JP2024517957A - ベクター系 - Google Patents

ベクター系 Download PDF

Info

Publication number
JP2024517957A
JP2024517957A JP2023570159A JP2023570159A JP2024517957A JP 2024517957 A JP2024517957 A JP 2024517957A JP 2023570159 A JP2023570159 A JP 2023570159A JP 2023570159 A JP2023570159 A JP 2023570159A JP 2024517957 A JP2024517957 A JP 2024517957A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
vector
sequence
transgene
intron
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023570159A
Other languages
English (en)
Inventor
アウリッキオ，アルベルト
デラクイラ，ファビオ
トラパーニ，イヴァナ
フェルラ，リタ
Original Assignee
フォンダツィオーネ テレトン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by フォンダツィオーネ テレトン filed Critical フォンダツィオーネ テレトン
Publication of JP2024517957A publication Critical patent/JP2024517957A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Abstract

細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含み、(a)第1のベクターが、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、(b)第2のベクターが、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、5'末端部分及び第3'末端部分が一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、イントロンが、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない、ベクター系。【選択図】なし

Description

本発明は、ベクター及びベクター系に、特に大きな導入遺伝子の、標的細胞への送達を可能にするベクター及びベクター系に関する。本発明はまた、遺伝子療法におけるベクター及びベクター系の使用に関する。
例えばアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用した遺伝子療法は、多くの遺伝性網膜変性症(IRD)の治療のための有望なアプローチである。実際に、種々のIRDに関する長年にわたる前臨床研究及び臨床試験により、AAVが治療用遺伝子を、罹患した網膜層(例えば、光受容器(PR)及び網膜色素上皮(RPE))に効率的に送達することができることが示されており、ヒトにおけるその優れた安全性及び有効性のプロファイルが強調されている。しかしながら、AAV遺伝子療法ベクターを利用する際の主な障害の1つは、導入遺伝子をパッケージングするそれらの容量であり、それは、最大約5kbに制限されうる。このことが、5kbよりも大きいコード配列(CDS)を有する遺伝子の突然変異に起因して起こるIRDなどの疾患に対する遺伝子置換療法の開発にとって限定因子となりうる。
AAVの容量を増加させるための戦略の同定に大きな関心が向けられてきた。例えば、AAVゲノムの、分子間組換えを介してコンカテマー化する(concatemerise)能力に基づく二重AAVベクターは、この問題に対処するのに首尾よく活用されてきた。二重AAVは、大きな導入遺伝子CDSを、別々の部分に分割して、それぞれを単一の正常サイズ(NS;5kb未満)のAAVベクターにパッケージングすることによって生成されうる。完全長導入遺伝子CDSの再構成は、両方の二重AAVベクターによる同じ細胞の同時感染、続くi)2つのベクターゲノムの逆位末端反復(ITR)媒介性のテールトゥヘッドコンカテマー化、その後のスプライシング(二重AAVトランススプライシング、TS)(Duanら(2001)Molecular Therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 4:383-391)、ii)2つのベクターゲノムに含有される重複領域間の相同組換え(二重AAV重複、OV)(Duanら.(2001)Molecular Therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 4:383-391)、又はiii)2つの組合せ(二重AAVハイブリッド)(Ghoshら(2008).Molecular Therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 16:124-130)のいずれかの際に達成されうる。
二重AAVハイブリッドベクターの状況で最も使用される組換え誘導(recombinogenic)領域は、高レベルの二重AAVハイブリッドベクター再構成を付与することが示されているヒトアルカリホスファターゼcDNAの中央の3分の1の872bp配列に由来する。更に、F1ファージゲノム(AK)由来の77bp配列は、in vitro及びin vivo実験で組換え誘導性が高いことが見出されている。
研究により、目的の組織における大きな導入遺伝子の送達及び再構成に関して、二重ベクター系、例えばAAVベクター系の潜在力が強調されてきたが、臨床用途へのそれらの変換は、依然として満たされていない大きな要求のままである。
大きな導入遺伝子(例えば、ミオシン7A、MYO7A)の送達用の二重ベクター系の開発中に、本発明者らは予期せぬことに、導入遺伝子CDSの5'末端部分を含有するベクターのそれらの調製において一貫性のある混入物を発見した。本発明者らは、サザンブロットを用いて調製物を分析し、予想されるベクターに相当するバンドを同定し、驚くべくことに、混入物に相当する約1.3kbのより小さなサイズのバンドも発見した。
続いて、本発明者らは、ベクターを更に研究して、ベクターで使用されるキメラプロモーターイントロンと、スプライシングドナー(SD)部位との間の相同性の領域を同定した。精製したウイルスDNAの更なるシーケンシング分析により、構築物内の相同性のこれらの領域の存在に起因して相同組換え事象が起こり、それが、AAV逆位末端反復(ITR)を保持しながら、イントロンの残りの部分、導入遺伝子CDSの5'末端部分及びSD部位の欠失をもたらし、このようにしてベクター産生を支持していることが確認された。
一態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、該導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、該導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
好ましい実施形態では、イントロンはサルウイルス40(SV40)イントロンである。SV40イントロンは、改変SV40イントロンでありうる。
一部の実施形態では、イントロンはマウス微小ウイルス(MVM)イントロンである。
一部の実施形態では、イントロンは、配列番号3又は4に対して少なくとも95%配列同一性(例えば、少なくとも96%、97%、98%若しくは99%配列同一性、又は100%配列同一性)を有するヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、イントロンは、配列番号3に対して少なくとも95%配列同一性(例えば、少なくとも96%、97%、98%若しくは99%配列同一性、又は100%配列同一性)を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、スプライスドナー配列は、配列番号5に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
好ましい実施形態では、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域は同じである。
一部の実施形態では、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域はともに、F1ファージ組換え誘導領域又はそれらの断片である。
一部の実施形態では、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域はともに、配列番号7に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列又はその断片を含む。
一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター又はアルファウイルスベクターでありうる。一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターはプラスミドである。第1及び/又は第2のプラスミドは、例えば、第1及び/又は第2のウイルスベクター粒子を産生する(組成物中で別々に又は一緒に)のに使用されうる。
好ましい実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターはAAVベクターである。
一部の実施形態では、AAVベクターは同じ血清型を有する(例えば、同じ血清型のキャプシドを含む)。一部の実施形態では、AAVベクターは異なる血清型を有する(例えば、異なる血清型のキャプシドを含む)。
一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、AAV2、AAV8、AAV5、AAV7、AAV9、AAV-PhP.B及びAAV-PhP.eBからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、hu68(例えば、国際公開第2018/160582号を参照)、Ancライブラリー(例えば、国際公開第2015/054653号及び国際公開第2017/019994号を参照)及びAAV2-TT(例えば、国際公開第2015/121501号を参照)からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターはAAV2ベクターである。一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターはAAV8ベクターである。
一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、AAV2、AAV8、AAV5、AAV7、AAV9、AAV-PhP.B及びAAV-PhP.eBからなる群から選択されるキャプシドを含む。一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、hu68(例えば、国際公開第2018/160582号を参照)、Ancライブラリー(例えば、国際公開第2015/054653号及び国際公開第2017/019994号を参照)及びAAV2-TT(例えば、国際公開第2015/121501号を参照)からなる群から選択されるキャプシドを含む。
一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターはAAV2キャプシドである。一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターはAAV8キャプシドである。
一部の実施形態では、第1のベクターは5'ITR及び3'ITRを更に含む。一部の実施形態では、第2のベクターは5'ITR及び3'ITRを更に含む。好ましい実施形態では、第1のベクターは5'ITR及び3'ITRを更に含み、第2のベクターは5'ITR及び3'ITRを更に含む。
好ましい実施形態では、ITRは、AAV ITR、好ましくはAAV2 ITRである。一部の実施形態では、ITRはAAV8 ITRである。
好ましい実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターはAAV2/8ベクターである。
一部の実施形態では、ITRは同じAAV血清型由来である。一部の実施形態では、ITRは異なるAAV血清型由来である。
好ましい実施形態では、第1のベクターの3'ITR及び第2のベクターの5'ITRは、同じAAV血清型由来である。
好ましい実施形態では、第1のベクターの5'ITR及び第2のベクターの5'ITRは、同じAAV血清型由来である。好ましい実施形態では、第1のベクターの3'ITR及び第2のベクターの3'ITRは、同じAAV血清型由来である。
好ましい実施形態では、第1のベクターの5'ITR及び第2のベクターの5'ITRは、AAV2 5'ITRであり、第1のベクターの3'ITR及び第2のベクターの3'ITRは、AAV2 3'ITRである。
一部の実施形態では、第1のベクターの5'ITR及び第2のベクターの5'ITRは、AAV8 5'ITRであり、第1のベクターの3'ITR及び第2のベクターの3'ITRは、AAV8 3'ITRである。
一部の実施形態では、第1のベクターの5'ITR及び第2のベクターの5'ITRは、異なるAAV血清型由来である。一部の実施形態では、第1のベクターの3'ITR及び第2のベクターの3'ITRは、異なるAAV血清型由来である。一部の実施形態では、第1のベクターの5'ITR及び第2のベクターの5'ITRは、異なるAAV血清型由来であり、第1のベクターの3'ITR及び第2のベクターの3'ITRは、異なるAAV血清型由来である。
一部の実施形態では、第1のベクターの5'ITR及び第2のベクターの3'ITRは、異なるAAV血清型由来である。
一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターはウイルスベクター粒子である。
一部の実施形態では、プロモーターはCBAプロモーター又はその断片である。
一部の実施形態では、第1のベクターはエンハンサー配列を更に含む。好ましい実施形態では、エンハンサーはCMVエンハンサーである。
一部の実施形態では、第2のベクターは、導入遺伝子CDSの3'末端部分の下流にポリアデニル化配列を更に含む。好ましい実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化配列である。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、ミオシン7A(MYO7A)、ABCA4、CEP290、CDH23、EYS、USH2a、GPR98及びALMS1からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、導入遺伝子はミオシン7A(MYO7A)導入遺伝子である。一部の実施形態では、導入遺伝子はABCA4導入遺伝子である。一部の実施形態では、導入遺伝子CDSは野生型配列である。一部の実施形態では、導入遺伝子CDSは、コドン最適化されている(例えば、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている)。
好ましい実施形態では、
(a)第1のベクターは、配列番号14に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、及び/又は
(b)第2のベクターは、配列番号15に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
特に好ましい実施形態では、
(a)第1のベクターは、配列番号14のヌクレオチド配列を含み、及び/又は
(b)第2のベクターは、配列番号15のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、1:1のゲノムコピー比で存在する。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現する方法であって、導入遺伝子が細胞において発現されるように、本明細書中で開示されるような第1のベクター及び第2のベクターで細胞に形質導入又はトランスフェクトすることを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書中で開示されるような第1のベクター及び第2のベクターを含む細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書中で開示されるような第1のベクター及び第2のベクターで形質導入又はトランスフェクトされた細胞を提供する。
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、網膜細胞又は非胚幹細胞である。
別の態様では、本発明はベクターを提供し、ここでベクターは、本明細書中で開示されるような第1のベクターである。
別の態様では、本発明はベクターを提供し、ここでベクターは、本明細書中で開示されるような第2のベクターである。
別の態様では、本発明は、5'から3'方向で、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含むベクターを提供し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含むベクターを提供し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び組換え誘導領域を含むベクターを提供し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
一部の実施形態では、ベクターは5'ITR及び3'ITRを更に含む。好ましい実施形態では、ITRは、AAV ITR、好ましくはAAV2 ITRである。
一部の実施形態では、ITRは同じAAV血清型由来である。一部の実施形態では、ITRは異なるAAV血清型由来である。
別の態様では、本発明は、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子コード配列(CDS)の3'末端部分を含むベクターを提供する。
別の態様では、本発明は、5'から3'方向で、組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子コード配列(CDS)の3'末端部分を含むベクターを提供する。
