TW201514200A - 用於治療由opa1單倍體不足所造成的疾病之人工轉錄因子 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種人工轉錄因子,其包含與活化性蛋白質域及核定位序列融合之特異性以OPA1啟動子為目標之多指鋅指蛋白。針對該OPA1啟動子之人工轉錄因子適用於治療與OPA1單倍體不足相關之疾病,諸如體染色體顯性視神經萎縮、症候群性加強型體染色體顯性視神經萎縮及正常眼壓青光眼。
Description
本發明係關於人工轉錄因子,其包含與活性域及核定位序列融合之特異性以OPA1基因啟動子為目標之多指鋅指蛋白,及其使用於治療由導致單倍體不足之OPA1突變所造成的疾病中之用途,該等疾病諸如體染色體顯性視神經萎縮(autosomal dominant optic atrophy,ADOA)或症候群性ADOA plus(syndromic ADOA plus)。
人工轉錄因子(artificial transcription factor,ATF)被提議為適用於調節基因表現之工具(Sera T.,2009,Adv Drug Deliv Rev 61,513-526)。經由抑制或活化基因轉錄而影響基因表現之許多天然存在之轉錄因子具有用於識別特定DNA序列之複雜的特異性域。若意欲調節其特異性且以基因為目標,則此使其成為無吸引力的操作目標。然而,一類特定轉錄因子含有若干個所謂的鋅指(zinc finger,ZF)域,其為模組化的且因此有助於遺傳工程改造。鋅指為以幾乎獨立的三個DNA鹼基對為目標的短(30個胺基酸)DNA結合基元。因此含有融合在一起之若干個鋅指的蛋白質能夠識別較長DNA序列。六聚鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)識別18個鹼基對(bp)DNA目標,其在整個人類基因組中幾乎為唯一的。最初認為是完全情境獨立的,更多深入分析揭露對於鋅指之某種情境特異性(Klug A.,2010,Annu Rev Biochem 79,213-231)。使鋅指識別表面中之某些胺基酸突變,改變ZF模組
之結合特異性產生為5'-GNN-3'、5'-CNN-3'、5'-ANN-3'及一些5'-TNN-3'密碼子中之大部分所定義之ZF構建嵌段(例如所謂的巴巴斯模組(Barbas module),參見Dreier B.,Barbas C.F.3rd等人,2005,J Biol Chem 280,35588-35597)。雖然對人工轉錄因子之早期工作集中於基於將預選鋅指與已知3bp目標序列組合之合理設計,但鋅指之某種情境特異性的實現需要產生大的鋅指文庫,使用諸如細菌或酵母單雜交、噬菌體呈現、隔室化核糖體呈現或使用FACS分析之活體內選擇之先進方法來查詢該等文庫。
使用該等人工鋅指蛋白,可以高特異性以人類基因組中之DNA基因座為目標。因此,此等鋅指蛋白為將具有轉錄調節活性之蛋白質域運輸至特定啟動子序列,從而使得所關注基因之表現得到調節的理想工具。適於基因轉錄之活化的域為疱疹病毒單純形VP16(SEQ ID NO:1)或VP64(VP16之四聚重複,SEQ ID NO:2)域(Beerli R.R.等人,1998,Proc Natl Acad Sci USA 95,14628-14633)。認為賦予轉錄活化之其他域為CJ7(SEQ ID NO:3)、p65-TA1(SEQ ID NO:4)、SAD(SEQ ID NO:5)、NF-1(SEQ ID NO:6)、AP-2(SEQ ID NO:7)、SP1-A(SEQ ID NO:8)、SP1-B(SEQ ID NO:9)、Oct-1(SEQ ID NO:10)、Oct-2(SEQ ID NO:11)、Oct-2_5x(SEQ ID NO:12)、MTF-1(SEQ ID NO:13)、BTEB-2(SEQ ID NO:14)及LKLF(SEQ ID NO:15)。另外,認為由基因本體論GO:0001071(http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term_details?term=GO:0001071)定義之蛋白質之轉錄活性域達成目標蛋白質之轉錄調控。
雖然由於特定特點之高保守,小分子藥並不總是能夠選擇性地以特定蛋白質家族之某一成員為目標,但生物製品提供如所示對於基於抗體之新穎藥之良好特異性。然而,迄今為止,幾乎所有生物製品均在細胞外起作用。尤其上文所提及之人工轉錄因子將適於以治療上有用之方式影響基因轉錄。然而,將該等因子傳遞至作用位點(核)並不容易達成,因此阻礙
了治療性人工轉錄因子方法之可用性,例如藉由依靠反轉錄病毒傳遞,其具有此方法之所有缺點,諸如免疫原性及細胞轉型潛力(Lund C.V.等人,2005,Mol Cell Biol 25,9082-9091)。
顯示所謂的蛋白轉導域(protein transduction domain,PTD)促進蛋白質跨越質膜位移至胞質液/核質中。顯示當諸如HIV衍生TAT肽(SEQ ID NO:16)等短肽誘導貨物蛋白質之細胞類型獨立性大吞飲泡攝取(Wadia J.S.等人,2004,Nat Med 10,310-315)。在到達胞質液時,顯示融合蛋白具有生物活性。有趣的是,甚至錯誤摺疊之蛋白質可在蛋白質轉導後很可能經由細胞內伴侶蛋白之作用變得具有功能。
遺傳突變為許多遺傳病症之核心。一般而言,該等突變關於其遺傳方式可分為顯性或隱性的,其中顯性突變能夠引起疾病表型,即使當影響僅一個基因複本(為其母親或父親的)時,而隱性突變引起母親與父親雙方之疾病,基因複本需要進行突變。顯性突變能夠藉由兩種一般機制中之一者,藉由顯性負作用或藉由單倍體不足(haploinsufficiency)來引起疾病。在顯性負突變之情況下,基因產物獲得新的異常功能,其為有毒的且引起疾病表型。實例為多聚蛋白質複合物之次單元,其在突變時防止該蛋白質複合物之固有功能。以顯性方式遺傳之疾病亦可由單倍體不足造成,其中疾病引起之突變使受影響之基因失活,由此降低有效基因量。在此等情況下,第二完整基因複本不能為正常功能提供足夠的基因產物。估計約12'000個人類基因為單倍體不足(Huang等人,2010,PLoS Genet.6(10),e1001154),其中已知約300個基因與疾病相關。
神經元存活決定性地視粒線體功能而定,其中粒線體故障為許多神經變性病症之核心(Karbowski M.,Neutzner A.,2012,Acta Neuropathol 123(2),157-71)。除其以ATP形式提供能量之主要功能外,粒線體決定性地與鈣緩衝、不同分解代謝以及代謝過程以及程序性細胞死亡有關。粒線體之
此等重要功能適當地反映在許多細胞機制中以維持粒線體且防止粒線體故障及隨後細胞死亡(Neutzner A.等人,2012,Semin Cell Dev Biol 23,499-508)。在此等過程中維持具有平衡粒線體形態之動態粒線體網起核心作用。此藉由所謂的粒線體形態發生因子達成,其在Drp1、Fis1、Mff、MiD49及MiD51之情況下促進粒線體裂變或在Mfn1、Mfn2及OPA1之情況下粒線體管融合。平衡粒線體形態為主要的,因為已知粒線體融合之損失可促進ATP產生之損失且使細胞對細胞凋亡刺激敏感,從而此過程與與神經變性病症相關之神經元細胞死亡有關聯。
