JP7285022B2 - 組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの遺伝子配列及びその使用 - Google Patents
組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの遺伝子配列及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7285022B2 JP7285022B2 JP2021509904A JP2021509904A JP7285022B2 JP 7285022 B2 JP7285022 B2 JP 7285022B2 JP 2021509904 A JP2021509904 A JP 2021509904A JP 2021509904 A JP2021509904 A JP 2021509904A JP 7285022 B2 JP7285022 B2 JP 7285022B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- vector
- recombinant nucleic
- sequence
- gtpase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
- C12Y306/03005—Zn2+-exporting ATPase (3.6.3.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/05—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on GTP; involved in cellular and subcellular movement (3.6.5)
- C12Y306/05005—Dynamin GTPase (3.6.5.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
Description
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列と、
(b)配列番号1に示されるヌクレオチド配列との同一性が≧95%、好ましくは≧98%、より好ましくは≧99%であるヌクレオチド配列と、
からなる群から選択される。
位置1~288は、MISをコードする配列であり、
位置289~2772は、GTPaseドメイン、中央ダイニンドメイン、及びGTPaseエフェクタードメインをコードする配列であり、
位置2773~2775は、終止コドンである。
Z1-Z2-Z3 (I)
の構造を有し、
式中、
それぞれの「-」は、独立して、結合またはヌクレオチドリンカー配列であり、
Z1は、存在しないか、または5’-UTR配列であり、
Z2は、本発明の第1の態様に記載のヌクレオチド配列であり、
Z3は、3’-UTR配列である。
(a)非ヒト哺乳類細胞を提供し、細胞中のOPA1遺伝子に点変異を導入し、それによってOPA1遺伝子の点変異を有する細胞を得るステップ、
(b)ステップ(a)において得られたOPA1遺伝子の点変異を有する細胞を使用することによってOPA1遺伝子の点変異を有する動物モデルを調製するステップ。
(b1)OPA1遺伝子のキメラ点変異を獲得している動物モデルを調製した後、交雑を介してOPA1遺伝子のホモ接合型点変異またはヘテロ接合型点変異を有する動物モデルを得るステップ
を含む。
(1)CRISPR-CAS9技術を使用することによってOPA1の位置285のQ(グルタミン)を変異させて終止(即ち、Q285終止)点変異を有する組換えプラスミドを構築し、相同組換えを介する変異導入に対する選択可能マーカーを有するDNA配列で置き換えてOPA1のQ285終止点変異陽性のモノクローナル胚性幹細胞を得ること、
(2)ステップ(1)において得られたOPA1点変異を有するマウス胚性幹細胞クローンを使用することによってキメラマウスを調製し、得ること、
(3)ステップ(2)において得られたキメラマウスを正常な野生型マウスと交配させ、繁殖させ、OPA1点変異を獲得したヘテロ接合型マウス、即ちOPA1のQ285終結点変異を有するマウスモデルを子孫からスクリーニングすること、
を含む。
によって示される。上段横列は最適化オープンリーディングフレームヌクレオチド配列であり、下段横列はヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの原型遺伝子配列(非最適化野生型コード配列)である。
本開示の理解を容易にするために、ある特定の用語が最初に定義される。本出願で使用される下記の用語はそれぞれ、本明細書にその他の明確な記載がない限り、以下に与えられる意味を有するものとする。他の定義は、本出願を通じて記載される。