一部の実施形態では、ベクターは、配列番号14に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
好ましい実施形態では、ベクターは、配列番号14のヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書中で開示されるような第1のベクター及び本明細書中で開示されるような第2のベクターを含むキットを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書中で開示されるような第1のベクター及び本明細書中で開示されるような第2のベクターを含む組成物を提供する。
一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、1:1のゲノムコピー比で存在する。
好ましい実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物である。
別の態様では、本発明は、療法における使用のための本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、網膜変性症の治療における使用のための本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を提供する。好ましくは、網膜変性症は遺伝性網膜変性症である。
別の態様では、本発明は、療法における使用のための本明細書中で開示されるような第1のベクターを提供し、ここで第1のベクターは、本明細書中で開示されるような第2のベクターと組み合わせて、同時に、順次又は別々に投与される。
別の態様では、本発明は、網膜変性症の治療における使用のための本明細書中で開示されるような第1のベクターを提供し、ここで第1のベクターは、本明細書中で開示されるような第2のベクターと組み合わせて、同時に、順次又は別々に投与される。好ましくは、網膜変性症は、遺伝性網膜変性症である。
別の態様では、本発明は、療法における使用のための本明細書中で開示されるような第2のベクターを提供し、ここで第2のベクターは、本明細書中で開示されるような第1のベクターと組み合わせて、同時に、順次又は別々に投与される。
別の態様では、本発明は、網膜変性症の治療における使用のための本明細書中で開示されるような第2のベクターを提供し、ここで第2のベクターは、本明細書中で開示されるような第1のベクターと組み合わせて、同時に、順次又は別々に投与される。好ましくは、網膜変性症は遺伝性網膜変性症である。
一部の実施形態では、使用は、アッシャー症候群、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障(LCA)、スターガルト病、アルストレーム症候群若しくはABCA4関連疾患の治療又は防止におけるものである。
別の態様では、本発明は、アッシャー症候群の治療における使用のための本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、網膜変性症を治療又は防止する方法であって、有効量の本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を、治療又は防止を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、網膜変性症は遺伝性網膜変性症である。
別の態様では、本発明は、アッシャー症候群を治療又は防止する方法であって、有効量の本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を、治療又は防止を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
混入物ベクターの同定。(A)AAV-5'hMYO7A(上の矢印で示される)及び混入物ベクター(下の矢印で示される)に相当するゲノムを示すサザンブロット画像。DNAse:混入物外部DNAの分解のためのDNAseによる処理、プラスミド:AAV8-CBA-キメライントロン-5'hMYO7Aを生成するためのDNA配列を含有するプラスミドDNA、5'AAVゲノム-CI:AAV8-CBAプロモーター-キメライントロン-5'hMYO7Aから抽出されたゲノムDNA、キロベースで表される分子量マーカー、bp=塩基対。CI:キメライントロン。(B)サザンブロットプローブによって認識された配列を示すAAV-5'hMYO7Aゲノムの描写。(C)キメラプロモーターのイントロンと、SDシグナルとの間の対形成メカニズム(点線で示される)。(D)サザンブロットプローブによって認識された配列を示す混入物ベクターゲノムの描写。 図1-1に続き、(E)下記の発現カセットを含むAAV調製物のサザンブロット分析:1.5'CMV ABCA4 AK(二重ハイブリッド)、2.5'CMV ABCA4 TS(二重トランススプライシング)、3.5'CMV NO INTR ABCA4 OV(二重重複)、4.5'CMV NO INTR ABCA4 AK(二重ハイブリッド)、5.5'VMD2 ABCA4 AK(二重ハイブリッド)、6.5'RHO ABCA4 AK(二重ハイブリッド)、7.5'RHO ABCA4 TS(二重トランススプライシング)。キメライントロンは、ベクター1及び2に存在し、ベクター3～7には存在しない。破線の囲みは、予想サイズの完全長ゲノムを示し、実線の囲みは、短い切断型ゲノムを示す。 キメライントロン、SV40イントロン、MVMイントロン及びイントロンなしのEGFP蛍光によるin vitroでの比較。(A)キメライントロン、SV40イントロン、MVMイントロンを有するか、又はイントロンを有さないEGFPをコードするプラスミドの描写。(B)トランスフェクトされたHEK293細胞の代表的な顕微鏡蛍光写真(倍率10倍、スケールバー100μm)。CI:キメライントロン、SV40:サルウイルス40、MVM:マウス微小ウイルス。 キメライントロン、SV40イントロン、MVMイントロン及びイントロンなしのウェスタンブロット分析によるin vitroでの比較。A)二重AAV2-キメライントロン-hMYO7A、二重AAV2-SV40イントロン-hMYO7A、二重AAV2-MVMイントロン-hMYO7A、二重AAV2-イントロンなし-hMYO7A又はベクターなしによる感染の72時間後のHEK293細胞のウェスタンブロット分析。矢印は完全長タンパク質を示し、タンパク質60μgが各レーンに負荷され、各ウェスタンブロットに関して、分子マーカーが左側に報告されている。実験番号は、各試料セットの下に報告されている。陰性対照:二重AAV2-hMYO7Aを受容しなかった細胞、@MYO7A:抗ミオシン7A(MYO7A)抗体を用いたウェスタンブロット、@フィラミン:抗フィラミン抗体を用いたウェスタンブロット、負荷対象として使用される。SV40イントロン:改変されたサルウイルス40イントロン、MVMイントロン:マウス微小ウイルスイントロン。 図3-1に続き、B)HEK293において二重AAV2-キメライントロン-hMYO7A、二重AAV2-SV40イントロン-hMYO7A、二重AAV2-MVMイントロン-hMYO7A又は二重AAV2-イントロンなし-hMYO7Aによる感染時に発現されたhMYO7Aレベルの定量化。hMYO7Aのレベルは、二重AAV2-キメライントロン-hMYO7Aによって発現されたhMYO7Aに対するものである。黒四角はそれぞれ、相当する群における各試料に関して定量化した値を表す。定量化は、抗MYO7A抗体を使用したウェスタンブロット分析によって実施され、ヒトMYO7Aバンド強度の測定は、フィラミンに対して標準化された。平均値は、各群のヒストグラムの内側に報告されている。SV40イントロン:改変されたサルウイルス40イントロン、MVMイントロン:マウス微小ウイルスイントロン。 キメライントロン、SV40イントロン及びMVMイントロンの比較。(A)AAV8-5'hMYO7Aによって保有される発現カセットの描写。上:AAV8-5'hMYO7Aキメライントロン;中:AAV8-5'hMYO7A SV40イントロン;下:AAV8-5'hMYO7A MVMイントロン。(B)AAV8-5'hMYO7Aキメライントロン、AAV8-5'hMYO7A SV40イントロン及びAAV8-5'hMYO7A MVMイントロン由来のウイルスゲノムのサザンブロット。試料は全て、DNAseで処理して、混入物外部DNAを分解した後、ウイルスゲノムDNAが抽出された。5'AAVゲノム-CI:AAV8-CBAプロモーター-キメライントロン-5'hMYO7Aから抽出されたウイルスゲノムDNA、5'AAVゲノム-SV40:AAV8-CBA-プロモーター-SV40イントロン-5'hMYO7Aから抽出されたウイルスゲノムDNA、5'AAVゲノム-MVM:AAV8-CBA-プロモーター-SV40イントロン-5'hMYO7Aから抽出されたウイルスゲノムDNA、キロベースで表される分子量マーカー、bp=塩基対。CI:キメライントロン、SV40:サルウイルス40イントロン、MVM:マウス微小ウイルスイントロン。(C)AAV8-3'hMYO7A-3XFLAGと組み合わせたAAV8-5'hMYO7Aキメライントロン、AAV8-5'hMYO7A SV40イントロン若しくはAAV8-5'hMYO7A MVMイントロン、又は賦形剤の網膜下注射の2週後のC57BL/6の眼杯の代表的なウェスタンブロット分析。矢印は完全長タンパク質を示し、タンパク質150μgが各レーンに負荷された。陰性対照:賦形剤を注射した眼、@フラグ:完全長ミオシン7A-3XFlagを認識するための抗フラグを用いたウェスタンブロット、@ディスフェリン:抗ディスフェリン抗体を用いたウェスタンブロット、負荷対照として使用される。(D)網膜下に注射されたC57BL/6の眼杯においてAAV8-3'hMYO7A-3XFLAGと組み合わせたAAV8-5'hMYO7Aキメライントロン、AAV8-5'hMYO7A SV40イントロン又はAAV8-5'hMYO7A MVMイントロンから発現されたhMYO7Aレベルの定量化。hMYO7A-3XFLAGのレベルは、AAV8-3'hMYO7A-3XFLAGと組み合わせたAAV8-5'hMYO7Aキメライントロンによって発現されるhMYO7A-3XFLAGに対するものである。hMYO7A-3XFLAGに関する陽性の眼の数(n)は、各棒の下に示されている。定量化は、抗フラグ抗体を使用したウェスタンブロット分析によって実施され(パネルC)、hMYO7A-3XFFLAGバンド強度の測定は、ディスフェリンに対して標準化された。平均値は、相当する棒の上に表される。値は、平均値±平均値の標準誤差(s.e.m.)として表される。 シェーカーマウスにおけるアピカルメラノソームの局在化及びhMYO7Aタンパク質再構成の用量依存的改善。(A)陰性対象としての溶媒、又は二重AAV8.hMYO7A(1.37E+10、4.4E+9又は1.37E+9個の総計GC/眼の用量)のいずれかの網膜下注射を受容したsh1-/-及び陽性対照としての溶媒の網膜下注射を受容したsh1+/-を代表するトルイジンブルーを用いて染色した半薄網膜切片。スケールバー(白色バー)は10μmである。黒矢印は、正確に局在化されたメラノソームを指している。(B)二重AAV8.hMYO7Aの網膜下送達の3カ月後のsh1マウスの全網膜切片のRPE絨毛におけるメラノソーム局在化の定量化。アピカルメラノソームの数/RPE100μmが報告されている。データは、各眼に関する単一測定値として(ドット)及び平均値±s.e.mとして(円柱)表される。統計学的解析は、一元配置分散分析、続くTukeyの事後検定を使用して行った。溶媒を受容したsh1-/-に対するp値は、**p<0.01、****p<0.0001である。 図5-1に続き、(C)1.37E+10、4.4E+9又は1.37E+9個の総計GC/眼の用量での二重AAV8.hMYO7Aの網膜下送達の5週後のsh1-/-眼杯の代表的なウェスタンブロット分析。陽性対照及び陰性対照として、sh1+/-及びsh1-/-は、それぞれ、溶媒(二重AAVと同容量)の網膜下注射を受容した。α-MYO7A:抗ミオシン7A抗体を用いたウェスタンブロット、α-ディスフェリン:抗ディスフェリン抗体を用いたウェスタンブロット、負荷対照として使用される。(D)溶媒を注射した同腹子sh1+/-の眼において発現された内因性Myo7aのパーセント(%)としての、二重AAV8ベクターの網膜下注射の5週後のsh1-/-眼杯において発現されたヒトMYO7Aレベルの定量化。定量化は、抗MYO7A抗体を使用してウェスタンブロット分析によって実施され、MYO7A及びMyo7aバンド強度の測定値は、ディスフェリンに対して標準化された。データは、平均値±s.e.mとして表される(平均値は、相当する棒の上に表されている)。
本明細書中で使用する用語「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「構成される(comprised of)」は、「含む(including)」若しくは「含む(includes)」、又は「含有する(containing)」若しくは「含有する(contains)」と同義であり、また包括的又は非限定的(open-ended)であって、追加の、記載されていない成員、エレメント又はステップを除外するものではない。当該用語「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「構成される(comprised of)」には、用語「からなる/から構成される(consisting of)」も含まれる。
ベクター系
一態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分;及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成する。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成する。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成する。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクターの組合せであって、第1のベクター及び第2のベクターを含む組合せを提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクターの組合せであって、第1のベクター及び第2のベクターを含む組合せを提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクターの組合せであって、第1のベクター及び第2のベクターを含む組合せを提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクターの組合せを提供し、ベクター系は第1のベクター及び第2のベクターを含み、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成する。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクターの組合せを提供し、ベクター系は第1のベクター及び第2のベクターを含み、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成する。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクターの組合せを提供し、ベクター系は第1のベクター及び第2のベクターを含み、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成する。
本発明のベクター系又はベクターの組合せは、導入遺伝子が、例えばベクターのサイズの制約に起因して、単一ベクターによってパッケージングされることが不可能である場合に、導入遺伝子を細胞へ送達するのに使用されうる。例えば、AAVベクターは、最大約5kbに制限される導入遺伝子をパッケージングする容量を有しうる。
第1のベクター及び第2のベクターが細胞に導入されると、導入遺伝子CDSは、5'及び3'末端部分から再構成されうる。再構成された導入遺伝子は、細胞において発現されうる。
例えば、完全長導入遺伝子CDSの再構成は、第1及び第2のベクターの両方の、同じ細胞への導入時に、i)2つのベクターゲノムの逆位末端反復(ITR)媒介性のテールトゥヘッドコンカテマー化、その後のスプライシング(二重ベクタートランススプライシング、TS)、ii)2つのベクターゲノムに含有される重複領域間の相同組換え(二重AAV重複、OV)、又はiii)2つの組合せ(二重ベクターハイブリッド)によって達成されうる。
一部の実施形態では、導入遺伝子CDSの部分(例えば、5'及び/又は3'末端部分)は、10kb未満又はそれに等しく、例えば、9.5kb、9kb、8.5kb、8kb、7.5kb、7kb、6.5kb、6kb、5.5kb、5kb若しくは4.5kb未満又はそれに等しい。好ましい実施形態では、導入遺伝子CDSの部分(例えば、5'及び/又は3'末端部分)は、5kb未満又はそれに等しい。
一部の実施形態では、5'末端部分及び3'末端部分は、重複配列を含まない。
一部の実施形態では、導入遺伝子CDSは、天然エキソン-エキソンジャンクションで5'末端部分及び3'末端部分に分割される。
本明細書中で使用する用語「相同組換えが可能でない」は、ベクターが標準的な条件下で調製される場合に(例えば本明細書中の実施例で開示されるように、例えば、AAVベクター粒子の場合、(a)ベクターゲノム、(b)Rep及びCapタンパク質、及び(c)AAV産生に要されるアデノウイルスヘルパー遺伝子(例えば、E2、E4及び/又はVARNA)をコードするプラスミドによるHEK293細胞のトランスフェクション、続く精製)、相同組換えが検出不可能であるか、又は実質的に検出不可能である(例えば本明細書中の実施例で開示されるように、例えば、サザンブロット分析を使用して)ことを意味しうる。イントロンが、スプライスドナー配列との相同組換えが可能でない場合、導入遺伝子CDSの5'末端部分の切り出しは、最小限に抑えられてもよく、又は防止されてもよく、例えば、それにより、第1及び第2のベクターが細胞に導入される場合、5'及び3'末端部分から再構成される導入遺伝子CDSの量を増加させる。
