JP2016515597A - 核内受容体を調節する人工転写因子およびその治療的使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合された核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる人工転写因子に関する。特定の例では、核内受容体遺伝子のこれらのプロモーター領域はグルココルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、またはエストロゲン受容体ESR1の発現を調節する。グルココルチコイド受容体を対象とする人工転写因子は、炎症過程、糖尿病、肥満、冠動脈疾患、ぜんそく、セリアック病、およびエリテマトーデスなどのグルココルチコイドによって調節される疾患の治療に有用である。アンドロゲン受容体を対象とする人工転写因子は、さまざまながん、冠動脈疾患、肥満若しくは糖尿病などの代謝障害、または統合失調症、うつ病、若しくは注意欠陥多動性障害などの気分障害などのテストステロンによって調節される疾患の治療に有用である。エストロゲン受容体を対象とする人工転写因子は、さまざまながん、心血管疾患、骨粗しょう症、または気分障害などのエストロゲンによって調節される疾患の治療に有用である。
Description
本発明は、抑制ドメインまたは活性化ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合された、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルポリダクチルジンクフィンガータンパク質(複数フィンガーのジンクフィンガータンパク質)、を含んでなる人工転写因子、並びにそのような核内受容体の活性によって引き起こされる疾患または調節される疾患の治療におけるその使用に関する。
人工転写因子(ATF)は遺伝子発現を調節する有用なツールであることが提案されている(Sera T., 2009, Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526)。天然の転写因子の多くは、遺伝子の転写を抑制または活性化することを通して発現に影響を及ぼし、ある特定のDNA配列を認識する複雑な特異的ドメインをもつ。このため、転写因子の特異性および標的遺伝子を改変しようとしても、転写因子は魅力ある操作対象ではない。しかし、転写因子のある特定の類は数個のいわゆるジンクフィンガー(ZF)ドメインを含み、そのジンクフィンガードメインはモジュラー(modular)であるので遺伝子操作に適している。ジンクフィンガーは、3つのDNA塩基対をほぼ独立に標的とする短い(30アミノ酸)DNA結合モチーフである。よって、数個のそのようなジンクフィンガーが融合されたものを含むタンパク質は、長いDNA配列を認識することができる。六量体ジンクフィンガータンパク質(ZFP)は18塩基対(bp)のDNA標的を認識するが、かかる塩基対はヒトゲノム全体でただ一つだけと言ってもよい。当初は全くコンテキストに依存しないと思われていたが、より詳細な解析からジンクフィンガーに関するいくらかのコンテキスト特異性が明らかになった(Klug A., 2010, Annu Rev Biochem 79, 213-231)。ZFモジュールの結合特異性を変えるジンクフィンガー認識表面でのある特定のアミノ酸の変異は、大部分の5’−GNN−3’、5’−CNN−3’、5’−ANN−3’、および幾つかの5’−TNN−3’コドンの定義された(defined)ZFビルディングブロックをもたらした(例えば、いわゆるBarbasモジュール、Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810を参照されたい)。初期の人工転写因子の研究では、既知の3bp標的配列をもつ予め選択されたジンクフィンガーを組み合わせることに基づいた合理的な設計に注目が集まったが、ジンクフィンガーのある特定のコンテキスト特異性を認識するには、細菌若しくは酵母ワンハイブリッド、ファージディスプレイ、コンパートメント化(compartmentalized)リボソームディスプレイ、またはFACS分析を用いた生体内選択などの高度な方法を用いて調べられる大きなジンクフィンガーライブラリーの作製を必要とした。
そのような人工ジンクフィンガータンパク質を用いて、ヒトゲノム内DNA遺伝子座を高度に特異的に標的とすることができる。よって、これらのジンクフィンガータンパク質は、転写調節活性をもつタンパク質ドメインを特異的なプロモーター配列に輸送して着目遺伝子の発現の調節をもたらすのに理想的なツールである。転写のサイレンシングに好適なドメインは、N末端としてのクルッペル関連ドメイン(KRAB)(配列番号1)またはC末端(配列番号2)KRABドメイン、Sin3相互作用ドメイン(SID、配列番号3)、およびERFリプレッサードメイン(ERD、配列番号4)であり、一方で遺伝子転写の活性化は、単純ヘルペスウイルスVP16(配列番号5)またはVP64(VP16の反復四量体、配列番号6)ドメインを通して達成される(Beerli R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633)。転写活性を付与すると考えられるさらなるドメインは、CJ7(配列番号7)、p65−TA1(配列番号8)、SAD(配列番号9)、NF−1(配列番号10)、AP−2(配列番号11)、SP1−A(配列番号12)、SP1−B(配列番号13)、Oct−1(配列番号14)、Oct−2(配列番号15)、Oct−2_5x(配列番号16)、MTF−1(配列番号17)、BTEB−2(配列番号18)、およびLKLF(配列番号19)である。くわえて、遺伝子オントロジーGO:0001071(http://amigo.geneontology.org/cgi bin/amigo/term_details?term=GO:0001071)によって定義されるタンパク質の転写活性のあるドメインは標的タンパク質の転写調節を達成すると考えられている。遺伝子操作されたジンクフィンガータンパク質および調節ドメインを含んでなる融合タンパク質は人工転写因子と呼ばれる。
特異的な特徴は高度に保存されるため、低分子薬物は所与のタンパク質ファミリーのある特定のメンバータンパク質を常に選択的に標的とすることができるわけではない。一方、天然のタンパク質または遺伝子組み換えタンパク質を基礎とした生物学的製剤は抗体ベースの新規薬物に示されるように高い特異性をもたらす。しかし、これまでの生物学的製剤は実質的にすべて細胞外に作用する。とりわけ、上記人工転写因子は、治療上有用であるように遺伝子転写に影響を及ぼすのに好適であろうと思われる。しかし、そのような因子の作用部位−核−への送達は容易には達成されず、よって、例えばレトロウイルス送達での中継等、治療的な人工転写因子の方法の有用性は、免疫原性や細胞形質転換の可能性など、この方法に伴うあらゆる欠点により妨害される(Lund C.V. et al., 2005, Mol Cell Biol 25, 9082-9091)。
いわゆるタンパク質形質導入ドメイン(PTD)は細胞膜をまたぐ細胞質基質/核質へのタンパク質移行を促進することが示された。HIV由来TATペプチド(配列番号20)などの短いペプチドは、積み荷タンパク質の、細胞タイプに依存しないマクロピノサイトーシス(macropinocytotic)取り込みを誘導することが示された(Wadia J.S. et al., 2004, Nat Med 10, 310-315)。細胞質基質に達した際にそのような融合タンパク質は生物活性を有することが示された。興味深いことに、誤って折り畳まれたタンパク質でさえもタンパク質形質導入の後に機能的になることができ、これはおそらく細胞内シャペロンの作用による。
核内受容体はリガンド活性化転写因子のタンパク質スーパーファミリーである。他の大部分の細胞膜固定受容体と違って、それらは細胞質基質または核質に局在する可溶性タンパク質である。リガンドが結合し、それに続いて二量体化すると、核内受容体はDNA結合と遺伝子の発現調節とを通じて転写因子として作用することができる。核内受容体のリガンドは油脂肪親和性分子であり、それらには、ステロイドおよび甲状腺ホルモン、脂肪酸および胆汁酸、レチノイン酸、ビタミンD3、並びにプロスタグランジンがある(McEwan I.J., Methods in Molecular Biology: The Nuclear Receptor Superfamily, 505, 3-17)。リガンドが結合すると核内受容体は二量体化し、リガンド応答性遺伝子プロモーター内の特異的な転写因子特異的DNA応答エレメントへの結合が起こり、遺伝子発現の活性化または抑制を引き起こす。核内受容体がステロイドなどの多くの広い範囲で作用するホルモンの活性および重要な代謝産物の活性を媒介することに関与することを考えれば、核内受容体の異常機能および機能障害は多くの疾患の自然経過に係わる。
核内受容体の活性を調節する作動剤または拮抗剤の使用が治療目的で採用されている。作動剤のデキサメタゾンなどのコルチコステロイドを使用したグルココルチコイド受容体(GR)機能の調節は、炎症性疾患に影響する一般的な臨床診療である。核内受容体活性の別の調節は経口の避妊法で例示され、そこにおいて、エストロゲン受容体(ESR1/ER)およびプロゲステロン受容体の活性化は女性の卵受精を防ぐのに使われる。別の例では、フルタミドまたはビカルタミドなどの抗アンドロゲンを用いてアンドロゲン受容体(AR)を塞ぐことがAR依存性の前立腺がんの治療に有用なことが証明された。さらに、エストロゲン合成およびエストロゲンの利用可能性を妨げることによるエストロゲン受容体の妨害は女性の乳がんまたは男性の女性化乳房症に対する標準的な治療である。
本発明は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合されたポリダクチルポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルポリダクチルジンクフィンガータンパク質、を含んでなる人工転写因子、並びにそのような人工転写因子を含んでなる医薬組成物に関する。さらに本発明は、核内受容体リガンドに対する細胞応答の調節、および特異的なエフェクターのそのような核内受容体への結合によって調節される疾患の治療におけるそのような人工転写因子の使用に関する。
特定の実施形態では、核内受容体遺伝子のプロモーター領域はアンドロゲン受容体プロモーター(配列番号21)である。この特定の実施形態では、本発明は、テストステロンに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、アンドロゲン受容体レベルを低下または増加させるための、およびテストステロンによって調節される疾患の治療で用いる、アンドロゲン受容体プロモーターを標的とする人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のアンドロゲン受容体プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるテストステロンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
別の特定の実施形態では、核内受容体遺伝子のプロモーター領域はエストロゲン受容体プロモーター(配列番号22)である。この特定の実施形態では、本発明は、エストロゲンに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、エストロゲン受容体レベルを低下または増加させるための、およびエストロゲンによって調節される疾患の治療で用いる、エストロゲン受容体プロモーターを標的とするそのような人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のエストロゲン受容体プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエストロゲンによって調節される疾患を治療する方法に関する。
さらに別の特定の実施形態では、核内受容体遺伝子のプロモーター領域はグルココルチコイド受容体プロモーター(配列番号23)である。この特定の実施形態では、本発明は、グルココルチコイドに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、グルココルチコイド受容体レベルを低下または増加させるための、およびグルココルチコイドによって調節される疾患の治療で用いる、特にグルココルチコイドによって調節される眼疾患の治療で用いる、グルココルチコイド受容体プロモーターを標的とする人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量のグルココルチコイド受容体プロモーターを標的とする本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるグルココルチコイドによって調節される疾患を治療する方法に関する。
さらに本発明は、本発明の人工転写因子をコードする核酸、それらを含んでなるベクター、およびそのようなベクターを含んでなる宿主細菌に関する。
本発明は、抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質、を含んでなる人工転写因子、並びにそのような人工転写因子を含んでなる医薬組成物に関する。
膜に固定された、膜貫通タンパク質からなるまたは膜貫通タンパク質を含むほとんど全ての他の細胞受容体と対照的に、核内受容体は1つのポリペプチドにリガンド結合と転写因子活性を組み入れた可溶性タンパク質である。核内受容体は細胞質基質または核質のいずれかに局在し、そこでリガンドが結合すると活性化されて二量体化し、莫大な転写プログラムを制御する活性転写因子になる。細胞の外側でそのリガンドと結合し、細胞膜をまたいでシグナルを細胞内に伝達する上記の膜に固定された受容体と違って、核内受容体は、細胞膜を通過して対応する受容体へのアクセスを得ることができる脂肪親和性のリガンドと結合する。くわえて、大部分の膜結合受容体は、細胞での目的とする効果を達成する前の複雑なシグナル増幅機構に依存する。一方、核内受容体はリガンドの結合を細胞応答に直接変換する。
多くの疾患の治療が核内受容体シグナリングを調節することに基づく。例としては、グルココルチコイドがグルココルチコステロイド受容体を活性化する炎症性の過程、アンドロゲン受容体の拮抗剤が有益な治療効果を有する前立腺がん、またはエストロゲン受容体シグナリングを遮断することが有用であると分かっている乳がんがある。伝統的に、核内受容体作動剤または拮抗剤のいずれかの形態での低分子が治療目的で受容体シグナリングに強い影響を及ぼすのに使用される。しかし、核内受容体シグナリングは、核内受容体タンパク質発現の直接的な調節によっても影響される可能性があり、そのような調節が本発明の主題である。
