JPH09503645A - 制御されたアポトーシス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明者は、細胞内タンパク質の調節された（誘導）二量体化またはオリゴマー化のための一般的な方法を開発し、そして遺伝子工学処理された細胞において細胞特異的アポトーシス（プログラム化された細胞死）を調節的に開始する方法および該方法を用いるための材料を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 制御されたアポトーシス 技術面 この発明は二量体または多量体、好ましくは非ペプチドの有機分子でのキメラ タンパク質のオリゴマー化に関する材料、方法、および適用に関するものである 。発明の側面は宿主細胞の組換え修飾および遺伝子治療におけるそれらの利用、 または他の誘導可能な遺伝子発現の適用によって例証される。 序論 生物学的特異性は通常、タンパク質間の高度に特異的な相互作用から生じる。 この原理は細胞外分子が細胞内の事象に影響する過程である、シグナル伝達によ って例証される。細胞外リガンドの細胞表面の受容体への結合で多くの経路が始 まる。多くの場合、受容体のダイマー化がシグナル伝達経路を継続する転移リン 酸化、およびタンパク質の補充を引き起こす。膜受容体がホモダイマー化によっ て活性化され得るという認識は、受容体が二つの受容体をクロスリンクする抗体 によって活性化されるという観察から生じた。その後、多くの受容体がそのよう な特性を持っていることが判明した。多くの受容体の細胞外および膜貫通領域は 、リガンド依存性のダイマー化またはオリゴマー化によって、受容体の細胞質ド メインをきわめて接近させることで機能している一方で、受容体の細胞質ドメイ ンは細胞内コンパートメントへの特異的なシグナルを伝えると信じられている。 他の人々がリガンドー受容体の相互作用を様々な系で調べてきた。例えばクラ ークら、Science(1992)258，123、はB細胞抗原受容体複合体の細胞質エフェクタ ーを記述している。デュランドら、Mol．Cell．Biol．(1988)8，1715、ベルウェ イユら、J．Biol．Chem．(1990)265，15788、およびショウら、Science(1988)24 1，202、はNF-ATによる転写が、厳密に抗原受容体の制御下にあることを報告し ている。NF-ATによる転写の、シクロスポリンAおよびFK506による阻害がエンメ ルら、Science(1989)246，1617、およびフラナガンら、Nature(1991) 352，803、によって報告されている。デュランドら、Mol．Cell．Biol．(1988)8 ，1715、およびマティラら、EMBO J．(1990)9，4425、はNF-ATの結合部位を記述 している。ζ鎖を記載した参考文献には、オーロフら、Nature(1990)347，189-1 91、キネットら、Cell(1989)57，351-354、ワイズマンら、Proc．Natl．Acad．S ci．USA(1988)85，9709-9713、およびラニアら、Nature(1989)342，803-805、が 含まれる。CD4免疫アドヘシンはビルンら、Nature(1990)344，667-670、によっ て記載されている。CD8-ζ融合タンパク質はアービングら、Cell(1992)64，891 、によって記載されている。レターナーおよびクラウスナー、Science(1992)255 ，79、も参照のこと。 プロモーター領域への転写因子の結合、および転写因子の独立した活性化およ びDNA結合を記載した説明項目は以下を含む：キーガンら、Nature(1986)231，69 9；フィールズおよびソング、同書(1989)340，245；ジョーンズ、Cell(1990)61 ，９；レーウィン、Cell(1990)61，1161；タッシュンおよびガン、Nature(1990) 346，329；アダムスおよびワークマン、Cell(1993)72，306。 小胞のターゲッティングおよび融合について記載した説明項目は以下を含む： ソルナーら、(1993)Nature 362，318-324；および、ベネットおよびシェラー、( 1993)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90，2559-2563。 制御されたタンパク分解について記載した説明項目は以下を含む：ホックシュ トラッサーら、(1990)Cell 61，697；M．シェフナーら、(1993)Cell 75，495； ロジャースら、(1986)Science 234，364-368。 FK506およびその関連化合物に関連した合成法および修飾に関する付加的な情 報を提供する説明書は以下を含む：GB 2 244 991 A; EP 0 455 427 A1; WO 91/1 7754; EP 0 465 426 A1，US 5,023,263、およびWO 92/00278。 Fas抗原、p55 TNF受容体（以下TNF受容体）、および/またはアポトーシスに関 する説明書は以下を含む：イトウら、(1991)Cell 66，233-243；ナガタら、Euro pean Patent Application Publication NO．510 691(1992)；スダら、Cell(1993 )，75(6)，1169-78; オームら、J Biological Chem．(1992)267(15)，10709-107 15；および、ワンおよびグーデル、J Immunol(1994)，152(4)，1751-5。 遺伝子治療の方法および材料の例証となる議論が、ワトソン、ギルマン、ウィ ッ コウスキー、およびゾラー、RECOMBINANT DNA，第２版(WH FREEMAN & Co，1992) 、に、およびその点で著書目録中の特に564-564頁に引用された参考文献になさ れている。 しかしながら、この開示から明らかになっても、差し控えた著者は誰も本発明 を記載または示唆してはいない。我々の発明は以下で詳細に開示しているが、生 きた細胞内で、ホモダイマー化、ヘテロダイマー化およびオリゴマー化を利用す る一般的に適用可能な方法および材料を含んでいる（本明細書中で使用されてい るように、オリゴマー、オリゴマー化する、オリゴマー化、という単語は、ダイ マー、トリマーおよびさらに高次のオリゴマー、およびそれらの形成を含む）。 キメラの応答タンパクは、特異的な受容体ドメインとの融合タンパク質として細 胞内で発現させる。受容体ドメインに結合する細胞透過性の多価リガンドで細胞 を処理すると、キメラがダイマー化、またはオリゴマー化する。他のキメラ受容 体との類推から（例えば、ワイズ、Cell（1993）73，209を参照のこと）、キメ ラタンパク質は、そのオリゴマー化が細胞死を引き起こしたり、ある具体例では 、他の続いた事象、例えば続いて起こるタンパク-タンパクの相互作用を介した 細胞内シグナルの伝達、およびそれによる転写因子の特異的部分の活性化を引き 起こすようにデザインする。転写の開始は、レポーター遺伝子分析を用いて検出 できる。合成リガンドによるキメラタンパク質の細胞内クロスリンクは、多様な 細胞の過程の基本的な研究において、調製された細胞で細胞死を制御的に始める こと、および治療学的または農業的に重要なタンパク質の合成を制御することに おいて有力である。さらに、今日、リガンドを介したオリゴマー化は制御された 遺伝子治療を可能にしている。そのようにすることで、遺伝子治療で得られる安 全性、発現量、および全体的効能を増加する新しい方法が提供される。 発明の概要 この発明は、細胞およびその子孫を、制御された方法で予定された細胞死（ア ポトーシス）しやすくするために、宿主細胞の遺伝学的な処理の材料および方法 を提供する。この発明は、培養液中で増殖しようと、in vivoで増殖しようと、 調製した細胞数を除去する方法として有用であり、こうして、とりわけ遺伝子治 療で使われる遺伝学的に調製された細胞にとって絶対安全なメカニズムを提供す る。 発明には、新規のキメラ（または融合）タンパク質、それらをコードするDNA 構築物、およびキメラタンパク質をオリゴマー化するのが可能なリガンド分子が 含まれる。キメラタンパク質は、以下に詳細に記載されているように、細胞内に アポトーシスを開始させることができる作用ドメインと融合した、少なくとも一 つのリガンド結合（または”受容体”）ドメインを含む。また、記載されている ように、キメラタンパク質は、さらに付加的なドメインも含む様々なドメインが 異なる源から生じているという意味で、これらのキメラタンパク質は組換え体で あり、それ自体は自然界には共には存在しない（例えば、異種構造である）。 この発明は、新規のキメラタンパク質をコードし、宿主細胞の遺伝学的調製に 利用できるDNA分子（”構築物”）を提供する。これらの構築物は、その成分の 一部分、例えば特定のドメインまたは発現制御配列、が自然界では別の部分とつ ながっていることはないという意味において、組換え体である。また、修飾され た細胞を生産し、利用するための方法および成分が提供される。修飾された細胞 を産生するためには、望みのキメラをコードするDNAを選択した宿主に導入する 。これは簡便なベクター（それらの様々な例が商業的に手に入る）、および手法 を用いて達成できる。望むならば、修飾された細胞を他の細胞から選択、分離し て、再び簡便な方法で培養できる。 この発明の実用に有用なオリゴマー化リガンドは、二つ（またはそれ以上）の 受容ドメイン、例えばそのような受容ドメイン、を含む二つまたはそれ以上のキ メラタンパク質に結合することができる。オリゴマー化したリガンドは、好まし くは約10^-6以下のKd値で、さらに好ましくは約10^-7以下で、さらにより好ましく は約10^-8以下で、およびいくつかの具体例では約10^-9M以下であり、リガンドは 非タンパク質で、約5kDa以下の分子量であることが好ましい。そのようにオリゴ マー化されたキメラタンパク質の受容ドメインは、同一であるか、または異なっ たものである。キメラタンパク質は、リガンドにさらすと、すなわちキメラのオ リゴマー化に続くものだが、宿主細胞のアポトーシスを引き起こすことができる 。 このように、本発明の遺伝学的に操作されたアポトーシスは、キメラをオリゴマ ー化することができるリガンドに細胞をさらすのに続いて起こる。別の言い方を すれば、本発明の遺伝学的に操作された細胞は、上述したようにキメラタンパク 質を含み、それらのキメラをオリゴマー化することのできるリガンドが存在する とそれに反応する。その応答性は、細胞死の介しによって明らかになる。 コードされるキメラタンパク質は、さらに、キメラタンパク質を望みの細胞器 官に送ることができる細胞内標的化ドメインを含む。