纳米颗粒或脂质体鱼精蛋白/DNA脂质复合物(LPD)。
47.根据权利要求30至46中任一项的方法，其中由该核酸序列编码的该功能性或非突变型CYP4V2蛋白质包含多肽，该多肽与选自由SEQ ID NO:4-6组成的群的序列中的任意者具有至少80％氨基酸序列同一性(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。
48.根据权利要求30至47中任一项的方法，其中该核酸分子与SEQ ID NO:1、2或3中的序列中的任意者具有至少75％序列同一性。
49.根据权利要求30至48中任一项的方法，其中该核酸分子与SEQ ID NO:1、2或3中的序列中的任意者具有至少80％序列同一性。
50.根据权利要求30至49中任一项的方法，其中该核酸分子包含SEQ ID NO:1、2或3中所示的序列。
51.根据权利要求30至50中任一项的方法，其中该核酸分子包含密码子最佳化的序列，其编码包含选自SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列的蛋白质。
52.根据权利要求30至51中任一项的方法，其中该调节序列包含启动子。
53.根据权利要求52的方法，其中该启动子为RPE细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、角膜细胞特异性启动子、眼部细胞特异性启动子或组成型启动子。
54.根据权利要求52的方法，其中该启动子为β肌动蛋白启动子或病毒启动子或其杂合体。
55.根据权利要求52的方法，其中该启动子选自由以下组成的群：CAG启动子(杂合CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白启动子，亦称为CAGGS启动子、CB启动子或CBA启动子)、鸡β肌动蛋白启动子、小CBA(smCBA)启动子、CBSB启动子或CBh启动子、诸如人类β肌动蛋白启动子等的另一β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短型(EFS)启动子、延伸因子1α(EF-1α)启动子、CMV启动子、PGK启动子、UBC启动子、GUSB启动子、UCOE启动子、VMD2(卵黄状黄斑变性2；亦称为BEST1)启动子、RPE65启动子、或其杂合体、变异体或衍生物。
56.根据权利要求30至55中任一项的方法，其中该调节序列包含多腺苷酸化(polyA)信号。
57.根据权利要求56的方法，其中该polyA信号为牛生长激素多腺苷酸化信号(bGHpolyA)、小polyA信号(SPA)、人类生长激素多腺苷酸化信号(hGH polyA)、SV40polyA信号、SV40晚期polyA信号、或其衍生物、杂合体或变异体。
58.根据权利要求30至57中任一项的方法，其中该调节序列包含科札克序列。
59.根据权利要求30至57中任一项的方法，其中该调节序列包含增强子。
60.根据权利要求59的方法，其中该增强子为病毒增强子，其包括但不限于WPRE增强子、HPRE增强子、CTE增强子，或其衍生物或杂合体或变异体。
61.一种用于治疗或预防BCD的方法，该方法包含施用载体，该载体包含与SEQ ID NO:60至64中的CYP4V2表达盒序列中的任意者共用至少80％序列同一性的核酸分子。
62.根据权利要求30至61中任一项的方法，其中该组合物以药学上可接受的载剂及适合用于特定给药途径的额外组分来配制。
63.一种供用于制造用于治疗或预防BCD的载体的组合物，该组合物包含与SEQ ID NO:60至64中的CYP4V2表达盒序列中的任意者共用至少80％序列同一性的核酸分子。
64.根据权利要求30至63中任一项的方法，其中对于体外治疗，以约1×103GC/细胞至约1×106GC/细胞的剂量(MOI)感染靶细胞(GC：基因组拷贝，测量含有基因组的AAV颗粒)。
65.根据权利要求30至64中任一项的方法，其中对于向受试者的眼睛的体内给药，单次给药可为大概约从1×106至2×1013GC的量级(例如，约1×1011GC至约1×1012GC的高剂量范围、约1×1010GC至约1×1011GC的中等剂量范围、约1×109GC至约1×1010GC的低剂量范围、约1×106GC至约1×109GC的极低剂量范围及约1×1012GC至约2×1013GC的极高剂量范围)，或在这些范围内的足够提供所期望的效果的任何剂量。
66.根据权利要求30至65中任一项的方法，其中施用步骤发生在疾病症状发作之前或疾病症状发作之后。
67.根据权利要求30至66中任一项的方法，其中该给药和/或靶向递送针对眼睛和/或眼部细胞。
68.根据权利要求30至67中任一项的方法，其中该给药借由视网膜下注射、玻璃体内注射或借由玻璃体内植入封装有该载体的装置。
69.根据权利要求30至68中任一项的方法，其中该给药借由任何其他可有效地将所述载体递送至该受试者的以下位置的给药方法：视网膜下位置、眼后段、角膜、视网膜、脉络膜、RPE细胞、光感受器或角膜上皮细胞、CE细胞。
70.根据权利要求67的方法，其中向眼睛的给药借由经由血流递送而达成。
71.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述眼部细胞选自由以下组成的群：视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器细胞(PRC)、角膜上皮细胞(CEC)、脉络膜内皮(CE)细胞、视网膜细胞、角膜细胞、晶状体细胞、神经节细胞、视神经细胞和/或脉络膜细胞，以及衍生自干细胞(包括但不限于iPSC、ES细胞、MSC、成体干细胞和/或组织特异性干细胞)的所述类型的细胞。
72.根据权利要求30至71中任一项的方法，其中该载体以药学上可接受的载剂及适合用于特定给药途径的额外组分来配制。
73.根据权利要求30至72中任一项的方法，其进一步包含鉴定具有BCD或具有患BCD的风险或具有双等位基因CYP4V2突变的受试者。
74.一种用于治疗或预防人类受试者的结晶样视网膜色素变性(BCD)的方法，该方法包含向该受试者的眼部细胞递送载体，该载体包含核酸分子，该核酸分子包含编码人类CYP4V2蛋白质的SEQ ID NO:2的核酸序列或与SEQ ID NO:2的核酸序列共用至少90％序列同一性的核酸序列，其可操作地连接至一个或多个调节序列。
75.根据权利要求74的方法，其中该载体为腺相关病毒(AAV)载体。
76.根据权利要求74或75的方法，其中该调节序列为启动子。
77.一种核酸分子，其包含编码人类CYP4V2蛋白质的SEQ ID NO:2的核酸序列或与SEQID NO:2的核酸序列共用至少90％序列同一性的核酸序列。
78.一种表达盒，其包含根据权利要求77的核酸分子及一个或多个可操作地连接至该核酸序列的调节序列。
79.一种载体，其包含根据权利要求77的核酸分子或根据权利要求78的表达盒。
80.根据权利要求79的载体，其中该载体为病毒载体或选自由以下组成的群：重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体、重组杆状病毒载体、重组仙台病毒载体及重组逆转录病毒载体。
81.根据权利要求79的载体，其中该载体为质粒或非病毒载体。
82.根据权利要求81的载体，其中该非病毒载体选自裸核酸、脂质体(例如，阳离子或阴离子脂质体)、树状体、纳米颗粒、聚合物(例如，聚合复合物)、脂质-聚合物系统、固体脂质纳米颗粒或脂质体鱼精蛋白/DNA脂质复合物(LPD)。
83.一种宿主细胞，其包含根据权利要求77的核酸分子和/或根据权利要求79至82中任一项的载体。
84.一种用以在病毒载体介导的基因疗法中降低对病毒载体的免疫响应、保持转导效率、降低病毒载体和/或免疫抑制剂剂量和/或使针对具有同一种遗传疾病的不同患者的治疗效果达到最大的方法，其包含：
(a)建立多于一种重组病毒载体(例如，rAAV)的库，所述重组病毒载体在该基因疗法所针对的靶细胞类型中具有足够的转导效率，该库借由产生具有抗原区突变的变异体或在所述病毒载体的衣壳上产生其他突变或变异体，在确认所述突变或变异体在与该疾病有关的靶细胞中(例如，对针对BCD的CYP4V2基因疗法而言，是在iPS-RPE或RPE细胞系中)具有足够的转导效率后建立；
(b)检测需要该基因疗法的该受试者中预先存在的针对不同病毒载体血清型和/或衣壳突变或变异体的中和抗病毒载体抗体(NAb)，和/或测试及比较衍生自该受试者的患者特异性疾病靶细胞(例如，iPS-RPE细胞)中的不同病毒载体；