本発明で考慮される核内受容体は、ヒト遺伝子AR、ESR1、ESR2、ESRRA、ESRRB、ESRRG、HNF4A、HNF4G、NR0B1、NR0B2、NR1D1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、PPARA、PPARD、PPARG、RARA、RARB、RARG、RORA、RORB、RORC、RXRA、RXRB、RXRG、THRA、THRB、およびVDRによってコードされるヒト核内受容体である。
さらに、ヒト以外の核内受容体、例えば、言及されたヒト核内受容体遺伝子に関連する遺伝子によってコード化されるブタ、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、またはネズミの転写因子が考慮される。
技術水準によれば、人工転写因子の細胞内発現はウイルス形質導入を用いて達成される。ウイルスベクターは非常に高い潜在的免疫原性を有するので、ある種の治療を繰り返して適用するのにそれらのベクターを使用することは制限される。ジンクフィンガーモジュールは高度に保存され、そのため本発明の人工転写因子を適用した後にそのような免疫応答は少ないか若しくは存在しないことになり、またはそのような免疫応答は標的部位結合および機能を保持したまま免疫原性を消す全体構造への小さな変化によって回避若しくはさらに最小化されうる。さらに、ポリエチレングリコールによる本発明の人工転写因子の修飾が免疫原性を減らすために考慮される。くわえて、本発明の人工転写因子の、眼および脳などの免疫特権をもつ器官への適用は、いずれの免疫反応も回避して、人工転写因子に対する全身耐性を誘導することになる。免疫特権をもつ器官の外の慢性疾患の治療には、事前の眼内注射を通した免疫寛容の誘導が考慮される。
一群の治療薬として伝統的に使用されている低分子の類は、的を絞って遺伝子発現を調節するのには適切ではない。よって、有望な薬物標的および関連する疾患の多くは古典的な製薬方法を受け入れない。とりわけこれは、医薬品となりうるとみなされない転写因子に当てはまる。対照的に、本発明の人工転写因子は全て、高度に定義された全体組成をもつ同じ物質の類に属する。2つの大きく異なるプロモーター配列を標的とする2つの六量体ジンクフィンガータンパク質に基づいた人工転写因子でさえ、全体的に類似した三次構造とともに85%もの最小アミノ酸配列同一性を有し、(下記の)標準化された方法によって迅速且つ経済的な方法で作製できる。よって、本発明の人工転写因子は、1つの類の分子内にあって、全体的に類似した組成と、非常に広範で多岐にわたる標的に対する非常に高い特異性とを兼ね備える。
くわえて、本発明の人工転写因子の薬品への製剤化はこれまでの経験に頼ることができ、さらに薬品開発過程をはかどらせる。
くわえて、本発明の人工転写因子の薬品への製剤化はこれまでの経験に頼ることができ、さらに薬品開発過程をはかどらせる。
タンパク質形質導入ドメイン(PTD)によって媒介される人工転写因子の細胞内送達は、新しいやり方で生物学的製剤の標的受容体分子に対する高選択性を利用する新規の方法である。従来の薬物はある特定の受容体の活性を調節する。一方で人工転写因子はこれらのタンパク質の利用可能性を変える。人工転写因子はそのような受容体遺伝子のプロモーター領域に特異的に作用するように適応させて作られるので、本発明によって、密接に関連するタンパク質でさえも選択的に標的とすることが可能になる。これは密接に関連するタンパク質でさえもプロモーター領域は厳密に保存されないことに基づく。タンパク質形質導入ドメインによって媒介される人工転写因子の送達は、核内受容体のリガンドに対する細胞応答を調節するのに有用である。
考慮されるタンパク質形質導入ドメインは、細胞膜をまたいで積み荷を輸送できる、HIV TAT、mT02ペプチド(配列番号25)、mT03ペプチド(配列番号26)、R9ペプチド(配列番号27)、ANTPドメイン(配列番号28)などである。
本発明はまた、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質が核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とする、核内受容体リガンドの核内受容体への結合によって調節される疾患の治療におけるそのような人工転写因子の使用に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる疾患を治療する方法に関し、治療される疾患は、特異的なエフェクターの核内受容体への結合によって調節され、ポリダクチルジンクフィンガータンパク質は受容体遺伝子プロモーターを特異的に標的とする。
考慮されるポリダクチルジンクフィンガータンパク質は、四量体、五量体、六量体、七量体、または八量体のジンクフィンガータンパク質である。「四量体」、「五量体」、「六量体」、「七量体」、および「八量体」とは、ジンクフィンガータンパク質がそれぞれ4、5、6、7、または8つの部分タンパク質構造体からなり、その各々が特定のヌクレオチドトリプレットに対する結合特異性を有することを意味する。好ましくは、人工転写因子は六量体ジンクフィンガータンパク質を含んでなる。
所与のプロモーター領域内の標的部位の選択
標的部位の選択は機能的な人工転写因子の作製を成功させるのに決定的に重要である。生体内での核内受容体遺伝子発現を調節する人工転写因子に関して、人工転写因子は核内受容体遺伝子遺伝子のゲノムコンテキスト中のその標的部位に結合しなければならない。これにはDNA標的部位が接近可能であることを必要とされ、この領域の染色体DNAはヌクレオソームにおいてヒストンのまわりに密に詰まった状態ではなく、メチル化などのDNA修飾が人工転写因子の結合を妨害しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は密に詰まった状態で、転写的に不活性である一方で、活発に転写される遺伝子の転写開始点(−1000〜+200bp)のすぐ近くは、内在転写因子およびRNAポリメラーゼなどの転写機構が接近可能でなければならない。よって、いずれの所与の標的遺伝子のその領域内から標的部位を選択することは、所望の生体内機能をもつ人工転写因子の作製の成功率を大きく高めることになる。
標的部位の選択は機能的な人工転写因子の作製を成功させるのに決定的に重要である。生体内での核内受容体遺伝子発現を調節する人工転写因子に関して、人工転写因子は核内受容体遺伝子遺伝子のゲノムコンテキスト中のその標的部位に結合しなければならない。これにはDNA標的部位が接近可能であることを必要とされ、この領域の染色体DNAはヌクレオソームにおいてヒストンのまわりに密に詰まった状態ではなく、メチル化などのDNA修飾が人工転写因子の結合を妨害しないことを意味する。ヒトゲノムの大部分は密に詰まった状態で、転写的に不活性である一方で、活発に転写される遺伝子の転写開始点(−1000〜+200bp)のすぐ近くは、内在転写因子およびRNAポリメラーゼなどの転写機構が接近可能でなければならない。よって、いずれの所与の標的遺伝子のその領域内から標的部位を選択することは、所望の生体内機能をもつ人工転写因子の作製の成功率を大きく高めることになる。
ヒトグルココルチコイド、アンドロゲン、およびエストロゲン受容体遺伝子プロモーター内の標的部位の選択
ヒトグルココルチコイド、アンドロゲン、およびエストロゲン受容体オープンリーディングフレーム(図2、図3、および図4)の転写開始点を含む1000bpを含んでなるプロモーター領域を(G/C/ANN)6の一般組成をもつ18bpの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでGはヌクレオチドのグアニン、Cはヌクレオチドのシトシン、Aはヌクレオチドのアデニン、並びにNはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの4つのヌクレオチドの各々を表わす。プロモーターにおける3〜4つの標的部位が転写開始点に対するその相対位置に基づいて選択された。グルココルチコイド受容体遺伝子プロモーターに見出された標的部位はGR_TS1(配列番号29)、GR_TS2(配列番号30)、GR_TS3(配列番号31)であり、アンドロゲン受容体に対する標的部位はAR_TS1(配列番号32)、AR_TS2(配列番号33)、AR_TS3(配列番号34)、およびAR_TS4(配列番号35)である。エストロゲン受容体遺伝子プロモーターで特定された標的部位はER_TS1(配列番号36)、ER_TS2(配列番号37)、およびER_TS3(配列番号38)である。転写開始の2000bp上流のグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、およびアンドロゲン受容体の調節領域から選ばれた一般組成(G/C/ANN)5および(G/C/ANN)6の標的部位もまた考慮する。
ヒトグルココルチコイド、アンドロゲン、およびエストロゲン受容体オープンリーディングフレーム(図2、図3、および図4)の転写開始点を含む1000bpを含んでなるプロモーター領域を(G/C/ANN)6の一般組成をもつ18bpの潜在的な標的部位の存在について分析した。ここでGはヌクレオチドのグアニン、Cはヌクレオチドのシトシン、Aはヌクレオチドのアデニン、並びにNはグアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの4つのヌクレオチドの各々を表わす。プロモーターにおける3〜4つの標的部位が転写開始点に対するその相対位置に基づいて選択された。グルココルチコイド受容体遺伝子プロモーターに見出された標的部位はGR_TS1(配列番号29)、GR_TS2(配列番号30)、GR_TS3(配列番号31)であり、アンドロゲン受容体に対する標的部位はAR_TS1(配列番号32)、AR_TS2(配列番号33)、AR_TS3(配列番号34)、およびAR_TS4(配列番号35)である。エストロゲン受容体遺伝子プロモーターで特定された標的部位はER_TS1(配列番号36)、ER_TS2(配列番号37)、およびER_TS3(配列番号38)である。転写開始の2000bp上流のグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、およびアンドロゲン受容体の調節領域から選ばれた一般組成(G/C/ANN)5および(G/C/ANN)6の標的部位もまた考慮する。
グルココルチコイド受容体プロモーターを標的とする形質導入可能な人工転写因子
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3(Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605)を用いて、いわゆるBarbasジンクフィンガーモジュールセット(Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810)から構成された。グルココルチコイド受容体を標的とする、活性化形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質、GR_TS1を標的とするZFP−GR1(配列番号39)、GR_TS2を標的とするZFP−GR2(配列番号40)、およびGR_TS3を標的とするZFP−GR3(配列番号41)は、タンパク質形質導入ドメインTATおよび転写活性化ドメインVP64に融合され、人工転写因子GR1akt(配列番号42)、GR2akt(配列番号43)、およびGR3akt(配列番号44)が得られた。負の調節活性をもつ形質導入可能な人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ZFP−GR1〜ZFP−GR3はタンパク質形質導入ドメインTATおよび転写抑制ドメインKRABに融合され、人工転写因子GR1rep(配列番号45)、GR2rep(配列番号46)、およびGR3rep(配列番号47)が得られた。
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3(Sander J.D., Nucleic Acids Research 35, 599-605)を用いて、いわゆるBarbasジンクフィンガーモジュールセット(Gonzalez B., 2010, Nat Protoc 5, 791-810)から構成された。グルココルチコイド受容体を標的とする、活性化形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質、GR_TS1を標的とするZFP−GR1(配列番号39)、GR_TS2を標的とするZFP−GR2(配列番号40)、およびGR_TS3を標的とするZFP−GR3(配列番号41)は、タンパク質形質導入ドメインTATおよび転写活性化ドメインVP64に融合され、人工転写因子GR1akt(配列番号42)、GR2akt(配列番号43)、およびGR3akt(配列番号44)が得られた。負の調節活性をもつ形質導入可能な人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ZFP−GR1〜ZFP−GR3はタンパク質形質導入ドメインTATおよび転写抑制ドメインKRABに融合され、人工転写因子GR1rep(配列番号45)、GR2rep(配列番号46)、およびGR3rep(配列番号47)が得られた。
アンドロゲン受容体プロモーターを標的とする形質導入可能な人工転写因子
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3を用いて、いわゆるBarbasジンクフィンガーモジュールセットから構成された。ARプロモーターを標的とするさらなるジンクフィンガータンパク質は、酵母ワンハイブリッドスクリーニングを用いて選択された。アンドロゲン受容体を標的とする、活性化形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質である、AR_TS1を標的とするZFP−AR1(配列番号48)、AR_TS2を標的とするZFP−AR2(配列番号49)、AR_TS3を標的とするZFP−AR3(配列番号50)、並びにAR_TS4を標的とするZFP−AR4(配列番号51)、ZFP−AR5(配列番号52)、およびZFP−AR6(配列番号53)は、タンパク質形質導入ドメインTATおよび転写活性化ドメインVP64に融合され、人工転写因子AR1akt(配列番号54)、AR2akt(配列番号55)、AR3akt(配列番号56)、AR4akt(配列番号57)、AR5akt(配列番号58)、およびAR6akt(配列番号59)が得られた。負の調節活性をもつ形質導入可能な人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ZFP−AR1〜ZFP−AR6はタンパク質形質導入ドメインTATおよび転写抑制ドメインSIDに融合され、人工転写因子AR1rep(配列番号60)、AR2rep(配列番号61)、AR3rep(配列番号62)、AR4rep(配列番号63)、AR5rep(配列番号64)、およびAR6rep(配列番号65)が得られた。
