JP2023511501A - 新規の細胞内送達方法 - Google Patents

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Abstract

アミノ酸配列：ＲＲＳＲＴＡＲＡＧＲＰＧＲＮＳＳＲＰＳＡＰＲ［配列番号１］及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列を含む、単離された、天然に存在しない細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）。【選択図】なし

Description

本開示は、一般に、細胞膜透過性ペプチド及び関連組成物に関する。
ペプチドは、高い効能及び標的特異性のために、魅力的な診断薬及び治療薬である。しかし、治療薬としてペプチドをより広く採用するための課題の１つは、様々な組織層が一般にペプチドの細胞内侵入に対する障壁として機能するので、ほとんどのペプチドが臓器（例えば、眼）内の種々の組織にアクセスできないことである。さらに、既存ペプチド及び結合している任意のカーゴは、通常、細胞のエンドソーム及びリソソーム区画にトラップされる。
細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、様々な分子カーゴ（ナノサイズの粒子から小さな化学分子、他のペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、及びＤＮＡのフラグメントまで）の細胞への摂取／取り込みを促進するペプチドのクラスである。「カーゴ」は、共有結合を介した化学結合または非共有結合性相互作用のいずれかを介してペプチドと結合している。ＣＰＰの機能は、カーゴを細胞に送達することであり、通常は、エンドサイトーシスにより生じるプロセスである。ＣＰＰ媒介性カーゴ送達において、細胞特異性がないことにより、現在の使用が制限される。
ほとんどのｉｎ ｖｉｔｒｏで検証されたＣＰＰモダリティのｉｎ ｖｉｖｏでの失敗は、診療所において、ＣＰＰで送達された薬物がないことにより証明される。単一細胞への侵入がｉｎ ｖｉｔｒｏ環境からｉｎ ｖｉｖｏ環境に進むと、ＣＰＰ媒介性送達の問題の複雑さが大幅に増加することが問題である。Ｒ８、Ｔａｔ、及びペネトラチンなどのカノニカルＣＰＰは、蛍光標識されたＣＰＰ追跡により証明されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの取り込みを示す。しかし、治療用カーゴと組み合わせる場合、これらの例はいずれも、病状の意味ある機能的変化につながっていない。ＣＰＰ媒介性カーゴ送達の有用性が、既存のペプチドでは制限され、細胞特異性がないことと組み合わされると、任意の関連カーゴが、通常、細胞エンドソーム及びリソソーム区画にトラップされるように見える。
ｉｎ ｖｉｖｏでの、連続する正荷電アミノ酸を有する電荷密度の高いカチオン性ペプチドを含む線状ＣＰＰは、糖鎖結合により隔離され、エンドソーム／リソソームにトラップされることが既知であり、膜変形を引き起こすリン脂質頭部基を結合することが実証されている。両親媒性を高めることでＣＰＰ活性を増強することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの取り込みを増加させるための既知の設計方策であり、おそらくは、膜変形及び破壊の増加により引き起こされる毒性のために、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達を改善しない。
さらに、トリプシン及びセリンエンドペプチダーゼ、ならびにｉｎ ｖｉｖｏの他のプロテアーゼの遍在的な存在は、カチオン富化ペプチドの急速な分解を引き起こす。
従って、細胞膜透過性ペプチド送達治療薬の利点を十分に活用するために、ｉｎ ｖｉｖｏでの組織、及び臓器内の特定の組織への、ペプチド及び結合しているペイロードの送達のための組成物及び方法を開発する継続的な必要性がある。
本発明は、改善されたまたは代替の細胞膜透過性ペプチドの提供を試みる。
背景技術の以前の議論は、本発明の理解を容易にすることのみを目的としている。考察により、参照された資料のいずれかが、出願の優先日における一般的な知識の一部であるか、またはそれであったことが承認または容認されるものではない。
本発明は、アミノ酸配列
ＲＲＳＲＴＡＲＡＧＲＰＧＲＮＳＳＲＰＳＡＰＲ［配列番号１］
及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列
を含む、単離された、天然に存在しない細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を提供する。
本発明の配列は、アミノ酸レベルが、配列番号１と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の類似性、好ましくは、少なくとも約９０、９５％、または９８％の類似性を有してもよい。
好ましくは、ＣＰＰは、以下の非カノニカルアミノ酸、脂肪酸、検出可能な標識、オリゴヌクレオチド、コレステロール、及び反応性基の使用のうちの１つ以上で修飾される。
好ましくは、ＣＰＰは、目的の分子にコンジュゲートされる。目的の分子は、以下の治療薬、オリゴヌクレオチド、さらなるペプチドもしくはタンパク質、反応性基、脂肪酸、コレステロール、または検出可能な標識から選択されてもよい。好ましくは、コンジュゲートは、共有結合または非共有結合性相互作用を使用して実施される。
本発明は、さらに、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、または、目的の分子にコンジュゲートされた、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、を含む改変細胞を提供する。
本発明は、さらに、薬剤または診断薬の製造における、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、目的の分子にコンジュゲートされた、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、またはこれらのいずれかを含む改変細胞の使用を提供する。
薬剤または診断薬としての、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、目的の分子にコンジュゲートされた、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、または、これらのいずれかを含む改変細胞の使用。
（ｉ）配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、目的の分子にコンジュゲートされた、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、またはこれらのいずれかを含む改変細胞、ならびに、（ｉｉ）使用説明書、を含むキット。
本発明のさらなる特徴は、より完全には、そのいくつかの非限定的な実施形態の以下の説明で説明される。この説明は、本発明を例示する目的でのみ含まれる。これは、上記の発明の大まかな要約、開示、または説明に対する制限として理解されるべきではない。説明は、添付の図面を参照して行われるであろう。
ペプチド－ＳＭＮ１コンジュゲート及びＳＭＮ１のみで処置した４８時間後のＳＭＮ１エクソン７スキップの有効性のグラフである。 ペプチド－ＳＭＮ１コンジュゲート及びＳＭＮ１のみで処置した４８時間後の細胞生存率のグラフである。 ＲＰＥ／脈絡膜細胞においてｉｎ ｖｉｖｏでＳｍｎ ＰＭＯにコンジュゲートされた配列番号１のＣＰＰで生成されたＳｍｎエクソン７スキップの有効性のグラフである。 網膜細胞においてｉｎ ｖｉｖｏでＳｍｎ ＰＭＯにコンジュゲートされた配列番号１のＣＰＰで生成されたＳｍｎエクソン７スキップの有効性のグラフである。 注射の５日後にＳｍｎ ＰＭＯにコンジュゲートされた配列番号１のＣＰＰのＧＦＡＰ ｉｎ ｖｉｖｏ毒性のグラフである。
細胞膜透過性ペプチド
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの性能の増強に関与する細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）の特徴、例えば、連続する正荷電アミノ酸を有する電荷密度の高いカチオン性ペプチドを含む線形ＣＰＰは、多くの場合、ｉｎ ｖｉｖｏでの結果につながらない。ＣＰＰの有効性は、毒性と密接に関連し、良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方のＣＰＰに対し、有効性及び毒性間の最適のバランスが必要とされる。克服すべき重要なハードルの１つは、エンドソーム及びリソソーム内にＣＰＰカーゴ部分をトラップすることである。ここで、本発明者らは、機能的な読み出しを行うためにＣＰＰカーゴの核への局在化を必要とするアッセイを提示し、従って、効果的な場合、エンドソーム／リソソームの脱出及び／または核送達を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアミノ酸配列などの細胞の核へのカーゴの良好な送達をもたらすＣＰＰを、本発明者らは同定している。
従って、アミノ酸配列：
ＲＲＳＲＴＡＲＡＧＲＰＧＲＮＳＳＲＰＳＡＰＲ［配列番号１］
及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列
を含む、単離された、天然に存在しない細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）が提供される。
好ましくは、ＣＰＰは、１０～１００の残基を含む。例えば、ＣＰＰは、１０～５０残基、２０～３０残基、２０～４０残基、３０～７０残基、４０～６０残基、または２５～５０残基を含んでもよい。
配列番号１のアミノ酸配列アナログは、アミノ酸のうちの１つ以上が別のアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有するものを含み、この置換は、分子の生物学的活性（細胞浸透能力）を実質的に変化させない。これらのアミノ酸配列アナログは、配列番号１と比較した場合、好ましくは、保存的アミノ酸置換を有する。
本発明の文脈では、アナログ配列は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、１００、または２００アミノ酸にわたり、アミノ酸レベルが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の類似性、好ましくは、少なくとも約９０、９５％、または９８％の類似性を有するＣＣＰアミノ酸配列を含むと解釈される。特に、類似性は、通常、非必須の隣接配列よりはむしろ、配列番号１によりコードされるＣＰＰの機能に必須であることが既知である配列のそれらの領域に関して考慮されるべきである。
類似の配列は、配列番号１と、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％の同一性、好ましくは、少なくとも約９０％、９５％、または９８％の同一性を有する配列（すなわち、同一の残基）を有してもよい。アナログ配列は、配列番号１と、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％の類似性、好ましくは、少なくとも約９０％、９５％、または９８％の類似性を有する配列（すなわち、同様の物理化学的特性で保存された残基）を有してもよい。
類似性の比較は、目視で、または、より一般には、すぐに利用できる配列比較プログラムを用いて、実施することができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間の％類似性を計算し得る。％類似性は、連続する配列について計算されてもよく、すなわち、１つの配列が、他の配列とアラインされ、１つの配列の各アミノ酸が、一度に１つの残基で、もう１つの配列の対応するアミノ酸と直接比較される。これは、「ギャップのない」アラインメントと呼ばれる。通常、そのようなギャップのないアラインメントは、比較的短い数の残基（例えば、５０未満の連続するアミノ酸）に対してのみ実行される。
これは、非常に単純で一貫性のある方法であるが、例えば、他の点では、ほぼ同一の配列のペアにおいて、１つの挿入または削除により、以下のアミノ酸残基がアラインメントから外れ、それにより、潜在的に、グローバルアラインメントが実施される場合の％類似性及び同一性の大幅な低減がもたらされることは考慮に入れない。従って、ほとんどの配列比較法は、全体的な類似性スコアに過度のペナルティを課すことなく、可能な挿入及び削除を考慮した最適なアラインメントを生成するように設計される。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性を最大化しようとすることにより達成される。
アミノ酸配列の同一性及び類似性は、欧州分子生物学研究所の一部である欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）から入手可能なＥＭＢＯＳＳペアワイズアラインメントアルゴリズムツールを使用して決定されてもよい。このツールは、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／にあるウェブサイトからアクセス可能である。このツールは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０）を利用する。Ｇａｐ Ｏｐｅｎ：１０．０及びＧａｐ Ｅｘｔｅｎｄ０．５を含むデフォルト設定が利用される。デフォルトのマトリックス「Ｂｌｏｓｕｍ６２」は、アミノ酸配列及びデフォルトマトリックスに利用される。
「細胞膜透過性ペプチド」（ＣＰＰ）という用語は、細胞膜を通過することが可能なペプチドを指す。一例では、ＣＰＰは、哺乳動物の細胞膜を通過して移行し、細胞に入ることが可能である。別の例では、ＣＰＰは、コンジュゲートを所望の細胞内区画に導き得る。従って、ＣＰＰは、リン脂質、細胞、ミトコンドリア、エンドソーム、リソソーム、小胞、または核膜を通過する目的の分子の浸透を導くか、または促進し得る。ＣＰＰは、膜を通過して移行されてもよく、アミノ酸配列が、完全で無傷であるか、あるいは部分的に分解される。
ＣＰＰは、細胞の外側から原形質膜を通って、細胞質または所望の細胞内区画に目的の分子を導き得る。代替的または追加的に、ＣＰＰは、血液脳、経粘膜、血液網膜、皮膚、胃腸及び／または肺関門を通過して目的の分子を導き得る。
ＣＰＰが膜を通過して移行する能力は、エネルギー依存性もしくは非依存性、及び／または、受容体依存性もしくは非依存性であってよい。いくつかの例では、ＣＰＰは、本明細書に記載の方法で決定されるように、原形質膜を通過して移行することが実証されるペプチドである。ＣＰＰは、（ｉ）細胞に内在化されるが、その後エンドソームまたはリソソーム内にトラップされるペプチド、ならびに、（ｉｉ）細胞に内在化されるだけでなく、細胞に内在化されると、エンドソーム及び／またはリソソーム区画から脱出することが可能であり、さらに、細胞質ゾル及び核、ミトコンドリア、ゴルジ体、及び他の細胞内区画への細胞内送達を媒介することも可能なペプチド、を含む。
いくつかの例では、ペプチドは、本明細書に記載の任意の配列と比較して、１～２、１～５、または１０の保存的アミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の保存的アミノ酸置換、を含む。保存的置換（保存的変異または保存的置換とも呼ばれる）は、アミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を有する側鎖のある別のアミノ酸残基で置換されて、異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をもたらすアミノ酸置換であるが、それは、同様の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、及びサイズ）を有する。
同様の物理化学的特性を有する側鎖のあるアミノ酸残基は、当該技術分野で既知であり、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸を有するものを含み、これは、天然に存在しないアミノ酸及び非タンパク質新生アミノ酸で置換されており、それ故、これは、遺伝コードにコードされた通常のアミノ酸にはない。保存的アミノ酸置換は、さらに、Ｄ－アミノ酸を含む。
「塩基性アミノ酸」という用語は、６．３を超える等電点（Ｋｉｃｅ ＆ Ｍａｒｖｅｌｌ“Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，１９７４）またはＭａｔｔｈｅｗｓ ａｎｄ ｖａｎ Ｈｏｌｄｅ“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９６に従って測定）を有する天然及び非天然アミノ酸を含む任意のアミノ酸に関する。アルギニン、リジン、ヒスチジン、及びホモアルギニン（Ｈａｒ）、ならびに、それらの誘導体が、この定義に含まれる。好適な非天然塩基性アミノ酸は、米国特許第６，８５８，３９６号に記載される。
いくつかの例では、ＣＰＰペプチドのいずれかのアミノ酸配列は、２０～１００残基、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または２０～１００の別の数の残基からなる。他の例では、上述のペプチドのいずれかのアミノ酸配列は、３０～７０残基、例えば、３５、４０、４５、４８、５０、５２、６０、６５、または３０～７０残基の別の数の残基からなる。他の例では、上述のペプチドのいずれかのアミノ酸配列は、４０～６０残基、例えば、４２、４３、４５、４８、５０、５２、５４、５７、５８、または４０～６０残基の別の数の残基からなる。いくつかの例では、上述のペプチドのいずれかのアミノ酸配列は、３５～５０残基、例えば、３６、３８、４０、４２、４３、４５、５７、５８、または３５～５０残基の別の数の残基からなる。さらに他の例では、上述のペプチドのいずれかのアミノ酸配列は、２０～５０残基、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３５、３７、３８、４０、４２、４６、４８、または２０～５０の別の数の残基からなる。
一例では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に対応するアミノ酸配列からなる。誤解を避けるために、そのような例では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に対応するアミノ酸配列からなるが、ペプチドは、それにもかかわらず、アミノ酸配列を変更しない化学改変を含み得ることが理解されるべきである。そのような改変には、非カノニカルアミノ酸、脂肪酸、検出可能な標識、ポリヌクレオチド、コレステロール、及び反応性基の使用；非ペプチドリンカーとのＣＰＰのコンジュゲーション；ＣＰＰの目的の分子とのコンジュゲーション（治療薬、オリゴヌクレオチド、及び検出可能な標識を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。他の例では、ＣＰＰは、配列番号１に対応するアミノ酸配列からなる。
一実施形態では、ＣＣＰは、配列番号１に対応するアミノ酸配列の複数のコピー、及び、本明細書では多量体ペプチドと呼ばれる配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、を含む。いくつかの例では、多量体ペプチドは、配列番号１に対応するアミノ酸配列の２～１０コピー、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０コピーを含む。一実施形態では、ＣＣＰは、配列番号１に対応するアミノ酸配列の複数のコピー、及び、配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、を含む。
改変ＣＰＰ
ＣＰＰは、非カノニカルアミノ酸、脂肪酸、検出可能な標識、ポリヌクレオチド、コレステロール、及び反応性基を使用することにより改変されてもよい。そのような修飾ペプチドは、ペプチドの侵入の検出の促進、細胞内での局在化、細胞への侵入の増強、及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでのペプチド分解の低減などの、ＣＰＰに追加の機能を付与してもよい。
非カノニカルアミノ酸
いくつかの例では、ＣＰＰは、非カノニカルアミノ酸を含む改変ペプチドである。好適な非カノニカルアミノ酸には、α－アミノ－ｎ－酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、アロイソロイシン、ｔ－ロイシン、オルニチン、アロトレオニン、β－アラニン、β－アミノ－ｎ－酪酸、ｎ－イソプロピルグリシン、イソセリン、サルコシン、６－アミノヘキサン酸、ガンマ－アミノ酪酸、及び５－アミノ吉草酸が挙げられるが、これらに限定されない。
反応性基
他の例では、改変ＣＰＰは、反応性基を含んでもよい。好適な反応性基には、アジド基、アミン反応性基、チオール反応性基、及びカルボニル反応性基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、反応性基は、化学タグの一部である。好適な化学タグには、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＨａｌｏＴａｇ、またはＴＭＰタグが挙げられるが、これらに限定されない。一例では、化学タグは、ＳＮＡＰタグまたはＣＬＩＰタグである。ＳＮＡＰ及びＣＬＩＰ融合タンパク質は、例えばＣｏｒｒｅａ２０１５（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１２６６：５５－７９）に記載されるように、目的のタンパク質またはペプチドへの事実上いかなる分子の特異的な共有結合も可能にする。別の例では、化学タグは、ＨａｌｏＴａｇである。ＨａｌｏＴａｇには、溶液中、生細胞内、または化学的に固定された細胞内で、種々の分子を共有結合させることが可能なモジュラータンパク質タグシステムを含む。別の例では、化学タグは、ＴＭＰタグである。ＴＭＰタグは、細胞表面ではなく、細胞内のタンパク質を高い選択性で標識することができる。
脂肪酸
いくつかの例では、改変ＣＰＰは、脂肪酸を含んでもよい。改変ペプチドに好適な脂肪酸には、パルミチン酸、ミリスチン酸、カプリル酸、ラウリン酸、ｎ－オクタン酸、及びｎ－デカン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
コレステロール
他の例では、改変ＣＰＰは、コレステロールを含んでもよい。
オリゴヌクレオチド
いくつかの例では、改変ＣＰＰは、オリゴヌクレオチドを含んでもよい。そのような場合では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、またはプラスミドであってよい。
検出可能な標識
いくつかの例では、改変ＣＰＰは、検出可能な標識を含んでもよい。「検出可能な標識」という用語は、光学的、蛍光的、同位体イメージングにより、または質量分析手法により、または単純な酵素アッセイを実施することにより、検出することができる任意のタイプの分子を指す。当該技術分野で既知の任意の検出可能な標識が使用されてもよい。いくつかの例では、検出可能な標識は、レポータータンパク質、フルオロフォア、蛍光基質、発光基質、及びビオチンの中から選択される。
検出可能な標識は、レポータータンパク質であってよい。好適なレポータータンパク質には、本明細書に記載の蛍光タンパク質、Ｑｕｒｅｓｈｉ（２００７），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４２（１）：９１－９５に記載のβラクタマーゼ、ハロアルカンデハロゲナーゼ、またはルシフェラーゼが挙げられる。いくつかの例では、レポータータンパク質は、β－ラクタマーゼのアミノ酸配列を含む。
検出可能な標識は、蛍光タグであってよい。例えば、蛍光タグは、フルオロフォア、例えば、フルオレセインイソチオシアナート、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＣｙＤｙｅ、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、及びＣｙ５．５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、及びＡｌｅｘａ６４７）、または近赤外蛍光色素であってよい。蛍光タグは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＡｃＧＦＰまたはＴｕｒｂｏＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥＢＦＰ、サファイア、Ｔ－サファイア、ＥＣＦＰ、ｍＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、ミドリイシシアン、ｍＴＦＰｌ（Ｔｅａｌ）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ、ｍＢａｎａｎａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ、ａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰｌ、Ｊｒｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄｌ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄｌ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ＡＱ１４３であってよい。蛍光タグは、量子ドットであってよい。蛍光タグは、ｐＨ感受性フルオロフォア、例えば、ナフトフルオレセイン、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、及びｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）であってよい。蛍光タグは、蛍光顕微鏡、例えば、落射蛍光または共焦点顕微鏡、蛍光スキャナー、例えば、マイクロアレイリーダー、分光蛍光光度計、マイクロプレートリーダー、及び／またはフローサイトメーターを使用して検出されてもよい。
検出可能な標識は、発光基質であってよい。好適な発光基質には、Ｄ－ルシフェリン、Ｌ－ルシフェリン、セレンテラジンが挙げられるが、これらに限定されない。
検出可能な標識は、エピトープタグであってよい。例えば、エピトープタグは、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグもしくはドデカヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、またはＶ５タグであってよい。エピトープタグは、規定通りに、市販の抗体で検出される。エピトープタグが、精製及び／または検出を容易にし得ることを、当業者は認識するであろう。例えば、ヘキサヒスチジンタグを含むＣＰＰは、例えば、固体または半固体支持体に固定化されたヘキサヒスチジンタグに特異的に結合するニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）と、タンパク質を含む試料を接触させ、試料を洗浄して未結合タンパク質を除去し、続いて結合タンパク質を溶出させることにより、当該技術分野で既知の方法を使用して精製されてもよい。代替的または追加的に、エピトープタグに結合するリガンドまたは抗体は、アフィニティー精製法で使用されてもよい。
検出可能な標識は、マスタグまたは等圧タグであってよい。そのようなタグは、相対絶対定量（ｉＴＲＡＱ）に使用されてもよい。マスタグは、タンパク質及びペプチドの質量分析ベースの定量に使用される化学標識である。そのような方法では、質量分析計は、タンパク質またはペプチドの標識型及び非標識型間の質量差を認識し、例えば、Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ ｅｔ ａｌ．２００７に記載されているように、それぞれのシグナル強度を比較することにより定量化が達成される。マスタグの例には、ＴＭＴｚｅｒｏ、ＴＭＴｄｕｐｌｅｘ、ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ、及びＴＭＴ １０－ｐｌｅｘが挙げられる。相対・絶対定量化の等圧タグ（ｉＴＲＡＱ）は、例えば、Ｗｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．２００７に記載されるように、単一の実験で、種々の供給源に由来するタンパク質の量を決定するために、タンデム質量分析による定量的プロテオミクスで使用される化学タグである。
コンジュゲートされたカーゴ
ＣＰＰは、細胞への目的の分子の送達を増加させるために、目的の分子（すなわち、「カーゴ」）にコンジュゲートされてもよい。目的の分子は、治療薬、オリゴヌクレオチド、さらなるペプチドもしくはタンパク質、反応性基、脂肪酸、コレステロール、または検出可能な標識を含む。コンジュゲーションは、共有結合または非共有結合性相互作用を介するものであってよい。例えば、ＣＰＰは、「ペプチドリンカー」を介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい。部分は、特定の細胞内標的に作用するように、または輸送を特定の細胞内区画に向けるように設計されてもよい。
目的の分子は、ＣＰＰペプチドのアミノ酸に共有結合していてもよい。一例では、目的の共有結合した分子は、ＣＰＰアミノ酸配列のＮ末端に共有結合している。別の例では、目的の共有結合している分子は、ＣＰＰアミノ酸配列のＣ末端に共有結合している。他の例では、目的の共有結合している分子は、ＣＰＰのアミノ酸残基側鎖を介して（例えば、内部のリジンまたはシステイン残基で）共有結合している。当業者らは、これが、限定されないが、ペプチド結合形成、アミド結合形成、反応性アミンを介した結合、ヒドラゾン形成、ジスルフィド形成、エーテル結合、クリックケミストリー（銅触媒及び歪促進の両方）、スタウディンガー反応、ネイティブケミカルライゲーション、ならびにコンジュゲーションケミストリー、例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇイソペプチド結合形成を含む様々な化学反応を通して達成することができることを認識している。
いくつかの例では、目的の分子は、例えば、ＣＰＰ中の１つ以上の荷電アミノ酸残基と、１つ以上のＣＰＰアミノ酸残基と反対の電荷である目的の分子内の１つ以上の官能基との間の非共有結合性相互作用を介して、ＣＰＰに非共有結合的に結合している。非共有結合性相互作用は、静電相互作用、ファンデルワールス力、パイ結合相互作用、及び疎水性相互作用であってよい。
治療薬
いくつかの例では、目的のコンジュゲート分子は、治療薬、好ましくは、小分子化合物（一般にサイズが約９００ダルトン未満）であってよい。いくつかの例では、小分子治療薬は、化学療法剤、細胞傷害性分子、または細胞増殖抑制性分子である。
オリゴヌクレオチド
いくつかの例では、目的のコンジュゲート分子は、オリゴヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、またはプラスミドであってよい。オリゴヌクレオチドは、モルフォリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、及び２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、（ｉ）改変骨格構造、例えば、天然に存在するオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドに見られる標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、ならびに／または、（ｉｉ）改変糖部分、例えば、リボースまたはデオキシリボース部分ではなくモルフォリノ部分、を有してもよい。
ペプチドまたはタンパク質
いくつかの例では、目的のコンジュゲート分子は、タンパク質またはペプチドであってよい。タンパク質またはペプチドは、アポトーシス促進ペプチド、標的タンパク質、細胞傷害性タンパク質、酵素タンパク質、レポータータンパク質、ペプチドベースのタンパク質－タンパク質相互作用阻害剤、タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）ペプチド、及びドミナントネガティブペプチドであってよい。
いくつかの例では、酵素タンパク質は、ＡＳＳ－１（Ｑｕｉｎｏｎｅｚ ａｎｄ Ｔｈｏｅｎｅ ２００４）またはベータ－ラクタマーゼ（Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ ２０１８）であってよく；ペプチド相互作用阻害剤は、ＫＲＡＳ／ＳＯＳ－１タンパク質相互作用遮断ペプチドであってよく（例えば、Ｌｅｓｈｃｈｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５）；タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）ペプチド配列は、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ ２００１またはＧｕ ｅｔ ａｌ．２０１８のものであってよい。
いくつかの例では、タンパク質またはペプチドは、プロアポトーシスペプチドであってよい。
いくつかの例では、タンパク質またはペプチドは、標的タンパク質であってよい。標的タンパク質は、特定の細胞表面抗原（例えば、受容体）に結合することにより、ペプチドコンジュゲートに特異性の増加をもたらし得、次に、これは、エンドソームに内在化される。標的タンパク質の例には、アフィボディ、ｓｃＦｖ、一本鎖抗体、及び代替の足場（例えば、ペプチドアプタマー）を使用する他の選択的結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、標的化タンパク質は、ゲノム標的化タンパク質（例えば、Ｃａｓ９ゲノム標的化タンパク質またはＣｐｆ１ゲノム標的化タンパク質）であってよい。
他の例では、タンパク質またはペプチドは、内在化及びエンドソームからの脱出時に急速な細胞死を誘導する細胞傷害性タンパク質（例えば、ブガニンまたはジフテリア毒素）であってよい。
いくつかの例において、タンパク質またはペプチドは、ドミナントネガティブペプチドであってよい。ドミナントネガティブペプチドは、一般に、それらが由来するタンパク質の１つ以上の機能、及び／または全長タンパク質の相互作用パートナーの機能を阻害するように作用する。通常、それらは、タンパク質とその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用を阻害することにより作用する。いくつかの例では、ドミナントネガティブ転写因子ペプチドは、抗がんペプチドである。好適な抗がんペプチドには、以下の、Ｍａｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１６），Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２２（１８）：４６９８－４７１１に記載の活性化転写因子５（ＡＴＦ５）ドミナントネガティブペプチドｄ／ｎ－ＡＴＦ５－Ｓ１、Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００８），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６２（３）：４９１－４９８に記載のｒａｓ－ｐ２１ ９６－１１０（ＰＮＣ－２）及びｒａｓ－ｐ２１ ３５－４７などの抗Ｒａｓ－ｐ２１ドミナントネガティブペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
反応性基
いくつかの例では、目的のコンジュゲート分子は、反応性基であってよい。好適な反応性基には、アジド基、アミン反応性基、チオール反応性基、及びカルボニル反応性基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、反応性基は、化学タグの一部である。好適な化学タグには、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＨａｌｏＴａｇ、またはＴＭＰタグが挙げられるが、これらに限定されない。一例では、化学タグは、ＳＮＡＰタグまたはＣＬＩＰタグである。ＳＮＡＰ及びＣＬＩＰ融合タンパク質は、例えばＣｏｒｒｅａ２０１５（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１２６６：５５－７９）に記載されるように、目的のタンパク質またはペプチドへの事実上いかなる分子の特異的な共有結合も可能にする。別の例では、化学タグは、ＨａｌｏＴａｇである。ＨａｌｏＴａｇには、溶液中、生細胞内、または化学的に固定された細胞内で、種々の分子を共有結合させることが可能なモジュラータンパク質タグシステムを含む。別の例では、化学タグは、ＴＭＰタグである。ＴＭＰタグは、細胞表面ではなく、細胞内のタンパク質を高い選択性で標識することができる。
脂肪酸
いくつかの例では、目的のコンジュゲート分子は、脂肪酸であってよい。改変ペプチドに好適な脂肪酸には、パルミチン酸、ミリスチン酸、カプリル酸、ラウリン酸、ｎ－オクタン酸、及びｎ－デカン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
コレステロール
いくつかの例では、目的のコンジュゲート分子は、コレステロールであってよい。
検出可能な標識
いくつかの例では、目的のコンジュゲート分子は、検出可能な標識である。検出可能な標識は、光学、蛍光、同位体イメージングにより、または質量分析手法により、または単純な酵素アッセイを実行することにより、検出することができる任意のタイプの分子であってよい。当該技術分野で既知の任意の検出可能な標識が使用されてもよい。いくつかの例では、検出可能な標識は、レポータータンパク質、フルオロフォア、蛍光基質、発光基質、及びビオチンの中から選択される。
検出可能な標識は、レポータータンパク質であってよい。好適なレポータータンパク質には、本明細書に記載の蛍光タンパク質、Ｑｕｒｅｓｈｉ（２００７），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４２（１）：９１－９５に記載のβラクタマーゼ、ハロアルカンデハロゲナーゼ、またはルシフェラーゼが挙げられる。いくつかの例では、レポータータンパク質は、β－ラクタマーゼのアミノ酸配列を含む。
検出可能な標識は、蛍光タグであってよい。例えば、蛍光タグは、フルオロフォア、例えば、フルオレセインイソチオシアナート、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＣｙＤｙｅ、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、及びＣｙ５．５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、及びＡｌｅｘａ６４７）、または近赤外蛍光色素であってよい。蛍光タグは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＡｃＧＦＰまたはＴｕｒｂｏＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥＢＦＰ、サファイア、Ｔ－サファイア、ＥＣＦＰ、ｍＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、ミドリイシシアン、ｍＴＦＰｌ（Ｔｅａｌ）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ、ｍＢａｎａｎａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ、ａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰｌ、Ｊｒｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄｌ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄｌ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ＡＱ１４３であってよい。蛍光タグは、量子ドットであってよい。蛍光タグは、ｐＨ感受性フルオロフォア、例えば、ナフトフルオレセイン、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、及びｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）であってよい。蛍光タグは、蛍光顕微鏡、例えば、落射蛍光または共焦点顕微鏡、蛍光スキャナー、例えば、マイクロアレイリーダー、分光蛍光光度計、マイクロプレートリーダー、及び／またはフローサイトメーターを使用して検出されてもよい。
検出可能な標識は、発光基質であってよい。好適な発光基質には、Ｄ－ルシフェリン、Ｌ－ルシフェリン、セレンテラジンが挙げられるが、これらに限定されない。
検出可能な標識は、エピトープタグであってよい。例えば、エピトープタグは、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグもしくはドデカヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、またはＶ５タグであってよい。エピトープタグは、規定通りに、市販の抗体で検出される。エピトープタグが、精製及び／または検出を容易にし得ることを、当業者は認識するであろう。例えば、ヘキサヒスチジンタグを含むＣＰＰは、例えば、固体または半固体支持体に固定化されたヘキサヒスチジンタグに特異的に結合するニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）と、タンパク質を含む試料を接触させ、試料を洗浄して未結合タンパク質を除去し、続いて結合タンパク質を溶出させることにより、当該技術分野で既知の方法を使用して精製されてもよい。代替的または追加的に、エピトープタグに結合するリガンドまたは抗体は、アフィニティー精製法で使用されてもよい。
検出可能な標識は、マスタグまたは等圧タグであってよい。そのようなタグは、相対絶対定量（ｉＴＲＡＱ）に使用されてもよい。マスタグは、タンパク質及びペプチドの質量分析ベースの定量に使用される化学標識である。そのような方法では、質量分析計は、タンパク質またはペプチドの標識型及び非標識型間の質量差を認識し、例えば、Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ ｅｔ ａｌ．２００７に記載されているように、それぞれのシグナル強度を比較することにより定量化が達成される。マスタグの例には、ＴＭＴｚｅｒｏ、ＴＭＴｄｕｐｌｅｘ、ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ、及びＴＭＴ １０－ｐｌｅｘが挙げられる。相対・絶対定量化の等圧タグ（ｉＴＲＡＱ）は、例えば、Ｗｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．２００７に記載されるように、単一の実験で、種々の供給源に由来するタンパク質の量を決定するために、タンデム質量分析による定量的プロテオミクスで使用される化学タグである。
合成
本開示の任意のＣＰＰは、当業者に既知の化学的方法を使用して合成されてもよい。例えば、合成ペプチドは、固相、液相、もしくはペプチド濃縮の既知の手法、またはそれらの任意の組み合わせを使用して調製され、天然及び／または非天然アミノ酸を含み得る。
本開示の任意のペプチドは、組み換え手段により発現されてもよい。例えば、ペプチドをコードする核酸は、細胞系または生物における発現を調節することが可能なプロモーターまたは他の調節配列と作動可能に接続して配置されてもよい。細菌細胞での発現に適する代表的なプロモーターには、例えば、ｌａｃｚプロモーター、Ｉｐｐプロモーター、温度感受性λＬもしくはλＲプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、または半人工プロモーター、例えば、ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモーターもしくはｌａｃＵＶ５プロモーターが挙げられる。細菌細胞において本発明のペプチドを発現させるための他の多くの遺伝子構築物システムは、当該技術分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）に記載される。
細菌細胞での組み換えペプチドの発現のための多数の発現ベクターが記載されており、とりわけ、例えば、ＰＫＣ３、ｐＫＫ１７３－３、ｐＥＴ２８、ｐＣＲベクタースイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬ発現ベクタースイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはアラビノース誘導性プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するｐＢＡＤ／チオ－ＴＯＰＯシリーズのベクターを含む。
例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＳ．ｐｏｍｂｅを含む群から選択される酵母細胞などの酵母細胞における発現に適する代表的なプロモーターには、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、またはＴＥＦ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
酵母細胞で発現するための発現ベクターが好ましく、例えば、ｐＡＣＴベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＤＢｌｅｕ－Ｘベクター、ｐＰＩＣベクタースイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＡＰＺベクタースイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＨＹＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＹＤ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＰＣ８６－Ｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＨシリーズのベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＹＥＳＴｒｐシリーズのベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。
哺乳動物細胞での発現に好ましいベクターには、例えば、ｐｃＤＮＡベクタースイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴＡＲＧＥＴシリーズのベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びｐＳＶベクタースイート（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。
宿主細胞を形質転換及びトランスフェクトするための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．２００１及び他の実験室のテキストに見出すことができる。一例では、核酸は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介性形質転換を使用して、原核細胞に導入されてもよい。別の例では、核酸は、例えば、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び／またはセルフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＥＧ媒介性ＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、トガウイルス、またはレトロウイルスによる形質導入を使用することによる、リポソームにより媒介されるトランスフェクション、ならびに、例えば、ＤＮＡコーティングされたタングステンまたは金粒子を使用することによるマイクロ粒子照射を使用して、動物細胞に導入されてもよい。あるいは、核酸は、例えば、エレクトロポレーション、及びＰＥＧ媒介性形質転換などの従来の手法を使用して酵母細胞に導入されてもよい。
生成／発現／合成の後に、本開示の任意のタンパク質またはペプチドは、ＨＰＬＣなどの当該技術分野で既知の方法を使用して精製することができる。（タンパク質精製：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４の）範囲を参照のこと。
細胞発現
また、ＣＰＰ、または本明細書に記載の目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰのいずれかを含む改変細胞が本明細書に記載される。
それ故、本発明は、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、または、目的の分子にコンジュゲートされた、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、を含む改変細胞を提供する。
本発明は、さらに、薬剤または診断薬の製造における、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、目的の分子にコンジュゲートされた、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、またはこれらのいずれかを含む改変細胞の使用を提供する。
いくつかの例では、改変細胞は、原核細胞である。他の例では、改変細胞は、真核細胞である。好適な真核細胞には、酵母細胞、及び、限定されないが、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞が挙げられる。いくつかの例では、改変哺乳動物細胞は、細胞株に由来する。好適な細胞株には、ＡＲＰＥ－１９、ＣＨＯ－Ｋ１、ＨＥＫ－２９３、ＣＯＳ７、ＨｅＬａ、Ｎ２ａ、及びＮＩＨ ３Ｔ３が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、改変細胞は、１つ以上の遺伝的にコードされたＣＰＰまたは目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰを発現する。他の例では、改変細胞は、初代哺乳動物細胞である。
他の例では、改変細胞は、ＣＰＰまたは目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰをコードする外因性核酸を含まないが、ＣＰＰまたは目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰのタンパク質形質導入で改変される。
好ましくは、改変細胞は、真核細胞である。より好ましくは、真核細胞は、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの例では、ヒト細胞は、ヒト幹細胞である。そのようなヒト幹細胞には、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び間葉系幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例では、ヒト細胞には、心筋細胞、ニューロン、肝細胞、及び膵島細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の例では、哺乳動物細胞は、がん細胞（例えば、ヒトがん細胞）である。
使用
本開示は、ＣＰＰ、目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰ、または薬剤もしくは診断薬として使用される改変細胞のいずれか１つも提供する。本開示は、ＣＰＰ、目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰ、または薬剤もしくは診断薬の製造に使用される改変細胞のいずれか１つも提供する。
それ故、本発明は、薬剤または診断薬の製造における、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、目的の分子とコンジュゲートされた、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、またはこれらのいずれかを含む改変細胞の使用を提供する。
本発明は、さらに、薬剤または診断薬としての、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、目的の分子とコンジュゲートされた、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、またはこれらのいずれかを含む改変細胞の使用を提供する。
本発明の配列は、アミノ酸レベルが、配列番号１と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の類似性、好ましくは、少なくとも約９０、９５％、または９８％の類似性を有してもよい。
好ましくは、ＣＰＰは、以下の非カノニカルアミノ酸、脂肪酸、検出可能な標識、オリゴヌクレオチド、コレステロール、及び反応性基の使用のうちの１つ以上で修飾される。
好ましくは、ＣＰＰは、目的の分子にコンジュゲートされる。目的の分子は、以下の治療薬、オリゴヌクレオチド、さらなるペプチドもしくはタンパク質、反応性基、脂肪酸、コレステロール、または検出可能な標識から選択されてもよい。好ましくは、コンジュゲートは、共有結合または非共有結合性相互作用を使用して実施される。
キット
本開示は、本発明のＣＰＰ及び使用説明書を含むキットも提供する。
それ故、本発明は、（ｉ）配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、目的の分子にコンジュゲートされた、配列番号１のＣＰＰ及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列、またはこれらのいずれかを含む改変細胞、ならびに、（ｉｉ）使用説明書、を含むキットを提供する。
本発明の配列は、アミノ酸レベルが、配列番号１と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の類似性、好ましくは、少なくとも約９０、９５％、または９８％の類似性を有してもよい。
好ましくは、ＣＰＰは、以下の非カノニカルアミノ酸、脂肪酸、検出可能な標識、オリゴヌクレオチド、コレステロール、及び反応性基の使用のうちの１つ以上で修飾される。
好ましくは、ＣＰＰは、目的の分子にコンジュゲートされる。目的の分子は、以下の治療薬、オリゴヌクレオチド、さらなるペプチドもしくはタンパク質、反応性基、脂肪酸、コレステロール、または検出可能な標識から選択されてもよい。好ましくは、コンジュゲートは、共有結合または非共有結合性相互作用を使用して実施される。
定義
「カノニカルアミノ酸」という用語は、普遍的な遺伝コードのコドンに直接コードされたアミノ酸を指す。カノニカルアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンである。
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関する「内因性」または「内因的にコードされた」という用語は、問題の配列が、問題のアミノ酸配列をコードまたは発現するように実験的に改変されていないウイルス、細胞、または生物に固有であることを示す。
ペプチドに関する「天然に存在しない」という用語は、（ｉ）問題のペプチドのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列をコードする内因性遺伝子またはオープンリーディングフレームがないこと、及び、（ｉｉ）これのアミノ酸配列が問題のペプチドからなる内因性タンパク質フラグメントがないこと、を示すと理解されるであろう。例えば、内因的に発現されたタンパク質のフラグメントのアミノ酸配列からなるペプチドは、タンパク質フラグメント自体が自然に発現されないか、または、通常は、内因的に発現されたタンパク質の副産物として生じない場合、天然に存在しないペプチドと見なされる。
「ペプチド」という用語は、アミド結合で結合されているアミノ酸残基から構成される化合物を含むことが意図される。ペプチドは、天然または非天然のリボソームでコードされても、合成で誘導されてもよい。通常、ペプチドは、２～２００アミノ酸からなるであろう。例えば、ペプチドは、該範囲（複数可）内の任意の長さを含む、１０～２０アミノ酸または１０～３０アミノ酸または１０～４０アミノ酸または１０～５０アミノ酸または１０～６０アミノ酸または１０～７０アミノ酸または１０～８０アミノ酸または１０～９０アミノ酸または１０～１００アミノ酸の範囲の長さを有してもよい。ペプチドは、約１５０アミノ酸未満または約１２５アミノ酸未満または約１００アミノ酸未満または約９０アミノ酸未満または約８０アミノ酸未満または約７０アミノ酸未満または約６０アミノ酸未満または約５０アミノ酸未満を含んでも、それらからなってもよい。
本明細書で言及されるペプチドは、全てのＬ－アミノ酸が対応するＤ－アミノ酸で置換されている「インベルソ」ペプチド、及び、アミノ酸の配列が逆になっており、全てのＬ－アミノ酸がＤ－アミノ酸で置換されている「レトロ－インベルソ」ペプチドを含む。
ペプチドは、Ｌ型及び／またはＤ型の両方のアミノ酸を含んでもよい。例えば、Ｌ型及びＤ型の両方は、同じペプチド配列内の種々のアミノ酸に使用されてもよい。いくつかの例では、ペプチド配列内のアミノ酸は、天然アミノ酸などのＬ型である。いくつかの例では、ペプチド配列内のアミノ酸は、Ｌ型及びＤ型の組み合わせである。いくつかの例では、ペプチド配列内のアミノ酸は、全てＤ型である。
ペプチドは、周知の固相ペプチド合成手法及び精製手法を使用して合成されてもよい。
「タンパク質」という用語は、単一のポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合で結合している一連の連続するアミノ酸、または互いに共有結合もしくは非共有結合的に結合している一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むと解釈されなければならない。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合またはジスルフィド結合を使用して共有結合的に結合させることができる。非共有結合の例には、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。
全般
本明細書に記載の発明が、具体的に記載されるもの以外の変形及び修正を受けやすいことを、当業者らは理解するであろう。本発明は、そのような全ての変形及び修正を含む。本発明は、本明細書で、個別または集合的に言及または示される全てのステップ、特徴、製剤、及び化合物、ならびに、ステップまたは特徴のうちのありとあらゆる組み合わせまたはそれらのうちの任意の２つ以上も含む。
本文で引用された各文書、参考文献、特許出願、または特許は、全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれ、このことは、それが、本文の一部として読者により読まれて、検討されなければならないことを意味する。本文で引用された文書、参考文献、特許出願、または特許が、本文で繰り返されないことは、単に、簡潔さの理由によるものである。
本明細書または本明細書に参照により組み込まれる任意の文書に記載の任意の製品についての製造業者の指示、説明、製品仕様、及び製品シートは、本明細書で参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に用いられてもよい。
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態のいずれかにより範囲が限定されるべきではない。これらの実施形態は、例示のみを目的とすることが意図される。機能的に同等の製品、製剤、及び方法は、本明細書に記載の本発明の範囲内にあることは明らかである。
本明細書に記載の発明は、１つ以上の範囲の値（例えば、サイズ、変位、及び電界強度など）を含んでもよい。値の範囲は、範囲を定義する値、及び範囲の境界を定義するその値に直接隣接する値と同じまたは実質的に同じ結果をもたらす範囲に隣接する値を含む、範囲内の全ての値を含むことが理解されるであろう。従って、反対の指示がない限り、明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明により得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。従って、「約８０％」は、「約８０％」及び「８０％」も意味する。控えめに言っても、各数値パラメータは、有効桁数及び通常の四捨五入アプローチに照らして解釈されるべきである。
本明細書全体にわたって、文脈に別途要求のない限り、「含む」という単語または「含む」もしくは「含むこと」などの変形形態は、規定した整数または整数群を含むが、他の任意の整数または整数群を除外することを意味すると理解されるだろう。また、本開示、特に、特許請求の範囲及び／または段落において、「含む」、「含まれた」、「含むこと」などの用語は、米国特許法におけるそれに起因する意味を有し得、例えば、それらは、「含む」、「含まれた」、「含むこと」などを意味し得ること、ならびに、「から本質的になること」及び「本質的にからなる」などの用語は、米国特許法におけるそれらに起因する意味を有し、例えば、それらは、明示的に列挙されていない要素を可能にするが、先行技術に見られる要素または本発明の基本的または新規の特徴に影響を与える要素は除外されること、が強調される。
本明細書で使用される選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な説明内に見出され、全体に適用してもよい。別途定義のない限り、本明細書で使用される他の全ての科学及び技術用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。「活性薬」という用語は、１つの活性薬を意味しても、２つ以上の活性薬を含んでもよい。
以下の例は、本発明の様々な態様を実施するために企図される最良のモードを記載するのに限らず、上記の発明を使用する仕方をより完全に説明するのに役立つ。これらの方法は、本発明の真の範囲を制限するのに役立つことは決してなく、むしろ、例示の目的で提示されることが理解される。
本発明のさらなる特徴は、以下の非限定的な実施例においてより完全に説明される。この説明は、本発明を例示する目的でのみ含まれる。上記のように、本発明の大まかな説明に対する制限として理解されるべきではない。
実施例１
潜在的なＣＰＰペプチドは、歪促進（ＳＰＡＡＣ）クリックケミストリー（Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１６）を使用して、ＳＭＮ１遺伝子のエクソン７を標的とするホスホロジアミダートオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）に結合された（Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ ２０１８）。ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートを、完全培地のＡＲＰＥ－１９細胞上で２日間インキュベートした。内在化の有効性を、ＲＮＡ抽出によるＳＭＮ１遺伝子ＲＮＡ転写産物のエクソン７スキップの程度で測定した。％ｄ７の転写産物がＰＭＯ処置単独よりも高いペプチド－ＰＭＯは、ＣＰＰと見なされた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＰＰ－ＳＭＮ１アッセイの導入
生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）遺伝子は、遍在的に発現され、スプライセオソームの集合及びリボ核タンパク質の生合成において重要な役割を果たす。ＳＭＮ１遺伝子のスプライシング調節が解明されている（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ ２０１２）。エクソン７がスキップされるＳＭＮ１のスプライスバリアントは、Ｄ７－ＳＭＮ１と呼ばれるより短いＳＭＮタンパク質をもたらす既知のアイソフォームである。細胞膜透過性ペプチド送達ホスホロジアミダートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）を使用するエクソンスキップは、ＣＰＰの有効性をテストするための実行可能な経路として確立されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２００７）。
ＳＭＮ１遺伝子を使用して、種々のＣＰＰにコンジュゲートされたホスホロジアミダートモルフォリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）を使用するエクソン７でＳＭＮ１遺伝子（Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ ２０１８）を標的とするエクソンスキップアッセイを、本発明者らは構築した。ＰＭＯカーゴを核に効率的に送達し、ＳＭＮ１のエクソンスキップに影響を与える得るＣＰＰを同定するために、このアッセイを使用した。ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ生成、及びＳＭＮ１特異的プライマーを使用するＰＣＲを使用して、Ｄ７－ＳＭＮ１ ＲＮＡ転写産物の変化を測定することにより、送達及び機能の効率を決定した。効率は、Ｄ７－ＳＭＮ１転写産物の割合が高いほど、ＣＰＰによる核への送達が良好であると解釈された。
このアッセイの特性を考えると、フルメディアの存在下でのプロテアーゼ消化のために、天然のＬ－ペプチドの特徴は望ましくない。ペプチドのＣＰＰ能力を適切に評価するために、全ての塩基性残基がＤ－アミノ酸である混合Ｌ／Ｄアミノ酸含有ペプチド、または完全Ｄアミノ酸含有ペプチドのいずれかとして、ペプチドを合成した。アプローチの両方は、細胞でのインキュベーション中にペプチドをタンパク質分解から保護した。
方法
哺乳動物の組織培養
ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２３０２）からＡＲＰＥ－１９細胞を得た。５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーターで、細胞株を維持し、完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１、１０％のＦＣＳ；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｘのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ １００ｕ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で培養した。
ペプチド及びＰＭＯの合成、ならびにＰＰＭＯのコンジュゲート
標準のＦｍｏｃ ＳＰＰＳベースの方法（Ｐｅｐｓｃａｎ ＧｍｂＨ、蘭国レリスタット、及びＭｉｍｏｔｏｐｅｓ、オーストラリアビクトリア州モルグレイブ）を使用して、ＣＰＰを合成した。全ての配列は、ＰＭＯへのカップリングを可能するＣ末端アジドリジン残基を含有していた。全てのＮ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化した。
Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）が開発した方法を使用して、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣ、米国オレゴン州フィロマス）で、５’シクロオクチンハンドルを含むＳＭＮ１ ＰＭＯ（ＡＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＣＴ）［配列番号２］を生成した。
歪促進クリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１６）を使用して、Ｃ末端アジドリジンを有するＣＰＰペプチドを、５’－シクロオシチンＰＭＯと化学選択的にコンジュゲートした。アジド官能化ペプチド及びシクロオクチン官能化ＰＭＯ間の環化付加反応は、５％のＤＭＳＯを含むリン酸緩衝生理食塩水中、３７℃で３～４日間実施した。未反応の物質からペプチド－ＰＭＯ（ＰＰＭＯ）コンジュゲートをイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）で分離し、脱塩した。最終画分を、分析用逆相ＨＰＬＣ及びＬＣ／ＭＳで分析した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＭＮ１有効性アッセイ
公開されたプロトコール（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ ２００２，Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，４，６４４－６５４）に従って、エクソンスキップアッセイ及びＰＣＲ検出を実施した。
網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）不死化細胞を、様々な濃度（４ｕＭ、２ｕＭ、１ｕＭ、２回ずつ）のＣＰＰ－ＰＭＯコンジュゲートで処置し、ＲＮＡ抽出及び精製による処置の４８時間後に、ＳＭＮ１転写産物レベル、続いて、ｃＤＮＡの生成及びＰＣＲを評価した。
細胞を２４ウェルプレート（ＡＲＰＥ－１９、２．５×１０４細胞／ウェル）の完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１、１０％のＦＣＳ；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ １００ｕ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）に播種した。細胞を一晩（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートして、細胞を接着させた。アッセイ当日に、培地を吸引し、処置培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１、１０％のＦＣＳ；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ １００ｕ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で希釈されたＣＰＰ－ＰＭＯまたはＰＭＯのみで置換し、続いて、２４時間インキュベーションした（３７℃、５％のＣＯ２）。翌日、新鮮な培地１：１を添加し、細胞をさらに２４時間インキュベーターに戻した。
処置の４８時間後、細胞培地を慎重に吸引し、細胞をＰＢＳですすいだ。製造者のプロトコールに従って市販のＲＮＡ抽出キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｕｒｕｍ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ９６キット；ＲＮＡ収量の定量化；Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＲＮＡ ＢＲキット）を使用して、処置された細胞からのＲＮＡを得た。
抽出されたＲＮＡを精製し、定量し、次に、１０ｎｇ／ｕｌに希釈した。製造者のプロトコール（ＢｉｏＲａｄ ｉＳｃｒｉｐｔ）に従い、市販の逆転写キットを使用して、ｃＤＮＡを生成した。目的の領域を増幅するように設計されたプライマーを用いたテンプレートとして、生成されたｃＤＮＡを使用して、ＤＮＡを増幅した。ＳＭＮ１遺伝子（ＬＣ－ＧＸ核酸アナライザー）の全長（ＦＬ ＳＭＮ１）及びエクソン－７スキップフラグメント（Ｄ７－ＳＭＮ１）を定量し、割合を計算することにより、エクソンスキップの有効性を決定した。Ｄ７－ＳＭＮ１ ＤＮＡの割合が高いほど、ＣＰＰ送達効率が高くなる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＭＮ１生存率アッセイ
細胞を９６ウェルプレート（ＡＲＰＥ－１９、４×１０３細胞／ウェル）の完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１、１０％のＦＣＳ；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ １００ｕ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）に播種した。細胞を一晩（３７℃、５％のＣＯ２）インキュベートして、細胞を接着させた。アッセイ当日に、培地を吸引し、様々な濃度（３２、１６、８、４、２、及び１ｕＭ）の処置培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１、１０％のＦＣＳ；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ １００ｕ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で希釈されたＣＰＰ－ＰＭＯまたはＰＭＯのみで置換し、続いて、２４時間インキュベーションした（３７℃、５％のＣＯ２）。翌日、新鮮な培地１：１を添加し、細胞をさらに２４時間インキュベーターに戻した。
処置の４８時間後、市販のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、オーストラリア）を使用して、細胞の生存率を測定した。簡単に説明すると、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬は、細胞を溶解させ、存在するＡＴＰの量に比例する発光シグナルを生じ、これは、培養中に存在する生細胞数に正比例する。既知の細胞傷害剤であるメリチン（Ｒｅｎａｔａ ｅｔ ａｌ．２００７）、及び細胞のみの対照を用いて、全てのアッセイを実施した。細胞生存率を使用して、ＣＰＰ－ＰＭＯコンジュゲートにより引き起こされる毒性のレベルを決定した。高生存率は、低毒性に相当し、低生存率は、高毒性に相当する。
結果
図１及び表１では、４ｕＭ、２ｕＭ、及び１ｕＭで、ＳＭＮ１ ＰＭＯにコンジュゲートされた配列番号１のＣＰＰは、ＳＭＮ１ ＰＭＯ単独よりも多くの切断型Ｄ７－ＳＭＮ１転写産物を生じる。誘導されたＳＭＮ１エクソンスキップの有効性は、適用されたペプチド－ＰＭＯコンジュゲートの用量反応曲線に従う。ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートは、ＳＭＮ１エクソンスキップの誘導において、ＳＭＮ１ ＰＭＯのみの処置よりも効率的である（２ｕＭで１．２倍）。従って、配列番号１に記載のペプチドは、効果的な細胞膜透過性及び核送達剤である。
図２及び表２では、３２ｕＭのペプチド－ＰＭＯコンジュゲート 対 ＰＭＯ単独で４８時間処置されたＡＲＰＥ－１９細胞の生存率は、ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートの添加が、ＰＭＯのみよりも細胞生存率への有害性が低い（１．０５倍）ことを明らかに示す。これは、ペプチドの細胞膜透過性及び核送達作用が、細胞の健康に有害ではなく、カチオン性細胞膜透過性ペプチドに通常関連する固有の毒性を引き起こさないことを示す。
Figure 2023511501000001
Figure 2023511501000002
実施例２
実施例１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＭＮ１有効性アッセイは、マウス体内におけるＳｍｎ遺伝子の遍在的分布を考えると、ｉｎ ｖｉｖｏ環境に等しく適用可能であり、Ｓｍｎは、ヒトＳＭＮ１のマウスオルソログである。体内に膨大な数のプロテアーゼが存在するため、ｉｎ ｖｉｖｏ環境では、天然のＬ－ペプチドの使用は望ましくない。ペプチドの細胞膜透過性能を適切に評価するために、全ての塩基性残基がＤ－アミノ酸である混合Ｌ／Ｄアミノ酸含有ペプチド、または、完全Ｄアミノ酸含有ペプチドのいずれかとしてペプチドを合成した。動物への全身投与中のタンパク質分解からペプチドを保護するために、両方のアプローチが確立されている。
マウスの硝子体液に投与して、５、７、２１、及び２８日後の網膜、ＲＰＥ、及び脈絡膜細胞層のＳｍｎ転写産物レベルの変化を測定することにより、ＣＰＰ－ＰＭＯがＳｍｎカーゴを、眼内の後部のＲＰＥ細胞にｉｎ ｖｉｖｏ送達する能力を評価した。Ｓｍｎ ＰＭＯ（配列番号２）にコンジュゲートされた本発明のＣＰＰ（配列番号１）及び対照ＣＰＰ Ｐｉｐ６ａ（配列番号３）を、眼毎に１．６ｕｇ（０．５ｕｌ体積）の硝子体内注射で投与した。処置後の所望の時点で、動物を殺処分し、眼を解剖し、組織層を均質化し、実施例１と同じプロトコールを使用してＲＮＡを抽出した。
対照ＣＰＰ Ｐｉｐ６ａは、非天然アミノ酸（Ｘ及びＢ）：
ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＹＱＦＬＩＲＸＲＢＲＸＲＢ［配列番号３］
Ａｒｇ Ａｈｘ Ａｒｇ Ａｒｇ ベータ－Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｈｘ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｈｘ Ａｒｇ ベータ－Ａｌａ Ａｒｇ Ａｈｘ Ａｒｇ ベータ－Ａｌａ
（式中、Ｘ＝Ａｈｘ＝アミノヘキサン酸；Ｂ＝ベータ－アラニン＝ベータ－アラニン）
を含有する。
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ生成、及びＳｍｎ特異的プライマーを使用するＰＣＲを使用して、全長からエクソン－７スキップフラグメント（Ｄ７－Ｓｍｎ）ＲＮＡ転写産物へのＳｍｎ ＲＮＡ転写産物の変化を測定することにより、様々な臓器への送達及び作用の効率を決定した。効率は、Ｄ７－Ｓｍｎ転写産物の割合が高いほど、ＣＰＰによる組織への送達が良好であると解釈された。
グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、中間径フィラメントの細胞骨格タンパク質である。ＧＦＡＰのレベルは、いくつかの細胞型の損傷またはストレスに強く影響され、ＧＦＡＰの発現は、中枢神経系の損傷の重要なマーカーになっている。眼内では、網膜損傷後にかなり増加するミュラーグリア細胞は通常、低レベルのＧＦＡＰを発現する。硝子体内（ＩＶＴ）投与後に比較的増加したＧＦＡＰ発現を誘発するペプチドは、より毒性が高いと見なされる。
方法
ペプチド及びＰＭＯの合成ならびにペプチド－ＰＭＯコンジュゲーション
標準のＦｍｏｃ ＳＰＰＳベースの方法（Ｐｅｐｓｃａｎ ＧｍｂＨ、蘭国レリスタット、及びＭｉｍｏｔｏｐｅｓ、オーストラリアビクトリア州モルグレイブ）を使用して、ＣＰＰを合成した。全ての配列は、ＰＭＯへのカップリングを可能するＣ末端アジドリジン残基を含有していた。全てのＮ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化した。
５’シクロオクチンハンドルを含むＳｍｎ ＰＭＯ（ＡＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＣＴ；配列番号２）は、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣ、米国オレゴン州フィロマス）が生成した。
歪促進クリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１６）を使用して、Ｃ末端アジドリジンを含むＣＰＰペプチドを５’－シクロオシチンＰＭＯと化学選択的にコンジュゲートし、イオン交換クロマトグラフィーで精製し、ＬＣ－ＭＳで定量した。
ｉｎ ｖｉｖｏ Ｓｍｎ有効性アッセイ（ＩＶＴ投与）
公開されたプロトコール（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ ２００２，Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，４，６４４－６５４）に従って、エクソンスキップアッセイ及びＲＴ－ＰＣＲ検出を実施した。
マウス（Ｃ５７Ｂ／６；７週齢）は、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＡＢＲ）から供給された。選択されたＣＰＰ－ＰＭＯを、処置群当たり１～３匹のマウスの硝子体に１眼当たり１．６ｕｇ（０．５ｕｌ）で注射した。
処置の４８時間後、マウスを殺処分し、以下の眼組織：網膜、ＲＰＥ層、またはＲＰＥ／脈絡膜の組み合わせを採取した。組織を均質化し、製造者のプロトコールに従って市販のＲＮＡ抽出キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｕｒｕｍ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ９６キット；ＲＮＡ収量の定量化；Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＲＮＡ ＢＲキット）を使用して、ＲＮＡを取得した。
抽出されたＲＮＡを精製し、定量し、次に、１０ｎｇ／ｕｌに希釈した。製造者のプロトコール（ＢｉｏＲａｄ ｉＳｃｒｉｐｔ）に従い、市販の逆転写キットを使用して、ｃＤＮＡを生成した。目的の領域を増幅するように設計されたプライマーを用いたテンプレートとして、生成されたｃＤＮＡを使用して、ＤＮＡを増幅した。Ｓｍｎ遺伝子（ＬＣ－ＧＸ核酸アナライザー）の全長（ＦＬ Ｓｍｎ）及びエクソン－７スキップフラグメント（Ｄ７－Ｓｍｎ）を定量し、割合を計算することにより、エクソンスキップの有効性を決定した。Ｄ７－Ｓｍｎ ＤＮＡの割合が高いほど、ＣＰＰ送達効率が高くなる。
ＧＦＡＰ ｉｎ ｖｉｖｏ毒性アッセイ
上記のｉｎ ｖｉｖｏＳｍｎ有効性アッセイの一部として得られたｃＤＮＡの増幅を介して、ＧＦＡＰ ｍＲＮＡの発現を定量した。ＢｉｏＲａｄ液滴生成装置及びリーダー（ＱＸ２００ ＤＧ８）及びサーモサイクラー（Ｔ１００）、マウスＧｆａｐ（ｄＭｍｕＣＰＥ５１１６１２６）の特定のプローブ及びハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈ、Ｅｅｆ１ａ１及びＲｐｌ２７（ｄＭｍｕＣＰＥ５１９５２８３、ｄＭｍｕＣＰＥ５１０１７３２、及びｄＭｍｕＣＰＥ５１９７０８３）、ならびに、ｄｄＰＣＲプローブに対するマスターミックス（＃１８６３０２４）及びＢｉｏＲａｄ製の他のｄｄＰＣＲ専用消耗品（＃１８６３００５、１２００１９２５、１８６３００４、１８６４００７）を使用して、ｄｄＰＣＲを実施した。
ＢｉｏＲａｄ ｄｄＰＣＲソフトウェアによりコピー／ｕＬで、アッセイ結果を得た。次に、実験間で比較するために、これをハウスキーピング遺伝子に正規化した。比較的増加したＧＦＡＰ発現を誘発するペプチドは、より毒性が高いと見なされる。
結果
図３及び４ならびに表３及び４では、Ｓｍｎ ＰＭＯにコンジュゲートされた配列番号１のＣＰＰは、Ｓｍｎ ＰＭＯ単独よりも多くの短縮型Ｄ７－Ｓｍｎ転写産物を作成する。ペプチド－ＰＭＯコンジュゲートは、Ｓｍｎ ＰＭＯのみの処置、または競合物質のＣＰＰ Ｐｉｐ６ａよりもＳｍｎエクソンスキップを誘導するのにより効率的である（Ｂｅｔｔｓ ｅｔ．ａｌ．２０１２）。従って、配列番号１に記載のペプチドは、効果的なｉｎ ｖｉｖｏ細胞膜透過性及び核送達剤である。
図５及び表５では、Ｓｍｎ ＰＭＯにコンジュゲートされた配列番号１のＣＰＰは、ＧＦＡＰの発現をほとんど誘発せず、５日でＰＭＯ単独よりも高くなく、競合物質ＣＰＰ Ｐｉｐ６ａよりもはるかに低い。従って、配列番号１に記載のペプチドは、臨床的に適切な濃度で硝子体内に投与された場合、ｉｎ ｖｉｖｏで非毒性であると見なされる。
Figure 2023511501000003
Figure 2023511501000004
Figure 2023511501000005
参考文献
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・Ｌｅｓｈｃｈｉｎｅｒ ＥＳ，Ｐａｒｋｈｉｔｋｏ Ａ，Ｂｉｒｄ ＧＨ，Ｌｕｃｃａｒｅｌｌｉ Ｊ，Ｂｅｌｌａｉｒｓ ＪＡ，Ｅｓｃｕｄｅｒｏ Ｓ，Ｏｐｏｋｕ－Ｎｓｉａｈ Ｋ，Ｇｏｄｅｓ Ｍ，Ｐｅｒｒｉｍｏｎ Ｎ，Ｗａｌｅｎｓｋｙ ＬＤ．Ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ＫＲＡＳ ｂｙ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ－ｓｔａｐｌｅｄ ＳＯＳ１ ｈｅｌｉｃｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１５ Ｆｅｂ １０；１１２（６）：１７６１－６．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１３１８５１１２．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｊａｎ ２６．ＰＭＩＤ：２５６２４４８５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４３３０７４２．
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Claims (10)

  1. アミノ酸配列：
    ＲＲＳＲＴＡＲＡＧＲＰＧＲＮＳＳＲＰＳＡＰＲ［配列番号１］
    及び配列番号１と少なくとも６０％の類似性を有する配列
    を含む、単離された、天然に存在しない細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）。
  2. アミノ酸レベルで、配列番号１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の類似性を有する、請求項１に記載のＣＰＰ。
  3. 以下の非カノニカルアミノ酸、脂肪酸、検出可能な標識、オリゴヌクレオチド、コレステロール、及び反応性基の使用のうちの１つ以上で修飾される、請求項１に記載のＣＰＰ。
  4. 目的の分子にコンジュゲートされる、請求項１に記載のＣＰＰ。
  5. 前記目的の分子が、以下の治療薬、オリゴヌクレオチド、さらなるペプチドもしくはタンパク質、反応性基、脂肪酸、コレステロール、または検出可能な標識から選択される、請求項４に記載のＣＰＰ。
  6. 前記コンジュゲーションが、共有結合または非共有結合性相互作用を使用して実施される、請求項４に記載のＣＰＰ。
  7. 請求項１に記載のＣＰＰまたは請求項４に記載の目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰを含む、改変細胞。
  8. 薬剤または診断薬の製造における、請求項１に記載のＣＰＰ、請求項４に記載の目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰ、または請求項７に記載の改変細胞の使用。
  9. 薬剤または診断薬としての、請求項１に記載のＣＰＰ、請求項４に記載の目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰ、または請求項７に記載の改変細胞の使用。
  10. （ｉ）請求項１に記載のＣＰＰ、請求項４に記載の目的の分子にコンジュゲートされたＣＰＰ、または請求項７に記載の改変細胞、及び、（ｉｉ）使用説明書、を含む、キット。
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