CN117377771A - 载体系统 - Google Patents
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Abstract
用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组型区域；(b)第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组型区域；剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
Description
技术领域
本发明涉及载体和载体系统，特别是能够使大转基因递送至靶细胞的载体和载体系统。本发明还涉及载体和载体系统在基因疗法中的用途。
背景技术
基因疗法，例如使用腺相关病毒(AAV)载体的基因疗法，是治疗许多遗传性视网膜变性(IRD)的有前景的方法。事实上，对不同IRD的多年临床前研究和临床试验已经表明，AAV能够有效地将治疗基因递送到患病的视网膜层(例如光感受器(PR)和视网膜色素上皮(RPE))，并强调了它们在人类中出色的安全性和有效性。然而，利用AAV基因疗法载体的主要障碍之一是它们包装转基因的能力，其可能被限制在最大约5kb。这可能是对诸如IRD的疾病开发基因替代疗法的限制因素，IRD是由于具有编码序列(CDS)的基因中大于5kb的突变而产生的。
人们对鉴定提高AAV能力的策略产生了极大的兴趣。例如，基于AAV基因组通过分子间重组串联的能力的双AAV载体已成功用于解决这个问题。可以通过将大的转基因CDS分裂成单独的部分并将每个部分包装在单个正常大小(NS；<5kb)的AAV载体中来生成双AAV载体。全长转基因CDS的重构可以通过两个双AAV载体共感染同一细胞来实现，然后进行以下任一项：i)反向末端重复(ITR-)介导的两个载体基因组的尾对头串联，然后进行剪接(双AAV反式剪接，TS)(Duan et al.(2001)Molecular Therapy:the journal of theAmerican Society of Gene Therapy 4:383-391)；ii)两个载体基因组中含有的重叠区域之间的同源重组(双AAV重叠，OV)((Duan et al.(2001)Molecular Therapy:the journalof the American Society of Gene Therapy 4:383-391))；或iii)两者的组合(双AAV杂交)(Ghosh et al.(2008).Molecular Therapy:the journal of the American Societyof Gene Therapy 16:124-130)。
双AAV杂交载体中最常用的致重组性区域源自人类碱性磷酸酶cDNA中间三分之一的872bp序列，该序列已被证明可实现高水平的双AAV杂交载体重构。此外，已有发现来自F1噬菌体基因组(AK)的77bp序列在体外和体内实验中具有高度致重组性。
尽管研究强调了双载体系统(例如AAV载体系统)在感兴趣组织中递送和重构大转基因的潜力，但它们向临床使用的转化仍然明显未被满足。
发明概述
在用于递送大转基因(例如肌球蛋白7A、MYO7A)的双载体系统的开发期间，发明人意外地在他们的含有转基因CDS的5’端部分的载体的制剂中发现了一致的污染物。发明人用Southern印迹分析了该制剂并鉴定了对应于预期载体的带，并且令人惊讶地还发现了对应于污染物的约1.3kb的较小尺寸的带。
然后，发明人进一步研究了载体并鉴定了载体中使用的嵌合启动子内含子和剪接供体(SD)位点之间的同源性区域。对纯化的病毒DNA的进一步测序分析证实，由于构建体内存在这些同源区域，发生了同源重组事件，导致内含子的剩余部分、转基因CDS的5’端部分和SD位点被删除，同时保留AAV反向末端重复(ITR)，从而支持载体产生。
在一个方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：内含子、转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
在另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
在另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组性区域；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组性区域；剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
在优选的实施方案中，内含子是猿病毒40(SV40)内含子。SV40内含子可以是修饰的SV40内含子。
在一些实施方案中，内含子是细小病毒小鼠(MVM)内含子。
在一些实施方案中，内含子包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性(例如至少96％、97％、98％或99％序列同一性，或100％序列同一性)的核苷酸序列。在优选的实施方案中，内含子包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性(例如至少96％、97％、98％或99％序列同一性，或100％序列同一性)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，剪接供体序列包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
在优选的实施方案中，第一致重组性区域和第二致重组性区域是相同的。
在一些实施方案中，第一致重组性区域和第二致重组性区域都是F1噬菌体致重组性区域或其片段。
在一些实施方案中，第一致重组性区域和第二致重组性区域均包含与SEQ ID NO:7或其片段具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体是病毒载体。病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、小核糖核酸病毒载体或甲病毒(alphaviral)载体。在一些实施方案中，第一载体和第二载体是质粒。第一和/或第二质粒可以例如用于产生第一和/或第二病毒载体颗粒(例如单独地或一起在组合物中)。
在优选的实施方案中，第一载体和第二载体是AAV载体。
在一些实施方案中，AAV载体具有相同血清型(例如包含相同血清型的衣壳)。在一些实施方案中，AAV载体具有不同血清型(例如包含不同血清型的衣壳)。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体选自由AAV2、AAV8、AAV5、AAV7、AAV9、AAV-PhP.B和AAV-PhP.eB组成的组。在一些实施方案中，第一载体和第二载体选自由hu68(参见例如WO2018/160582)、Anc文库(参见例如WO2015/054653和WO2017/019994)和AAV2-TT(参见例如WO2015/121501)组成的组。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体是AAV2载体。在一些实施方案中，第一载体和第二载体是AAV8载体。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体包含选自由AAV2、AAV8、AAV5、AAV7、AAV9、AAV-PhP.B和AAV-PhP.eB组成的组的衣壳。在一些实施方案中，第一载体和第二载体包含选自由hu68(参见例如WO2018/160582)、Anc文库(参见例如WO2015/054653和WO2017/019994)和AAV2-TT(参见例如WO2015/121501)组成的组的衣壳。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体包含AAV2衣壳。在一些实施方案中，第一载体和第二载体包含AAV8衣壳。
在一些实施方案中，第一载体进一步包含5’ITR和3’ITR。在一些实施方案中，第二载体进一步包含5’ITR和3’ITR。在优选的实施方案中，第一载体进一步包含5’ITR和3’ITR，并且第二载体进一步包含5’ITR和3’ITR。
在优选的实施方案中，ITR是AAV ITR，优选AAV2 ITR。在一些实施方案中，ITR是AAV8 ITR。
在优选的实施方案中，第一载体和第二载体是AAV2/8载体。
在一些实施方案中，ITR来自相同的AAV血清型。在一些实施方案中，ITR来自不同的AAV血清型。
在优选的实施方案中，第一载体的3’ITR和第二载体的5’ITR来自相同的AAV血清型。
在优选的实施方案中，第一载体的5’ITR和第二载体的5’ITR来自相同的AAV血清型。在优选的实施方案中，第一载体的3’ITR和第二载体的3’ITR来自相同的AAV血清型。
在优选的实施方案中，第一载体的5’ITR和第二载体的5’ITR是AAV25’ITR，并且第一载体的3’ITR和第二载体的3’ITR是AAV2 3’ITR。
在一些实施方案中，第一载体的5’ITR和第二载体的5’ITR是AAV8 5’ITR，并且第一载体的3’ITR和第二载体的3’ITR是AAV8 3’ITR。
在一些实施方案中，第一载体的5’ITR和第二载体的5’ITR来自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，第一载体的3’ITR和第二载体的3’ITR来自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，第一载体的5’ITR和第二载体的5’ITR来自不同的AAV血清型，并且第一载体的3’ITR和第二载体的3’ITR来自不同的AAV血清型。
在一些实施方案中，第一载体的5’ITR和第二载体的3’ITR来自不同的AAV血清型。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体是病毒载体颗粒。
在一些实施方案中，启动子是CBA启动子或其片段。
在一些实施方案中，第一载体进一步包含增强子序列。在优选的实施方案中，增强子是CMV增强子。
在一些实施方案中，第二载体进一步包含转基因CDS的3’端部分下游的聚腺苷酸化序列。在优选的实施方案中，聚腺苷酸化序列是牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，转基因选自由以下组成的组：肌球蛋白7A(MYO7A)、ABCA4、CEP290、CDH23、EYS、USH2a、GPR98和ALMS1。
在优选的实施方案中，转基因是肌球蛋白7A(MYO7A)转基因。在一些实施方案中，转基因是ABCA4转基因。在一些实施方案中，转基因CDS是野生型序列。在一些实施方案中，转基因CDS是密码子优化的(例如针对在人中表达而密码子优化的)。
在优选实施方案中：
(a)第一载体包含与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；和/或
(b)第二载体包含与SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
在特别优选的实施方案中：
(a)第一载体包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列；和/或
(b)第二载体包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体的基因组拷贝比为1:1。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的方法，其包括用本文公开的第一载体和第二载体转导或转染细胞，使得转基因在细胞中表达。
另一方面，本发明提供了包含本文公开的第一载体和第二载体的细胞。
另一方面，本发明提供了用本文公开的第一载体和第二载体转导或转染的细胞。
在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞、人类细胞、视网膜细胞或非胚胎干细胞。
另一方面，本发明提供了载体，其中载体是本文公开的第一载体。
另一方面，本发明提供了载体，其中载体是本文公开的第二载体。
另一方面，本发明提供了载体，其在5’至3’方向上包含：内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列，其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
另一方面，本发明提供了载体，其在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分和剪接供体序列，其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
另一方面，本发明提供了载体，其在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分、剪接供体序列；和致重组性区域，其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
在一些实施方案中，载体进一步包含5’ITR和3’ITR。在优选的实施方案中，ITR是AAV ITR，优选AAV2 ITR。
在一些实施方案中，ITR来自相同的AAV血清型。在一些实施方案中，ITR来自不同的AAV血清型。
另一方面，本发明提供了载体，其在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；以及转基因编码序列(CDS)的3’端部分。
另一方面，本发明提供了载体，其在5’至3’方向上包含：致重组性区域；；剪接受体序列；以及转基因编码序列(CDS)的3’端部分。
在一些实施方案中，载体包含与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
在优选的实施方案中，载体包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了包含本文公开的第一载体和本文公开的第二载体的试剂盒。