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3を用いて、いわゆるBarbasジンクフィンガーモジュールセットから構成された。ARプロモーターを標的とするさらなるジンクフィンガータンパク質は、酵母ワンハイブリッドスクリーニングを用いて選択された。アンドロゲン受容体を標的とする、活性化形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質である、AR_TS1を標的とするZFP−AR1(配列番号48)、AR_TS2を標的とするZFP−AR2(配列番号49)、AR_TS3を標的とするZFP−AR3(配列番号50)、並びにAR_TS4を標的とするZFP−AR4(配列番号51)、ZFP−AR5(配列番号52)、およびZFP−AR6(配列番号53)は、タンパク質形質導入ドメインTATおよび転写活性化ドメインVP64に融合され、人工転写因子AR1akt(配列番号54)、AR2akt(配列番号55)、AR3akt(配列番号56)、AR4akt(配列番号57)、AR5akt(配列番号58)、およびAR6akt(配列番号59)が得られた。負の調節活性をもつ形質導入可能な人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ZFP−AR1〜ZFP−AR6はタンパク質形質導入ドメインTATおよび転写抑制ドメインSIDに融合され、人工転写因子AR1rep(配列番号60)、AR2rep(配列番号61)、AR3rep(配列番号62)、AR4rep(配列番号63)、AR5rep(配列番号64)、およびAR6rep(配列番号65)が得られた。
エストロゲン受容体プロモーターを標的とする形質導入可能な人工転写因子
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3を用いて、いわゆるBarbasジンクフィンガーモジュールセットから構成された。エストロゲン受容体を標的とする、活性化形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質、ER_TS1を標的とするZFP−ER1(配列番号66)、ER_TS2を標的とするZFP−ER2(配列番号67)、およびER_TS3を標的とするZFP−ER3(配列番号68)は、タンパク質形質導入ドメインTATおよび転写活性化ドメインVP64に融合され、人工転写因子ER1akt(配列番号69)、ER2akt(配列番号70)、およびER3akt(配列番号71)が得られた。負の調節活性をもつ形質導入可能な人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ZFP−ER1〜ZFP−ER3はタンパク質形質導入ドメインTATおよび転写抑制ドメインSIDに融合され、人工転写因子ER1rep(配列番号72)、ER2rep(配列番号73)、およびER3rep(配列番号74)が得られた。
特異的六量体ジンクフィンガータンパク質は、ZiFitソフトウェアv3.3を用いて、いわゆるBarbasジンクフィンガーモジュールセットから構成された。エストロゲン受容体を標的とする、活性化形質導入可能人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質、ER_TS1を標的とするZFP−ER1(配列番号66)、ER_TS2を標的とするZFP−ER2(配列番号67)、およびER_TS3を標的とするZFP−ER3(配列番号68)は、タンパク質形質導入ドメインTATおよび転写活性化ドメインVP64に融合され、人工転写因子ER1akt(配列番号69)、ER2akt(配列番号70)、およびER3akt(配列番号71)が得られた。負の調節活性をもつ形質導入可能な人工転写因子を作製するには、六量体ジンクフィンガータンパク質ZFP−ER1〜ZFP−ER3はタンパク質形質導入ドメインTATおよび転写抑制ドメインSIDに融合され、人工転写因子ER1rep(配列番号72)、ER2rep(配列番号73)、およびER3rep(配列番号74)が得られた。
本発明によるグルココルチコイド、アンドロゲン、またはエストロゲン受容体を標的とする人工転写因子はまた、配列番号39〜41、48〜53、および66〜68に開示されるジンクフィンガーモジュール組成物に基づくジンクフィンガータンパク質をそれぞれ含んでなり、そこにおいて、最大で4個の個々のジンクフィンガーモジュールは代替的な結合特性をもつ他のジンクフィンガーモジュールに対して交換されて人工転写因子のその標的配列への結合を調節する。
五量体、六量体、七量体、または八量体のジンクフィンガータンパク質を含む本発明の人工転写因子もまた考慮され、そこにおいて、個々のジンクフィンガーモジュールは交換されてそれぞれの核内受容体プロモーター遺伝子の標的部位に対する結合親和力を向上し、または忍容性を上げるためにジンクフィンガータンパク質の免疫学的性状を変える。
本発明による核内受容体グルココルチコイド、アンドロゲン、および/またはエストロゲン受容体を標的とする人工転写因子はまた、配列番号39〜41、48〜53、および66〜68に開示されるジンクフィンガーモジュール組成物に基づくジンクフィンガータンパク質をそれぞれ含んでなり、そこにおいて、個々のアミノ酸は潜在的な免疫原性を最小限にする一方で目的の標的部位に対する結合親和力を保持するために交換される。
本発明の人工転写因子はまた、N末端KRAB、C末端KRAB、SID、およびERDドメインなど、好ましくはSID、の、遺伝子オントロジーGO:0001071によって定義されるタンパク質の他の転写活性のあるタンパク質ドメインも含みうる。考慮される活性化タンパク質ドメインは、VP16またはVP64(VP16の反復四量体)など、好ましくはVP64、の、遺伝子オントロジーGO:0001071によって定義されるタンパク質の転写的に活性のあるドメインである。
さらに、本発明の人工転写因子は核局在化配列(NLS)を含んでなる。考慮される核局在化配列は、遺伝子オントロジーGO:0008139によって定義されるタンパク質への結合を通した核内移行を与えるアミノ酸モチーフであり、例えば、リジン残基(K)それに続くリジン残基(K)若しくはアルギニン残基(R)、それに続く任意のアミノ酸(X)、それに続くリジン若しくはアルギニン残基(K−K/R−X−K/Rコンセンサス配列、Chelsky D. et al., 1989 Mol Cell Bio 9, 2487-2492)を含む塩基性アミノ酸クラスターまたはSV40 NLS(配列番号75)があり、SV40 NLSが好ましい。
核内受容体遺伝子のプロモーター領域を対象とするが、タンパク質形質導入ドメインを含まない人工転写因子もまた本発明の主題である。それらは、本明細書において上記で定義される本発明の人工転写因子の中間体である。核内受容体遺伝子のプロモーター領域を対象とするが、タンパク質形質導入ドメインを含まないそのような人工転写因子の特定の実施形態は、ともにタンパク質形質導入ドメインを含まない、アンドロゲン受容体遺伝子プロモーターを対象とする人工転写因子およびエストロゲン受容体遺伝子プロモーターを対象とする人工転写因子である。
さらに考慮されるのは、トランスフェクションによって、または限定はされないが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに基づいたベクターなどのウイルスベクターを介して移される、核酸の形態での本発明の人工転写因子の代替的な送達方法である。
本発明の人工転写因子のドメインは短い柔軟なリンカーによって連結されてもよい。短く柔軟なリンカーは2〜8個の好ましくはグリシンおよびセリンであるアミノ酸をもつ。考慮される具体的なリンカーはGGSGGS(配列番号76)である。人工転写因子はその検出および処理を容易にするマーカーをさらに含んでもよい。
人工転写因子処理後のグルココルチコイド受容体調節の評価
グルココルチコイド受容体プロモーター特異的負調節人工転写因子で処理したHeLa細胞を、デキサメタゾン処理後の転写誘導の点に関して対照処理した細胞と比較する。定量的RT‐PCRを用いて、グルココルチコイド受容体標的遺伝子TSC22D3、IGFBP1、およびIRF8の発現レベルを測定する。対照細胞と比較した、人工転写因子で処理した細胞におけるこれらのグルココルチコイド応答性遺伝子の発現の減少は、グルココルチコイド受容体特異的人工転写因子の調節活性の証拠である。
グルココルチコイド受容体プロモーター特異的負調節人工転写因子で処理したHeLa細胞を、デキサメタゾン処理後の転写誘導の点に関して対照処理した細胞と比較する。定量的RT‐PCRを用いて、グルココルチコイド受容体標的遺伝子TSC22D3、IGFBP1、およびIRF8の発現レベルを測定する。対照細胞と比較した、人工転写因子で処理した細胞におけるこれらのグルココルチコイド応答性遺伝子の発現の減少は、グルココルチコイド受容体特異的人工転写因子の調節活性の証拠である。
人工転写因子処理後のアンドロゲン受容体調節の評価
アンドロゲン受容体プロモーター特異的負調節人工転写因子で処理したアンドロゲン受容体発現細胞を、テストステロン処理後の転写誘導の点に関して対照処理した細胞と比較する。定量的RT‐PCRを用いて、アンドロゲン受容体標的遺伝子PSA、SPAK、およびTMPRSS2の発現レベルを測定する。対照細胞と比較した、人工転写因子で処理した細胞におけるこれらのアンドロゲン応答性遺伝子の発現の減少は、アンドロゲン受容体特異的人工転写因子の調節活性の証拠である。
アンドロゲン受容体プロモーター特異的負調節人工転写因子で処理したアンドロゲン受容体発現細胞を、テストステロン処理後の転写誘導の点に関して対照処理した細胞と比較する。定量的RT‐PCRを用いて、アンドロゲン受容体標的遺伝子PSA、SPAK、およびTMPRSS2の発現レベルを測定する。対照細胞と比較した、人工転写因子で処理した細胞におけるこれらのアンドロゲン応答性遺伝子の発現の減少は、アンドロゲン受容体特異的人工転写因子の調節活性の証拠である。
人工転写因子処理後のエストロゲン受容体調節の評価
エストロゲン受容体プロモーター特異的負調節人工転写因子で処理したエストロゲン受容体発現細胞を、エストラジオール処理後の転写誘導の点に関して対照処理した細胞と比較する。定量的RT‐PCRを用いて、エストロゲン受容体標的遺伝子bcl−2、オボアルブミン、c−fos、コラゲナーゼ、およびオキシトシンの発現レベルを測定する。対照細胞と比較した、人工転写因子で処理した細胞におけるこれらのエストラジオール応答性遺伝子の発現の減少は、エストロゲン受容体特異的人工転写因子の調節活性の証拠である。
エストロゲン受容体プロモーター特異的負調節人工転写因子で処理したエストロゲン受容体発現細胞を、エストラジオール処理後の転写誘導の点に関して対照処理した細胞と比較する。定量的RT‐PCRを用いて、エストロゲン受容体標的遺伝子bcl−2、オボアルブミン、c−fos、コラゲナーゼ、およびオキシトシンの発現レベルを測定する。対照細胞と比較した、人工転写因子で処理した細胞におけるこれらのエストラジオール応答性遺伝子の発現の減少は、エストロゲン受容体特異的人工転写因子の調節活性の証拠である。
ルシフェラーゼリポーターアッセイにおけるAR4rep活性の評価
ハイブリッドCMV/AR_TS4プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼおよび恒常性CMVプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを含むHEK293 FlpIn TRex細胞に基づくリポーター細胞株を用いてAR4repの活性を評価した。図5に示されるように、AR4repでのこの種の細胞の処理は、対照処理した細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性の減少を引き起こした。
ハイブリッドCMV/AR_TS4プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼおよび恒常性CMVプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを含むHEK293 FlpIn TRex細胞に基づくリポーター細胞株を用いてAR4repの活性を評価した。図5に示されるように、AR4repでのこの種の細胞の処理は、対照処理した細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性の減少を引き起こした。
ポリエチレングリコール残基の結合
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合(PEG化)が人工転写因子に溶解度を増加させ、その腎クリアランスを減少させ、その免疫原性を制御するために考慮された。大きさが1〜40キロダルトンの範囲のアミンおよびチオール反応性ポリエチレングリコールが考慮される。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いて、人工転写因子の部位特異的PEG化が達成される。本発明の人工転写因子においてチオール基を含む唯一の必須アミノ酸は、亜鉛配位に必須のジンクフィンガーモジュールに位置するシステイン残基である。これらのチオール基は亜鉛配位によりPEG化に利用できず、よって1つまたは幾つかのシステイン残基の本発明の人工転写因子への包含はチオール特異的ポリエチレングリコール試薬を使用したPEG化のための遊離チオール基を提供する。
本発明の人工転写因子へのポリエチレングリコール残基の共有結合(PEG化)が人工転写因子に溶解度を増加させ、その腎クリアランスを減少させ、その免疫原性を制御するために考慮された。大きさが1〜40キロダルトンの範囲のアミンおよびチオール反応性ポリエチレングリコールが考慮される。チオール反応性ポリエチレングリコールを用いて、人工転写因子の部位特異的PEG化が達成される。本発明の人工転写因子においてチオール基を含む唯一の必須アミノ酸は、亜鉛配位に必須のジンクフィンガーモジュールに位置するシステイン残基である。これらのチオール基は亜鉛配位によりPEG化に利用できず、よって1つまたは幾つかのシステイン残基の本発明の人工転写因子への包含はチオール特異的ポリエチレングリコール試薬を使用したPEG化のための遊離チオール基を提供する。
医薬組成物
本発明はまた上記で定義された人工転写因子を含んでなる医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、とりわけヒトに対する非経口全身投与用組成物、特に静脈内投与用組成物、吸入用組成物、および局所投与用組成物、特に眼部局所投与用組成物、例えば点眼剤としての組成物、または硝子体内、結膜下、傍眼球(parabulbar)若しくは眼球後投与用の組成物である。特に好ましいのは、点眼剤および硝子体内、結膜下、傍眼球または眼球後投与用の組成物である。該組成物は活性成分を単独、または好ましくは薬理学的に許容される担体とともに含んでなる。さらに徐放製剤が考慮される。活性成分の投与量は、治療される疾患、並びに種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。