(c)从该病毒载体的库中选择病毒载体，该病毒载体(i)在所述疾病靶细胞中具有足够的转导效率且(ii)与该受试者中的所述预先存在的Nab具有低交叉反应性，和/或(iii)在该受试者的患者特异性疾病靶细胞(例如，对针对BCD的CYP4V2基因疗法而言，为患者特异性iPS-RPE或RPE细胞系)中具有良好表型拯救结果，其中该病毒载体的库包含不同血清型和/或衣壳经修饰的病毒载体(例如，包括但不限于衣壳突变型AAV和/或衣壳蛋白变异型AAV)；
(d)使用选自(c)的该病毒载体向该受试者给药；
(e)每当该受试者需要施用基因疗法时重复以上的(b)至(d)(仅重复与预先存在的NAb相关的部分)，其包括但不限于向同一器官(例如，眼睛或对侧眼睛)或向其它器官进行后续给药。
85.一种使用AAV载体介导的基因疗法来治疗或预防人类视网膜疾病的方法，其中该AAV载体包含以下：可操作地连接至治疗性转基因的包含EFS启动子(SEQ ID NO:35)和/或小polyA(SEQ ID NO:36)的核酸分子，或与SEQ ID NO:35共用至少90％序列同一性或与SEQID NO:36共用至少85％序列同一性的核酸分子。
86.根据权利要求85的方法，其中该AAV载体为单链AAV。
87.根据权利要求85的方法，其中该AAV载体为自身互补型AAV(scAAV)。
88.一种细胞疾病模型，其包含细胞系组合物，该细胞系组合物包含(a)由受试者提供或从由受试者提供的细胞重编程的干细胞，或(2)衍生自由受试者提供或从由受试者提供的细胞重编程的干细胞的细胞，其包含靶基因中的一个或多个突变。
89.根据权利要求88的组合物，其中该干细胞为诱导性多能干(iPS)细胞。
90.根据权利要求88的组合物，其中该干细胞为胚胎干(ES)细胞、体(或成体)干细胞、组织特异性干细胞或间充质干细胞(MSC)。
91.根据权利要求88的组合物，其中由受试者提供的该细胞为体细胞。
92.根据权利要求88的组合物，其中由受试者提供的该细胞为皮肤细胞、成纤维细胞或血细胞。
93.根据权利要求88或92的组合物，其中由受试者提供的该细胞为皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。
94.根据权利要求88的组合物，其中由受试者提供的该细胞为尿路细胞、肾上皮细胞、毛囊或真皮乳头细胞。
95.根据权利要求88的组合物，其中衍生自干细胞的该细胞为眼部细胞。
96.根据权利要求95的组合物，其中该眼部细胞为视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器细胞(PRC，包括视杆细胞、视锥细胞及光感受器祖细胞)、视网膜细胞、角膜细胞、角膜上皮细胞(CEC)、视神经细胞、晶状体细胞、脉络膜内皮(CE)细胞、视神经细胞或脉络膜细胞。
97.根据权利要求88的组合物，其中衍生自干细胞的该细胞为神经元细胞。
98.根据权利要求88的组合物，其中该突变于该受试者而言为内源性的。
99.根据权利要求88或98的组合物，其中该突变经由基因编辑或基因操作而人工引入。
100.根据权利要求88的组合物，其中该细胞系包含多个于该受试者而言为内源性和/或外源性的突变。
101.根据权利要求88的组合物，其中该受试者为哺乳动物。
102.根据权利要求88的组合物，其中该受试者为人类。
103.根据权利要求88的组合物，其中该靶基因包含表4中所述的基因。
104.根据权利要求88的组合物，其中该靶基因包含突变的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
105.根据权利要求88的组合物，其中该靶基因为CYP4V2。
106.根据权利要求105的组合物，其中该细胞系包含iPS细胞。
107.根据权利要求105的组合物，其中该细胞系包含iPS-RPE细胞。
108.根据权利要求105的组合物，其中该细胞系包含iPS-光感受器(iPS-PRC)细胞、iPS-角膜上皮细胞(iPS-CEC)、iPS-脉络膜内皮(CE)细胞、iPS-角膜细胞、iPS-脉络膜细胞、iPS-视神经细胞、iPS-眼部细胞或iPS-神经元细胞。
109.根据权利要求88或105至108中任一项的组合物，其中该细胞系中的该CYP4V2突变于该受试者而言为内源性的。
110.根据权利要求88或109的组合物，其中该受试者在该CYP4V2基因中或在该CYP4V2基因的直系同源物中具有病理性突变。
111.根据权利要求88或109的组合物，其中该受试者具有表1中所述的至少一个纯合突变或两个复合杂合突变。
112.根据权利要求88的组合物，其中该受试者具有遗传性视网膜退化(IRD)或视网膜色素变性(RP)。
113.根据权利要求88的组合物，其中该受试者具有结晶样视网膜色素变性(BCD，又名结晶样角膜视网膜变性、结晶样视网膜病变、Bietti视网膜变性)或具有患BCD的风险。
114.根据权利要求88或105的组合物，其中该细胞系包含至少一个CYP4V2突变，该突变于该受试者而言为外源性的且经由基因编辑或基因操作而人工引入。
115.根据权利要求88或114的组合物，其中该细胞系包含iPS细胞、ES细胞、MSC、组织特异性干细胞或成体干细胞，或衍生自iPS细胞、ES细胞、MSC、组织特异性干细胞或成体干细胞的RPE细胞、光感受器细胞、角膜上皮细胞、脉络膜内皮(CE)细胞或脉络膜细胞。
116.一种BCD人类细胞模型组合物或CYP4V2功能障碍细胞模型组合物，其包含衍生自BCD患者的细胞或细胞系或衍生自具有人工产生的双等位基因CYP4V2突变的细胞或细胞系的iPS细胞或iPS细胞系，或iPS-RPE细胞或iPS-RPE细胞系。
117.根据权利要求88或105至116中任一项的组合物，其中该细胞系相比于健康对照组的相应细胞系，具有以下各组化合物中的一种或多种化合物的异常生化谱：(i)脂肪酸、(ii)神经酰胺、(iii)鞘磷脂、(iv)神经鞘氨醇、(v)二氢鞘氨醇、(vi)羟基-脂肪酸、(vii)皮质类固醇或(viii)蛋白质(除了CYP4V2之外)，或具有异常RPE功能，或具有较高的细胞萎缩、退化或死亡水平。
118.根据权利要求88或105至117中任一项的组合物，其中该细胞系相比于健康对照组的相应细胞系具有表2中所述的一种或多种化合物的异常生化谱。
119.一种发现疾病细胞模型中的异常或表型的方法，其包含评估及比较患者细胞系(或经基因编辑或操作的细胞系，其包含引起该疾病的在该基因中的外源性突变)及健康对照组的细胞系的细胞活力水平。
120.一种发现疾病细胞模型中的异常或表型的方法，其包含评估及比较患者细胞系(或经基因编辑或操作的细胞系，其包含引起该疾病的在该基因中的外源性突变)及健康对照组的细胞系的RPE功能水平(例如，吞噬活性、跨上皮电阻)，其中该细胞系为RPE细胞系(包括衍生自干细胞的RPE细胞系)。
121.根据权利要求119或120的方法，其中细胞系之间的该比较是在不暴露于光的情况下进行的。
122.根据权利要求119或120的方法，其中细胞系之间的该比较是在暴露于光后进行的。
123.根据权利要求119、120或122的方法，其中细胞系之间的该比较是在暴露于蓝光后进行的。
124.根据权利要求119、121、122或123的方法，其中细胞活力借由死细胞/活细胞比率、病细胞/健康细胞比率或类似比率或死细胞/总细胞或活细胞/总细胞的百分比来测量。
125.一种发现疾病细胞模型中的异常或表型的方法，其包含评估及比较患者细胞系(或经基因编辑或操作的细胞系，其包含引起该疾病的在该基因中的外源性突变)与健康对照组的细胞系之间一种或多种化合物的水平，其中该一种或多种化合物选自以下的组：(i)脂肪酸、(ii)神经酰胺、(iii)鞘磷脂、(iv)神经鞘氨醇、(v)二氢鞘氨醇、(vi)羟基-脂肪酸、(vii)皮质类固醇和/或(viii)蛋白质。
126.根据权利要求125的方法，其中所评估的一种或多种所述化合物阐述于表2中。
127.根据权利要求125或126的方法，其中化合物水平的鉴定和/或评估使用LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS、GC-MS/MS和/或FIA-MS/MS来进行。
128.根据权利要求119、120或125的方法，其中该疾病细胞模型包含表4中所述的突变的或有缺陷的基因。
129.根据权利要求119、120或125的方法，其中该疾病细胞模型包含以下基因中的突变的或有缺陷的基因：CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
130.一种筛选用于针对BCD的治疗功效的测试剂的方法，其包含：
