JP2022551744A - Ａａｖ導入カセット - Google Patents
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Abstract
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生において使用されるＡＡＶ導入カセット及びプラスミドが本明細書に記載される。開示されるカセット及びプラスミドは、１つ以上の疾患又は障害、例えばニーマン・ピック病Ｃ１型（ＮＰＣ１）の改善、治療及び／又は予防における治療有効性を有する１つ以上の導入遺伝子を含む。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９２３，２５３号及び２０１９年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９１６，７４９号に対する優先権の主張し、そのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９２３，２５３号及び２０１９年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９１６，７４９号に対する優先権の主張し、そのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙複写物に代えてテキストフォーマットで提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、STRD_015_02WO_SeqList_ST25.txtである。ファイルは、約６７．６ｋｂであり、２０２０年１０月１４日に作成され、電子的に提出されている。
本出願に付随する配列表は、紙複写物に代えてテキストフォーマットで提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、STRD_015_02WO_SeqList_ST25.txtである。ファイルは、約６７．６ｋｂであり、２０２０年１０月１４日に作成され、電子的に提出されている。
分野
本開示は、分子生物学及び遺伝子療法の分野に関する。より具体的には、本開示は、組換えウイルスベクターを産生するための組成物及び方法に関する。
本開示は、分子生物学及び遺伝子療法の分野に関する。より具体的には、本開示は、組換えウイルスベクターを産生するための組成物及び方法に関する。
背景
ニーマン・ピック病Ｃ１型（ＮＰＣ１）は、エンドリソソームコンパートメント中のコレステロール蓄積により特徴付けられる神経変性障害である。これは、ＮＰＣ１、細胞内コレステロールトラフィッキングを媒介するエンドリソソームタンパク質をコードする遺伝子中の変異により引き起こされる。
ニーマン・ピック病Ｃ１型（ＮＰＣ１）は、エンドリソソームコンパートメント中のコレステロール蓄積により特徴付けられる神経変性障害である。これは、ＮＰＣ１、細胞内コレステロールトラフィッキングを媒介するエンドリソソームタンパク質をコードする遺伝子中の変異により引き起こされる。
ＮＰＣ１は、幼児、小児又は成人において見られ得る。新生児は、腹水及び肝臓の浸潤からの重度肝疾患及び／又は肺の浸潤からの呼吸器不全を呈し得る。肝疾患も肺疾患も有さない他の幼児は、低血圧症及び発育遅延を有する。典型的症状は、小児期中期から後期に生じ、遅発性運動失調、垂直性核上性注視麻痺（ＶＳＧＰ）及び認知症の潜行性の発症を伴う。ジストニア及び痙攣が一般的である。構音障害及び嚥下障害により最終的に日常生活に支障を来たし、経口摂取が不可能となり、通常、十代後半又は二十代で誤嚥性肺炎から死亡する。成人は、認知症又は精神的症状を呈する可能性がより高い。
２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）は、ＮＰＣ１動物モデルにおいてコレステロール及び脂質蓄積を低減させ、生存を延長することが示されている。しかしながら、Food and Drug Administration（ＦＤＡ）により承認されたＮＰＣ１の治療法は、存在しない。したがって、ＮＰＣ１を治療、治癒及び／又は予防する組成物及び方法が緊急に必要とされている。
概要
核酸（例えば、導入遺伝子を含む核酸）の送達のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生において使用されるＡＡＶ導入カセット、核酸及びプラスミドが本明細書に記載される。開示されるカセット、核酸及びプラスミドは、１つ以上の疾患又は障害、例えばＮＰＣ１の改善、治療及び／又は予防において治療有効性を有する１つ以上の導入遺伝子を発現させるために使用することができる配列を含む。
核酸（例えば、導入遺伝子を含む核酸）の送達のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生において使用されるＡＡＶ導入カセット、核酸及びプラスミドが本明細書に記載される。開示されるカセット、核酸及びプラスミドは、１つ以上の疾患又は障害、例えばＮＰＣ１の改善、治療及び／又は予防において治療有効性を有する１つ以上の導入遺伝子を発現させるために使用することができる配列を含む。
一部の実施形態において、本開示は、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットであって、イントロン配列を含むＡＡＶ導入カセットを提供する。一部の実施形態において、イントロン配列は、プロモーターと導入遺伝子との間に局在する。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む。
一部の実施形態において、本開示は、タンパク質カプシド及びタンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含む組換えＡＡＶベクターであって、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む導入カセットを含む、組換えＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態において、導入カセットは、イントロン配列、例えばプロモーターと導入遺伝子との間に局在するイントロン配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む。
一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する。５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３の配列又はそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。一部の実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号４の配列又はそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
一部の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＥＦ－１ショートプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択することができる。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター及びＨＳＶＴＫプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号５～８のいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一の配列を含む。
一部の実施形態において、イントロン配列は、キメラ配列又はハイブリッド配列である。一部の実施形態において、イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する配列を含む。一部の実施形態において、イントロン配列は、配列番号１０～１１のいずれか１つの配列を含む。
ＮＰＣ１タンパク質は、例えば、ヒトＮＰＣ１タンパク質であり得る。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一の配列を有する。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１の配列又はそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号２０の配列又はそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、UniProtアクセッション番号Ｏ１５１１８で示される配列を有する。
一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２の配列又はそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ウサギベータグロビン（ｒＢＧ）、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）から選択される。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２又は配列番号１３の配列を含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２又は１３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、エンハンサーをさらに含む。エンハンサーは、例えば、ＣＭＶエンハンサーであり得る。一部の実施形態において、エンハンサーは、配列番号９の配列又はそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
本開示のＡＡＶ導入カセットを含む核酸も本明細書で提供される。本開示のＡＡＶ導入カセットを含むプラスミド又はバクミドも本明細書で提供される。
タンパク質カプシド及びタンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含む組換えＡＡＶベクターであって、核酸は、本開示のＡＡＶ導入カセットを含む、組換えＡＡＶベクターも本明細書で提供される。
本開示のＡＡＶ導入カセットを含む細胞も提供される。
組換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ産生細胞を本開示のＡＡＶ導入カセット又はプラスミド／バクミドと接触させることを含む方法も提供される。本方法によって産生される組換えＡＡＶベクターも提供される。組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ及びウシＡＡＶから選択される血清型のものであり得る。組換えＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシドを含み得、カプシドタンパク質サブユニットは、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質サブユニットと比較して１つ以上の変異を含む。
本開示のＡＡＶ導入カセット、核酸（例えば、プラスミド又はバクミド）、細胞又は組換えＡＡＶベクターを含む組成物も提供される。
治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、治療有効量の本開示のＡＡＶ導入カセット、核酸（例えば、プラスミド）、細胞又は組換えＡＡＶベクターを投与することを含む方法も提供される。一部の実施形態において、対象は、ヒト対象である。一部の実施形態において、対象は、ＮＰＣ１を有する。
これら及び他の実施形態は、以下に記載される詳細な説明でより詳細に検討される。
図面の簡単な説明
野生型Ｕ２ＯＳ細胞、ＮＰＣ１欠損（ＮＰＣ１－／－）Ｕ２ＯＳ細胞及び５×１０３又は１０×１０３のいずれかの感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶ２－ｈＮＰＣを形質導入されたＮＰＣ１－／－細胞におけるLysoTracker（登録商標）蓄積を測定することにより決定されたリソソーム表現型を示すグラフである。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡを使用して決定した。エラーバーは、標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
野生型Ｕ２ＯＳ細胞、ＮＰＣ１欠損（ＮＰＣ１－／－）Ｕ２ＯＳ細胞及び５×１０３又は１０×１０３のいずれかの感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶ２－ｈＮＰＣを形質導入されたＮＰＣ１－／－細胞における、フィリピン染色を使用して決定されたコレステロール蓄積を示すグラフである。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡを使用して決定した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
生理食塩水又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１の眼窩静脈叢注射後のＮＰＣ１－／－マウスの生存率を示すカプラン・マイヤー生存曲線である。全てのＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１注射動物は、実験の継続期間にわたり生存し、組織学的分析のために約１００日齢で犠死させた。
野生型マウス、生理食塩水処理ＮＰＣ１－／－マウス又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１が注射されたＮＰＣ１－／－マウスの約１０週（７０日）齢における行動的表現型スコアを示す。統計的有意性は、対応のないＴ検定を使用して決定し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。
野生型マウス、生理食塩水処理ＮＰＣ１－／－マウス又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１で処理されたＮＰＣ１－／－マウスの約８週（５６日）齢における平均台歩行テストにおける転倒の回数を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。
詳細な説明
ＮＰＣ１を治療、予防及び／又は治癒するための遺伝子療法組成物及び方法が本明細書で提供される。より具体的には、本開示は、核酸、例えば導入遺伝子並びにＮＰＣ１を治療、予防及び／又は治癒するための核酸（ＡＡＶ導入カセットを含む）の送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。
ＮＰＣ１を治療、予防及び／又は治癒するための遺伝子療法組成物及び方法が本明細書で提供される。より具体的には、本開示は、核酸、例えば導入遺伝子並びにＮＰＣ１を治療、予防及び／又は治癒するための核酸（ＡＡＶ導入カセットを含む）の送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。
ＡＡＶは、遺伝子送達剤として有用であり、ヒト遺伝子療法のための強力なツールである。ＡＡＶを使用すると、高頻度ＤＮＡ送達及び安定的発現を種々の細胞においてインビボ及びインビトロの両方で達成することができる。一部の他のウイルスベクター系と異なり、ＡＡＶは、標的細胞中での安定的組込みのために活発な細胞分裂を要求しない。
本明細書に引用される全ての論文、刊行物及び特許は、あたかもそれぞれの個別の論文、刊行物又は特許が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に指示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれ、引用される刊行物と関連する方法及び／又は材料を開示及び記述するために参照により本明細書に組み込まれる。
文脈が特に示さない限り、本明細書に記載の種々の特徴は、任意の組み合わせで使用され得ることが具体的に意図される。
特に規定のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の詳細な説明において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、限定的であることを意図しない。