本発明はまた上記で定義された人工転写因子を含んでなる医薬組成物にも関する。考慮される医薬組成物は、温血動物、とりわけヒトに対する非経口全身投与用組成物、特に静脈内投与用組成物、吸入用組成物、および局所投与用組成物、特に眼部局所投与用組成物、例えば点眼剤としての組成物、または硝子体内、結膜下、傍眼球(parabulbar)若しくは眼球後投与用の組成物である。特に好ましいのは、点眼剤および硝子体内、結膜下、傍眼球または眼球後投与用の組成物である。該組成物は活性成分を単独、または好ましくは薬理学的に許容される担体とともに含んでなる。さらに徐放製剤が考慮される。活性成分の投与量は、治療される疾患、並びに種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。
経口送達に有用な医薬組成物、特に、好適にカプセル化された活性成分を含んでなるか、そうでなければ腸内での分解から保護された組成物がさらに考慮される。例えば、そのような医薬組成物は膜透過性向上剤、プロテアーゼ酵素阻害剤を含んでもよく、腸溶性コーティングによって包まれてもよい。
医薬組成物は活性成分を約1%〜約95%含んでなる。単位剤形は、例えば、アンプル、バイアル、吸入器、点眼剤などである。
本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法、例えば、従来の混合、溶解または凍結乾燥法を用いて調製される。
活性成分の溶液、また懸濁液または、分散液、とりわけ、例えば、活性成分を単独または担体、例えば、マンニトールとともに含んでなる凍結乾燥組成物の場合、使用前に作ることができる等張水溶液、分散液、または懸濁液の使用が好ましい。医薬組成物は滅菌してもよく、並びに/または賦形剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤および/若しくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩および/若しくは緩衝剤を含んでいてもよく、それ自体公知の方法、例えば、従来の溶解および凍結乾燥法を用いて調製される。前記溶液または懸濁液は、粘性増加剤、典型的に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、若しくはゼラチン含んでいてもよく、または可溶化剤、例えば、Tween80(商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレアート)も含んでいてもよい。
油中の懸濁液は慣習的に注射目的で植物油、合成油、または半合成油を油成分として含んでなる。それらについては、酸成分として8〜22個、とりわけ12〜22個の炭素原子をもつ長鎖脂肪酸を含む液体脂肪酸エステルが特記されうる。これらの脂肪酸エステルのアルコール構成成分は最大で6個の炭素原子を有し、一価または多価であり、例えば、一価、二価、または三価アルコール、とりわけ、グリコールおよびグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物として、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ひまし油、ゴマ油、大豆油、および落花生油などの植物油がとりわけ有用である。
注射可能薬製剤の製造は通常無菌状態下で実施され、例えば、アンプルまたはバイアルへの充填や容器の密封も同様である。
非経口投与に関して、水溶性の活性成分、例えば、水溶性の塩の水溶液、または粘性増加物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストラン、および所望の場合、安定剤を含む水性注射懸濁液がとりわけ好適である。活性成分は、随意に賦形剤とともに、凍結乾燥物の形態であることもでき、好適な溶媒を加えることによって非経口投与前に溶液にすることができる。
吸入用組成物は、エアロゾルの形態、スプレー、ミストとして、または液滴の形態で投与できる。エアロゾルは、定量噴霧式吸入器またはネブライザー、すなわち、特定量の薬剤を好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスを用いて、患者によって吸入されるエアロゾル化された薬剤の短いバーストの形態で、気道または肺に送達する装置を用いて送達できる、溶液または懸濁液から調製される。ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤を含む吸入粉末スプレー剤も提供できる。
好ましくは、点眼剤は涙液と等張(295〜305mOsm/l)の組成を与える好適な薬剤を含んでなる活性成分の等張水溶液である。考慮される薬剤は、塩化ナトリウム、クエン酸、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、デキストロースなどである。さらに組成物は、pHを5〜8、好ましくは7.0〜7.4に維持するために、緩衝剤、例えば、リン酸バッファー、リン酸−クエン酸バッファー、またはトリスバッファー(トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン)含んでなる。組成物は、抗菌性保存剤、例えば、パラベン、塩化ベンザルコニウム、ポリヘキサメチレンビグアニジン(PHMB)などの第四級アンモニウム塩をさらに含んでもよい。点眼剤はゲル状の点眼剤を作り出すキサンタンガム、および/またはヒアルロン酸、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、若しくはポリビニルピロリドンなどの他の粘性増強剤をさらに含んでもよい。
治療法における人工転写因子の使用
さらに本発明は、核内受容体リガンドに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、核内受容体のレベルを低下または増加させるための、およびそのような核内受容体によって調節される疾患の治療で用いる、上記のように核内受容体のプロモーター領域を標的とするように構築された人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の核内受容体プロモーターを対象とする人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる核内受容体リガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。
さらに本発明は、核内受容体リガンドに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、核内受容体のレベルを低下または増加させるための、およびそのような核内受容体によって調節される疾患の治療で用いる、上記のように核内受容体のプロモーター領域を標的とするように構築された人工転写因子に関する。同様に本発明は、治療上有効な量の核内受容体プロモーターを対象とする人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる核内受容体リガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。
核内受容体リガンドによって調節される疾患は、例えば、副腎不全、副腎皮質不全、アルコール依存症、アルツハイマー病、アンドロゲン不応症、神経性無食欲症、大動脈瘤、大動脈弁硬化症、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化、注意欠陥多動性障害、自閉症、無精子症、原発性胆汁性肝硬変、双極性障害、膀胱がん、骨がん、乳がん、心血管疾患、心血管心筋梗塞、セリアック病、胆汁うっ滞、慢性腎不全およびメタボリックシンドローム、肝硬変、口蓋裂、結腸直腸がん、先天性副腎皮質過形成、冠状動脈性心疾患、停留精巣、深部静脈血栓症、認知症、うつ病、糖尿病性網膜症、ドライアイ病、子宮内膜症、子宮内膜がん、S錐体増強症候群、本態性高血圧症、家族性部分型リポジストロフィー、神経膠芽腫、グルココルチコイド抵抗性、グレーブス病、高血清脂質レベル、高アポβリポタンパク質血症(hyperapobetalipoproteinemia)、高脂血症、高血圧[症]、高トリグリセリド血症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、尿道下裂、不妊症、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、虚血性心疾患、脂肪肝、肺がん、エリテマトーデス、大うつ病性障害、男性乳がん、代謝血漿脂質レベル、メタボリックシンドローム、偏頭痛、多発性硬化症、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、非ホジキンリンパ腫、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗しょう症、卵巣がん、パーキンソン病、妊娠高血圧腎、プロゲステロン抵抗性、前立腺がん、偽性低アルドステロン症、乾癬、精神統合失調症、精神病、網膜色素変性症−37、統合失調症、硬化性胆管炎、性転換、皮膚がん、ケネディーの球脊髄性萎縮症、心筋梗塞に対する感受性、乾癬に対する感受性、精巣がん、1型糖尿病、2型糖尿病、子宮がん、およびめまいである。
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる核内受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。特に、本発明は、有効量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、副腎不全、副腎皮質不全、アルコール依存症、アルツハイマー病、アンドロゲン不応症、神経性無食欲症、大動脈瘤、大動脈弁硬化症、関節炎、ぜんそく、アテローム性動脈硬化、注意欠陥多動性障害、自閉症、無精子症、原発性胆汁性肝硬変、双極性障害、膀胱がん、骨がん、乳がん、心血管疾患、心血管心筋梗塞、セリアック病、胆汁うっ滞、慢性腎不全およびメタボリックシンドローム、肝硬変、口蓋裂、結腸直腸がん、先天性副腎皮質過形成、冠状動脈性心疾患、停留精巣、深部静脈血栓症、認知症、うつ病、糖尿病性網膜症、子宮内膜症、子宮内膜がん、S錐体増強症候群、本態性高血圧症、家族性部分型リポジストロフィー、神経膠芽腫、グルココルチコイド抵抗性、グレーブス病、高血清脂質レベル、高アポβリポタンパク質血症(hyperapobetalipoproteinemia)、高脂血症、高血圧[症]、高トリグリセリド血症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、尿道下裂、不妊症、炎症性腸疾患、インスリン抵抗性、虚血性心疾患、脂肪肝、肺がん、エリテマトーデス、大うつ病性障害、男性乳がん、代謝血漿脂質レベル、メタボリックシンドローム、偏頭痛、多発性硬化症、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、非ホジキンリンパ腫、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗しょう症、卵巣がん、パーキンソン病、妊娠高血圧腎、プロゲステロン抵抗性、前立腺がん、偽性低アルドステロン症、乾癬、精神統合失調症、精神病、網膜色素変性症−37、統合失調症、硬化性胆管炎、性転換、皮膚がん、ケネディーの球脊髄性萎縮症、心筋梗塞に対する感受性、乾癬に対する感受性、精巣がん、1型糖尿病、2型糖尿病、子宮がん、およびめまいを治療する方法に関する。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、0.5〜1mgの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、10mg/kgの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジット(deposit)の眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
さらに本発明は、アンドロゲン受容体のリガンドに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、アンドロゲン受容体レベルを低下または増加させるための、およびアンドロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患の治療で用いる、上記のようにアンドロゲン受容体を対象とする人工転写因子に関する。
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるアンドロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。考慮される疾患は、前立腺がん、男性乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、精巣がん、冠動脈疾患、1型糖尿病、糖尿病性網膜症、肥満、アンドロゲン不応症、骨粗しょう症、変形性関節症、2型糖尿病、アルツハイマー病、偏頭痛、注意欠陥多動性障害、うつ病、統合失調症、無精子症、子宮内膜症、およびケネディーの球脊髄性萎縮症である。特に、ARレベルを上方調節することはドライアイ病の治療に有益であり、一方、ARレベルの下方調節はAR遮断非感受性前立腺がんの治療に有益である。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の病態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、0.5〜1mgの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、10mg/kgの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
さらに本発明は、エストロゲン受容体のリガンドに対する細胞応答に影響を与えるのに用いる、エストロゲン受容体レベルを低下または増加させるための、およびエストロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患の治療で用いる、上記のようにエストロゲン受容体を対象とする人工転写因子に関する。