一部の実施形態では、イントロンは、スプライスドナー配列の領域に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%(好ましくは100%)配列同一性を有する少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の連続するヌクレオチドの領域を含まない。イントロンは、スプライスドナー配列と相同性を共有しないため、イントロンは、当該配列と相同組換えが可能でない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、スプライスドナー配列の領域に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%(好ましくは100%)配列同一性を有する少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の連続するヌクレオチドの領域を含まない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、スプライスドナー配列の領域に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%(好ましくは100%)配列同一性を有する少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の連続するヌクレオチドの領域を含まない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、スプライスドナー配列の領域に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%(好ましくは100%)配列同一性を有する少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の連続するヌクレオチドの領域を含まない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクターの組合せであって、第1のベクター及び第2のベクターを含む組合せを提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、スプライスドナー配列の領域に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%(好ましくは100%)配列同一性を有する少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の連続するヌクレオチドの領域を含まない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクターの組合せであって、第1のベクター及び第2のベクターを含む組合せを提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、スプライスドナー配列の領域に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%(好ましくは100%)配列同一性を有する少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の連続するヌクレオチドの領域を含まない。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクターの組合せであって、第1のベクター及び第2のベクターを含む組合せを提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、スプライスドナー配列の領域に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%(好ましくは100%)配列同一性を有する少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の連続するヌクレオチドの領域を含まない。
プロモーター及びエンハンサー
本発明のベクターは、プロモーターを含みうる。適切には、導入遺伝子CDSの5'末端部分は、プロモーターに作動可能に連結されている。用語「作動可能に連結されている」は、本明細書中で使用する場合、部分(例えば、導入遺伝子及びプロモーター)がともに実質的に妨げられていないそれらの機能を実行することが可能な様式で一緒に連結されていることを意味する。
任意の適切なプロモーターが使用されてもよく、その選択は、当業者によって容易に成されうる。プロモーター配列は、構成的に活性であってもよく(即ち、任意の宿主細胞バックグラウンドで作動可能)か、或いは特定宿主細胞環境においてのみ活性であってもよく、したがって特定の細胞型(例えば、組織特異的プロモーター)における導入遺伝子の標的発現が可能である。プロモーターは、別の因子、例えば宿主細胞中に存在する因子の存在に応答して、誘導性発現を示しうる。ベクターが療法のために投与される場合、プロモーターは、標的細胞(例えば、網膜細胞)において機能性であることが好ましい。
一部の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、光受容器間レチノイド結合タンパク質プロモーター、及び卵黄様黄斑変性症2プロモーター、又はそれらの断片からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、プロモーターは、トリβ-アクチン(CBA)プロモーター又はその断片である。
例示的なCBAプロモーターは、
Figure 2024517957000001
Figure 2024517957000002
(配列番号1)
Figure 2024517957000003
(配列番号28)
を含む。
一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号1に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、プロモーターは、配列番号1のプロモーターの天然機能を実質的に保持している。
一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号28に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、プロモーターは、配列番号28のプロモーターの天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、プロモーターは、配列番号1の核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号1の核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなるプロモーターを含む。
例となるロドプシン(Rho)プロモーター配列は、
Figure 2024517957000004
Figure 2024517957000005
(配列番号29)
である。
一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号29に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、プロモーターは、配列番号29のプロモーターの天然機能を実質的に保持している。
例となる卵黄様黄斑変性症2(VMD2)プロモーター配列は、
Figure 2024517957000006
(配列番号30)
である。
一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号30に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、プロモーターは、配列番号30のプロモーターの天然機能を実質的に保持している。
本発明のベクターは、エンハンサーを含みうる。適切には、導入遺伝子CDSの5'末端部分は、エンハンサーに作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、エンハンサーは、プロモーターの上流 (即ち、ベクターの5'末端の方向)にある。
「エンハンサー」はタンパク質(活性化因子)の結合を受けて特定の遺伝子の転写が起こる可能性を増大しうるDNAの領域である。エンハンサーはシス作用性である。エンハンサーは遺伝子から最大1Mbp(1,000,000bp)離れて、開始部位の上流又は下流に位置しうる。
好ましい実施形態では、エンハンサーはCMVエンハンサーである。
例となるCMVエンハンサー配列は、
Figure 2024517957000007
(配列番号2)
である。
一部の実施形態では、エンハンサーは、配列番号2に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、エンハンサーは、配列番号2のエンハンサーの天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、エンハンサーは、配列番号2の核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号2の核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなるエンハンサーを含む。
イントロン
イントロンは、導入遺伝子発現を増加させるためのベクターに含まれうる。任意の適切なイントロンが使用されてもよく、その選択は、当業者によって容易に成されうるが、但し、第1のベクターのイントロンは、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない。
例となるイントロン配列は、
Figure 2024517957000008
(配列番号31、野生型スモールT抗原イントロン)
Figure 2024517957000009
(配列番号32;野生型ラージT抗原イントロン)
Figure 2024517957000010
(配列番号33、SV40イントロン、例えば、上流配列は、ラージT抗原イントロン由来であり、下流配列は、SV40 cds由来である)、
を含む。
一部の実施形態では、イントロンは、配列番号31、32又は33に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、好ましくは、イントロンは、それぞれ、配列番号31、32又は33のイントロンの天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、イントロンは、サルウイルス40(SV40)イントロンである。SV40イントロンは、改変されたSV40イントロンであってもよい(例えば、Nathwaniら(2006)Blood 107:2653-2661を参照)。
一部の実施形態では、イントロンは、マウス微小ウイルス(MVM)イントロンである。
例となるSV40イントロン配列は、
Figure 2024517957000011
(配列番号3、改変されたSV40イントロン)
である。
好ましい実施形態では、イントロンは、配列番号3に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、イントロンは、配列番号3のイントロンの天然機能を実質的に保持している。
一部の実施形態では、イントロンは、配列番号3の核酸配列、又は4、3、2若しくは1個のヌクレオチド置換、付加又は欠失を有するそのバリアントを含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、イントロンは、配列番号3のイントロンの天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、イントロンは、配列番号3の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号3の核酸配列を含むか、或いはそれからなるイントロンを含む。
例となるMVMイントロン配列は、
Figure 2024517957000012
(配列番号4)
である。
一部の実施形態では、イントロンは、配列番号4に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、イントロンは、配列番号4のイントロンの天然機能を実質的に保持している。
一部の実施形態では、イントロンは、配列番号4の核酸配列、又は4、3、2若しくは1個のヌクレオチド置換、付加又は欠失を有するそのバリアントを含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、イントロンは、配列番号4のイントロンの天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、イントロンは、配列番号4の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号4の核酸配列を含むか、或いはそれからなるイントロンを含む。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、配列番号3又は4に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、イントロンは、それぞれ、配列番号3又は4のイントロンの天然機能を実質的に保持している。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、及びスプライスドナー配列を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、配列番号3又は4に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、イントロンは、それぞれ、配列番号3又は4のイントロンの天然機能を実質的に保持している。
別の態様では、本発明は、細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含むベクター系を提供し、ここで、
(a)第1のベクターは、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、
(b)第2のベクターは、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
ここで5'末端部分及び第3'末端部分は一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、ここでイントロンは、配列番号3又は4に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、イントロンは、それぞれ、配列番号3又は4のイントロンの天然機能を実質的に保持している。
スプライスドナー及びアクセプター1
RNAスプライシングは、新たに作製された前駆物質メッセンジャーRNA(プレ-mRN)転写物が、成熟メッセンジャーRNA(mRNA)に形質転換されるRNAプロセシングの形態である。スプライシング中、イントロン(非コード領域)は除去され、エキソン(コード配列)は互いに結合される。
イントロン内で、ドナー部位(イントロンの5'末端)、分岐部位(イントロンの3'末端付近)及びアクセプター部位(イントロンの3'末端)は、スプライシングに必要とされる。スプライスドナー部位は、より大きくあまり高度に保存されない領域内に、イントロンの5'末端にあるほぼ不変の配列GUを含む。イントロンの3'末端にあるスプライスアクセプター部位は、ほぼ不変のAG配列でイントロンを終結させる。AGから上流に(5'側)、ピリミジン(C及びU)が多い領域、又はポリピリミジントラクトが存在する。更に、ポリピリミジントラクトから上流に、分岐点が存在する。
「スプライスドナー配列」は、イントロンの5'末端にあるドナー部位として機能しうるヌクレオチド配列である。ヒトスプライス部位領域のコンセンサス配列及び頻度は、Maら(2015)PLoS One 10(6):p.e0130729に記載されている。
「スプライスアクセプター配列」は、イントロンの3'末端にあるアクセプター部位として機能しうるヌクレオチド配列である。ヒトスプライス部位領域のコンセンサス配列及び頻度は、Maら(2015)PLoS One 10(6):p.e0130729に記載されている。
例となるスプライスドナー配列は、
Figure 2024517957000013
(配列番号5)である。
一部の実施形態では、スプライスドナー配列は、配列番号5に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、スプライスドナー配列は、配列番号5のスプライスドナー配列の天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、スプライスドナー配列は、配列番号5の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号5の核酸配列を含むか、或いはそれからなるスプライスドナー配列を含む。
例となるスプライスアクセプター配列は、
Figure 2024517957000014
(配列番号6)である。
一部の実施形態では、スプライスアクセプター配列は、配列番号6に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、スプライスアクセプター配列は、配列番号6のスプライスアクセプター配列の天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、スプライスアクセプター配列は、配列番号6の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第2のベクターは、配列番号6の核酸配列を含むか、或いはそれからなるスプライスアクセプター配列を含む。
組換え誘導領域
組換え誘導領域は、組換えを増加させるために二重ベクターに付加されうる。好ましくは、第1の組換え誘導領域は、第1のベクターにおけるスプライスドナー配列の下流に位置し、第2の組換え誘導領域は、第2のベクターにおけるスプライスアクセプター配列の上流に位置する。
好ましい実施形態では、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域は同じである。
一部の実施形態では、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域はともに、F1ファージ組換え誘導領域又はそれらの断片である。好ましい実施形態では、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域はともに、AK組換え誘導領域又はそれらの断片である。
例示的な組換え誘導領域配列(AK)は、
Figure 2024517957000015
(配列番号7)
Figure 2024517957000016
(配列番号34)
を含む。