本明細書で使用される「(組換え)ヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPase」、「視神経萎縮タンパク質1」、「OPA1(タンパク質)」、「hOPA1(タンパク質)」、「ポリペプチド」、「本発明のポリペプチド」、及び「本発明のタンパク質」という用語は、同じ意味を有し、本明細書で互換的に使用され得る。OPA1は、ミトコンドリア内膜に位置するGTPase活性を有する膜貫通タンパク質であり、このタンパク質は、ミトコンドリア移入配列(MIS)を有するN末端膜貫通領域と、膜貫通領域(TR)及び疎水性領域(HR)と、GTPaseドメインと、中央ダイニンドメインと、GTPaseエフェクタードメイン(GED)を有するC末端と、を含む。OPA1のMISポリペプチドを機能は、GTPタンパク質をミトコンドリアに導くことである。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、アデノ随伴ウイルスとしても知られ、Parvoviridae科のDependovirus属に属する。AAVは、これまでに発見された中で最も単純な型の一本鎖DNA不完全ウイルスであり、その複製にはヘルパーウイルス(通常はアデノウイルス)が関与する必要がある。AAVは、両末端に位置する逆位反復配列(ITR)中にcap遺伝子及びrep遺伝子をコードする。ITRは、ウイルスの複製及びパッケージングにおいて決定的な役割を果たす。cap遺伝子は、ウイルスカプシドタンパク質をコードし、rep遺伝子は、ウイルス複製及び組み込みに関与する。AAVは、さまざまな細胞に感染し得る。
本発明が解決すべき技術的課題は、先行技術では組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの発現量が低く、治療効果が不十分であるという技術的欠点を克服することである。本発明の目的は、組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの最適化遺伝子配列を提供することである。組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの遺伝子は、配列番号1に示されるサイズが2,775bpの最適化CDSヌクレオチド配列(コドンATGから始まり、924アミノ酸をコードする)を有し、当該配列中、1~288bpは、OPA1-MISのコード配列(GTPタンパク質がミトコンドリアに入ってその生理学的機能を発揮するように導く働きをするアミノ酸数96のペプチド鎖をコードする)であり、289~2,772bpは、GTP機能性タンパク質として働くアミノ酸数828のペプチド鎖をコードし、最後の3bpは、終止コドンである。本発明の最適化OPA1遺伝子配列(配列番号1)は、OPA1タンパク質の発現効率を高め、患者の視神経節細胞において生理学的役割を担うOPA1タンパク質の存在量が増えることが研究によって明らかとなっている。
本発明では、哺乳類細胞での発現に特に適した組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの最適化コード配列が提供され、このコード配列は、配列番号1に示される。
本発明は、本発明の第1の態様に記載のヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseをコードする核酸配列を含む融合核酸も提供する。
Z1-Z2-Z3(I)
の構造を有し、
式中、
それぞれの「-」は、独立して、結合またはヌクレオチドリンカー配列であり、
Z1は、5’-UTR配列であり、
Z2は、本発明の第1の態様に記載のヌクレオチド配列であり、
Z3は、3’-UTR配列である。
本発明は、OPA1タンパク質のための発現ベクターも提供し、この発現ベクターは、本発明の最適化されたOPA1コード配列を含む。
本発明は、(a)本発明の第3の態様によるベクターと、(b)医薬的に許容可能な担体または医薬品添加物と、を含む調製物または組成物を提供する。
1.本発明の組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPase(OPA1)の遺伝子コード配列は、OPA1中のMISコード配列及びGTPaseドメインコード配列の最適化を含めて、特別に最適化されている。OPA1の非最適化DNAコード配列と比較して、発現量は顕著に増加し、ミトコンドリアにトランスフェクションされるOPA1タンパク質は増加する。最適化配列では、OPA1タンパク質の発現量が顕著に増加し、OPA1タンパク質が高い生物学的活性を有することが確保される。
2.本発明の最適化OPA1コード遺伝子(配列番号1)または融合核酸は、良好な安全性を伴って常染色体優性視神経萎縮(ADOA)を効果的に治療し得る。
3.本発明は、II型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの遺伝子の不活性化に基づくADOAの非ヒト哺乳類モデルを提供し、このモデルは、網膜ATP含量の低下及びミトコンドリアのアポトーシス性変化を含めて、常染色体優性視神経萎縮(ADOA)と同様の病理学的徴候を示し、常染色体優性視神経萎縮(ADOA)についての実験的研究、評価、または薬物スクリーニングに使用できるものである。
4.本発明によって提供されるrAAV2-hOPA1組換えアデノ随伴ウイルスは、ADOA(常染色体優性視神経萎縮)の点変異のモデルマウスの病状に対して顕著かつ効果的な改善作用を有し、改善作用を継続的に与えることができ、単回投与から3ヶ月で、モデルマウスにおける当該疾患の影響を完全かつ効果的に好転させることができるものである。
組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの特別に最適化された遺伝子(配列番号:1)に対して2つの制限酵素消化部位(KpnI及びSalI)を追加した。あるいは、この新規の遺伝子に沿ってプライマーを設計して当該遺伝子をPCRによって増幅することで産物を得た。この産物及びpSNaVプラスミドベクターを、KpnI及びSalIでの二重消化にそれぞれ供し、消化産物を回収し、T4 DNAリガーゼを用いて一晩ライゲーションした。ライゲーション産物でコンピテント細胞の形質転換を行うことで、組換えpSNaV/rAAV2/2-hOPA1アイソフォーム2を得た(図2)。