另一方面，本发明提供了包含本文公开的第一载体和本文公开的第二载体的组合物。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体的基因组拷贝比为1:1。
在优选的实施方案中，组合物是包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
另一方面，本发明提供了本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物，其用于疗法。
另一方面，本发明提供了本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物，其用于治疗视网膜变性。优选地，视网膜变性是遗传性视网膜变性。
另一方面，本发明提供了本文公开的第一载体，其用于疗法，其中第一载体与本文公开的第二载体以组合同时、依次或单独施用。
另一方面，本发明提供了本文公开的第一载体，其用于治疗视网膜变性，其中第一载体与本文公开的第二载体以组合同时、依次或单独施用。优选地，视网膜变性是遗传性视网膜变性。
另一方面，本发明提供了本文公开的第二载体，其用于疗法，其中第二载体与本文公开的第一载体以组合同时、依次或单独施用。
另一方面，本发明提供了本文公开的第二载体，其用于治疗视网膜变性，其中第二载体与本文公开的第一载体以组合同时、依次或单独施用。优选地，视网膜变性是遗传性视网膜变性。
在一些实施方案中，该用途是治疗或预防Usher综合征、色素性视网膜炎、Leber先天性黑朦(LCA)、Stargardt病、Alstrom综合征或ABCA4相关疾病。
另一方面，本发明提供了本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物，其用于治疗Usher综合征。
另一方面，本发明提供了治疗或预防视网膜变性的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物。优选地，视网膜变性是遗传性视网膜变性。
另一方面，本发明提供了治疗或预防Usher综合征的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物。
附图说明
图1：污染物载体的鉴定。
(A)Southern印迹图像显示与AAV-5’hMYO7A(由顶部箭头指示)和污染物载体(由底部箭头指示)相对应的基因组。DNA酶：用DNA酶处理以降解外部DNA污染物；质粒：含有产生AAV8-CBA-嵌合内含子-5’hMYO7A的DNA序列的质粒DNA；5’AAV基因组-CI：从AAV8-CBA启动子-嵌合内含子-5’hMYO7A中提取的基因组DNA；分子量标志物以千碱基表示；bp＝碱基对。CI：嵌合内含子。(B)AAV-5’hMYO7A基因组的示意图，显示了Southern印记探针识别的序列。(C)嵌合启动子内含子与SD信号之间的配对机制(虚线所示)。(D)污染物载体基因组的示意图，显示了Southern印记探针识别的序列。(E)包含以下表达盒的AAV制剂的Southern印迹分析：1.5’CMV ABCA4AK(双杂交)；2.5’CMV ABCA4 TS(双反式剪接)；3.5’CMV NO INTRABCA4OV(双重叠)；4.5’CMV NO INTR ABCA4 AK(双杂交)；5.5’VMD2 ABCA4AK(双杂交)；6.5’RHO ABCA4 AK(双杂交)；7.5’RHO ABCA4 TS(双反式剪接)。嵌合内含子存在于载体1和2中，并且在载体3至7中不存在。虚线框指示预期大小的全长基因组；实心框指示短的、截断的基因组。
图2：通过EGFP荧光的嵌合内含子、SV40内含子、MVM内含子和无内含子的体外比较。
(A)编码带有嵌合内含子、SV40内含子、MVM内含子或无内含子的EGFP的质粒的示意图。(B)转染的HEK293细胞的代表性显微镜荧光图片(10倍放大倍数，比例尺100μm)。CI：嵌合内含子；SV40：猿病毒40；MVM：细小病毒小鼠。
图3：通过蛋白质印迹分析的嵌合内含子、SV40内含子、MVM内含子和无内含子的体外比较。
A)用双AAV2-嵌合内含子-hMYO7A、双AAV2-SV40内含子-hMYO7A、双AAV2-MVM内含子-hMYO7A、双AAV2-无内含子-hMYO7A或无载体感染72小时后HEK293细胞的蛋白质印迹分析。箭头指示全长蛋白质，每个泳道上样60μg蛋白质，对于每个蛋白质印迹，在左侧报告分子标志物。在每组样品下方报告实验编号。阴性对照：未接受双AAV2-hMYO7A的细胞；@MYO7A：使用抗肌球蛋白7A(MYO7A)抗体的蛋白质印迹；@细丝蛋白(Filamin)：使用抗细丝蛋白(Filamin)抗体的蛋白质印迹，用作上样对照。SV40内含子：修饰的猿病毒40内含子；MVM内含子：细小病毒小鼠内含子。
B)HEK293中，用双AAV2-嵌合内含子-hMYO7A、双AAV2-SV40内含子-hMYO7A、双AAV2-MVM内含子-hMYO7A或双AAV2-无内含子-hMYO7A感染后，表达的hMYO7A水平的量化。hMYO7A的水平与由双AAV2-嵌合内含子-hMYO7A表达的hMYO7A相关。每个实心方块代表相应组中每个样品的量化值。使用抗MYO7A抗体通过蛋白质印迹分析进行量化，并将人MYO7A带强度的测量归一化为细丝蛋白。平均值报告在每组的直方图中。SV40内含子：修饰的猿病毒40内含子；MVM内含子：细小病毒小鼠内含子。
图4：嵌合内含子、SV40内含子和MVM内含子的比较。
AAV8-5’hMYO7A携带的表达盒的示意图。上：AAV8-5’hMYO7A嵌合内含子；中：AAV8-5’hMYO7A SV40内含子；下：AAV8-5’hMYO7AMVM内含子。(B)来自AAV8-5’hMYO7A嵌合内含子、AAV8-5’hMYO7A SV40内含子和AAV8-5’hMYO7A MVM内含子的病毒基因组的Southern印迹。所有样品均用DNA酶处理以降解外部DNA污染物，然后提取病毒基因组DNA。5’AAV基因组-CI：从AAV8-CBA启动子-嵌合内含子-5’hMYO7A中提取的病毒基因组DNA；5’AAV基因组-SV40：从AAV8-CBA启动子-SV40内含子-5’hMYO7A中提取的病毒基因组DNA；5’AAV基因组-MVM：从AAV8-CBA启动子-SV40内含子-5’hMYO7A中提取的病毒基因组DNA；分子量标志物以千碱基表示；bp＝碱基对。CI：嵌合内含子；SV40：猿病毒40内含子；MVM：细小病毒小鼠内含子。(C)视网膜下注射AAV8-5’hMYO7A嵌合内含子、AAV8-5’hMYO7ASV40内含子或AAV8-5’hMYO7A MVM内含子与AAV8-3’hMYO7A-3XFLAG的组合，或赋形剂后2周，C57BL/6眼杯的代表性蛋白质印迹分析。箭头指示全长蛋白质，每条泳道上样150μg蛋白质。阴性对照：用赋形剂注射的眼；@Flag：用抗flag以识别全长Myosin7A-3XFlag的蛋白质印迹；@Dysferlin：用抗Dysferlin抗体的蛋白质印迹，用作上样对照。(D)对视网膜下注射AAV8-5’hMYO7A嵌合内含子、AAV8-5’hMYO7ASV40内含子或AAV8-5’hMYO7AMVM内含子与AAV8-3’hMYO7A-3XFLAG的组合的C57BL/6的眼杯中表达的hMYO7A的水平的量化。hMYO7A-3XFLAG的水平与AAV8-5’hMYO7A嵌合内含子与AAV8-3’hMYO7A-3XFLAG组合表达的hMYO7A-3XFLAG相关。每个条下方描述了hMYO7A-3XFLAG阳性眼的数量(n)。使用抗Flag抗体通过蛋白质印迹分析(图C)进行量化，并将hMYO7A-3XFLAG带强度的测量归一化为Dysferlin。相应条的上方描述了平均值。值表示为平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)。
图5：shaker小鼠中顶端黑素体定位和hMYO7A蛋白重构的剂量依赖性改善。
(A)用甲苯胺蓝染色的半薄视网膜切片，sh1-/-代表接受视网膜下注射任一溶剂(作为阴性对照)或双AAV8.hMYO7A(剂量1.37E+10、4.4E+9或1.37E+9总GC/眼)，和sh1+/-代表接受视网膜下注射溶剂，作为阳性对照。比例尺(白条)为10μm。黑色箭头指向正确定位的黑素体。(B)在视网膜下递送双AAV8.hMYO7A三个月后，sh1小鼠整个视网膜切片的RPE绒毛中黑素体定位的量化。报告了顶端黑素体的数量/100μm RPE。数据表示为每眼的单次测量(点)和平均值±s.e.m(柱)。使用单因素方差分析进行统计分析，然后进行Tukey事后检验。相对于接收溶剂的sh1-/-的P值是：**p<0.01；****p<0.0001。(C)以1.37E+10、4.4E+9或1.37E+9总GC/眼的剂量视网膜下递送双AAV8.hMYO7A后5周，sh1-/-眼杯的代表性蛋白质印迹分析。作为阳性和阴性对照，sh1+/-和sh1-/-分别接受视网膜下注射溶剂(与双AAV相同体积)。α-MYO7A，使用抗肌球蛋白7A抗体的蛋白质印迹；α-Dysferlin：使用抗Dysferlin抗体的蛋白质印迹，用作上样对照。(D)视网膜下注射双AAV8载体5周后，sh1-/-眼杯中表达的人MYO7A水平的量化，作为注射溶剂的同窝sh1+/-眼中表达的内源性Myo7a的百分比(％)。使用抗MYO7A抗体通过蛋白质印迹分析进行量化，并将MYO7A和Myo7a带强度的测量归一化为Dysferlin。数据表示为：平均值±s.e.m(在相应条形上方描述平均值)。
发明详述
本文所用的术语“包括”与“包含”；或“含有”同义；并且是包容性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的成员、要素或步骤。术语“包括”还包括术语“由......组成”。
载体系统
在一个方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；以及转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组性区域；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组性区域；剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组性区域；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组性区域；剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体的组合，该组合包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体的组合，该组合包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；以及转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体的组合，该组合包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组性区域；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组性区域、剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体的组合，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体的组合，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体的组合，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组性区域；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组性区域；剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS。
当转基因不能通过单个载体包装时，例如由于载体的大小限制，本发明的载体系统或载体的组合可以用于将转基因递送至细胞。例如，AAV载体的包装转基因的能力可能被限制在最大约5kb。
当将第一载体和第二载体引入细胞中时，转基因CDS可以从5’和3’端部分重构。重构的转基因可以在细胞中表达。
例如，在将第一和第二载体引入同一细胞后，全长转基因CDS的重构可以通过以下方式实现：i)反向末端重复(ITR-)介导的两个载体基因组的尾对头串联，然后进行剪接(双载体反式剪接，TS)；ii)两个载体基因组中含有的重叠区域之间的同源重组(双载体重叠，OV)；或iii)两者的组合(双载体杂交)。
在一些实施方案中，转基因CDS的部分(例如5’和/或3’端部分)小于或等于10kb，例如小于或等于9.5kb、9kb、8.5kb、8kb、7.5kb、7kb、6.5kb、6kb、5.5kb、5kb或4.5kb。在优选的实施方案中，转基因CDS的部分(例如5’和/或3’端部分)小于或等于5kb。
在一些实施方案中，5’端部分和3’端部分不包含重叠序列。
在一些实施方案中，转基因CDS在天然外显子-外显子连接处分裂成5’末端部分和3’末端部分。
本文所用的术语“不能同源重组”意为，当在标准条件下制备载体时(例如，对于AAV载体颗粒，用编码(a)载体基因组；(b)Rep和Cap蛋白；和(c)AAV生产所需的腺病毒辅助基因(例如E2、E4和/或VARNA)的质粒转染HEK293细胞，随后进行纯化，例如如本文实施例中所公开的)，没有或者基本上没有可检测的(例如使用Southern印迹分析，例如如本文实施例中所公开的)同源重组。当内含子不能与剪接供体序列同源重组时，可以最小化或防止转基因CDS的5’端部分的切除，例如由此增加转基因CDS的量，当将第一和第二载体引入细胞中时，转基因CDS由5’和3’端部分重构。