定義
以下の用語は、本明細書の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される。
以下の用語は、本明細書の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される。
単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」は、文脈が特に明らかに示さない限り、複数形も含むことが意図される。
さらに、「約」という用語は、本明細書において使用されるとき、測定可能な値、例えばポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度などの量を指す場合、規定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％又はさらに±０．１％の変動を包含することを意味する。
また、本明細書において使用されるとき、「及び／又は」は、付随する列記項目の１つ以上の任意の及び全ての可能な組み合わせ並びに択一（「又は」）で解釈された場合の組み合わせの欠如を指し、包含する。
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方が挙げられる）である。一部の実施形態において、本開示の核酸は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。核酸は、１～１，０００、１，０００～１０，０００、１０，０００～１００，０００、１００，０００～１００万又は１００万超のヌクレオチド長であり得る。核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有するが、一部の事例において、例えばホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホホロアミダイト結合を含む代替骨格並びにペプチド核酸骨格及び結合を有し得る核酸類似体が含まれる。他の類似体核酸としては、正の骨格、非イオン性骨格及び非リボース骨格を有するものが挙げられる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸も核酸の定義内に含まれる。リボース－リン酸骨格のこれらの修飾は、標識の添加を容易にし得るか、又は生理的環境におけるそのような分子の安定性及び半減期を増加させ得る。本開示の核酸は、直線状であり得るか、又は環状（例えば、プラスミド）であり得る。
「ＡＡＶ導入カセット」は、ＡＡＶベクターの生成において使用することができる核酸である。
本明細書において使用されるとき、「ウイルスベクター（virus vector）」又は「ウイルスベクター（viral vector）」という用語は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン又はウイルス様粒子内にパッケージングされた核酸（例えば、導入遺伝子を含む核酸）を含むウイルス粒子を指す。本開示の例示的なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターが挙げられる。
「アデノ随伴ウイルスベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、典型的には、タンパク質カプシド及びタンパク質カプシドによってカプシド化された核酸（例えば、導入遺伝子を含む核酸）を含む。「タンパク質カプシド」は、Ｔ＝１の二十面体対称で会合及び配置された個々の「カプシドタンパク質サブユニット」（例えば、約６０個のカプシドタンパク質サブユニット）を含むほぼ球形のタンパク質シェルである。本明細書に記載のＡＡＶベクターのタンパク質カプシドは、複数のカプシドタンパク質サブユニットを含む。ＡＡＶベクターがＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含むとして本明細書に記載される場合、ＡＡＶベクターは、タンパク質カプシドを含み、タンパク質カプシドは、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含むことが理解される。本明細書において使用されるとき、「カプシドタンパク質」という用語は、カプシドタンパク質サブユニットを指すために使用されることがある。「ウイルス様粒子（viral-like particle）」又は「ウイルス様粒子（virus-like particle）」という用語は、導入カセット又は導入遺伝子を含むいかなるベクターゲノムも核酸も含まないタンパク質カプシドを指す。
本明細書において使用されるとき、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、限定されるものではないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（例として３Ａ及び３Ｂ型）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶ ｒｈ３２．３３型、ＡＡＶ ｒｈ８型、ＡＡＶ ｒｈ１０型、ＡＡＶ ｒｈ７４型、ＡＡＶ ｈｕ．６８型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ及び現在公知の又は後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、表１を参照されたい。
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、ウイルス産生細胞系を使用して培養物中で産生することができる。「ウイルス産生細胞（viral production cell）」、「ウイルス産生細胞系」又は「ウイルス産生細胞（viral producer cell）」という用語は、ウイルスベクターを産生するために使用される細胞を指す。ＨＥＫ２９３及び２３９Ｔ細胞が一般的なウイルス産生細胞系である。以下の表２は、種々のウイルスベクターのための例示的なウイルス産生細胞系を列記する。ｒＡＡＶの産生は、典型的には、細胞において３つのエレメント：１）ＡＡＶ逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列によりフランキングされた導入遺伝子、２）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及び３）ヘルパーウイルスタンパク質配列の存在を要求する。これらの３つのエレメントは、１つ以上のプラスミド上で提供し、細胞中に形質移入又は形質導入することができる。
「ＨＥＫ２９３」は、元々組織培養物中で増殖させたヒト胎児腎細胞に由来する細胞系を指す。ＨＥＫ２９３細胞系は、培養物中で容易に増殖し、ウイルス産生のために一般に使用される。本明細書において使用されるとき、「ＨＥＫ２９３」は、１つ以上のバリアントＨＥＫ２９３細胞系、すなわち１つ以上の遺伝子変化をさらに含む、元のＨＥＫ２９３細胞系に由来する細胞系も指し得る。多くのバリアントＨＥＫ２９３系は、１つ以上の特定の用途のために開発及び最適化されてきた。例えば、２９３Ｔ細胞系は、ＳＶ４０複製起点を含有する形質移入されたプラスミドのエピソーム複製を可能とするＳＶ４０ラージＴ抗原を含有し、所望の遺伝子産物の発現の増加を導く。
「Ｓｆ９」は、親スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞系ＩＰＬＢ－Ｓｆ－２１－ＡＥに由来するクローン単離体である昆虫細胞系を指す。Ｓｆ９細胞は、血清の不存在下で増殖させることができ、接着培養するか又は懸濁液中で培養することができる。
「形質移入試薬」は、細胞中への核酸の移行を向上させる組成物を意味する。当技術分野において一般に使用される一部の形質移入試薬としては、核酸に及び細胞表面に結合する１つ以上の脂質（例えば、Lipofectamine（商標））が挙げられる。
本明細書において使用されるとき、「感染多重度」又は「ＭＯＩ」という用語は、細胞と接触するビリオンの数を指す。例えば、培養細胞は、１細胞当たり１×１０２～１×１０５個のビリオンの範囲のＭＯＩでＡＡＶと接触させることができる。
本明細書において使用されるとき、「有効量」は、対象における疾患若しくは障害を治療若しくは予防するため又はその徴候若しくは症状を改善するために有効である、本明細書で提供されるＡＡＶベクター、核酸又は他の薬剤の量である。「有効量」は、例えば、疾患及び／又は疾患の症状、疾患の重症度及び／又は疾患若しくは障害の症状、年齢、体重及び／又は治療される患者の健康並びに処方医の判断に応じて変動し得る。任意の所与の例における適切な量は、当業者が確認することができるか、又は定型的な実験により決定することができる。
２つ以上のアミノ酸配列間の配列類似性又は同一性を決定する方法は、当技術分野において公知である。配列類似性又は同一性は、核酸の全長又は核酸の示される一部について決定することができる。配列類似性又は同一性は、当技術分野において公知の標準的技術、例として、限定されるものではないが、Smith&Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)の局所配列同一性アルゴリズムを使用して、Needleman&Wunsch, J Mol. Biol. 48, 443 (1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson&Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Wisconsin Genetics Software PackageにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI）により、Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)により記載されたBest Fit配列プログラム又は目視により決定することができる。
別の好適なアルゴリズムは、Altschul et al., J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)及びKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.htmlから得られたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメータを使用し、それらは、任意選択で、デフォルト値に設定される。パラメータは、動的な値であり、特定の配列の組成及び目的配列が検索されている特定のデータベースの組成に応じてプログラム自体により構築されるが、それらの値を調整して感度を増加させることができる。
さらに、追加の有用なアルゴリズムは、Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402に報告されているようなギャップＢＬＡＳＴである。
本開示の目的のため、特に示されない限り、同一性パーセントは、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいてオンラインで利用可能なBasic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）を使用して計算される。当業者は、他のアルゴリズムに適宜置き換え得ることを理解する。
逆位末端リピート
逆位末端リピート又はＩＴＲ配列は、ＡＡＶプロウイルス組込みを媒介する、ビリオン中へのＡＡＶ ＤＮＡのパッケージングのための配列である。ＩＴＲは、ＡＡＶ生活環における種々の活性に関与する。例えば、ＩＴＲ配列は、ヘアピン構造を形成し得、形質移入後のプラスミドからの切出し、ベクターゲノムの複製並びに組込み及び宿主細胞ゲノムからのレスキューにおける役割を果たす。
逆位末端リピート又はＩＴＲ配列は、ＡＡＶプロウイルス組込みを媒介する、ビリオン中へのＡＡＶ ＤＮＡのパッケージングのための配列である。ＩＴＲは、ＡＡＶ生活環における種々の活性に関与する。例えば、ＩＴＲ配列は、ヘアピン構造を形成し得、形質移入後のプラスミドからの切出し、ベクターゲノムの複製並びに組込み及び宿主細胞ゲノムからのレスキューにおける役割を果たす。
本開示のＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含み得る。ＩＴＲ配列は、約１１０～約１６０ヌクレオチド長、例えば１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９又は１６０ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、ＩＴＲ配列は、約１４１ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲよりも長く、他の実施形態において、３’ＩＴＲは、５’ＩＴＲよりも長い。
ＩＴＲは、任意のＡＡＶ、例えば表１に列記されるＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来する。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ以外の別のパルボウイルス種のメンバーから単離され、それに由来する野生型又は変異ＩＴＲであり得る。例えば、一部の実施形態において、ＩＴＲは、ボカウイルス又はパルボウイルスＢ１９から単離されるか又はそれに由来する野生型又は変異ＩＴＲであり得る。
一部の実施形態において、ＩＴＲは、ｓｃＡＡＶの産生を促進するための修飾を含む。一部の実施形態において、ｓｃＡＡＶの産生を促進するための修飾は、ＩＴＲからの末端解離配列（ＴＲＳ）の欠失である。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり、３’ＩＴＲは、末端解離配列を欠く変異ＩＴＲである。一部の実施形態において、３’ＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり、５’ＩＴＲは、末端解離配列を欠く変異ＩＴＲである。一部の実施形態において、末端解離配列は、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの両方で不存在である。他の実施形態において、ｓｃＡＡＶの産生を促進するための修飾は、異なるヘアピン形成配列、例えばｓｈＲＮＡ形成配列によるＩＴＲの置き換えである。
一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含み得る。一部の実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号４の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含み得る。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含み、３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、１つ以上の「代理」ＩＴＲ、すなわちＩＴＲと同じ機能を提供する非ＩＴＲ配列を含む。例えば、Xie, J. et al., Mol. Ther., 25 (6): 1363-1374 (2017)を参照されたい。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセット中のＩＴＲは、代理ＩＴＲにより置き換えられる。一部の実施形態において、代理ＩＴＲは、ヘアピン形成配列を含む。一部の実施形態において、代理ＩＴＲは、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ形成配列である。
プロモーター、エンハンサー、リプレッサー及び他の調節配列
遺伝子発現は、所与のタンパク質についてのコード領域をフランキングするプロモーター及びエンハンサーと呼ばれるヌクレオチド配列により制御することができる。
遺伝子発現は、所与のタンパク質についてのコード領域をフランキングするプロモーター及びエンハンサーと呼ばれるヌクレオチド配列により制御することができる。
本明細書において使用されるとき、「プロモーター」という用語は、作動可能に連結された核酸の転写を指令する１つ以上の核酸制御配列を指す。プロモーターは、転写の開始部位付近の核酸配列、例えばＴＡＴＡエレメントを含み得る。プロモーターは、転写因子により結合され得るシス作用ポリヌクレオチド配列も含み得る。