使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的细胞或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的细胞与测试剂接触；及
针对以下各者评估所述细胞：相比于接触该测试剂之前，表2中所述的一种或多种化合物的水平的标准化；所述细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；所述细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；和/或改良的细胞结构、形态或功能，或改良的细胞活力；
其中相比于用该测试剂处理之前，表2中所述的一种或多种化合物的水平的标准化；所述细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；所述细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；和/或改良的细胞结构、形态、功能或细胞活力，表明测试剂展现针对BCD的治疗功效；
其中细胞系之间的该比较可以在暴露于光后和/或在不暴露于光的情况下进行。
131.根据权利要求130的方法，其中所述测试剂选自由以下组成的群：核酸或其类似物、含有核酸序列或编码多肽的载体、多肽或其类似物、抗体、化学制品、小分子和/或其任何组合。
132.根据权利要求130的方法，其中所述细胞使用PCR技术、免疫分析、测序、生化分析、功能分析、细胞活力分析、显微术或其组合来评估。
133.一种筛选包含用于BCD的测试剂的制剂、载体或构建体的功效或效率的方法，其包含：
使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的多个细胞样品或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的多个细胞样品与配制或包装于各种制剂、载体或构建体中的测试剂接触；及
针对以下各者评估所述细胞样品：相比于用该测试剂处理之前和/或相比于用相同的但配制或包装于不同制剂、载体或构建体中的测试剂处理的细胞样品，表2中所述的一种或多种化合物的水平的标准化；所述细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；所述细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；改良的细胞结构、形态、功能或活力；和/或细胞耐受性或死亡，用以测定及比较该制剂、载体或构建体的效率或功效；
其中所述细胞使用PCR技术、免疫分析、测序、生化分析、细胞活力分析、显微术或其组合来评估；
其中细胞系之间的该比较可以在暴露于光后和/或在不暴露于光的情况下进行。
134.一种筛选用于BCD的测试剂的有效及安全剂量范围的方法，其包含：
使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的多个细胞样品或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的多个细胞样品与测试剂以针对各细胞样品的不同剂量接触；
针对以下各者评估所述细胞样品：相比于用该测试剂处理之前和/或相比于用相同测试剂但用不同剂量处理的细胞样品，表2中所述的一种或多种化合物的水平的标准化；所述细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；所述细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；改良的细胞结构、形态、活力或功能；和/或细胞耐受性或死亡，用以测定及比较不同剂量的有效性及安全性，从而确定恰当的剂量范围；
其中所述细胞使用PCR技术、免疫分析、测序、生化分析、功能分析、细胞活力分析、显微术或其组合来评估；
其中细胞系之间的该比较可以在暴露于光后和/或在不暴露于光的情况下进行。
135.一种筛选或评估用于向视网膜或视网膜细胞递送治疗剂的递送装置或方法的功效或效率的方法，其包含：
(i)在不采用该递送装置或方法的情况下，使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的细胞样品或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的细胞样品与测试剂接触；
(ii)采用该递送装置或方法，使来自衍生自BCD患者的iPS-RPE细胞系的另一个细胞样品或来自因为人工基因编辑或操作而包含突变的或有缺陷的CYP4V2基因的iPS-RPE细胞系的另一个细胞样品与跟(i)中相同剂量的该测试剂接触；
(iii)针对以下各者评估及比较来自(i)及(ii)的所述细胞样品：相比于在用该测试剂处理和/或用相同剂量的相同测试剂但是不采用该递送装置或方法进行处理之前，表2中所述的一种或多种化合物的水平的标准化；所述细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；所述细胞中的CYP4V2多肽的量的增加；改良的细胞结构、形态或功能；细胞耐受性或死亡；和/或该测试剂在所述细胞中的水平，从而测定该递送装置或技术的功效或效率；
其中所述细胞使用PCR技术、免疫分析、测序、生化分析、功能分析、细胞活力、显微术或其组合来评估；
其中细胞系之间的该比较可以在暴露于光后和/或在不暴露于光的情况下进行。
136.根据权利要求135的方法，其中所述视网膜细胞为RPE细胞。
137.一种产生等基因对照组的方法，其包含借由基因编辑疗法中的权利要求或其中的RNP权利要求中任一项基因校正患者细胞系中的突变。
138.一种使用患者特异性iPS-眼部细胞评定并建议体内治疗的治疗有效剂量的方法，该方法包含将在患者特异性iPS-眼部细胞模型中体外测定的最佳剂量水平(例如，表示为体外基因疗法的MOI)乘以所估计的体内治疗所靶向的眼部细胞(例如RPE细胞、光感受器细胞、或者RPE细胞和光感受器细胞)的数目以获得体内使用的基因疗法载体(例如，GC或gp)的剂量水平，且该载体剂量水平借由乘数(例如1至10(例如视网膜下注射为1至5或玻璃体内注射为5至10)调整；影响应用的乘数的其他因素包括目标区域的大小、治疗的受试者(例如，年龄、体重、疾病的发展阶段和待治疗的所述受试者的状况，以及潜在的免疫响应(即，预先存在的NAb))；治疗靶向的眼部细胞的位置和密度)以建议体内治疗的治疗有效剂量范围，其可通过临床试验证实或进一步完善。
139.根据权利要求138的方法，其中该方法用于评定或建议个别患者体内治疗中使用的个体化最佳剂量。
140.根据权利要求138或139的方法，其中该疾病为遗传性视网膜病症(IRD)或视网膜色素变性(RP)。
141.根据权利要求138或139的方法，其中该疾病为BCD且所述iPS-眼部细胞为iPS-RPE细胞且体内治疗所靶向的所述眼部细胞为RPE细胞。
142.一种组合物，其包含：(a)靶向距离该CYP4V2基因100bp或100bp内的核酸序列(“靶序列”)的CRISPR引导RNA，及(b)功能性CRISPR相关蛋白(Cas)。
143.根据权利要求142的组合物，其进一步包含(c)包含该CYP4V2基因的野生型序列或功能序列的全部或一部分的供体核酸序列，其用于校正、破坏或替代CYP4V2基因或其一部分。
144.根据权利要求142或143的组合物，其中其一种或多种组分以编码所述组分的DNA分子、编码所述组分的mRNA分子、RNA分子、多肽和/或核糖核蛋白(RNP)或蛋白质-RNA复合物的形式提供。
145.根据权利要求142或143的组合物，其中其两种或更多种组分在单独的分子中或组合于一个分子或一个复合物中、在单独的载体中或组合于一个载体中、在一个或多个核酸复合物中、在一个或多个RNP复合物中。
146.根据权利要求143的组合物，其中该供体核酸序列以单链供体寡核苷酸(ssODN)或载体提供。
147.根据权利要求142至146中任一项的组合物，其中该载体为质粒、重组AAV载体、重组慢病毒载体和/或其组合。
148.一种组合物，其包含具有病理性CYP4V2突变的细胞，包含根据权利要求142至147中任一项的组合物。
149.根据权利要求142至148中任一项的组合物，其中(a)该CRISPR引导RNA包含(i)CRISPR RNA(crRNA)，其包含与距离靶基因(该“靶基因”)100bp或100bp内的靶序列互补的原型间隔区元件序列及对应于反式活化crRNA(tracrRNA)的互补区的序列，及(ii)tracrRNA，其包含与该crRNA的对应区域互补的区域及与CRISPR相关蛋白9(Cas9)相互作用的序列，且(b)该功能性CRISPR相关蛋白包含Cas9。