37℃での培養後、青色プラーク及び白色のプラークがLBプレート上に現れ、白色のプラークを組換えクローンとした。白色のコロニーをピッキングして取り出し、100mg/Lのアンピシリンを含むLB液体培地に添加し、37℃、200rpmで8時間培養した。培養した細菌懸濁物からプラスミドを抽出し、プラスミド抽出ステップでは、Biomigaの説明を参照した。プラスミド1μLをテンプレートとし、以下の特別なプライマーを使用した:
1F:5’-ATGTGGCGACTACGTCG-3’(配列番号4);
1R:5’-TTATTTCTCCTGATGAAGAG-3’(配列番号5);
同定した細菌懸濁物1mLを滅菌グリセロールと1:3の比でピペッテイングして混合し、-80℃で保存した。細菌懸濁物をシークエンシングに供し、シークエンシングによって得られた配列を、組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの遺伝子とアライメントし、正しい配列を有する組換えアデノ随伴ウイルスプラスミドpSNaV/rAAV2/2-hOPA1を得ることに成功した(図4)。
(a)各トランスフェクションフラスコからプラスミドpAdHelper、プラスミドpAAV-r2c5、及びプラスミドpSNaV-hOPA1を取り出し、必要な比となるように1.5mLの滅菌Epチューブ中でDMEM+PlasmidTransII(VGTC)(トランスフェクション試薬)と混合し、試薬Aと命名した。次に、この試薬Aをそのまま室温で10~15分間保持した。
(b)試薬Aを30mLのDMEM+10%ウシ血清と混合し、試薬Bと命名した。
(c)試薬Bを細胞培養フラスコに均等に添加し、5%CO2を含むインキュベーター中、37℃で培養を継続した。
(d)トランスフェクションから16時間後に完全培地(DMEM+10%ウシ血清)を添加して培地交換を行った。
クロロホルム処理-PEG/NaCl沈殿-クロロホルム抽出という3つのステップを使用してrAAV2/2-hOPA1ウイルスの分離、濃縮、及び精製を行った。総回収率=最終産物中のウイルス粒子数/出発材料中のウイルス粒子数。
SDS-PAGE用の分離ゲル及び濃縮ゲルをロードし、その際、分離ゲルの濃度は10%とした。試料15μgを各試料ウェルにそれぞれ添加した。電気泳動後、クマシーブリリアントブルーでゲルを染色し、対応する脱染溶液を用いて、バックグラウンドが下がって明瞭なバンドが出現するまでゲルを脱染した(図5)。
24匹のウサギを3群に分け、これら3群には、実験群A、実験群B、及び対照群を含めた。rAAV2/2-最適化hOPA1アイソフォーム2、rAAV2/2-原型hOPA1アイソフォーム2、及びrAAV-ZsGreenを、それぞれ50μl(1×1012vg/mL)用意し、角膜縁から3mm離れた毛様体の平坦部を刺すことによって硝子体腔に注射した。
2つのウサギ群に対して、それぞれ細隙灯検査及び眼圧検査を、手術から1日目、3日目、7日目、及び30日目に行った。手術から1ヶ月後の眼底写真に示されるように、すべてのウサギについて、明らかな異常、結膜の充血及び分泌物、眼内炎、ならびに眼圧の上昇は認められなかった。
硝子体腔注射から30日後、ZsGreen群(対照群)の網膜の蛍光写真から、網膜上での良好なGFP発現が示され、このことは、GFPをトランスフェクションしてウサギの眼の硝子体に送り込むためのベクターとしてrAAVが機能したことを示しており、これによって、rAAV2/2-hOPA1アイソフォーム2組換え遺伝子が網膜上に発現し得ることが実証された。
硝子体腔注射から30日後、実験群A及び実験群Bならびに対照群の眼球を剥がし、パラフィン切片とした。これらのパラフィン切片を65℃の乾燥器中に入れて2時間乾燥させ、脱パラフィン処理に供してから水に浸し、PBSで3回(各5分間)すすいだ。切片をEDTA緩衝液に浸してマイクロ波による修復に供した後、中程度の熱で煮沸し、その後に静置して10分間の間隔を空けてから、沸騰に至るまで切片に低度の熱を加え、その後に電源を切った。自然冷却後、切片をPBSで3回洗浄(各5分間)した。切片を3%の過酸化水素溶液に浸し、室温で10分間インキュベートした。切片をPBSで3回洗浄(各5分間)し、スピン乾燥後に5%のBSAで20分間ブロッキングした。BSA溶液を除去した後、希釈した一次抗体を各切片に50μl添加して組織を覆い、4℃で一晩静置した。次に、切片をPBSで3回洗浄(各5分間)した。PBS溶液を除去し、対応する種の蛍光二次抗体を各切片に50μl~100μl添加し、遮光しながら切片を室温で50分~1時間インキュベートした。遮光しながら切片をPBSで3回洗浄(各5分間)した。PBS溶液を除去した。DAPIを各切片に50~100μl添加して、遮光しながら核を5分間染色した。切片をPBSで3回洗浄(各5分間)した。切片がわずかに乾燥した後、抗蛍光消光マウント媒体を切片にマウントし、写真撮影の準備が整うまで遮光しながら4℃で保管した。
実験群A及び実験群Bの網膜神経線維束の厚さは、それぞれ67.55μm及び66.00μmであり、有意差を伴わないことが結果から示された(P>0.05、図8)。
実験群及び対照群における網膜神経節細胞の数は実質的に同じであり、構造は完全なものであることがHEの結果から示され、このことは、rAAV-hOPA1組換え遺伝子が安全であり、網膜に損傷を与えなかったことを示している(図9)。
最初に、NCBIの保存ドメイン解析ソフトウェアを使用してhOPA1の保存構造を解析することで、設計プライマーを用いて増幅される断片が確実に非保存領域に位置するものとなるようにした。次に、蛍光定量的PCRのプライマー設計原理に従ってPrimer premier5を使用してプライマーを設計した:
TRIZOLキットを使用して、異なる実験群のウサギ網膜から全RNAを抽出し、逆転写を実施してcDNAテンプレートを得た。
Real-time PCR Detection Systemで蛍光定量的PCRを実施した。12.5μLのSYBR Green mix、8μLのddH2O、プライマーペア(各1μL)、2.5μLのcDNA試料を0.2mLのPCR反応チューブに添加し、系全体を25μLとした。目的遺伝子及び内部参照遺伝子(ウサギアクチン)の増幅に各試料を使用し、各遺伝子の増幅は3連で実施した。実際に試料を添加する際には、誤差低減のために、各PCR反応チューブに共通する試薬については、それらの試薬をひとまとめにしてから分注することができる。試料添加完了後に蛍光定量的PCRを実施した。
異なる実験群のウサギの眼球の網膜を剥がし、対応する体積のRIPA溶解溶液を100μL/組織50mgとなるように添加した後、ホモジナイザーを用いて均質化し、遠心分離して上清を収集した。BCA法によってタンパク質濃度を決定した後、総タンパク質量が50μgとなるように実験群及び対照群の試料ロード体積を計算し、SDS-PAGEゲル電気泳動及びウエスタンブロットを実施した。抗体とのインキュベート後、ECLでの発色を実施した。
野生型C57BL/6Jマウスに対して硝子体腔を介する投与を行い、当該マウスを無作為に群分けした(マウス2匹/ケージ)。この投与では、濃度を2E11vg/mlとし、体積を1μLとしてrAAV2/2-OPA1を硝子体下注射によって投与した。投与後、マウスを7日群、15日群、20日群、30日群、45日群、60日群、及び90日群に分けた。指定日に達した時点で、異なる群のマウスを屠殺し、眼球試料を採取し、関連する検出及び解析を実施した。
実施例2に記載の方法及びステップと同様に、全RNA抽出、RNAの濃度決定及び電気泳動による同定、逆転写、ならびにリアルタイムPCRによる同定を実施した。その際、以下のプライマー配列を使用した:
1)水浴ケトルから遠心管を取り出し、室温で10~15分間静置して試料温度を室温にさげ、遠心管を反転させて均一に混合した。13,000rpm、室温での遠心分離を15分間実施した。
2)上清400μlをピペットで別の新たな遠心管に移した。等体積のイソプロパノールを添加し、直ちに遠心管を穏やかに上下に反転させて完全に混合した。白色の綿状沈殿が出現した時点で、12000rpm、室温での遠心分離を10分間実施し、上清を捨てた。
3)氷冷75%エタノールを遠心管に700μl添加して産物をすすぎ、遠心管を穏やかに上下に反転させて均一に混合した。12000rpm、室温での遠心分離を5分間実施し、すべての上清を捨てた。
4)遠心管を反転させて吸収紙上に置いてエタノールを吸収させた。風乾後、DNAを50μlの滅菌ddH2Oに溶解し、55℃で2時間溶解させた(ただちに使用しない場合は-20℃で保存した)。
5)DNAの濃度を決定し、DNAを100~200ng取り分け、PCRテンプレートとして使用した。
PCR増幅を介して、Q285部位を含む核酸増幅産物(長さ530bp)が得られるようにプライマーペアを合成した。
マウスの全DNAを抽出し、PCR産物をシークエンシングした。
OPA1変異マウスをマウス2匹/ケージとし、3群に分けた。rAAV-OPAl濃度を2E11vg/ml、投与体積を1μLとして、マウスの硝子体下への注射を行った。1ヶ月後及び3ヶ月後に、異なる群のマウスを屠殺して眼球試料を得た。OPA変異群に1μLのPBSを硝子体下注射し、野生型マウスをマウス2匹/ケージとし、1μLのPBSを硝子体下注射し、対照群とした。ATP含量の変化及びミトコンドリア形態観察について検出及び分析を実施した。
クロマトグラフィーカラム:SepaxGP-C18(4.6mm×250mm、5μm)
移動相A:15mMのKH2PO4、15mMのKCL、及びpHを6.0に調整するために使用した0.1MのKOH
移動相B:アセトニトリル含有率15%、移動相A含有率85%とした混合液
ロード体積:20μl
検出波長:254nm
勾配溶出条件:
マウス眼球を取り出した後、これらのマウス眼球を、それぞれ2.5%のグルタルアルデヒドに浸漬し、一晩固定化し、0.1mol/Lのリン酸緩衝液で3回洗浄(各15分間)し、オスミウム酸で2時間固定化し、0.1mol/Lのリン酸緩衝液で3回洗浄(各15分間)し、エタノール(50%、70%、80%、90%、100%)を使用して濃度勾配脱水を実施し、その後、純粋アセトンの使用に切り替え、純粋アセトンで2回脱水を行った。各ステップには15分かけた。812樹脂:アセトンを3:1、3:2、及び3:3の比で使用して濃度勾配浸透処理を実施した後(各ステップには40分かけた)、純粋な包埋剤を用いる45℃での一晩の包埋、60℃での重合、切片作成、染色、及び透過型電子顕微鏡下での観察を実施した。
眼疾患の治療において遺伝子治療が迅速に開発されれば、ADOAの治癒は困難なことではなくなるであろう。ヒトの眼とウサギ眼とは、解剖学的形態及び体積が類似していることから、本発明ではrAAV2/2-hOPA1アイソフォーム2の硝子体腔注射のためのモデルとしてウサギの眼を使用した。この実験では、注射用量、安全性レベル、及び術後合併症を調べ、将来の臨床試験のための重要な基準が得られた。すべてのウサギに細隙灯検査及び眼圧検査を実施し、これらのウサギについて、明らかな異常、結膜の充血及び分泌物、眼内炎、ならびに眼圧の上昇は認められなかった。手術から1ヶ月後に撮影した眼底写真から、すべてのウサギについて、明らかな合併症または網膜血管及び視神経の損傷は認められないことが示され、このことは、この実験が安全であったことを示唆している。