「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境的及び発生的条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的又は発生的調節下で活性なプロモーターである。「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター又は転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との間の機能的な連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指令する。
遺伝子発現は、転写の開始部位から数千塩基対ほどに局在し得る１つ以上の遠位「エンハンサー」又は「リプレッサー」エレメントによっても制御することができる。エンハンサー又はリプレッサーエレメントは、転写の開始部位から離れてエンハンサーエレメントが作用し得る例外を除き、転写の開始部位付近でシス作用エレメントに類似した方式で転写を調節する。
一部の実施形態において、本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットは、プロモーターを含む。プロモーターは、例えば、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。一部の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセット中で使用することができる例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター及びＥＦ－１アルファショートプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号５～８のいずれか１つから選択される配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットは、エンハンサーを含む。エンハンサーは、例えば、ＣＭＶエンハンサーであり得る。一部の実施形態において、エンハンサーは、配列番号９の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む。
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセット中で使用することができる例示的な組織特異的プロモーター及びエンハンサーの非限定的なリストとしては、ＨＭＧ－ＣＯＡレダクターゼプロモーター、ステロール調節エレメント１（ＳＲＥ－１）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）プロモーター、ヒトグルコキナーゼプロモーター、コレステロール７－アルファヒドロイラーゼ（ＣＹＰ－７）プロモーター、ベータ－ガラクトシダーゼアルファ－２，６シアリルトランスフェラーゼプロモーター、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ－１）プロモーター、アルドラーゼＢプロモーター、ヒトトランスフェリンプロモーター、コラーゲンＩ型プロモーター、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）プロモーター、９４の前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ９４）プロモーター、前立腺特異的抗原複合体プロモーター、ヒト腺性カリクレイン遺伝子プロモーター（ｈｇｔ－１）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２、筋クレアチンキナーゼプロモーター、膵炎関連タンパク質プロモーター（ＰＡＰ）、エラスターゼ１転写エンハンサー、膵特異的アミラーゼ及びエラスターゼエンハンサープロモーター、膵コレステロールエラスターゼ遺伝子プロモーター、ウテログロビンプロモーター、コレステロール側鎖開裂（ＳＣＣ）プロモーター、ガンマ－ガンマエノラーゼ（ニューロン特異的エノラーゼ、ＮＳＥ）プロモーター、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）プロモーター、ヒトＣＧＬ－１／グランザイムＢプロモーター、末端デオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ラムダ５、ＶｐｒｅＢ及びｌｃｋ（リンパ球特異的チロシンタンパク質キナーゼｐ５６１ｃｋ）プロモーター、ヒトＣＤ２プロモーター及びその３’転写エンハンサー、ヒトＮＫ及びＴ細胞特異的活性化（ＮＫＧ５）プロモーター、ｐｐ６０ｃ－ｓｒｃチロシンキナーゼプロモーター、器官特異的ネオ抗原（ＯＳＮ）、分子量４０ｋＤａ（ｐ４０）プロモーター、結腸特異的抗原－Ｐプロモーター、ヒトアルファ－ラクトアルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーター、カゼインプロモーター、ＩｇＧプロモーター、絨毛性胎児性抗原プロモーター、エラスターゼプロモーター、ポルホビリノゲンデアミナーゼプロモーター、インスリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、アセチルコリン受容体プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、アルファ又はベータグロビンプロモーター、Ｔ細胞受容体プロモーター、オステオカルシンプロモーター、ＩＬ－２プロモーター、ＩＬ－２受容体プロモーター、乳清（ｗａｐ）プロモーター並びにＭＨＣクラスＩＩプロモーターが挙げられる。
導入遺伝子
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットは、標的細胞中での発現のための導入遺伝子を含む。
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットは、標的細胞中での発現のための導入遺伝子を含む。
導入遺伝子は、（１つ以上の）任意の目的異種核酸配列であり得る。このような核酸としては、ポリペプチド、例として治療（例えば、医学的又は獣医学的使用のための）又は免疫原性（例えば、ワクチンのための）ポリペプチド又はＲＮＡをコードする核酸を挙げることができる。代わりに、核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム、スプライセオソーム媒介／ｒａｍスプライシングを付与するＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、例として遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ及び他の非翻訳ＲＮＡをコードし得る。一部の実施形態において、核酸配列は、遺伝子編集を指令し得る。例えば、核酸は、遺伝子編集分子、例えばガイドＲＮＡ又はヌクレアーゼをコードし得る。一部の実施形態において、核酸は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＮｇＡｇｏ（アグロノート（エンドヌクレアーゼ）、ＳＧＮ（構造ガイド型エンドヌクレアーゼ）又はＲＧＮ（ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ）、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードし得る。一部の実施形態において、核酸は、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有し、それと組換わり得る。このアプローチを利用して、例えば宿主細胞における遺伝子欠損を修正することができる。
本開示によるウイルスベクターは、導入遺伝子を広範な細胞、例として分裂及び非分裂細胞中に送達する手段を提供する。ウイルスベクターを用いて、例えばインビトロでポリペプチドを産生するため又はエクスビボ遺伝子療法のため、インビトロで細胞に導入遺伝子を送達することができる。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性若しくは治療ポリペプチド又は機能性ＲＮＡを発現させるため、導入遺伝子を、それを必要とする対象に送達する方法においてさらに有用である。この様式において、ポリペプチド又は機能性ＲＮＡは、対象においてインビボで産生され得る。対象は、ポリペプチドの欠損を有するため、対象は、ポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチド又は機能性ＲＮＡの産生が一部の有益な効果を付与し得るため、その方法を実施することができる。本明細書において使用されるとき、「機能性ＲＮＡ」という用語は、細胞において１つ以上の機能を有する任意の非コードＲＮＡ配列、例えば上記段落に記載のものを指す。
ウイルスベクターを使用して、培養細胞における又は対象における目的ポリペプチド又は機能性ＲＮＡの産生のために核酸を送達することもできる（例えば、ポリペプチドを産生するため又は例えばスクリーニング方法と連動して、対象に対する機能性ＲＮＡの効果を観察するために対象をバイオリアクターとして使用する）。
一般に、本開示のウイルスベクターを用いて、ポリペプチド又は機能性ＲＮＡをコードする導入遺伝子を送達して、治療ポリペプチド又は機能性ＲＮＡを送達することが有益である任意の疾患状態を治療及び／又は予防することができる。
一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１の治療に有用である。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする。ＮＰＣ１タンパク質は、例えば、ヒトＮＰＣ１タンパク質であり得る。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一の配列を有する。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、表３（番号付けは、配列番号１に基づく）に列記される単一アミノ酸変化の１つ以上を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、表３（番号付けは、配列番号２０に基づく）に列記されるアミノ酸変化の１つ以上を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質のトランケート形態である。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１の配列又はそれと少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号２０の配列又はそれと少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１又は２０の配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上のアミノ酸変化を有する配列番号１又は２０の配列を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、表３に列記されるアミノ酸変化の１つ以上を有する配列番号１又は２０の配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする。
一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２の配列又はそれと少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２の配列又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上の核酸変化を有する配列を含む。
ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル
ポリアデニル化シグナルは、ほぼ全ての哺乳動物遺伝子中で見出されるヌクレオチド配列であり、遺伝子転写物の３’末端への一続きのおよそ２００個のアデノシン残基（ポリ（Ａ）テール）の付加を制御する。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、ポリ（Ａ）テールを欠くｍＲＮＡは、急速に分解される。ポリ（Ａ）テールの存在が翻訳の開始に影響を与えることにより、ｍＲＮＡの翻訳可能性に正に寄与するという証拠もある。
ポリアデニル化シグナルは、ほぼ全ての哺乳動物遺伝子中で見出されるヌクレオチド配列であり、遺伝子転写物の３’末端への一続きのおよそ２００個のアデノシン残基（ポリ（Ａ）テール）の付加を制御する。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、ポリ（Ａ）テールを欠くｍＲＮＡは、急速に分解される。ポリ（Ａ）テールの存在が翻訳の開始に影響を与えることにより、ｍＲＮＡの翻訳可能性に正に寄与するという証拠もある。
一部の実施形態において、本開示のＡＡＶ導入カセットは、ポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のポリアデニル化シグナルから選択することができる。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２又は配列番号１３の配列を含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２又は配列番号１３の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
スタッファー配列
ＡＡＶベクターは、典型的には、一般に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ又はそれよりわずかに大きい範囲の定義されたサイズ範囲を有するＤＮＡのインサートを許容する。したがって、より短い導入遺伝子配列について、追加の核酸を含めてＡＡＶベクターに許容可能な要求される長さを達成することが必要であり得る。したがって、一部の実施形態において、本開示のＡＡＶ導入カセットは、スファー（ｓｕｆｆｅｒ）配列を含み得る。スタッファー配列は、例えば、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１，０００、１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、２，０００～２，５００、２，５００～３，０００、３，０００～３，５００、３，５００～４，０００、４，０００～４，５００から４，５００～５，０００ヌクレオチド長の配列であり得る。スタッファー配列は、それがベクターの機能や活性を妨げないように、カセット中に任意の所望位置で局在させることができる。
ＡＡＶベクターは、典型的には、一般に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ又はそれよりわずかに大きい範囲の定義されたサイズ範囲を有するＤＮＡのインサートを許容する。したがって、より短い導入遺伝子配列について、追加の核酸を含めてＡＡＶベクターに許容可能な要求される長さを達成することが必要であり得る。したがって、一部の実施形態において、本開示のＡＡＶ導入カセットは、スファー（ｓｕｆｆｅｒ）配列を含み得る。スタッファー配列は、例えば、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１，０００、１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、２，０００～２，５００、２，５００～３，０００、３，０００～３，５００、３，５００～４，０００、４，０００～４，５００から４，５００～５，０００ヌクレオチド長の配列であり得る。スタッファー配列は、それがベクターの機能や活性を妨げないように、カセット中に任意の所望位置で局在させることができる。
イントロン配列
一部の実施形態において、本開示のＡＡＶ導入カセットは、イントロン配列を含み得る。イントロン配列の包含は、イントロン配列の不存在下での発現と比較して発現を向上させ得る。一部において、イントロン配列は、転写因子の結合部位として機能せずに遺伝子発現を増加させ得る。例えば、イントロン配列は、転写速度、核輸送及び転写物安定性に影響を与えることにより転写物レベルを増加させ得る。一部の実施形態において、イントロン配列は、ｍＲＮＡ翻訳の効率を増加させる。
一部の実施形態において、本開示のＡＡＶ導入カセットは、イントロン配列を含み得る。イントロン配列の包含は、イントロン配列の不存在下での発現と比較して発現を向上させ得る。一部において、イントロン配列は、転写因子の結合部位として機能せずに遺伝子発現を増加させ得る。例えば、イントロン配列は、転写速度、核輸送及び転写物安定性に影響を与えることにより転写物レベルを増加させ得る。一部の実施形態において、イントロン配列は、ｍＲＮＡ翻訳の効率を増加させる。
一部の実施形態において、イントロン配列は、ハイブリッド又はキメラ配列である。一部の実施形態において、イントロン配列は、ＳＶ４０、β－グロビン、ニワトリβ－アクチン、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、第ＩＸ因子及び／又はヒトＩｇＧ（重鎖又は軽鎖）の１つ以上のイントロン配列から単離されるか又はそれに由来する。一部の実施形態において、イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する。一部の実施形態において、イントロン配列は、キメラである。一部の実施形態において、イントロン配列は、配列番号１０若しくは配列番号１１の配列又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
イントロン配列は、それがＡＡＶベクターの産生を妨害しない導入カセットのいずれの場所にも局在させることができる。例えば、一部の実施形態において、イントロン配列は、プロモーターと導入遺伝子との間に局在させることができる。
ＡＡＶ導入カセット
一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットは、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、導入カセットは、イントロン配列、例えばプロモーターと導入遺伝子との間のイントロン配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、エンハンサーを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、イントロン配列を含む。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含み、３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む。一部の実施形態において、エンハンサーは、配列番号９の配列を含む。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号５～８のいずれか１つの配列を含む。一部の実施形態において、イントロン配列は、配列番号１０又は１１の配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態において、ポリＡシグナルは、配列番号１２又は１３の配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４の配列を含む。
一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットは、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、導入カセットは、イントロン配列、例えばプロモーターと導入遺伝子との間のイントロン配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、エンハンサーを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、イントロン配列を含む。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含み、３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む。一部の実施形態において、エンハンサーは、配列番号９の配列を含む。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号５～８のいずれか１つの配列を含む。一部の実施形態において、イントロン配列は、配列番号１０又は１１の配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態において、ポリＡシグナルは、配列番号１２又は１３の配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４の配列を含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、キメライントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ｒＢＧポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ｒＢＧポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、キメライントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ｒＢＧポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号５の配列を含むＣＢＡプロモーター、配列番号１０の配列を含むＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号１）をコードする導入遺伝子、配列番号１２を含むＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び配列番号４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号６の配列を含むＧＵＳＢ２４０プロモーター、配列番号１１を含むキメライントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号１）をコードする導入遺伝子、配列番号１３を含むｒＢＧポリアデニル化シグナル及び配列番号４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号６を含むＧＵＳＢ３７９プロモーター、配列番号１０の配列を含むＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号１）をコードする導入遺伝子、配列番号１３を含むｒＢＧポリアデニル化シグナル及び配列番号４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号７を含むＧＵＳＢ２４０プロモーター、配列番号１１の配列を含むキメライントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号１）をコードする導入遺伝子、配列番号１２を含むＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び配列番号４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号６を含むＧＵＳＢ２４０プロモーター、配列番号１０の配列を含むＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号１）をコードする導入遺伝子、配列番号１２を含むＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び配列番号４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３の配列を含む５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、配列番号８を含むＨＳＶＴＫプロモーター、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号１）をコードする導入遺伝子、配列番号１３を含むｒＢＧポリアデニル化シグナル及び配列番号４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
一部の実施形態において、核酸は、ＡＡＶ導入カセットを含む。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子を含み、導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子を含み、導入遺伝子は、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含み、導入遺伝子は、配列番号１又は配列番号２０のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、イントロン配列、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含み、導入遺伝子は、配列番号１又は配列番号２０のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、イントロン配列、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含み、導入遺伝子は、配列番号１又は配列番号２０のアミノ酸配列をコードする。
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットは、標準的な分子生物学技術を使用してプラスミド又はバクミド中に取り込むことができる。プラスミド又はバクミドは、ＡＡＶの産生中に使用される１つ以上の遺伝子エレメント、例として例えばＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルスタンパク質配列をさらに含み得る。
ＡＡＶ産生方法
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセット及びＡＡＶ導入カセットを含む核酸（例えば、プラスミド）を使用して組換えＡＡＶベクターを産生することができる。
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセット及びＡＡＶ導入カセットを含む核酸（例えば、プラスミド）を使用して組換えＡＡＶベクターを産生することができる。
一部の実施形態において、組換えＡＡＶベクターを産生する方法は、ＡＡＶ産生細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）を本開示のＡＡＶ導入カセット又は核酸（例えば、プラスミド）と接触させることを含む。一部の実施形態において、方法は、ＡＡＶ産生細胞を、例えばＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルスタンパク質配列をコードする１つ以上の追加のプラスミドと接触させることをさらに含む。
一部の実施形態において、組換えＡＡＶベクターを産生する方法は、ＡＡＶ産生細胞（例えば、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞）を、本開示のＡＡＶ導入カセットを含む少なくとも１つの昆虫細胞適合性核酸と接触させることを含む。「昆虫細胞適合性」核酸は、昆虫細胞中に形質転換又は形質移入することができ、その細胞の転写及び／又は翻訳機構により認識され得る任意の核酸である。一部の実施形態において、昆虫細胞適合性核酸は、バキュロウイルス核酸である。一部の実施形態において、方法は、ＡＡＶが産生されるような条件下で昆虫細胞を維持することをさらに含む。
産生される組換えＡＡＶベクターは、任意の血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ及びウシＡＡＶのものであり得る。一部の実施形態において、産生される組換えＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシドを含み得、カプシドタンパク質サブユニットは、天然ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットと比較して１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換及び／又は欠失）を含む。例えば、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ及びウシＡＡＶに由来する修飾ＡＡＶベクターであり得る。
組換えＡＡＶベクターを使用して、例えば組換えＡＡＶベクターを標的細胞と接触させることにより標的細胞を導入遺伝子で形質導入することができる。
組成物
本開示のＡＡＶ導入カセット、プラスミド、細胞又は組換えＡＡＶベクターを含む組成物も提供される。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤をさらに含み得る。
本開示のＡＡＶ導入カセット、プラスミド、細胞又は組換えＡＡＶベクターを含む組成物も提供される。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤をさらに含み得る。
治療の方法
本開示のＡＡＶベクターを使用して、疾患、障害又は他の病態の治療又は予防を必要とする対象における疾患、障害又は他の病態を治療又は予防することができる。対象は、例えば、ヒト又は動物であり得る。ヒトは、小児対象、若年成人対象、成人対象又は高齢者対象であり得る。
本開示のＡＡＶベクターを使用して、疾患、障害又は他の病態の治療又は予防を必要とする対象における疾患、障害又は他の病態を治療又は予防することができる。対象は、例えば、ヒト又は動物であり得る。ヒトは、小児対象、若年成人対象、成人対象又は高齢者対象であり得る。
したがって、本開示のさらなる態様は、本開示のウイルスベクター、ウイルス粒子及び／又はウイルス様粒子を対象に投与する方法である。
本開示は、核酸を対象に送達する方法であって、対象に、本開示のウイルスベクター及び／又は組成物を投与することを含む方法も提供する。本開示によるウイルスベクター及び／又は組成物の投与を必要とする対象への本開示によるウイルスベクター及び／又は組成物の投与は、当技術分野において公知の任意の手段によるものであり得る。任意選択で、ウイルスベクター及び／又は組成物を薬学的に許容可能な担体中において有効用量（例えば、治療有効用量）で送達する。好ましい実施形態において、有効量のウイルスベクター及び／又は組成物を送達する。
対象に投与されるウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子の投与量は、投与方式、治療及び／又は予防される疾患又は病態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター又は粒子並びに送達される核酸などに依存し、定型的な様式で決定することができる。一部の実施形態において、組換えＡＡＶの用量は、有効用量である。例示的な有効用量は、例えば、少なくとも約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５形質導入単位、任意選択で約１０８～約１０１３形質導入単位の用量であり得る。一部の実施形態において、組換えＡＡＶの有効用量は、対象の体重１キログラム当たり約１×１０１１～約１×１０１５個のベクターゲノムの範囲の用量である。例えば、有効用量は、対象の体重１キログラム当たり約１×１０１１、約５×１０１１、約１×１０１２、約５×１０１２、約１×１０１３、約５×１０１３、約１×１０１４、約５×１０１４又は約１×１０１５個のベクターゲノムであり得る。
特定の実施形態において、２回以上の投与（例えば、２、３、４回以上の投与）を用いて、種々の間隔の期間にわたり、例えば毎日、毎週、毎月、毎年などで所望レベルの遺伝子発現を達成することができる。
例示的な投与方式としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（又は卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［例として、骨格筋、横隔膜筋及び／又は心筋への投与］、皮内、胸腔内、脳内及び関節内）、局所（例えば、皮膚及び粘膜表面の両方への例として気道表面及び経皮投与）、リンパ管内など、並びに組織又は器官の直接的注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋又は脳への）が挙げられる。投与は、腫瘍へ（例えば、腫瘍又は流入領域リンパ節中で又はその付近）のものでもあり得る。任意の所与の例における最も好適な経路は、治療及び／又は予防されている病態の性質及び重症度並びに使用されている特定のＡＡＶベクターの性質に依存する。
標的組織への送達は、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を含むデポ剤を送達することによっても達成することができる。本明細書に記載されるとき、「デポ剤」の送達は、ウイルスが標準的注射について考えられるよりも長い期間作用し得るようにウイルスの徐放及び／又は漸次的な広がりを可能とする持続作用配合物の投与を指す。代表的な実施形態において、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を含むデポ剤を骨格筋、心筋及び／又は横隔膜筋組織中に埋め込み又は組織を、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を含むフィルム若しくは他のマトリックスと接触させることができる。
一部の実施形態において、治療を必要とする対象を治療する方法は、対象に、有効量（例えば、治療有効量）の本開示のＡＡＶ導入カセット、プラスミド、細胞又は組換えＡＡＶを投与することを含む。一部の実施形態において、対象は、ヒト対象である。一部の実施形態において、対象は、ＮＰＣ１を有する。
実施例
以下の実施例は、説明目的のみのために本明細書に含まれ、限定することを意図されない。
以下の実施例は、説明目的のみのために本明細書に含まれ、限定することを意図されない。
実施例１：哺乳動物細胞における組換えＡＡＶベクターの調製
３つのプラスミドを提供する。第１のプラスミドは、２つのＩＴＲ（配列番号３及び４）によりフランキングされたＮＰＣ１をコードする導入遺伝子（配列番号２）を含む導入カセットを含む。第１のプラスミドは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む。第２のプラスミドは、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質をコードする配列を含む。第３のプラスミドは、ＡＡＶ産生に要求される種々の「ヘルパー」因子（Ｅ４、Ｅ２ａ及びＶＡ）を含む。
３つのプラスミドを提供する。第１のプラスミドは、２つのＩＴＲ（配列番号３及び４）によりフランキングされたＮＰＣ１をコードする導入遺伝子（配列番号２）を含む導入カセットを含む。第１のプラスミドは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む。第２のプラスミドは、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質をコードする配列を含む。第３のプラスミドは、ＡＡＶ産生に要求される種々の「ヘルパー」因子（Ｅ４、Ｅ２ａ及びＶＡ）を含む。
３つのプラスミドを、適切な形質移入試薬（例えば、Lipofectamine（商標））を使用して、ウイルス産生細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）中に形質移入する。３７℃での所定期間のインキュベーション後、ＡＡＶ粒子を培地から収集するか、又は細胞を溶解させてＡＡＶ粒子を放出させる。次いで、ＡＡＶ粒子を精製し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又は液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）のいずれかを標準的方法に従って使用して力価測定する。ＡＡＶ粒子は、後の使用のために－８０℃で貯蔵することができる。
実施例２：昆虫細胞における組換えＡＡＶベクターの調製
第１の組換えバキュロウイルスベクターを提供する。第１の組換えバキュロウイルスベクターは、ＮＰＣ１をコードする導入遺伝子（配列番号２）を含む導入カセットを含む核酸を含み、導入遺伝子は、２つのＩＴＲ（配列番号３及び４）によりフランキングされる。導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれかの１つの配列を含む。
第１の組換えバキュロウイルスベクターを提供する。第１の組換えバキュロウイルスベクターは、ＮＰＣ１をコードする導入遺伝子（配列番号２）を含む導入カセットを含む核酸を含み、導入遺伝子は、２つのＩＴＲ（配列番号３及び４）によりフランキングされる。導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれかの１つの配列を含む。
昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）を、第１の組換えバキュロウイルスベクター並びにＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐタンパク質をコードする核酸を含む少なくとも１つの追加の組換えバキュロウイルスベクターで懸濁培養物中において共感染させる。２８℃での所定期間のインキュベーション後、ＡＡＶ粒子を培地から収集するか、又は細胞を溶解させてＡＡＶ粒子を放出させる。次いで、ＡＡＶ粒子を精製し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又は液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）のいずれかを標準的方法に従って使用して力価測定する。ＡＡＶ粒子は、後の使用のために－８０℃で貯蔵することができる。
実施例３：インビトロ効力アッセイ
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットが培養細胞中でＮＰＣ１リソソーム表現型をレスキューし得るか否かを判定するため、ｈＮＰＣ１導入カセット（配列番号１４）をパッケージングする組換えＡＡＶ２ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞中で三重形質移入プロトコル（例えば、実施例１を参照されたい）を使用して調製した。次いで、ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１ベクターを使用して、野生型Ｕ２ＯＳ細胞（骨肉腫）及びＮＰＣ１を発現しないＵ２ＯＳ細胞（ＮＰＣ－／－）をインビトロで５×１０３（５Ｋ）又は１０×１０３（１０Ｋ）のいずれかの感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。次いで、細胞を５％ＣＯ２雰囲気中において３７℃でインキュベートした。
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットが培養細胞中でＮＰＣ１リソソーム表現型をレスキューし得るか否かを判定するため、ｈＮＰＣ１導入カセット（配列番号１４）をパッケージングする組換えＡＡＶ２ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞中で三重形質移入プロトコル（例えば、実施例１を参照されたい）を使用して調製した。次いで、ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１ベクターを使用して、野生型Ｕ２ＯＳ細胞（骨肉腫）及びＮＰＣ１を発現しないＵ２ＯＳ細胞（ＮＰＣ－／－）をインビトロで５×１０３（５Ｋ）又は１０×１０３（１０Ｋ）のいずれかの感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。次いで、細胞を５％ＣＯ２雰囲気中において３７℃でインキュベートした。
ＮＰＣ１細胞は、リソソーム中でコレステロールの特徴的な蓄積を呈し、それは、細胞中のリソソームのサイズ及び数を観察することによりモニタリングすることができる。このアッセイにおいて、細胞中の蛍光オルガネラ色素LysoTracker（登録商標）（ThermoFisher Scientific（登録商標））の蓄積を測定することによりリソソーム表現型をモニタリングした。ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１ベクターでの形質導入の７２時間後、５０ｍＭのLysoTracker（登録商標）を細胞に添加した。２時間後、細胞を固定し、LysoTracker（登録商標）蛍光を測定した。
結果を図１Ａに示す。予測されるとおり、野生型Ｕ２ＯＳ細胞は、リソソーム中のLysoTracker（登録商標）蛍光の有意な蓄積を示さなかった一方、ＮＰＣ１－／－細胞は、それを示した。ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１を５Ｋ又は１０ＫのいずれかのＭＯＩで形質導入された細胞は、リソソーム中のLysoTracker（登録商標）蛍光の有意に低減した蓄積を有した。
別個のアッセイにおいて、ｈＮＰＣ１を形質導入された細胞を固定し、コレステロールについての組織化学的染色剤のフィリピンを使用して染色した。フィリピン染色剤は、ストレプトマイセス・フィリピネンシス（Streptomyces filipinensis）に由来し、Polysciencesから購入し、５０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用した。Pico Automated Cell Imaging System（ImageXpress（登録商標））を使用して細胞を可視化し、フィリピン染色剤を定量した。結果を図１Ｂに示す。予測されるとおり、野生型Ｕ２ＯＳ細胞は、有意なコレステロール蓄積を示さなかった一方、ＮＰＣ１－／－細胞は、それを示した。ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１を５Ｋ又は１０ＫのいずれかのＭＯＩで形質導入された細胞は、有意に低減したコレステロール蓄積を有した。
まとめると、これらのデータは、ＡＡＶ２－ｈＮＰＣを使用する細胞の形質導入がＮＰＣ１欠損Ｕ２ＯＳ細胞におけるリソソーム表現型を良好にレスキューしたことを示す。
実施例４：インビボ効力アッセイ
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットがインビボでＮＰＣ１表現型をレスキューし得るか否かを判定するため、ｈＮＰＣ１導入カセット（配列番号１４）をパッケージングする組換えＡＡＶ９ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞中で三重形質移入プロトコル（例えば、実施例１を参照されたい）を使用して調製した。ＮＰＣ１を欠損するマウス（すなわちＮＰＣ１－／－マウス）に対して、１キログラム当たり３．０×１０１４個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で眼窩静脈叢注射により生理食塩水又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１ベクターのいずれかを約２４～２８日齢で静脈内注射した。結果を図２に示す。全ての生理食塩水処理マウスは、約８０日齢までに死亡した。しかしながら、全てのＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１注射動物は、実験の継続期間にわたり生存した。ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１注射マウスを分析のために約１００日齢で犠死させた。
本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットがインビボでＮＰＣ１表現型をレスキューし得るか否かを判定するため、ｈＮＰＣ１導入カセット（配列番号１４）をパッケージングする組換えＡＡＶ９ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞中で三重形質移入プロトコル（例えば、実施例１を参照されたい）を使用して調製した。ＮＰＣ１を欠損するマウス（すなわちＮＰＣ１－／－マウス）に対して、１キログラム当たり３．０×１０１４個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で眼窩静脈叢注射により生理食塩水又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１ベクターのいずれかを約２４～２８日齢で静脈内注射した。結果を図２に示す。全ての生理食塩水処理マウスは、約８０日齢までに死亡した。しかしながら、全てのＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１注射動物は、実験の継続期間にわたり生存した。ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１注射マウスを分析のために約１００日齢で犠死させた。
マウスに平均台歩行テストも課し、マウスが平均台を歩行するときの転倒の回数を測定した。テストは、約８週（５６日）齢で実施した。図４に示されるとおり、野生型マウスは、平均台から滑落しなかった。ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１で処理されたＮＰＣ１－／－マウスと生理食塩水処理ＮＰＣ１－／－マウスとの間の転倒の回数に統計的有意差は存在しなかったが、ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１群において観察された転倒の平均数は、より少なかった。
マウスの行動的表現型スコアも約１０週（７０日）齢で評価した。行動的表現型スコアは、種々の疾患症状、例として毛繕い、歩容、後弯、レッジテスト、後肢痙縮及び振戦を測定する複合的なスコアである（Alam et al ,Sci Transl Med, 2016；Guyenet et al, J Vis Exp, 2010を参照されたい）。図３に示されるとおり、ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１で処理されたＮＰＣ１－／－マウスは、生理食塩水処理ＮＰＣ１－／－マウスと比較して有意に低減したスコアを有した。
まとめると、これらのデータは、ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１がＮＰＣ１欠損マウスの疾患表現型を少なくとも部分的にレスキューし得ることを実証する。
上記のものは本発明の説明であり、それを限定するものと解釈すべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲の均等物は、それに含まれるものとする。
番号付けされた実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、以下の番号付けされた実施形態も本開示の一部を形成する。
１．５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットであって、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセット。
２．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である、実施形態１のＡＡＶ導入カセット。
３．５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである、実施形態１又は２のＡＡＶ導入カセット。
４．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する、実施形態１又は２のＡＡＶ導入カセット。
５．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来する、実施形態１～４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
６．５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含む、実施形態１のＡＡＶ導入カセット。
７．３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む、実施形態１のＡＡＶ導入カセット。
８．プロモーターは、構成的プロモーターである、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
９．プロモーターは、誘導性プロモーターである、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１０．プロモーターは、組織特異的プロモーターである、実施形態１～９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１１．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択される、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１２．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター及びＨＳＶＴＫプロモーターからなる群から選択される、実施形態１１のＡＡＶ導入カセット。
１３．プロモーターは、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のいずれか１つと少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１４．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１５．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１６．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１５のＡＡＶ導入カセット。
１７．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９８％同一の配列を有する、実施形態１６のＡＡＶ導入カセット。
１８．ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１の配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１９．導入遺伝子は、配列番号２の配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２０．ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）から選択される、実施形態１～１８のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２１．ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態２０のＡＡＶ導入カセット。
２２．ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである、実施形態２０のＡＡＶ導入カセット。
２３．ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２又は配列番号１３と少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態１～１９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２４．カセットは、エンハンサーをさらに含む、実施形態１～２３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２５．エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである、実施形態２４のＡＡＶ導入カセット。
２６．エンハンサーは、配列番号９の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態２４のＡＡＶ導入カセット。
２７．カセットは、イントロン配列をさらに含む、実施形態１～２６のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２８．イントロン配列は、キメラ配列である、実施形態２７のＡＡＶ導入カセット。
２９．イントロン配列は、ハイブリッド配列である、実施形態２７のＡＡＶ導入カセット。
３０．イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する配列を含む、実施形態２７のＡＡＶ導入カセット。
３１．イントロン配列は、配列番号１０～１１のいずれか１つの配列を含む、実施形態２７のＡＡＶ導入カセット。
３２．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む、実施形態１のＡＡＶ導入カセット。
３３．実施形態１～３１のいずれか１つのＡＡＶ導入カセットを含むプラスミド。
３４．実施形態１～３２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット又は実施形態３３のプラスミドを含む細胞。
３５．タンパク質カプシド及びタンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含む組換えＡＡＶベクターであって、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む導入カセットを含み、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする、組換えＡＡＶベクター。
３６．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
３７．５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである、実施形態３６又は３６の組換えＡＡＶベクター。
３８．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する、実施形態３５又は３６の組換えＡＡＶベクター。
３９．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来する、実施形態３５～３８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４０．５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含む、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
４１．３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
４２．プロモーターは、構成的プロモーターである、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４３．プロモーターは、誘導性プロモーターである、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４４．プロモーターは、組織特異的プロモーターである、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４５．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択される、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４６．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター及びＨＳＶＴＫプロモーターからなる群から選択される、実施形態４５の組換えＡＡＶベクター。
４７．プロモーターは、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のいずれか１つと少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４８．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、実施形態３５～４７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４９．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する、実施形態３５～４８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５０．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態４９の組換えＡＡＶベクター。
５１．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９８％同一の配列を有する、実施形態５０の組換えＡＡＶベクター。
５２．ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１の配列を含む、実施形態３５～４８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５３．導入遺伝子は、配列番号２の配列を含む、実施形態３５～４８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５４．ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）から選択される、実施形態３５～５３のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５５．ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態５４の組換えＡＡＶベクター。
５６．ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである、実施形態５４の組換えＡＡＶベクター。
５７．ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２又は配列番号１３と少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態３５～５３のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５８．カセットは、エンハンサーをさらに含む、実施形態３５～５７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５９．エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである、実施形態５８の組換えＡＡＶベクター。
６０．エンハンサーは、配列番号９の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態５８の組換えＡＡＶベクター。
６１．カセットは、イントロン配列をさらに含む、実施形態３５～６０のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６２．イントロン配列は、キメラ配列である、実施形態６１の組換えＡＡＶベクター。
６３．イントロン配列は、ハイブリッド配列である、実施形態６１の組換えＡＡＶベクター。
６４．イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する配列を含む、実施形態６１の組換えＡＡＶベクター。
６５．イントロン配列は、配列番号１０～１１のいずれか１つの配列を含む、実施形態６１の組換えＡＡＶベクター。
６６．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
６７．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４の配列を含む、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
６８．タンパク質カプシドは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのＡＡＶからのカプシドタンパク質サブユニットを含む、実施形態３５～６７の組換えＡＡＶベクター。
６９．タンパク質カプシドは、以下のＡＡＶ血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのカプシドタンパク質サブユニットに対して１つ以上のアミノ酸変異を有するカプシドタンパク質サブユニットを含む、実施形態３５～６７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
７０．組換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ産生細胞を、実施形態１～３２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット又は実施形態３３のプラスミドと接触させることを含む方法。
７１．実施形態３５の方法によって産生される組換えＡＡＶベクター。
７２．ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ及びウシＡＡＶから選択される血清型のものである、実施形態７１の組換えＡＡＶベクター。
７３．実施形態１～３２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態３３のプラスミド、実施形態３４の細胞又は実施形態３５～６９、７１若しくは７２のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
７４．治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、有効量の、実施形態１～３２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態３３のプラスミド、実施形態３４の細胞又は実施形態３５～６８、７０若しくは７１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを投与することを含む方法。
７５．対象は、ＮＰＣ１を有する、実施形態７４の方法。
７６．対象は、ヒト対象である、実施形態７４又は７５の方法。
７７．５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含むコードする核酸であって、導入遺伝子は、配列番号１又は配列番号２０のアミノ酸配列をコードする、核酸。
７８．５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットであって、導入カセットは、イントロン配列を含み、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする、ＡＡＶ導入カセット。
７９．イントロン配列は、プロモーターと導入遺伝子との間に局在する、実施形態７８のＡＡＶ導入カセット。
８０．５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含む、実施形態７８又は７９のＡＡＶ導入カセット。
８１．３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む、実施形態７８～８０のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８２．プロモーターは、配列番号５の配列を含む、実施形態７８～８１のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８３．イントロン配列は、ＳＶ４０イントロンである、実施形態７８～８２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８４．イントロン配列は、配列番号１０の配列を含む、実施形態７８～８２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８５．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、実施形態７８～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８６．ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１の配列を含む、実施形態７８～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８７．導入遺伝子は、配列番号２の配列を含む、実施形態７８～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８８．ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態７８～８７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８９．ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２の配列を含む、実施形態７８～８７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
９０．カセットは、エンハンサーを含む、実施形態７８～８９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
９１．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４の配列を含む、実施形態７８のＡＡＶ導入カセット。
９２．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１５～１９のいずれか１つの配列を含む、実施形態７８のＡＡＶ導入カセット。
９３．実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセットを含むプラスミド。
９４．５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む核酸であって、核酸は、イントロン配列を含み、導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする、核酸。
９５．イントロン配列は、プロモーターと導入遺伝子との間に局在する、実施形態９４の核酸。
９６．実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態９３のプラスミド又は実施形態９４若しくは９５の核酸を含む細胞。
９７．タンパク質カプシド及びタンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含む組換えＡＡＶベクターであって、核酸は、実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセットを含む、組換えＡＡＶベクター。
９８．タンパク質カプシドは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのＡＡＶからのカプシドタンパク質サブユニットを含む、実施形態９７の組換えＡＡＶベクター。
９９．タンパク質カプシドは、以下のＡＡＶ血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのカプシドタンパク質サブユニットに対して１つ以上のアミノ酸変異を有するカプシドタンパク質サブユニットを含む、実施形態９７の組換えＡＡＶベクター。
１００．組換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ産生細胞を、実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態９３のプラスミド又は実施形態９３の核酸と接触させることを含む方法。
１０１．実施形態１００の方法によって産生される組換えＡＡＶベクター。
１０２．実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態９３のプラスミド、実施形態９４若しくは９５の核酸、実施形態９６の細胞又は実施形態９７～９９若しくは１０１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
１０３．治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、有効量の、実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態９３のプラスミド、実施形態９４若しくは９５の核酸、実施形態９６の細胞又は実施形態９７～９９若しくは１０１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを投与することを含む方法。
１０４．対象は、ＮＰＣ１を有する、実施形態１０３の方法。
１０５．対象は、ヒト対象である、実施形態１０３又は１０４の方法。
添付の特許請求の範囲にかかわらず、以下の番号付けされた実施形態も本開示の一部を形成する。
１．５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットであって、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセット。
２．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である、実施形態１のＡＡＶ導入カセット。
３．５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである、実施形態１又は２のＡＡＶ導入カセット。
４．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する、実施形態１又は２のＡＡＶ導入カセット。
５．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来する、実施形態１～４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
６．５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含む、実施形態１のＡＡＶ導入カセット。
７．３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む、実施形態１のＡＡＶ導入カセット。
８．プロモーターは、構成的プロモーターである、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
９．プロモーターは、誘導性プロモーターである、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１０．プロモーターは、組織特異的プロモーターである、実施形態１～９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１１．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択される、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１２．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター及びＨＳＶＴＫプロモーターからなる群から選択される、実施形態１１のＡＡＶ導入カセット。
１３．プロモーターは、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のいずれか１つと少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１４．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１５．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１６．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１５のＡＡＶ導入カセット。
１７．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９８％同一の配列を有する、実施形態１６のＡＡＶ導入カセット。
１８．ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１の配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
１９．導入遺伝子は、配列番号２の配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２０．ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）から選択される、実施形態１～１８のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２１．ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態２０のＡＡＶ導入カセット。
２２．ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである、実施形態２０のＡＡＶ導入カセット。
２３．ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２又は配列番号１３と少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態１～１９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２４．カセットは、エンハンサーをさらに含む、実施形態１～２３のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２５．エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである、実施形態２４のＡＡＶ導入カセット。
２６．エンハンサーは、配列番号９の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態２４のＡＡＶ導入カセット。
２７．カセットは、イントロン配列をさらに含む、実施形態１～２６のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
２８．イントロン配列は、キメラ配列である、実施形態２７のＡＡＶ導入カセット。
２９．イントロン配列は、ハイブリッド配列である、実施形態２７のＡＡＶ導入カセット。
３０．イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する配列を含む、実施形態２７のＡＡＶ導入カセット。
３１．イントロン配列は、配列番号１０～１１のいずれか１つの配列を含む、実施形態２７のＡＡＶ導入カセット。
３２．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む、実施形態１のＡＡＶ導入カセット。
３３．実施形態１～３１のいずれか１つのＡＡＶ導入カセットを含むプラスミド。
３４．実施形態１～３２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット又は実施形態３３のプラスミドを含む細胞。
３５．タンパク質カプシド及びタンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含む組換えＡＡＶベクターであって、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む導入カセットを含み、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする、組換えＡＡＶベクター。
３６．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
３７．５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである、実施形態３６又は３６の組換えＡＡＶベクター。
３８．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する、実施形態３５又は３６の組換えＡＡＶベクター。
３９．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来する、実施形態３５～３８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４０．５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含む、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
４１．３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
４２．プロモーターは、構成的プロモーターである、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４３．プロモーターは、誘導性プロモーターである、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４４．プロモーターは、組織特異的プロモーターである、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４５．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択される、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４６．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター及びＨＳＶＴＫプロモーターからなる群から選択される、実施形態４５の組換えＡＡＶベクター。
４７．プロモーターは、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のいずれか１つと少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態３５～４１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４８．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、実施形態３５～４７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４９．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する、実施形態３５～４８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５０．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態４９の組換えＡＡＶベクター。
５１．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９８％同一の配列を有する、実施形態５０の組換えＡＡＶベクター。
５２．ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１の配列を含む、実施形態３５～４８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５３．導入遺伝子は、配列番号２の配列を含む、実施形態３５～４８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５４．ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）から選択される、実施形態３５～５３のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５５．ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態５４の組換えＡＡＶベクター。
５６．ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである、実施形態５４の組換えＡＡＶベクター。