在粒線體融合過程中起關鍵作用的是視神經萎縮1或OPA1。OPA1為由OPA1基因編碼且對粒線體融合必不可少之過程之大GTP酶(GTPase)。另外,OPA1在維持作為脊組分之內部粒線體結構中起重要作用。表明由於融合損失,OPA1基因表現之下調會引起粒線體破碎,且使細胞對細胞凋亡刺激敏感。OPA1中之突變經鑑定為負責凱傑視神經病變(Kjer's optic neuropathy)或體染色體顯性萎縮(autosomal dominant atrophy,ADOA)之約70%。在大多數群體中,ADOA之流行率介於1/10'000和3/100'000之間且其特徵在於在兒童早期開始的視力緩慢進展的降低。視覺障礙之範圍為輕度至法定失明,為不可逆的且由視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell,RGC)之緩慢變性引起。在大多數情況下,ADOA為非症候群性,然而,在約15%之患者中遭遇眼外神經肌肉表現(諸如感音神經性聽力損失)。迄今為止,對於此疾病無可用之可行治療。有趣的是,某些OPA1等位基因與正常眼壓而非高張力青光眼有關聯,從而再次突出OPA1對於維持正常粒線體生理學之重要性。
本發明係關於一種人工轉錄因子,其包含與活化性蛋白質域及核定位序列融合之以OPA1啟動子為目標之多指鋅指蛋白,及包含該人工轉錄因子
之醫藥組成物。
此外,本發明係關於一種人工轉錄因子,其包含與活化性蛋白質域、核定位序列及蛋白轉導域融合之以OPA1啟動子為目標之多指鋅指蛋白,及包含該人工轉錄因子之醫藥組成物。
本發明亦關於該等人工轉錄因子用於增強OPA1基因之表現及用於改善OPA1基因產物之產生的用途。
此外,本發明係關於該等人工轉錄因子用於治療由低OPA1含量造成或調節之疾病、尤其用於治療眼病(諸如ADOA及ADOA plus)之用途。同樣,本發明係關於一種治療受低OPA1含量影響之疾病的方法,其包含向有需要之患者投予治療有效量之本發明之人工轉錄因子。
圖1:用於使用可轉導人工轉錄因子減輕單倍體不足之治療方法
(A)單倍體不足突變(HM)引起與野生型情況(WT)相比自在啟動子(P)控制下之基因(G)產生之基因產物(GP)減少。
(B)藉由蛋白轉導域(PTD)(諸如TAT或其他域)之作用將含有與活性域(RD)以及核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)融合之特異性以單倍體不足基因(G)之啟動子(P)區域為目標之六聚鋅指(ZF)蛋白的人工轉錄因子運輸至細胞中。在結合於突變型(HM)及野生型基因(G)之啟動子時,自該野生型基因複本產生之基因產物增加以替代自該突變型基因複本損失之基因產物。
(C)在編碼該人工轉錄因子之cDNA之病毒轉導後,由細胞表現含有與活性域(RD)以及核定位序列(NLS)融合之特異性以啟動子(P)區域為目標之六聚鋅指(ZF)的人工轉錄因子。在結合於突變型(HM)及野生型基因(G)之啟動子時,自該野生型基因複本產生之基因產物增加以替代自該突變型基因複本損失之基因產物。
圖2:OPA1啟動子區域
展示含有OPA1啟動子之OPA1的5'未轉譯區域(SEQ ID NO:17)。突出用於本發明之人工轉錄因子的結合位點(加下劃線之重疊位點為位置85至102及91至108、位置834至853及位置983至1000),及位置846為轉錄起點(粗體)。
圖3:評估OPA1特異性人工轉錄因子之活性的螢光素酶報導分子分析
用用於OPA1_akt1至OPA1_akt5(圖A,標記為A1至A5)或OPA1_akt6至OPA1_akt10(圖B,標記為A6至A10)之表現質體及含有在人類OPA1啟動子控制下之高斯椰屬(Gaussia)螢光素酶及在CMV啟動子控制下之分泌型鹼性磷酸酶的報導質體共轉染海拉細胞(HeLa cell)。用非活性(改良)OPA1_akt1(圖A)或非活性(改良)OPA1_akt6(圖B)轉染,其中鋅指蛋白中之所有鋅配位半胱胺酸殘基均為交換為絲胺酸殘基,用作對照組(標記為C)。共轉染後48小時量測螢光素酶及分泌型鹼性磷酸酶。將螢光素酶活性校正為分泌型鹼性磷酸酶且表示為對照組之百分比(相對螢光素酶活性-RLA)。展示三次獨立實驗之平均值,其中誤差線表示SD。
本發明係關於一種人工轉錄因子(ATF),其包含與活化性蛋白質域、核定位序列(NLS)及視情況存在之蛋白轉導域(PTD)融合之特異性以OPA1啟動子(SEQ ID NO:17)為目標之多指鋅指蛋白(ZFP),及包含該人工轉錄因子之醫藥組成物(圖1)。
在本發明文中,啟動子定義為基因之調控區域。此定義對應於此項技術中之一般定義。同樣在本發明文中,單倍體不足啟動子定義為能夠在所有情況下在所有細胞類型中引起足夠基因產物之產生的啟動子,只要基因組中存在兩個功能基因複本即可。由此,在生物體之一些或所有細胞中在一些或所有生理學環境下單倍體不足基因之一個基因複本的突變會引起不
足的基因產物產生。在本發明文中,基因定義為含有調控序列以及用於導致產生蛋白質或RNA之基因產物的序列之基因組區域。此定義亦對應於此項技術中之一般定義。
蛋白轉導域介導之人工轉錄因子之細胞內傳遞為以新穎方式利用生物製品之高選擇性以病理生理學相關分子為目標之新方式。對於由OPA1單倍體不足所造成的疾病(諸如ADOA或ADOA plus),使用當前方法之治療(例如小分子藥物)均不可信,因為不足的基因表現為該等病症之根本原因。然而,藉由將人工轉錄因子技術以蛋白轉導域(PTD)形式與先進藥物目標設定配對,OPA1之單倍體不足可直接在分子層面上藉由運輸活化人工轉錄因子且使其餘功能基因複本之轉錄增強至將達到兩個基因複本皆具功能之程度來解決。
所考慮之蛋白轉導域為HIV TAT、肽mT02(SEQ ID NO:18)、肽mT03(SEQ ID NO:19)、R9肽(SEQ ID NO:20)、ANTP域(SEQ ID NO:21)或能夠運輸貨物穿過質膜之其他肽。
此外,認為用聚乙二醇修飾本發明之人工轉錄因子可減少免疫原性。另外,將本發明之人工轉錄因子施用於免疫特權器官(諸如眼睛及腦)將避免任何免疫反應,且誘導對人工轉錄因子之全身耐受性。為了治療免疫特權器官外之慢性疾病,考慮經由先前眼內注射誘導免疫耐受性。
顯性視神經萎縮由導致單倍體不足之OPA1基因突變引起。由於形成視神經之視網膜神經節細胞的進行性損失,因此顯性視神經萎縮患者遭受進行性視力損失,最終造成失明。有趣的是,大多數顯性視神經萎縮患者並不呈現眼外症狀。僅一小部分患者遭受所謂的加強型顯性視神經萎縮(dominant optic atrophy plus)表型伴有眼外神經學症狀,諸如痙攣性截癱及聽覺障礙。OPA1與在結構層面上藉由穩定內粒線體脊結構及藉由促進粒線體管之間的融合來維持粒線體功能有關。因為粒線體為ATP形式之細胞能量
之主要產生者,所以OPA1為維持細胞能量水準所必需的。已知OPA1功能之損失經由細胞凋亡機制來促進細胞死亡。在人體幾乎所有細胞中,OPA1基因之一個功能複本足以產生足夠的OPA1蛋白以使粒線體功能維持在足夠的水準上。然而,特定能量不足視網膜神經節細胞具有關於其粒線體狀態之特殊需要,且因此視無法由一個OPA1基因複本產生之OPA1含量而定,因此單倍體不足OPA1突變與視網膜神經節細胞死亡相關且導致視力損失及失明。使用本發明之人工轉錄因子,OPA1蛋白含量可在視網膜神經節細胞中藉由使自其餘功能性OPA1基因產生OPA1蛋白增強至超過正常含量而增加,由此修復粒線體功能,防止視網膜神經節細胞死亡及相關視力損失。
OPA1之單倍體不足理論上可藉由典型基因治療方法,經由藉助於病毒轉移供應突變型OPA1基因之另一功能複本來治療,由此增加基因劑量。然而,認為安全用於基因治療之目前可用的病毒載體並不能夠運輸大於約5至8千鹼基對之基因。雖然此對於一些基因足夠,但OPA1基因遠大於8千鹼基對且因此並非使用目前可用的載體之基因治療的候選者。另外,基因表現之準確調控無法使用具有所傳遞基因之總過表現之可能性及相關有毒副作用的基因治療達成。
此病毒轉移之限制並不適用於本發明之人工轉錄因子。單倍體不足基因之大小與本發明中所述之治療方法無關(圖1),即使是適合藉由人工轉錄因子調節之最大基因。另外,由本發明之人工轉錄因子增加基因表現之程度經由相應地給與人工轉錄因子或藉由使用具有較高或較低轉錄調節活性之替代性活化域調節。另外,OPA1 mRNA經受廣泛替代性剪接,從而引起若干OPA1同功異構物之產生,其全部為OPA1進行其功能所必需的。尤其,多種OPA1同功異構物之不同蛋白水解加工為OPA1進行其功能之必要機械學先決條件。