標的化ドメインは、分泌リ ーダー配列、膜貫通ドメイン、膜結合ドメイン、または、タンパク質を例えば小 胞、または核と関連付けるようにさせる配列である得る。 キメラタンパク質の作用ドメインは、例えばFas抗原の細胞質ドメインを含む クロスリンクによってアポトーシスを引き起こすタンパク質、またはタンパクド メイン（好ましくはヒト起源、またはその系統）のいずれかから選択する。 後でより詳細に議論されているように、例として、本発明の様々な具体例では 、キメラタンパク質はFK506型リガンド、シクロスポリンA型リガンド、テトラサ イクリン、またはステロイドリガンドに結合することができる。そのような結合 は、同一かまたは異なった他のキメラタンパク質分子のオリゴマー化を導く。上 記のキメラ（”一次キメラ”）をコードする構築物に加えて、細胞は所望により 、さらに一つまたはそれ以上の望みの遺伝子の制御的または構成的な発現のため のさらなる異種構造DNA構築物を含む。例えば、細胞は、所望のキメラをコード する一つまたはそれ以上の他の構築物をさらに含んでいるか、そうでなければ上 述したように、リガンドに誘導されるオリゴマー化でアポトーシス以外の生物学 的事象を引き起こす作用ドメインを含んでいる。そのような他の作用ドメインは 、キメラタンパク質のオリゴマー化によって生じる望みの生物学的結果に影響す ることのできる多種多様なタンパクドメインから選択できる。例えば、作用ドメ インは、リガンドにさらしたり、およびそれに続くオリゴマー化によって検出可 能な細胞内シグナルを開始することのできるCD3ゼータサブユニットのようなタ ンパクドメイン；Ga14のようなDNA結合タンパク質；またはVP16のような転写活 性化ドメインを含む。本明細書中に多数の他の例が提供されている。検出可能な 細胞内シグナルの一つの例は、オリゴマー化に応答する転写調節因子（例えばエ ンハ ンサー、および/またはプロモーター要素、および類似のもの）の転写制御下で 、遺伝子の転写を活性化するシグナルである。一次キメラをオリゴマー化し、ア ポトーシスへ導くリガンドは、所望のキメラタンパク質のオリゴマー化を引き起 こさないのが好ましい。通常、所望のキメラをオリゴマー化し、制御された遺伝 子の転写のような所望の生物学的事象に影響するリガンドは、一次キメラのオリ ゴマー化へ導いたり、アポトーシスを引き起こしたりしないほうがより好ましい 。リガンドの異なったセットは、その意味で直交する。 後により詳細に議論されているように、本発明の様々な具体例において、キメ ラタンパク質はFK506型リガンド、シクロスポリンA型リガンド、テトラサイクリ ン、またはステロイドリガンドに結合することができる。そのような結合は、キ メラタンパク質分子の同一の、または異なった他のキメラタンパク質とのオリゴ マー化を導く。 所望により、細胞は、リガンドに媒介される所望のキメラタンパク質のオリゴ マー化によって引き起こされるシグナルに、すなわち、細胞を関連のあるリガン ドにさらすことに応答する転写調節要素（例えばプロモーター/エンハンサー） の転写制御下の標的遺伝子を含む、さらに別の組換え構築物、またはそのような 構築物のシリーズを含むことができる。これらの構築物は、標的遺伝子が本来、 応答性の転写調節要素の制御下にあるという意味で組換え体である。 そのような所望の標的遺伝子構築物は、(a)上述した所望のキメラタンパク質 のオリゴマー化に応答する転写調節要素、および(b)標的遺伝子に関連して宿主 細胞中への転写調節要素の相同的組換えを可能にする標的遺伝子由来の一連のDN A配列を含むことが可能である。他の具体例では、構築物は、望みの部位に標的 遺伝子の組換えを可能にする、標的遺伝子由来の望みの遺伝子、および一連のDN A配列を含む（例えばマンサーら、1988，Nature 336，348-352、およびM．カペ ッキらのそれに続く論文を参照のこと）。構築物には、応答性の転写調節要素も 含まれ、または応答性の要素はその部位によって提供される。標的遺伝子は、例 えば膜表面タンパク質、分泌タンパク質、細胞質タンパク質、またはリボザイム またはアンチセンス配列をコードし得る。 本発明の構築物はまた、宿主細胞へのその構築物の感染、およびその構築物を 含む感染細胞の選択を可能にする選択マーカーも含んでいる。本発明はさらに、 組織培養中での宿主細胞への構築物の導入のためのものであれ、in vivoでの細 胞への導入のための全有機物の投与のためのものであれ、本明細書中に記載した 様々な構築物を含むDNAベクターを含んでいる。どちらの場合にも、その構築物 はエピソームとして、または染色体への挿入のために導入される。そのベクター は、例えばアデノ-、アデノ関連-、またはレトロウィルスのベクターを含むウィ ルスベクターである。 本発明はさらに、我々のDNA構築物をどれでも含み、および/または、発現する 細胞同様、原核および真核細胞、および特に、酵母、虫、昆虫、マウス、または 他のげっ歯類、およびヒトの細胞を含む様々な型および系統の他の哺乳類細胞を 、凍結したものであれ、活発に増殖しているものであれ、培養液中であれ、それ らを含む全有機物中であれ、我々のDNA構築物のいずれかにコードされるタンパ ク質を含んでいる。 要約すると、本発明は、好ましくは、しかし必ずしもではないが、哺乳類の、 (i)本発明の選択したオリゴマー化リガンドに結合することのできる、少なくと も一つの受容ドメイン、および、(ii)受容ドメインに関して非相同的であるが、 一つまたはそれ以上の他の類似したドメインでのオリゴマー化に対して、細胞の アポトーシスを引き起こすことのできる別のタンパクドメインを含む、一次キメ ラタンパク質をコードする最初のDNA構築物を含む細胞を提供する。 いくつかの具体例では、まさに記載されたように、細胞はまた、(i)本発明の 選択されたオリゴマー化リガンドに結合することができる、少なくとも一つの受 容ドメイン、および、(ii)受容ドメインに関して非相同的であるが、これら所望 のキメラのオリゴマー化に対して、上述のオリゴマー化に応答する転写調節要素 の転写制御下で、標的遺伝子の転写の活性化を（直接、または間接に）引き起こ すことのできる別のタンパクドメインを含む、一つまたはそれ以上のキメラタン パク質をコードする、一つまたはそれ以上の所望のDNA構築物を含んでいる。細 胞はまた、通常、上述のオリゴマー化リガンドに応答する転写調節要素の発現制 御下にある標的細胞を含むことだろう。選択したリガンドにさらすのに続いて、 標的遺伝子が発現される。再び、一次キメラをオリゴマー化することのできるリ ガンド、および所望のキメラをオリゴマー化することのできるリガンドは、直交 であるべきである。 他の具体例では、本発明の細胞はまた、DNA結合ドメインおよび最初に選択さ れたリガンドの一部に結合することのできる少なくとも一つの受容ドメインを含 む、最初の所望のキメラタンパク質をコードしているDNA構築物を含んでいる。 細胞はさらに、転写活性化ドメイン、および（最初に選択したリガンドの一部と 同じ、または異なる）二番目に選択したリガンドの一部に結合することのできる 少なくとも一つの受容ドメインを含む、第二の所望のキメラタンパク質を含んで いる。細胞は加えて、DNA結合ドメインの同系統の結合部位をもった非相同的な 転写調節配列の転写制御下にある標的細胞をコードし、選択したリガンドの一部 を含むオリゴマー化リガンドにさらすのに続いて、細胞が標的遺伝子を発現でき るよう、転写活性化ドメインに応答するDNA構築物を含む。 本発明の実用面で有用なDNA成分には、所望のキメラをコードするものが含ま れる。それらの成分は、オリゴマー化リガンドにさらす際に、すなわち、キメラ タンパク質のオリゴマー化の際に、生物学的過程を開始することのできる異種構 造の付加的なタンパクドメインに融合し、選択したリガンドに結合することので きる、少なくとも一つの受容ドメインを含むキメラタンパク質をコードする最初 のDNA構築物、およびオリゴマー化リガンドに応答する転写調節要素の転写制御 下にある標的遺伝子をコードする第二のDNA構築物を含む。 第一のキメラタンパク質をコードするDNA構築物は、(a)選択した第一のリガン ドの一部に結合することができ、(b)オリゴマー化リガンドにさらす際、すなわ ち第一のキメラタンパク質の第二のキメラタンパク質分子へのオリゴマー化の際 に、生物学的過程を開始することのできる、異種構造の付加的なタンパクドメイ ンに融合した、少なくとも一つの第一の受容ドメインを含む。第二のキメラタン パク質をコードするDNA構築物は、(i)選択した第二のリガンドの一部に結合する ことができ、(ii)オリゴマー化リガンドにさらした際、すなわち第一のキメラタ ンパク質がオリゴマー化した際に、生物学的過程を開始することのできる異種構 造の付加的なタンパクドメインに融合した、少なくとも一つの受容ドメインを含 む。そのような場合、第一、および第二の選択したリガンドの一部は、同様に同 一であるか、または異なるものである。 我々のリガンドは、それからオリゴマーを形成するための、二つまたはそれ以 上の本発明のキメラタンパク質分子に結合することができる分子であり、次の化 学式をもつ： リンカー-{rbm₁，rbm₂，…，rbm_n} ここでnは、2から約5までの整数であり、rbm₍₁₎-rbm_(n)は、同一、または異なる もので、キメラタンパク質に結合することのできる受容体結合部分である。rbm 部分は、二つまたはそれ以上のrbm部分に共有結合(-)でつながることのできる二 または多機能分子であるリンカー部分に共有結合で接着している。リガンドは約 5kDa以下の分子量で、タンパク質ではないのが好ましい。そのようなリガンドの 例には、rbm部分が同一、または異なるものが含まれ、また、FK506型部分、シク ロスポリン型部分、ステロイドまたはテトラサイクリンが含まれる。シクロスポ リン型部分には、シクロスポリン、および自然に生じるか、または修飾され、好 ましくは約10-6M以下のKd値でシクロフィリンに結合することのできる、シクロ スポリンからの派生物が含まれる。いくつかの具体例では、リガンドは、自然に 生じる受容体に約10^-6M以上、およびより好ましくは約10^-5M以上のKd値で結合す るのが好まれる。本発明の例証となるリガンドは、少なくとも一つのrbmが、FK5 06、FK520、ラパマイシン、またはC9、C10、またはその両方で修飾されたその派 生物の分子を含み、そのリガンドが、修飾した受容体または修飾した受容ドメイ ンを含むキメラ分子に、少なくとも1、および好ましくは2、およびより好ましく は3、およびさらに好ましくは4、または5またはそれ以上の、自然に生じる受容 体タンパク質に関してのKd値以下のオーダーのKd値で結合するものである。