在一些实施方案中，内含子不包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸的区域，其与剪接供体序列的区域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(优选100％)的序列同一性。由于内含子与剪接供体序列不具有同源性，因此它不能与该序列同源重组。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸的区域，其与剪接供体序列的区域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(优选100％)的序列同一性。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸的区域，其与剪接供体序列的区域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(优选100％)的序列同一性。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组性区域；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组性区域；剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸的区域，其与剪接供体序列的区域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(优选100％)的序列同一性。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体的组合，该组合包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸的区域，其与剪接供体序列的区域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(优选100％)的序列同一性。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体的组合，该组合包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸的区域，其与剪接供体序列的区域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(优选100％)的序列同一性。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体的组合，该组合包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组性区域；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组性区域；剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子不包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸的区域，其与剪接供体序列的区域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(优选100％)的序列同一性。
启动子和增强子
本发明的载体可以包含启动子。适当地，转基因CDS的5’端部分可操作地连接至启动子。如本文所用，术语“可操作地连接”是指各部分(例如转基因和启动子)以使两者能够基本上不受阻碍地执行其功能的方式连接在一起。
可以使用任何合适的启动子，技术人员可以容易地进行选择。启动子序列可以是组成型活性的(即在任何宿主细胞背景中操作)，或替代地，可以仅在特定宿主细胞环境中是活性的，从而允许转基因在特定细胞类型中靶向表达(例如组织特异性启动子)。启动子可以响应于另一种因子(例如宿主细胞中存在的因子)的存在而显示诱导型表达。当施用载体用于疗法时，优选启动子在靶细胞(例如视网膜细胞)中具有功能。
在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的组：巨细胞病毒启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、光感受器间视黄醇结合蛋白启动子和卵黄状黄斑营养不良2启动子；或其片段。
在优选的实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其片段。
示例性的CBA启动子序列包括：
在一些实施方案中，启动子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中启动子基本上保留SEQ ID NO:1的启动子的天然功能。
在一些实施方案中，启动子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:28或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中启动子基本上保留SEQ ID NO:28的启动子的天然功能。
在优选的实施方案中，启动子包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1的核酸序列或其片段。
在优选的实施方案中，第一载体包含启动子，该启动子包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1的核酸序列或其片段。
视紫红质(Rho)启动子序列的示例为：
/>
在一些实施方案中，启动子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:29或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中启动子基本上保留SEQ ID NO:29的启动子的天然功能。
卵黄状黄斑营养不良2(VMD2)启动子序列的示例为：
/>
在一些实施方案中，启动子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:30或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中启动子基本上保留SEQ ID NO:30的启动子的天然功能。
本发明的载体可以包含增强子。适当地，转基因CDS的5’端部分可操作地连接至增强子。
在一些实施方案中，增强子是启动子上游的(即朝向载体的5’端)。
“增强子”是DNA的区域，其可以与蛋白质(激活剂)结合，以增加特定基因转录发生的可能性。增强子是顺式作用的。它们可以位于起始位点的上游或下游，距离基因长达1Mbp(1,000,000bp)处。
在优选的实施方案中，增强子是CMV增强子。
CMV增强子序列的示例为：
在一些实施方案中，增强子包含与SEQ ID NO:2或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列或由其组成，优选地其中增强子基本上保留SEQ ID NO:2的增强子的天然功能。
在优选的实施方案中，增强子包含SEQ ID NO:2的核酸序列或其片段或由其组成。
在优选的实施方案中，第一载体包含增强子，该增强子包含SEQ ID NO:2的核酸序列或其片段或由其组成。
内含子
载体中可以包含内含子以增加转基因表达。可以使用任何合适的内含子，技术人员可以容易地进行选择，前提是第一载体的内含子不能与剪接供体序列同源重组以切除转基因CDS的5’端部分。
示例性内含子序列包括：
(SEQ ID NO:31；野生型小T抗原内含子)
(SEQ ID NO:32；野生型大T抗原内含子)
(SEQ ID NO:33；SV40内含子，例如上游序列来自大T抗原内含子，下游序列来自SV40cds)
在一些实施方案中，内含子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:31、32或33具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中内含子基本上分别保留SEQ ID NO:31、32或33的内含子的天然功能。
在优选的实施方案中，内含子是猿病毒40(SV40)内含子。SV40内含子可以是修饰的SV40内含子(参见，例如，Nathwanietal.(2006)Blood107:2653–2661)。
在一些实施方案中，内含子是细小病毒小鼠(MVM)内含子。
SV40内含子序列的示例为：
(SEQ ID NO:3；修饰的SV40内含子)
在优选的实施方案中，内含子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中内含子基本上保留SEQ ID NO:3的内含子的天然功能。
在一些实施方案中，内含子包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:3的核酸序列或其具有4个、3个、2个或1个核苷酸取代、添加或缺失的变体，优选地其中内含子基本上保留SEQID NO:3的内含子的天然功能。
在优选的实施方案中，内含子包含SEQ ID NO:3的核酸序列或由SEQ ID NO:3的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第一载体包含内含子，该内含子包含SEQ ID NO:3的核酸序列或由SEQ ID NO:3的核酸序列组成。
MVM内含子序列的示例为：
在一些实施方案中，内含子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:4具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中内含子基本上保留SEQ ID NO:4的内含子的天然功能。
在一些实施方案中，内含子包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:4的核酸序列或其具有4个、3个、2个或1个核苷酸取代、添加或缺失的变体，优选地其中内含子基本上保留SEQID NO:4的内含子的天然功能。
在优选的实施方案中，内含子包含SEQ ID NO:4的核酸序列或由SEQ ID NO:4的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第一载体包含内含子，该内含子包含SEQ ID NO:4的核酸序列或由SEQ ID NO:4的核酸序列组成。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中内含子分别基本上保留SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的内含子的天然功能。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；和剪接供体序列；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中内含子分别基本上保留SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的内含子的天然功能。
另一方面，本发明提供了用于在细胞中表达转基因的载体系统，该载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组性区域；
(b)第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组性区域；剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中5’端部分和3’端部分共同构成转基因CDS，并且其中内含子包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中内含子分别基本上保留SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的内含子的天然功能。
剪接供体和受体
RNA剪接是RNA加工的一种形式，新产生的前体信使RNA(pre-mRNA)转录物经此转化为成熟的信使RNA(mRNA)。该剪接过程中将内含子(非编码区)去除，并将外显子(编码区)连接在一起。
在内含子内，剪接需要供体位点(内含子的5’端)、分支位点(内含子的3’端附近)和受体位点(内含子的3’端)。剪接供体位点包含几乎不变的序列GU，其位于更大、更少高度保守的区域内的内含子的5’端处。内含子3’端处的剪接受体位点以几乎不变的AG序列终止内含子。AG的上游(5’方向)存在富含嘧啶(C和U)或多嘧啶片段的区域。多嘧啶片段的更上游是分支点。
“剪接供体序列”是可以在内含子5’端处充当供体位点的核苷酸序列。Maetal.(2015)PLoSOne10(6):p.e0130729中描述了人类剪接位点区域的共有序列和频率。
“剪接受体序列”是可以在内含子3’端处充当受体位点的核苷酸序列。Maetal.(2015)PLoSOne10(6):p.e0130729中描述了人类剪接位点区域的共有序列和频率。
剪接供体序列的示例为：
在一些实施方案中，剪接供体序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:5具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中剪接供体序列基本上保留SEQ ID NO:5的剪接供体序列的天然功能。
在优选的实施方案中，剪接供体序列包含SEQ ID NO:5的核酸序列或由SEQ IDNO:5的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第一载体包含剪接供体序列，该剪接供体序列包含SEQ IDNO:5的核酸序列或由SEQ ID NO:5的核酸序列组成。
剪接受体序列的示例为：
在一些实施方案中，剪接受体序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中剪接受体序列基本上保留SEQ ID NO:6的剪接受体序列的天然功能。