同様に本発明は、治療上有効な量の本発明の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなるエストロゲン受容体のリガンドによって調節される疾患を治療する方法に関する。考慮される疾患は、骨がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、前立腺がん、子宮がん、アルコール依存症、偏頭痛、大動脈瘤、心筋梗塞に対する感受性、大動脈弁硬化症、心血管疾患、冠動脈疾患、高血圧[症]、深部静脈血栓症、グレーブス病、関節炎、多発性硬化症、肝硬変、B型肝炎、慢性肝疾患、胆汁うっ滞、尿道下裂、肥満、変形性関節症、骨減少症、骨粗しょう症、アルツハイマー病、パーキンソン病、偏頭痛、めまい、神経性無食欲症、注意欠陥多動性障害、認知症、うつ病、精神病、子宮内膜症、および不妊症である。特に、ERレベルの下方調節はホルモン依存性乳がんの治療に有益である。本発明の人工転写因子の有効量は、治療される疾患の特定の種類、並びに種、その年齢、体重、および個々の状態、個々の薬物動態データ、並びに投与方法に依存する。眼への投与については、0.5〜1mgの毎月の硝子体注射が好ましい。全身への適用については、10mg/kgの毎月の注射が好ましい。くわえて、徐放性デポジットの眼の硝子体への埋め込みもまた好ましい。
動物における人工転写因子の使用
さらに本発明は、そのような核内受容体の機能障害によって調節される疾患を治療するための、動物に見られる核内受容体を標的とする人工転写因子の使用に関する。好ましくは、人工転写因子は、それを必要としている動物への局所適用に好適な組成物の状態で直接適用される。
さらに本発明は、そのような核内受容体の機能障害によって調節される疾患を治療するための、動物に見られる核内受容体を標的とする人工転写因子の使用に関する。好ましくは、人工転写因子は、それを必要としている動物への局所適用に好適な組成物の状態で直接適用される。
DNAプラスミドのクローニング
クローニングの全工程に関して、制限エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼはニュー・イングランド・バイオラボから購入する。エビアルカリホスファターゼ(SAP)はプロメガから購入する。標準的なPCR反応には全て、高忠実度のPlatinum Pfx DNAポリメラーゼ(インビトロジェン)を適用する。DNA断片およびプラスミドは、NucleoSpin Gel and PCR Clean−upキット、NucleoSpin Plasmidキット、またはNucleoBond Xtra Midi Plusキット(マッハライ・ナーゲル社)を製造業者の取扱説明書に従って用いて単離する。オリゴヌクレオチドはシグマ−アルドリッチから購入する。新たに作製されたプラスミドの関連DNA配列はすべて、シークエンシング(Microsynth社)によって確認した。
クローニングの全工程に関して、制限エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼはニュー・イングランド・バイオラボから購入する。エビアルカリホスファターゼ(SAP)はプロメガから購入する。標準的なPCR反応には全て、高忠実度のPlatinum Pfx DNAポリメラーゼ(インビトロジェン)を適用する。DNA断片およびプラスミドは、NucleoSpin Gel and PCR Clean−upキット、NucleoSpin Plasmidキット、またはNucleoBond Xtra Midi Plusキット(マッハライ・ナーゲル社)を製造業者の取扱説明書に従って用いて単離する。オリゴヌクレオチドはシグマ−アルドリッチから購入する。新たに作製されたプラスミドの関連DNA配列はすべて、シークエンシング(Microsynth社)によって確認した。
酵母ワンハイブリッド用の六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのクローニング
GNNおよび/またはCNNおよび/またはANN結合ジンクフィンガー(ZF)モジュールを含む六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改変を含むGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。GNN、CNN、およびANN ZFモジュールをコードするDNA配列を合成し、pUC57(GenScript社)に挿入し、それぞれpAN1049(配列番号77)、pAN1073(配列番号78)、およびpAN1670(配列番号79)を得た。ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ライブラリーの段階的構築はpBluescriptSK(+)ベクターで行う。個々のクローニングの各工程の間の、非機能性タンパク質をもたらす複数のZFモジュールの挿入を避けるために、pBluescript(および1つのZFP、2つのZFP、または3つのZFPを含有するその派生製品)、並びにpAN1049、pAN1073、またはpAN1670を1つの制限酵素と最初にインキュベーションし、その後SAPで処理する。酵素をNucleoSpin Gel and PCR Clean−up キットを用いて除去した後、第2の制限エンドヌクレアーゼを加える。
GNNおよび/またはCNNおよび/またはANN結合ジンクフィンガー(ZF)モジュールを含む六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを、以下の改変を含むGonzalez B. et al,. 2010, Nat Protoc 5, 791-810に従ってクローニングする。GNN、CNN、およびANN ZFモジュールをコードするDNA配列を合成し、pUC57(GenScript社)に挿入し、それぞれpAN1049(配列番号77)、pAN1073(配列番号78)、およびpAN1670(配列番号79)を得た。ジンクフィンガータンパク質(ZFP)ライブラリーの段階的構築はpBluescriptSK(+)ベクターで行う。個々のクローニングの各工程の間の、非機能性タンパク質をもたらす複数のZFモジュールの挿入を避けるために、pBluescript(および1つのZFP、2つのZFP、または3つのZFPを含有するその派生製品)、並びにpAN1049、pAN1073、またはpAN1670を1つの制限酵素と最初にインキュベーションし、その後SAPで処理する。酵素をNucleoSpin Gel and PCR Clean−up キットを用いて除去した後、第2の制限エンドヌクレアーゼを加える。
pBluescript−1ZFPLのクローニングは、5μgのpBluescriptをXhoI、SAPで処理し、その後続いてSpeIで処理することによって行なう。10μgのpAN1049(16個の異なるGNN ZFモジュールの放出)またはpAN1073(15個の異なるCNN ZFモジュールの放出)またはpAN1670(15個の異なるANN ZFモジュールの放出)をSpeI、SAPとインキュベーションし、その後続いてXhoIとインキュベーションすることによってインサートを作製する。pBluescript−2ZFPLおよびpBluescript−3ZFPLの作製のために、7μgのpBluescript−1ZFPLまたはpBluescript−2ZFPLをAgeIで切断し、脱リン酸化し、SpeIで切断する。10μgのpAN1049またはpAN1073またはpAN1670にそれぞれSpeI、SAPを加え、その後続いてXmaIを加えることによってインサートを得る。pBluescript−6ZFPLのクローニングを、14μgのpBluescript−3ZFPLをAgeI、SAPで処理し、その後SpeIで処理して切断されたベクターを得ることによって行なった。SpeI、SAPとインキュベーションし、その後続いてXmaIとインキュベーションすることによって20μgのpBluescript−3ZFPLから3ZFPLインサートを放出させた。
1、2、および3つのZFPを含むライブラリーのライゲーション反応を、3:1のインサート:ベクターのモル比で、200ngの切断ベクター、400UのT4 DNAリガーゼを用いて、20μlの総容積でRT(室温)にて一晩行なった。六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーのライゲーション反応は、200μlの総容積に、2000ngのpBluescript−3ZFPL、500ngの3ZFPLインサート、4000UのT4 DNAリガーゼを含み、それを十等分して20μlにして、別々にRTで一晩インキュベーションした。ライゲーション反応の一部を各ライブラリーに要するクローンの数に応じて数種の方法で大腸菌に形質転換した。pBluescript−1ZFPLおよびpBluescript−2ZFPLの作製のためには、3μlのライゲーション反応を直接、大腸菌NEB5−アルファのヒートショック形質転換に使用した。pBluescript−3ZFPLのライゲーション反応のプラスミドDNAをNucleoSpin Gel and PCR Clean−upキットを用いて精製し、エレクトロコンピテント大腸菌NEB5−アルファに形質転換した(EquiBio社のEasyjecT Plusエレクトロポレーション装置またはエッペンドルフのMultiporator、2.5kVおよび25μF、バイオ・ラッドの2mmエレクトロポレーションキュベット)。pBluescript−6ZFPライブラリーのライゲーション反応をNucleoSpin Gel and PCR Clean−upキットにかけ、DNAを15μlの脱イオン水に溶出した。約60ngの脱塩したDNAを50μlのNEB10−ベータエレクトロコンピテント大腸菌(ニュー・イングランド・バイオラボ)と混ぜ、エレクトロポレーションを、EasyjecT PlusまたはMultiporator、2.5kV、25μF、および2mmエレクトロポレーションキュベットを用いて製造業者の推奨通りに行なった。各ライブラリーについて複数のエレクトロポレーションを行い、その後細胞を直接貯えてライブラリーサイズを増やした。ヒートショック形質転換またはエレクトロポレーションの後、SOC培地を細菌に加えた。37℃にて250rpmで1時間インキュベーションした後、30μlのSOC培養物を連続希釈してアンピシリン含有LBプレートに播いた。翌日、得られたライブラリークローンの総数を決定した。くわえて、各ライブラリーの10個のクローンを選んでプラスミドDNAを単離し、制限酵素切断によってインサートの組み込みを確認した。これらのプラスミドの少なくとも3つをシークエンシングしてライブラリーの多様性を確かめた。残りのSOC培養物を100mlのアンピシリン含有LB培地に移し、37℃にて250rpmで一晩培養した。それらの細胞を使用して各ライブラリーのPlasmid Midi DNAを調製した。
酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを適合プレイベクターに移す。その目的のために、pGAD10(クロンテック)のマルチプルクローニングサイトを、ベクターをXhoI/EcoRIで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドOAN971(TCGACAGGCCCAGGCGGCCCTCGAGGATATCATGATGACTAGTGGCCAGGCCGGCCC、配列番号80)およびOAN972(AATTGGGCCGGCCTGGCCACTAGTCATCATGATATCCTCGAGGGCCGCCTGGGCCTG、配列番号81)を挿入することによって変更した。結果として得られたベクターpAN1025(配列番号82)を切断し、脱リン酸化した。6ZFPライブラリーインサートをXhoI/SpeIによってpBluescript−6ZFPLから出した。ライゲーション反応およびNEB10−ベータエレクトロコンピテント大腸菌へのエレクトロポレーションを、上記でpBluescript−6ZFPライブラリーについて記載したように行なった。
改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを改良プレイベクターpAN1375(配列番号83)にも移す。このプレイベクターは次のように構築された:pRS315(配列番号84)をApaI/NarIで切断し、アニールしたOAN1143(CGCCGCATGCATTCATGCAGGCC、配列番号85)およびOAN1144(TGCATGAATGCATGCGG、配列番号86)を挿入してpAN1373(配列番号87)を得た。pAN1025からのSphIインサートを、SphIで切断したpAN1373にライゲーションしてpAN1375を得た。
さらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーを改良プレイベクターpAN1920(配列番号88)にも移す。
いっそうさらなる改良酵母ワンハイブリッドスクリーニングのために、六量体ジンクフィンガーライブラリーをプレイベクターpAN1992(配列番号89)に挿入する。
酵母ワンハイブリッドスクリーニング用のベイトプラスミドのクローニング
各ベイトプラスミドについて、その中央に18bpの潜在的な人工転写因子標的部位を含む60bp配列を選択し、制限酵素切断解析のためにNcoI部位を含める。HindIII/XhoIで切断したpAbAi(クロンテック)に直接ライゲーションすることを可能にする5’HindIIIおよび3’XhoI部位を作るようにオリゴヌクレオチドを設計してアニールする。生成物をNcoIで切断して、シークエンシングをしてベイトプラスミドの構築を確認する。
各ベイトプラスミドについて、その中央に18bpの潜在的な人工転写因子標的部位を含む60bp配列を選択し、制限酵素切断解析のためにNcoI部位を含める。HindIII/XhoIで切断したpAbAi(クロンテック)に直接ライゲーションすることを可能にする5’HindIIIおよび3’XhoI部位を作るようにオリゴヌクレオチドを設計してアニールする。生成物をNcoIで切断して、シークエンシングをしてベイトプラスミドの構築を確認する。
酵母株および培地
サッカロマイセス・セレビシエY1H Goldはクロンテックから購入し、YPD培地およびYPD寒天はCarl Roth社から購入した。合成ドロップアウト(SD)培地は、20g/lのグルコース、6.8g/lのNa2HPO4・2H2O、9.7g/lのNaH2PO4・2H2O(全てCarl Roth社から)、1.4g/lの酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、6.7g/lの酵母窒素ベース、0.1g/lのL−トリプトファン、0.1g/lのL−ロイシン、0.05g/lのL−アデニン、0.05g/lのL−ヒスチジン、0.05g/lのウラシル(全てシグマ−アルドリッチから)を含有した。SD−U培地はウラシルを除く全ての構成成分を含み、SD−LはL−ロイシンを入れずに調製した。SD寒天プレートはリン酸ナトリウムを含まないが、16g/lのBacto Agar(BD)を含有した。オーレオバシジンA(AbA)はクロンテックから購入した。