リン カー部分はまた、後に詳細に記載してあるが、例証のために、C2-C20 アルキレ ン、C4-C18 アザルキレン、C6-C24 N-アルキレンアザルキレン、C6-C18 アリレ ン、C8-C24 アルジアルキレン、またはC8-C36 ビスカルボキシアミドアルキレン 部分のような部分を含む。 我々のキメラタンパク質に結合することはできるが、（個々のrbmのモノマー の性質の観点から）それによるダイマー化、またはより高次 のオリゴマー化には影響しない、rbmの単一のコピー数を含む化合物同様、本発 明のモノマーrbmはオリゴマー化拮抗薬である。 本発明の重要な側面では、本発明の遺伝学的に調製された細胞は、他の細胞と 共に増殖させることができ、一次キメラタンパク質に対応する（すなわち、それ に結合することのできる）効果的な量のオリゴマー化リガンドを加えることによ って、細胞の混合物から選択的に除去することができる。このように、細胞とオ リゴマー化リガンドとの接着によって、その調製された細胞内で細胞死が引き起 こされる。例えば、そのような細胞は、いくつかの望みの時期に内生的な、また は異種構造の産物を産生することが可能で、その後、リガンドの添加によって除 かれる。そのような場合は、細胞は、本発明に従って一次キメラを産生するよう に調製される。リガンドに誘導される制御下で望みの遺伝子を発現するようにさ らに調製した細胞は、慣例の方法によって、培養液中で増殖させられる。その場 合は、所望のキメラに対するリガンドを培養液中に加えることによって、望みの 遺伝子の発現、および望みのタンパク質の産生が起こる。遺伝子の発現、および タンパク質の産生は、以下に詳細に記載されているように、培地にオリゴマー化 拮抗試薬を加えることによって停止できる。他の場合には、タンパク質の産生は 構成的である。次に、どの事象においても、調製された細胞は、意図した目的（ 例えば望みのタンパク質、または他の産物の産生）をかなえた後で、調製した細 胞内で一次キメラのオリゴマー化を引き起こしたり、アポトーシスを誘導するた めに十分な量の適当なオリゴマー化リガンドを培地に加えることによって、細胞 培養液中から取り除くことができる。本発明の調製された細胞はまた、全有機物 、好ましくは、ヒトを含む動物のものを修飾するために、例えば細胞が、望みの タンパク質またはそのような細胞を含む動物内での他の結果を生み出すように、 in vivoにおいて利用することができる。そのような利用は遺伝子治療を含む。 あるいはまた、キメラタンパク質およびオリゴマー化した分子は、生理学的活動 を開始するために協調して働くタンパク質を、細胞外から共にもたらすように使 用する。 本発明は、このように、オリゴマー化リガンドの添加に応答して、選択的に細 胞を除去するための材料および方法を提供する。その方法には、本発明に従って 調製した細胞の提供、および細胞をリガンドにさらすことが含まれる。 従って、本発明は、本明細書中に記載したように、細胞中の標的タンパク質の 転写活性化を制御することによってヘテロなタンパク質の生産を行なうように操 作した細胞の使用方法、および望む場合には操作した細胞を除去するための方法 を提供する。方法は、オリゴマー化することによって、アポトーシスを開始でき る一次キメラタンパク質を発現する本発明の細胞で、この細胞は、さらにオリゴ マー化に続いて（ｂ）標的遺伝子の転写を活性化できるキメラタンパク質をコー ドする（ａ）少なくとも１つのＤＮＡ構築物を保持し、そして発現できる細胞を 提供することを含む。キメラタンパク質は、選択したオリゴマー化したリガンド に結合可能な受容ドメインを少なくとも１つ含む。受容ドメインを、オリゴマー 化したリガンドにさらすことによって、すなわち、活性ドメインをもう１つ含む １つまたはそれ以上の他のキメラタンパク質とのオリゴマー化によって、細胞内 へのシグナルを開始することが可能な活性ドメインに融合する。このシグナルに よって、シグナルに反応する転写制御エレメントの転写制御下にある、この場合 には標的遺伝子のような、遺伝子の転写活性化が可能である。従って、方法は、 標的遺伝子の発現が起こるのに効果的な量がキメラタンパク質に結合することが 可能な程度のオリゴマー化したリガンドに細胞をさらすことを含む。細胞を培養 液中で培養している場合には、細胞をリガンドにさらすことは、培地中にリガン ドを添加することによってもたらされる。細胞が宿主体内に存在する場合には、 細胞をリガンドにさらすことは、リガンドを宿主体内に投与することによっても たらされる。例えば、宿主体が動物、特にほ乳動物（ヒトを含む）である場合に は、経口、頬、舌下、皮膚経由、皮下、筋肉内、静脈内、関節、または吸入によ る場合に応じた適切な輸送手段にて投与することによって宿主動物にリガンドを 投与する。操作した細胞を除去するためには、一次キメラをオリゴマー化させる ことが可能な二次的なオリゴマー化用のリガンドを培養液に添加するかまたは宿 主体に投与する。 本発明は、動物組織または操作した細胞を含む被検者由来の細胞を含む、様々 な細胞の混合物から本発明の遺伝学的に操作した細胞を除去するための薬剤組成 物にまで及ぶ。このような薬剤組成物は、薬剤的に受容可能なキャリヤーおよび 所望によっては１つまたはそれ以上の薬剤的に受容可能な補形剤と混合した状態 の、本発明のオリゴマー化したリガンドを含む。オリゴマー化したリガンドは、 本発明の一次キメラタンパク質に結合可能または本発明の操作した細胞にアポト ーシスを引き起こすことが可能な限り、本明細書中に詳細に記載したような、ホ モのオリゴマー化試薬またはヘテロなオリゴマー化試薬でよい。同様に、本発明 は、細胞培養液中または被検者における本発明の操作した細胞のキメラタンパク 質のオリゴマー化の程度を、全体または部分的に妨げまたは減少させ、そしてこ のようにして適切な細胞の細胞死を妨げまたは細胞死活性をなくすための、薬剤 的に受容可能なキャリヤーおよび所望によっては１つまたはそれ以上の薬剤的に 受容可能な補形剤と混合した状態の、本発明のオリゴマー化の拮抗剤を含む薬剤 組成物にまで及ぶ。従って、薬剤化合物を調製するためのオリゴマー化試薬およ びオリゴマー化拮抗剤の使用は、本発明の及ぶ範囲内である。 本発明はまた、本発明のオリゴマー化したリガンドに反応を示す宿主生物、好 ましくは動物であり、多くの場合はほ乳動物を提供する方法も提供する。方法は 、本明細書中に記載したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物などを含む 、本発明に従ってｅｘ ｖｉｖｏで操作した細胞を持ち出すことを含む。あるい は、例えばｉｎ ｖｉｖｏで宿主ほ乳動物の１つまたはそれ以上の細胞を形質導 入することが可能な条件下にある、ほ乳動物の、宿主体中に本発明のＤＮＡ構築 物を、導入可能である。 我々はさらに、リガンドによって制御されるアポトーシスを受けやすい細胞を 生産するためのキットを提供する。キットには、少なくとも１個の受容ドメイン および活性ドメインを含む、我々の一次キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構 築物を少なくとも１つ含む（たとえば、本明細書中に記載したような、Ｆａｓま たはＴＮＦ受容体の細胞質ドメイン）。ある態様において、ＤＮＡ構築物は、１ つまたはそれ以上のキメラについて細胞型または組織特異的な発現を提供するた めの細胞型特異的な発現用の制御エレメント（プロモーターおよび／またはエン ハンサーエレメント）を組み込むための部位を取扱者に提供する従来のポリリン カーを含む。キットには、キットのＤＮＡ構築物によってコードされるキメラタ ンパク質分子をオリゴマー化できる本発明のリガンドを含み、さらに、例えば単 量体リガンド試薬のような、オリゴマー化の拮抗剤を含む。構築物によってコー ドされるキメラタンパク質がただ１つである場合には、オリゴマー化するリガン ドはホモのオリゴマー化リガンドである。このようなキメラタンパク質がいくつ かコードされている場合には、ヘテロなオリゴマー化をするリガンドが含まれる 。キットはさらに、所望のキメラをコードするＤＮＡ構築物および／または標的 遺伝子構築物および／またはキメラタンパク質分子のオリゴマー化に反応を示す 転写制御エレメントを含む。ＤＮＡ構築物は、好適には、原核生物における複製 、真核生物に置ける発現などに有効な従来のベクターエレメントと同様に、形質 転換体の選択が容易になるような１つまたはそれ以上の選択マーカーに結合させ る。さまざまなＤＮＡ構築物の組合せを含む細胞を選択することが可能になるよ うに、各々のＤＮＡ構築物については同様のまたは異なる選択マーカーにする。 例えば、本発明のキットは、本明細書中に記載した一次キメラタンパク質をコ ードするＤＮＡ構築物を含む；転写活性化ドメインに融合した、少なくとも１つ の受容ドメイン（選択したリガンドに結合可能）を含むキメラタンパク質をコー ドする第一の所望のＤＮＡ構築物；ＤＮＡ結合ドメインに融合した、少なくとも １つの受容ドメイン（選択したリガンドに結合可能）を含むキメラタンパク質を コードする第二の所望のＤＮＡ構築物；およびＤＮＡ結合ドメインが結合し、所 望の一次および二次キメラタンパク質の存在下で、リガンドにさらすことによっ て転写が活性化されるＤＮＡ配列を含む転写制御エレメントの制御下にある、標 的遺伝子をコードする標的遺伝子ＤＮＡ構築物。 または、発現誘導される転写制御エレメントの制御下にある標的遺伝子を誘導 するためのＤＮＡ構築物は、標的遺伝子の位置にクローニング部位を含み、取扱 者が提供する遺伝子を誘導的に発現するように細胞を操作するためのキットを提 供する。 本発明の他のキットは、いくつかは活性ドメインの場所にクローニング部位を 含むキメラタンパク質用の１つまたは２つ（またはそれ以上）のＤＮＡ構築物を 含み、使用者が活性ドメインを望ましいところに挿入することを可能にする。こ のようなキットは所望により、例えば発現誘導の制御下にある標的遺伝子のＤＮ Ａ構築物、オリゴマー化したリガンド、拮抗剤などのような、上記に記載した他 のエレメントを含む。 キットは、細胞がリガンドにさらされることに反応して、レポーター遺伝子（ ＣＡＴ，ベータガラクトシダーゼまたは従来の検出可能な遺伝子産物）を発現す るような本発明の構築物を安定に形質転換した正のコントロール細胞もまた含む 。レポーター遺伝子の発現を検出および／または定量するための試薬もまた提供 する。 図の詳細な説明 図１は、プラスミドｐＳＸＮｅｏ／ＩＬ２（ＩＬ２−ＳＸ）の図解である。Ｎ Ｆ−ＡＴ−ＳＸでは、ＩＬ２のエンハンサー／プロモーターを含むＩＬ２−ＳＸ 由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩＤＮＡ断片を、基本的な転写に関与する最少の ＩＬ２プロモーター領域および３つのタンデムなＮＦＡＴ−ベアディング部位（ 以下に記載）を含む誘導可能なエレメントによって置換される。 