５７．ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２又は配列番号１３と少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態３５～５３のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５８．カセットは、エンハンサーをさらに含む、実施形態３５～５７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５９．エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである、実施形態５８の組換えＡＡＶベクター。
６０．エンハンサーは、配列番号９の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態５８の組換えＡＡＶベクター。
６１．カセットは、イントロン配列をさらに含む、実施形態３５～６０のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６２．イントロン配列は、キメラ配列である、実施形態６１の組換えＡＡＶベクター。
６３．イントロン配列は、ハイブリッド配列である、実施形態６１の組換えＡＡＶベクター。
６４．イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する配列を含む、実施形態６１の組換えＡＡＶベクター。
６５．イントロン配列は、配列番号１０～１１のいずれか１つの配列を含む、実施形態６１の組換えＡＡＶベクター。
６６．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４～１９のいずれか１つの配列を含む、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
６７．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４の配列を含む、実施形態３５の組換えＡＡＶベクター。
６８．タンパク質カプシドは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのＡＡＶからのカプシドタンパク質サブユニットを含む、実施形態３５～６７の組換えＡＡＶベクター。
６９．タンパク質カプシドは、以下のＡＡＶ血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのカプシドタンパク質サブユニットに対して１つ以上のアミノ酸変異を有するカプシドタンパク質サブユニットを含む、実施形態３５～６７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
７０．組換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ産生細胞を、実施形態１～３２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット又は実施形態３３のプラスミドと接触させることを含む方法。
７１．実施形態３５の方法によって産生される組換えＡＡＶベクター。
７２．ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ及びウシＡＡＶから選択される血清型のものである、実施形態７１の組換えＡＡＶベクター。
７３．実施形態１～３２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態３３のプラスミド、実施形態３４の細胞又は実施形態３５～６９、７１若しくは７２のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
７４．治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、有効量の、実施形態１～３２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態３３のプラスミド、実施形態３４の細胞又は実施形態３５～６８、７０若しくは７１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを投与することを含む方法。
７５．対象は、ＮＰＣ１を有する、実施形態７４の方法。
７６．対象は、ヒト対象である、実施形態７４又は７５の方法。
７７．５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含むコードする核酸であって、導入遺伝子は、配列番号１又は配列番号２０のアミノ酸配列をコードする、核酸。
７８．５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットであって、導入カセットは、イントロン配列を含み、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする、ＡＡＶ導入カセット。
７９．イントロン配列は、プロモーターと導入遺伝子との間に局在する、実施形態７８のＡＡＶ導入カセット。
８０．５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含む、実施形態７８又は７９のＡＡＶ導入カセット。
８１．３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む、実施形態７８～８０のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８２．プロモーターは、配列番号５の配列を含む、実施形態７８～８１のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８３．イントロン配列は、ＳＶ４０イントロンである、実施形態７８～８２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８４．イントロン配列は、配列番号１０の配列を含む、実施形態７８～８２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８５．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、実施形態７８～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８６．ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１の配列を含む、実施形態７８～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８７．導入遺伝子は、配列番号２の配列を含む、実施形態７８～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８８．ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態７８～８７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
８９．ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２の配列を含む、実施形態７８～８７のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
９０．カセットは、エンハンサーを含む、実施形態７８～８９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
９１．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４の配列を含む、実施形態７８のＡＡＶ導入カセット。
９２．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１５～１９のいずれか１つの配列を含む、実施形態７８のＡＡＶ導入カセット。
９３．実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセットを含むプラスミド。
９４．５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む核酸であって、核酸は、イントロン配列を含み、導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする、核酸。
９５．イントロン配列は、プロモーターと導入遺伝子との間に局在する、実施形態９４の核酸。
９６．実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態９３のプラスミド又は実施形態９４若しくは９５の核酸を含む細胞。
９７．タンパク質カプシド及びタンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含む組換えＡＡＶベクターであって、核酸は、実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセットを含む、組換えＡＡＶベクター。
９８．タンパク質カプシドは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのＡＡＶからのカプシドタンパク質サブユニットを含む、実施形態９７の組換えＡＡＶベクター。
９９．タンパク質カプシドは、以下のＡＡＶ血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのカプシドタンパク質サブユニットに対して１つ以上のアミノ酸変異を有するカプシドタンパク質サブユニットを含む、実施形態９７の組換えＡＡＶベクター。
１００．組換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ産生細胞を、実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態９３のプラスミド又は実施形態９３の核酸と接触させることを含む方法。
１０１．実施形態１００の方法によって産生される組換えＡＡＶベクター。
１０２．実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態９３のプラスミド、実施形態９４若しくは９５の核酸、実施形態９６の細胞又は実施形態９７～９９若しくは１０１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
１０３．治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、有効量の、実施形態７８～９２のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態９３のプラスミド、実施形態９４若しくは９５の核酸、実施形態９６の細胞又は実施形態９７～９９若しくは１０１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを投与することを含む方法。
１０４．対象は、ＮＰＣ１を有する、実施形態１０３の方法。
１０５．対象は、ヒト対象である、実施形態１０３又は１０４の方法。
Claims (26)
- ５’から３’にかけて、
５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、
ニワトリベータ－アクチンプロモーター、
導入遺伝子、
ポリアデニル化シグナル、及び
３’ＩＴＲ
を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットであって、
前記導入カセットは、イントロン配列を含み、
前記導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセット。 - 前記５’ＩＴＲは、配列番号３の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記３’ＩＴＲは、配列番号４の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記プロモーターは、配列番号５の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記イントロン配列は、ＳＶ４０イントロンである、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記イントロン配列は、配列番号１０の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号１の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記導入遺伝子は、配列番号２の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記カセットは、エンハンサーを含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１４の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 前記ＡＡＶ導入カセットは、配列番号１５～１９のいずれか１つの配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶ導入カセット。
- 請求項１～１４のいずれか一項に記載のＡＡＶ導入カセットを含むプラスミド。
- ５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む核酸であって、前記核酸は、イントロン配列を含み、前記導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする、核酸。
- 請求項１～１４のいずれか一項に記載のＡＡＶ導入カセット、請求項１５に記載のプラスミド又は請求項１６に記載の核酸を含む細胞。
- タンパク質カプシド及び前記タンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含む組換えＡＡＶベクターであって、前記核酸は、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＡＡＶ導入カセットを含む、組換えＡＡＶベクター。
- 前記タンパク質カプシドは、以下の血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのＡＡＶからのものであるカプシドタンパク質サブユニットを含む、請求項１８に記載の組換えＡＡＶベクター。
- 前記タンパク質カプシドは、以下のＡＡＶ血清型：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのいずれか１つのカプシドタンパク質サブユニットに対して１つ以上のアミノ酸変異を有するカプシドタンパク質サブユニットを含む、請求項１８に記載の組換えＡＡＶベクター。
- 組換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ産生細胞を、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＡＡＶ導入カセット、請求項１５に記載のプラスミド又は請求項１６に記載の核酸と接触させることを含む方法。
- 請求項２１に記載の方法によって産生される組換えＡＡＶベクター。
- 請求項１～１４のいずれか一項に記載のＡＡＶ導入カセット、請求項１５に記載のプラスミド、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載の細胞又は請求項１８～２０若しくは２２のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
- 治療を必要とする対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＡＡＶ導入カセット、請求項１５に記載のプラスミド、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載の細胞又は請求項１８～２０若しくは２２のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを投与することを含む方法。
- 前記対象は、ＮＰＣ１を有する、請求項２４に記載の方法。
- 前記対象は、ヒト対象である、請求項２４に記載の方法。
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