サッカロマイセス・セレビシエY1H Goldはクロンテックから購入し、YPD培地およびYPD寒天はCarl Roth社から購入した。合成ドロップアウト(SD)培地は、20g/lのグルコース、6.8g/lのNa2HPO4・2H2O、9.7g/lのNaH2PO4・2H2O(全てCarl Roth社から)、1.4g/lの酵母合成ドロップアウト培地サプリメント、6.7g/lの酵母窒素ベース、0.1g/lのL−トリプトファン、0.1g/lのL−ロイシン、0.05g/lのL−アデニン、0.05g/lのL−ヒスチジン、0.05g/lのウラシル(全てシグマ−アルドリッチから)を含有した。SD−U培地はウラシルを除く全ての構成成分を含み、SD−LはL−ロイシンを入れずに調製した。SD寒天プレートはリン酸ナトリウムを含まないが、16g/lのBacto Agar(BD)を含有した。オーレオバシジンA(AbA)はクロンテックから購入した。
ベイト酵母株の調製
20μlの総容積中で約5μgの各ベイトプラスミドをBstBIで直線化し、反応混合物の半分をサッカロマイセス・セレビシエY1H Goldのヒートショック形質転換に直接使用する。酵母細胞を形質転換の前日に5mlのYPD培地に播種するのに使用し、ローラー上でRT(室温)にて一晩培養する。1ミリリットルのこの前培養物を新鮮なYPD培地で1:20に希釈し、30℃にて225rpmで2〜3時間インキュベーションする。各形質転換反応について、1OD600の細胞を遠心分離によって採取し、酵母細胞を1mlの滅菌水で1回洗い、1mlのTE/LiAc(10mM トリス/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム)で1回洗う。そして最終的に、酵母細胞を50μlのTE/LiAcに再懸濁し、50μgのサケ精巣由来の一本鎖DNA(シグマ−アルドリッチ)、10μlのBstBIで直線化したベイトプラスミド(上記)、および300μlのPEG/TE/LiAc(10mM トリス/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム、50%(w/v)PEG3350)と混ぜる。細胞とDNAをローラー上でRTにて20分間インキュベーションし、その後42℃の水浴に15分間置く。そして最終的に、酵母細胞を遠心分離によって集め、100μlも滅菌水に再懸濁し、SD−U寒天プレート上に広げる。30℃で3日間インキュベーションした後、各形質転換反応からSD−U上に成長している8個のクローンを選び、それらのオーレオバシジンA(AbA)に対する感受性を分析する。前培養をローラー上でRTにて一晩培養した。各培養物について、OD600を測定し、滅菌水でOD600=0.3に調整した。この最初の希釈から、さらなる5回の1:10希釈工程を、滅菌水を用いて調製した。各クローンについて、各希釈工程の5μlを、SD−U、SD−U 100ng/ml AbA、SD−U 150ng/ml AbA、およびSD−U 200ng/ml AbAを含む寒天プレート上にスポットした。30℃で3日間インキュベーションした後、SD−U上で良好に成長し、AbAに最も感受性がある3個のクローンをさらなる分析のために選ぶ。ベイトプラスミドの酵母ゲノムへの安定的な組み込みをMatchmaker Insert Check PCR Mix1(クロンテック)で製造業者の取扱説明書に従って確かめる。3個のうち1個クローンを後に続くY1Hスクリーニングに使用する。
20μlの総容積中で約5μgの各ベイトプラスミドをBstBIで直線化し、反応混合物の半分をサッカロマイセス・セレビシエY1H Goldのヒートショック形質転換に直接使用する。酵母細胞を形質転換の前日に5mlのYPD培地に播種するのに使用し、ローラー上でRT(室温)にて一晩培養する。1ミリリットルのこの前培養物を新鮮なYPD培地で1:20に希釈し、30℃にて225rpmで2〜3時間インキュベーションする。各形質転換反応について、1OD600の細胞を遠心分離によって採取し、酵母細胞を1mlの滅菌水で1回洗い、1mlのTE/LiAc(10mM トリス/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム)で1回洗う。そして最終的に、酵母細胞を50μlのTE/LiAcに再懸濁し、50μgのサケ精巣由来の一本鎖DNA(シグマ−アルドリッチ)、10μlのBstBIで直線化したベイトプラスミド(上記)、および300μlのPEG/TE/LiAc(10mM トリス/HCl、pH7.5、1mM EDTA、100mM 酢酸リチウム、50%(w/v)PEG3350)と混ぜる。細胞とDNAをローラー上でRTにて20分間インキュベーションし、その後42℃の水浴に15分間置く。そして最終的に、酵母細胞を遠心分離によって集め、100μlも滅菌水に再懸濁し、SD−U寒天プレート上に広げる。30℃で3日間インキュベーションした後、各形質転換反応からSD−U上に成長している8個のクローンを選び、それらのオーレオバシジンA(AbA)に対する感受性を分析する。前培養をローラー上でRTにて一晩培養した。各培養物について、OD600を測定し、滅菌水でOD600=0.3に調整した。この最初の希釈から、さらなる5回の1:10希釈工程を、滅菌水を用いて調製した。各クローンについて、各希釈工程の5μlを、SD−U、SD−U 100ng/ml AbA、SD−U 150ng/ml AbA、およびSD−U 200ng/ml AbAを含む寒天プレート上にスポットした。30℃で3日間インキュベーションした後、SD−U上で良好に成長し、AbAに最も感受性がある3個のクローンをさらなる分析のために選ぶ。ベイトプラスミドの酵母ゲノムへの安定的な組み込みをMatchmaker Insert Check PCR Mix1(クロンテック)で製造業者の取扱説明書に従って確かめる。3個のうち1個クローンを後に続くY1Hスクリーニングに使用する。
六量体ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを用いたベイト酵母株の形質転換
約500μlの酵母ベイト株の前培養物を1LのYPD培地に希釈し、30℃および225rpmでOD600=1.6〜2.0まで(およそ20時間)インキュベーションする。細胞をスイングアウトローターで遠心分離によって集める(5分、1500×g、4℃)。エレクトロコンピテント細胞の調製をBenatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各形質転換反応について、400μlのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を1μgの6ZFPライブラリーをコードするプレイプラスミドと混ぜ、氷上で3分間インキュベーションする。細胞−DNA懸濁液を予め冷やした2mmエレクトロポレーションキュベットに移す。酵母細胞懸濁液の全てが形質転換されるまで、複数回のエレクトロポレーション反応(EasyjecT Plusエレクトロポレーション装置またはMultiporator、2.5kVおよび25μF)を行う。エレクトロポレーション後、酵母細胞を100mlのYPD:1Mソルビトールの1:1混合物に移し、30℃且つ225rpmで60分間インキュベーションする。細胞を遠心分離によって集め、1〜2mlのSD−L培地に再懸濁する。200μlに分注したものを1000〜4000ng/mlのAbAを含有する15cmSD−L寒天プレートに広げる。くわえて、50μlの細胞懸濁液を使って1/100および1/1000希釈を作り、50μlの未希釈細胞および希釈細胞をSD−L上に播く。プレートを全て30℃で3日間インキュベーションする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体を含むプレートから計算する。未希釈細胞を含むSD−Lプレートは全ての形質転換体の成長を示す一方で、AbA含有SD−Lプレートにはプレイ6ZFPがそのベイト標的部位への結合が成功した場合にのみコロニーが形成された。
約500μlの酵母ベイト株の前培養物を1LのYPD培地に希釈し、30℃および225rpmでOD600=1.6〜2.0まで(およそ20時間)インキュベーションする。細胞をスイングアウトローターで遠心分離によって集める(5分、1500×g、4℃)。エレクトロコンピテント細胞の調製をBenatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159に従って行う。各形質転換反応について、400μlのエレクトロコンピテントベイト酵母細胞を1μgの6ZFPライブラリーをコードするプレイプラスミドと混ぜ、氷上で3分間インキュベーションする。細胞−DNA懸濁液を予め冷やした2mmエレクトロポレーションキュベットに移す。酵母細胞懸濁液の全てが形質転換されるまで、複数回のエレクトロポレーション反応(EasyjecT Plusエレクトロポレーション装置またはMultiporator、2.5kVおよび25μF)を行う。エレクトロポレーション後、酵母細胞を100mlのYPD:1Mソルビトールの1:1混合物に移し、30℃且つ225rpmで60分間インキュベーションする。細胞を遠心分離によって集め、1〜2mlのSD−L培地に再懸濁する。200μlに分注したものを1000〜4000ng/mlのAbAを含有する15cmSD−L寒天プレートに広げる。くわえて、50μlの細胞懸濁液を使って1/100および1/1000希釈を作り、50μlの未希釈細胞および希釈細胞をSD−L上に播く。プレートを全て30℃で3日間インキュベーションする。得られたクローンの総数を、希釈形質転換体を含むプレートから計算する。未希釈細胞を含むSD−Lプレートは全ての形質転換体の成長を示す一方で、AbA含有SD−Lプレートにはプレイ6ZFPがそのベイト標的部位への結合が成功した場合にのみコロニーが形成された。
正の相互作用の検証と6ZFPをコードするプレイプラスミドの回復
初期解析のために、40個のかなり大きいコロニーを最も高い濃度のAbAを含むSD−Lプレートから採り、酵母細胞を1000〜4000ng/mlのAbAを含むSD−L上に再度二回ストリークして単一コロニーを得た。各クローンについて、1個のコロニーを使って5mlのSD−L培地に播種し、細胞をRTで一晩培養する。翌日、滅菌水でOD600=0.3に調整し、5つのさらなる1/10希釈物を調製し、5μlの各希釈工程を、SD−L、SD−L 500ng/ml AbA、1000ng/ml AbA、SD−L 1500ng/ml AbA、SD−L 2000ng/ml AbA、SD−L 2500ng/ml AbA、SD−L 3000ng/ml AbA、およびSD−L 4000ng/ml AbAプレート上にスポットする。クローンをその高AbA濃度で成長する能力に従ってランクづける。最も良好に成長したクローンから、5mlの初期SD−L前培養を用いて細胞を沈降させ、100μlの水または残存培地に再懸濁する。50Uのリチカーゼ(lyticase)(シグマ−アルドリッチ、L2524)の添加後、細胞を水平振とう機で37℃および300rpmにて数時間インキュベーションする。生成したスフェロプラストを10μlの20%(w/v)SDS溶液を加えることによって溶解し、1分間ボルテックスすることによって激しく混ぜ、−20℃で少なくとも1時間凍らせる。その後、NucleoSpin PlasmidキットのA1バッファー250μlおよびスパチュラ先一杯分のガラスビーズ(シグマ−アルドリッチ、G8772)を加え、チューブを1分間ボルテックスすることによって激しく混ぜる。標準的なNucleoSpin Plasmidキットプロトコールを続ける前に、NucleoSpin PlasmidキットのA2バッファー250μlを加え、RTで少なくとも15分間インキュベーションすることによってプラスミドの単離はさらに向上される。30μlの溶出緩衝液で溶出後、5μlのプラスミドDNAを大腸菌DH5アルファにヒートショック形質転換によって形質転換する。2個の別々のコロニーをアンピシリン含有LBプレートから採り、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートをシークエンシングする。各標的部位に対する6ZFP中のコンセンサス配列について、得られた結果を解析する。
初期解析のために、40個のかなり大きいコロニーを最も高い濃度のAbAを含むSD−Lプレートから採り、酵母細胞を1000〜4000ng/mlのAbAを含むSD−L上に再度二回ストリークして単一コロニーを得た。各クローンについて、1個のコロニーを使って5mlのSD−L培地に播種し、細胞をRTで一晩培養する。翌日、滅菌水でOD600=0.3に調整し、5つのさらなる1/10希釈物を調製し、5μlの各希釈工程を、SD−L、SD−L 500ng/ml AbA、1000ng/ml AbA、SD−L 1500ng/ml AbA、SD−L 2000ng/ml AbA、SD−L 2500ng/ml AbA、SD−L 3000ng/ml AbA、およびSD−L 4000ng/ml AbAプレート上にスポットする。クローンをその高AbA濃度で成長する能力に従ってランクづける。最も良好に成長したクローンから、5mlの初期SD−L前培養を用いて細胞を沈降させ、100μlの水または残存培地に再懸濁する。50Uのリチカーゼ(lyticase)(シグマ−アルドリッチ、L2524)の添加後、細胞を水平振とう機で37℃および300rpmにて数時間インキュベーションする。生成したスフェロプラストを10μlの20%(w/v)SDS溶液を加えることによって溶解し、1分間ボルテックスすることによって激しく混ぜ、−20℃で少なくとも1時間凍らせる。その後、NucleoSpin PlasmidキットのA1バッファー250μlおよびスパチュラ先一杯分のガラスビーズ(シグマ−アルドリッチ、G8772)を加え、チューブを1分間ボルテックスすることによって激しく混ぜる。標準的なNucleoSpin Plasmidキットプロトコールを続ける前に、NucleoSpin PlasmidキットのA2バッファー250μlを加え、RTで少なくとも15分間インキュベーションすることによってプラスミドの単離はさらに向上される。30μlの溶出緩衝液で溶出後、5μlのプラスミドDNAを大腸菌DH5アルファにヒートショック形質転換によって形質転換する。2個の別々のコロニーをアンピシリン含有LBプレートから採り、プラスミドを単離し、ライブラリーインサートをシークエンシングする。各標的部位に対する6ZFP中のコンセンサス配列について、得られた結果を解析する。
形質導入可能人工転写因子活性を試験するための安定したルシフェラーゼ/分泌アルカリホスファターゼリポーター細胞株の作製用のリポータープラスミドのクローニング
ハイブリッドCMV/人工転写因子標的部位プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼと、恒常性CMVプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼとを含むリポーターコンストラクトを作製するために、人工転写因子結合部位を含む42bpをpAN1660のAflIII/SpeIにクローニングした(配列番号90)。これらのリポーターコンストラクトは、HEK293 FlpIn TRex(インビトロジェン)細胞などのFlpIn部位含有細胞への安定した組み込みのためのFlpIn部位を含む。オリゴヌクレオチドOAN1612(配列番号91)およびOAN1613(配列番号92)を使用して、AR_TS4を標的とする人工転写因子をテストするそのようなリポーターコンストラクトを作製した。