図２は、細胞内シグナル伝達を行なうキメラプラスミドｐ♯ＭＸＦｎおよびｐ ＭＦｎＺの調製の流れ図であり、ｎは結合ドメインの数を示す。 図３Ａおよび３Ｂは、細胞外シグナル伝達を行なうキメラプラスミドｐ♯１Ｆ Ｋ３／ｐＢＪ５の調製の流れ図である。 図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、被検者についての発明で用いたプラスミドの構築 に使用したプライマーの塩基配列である。 図５は、ＴＡＣ／ＣＤ３ζ受容体がリガンドに反応するいくつかのエンハンサ ーグループを持つレポーター構築物の反応の図解である。 図６は、実施例１に記載したＴＡｇヤーケット細胞に対するさまざまなリガン ドの活性の図解である。 図７は、細胞外受容体１ＦＫ３（ＦＫＢＰｘ３／ＣＤ３ζ）に対するリガンド ＦＫ１０１２Ａ（８，図９Ｂ）の活性の図解である。 図８は、ミリスチル化したＣＤ３ζ／ＦＫＢＰ１２キメラを通じたシグナル伝 達によるＮＦＡＴレポーター活性の図解である。 図９Ａおよび９Ｂは、各々、アリル基に結合したＦＫ５０６誘導体およびシク ロヘキシル基に結合したＦＫ５０６誘導体の化学構造である。 図１０は、ＦＫ５２０誘導体の合成の流れ図である。 図１１ＡおよびＢは、ＦＫ５２０誘導体の合成の流れ図およびＦＫ５２０の化 学構造であり、下の構造は変異型ＦＫＢＰ１２に結合するようにデザインした。 図１２は、修飾したＦＫ５２０とＦＫＢＰ変異体を図式化したものである。 図１３は、ＦＫ５２０およびサイクロスフォリンのヘテロ二量体合成の流れ図 である。 図１４は、受容体ドメインとしてイムノフィリン分子を含むキメラタンパク質 によって例示した、キメラタンパク質のオリゴマー化の図解である。 図１５は、リガンドによって仲介されるキメラタンパク質のオリゴマー化を描 写したものであり、転写開始シグナル伝達の引金を図的に示す。 図１６は、ＦＫ５０６型分子に基づくＨＥＤおよびＨＯＤ試薬の合成法を描写 したものである。 図１７は、ＣｓＡから始まる（ＣｓＡ）²の合成の描写である。 図１８は、融合したｃＤＮＡ構築物およびＭＺＦ３Ｅタンパク質の概観である 。 図１９は、ミリスチル化されたＦａｓ−ＦＫＢＰ１２融合タンパク質（ＭＦＦ ３Ｅ）で形質転換したヤーケットＴ細胞系列のＦＫ１０１２によって誘導される 細胞死を、細胞の転写活性の減少にて示した。 図２０Ａは、一次的な形質転換解析によるサイクロフィリン−Ｆａｓ（および Ｆａｓ−サイクロフィリン）融合構築物の解析である。ＭＣ３ＦＥは、この系列 においてもっとも効果的であることがわかる。 図２０Ｂは、イムノフィリン−Ｆａｓ抗原キメラおよびラージＴ抗原で安定に 形質転換したヤーケットＴ細胞中における一次的な発現実験の結果を描写する。 Ｍｙｒ：１−１４残基にコードされるｐｐ６０^c-src由来のミリスチル化配列（ ウィルソンら．，Ｍｏｌ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ１９４（１９８９）：１５３６−４ ４）；ＦＫＢＰ：ヒトのＦＫＢＰ１２；ＣｙｐＣ：３６−２１２残基にコードさ れるマウスサイクロフィリンＣ配列（フリードマンら．，Ｃｅｌ１６６ ４（１ ９９１）：７９９−８０６）；Ｆａｓ：１７９−３１９残基にコードされるヒト Ｆａｓ抗原の細胞内ドメイン（オームら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６７ １５ （１ ９９２）：１０７０９−１５）。細胞を、６倍モル濃度のイムノフィリン融合構 築物とともに、３つタンデムにつながったＡＰ１プロモーターの制御下にある分 泌アルカリフォスファターゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドでエレク トロポレーションによる形質転換をした。２４時間後に、レポーター遺伝子の合 成を刺激するＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）および（ＣｓＡ）２で刺激した。４８時 間後に、細胞を、レポーター遺伝子活性の測定を行なった。ウエスタンブロット は、坑ＨＡエピトープ坑体を使用して２４時間行なった。 図２１は、修飾したＦＫ５０６型化合物の合成の描写である。 記載 Ｉ．遺伝学的議論 本発明は、キメラタンパク質、キメラタンパク質をオリゴマー化するための基 本的な分子およびこれらを使用するためのシステムを提供する。融合タンパク質 （キメラ）は、（好ましくは小さな）基本的なオリゴマー化分子に結合するため の結合ドメイン、およびキメラタンパク質がオリゴマー化した結果、生理学的反 応または細胞内プロセスを効率的にできる活性ドメインを持つ。 誘導されるタンパク質が会合する基本的な概念は、図１４に例示する。ヘテロ 二量体化（またはヘテロオリゴマー化、”ＨＥＤ”）およびホモ二量体化（また はホモオリゴマー化、”ＨＯＤ”）試薬として機能できるリガンドを、ダンベル 型構造として描写する。 （ホモ二量体化およびホモオリゴマー化は、本発明のリガンドによって結合さ れる、同じ化合物が結合して二量体またはオリゴマーを形成することを言う。ヘ テロ二量体化およびヘテロオリゴマー化は、違う化合物が結合して二量体または オリゴマーを形成することを言う。従って、ホモオリゴマーは、ある特定の化合 物が多数会合したものを含み、一方、ヘテロオリゴマーは、異なる化合物が会合 したものを含む。本明細書中で使用した”オリゴマー化”、”オリゴマー化する ”および”オリゴマー”の言葉は、”二量体化”、”二量体化する”および”二 量体”を含み、逆はなりたたない。） 図１４の描写はまた、興味ある標的タンパク質ドメイン（”活性ドメイン”） およびリガンドに結合できる１つまたはそれ以上の受容体ドメインを含む融合タ ンパク質分子でもある。細胞内キメラタンパク質、即ち、細胞内に存在し、細胞 内で生産されるタンパク質には、細胞標的配列（細胞内小器官への標的アミノ酸 配列を含む）が、好適には存在する。受容ドメインにリガンドが結合すると、融 合タンパク質がヘテロまたはホモ二量体化する。オリゴマー化によって活性ドメ インは互いに最も近い位置になり、それによって、通常活性ドメインに関連した 細胞内プロセス、たとえばアポトーシスまたはＴＣＲによって仲介されるシグナ ル伝達、の引金が引かれる。 オリゴマー化によって始まる細胞内プロセスは、例えば構造変化といった物理 的状態のような状態の変化、結合相手の変更、細胞死、転写開始、チャネルの開 口、Ｃａ⁺²などといったイオンの放出、アセチル化、メチル化、ヒドロキシル化 、リン酸化または脱リン酸化のような酵素的に触媒される化学反応といった化学 状態、レドックス状態の変化、リアレンジメントのようなことを含む。従って、 本発明に置ける当初の焦点はアポトーシスであるが、リガンドによって仲介され るオリゴマー化により引き起こされるこのような過程は、本発明の範囲内に含ま れる。 本発明の中心的な特徴として、細胞は、本明細書中に記載した一次キメラに結 合し、そしてオリゴマー化することができるようなリガンド分子に反応するよう に修飾される。例えば、以下に記載したような、実施例４（Ｂ）および４（Ｃ） 参照。このように操作した細胞は、リガンドの存在に対してアポトーシスを行な うことによって反応するため、従って、遺伝子治療の応用または遺伝学的に修飾 した細胞を除去する必要のある時または望む場合のような他の状況において除去 できる。例えば、修飾した細胞はガン化する可能性があり、さもなければ毒性ま たは不必要になる可能性がある。 修飾した細胞は、リガンドによって制御されるアポトーシスを可能にする、本 発明の一次キメラタンパク質をコードする遺伝学的構築物（またはその一連のも の）を含むゲノムによって特徴づけられる。一次キメラは、例えば、互いに結合 し、多くの細胞においてアポトーシスを誘導するｆａｓ抗原またはＡｐｏ−１抗 原の細胞質ドメインを含む（トラウフら．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５， ３０１−３０５；ワタナベ−フクナガら．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５６，３ １４）。この方法で、操作した細胞集団に対して、リガンドによって誘導できる 細胞死を提供することが可能になる。 細胞は、選択したリガンド分子と結合し、および反応できる所望の付加的なキ メラタンパク質を生産するように遺伝子工学をさらに施すことが可能である。こ のようにさらなる所望の遺伝子工学は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞培養およ び遺伝子治療への応用を含む応用に使用できるような、リガンドによって制御可 能な付加的な機能性を細胞に与える。好適には、所望の付加的なキメラに結合で き、所望の付加的な細胞内プロセス（例えば、遺伝子の転写のような）を制御で きるリガンド分子は、一次キメラ分子とは反応しないため、遺伝子工学を施した 細胞はアポトーシスを引き起こさない。 このようにさらに修飾した細胞は、望ましい標的遺伝子の転写または翻訳（ど ちらも時期特異的な発現によって制御される）のような細胞内プロセスの制御と いった応用に使用可能である。このような細胞は、少なくとも所望の付加的なキ メラをコードする遺伝学的構築物の第一または第一のシリーズ（シリーズはただ １つの構築物を含む）、および望ましくは標的遺伝子構築物の第二または第二の シリーズ（シリーズはただ１つの構築物を含む）を含むゲノムによって特徴づけ られる。 このような遺伝学的構築物の性質および数は、キメラタンパク質の性質および 細胞内に置けるその役割に依存する。例えば、標的遺伝子の発現（および細胞表 面の膜または核または小胞のような細胞内小器官にキメラタンパク質を結合させ るような細胞内標的配列またはドメインを含む標的遺伝子の発現）に関連する所 望の付加的なキメラタンパク質の態様において、通常少なくともこのような付加 的な構築物が２シリーズ必要である：リガンドで仲介されるオリゴマー化によっ て標的遺伝子発現をおこすようなシグナル伝達を開始するキメラタンパク質をコ ードする一次シリーズ、および望ましくはシグナル伝達に反応する標的遺伝子お よび／または発現制御エレメントを含む第二のシリーズ。 単一種の第一のシリーズの構築物が、ホモオリゴマー、通常はホモ二量体が含 まれる場合に必要であり、一方、ヘテロオリゴマーが含まれる場合に、２つまた はそれ以上で、通常は３つ以上にはならない構築物が含まれる。構築物の第一の シリーズによってコードされるキメラタンパク質は、遺伝子の転写物の集合体と 結合し、通常はオリゴマー化したキメラタンパク質が、１つまたはそれ以上の標 的タンパク質の転写を直接または間接的に開始することが可能な膜表面または核 に向かわせる。