在优选的实施方案中，剪接受体序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列或由SEQ IDNO:6的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第二载体包含剪接受体序列，该剪接受体序列包含SEQ IDNO:6的核酸序列或由SEQ ID NO:6的核酸序列组成。
致重组性区域
可以将致重组性区域添加到双载体中以增加重组。优选地，第一致重组性区域位于第一载体中剪接供体序列的下游，并且第二致重组性区域位于第二载体中剪接受体序列的上游。
在优选的实施方案中，第一致重组性区域和第二致重组性区域是相同的。
在一些实施方案中，第一致重组性区域和第二致重组性区域都是F1噬菌体致重组性区域或其片段。在优选的实施方案中，第一致重组性区域和第二致重组性区域都是AK致重组性区域或其片段。
示例性致重组性区域序列(AK)包括：
在一些实施方案中，致重组性区域(例如，第一致重组性区域和第二致重组性区域)包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:7或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中致重组性区域基本上保留SEQ ID NO:7的致重组性区域的天然功能。
在一些实施方案中，致重组性区域(例如，第一致重组性区域和第二致重组性区域)包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:34或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中致重组性区域基本上保留SEQ ID NO:34的致重组性区域的天然功能。
在优选的实施方案中，致重组性区域(例如第一致重组性区域和第二致重组性区域)包含SEQ ID NO:7的核酸序列或其片段或由SEQ ID NO:7的核酸序列或其片段组成。
在优选的实施方案中，第一载体包含致重组性区域，该致重组性区域包含SEQ IDNO:7的核酸序列或其片段或由其SEQ ID NO:7的核酸序列或其片段组成。
在优选的实施方案中，第二载体包含致重组性区域，该致重组性区域包含SEQ IDNO:7的核酸序列或其片段或由SEQ ID NO:7的核酸序列或其片段组成。
在一些实施方案中，第一致重组性区域和第二致重组性区域均源自碱性磷酸酶基因，例如AP(NM001632,bp823-1100,SEQ ID NO：35)；AP1(XM005246439.2,bp1802-1516,SEQID NO：36)；AP2(XM_005246439.2,bp1225-938,SEQ ID NO：37)。
示例性AP致重组性区域序列包括：
在一些实施方案中，致重组性区域(例如，第一致重组性区域和第二致重组性区域)包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:35或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中致重组性区域基本上保留SEQ ID NO:35的致重组性区域的天然功能。
在一些实施方案中，致重组性区域(例如，第一致重组性区域和第二致重组性区域)包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:36或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中致重组性区域基本上保留SEQ ID NO:36的致重组性区域的天然功能。
在一些实施方案中，致重组性区域(例如，第一致重组性区域和第二致重组性区域)包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:37或其片段具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中致重组性区域基本上保留SEQ ID NO:37的致重组性区域的天然功能。
聚腺苷酸化序列
本发明的载体可以包含聚腺苷酸化序列。适当地，转基因可操作地连接至聚腺苷酸化序列。可以将聚腺苷酸化序列插入转基因的下游以改善转基因表达。
聚腺苷酸化序列通常包含聚腺苷酸化信号、聚腺苷酸化位点和下游元件：聚腺苷酸化信号包含由RNA切割复合物识别的序列基序；聚腺苷酸化位点是在mRNA上添加多聚腺苷酸尾的切割位点；下游元件是富含GT的区域，其通常位于聚腺苷酸化位点的正下游，这对于高效加工非常重要。
在一些实施方案中，第二载体进一步包含转基因CDS的3’端部分下游的聚腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列是牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化序列或SV40聚腺苷酸化序列。
在优选的实施方案中，聚腺苷酸化序列是牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化序列。
示例性的聚腺苷酸化序列包括：
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中聚腺苷酸化序列基本上保留SEQ ID NO:8的聚腺苷酸化序列的天然功能。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:38具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中聚腺苷酸化序列基本上保留SEQ ID NO:38的聚腺苷酸化序列的天然功能。
在优选的实施方案中，聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:8的核酸序列或由SEQ IDNO:8的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第二载体包含聚腺苷酸化序列，该聚腺苷酸化序列包含SEQID NO:8的核酸序列或由多腺苷酸化组成。
载体
载体是一种允许或促进实体从一个环境转移到另一个环境的工具。根据本发明，并且举例而言，用于重组核酸技术的一些载体允许实体，例如核酸片段(例如异源DNA片段，诸如异源cDNA片段)转移至靶细胞。载体可以用于以下目的：将异源核酸(DNA或RNA)维持在细胞内、促进包含核酸片段的载体的复制或促进由核酸片段编码的蛋白质的表达。载体可以是非病毒的或病毒的。用于重组核酸技术的载体的实例包括但不限于质粒、mRNA分子(例如体外转录的mRNA)、染色体、人工染色体和病毒。载体还可以是例如裸核酸(例如DNA)。在其最简单的形式中，载体本身可以是感兴趣的核苷酸。
可以使用本领域已知的各种技术将载体引入细胞中，例如转染、转化和转导。几种此类技术是本领域已知的，例如用重组病毒载体(例如逆转录病毒、慢病毒(例如整合缺陷型慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯疱疹病毒载体)感染；直接注射核酸和基因枪(biolistic)转化。
非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。这里，转染包括使用非病毒载体将基因递送至靶细胞的过程。典型的转染方法包括电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、压缩DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质体法(lipofectin)、阳离子剂介导的转染、阳离子表面两亲物(CFA)(Nat.Biotechnol.(1996)14:556)及其组合。
病毒载体
在优选的实施方案中，载体是病毒载体，例如包含病毒(优选AAV)载体基因组。病毒载体可以是病毒载体颗粒的形式。
病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、小核糖核酸病毒载体或甲病毒载体。
在优选的实施方案中，第一载体和第二载体是AAV载体。AAV载体可以是AAV载体颗粒的形式。
腺相关病毒载体
AAV载体或AAV载体颗粒可包含AAV基因组或其片段或衍生物。AAV基因组是多核苷酸序列，其可以编码产生AAV颗粒所需的功能。这些功能包括在宿主细胞中AAV的复制和包装循环中运行的那些，包括将AAV基因组衣壳化为AAV颗粒。天然存在的AAV是复制缺陷的，并且依赖于提供的反式辅助功能来完成复制和包装循环。因此，AAV基因组通常是复制缺陷的。
AAV基因组可以是单链形式，可以是正义或负义，或替代地是双链形式。双链形式的使用允许避开靶细胞中的DNA复制步骤，因此可以加速转基因表达。
自然界中存在的AAV可以根据各种生物系统进行分类。AAV基因组可以来自任何天然来源的AAV血清型，分离株或进化枝。
AAV可以根据其血清型来指代。血清型对应于AAV的变异亚种，由于其衣壳表面抗原的表达谱，使其具有独特的反应性，可用于将其与其他变异亚种区分开。通常，具有特定AAV血清型的AAV载体颗粒不与任何其他AAV血清型特异性的中和抗体有效地交叉反应。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV-PhP.B和AAV-PhP.eB。
AAV也可以根据进化枝或克隆来指代。这是指天然来源的AAV的系统发育关系，通常是指可以追溯到共同祖先的AAV系统发育群体，并包括其所有后代。此外，AAV可以指特定分离株，即自然界中发现的特定AAV的基因分离株。术语基因分离株描述了AAV群体，该群体与其他天然存在的AAV经历有限的基因混合，从而在基因水平上定义了可识别的不同群体。
通常，天然来源的AAV血清型、分离株或进化枝的AAV基因组包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。ITR序列以顺式作用，以提供功能性复制起点，并允许载体整合到细胞基因组中或从细胞基因组中切除。适当地，一个或多个ITR序列位于转基因或其部分的侧翼。
AAV基因组还可以包含包装基因，例如编码AAV颗粒的包装功能的rep和/或cap基因。启动子可以可操作地连接至每个包装基因。此类启动子的具体实例包括p5、p19和p40启动子。例如，p5和p19启动子一般用于表达rep基因，而p40启动子一般用于表达cap基因。rep基因编码蛋白质Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一种或多种。cap基因编码一种或多种衣壳蛋白，例如VP1、VP2和VP3或其变体。
AAV基因组可以是天然存在的AAV的完整基因组。例如，包含完整AAV基因组的载体可以用于制备AAV载体或载体颗粒。
适当地，出于对患者施用的目的，将AAV基因组衍生化。此类衍生化是本领域标准的，并且本发明涵盖AAV基因组的任何已知衍生物的使用，以及可以通过应用本领域已知的技术产生的衍生物。AAV基因组可以是任何天然存在的AAV的衍生物。适当地，AAV基因组是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11的衍生物。
AAV基因组的衍生物包括AAV基因组的任何截短或修饰形式，其允许来自本发明的AAV载体的转基因在体内表达。通常，可以显著截短AAV基因组，以包含最少的病毒序列，但仍保留上述功能。这可以降低载体与野生型病毒重组的风险，并避免因靶细胞中存在病毒基因蛋白而引发细胞免疫反应。
通常，衍生物将包括至少一个反向末端重复序列(ITR)，任选地多于一个ITR，例如两个ITR或更多个。一种或多种ITR可以源自具有不同血清型的AAV基因组，或者可以是嵌合的或突变的ITR。合适的突变体ITR是删除了trs(末端解析位点)的突变体。这种删除允许基因组继续复制，以生成含有编码序列和互补序列的单链基因组，即自身互补的AAV基因组。这允许避开靶细胞中的DNA复制，从而加速转基因表达。
AAV基因组可以包含来自任何天然来源的AAV或其变体的血清型、分离株或进化枝的一个或多个ITR序列。AAV基因组可包含至少一种、例如两种AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11 ITR或其变体。
一个或多个ITR可以位于转基因或其部分的任一端侧翼。包含一个或多个ITR可以有助于AAV载体在宿主细胞的细胞核中形成串联体，例如在通过宿主细胞DNA聚合酶的作用将单链载体DNA转变为双链DNA之后。此类游离基因的串联体(episomal concatemer)的形成可以在宿主细胞的生命周期中保护AAV载体，从而允许转基因在体内延长表达。
适当地，ITR元件是衍生物中从天然AAV基因组中保留的唯一序列。适当地，衍生物可以不包括天然基因组的rep和/或cap基因以及天然基因组的任何其他序列。这可能会降低载体整合到宿主细胞基因组中的可能性。此外，减小AAV基因组的大小允许提高在载体内引入除了转基因或其部分之外的其他序列元件(例如调控元件)的灵活性。
因此，在本发明的衍生物中可以去除以下部分：一个反向末端重复(ITR)序列、复制(rep)和衣壳(cap)基因。然而，衍生物可以另外包括AAV基因组的一种或多种rep和/或cap基因或其他病毒序列。天然存在的AAV在人类19号染色体上的特定位点处以高频率整合，并且显示出可忽略不计的随机整合频率，使得在治疗环境中可以耐受在AAV载体中保留整合能力。
本发明另外涵盖以与天然AAV基因组不同的顺序和配置提供AAV基因组序列。本发明还涵盖用来自另一种病毒的序列或包含来自多于一种病毒的序列的嵌合基因替换一个或多个AAV序列或基因。此类嵌合基因可以包含来自不同病毒种类的两种或更多种相关病毒蛋白的序列。
AAV载体颗粒可以被衣壳蛋白包裹。合适地，AAV载体颗粒可以是转衣壳形式，其中将具有一种血清型ITR的AAV基因组或衍生物包装在不同血清型的衣壳中。AAV载体颗粒还包括嵌合形式，其中来自两种或更多种不同血清型的未修饰衣壳蛋白的混合物构成病毒衣壳。AAV载体颗粒还包括带有吸附到衣壳表面的配体的化学修饰形式。例如，此类配体可以包括用于靶向特定细胞表面受体的抗体。
当衍生物包含衣壳蛋白，即VP1、VP2和/或VP3时，该衍生物可以是一种或多种天然存在的AAV的嵌合的、改组的(shuffled)或衣壳修饰的衍生物。具体地，本发明涵盖在同一载体(即假型载体)内提供来自AAV的不同血清型、进化枝、克隆或分离株的衣壳蛋白序列。AAV载体可以是假型AAV载体颗粒的形式。