使用本發明之人工轉錄因子的病毒傳遞增加功能基因複本之OPA1 mRNA產生將允許發生此主要過程,由此提供用於由OPA1單倍體不足所造成的疾病之功能性治癒。
傳統上用作治療劑混合物之幾類小分子並不適於以基因表現之調節為目標。因此,許多有前途的藥物目標及相關疾病並不適合典型藥物方法。相比之下,本發明之人工轉錄因子均屬於具有高度定義總組成之同一物質類別。以兩種非常不同的啟動子序列為目標之兩種基於六聚鋅指蛋白之人工轉錄因子仍具有85%之最小胺基酸序列一致性及總體類似三級結構,且可經由標準化方法(如下文所述)以快速且經濟的方式產生。因此,本發明之人工轉錄因子將對於一組廣泛且不同的目標之格外高特異性與總體類似組成組合在一類分子中。另外,將本發明之人工轉錄因子調配至藥物中可依靠先前經驗,從而進一步加快藥物開發過程。
本發明亦關於該等人工轉錄因子於治療由導致OPA1單倍體不足之OPA1突變所造成的疾病中之用途,其中多指鋅指蛋白特異性以OPA1啟動子區域為目標。同樣,本發明係關於一種治療疾病之方法,其包含向有需要之患者投予治療有效量之本發明之人工轉錄因子,其中該待治療之疾病由OPA1基因之單倍體不足造成,且其中多指鋅指蛋白特異性以OPA1啟動子為目標。
所考慮之多指鋅指蛋白為四聚、五聚、六聚或七聚鋅指蛋白。「四聚」、「五聚」、「六聚」及「七聚」意謂鋅指蛋白分別由四、五、六及七個部分蛋白質結構組成,其中每一者對於特定核苷酸三聯體具有結合特異性。較佳地,人工轉錄因子包含六聚鋅指蛋白。
OPA1啟動子區域內之目標位點的選擇
目標位點選擇對於成功產生功能性人工轉錄因子至關重要。對於活體內調節OPA1基因表現之人工轉錄因子,其必須在OPA1基因之基因組環境
下結合其目標位點。此需要DNA目標位點之可接近性,意謂區域中之染色體DNA未在組蛋白周圍緊密包裹為核小體且(諸如甲基化)DNA修飾不會干擾人工轉錄因子結合。雖然人類基因組之大部分緊密包裹且無轉錄活性,但主動轉錄基因之轉錄起始位點(-1000至+200bp)的附近對於內源性轉錄因子及轉錄機構(諸如RNA聚合酶)必須為可接近的。因此,選擇任何特定目標基因之此區域中之目標位點將允許成功產生具有所需活體內功能之人工轉錄因子。
人類OPA1基因啟動子內之目標位點的選擇
針對具有(G/C/ANN)6之一般組成的潛在18bp目標位點之存在分析人類OPA1開放閱讀框(圖2)之起始密碼子上游1000bp的區域,其中G為核苷酸鳥嘌呤,C為核苷酸胞嘧啶,A為核苷酸腺嘌呤且N代表四種核苷酸鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及胸腺嘧啶中之每一者。選擇四個目標位點OPA_TS1(SEQ ID NO:22)、OPA_TS2(SEQ ID NO:23)、OPA_TS3(SEQ ID NO:24)及OPA_TS4(SEQ ID NO:25)。
以OPA1基因啟動子為目標之可轉導人工轉錄因子
特定六聚鋅指蛋白由使用ZiFit軟體v3.3(Sander JD.,Nucleic Acids Research 35,599-605)之所謂巴巴斯鋅指模組設置(Gonzalez B.,2010,Nat Protoc 5,791-810)構成,或選自使用酵母單雜交技術之鋅指蛋白文庫。為了產生以OPA1基因啟動子為目標之活性可轉導人工轉錄因子,使六聚鋅指蛋白ZFP_OPA1_1(SEQ ID NO:26)、ZFP_OPA1_2(SEQ ID NO:27)、ZFP_OPA1_3(SEQ ID NO:28)、ZFP_OPA1_4(SEQ ID NO:29)、ZFP_OPA1_5(SEQ ID NO:30)、ZFP_OPA1_6(SEQ ID NO:31)、ZFP_OPA1_7(SEQ ID NO:32)、ZFP_OPA1_8(SEQ ID NO:33)、ZFP_OPA1_9(SEQ ID NO:34)、ZFP_OPA1_10(SEQ ID NO:35)、ZFP_OPA1_11(SEQ ID NO:36)、ZFP_OPA1_12(SEQ ID NO:37)、ZFP_OPA1_13(SEQ ID NO:38)、
ZFP_OPA1_14(SEQ ID NO:39)、ZFP_OPA1_15(SEQ ID NO:40)、ZFP_OPA1_16(SEQ ID NO:41)、ZFP_OPA1_17(SEQ ID NO:42)及ZFP_OPA1_18(SEQ ID NO:43),與轉錄活化域VP64融合,得到亦含有NLS及3xmyc抗原決定基標記之人工轉錄因子OPA_akt1(SEQ ID NO:44)、OPA_akt2(SEQ ID NO:45)、OPA_akt3(SEQ ID NO:46)、OPA_akt4(SEQ ID NO:47)、OPA_akt5(SEQ ID NO:48)、OPA_akt6(SEQ ID NO:49)、OPA_akt7(SEQ ID NO:50)、OPA_akt8(SEQ ID NO:51)、OPA_akt9(SEQ ID NO:52)、OPA_akt10(SEQ ID NO:53)、OPA_akt11(SEQ ID NO:54)、OPA_akt12(SEQ ID NO:55)、OPA_akt13(SEQ ID NO:56)、OPA_akt14(SEQ ID NO:57)、OPA_akt15(SEQ ID NO:58)、OPA_akt16(SEQ ID NO:59)、OPA_akt17(SEQ ID NO:60)及OPA_akt18(SEQ ID NO:61)。
亦考慮含有五聚或六聚或七聚鋅指蛋白的本發明之人工轉錄因子,其中個別鋅指模組經交換以改善對OPA1啟動子基因之目標位點的結合親和性或改變鋅指蛋白之免疫學特徵以改善可耐受性。
根據本發明之以OPA1啟動子為目標之人工轉錄因子亦包含基於如SEQ ID NO:26及43所揭示之鋅指模組組成之鋅指蛋白,其中個別胺基酸經交換以便使潛在免疫原性減至最小,同時保留與所欲目標位點之結合親和性。
本發明之人工轉錄因子亦可能含有如由基因本體論GO:0001071所定義之能夠增加基因轉錄之其他蛋白質域,諸如VP16、VP64(VP16之四聚重複)CJ7、p65-TA1、SAD、NF-1、AP-2、SP1-A、SP1-B、Oct-1、Oct-2、Oct-2_5x、MTF-1、BTEB-2、LKLF等,較佳為VP64或A-2。
此外,本發明之人工轉錄因子包含核定位序列(NLS)。所考慮之核定位序列為經由結合於由基因本體論GO:0008139定義之蛋白質來賦予核輸入之胺基酸基元,例如含有離胺酸殘基(K)、隨後離胺酸(K)或精胺酸殘基
(R)、隨後任何胺基酸(X)、隨後離胺酸或精胺酸殘基之鹼性胺基酸叢集(K-K/R-X-K/R一致序列,Chelsky D.等人,1989 Mol Cell Biol 9,2487-2492)或SV40 NLS(SEQ ID NO:62),其中SV40 NLS為較佳。
針對OPA1基因之啟動子區域但無蛋白轉導域之人工轉錄因子亦為本發明之主題。其為如上文所定義之本發明之人工轉錄因子的中間物,或可按原樣使用。
考慮用於藉由轉染或經由病毒載體(諸如基於疱疹病毒、腺病毒及腺相關病毒之載體)傳遞之核酸形式的本發明之人工轉錄因子的替代性傳遞方法。
本發明之人工轉錄因子的域可由短的可撓性連接子連接。短的可撓性連接子具有2至8個胺基酸,較佳為甘胺酸及絲胺酸。所考慮之特定連接子為GGSGGS(SEQ ID NO:63)。人工轉錄因子可進一步含有易於其偵測及加工之標記物。
在用以OPA1啟動子為目標之人工轉錄因子治療後評估OPA1上調及改善之粒線體活性