Claims (22)
- ヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号1の配列と同一である、組換え核酸。
- 更に、非翻訳領域(UTR)配列若しくはプロモーター配列、又はその両方を含む、請求項1に記載の組換え核酸。
- 前記UTR配列は、5’-UTR配列若しくは3’-UTR配列、又はその両方を含む、請求項2に記載の組換え核酸。
- 前記5’-UTR配列は、前記ヌクレオチド配列の5’末端に機能可能なように連結されている、請求項3に記載の組換え核酸。
- 前記3’-UTR配列は、前記ヌクレオチド配列の3’末端に機能可能なように連結されている、請求項3に記載の組換え核酸。
- 前記5’-UTR配列は、前記ヌクレオチド配列の5’末端に機能可能なように連結され、前記3’-UTR配列は、前記ヌクレオチド配列の3’末端に機能可能なように連結されている、請求項3に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸が、5’末端から3’末端の向きで式I:
Z1-Z2-Z3(I)
の構造を有し、
式中、
それぞれの「-」が、独立して、結合またはヌクレオチドリンカー配列であり、
Z1が、存在しないか、または5’-UTR配列であり、
Z2が、ヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseをコードするヌクレオチド配列であり、
Z3が、3’-UTR配列である、請求項3に記載の組換え核酸。 - 請求項1に記載の組換え核酸を含む、ベクター。
- 前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターから選択される、請求項8に記載のベクター。
- 前記ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項9に記載のベクター。
- 前記ベクターがAAVベクターである、請求項10に記載のベクター。
- 前記AAVベクターが、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、及びそれらの組み合わせから選択される血清型を有する、請求項11に記載のベクター。
- 前記ベクターが、DNAウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項8に記載のベクター。
- 請求項1に記載の組換え核酸を含む、単離された宿主細胞であって、前記ヌクレオチド配列が、前記宿主細胞の染色体に組み込まれたものである、前記宿主細胞。
- 前記単離された宿主細胞が、293T細胞、光受容細胞、視細胞、及び神経細胞からなる群から選択される、請求項14に記載の宿主細胞。
- (a)請求項1に記載の組換え核酸を含むアデノ随伴ウイルスと、(b)医薬的に許容可能な担体または医薬品添加物と、を含む、医薬調製物。
- 前記医薬調製物の剤形が、凍結乾燥調製物及び液体調製物からなる群から選択される、請求項16に記載の医薬調製物。
- 前記医薬調製物中の前記ウイルスの含量が、1×109~1×1016個ウイルス/mLである、請求項16に記載の医薬調製物。
- 前記医薬調製物中の前記ウイルスの含量が、2×1011~1×1012個ウイルス/mLである、請求項18に記載の医薬調製物。
- 細胞中でのミトコンドリアダイニン様GTPaseの発現及び/または活性を増加させるための医薬調製物であって、
前記医薬調製物が、(a)組換え核酸を含むベクター及び(b)医薬的に許容可能な担体または医薬品添加物を含み、
前記組換え核酸は、ヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseをコードし、且つ配列番号1の配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、前記医薬調製物。 - 対象の眼に投与される、眼疾患の治療のための医薬調製物であって、
前記医薬調製物は、(a)組換え核酸を含むアデノ随伴ウイルス及び(b)医薬的に許容可能な担体または医薬品添加物を含み、
前記組換え核酸は、ヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseをコードし、且つ配列番号1の配列と同一であるヌクレオチド配列を含み、
前記眼疾患が、オプティックアトロフィー1(OPA1)のハプロタイプ不全に起因する常染色体優性視神経萎縮(ADOA)である、前記医薬調製物。 - 組換え核酸を調製するための方法であって、前記方法が、前記組換え核酸を含む宿主細胞を培養し、それによって前記組換え核酸を得ることを含み、
前記組換え核酸は、ヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseをコードし、且つ配列番号1の配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、前記方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810968173.0 | 2018-08-23 | ||
CN201810968173.0A CN110857440B (zh) | 2018-08-23 | 2018-08-23 | 重组人ⅱ型线粒体动力蛋白样gtp酶基因序列及其应用 |