通常选择嵌合的、改组的或衣壳修饰的衍生物来为AAV载体提供一种或多种所需的功能。因此，与包含天然存在的AAV基因组的AAV载体相比，这些衍生物可以展示出提高的基因递送效率和/或降低的免疫原性(体液或细胞)。例如，基因递送效率的提高可以通过改善细胞表面的受体或共受体结合、改善内化、改善细胞内和向细胞核内的运输、改善病毒颗粒的脱壳以及改善单链基因组向双链形式的转变来实现。
嵌合衣壳蛋白包括通过天然存在的AAV血清型的两个或更多个衣壳编码序列之间重组产生的那些。这可以例如通过标记获救(rescue approach)方法来进行，其中一种血清型的非感染性衣壳序列与不同血清型的衣壳序列共转染，并且使用定向选择来选择具有所需特性的衣壳序列。不同血清型的衣壳序列可以通过细胞内的同源重组来改变，以产生新的嵌合衣壳蛋白。
嵌合衣壳蛋白还包括通过工程化改造衣壳蛋白序列以在两个或更多个衣壳蛋白之间，例如在不同血清型的两个或更多个衣壳蛋白之间转移特定衣壳蛋白域、表面环或特定氨基酸残基而产生的那些，。
改组或嵌合衣壳蛋白也可以通过DNA改组或易错PCR产生。杂交AAV衣壳基因可以通过随机片段化相关AAV基因的序列，例如这些编码多种不同血清型的衣壳蛋白，然后随后在自引发聚合酶反应中重新组装片段来创建，这也可能导致同源性序列区域的交叉。可以筛选通过改组几种血清型的衣壳基因这种方式创建的杂交AAV基因文库，以鉴定具有所需功能的病毒克隆。类似地，易错PCR可以用于随机突变AAV衣壳基因，以创建多样化的变体文库，然后可以对于所需的特性选择这些变体文库。
还可以对衣壳基因的序列进行遗传修饰以引入相对于天然野生型序列的特异性缺失、取代或插入。具体地，衣壳基因可以通过在衣壳编码序列的开放阅读框内或在衣壳编码序列的N-和/或C-末端处插入不相关的蛋白质或肽的序列来修饰。不相关的蛋白质或肽可以有利地是充当特定细胞类型的配体的蛋白质或肽，从而赋予与靶细胞的改善的结合，或改善载体靶向特定细胞群的特异性。不相关的蛋白质也可以是作为生产过程的一部分帮助病毒颗粒纯化的蛋白质，即表位或亲和标签。通常选择插入位点以便不干扰病毒颗粒的其他功能，例如病毒颗粒的内化、运输。
衣壳蛋白可以是人工的或突变体衣壳蛋白。本文所用的术语“人工衣壳”意指衣壳颗粒包含自然界中不存在的氨基酸序列，或包含已从天然存在的衣壳氨基酸序列工程化改造(例如修饰)的氨基酸序列。换句话说，当将人工衣壳氨基酸序列与亲本衣壳氨基酸序列比对时，与其所源自的亲本衣壳的序列相比，人工衣壳蛋白包含氨基酸序列中的突变或变异。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体选自由以下组成的组：hu68(参见，例如WO2018/160582)、Anc文库(参见，例如WO2015/054653和WO2017/019994)和AAV2-TT(参见，例如WO2015/121501)。
5’ITR序列的示例如下：
在一些实施方案中，5’ITR包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:9具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中5’ITR基本上保留SEQ ID NO:9的5’ITR的天然功能。
在优选的实施方案中，5’ITR包含SEQ ID NO:9的核酸序列或由SEQ ID NO:9的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第一载体和第二载体包含5’ITR，5’ITR包含SEQ ID NO:9的核酸序列或由SEQ ID NO:9的核酸序列组成。
3’ITR序列的示例如下：
在一些实施方案中，3’ITR包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:10具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中3’ITR基本上保留SEQ ID NO:10的3’ITR的天然功能。
在优选的实施方案中，3’ITR包含SEQ ID NO:10的核酸序列或由SEQ ID NO:10的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第一载体和第二载体包含3’ITR，3’ITR包含SEQ ID NO:10的核酸序列或由SEQ ID NO:10的核酸序列组成。
转基因
在一些实施方案中，转基因选自由以下组成的组：肌球蛋白7A(MYO7A)、ABCA4、CEP290、CDH23、EYS、USH2a、GPR98和ALMS1。
在优选的实施方案中，转基因是肌球蛋白7A(MYO7A)转基因。
MYO7A核苷酸序列的示例为：
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MYO7A转基因的5’端部分的示例为：
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在一些实施方案中，转基因的5’端部分包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:12具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中转基因的5’端部分基本上保留SEQ ID NO:12的转基因的5’端部分的天然功能。
在优选的实施方案中，转基因的5’端部分包含SEQ ID NO:12的核酸序列或由SEQID NO:12的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第一载体包含转基因的5’端部分，该转基因的5’端部分包含SEQ ID NO:12的核酸序列或由SEQ ID NO:12的核酸序列组成。MYO7A转基因的3’端部分的示例为：
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/>
在一些实施方案中，转基因的3’端部分包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:13具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中转基因的3’端部分基本上保留SEQ ID NO:13的转基因的3’端部分的天然功能。
在优选的实施方案中，转基因的3’端部分包含SEQ ID NO:13的核酸序列或由SEQID NO:13的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第一载体包含转基因的3’端部分，该转基因的3’端部分包含SEQ ID NO:13的核酸序列或由SEQ ID NO:13的核酸序列组成。
MYO7A核苷酸序列的将另外示例为：
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(SEQ ID NO:39；NM_000260.3核苷酸273-6920)MYO7A转基因的5’端部分的另外示例为：
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(SEQ ID NO:40；NM_000260.3核苷酸273-3380)
在一些实施方案中，转基因的5’端部分包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:40具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中转基因的5’端部分基本上保留SEQ ID NO:40的转基因的5’端部分的天然功能。
在优选的实施方案中，转基因的5’端部分包含SEQ ID NO:40的核酸序列或由SEQID NO:40的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第一载体包含转基因的5’端部分，该转基因的5’端部分包含SEQ ID NO:40的核酸序列或由SEQ ID NO:40的核酸序列组成。
MYO7A转基因的3’端部分的示例为：
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(SEQ ID NO:41；NM_000260.3核苷酸3381-6920)
在一些实施方案中，转基因的3’端部分包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:41具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中转基因的3’端部分基本上保留SEQ ID NO:41的转基因的3’端部分的天然功能。
在优选的实施方案中，转基因的3’端部分包含SEQ ID NO:41的核酸序列或由SEQID NO:41的核酸序列组成。
在优选的实施方案中，第一载体包含转基因的3’端部分，转基因的3’端部分包含SEQ ID NO:41的核酸序列或由SEQ ID NO:41的核酸序列组成。
在一些实施方案中，转基因是ABCA4转基因。
ABCA4核苷酸序列的示例为：
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ABCA4转基因的5’端部分的示例为：
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在一些实施方案中，转基因的5’端部分包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:43具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中转基因的5’端部分基本上保留SEQ ID NO:43的转基因的5’端部分的天然功能。
ABCA4转基因的3’端部分的的示例为：
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/>
在一些实施方案中，转基因的3’端部分包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:44具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中转基因的5’端部分基本上保留SEQ ID NO:44的转基因的5’端部分的天然功能。
本发明中使用的多核苷酸可以是密码子优化的。在一些实施方案中，转基因是密码子优化的。密码子优化先前已在WO1999/41397和WO2001/79518中描述。不同的细胞对特定密码子的使用有所不同。这种密码子偏好对应于细胞类型中特定tRNA相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，使其定制为与相应tRNA的相对丰度相匹配，可以增加表达。出于同样的原因，可以通过故意选择已知的相应tRNA在特定细胞类型中很少见的密码子来减少表达。因此，可以获得额外程度的翻译控制。对于哺乳动物细胞以及各种其他生物体来说，密码子使用表是本领域已知的。
示例性载体
本发明的第一载体的示例序列为：
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5’ITR
CMV增强子
CBA启动子
修饰的SV40内含子
MYO7A转基因的5’部分
剪接供体序列
致重组性区域
3’ITR
在一些实施方案中，第一载体包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:14具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中第一载体基本上保留SEQ ID NO:14的第一载体的天然功能。
在优选的实施方案中，第一载体包含SEQ ID NO:14的核酸序列或由SEQ ID NO:14的核酸序列组成。
本发明的第二载体的示例序列为：
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/>
致重组性区域
剪接受体序列
endportionofMYO7A转基因的3’端部分
bGH聚腺胺酸化序列
3’ITR
在一些实施方案中，第二载体包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:15具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸同一性的核酸序列，优选地其中第二载体基本上保留SEQ ID NO:15的第二载体的天然功能。
在优选的实施方案中，第二载体包含SEQ ID NO:15的核酸序列或由SEQ ID NO:15的核酸序列组成。
在特别优选的实施方案中，第一载体包含SEQ ID NO:14的核酸序列或由SEQ IDNO:14的核酸序列组成，并且第二载体包含SEQ ID NO:15的核酸序列或由SEQ ID NO:15的核酸序列组成。
组合物
本发明的载体、载体系统和细胞可以与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起配制用于施用给受试者。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，并且可能含有人血清白蛋白。
用于配制药物组合物的材料应该是无毒的并且不应该干扰活性成分的功效。载体或其他材料的精确性质可以由技术人员根据施用途径确定。
药物组合物通常是液体形式。液体药物组合物通常包含液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包含生理盐水溶液、氯化镁、右旋糖或其他糖溶液，或者二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。在一些情况下，可以使用表面活性剂，例如0.001％的普朗尼克酸(PF68)。