ハイブリッドCMV/人工転写因子標的部位プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼと、恒常性CMVプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼとを含むリポーターコンストラクトを作製するために、人工転写因子結合部位を含む42bpをpAN1660のAflIII/SpeIにクローニングした(配列番号90)。これらのリポーターコンストラクトは、HEK293 FlpIn TRex(インビトロジェン)細胞などのFlpIn部位含有細胞への安定した組み込みのためのFlpIn部位を含む。オリゴヌクレオチドOAN1612(配列番号91)およびOAN1613(配列番号92)を使用して、AR_TS4を標的とする人工転写因子をテストするそのようなリポーターコンストラクトを作製した。
哺乳類トランスフェクション用の人工転写因子のクローニング
ポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするDNA断片を、AgeI/XhoIを用いる標準的な手順で哺乳類細胞における、着目したジンクフィンガーアレイ、SV40 NLS、3×mycエピトープタグ、およびN末端KRABドメイン(pAN1255−配列番号93)、C末端KRABドメイン(pAN1258−配列番号94)、SIDドメイン(pAN1257−配列番号95)、またはVP64活性化ドメイン(pAN1510−配列番号96)の間の融合タンパク質としての発現用の哺乳類発現ベクターにクローニングする。
ポリダクチルジンクフィンガータンパク質をコードするDNA断片を、AgeI/XhoIを用いる標準的な手順で哺乳類細胞における、着目したジンクフィンガーアレイ、SV40 NLS、3×mycエピトープタグ、およびN末端KRABドメイン(pAN1255−配列番号93)、C末端KRABドメイン(pAN1258−配列番号94)、SIDドメイン(pAN1257−配列番号95)、またはVP64活性化ドメイン(pAN1510−配列番号96)の間の融合タンパク質としての発現用の哺乳類発現ベクターにクローニングする。
安定的にトランスフェクションされた、テトラサイクリン誘導可能細胞作製用プラスミドを次にように作製した:ポリダクチルジンクフィンガードメイン、調節ドメイン(N末端KRAB、C末端KRAB、SID、またはVP64)、およびSV40 NLSを含んでなる人工転写因子をコードするDNA断片をEcoRV/AgeIを用いてpAN2071(配列番号97)にクローニングする。これらの人工転写因子発現プラスミドは、AAVS1 Left TALENおよびAAVS1 Right TALEN(ジーンコピア)との共トランスフェクションによってヒトゲノムのAAVS1座に組み込まれる。
細胞培養およびトランスフェクション
HeLa細胞を、4.5g/l グルコース、10%加熱不活性化ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、および1mM ピルビン酸ナトリウム(全てシグマ−アルドリッチから)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)中で、5%CO2、37℃にて培養する。ルシフェラーゼリポーターアッセイのために、7000個のHeLa細胞/ウェルを96ウェルプレートに播いた。翌日、Effecteneトランスフェクション試薬(キアゲン)を製造業者の取扱説明書に従って使用して共トランスフェクションを行う。人工転写因子およびルシフェラーゼをコードするPlasmid Midi調製物を3:1の比率で用いる。トランスフェクションの6時間後および24時間後に、培地をウェルあたり100μlの新鮮なDMEMで取り換えた。
HeLa細胞を、4.5g/l グルコース、10%加熱不活性化ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、および1mM ピルビン酸ナトリウム(全てシグマ−アルドリッチから)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)中で、5%CO2、37℃にて培養する。ルシフェラーゼリポーターアッセイのために、7000個のHeLa細胞/ウェルを96ウェルプレートに播いた。翌日、Effecteneトランスフェクション試薬(キアゲン)を製造業者の取扱説明書に従って使用して共トランスフェクションを行う。人工転写因子およびルシフェラーゼをコードするPlasmid Midi調製物を3:1の比率で用いる。トランスフェクションの6時間後および24時間後に、培地をウェルあたり100μlの新鮮なDMEMで取り換えた。
Flp−In(商標)T−Rex(商標)293発現細胞株の作製および維持
安定した、テトラサイクリン誘導可能なFlp−In(商標)T−Rex(商標)293発現細胞株をFlpリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Flp−In(商標)T−Rex(商標)Core Kitを用いて、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株をpFRT/lacZeo標的部位ベクターおよびpcDNA6/TRベクターをトランスフェクションすることによって作製する。誘導可能な293発現細胞株の作製のために、着目した遺伝子を含むpcDNA5/FRT/TO発現ベクターを、Flpリコンビナーゼ媒介DNA組み換えを介してFlp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株のFRT部位に組み込む。安定したFlp−In(商標)T−Rex(商標)発現細胞株を、(DMEM;10% Tet−FBS;2mM グルタミン;15μg/ml ブラストサイジン、および100μg/ml ハイグロマイシン)を含む選択培地で維持する。遺伝子発現を誘導するために、テトラサイクリンを1μg/mlの最終濃度まで加えた。
安定した、テトラサイクリン誘導可能なFlp−In(商標)T−Rex(商標)293発現細胞株をFlpリコンビナーゼ媒介組み込みによって作製する。Flp−In(商標)T−Rex(商標)Core Kitを用いて、Flp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株をpFRT/lacZeo標的部位ベクターおよびpcDNA6/TRベクターをトランスフェクションすることによって作製する。誘導可能な293発現細胞株の作製のために、着目した遺伝子を含むpcDNA5/FRT/TO発現ベクターを、Flpリコンビナーゼ媒介DNA組み換えを介してFlp−In(商標)T−Rex(商標)宿主細胞株のFRT部位に組み込む。安定したFlp−In(商標)T−Rex(商標)発現細胞株を、(DMEM;10% Tet−FBS;2mM グルタミン;15μg/ml ブラストサイジン、および100μg/ml ハイグロマイシン)を含む選択培地で維持する。遺伝子発現を誘導するために、テトラサイクリンを1μg/mlの最終濃度まで加えた。
TALENを用いた安定して人工転写因子を発現する細胞株の作製および維持
テトラサイクリン誘導可能なプロモーターの制御下で安定して人工転写因子を発現する細胞株を作製するために、細胞を、着目した人工転写因子を含むpAN2071をベースとした発現コンストラクト並びにAAVS1 Left TALENおよびAAVS1 Right TALEN(ジーンコピア)プラスミドで、Effectene(キアゲン、トランスフェクション試薬)を製造業者の推奨に従って用いて共トランスフェクションする。トランスフェクションの8時間後に成長培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄し、新鮮な成長培地を加えた。トランスフェクションの24時間後、Tet仕様FBS(テトラサイクリンを含まないFBS、タカラ)を含み、抗生物質を含まない成長培地に細胞を1:10の比率で分けた。トランスフェクションの48時間後、ピューロマイシン選択を細胞タイプに特異的な濃度で開始し、細胞を選択圧下で7〜10日保持した。安定細胞のコロニーを貯め、選択培地中で維持した。
テトラサイクリン誘導可能なプロモーターの制御下で安定して人工転写因子を発現する細胞株を作製するために、細胞を、着目した人工転写因子を含むpAN2071をベースとした発現コンストラクト並びにAAVS1 Left TALENおよびAAVS1 Right TALEN(ジーンコピア)プラスミドで、Effectene(キアゲン、トランスフェクション試薬)を製造業者の推奨に従って用いて共トランスフェクションする。トランスフェクションの8時間後に成長培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄し、新鮮な成長培地を加えた。トランスフェクションの24時間後、Tet仕様FBS(テトラサイクリンを含まないFBS、タカラ)を含み、抗生物質を含まない成長培地に細胞を1:10の比率で分けた。トランスフェクションの48時間後、ピューロマイシン選択を細胞タイプに特異的な濃度で開始し、細胞を選択圧下で7〜10日保持した。安定細胞のコロニーを貯め、選択培地中で維持した。
定量的RT−PCRによる遺伝子発現レベルの決定
RNeasy Plus Mini Kit(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)を製造業者の取扱説明書に従って用いて、全RNAを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを10μl/mlのβ−メルカプトエタノールを含むRLT Plus溶解バッファーに再懸濁する。QIAshredderスピンカラムを用いたホモジナイゼーションの後、溶解物の全てをgDNA Eliminatorスピンカラムに移してゲノムDNAを除去する。同容積の70%エタノールを加え、全溶解物をRNeasyスピンカラムに移す。数回の洗浄工程の後、RNAを最終容積が30μlのRNaseを含まない水に溶出する。さらに使用するまでRNAを−80℃で保存する。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(アプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国)を製造業者の取扱説明書に従って用いてcDNAの合成を行う。2μl 10×バッファー、0.8μl 25×dNTPミックス、2μl 10×RTランダムプライマー、1μl Multiscribe逆転写酵素、および4.2μl H2Oを含む20μlの総反応容積中でcDNA合成を行う。最終容積が10μlのRNAを加え、反応を次の条件下で行う:25℃で10分、それに続いて37℃で2時間、および85℃で5分の最終工程。1μlの20×TaqMan Gene Expression Master Mix、10.0μlのTaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix(ともにアプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国)、および8μlのH2Oを含む20μlの総反応容積中で定量PCRを実施する。各反応に1μlのcDNAを加える。ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(アプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国)を使用して次の条件下でqPCRを行う:50℃で2分間の開始工程の後に、95℃で10分間の第一の変性並びに95℃で15秒および60℃で1分の40サイクルからなるさらなる工程が続く。
RNeasy Plus Mini Kit(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)を製造業者の取扱説明書に従って用いて、全RNAを細胞から単離する。凍結細胞ペレットを10μl/mlのβ−メルカプトエタノールを含むRLT Plus溶解バッファーに再懸濁する。QIAshredderスピンカラムを用いたホモジナイゼーションの後、溶解物の全てをgDNA Eliminatorスピンカラムに移してゲノムDNAを除去する。同容積の70%エタノールを加え、全溶解物をRNeasyスピンカラムに移す。数回の洗浄工程の後、RNAを最終容積が30μlのRNaseを含まない水に溶出する。さらに使用するまでRNAを−80℃で保存する。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(アプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国)を製造業者の取扱説明書に従って用いてcDNAの合成を行う。2μl 10×バッファー、0.8μl 25×dNTPミックス、2μl 10×RTランダムプライマー、1μl Multiscribe逆転写酵素、および4.2μl H2Oを含む20μlの総反応容積中でcDNA合成を行う。最終容積が10μlのRNAを加え、反応を次の条件下で行う:25℃で10分、それに続いて37℃で2時間、および85℃で5分の最終工程。1μlの20×TaqMan Gene Expression Master Mix、10.0μlのTaqMan(登録商標)Universal PCR Master Mix(ともにアプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国)、および8μlのH2Oを含む20μlの総反応容積中で定量PCRを実施する。各反応に1μlのcDNAを加える。ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(アプライドバイオシステムズ、ニュージャージー州ブランチバーグ、アメリカ合衆国)を使用して次の条件下でqPCRを行う:50℃で2分間の開始工程の後に、95℃で10分間の第一の変性並びに95℃で15秒および60℃で1分の40サイクルからなるさらなる工程が続く。
細菌発現のための人工転写因子のクローニング
His6でタグされた人工転写因子とTATタンパク質形質導入ドメインとの融合タンパク質として大腸菌で発現するためのpET41a+(ノバジェン)をベースとする細菌発現ベクターpAN983(配列番号98)に、EcoRV/NotIを用いる標準的な手順で人工転写因子をコードするDNA断片をクローニングする。
His6でタグされた人工転写因子とTATタンパク質形質導入ドメインとの融合タンパク質として大腸菌で発現するためのpET41a+(ノバジェン)をベースとする細菌発現ベクターpAN983(配列番号98)に、EcoRV/NotIを用いる標準的な手順で人工転写因子をコードするDNA断片をクローニングする。