付加的な構築物の第二のシリーズは、外来遺伝子が導入される場 合または細胞内遺伝子の発現用に外来遺伝子または組換え発現制御配列（例えば 、相同組換えによって）が導入される場合に必要であり、どちらの場合において も、その転写はキメラタンパク質のオリゴマー化によって活性化される。 キメラタンパク質が細胞内にあり、他の遺伝子の転写を開始しないで直接働く ことができる場合には、異なる第一シリーズの付加的な構築物が使用される。例 えば、エキソサイトーシスに関与するタンパク質は、誘導的または構成的に発現 されるが、通常はタンパク質はオリゴマー化分子が存在しないと複合体を形成し ない。これらの特質のいくつかまたはすべてを持つ、宿主細胞中で複合体を形成 しないタンパク質を使用することによって；他のタンパク質との複合体形成によ って阻害され、阻害はリガンドとオリゴマー化する事によって解かれる；宿主細 胞中では不可能なプロセスを通じた活性化が必要であり；またはキメラタンパク 質を作るために小胞と細胞膜をを直接融合させるようなタンパク質を修飾するこ とによって、複合体形成の程度および膜への融合はオリゴマー化分子の存在下に おいて活性化されるが、エキソサイトーシスはオリゴマー化分子によって誘導さ れる。 キナーゼ、ホスファターゼおよび細胞周期制御タンパク質のような他の細胞内 タンパク質は、同様に修飾し使用できる。 本発明の実用化において有用な所望の付加的な遺伝学的構築物の様々な分類を 以下に記載する： （１）結合ドメインは細胞外または細胞内で、活性ドメインは細胞内のタンパ ク質であり、リガンドによって仲介されるキメラタンパク質をオリゴマー化する のような、それ自身（ホモオリゴマーを形成する）または異なる活性ドメインを 含む異なる融合タンパク質（ヘテリオリゴマーを形成する）は、１つまたはそれ 以上の遺伝子の転写活性化の結果生じた一連の事柄の結果としてのシグナルを誘 導する、結合ドメインおよび活性ドメインを含むキメラタンパク質をコードする 構築物； （２）結合ドメインおよび活性ドメインは核内にあり、リガンドによって仲介 されるタンパク質をオリゴマー化するような、それ自身（ホモオリゴマーを形成 する）または異なる活性ドメインを含む異なる融合タンパク質（ヘテリオリゴマ ーを形成する）は、ＤＮＡの転写開始領域とオリゴマーの複合体形成を通して直 接転写を誘導する、結合ドメインおよび活性ドメインを持つキメラタンパク質を コードする構築物； （３）結合ドメインおよび活性ドメインは細胞質内にあり、リガンドによって 仲介されるタンパク質をオリゴマー化するような、それ自身（ホモオリゴマーを 形成する）または異なる活性ドメインを含む異なる融合タンパク質（ヘテリオリ ゴマーを形成する）によって、エキソサイトーシスを起こす、結合ドメインおよ び活性ドメインを含むキメラタンパク質をコードする構築物；および （４）結合ドメインおよび活性ドメインは細胞外にあり、活性ドメインは生化 学的活性化の開始に関連しているような（例に限らずに、活性ドメインはそれ自 身基質、受容体または他の膜タンパク質産物に結合可能で、リガンドによって仲 介されるキメラのオリゴマー化に応じて、１つまたはそれ以上の同様または異な る分子または細胞をかけはしする）、結合ドメインおよび活性ドメインを含むキ メラタンパク質をコードする構築物；および、 （５）リガンドによって仲介されるタンパク質と、上述のオリゴマー化した標 的タンパク質の不安定化および／または分解または不活性化を誘導する異なる活 性ドメインを含む標的タンパク質とのオリゴマー化のような、結合ドメインおよ び活性ドメインを持つ不安定化、不活性化または半減期の短いキメラタンパク質 をコートする構築物。 ＩＩ 転写制御 上述の分類（１）および（２）の構築物は、初めに考慮した。分類（１）の構 築物は、その効果において、分類（２）の構築物と異なる。分類（１）の構築物 は、いくらか多機能的である、即ち、標的遺伝子と同様に、いくつかの野生型遺 伝子を活性化できる。さらに、リガンドに対する分類（１）の遺伝子の発現産物 の反応は、比較的遅い。分類（２）の構築物は、特定の標的遺伝子を標的とし、 転写される遺伝子の数が限られている。リガンドに対する分類（２）構築物の発 現産物の反応は、非常に速い。 分類（１）および（２）のシステムは、１つから３つで、通常は１つから２つ 含む異なる構築物を通常含む、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む 第一のシリーズの構築物を含む。システムは、通常、１つまたはそれ以上の外来 遺伝子の発現を提供する第二のシリーズの構築物をまた含む。”外来遺伝子”と は、例えば、細胞の性質、細胞の遺伝的欠損、異なる種由来または変異を導入し たあるいは合成遺伝子などの遺伝子のために、通常では細胞が発現しない遺伝子 を意味する。このような遺伝子は、タンパク質、アンチセンス分子、リボザイム などをコードし、または発現制御配列が通常は関与しない細胞内遺伝子に結合し たまたは結合させた発現制御配列を含むＤＮＡ配列である。従って、上述したよ うに、構築物は、リガンドによって細胞内遺伝子の発現が誘導されるような外来 遺伝子または組換え発現制御配列を含む。 分類（１）、（２）および（３）の構築物によってコードされるキメラタンパ ク質は、好適には、望ましい画分、例えば、膜表面、核、小胞膜、またはリガン ドによって仲介されるキメラタンパク質のオリゴマー化、少なくとも二量体化に よって、望ましい生理学的活性化がおこるような他の場所に、キメラタンパク質 を方向付けるための配列を含む細胞内標的ドメインを持つ。 キメラタンパク質は、少なくとも１つのリガンド分子が結合できる第二のドメ イン（”結合”または”受容”）を含む。リガンドは１つ以上の結合部位または エピトープを含むので、本発明のキメラタンパク質と二量体またはより高次のホ モまたはヘテロオリゴマーを形成できる。キメラタンパク質の結合ドメインは、 １つまたは複数の結合ドメインを持つので、ホモオリゴマーは二価のリガンドで 形成できる。このようにして、リガンドは第二のドメインが結合できる２つまた はそれ以上のエピトープを持つことによってキメラタンパク質をオリゴマー化で きるため、キメラタンパク質のより高次のオリゴマー化を提供することがが可能 になる。 キメラタンパク質はまた、結合ドメインを通して、リガンドによって仲介され るキメラタンパク質のオリゴマー化がおこると、生物学的な活性化を始める第３ の（”活性”）ドメインを含む。従って、活性ドメインは、リガンドによって仲 介されるオリゴマー化の結果としてのシグナル伝達に関与する。例えば、このよ うなシグナルが生じた結果、シグナル伝達に含まれるある特定の仲介因子に依存 して、１つまたはそれ以上の遺伝子の転写が開始する。ミリスチル化部位を含む 細胞内標的ドメインを持つ例示したキメラタンパク質を描写した図１５を参照； 受容ドメインは、３つのＦＫＢＰ１２部分を含み；および活性ドメインは、ゼー タサブユニットを含む。他のキメラタンパク質において、活性ドメインは、オリ ゴマー化に伴って、１つまたはそれ以上の標的遺伝子、細胞内遺伝子および／ま たは外来遺伝子の転写を開始するような転写因子を含む。活性ドメインは、表面 または他の膜と小胞膜を融合するのに関与するタンパク質またはタンパク質部分 、例えば、ＳＮＡＰタンパク質およびＳＮＡＲＥ基（ゾルナーら．，Ｎａｔｕｒ ｅ（１９９３）３６２，３１８および３５３；Ｃｅｌｌ（１９９３）７２，４３ 参照）を含む。Ａ 表面膜レセプター 本発明の別のキメラ蛋白質の一群は表面膜に含まれ、一つまたはそれ以上の遺 伝子の転写を先導する信号を導入することができる。この過程には標的遺伝子に 関係するプロモーター領域への転写因子の結合を生む一連の相互作用に多くの補 助蛋白質が含まれている。転写因子が他の遺伝子に関係するプロモーター領域に 結合する場合には、同様にそこで転写が開始される。この実施態様のキメラ蛋白 質をコードしている構築物は、プロセシングを受け、従って成熟キメラ蛋白質に は存在しないであろうシグナル配列をコードすることができる。本キメラ蛋白質 は全ての場合において（ａ）前もって決定されているリガンドを結合できる結合 ドメイン、（ｂ）トランスメンブランドメインまたは融合蛋白質を細胞表面／膜 に移し、細胞表面膜へ結合された蛋白質を保持するために結合された脂質を含む 随意の（しかしながら多くの実施態様で好適である）膜結合ドメイン、および（ ｃ）活性ドメインとしての細胞質シグナル開始ドメインを含んでいる。細胞質 シグナル開始ドメインは転写開始領域中の開始シグナルのための認識配列を持つ 遺伝子の転写を生じるシグナルを開始させることができる。 その発現がキメラ蛋白質からのシグナルにより制御されている遺伝子は、それ が内因性または外因性（またはハイブリット）発現制御配列の発現制御下の外因 性遺伝子または内因性遺伝子であるにしてもここでは”標的”遺伝子と称される 。膜への結合のために働くキメラ蛋白質の分子部分もまた”保持ドメイン”と称 される。適した保持ドメインには膜中の脂質参加を通してまたは膜を通過して伸 びるなどのように膜の脂質層に直接的に結合する部分を含んでいる。そのような 場合においては、蛋白質は図１５に示したように膜、特に細胞膜に移され、結合 されている。Ｂ．核転写因子 別の随意の第一の構築物は、核に移されるべき蛋白質を提供する細胞標的配列 を含んでいるキメラ蛋白質をコードしている。この（”シグナル共通”）配列は 二つの部分からなる塩基性反復(Garcia-Bustons et al，Biochimica et Biophys ica Acta(1991)1071,83-101)と称される多数の塩基性アミノ酸を持っている。こ の配列は内部またはＮ−またはＯ−末端近傍の分子の任意の位置に現れることが でき、キメラ蛋白質を核の内部に位置させるようにする。本発明の一つの実施態 様の実施では少なくとも二つの（第一の組）キメラ蛋白質が含まれているであろ う：（１）一つは標的遺伝子に関係する転写開始領域のＤＮＡへ結合する作用ド メインを持つもの、および（２）第一のキメラ蛋白質のＤＮＡ結合ドメインと共 同して標的遺伝子の転写を開始させることができる転写活性化ドメインを作用ド メインとして含む異なったキメラ蛋白質。この二つの作用ドメインまたは転写因 子は同一のまたは異なった蛋白質分子から誘導できる。 転写因子は細胞宿主に対して内因性でも外因性でもよい。もし転写因子が宿主 内で機能的であるが外因性であり、内因性ＲＮＡポリメラーゼ（外因性ＲＮＡポ リメラーゼを必要とするよりも、これに対し遺伝子が導入できるであろう）と協 力できるならば、融合転写因子に機能する外因性プロモーター要素から標的遺伝 子の転写を制御するための第二の構築物が提供できる。この手段により転写の開 始が外因性プロモーター領域に関係する遺伝子、すなわち標的遺伝子に制限でき る。 その活性に二つのサブユニットを必要とする多くの転写因子が知られている。 