用OPA1啟動子特異性人工轉錄因子處理之海拉細胞將與緩衝液對照物處理之細胞進行比較且OPA1之蛋白質含量將藉由基於西方墨點法(Western blot)之定量紅外螢光使用特異性抗OPA1抗體來評估。OPA1蛋白含量之增加指示用人工轉錄因子處理後增加之OPA1產生。為了量測用OPA1特異性人工轉錄因子處理之有益作用,評估粒線體保真度及細胞存活率。為此,就經由用粒線體毒藥魚藤酮處理所觸發之氧化損傷後的粒線體活性氧產生而言,將用OPA1特異性人工轉錄因子處理之細胞對照物處理之細胞進行比較。使用流動式細胞測量術及活性氧特異性染料MitoSox量測粒線體活性氧產生。另外,藉由流動式細胞測量術偵測電位敏感性TMRE螢光來量測作為粒線體健康參數之粒線體膜電位。與對照組細胞相比,在人
工轉錄因子處理之細胞中活性氧物質產生之降低或粒線體膜電位之增加指示以人工轉錄因子為目標之OPA1的有益活性。此外,量測用以人工轉錄因子為目標之OPA1處理之細胞或對照物處理之細胞對由星形孢菌素(staurosporine)、魚藤酮及放線菌素D(actinomycin D)誘導之細胞凋亡的敏感性。為此,使用經治療細胞之螢光顯微術量測作為細胞凋亡性細胞死亡之指示劑的細胞色素C之釋放且與對照組細胞進行比較。
聚乙二醇殘基之連接
認為將聚乙二醇殘基共價連接(聚乙二醇化)於本發明之人工轉錄因子可增加人工轉錄因子之可溶性,降低其腎清除率,且控制其免疫原性。考慮胺以及大小範圍為1至40千道爾頓(kilodalton)之硫醇活性聚乙二醇。使用硫醇活性聚乙二醇,達成人工轉錄因子之位點特異性聚乙二醇化。在本發明之人工轉錄因子中僅含有必要硫氫基之胺基酸為對於鋅配位必不可少的位於鋅指模組中之半胱胺酸殘基。此等硫氫基由於其鋅配位而不易用於聚乙二醇化,因此本發明之人工轉錄因子中包涵一個或若干個半胱胺酸殘基提供自由硫氫基用於使用硫醇特異性聚乙二醇試劑之聚乙二醇化。
醫藥組成物
本發明亦關於包含如上文所定義之人工轉錄因子的醫藥組成物。所考慮之醫藥組成物為用於非經腸全身投藥(尤其靜脈內投藥)之組成物,用於吸入之組成物,用於向溫血動物(尤其人類)局部投藥(尤其眼部局部投藥(例如以滴眼劑形式),或玻璃體內、結膜下、眼旁(parabulbar)或眼球後投藥)之組成物。尤其較佳為滴眼劑及用於玻璃體內、結膜下、眼旁或眼球後投藥之組成物。組成物包含單獨活性成分或較佳以及醫藥學上可接受之載劑。另外考慮緩慢釋放調配物。活性成分之劑量視所治療之疾病及物種、其年齡、體重及個體病狀、個體藥物動力學資料及投藥方式而定。
另外考慮適用於經口傳遞之醫藥組成物,尤其為包含經適當囊封或以
其他方式防止在內臟中降解之活性成分的組成物。舉例而言,該等醫藥組成物可含有膜滲透性增強劑、蛋白酶抑制劑,且由腸溶包衣包裹。
醫藥組成物包含約1%至約95%活性成分。單位劑型為例如安瓿、小瓶、吸入器、滴眼劑及其類似物。
本發明之醫藥組成物以自身已知方式製備,例如藉助於習知混合、溶解或凍乾過程。
較佳使用活性成分之溶液,且亦可在使用之前製備懸浮液或分散液,尤其為等張水性溶液、懸浮液或分散液,例如在凍乾組成物之情況下其包含單獨活性成分或以及載劑(例如甘露糖醇)。醫藥組成物可經滅菌及/或可包含賦形劑,例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑及/或乳化劑、增溶劑、用於調節滲透壓力之鹽及/或緩衝液且以自身已知之方式製備,例如藉助於習知溶解及凍乾過程。該等溶液或懸浮液可包含黏度增加劑,典型地為羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮或明膠,或亦為增溶劑,例如Tween 80TM(聚氧化乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯)。
於油中之懸浮液包含習知用於注射目的之植物油、合成油或半合成油作為油組分。關於此方面,可特別提及液體脂肪酸酯,其含有具有8至22個、尤其12至22個碳原子之長鏈脂肪酸作為酸組分。此等脂肪酸酯之醇組分具有最多6個碳原子且為單價或多價(例如單價、二價或三價)醇,尤其為乙二醇及甘油。作為脂肪酸酯之混合物,諸如棉籽油、杏仁油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油、大豆油及花生油之植物油尤其適用。
可注射製劑之製造通常在無菌條件下進行,容器之填充(例如填充至安瓿或小瓶中)及密封亦如此。
對於非經腸投藥,水溶性形式之活性成分(例如水溶性鹽)之水性溶液或含有黏度增加物質(例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或葡聚糖)及(需要時)穩定劑之水性注射懸浮液尤其適合。活性成分,視情況以及賦形
劑亦可呈凍乾物形式且可在非經腸投藥之前藉由添加適合之溶劑而製成溶液。
用於吸入之組成物可以氣溶膠形式、以噴霧、薄霧形式或以滴劑形式投予。氣溶膠由可用定劑量吸入器或霧化器傳遞之溶液或懸浮液製備,該定劑量吸入器或霧化器亦即為使用適合之推進劑(例如二氯二氟-甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合之氣體)以由患者吸入之霧化藥物之短脈衝形式將特定量之藥物傳遞至氣道或肺中的裝置。亦可提供用於吸入之具有適合粉末基劑(諸如乳糖或澱粉)之粉末噴霧。
滴眼劑較佳為活性成分之等張水性溶液,其包含適合之藥劑以使得組成物與淚液等張(295-305mOsm/l)。所考慮之藥劑為氯化鈉、檸檬酸、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、乙二醇、丙二醇、右旋糖及其類似物。此外,組成物包含緩衝劑,例如磷酸鹽緩衝液、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液或Tris緩衝液(參(羥甲基)-胺基甲烷)以便使pH值維持在5與8之間、較佳為7.0至7.4。組成物可進一步含有抗微生物防腐劑,例如對羥苯甲酸酯、四級銨鹽(諸如氯化苄烷銨)、聚六亞甲基雙胍(polyhexamethylene biguanidine,PHMB)及其類似物。滴眼劑可進一步含有黃原膠以產生膠狀滴眼劑,及/或其他黏度增強劑,諸如玻尿酸、甲基纖維素、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯啶酮。
人工轉錄因子在治療方法中之用途
此外,本發明係關於一種針對如上文所述之OPA1啟動子之人工轉錄因子,其用於增加OPA1產生,及用於治療受OPA1影響之疾病,尤其用於治療該等眼病。由OPA1調節之疾病為體染色體顯性視神經萎縮、加強型體染色體顯性視神經萎縮以及正常眼壓青光眼。
同樣,本發明係關於一種治療受OPA1影響之疾病的方法,其包含向有需要之患者投予治療有效量之本發明之人工轉錄因子。詳言之,本發明係
關於一種治療與正常眼壓青光眼或顯性視神經萎縮相關之神經變性的方法。本發明之人工轉錄因子之有效量視所治療之疾病特定類型及物種、其年齡、體重及個體病狀、個體藥物動力學資料及投藥方式而定。對於投藥至眼睛中,每月玻璃體注射0.5至1mg為較佳。對於全身施用,每月注射10mg/kg為較佳。另外,將緩慢釋放沈澱物移植至眼睛玻璃體中亦為較佳。
人工轉錄因子在動物中之用途
此外,本發明係關於以動物OPA1啟動子為目標之人工轉錄因子用於增強基因產物產生之用途。較佳地,將人工轉錄因子直接應用於適於表面施用於有需要之動物之組成物中。
實施例
DNA質體之選殖
對於所有選殖步驟,限制性核酸內切酶及T4 DNA連接酶購自New England Biolabs。蝦鹼性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase,SAP)來自Promega。在所有標準PCR反應中應用高保真度鉑Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。根據製造商之說明書,使用NucleoSpin Gel及PCR Clean-up套組、NucleoSpin Plasmid套組或NucleoBond Xtra Midi Plus套組(Macherey-Nagel)分離DNA片段及質體。寡聚核苷酸購自Sigma-Aldrich。新產生之質體的所有相關DNA序列均藉由測序(Microsynth)來檢驗。