GR、AR、およびERを標的とする、BL21(DE3)などの好適な大腸菌宿主細菌における、形質導入可能な転写因子の細菌による産生用の発現コンストラクトは、pAN2343(配列番号99)、pAN2344(配列番号100)、pAN2345(配列番号101)、pAN2346(配列番号102)、およびpAN2347(配列番号103)である。
人工転写因子タンパク質の作製
所与の人工転写因子用の発現プラスミドで形質転換した大腸菌BL21(DE3)を100μM ZnCl2を補充した1LのLB培地でOD600が0.8〜1に達するまで培養し、1mM IPTGで2時間誘導した。細菌を遠心分離によって採取し、細菌溶解物をソニケーションによって調製し、封入体を精製した。この目的のために、封入体を遠心分離(5000g、4℃、15分)によって集め、20mlの結合バッファー(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール;pH7.5)で3回洗った。精製した封入体を30mlの結合バッファーA(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)に氷上で1時間可溶化した。可溶化した封入体を4℃にて13,000gで40分間遠心分離し、0.45μmのPVDFフィルターを通してろ過した。ヒスチジンタグ人工転写因子を、結合バッファーAおよび溶出バッファーB(50mM HEPES、500mM NaCl、500mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)を用いてAktaprime FPLC(GEヘルスケア)のHis−Trapカラムで精製した。精製した人工転写因子を含む画分を貯め、SIDドメインを含む人工転写因子の場合はバッファーS(50mM トリス−HCl、500mM NaCl、200mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH7.5)に対して、またはKRABドメインを含む人工転写因子はバッファーK(50mM トリス−HCl、300mM NaCl、500mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH8.5)に対して、4℃で一晩透析した。透析に続いて、タンパク質試料を14,000rpmで4℃にて30分間遠心分離し、0.22μm Millex−GVフィルターチップ(ミリポア)を用いて滅菌ろ過した。VP64活性化ドメインを含む人工転写因子については、タンパク質を可溶性画分(結合バッファー:50mM NaPO4、pH7.5、500mM NaCl、10mM イミダゾール;溶出バッファー:50mM HEPES、pH7.5、500mM NaCl、500mM イミダゾール)から、His−Bond Ni−NTA樹脂(ノバジェン)を製造業者の推奨に従って用いて作製した。タンパク質をVP64−バッファー(550mM NaCl、pH7.4、400mM アルギニン、100μM ZnCl2)に対して透析した。
所与の人工転写因子用の発現プラスミドで形質転換した大腸菌BL21(DE3)を100μM ZnCl2を補充した1LのLB培地でOD600が0.8〜1に達するまで培養し、1mM IPTGで2時間誘導した。細菌を遠心分離によって採取し、細菌溶解物をソニケーションによって調製し、封入体を精製した。この目的のために、封入体を遠心分離(5000g、4℃、15分)によって集め、20mlの結合バッファー(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール;pH7.5)で3回洗った。精製した封入体を30mlの結合バッファーA(50mM HEPES、500mM NaCl、10mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)に氷上で1時間可溶化した。可溶化した封入体を4℃にて13,000gで40分間遠心分離し、0.45μmのPVDFフィルターを通してろ過した。ヒスチジンタグ人工転写因子を、結合バッファーAおよび溶出バッファーB(50mM HEPES、500mM NaCl、500mM イミダゾール、6M GuHCl;pH7.5)を用いてAktaprime FPLC(GEヘルスケア)のHis−Trapカラムで精製した。精製した人工転写因子を含む画分を貯め、SIDドメインを含む人工転写因子の場合はバッファーS(50mM トリス−HCl、500mM NaCl、200mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH7.5)に対して、またはKRABドメインを含む人工転写因子はバッファーK(50mM トリス−HCl、300mM NaCl、500mM アルギニン、100μM ZnCl2、5mM GSH、0.5mM GSSG、50% グリセロール;pH8.5)に対して、4℃で一晩透析した。透析に続いて、タンパク質試料を14,000rpmで4℃にて30分間遠心分離し、0.22μm Millex−GVフィルターチップ(ミリポア)を用いて滅菌ろ過した。VP64活性化ドメインを含む人工転写因子については、タンパク質を可溶性画分(結合バッファー:50mM NaPO4、pH7.5、500mM NaCl、10mM イミダゾール;溶出バッファー:50mM HEPES、pH7.5、500mM NaCl、500mM イミダゾール)から、His−Bond Ni−NTA樹脂(ノバジェン)を製造業者の推奨に従って用いて作製した。タンパク質をVP64−バッファー(550mM NaCl、pH7.4、400mM アルギニン、100μM ZnCl2)に対して透析した。
タンパク質形質導入
培養密度が約80%にまで成長した細胞を2時間〜120時間、0.01〜1μMの人工転写因子で処置または模擬処理し、随意に24時間毎に人工転写因子をOptiMEMまたは成長培地に37℃で加える。随意に10〜500μMのZnCl2を成長培地に加える。免疫蛍光のために、細胞をPBSで1回洗い、トリプシン処理し、さらなる試験のためにカバーガラス上に播く。
培養密度が約80%にまで成長した細胞を2時間〜120時間、0.01〜1μMの人工転写因子で処置または模擬処理し、随意に24時間毎に人工転写因子をOptiMEMまたは成長培地に37℃で加える。随意に10〜500μMのZnCl2を成長培地に加える。免疫蛍光のために、細胞をPBSで1回洗い、トリプシン処理し、さらなる試験のためにカバーガラス上に播く。
免疫蛍光
細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.15%トリトンX−100で処理し、10%BSAでブロックし、マウス抗HA抗体(1:500、H9658、シグマ)またはマウス抗myc(1:500、M5546、シグマ)で一晩インキュベーションする。試料をPBS/1%BSAで3回洗い、アレクサフルオル546結合ヤギ抗マウス抗体(1:1000、インビトロジェン)でインキュベーションし、DAPI(1:1000の1mg/ml、3分間、シグマ)を用いて対比染色する。蛍光顕微鏡観察を用いて試料を解析する。
細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.15%トリトンX−100で処理し、10%BSAでブロックし、マウス抗HA抗体(1:500、H9658、シグマ)またはマウス抗myc(1:500、M5546、シグマ)で一晩インキュベーションする。試料をPBS/1%BSAで3回洗い、アレクサフルオル546結合ヤギ抗マウス抗体(1:1000、インビトロジェン)でインキュベーションし、DAPI(1:1000の1mg/ml、3分間、シグマ)を用いて対比染色する。蛍光顕微鏡観察を用いて試料を解析する。
ルシフェラーゼ/SEAPプロモーター活性組み合せアッセイ
人工転写因子の活性をテストするために、リポーター細胞株を採用した。このリポーター細胞株は、ハイブリッドCMV/人工転写因子標的部位プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼおよび恒常性CMVプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを含むHEK293 FlpIn TRex細胞に基づく。
人工転写因子の活性をテストするために、リポーター細胞株を採用した。このリポーター細胞株は、ハイブリッドCMV/人工転写因子標的部位プロモーターの制御下のガウシアルシフェラーゼおよび恒常性CMVプロモーターの制御下の分泌アルカリホスファターゼを含むHEK293 FlpIn TRex細胞に基づく。
タンパク質形質導入の24時間前に、1ウェル当たり1×105個のリポーター細胞を6ウェルプレートに播く。播種の24時間後に、培地をプレートから吸引し、細胞をPBSで1回洗う。タンパク質処理のために、AR4repをOptiMEMで1μMの最終濃度に希釈し、細胞に加え、インキュベーター(37℃;5%CO2)で2時間インキュベーションした。タンパク質形質導入後に、細胞を通常成長培地で24時間培養した。上澄みを96ウェルプレートに移し、2000rpmで5分間遠心分離した。ガウシアルシフェラーゼの測定のために、ピアス(商標)ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキット(Gaussia Luciferase Glow Assay Kit)(サーモサイエンティフィック)を製造業者の取扱説明書に従って使用した。作業溶液(working solution)を室温に平衡化し、セレンテラジンを1:100の希釈で加えた。20μlの細胞上澄みを不透明の96ウェルプレートに移し、50μlの作業溶液を加えた。10分間インキュベーションした後、発光をMicroLumatPlus(ベルトールドテクノロジー)を用いて1.0秒の積分時間で測定した。分泌アルカリホスファターゼ活性の測定のために、化学発光によるSEAPレポータージーンアッセイ(SEAP Reporter Gene Assay)(ロシュ)を製造業者の取扱説明書に従って使用した。細胞上澄みを希釈バッファーで1:4希釈し、65℃で5分間熱不活化した。50μlの熱不活化試料を不透明の96ウェルプレートに移し、50μlの不活化バッファーを加えた。室温で5分間インキュベーションした後、基質バッファー中の1:20のAP基質からなる50μLの基質試薬を加え、軽く撹拌しながら室温で10分間インキュベーションした。発光をMicroLumatPlus(ベルトールドテクノロジー)を用いて1.0秒の積分時間で測定した。
Claims (20)
- 抑制または活性化タンパク質ドメイン、核局在化配列、およびタンパク質形質導入ドメインに融合されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる、人工転写因子。
- 前記核内受容体遺伝子の前記プロモーター領域がアンドロゲン受容体プロモーターである、請求項1に記載の人工転写因子。
- 前記核内受容体遺伝子の前記プロモーター領域がエストロゲン受容体プロモーターである、請求項1に記載の人工転写因子。
- 六量体ジンクフィンガータンパク質を含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 前記ジンクフィンガータンパク質が抑制タンパク質ドメインに融合されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 前記抑制タンパク質ドメインが、配列番号1のN末端KRAB、配列番号2のC末端KRAB、配列番号3のSID、または配列番号4のERDである、請求項5に記載の人工転写因子。
- 前記ジンクフィンガータンパク質が活性化タンパク質ドメインに融合されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 前記活性化タンパク質ドメインが、配列番号5のVP16、配列番号6のVP64、配列番号7のCJ7、配列番号8のp65TA1、配列番号9のSAD、配列番号10のNF−1、配列番号11のAP−2、配列番号12のSP1−A、配列番号13のSP1−B、配列番号14のOct−1、配列番号15のOct−2、配列番号16のOct2−5x、配列番号17のMTF−1、配列番号18のBTEB−2、または配列番号19のLKLFである、請求項7に記載の人工転写因子。
- 前記核局在化配列がK−K/R−X−K/Rコンセンサス配列を含有する塩基性アミノ酸クラスターまたは配列番号75のSV40 NLSである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 前記タンパク質形質導入ドメインが、配列番号20のHIV由来TATペプチド、配列番号25の合成ペプチドmT02、配列番号26の合成ペプチドmT03、配列番号27のR9ペプチド、または配列番号28のANTPドメインである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 配列番号39〜41、48〜53、および66〜68からなる群から選択されるタンパク質配列のジンクフィンガータンパク質を含んでなる、請求項1に記載の人工転写因子。
- 抑制または活性化タンパク質ドメインおよび核局在化配列に融合されたポリダクチルジンクフィンガータンパク質であって、核内受容体遺伝子のプロモーター領域を特異的に標的とするポリダクチルジンクフィンガータンパク質を含んでなる、人工転写因子。
- ポリエチレングリコール残基をさらに含んでなる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の人工転写因子を含んでなる、医薬組成物。
- 請求項1〜12のいずれか一項の人工転写因子を産生するための、配列番号99〜103の発現コンストラクトを含んでなる大腸菌宿主細菌。
- 核内受容体のリガンドに対する細胞応答を調節するための、請求項1〜13のいずれか一項に記載の人工転写因子。
- 治療上有効な量の請求項1〜13のいずれか一項に記載の人工転写因子を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、核内受容体遺伝子の発現の調節が治療に有益である疾患の治療法。
- 前記核内受容体がアンドロゲン受容体であり、前記疾患がテストステロンによって調節され、がん、冠動脈疾患、肥満、糖尿病、統合失調症、うつ病、および注意欠陥多動性障害からなる群から選択される、請求項18に記載の治療法。
- 前記核内受容体がエストロゲン受容体であり、前記疾患がエストロゲンによって調節され、がん、心血管疾患、骨粗しょう症、および気分障害からなる群から選択される、請求項18に記載の治療法。
- 前記核内受容体がグルココルチコイド受容体であり、前記疾患がグルココルチコイドによって調節され、炎症過程、糖尿病、肥満、冠動脈疾患、ぜんそく、セリアック病、およびエリテマトーデスからなる群から選択される、請求項18に記載の治療法。
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