もしくは、単一の転写因子が二つの別々な機能性ドメイン（例えば、転写活性化 因子ドメインおよびＤＮＡ結合ドメイン）に分割できる場合、各々のドメインは それ自身では不活性であるが、一緒に非常に近接して置かれた場合には活性が回 復される。使用することができる転写因子には、FeldsおよびSong（上記文献） に記載されているように二つのドメインに分割可能な酵母ＧＡＬ４が含まれる。 著者はＧＡＬ４（１−１４７）−ＳＮＦ１およびＳＮＦ４−ＧＡＬ４（７６８− ８８１）の融合を使用しており、ここでＳＮＦ１および−４は結合ドメインとし て課題結合蛋白質に置換されているであろう。ＧＡＬ４およびＶＰ１６またはＨ ＮＦ−１の組み合わせが使用されるであろう。その他の転写因子はＪｕｎ、Ｆｏ ｓおよびＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリー、Ｏｃｔ１、Ｓｐ１、ＨＮＦ−３ステロイ ドレセプタースーパーファミリーなどの群である。 ＤＮＡ結合ドメインおよび天然の活性化ドメインまたはその修飾型の組み合わ せを用いる別法としては、活性化ドメインが転写活性化ドメインおよびＲＮＡポ リメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼIIが含まれるがそれに制限されるわけではない ）間の架橋に関連する結合蛋白質の一つに置換されているであろう。これらの蛋 白質にはＴＦII蛋白質、特にＥおよびＤなどのＴＡＦ’ｓと称されている蛋白質 が含まれる。従って、ＤＮＡ結合ドメインとＲＮＡポリメラーゼ間の架橋として 働き転写の開始を提供する任意の一つまたは蛋白質（例えば融合蛋白質）および その結合モチーフの組み合わせが使用できる。好適には転写の開始を提供するた めにＤＮＡ結合ドメインと連結してＲＮＡポリメラーゼに最も近い蛋白質が使用 されるであろう。必要に応じ、転写開始複合体を提供するため一緒に集められる べき３またはそれ以上（通常約４より多くはない）の蛋白質を課題とする構築物 が提供することができる。 作用ドメインとして転写活性化ドメインを持つよりもｓｓｎ−６／ＴＵＰ−１ またはクリュッペルーファミリーサプレッサードメインのような不活性化ドメイ ンが用いることができる。この様式では、制御により構築的に発現される遺伝子 の転写を止めることになる。例えば、遺伝子治療の場合において成長ホルモンの ようなホルモン、血液蛋白質、免疫グロブリンその他の構築的発現を提供できる 。リガンド結合ドメインに連結されたＤＮＡ結合ドメインを含む一つのキメラ蛋 白質およびリガンド結合ドメインに連結された不活性化ドメインを含む別のキメ ラ蛋白質をコードしている構築物を用いることにより、遺伝子の発現をリガンド 仲介オリゴマー化により阻害することができる。 なかんずく転写活性化ドメインまたはサブユニット、転写不活性化ドメインま たはＤＮＡ−結合ドメインに融合されたリガンドー結合ドメインを含むキメラ蛋 白質をコードしている構築物は他の構築物で記載したような方法と同様の方法に より設計および組み立てることができる。しばしば、転写因子のＮ−末端がリガ ンドー結合ドメインのＣ−末端に結合されるであろう、しかしながらいくつかの 場合には逆であろうし、例えば、単一の転写因子の二つの個々のドメインが二つ の異なったキメラ間で分割される。III．エキソサイトーシス リガンド仲介オリゴマー化機構の別の応用はエキソサイトーシスであり、転写 というよりも蛋白質の放出がリガンドにより制御される。これは分泌シグナル配 列を通した問題とする蛋白質の分泌を提供するための変質法として、問題とする 一つまたはそれ以上の蛋白質の発現と共に使用できる。この実施態様は二つの異 なった第一の構築物を含んでいる。一つの構築物はSollnerら（上記文献）によ り記載されているように、小胞膜内に組み込まれるべき小胞へ蛋白質を向かわせ るキメラ蛋白質をコードしている。小胞結合蛋白質として使用されるであろう蛋 白質にはＶＡＭＰ（シナプトブレビン）、ＳＮＣ２、ｒａｂ３、ＳＥＣ４、シナ プトタグミンなど（個々にまたは組み合わせて）が含まれる。細胞膜蛋白質には シンタキシン、ＳＳＯ１、ＳＳＯ２、ニューレキシンなど（個々にまたは組み合 わせて）が含まれる。他の構築物は表面膜への輸送のために提供され、ミリスト リルシグナル配列、他の原形質膜標的化配列（例えば、プレニル化）または上記 のトランスメンブラン保持ドメインを用いている。コードされている蛋白質は上 記の文献に記載されており、全てのまたは機能性部分が作用ドメインとして働く であろう。これらの構築物は外因性蛋白質の発現と共に使用されるてあろうし、 内因性蛋白質の放出を促進するため小胞への輸送またはエンドサイトーシスを受 ける内因性蛋白質のために適切にコードされている。 エキソサイトーシスには種々の機構を用いることができる。細胞型および細胞 におけるエンドサイトーシスに対してどの蛋白質が制限されているかに依存して 、一つまたはそれ以上の小胞結合蛋白質または細胞蛋白質はリガンドにより活性 化される応答要素を持つ一つまたはそれ以上の構築物によりコードされているで あろう。特に興味深いのはＶＡＭＰおよびシンタキシンの組み合わせである。も しくは、非制限蛋白質制御エキソサイトーシスの構築的発現を提供でき、エキソ サイトーシス制限蛋白質のリガンド制御発現を提供できる。最後に、エキソサイ トーシスがキメラ蛋白質とリガンドのオリゴマー化により制御されるために、エ キソサイトーシスに付随するキメラ蛋白質の構築的発現を提供できる。適当な結 合ドメインを用いることにより、小胞表面上でオリゴマー化され活性複合体を形 成するか、および／またはリガンドを通して小胞蛋白質と細胞膜表面蛋白質を連 結する異なったキメラ蛋白質が提供できる。欠失または突然変異などのような、 エキソサイトーシスを支配する蛋白質との結合親和性を実質的に減少させるリガ ンドの修飾のためリガンド不在下ではキメラ蛋白質はエキソサイトーシスには提 供されないであろう。これらの修飾は個々の蛋白質の重なりあっている断片を用 い、どの断片が活性を保持しているかを決定することにより容易に決定できる。 実質的に結合に影響を及ぼす個々のアミノ酸を決定するためにアラニン置換を用 いて断片はさらに修飾できる（Beohncke et al.,J.Immunol.(1993)150,331-341; 同文献(1992)148,347-353）。 小胞の内腔で組み立てられた蛋白質は、エキソサイトーシスに付随する融合蛋 白質と同じく上記のように構築的または誘導的に発現できる。エキソサイトーシ スの目的、内因性または外因性蛋白質が含まれているかどうか、放出されるべき 蛋白質が構築的または誘導的に発現されるかどうか、エキソサイトーシスに伴う 融合蛋白質および放出されるべき蛋白質の転写の開始に同一のリガンドが使用で きるかどうか、または異なった蛋白質が異なった誘導可能シグナルを必要とする かなどに依存して発現が制御される様式が決定されるであろう。一つの態様にお いて、エキソサイトーシス機構はリガンドによってのみ制御されるであろう。別 の態様では、少なくとも一つの蛋白質の発現およびエキソサイトーシスの両方が リガンドにより制御されるであろう。 種々の蛋白質がその蛋白質の生理学的活性を失うことなく、蛋白質の小胞への トランスロケーションのための細胞標的化配列の導入により修飾されるであろう 。運搬機構としてエキソサイトーシスを用いることにより、宿主の性質に依存す るが、比較的多い量が短時間の間に運搬され蛋白質の高い極在レベルまたは小胞 系での高濃度が達成される。興味ある蛋白質としては、例えば、インシュリン、 組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、エリスロポエチン、コロニー 刺激因子、成長因子、炎症性ペプチド、細胞遊走因子が含まれる。 蛋白質を小胞に向かわせるためのコード配列はエキソサイトーシスに関係する 小胞結合蛋白質から手に入れることができる。例えば、Sollnerら（上記文献） を参照されたい。 オリゴマー化機構の別の使いみちは蛋白質分解または不活性化の制御である。 例えば、比較的安定で長寿命の本発明のキメラ蛋白質は、比較的短い寿命を持つ かまたはオリゴマーを不安定化または分解のために標的とする本発明の異なった キメラ蛋白質によるリガンド仲介オリゴマー化により不安定化または分解のため の標的とすることができる。この実施態様においては、リガンド仲介オリゴマー 化は短くされた半減期を与えることにより蛋白質の生物学的機能を制御する。後 者のキメラ蛋白質は蛋白質をリソソームの標的とするドメインまたは蛋白質の細 胞質または核または非ーリソソーム細胞小器官での蛋白分解切断に対する感受性 を高めるドメインを含んでいるであろう。 細胞内での蛋白質の半減期は多くの因子により決定され、プロリン、グルタミ ン酸、セリンおよびスレオニン（この故に”ＰＥＳＴ”）が豊富な上記蛋白質内 の短いアミノ酸配列の存在、同様の機能を持つ他の配列、プロテアーゼ感受性切 断部位およびユビキチン化の状態などが含まれる。ユビキチン化とは蛋白質を分 解の標的とする一つまたはそれ以上の単位の短いポリペプチド鎖、ユビキチン、 による蛋白質の修飾である。蛋白質のユビキチン化の速度は、プロセシングを受 ける蛋白質のＮ−末端アミノ酸およびアミノ末端近くの一つまたはそれ以上の独 特のリジン残基の同一性により基本的に決定されると考えられている。IV．他の制御システム 個々の蛋白質に関係する特定の活性のオリゴマー化により制御できるその他の 生物機能は、プロテインキナーゼまたはホスファターゼ活性、レダクターゼ活性 、シクロオキシゲナーゼ活性、プロテアーゼ活性またはサブユニット会合に依存 するその他の酵素反応である。また、Ｇ蛋白質と細胞周期に関係するレセプター 蛋白質（例えば、シクリンおよびｃｄｃキナーゼ、多ユニット酵素）との会合の ために提供できるであろう。Ｖ．構築物の成分 グループ（１）および（２）の随意に追加のキメラ蛋白質に付随する第二また は追加の随意の構築物（標的遺伝子構築物）は、活性化されたレセプターまたは 活性化された転写因子からのシグナル開始に応答性であり、少なくとも一つの問 題とする遺伝子が問題とする配列（通常ｍＲＮＡ）へ転写（その転写および適切 な翻訳は例えば、蛋白質の発現および／またはアンチセンスのような他の遺伝子 の制御、転写因子の発現、膜融合蛋白質の発現などを生じるであろう）されるよ うに、指定された標的認識配列または応答性要素を持つ転写開始領域を持ってい る。異なった目的および異なった部位のためには、異なった結合ドメインおよび 異なった細胞質ドメインが使用されるであろう。表面膜に関係するキメラ蛋白質 レセプターのためには、もしリガンドー結合ドメインが細胞外であればキメラ蛋 白質は種々の表面膜蛋白質から選択された細胞外ドメインを含むように設計でき る。