PCT/CN2019/102352 WO2020038473A1 (zh) | 2018-08-23 | 2019-08-23 | 重组人ⅱ型线粒体动力蛋白样gtp酶基因序列及其应用 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021533801A JP2021533801A (ja) | 2021-12-09 |
JPWO2020038473A5 JPWO2020038473A5 (ja) | 2022-08-31 |
JP7285022B2 true JP7285022B2 (ja) | 2023-06-01 |
Family
ID=69592310
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021509904A Active JP7285022B2 (ja) | 2018-08-23 | 2019-08-23 | 組換えヒトII型ミトコンドリアダイニン様GTPaseの遺伝子配列及びその使用 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11459584B2 (ja) |
EP (1) | EP3851535A4 (ja) |
JP (1) | JP7285022B2 (ja) |
KR (1) | KR102612148B1 (ja) |
CN (1) | CN110857440B (ja) |
AU (1) | AU2019323501B2 (ja) |
BR (1) | BR112021002566A2 (ja) |
CA (1) | CA3110153A1 (ja) |
MX (1) | MX2021002135A (ja) |
SG (1) | SG11202101236WA (ja) |
WO (1) | WO2020038473A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110857440B (zh) | 2018-08-23 | 2021-02-19 | 武汉纽福斯生物科技有限公司 | 重组人ⅱ型线粒体动力蛋白样gtp酶基因序列及其应用 |
CN111849998A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-30 | 武汉纽福斯生物科技有限公司 | 编码人卵黄状黄斑病蛋白1的核酸分子及其应用 |
CN117904156A (zh) * | 2022-10-17 | 2024-04-19 | 武汉纽福斯生物科技有限公司 | 人线粒体动力蛋白样gtp酶及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017191274A2 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Curevac Ag | Rna encoding a therapeutic protein |
WO2018146588A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Synp88, a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
WO1991018088A1 (en) | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
US6566118B1 (en) | 1997-09-05 | 2003-05-20 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
US6995006B2 (en) | 1997-09-05 | 2006-02-07 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
AU781958C (en) | 1999-08-09 | 2006-03-30 | Targeted Genetics Corporation | Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs |
WO2006073496A2 (en) | 2004-07-30 | 2006-07-13 | Targeted Genetics Corporation | Recombinant aav based vaccine methods |
ES2541771T3 (es) * | 2005-05-03 | 2015-07-24 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Expresión de una proteína mitocondrial mediante un enfoque alotópico mejorado |
EP2030021B1 (en) * | 2006-05-18 | 2012-11-21 | Andreas Reichert | Method for diagnosing mitochondrial dysfunction |
CN102634527B (zh) * | 2012-04-11 | 2013-11-06 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 重组人nadh脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法 |