150.根据权利要求149的组合物，其中该原型间隔区元件为约20个碱基、约19个碱基、约21个碱基、约19-21个碱基、约18-22个碱基或约16-24个碱基。
151.根据权利要求149或150的组合物，其中该crRNA及该tracrRNA在单独的分子中。
152.根据权利要求149或150的组合物，其中该crRNA及该tracrRNA组合于单引导RNA(sgRNA)中。
153.根据权利要求152的组合物，其中该sgRNA为约88-150bp。
154.根据权利要求149至153中任一项的组合物，其中该Cas9包含Cas9直系同源物或突变型Cas9，其选自：酿脓链球菌(SpCas9)、SpCas9切口酶(Cas9n D10A)、SpCas9(D1135E)、eSpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9VRER、SpCas9VQR、SpCas9EQR、金黄色葡萄球菌(SaCas9)、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜热链球菌、肺炎链球菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、变形链球菌、多杀性巴氏杆菌、长双歧杆菌、史氏芽孢杆菌、齿垢密螺旋体、犬支原体及粪肠球菌。
155.根据权利要求142至148中任一项的组合物，其中(a)该CRISPR引导RNA包含crRNA，该crRNA包含与距离靶基因100bp或100bp内的该靶序列互补的原型间隔区元件序列，且(b)该功能性CRISPR相关蛋白包含Cpf1。
156.根据权利要求142至155中任一项的组合物，其中该CRISPR相关蛋白Cas9或Cpf1进一步包含一个、两个、三个或更多个位于N端和/或C端的核定位序列(NLS)，和/或选择标记物，其包括但不限于GFP或EGFP。
157.根据权利要求142的组合物，其中该原型间隔区元件序列选自由SEQ ID NO:48至52组成的群，或与SEQ ID NO:48至52中的任一者共用至少85％序列同一性，用于与具有NGG作为原型间隔区相邻基序(PAM)的Cas蛋白质一起使用以靶向该CYP4V2基因的c.802-8_810del17insGC突变。
158.根据权利要求142、143或157的组合物，其中该供体核酸序列选自SEQ ID NO:56及57，或与SEQ ID NO:56、57或其互补序列中之一者共用至少90％序列同一性，用于校正、破坏或替代该CYP4V2基因的c.802-8_810del17insGC突变。
159.一种治疗或预防含突变的CYP4V2基因的受试者或细胞中的BCD的方法，其包含：
(i)经由测序鉴定该受试者或该细胞中的该病理性突变；
(ii)找出跨度为距离参与该突变的第一个核苷酸的上游约100bp至距离参与该突变的最后一个核苷酸的下游约100bp的区域内的Cas相关PAM位点；
(iii)鉴定与(ii)中所鉴定的各PAM位点有关的各种靶向该CYP4V2序列的原型间隔区元件序列；
(iv)基于该原型间隔区元件序列及PAM，评定包含(iii)中所鉴定的原型间隔区元件序列的各CRISPR引导RNA的活性水平及脱靶编辑谱；
(v)基于(iv)选择一个或多个CRISPR引导RNA设计；
(vi)基于同源定向修复(HDR)设计一个或多个供体核酸序列，用于校正、破坏或替代所靶向的CYP4V2突变；
(vii)构建该CRISPR引导RNA、Cas及供体核酸序列，如组合物权利要求1至18任一项中所提供；
(viii)任选地在从该受试者分离的细胞、或衍生自该受试者的iPS细胞或从衍生自该受试者的干细胞分化的细胞、或从该受试者分离的基因组DNA中，验证并进一步选择(vii)的所述组分，以评定该活性水平和/或脱靶编辑谱；以及
(ix)经由选自由以下组成的群的递送系统向该受试者或该细胞施用(viii)中的所述组分：核糖核蛋白或蛋白质-RNA复合物、载体、蛋白质、核酸分子、纳米颗粒、脂质体、微胞、病毒体、核酸复合物和/或其组合，其中该递送借由电穿孔或经由脂质介导的转染或核转染或病毒转导或注射或其组合进行。
160.一种基因编辑组合物，其用于校正或替代受试者体内或体外细胞中的CYP4V2基因中的c.802-8_810del17insGC突变，该组合物包含：
(i)CRISPR引导RNA，其包含选自SEQ ID NO:48至52中之一者或与SEQ ID 48至52中的序列中之一者共用至少80％序列同一性的原型间隔区元件序列；
(ii)供体核酸序列，其选自SEQ ID NO:56及57中之一者，或与SEQ ID NO:56、57或其互补序列中之一者共用至少90％序列同一性；以及
(iii)Cas9蛋白质(示范性序列显示于SEQ ID NO:58中)，其任选地含有1、2、3个或更多个NLS，和/或选择标记物，包括但不限于GFP或EGFP。
161.根据权利要求160的组合物，其中在该原型间隔区元件序列之前添加任选的核苷酸G(SEQ ID NO:59)。
162.根据权利要求160或161的组合物，其中该CRISPR引导RNA包含crRNA(显示于SEQID NO:53中的示范性序列(不包括5'原型间隔区元件序列))及tracrRNA(显示于SEQ IDNO:54中的示范性序列)；且该原型间隔区元件序列含于该crRNA中。
163.根据权利要求160至162中任一项的组合物，其中该CRISPR引导RNA包含单引导RNA(sgRNA)，其包含该原型间隔区元件序列(显示于SEQ ID NO:55中的示范性sgRNA序列(不包括5'原型间隔区元件序列))。
164.根据权利要求160至163中任一项的组合物，其中(i)、(ii)及(iii)的一种或多种组分按以下形式提供：编码该组分的DNA分子、编码该组分的mRNA分子、核酸分子、载体、RNA分子、多肽、核糖核蛋白(RNP)或蛋白质-RNA复合物和/或其组合。
165.一种治疗或预防受试者的眼睛疾病的方法，其中该疾病与CYP4V2基因中的病理性遗传或表观遗传改变相关，该方法包含向该受试者施用细胞组合物，其中该细胞组合物包含：视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器或光感受器祖细胞(PRC)、角膜上皮细胞(CEC)、脉络膜内皮(CE)细胞和/或其他眼部细胞或其他衍生自干细胞的细胞。
166.根据权利要求165的方法，其中该干细胞为胚胎干(ES)细胞、iPC细胞、MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。
167.根据权利要求165的方法，其中该干细胞来自或衍生自一个或多个没有BCD或没有病理性CYP4V2基因的受试者。
168.根据权利要求165的方法，其中该干细胞来自或衍生自一个或多个在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者。
169.根据权利要求165至168中任一项的方法，其中该受试者为人类受试者。
170.一种细胞组合物，其包含(a)从分离自被BCD影响或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者的细胞重编程的干细胞或从该受试者分离的干细胞，或(2)从干细胞分化的细胞，该干细胞分离自被BCD影响或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者或分离自该受试者的细胞重编程。
171.根据权利要求170的组合物，其中从分离自该受试者的细胞重编程的该干细胞为iPC细胞。
172.根据权利要求170的组合物，其中该iPS细胞从来自该受试者的体细胞重编程。
173.根据权利要求170的组合物，其中该iPS细胞从皮肤细胞、血细胞、尿路细胞、毛发细胞、成纤维细胞、外周血单核细胞(PBMC)、肾上皮细胞、毛囊或真皮乳头细胞重编程。
174.根据权利要求170的组合物，其中从该受试者分离的该干细胞为MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。
175.根据权利要求170的组合物，其中从干细胞分化的该细胞为眼部细胞。