同様に、どの内因性遺伝子が細胞質部分で制御されるかに依存してシグナル を伝達することができる表面膜蛋白質の異なった細胞質または細胞内ドメインを 用いることができる。キメラ蛋白質が内部である場合（表面膜蛋白質に対して内 部、または例えば、核、小胞などのオルガネラに関係している）、リガンドー結 合ドメイン蛋白質は適切には表面膜またはその他の膜と交差できる分子を結合で きるドメインに制限されるであろう。従って、これらの結合ドメインは一般的に は蛋白質または核酸を含まない天然のまたは合成リガンド分子を結合するであろ う。Ａ．細胞質ドメイン グループ（１）のキメラ蛋白質レセプターは種々の細胞表面膜レセプター（そ の突然変異体を含む）の一つからの細胞質ドメインを含むことができ、ここで細 胞質ドメインに関係する転写の開始に含まれている認識配列が既知であるか、ま たはそのような配列に応答性の遺伝子が既知である。問題とする突然変異体レセ プターは制御されていない細胞増殖またはサイトカインの不適当な放出のような 有害な副作用を伴うであろう遺伝子の活性化から標的遺伝子の転写活性化を引き 離すであろう。特に興味あるレセプターー付随細胞質ドメインは以下の特性を持 っているであろう：レセプター活性化は細胞宿主中の比較的少なく（望ましくは １００より少なく）一般的に無害な遺伝子の転写の開始しか起こさず；レセプタ ー活性化により開始される転写に必要な他の因子が細胞宿主に存在し；標的遺伝 子以外で活性化される遺伝子はこれらの細胞が使用されるべき企図する目的には 影響を及ぼさないであろうし；細胞質ドメインのオリゴマー化またはその他の利 用できる機構はシグナル開始を生じ；および所望のリガンドー結合ドメインへの 細胞質ドメインの結合はシグナル発生を妨害しないであろう。多数の異なった細 胞質ドメインが知られている。これらのドメインの多くはチロシンキナーゼであ るかまたはチロシンキナーゼと複合している（例えば、ＣＤ３ζ、ＩＬ−２Ｒ、 ＩＬ−３Ｒなど）。総説としてはCantley et al.,Cell(1991)64,281を参照され たい。架橋（Ulrich,Annu.Rev.Biochem.(1988)57,443により最初に提案された命 名法に基づいて）により活性化されるチロシンキナーゼレセプターには；サブク ラスＩ：ＥＧＦ−Ｒ、ＡＴＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｃ−ｅ ｒｂＢ−３、Ｘｍｒｋ；サブクラスII：インシュリン−Ｒ、ＩＧＦ−１−Ｒ（イ ンシュリン様増殖因子レセプター）、ＩＲＲ；サブクラスIII：ＰＤＧＦ−Ｒ− Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ−Ｂ、ＣＳＦ−１−Ｒ（Ｍ−ＣＳＦ／ｃ−Ｆｍｓ）、ｃ−ｋｉ ｔ、ＳＴＫ−１／Ｆｌｋ−２；およびサブクラスIV：ＦＧＦ−Ｒ、ｆｌｇ（酸性 ＦＧＦ）、ｂｅｋ（塩基性ＦＧＦ）；神経栄養性チロシンキナーゼ：ＮＧＦ−Ｒ 、Ｒｏｒ１，２を含むＴｒｋファミリーが含まれる。架橋によりチロシンキナー ゼと 関係するレセプターには、ＣＤ３ζファミリー：ＣＤ３ζおよびＣＤ３η（主と してＴ細胞で観察される、Ｆｙｎと関係がある）；ＦｃγＲIII／ＣＤ１６のγ 鎖（主としてマクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞で観察される ）；ＣＤ３γ、−δおよび−ε（主としてＴ細胞で観察される）；Ｉｇ−α／Ｍ Ｂ−１およびＩｇ−β／Ｂ２９（主としてＢ細胞で観察される）が含まれる。多 くのサイトカインおよび増殖因子レセプターが、チロシンキナーゼおよび／また は他のシグナル発生分子と相互作用しおよび本発明のキメラ蛋白質の細胞質ドメ インとして使用できる共通βサブユニットに関係している。これらには（１）Ｇ Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５レセプター；（２）ＩＬ−６、白血病阻害 因子（ＬＩＦ）、繊毛性神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭおよび ＩＬ−１１レセプターに関係するβ鎖ｇｐ１３０；（３）ＩＬ−４、ＩＬ−７お よびＩＬ−１３（および多分ＩＬ−９）のレセプターともまた関係するＩＬ−２ レセプターγサブユニット；および（４）Ｇ−ＣＳＦレセプターの細胞質ドメイ ンと相同的であるＩＬ−２レセプターのβ鎖が含まれる。 インターフェロンα／βおよびγを含むインターフェロンファミリー（チロシ ンキナーゼのＪＡＫ、Ｔｒｋファミリーの一つまたはそれ以上の酵素を活性化で きる）ならびに増殖因子、エリスロポエチンおよびプロラクチンのレセプター（ これらはＪＡＫ２を活性化できる）もまた細胞質ドメイン源として使用できるで あろう。 細胞質ドメインの他の源としては細胞表面レセプターのＴＧＦ−βファミリー が挙げられる（Kingsley,D.,Genes and Development 1994 8 133による総説があ る）。レセプターのこのファミリーはその細胞質ドメインに架橋により活性化さ れると信じられているセリン／トレオニンキナーゼ活性を含んでいる。 転写因子の活性化および不活性化に関係するチロシンキナーゼは外因性遺伝子 の発現の開始または阻害を制御でき、それに使用できる特別の経路を提供するた めに特に興味が持たれる。 以下の表は多くのレセプターおよびレセプターに関係する特徴および遺伝子を 活性化するそれらの核応答要素を提供している。このリストは全部を網羅したも のではなく、本発明で使用するための典型的システムを示している。 多くの状況において、突然変異した細胞膜ドメインは導入されたシグナルが野 生型と異なり、野生型経路と比較して制限されたまたは異なった経路を生じる場 合に得ることができるであろう。例えば、ＥＧＦおよびＦＧＦのような増殖因子 の場合、シグナルは細胞増殖には関与しないが、ｃ−ｆｏｓにはまだ保持されて いる突然変異が報告されている（Petersら、Nature(1992)358,678）。 チロシンキナーゼレセプターは体中の広範囲な細胞で観察できる。対照的に、 ＣＤ３ζ−ファミリー、Ｉｇファミリーおよびリンホカインβ鎖レセプターファ ミリーは主として造血細胞、特に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、好塩基球、マ クロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞に観察される。ＮＦ−ＡＴ転 写のために必要なシグナルは主として抗原レセプターのゼータ（ζ）鎖、および より少ないがＣＤ３γ、δ、εから発せられる。 細胞質ドメイン（天然のまま存在してもまたは端を切り取られていても、修飾 されていてもまたは突然変異を受けていても）は少なくとも約１０、普通少なく とも約３０のアミノ酸、より普通には少なくとも約５０のアミノ酸および、一般 的には約４００のアミノ酸を超えない、通常約２００のアミノ酸を超えないもの であろう（Romeoら、Cell(1992)&8,889-893参照）。任意の化学種を用いること ができるが、宿主細胞に対して内因性である化学種が通常好適である。しかしな がら、多くの場合、異なった種からの細胞質ドメインが有効に使用できる。上に 示した任意の細胞質ドメインが使用できるであろうし、現在既知であるまたは後 に発見されるであろうものでもよい。 ほとんどのものは（転写因子に関係する他のキメラ蛋白質）、キメラ蛋白質を 核膜の内部に向ける細胞標的化配列を持っていることおよび作用ドメインとして 転写因子またはその一部を持っていることにおいて主として異なっているであろ う。通常、転写因子作用ドメインは”ＤＮＡ結合ドメイン”および”活性化ドメ イン”へ分割することができる。一つまたはそれ以上のリガンド結合ドメインを 持つＤＮＡ結合ドメインおよび一つまたはそれ以上のリガンド結合ドメインを持 つ活性化ドメインを提供することができる。この方法でＤＮＡ結合ドメインを多 数の結合ドメインおよび／または活性化ドメインに結合することができる。もし くは、シグナル導入のための表面膜に関係するキメラ蛋白質の議論をゲノムＤＮ Ａへの結合を指示するためのキメラ蛋白質に応用することができる。同様に、エ キソサイトーシスに関係するキメラ蛋白質は、導入細胞質蛋白質の代わりに小胞 膜と表面膜の融合に関係する蛋白質とは基本的に異なっているであろう。Ｂ．細胞標的化ドメイン シグナルペプチドまたは配列は細胞表面膜へのキメラ蛋白質の輸送を起こし、 ここで同一のまたは他の配列が細胞表面膜へのキメラ蛋白質の結合を生じさせる 。シグナル配列には一般的なモチーフが存在するが（二つまたは三つのＮ−末端 極性アミノ酸に続く約１５−２０の主として疎水性のアミノ酸）、個々のアミノ 酸は広範囲に変わり得る。従って、宿主で機能する実質的に任意のシグナルペプ チドを使用することができ、キメラ蛋白質の他のドメインの一つに関係していて も関係していなくても良い。普通、シグナルペプチドは処理され、成熟キメラ蛋 白質では保持されていないであろう。シグナルペプチドをコードしている配列は コード配列の５’−末端にあり、開始メチオニンコドンを含んでいるであろう。 膜保持ドメインは実質的に代用でき、活性化のための別の膜領域への結びつき または結合生成に必要とされる決定的なアミノ酸は存在しないため膜保持ドメイ ンの選択は本発明では重要ではない。従って、膜保持ドメインは任意の都合の良 い表面膜または細胞質蛋白質（宿主細胞に対して内在性であってもなくても）か ら単離できるであろう。 少なくとも二つの異なった膜保持ドメインが存在する：膜を通過して伸びてい るアミノ酸配列であるトランスメンブラン保持ドメイン；脂質が細胞表面膜の脂 質と関係する脂質膜保持ドメイン。 ほとんどのものに対し、構築を容易にするために細胞質ドメインまたはレセプ タードメインのトランスメンブランを用いることができ、融合蛋白質の構築を簡 素化し易いであろう。しかしながら、脂質膜保持ドメインに対しては膜へのＮ− 末端結合のためにコード配列の５’−末端におよびＣ−末端結合のために３’末 端の近傍へプロセシングシグナルが通常付加されるであろう。脂質膜保持ドメイ ンはグリシンに結合された約１２から２４の炭素原子、特に１４の炭素原子、よ り特別にはミリストリルの脂質を持つであろう。脂質結合ドメインのためのシグ ナル配列はＮ−末端配列であり広範囲に変わり得るが、通常残基２にグリシンお よび残基７にリジンまたはアルギニンを持っている（Kaplanら、Mol.Cell.Biol. (1988)8,2435）。