一部の実施形態では、組換え誘導領域(例えば、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域)は、配列番号7に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、組換え誘導領域は、配列番号7の組換え誘導領域の天然機能を実質的に保持している。
一部の実施形態では、組換え誘導領域(例えば、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域)は、配列番号34に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、組換え誘導領域は、配列番号34の組換え誘導領域の天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、組換え誘導領域(例えば、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域)は、配列番号7の核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号7の核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなる組換え誘導領域を含む。
好ましい実施形態では、第2のベクターは、配列番号7の核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなる組換え誘導領域を含む。
一部の実施形態では、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域はともに、アルカリホスファターゼ遺伝子、例えばAP(NM 001632、bp823～1100、配列番号35)、AP1(XM 005246439.2、bp1802～1516、配列番号36)、AP2(XM_005246439.2、bp1225～938、配列番号37)に由来する。
例示的なAP組換え誘導領域配列は、
Figure 2024517957000017
(配列番号35;AP)
Figure 2024517957000018
(配列番号36;AP1)
Figure 2024517957000019
(配列番号37;AP2)
を含む。
一部の実施形態では、組換え誘導領域(例えば、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域)は、配列番号35に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、組換え誘導領域は、配列番号35の組換え誘導領域の天然機能を実質的に保持している。
一部の実施形態では、組換え誘導領域(例えば、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域)は、配列番号36に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、組換え誘導領域は、配列番号36の組換え誘導領域の天然機能を実質的に保持している。
一部の実施形態では、組換え誘導領域(例えば、第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域)は、配列番号37に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列又はその断片を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、組換え誘導領域は、配列番号37の組換え誘導領域の天然機能を実質的に保持している。
ポリアデニル化配列
本発明のベクターはポリアデニル化配列を含みうる。適切には、導入遺伝子はポリアデニル化配列に作動可能に連結されている。ポリアデニル化配列は導入遺伝子発現を改善するために導入遺伝子の下流に挿入されうる。
ポリアデニル化配列は通常、ポリアデニル化シグナル、ポリアデニル化部位及び下流エレメントを含む:ポリアデニル化シグナルはRNA切断複合体によって認識される配列モチーフを含み、ポリアデニル化部位はポリAテールがmRNAに付加されている切断部位であり、下流エレメントは、通常ポリアデニル化部位のすぐ下流に存在するGTリッチな領域であり、それは効率的なプロセシングに重要である。
一部の実施形態では、第2のベクターは、導入遺伝子CDSの3'末端部分の下流にポリアデニル化配列を更に含む。
一部の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化配列又はSV40ポリアデニル化配列である。
好ましい実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化配列である。
例示的なポリアデニル化配列は、
Figure 2024517957000020
(配列番号8)
Figure 2024517957000021
(配列番号38)
を含む。
一部の実施形態では、ポリアデニル化配列は、配列番号8に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、ポリアデニル化配列は、配列番号8のポリアデニル化配列の天然機能を実質的に保持している。
一部の実施形態では、ポリアデニル化配列は、配列番号38に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、ポリアデニル化配列は、配列番号38のポリアデニル化配列の天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、ポリアデニル化配列は、配列番号8の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第2のベクターは、配列番号8の核酸配列を含むか、或いはそれからなるポリアデニル化配列を含む。
ベクター
ベクターは、ある環境から別の環境への実体の移行を可能又は容易にするツールである。本発明によれば、また例として、組換え核酸技法で使用される幾つかのベクターは、実体、例えば核酸のセグメント(例えば、異種DNAセグメント、例えば異種cDNAセグメント)が標的細胞へ移行されるのを可能にする。ベクターは、細胞内に異種核酸(DNA又はRNA)を維持する目的を果たし、核酸のセグメントを含むベクターの複製を促進しうるか、又は核酸のセグメントによってコードされるタンパク質の発現を容易にしうる。ベクターは、非ウイルス性又はウイルス性でありうる。組換え核酸技法で使用されるベクターの例として、プラスミド、mRNA分子(例えば、in vitroで転写されるmRNA)、染色体、人工染色体及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターはまた、例えば、ネイキッド核酸(例えば、DNA)であってもよい。その最も簡素な形態で、ベクター自体は、目的のヌクレオチドでありうる。
ベクターは、トランスフェクション、形質転換及び形質導入などの当該技術分野で既知の様々な技法を使用して、細胞に導入されうる。幾つかのそのような技法は、当該技術分野で既知であり、例えば、組換えウイルスベクター、例えばレトロウイルス、レンチウイルス(例えば、組込み欠陥レンチウイルス)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス及び単純ヘルペスウイルスベクターによる感染、核酸の直接注入及びバイオリスティック形質転換である。
非ウイルス送達システムとして、DNAトランスフェクション法が挙げられるが、これに限定されない。ここで、トランスフェクションは、非ウイルスベクターを使用して、遺伝子を標的細胞に送達するプロセスを含む。典型的なトランスフェクション法として、エレクトロポレーション、DNAバイオリスティクス、脂質媒介性トランスフェクション、コンパクトDNA媒介性トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、カチオン性薬剤媒介性トランスフェクション、カチオン性界面両親媒性物質(cationic facial amphiphile)(CFA)(Nat.Biotechnol.(1996)14:556)及びそれらの組合せが挙げられる。
ウイルスベクター
好ましい実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり、例えば、ウイルス(好ましくはAAV)ベクターゲノムを含む。ウイルスベクターは、ウイルスベクター粒子の形態で存在しうる。
ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター又はアルファウイルスベクターでありうる。
好ましい実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、AAVベクターである。AAVベクターは、AAVベクター粒子の形態で存在しうる。
アデノ随伴ウイルスベクター
AAVベクター又はAAVベクター粒子はAAVゲノム又はその断片若しくは誘導体を含みうる。AAVゲノムはポリヌクレオチド配列であり、これらはAAV粒子の産生に必要とされる機能をコードしうる。これらの機能として、AAV粒子へのAAVゲノムのキャプシド形成を含む、宿主細胞におけるAAVの複製及びパッケージング周期において働く機能が挙げられる。天然に存在するAAVは複製欠陥性であり、また複製及びパッケージング周期の完了に関するトランスでのヘルパー機能の供給に依存している。したがってAAVゲノムは通常、複製欠陥性である。
AAVゲノムはプラス若しくはマイナス鎖のいずれかの一本鎖形態であってもよく、又はその代わりに二本鎖形態であってもよい。二本鎖形態の使用により、標的細胞でのDNA複製ステップの回避が可能となり、そのため導入遺伝子発現を加速することができる。
自然に存在するAAVは、様々な生物学的系に従って分類されうる。AAVゲノムは、AAVの任意の天然由来の血清型、分離株又はクレードに由来しうる。
AAVは、その血清型の観点から言及されうる。血清型はAAVのバリアント亜種に相当し、このバリアント亜種は、キャプシド表面抗原の発現のそのプロファイルのために、それを他のバリアント亜種と区別するのに使用することができる特徴的な反応性を有する。通常、特定のAAV血清型を有するAAVベクター粒子は、任意の他のAAV血清型に特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。AAV血清型には、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV-PhP.B及びAAV-PhP.eBが含まれる。
AAVは、クレード又はクローンの観点からも言及されうる。これは天然由来のAAVの系統関係、及び通常は、共通の祖先まで遡ることができるAAVの系統群を指し、その全ての子孫を含む。更に、AAVは、特定の分離株、即ち自然界に見出される特定のAAVの遺伝的分離株の観点からも言及されうる。用語遺伝的分離株は、他の天然に存在するAAVとの限定的な遺伝的混合を経たAAVの集団を表しており、それにより遺伝子レベルで認識できるほど異なる集団を定義するものである。
通常、AAVの天然由来の血清型、分離株又はクレードのAAVゲノムは、少なくとも1つの逆方向末端反復配列(ITR)を含む。ITR配列はシスで作用して、機能的な複製起点を提供し、且つ細胞のゲノムからのベクターの組込み及び切り出しを可能にする。適切には、1つ以上のITR配列は導入遺伝子又はその部分に隣接している。
AAVゲノムはまた、パッケージング遺伝子、例えばAAV粒子のためのパッケージング機能をコードするrep及び/又はcap遺伝子を含みうる。プロモーターはパッケージング遺伝子の各々に作動可能に連結されうる。そのようなプロモーターの具体例として、p5、p19及びp40プロモーターが挙げられる。例えば、p5及びp19プロモーターは一般にrep遺伝子を発現するのに使用されるのに対し、p40プロモーターは一般にcap遺伝子を発現するのに使用される。rep遺伝子は、タンパク質Rep78、Rep68、Rep52及びRep40又はそのバリアントの1つ以上をコードする。cap遺伝子は、1つ以上のキャプシドタンパク質、例えばVP1、VP2及びVP3又はそのバリアントをコードする。
AAVゲノムは、天然に存在するAAVの完全ゲノムでありうる。例えば、完全AAVゲノムを含むベクターを使用して、AAVベクター又はベクター粒子を調製しうる。
適切には、AAVゲノムは、患者への投与を目的として誘導体化されている。そのような誘導体化は当該技術分野では標準的であり、本発明は、AAVゲノムの任意の既知の誘導体、及び当該技術分野で既知の技法を応用することにより生成されうる誘導体の使用を包含する。AAVゲノムは任意の天然に存在するAAVの誘導体であってもよい。適切には、AAVゲノムは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、又はAAV11の誘導体である。
AAVゲノムの誘導体には、in vivoで本発明のAAVベクターからの導入遺伝子の発現を可能にする、任意の切断型又は改変型のAAVゲノムが含まれる。通常、最小ウイルス配列を含むが上記機能は保持するようにAAVゲノムを大幅に切断することが可能である。これは、ベクターの野生型ウイルスとの組換えのリスクを低減し、標的細胞中のウイルス遺伝子タンパク質の存在による細胞性免疫応答の誘発を回避しうる。
通常、誘導体は少なくとも1つの逆方向末端反復配列(ITR)、場合により2つ以上のITR、例えば2つのITR又はそれ以上を含む。ITRの1つ以上が、異なる血清型を有するAAVゲノムに由来していてもよく、又はキメラ若しくは突然変異ITRであってもよい。適切な突然変異ITRは、trs(末端分離部位(terminal resolution site))の欠失を有するものである。この欠失によりゲノムの連続複製を可能にして、コード配列及び相補配列の両方を含有する一本鎖ゲノム、即ち自己相補的AAVゲノムを生成する。これにより、標的細胞におけるDNA複製の回避が可能となり、そのため導入遺伝子発現を加速させることが可能となる。
AAVゲノムは、AAVの任意の天然由来の血清型、分離株若しくはクレードからの1つ以上のITR配列又はそのバリアントを含みうる。AAVゲノムは、少なくとも1つ、例えば2つの、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、若しくはAAV11のITR、又はそのバリアントを含みうる。
1つ以上のITRは両端で導入遺伝子又はその部分に隣接しうる。1つ以上のITRを含めることは、例えば宿主細胞のDNAポリメラーゼの作用による一本鎖ベクターDNAの二本鎖DNAへの変換後に、宿主細胞の核におけるAAVベクターのコンカテマー形成を補助することができる。そのようなエピソームコンカテマーの形成は、宿主細胞の寿命期間中はAAVベクターを防御し、それによりin vivoでの導入遺伝子の長期発現を可能にする。
適切には、ITRエレメントは、誘導体において自然AAVゲノムから保持された唯一の配列である。適切には、誘導体は、自然ゲノムのrep及び/又はcap遺伝子並びに自然ゲノムの任意の他の配列を含まない可能性がある。これは、宿主細胞ゲノムにベクターが組み込まれる可能性を低減しうる。更に、AAVゲノムのサイズを縮小することで、ベクター内に導入遺伝子又はその部分だけでなく他の配列エレメント(例えば、調節エレメント)を組み入れる際の柔軟性を高めることが可能である。
したがって本発明の誘導体では下記部分、即ち、1つの逆方向末端反復(ITR)配列、複製(rep)及びキャプシド(cap)遺伝子を除去しうる。しかしながら、誘導体は、1つ以上のrep及び/又はcap遺伝子或いはAAVゲノムの他のウイルス配列を更に含みうる。天然に存在するAAVはヒト第19染色体上の特定の部位に高頻度で組み込まれ、無視できる頻度のランダムな組込みを示し、したがってAAVベクターにおける組込み能力の保持が治療環境において許容されうる。
本発明は更に、自然AAVゲノムの配列の順序及び配置とは異なる順序及び配置でのAAVゲノムの配列の提供を包含する。本発明はまた、1つ以上のAAV配列若しくは遺伝子と、別のウイルス由来の配列又は1つよりも多いウイルス由来の配列で構成されるキメラ遺伝子との置き換えも包含する。そのようなキメラ遺伝子は、種々のウイルス種の2つ以上の関連ウイルスタンパク質由来の配列で構成されうる。
AAVベクター粒子は、キャプシドタンパク質によりキャプシド形成されていてもよい。適切には、AAVベクター粒子は、1つの血清型のITRを有するAAVゲノム又は誘導体が異なる血清型のキャプシド中にパッケージングされているトランスキャプシド(transcapsidated)形態であってもよい。AAVベクター粒子はまた、2つ以上の異なる血清型由来の非改変キャプシドタンパク質の混合物がウイルスキャプシドを構成しているモザイク形態も含む。AAVベクター粒子はまた、キャプシド表面に吸着されたリガンドを持つ化学修飾形態も含む。例えば、そのようなリガンドとして、特定の細胞表面受容体を標的とするための抗体を挙げることができる。
誘導体がキャプシドタンパク質、即ちVP1、VP2及び/又はVP3を含む場合、誘導体は、1つ以上の天然に存在するAAVのキメラ、シャッフル又はキャプシド改変誘導体であってもよい。特に、本発明は、同一ベクター内のAAVの異なる血清型、クレード、クローン、又は分離株からのキャプシドタンパク質配列(即ちシュードタイプベクター)の提供を包含する。AAVベクターは、シュードタイプAAVベクター粒子の形態であってもよい。
キメラ、シャッフル又はキャプシド改変誘導体は通常、AAVベクターに1つ以上の所望の機能性を提供するよう選択される。したがってこれらの誘導体は、天然に存在するAAVゲノムを含むAAVベクターと比較して、遺伝子送達の効率の増大及び/又は免疫原性(液性又は細胞性)の減少を示しうる。例えば、遺伝子送達の効率の増大は、細胞表面における受容体又は共受容体結合の改善、内部移行の改善、細胞内及び核内への輸送の改善、ウイルス粒子の脱殻の改善並びに一本鎖ゲノムの二本鎖形態への変換の改善により達成されうる。
キメラキャプシドタンパク質には、天然に存在するAAV血清型の2つ以上のキャプシドコード配列間の組換えにより生成されるものが含まれる。これは例えば、1つの血清型の非感染性キャプシド配列が異なる血清型のキャプシド配列でコトランスフェクトされ、指向性選択(directed selection)を使用して所望の特性を有するキャプシド配列について選択する、マーカーレスキューアプローチにより実施されうる。異なる血清型のキャプシド配列は、新規キメラキャプシドタンパク質を産生させるために、細胞内で相同組換えにより変更することができる。