PT3494997T (pt) * | 2012-07-25 | 2019-12-05 | Massachusetts Inst Technology | Proteínas de ligação a adn indutíveis e ferramentas de perturbação do genoma e aplicações destas |
TW201514200A (zh) * | 2013-04-03 | 2015-04-16 | Aliophtha Ag | 用於治療由opa1單倍體不足所造成的疾病之人工轉錄因子 |
CN104450747B (zh) * | 2014-09-23 | 2018-02-09 | 武汉纽福斯生物科技有限公司 | 用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒‑NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂 |
DK3289080T3 (da) * | 2015-04-30 | 2021-11-08 | Univ Columbia | Genterapi til autosomalt dominante sygdomme |
EP3548039B1 (en) * | 2016-12-04 | 2023-07-19 | Alavi Khorassani Moghadam, Marcel Victor | Ribavirin for use in the treatment of a mitochondrial disease |
CN111068071A (zh) * | 2018-10-22 | 2020-04-28 | 武汉纽福斯生物科技有限公司 | 基因治疗Leber遗传学视神经病变 |
CN110857440B (zh) | 2018-08-23 | 2021-02-19 | 武汉纽福斯生物科技有限公司 | 重组人ⅱ型线粒体动力蛋白样gtp酶基因序列及其应用 |
-
2018
- 2018-08-23 CN CN201810968173.0A patent/CN110857440B/zh active Active
-
2019
- 2019-08-23 AU AU2019323501A patent/AU2019323501B2/en active Active
- 2019-08-23 SG SG11202101236WA patent/SG11202101236WA/en unknown
- 2019-08-23 BR BR112021002566-9A patent/BR112021002566A2/pt unknown
- 2019-08-23 CA CA3110153A patent/CA3110153A1/en active Pending
- 2019-08-23 EP EP19851390.5A patent/EP3851535A4/en active Pending
- 2019-08-23 JP JP2021509904A patent/JP7285022B2/ja active Active
- 2019-08-23 KR KR1020217008407A patent/KR102612148B1/ko active IP Right Grant
- 2019-08-23 MX MX2021002135A patent/MX2021002135A/es unknown
- 2019-08-23 WO PCT/CN2019/102352 patent/WO2020038473A1/zh unknown
-
2021
- 2021-02-23 US US17/182,903 patent/US11459584B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017191274A2 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Curevac Ag | Rna encoding a therapeutic protein |
WO2018146588A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Synp88, a promoter for the specific expression of genes in retinal ganglion cells |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Eye,2014年05月,Vol.28, No.5,pp.521-537 |
Mol. Ther. Methods Clin. Dev.,2017年12月01日,Vol.8,pp.87-104 |
Sci. Rep.,2018年02月06日,Vol.8, No.1, 2468,pp.1-6 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110857440B (zh) | 2021-02-19 |
WO2020038473A1 (zh) | 2020-02-27 |
EP3851535A4 (en) | 2022-12-14 |
CA3110153A1 (en) | 2020-02-27 |
US20210180086A1 (en) | 2021-06-17 |
SG11202101236WA (en) | 2021-03-30 |
MX2021002135A (es) | 2021-06-23 |
KR102612148B1 (ko) | 2023-12-12 |
CN110857440A (zh) | 2020-03-03 |
AU2019323501B2 (en) | 2023-08-03 |