对于注射剂来说，活性成分可以是无热原的水溶液形式，并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。技术人员完全能够使用例如等渗媒介物(诸如氯化钠注射液、林格注射液或乳酸林格注射液)来制备合适的溶液。根据需要可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
对于延迟释放，药物可以包含在配制用于缓慢释放的药物组合物中，例如根据本领域已知的方法包含在由生物相容性聚合物形成的微胶囊中或脂质体载体系统中。
细胞疗法产品的处理优选地按照细胞疗法的FACT-JACIE国际标准进行。
治疗的方法
一方面，本发明提供了本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物，其用于疗法。
另一方面，本发明提供了本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物，其用于治疗视网膜变性。优选地，视网膜变性是遗传性视网膜变性。
在一些实施方案中，该用途是治疗或预防Usher综合征、色素性视网膜炎、Leber先天性黑朦(LCA)、Stargardt病、Alstrom综合征或ABCA4相关疾病。
另一方面，本发明提供了本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物，其用于治疗Usher综合征。
在优选的实施方案中，Usher综合征是1B型Usher综合征。
另一方面，本发明提供了治疗或预防视网膜变性的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物。优选地，视网膜变性是遗传性视网膜变性。
另一方面，本发明提供了治疗或预防Usher综合征的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的载体系统、载体、试剂盒或组合物。
在一些实施方案中，黑素体对视网膜色素上皮(RPE)顶端绒毛的定位增加或正常化(例如增加至与健康受试者大约相同的水平)。该增加可以与来自未根据本发明治疗过的眼(例如，来自患有该疾病但在其他方面基本上相同的条件下的受试者的眼)的RPE顶端绒毛相比。该增加(例如以每100μm的数量)可以是例如至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的增加。该增加可以例如将黑素体的数量(例如每100μm的数量)增加至健康受试者的黑素体数量的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％以内。用于分析黑素体的方法技术人员众所周知的，并且包括例如本文公开的方法。
遗传性视网膜变性(IRD)的全球总患病率为1/2,000，是世界范围内失明发生的主要原因。其中最高频率和最严重的IRD是色素性视网膜炎(RP)、Leber先天性黑朦(LCA)和Stargardt病(STGD)，其最常见是作为单基因状况遗传。导致IRD的大多数突变发生在视网膜神经元光感受器(PR)、视杆细胞和/或视锥细胞中表达的基因中。
AAV载体是靶向PR和视网膜色素上皮(RPE)进行单次视网膜下施用后长期治疗的最有效载体之一。本发明能够治疗诸如下表所列的疾病，这些疾病可能难以用单个AAV载体(其可以具有约5kb的最大载货容量)治疗：
IB型Usher综合征(USH1B)是由编码非常规MYO7A的MYO7A基因(CDS：6648bp)突变引起的最严重的RP和耳聋形式，是基于肌动蛋白的马达，在视网膜内的PR和RPE中表达。
Stargardt病(STGD)是由ABCA4基因(CDS：6822bp)突变引起的遗传性黄斑变性的最常见形式，ABCA4基因编码位于PR外段的全反式视网膜转运体(transporter)。
3型视锥-视杆细胞营养不良、黄斑眼底(fundus flavimaculatus)、2型年龄相关性黄斑变性、早发性严重视网膜营养不良和19型色素性视网膜炎也与ABCA4突变(ABCA4相关疾病)相关。
本文提及的所有治疗包括治愈性、缓解性和预防性治疗。优选哺乳动物、特别是人类的治疗。人类和兽医治疗均在本发明的范围内。
施用
在一些实施方案中，将载体、载体系统或细胞局部施用于受试者。
在一些实施方案中，将载体、载体系统或细胞施用于受试者的眼。可以通过注射，例如视网膜下注射施用。
第一载体和第二载体可以以组合同时、依次或单独施用。
本文所用的术语“组合”、“以组合”、“以组合使用”或“组合制剂”可以指两种或更多种药剂同时、依次或单独组合施用。
本文使用的术语“同时”是指同时施用药剂，即在相同时间施用。
本文所用的术语“依次”是指一个接一个地施用药剂。
本文所用的术语“单独”是指彼此独立地但在允许药剂显示出组合的、优选协同的效果的时间间隔内施用药剂。因此，“单独”施用可以允许一种药剂例如在另一种药剂之后1分钟、5分钟或10分钟内施用。
剂量
技术人员可以容易地确定施用于受试者的本发明药剂的合适剂量。通常，医生将确定最适合个体患者的实际剂量，这将取决于各种因素，包括所用特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合、特定状况的严重程度以及经受疗法的个体。当然，可以存在需要更高或更低剂量范围的个体情况，并且这在本发明的范围内。
该剂量可以例如足以治疗或预防视网膜变性。该剂量可以例如足以治疗或预防Usher综合征、色素性视网膜炎、Leber先天性黑朦(LCA)、Stargardt病、Alstrom综合征或ABCA4相关疾病。
在一些实施方案中，剂量是每眼1x109至1.5x1010个总基因组拷贝。在一些实施方案中，剂量是每眼4x109至1.5x1010个总基因组拷贝。在一些实施方案中，剂量为每眼1x109至8x109个总基因组拷贝、每眼2x109至7x109个总基因组拷贝、每眼3x109至6x109个总基因组拷贝或每眼4x109至5x109个总基因组拷贝。在一些实施方案中，剂量为每眼7x109至5x1010个总基因组拷贝、每眼8x109至4x1010个总基因组拷贝、每眼9x109至3x1010个总基因组拷贝或每只眼1x1010至2x1010个总基因组拷贝。
可以使用针对人类受试者优化的等效剂量。在一些实施方案中，剂量是每眼1x109至2x1012个总基因组拷贝。在一些实施方案中，剂量是每眼1x1010至2x1012个总基因组拷贝。在一些实施方案中，剂量是每眼1x1011至2x1012总基因组拷贝。
在一些实施方案中，剂量是每眼1x1011至1.5x1012个总基因组拷贝。在一些实施方案中，剂量是每眼4x1011至1.5x1012个总基因组拷贝。在一些实施方案中，剂量为每眼1x1011至8x1011个总基因组拷贝、每眼2x1011至7x1011个总基因组拷贝、每眼3x1011至6x1011个总基因组拷贝或每眼4x1011至5x1011个总基因组拷贝。在一些实施方案中，剂量为每眼7x1011至5x1012个总基因组拷贝、每眼8x1011至4x1012个总基因组拷贝、每眼9x1011至3x1012个总基因组拷贝或每眼1x1011至2x1012个总基因组拷贝。
可以使用针对不同的非人受试者优化的等效剂量。
受试者
本文使用的术语“受试者”是指人或非人动物。
非人动物的实例包括脊椎动物，例如哺乳动物，诸如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、狗、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠或豚鼠)、猪和猫。非人动物可以是伴侣动物。
优选地，受试者是人。
变体、衍生物、类似物和片段
除了本文提及的特定蛋白质和多核苷酸之外，本发明还涵盖其变体、衍生物和片段。
在本发明的上下文中，任何给定序列的“变体”是其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的具体序列已被如下方式修饰的序列：使得所讨论的多肽或多核苷酸保留其至少一种内源性功能。变体序列可以通过天然存在的多肽或多核苷酸中存在的至少一个残基的添加、缺失、取代、修饰、置换和/或变异来获得。
如本文中所用，与本发明的蛋白质或多肽相关的术语“衍生物”包括来自序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何替代、变化、修饰、替换、删除和/或添加，或对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何替代、变化、修饰、替换、删除和/或添加，前提是所得蛋白质或多肽保留其至少一种内源性功能。
通常，可以进行氨基酸取代，例如1、2或3至10或20个取代，前提是修饰的序列保留所需的活性或能力。氨基酸取代可以包括使用非天然存在的类似物。
本发明中使用的蛋白质还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并产生功能等同的蛋白质。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有不带电荷极性头基团(具有相似亲水性值)的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表进行保守取代。第二列中同一块中和第三列中同一行中的氨基酸可以相互取代：
通常，变体可以与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列具有一定的同一性。
在本文中，认为变体序列包括与主题序列可以至少50％、55％、65％、75％、85％或90％相同，适当地至少95％、96％或97％或98％或99％相同的氨基酸序列。尽管变体也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，但在本发明的上下文中，优选根据序列同一性来表达。
在本文中，认为变体序列包括与主题序列可以至少50％、55％、65％、75％、85％或90％相同，适当地至少95％、96％或97％或98％或99％相同的核苷酸序列。尽管变体也可以根据相似性来考虑，但在本发明的上下文中，优选根据序列同一性来表达它。
适当地，提及与本文详述的任一SEQ ID NO具有百分比同一性的序列是指，在所涉及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
序列同一性比较可以通过肉眼进行，或者更常见的是借助现成的序列比较程序进行。这些市售计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同一性百分比。
可以计算连续序列的同一性百分比，即将一个序列与另一序列对齐，并且将一个序列中的每个氨基酸或核苷酸与另一序列中的相应氨基酸或核苷酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位(ungapped)”对齐。通常，此类无空位对齐仅在相对较少数量的残基上进行。
尽管这是一种非常简单且一致的方法，但其没有考虑到，例如，在一对在其他方面相同的序列中，氨基酸或核苷酸序列中的一个插入或缺失可能会导致后面的残基或密码子失去对齐，因此在进行全局比对时，可能会导致同一性百分比大幅下降。因此，大多数序列比较方法旨在产生最佳对齐，考虑可能的插入和缺失，而不会过度惩罚总体同一性得分。这是通过在序列对齐中插入“空位”以尝试最大化局部同一性来实现的。
然而，这些更复杂的方法为对齐中出现的每个空位分配“空位罚分”，以便对于相同数量的相同氨基酸或核苷酸，序列对齐具有尽可能少的空位，反映两个比较序列之间更高的相关性，会比有很多空位的序列获得更高的分数。通常使用“仿射空位成本”，其对于空位的存在收取相对较高的成本，并且对空位中的每个后续残基收取较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生空位更少的优化对齐。大多数对齐程序允许修改空位罚分。然而，当使用此类软件进行序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCGWisconsin Bestfit包时，氨基酸序列对于空位的默认空位罚分为-12，并且对于每个延伸为-4。
因此，计算最大同一性百分比首先需要产生最佳对齐，同时考虑空位罚分。用于进行此类对齐的合适计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit包(威斯康星大学,USA；Devereuxet al.(1984)Nucleic Acids Research 12:387)。可以执行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST包(参见Ausubel et al.(1999)ibid–Ch.18)、FASTA(Atschul et al.(1990)J.Mol.Biol.403-410)、EMBOSS Needle(Madeira,F.,et al.,2019.Nucleic acidsresearch,47(W1),pp.W636-W641)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA都可用于离线和在线搜索(参见Ausubel et al.(1999)ibid,7-58至7-60页)。然而，对于某些应用程序，优选使用GCG Bestfit程序。另一种工具BLAST 2Sequences也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(FEMS Microbiol.Lett.(1999)174(2):247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177(1):187-8)。