またキメラキャプシドタンパク質には、特定のキャプシドタンパク質ドメイン、表面ループ又は特定のアミノ酸残基を2つ以上のキャプシドタンパク質間、例えば異なる血清型の2つ以上のキャプシドタンパク質間で移行させるためのキャプシドタンパク質配列の操作によって生成されるものも含まれる。
シャッフル又はキメラキャプシドタンパク質はまた、DNAシャッフリングにより又はエラープローンPCRにより生成されてもよい。ハイブリッドAAVキャプシド遺伝子は、関連のあるAAV遺伝子、例えば複数の異なる血清型のキャプシドタンパク質をコードするAAV遺伝子の配列をランダムに断片化し、その後続いて、配列相同性の領域においてクロスオーバーも引き起こしうる自己プライミングポリメラーゼ反応において断片を再構成させることによって生成することができる。このように幾つかの血清型のキャプシド遺伝子をシャッフルすることによって作成したハイブリッドAAV遺伝子のライブラリーをスクリーニングして、所望の機能性を有するウイルスクローンを同定することができる。同様に、エラープローンPCRを使用してAAVキャプシド遺伝子をランダムに突然変異させ、後に所望の特性について選択されうるバリアントの多様なライブラリーを作成しうる。
キャプシド遺伝子の配列はまた、自然野生型配列に対して特定の欠失、置換又は挿入を導入するよう遺伝子操作されうる。特に、キャプシド遺伝子は、キャプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内の、又はキャプシドコード配列のN末端及び/又はC末端での、非関連タンパク質又はペプチドの配列の挿入によって改変してもよい。非関連タンパク質又はペプチドは有利には、特定の細胞型に対するリガンドとして作用し、それにより標的細胞への改善された結合を付与するか又は特定の細胞集団へのベクターのターゲティングの特異性を改善するものでありうる。非関連タンパク質はまた、産生プロセスの一部としてのウイルス粒子の精製を補助するもの、即ちエピトープ又は親和性タグであってもよい。挿入の部位は通常、ウイルス粒子の他の機能、例えばウイルス粒子の内部移行、輸送を妨害しないように選択される。
キャプシドタンパク質は、人工又は突然変異キャプシドタンパク質であってもよい。本明細書中で使用する用語「人工キャプシド」は、キャプシド粒子が自然界に存在しないか、又は天然に存在するキャプシドアミノ酸配列から操作されている(例えば改変されている)アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含むことを意味する。換言すると、人工キャプシドタンパク質は人工キャプシドアミノ酸配列及び親キャプシドアミノ酸配列をアラインメントした場合に、人工キャプシドアミノ酸配列が由来する親キャプシドの配列と比較して、アミノ酸配列中に突然変異又は変異を含む。
一部の実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、hu68(例えば、国際公開第2018/160582号を参照)、Ancライブラリー(例えば、国際公開第2015/054653号及び国際公開第2017/019994号を参照)及びAAV2-TT(例えば、国際公開第2015/121501号を参照)からなる群から選択される。
例となる5'ITR配列は、
Figure 2024517957000022
(配列番号9)
である。
一部の実施形態では、5'ITRは、配列番号9に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、5'ITRは、配列番号9の5'ITRの天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、5'ITRは、配列番号9の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、配列番号9の核酸配列を含むか、或いはそれからなる5'ITRを含む。
例となる3'ITR配列は、
Figure 2024517957000023
(配列番号10)
である。
一部の実施形態では、3'ITRは、配列番号10に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、3'ITRは、配列番号10の3'ITRの天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、3'ITRは、配列番号10の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクター及び第2のベクターは、配列番号10の核酸配列を含むか、或いはそれからなる3'ITRを含む。
導入遺伝子
一部の実施形態では、導入遺伝子は、ミオシン7A(MYO7A)、ABCA4、CEP290、CDH23、EYS、USH2a、GPR98及びALMS1からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、導入遺伝子は、ミオシン7A(MYO7A)導入遺伝子である。
例となるMYO7Aヌクレオチド配列は、
Figure 2024517957000024
Figure 2024517957000025
Figure 2024517957000026
Figure 2024517957000027
(配列番号11)
である。
例となるMYO7A導入遺伝子の5'末端部分は、
Figure 2024517957000028
Figure 2024517957000029
(配列番号12)
である。
一部の実施形態では、導入遺伝子の5'末端部分は、配列番号12に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、導入遺伝子の5'末端部分は、配列番号12の導入遺伝子の5'末端部分の天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、導入遺伝子の5'末端部分は、配列番号12の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号12の核酸配列を含むか、或いはそれからなる導入遺伝子の5'末端部分を含む。
例となるMYO7A導入遺伝子の3'末端部分は、
Figure 2024517957000030
Figure 2024517957000031
(配列番号13)
である。
一部の実施形態では、導入遺伝子の3'末端部分は、配列番号13に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、導入遺伝子の3'末端部分は、配列番号13の導入遺伝子の3'末端部分の天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、導入遺伝子の3'末端部分は、配列番号13の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号13の核酸配列を含むか、或いはそれからなる導入遺伝子の3'末端部分を含む。
更なる例となるMYO7Aヌクレオチド配列は、
Figure 2024517957000032
Figure 2024517957000033
Figure 2024517957000034
Figure 2024517957000035
(配列番号39;NM_000260.3 ヌクレオチド273-6920)
である。
更なる例となるMYO7A導入遺伝子の5'末端部分は、
Figure 2024517957000036
Figure 2024517957000037
(配列番号40;NM_000260.3 ヌクレオチド273-3380)
である。
一部の実施形態では、導入遺伝子の5'末端部分は、配列番号40に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、導入遺伝子の5'末端部分は、配列番号40の導入遺伝子の5'末端部分の天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、導入遺伝子の5'末端部分は、配列番号40の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号40の核酸配列を含むか、或いはそれからなる導入遺伝子の5'末端部分を含む。
例となるMYO7A導入遺伝子の3'末端部分は、
Figure 2024517957000038
Figure 2024517957000039
(配列番号41;NM_000260.3 ヌクレオチド3381-6920)
である。
一部の実施形態では、導入遺伝子の3'末端部分は、配列番号41に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、導入遺伝子の3'末端部分は、配列番号41の導入遺伝子の3'末端部分の天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、導入遺伝子の3'末端部分は、配列番号41の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号41の核酸配列を含むか、或いはそれからなる導入遺伝子の3'末端部分を含む。
一部の実施形態では、導入遺伝子は、ABCA4導入遺伝子である。
例となるABCA4ヌクレオチド配列は、
Figure 2024517957000040
Figure 2024517957000041
Figure 2024517957000042
Figure 2024517957000043
(配列番号42)
である。
例となるABCA4導入遺伝子の5'末端部分は、
Figure 2024517957000044
Figure 2024517957000045
(配列番号43)
である。
一部の実施形態では、導入遺伝子の5'末端部分は、配列番号43に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、導入遺伝子の5'末端部分は、配列番号43の導入遺伝子の5'末端部分の天然機能を実質的に保持している。
例となるABCA4導入遺伝子の3'末端部分は、
Figure 2024517957000046
Figure 2024517957000047
Figure 2024517957000048
(配列番号44)
である。
一部の実施形態では、導入遺伝子の3'末端部分は、配列番号44に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、導入遺伝子の5'末端部分は、配列番号44の導入遺伝子の5'末端部分の天然機能を実質的に保持している。
本発明において使用されるポリヌクレオチドは、コドン最適化されている。一部の実施形態では、導入遺伝子は、コドン最適化されている。コドン最適化は、国際公開第1999/41397号及び国際公開第2001/79518号においてこれまでに記載されている。異なる細胞は、特定のコドンのそれらの使用が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のtRNAの相対的存在量におけるバイアスに相当する。コドンが、相当するtRNAの相対的存在量と適合するよう調整されるように、配列におけるコドンを変更することによって、発現を増加させることが可能である。同様に、相当するtRNAが特定の細胞型において稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。したがって更なる度合いの転写制御が利用可能である。コドン使用表は、哺乳動物細胞に関して、並びに様々な他の生物に関して当該技術分野で既知である。
例示的なベクター
本発明の第1のベクターの例となる配列は、
Figure 2024517957000049
Figure 2024517957000050
(配列番号14)
である。
一部の実施形態では、第1のベクターは、配列番号14に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、第1のベクターは、配列番号14の第1のベクターの天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号14の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
本発明の第2のベクターの例となる配列は、
Figure 2024517957000052
Figure 2024517957000053
Figure 2024517957000054
(配列番号15)
である。
一部の実施形態では、第2のベクターは、配列番号15に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を含むか、或いはそれからなり、ここで好ましくは、第2のベクターは、配列番号15の第2のベクターの天然機能を実質的に保持している。
好ましい実施形態では、第2のベクターは、配列番号15の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
特に好ましい実施形態では、第1のベクターは、配列番号14の核酸配列を含むか、或いはそれからなり、第2のベクターは、配列番号15の核酸配列を含むか、或いはそれからなる。
組成物
本発明のベクター、ベクター系及び細胞は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とともに対象への投与用に製剤化されうる。適切な担体及び希釈剤は、等張性生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含み、潜在的にヒト血清アルブミンを含有する。
医薬組成物を製剤化するのに使用される材料は無毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨害すべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に応じて当業者によって決定されうる。
医薬組成物は通常、液体形態で存在する。液体医薬組成物として一般的に、液体担体、例えば水、石油、動物油又は植物油、鉱油又は合成油が挙げられる。生理食塩水、塩化マグネシウム、デキストロース若しくは他の糖類溶液、又はグリコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールが含まれてもよい。一部の場合において、プルロニック酸(pluronic acid)(PF68)0.001%などの界面活性剤が使用されてもよい。
注射用に、有効成分は、発熱物質を含まない水溶液の形態で存在してもよく、適切なpH、等張性及び安定性を有する。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル液注射液又は乳酸リンゲル液注射液などの等張性ビヒクルを使用した適切な溶液を調製することが十分可能である。防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤及び/又は他の添加物は、必要に応じて含まれうる。
遅延放出用に、薬剤は、当該技術分野で既知の方法に従って、徐放用に製剤化されている医薬組成物において、例えば、生体適合性ポリマーから形成されるマイクロカプセルにおいて、又はリポソーム担体系において含まれてもよい。
細胞療法製品の取扱いは、細胞療法に関するFACT-JACIE International Standardsを遵守して実施されることが好ましい。
治療方法
1つの態様では、本発明は、療法における使用のための本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、網膜変性症の治療における使用のための本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を提供する。好ましくは、網膜変性症は遺伝性網膜変性症である。
一部の実施形態では、使用は、アッシャー症候群、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障(LCA)、スターガルト病、アルストレーム症候群若しくはABCA4関連疾患の治療又は防止におけるものである。
別の態様では、本発明は、アッシャー症候群の治療における使用のための本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を提供する。
好ましい実施形態では、アッシャー症候群はアッシャー症候群1B型である。
別の態様では、本発明は、網膜変性症を治療又は防止する方法であって、有効量の本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を、治療又は防止を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、網膜変性症は遺伝性網膜変性症である。
別の態様では、本発明は、アッシャー症候群を治療又は防止する方法であって、有効量の本発明のベクター系、ベクター、キット又は組成物を、治療又は防止を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、メラノソームの、網膜色素上皮(RPE)アピカル絨毛への局在化は、増加又は標準化される(例えば、健常な対象のレベルとほぼ同じであるレベルにまで増加される)。増加は、本発明に従って治療されていない眼由来のRPEアピカル絨毛と比較しうる(例えば、疾患を患っているが、他の状況では実質的に同じ条件下の対象由来の眼である)。増加(例えば、100μm当たりの数で)は、例えば少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍又は少なくとも10倍の増加でありうる。増加は、例えば健常な対象に関する数の30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は99%以内にメラノソームの数(例えば、100μm当たりの数で)を増加させうる。メラノソームを分析する方法は、当業者に周知されおり、例えば本明細書中で開示される発明を含む。
世界全体の有病率の1/2,000の遺伝性網膜変性症(IRD)は、世界的規模で盲目の主な原因である。最も頻度が多く且つ重度のIRDの中には、網膜色素変性症(RP)、レーバー先天性黒内障(LCA)及びスターガルト病(STGD)があり、それはほとんどの場合で、一遺伝子条件として遺伝されている。IRDを引き起こす突然変異の大部分が、網膜におけるニューロン光受容器(PR)、桿体及び/又は錐体において発現される遺伝子に見られる。