用於酵母單雜交之六聚鋅指蛋白文庫之選殖
根據Gonzalez B.等人,.2010,Nat Protoc 5,791-810,經以下改良後,選殖含有GNN及/或CNN及/或ANN結合鋅指(ZF)模組之選殖六聚鋅指蛋白文庫。合成編碼GNN、CNN及ANN ZF模組之DNA序列且分別插入pUC57(GenScript)中,產生pAN1049(SEQ ID NO:64)、pAN1073(SEQ ID NO:65)及pAN1670(SEQ ID NO:66)。鋅指蛋白(ZFP)文庫之逐步組裝在pBluescript SK(+)載體中進行。為了避免在每一個別選殖步驟期間插入多個ZF模組
而產生非功能性蛋白質,pBluescript(及其含有1個ZFP、2個ZFP或3個ZFP之衍生產物)且首先將pAN1049、pAN1073或pAN1670與一種限制酶一起培育,隨後用SAP處理。在添加第二種限制酶之前使用NucleoSpin Gel及PCR Clean-up套組移除酶。
藉由用XhoI、SAP及隨後SpeI處理5μg pBluescript進行pBluescript-1ZFPL之選殖。藉由將10μg pAN1049(釋放16個不同GNN ZF模組)或pAN1073(釋放15個不同CNN ZF模組)或pAN1670(釋放15個不同ANN ZF模組)與SpeI、SAP及隨後XhoI一起培育來產生插入物。為產生pBluescript-2ZFPL及pBluescript-3ZFPL,用AgeI切割7μg pBluescript-1ZFPL或pBluescript-2ZFPL,去磷酸,且用SpeI切割。藉由分別將SpeI、SAP及隨後XmaI施用於10μg pAN1049或pAN1073或pAN1670來獲得插入物。藉由用AgeI、SAP及其後SpeI處理14μg pBluescript-3ZFPL以獲得經切割載體來進行pBluescript-6ZFPL之選殖。藉由與SpeI、SAP及隨後XmaI一起培育而自20μg pBluescript-3ZFPL釋放3ZFPL插入物。
在RT(室溫)下以20μl總體積以3:1莫耳比之插入物:載體使用200ng經切割載體、400U T4 DNA連接酶設置用於含有一個、兩個及三個ZFP之文庫的連接反應隔夜。六聚鋅指蛋白文庫之連接反應物包括200μl總體積之2000ng pBluescript-3ZFPL、500ng 3ZFPL插入物、4000U T4 DNA連接酶,將其分成十份20μl且在RT下分開培育隔夜。藉由若干方法使連接反應物之部分轉型至大腸桿菌(Escherichia coli)中,此視每一文庫所需之純系數目而定。為產生pBluescript-1ZFPL及pBluescript-2ZFPL,將3μl連接反應物直接用於大腸桿菌NEB 5-α之熱休克轉型。使用NucleoSpin Gel及PCR Clean-up套組純化pBluescript-3ZFPL之連接反應物之質體DNA且轉型至電穿孔勝任大腸桿菌NEB 5-α中(來自EquiBio之EasyjecT Plus電穿孔儀或來自Eppendorf之Multiporator,2.5kV及25μF,來自Bio-Rad之2mm電穿
孔小試管)。將pBluescript-6ZFP文庫之連接反應物施加於NucleoSpin Gel及PCR Clean-up套組且用15μl去離子水洗提DNA。將約60ng去鹽DNA與50μl NEB 10-β電穿孔勝任大腸桿菌(New England Biolabs)混合且如製造商所推薦使用EasyjecT Plus或multiporator,2.5kV、25μF及2mm電穿孔小試管進行電穿孔。對於每一文庫進行多次電穿孔且隨後直接混合細胞以增加文庫大小。熱休克轉型或電穿孔後,將SOC培養基施用於細菌且在37℃及250rpm下1小時培育後,使用30μl SOC培養物進行連續稀釋且接種於含有胺苄青黴素之LB板上。次日,測定所得文庫純系之總數。另外,每一文庫選擇十個純系以分離質體DNA且藉由限制酶消化來檢查檢查插入物之合併。對此等質體中至少三個進行測序以檢驗文庫之多樣性。將剩餘SOC培養物轉移至含有胺苄青黴素之100ml LB培養基且在37℃及250rpm下培養隔夜。使用彼等細胞製備每一文庫之質體Midi DNA。
對於酵母單雜交篩,將六聚鋅指蛋白文庫轉移至相容的獵物載體。出於該目的,藉由用XhoI/EcoRI切割載體且插入經黏接之寡聚核苷酸OAN971(TCGACAGGCCCAGGCGGCCCTCGAGGATATCATGATGACTAGTGGCCAGGCCGGCCC,SEQ ID NO:67)及OAN972(AATTGGGCCGGCCTGGCCACTAGTCATCATGATATCCTCGAGGGCCGCCTGGGCCTG,SEQ ID NO:68)來調節pGAD10(Clontech)之多個選殖位點。切割所得載體pAN1025(SEQ ID NO:69)且去磷酸,藉由XhoI/SpeI自pBluescript-6ZFPL釋放6ZFP文庫插入物。如上文所述對pBluescript-6ZFP文庫進行連接反應及電穿孔至NEB 10-β電穿孔勝任大腸桿菌中。
對於改良之酵母單雜交篩選,亦將六聚鋅指文庫轉移至改良之獵物載體pAN1375(SEQ ID NO:70)中。如下構築此獵物載體:用ApaI/NarI切割pRS315(SEQ ID NO:71)且插入經黏接之OAN1143
(CGCCGCATGCATTCATGCAGGC C,SEQ ID NO:72)及OAN1144(TGCATGAATGCATGCGG,SEQ ID NO:73),得到pAN1373(SEQ ID NO:74)。將來自pAN1025之SphI插入物連接至用SphI切割之pAN1373中以獲得pAN1375。
對於進一步改良之酵母單雜交篩選,亦將六聚鋅指文庫轉移至改良之獵物載體pAN1920(SEQ ID NO:75)中。
對於甚至進一步改良之酵母單雜交篩選,將六聚鋅指文庫插入獵物載體pAN1992(SEQ ID NO:76)中。
用於酵母單雜交篩選之誘餌質體之選殖
對於每一誘餌質體,選擇在中間含有18bp潛在人工轉錄因子目標位點之60bp序列且包括NcoI位點以用於限制分析。設計寡聚核苷酸且以該方式黏接以產生5' HindIII及3' XhoI位點,其允許直接連接至用HindIII/XhoI切割之pAbAi(Clontech)中。使用用NcoI消化並測序來證實誘餌質體之組裝。
酵母菌株及培養基
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y1H Gold購自Clontech,YPD培養基及YPD瓊脂購自CarlRoth。合成營養缺陷(SD)培養基含有20g/l葡萄糖、6.8g/l Na2HPO4.2H2O、9.7g/l NaH2PO4.2H2O(全部來自Carl Roth)、1.4g/l酵母合成營養缺陷培養基補充劑、6.7g/l酵母氮鹼、0.1g/l L-色胺酸、0.1g/l L-白胺酸、0.05g/l L-腺嘌呤、0.05g/l L-組胺酸、0.05g/l尿嘧啶(全部來自Sigma-Aldrich)。SD-U培養基含有除尿嘧啶外之所有組分,製備無L-白胺酸之SD-L。SD瓊脂板不含有磷酸鈉,但含有16g/l Bacto瓊脂(BD)。短梗黴素A(Aureobasidin A,AbA)購自Clontech。
誘餌酵母菌株之製備
以20μl之總體積用BstBI使約5μg每一誘餌質體線性化且將反應混
合物之一半直接用於釀酒酵母Y1H Gold之熱休克轉型。在轉型前一天使用酵母細胞接種5ml YPD培養基且在RT下在滾筒上生長隔夜。以1:20用新鮮YPD培養基稀釋一毫升此預培養物且在30℃、225rpm下培育2-3小時。因為每一轉型反應,藉由離心收穫1OD600細胞,將酵母細胞用1ml無菌水洗滌一次及用1ml TE/LiAc(10mM Tris/HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、100mM乙酸鋰)洗滌一次。最後,使酵母細胞再懸浮於50μl TE/LiAc中且與50μg來自鮭魚精巢之單股DNA(Sigma-Aldrich)、10μl BstBI線性化誘餌質體(參見上文)及300μl PEG/TE/LiAc(10mM Tris/HCl(pH 7.5)、1mMEDTA、100mM乙酸鋰、50%(w/v)PEG 3350)混合。在RT下將細胞及DNA在滾筒上培育20分鐘,隨後置於42℃水浴中15分鐘。最後,藉由離心作用收集酵母細胞,再懸浮於100μl無菌水中且展佈於SD-U瓊脂板上。在30℃下培育3天後,選自來自每一轉型反應之在SD-U上生長之八個純系以分析其對短梗黴素A(AbA)之敏感性。在RT下使預培養物在滾筒上生長隔夜。對於每一培養物,量測OD600且用無菌水調整為OD600=0.3。由此第一種稀釋液,用無菌水製備五種其他1:10稀釋步驟。對於每一純系,將來自每一稀釋步驟之5μl點樣於含有SD-U、SD-U 100ng/ml AbA、SD-U 150ng/ml AbA及SD-U 200ng/ml AbA之瓊脂板上。在30℃下培育3天後,選擇在SD-U上生長良好且對AbA最敏感之三個純系用於進一步分析。根據製造商之說明書,藉由Matchmaker Insert Check PCR Mix 1(Clontech)檢驗誘餌質體穩定整合至酵母基因組中。三個純系中之一者用於隨後Y1H篩。
用六聚鋅指蛋白文庫轉型誘餌酵母菌株
將約500μl酵母誘餌菌株預培養物為稀釋於1 l YPD培養基中且在30℃及225rpm下培育直至OD600=1.6-2.0(約20小時)。藉由以迴旋式轉子離心(5分鐘,1500g,4℃)收集細胞。根據Benatuil L.等人,2010,Protein Eng Des Sel 23,155-159進行電穿孔勝任細胞之製備。對於每一轉型反應,將400
μl電穿孔勝任誘餌酵母細胞與1μg編碼6ZFP文庫之獵物質體混合且在冰上培育3分鐘。將細胞-DNA懸浮液轉移至預冷卻之2mm電穿孔小試管中。進行多個電穿孔反應(EasyjecT Plus電穿孔儀或Multiporator,2.5kV及25μF)直至所有酵母細胞懸浮液均已轉型。電穿孔後,將酵母細胞轉移至100ml YPD:1M山梨糖醇之1:1混合物中且在30℃及225rpm下培育60分鐘。藉由離心收集細胞且再懸浮於1-2ml SD-L培養基中。將200μl等分試樣展佈於含有1000-4000ng/ml AbA之15cm SD-L瓊脂板上。另外,使用50μl細胞懸液製備1/100及1/1000稀釋液且將50μl未稀釋及稀釋之細胞接種於SD-L上。所有培養板均在30℃下培育3天。自具有經稀釋轉型體之培養板計算所得純系之總數。雖然具有未稀釋細胞之SD-L培養板指示所有轉型體均生長,但若獵物6ZFP成功結合於其誘餌目標位點,則含有AbA之SD-L培養板僅產生群落形成。
編碼6ZFP之獵物質體的正相互作用及回收率之檢驗
對於初始分析,自含有最高AbA濃度之SD-L培養板上挑選四十個大小良好之群落且在具有1000-4000ng/ml AbA之SD-L上將酵母細胞再劃兩次以獲得單一群落。對於每一純系,使用一個群落接種5ml SD-L培養基且在RT下使細胞生長隔夜。次日,用無菌水調整為OD600=0.3,製備五種其他1/10稀釋液且將5μl每一稀釋步驟點樣於SD-L、SD-L 500ng/ml AbA、1000ng/ml AbA、SD-L 1500ng/ml AbA、SD-L 2000ng/ml AbA、SD-L 2500ng/ml AbA、SD-L 3000ng/ml AbA及SD-L 4000ng/ml AbA培養板上。將純系根據其在高AbA濃度下生長之能力進行分級。自生長最好之純系,使用5ml初始SD-L預培養物來離心細胞且使其再懸浮於100μl水或殘餘培養基中。添加50U溶壁酶(Sigma-Aldrich,L2524)後,在37℃及300rpm下在水平震盪器上培育細胞若干小時。藉由添加10μl 20%(w/v)SDS溶液來溶解所產生之球芽,藉由渦旋有力地混合1分鐘且在-20℃下冷凍至少1小時。
隨後,添加來自NucleoSpin Plasmid套組之250μl A1緩衝液及一刮刀尖端之玻璃珠(Sigma-Aldrich,G8772)且藉由渦旋有力地混合試管1分鐘。藉由添加來自NucleoSpin Plasmid套組之250μl A2緩衝液且在RT下培育至少15分鐘,隨後繼續標準NucleoSpin Plasmid套組方案來進一步改良質體分離。用30μl洗提緩衝液洗提後,藉由熱休克轉型將5μl質體DNA轉型至大腸桿菌DH5 α中。自含有胺苄青黴素之LB培養板挑選兩個個別群落,分離質體且對文庫插入物進行測序。針對在6ZFP間每一目標位點之一致序列分析所得結果。
用於組合之分泌型螢光素酶與鹼性磷酸酶分析之OPA1基因啟動子區域之選殖
將含有OPA1啟動子區域之DNA片段選殖至pAN1485(NEG-PG04,GeneCopeia)中,產生在OPA1基因啟動子控制下之含有分泌型高斯椰屬螢光素酶之報導質體pAN1680(SEQ ID NO:77)及在組成性CMV啟動子控制下之分泌型胚胎鹼性磷酸酶,從而允許螢光素酶校正為鹼性磷酸酶信號。
用於哺乳動物轉染之人工轉錄因子之選殖
使用標準程序利用AgeI/XhoI將編碼經由Gensynthesis(GenScript)產生或藉由酵母單雜交選擇之多指鋅指蛋白之DNA片段選殖至用於在哺乳動物細胞中表現為所關注鋅指陣列、SV40 NLS、3x真菌抗原決定基標記及N末端KRAB域(pAN1255-SEQ ID NO:78)、C末端KRAB域(pAN1258-SEQ ID NO:79)、SID域(pAN1257-SEQ ID NO:80)或VP64活化域(pAN1510-SEQ ID NO:81)之間的融合蛋白之哺乳動物表現載體中。
如下產生用於產生穩定轉染之四環素誘導型細胞之質體:使用EcoRV/NotI將編碼包含多指鋅指域、調控域(N末端KRAB、C末端KRAB、SID或VP64)、SV40 NLS及3x真菌抗原決定基標記之人工轉錄因子的DNA片段選殖至pcDNA5/FRT/TO(Invitrogen)中。
細胞培養及轉染
在5% CO2、37℃下使海拉細胞在補充有4.5g/l葡萄糖、10%熱失活胎牛血清、2mM L-麩醯胺酸及1mM丙酮酸鈉(全部均來自Sigma-Aldrich)之杜科貝爾氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM)中生長。對於螢光素酶報導分子分析,將7000個海拉細胞/孔接種於96孔板中。次日,根據製造商之說明書,使用Effectene轉染試劑(Qiagen)進行共轉染。以比率3:1使用編碼人工轉錄因子及螢光素酶之質體midi製備物。在轉染後6小時小時及24小時由每孔100μl新鮮DMEM替換培養基。
Flp-In
Tm
T-Rex
TM
293表現細胞系之產生及維持
穩定的四環素誘導型Flp-InTm T-RexTM 293表現細胞系由Flp重組酶介導之整合產生。使用Flp-InTm T-RexTM Core套組,藉由轉染pFRT/lacZeo目標位點載體及pcDNA6/TR載體來產生Flp-InTm T-RexTM宿主細胞系。為了產生誘導型293表現細胞系,經由Flp重組酶介導之DNA重組在Flp-InTm T-RexTM宿主細胞系中之FRT位點處整合含有所關注基因之pcDNA5/FRT/TO表現載體。在含有(DMEM;10% Tet-FBS;2mM麩醯胺酸;15μg/ml殺稻瘟菌素(blasticidine)及100μg/ml潮黴素)之選擇培養基中維持穩定的Flp-InTm T-RexTM表現細胞系。為了誘導基因表現,添加四環素至1μg/ml之最終濃度。