尽管可以测量最终的同一性百分比，但比对过程本身通常不是基于全有或全无的配对比较。相反，通常使用分级的相似性评分矩阵，其基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配分数。常用的此类矩阵的实例是BLOSUM62矩阵(BLAST程序套件的默认矩阵)。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供)(进一步的细节参见用户手册)。对于某些应用程序，对于GCG包优选使用公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵，诸如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳对齐，就可以计算序列同一性百分比。软件通常将其作为序列比较的一部分并生成数值结果。序列同一性百分比可以计算为相同残基的数目占所涉及的SEQ ID NO中总残基的百分比。
“片段”也是变体，并且该术语通常指在功能上或例如在试验中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
此类变体、衍生物和片段可以使用标准重组DNA技术诸如定点诱变来制备。当要制备插入时，可以制备编码插入的合成DNA以及对应于插入位点任一侧的天然存在序列的5’和3’侧翼区域。侧翼区域将含有与天然存在的序列中的位点相对应的方便的限制性位点，以便可以用适当的酶切割该序列并将合成DNA连接到切口中。然后根据本发明表达DNA以制备编码的蛋白质。这些方法仅是本领域已知的用于操作DNA序列的众多标准技术的示例，并且也可以使用其他已知的技术。
技术人员将理解，他们可以组合本文公开的本发明的所有特征而不脱离所公开的本发明的范围。
现在将通过非限制性示例来描述本发明的优选特征和实施方案。
除非另有说明，本发明的实践将采用化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域普通技术人员的能力范围内。文献中对此类技术进行了解释。参见，例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.et al.(1995和定期补充)Current Protocols in Molecular Biology,Ch.9,13和16,John Wiley&Sons；Roe,B.,Crabtree,J.和Kahn,A.(1996)DNA Isolationand Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；Polak,J.M.和McGee,J.O’D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,Oxford University Press；Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；和Lilley,D.M.和Dahlberg,J.E.(1992)Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press。这些通用文本中的每一个均通过引用并入本文。
实施例
实施例1
结果与讨论
双腺相关病毒(AAV)载体的优化
在表征用于递送人Myosin7A(hMYO7A)的双AAV8载体的过程中，我们在包含转基因编码序列CDS(AAV8-5’hMYO7A)的5’端部分的载体的制剂中发现了污染物载体。
使用探针(该探针识别载体中使用的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子)开发的Southern印迹分析显示对应于预期AAV8-5’hMYO7A的较大的带和对应于污染物的约1.3Kb的较小的带(图1A、B)。
较小的基因组污染物始终存在于载体制剂中，但在用于生成它们的质粒中不存在。因此，我们假设该问题与病毒基因组有关，并且较小产物的产生发生在制造载体颗粒时或之后，因为初始质粒基因组显然是完整的。
然后，我们鉴定了两个序列之间的82碱基对同源区域：嵌合启动子内含子和剪接供体(SD)信号(图1C，参见下面的序列)。
嵌合内含子(Bothwell et al.(1981)Cell 24:625–637)：
剪接供体(SD)序列：
下划线序列是相同的：SD序列与嵌合内含子的核苷酸1-82相同。
使用纯化的病毒DNA的亚克隆和Sanger测序，我们证实由于构建体内存在同源区域，因此发生了同源重组事件。这导致内含子的剩余部分、5’hMYO7A序列和SD信号的缺失，而新构建体仍然保留AAV反向末端重复(ITR)，从而支持载体产生(图1D)。
在含有内含子序列和SD序列的其他载体(例如包含其他转基因和启动子)中观察到类似的污染物(图1E)，并且通过去除内含子序列而消除了类似的污染物。
然后我们用与SD序列不同源的序列替换嵌合内含子。我们克隆了编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒，其具有嵌合内含子(猿病毒40(SV40)内含子的改良版本)(Nathwani et al.(2006)Blood 107:2653–2661)、细小病毒小鼠(MVM)内含子(Wu et al.(2008)Mol.Ther.16:280–289)或无内含子，以便通过转染进行HEK293细胞中EGFP表达的比较。荧光成像(图2B)显示，含有SV40内含子或MVM内含子的构建体的EGFP表达与含有嵌合内含子的构建体相似。
克隆SV40和MVM内含子后，我们分别制作了包含hMYO7A CDS的5’端部分的AAV2载体(AAV2-SV40内含子-5’hMYO7A和AAV2-MVM内含子-5’hMYO7A)以在HEK293细胞中进行第二次体外比较：通过针对AAV2-嵌合内含子-5’hMYO7A和AAV2-无内含子-5’hMYO7A的MYO7A表达。
Westernblot分析显示，SV40和MVM内含子在体外诱导hMYO7A的表达水平相当(图3)。
最后，我们分别制备了包含hMYO7ACDS 5’端部分的AAV8载体(AAV8-SV40内含子-5’hMYO7A和AAV8-MVM内含子-5’hMYO7A)。然后，我们通过Southern印记对纯化的病毒DNA针对AAV8-嵌合内含子-5’hMYO7A进行了第三次比较，并且我们还向C57BL/6小鼠视网膜下注射了AAV8-3’hMYO7A-3XFlag，以通过蛋白质印记分析来评价hMYO7A表达水平。
我们发现SV40和MVM内含子都避免了污染物载体的形成，并在体内实现了相似的hMYO7A表达水平(图4)。我们决定使用AAV8-SV40内含子-5’hMYO7A来制备双AAV8-5’hMYO7A，以用于非临床和临床研究。
材料和方法
AAV载体质粒的生成
用于产生AAV载体的质粒含有AAV血清型2的反向末端重复(ITR)。生成双AAV载体所需的两个AAV载体质粒(5’和3’)含有多个元件。5’质粒含有：鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)和与嵌合启动子内含子偶联的CMV增强子，该嵌合启动子内含子包含来自人β-珠蛋白基因第一内含子的5’-供体位点和分支和来自内含子的3’-受体位点，该内含子为位于免疫球蛋白基因重链可变区的前导序列和主体之间(Bothwell et al.(1981)Cell 24:625–637)，猿病毒40启动子内含子(SV40)的改良版本(Nathwani et al.(2006)Blood 107:2653–2661)或细小病毒小鼠内含子(Wu et al.(2008)Mol.Ther.16:280–289)；转基因编码序列(CDS)的N末端部分；剪接供体序列。3’质粒含有：剪接受体序列和其后是BGH PolyA转基因CDS的C末端部分。对于一些实验，使用了C末端处带有3XFlag标签的hMYO7A的3’部分。
hMYO7ACDS在外显子24-25之间的天然外显子-外显子连接处分裂(5’半：NM_000260.3,bp 273-3380；3’半：NM_000260.3,bp 3381-6920)。
双AAV载体质粒中含有的剪接供体(SD)序列和剪接受体(SA)序列如下：
SD:
SA:
杂交AK载体质粒中含有的致重组性序列源自噬菌体F1基因组(基因库登录号：J02448.1；bp 5850-5926)。AK序列为：
AAV载体的产生和表征
双AAV-hMYO7A载体由TIGEM AAV Vector Core产生。通过转染HEK293细胞三次，然后进行两轮CsCl2纯化来产生载体(Grimm et al.(1998)Hum.Gene Ther.2760:2745–2760；Liu et al.(2003)Biotechniques 34:184–189；Salvetti et al.(1998)Hum.GeneTher.9:695–706；Zolotukhin et al.(1999)Gene Ther.6:973–985)。对于每种病毒制剂，通过TaqMan定量PCR(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)确定物理滴度[基因组拷贝数(GC)/ml]。引物和探针设计为在AAV-5’hMYO7a的5’-hMYO7A上退火以及在AAV-3’hMYO7A的BGH pA上退火。AAV-5’hMYO7A的碱性Southern印迹分析按如下进行：从AAV颗粒提取3E+10GC病毒DNA。为了消化未包装的基因组，将载体溶液与1U/μL DNA酶I(Roche，米兰，意大利)以300μL的总体积在37℃温育2小时，该温育中含有40mM TRIS–HCl、10mM NaCl、6mMMgCl2、1mM CaCl2，pH 7.9。接下来将DNA酶I用50mM EDTA灭活，然后与蛋白酶K和2.5％N-月桂酰肌氨酸溶液在50℃温育45分钟以裂解衣壳。用苯酚-氯仿提取DNA两次，并用两倍体积的绝对乙醇和10％乙酸钠(3M，pH 7)沉淀。纯化的DNA跑进碱性琼脂糖凝胶，并使用地高辛非放射性方法(Roche，米兰，意大利)成像。上样10μL的1kb DNA梯(N3232L；New EnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)作为分子量标志物。Southern印记探针是通过使用KpnI-XhoI酶消化5’AAV质粒DNA来提取并纯化544碱基对探针而获得的。
细胞培养和转染
HEK293细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中(Gibco,Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)。将细胞铺在6孔板中(HEK2931E+6个细胞/孔)，24小时后使用磷酸钙+1.5μg相应质粒转染孔。4小时后，用2mL的新鲜预热培养基更换培养基。转染后72小时收获并裂解细胞。
小鼠中视网膜下注射AAV载体
这项研究是根据视觉和眼科研究协会(Association for Research in Visionand Ophthalmology Statement)关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明以及根据意大利卫生部(Ministry of Health)关于动物程序的规定(授权号301/2020-PR)进行的。
C57BL/6和shaker-/-小鼠饲养在TIGEM动物房(Pozzuoli，意大利)，并维持在12小时光/暗周期下(光照阶段期间10-50lux暴露)。手术在麻醉下进行，并尽一切努力尽量减少痛苦。成年小鼠腹腔注射2mL/100g体重的氯胺酮/美托咪定进行麻醉。如Liang等人所述，通过后经巩膜经脉络膜方法将等体积的载体溶液或赋形剂递送至视网膜下(Liang et al.(2000)Vis.Res.Protoc.47:125–139)。
蛋白质印迹分析
用于蛋白质印迹(Wb)分析的细胞和眼杯(杯+视网膜)在RIPA缓冲液(50mM Tris–HCl pH 8.0,150mM NaCl,1％ NP40,0.5％脱氧胆酸钠,1mM EDTA pH 8.0,0.1％ SDS)中裂解，以提取MYO7A。裂解缓冲液补充有0.5％苯甲基磺酰氟(PSMF)(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)和1％完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche，米兰，意大利)。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo-Scientific)确定蛋白质浓度。裂解后，将样品在以1:10补充有β-巯基乙醇的4X Laemmli样品缓冲液(Bio-rad，米兰，意大利)中于99℃变性5分钟。将样品在7％丙烯酰胺凝胶上分离。用于免疫印迹的抗体如下：抗3XFlag(1:1000，单克隆，A8592；Sigma)，用于识别全长hMYO7A-3XFlag；抗Dysferlin(1:500，MONX10795；Tebu-bio，Le Perray-en-Yveline，法国)。使用ImageJ软件进行Wb带的定量，hMYO7A表达相对于Dysferlin表达进行归一化。
载体序列
实验中使用的MYO7A编码载体的序列在本文中公开为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
实验中使用的另外的载体的序列是：
5’CMV-ABCA4-AK
/>
/>
/>
5’ITR
CMV即时早期增强子/启动子
嵌合内含子
ABCA4的5’端部分
剪接供体序列
AK致重组性区域
3’ITR
5’CMV-ABCA4-TS
/>
/>
5’ITR
CMV即时早期增强子/启动子
嵌合内含子
ABCA4的5’端部分
剪接供体序列
3’ITR
5’CMV无内含子ABCA4 OV
/>
/>
/>
5’ITR
CMV即时早期增强子/启动子
ABCA4的5’端部分
3’ITR
5’CMV无内含子ABCA4-AK
/>
/>
/>
(SEQ ID NO:24)
5’ITR
CMV即时早期增强子/启动子
ABCA4的5’端部分
剪接供体序列
AK致重组性区域
3’ITR
5’VMD2 ABCA4-AK
/>
/>
/>
5’ITR
增强子
VMD2启动子
ABCA4的5’端部分
剪接供体序列
AK致重组性区域
3’ITR
5’RHOABCA4-AK
/>
/>
/>
5’ITR
增强子
RHO启动子
ABCA4的5’端部分
剪接供体序列
AK致重组性区域
3’ITR
5’RHO ABCA4-TS
/>
/>
/>
5’ITR
增强子
RHO启动子
ABCA4的5’端部分
剪接供体序列
3’ITR
实施例2.双AAV8.hMYO7A反应研究
在shaker1-/-(sh1-/-)小鼠(Usher 1b的小鼠模型)体内测试了双AAV8.MYO7A(包括带有SV40内含子的AAV8.5’MYO7A)的治疗功效。为了选择用于1B型Usher综合征(USH1B)受试者的剂量，我们使用在良好的类似生产的做法(即tox批次)下生产的双AAV8.hMYO7A进行了剂量反应研究。对视网膜下注射的sh1-/-小鼠(USH1B小鼠模型)进行分析，以用于视网膜缺陷的修复和hMYO7A蛋白水平。我们选择了三种不同的剂量：1,37E+9总GC/眼(低剂量或LD)、4,4E+9总GC/眼(中等剂量或MD)和1,37E+10总GC/眼(高剂量或HD)。未受影响的杂合小鼠和仅注射AAV溶剂(补充有35mM NaCl和0.001％泊洛沙姆188的磷酸盐缓冲盐水)的受影响小鼠分别作为阳性和阴性对照。Sh1-/-小鼠表现出视网膜超微结构缺陷，因为几乎没有黑素体定位到视网膜色素上皮(RPE)顶端绒毛。注射三个月后，我们通过测量正确定位到RPE顶端绒毛的黑素体的数量证实剂量依赖性效应(图5A-B)。与仅接受溶剂的sh1-/-相比，注射HD和MD的双AAV8.hMYO7A显著修复了视网膜缺陷；此外，未受影响的眼和用HD治疗的受影响的眼之间没有统计学差异(图5B，pANOVA值：注射制剂缓冲液的受影响的sh1-/-相比于以下任一：注射制剂缓冲液的未受影响的sh1+/-<0.0001，用高剂量治疗的sh1-/-<0,0001，用中等剂量治疗的sh1-/-<0,01或用低剂量治疗的sh1-/-＝0,313；用高剂量治疗的sh1-/-相比于以下任一：注射制剂缓冲液的未受影响的sh1+/-＝0,105，用中等剂量治疗的sh1-/-＝0,113或用低剂量治疗的sh1-/-<0,01；用中等剂量治疗的sh1-/-相比于以下任一：注射制剂缓冲液的未受影响的sh1+/-<0.001或用低剂量治疗的sh1-/-＝0.442；注射制剂缓冲液的未受影响的sh1+/-相比于用低剂量治疗的sh1-/-<0.0001)。与阴性对照相比，Sh1-/-LD治疗的眼也显示出视网膜表型的矫正。未受影响的sh1+/-组内存在一些影响统计分析的变异性，因此我们在没有未受影响的sh1+/-的情况下重复了ANOVA分析，并且LD也达到了统计显著性(图5B，pANOVA值：注射制剂缓冲液的受影响的sh1-/-相比于以下任一：用高剂量治疗的sh1-/-<0.0001，用中等剂量治疗的sh1-/-<0.0001或用低剂量治疗的sh1-/-<0.01；用高剂量治疗的sh1-/-相比于以下任一：用中等剂量治疗的sh1-/-<0,001或低剂量治疗的sh1-/-<0,0001；用中等剂量治疗的sh1-/-相比于用低剂量治疗的sh1-/-<0.05)。视网膜下注射5周后，对sh1-/-小鼠的裂解眼杯(RPE+神经视网膜)进行蛋白质印迹分析，显示了所有选定剂量的双AAV8.hMYO7A的全长hMYO7A的表达(图5C-D)。与LD相比，使用HD和MD的hMYO7A表达呈阳性的眼的数量较多(图5D)。考虑到人视网膜是鼠视网膜的100倍(Panda-Jonas et al.(1994)Ophthalmology101:519–523；Remtulla et al.(1985)Vision Res.25:21–31)，我们可以推断出双AAV8.hMYO7A的相应人类治疗剂量范围可以在1.37E+11总GC/眼至1.37E+12总GC/眼之间。
材料和方法
蛋白质印迹分析
用于蛋白质印迹(WB)分析的眼杯(杯+视网膜)在RIPA缓冲液(50mM Tris–HCl pH8.0,150mM NaCl,1％ NP40,0.5％脱氧胆酸钠,1mM EDTApH 8.0,0.1％ SDS)中裂解。裂解缓冲液补充有0.5％苯甲基磺酰氟(PSMF)(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri)和1％完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche，米兰，意大利)。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo-Scientific,Waltham,Massachusetts)确定蛋白质浓度。裂解后，样品在补充有1:10稀释的β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)的4X Laemmli样品缓冲液(Bio-rad，米兰，意大利)中于99℃变性5分钟。在4-20％梯度预制TGX凝胶(Bio-rad)上分析样品的MYO7A。使用以下抗体进行免疫印迹：定制抗hMYO7A(1:200，多克隆；Primm Srl,米兰，意大利)，其识别与hMYO7A蛋白的氨基酸941-1070相对应的肽(DMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPV；下划线的氨基酸在鼠的Myo7A中是不同的(1,6％))；抗Dysferlin(1:500，MONX10795；Tebu-bio，Le Perray-en-Yveline，法国)。使用ImageJ软件进行WB带的定量，hMYO7A表达相对于Dysferlin表达进行归一化。
黑素体定位分析
注射AAV3个月后，将着色的sh1小鼠(+/-或-/-)的眼睛摘除，并在角膜颞侧烧灼。使用0.1M PBS中的2％戊二醛-2％多聚甲醛进行固定过夜，在0.1M PBS中冲洗并在光学显微镜下解剖。眼杯的颞侧部分用Araldite 502/EMbed812(Araldite 502/EMbed 812KIT,catalog#13940；Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA,USA)包埋。在Leica超微切片机RM2235(Leica Microsystems,Bannockburn,IL,USA)上横向切割半薄(0.5μm)切片，安装在载玻片上并用甲苯胺蓝和硼砂(borace)染色。由戴面具的操作员在整个视网膜切片的拼集(montage)中对黑素体进行计数，该视网膜切片的拼集是通过使用Zeiss Apotome(Carl Zeiss,Oberkochen，德国)以100倍放大倍数采集重叠视野而获得的；然后，在Photoshop软件(Adobe,San Jose,California)上重构整个视网膜切片。使用ImageJ软件进行黑素体计数和视网膜色素上皮(RPE)测量。黑素体数量按RPE长度除以100μm进行归一化。
统计分析
使用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tuckey事后分析，以在图5中的组之间进行多对比较。图5：对正确定位至视网膜色素上皮的黑素体的剂量依赖性影响：ANOVAp-值如下。注射制剂缓冲液的受影响的sh1-/-相比于以下任一：注射制剂缓冲液的未受影响的sh1+/-(pANOVA<0,0001)，用高剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0,0001)，用中等剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0.01)或用低剂量治疗的sh1-/-(pANOVA＝0.313)；用高剂量治疗的sh1-/-相比于以下任一：注射制剂缓冲液的未受影响的sh1+/-(pANOVA＝0,105)，用中等剂量治疗的sh1-/-(pANOVA＝0,113)或用低剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0,01)；用中等剂量治疗的sh1-/-相比于以下任一：注射制剂缓冲液的未受影响的sh1+/-(pANOVA<0,001)或用低剂量治疗的sh1-/-(pANOVA0,442)；注射制剂缓冲液的未受影响的sh1+/-相比于用低剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0.0001)。由于注射制剂缓冲液的sh1+/-的变异性影响ANOVA分析，因此在没有未受影响的对照的情况下再次进行比较的分析，并且ANOVAp值如下：注射制剂缓冲液的受影响的sh1-/-相比于用高剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0.0001)、用中等剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0.0001)或用低剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0.01)；用高剂量治疗的sh1-/-相比于以下任一：用中等剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0,001)或用低剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0,0001)；用中等剂量治疗的sh1-/-相比于用低剂量治疗的sh1-/-(pANOVA<0.05)。数据以平均值[±平均值的标准误差(s.e.m.)]表示，该平均值是使用独立体外实验或眼的数量计算的(不是同一样本的重复测量)。统计p值≤0.05被认为是显著的。
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所公开的载体、系统、方法或用途的各种修改和变化对于技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案公开了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不合理地限于此类特定的实施方案。事实上，对于技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所公开模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
Claims (17)
1.一种用于在细胞中表达转基因的载体系统，所述载体系统包含第一载体和第二载体，其中：
(a)所述第一载体在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和第一致重组性区域；
(b)所述第二载体在5’至3’方向上包含：第二致重组性区域；剪接受体序列；和转基因CDS的3’端部分；
其中所述5’端部分和所述3’端部分共同构成所述转基因CDS，并且其中所述内含子不能与所述剪接供体序列同源重组以切除所述转基因CDS的5’端部分。
2.权利要求1的载体系统，其中所述内含子不包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸的区域，其与所述剪接供体序列的区域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(优选100％)序列同一性。
3.权利要求1或2的载体系统，其中所述内含子：
(a)是猿病毒40(SV40)内含子或细小病毒小鼠(MVM)内含子；和/或
(b)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
4.前述权利要求中任一项的载体系统，其中所述剪接供体序列包含与SEQ ID NO:5具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
5.前述权利要求中任一项的载体系统，其中所述第一致重组性区域和所述第二致重组性区域：
(a)都是F1噬菌体致重组性区域或其片段；和/或
(b)两者均包含与SEQ ID NO:7或其片段具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
6.前述权利要求中任一项的载体系统，其中所述第一载体和所述第二载体是病毒载体。
7.前述权利要求中任一项的载体系统，其中所述第一载体和所述第二载体是AAV载体，任选地，其中所述第一载体进一步包含5’ITR和3’ITR，和所述第二载体进一步包含5’ITR和3’ITR。
8.前述权利要求中任一项的载体系统，其中所述启动子是CBA启动子或其片段。
9.前述权利要求中任一项的载体系统，其中所述第二载体进一步包含所述转基因CDS的3’端部分下游的聚腺苷酸化序列。
10.前述权利要求中任一项的载体系统，其中所述转基因是肌球蛋白7A(MYO7A)转基因。
11.前述权利要求中任一项的载体系统，其中：
(a)所述第一载体包含与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；和/或
(b)所述第二载体包含与SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
12.一种用于在细胞中表达转基因的方法，包括用前述权利要求中任一项中所定义的第一载体和第二载体转导或转染所述细胞，使得所述转基因在所述细胞中表达。
13.一种载体，其在5’至3’方向上包含：启动子；内含子；转基因编码序列(CDS)的5’端部分；剪接供体序列；和致重组性区域；其中所述内含子不能与所述剪接供体序列同源重组以切除所述转基因CDS的5’端部分。
14.权利要求13的载体，其中所述载体包含与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
15.权利要求1-11中任一项的载体系统，其用于疗法。
16.权利要求1-11中任一项的载体系统，其用于治疗Usher综合征，任选地，1B型Usher综合征。
17.一种治疗或预防Usher综合征的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1-11中任一项所述的载体系统，任选地，其中所述Usher综合征是1B型Usher综合征。
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