US11459584B2 (en) | 2022-10-04 |
EP3851535A1 (en) | 2021-07-21 |
KR20210049131A (ko) | 2021-05-04 |
JP2021533801A (ja) | 2021-12-09 |
AU2019323501A1 (en) | 2021-02-25 |
BR112021002566A2 (pt) | 2021-06-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109476707B (zh) | 腺相关病毒变体衣壳和其使用方法 | |
JP2024015194A (ja) | アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用 | |
JP2023126919A (ja) | バリアントカプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法 | |
AU2016370487B2 (en) | Gene therapy for ocular disorders | |
US11459584B2 (en) | Gene sequence of recombinant human type II mitochondrial dynein-like GTPase and uses thereof | |
CN111621502B (zh) | 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用 | |
JP2020536589A (ja) | Aavベクター | |
US20210347834A1 (en) | Gene therapy vector for treating retinitis pigmentosa disease | |
JP2023116709A (ja) | 眼疾患のための遺伝子療法 | |
CN113025633A (zh) | 编码人nadh脱氢酶亚单位1蛋白的核酸及其应用 | |
WO2020077756A1 (zh) | Nd4蛋白的编码序列及其应用 | |
WO2020010491A1 (zh) | 编码人nadh脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用 | |
JP2023539368A (ja) | コドン最適化したrpgrorf15遺伝子およびその使用 | |
CN111926021A (zh) | 重组人norrin胱氨酸结生长因子表达载体及其应用 | |
WO2020000641A1 (zh) | 编码人nadh脱氢酶亚单位蛋白的核酸及其应用 | |
CN111518813B (zh) | 视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用 | |
CN111909935B (zh) | 重组人卷曲蛋白受体4(fzd4)的表达载体及其应用 | |
CN110699367B (zh) | 编码人nadh脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用 | |
WO2024083013A1 (zh) | 人线粒体动力蛋白样gtp酶及应用 | |
CN110191954B (zh) | 用于治疗涉及rdh12的病症和疾病的方法和组合物 | |
CN117377771A (zh) | 载体系统 | |
JP2023528139A (ja) | ヒト核因子e2関連因子2の発現ベクター及び発現ベクターの適用 | |
CN110191954A (zh) | 用于治疗涉及rdh12的病症和疾病的方法和组合物 | |
NZ753155B2 (en) | Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of achromatopsia and other diseases | |
NZ713958B2 (en) | Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of achromatopsia and other diseases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220822 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220822 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20220822 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220927 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221216 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230324 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230425 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230515 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7285022 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |