TW201514201A

TW201514201A - 調控核受體之人工轉錄因子及其治療用途

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Publication number: TW201514201A
Application number: TW103112112A
Authority: TW
Inventors: Albert Neutzner; Josef Flammer; Alice Huxley
Original assignee: Aliophtha Ag
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2014-04-01
Publication date: 2015-04-16
Also published as: AR095984A1; WO2014161884A3; WO2014161884A2; US20160046681A1; JP2016515597A; EP2981549A2

Abstract

本發明係關於一種人工轉錄因子，其包含與抑制性或活化性蛋白質域、核定位序列及蛋白轉導域融合之特異性以核受體基因之啟動子區域為目標之多指鋅指蛋白。在特定實例中，核受體基因之此等啟動子區域調節糖皮質激素受體、雄激素受體或雌激素受體ESR1之表現。針對該糖皮質激素受體之人工轉錄因子適用於治療由糖皮質激素調節之疾病，諸如發炎性過程、糖尿病、肥胖症、冠狀動脈病、哮喘、乳糜瀉及紅斑狼瘡。針對該雄激素受體之人工轉錄因子適用於治療由睪固酮調節之疾病，諸如各種癌症、冠狀動脈病、代謝失調(諸如肥胖症或糖尿病)或情感障礙(諸如精神分裂症、抑鬱症或注意力不足過動症)。針對該雌激素受體之人工轉錄因子適用於治療由雌激素調節之疾病，諸如各種癌症、心血管疾病、骨質疏鬆症或情感障礙。

Description

調控核受體之人工轉錄因子及其治療用途

本發明係關於人工轉錄因子，其包含與抑制性或活性域、核定位序列及蛋白轉導域融合之特異性以核受體基因之啟動子區域為目標之多指鋅指蛋白，及其於治療由該等核受體之活性引起或調節之疾病中的用途。

人工轉錄因子(artificial transcription factor，ATF)被提議為適用於調控基因表現之工具(Sera T.,2009,Adv Drug Deliv Rev 61,513-526)。經由抑制或活化基因轉錄而影響表現之許多天然存在之轉錄因子具有用於識別特定DNA序列之複雜的特異性域。若意欲調節其特異性且以基因為目標，則此使其成為無吸引力的操作目標。然而，一類特定轉錄因子含有若干個所謂的鋅指(zinc finger，ZF)域，其為模組化的且因此有助於遺傳工程改造。鋅指為以幾乎獨立的三個DNA鹼基對為目標的短(30個胺基酸)DNA結合基元。因此含有融合在一起之若干個鋅指的蛋白質能夠識別較長DNA序列。六聚鋅指蛋白(zinc finger protein，ZFP)識別18個鹼基對(bp)DNA目標，其在整個人類基因組中幾乎為唯一的。最初認為是完全情境獨立的，更多深入分析揭露對於鋅指之某種情境特異性(Klug A.,2010,Annu Rev Biochem 79,213-231)。使鋅指識別表面中之某些胺基酸突變，改變ZF模組之結合特異性產生為5'-GNN-3'、5'-CNN-3'、5'-ANN-3'及一些5'-TNN-3'密碼子中之大部分所定義之ZF構建嵌段(例如所謂的巴巴斯模組(Barbas module)，參見Gonzalez B.,2010,Nat Protoc 5,791-810)。雖然對人工轉錄因子之早期工作集中於基於將預選鋅指與已知3bp目標序列組合之合理設計，但鋅指之某種情境特異性的實現需要產生大的鋅指文庫，使用諸如細菌或酵母單雜交、噬菌體呈現、隔室化核糖體呈現或使用FACS分析之活體內選擇之先進方法來查詢該等文庫。

使用該等人工鋅指蛋白，可以高特異性以人類基因組中之DNA基因座為目標。因此，此等鋅指蛋白為將具有轉錄調控活性之蛋白質域運輸至特定啟動子序列，從而使得所關注基因之表現得到調控的理想工具。適於轉錄沉默之域為作為N末端(SEQ ID NO：1)或C末端(SEQ ID NO：2)KRAB域之Krueppel相關域(Krueppel-associated domain，KRAB)、Sin3相互作用域(SID，SEQ ID NO：3)及ERF抑制蛋白域(ERD，SEQ ID NO：4)，而基因轉錄之活化經由疱疹病毒單純形VP16(SEQ ID NO：5)或VP64(VP16之四聚重複，SEQ ID NO：6)域來達成(Beerli R.R.等人，1998,Proc Natl Acad Sci USA 95,14628-14633)。認為賦予轉錄活化之其他域為CJ7(SEQ ID NO：7)、p65-TA1(SEQ ID NO：8)、SAD(SEQ ID NO：9)、NF-1(SEQ ID NO：10)、AP-2(SEQ ID NO：11)、SP1-A(SEQ ID NO：12)、SP1-B(SEQ ID NO：13)、Oct-1(SEQ ID NO：14)、Oct-2(SEQ ID NO：15)、Oct-2_5x(SEQ ID NO：16)、MTF-1(SEQ ID NO：17)、BTEB-2(SEQ ID NO：18)及LKLF(SEQ ID NO：19)。另外，認為由基因本體論GO：0001071(http：//amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term_details？term=GO：0001071)定義之蛋白質之轉錄活性域達成目標蛋白質之轉錄調控。包含經工程改造之鋅指蛋白以及調控域之融合蛋白被稱為人工轉錄因子。

雖然由於特定特點之高保守，小分子藥並不總是能夠選擇性地以特定蛋白質家族之某一成員為目標，但基於天然存在或經工程改造之蛋白質之生物製品提供如所示對於基於抗體之新穎藥之良好特異性。然而，迄今為止，幾乎所有生物製品均在細胞外起作用。尤其上文所提及之人工轉錄因子將適於以治療上有用之方式影響基因轉錄。然而，將該等因子傳遞至作用位點(核)並不容易達成，因此阻礙了治療性人工轉錄因子方法之可用性，例如藉由依靠反轉錄病毒傳遞，其具有此方法之所有缺點，諸如免疫原性及細胞轉型潛力(Lund C.V.等人，2005,Mol Cell Biol 25,9082-9091)。

顯示所謂的蛋白轉導域(protein transduction domain，PTD)促進蛋白質跨越質膜位移至胞質液/核質中。顯示諸如HIV衍生TAT肽(SEQ ID NO：20)等短肽誘導貨物蛋白質之細胞類型獨立性大吞飲泡攝取(Wadia J.S.等人，2004,Nat Med 10,310-315)。在到達胞質液時，顯示融合蛋白具有生物活性。有趣的是，甚至錯誤摺疊之蛋白質可在蛋白質轉導後很可能經由細胞內伴侶蛋白之作用變得具有功能。

核受體為配位體活化之轉錄因子的蛋白質超家族。不同於大多數其他細胞膜錨定受體，其為定位於胞質液或核質之可溶性蛋白質。在配位體結合及隨後二聚化時，核受體能夠經由DNA結合及基因表現之調節來充當轉錄因子。核受體之配位體為親脂性分子，尤其為類固醇及甲狀腺激素、脂肪酸及膽汁酸、視黃酸、維生素D3及前列腺素(McEwan I.J.,Methods in Molecular Biology：The Nuclear Receptor Superfamily,505,3-17)。在配位體結合時，核受體二聚化，由此觸發與配位體反應性基因啟動子內之特定轉錄因子特異性DNA反應元件內部結合，從而引起基因表現之活化或抑制。假定核受體負責調控許多廣泛作用激素(諸如類固醇)及重要代謝產物之活性，核受體之錯誤功能及機能障礙與許多病症之自然史有關。

將使用促效劑或拮抗劑調控核受體之活性用於治療性目的。使用諸如促效性地塞米松(dexamethasone)之皮質類固醇調控糖皮質激素受體(GR)功能為用於影響發炎性疾病之常見臨床實踐。核受體活性之另一調控以口服避孕藥來例示，其中使用雌激素受體(ESR1/ER)及孕酮受體之活化來防止女性卵子受精。在另一個實例中，使用諸如氟他胺(flutamide)或比卡魯胺(bicalutamide)之抗雄激素阻斷雄激素受體(AR)證明適用於治療AR依賴性前列腺癌。此外，藉由阻斷雌激素合成及因此雌激素之可用性來阻斷雌激素受體為女性乳癌或男性之男性乳腺增生之標準療法。

本發明係關於一種人工轉錄因子，其包含與抑制性或活化性蛋白質域、核定位序列及蛋白轉導域融合之特異性以核受體基因之啟動子區域為目標之多指鋅指蛋白，及包含該人工轉錄因子之醫藥組成物。此外，本發明係關於該等人工轉錄因子用於調節細胞對核受體配位體之反應及治療藉由特定效應物與該等核受體之結合調節之疾病的用途。

在一特定具體實例中，核受體基因之啟動子區域為雄激素受體啟動子(SEQ ID NO：21)。在此特定具體實例中，本發明係關於一種以雄激素受體啟動子為目標之人工轉錄因子，其用於影響細胞對睪固酮之反應，用於降低或增加雄激素受體含量，及用於治療由睪固酮調控之疾病。同樣，本發明係關於一種治療由睪固酮調控之疾病的方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量之以雄激素受體啟動子為目標的本發明之人工轉錄因子。

在另一特定具體實例中，核受體基因之啟動子區域為雌激素受體啟動子(SEQ ID NO：22)。在此特定具體實例中，本發明係關於以雌激素受體啟動子為目標之該人工轉錄因子，其用於影響細胞對雌激素之反應，用於降低或增加雌激素受體含量，及用於治療由雌激素調控之疾病。同樣，本發明係關於一種治療由雌激素調控之疾病的方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量之以雌激素受體啟動子為目標的本發明之人工轉錄因子。

在另一特定具體實例中，核受體基因之啟動子區域為糖皮質激素受體啟動子(SEQ ID NO：21)。在此特定具體實例中，本發明係關於一種以糖皮質激素受體啟動子為目標之人工轉錄因子，其用於影響細胞對糖皮質激素之反應，用於降低或增加糖皮質激素受體含量，及用於治療由糖皮質激素調控之疾病，尤其用於治療由糖皮質激素調控之眼病。同樣，本發明係關於一種治療由糖皮質激素調控之疾病的方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量之以糖皮質激素受體啟動子為目標的本發明之人工轉錄因子。

本發明進一步係關於編碼本發明之人工轉錄因子的核酸，包含此等核酸之載體，及包含該等載體之宿主細胞。

圖1：使用可轉導人工轉錄因子調控基因表現

藉由蛋白轉導域(protein transduction domain，PTD)(諸如TAT或其他域)之作用將含有與抑制性/活性域(RD=調控域)以及核定位序列(NLS)融合之特異性以核受體基因(G)之啟動子(P)區域為目標之六聚鋅指(ZF) 蛋白的人工轉錄因子運輸至細胞中。視轉錄調控域而定，受體基因表現增加(+)或抑制(-)，導致核受體(NR)之表現增強或減弱及因此細胞對核受體配位體(L)之反應增強或減弱。

圖2：人類糖皮質激素受體啟動子及人工轉錄因子目標位點

展示糖皮質激素受體啟動子之5'未轉譯區域(SEQ ID NO：21)。突出本發明之人工轉錄因子的轉錄起始位點(標記為粗體，位置707)及三個結合位點(加下劃線)。

圖3：人類雄激素受體啟動子及人工轉錄因子目標位點

展示雄激素受體啟動子之5'未轉譯區域(SEQ ID NO：22)。突出本發明之人工轉錄因子的轉錄起始位點(標記為粗體，位置768)及四個結合位點(加下劃線)。

圖4：人類雌激素受體啟動子及人工轉錄因子目標位點

展示雌激素受體啟動子之5'未轉譯區域(SEQ ID NO：23)。突出本發明之人工轉錄因子的轉錄起始位點(標記為粗體，位置960)及三個結合位點(加下劃線)。

圖5：在螢光素酶報導分子分析中AR4 rep能夠抑制基因表現

在OptiMEM培養基中用1μm AR4rep處理含有由在雜交CMV/AR_TS4啟動子控制下之高斯椰屬(Gaussia)螢光素酶以及在組成性CMV啟動子控制下之分泌型鹼性磷酸酶組成之報導分子構築體的HEK 293 FlpInTRex細胞2小時。用無關人工轉錄因子ATFControl(SEQ ID NO：24)處理用作對照組(標記為c)。在AR4rep處理後24小時量測螢光素酶以及分泌型鹼性磷酸酶。校正為分泌型鹼性磷酸酶之螢光素酶活性表示為以對照組之百分比計的相對螢光素酶活性(RLA)。使用雙尾、未配對的學生t檢驗(Student's t-test)分析統計顯著性。P值<0.01以**標記。

本發明係關於一種人工轉錄因子，其包含與抑制性或活化性蛋白質域、核定位序列及蛋白轉導域融合之特異性以核受體基因之啟動子區域為目標之多指鋅指蛋白，及包含該人工轉錄因子之醫藥組成物。

與錨定膜且包含或含有跨膜蛋白之幾乎所有其他細胞受體相反，核受體為在一個多肽中併有配位體結合及轉錄因子活性之可溶性蛋白。核受體定位於胞質液或核質，其中其在配位體結合時活化，二聚化且變成調控一系列巨大轉錄程式之活性轉錄因子。不同於上文所提及之結合細胞外之配位體且將信號轉導穿過質膜至細胞中的膜錨定受體，核受體結合能夠穿過質膜以接近其同源受體之親脂性配位體。另外，在達成所欲細胞結果之前，大多數膜結合受體依靠複雜的信號放大機制。另一方面，核受體直接將配位體結合轉化為細胞反應。

許多疾病之治療基於調控核受體信號傳導。實例為糖皮質激素活化糖皮質類固醇受體之發炎過程、雄激素受體之拮抗劑具有有益治療作用之前列腺癌或阻斷雌激素受體信號傳導證明有用之乳癌。傳統上，出於治療目的，使用核受體促效劑或拮抗劑形式之小分子來影響受體信號傳導。然而，核受體信號傳導亦可受核受體蛋白表現之直接調控影響，且該調控為本發明之本題。

本發明中所考慮之核受體為由以下人類基因編碼之人類核受體：AR、ESR1、ESR2、ESRRA、ESRRB、ESRRG、HNF4A、HNF4G、NR0B1、NR0B2、 NR1D1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、PPARA、PPARD、PPARG、RARA、RARB、RARG、RORA、RORB、RORC、RXRA、RXRB、RXRG、THRA、THRB及VDR。

另外考慮由與所提及之人類核受體基因有關之基因編碼之非人類核受體，例如豬、馬、牛、貓、犬或鼠轉錄因子。

根據目前技術水平，使用病毒轉導完成人工轉錄因子之細胞內表現。病毒載體具有格外高的免疫原性潛力，由此限制其在某種治療之重複應用中之使用。由於鋅指模組之高保守，根據本發明之人工轉錄因子的應用，該免疫反應將為微小的或不存在，或可藉由總體結構之小變化而避免或進一步減至最少，從而消除免疫原性，同時仍保留目標位點結合及由此保留功能。此外，認為用聚乙二醇修飾本發明之人工轉錄因子可減少免疫原性。另外，將本發明之人工轉錄因子施用於免疫特權器官(諸如眼睛及腦)將避免任何免疫反應，且誘導對人工轉錄因子之全身耐受性。為了治療免疫特權器官外之慢性疾病，考慮經由先前眼內注射誘導免疫耐受性。

傳統上用作治療劑混合物之幾類小分子並不適於以基因表現之調節為目標。因此，許多有前途的藥物目標及相關疾病並不適合典型藥物方法。此對於認視不可製成藥物之轉錄因子而言尤其如此。相比之下，本發明之人工轉錄因子均屬於具有高度定義總組成之同一物質類別。以兩種非常不同的啟動子序列為目標之兩種基於六聚鋅指蛋白之人工轉錄因子仍具有85%之最小胺基酸序列一致性及總體類似三級結構，且可經由標準化方法 (如下文所述)以快速且經濟的方式產生。因此，本發明之人工轉錄因子將對於一組廣泛且不同的目標之格外高特異性與總體類似組成組合在一類分子中。另外，將本發明之人工轉錄因子調配至藥物中可依靠先前經驗，從而進一步加快藥物開發過程。

蛋白轉導域(PTD)介導之人工轉錄因子之細胞內傳遞為以新穎方式利用生物製品之高選擇性以受體分子為目標之新方式。雖然習知藥物調節某些受體之活性，但人工轉錄因子改變此等蛋白質之可用性。且因為人工轉錄因子經定製以特異性作用於該等受體基因之啟動子區域，所以本發明允許選擇性地以密切相關蛋白質為目標。此僅基於密切相關蛋白質之啟動子區域的寬鬆保守。蛋白轉導域介導之人工轉錄因子傳遞適用於調節細胞核受體配位體之反應。

所考慮之蛋白轉導域為HIV TAT、肽mT02(SEQ ID NO：25)、肽mT03(SEQ ID NO：26)、R9肽(SEQ ID NO：27)、ANTP域(SEQ ID NO：28)或能夠運輸貨物穿過質膜之其他肽。

本發明亦關於該等人工轉錄因子於治療藉由核受體配位體與核受體之結合調節之疾病中的用途，其中多指鋅指蛋白特異性以核受體基因之啟動子區域為目標。同樣，本發明係關於一種治療疾病之方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量之人工轉錄因子，其中該待治療之疾病藉由特定效應物與核受體之結合調節，其中多指鋅指蛋白特異性以受體基因啟動子為目標。

所考慮之多指鋅指蛋白為四聚、五聚、六聚或七聚鋅指蛋白。「四聚」、「五聚」、「六聚」及「七聚」意謂鋅指蛋白分別由四、五、六及七個部分蛋白質結構組成，其中每一者對於特定核苷酸三聯體具有結合特異性。較佳地，人工轉錄因子包含六聚鋅指蛋白。

特定啟動子區域內之目標位點的選擇

目標位點選擇對於成功產生功能性人工轉錄因子至關重要。對於活體內調節核受體基因表現之人工轉錄因子，其必須在核受體基因之基因組環境下結合其目標位點。此需要DNA目標位點之可接近性，意謂區域中之染色體DNA未在組蛋白周圍緊密包裹為核小體且(諸如甲基化)DNA修飾不會干擾人工轉錄因子結合。雖然人類基因組之大部分緊密包裹且無轉錄活性，但主動轉錄基因之轉錄起始位點(-1000至+200bp)的附近對於內源性轉錄因子及轉錄機構(諸如RNA聚合酶)必須為可接近的。因此，選擇任何特定目標基因之此區域中之目標位點將大大提高產生具有所需活體內功能之人工轉錄因子的成功率。

人類糖皮質激素、雄激素及雌激素受體基因啟動子內之目標位點的選擇

針對具有(G/C/ANN)₆之一般組成的潛在18bp目標位點之存在分析包含包括人類糖皮質激素、雄激素及雌激素受體開放閱讀框(圖2、3及4)之轉錄起始位點之1000bp的啟動子區域，其中G為核苷酸鳥嘌呤，C為核苷酸胞嘧啶，A為核苷酸腺嘌呤且N代表四種核苷酸鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及胸腺嘧啶中之每一者。基於相對於轉錄起始位點之位置選擇每一啟動子中之三至四個目標位點。存在於糖皮質激素受體基因啟動子中之目標位點為GR_TS1(SEQ ID NO：29)、GR_TS2(SEQ ID NO：30)、GR_TS3(SEQ ID NO：31)，存在於雄激素受體中之目標位點為AR_TS1(SEQ ID NO：32)、 AR_TS2(SEQ ID NO：33)、AR_TS3(SEQ ID NO：34)及AR_TS4(SEQ ID NO：35)。雌激素受體基因啟動子中所鑑別之目標位點為ER_TS1(SEQ ID NO：36)、ER_TS2(SEQ ID NO：37)及ER_TS3(SEQ ID NO：38)。亦考慮選自轉錄起點上游2000bp之糖皮質激素受體、雌激素受體及雄激素受體之調控區域的具有一般組成(G/C/ANN)₅及(G/C/ANN)₆之目標位點。

以糖皮質激素受體啟動子為目標之可轉導人工轉錄因子

特定六聚鋅指蛋白由使用ZiFit軟體v3.3(Sander J.D.,Nucleic Acids Research 35,599-605)之所謂巴巴斯鋅指模組設置(Gonzalez B.,2010,Nat Protoc 5,791-810)構成。為了產生以糖皮質激素受體為目標之活性可轉導人工轉錄因子，使六聚鋅指蛋白以GR_TS1為目標之ZFP-GR1(SEQ ID NO：39)、以GR_TS2為目標之ZFP-GR2(SEQ ID NO：40)及以GR_TS3為目標之ZFP-GR3(SEQ ID NO：41)與蛋白轉導域TAT以及轉錄活化域VP64融合，得到人工轉錄因子GR1akt(SEQ ID NO：42)、GR2akt(SEQ ID NO：43)及GR3akt(SEQ ID NO：44)。為了產生具有負調控活性之可轉導人工轉錄因子，使六聚鋅指蛋白ZFP-GR1至ZFP-GR3與蛋白轉導域TAT以及轉錄抑制域KRAB融合，得到人工轉錄因子GR1rep(SEQ ID NO：45)、GR2rep(SEQ ID NO：46)及GR3rep(SEQ ID NO：47)。

以雄激素受體啟動子為目標之可轉導人工轉錄因子

特定六聚鋅指蛋白由使用ZiFit軟體v3.3之所謂巴巴斯鋅指模組設置構成。使用酵母單雜交篩選選擇以AR啟動子為目標之其他鋅指蛋白。為了產生以雄激素受體為目標之活性可轉導人工轉錄因子，使六聚鋅指蛋白以AR_TS1為目標之ZFP-AR1(SEQ ID NO：48)、以AR_TS2為目標之ZFP-AR2 (SEQ ID NO：49)、以AR_TS3為目標之ZFP-AR3(SEQ ID NO：50)及以AR_TS4為目標之ZFP-AR4(SEQ ID NO：51)、ZFP-AR5(SEQ ID NO：52)及ZFP-AR6(SEQ ID NO：53)與蛋白轉導域TAT以及轉錄活化域VP64融合，得到人工轉錄因子AR1akt(SEQ ID NO：54)、AR2akt(SEQ ID NO：55)、AR3akt(SEQ ID NO：56)、AR4akt(SEQ ID NO：57)、AR5akt(SEQ ID NO：58)及AR6akt(SEQ ID NO：59)。為了產生具有負調控活性之可轉導人工轉錄因子，使六聚鋅指蛋白ZFP-AR1至ZFP-AR6與蛋白轉導域TAT以及轉錄抑制域SID融合，得到人工轉錄因子AR1rep(SEQ ID NO：60)、AR2rep(SEQ ID NO：61)、AR3rep(SEQ ID NO：62)、AR4rep(SEQ ID NO：63)、AR5rep(SEQ ID NO：64)及AR6rep(SEQ ID NO：65)。

以雌激素受體啟動子為目標之可轉導人工轉錄因子

特定六聚鋅指蛋白由使用ZiFit軟體v3.3之所謂巴巴斯鋅指模組設置構成。為了產生以雌激素受體為目標之活性可轉導人工轉錄因子，使六聚鋅指蛋白以ER_TS1為目標之ZFP-ER1(SEQ ID NO：66)、以ER_TS2為目標之ZFP-ER2(SEQ ID NO：67)、及以ER_TS3為目標之ZFP-ER3(SEQ ID NO：68)與蛋白轉導域TAT以及轉錄活化域VP64融合，得到人工轉錄因子ER1akt(SEQ ID NO：69)、ER2akt(SEQ ID NO：70)及ER3akt(SEQ ID NO：71)。為了產生具有負調控活性之可轉導人工轉錄因子，使六聚鋅指蛋白ZFP-ER1至ZFP-ER3與蛋白轉導域TAT以及轉錄抑制域SID融合，得到人工轉錄因子ER1rep(SEQ ID NO：72)、ER2rep(SEQ ID NO：74)及ER3rep(SEQ ID NO：74)。

根據本發明之以糖皮質激素、雄激素或雌激素受體為目標之人工轉錄因子分別亦包含基於如SEQ ID NO39至41、48至53及66至68所揭示之鋅指模組組成之鋅指蛋白，其中至多四個個別鋅指模組與具有替代性結合特徵之其他鋅指模組交換以調節人工轉錄因子與其目標序列之結合。

亦考慮含有五聚或六聚或七聚鋅指蛋白的本發明之人工轉錄因子，其中個別鋅指模組經交換以改善對各別核受體啟動子基因之目標位點的結合親和性或改變鋅指蛋白之免疫學特徵以改善可耐受性。

根據本發明之以核受體糖皮質激素、雄激素及或雌激素受體為目標之人工轉錄因子分別亦包含基於如SEQ ID NO39至41、48至53及66至68所揭示之鋅指模組組成的鋅指蛋白，其中個別胺基酸經交換以便使潛在免疫原性減至最小，同時保留與所欲目標位點之結合親和性。

本發明之人工轉錄因子亦可能含有由基因本體論GO：0001071定義之蛋白質的其他轉錄活性蛋白質域，諸如N末端KRAB、C末端KRAB、SID及ERD域，較佳為SID。所考慮之活化性蛋白質域為由基因本體論go：0001071定義之蛋白質之轉錄活性域，諸如VP16或VP64(VP16之四聚重複)，較佳為VP64。

此外，本發明之人工轉錄因子包含核定位序列(NLS)。所考慮之核定位序列為經由結合於由基因本體論GO：0008139定義之蛋白質來賦予核輸入之胺基酸基元，例如含有離胺酸殘基(K)、隨後離胺酸(K)或精胺酸殘基(R)、隨後任何胺基酸(X)、隨後離胺酸或精胺酸殘基之鹼性胺基酸叢集(K-K/R-X-K/R一致序列，Chelsky D.等人，1989 Mol Cell Biol 9,2487-2492)或SV40 NLS(SEQ ID NO：37)，其中SV40 NLS為較佳。

針對核受體基因之啟動子區域但無蛋白轉導域之人工轉錄因子亦為本發明之主題。其為如上文所定義之本發明之人工轉錄因子的中間物。針對核受體基因之啟動子區域但無蛋白轉導域之該等人工轉錄因子的特定具體實例為針對雄激素受體基因啟動子之人工轉錄因子，及針對雌激素受體基因啟動子之人工轉錄因子，全部均無蛋白轉導域。

另外考慮用於藉由轉染或經由病毒載體(諸如(但不限於)基於疱疹病毒、腺病毒及腺相關病毒之載體)傳遞之核酸形式的本發明之人工轉錄因子的替代性傳遞方法。

本發明之人工轉錄因子的域可由短的可撓性連接子連接。短的可撓性連接子具有2至8個胺基酸，較佳為甘胺酸及絲胺酸。所考慮之特定連接子為GGSGGS(SEQ ID NO：76)。人工轉錄因子可進一步含有易於其偵測及加工之標記物。

在人工轉錄因子處理後評估糖皮質激素受體調節

就地塞米松(dexamethasone)處理後之轉錄誘導而言，將用糖皮質激素受體啟動子特異性負調控人工轉錄因子處理之海拉細胞(HeLa cell)與對照物處理之細胞進行比較。使用定量RT-PCR量測以基因TSC22D3、IGFBP1及IRF8為目標之糖皮質激素受體的表現量。與對照組細胞相比，在人工轉錄因子處理之細胞中此等糖皮質激素反應性基因之表現減少證明糖皮質激素受體特異性人工轉錄因子之調控活性。

在人工轉錄因子處理後評估雄激素受體調節

就睪固酮處理後之轉錄誘導而言，將用雄激素受體啟動子特異性負調控人工轉錄因子處理之表現雄激素受體之細胞與對照物處理之細胞進行比較。使用定量RT-PCR量測以基因PSA、SPAK及TMPRSS2為目標之雄激素受體的表現量。與對照組細胞相比，在人工轉錄因子處理之細胞中此等雄激素反應性基因之表現減少證明雄激素受體特異性人工轉錄因子之調控活性。

在人工轉錄因子處理後評估雌激素受體調節

就雌二醇處理後之轉錄誘導而言，將用雌激素受體啟動子特異性負調控人工轉錄因子處理之表現雌激素受體之細胞與對照物處理之細胞進行比較。使用定量RT-PCR量測以基因bcl-2、卵清蛋白、c-fos、膠原酶及催產素為目標之雌激素受體的表現量。與對照組細胞相比，在人工轉錄因子處理之細胞中此等雌二醇反應性基因之表現減少證明雌激素受體特異性人工轉錄因子之調控活性。

在螢光素酶報導分子分析中評估AR4rep活性

使用基於含有在雜交CMV/AR_TS4啟動子控制下之高斯椰屬螢光素酶及在組成性CMV啟動子控制下之分泌型鹼性磷酸酶的HEK 293 FlpInTRex細胞之報導分子細胞系來評估AR4rep之活性。如圖5中所示，用AR4rep處理該等細胞可引起與對照物處理之細胞相比螢光素酶活性減少。

聚乙二醇殘基之連接

認為將聚乙二醇殘基共價連接(聚乙二醇化)於本發明之人工轉錄因子可增加人工轉錄因子之可溶性，降低其腎清除率，且控制其免疫原性。考慮胺以及大小範圍為1至40千道爾頓(kilodalton)之硫醇活性聚乙二醇。使用硫醇活性聚乙二醇，達成人工轉錄因子之位點特異性聚乙二醇化。在本發明之人工轉錄因子中僅含有必要硫氫基之胺基酸為對於鋅配位必不可少的位於鋅指模組中之半胱胺酸殘基。此等硫氫基由於其鋅配位而不易用於聚乙二醇化，因此本發明之人工轉錄因子中包涵一個或若干個半胱胺酸殘基提供自由硫氫基用於使用硫醇特異性聚乙二醇試劑之聚乙二醇化。

醫藥組成物

本發明亦關於包含如上文所定義之人工轉錄因子的醫藥組成物。所考慮之醫藥組成物為用於非經腸全身投藥(尤其靜脈內投藥)之組成物，用於吸入之組成物，用於向溫血動物(尤其人類)局部投藥(尤其眼部局部投藥(例如以滴眼劑形式)，或玻璃體內、結膜下、眼旁(parabulbar)或眼球後投藥)之組成物。尤其較佳為滴眼劑及用於玻璃體內、結膜下、眼旁或眼球後投藥之組成物。組成物包含單獨活性成分或較佳以及醫藥學上可接受之載劑。另外考慮緩慢釋放調配物。活性成分之劑量視所治療之疾病及物種、其年齡、體重及個體病狀、個體藥物動力學資料及投藥方式而定。

另外考慮適用於經口傳遞之醫藥組成物，尤其為包含經適當囊封或以其他方式防止在內臟中降解之活性成分的組成物。舉例而言，該等醫藥組成物可含有膜滲透性增強劑、蛋白酶抑制劑，且由腸溶包衣包裹。

醫藥組成物包含約1%至約95%活性成分。單位劑型為例如安瓿、小瓶、吸入器、滴眼劑及其類似物。

本發明之醫藥組成物以自身已知方式製備，例如藉助於習知混合、溶解或凍乾過程。

較佳使用活性成分之溶液，且亦可在使用之前製備懸浮液或分散液，尤其為等張水性溶液、懸浮液或分散液，例如在凍乾組成物之情況下其包含單獨活性成分或以及載劑(例如甘露糖醇)。醫藥組成物可經滅菌及/或可包含賦形劑，例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑及/或乳化劑、增溶劑、用於調節滲透壓力之鹽及/或緩衝液且以自身已知之方式製備，例如藉助於習知溶解及凍乾過程。該等溶液或懸浮液可包含黏度增加劑，典型地為羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮或明膠，或亦為增溶劑，例如Tween 80^TM(聚氧化乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯)。

於油中之懸浮液包含習知用於注射目的之植物油、合成油或半合成油作為油組分。關於此方面，可特別提及液體脂肪酸酯，其含有具有8至22個、尤其12至22個碳原子之長鏈脂肪酸作為酸組分。此等脂肪酸酯之醇組分具有最多6個碳原子且為單價或多價(例如單價、二價或三價)醇，尤其為乙二醇及甘油。作為脂肪酸酯之混合物，諸如棉籽油、杏仁油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油、大豆油及花生油之植物油尤其適用。

可注射製劑之製造通常在無菌條件下進行，容器之填充(例如填充至安瓿或小瓶中)及密封亦如此。

對於非經腸投藥，水溶性形式之活性成分(例如水溶性鹽)之水性溶液或含有黏度增加物質(例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或葡聚糖)及(需要時)穩定劑之水性注射懸浮液尤其適合。活性成分，視情況以及賦形劑亦可呈凍乾物形式且可在非經腸投藥之前藉由添加適合之溶劑而製成溶液。

用於吸入之組成物可以氣溶膠形式、以噴霧、薄霧形式或以滴劑形式投予。氣溶膠由可用定劑量吸入器或霧化器傳遞之溶液或懸浮液製備，該定劑量吸入器或霧化器亦即為使用適合之推進劑(例如二氯二氟-甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合之氣體)以由患者吸入之霧化藥物之短脈衝形式將特定量之藥物傳遞至氣道或肺中的裝置。亦可提供用於吸入之具有適合粉末基劑(諸如乳糖或澱粉)之粉末噴霧。

滴眼劑較佳為活性成分之等張水性溶液，其包含適合之藥劑以使得組成物與淚液等張(295-305mOsm/l)。所考慮之藥劑為氯化鈉、檸檬酸、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、乙二醇、丙二醇、右旋糖及其類似物。此外，組成物包含緩衝劑，例如磷酸鹽緩衝液、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液或Tris緩衝液(參(羥甲基)-胺基甲烷)以便使pH值維持在5與8之間、較佳為7.0至7.4。組成物可進一步含有抗微生物防腐劑，例如對羥苯甲酸酯、四級銨鹽(諸如氯化苄烷銨)、聚六亞甲基雙胍(polyhexamethylene biguanidine，PHMB)及其類似物。滴眼劑可進一步含有黃原膠以產生膠狀滴眼劑，及/或其他黏度增強劑，諸如玻尿酸、甲基纖維素、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯啶酮。

人工轉錄因子在治療方法中之用途

此外，本發明係關於一種經組裝以便以如上文所述之核受體的啟動子區域為目標之人工轉錄因子，其用於影響細胞對核受體配位體之反應，用於降低或增加核受體含量，及用於治療由該等核受體調節之疾病。同樣，本發明係關於一種治療由核受體配位體調節之疾病的方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量之針對核受體啟動子之人工轉錄因子。

由核受體配位體調節之疾病為例如腎上腺功能不全、腎上腺皮質功能不全、酒精中毒、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、雄激素不敏感症候群、神經性厭食、主動脈瘤、主動脈瓣硬化、關節炎、哮喘、動脈粥樣硬化、注意力不足過動症、孤獨症、精子缺乏症、膽汁原發性肝硬化、躁鬱症、膀胱癌、骨癌、乳癌、心血管疾病、心血管心肌梗死、乳糜瀉、膽汁鬱積、慢性腎衰竭及代謝症候群、肝硬化、齶裂、結腸直腸癌、先天性腎上腺發育不全、冠心病、隱睪、深靜脈血栓形成、癡呆、抑鬱症、糖尿病性視網膜病、乾眼病、子宮內膜異位、子宮內膜癌、增強S視錐症候群(enhanced S-cone syndrome)、原發性高血壓、家族性部分脂肪代謝障礙、神經膠質母細胞瘤、糖皮質激素抗性、格雷夫氏症(Graves' Disease)、高血清脂質含量、高阿樸β脂蛋白血症(hyperapobetalipoproteinemia)、高脂血症、高血壓、高甘油三酯血症、低促性腺激素性腺機能減退(hypogonadotropic hypogonadism)、尿道下裂、不育症、發炎性腸病、胰島素抗性、缺血性心臟病、肝皮脂腺病、肺癌、紅斑狼瘡、重度抑鬱症、男性乳癌、代謝血漿脂質含量、代謝症候群、偏頭痛、多發性硬化症、心肌梗塞、腎病症候群、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、肥胖症、骨關節炎、骨質缺乏症、骨質疏鬆症、卵巢癌、帕金森氏病(Parkinson's disease)、子癇前期、孕酮抗性、前列腺癌、假性醛固酮減少症、牛皮癬、精神病學精神分裂症、精神病、色素性視網膜炎-37、精神分裂症、硬化性膽管炎、性反轉、皮膚癌、肯尼迪脊髓延髓萎縮(spinal and bulbar atrophy of Kennedy)、心肌梗塞易患性、牛皮癬易患性、睪丸癌、I型糖尿病、II類型糖尿病、子宮癌及眩暈。

同樣，本發明係關於一種治療由核受體配位體調節之疾病的方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量之本發明之人工轉錄因子。詳言之，本發明係關於一種治療以下疾病之方法：腎上腺功能不全、腎上腺皮質功能不全、酒精中毒、阿茲海默氏病、雄激素不敏感症候群、神經性厭食、主動脈瘤、主動脈瓣硬化、關節炎、哮喘、動脈粥樣硬化、注意力不足過動症、孤獨症、精子缺乏症、膽汁原發性肝硬化、躁鬱症、膀胱癌、骨癌、乳癌、心血管疾病、心血管心肌梗死、乳糜瀉、膽汁鬱積、慢性腎衰竭及代謝症候群、肝硬化、齶裂、結腸直腸癌、先天性腎上腺發育不全、冠心病、隱睪、深靜脈血栓形成、癡呆、抑鬱症、糖尿病性視網膜病、乾眼病、子宮內膜異位、子宮內膜癌、增強S視錐症候群、原發性高血壓、家族性部分脂肪代謝障礙、神經膠質母細胞瘤、糖皮質激素抗性、格雷夫氏症、高血清脂質含量、高阿樸β脂蛋白血症、高脂血症、高血壓、高甘油三酯血症、低促性腺激素性腺機能減退、尿道下裂、不育症、發炎性腸病、胰島素抗性、缺血性心臟病、肝皮脂腺病、肺癌、紅斑狼瘡、重度抑鬱症、男性乳癌、代謝血漿脂質含量、代謝症候群、偏頭痛、多發性硬化症、心肌梗塞、腎病症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、肥胖症、骨關節炎、骨質缺乏症、骨質疏鬆症、卵巢癌、帕金森氏病、子癇前期、孕酮抗性、前列腺癌、假性醛固酮減少症、牛皮癬、精神病學精神分裂症、精神病、色素性視網膜炎-37、精神分裂症、硬化性膽管炎、性反轉、皮膚癌、肯尼迪脊髓延髓萎縮、心肌梗塞易患性、牛皮癬易患性、睪丸癌、I型糖尿病、II類型糖尿病、子宮癌及眩暈，該方法包含向有需要之患者投予有效量之本發明之人工轉錄因子。本發明之人工轉錄因子之有效量視所治療之疾病特定類型及物種、其年齡、體重及個體病狀、個體藥物動力學資料及投藥方式而定。對於投藥至眼睛中，每月玻璃體注射0.5至1mg為較佳。對於全身施用，每月注射10mg/kg為較佳。另外，將緩慢釋放沈澱物移植至眼睛玻璃體中亦為較佳。

此外，本發明係關於一種針對如上文所述之雄激素受體之人工轉錄因子，其用於影響細胞對雄激素受體配位體之反應，用於降低或增加雄激素受體含量，及用於治療由雄激素受體配位體調節之疾病。

同樣，本發明係關於一種治療由雄激素受體配位體調節之疾病的方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量之本發明之人工轉錄因子。所考慮之疾病為前列腺癌、男性乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、睪丸癌、冠狀動脈病、I型糖尿病、糖尿病性視網膜病、肥胖症、雄激素不敏感症候群、骨質疏鬆症、骨關節炎、II型糖尿病、阿茲海默氏病、偏頭痛、注意力不足過動症、抑鬱症、精神分裂症、精子缺乏症、子宮內膜異位及肯尼迪脊髓延髓萎縮。詳言之，上調AR含量有益於治療乾眼病，而下調AR含量有益於治療AR阻斷非敏感性前列腺癌。本發明之人工轉錄因子之有效量視所治療之疾病特定類型及物種、其年齡、體重及個體病狀、個體藥物動力學資料及投藥方式而定。對於投藥至眼睛中，每月玻璃體注射0.5至1mg為較佳。對於全身施用，每月注射10mg/kg為較佳。另外，將緩慢釋放沈澱物移植至眼睛玻璃體中亦為較佳。

此外，本發明係關於一種針對如上文所述之雌激素受體之人工轉錄因子，其用於影響細胞對雌激素受體配位體之反應，用於降低或增加雌激素受體含量，及用於治療由雌激素受體配位體調節之疾病。

同樣，本發明係關於一種治療由雌激素受體配位體調節之疾病的方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量之本發明之人工轉錄因子。所考慮之疾病為骨癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、酒精中毒、偏頭痛、主動脈瘤、心肌梗塞易患性、主動脈瓣硬化、心血管疾病、冠狀動脈病、高血壓、深靜脈血栓形成、格雷夫氏病、關節炎、多發性硬化症、肝硬化、B型肝炎、慢性肝病、膽汁鬱積、尿道下裂、肥胖症、骨關節炎、骨質缺乏症、骨質疏鬆症、阿茲海默氏病、帕金森氏病、偏頭痛、眩暈)、神經性厭食、注意力不足過動症、癡呆、抑鬱症、精神病、子宮內膜異位及不育症。詳言之，下調ER含量有益於治療激素依賴性乳癌。本發明之人工轉錄因子之有效量視所治療之疾病特定類型及物種、其年齡、體重及個體病狀、個體藥物動力學資料及投藥方式而定。對於投藥至眼睛中，每月玻璃體注射0.5至1mg為較佳。對於全身施用，每月注射10mg/kg為較佳。另外，將緩慢釋放沈澱物移植至眼睛玻璃體中亦為較佳。

人工轉錄因子在動物中之用途

此外，本發明係關於動物中所見之以核受體為目標之人工轉錄因子的用途，其用於治療藉由該等核受體之功能異常調節之疾病。較佳地，將人工轉錄因子直接應用於適於表面施用於有需要之動物之組成物中。

實施例

DNA質體之選殖

對於所有選殖步驟，限制性核酸內切酶及T4 DNA連接酶購自New England Biolabs。蝦鹼性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)來自Promega。在所有標準PCR反應中應用高保真度鉑Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。根據製造商之說明書，使用NucleoSpin Gel及PCR Clean-up套組、NucleoSpin Plasmid套組或NucleoBondXtra Midi Plus套組(Macherey-Nagel)分離DNA片段及質體。寡聚核苷酸購自Sigma-Aldrich。新產生之質體的所有相關DNA序列均藉由測序(Microsynth)來檢驗。

用於酵母單雜交之六聚鋅指蛋白文庫之選殖

根據Gonzalez B.等人，.2010,Nat Protoc 5,791-810，經以下改良後，選殖含有GNN及/或CNN及/或ANN結合鋅指(ZF)模組之選殖六聚鋅指蛋白文庫。合成編碼GNN、CNN及ANN ZF模組之DNA序列且分別插入pUC57(GenScript)中，產生pAN1049(SEQ ID NO：77)、pAN1073(SEQ ID NO：78)及pAN1670(SEQ ID NO：79)。鋅指蛋白(ZFP)文庫之逐步組裝在pBluescript SK(+)載體中進行。為了避免在每一個別選殖步驟期間插入多個ZF模組而產生非功能性蛋白質，pBluescript(及其含有1個ZFP、2個ZFP或3個ZFP之衍生產物)且首先將pAN1049、pAN1073或pAN1670與一種限制酶一起培育，隨後用SAP處理。在添加第二種限制酶之前使用NucleoSpin Gel及PCR Clean-up套組移除酶。

藉由用XhoI、SAP及隨後SpeI處理5μg pBluescript進行pBluescript-1ZFPL之選殖。藉由將10μg pAN1049(釋放16個不同GNN ZF模組)或pAN1073(釋放15個不同CNN ZF模組)或pAN1670(釋放15個不同ANN ZF模組)與SpeI、SAP及隨後XhoI一起培育來產生插入物。為產生pBluescript-2ZFPL及pBluescript-3ZFPL，用AgeI切割7μg pBluescript-1ZFPL或pBluescript-2ZFPL，去磷酸，且用SpeI切割。藉由分別將SpeI、SAP及隨後XmaI施用於10μg pAN1049或pAN1073或pAN1670來獲得插入物。藉由用AgeI、SAP及其後SpeI處理14μg pBluescript-3ZFPL以獲得經切割載體來進行pBluescript-6ZFPL之選殖。藉由與SpeI、SAP及隨後XmaI一起培育而自20μg pBluescript-3ZFPL釋放3ZFPL插入物。

在RT(室溫)下以20μl總體積以3：1莫耳比之插入物：載體使用200ng經切割載體、400U T4 DNA連接酶設置用於含有一個、兩個及三個ZFP之文庫的連接反應隔夜。六聚鋅指蛋白文庫之連接反應物包括200μl總體積之2000ng pBluescript-3ZFPL、500ng 3ZFPL插入物、4000U T4 DNA連接酶，將其分成十份20μl且在RT下分開培育隔夜。藉由若干方法使連接反應物之部分轉型至大腸桿菌(Escherichia coli)中，此視每一文庫所需之純系數目而定。為產生pBluescript-1ZFPL及pBluescript-2ZFPL，將3μl連接反應物直接用於大腸桿菌NEB 5-α之熱休克轉型。使用NucleoSpin Gel及PCR Clean-up套組純化pBluescript-3ZFPL之連接反應物之質體DNA且轉型至電穿孔勝任大腸桿菌NEB 5-α中(來自EquiBio之EasyjecT Plus電穿孔儀或來自Eppendorf之Multiporator，2.5kV及25μF，來自Bio-Rad之2mm電穿孔小試管)。將pBluescript-6ZFP文庫之連接反應物施加於NucleoSpin Gel及PCR Clean-up套組且用15μl去離子水洗提DNA。將約60ng去鹽DNA與50μl NEB 10-β電穿孔勝任大腸桿菌(New England Biolabs)混合且如製造商所推薦使用EasyjecT Plus或multiporator，2.5kV、25μF及2mm電穿孔小試管進行電穿孔。對於每一文庫進行多次電穿孔且隨後直接混合細胞以增加文庫大小。熱休克轉型或電穿孔後，將SOC培養基施用於細菌且在37℃及250rpm下1小時培育後，使用30μl SOC培養物進行連續稀釋且接種於含有胺苄青黴素之LB板上。次日，測定所得文庫純系之總數。另外，每一文庫選擇十個純系以分離質體DNA且藉由限制酶消化來檢查檢查插入物之合併。對此等質體中至少三個進行測序以檢驗文庫之多樣性。將剩餘SOC培養物轉移至含有胺苄青黴素之100ml LB培養基且在37℃及250rpm下培養隔夜。使用彼等細胞製備每一文庫之質體Midi DNA。

對於酵母單雜交篩，將六聚鋅指蛋白文庫轉移至相容的獵物載體。出於該目的，藉由用XhoI/EcoRI切割載體且插入經黏接之寡聚核苷酸OAN971 (TCGACAGGCCCAGGCGGCCCTCGAGGATATCATGATGACTAGTGGCCAGGCCGGCCC，SEQ ID NO：80)及OAN972(AATTGGGCCGGCCTGGCCACTAGTCATCATGATATCCTCGAGGGCCGCCTGGGCCTG，SEQ ID NO：81)來調節pGAD10(Clontech)之多個選殖位點。切割所得載體pAN1025(SEQ ID NO：82)且去磷酸，藉由XhoI/SpeI自pBluescript-6ZFPL釋放6ZFP文庫插入物。如上文所述對pBluescript-6ZFP文庫進行連接反應及電穿孔至NEB 10-β電穿孔勝任大腸桿菌中。

對於改良之酵母單雜交篩選，亦將六聚鋅指文庫轉移至改良之獵物載體pAN1375(SEQ ID NO：83)中。如下構築此獵物載體：用ApaI/NarI切割pRS315(SEQ ID NO：84)且插入經黏接之OAN1143(CGCCGCATGCATTCATGCAGGC C，SEQ ID NO：85)及OAN1144(TGCATGAATGCATGCGG，SEQ ID NO：86)，得到pAN1373(SEQ ID NO：87)。將來自pAN1025之SphI插入物連接至用SphI切割之pAN1373中以獲得pAN1375。

對於進一步改良之酵母單雜交篩選，亦將六聚鋅指文庫轉移至改良之獵物載體pAN1920(SEQ ID NO：88)中。

對於甚至進一步改良之酵母單雜交篩選，將六聚鋅指文庫插入獵物載體pAN1992(SEQ ID NO：89)中。

用於酵母單雜交篩選之誘餌質體之選殖

對於每一誘餌質體，選擇在中間含有18bp潛在人工轉錄因子目標位點之60bp序列且包括NcoI位點以用於限制分析。設計寡聚核苷酸且以該方式黏接以產生5' HindIII及3' XhoI位點，其允許直接連接至用HindIII/XhoI切割之pAbAi(Clontech)中。使用用NcoI消化並測序來證實誘餌質體之組裝。

酵母菌株及培養基

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y1H Gold購自Clontech，YPD培養基及YPD瓊脂購自CarlRoth。合成營養缺陷(SD)培養基含有20g/l葡萄糖、6.8g/l Na₂HPO₄．2H₂O、9.7g/l NaH₂PO₄．2H₂O(全部來自Carl Roth)、1.4g/l酵母合成營養缺陷培養基補充劑、6.7g/l酵母氮鹼、0.1g/l L-色胺酸、0.1g/l L-白胺酸、0.05g/l L-腺嘌呤、0.05g/l L-組胺酸、0.05g/l尿嘧啶(全部來自Sigma-Aldrich)。SD-U培養基含有除尿嘧啶外之所有組分，製備無L-白胺酸之SD-L。SD瓊脂板不含有磷酸鈉，但含有16g/l Bacto瓊脂(BD)。短梗黴素A(Aureobasidin A，AbA)購自Clontech。

誘餌酵母菌株之製備

以20μl之總體積用BstBI使約5μg每一誘餌質體線性化且將反應混合物之一半直接用於釀酒酵母Y1H Gold之熱休克轉型。在轉型前一天使用酵母細胞接種5ml YPD培養基且在RT下在滾筒上生長隔夜。以1：20用新鮮YPD培養基稀釋一毫升此預培養物且在30℃、225rpm下培育2-3小時。因為每一轉型反應，藉由離心收穫1 OD₆₀₀細胞，將酵母細胞用1ml無菌水洗滌一次及用1ml TE/LiAc(10mM Tris/HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、100mM乙酸鋰)洗滌一次。最後，使酵母細胞再懸浮於50μl TE/LiAc中且與50μg來自鮭魚精巢之單股DNA(Sigma-Aldrich)、10μl BstBI線性化誘餌質體(參見上文)及300μl PEG/TE/LiAc(10mM Tris/HCl(pH 7.5)、1mMEDTA、100 mM乙酸鋰、50%(w/v)PEG 3350)混合。在RT下將細胞及DNA在滾筒上培育20分鐘，隨後置於42℃水浴中15分鐘。最後，藉由離心作用收集酵母細胞，再懸浮於100μl無菌水中且展佈於SD-U瓊脂板上。在30℃下培育3天後，選自來自每一轉型反應之在SD-U上生長之八個純系以分析其對短梗黴素A(AbA)之敏感性。在RT下使預培養物在滾筒上生長隔夜。對於每一培養物，量測OD₆₀₀且用無菌水調整為OD₆₀₀=0.3。由此第一種稀釋液，用無菌水製備五種其他1：10稀釋步驟。對於每一純系，將來自每一稀釋步驟之5μl點樣於含有SD-U、SD-U 100ng/ml AbA、SD-U 150ng/ml AbA及SD-U 200ng/ml AbA之瓊脂板上。在30℃下培育3天後，選擇在SD-U上生長良好且對AbA最敏感之三個純系用於進一步分析。根據製造商之說明書，藉由Matchmaker Insert Check PCR Mix 1(Clontech)檢驗誘餌質體穩定整合至酵母基因組中。三個純系中之一者用於隨後Y1H篩。

用六聚鋅指蛋白文庫轉型誘餌酵母菌株

將約500μl酵母誘餌菌株預培養物為稀釋於1 1 YPD培養基中且在30℃及225rpm下培育直至OD₆₀₀=1.6-2.0(約20小時)。藉由以迴旋式轉子離心(5分鐘，1500g，4℃)收集細胞。根據Benatuil L.等人，2010,Protein Eng Des Sel 23,155-159進行電穿孔勝任細胞之製備。對於每一轉型反應，將400μl電穿孔勝任誘餌酵母細胞與1μg編碼6ZFP文庫之獵物質體混合且在冰上培育3分鐘。將細胞-DNA懸浮液轉移至預冷卻之2mm電穿孔小試管中。進行多個電穿孔反應(EasyjecT Plus電穿孔儀或Multiporator，2.5kV及25μF)直至所有酵母細胞懸浮液均已轉型。電穿孔後，將酵母細胞轉移至100ml YPD：1M山梨糖醇之1：1混合物中且在30℃及225rpm下培育60分鐘。藉由離心收集細胞且再懸浮於1-2ml SD-L培養基中。將200μl等分試樣展佈於含有1000-4000ng/ml AbA之15cm SD-L瓊脂板上。另外，使用50μl細胞懸液製備1/100及1/1000稀釋液且將50μl未稀釋及稀釋之細胞接種於SD-L上。所有培養板均在30℃下培育3天。自具有經稀釋轉型體之培養板計算所得純系之總數。雖然具有未稀釋細胞之SD-L培養板指示所有轉型體均生長，但若獵物6ZFP成功結合於其誘餌目標位點，則含有AbA之SD-L培養板僅產生群落形成。

編碼6ZFP之獵物質體的正相互作用及回收率之檢驗

對於初始分析，自含有最高AbA濃度之SD-L培養板上挑選四十個大小良好之群落且在具有1000-4000ng/ml AbA之SD-L上將酵母細胞再劃兩次以獲得單一群落。對於每一純系，使用一個群落接種5ml SD-L培養基且在RT下使細胞生長隔夜。次日，用無菌水調整為OD₆₀₀=0.3，製備五種其他1/10稀釋液且將5μl每一稀釋步驟點樣於SD-L、SD-L 500ng/ml AbA、1000ng/ml AbA、SD-L 1500ng/ml AbA、SD-L 2000ng/ml AbA、SD-L 2500ng/ml AbA、SD-L 3000ng/ml AbA及SD-L 4000ng/ml AbA培養板上。將純系根據其在高AbA濃度下生長之能力進行分級。自生長最好之純系，使用5ml初始SD-L預培養物來離心細胞且使其再懸浮於100μl水或殘餘培養基中。添加50U溶壁酶(Sigma-Aldrich，L2524)後，在37℃及300rpm下在水平震盪器上培育細胞若干小時。藉由添加10μl 20%(w/v)SDS溶液來溶解所產生之球芽，藉由渦旋有力地混合1分鐘且在-20℃下冷凍至少1小時。隨後，添加來自NucleoSpin Plasmid套組之250μl A1緩衝液及一刮刀尖端之玻璃珠(Sigma-Aldrich，G8772)且藉由渦旋有力地混合試管1分鐘。藉由添加來自NucleoSpin Plasmid套組之250μl A2緩衝液且在RT下培育至少15分鐘，隨後繼續標準NucleoSpin Plasmid套組方案來進一步改良質體分離。用30μl洗提緩衝液洗提後，藉由熱休克轉型將5μl質體DNA轉型至大腸桿菌DH5 α中。自含有胺苄青黴素之LB培養板挑選兩個個別群落，分離質體且對文庫插入物進行測序。針對在6ZFP間每一目標位點之一致序列分析所得結果。

用於產生用於測試可轉導人工轉錄因子活性之穩定螢光素酶/分泌型鹼性磷酸酶報導細胞系之報導質體之選殖

為了產生含有在雜交CMV/人工轉錄因子目標位點啟動子控制下以及在組成性CMV啟動子控制下之分泌型鹼性磷酸酶之高斯椰屬螢光素酶之報導分子構築體，用AfIIII/SpeI將含有人工轉錄因子結合位點之42bp選殖至pAN1660(SEQ ID NO：90)中。此等報導分子構築體含有用於穩定整合至含有FlpIn位點之細胞(諸如HEK 293 FlpIn TRex(Invitrogen)細胞)中之FlpIn位點。使用寡聚核苷酸OAN1612(SEQ ID NO：91)及OAN1613(SEQ ID NO：92)產生用於測試以AR_TS4為目標之人工轉錄因子的該報導分子構築體。

用於哺乳動物轉染之人工轉錄因子之選殖

使用標準程序利用AgeI/XhoI將編碼多指鋅指蛋白之DNA片段選殖至用於在哺乳動物細胞中表現為所關注鋅指陣列、SV40 NLS、3x真菌抗原決定基標記及N末端KRAB域(pAN1255-SEQ ID NO：93)、C末端KRAB域(pAN1258-SEQ ID NO：94)、SID域(pAN1257-SEQ ID NO：95)或VP64活化域(pAN1510-SEQ ID NO：96)之間的融合蛋白之哺乳動物表現載體中。

如下產生用於產生穩定轉染之四環素誘導型細胞之質體：使用 EcoRV/AgeI將編碼包含多指鋅指域、調控域(N末端KRAB、C末端KRAB、SID或VP64)及SV40 NLS之人工轉錄因子的DNA片段選殖至pAN2071(SEQ ID NO：97)中。此等人工轉錄因子表現質體可藉由用AAVS1 Left TALEN及AAVS1 Right TALEN(GeneCopoeia)共轉染而整合至人類基因組中之AAVS1基因座中。

細胞培養及轉染

在5% CO₂、37℃下使海拉細胞在補充有4.5g/l葡萄糖、10%熱失活胎牛血清、2mM L-麩醯胺酸及1mM丙酮酸鈉(全部均來自Sigma-Aldrich)之杜科貝爾氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)中生長。對於螢光素酶報導分子分析，將7000個海拉細胞/孔接種於96孔板中。次日，根據製造商之說明書，使用Effectene轉染試劑(Qiagen)進行共轉染。以比率3：1使用編碼人工轉錄因子及螢光素酶之質體midi製備物。在轉染後6小時小時及24小時由每孔100μl新鮮DMEM替換培養基。

Flp-In ^Tm T-Rex ^TM 293表現細胞系之產生及維持

穩定的四環素誘導型Flp-In^Tm T-Rex^TM 293表現細胞系由Flp重組酶介導之整合產生。使用Flp-In^Tm T-Rex^TM Core套組，藉由轉染pFRT/lacZeo目標位點載體及pcDNA6/TR載體來產生Flp-In^Tm T-Rex^TM宿主細胞系。為了產生誘導型293表現細胞系，經由Flp重組酶介導之DNA重組在Flp-In^Tm T-Rex^TM宿主細胞系中之FRT位點處整合含有所關注基因之pcDNA5/FRT/TO表現載體。在含有(DMEM；10% Tet-FBS；2mM麩醯胺酸；15μg/ml殺稻瘟菌素(blasticidine)及100μg/ml潮黴素)之選擇培養基中維持穩定的Flp-In^Tm T-Rex^TM表現細胞系。為了誘導基因表現，添加四環素至1μg/mL之最終濃度。

使用TALEN產生及維持穩定表現人工轉錄因子之細胞系

為了產生穩定表現在四環素誘導型啟動子控制下之人工轉錄因子之細胞系，根據製造商之推薦，使用Effectene(Qiagen，轉染試劑)，用含有所關注人工轉錄因子之表現構築體及AAVS1 Left TALEN及AAVS1 Right TALEN(GeneCopoeia)質體之基於pAN2071共轉染細胞。轉染後8小時，抽出生長培養基，用PBS洗滌細胞且添加新鮮生長培養基。轉染後24小時，使細胞以1：10比率在含有Tet-經批准FBS(無四環素FBS，Takara)而無抗生素之生長培養基中分裂。轉染後48小時，嘌呤黴素選擇以細胞類型特異性濃度開始且使細胞保持在選擇壓力下7-10天。混合穩定細胞群落且在選擇培養基中加以維持。

藉由定量RT-PCR測定基因表現量

根據製造商之說明書，使用RNeasy Plus Mini套組(Qiagen，Hilden,Germany)自細胞分離總RNA。將冷凍之細胞集結粒再懸浮於含有10μl/ml β-巰基乙醇之RLT Plus Lysis緩衝液中。使用QIAshredder離心柱均質化後，將總溶解產物轉移至gDNA Eliminator離心柱以消除基因組DNA。添加一體積之70%乙醇且將總溶解產物轉移至RNeasy離心柱。若干個洗滌步驟後，用最終容積為30μl之無RNA酶(RNase)水洗提RNA。將RNA儲存於-80℃下直至進一步使用。根據製造商之說明書，使用高容量cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems，Branchburg,New Jersey,USA)進行cDNA之合成。以含有2μl 10×緩衝液、0.8μl 25×dNTP混合物、2μl 10×RT隨機引子、 1μl Multiscribe反轉錄酶及4.2μl H₂O之20μl總反應體積進行cDNA合成。添加最終體積為10μl之RNA且在以下條件下進行反應：在25℃下10分鐘、隨後在37℃下2小時及最後一步在85℃下5分鐘。以含有1μL 20×TaqMan Gene Expression Master混合物、10.0μl TaqMan^® Universal PCR Master混合物(兩者皆來自Biosystems，Branchburg,New Jersey,USA)及8μl H₂O之20μl總反應體積進行定量PCR。對於每一反應，添加1μl cDNA。使用ABI PRISM 7000序列偵測系統(Applied Biosystems，Branchburg,New Jersey,USA))在以下條件下進行qPCR：起始步驟為在50℃下2分鐘，隨後在95℃下第一次變性10分鐘及由在95℃下15秒及在60℃下1分鐘之40個循環組成之另一步驟。

用於細菌表現之人工轉錄因子的選殖

使用標準程序用EcoRV/NotI將編碼人工轉錄因子之DNA片段選殖至基於pET41a+(Novagen)之細菌表現載體pAN983(SEQ ID NO：98)中以用於在大腸桿菌中表現為人工轉錄因子與TAT蛋白轉導域之間的His₆標記融合蛋白。

在適合之大腸桿菌宿主細胞(諸如以GR、AR或ER為目標之BL21(DE3))中用於細菌性產生組織蛋白酶B敏感性可轉導人工轉錄因子之表現構築體為pAN2343(SEQ ID NO：99)、pAN2344(SEQ ID NO：100)、pAN2345(SEQ ID NO：101)、pAN2346(SEQ ID NO：102)及pAN2347(SEQ ID NO：103)。

人工轉錄因子蛋白之產生

使用用於特定人工轉錄因子之表現質體轉型之大腸桿菌BL21(DE3)在補充有100μM ZnCl₂之1 1 LB培養基中生長直至達到0.8與1之間的 OD₆₀₀，且誘導用1mM IPTG誘導兩小時。藉由離心收穫細菌，藉由音波處理來製備細菌溶解產物，且純化包涵體。為此，藉由離心收集(5000g，4℃，15分鐘)包涵體且在20ml結合緩衝液(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM咪唑；pH 7.5)中洗滌三次。在冰上在30ml結合緩衝液A(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM咪唑、6M GuHCl；pH 7.5)中溶解經純化之包涵體一小時。在4℃及13'000g下離心溶解之包涵體40分鐘且經由0.45μm PVDF過濾器過濾。使用His-Trap管柱陷阱管柱在Äktaprime FPLC(gehealthcare)上使用結合緩衝液A及洗提緩衝液B(50mM HEPES、500mM NaCl、500mM咪唑、6M GuHCl；pH 7.5)純化His標記之人工轉錄因子。混合含有經純化之人工轉錄因子的洗提份且在4℃下在含有SID域之人工轉錄因子的情況下針對緩衝液S(50mM Tris-HCl、500mM NaCl、200mM精胺酸、100μM ZnCl₂、5mM GSH、0.5mM GSSG、50%甘油；pH 7.5)，或針對用於含有KRAB域之人工轉錄因子之緩衝液K(50mM Tris-HCl、300mM NaCl、500mM精胺酸、100μM ZnCl₂、5mMGSH、0.5mM GSSG、50%甘油；pH 8.5)透析隔夜。透析後，在4℃下以14'000rpm離心蛋白質樣品30分鐘且使用0.22μm Millex-GV過濾型吸管尖(Millipore)無菌過濾。對於含有VP64活化域之人工轉錄因子，根據製造商之推薦，使用His-Bond Ni-NTA樹脂(Novagen)，由可溶性組分(結合緩衝液：50mM NaPO₄(pH 7.5)、500mM NaCl、10mM咪唑；洗提緩衝液：50mM HEPES(pH 7.5)、500mM NaCl、500mM咪唑)產生蛋白質。針對VP64-緩衝液(550mM NaCl(pH 7.4)、400mM精胺酸、100μM ZnCl₂)透析蛋白質。

蛋白質轉導

用0.01至1μM人工轉錄因子處理生長至約80%融合之細胞或模擬處理2小時至120小時，其中在37℃下每24小時在OptiMEM或生長培養基中隨意添加人工轉錄因子。視情況，將10-500μM ZnCl₂添加至生長培養基中。對於免疫螢光，用PBS洗滌細胞一次，經胰蛋白酶作用且接種於玻璃蓋片上以作進一步分析。

免疫螢光

用4%多聚甲醛固定細胞，用0.15% Triton X-100處理，用10% BSA阻斷且與小鼠抗-HA抗體(1：500，H9658，Sigma)或小鼠抗-真菌劑(1：500，M5546，Sigma)一起培育隔夜。用PBS/1% BSA洗滌樣品三次，且與偶合於Alexa Fluor 546(1：1000，Invitrogen)之山羊抗-小鼠抗體一起培育，且使用DAPI(1：1000之1mg/ml，3分鐘，Sigma)進行對比染色。使用螢光顯微術分析樣品。

組合之螢光素酶/SEAP啟動子活性分析

為了測試人工轉錄因子之活性，使用報導分子細胞系。此報導分子細胞系基於含有在雜交CMV/人工轉錄因子目標位點啟動子控制下之高斯椰屬螢光素酶及在組成性CMV啟動子控制下之分泌型鹼性磷酸酶的HEK 293 FlpInTRex細胞。

將每孔1×10⁵個報導分子細胞接種於6孔板中24小時，隨後進行蛋白質轉導。接種後24小時，自培養板吸出培養基且用PBS洗滌細胞一次。對於蛋白質處理，用OptiMEM將AR4rep稀釋至1μm之最終濃度，添加至細胞中且在保溫箱(37℃；5% CO₂)中培育2小時。在蛋白質轉導後，使細胞在正常生長培養基中生長24小時。將上清液轉移至96孔板，且在2000rpm 下離心5分鐘。為了量測高斯椰屬螢光素酶，根據製造商之說明書使用Pierce^TM高斯椰屬螢光素酶發熱分析套組(Thermo Scientific)。將工作溶液平衡至室溫且以1：100稀釋度添加腔腸素(coelenterazine)。將20μl細胞上清液轉譯至不透明96孔板中且添加50μl工作溶液。培育10分鐘後，使用MicroLumatPlus(Berthold Technologies)以1.0秒之積分時間量測發光。為了量測分泌型鹼性磷酸酶，根據製造商之說明書使用化學發光SEAP報導基因分析(Roche)。以1：4用稀釋緩衝液稀釋細胞上清液且在65℃下加熱失活5分鐘。將50μL加熱失活樣品轉移至不透明96孔板且添加50μL失活緩衝液。在室溫下培育5分鐘後，添加由含AP受質1：20之受質緩衝液組成之50μL受質試劑且在室溫在輕輕攪拌下下培育10分鐘。使用MicroLumatPlus(Berthold Technologies)以1.0秒之積分時間量測發光。

<110> 艾立歐夫塔公司

<120> 調控核受體之人工轉錄因子及其治療用途

<130> P3033TW00

<150> EP13162198.9

<151> 2013-04-03

<160> 103

<170> PatentIn 3.5版

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<213> 疱疹單純型病毒7

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<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

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<213> 人類免疫缺陷病毒

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> 合成構築體

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<213> 人工序列

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<213> 果蠅

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 61

<210> 62

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 62

<210> 63

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 63

<210> 64

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 64

<210> 65

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 65

<210> 66

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 66

<210> 67

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 67

<210> 68

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 68

<210> 69

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 69

<210> 70

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 70

<210> 71

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 71

<210> 72

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 72

<210> 73

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 73

<210> 74

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 74

<210> 75

<211> 7

<212> PRT

<213> 猿猴病毒40

<400> 75

<210> 76

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 76

<210> 77

<211> 4513

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 77

<210> 78

<211> 4442

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 78

<210> 79

<211> 4376

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 79

<210> 80

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 80

<210> 81

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 81

<210> 82

<211> 6699

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 82

<210> 83

<211> 6481

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 83

<210> 84

<211> 6018

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 84

<210> 85

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 85

<210> 86

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 86

<210> 87

<211> 5021

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 87

<210> 88

<211> 6408

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 88

<210> 89

<211> 6308

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 89

<210> 90

<211> 8068

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 雜項特徵

<222> (1062)..(1062)

<223> n為a、c、g或t

<400> 90

<210> 91

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 91

<210> 92

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 92

<210> 93

<211> 6083

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 93

<210> 94

<211> 5916

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 94

<210> 95

<211> 5897

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 95

<210> 96

<211> 6198

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 96

<210> 97

<211> 10723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 97

<210> 98

<211> 5185

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 98

<210> 99

<211> 5866

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 99

<210> 100

<211> 5866

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 100

<210> 101

<211> 5866

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 101

<210> 102

<211> 5866

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 102

<210> 103

<211> 5866

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 103

Claims

一種人工轉錄因子，其包含與抑制性或活化性蛋白質域、核定位序列及蛋白轉導域融合之特異性以核受體基因之啟動子區域為目標之多指(polydactyl)鋅指蛋白。
如申請專利範圍第1項之人工轉錄因子，其中該核受體基因之啟動子區域為雄激素受體啟動子。
如申請專利範圍第1項之人工轉錄因子，其中該核受體基因之啟動子區域為雌激素受體啟動子。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之人工轉錄因子，其包含六聚鋅指蛋白。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之人工轉錄因子，其中該鋅指蛋白與抑制性蛋白質域融合。
如申請專利範圍第5項之人工轉錄因子，其中該抑制性蛋白質域為SEQ ID NO：1之N末端KRAB、SEQ ID NO：2之C末端KRAB、SEQ ID NO：3之SID或SEQ ID NO：4之ERD。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之人工轉錄因子，其中該鋅指蛋白與活化性蛋白質域融合。
如申請專利範圍第7項之人工轉錄因子，其中該活化性蛋白質域為SEQ ID NO：5之VP16、SEQ ID NO：6之VP64、SEQ ID NO：7之CJ7、SEQ ID NO：8之p65TA1、SEQ ID NO：9之SAD、SEQ ID NO：10之NF-1、SEQ ID NO：11之AP-2、SEQ ID NO：12之SP1-A、SEQ ID NO：13之SP1-B、SEQ ID NO：14之Oct-1、SEQ ID NO：15之Oct-2、SEQ ID NO：16之Oct2-5x、 SEQ ID NO：17之MTF-1、SEQ ID NO：18之BTEB-2或SEQ ID NO：19之LKLF。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之人工轉錄因子，其中該核定位序列為含有K-K/R-X-K/R一致序列之鹼性胺基酸叢集或SEQ ID NO：75之SV40 NLS。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之人工轉錄因子，其中該蛋白轉導域為SEQ ID NO：20之HIV衍生TAT肽、SEQ ID NO：25之合成肽mT02、SEQ ID NO：26之合成肽mT03、SEQ ID NO：27之R9肽或SEQ ID NO：28之ANTP域。
如申請專利範圍第1項之人工轉錄因子，其包含選自由SEQ ID NO：39至41、48至53及66至68組成之群的蛋白質序列之鋅指蛋白。
一種人工轉錄因子，其包含與抑制性或活化性蛋白質域及核定位序列融合之特異性以核受體基因之啟動子區域為目標之多指鋅指蛋白。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之人工轉錄因子，其進一步包含聚乙二醇殘基。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之人工轉錄因子。
一種用於產生如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之人工轉錄因子之大腸桿菌(E.coli)宿主細胞，其含有SEQ ID NO：99至103之表現構築體。
一種用於調節細胞對核受體之配位體的反應之如申請專利範圍第1項至第13項之人工轉錄因子。
一種如申請專利範圍第2項或第4項至第13項中任一項之人工轉錄因子的用途，其係用於製造用於治療由睪固酮調節且選自由癌症、冠狀動脈病、肥胖症、糖尿病、精神分裂症、抑鬱症及注意力不足過動症組成之群的疾病之醫藥品，其中該核受體為雄激素受體。
一種如申請專利範圍第3項至第13項中任一項之人工轉錄因子的用途，其係用於製造用於治療由雌激素調節且選自由癌症、心血管疾病、骨質疏鬆症及情感障礙組成之群的疾病之醫藥品，其中該核受體為雌激素受體。
一種如申請專利範圍第1項或第4項至第13項中任一項之人工轉錄因子的用途，其係用於製造用於治療由糖皮質激素調節且選自由發炎性過程、糖尿病、肥胖症、冠狀動脈病、哮喘、乳糜瀉及紅斑狼瘡組成之群的疾病之醫藥品，其中該核受體為糖皮質激素受體。