AAVベクターは、単一網膜下投与時の長期間の処理に関してPR及び網膜色素上皮(RPE)の両方を標的とする際に最も効率的なベクターの中の1つである。本発明は、以下の表において列挙した、単一AAVベクター(それらは、約5kbの最大カーゴ用量を有しうる)で処理することが困難である可能性の高い疾患などの疾患の治療を可能にする。
Figure 2024517957000056
アッシャー症候群1B型(USH1B)は、網膜内のPR及びRPEの両方において発現されるアクチンベースの運動である非通常性MYO7AをコードするMYO7A遺伝子(CDS:6648bp)における突然変異によって引き起こされるRP及び難聴の最も重篤な形態である。
スターガルト病(STGD)は、PR外側セグメントに位置するオールトランス型網膜輸送体をコードするABCA4遺伝子(CDS:6822bp)における突然変異によって引き起こされる遺伝性黄斑変性症の最も一般的な形態である。
錐体桿体ジストロフィ3型、黄色斑眼底、加齢性黄斑変性症2型、早期発症型の重篤な網膜ジストロフィ及び網膜色素変性症19型もまた、ABCA4突然変異と関連付けられる(ABCA4関連疾患)。
治療に対する本明細書中の言及は全て、治癒的、対症療法的及び予防的処置を包含する。哺乳動物、特にヒトの治療が好ましい。ヒト及び獣医学的治療はともに、本発明の範囲内である。
投与
一部の実施形態では、ベクター、ベクター系又は細胞は、対象に局所的に投与される。
一部の実施形態では、ベクター、ベクター系又は細胞は、対象の眼に投与される。投与は、注射、例えば網膜下注射であってもよい。
第1のベクター及び第2のベクターは、同時に、順次又は別々に組み合わせて投与されうる。
本明細書中で使用する用語「組合せ」、又は用語「組み合わせて」、「と組み合わせて使用される」若しくは「組み合わせられた調製物」は、2つ以上の作用物質を同時に、順次又は別々に組み合わせられた投与を指しうる。
本明細書中で使用する用語「同時の」は、作用物質が同時に、即ち同じ時間に投与されることを意味する。
本明細書中で使用する用語「順次」は、作用物質が次々に投与されることを意味する。
本明細書中で使用する用語「別々の」は、作用物質が互いに独立しているが、作用物質が複合効果、好ましくは相乗効果を示すことが可能な時間間隔内で投与されることを意味する。したがって「別々に」投与することは、一方の作用物質が、例えば他方の1分後、5分後又は10分後以内に投与されることを可能にしうる。
投与量
当業者は、本発明の作用物質の、対象へ投与するのに適切な用量を容易に決定することができる。通常、医師は個々の患者に最も適している実際の投与量を決定し、それは、用いられる特定化合物の活性、当該化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与様式及び投与時期、排出速度、薬物併用、特定の状態の重篤性、及び個々が受けている療法などの様々な要因に依存する。当然のことながら、より多い投与量範囲又はより少ない投与量範囲が見合っている個々の状況が存在する可能性があり、それは、本発明の範囲内である。
用量は、例えば、網膜変性症を治療又は防止するのに十分でありうる。用量は、例えばアッシャー症候群、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障(LCA)、スターガルト病、アルストレーム症候群若しくはABCA4関連疾患を治療又は防止するのに十分でありうる。
一部の実施形態では、用量は眼1つにつき1×109～1.5×1010個の総ゲノムコピーである。一部の実施形態では、用量は眼1つにつき4×109～1.5×1010個の総ゲノムコピーである。一部の実施形態では、用量は眼1つにつき1×109～8×109個の総ゲノムコピー、眼1つにつき2×109～7×109個の総ゲノムコピー、眼1つにつき3×109～6×109個の総ゲノムコピー又は眼1つにつき4×109～5×109個の総ゲノムコピーである。一部の実施形態では、用量は眼1つにつき7×109～5×1010個の総ゲノムコピー、眼1つにつき8×109～4×1010個の総ゲノムコピー、眼1つにつき9×109～3×1010個の総ゲノムコピー又は眼1つにつき1×1010～2×1010個の総ゲノムコピーである。
ヒト対象に関して最適化される等価な用量が使用されてもよい。一部の実施形態では、用量は眼1つにつき1×109～2×1012個の総ゲノムコピーである。一部の実施形態では、用量は眼1つにつき1×1010～2×1012個の総ゲノムコピーである。一部の実施形態では、用量は眼1つにつき1×1011～2×1012個の総ゲノムコピーである。
一部の実施形態では、用量は眼1つにつき1×1011～1.5×1012個の総ゲノムコピーである。一部の実施形態では、用量は眼1つにつき4×1011～1.5×1012個の総ゲノムコピーである。一部の実施形態では、用量は眼1つにつき1×1011～8×1011個の総ゲノムコピー、眼1つにつき2×1011～7×1011個の総ゲノムコピー、眼1つにつき3×1011～6×1011個の総ゲノムコピー又は眼1つにつき4×1011～5×1011個の総ゲノムコピーである。一部の実施形態では、用量は眼1つにつき7×1011～5×1012個の総ゲノムコピー、眼1つにつき8×1011～4×1012個の総ゲノムコピー、眼1つにつき9×1011～3×1012個の総ゲノムコピー又は眼1つにつき1×1011～2×1012個の総ゲノムコピーである。
異なる非ヒト対象に関して最適化される等価な用量が使用されてもよい。
対象
本明細書中で使用する用語「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを指す。
非ヒト動物の例として、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類(特に、高等霊長類)、イヌ、齧歯類(例えば、マウス、ラット又はモルモット)、ブタ及びネコが挙げられる。非ヒト動物は、ペットであってもよい。
好ましくは、対象はヒトである。
バリアント、誘導体、類似体、及び断片
本明細書中で言及した特定タンパク質及びポリヌクレオチドに加えて、本発明はそれらのバリアント、誘導体、及び断片もまた包含する。
本発明の文脈において、任意の所与の配列の「バリアント」は、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドがその内因性機能の少なくとも1つを保持するように残基(アミノ酸残基か核酸残基かにかかわらず)の特定配列が改変された配列である。バリアント配列は、天然に存在するポリペプチド若しくはポリヌクレオチド中に存在する少なくとも1つの残基の付加、欠失、置換、改変、置き換え及び/又は変異によって得ることができる。
本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して本明細書中で使用する用語「誘導体」は、その配列からの又はその配列に対する1つ(又はそれ以上)のアミノ酸残基の任意の置換、変異、改変、置き換え、欠失及び/又は付加を含み、結果として生じるタンパク質又はポリペプチドがその内因性機能の少なくとも1つを保持するとしている。
通常、アミノ酸置換、例えば1個、2個又は3個から10個又は20個の置換が行われうるが、但し、改変された配列は所要の活性又は能力を保持する。アミノ酸置換は、天然に存在しない類似体の使用を含んでもよい。
本発明で使用するタンパク質はまた、サイレント変化をもたらし、且つ機能的に等価なタンパク質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有しうる。内因性機能が保持される限りは、意図的なアミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び/又は両親媒性の類似度に基づいて行われうる。例えば、負荷電アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正荷電アミノ酸として、リジン及びアルギニンが挙げられ、類似した親水性値を有する非荷電極性ヘッド基を有するアミノ酸として、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシンが挙げられる。
保存的置換は、例えば下記表に従って行われうる。2列目の同じブロック、及び3列目の同じ行のアミノ酸は、互いに置換されうる:
Figure 2024517957000057
通常、バリアントは野生型アミノ酸配列又は野生型ヌクレオチド配列と或る特定の同一性を有しうる。
この文脈において、バリアント配列は、対象配列に対して少なくとも50%、55%、65%、75%、85%又は90%同一、適切には少なくとも95%、96%又は97%又は98%又は99%同一でありうるアミノ酸配列を含むものとみなされる。バリアントはまた、類似性(即ち、類似した化学的特性/機能を有するアミノ酸残基)の観点から考えることもできるが、本発明の文脈において配列同一性の観点から表現することが好ましい。
この文脈において、バリアント配列は、対象配列に対して少なくとも50%、55%、65%、75%、85%又は90%同一、適切には少なくとも95%、96%又は97%又は98%又は99%同一でありうるヌクレオチド配列を含むものとみなされる。バリアントはまた、類似性の観点から考えることもできるが、本発明の文脈において配列同一性の観点から表現することが好ましい。
適切には、本明細書中に詳述した配列番号のいずれか1つに対してパーセント同一性を有する配列に対する言及は、言及された配列番号の全長にわたってその記載されたパーセント同一性を有する配列を指す。
配列同一性比較は、目測で、又はより通常では、容易に入手可能な配列比較プログラムを活用して実行することができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、2つ以上の配列間のパーセント同一性を算出することができる。
パーセント同一性を連続した配列にわたって算出してもよく、即ち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸又はヌクレオチドを、他方の配列中の相当するアミノ酸又はヌクレオチドと、1回に1残基を直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、そのようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。
これは非常に簡便で且つ一貫した方法であるが、それは例えば、その他の点で同一の配列ペアにおいて、アミノ酸若しくはヌクレオチド配列における1つの挿入又は欠失が、続く残基又はコドンをアラインメントから締め出し、ひいては大域的アラインメントを実施した場合にパーセント同一性の大幅な減少をもたらす可能性がありうることを考慮していない。その結果として、大抵の配列比較方法は、総合的な同一性スコアに過度にペナルティを課すことなく可能性のある挿入及び欠失を考慮した最適なアラインメントを作成するように設計される。これは、局所的同一性を最大化しようと試みる目的で、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸又はヌクレオチドに関して、2つの比較した配列間のより高い関連性を反映するできる限り少ないギャップを含む配列アラインメントが、多数のギャップを含むものより高いスコアを獲得するように、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に比較的高いコストを、且つギャップ中のその後の各残基により小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が通常使用される。これは最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは当然ながら、より少ないギャップを含む最適化されたアラインメントを作成する。大抵のアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更させることが可能である。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合には、デフォルト値を使用することが好ましい。例えばGCG Wisconsin Bestfitパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対しては-12、各伸長に対しては-4である。
したがって最大パーセント同一性の算出はまず、ギャップペナルティを考慮した最適なアラインメントの作成を必要とする。そのようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ(University of Wisconsin,USA;Devereuxら(1984)Nucleic Acids Research 12:387)である。配列比較を実施することができる他のソフトウェアの例として、BLASTパッケージ(Ausubelら(1999)同書のCh.18を参照されたい)、FASTA(Atschulら(1990)J.Mol.Biol.403-410)、EMBOSS Needle(Madeira,F.ら,2019.Nucleic acids research,47(W1),pp.W636-W641)及びGENEWORKSスイートの比較ツールが挙げられるが、これらに限定されない。BLAST及びFASTAはともに、オフライン及びオンライン検索に利用可能である(Ausubelら(1999)同書のpages 7-58～7-60を参照されたい)。しかしながら、一部のアプリケーションに関しては、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。別のツールであるBLAST 2 Sequencesもまた、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較するのに利用可能である(FEMS Microbiol.Lett.(1999)174(2):247-50、FEMS Microbiol.Lett.(1999)177(1):187-8)。
最終的なパーセント同一性を測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、通常全てかなしかの(all-or-nothing)ペア比較に基づくものではない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいて各ペアワイズ比較に対しスコアを割り当てる、スケールを用いる(scaled)類似性スコアマトリックスを一般的に使用する。一般的に使用されるそのようなマトリックスの例は、BLOSUM62マトリックス(BLASTスイートのプログラム用のデフォルトマトリックス)である。GCG Wisconsinプログラムは一般的にパブリックデフォルト値又は提供されていればカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する(更なる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい)。一部のアプリケーションに関しては、GCGパッケージ用のパブリックデフォルト値を、又は他のソフトウェアの場合は、BLOSUM62などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
ソフトウェアにより最適なアラインメントが生成されれば、パーセント配列同一性を算出することが可能である。ソフトウェアは通常、配列比較の一環としてこれを行い、数値結果を生成する。パーセント配列同一性は、言及される配列番号中の総残基に占める割合としての、同一残基の数として算出されうる。
「断片」もバリアントであり、この用語は通常、機能的に又は例えばアッセイにおいて目的のポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって「断片」は、完全長ポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸又は核酸配列を指す。
そのようなバリアント、誘導体、及び断片は、標準的な組換えDNA技術、例えば部位特異的突然変異誘発を使用して調製されうる。挿入物が作製されるうる場合、挿入部位の両側の天然に存在する配列に相当する5'及び3'隣接領域と一緒に挿入物をコードする合成DNAが作製されうる。隣接領域は、天然に存在する配列中の部位に相当する利便性の高い制限部位を含有し、その結果、配列は適当な酵素(複数可)で切断されて、合成DNAは切断部に連結されうる。続いてDNAは、コードされるタンパク質を作製するために本発明に従って発現される。これらの方法はDNA配列の操作のための当該分野で既知の数多くの標準技法の例示に過ぎず、他の既知の技法を使用してもよい。
開示される本発明の範囲を逸脱することなく本明細書中に開示される本発明の特徴全てを組み合わせることができることは当業者に理解されよう。
ここで、本発明の好ましい特徴及び実施形態は非限定的な例の目的で記載される。
本発明の実施は別記しない限り、当業者の力量内にある化学、生化学、分子生物学、微生物学及び免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は文献で説明されている。例えば、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel,F.M.ら(1995 and periodic supplements)Current Protocols in Molecular Biology,Ch.9,13 and 16, John Wiley & Sons、Roe,B.,Crabtree,J.及びKahn,A.(1996)DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques,John Wiley & Sons、Polak,J.M.及びMcGee,J.O'D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,Oxford University Press、Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press、並びにLilley,D.M.及びDahlberg,J.E.(1992)Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Pressを参照されたい。これらの汎用テキストはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
[実施例]
[実施例1]
結果及び論述
二重アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの最適化
ヒトミオシン7A(hMYO7A)の送達用の二重AAV8ベクターの特性決定中に、本発明者らは、導入遺伝子コード配列CDSの5'末端部分を含むベクター(AAV8-5'hMYO7A)の調製物中に混入物ベクターを発見した。
当該ベクターにおいて使用されるトリベータ-アクチン(CBA)プロモーターを認識するプローブを使用して開発されたサザンブロット分析により、予想されるAAV8-5'hMYO7Aに相当するより大きなバンド及び混入物に相当する約1.3Kbのより小さなバンドが示された(図1A、1B)。
より小さなゲノム混入物は、ベクター調製物中に一貫して存在したが、それらを生成するのに使用されたプラスミド中には存在しなかった。したがって本発明者らは、この問題はウイルスゲノムに関連し、また元のプラスミドゲノムが明らかに無傷であったため、より小さな産物の生成は、ベクター粒子の製造時又は製造後に起きると仮定した。
次に、本発明者らは、2つの配列:キメラプロモーターイントロンと、スプライシングドナー(SD)シグナルとの間に82塩基対の相同性領域を同定した(図1C、以下の配列を参照)。
キメライントロン(Bothwellら(1981)Cell 24:625-637):
Figure 2024517957000058
(配列番号16)
スプライシングドナー(SD)配列:
Figure 2024517957000059
(配列番号17)
下線を付した配列は同一である:SD配列は、キメライントロンのヌクレオチド1～82と同一である。
精製したウイルスDNAのサブクローニング及びSangerシーケンシングを使用して、本発明者らは、相同組換え事象が構築物内の相同性の領域の存在に起因して起きることを確認した。このことは、イントロン、5'hMYO7A配列及びSDシグナルの残りの部分の欠失をもたらす一方で、新たな構築物は依然としてAAV逆方向末端反復(ITR)を保持しており、したがってベクター産生を支持している(図1D)。
同様の混入物がイントロン配列及びSD配列を含有する他のベクター(例えば、他の導入遺伝子及びプロモーターを含む)において観察され(図1E)、イントロン配列を除去することによって消失された。
続いて、本発明者らは、キメライントロンをSD配列に対して相同性でない配列で置換した。本発明者らは、トランスフェクションによるHE293細胞におけるEGFP発現に関して比較するために、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)をコードするプラスミドを、キメライントロン、サルウイルス40(SV40)イントロンの改変された様式(Nathwaniら(2006)Blood 107:2653-2661)、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン(Wuら(2008)Mol.Ther.16:280-289)又はイントロンなしのいずれかでクローニングした。蛍光イメージング(図2B)は、SV40イントロン又はMVMイントロンを含有する構築物からのEGFP発現が、キメライントロンを含有するものに類似していることを示している。
SV40及びMVMイントロンをクローニングした後、本発明者らは、hMYO7A CDSの5'末端部分を含む各々のAAV2ベクター(AAV2-SV40イントロン-5'hMYO7A及びAAV2-MVMイントロン-5'hMYO7A)を産生し、AAV2-キメライントロン-5'hMYO7A及びAAV2-イントロンなし-5'hMYO7Aに対してMYO7A発現によるHEK293細胞におけるin vitroでの第2の比較を行った。
ウェスタンブロット分析により、SV40及びMVMイントロンはともに、in vitroでhMYO7Aの同等の発現レベルを誘導することが示されている(図3)。
最終的に、本発明者らは、hMYO7A CDSの5'末端部分を含む各々のAAV8ベクター(AAV8-SV40イントロン-5'hMYO7A及びAAV8-MVMイントロン-5'hMYO7A)を産生した。次に、本発明者らは、精製したウイルスDNAのサザンブロットによるAAV8-キメライントロン-5'hMYO7Aに対する第3の比較を実施し、本発明者らはまた、C57BL/6マウスにAAV8-3'hMYO7A-3XFlagを一緒に網膜下に注射して、ウェスタンブロット分析によってhMYO7A発現レベルを評価した。
本発明者らは、SV40及びMVMイントロンはともに、混入物ベクターの形成を回避して、in vivoで同様のhMYO7A発現レベルを達成することを見出した(図4)。本発明者らは、非臨床及び臨床研究で使用されるべき二重AAV8-5'hMYO7Aの産生のためにAAV8-SV40イントロン-5'hMYO7Aを使用することにした。
材料及び方法
AAVベクタープラスミドの生成
AAVベクター産生に使用されるプラスミドは、AAV血清型2の逆方向末端反復(ITR)を含有していた。二重AAVベクターを生成するのに必要とされる2つのAAVベクタープラスミド(5'及び3')は、幾つかのエレメントを含有していた。5'プラスミドは、ヒトβ-グロブリン遺伝子の第1のイントロン由来の5'-ドナー部位及び分岐及びリーダーと、免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域の本体との間にあるイントロン由来の3'-アクセプター部位で構成されるキメラプロモーターイントロン(Bothwellら(1981)Cell 24:625-637)、サルウイルス40プロモーターのイントロン(SV40)の改変された様式(Nathwaniら(2006)Blood 107:2653-2661)又はマウス微小ウイルスイントロン(Wuら(2008)Mol.Ther.16:280-289)と連結されたトリベータ-アクチンプロモーター(CBA)及びCMVエンハンサー;導入遺伝子コード配列(CDS)のN末端部分;スプライスドナー配列を含有していた。3'プラスミドは、スプライスアクセプター配列及び導入遺伝子CDSのC末端部分、続くBGHポリAを含有していた。幾つかの実験について、C末端にある3XFlag-タグを有するhMYO7Aの3'部分を使用した。
hMYO7A CDSを、天然エキソン-エキソンジャンクションにてエキソン24～25間で分割した(5'半分:NM_000260.3、bp273-3380;3'半分:NM_000260.3、bp3381-6920)。
二重AAVベクタープラスミド中に含有されるスプライスドナー(SD)及びスプライスアクセプター(SA)配列は、下記の通りである:
SD:
Figure 2024517957000060
(配列番号18)
SA:
Figure 2024517957000061
(配列番号19)
ハイブリッドAKベクタープラスミド中に含有される組換え誘導配列は、ファージF1ゲノムに由来していた(Gene Bankアクセッション番号:J02448.1;bp5850-5926)。AK配列は、
Figure 2024517957000062
(配列番号20)
である。
AAVベクター産生及び特性決定
二重AAV-hMYO7AベクターはTIGEM AAVベクターコアによって産生された。ベクターは、HEK293細胞の三重トランスフェクション、続く2回のCsCl2精製によって産生された(Grimmら(1998)Hum.Gene Ther.2760:2745-2760、Liuら(2003)Biotechniques 34:184-189、Salvettiら(1998)Hum.Gene Ther.9:695-706、Zolotukhinら(1999)Gene Ther.6:973-985)。各ウイルス調製について、TaqMan定量的PCRによって、物理的な力価[ゲノムコピー(GC)/ml]を決定した(Applied Biosystems社、カールスバッド、CA、USA)。プライマー及びプローブは、AAV-5'hMYO7aについては5'-hMYO7Aで、及びAAV-3'hMYO7AについてはBGH pAでアニーリングするよう設計された。AAV-5'hMYO7Aに関するアルカリ性サザンブロット分析を下記の通りに実行した:3E+10個のGCのウイルスDNAをAAV粒子から抽出した。パッケージングされていないゲノムを消化するために、ベクター溶液を40mM TRIS-HCl、10mM NaCl、6mM MgCl2、1mM CaCl2、pH7.9を含有する総容量300μL中で、37℃で2時間1U/μLのDNase I(Roche社、ミラノ、イタリア)ともにインキュベートした。次に、DNase Iを50mM EDTAで不活性化した後、プロテイナーゼK及び2.5% N-ラウロイル-サルコシル溶液とともに50℃で45分間インキュベートして、キャプシドを溶解した。DNAをフェノール-クロロホルムで2度抽出して、2倍容量の無水エタノール及び10%酢酸ナトリウム(3M、pH7)で沈殿させた。精製したDNAをアルカリ性アガロースゲルに流して、ジゴキシゲニンの非放射性方法を使用して画像化した(Roche社、ミラノ、イタリア)。1kbのDNAラダー(N3232L;New England Biolabs社、イプスウィッチ、MA、USA)10μLを分子量マーカーとして負荷した。サザンブロットプローブは、KpnI-XhoIを使用した5'AAVプラスミドDNAの酵素的消化によって得られ、544塩基対プローブを抽出及び精製した。
細胞培養及びトランスフェクション
HEK293細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)(Gibco、Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、MA、USA)を補充したDMEM中に維持した。細胞を6ウェルプレート(HEK293 1E+6個の細胞/ウェル)に蒔いて、24時間後にリン酸カルシウム+相当するプラスミド1.5μgを使用してウェルをトランスフェクトした。4時間後、培地を新鮮なあらかじめ加熱した培地2mLと交換した。トランスフェクションの72時間後に、細胞を収集して溶解させた。
マウスにおけるAAVベクターの網膜下注射
この研究は、the Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに従って、また動物手順に関するイタリアの保健省の規制(認可n°301/2020-PR)を用いて実行した。
C57BL/6及びシェーカー-/-マウスをTIGEM動物ハウス(ポッツオリ、イタリア)に収容して、12時間の明/暗サイクル下で維持した(明期中、10～50ルクスの露光)。麻酔下で手術を行い、苦痛を最低限に抑えるよう全力を尽くした。2mL/100g体重のケタミン/メデトミジンの腹腔内注射で成体マウスに麻酔をした。Liangら(Liangら(2000)Vis.Res.Protoc.47:125-139)に記載されるように、等容量のベクター溶液又は賦形剤を、後方経強膜経脈絡膜アプローチを介して網膜下に送達した。
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット(Wb)分析用の細胞及び眼杯(杯+網膜)を、RIPA緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1% NP40、0.5% Na-デオキシコール酸塩、1mM EDTA pH8.0、0.1%SDS)中に溶解して、MYO7Aを抽出した。溶解緩衝液に、0.5%フッ化フェニルメチルスルホニル(PSMF)(Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ、USA)及び1%cOmplete EDTA-フリープロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社、ミラノ、イタリア)を補充した。Pierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo-Scientific社)を使用してタンパク質濃度を決定した。溶解後、β-メルカプトエタノール1:10を補充した4×Laemmli試料緩衝液(Bio-rad社、ミラノ、イタリア)中で99℃にて5分間試料を変性させた。試料を7%アクリルアミドゲル上で分離した。免疫ブロッティングに使用した抗体は、下記の通りであった:完全長hMYO7A-3XFlagを認識するための抗3XFlag(1:1000、モノクローナル、A8592;Sigma社)、抗ディスフェリン(1:500、MONX10795;Tebu-bio社、ル・ペレ=アン=イブリーヌ、フランス)。Wbバンドの定量化はImageJソフトウェアを使用して実施され、hMYO7A発現は、ディスフェリンの発現で標準化された。
ベクター配列
実験において使用したMYO7Aコードベクターの配列を、配列番号14及び15として本明細書中で開示する。
実験で使用した更なるベクターの配列は下記である:
5'CMV-ABCA4-AK
Figure 2024517957000063
Figure 2024517957000064
Figure 2024517957000065
(配列番号21)
5'CMV-ABCA4-TS
Figure 2024517957000067
Figure 2024517957000068
(配列番号22)
5'CMV NO INTRON ABCA4 OV
Figure 2024517957000070
Figure 2024517957000071
Figure 2024517957000072
(配列番号23)
5'CMV NO INTRON ABCA4-AK
Figure 2024517957000074
Figure 2024517957000075
Figure 2024517957000076
(配列番号24)
5'VMD2 ABCA4-AK
Figure 2024517957000078
Figure 2024517957000079
Figure 2024517957000080
(配列番号25)
5'RHOABCA4-AK
Figure 2024517957000082
Figure 2024517957000083
(配列番号26)
5'RHO ABCA4-TS
Figure 2024517957000085
Figure 2024517957000086
Figure 2024517957000087
(配列番号27)
[実施例2]
二重AAV8.hMYO7A応答研究
SV40イントロンを有するAAV8.5'MYO7Aを含む二重AAV8.hMYO7Aの治療有効性を、アッシャー1bのマウスモデルであるシェーカー-/-(sh1-/-)マウスにおいてin vivoで検査した。アッシャー症候群1B型(USH1B)対象において使用されるべき用量を選択するために、本発明者らは、適正製造基準(good manufacturing-like practices)下で産生した二重AAV8.hMYO7A(即ち、toxロット)を使用して用量応答研究を実施した。網膜下に注射したUSH1Bのマウスモデルであるsh1-/-マウスを、網膜欠陥のレスキュー及びタンパク質hMYO7Aレベルについて分析した。本発明者らは、3つの異なる用量を選択した:1,37E+9個(低用量又はLD)、4,4E+9個(中用量又はMD)、及び1,37E+10個(高用量又はHD)の総GC/眼。AAV溶媒のみ(NaCl 35mM及び0.001%Poloxamer 188を補充したリン酸緩衝生理食塩水)を注射した罹患していないヘテロ接合性マウス及び罹患しているマウスを、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。メラノソームが、網膜色素上皮(RPE)アピカル絨毛にほとんど位置していないため、Sh1-/-マウスは網膜の超微細構造的欠陥を示す。注射の3カ月後、本発明者らは、RPEアピカル絨毛へ正確に局在化されたメラノソームの数を測定することによって、用量依存的効果を確認した(図5A～5B)。二重AAV8.hMYO7AのHD及びMDの注射は、溶媒のみを受容したsh1-/-と比較して網膜欠陥を著しくレスキューし、更にHDで処理した罹患していない眼と、罹患している眼との間に統計学的な差は見られなかった(図5B、pANOVA値:製剤化緩衝液を注射した罹患しているsh1-/-対製剤化緩衝液を注射した罹患していないsh1+/-<0,0001、対高用量で処理したsh1-/-<0,0001、対中用量で処理したsh1-/-<0,01又は対低用量で処理したsh1-/-=0,313のいずれか;高用量で処理したsh1-/-対製剤化緩衝液を注射した罹患していないsh1+/-=0,105、対中用量で処理したsh1-/-= 0,113又は対低用量で処理したsh1-/-<0,01のいずれか;中用量で処理したsh1-/-対製剤化緩衝液を注射した罹患していないsh1+/-<0,001又は低用量で処理したsh1-/-=0,442のいずれか;製剤化緩衝液を注射した罹患していないsh1+/-対低用量で処理したsh1-/-<0,0001)。LD処理したSh1-/-の眼はまた、陰性対照と比較して網膜表現型の矯正を示した。統計学的解析に影響を及ぼす、罹患していないsh1+/-群内の変動性が幾らか見られ、したがって本発明者らは、罹患していないsh1+/-を用いずにANOVA解析を繰り返し、LDに関しても同様に統計学的有意性に達した(図5B、pANOVA値:製剤化緩衝液を注射した罹患しているsh1-/-対高用量で処理したsh1-/-<0,0001、対中用量で処理したsh1-/-<0,0001又は対低用量で処理したsh1-/-<0,01;高用量で処理したsh1-/-対中用量で処理したsh1-/-<0,001又は対低用量で処理したsh1-/-<0,0001のいずれか;中用量で処理したsh1-/-対低用量で処理したsh1-/-<0,05)。網膜注射の5週後のsh1-/-マウス由来の溶解した眼杯(RPE+神経網膜)のウェスタンブロット分析は、二重AAV8.hMYO7Aの全ての選択した用量に関して完全長hMYO7Aの発現を示す(図5C～5D)。LDと比較して、HD及びMDを使用してより多数の眼がhMYO7A発現に関して陽性であった(図5D)。ヒト網膜がマウス網膜の100倍である(Panda-Jonasら(1994)Ophthalmology 101:519-523、Remtullaら(1985)Vision Res.25:21-31)ことを考慮すると、本発明者らは、ヒトにおける相当する治療用量が1.37E+11～1.37E+12個の総GC/眼の二重AAV8.hMYO7Aの範囲でありうると推察することができる。
材料及び方法
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット(WB)分析用の眼杯(杯+網膜)を、RIPA緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1%NP40、0.5%Na-デオキシコール酸塩、1mM EDTA pH8.0、0.1% SDS)中に溶解した。溶解緩衝液に0.5%フッ化フェニルメチルスルホニル(PSMF)(Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ)及び1%完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社、ミラノ、イタリア)を補充した。タンパク質濃度は、Pierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo-Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ)を使用して決定した。溶解後、1:10に希釈したβ-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich社)を補充した4×Laemmli試料緩衝液(Bio-rad社、ミラノ、イタリア)中で99℃にて5分間試料を変性させた。4～20%勾配のプレキャストしたTGXゲル(Bio-rad社)上でのMYO7A分析用の試料。下記の抗体を免疫ブロッティングに使用した:hMYO7Aタンパク質のアミノ酸941～1070に相当するペプチド(DMVDKMFGFLGTSGGLPGQEGQAPSGFEDLERGRREMVEEDLDAALPLPDEDEEDLSEYKFAKFAATYFQGTTTHSYTRRPLKQPLLYHDDEGDQLAALAVWITILRFMGDLPEPKYHTAMSDGSEKIPV;下線を付したアミノ酸は、マウスMyo7Aと異なる(1,6%))を認識する特注の抗hMYO7A(1:200、ポリクローナル;Primm Srl社、ミラノ、イタリア)、抗ディスフェリン(1:500、MONX10795;Tebu-bio社、ル・ペレ=アン=イブリーヌ、フランス)。WBバンドの定量化はImageJソフトウェアを使用して実施した。hMYO7A発現はディスフェリンの発現で標準化された。
メラノソーム局在化分析
着色されたsh1マウス(+/-又は-/-)由来の眼を、AAV注射の3カ月後に眼球除去して、角膜の側頭部側で焼灼した。0.1M PBS中の2%グルタルアルデヒド-2%パラホルムアルデヒドを使用して、一晩固定を行い、0.1M PBS中ですすぎ、光学顕微鏡下で精査した。眼杯の側頭側部分をAraldite 502/EMbed 812(Araldite 502/EMbed 812 KIT、カタログ#13940;Electron Microscopy Sciences社、ハットフィールド、PA、USA)に包埋した。半薄(0.5μm)切片を、Leica Ultramicrotome RM2235(Leica Microsystems社、バノックバーン、IL、USA)上で横断面に切断し、スライドガラス上に載せて、トルイジンブルー及びボレース(borace)染色で染色した。100倍の倍率でZeiss Apotome(Carl Zeiss社、オーバーコッヘン、ドイツ)を使用して、重複野の獲得を通じて得られた網膜切片全体のモンタージュにおいて覆面オペレーターによってメラノソームが計数され、続いて、網膜切片全体をPhotoshopソフトウェア(Adobe社、サンノゼ、カリフォルニア)で再構成した。メラノソーム計数及び網膜色素上皮(RPE)測定を、ImageJソフトウェアを使用して実施した。メラノソーム数は、100μmで除算したRPEの長さで標準化した。
統計学的解析
一元配置分散分析(ANOVA)、続くTukeyの事後検定を使用して、図5における群間の多重ペアワイズ比較を実施した。図5:網膜色素上皮に正確に局在化されたメラノソームに対する用量依存的効果:ANOVA p-値は下記である。製剤化緩衝液を注射した罹患しているsh1-/-対製剤化緩衝液を注射した罹患していないsh1+/-(pANOVA<0,0001)、対高用量で処理したsh1-/-(pANOVA<0,0001)、対中用量で処理したsh1-/-(pANOVA<0,01)又は対低用量で処理したsh1-/-(pANOVA=0,313)のいずれか;高用量で処理したsh1-/-対製剤化緩衝液を注射した罹患していないsh1+/-(pANOVA=0,105)、対中用量で処理したsh1-/-(pANOVA=0,113)又は対低用量で処理したsh1-/-(pANOVA<0,01)のいずれか;中用量で処理したsh1-/-対製剤化緩衝液を注射した罹患していないsh1+/-(pANOVA<0,001)又は対低用量で処理したsh1-/-(pANOVA 0,442)のいずれか;製剤化緩衝液を注射した罹患していないsh1+/-対低用量で処理したsh1-/-(pANOVA<0,0001)。ANOVA解析に影響を与える製剤化緩衝液を注射したsh1+/-の変動性に起因して、罹患していない対照を用いずに、再度比較を解析して、ANOVA p-値は下記である:製剤化緩衝液を注射した罹患しているsh1-/-対高用量で処理したsh1-/-(pANOVA<0,0001)、対中用量で処理したsh1-/-(pANOVA<0,0001)又は対低用量で処理したsh1-/-(pANOVA<0,01);高用量で処理したsh1-/-対中用量で処理した(pANOVA<0,001)又は対低用量で処理したsh1-/-(pANOVA<0,0001)のいずれか;中用量で処理したsh1-/-対低用量で処理したsh1-/- (pANOVA<0,05)。データは、独立したin vitro実験又は眼の数(同じ試料の反復測定ではない)を使用して算出された平均値[±平均値の標準誤差(s.e.m.)]として提示される。統計学的p値≦0.05は、有意であるとみなされた。
上記明細書中で言及した刊行物は全て、参照により本明細書中に組み込まれるものとする。開示した本発明のベクター、系、方法又は使用の様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び主旨を逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態と関連付けて開示してきたが、特許請求の範囲に記載されている本発明をそのような特定の実施形態に過度に限定すべきではないことが理解されるべきである。実際には、本発明を実施するための開示された様式の様々な修正は、当業者には明白であり、併記の特許請求の範囲内にあるものと意図される。

Claims (17)

  1. 細胞において導入遺伝子を発現するためのベクター系であって、第1のベクター及び第2のベクターを含み、
    (a)第1のベクターが、5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び第1の組換え誘導領域を含み、
    (b)第2のベクターが、5'から3'方向で、第2の組換え誘導領域、スプライスアクセプター配列、及び導入遺伝子CDSの3'末端部分を含み、
    5'末端部分及び第3'末端部分が一緒に、導入遺伝子CDSを構成し、イントロンが、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない、ベクター系。
  2. イントロンが、スプライスドナー配列の領域に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%(好ましくは100%)配列同一性を有する少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の連続するヌクレオチドの領域を含まない、請求項1に記載のベクター系。
  3. イントロンが、
    (a)サルウイルス40(SV40)イントロン又はマウス微小ウイルス(MVM)イントロンであり、及び/又は
    (b)配列番号3又は4に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1又は2に記載のベクター系。
  4. スプライスドナー配列が、配列番号5に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のベクター系。
  5. 第1の組換え誘導領域及び第2の組換え誘導領域が、
    (a)ともにF1ファージ組換え誘導領域又はそれらの断片であり、及び/又は
    (b)ともに配列番号7に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列又はその断片を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のベクター系。
  6. 第1のベクター及び第2のベクターがウイルスベクターである、請求項1から5のいずれか一項に記載のベクター系。
  7. 第1のベクター及び第2のベクターがAAVベクターであり、任意選択で第1のベクターが5'ITR及び3'ITRを更に含み、第2のベクターが5'ITR及び3'ITRを更に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のベクター系。
  8. プロモーターがCBAプロモーター又はその断片である、請求項1から7のいずれか一項に記載のベクター系。
  9. 第2のベクターが導入遺伝子CDSの3'末端部分の下流にポリアデニル化配列を更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のベクター系。
  10. 導入遺伝子がミオシン7A(MYO7A)導入遺伝子である、請求項1から9のいずれか一項に記載のベクター系。
  11. (a)第1のベクターが、配列番号14に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、及び/又は
    (b)第2のベクターが、配列番号15に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のベクター系。
  12. 細胞において導入遺伝子を発現する方法であって、導入遺伝子が細胞において発現されるように、請求項1から11のいずれか一項において規定される第1のベクター及び第2のベクターで細胞に形質導入又はトランスフェクトすることを含む方法。
  13. 5'から3'方向で、プロモーター、イントロン、導入遺伝子コード配列(CDS)の5'末端部分、スプライスドナー配列、及び組換え誘導領域を含むベクターであって、イントロンが、導入遺伝子CDSの5'末端部分を切り出すためのスプライスドナー配列との相同組換えが可能でない、ベクター。
  14. 配列番号14に対して少なくとも95%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載のベクター。
  15. 療法における使用のための請求項1から11のいずれか一項に記載のベクター系。
  16. アッシャー症候群、任意選択でアッシャー症候群1B型の治療における使用のための請求項1から11のいずれか一項に記載のベクター系。
  17. アッシャー症候群を治療又は防止する方法であって、有効量の請求項1から11のいずれか一項に記載のベクター系を、治療又は防止を必要とする対象に投与することを含み、任選択でアッシャー症候群がアッシャー症候群1B型である、方法。
JP2023570159A 2021-05-12 2022-05-12 ベクター系 Pending JP2024517957A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21173687 2021-05-12
EP21173687.1 2021-05-12
PCT/EP2022/062989 WO2022238556A1 (en) 2021-05-12 2022-05-12 Vector system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024517957A true JP2024517957A (ja) 2024-04-23

Family

ID=75919220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023570159A Pending JP2024517957A (ja) 2021-05-12 2022-05-12 ベクター系

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220389450A1 (ja)
EP (1) EP4337779A1 (ja)
JP (1) JP2024517957A (ja)
KR (1) KR20240005950A (ja)
CN (1) CN117377771A (ja)
AU (1) AU2022274162A1 (ja)
BR (1) BR112023023599A2 (ja)
CA (1) CA3218631A1 (ja)
IL (1) IL308356A (ja)
WO (1) WO2022238556A1 (ja)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
GB0009760D0 (en) 2000-04-19 2000-06-07 Oxford Biomedica Ltd Method
ES2704677T3 (es) * 2013-04-18 2019-03-19 Fond Telethon Suministro eficaz de genes grandes por vectores de AAV duales
HUE052676T2 (hu) 2013-10-11 2021-05-28 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Eljárások õsi vírusszekvenciák elõrejelzésére és alkalmazásaik
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
EP3270944B1 (en) * 2015-03-17 2019-10-23 Vrije Universiteit Brussel Optimized liver-specific expression systems for fviii and fix
EP3872085B1 (en) 2015-07-30 2023-03-01 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Ancestral aav sequences and uses thereof
RS65241B1 (sr) 2017-02-28 2024-03-29 Univ Pennsylvania Vektor adeno-asociranih virusa (aav) iz podgrupe f i njegove upotrebe

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240005950A (ko) 2024-01-12
AU2022274162A1 (en) 2023-11-30
CN117377771A (zh) 2024-01-09
CA3218631A1 (en) 2022-11-17
US20220389450A1 (en) 2022-12-08
WO2022238556A1 (en) 2022-11-17
BR112023023599A2 (pt) 2024-03-12
EP4337779A1 (en) 2024-03-20
IL308356A (en) 2024-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210154325A1 (en) Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of achromatopsia and other diseases
EP2986635B1 (en) Effective delivery of large genes by dual aav vectors
JP7182873B2 (ja) 多重ベクターシステム及びその使用
JP2020054345A (ja) コロイデレミアの遺伝子治療に使用するためのａａｖベクター
US20190002913A1 (en) Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of achromatopsia and other diseases
KR20180012772A (ko) 파브리 병 유전자 치료
JP2019523648A (ja) Ａｂｃ４ａを発現させるためのデュアル重複アデノ随伴ウイルスベクターシステム
JP2019505183A (ja) クリグラー・ナジャー症候群の処置のための組成物
WO2021113634A1 (en) Transgene cassettes designed to express a human mecp2 gene
JP7285022B2 (ja) 組換えヒトＩＩ型ミトコンドリアダイニン様ＧＴＰａｓｅの遺伝子配列及びその使用
JP2023539368A (ja) コドン最適化したｒｐｇｒｏｒｆ１５遺伝子およびその使用
CN111601620A (zh) 用于21-羟化酶缺乏症的腺相关病毒基因疗法
AU2021234169A1 (en) Gene therapy
WO2020211843A1 (en) A new type of enzyme composition
JP2024517957A (ja) ベクター系
WO2024017387A1 (en) Novel aav capsids for targeting nervous system and uses thereof
WO2023184107A1 (en) Crispr-cas13 system for treating mecp2-associated diseases
WO2024069144A1 (en) Rna editing vector
WO2024079292A1 (en) Gene therapy treatment
CN115666658A (zh) 具有提高的治疗ush1b的安全性的双aav-myo7a载体
WO2024100145A1 (en) Polynucleotide and vector
JP2022514271A (ja) 糖原病を処置するための方法および組成物
NZ753155B2 (en) Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of achromatopsia and other diseases