KR20210097547A - 생체 물질 전달용 세포 투과성 펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 세포 투과성 펩타이드에 관한 것으로서, 상기 세포 투과성 펩타이드의 적어도 하나의 말단에 하나 이상의 아미노산을 포함하는 생체 물질 결합성 펩타이드가 생체 물질과 결합하여 세포 내로 생체 물질을 전달할 수 있는 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다.
세포는 세포막으로 둘러싸인 세포질로 구성되어 있으며, 단백질 및 핵산과 같은 많은 생체 분자들을 포함하고 있다.
진핵세포는 세포 내에 세포핵을 포함하고 있는데, 핵은 유전자가 변형되지 않게 유지하고 유전자 발현을 조절함으로써 세포 활성 및 세포 분열을 조절하며 유전에 관여한다.
유전자 발현은 DNA에 저장된 유전정보에 기초하여, 세포핵에서 DNA를 이용하여 RNA를 만든 후, RNA로 단백질을 합성함으로써 발현된다. 세포핵에서 발현된 유전정보를 통해 얻어지는 다양한 단백질은 세포 활성 및 기능을 수행하는 역할을 하므로 생명 유지에 큰 영향을 미친다.
이와 같이 세포핵의 중요한 역할과 유전자 발현을 조절하기 위해서는 세포핵이 존재하는 세포질 내로 물질의 유입을 차단하는 것이 중요하다. 세포막은 인지질 이중막으로 구성되어, 세포질과 세포 외부를 분리시키고, 외부의 물질이 세포 내로 유입되는 것을 방지한다.
상기와 같은 DNA의 세포 내 작용을 이용하여, 사람의 질병을 치료하기 위해, 약물을 통해 DNA를 세포 내로 유입시키고, 최종적으로 핵 내로 유입된 DNA가 질병을 치료할 수 있는 단백질을 합성할 수 있도록 하는 치료법 등이 다양하게 개발되고 있다.
그러나, 상술한 바와 같이, 세포의 기능을 유지할 수 있도록 세포 외부에서 외부의 물질이 유입되는 것을 방지하고, 세포 내의 소기관을 보호하기 위해 존재하는 세포막은 세포 내외로의 전달이 필요한 물질들은 특별한 채널이나 통과 기작을 이용하여 한정적으로 투과가 가능하도록 구성되어 있는 바, 외부로부터 세포 내로 물질을 유입시키는 것이 용이하지 않다.
본 발명의 발명자들은 상술한 과제를 해결하고자 연구를 거듭한 끝에, 신규한 아미노산 서열을 가진 펩타이드로서 세포 투과성을 가지며, 펩타이드의 말단에 생체 물질을 직, 간접적으로 연결하여 세포 내로 생체 물질을 전달할 수 있는 기능을 가지는 신규한 펩타이드를 개발하기에 이르렀다.
본 발명은 세포 투과성을 가지는 신규한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 세포 투과성 펩타이드에 생체 물질을 직, 간접적으로 연결하여 세포 내로 해당 생체 물질을 전달할 수 있는 신규한 세포 투과성 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 세포 독성이 양호한 신규한 세포 투과성 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드를 이용하여 세포 내로 생체 물질을 전달하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 해결과제들을 해결하기 위한 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 이의 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 포함하는 생체 물질 결합성 펩타이드가 결합된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 생체 물질 결합성 펩타이드가 생체 물질과 결합하여 세포 내에 상기 생체물질을 세포 내로 전달하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체 물질은 DNA, RNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 DNA 결합 도메인(DNA-Binding Domain, DBD)과 결합되어 있을 수 있다.
본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 별도의 채널이나 기작에 의하지 않고도 세포 내로 투과할 수 있는 효과를 가진다.
본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 이의 말단에 추가 단백질이나 기능기를 연결하여도, 세포 투과 능력이 저하되지 않는 효과를 가진다.
본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 이의 말단에 직, 간접적으로 생체 물질을 연결하여, 세포 내로 투과됨으로써 세포 내로 생체물질을 전달할 수 있는 효과를 가진다.
본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 질병의 치료, 체질개선 등을 위해 생체 물질을 세포 내로 전달할 수 있는 효과를 가진다.
도 1은 플라스미드 DNA인 pEGFP-N1 (Clontech)의 개열 지도이다;
도 2은 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드 및 리포펙타민을 각각 사용하여 HEK293 세포에 대한 플라스미드 DNA의 전달 효율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 3은 실시예의 KHE-CPP 펩타이드의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 4는 실시예의 KHE-DBD 펩타이드의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸그래프이다.
도 2은 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드 및 리포펙타민을 각각 사용하여 HEK293 세포에 대한 플라스미드 DNA의 전달 효율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 3은 실시예의 KHE-CPP 펩타이드의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다;
도 4는 실시예의 KHE-DBD 펩타이드의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸그래프이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 각 구성을 보다 상세히 설명하나, 이는 하나의 예시에 불과할 뿐, 본 발명의 권리범위가 다음 내용에 의해 제한되지 아니한다.
본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이면, 추가 아미노산이 연결되어 있는 것이라도 이에 해당될 수 있다.
예를 들어, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 다음 서열번호 1과 같다.
서열번호 1: KHEERQDEHGFI
상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 말단에 추가 펩타이드를 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드일 수 있다. 즉, 상기 서열번호 1과 같이 12개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있다.
본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 이의 N-말단 및/또는 C-말단에 추가 아미노산 내지는 펩타이드가 결합된 것일 수 있다.
상세하게는, 상기 추가 아미노산 내지는 펩타이드는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 생체 물질 결합성 펩타이드일 수 있다.
본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 생체 물질과 직, 간접적으로 결합한 상태로 세포를 투과하여 세포 내로 생체 물질을 전달하는 역할을 하는 바, 생체 물질은 추가 아미노산이나 펩타이드와 같이 직접 상기 세포 투과성 펩타이드의 말단에 연결된 것일 수도 있고, 말단에 연결된 펩타이드에 결합될 수 있는 생체 물질일 수 있다.
상기 생체 물질은, 예를 들어, DNA, RNA, 단백질 등의 생체 내에서 기능을 가지는 물질일 수 있고, 이 외의 물질이라도 세포 내로 전달될 필요가 있는 물질이면 어떠한 것이든 제한되지 않고 적용이 가능하다.
상세하게는, 상기 세포 투과성 펩타이드는 DNA 결합 도메인(DNA-Binding Domain, DBD)와 결합된 것일 수 있고, 이에 따라, DBD와 결합된 세포 투과성 펩타이드에 DNA가 DBD에 결합된 상태로 상기 세포 투과성 펩타이드가 세포 내로 유입된 후, DNA가 상기 세포 투과성 펩타이드로부터 릴리즈됨으로써, 세포 내로 DNA가 전달되는 효과를 가진다.
구체적으로, 상기 생체 물질 결합성 펩타이드의 하나인 DBD의 아미노산 서열은 하기의 서열번호 2와 같다. 다만, 이는 하나의 예시에 해당되는 펩타이드로서, 대한민국 특허출원 10-2015-0131427호에 개시된 DBD 펩타이드이다. 이는 하나의 가능한 예시에 불과할 뿐, 생체 물질과 결합할 수 있는 기능을 가지는 다른 어떤 펩타이드나 아미노산, 작용기 등이 결합되는 것도 가능하다.
서열번호 2: KSPKKAKKKSPKKAKK
상기 DBD와 결합된 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 예를 들어, 하기의 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 것일 수 있다. 마찬가지로, 이는 하나의 예시적인 펩타이드 형태에 불과할 뿐, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 이상 다양한 형태로 구현이 가능하다.
서열번호 3: KHEERQDEHGFIKSPKKAKKKSPKKAKK
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명하나, 이는 하나의 예시에 불과할 뿐, 본 발명의 권리범위가 다음 내용에 의해 제한되지 아니한다.
[실시예: 세포 투과성 펩타이드의 합성]
서열번호 1의 펩타이드(12-mer, 'KHE-CPP'로 명명), 서열번호 2의 펩타이드(16-mer, 'DBD'로 명명), 서열번호 3의 융합 펩타이드(28-mer, 'KHE-DBD'로 명명, 서열번호 1과 서열번호 2의 융합 펩타이드)는 펩트론사(대전, 대한민국)에 의뢰하여 합성하였으며, 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)를 이용하여 FMOC 고체상 방법(FMOC solid-phase method)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 분석용 RP 컬럼(Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.
[실험예 1: KHE-DBD 융합 펩타이드를 이용한 플라스미드 DNA 전달 효율 확인 실험]
HEK293 세포(ATCC)를 사용하여 본 발명의 융합 펩타이드의 핵산 전달 효율 (Transfection efficiency)을 평가하였으며, 비교를 위하여 현재 플라스미드 DNA 전달을 위해 사용되고 있는 시약인 리포펙타민(lipofectamine)의 핵산 전달 효율을 평가하였다.
DNA 전달 효율 측정을 위해 사용한 플라스미드 DNA는 형광단백질(Enhanced green fluorescent protein, EGFP) 유전자가 삽입되어 있는 pEGFP-N1 (Clontech)을 사용하였다. 이 플라스미드 DNA의 개열지도는 도 1와 같다.
6-웰 플레이트에 1 x 106의 HEK293 세포를 RPMI 1640 배지(Thermo Fisher Scientific)와 함께 12시간 동안 배양한 후, pEGFP-N1 4 ug과 융합 펩타이드 KHE-DBD 1 ug을 섞어 30분간 반응시킨 후 세포에 처리하였다. 이때 비교군은 pEGFP-N1 4 ug과 DBD 1 ug 섞은 실험군 및 pEGFP-N1 4 ug을 리포펙타민 2000 (Thermo Fisher Scientific) 10 ul과 함께 제조사 지침에 따라 처리한 실험군으로 하였다. 상기 처리 후 24시간 이후, 각 실험군을 PBS로 세척하고 세포를 떼어내 96-well plate로 옮겨 Fluorescence Spectrometer(excitation 488nm, emission 509nm)로 형광값을 측정하였다. 도 2의 결과로부터 리포펙타민 2000을 처리한 대조군에 비해 융합 펩타이드 KHE-DBD를 처리한 시험군의 DNA 전달 활성이 4배 정도 높음을 알 수 있다 (도 2).
[실험예 2: KHE-CCP 및 KHE-DBD 융합 펩타이드를 이용한 세포 독성 확인실험]
본 발명의 KHE-CPP 펩타이드 및 융합 펩타이드 KHE-DBD의 세포 독성을 평가하였다. 24-웰 플레이트에 1 x 105의 HEK293 세포를 RPMI 1640 배지(Thermo Fisher Scientific)와 함께 배양하고 KHE-CPP 펩타이드와 KHE-DBD 펩타이드를 농도별로 처리한 후 48시간 후에 MTT 분석을 실시하여 세포 생존율(Cell Viability)을 측정하여 그 결과를 도 3과 도 4에 나타냈다.
도 3을 참조하면, 처리 농도에 관계없이 본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 유의성 있는 세포독성을 초래하지 않음을 알 수 있다(도 3). 위의 실험과 동일한 방법으로 융합 펩타이드 KHE-DBD의 세포 생존율을 측정한 결과 세포독성이 발견되지 않았다(도 4).
<110> Biosharp
<120> CELL-PENETRATING PEPTIDE FOR DELIVERY BIOMATERIALS
<130> CDP20200049
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cell-penetrating Peptide
<400> 1
Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Phe Ile
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA-binding Domain
<400> 2
Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusion Peptide
<400> 3
Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Phe Ile Lys Ser Pro Lys
1 5 10 15
Lys Ala Lys Lys Lys Ser Pro Lys Lys Ala Lys Lys
20 25
Claims (5)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과성 펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 세포 투과성 펩타이드는 이의 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 포함하는 생체 물질 결합성 펩타이드가 결합된 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩타이드. - 제1항에 있어서,
상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 생체 물질 결합성 펩타이드가 생체 물질과 결합하여 세포 내에 상기 생체 물질을 세포 내로 전달하는 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩타이드. - 제3항에 있어서,
상기 생체 물질은 DNA, RNA 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩타이드. - 제1항에 있어서,
상기 세포 투과성 펩타이드는 DNA 결합 도메인(DNA-Binding Domain, DBD)와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩타이드.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020200011379A KR20210097547A (ko) | 2020-01-30 | 2020-01-30 | 생체 물질 전달용 세포 투과성 펩타이드 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020200011379A KR20210097547A (ko) | 2020-01-30 | 2020-01-30 | 생체 물질 전달용 세포 투과성 펩타이드 |
Publications (1)
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| KR20210097547A true KR20210097547A (ko) | 2021-08-09 |
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ID=77313342
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| KR1020200011379A KR20210097547A (ko) | 2020-01-30 | 2020-01-30 | 생체 물질 전달용 세포 투과성 펩타이드 |
Country Status (1)
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|---|---|
| KR (1) | KR20210097547A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118064372A (zh) * | 2024-04-24 | 2024-05-24 | 四川大学华西医院 | 卡波西样血管内皮瘤消化液及其用途、消化方法、原代细胞培养方法和原代细胞 |
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2020
- 2020-01-30 KR KR1020200011379A patent/KR20210097547A/ko unknown
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|---|---|---|---|---|
| CN118064372A (zh) * | 2024-04-24 | 2024-05-24 | 四川大学华西医院 | 卡波西样血管内皮瘤消化液及其用途、消化方法、原代细胞培养方法和原代细胞 |
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