176.根据权利要求170或175的组合物，其中从干细胞分化的该细胞为RPE细胞、PRC、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、CEC或CE细胞。
177.根据权利要求170的组合物，其中从干细胞分化的该细胞为iPS-RPE、iPS-PRC、iPS-CEC或iPS-CE细胞。
178.根据权利要求170的组合物，其中对以下细胞进行基因修复以改善突变的CYP4V2基因的影响：(i)从患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者分离以用于重编程成iPSC的细胞；(ii)从患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者分离的干细胞或从分离自该受试者的细胞重编程的iPS细胞；或(iii)从分离自被BCD影响或在CYP4V2基因中具有病理性突变的受试者的干细胞分化的细胞或由从分离自该受试者的细胞重编程的iPS细胞分化的细胞。
179.根据权利要求178的组合物，其中基因修复经由基因转移疗法。
180.根据权利要求178的组合物，其中基因修复经由基因转移疗法，借由使用基因疗法权利要求中任一项的任何组合物或方法。
181.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中基因修复经由基因编辑疗法。
182.根据权利要求181的组合物，其中基因修复经由基因编辑疗法，借由使用CRISPR基因疗法权利要求中任一项的任何组合物或方法。
183.一种治疗或预防患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性遗传或表观遗传改变的受试者的眼睛疾病的方法，该方法包含向该受试者施用与CYP4V2自体细胞组合物相关的权利要求中任一项的组合物，其中该细胞组合物包含：基因修复的细胞，包含视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器或光感受器祖细胞(PRC)、角膜上皮细胞(CEC)、脉络膜内皮(CE)细胞和/或其他眼部细胞或其他衍生自该受试者的干细胞的细胞。
184.根据权利要求183的方法，其中该干细胞为iPC细胞、MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。
185.根据权利要求184的方法，其中该iPS细胞使用OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC转录因子中的一者或多者重编程。
186.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述基因修复的细胞相比于在进行基因修复之前展现以下中的一者或多者：表2中所述的一种或多种化合物的水平的标准化；所述细胞中的无缺陷的CYP4V2核酸序列的增加；所述细胞中的功能性CYP4V2多肽的量的增加；和/或改良的细胞结构、形态、活力或功能。
187.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在单次给药中所施用的细胞的量为约1,000至约1000万个细胞。
188.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该给药经由注射、视网膜下注射或玻璃体内注射。
189.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该给药借由任何其他可将所述细胞有效地递送至该受试者的眼睛的视网膜下位置、后段或角膜的给药方法。
190.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞经由注射细胞悬浮液来施用。
191.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞作为层片、基质、支架、组织或3D视网膜结构的一部分施用。
192.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述RPE细胞使用天然和/或合成支架来施用以产生功能性RPE单层。
193.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该受试者为人类受试者。
194.一种细胞组合物，其包含(a)从分离自受疾病影响的受试者的细胞重编程的干细胞或从该受试者分离的干细胞，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病，或(2)从干细胞分化的细胞，该干细胞从受疾病影响的受试者分离或从分离自该受试者的细胞重编程，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病。
195.根据权利要求194的组合物，其中从分离自该受试者的细胞重编程的该干细胞为iPS细胞。
196.根据权利要求195的组合物，其中该iPS细胞从该受试者的体细胞重编程。
197.根据权利要求195或196的组合物，其中该iPS细胞从皮肤细胞、血细胞、尿路细胞、毛发细胞、成纤维细胞、外周血单核细胞(PBMC)、肾上皮细胞、毛囊或真皮乳头细胞重编程。
198.根据权利要求194的组合物，其中从该受试者分离的该干细胞为MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。
199.根据权利要求194的组合物，其中该基因涉及引起眼部疾病或为引起眼部疾病的风险因素的眼部发育或功能和/或其突变。
200.根据权利要求194的组合物，其中该基因涉及引起神经退化性疾病或为引起神经退化性疾病的风险因素的神经元发育或功能和/或其突变。
201.根据权利要求194的组合物，其中该基因为细胞色素P450基因。
202.根据权利要求194的组合物，其中该基因为表4中所述的基因。
203.根据权利要求194的组合物，其中该基因包含突变的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
204.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中从干细胞分化的该细胞为任何类型的细胞。
205.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中从干细胞分化的该细胞为眼部细胞。
206.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中从干细胞分化的该细胞为RPE细胞、PRC、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、CEC、CE细胞或视神经细胞。
207.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中从干细胞分化的该细胞为iPS-RPE、iPS-PRC、iPS-CEC或iPS-CE细胞。
208.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中从干细胞分化的该细胞为神经元。
209.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中对以下细胞进行基因修复以改善突变的或有缺陷的基因的影响：(i)从受疾病影响的受试者分离以用于重编程成iPSC的细胞，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病；(ii)从受疾病影响的受试者分离的干细胞或从分离自该受试者的细胞重编程的iPS细胞，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病；或(iii)从分离自受疾病影响的受试者的干细胞分化的细胞或由从分离自该受试者的细胞重编程的iPS细胞分化的细胞，该受试者患有由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病。
210.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中基因修复经由基因转移疗法。
211.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中基因修复经由基因转移疗法，借由使用与基因疗法相关的权利要求中任一项的任何组合物或方法。