組合之螢光素酶/SEAP啟動子活性分析
用人工轉錄因子表現構築體及運載在OPA1啟動子控制下之分泌型高斯椰屬螢光素酶及在組成性CMV啟動子控制下之分泌型鹼性磷酸酶之質體(高斯椰屬螢光素酶發熱分析套組,Pierce;SEAP報導基因分析化學發光,Roche)共轉染海拉細胞。轉染後兩天,收集細胞培養物上清液且分別使用高斯椰屬螢光素酶發熱分析套組(Thermo Scientific)或SEAP報導基因分析
(Roche)量測螢光素酶活性及SEAP活性。用於鋅指域中之所有半胱胺酸均交換為絲胺酸殘基之非活性人工轉錄因子的表現質體之共轉染用作對照組。將螢光素酶活性校正為SEAP活性且表示為對照組之百分比。
藉由定量RT-PCR測定基因表現量
根據製造商之說明書,使用RNeasy Plus Mini套組(Qiagen,Hilden,Germany)自細胞分離總RNA。將冷凍之細胞集結粒再懸浮於含有10μl/ml β-巰基乙醇之RLT Plus Lysis緩衝液中。使用QIAshredder離心柱均質化後,將總溶解產物轉移至gDNA Eliminator離心柱以消除基因組DNA。添加一體積之70%乙醇且將總溶解產物轉移至RNeasy離心柱。若干個洗滌步驟後,用最終容積為30μl之無RNA酶(RNase)水洗提RNA。將RNA儲存於-80℃下直至進一步使用。根據製造商之說明書,使用高容量cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems,Branchburg,New Jersey,USA)進行cDNA之合成。以含有2μl 10×緩衝液、0.8μl 25×dNTP混合物、2μl 10×RT隨機引子、1μl Multiscribe反轉錄酶及4.2μl H2O之20μl總反應體積進行cDNA合成。添加最終體積為10μl之RNA且在以下條件下進行反應:在25℃下10分鐘、隨後在37℃下2小時及最後一步在85℃下5分鐘。以含有1μl 20×TaqMan Gene Expression Master混合物、10.0μl TaqMan® Universal PCR Master混合物(兩者皆來自Biosystems,Branchburg,New Jersey,USA)及8μl H2O之20μl總反應體積進行定量PCR。對於每一反應,添加1μl cDNA。使用ABI PRISM 7000序列偵測系統(Applied Biosystems,Branchburg,New Jersey,USA))在以下條件下進行qPCR:起始步驟為在50℃下2分鐘,隨後在95℃下第一次變性10分鐘及由在95℃下15秒及在60℃下1分鐘之40個循環組成之另一步驟。
用於細菌表現之人工轉錄因子的選殖
使用標準程序用EcoRV/NotI將編碼人工轉錄因子之DNA片段選殖至基
於pET41a+(Novagen)之細菌表現載體pAN983(SEQ ID NO:82)中以用於在大腸桿菌中表現為人工轉錄因子與TAT蛋白轉導域之間的His6標記融合蛋白。
在適合之大腸桿菌宿主細胞(諸如以OPA1為目標之BL21(DE3))中用於細菌性產生可轉導人工轉錄因子之表現構築體為pAN1964(SEQ ID NO:83)、pAN2053(SEQ ID NO:84)、pAN2055(SEQ ID NO:85)、pAN2057(SEQ ID NO:86)、pAN2059(SEQ ID NO:87)、pAN2061(SEQ ID NO:88)及pAN2063(SEQ ID NO:89)。
人工轉錄因子蛋白之產生
使用用於特定人工轉錄因子之表現質體轉型之大腸桿菌BL21(DE3)在補充有100μM ZnCl2之1 l LB培養基中生長直至達到0.8與1之間的OD600,且誘導用1mM IPTG誘導兩小時。藉由離心收穫細菌,藉由音波處理來製備細菌溶解產物,且純化包涵體。為此,藉由離心收集(5000g,4℃,15分鐘)包涵體且在20ml結合緩衝液(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM咪唑;pH 7.5)中洗滌三次。在冰上在30ml結合緩衝液A(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM咪唑、6M GuHCl;pH 7.5)中溶解經純化之包涵體一小時。在4℃及13'000g下離心溶解之包涵體40分鐘且經由0.45μm PVDF過濾器過濾。使用His-Trap管柱陷阱管柱在Äktaprime FPLC(gehealthcare)上使用結合緩衝液A及洗提緩衝液B(50mM HEPES、500mM NaCl、500mM咪唑、6M GuHCl;pH 7.5)純化His標記之人工轉錄因子。混合含有經純化之人工轉錄因子的洗提份且在4℃下在含有SID域之人工轉錄因子的情況下針對緩衝液S(50mM Tris-HCl、500mM NaCl、200mM精胺酸、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50%甘油;pH 7.5),或針對用於含有KRAB域之人工轉錄因子之緩衝液K(50mM Tris-HCl、300mM NaCl、500mM精胺酸、100μM ZnCl2、5mMGSH、0.5mM GSSG、50%甘油;pH 8.5)透析
隔夜。透析後,在4℃下以14'000rpm離心蛋白質樣品30分鐘且使用0.22μm Millex-GV過濾型吸管尖(Millipore)無菌過濾。對於含有VP64活化域之人工轉錄因子,根據製造商之推薦,使用His-Bond Ni-NTA樹脂(Novagen),由可溶性組分(結合緩衝液:50mM NaPO4(pH 7.5)、500mM NaCl、10mM咪唑;洗提緩衝液:50mM HEPES(pH 7.5)、500mM NaCl、500mM咪唑)產生蛋白質。針對VP64-緩衝液(550mM NaCl(pH 7.4)、400mM精胺酸、100μM ZnCl2)透析蛋白質。
使用ELDIA(酶聯DNA相互作用分析)測定人工轉錄因子之DNA結合活性
用洗滌緩衝液(25mM Tris/HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween-20)洗滌BSA預阻斷塗鎳培養板(Pierce)3次。在儲存緩衝液中在飽和條件(每孔50pmol)下用經純化之人工轉錄因子塗佈培養板且在RT下在輕微震動下培育1小時。3個洗滌步驟後,在RT下,在結合緩衝液(10mM Tris/HCl(pH 7.5)、60mM KCl、1mM DTT、2%甘油、5mM MgCl2及100μM ZnCl2)中,在非特異性競爭者(0.1mg/ml來自鮭魚精液之單股DNA,Sigma)存在下,將1×10-12至5×10-7個含有60bp啟動子序列之經黏接的生物素化寡聚物與結合人工轉錄因子一起培育1小時。洗滌(5次)後,在RT下用3% BSA阻斷各孔30分鐘。在RT下添加含抗-抗生蛋白鏈菌素-HRP之結合緩衝液持續1小時。5個洗滌步驟後,添加TMB受質(Sigma)且在RT下培育2至30分鐘。藉由添加TMB終止溶液(Sigma)來終止反應且在450nM下讀取樣品消減。根據Hill,使用Sigma Plot v8.1進行配位體結合動力學之資料分析。
蛋白質轉導
用0.01至1μM人工轉錄因子處理生長至約80%融合之細胞或模擬處理2小時至120小時,其中在37℃下每24小時在OptiMEM或生長培養基
中隨意添加人工轉錄因子。視情況,將10-500μM ZnCl2添加至生長培養基中。對於免疫螢光,用PBS洗滌細胞一次,經胰蛋白酶作用且接種於玻璃蓋片上以作進一步分析。
免疫螢光
用4%多聚甲醛固定細胞,用0.15% Triton X-100處理15分鐘,用10% BSA PBS阻斷且與小鼠抗-HA抗體(1:500,H9658,Sigma)或小鼠抗-真菌劑(1:500,M5546,Sigma)一起培育隔夜。用PBS/1% BSA洗滌樣品三次,且與偶合於Alexa Fluor 546(1:1000,Invitrogen)之山羊抗-小鼠抗體一起培育,且使用DAPI(1:1000之1mg/ml,3分鐘,Sigma)進行對比染色。使用螢光顯微術分析樣品。
西方墨點法(Western blotting)
為了量測蛋白質含量,使用RIPA緩衝液(Pierce)溶解細胞且將蛋白質溶解產物與Laemmli樣品緩衝液混合。藉由SDS-PAGE,根據其大小分離蛋白質且使用電墨點法(electroblotting)轉移至硝化纖維膜。使用小鼠或兔中產生之特異性初級抗體進行蛋白質之偵測。藉由偶合於辣根過氧化酶之次級抗體及基於發光之偵測(ECL plus,Pierce)或使用紅外鐳射掃描器偵測及定量之偶合於DyLight700或DyLight800螢光之次級抗體進行初級抗體之偵測。
量測粒線體功能
對於流動式細胞測量術分析,用10mM EDTA/PBS收穫經處理之細胞。使用經模擬處理之細胞作為對照組。為了量測粒線體膜電位,使細胞再懸浮於FACS緩衝液P(PBS、5mM EDTA、0.5%(w/v)BSA、1μg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI,Sigma)、10nM四甲基若丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethylester,TMRE,Sigma))中且在37℃下培育30分鐘,隨後進行分析。用50μM羰基氰化物3-氯苯基腙(CCCP,Sigma)處理以
耗散粒線體膜電位用作對照組。為了量測粒線體質量,使細胞再懸浮於FACS緩衝液M(PBS、5mM EDTA、0.5%(w/v)BSA、1μg/ml DAPI及100nM MitoTracker green FM(Invitrogen))中且在37℃下培育30分鐘,隨後進行分析。對於粒線體ROS量測,使細胞再懸浮於FACS緩衝液R(PBS、5mM EDTA、0.5% BSA、1μg/ml DAPI及5μM MitoSOX(Invitrogen))中,在37℃下培育10分鐘,用PBS洗滌,且再懸浮於FACS緩衝液R2(PBS、5mM EDTA、0.5%(w/v)BSA)中。使用FlowJo軟體(Tree Star公司)對CyAnADP(Dako)進行流動式細胞測量術分析。
量測細胞凋亡誘導
在RT下用含4% EM等級多聚甲醛(Pierce,28908)之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)固定細胞30分鐘。隨後,在RT下用含0.15%(v/v)Triton X-100之PBS對細胞進行可滲透化處理15分鐘,隨後在RT下用含10%(w/v)BSA之PBS阻斷1小時。在4℃下將樣品與用阻斷緩衝液稀釋之小鼠抗-細胞色素c抗體(BD Biosciences,5564321:1000)一起培育隔夜。用阻斷緩衝液洗滌細胞三次持續15分鐘,接著在RT下與結合Alexa Fluor 546之山羊抗-小鼠IgG抗體(Invitrogen)一起培育1小時。藉由螢光顯微術,由不知情觀察者分析作為細胞凋亡之度量的細胞色素c釋放。經模擬處理之細胞用作對照組。
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<223> 合成構築體
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<221> 雜項特徵
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Claims (21)
- 一種人工轉錄因子,其包含與活化性蛋白質域及核定位序列融合之特異性以OPA1基因啟動子為目標之多指(polydactyl)鋅指蛋白。
- 如申請專利範圍第1項之人工轉錄因子,其進一步包含蛋白轉導域。
- 如申請專利範圍第1項之人工轉錄因子,其包含六聚鋅指蛋白。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之人工轉錄因子,其中該活化性蛋白質域為SEQ ID NO:1之VP16、SEQ ID NO:2之VP64、SEQ ID NO:3之CJ7、SEQ ID NO:4之p65TA1、SEQ ID NO:5之SAD、SEQ ID NO:6之NF-1、SEQ ID NO:7之AP-2、SEQ ID NO:8之SP1-A、SEQ ID NO:9之SP1-B、SEQ ID NO:10之Oct-1、SEQ ID NO:11之Oct-2、SEQ ID NO:12之Oct2-5x、SEQ ID NO:13之MTF-1、SEQ ID NO:14之BTEB-2或SEQ ID NO:15之LKLF。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之人工轉錄因子,其中該核定位序列為含有K-K/R-X-K/R一致序列之鹼性胺基酸叢集或SEQ ID NO:62之SV40 NLS。
- 如申請專利範圍第2項之人工轉錄因子,其中該蛋白轉導域為SEQ ID NO:16之HIV衍生TAT肽、SEQ ID NO:18之合成肽mT02、SEQ ID NO:19之合成肽mT03、SEQ ID NO:20之R9肽或SEQ ID NO:21之ANTP域。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之人工轉錄因子,其包含選自由SEQ ID NO:26至43組成之群的蛋白質序列之鋅指蛋白。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之人工轉錄因子,其進一步包含聚乙二醇殘基。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之人工轉錄因子。
- 一種核酸,其編碼如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之人工轉錄因子。
- 一種載體,其包含如申請專利範圍第10項之核酸。
- 如申請專利範圍第11項之載體,其為病毒載體。
- 一種宿主細胞,其包含如申請專利範圍第11項或第12項之載體。
- 一種如申請專利範圍第13項之大腸桿菌(E.coli)宿主細胞,其含有SEQ ID NO:83至89之表現構築體。
- 一種病毒載劑,其包含如申請專利範圍第10項之核酸。
- 如申請專利範圍第15項之病毒載劑,其選自由以下組成之群:腺相關病毒、反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、假型腺相關病毒、假型反轉錄病毒、假型慢病毒及假型腺病毒。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第15項或第16項之病毒載劑。
- 一種用於增加自OPA1基因啟動子的表現之如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之人工轉錄因子。
- 一種用於增加自OPA1基因啟動子的表現之如申請專利範圍第10項之核酸。
- 一種用於治療體染色體顯性萎縮、加強型體染色體顯性萎縮(autosomal dominant atrophy plus)及青光眼之如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之人工轉錄因子。
- 一種用於治療體染色體顯性萎縮、加強型體染色體顯性萎縮及青光眼之如申請專利範圍第10項之核酸。
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