212.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中基因修复经由基因编辑疗法。
213.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中基因修复经由基因编辑疗法，借由使用与CRISPR基因编辑疗法相关的权利要求中任一项的任何组合物或方法。
214.一种治疗或预防受疾病影响的受试者的疾病的方法，该受试者患有由表4中所述的突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病，该方法包含向该受试者施用与自体细胞组合物相关的权利要求中任一项的细胞组合物，其中该细胞组合物包含：基因修复的细胞，其包含视网膜色素上皮(RPE)细胞、光感受器或光感受器祖细胞(PRC)、角膜上皮细胞(CEC)、神经元、脉络膜内皮(CE)细胞和/或其他眼部细胞，或其他衍生自该受试者的干细胞的细胞，且其中该细胞组合物中的该突变的或有缺陷的基因已经基因修复。
215.一种自体治疗受试者的方法，其包含：
(i)提供来自具有眼睛疾病的受试者的细胞；
(ii)在来自该受试者的所述细胞中诱导多能性以产生iPSC；
(iii)经由基因编辑疗法基因修复衍生自该受试者的所述iPSC中于表4中所述的突变的或有缺陷的基因中的一个或多个突变；
(iv)根据替代移植的需要，将所述iPSC分化成眼部细胞或其他细胞；
(v)作为步骤(iii)的替代方案，经由基因转移疗法基因修复所述iPS衍生的细胞；以及
(vi)将所述iPS衍生的细胞引入该受试者中，从而自体治疗具有与突变的或有缺陷的基因(“靶基因”)相关的疾病的该受试者。
216.根据权利要求214或215的方法，其中该干细胞为iPC细胞、MSC、成体干细胞或组织特异性干细胞。
217.根据权利要求216的方法，其中该iPS细胞使用OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC转录因子中的一者或多者来重编程。
218.根据权利要求214或215的方法，其中所述基因修复的细胞，相比于在进行基因修复之前，展现以下中的一者或多者：所述细胞中的无缺陷的靶基因核酸序列的增加；所述细胞中由该靶基因编码的功能性多肽的量的增加；改良的细胞结构、形态、活力或功能；和/或所述细胞中改良的或标准化的生化功能。
219.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在单次给药中所施用的细胞的量为约1,000至约1000万个细胞。
220.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该给药经由注射、视网膜下注射或玻璃体内注射。
221.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该给药借由任何其他有效地将所述细胞递送至以下位置的给药方法：该受试者的眼睛的视网膜下位置、后段或角膜，或需要替代细胞的组织或器官。
222.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞经由注射细胞悬浮液来施用。
223.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞作为层片、基质、支架、组织或3D视网膜结构的一部分来施用。
224.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述RPE细胞使用天然和/或合成支架施用以产生功能性RPE单层。
225.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该受试者为人类受试者。
226.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该疾病与该受试者中于表4中所述的基因的遗传或表观遗传改变或风险因素相关。
227.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该疾病为光感受器退化、视网膜色素上皮细胞退化、视网膜退化、角膜退化和/或脉络膜病症。
228.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该疾病为遗传性视网膜退化(IRD)。
229.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该疾病为视网膜色素变性(RP)。
230.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该疾病为结晶样视网膜色素变性(亦称为结晶样角膜视网膜变性；BCD)。
231.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该疾病与神经退化相关。
232.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该疾病为角膜变性。
233.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该受试者具有BCD或处于罹患BCD的风险中。
234.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述细胞为成纤维细胞、血细胞或眼部细胞。
235.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述细胞从尿液或从毛发或毛囊获得。
236.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述眼部细胞为视网膜色素上皮(RPE)细胞、角膜上皮细胞(CEC)、脉络膜内皮(CE)细胞或光感受器细胞(PRC)。
237.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该遗传或表观遗传改变选自由以下组成的群：突变、插入、单核苷酸多态性、不当甲基化、不当脱甲基化及其组合。
238.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该遗传或表观遗传改变为突变。
239.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中来自该受试者的所述iPS-眼部细胞中的该遗传或表观遗传改变已使用基因编辑疗法来基因修复。
240.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该基因编辑疗法方法利用锌指核酸酶、TALEN技术或CRISPR技术。
241.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中来自该受试者的所述iPSC-眼部细胞中的该遗传或表观遗传改变已使用基因转移疗法来基因修复。
242.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该基因转移疗法方法利用重组AAV载体或另一病毒载体或非病毒载体将该靶基因的健康拷贝(例如，cDNA)递送至待移植的细胞。
243.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该给药步骤发生在疾病症状发作之前或发生在疾病症状发作之后。
244.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该给药施用至眼睛或包含神经元的其它器官或组织。
245.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该给药借由注射、视网膜下或玻璃体内注射、直接视网膜注射或。
246.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该给药借由任何其他有效地将所述细胞递送至以下位置的给药方法：该受试者的眼睛的视网膜下位置、后段或角膜，或需要替代细胞的组织或器官。
247.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包含：在给药或移植之前，对所述细胞进行基因型分析，以鉴定在表4中所述的一个或多个基因中存在或不存在该遗传或表观遗传改变。
248.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该遗传或表观遗传改变为突变。
249.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该突变在CYP4V2核酸分子中。
250.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包含：在给药之前，评估该受试者的眼睛以鉴定受损的或残留的光感受器、视网膜细胞或角膜细胞的区域及程度。
251.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包含：在给药之后，监测该受试者。
252.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该监测包含进行非侵入性视网膜成像、角膜测试、暗适应、对比敏感度、视野测量、ERG、OCT、视敏度测试和/或功能研究。
253.根据前述权利要求中任一项的方法，其中该监测包含评估该受试者的免疫响应。
254.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包含：在给药之后，评估该受试者的眼睛以鉴定受损的或残留的光感受器、视网膜细胞或角膜细胞的区域及程度。
255.一种组合物，其包含在核糖核蛋白(RNP)或蛋白质-RNA复合物中的：(a)靶向距离靶基因(该“靶基因”)100bp或100bp内的核酸序列(“靶序列”)的CRISPR引导RNA，及(b)功能性CRISPR相关蛋白。
256.根据权利要求255的组合物，其进一步包含(c)包含该靶基因的野生型序列或功能序列的全部或一部分的供体核酸序列，其用于校正或替代该靶基因或其一部分。
257.根据权利要求255或256的组合物，其中该靶基因涉及眼部发育或功能和/或其突变引起眼部疾病或为引起眼部疾病的风险因素。
258.根据权利要求255或256的组合物，其中该靶基因涉及神经元的发育或功能和/或其突变引起神经退化性疾病或为引起神经退化性疾病的风险因素。
259.根据权利要求255或256的组合物，其中该靶基因为细胞色素P450基因。
260.根据权利要求255或256的组合物，其中该靶基因包含表4中所述的突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因。
261.根据权利要求256的组合物，其中该供体核酸序列以单链供体寡核苷酸(ssODN)或载体提供。
262.根据权利要求255至261中任一项的组合物，其中(a)该CRISPR引导RNA包含(i)CRISPR RNA(crRNA)，其包含与距离靶基因100bp或100bp内的该靶序列互补的原型间隔区元件序列及对应于反式活化crRNA(tracrRNA)的互补区的序列，及(ii)tracrRNA，其包含与该crRNA的对应区域互补的区域及与CRISPR相关蛋白9(Cas9)相互作用的序列，且(b)该功能性CRISPR相关蛋白包含Cas9。
263.根据权利要求261或262的组合物，其中该crRNA及该tracrRNA在不同的核酸分子中。
264.根据权利要求261或262的组合物，其中该crRNA及该tracrRNA组合于单引导RNA(sgRNA)中。
265.根据权利要求261至264中任一项的组合物，其中该Cas9包含Cas9直系同源物或突变型Cas9，其选自：酿脓链球菌(SpCas9)、SpCas9切口酶(Cas9n D10A)、SpCas9(D1135E)、eSpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9VRER、SpCas9VQR、SpCas9EQR、金黄色葡萄球菌(SaCas9)、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜热链球菌、肺炎链球菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、变形链球菌、多杀性巴氏杆菌、长双歧杆菌、史氏芽孢杆菌、齿垢密螺旋体、犬支原体及粪肠球菌。
266.根据权利要求255至265中任一项的组合物，其中(a)该CRISPR引导RNA包含crRNA，该crRNA包含与距离靶基因100bp或100bp内的该靶序列互补的原型间隔区元件序列，且(b)该功能性CRISPR相关蛋白包含Cpf1。
267.根据权利要求255至266中任一项的组合物，其中该CRISPR相关蛋白Cas9或Cpf1进一步包含一个、两个、三个或更多个位于N端和/或C端的核定位序列(NLS)，和/或选择标记物，包括但不限于GFP或EGFP。
268.根据权利要求255至267中任一项的组合物，其中该原型间隔区元件与该靶序列100％互补或含有1、2、3、4或5个对应于该靶序列的核苷酸错配。
269.根据权利要求255或256的组合物，其中该crRNA序列进一步包含G核苷酸，该G核苷酸任选地添加至该crRNA序列紧接在该原型间隔区元件之前。
270.根据权利要求255至269中任一项的组合物，其中该CRISPR引导RNA、crRNA和/或该tracrRNA或该sgRNA经化学修饰。
271.根据权利要求255至270中任一项的组合物，其中该靶基因的野生型形式编码酶。
272.根据权利要求255或256的组合物，其中该靶基因包含突变的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
273.根据权利要求255至272中任一项的组合物，其中其任何一种或多种组分，包括该CRISPR引导RNA、CRISPR相关蛋白和/或该供体核酸序列，单独地和/或额外地以能够转录和/或翻译成该组分的载体、DNA和/或mRNA来提供。
274.一种药学上可接受的制剂，其包含根据权利要求255或273的组合物。
275.一种治疗受试者的由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病的方法，其包含向该受试者施用根据权利要求255至274中任一项的组合物。
276.一种治疗受试者的由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的眼部疾病或改善与其相关的风险因素的方法，其包含向该受试者施用根据权利要求255至157中任一项的组合物。
277.一种治疗受试者的由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的神经退化性疾病或改善与其相关的风险因素的方法，其包含向该受试者施用根据权利要求255、256或258至276中任一项的组合物。
278.一种治疗受试者的由突变的或有缺陷的细胞色素P450基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的细胞色素P450基因引起的疾病或改善与其相关的风险因素的方法，其包含向该受试者施用根据权利要求255至277中任一项的组合物。
279.根据权利要求278的方法，其中被破坏、校正或替代的该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因为表4中所述的基因的突变的或有缺陷的形式，或表4中所述的基因的编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的形式。
280.根据权利要求278的方法，其中该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因存在于成纤维细胞、血细胞、RPE细胞、光感受器细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、眼部细胞、视神经细胞、神经元细胞或干细胞或任何类型的衍生自干细胞的细胞中。
281.根据权利要求278或279的方法，其中将其中的该组合物递送至成纤维细胞、血细胞、RPE细胞、光感受器细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、眼部细胞、视神经细胞、神经元细胞或干细胞或任何类型的衍生自干细胞的细胞。
282.根据权利要求281的方法，其中递送借由电穿孔或经由脂质介导的转染或核转染或病毒转导或注射或其组合来进行。
283.根据权利要求278至282中任一项的方法，其中其任何一种或多种组分，包括该CRISPR引导RNA、CRISPR相关蛋白和/或该供体核酸序列，经由选自由以下组成的群的递送系统向该受试者或向所述细胞施用：核糖核蛋白或蛋白质-RNA复合物、纳米颗粒、脂质体、微胞、病毒体、核酸复合物和/或其组合。
284.根据权利要求278至283中任一项的方法，其中治疗对受试者体内进行。
285.根据权利要求278至283中任一项的方法，其中治疗在以下细胞中体外进行：成纤维细胞、血细胞、RPE细胞、光感受器细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、眼部细胞、视神经细胞、神经元细胞或干细胞或任何类型的衍生自干细胞的细胞。
286.根据权利要求285的方法，其中将经治疗的细胞体内移植至受试者，或若该经治疗的细胞为干细胞，则使该干细胞分化成用于移植的所期望类型的细胞，然后将分化的细胞体内移植至受试者中。
287.根据权利要求278至280中任一项的方法，其中该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因被替代。
288.根据权利要求278至280中任一项的方法，其中该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因中有一个或多个突变被校正或替代。
289.根据权利要求278至280中任一项的方法，其中该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因被破坏。
290.根据权利要求278至280中任一项的方法，其中该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因中有1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-1000、1001-10000个碱基对的核苷酸或突变被破坏、校正或替代。
291.根据权利要求278至280中任一项的方法，其中该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因的区域被破坏、校正或替代。
292.根据权利要求278至280中任一项的方法，其中该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因的小于约10、8、6、4、2或1kb的区域被破坏、校正或替代。
293.根据权利要求278至280中任一项的方法，其中经由插入和/或删除核苷酸来破坏、校正或替代该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因。
294.根据权利要求278至280中任一项的方法，其中在一个等位基因或两个等位基因中破坏、校正或替代该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因。
295.根据权利要求278至280中任一项的方法，其中使用两个或更多个不同的CRISPR引导RNA、CRISPR相关蛋白和/或供体核酸序列来破坏、校正或替代该突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能的蛋白质的基因中的一个或多个突变或缺陷。
296.根据权利要求278的方法，其中该受试者为哺乳动物。
297.根据权利要求278的方法，其中该受试者为人类。
298.根据权利要求278的方法，其中该方法改善眼的发育或功能，或预防眼、视网膜或角膜的退化。
299.根据权利要求278的方法，其中该方法改善神经的发育或功能，或预防神经退化。
300.根据权利要求278的方法，其中该方法改善P450酶的表达或功能。
301.根据权利要求255、257、258或259中任一项的组合物，其进一步包含(c)包含表4中所述的靶基因的全部或一部分的供体核酸序列，其具有用于产生突变的或改变的靶基因或其一部分的突变或改变。
302.一种组合物，其包含具有表4中所述的突变的或有缺陷的基因的细胞。
303.一种组合物，其包含具有突变的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因的细胞，包含本文中权利要求中任一项的组合物。
304.根据权利要求303的组合物，其中该载体为AAV载体。
305.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该原型间隔区元件序列选自由SEQ IDNO:48至52组成的群，或与SEQ ID NO:48至52中之一者共用至少80％序列同一性，其用于与具有NGG作为原型间隔区相邻基序(PAM)的Cas蛋白质一起使用以靶向该CYP4V2基因的c.802-8_810del17insGC突变。
306.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中该供体核酸序列选自SEQ ID NO:56及57，或与SEQ ID NO:56及57或其互补序列中之一者共用至少90％序列同一性，其用于校正、破坏或替代该CYP4V2基因的该c.802-8_810del17insGC突变。
307.一种治疗受试者的由突变的或有缺陷的基因或编码具有有缺陷的或部分的功能或活性的蛋白质的基因引起的疾病的方法，其包含向该受试者施用以下两者的组合：(i)靶向该受试者中所存在的病变细胞的组合物，其包含基因编辑疗法组合物或基因转移疗法组合物；及(ii)包含替代细胞的细胞组合物。
308.根据权利要求307的方法，其中该受试者为人类。
309.根据权利要求307的方法，其中该疾病在该受试者的细胞中引起退化。
310.根据权利要求307或308的方法，其中该退化发生于RPE细胞、RPC、CEC、CE细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、视神经细胞、眼部细胞、神经元、神经元细胞、脑细胞、肝细胞、肺细胞及心脏细胞中。
311.根据权利要求307的方法，其中该疾病由表4中基所述的因引起。
312.根据权利要求307的方法，其中该基因编辑疗法组合物为本文中的基因编辑疗法权利要求中任一项的组合物。
313.根据权利要求307的方法，其中该基因转移疗法组合物为本文中的基因转移疗法权利要求中任一项的组合物。
314.根据权利要求307的方法，其中该细胞组合物包含本文中的细胞疗法权利要求或自体细胞疗法权利要求中任一项的组合物。
315.根据权利要求307的方法，其中该细胞组合物对于被治疗的该受试者而言是同种异体的。
316.根据权利要求307的方法，其中该细胞组合物对于被治疗的该受试者而言是自体的。
317.根据权利要求307或314的方法，其中该细胞组合物在施用给该受试者之前经过基因修复。
318.根据权利要求307或317的方法，其中该基因修复经由基因编辑疗法。
319.根据权利要求307或318的方法，其中该基因编辑疗法经由本文中的基因编辑疗法权利要求中的任一项权利要求。
320.根据权利要求307、318或319的方法，其中该基因编辑疗法经由本文中的CRISPRRNP权利要求中的任一项。
321.根据权利要求307或317的方法，其中该基因修复经由基因转移疗法。
322.根据权利要求307或321的方法，其中该基因转移疗法经由本文中的基因转移疗法或基因疗法权利要求中的任一项。
323.根据权利要求307的方法，其中(i)及(ii)的所述组合物以单次给药施用。
324.根据权利要求307的方法，其中(i)及(ii)的所述组合物分开地或在分开给药中施用。
325.根据权利要求307的方法，其中所述替代细胞衍生自干细胞。
326.根据权利要求307或325的方法，其中所述替代细胞衍生自iPS细胞。
327.根据权利要求307或326的方法，其中该iPS细胞衍生自同一个被治疗的受试者。
328.根据权利要求307或326的方法，其中该替代细胞为iPS-RPE、iPS-PRC、iPS-CEC或iPS-CE细胞。
329.根据权利要求307或326的方法，其中该替代细胞为iPS-眼部细胞。
330.根据权利要求307或326的方法，其中该替代细胞为iPS-神经元细胞。
331.根据权利要求307的方法，其中该方法改善该受试者的眼的发育或功能，或预防眼、视网膜或角膜的退化。
332.根据权利要求307的方法，其中该方法改善该受试者的神经的发育或功能，或预防神经退化。
333.根据权利要求307的方法，其中该方法改善该受试者中的P450酶的表达或功能。
334.根据权利要求307至332中任一项的方法，其中该受试者患有眼、视网膜、角膜、脉络膜或神经元的退化。
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