脂質膜結合に提供するための翻訳後プロセッシングに含まれる ペプチド配列はCarr et al.,PNAS USA(1988)79,6128;Aitken，et al.,FEBS Lett . (1982)150,314;Henderson,et al.,PNAS USA(1982)80,319;Schulz,et al.,Virol ogy (1984)123,2131;Dellman,et al.,Nature(1985)314,374;およびAnn.Rev.of Bi ochem. (1988)57,69の総説に記載されている。興味が持たれるアミノ酸配列は配 列M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-Rである。融合レセプター蛋白質でそのような配 列をコードするためには種々のＤＮＡ配列が使用できる。 一般的に、トランスメンブランドメインは約１８ー３０のアミノ酸、より普通 には約２０ー３０のアミノ酸を持っており、その中心部分は主として中性の非極 性アミノ酸を持っているであろうし、ドメインの末端は極性アミノ酸、しばしば 荷電したアミノ酸（一般的にはトランスメンブランドメインの末端で約１ー２に 荷電された、主として塩基性アミノ酸）を持っており、ヘリックス破壊残基（例 えば、ｐｒｏ−またはｇｌｙ−）が続いているであろう。Ｃ．リガンド結合ドメイン 本発明のキメラ蛋白質のリガンド結合（”二量化”または”レセプター”）ド メインは、天然のまたは非天然のリガンド（好適には非天然の合成リガンド）を 用いる（または結合する）誘導を可能にするであろう都合の良いドメインであっ てよい。結合ドメインは、構築物の性質およびリガンドの選択に依存して細胞膜 の内側でも外側でもよい。レセプターを含む広範囲の結合蛋白質が知られており 、上記の細胞質領域に関係する結合蛋白質が含まれる。特に興味を引くのはリガ ンド（好適には小さな有機リガンド）が既知であるかまたは容易に製造できるも のであろう。これらのレセプターまたはリガンド結合ドメインにはＦＫＢＰおよ びシクロフィリンレセプター、ステロイドルセプター、テトラサイクリンレセプ ター、および上記のその他のレセプター、ならびに抗体、特に重鎖または軽鎖サ ブユニット、それらの突然変異した配列、推計学的方法、結合合成などにより得 られたランダムアミノ酸配列から得られるであろう”非天然の”レセプターが含 まれる。ほとんどのものに対し、レセプタードメインは少なくとも約５０のアミ ノ酸で約３５０のアミノ酸より少なく、通常は２００のアミノ酸より少ないであ ろうし、天然のドメインかまたはそれらの端が切断されたものであろう。望まし い結合ドメインは二量化を起こすことができる、小さい（＜２５ｋＤａ、ウイル スベクターでの効率のよいトランスフェクションを可能にするため）、単量体で （これはアビジンービオチン系を除外する）、非免疫原性でありおよび合成的に 受け入れ可能であり、細胞透過性であり、無毒のリガンドである。 レセプタードメインはキメラ蛋白質をコードする構築物の計画および適当なリ ガンドの利用可能性に依存して細胞内でも細胞外であってもよい。疎水性リガン ドに対しては結合ドメインは膜のどちらの側でもよいが、親水性リガンドに対し ては（特に蛋白質リガンド）、結合に利用可能な形にリガンドを取り込むための 輸送系が存在しない限り結合ドメインは通常細胞膜の外側であろう。細胞内レセ プターに対しては、構築物はシグナルペプチドおよびレセプタードメイン配列の トランスメンブランドメイン５’または３’をコードできるか、またはレセプタ ードメイン配列の脂質付加シグナル配列５’または３’を持っている。レセプタ ードメインがシグナルペプチドとトランスメンブランドメインの間にある場合は 、レセプタードメインは細胞外性であろう。 レセプターをコードしている構築物の部分は種々の理由により突然変異を受け るであろう。突然変異を誘発された蛋白質はより高い結合親和性を与え、天然に 存在するレセプターおよび突然変異を誘発されたレセプターのリガンドによる判 別を可能にし、レセプターーリガンド対を設計するための機会を提供する。レセ プターの変化は結合部位にあることが知られているアミノ酸の変化を含むことが でき、結合部位に関係するアミノ酸またはコンホメーション変化に関係するその 他のアミノ酸に対するコドンを既知の変化でまたは無作為に特定のアミノ酸に対 するコドンに変化させることにより突然変異を発生させることができる結合的技 術を用いたランダム突然変異発生で生じた蛋白質を原核生物宿主で発現させ、続 いて生じた蛋白質の結合をスクリーニングする。この場所の例はＦＫ５０６また はＦＫ５２０の９または１０位での置換を図るためのＦＫＢＰ１２’ｓＰｈｅ３ ６のＡｌａへのおよび／またはＡｓｐ３７のＧｌｙまたはＡｌａへの改変である 。特に、Ｔｙｒ２６、Ｐｈｅ３６、Ａｓｐ３７、Ｔｙｒ８２およびＰｈｅ９９の 一つまたはそれ以上の代わりにＶａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、またはその他 の小さなアミノ酸を含む突然変異体ＦＫＢＰ１２部分はＣ９および／またはＣ１ ０での改変を含むＦＫ５０６型およびＦＫ−５２０型リガンドのためのレセプタ ードメインとして特に興味が持たれる。 抗体サブユニット（例えば重鎖または軽鎖）、特に断片、より特別には可変領 域の全部または一部、または高親和性結合を創り出すための重鎖および軽鎖の融 合は結合ドメインとして使用できる。抗体は生理学的に受容可能であるハプテン 分子に対して製造でき、個々の抗体サブユニットは結合親和性でスクリーニング された。サブユニットをコードしているｃＤＮＡは単離でき、リガンドに対して 適当な親和性を持つ結合蛋白質ドメインを得るために定常部、可変領域の一部の 欠失、可変領域の突然変異発生などにより改変した。この方法では、ほとんど全 ての生理学的に受容可能なハプテン化合物がリガンドとして、またはリガンドの ためのエピトープを提供するために使用できる。抗体ユニットの代わりに、結合 ドメインが既知であり、結合のために有用なリガンドが存在する場合は天然のレ セプターが使用できる。 蛋白質をコードしている配列のインビトロ突然変異発生または結合的改変を用 いることにより蛋白質のライブラリーの産生が可能であり、それは異なったリガ ンドに対する結合親和性でスクリーニングできる。例えば、結合蛋白質をコード しているＤＮＡ配列中の一つまたはそれ以上の部位で１から５、１０またはそれ 以上の配列を完全に無作為化でき、発現構築物を作り、単細胞微生物内へ発現構 築物を導入してライブラリーを発展させる。一つまたは望ましくは複数のリガン ドに対する結合親和性でライブラリーをスクリーニングできる。導入されるであ ろう細胞に適合できる最高の親和性の配列が結合ドメインとして使用できる。内 因性蛋白質に対するリガンドの結合程度を決定するためにリガンドが使用される 宿主細胞でスクリーニングされるであろう。突然変異させた結合ドメインへの結 合親和性と内因性蛋白質への結合親和性の比に重みを付けて結合プロフィールが 決定できた。最高の結合プロフィールを持つリガンドがリガンドとして使用でき た。ファージディスプレイ技術（この技術に制限するわけではない）が前記のも のの実施に使用できる。Ｄ．多量化 導入されたシグナルは通常はキメラ蛋白質分子のリガンド仲介オリゴマー化（ 即ち、リガンド結合に続くオリゴマー化の結果として）により生じるであろうが 、他の結合の結果（例えば、アロステリック活性化）もシグナルの開始に使用す ることができる。キメラ蛋白質構築物は種々のドメインの順序および個々のドメ インの反復の数に関して変化するであろう。転写の５’−３’方向での細胞外レ セプタードメインに対しては、構築物はシグナルペプチド、レセプタードメイン 、トランスメンブランドメインおよびシグナル開始ドメイン（最後のドメインは 細胞内であろう、細胞質性）を含む蛋白質をコードしているであろう。しかしな がら、レセプタードメインが細胞内である場合は異なった順序が用いられ、そこ ではシグナルペプチドにはレセプターかまたはシグナル開始ドメインが続いて、 次に残りのドメインを続かすことができ、複数のレセプターを持つ場合はシグナ ル開始ドメインはレセプタードメインの間に挟むことができる。通常、シグナル 開始ドメインの活性部位は配列の内部にあり、遊離カルボキシル末端を必要とし ない。ドメインの各々を多量化でき（特にレセプタードメイン）通常約５を超え ない、より普通には約３を超えない反復を持っている。 レセプターの多量化のため、キメラ表面膜蛋白質のレセプタードメインのため のリガンドは、少なくとも二つの結合部位を持ち、結合部位の各々がレセプター ドメインに結合できるという意味において通常多量体であろう。望ましくは、問 題リガンドは、個々の分子が典型的には少なくとも約１５０Ｄで約５ｋＤより小 さい（通常は約３ｋＤより小さい）、小さな合成有機分子の二量体またはより高 程度のオリゴマー（通常は四量体より大きくない）であろう。種々の合成リガン ドおよびレセプターの対を用いることができる。例えば、天然のレセプターを含 む実施態様においては二量体ＦＫ５０６がＦＫＢＫレセプターと使用でき、二量 化シクロスポリンＡはシクロフィリンレセプターと使用でき、二量化エストロジ ェンはエストロジェンレセプターと、二量化グルココルチコイドはグルココルチ コイドレセプターと、二量化テトラサイクリンはテトラサイクリンレセプターと 、二量化ビタミンＤはビタミンＤレセプターなどと使用できる。もしくは、高程 度のリガンド、例えば三量体も使用できる。例えば抗体サブユニット、改変抗体 サブユニットまたは改変レセプターなどの非天然のレセプターを含む実施態様に おいては多くの種類の化合物が使用できる。これらのリガンドユニットの著しい 特徴は、それらが高親和性でレセプターを結合し（好適にはＫ_d≦１０^-8Ｍ）、 化学的に二量化できることである。 本リガンドは異なったエピトープを持つ異なったレセプター結合分子を持つこ とができる（同一または異なった結合ドメインを持つキメラ蛋白質のヘテロ二量 化またはヘテロオリゴマー化を仲介することができるので”ＨＥＤ”試薬とも称 されている）。例えば、リガンドはＦＫ５０６またはＦＫ５０６型部分およびＣ ｓＡまたはシクロスポリン部分を含んでいてもよい。両方の部分は共通リンカー 部分へ共有結合で結合されている。そのようなリガンドは第一のキメラ蛋白質が ＦＫ５０６型部分へ結合できるＦＫＢＰ１２のようなレセプタードメインを含み 、および第二のキメラ蛋白質がシクロスポリンＡ型部分へ結合できるシクロフィ リンのようなレセプタードメインを含む場合の第一および第二のキメラ蛋白質の オリゴマー化の仲介に有用であろう。VI．細胞 細胞は原核生物でもよいが、植物、酵母、ぜん虫、昆虫および哺乳類を含む真 核生物が好適である。現在のところ細胞が哺乳類細胞（特に霊長類、より特別に はヒト）であるのが特に好適であるが、問題とする動物、特にウマ、ウシ、マウ ス、ヒツジ、イヌ、ネコなどのような飼い慣らされた動物に関係するはずである 。これらの種の間では、造血、神経、間充織、皮膚、粘膜、間質、筋肉、脾臓、 細網内皮、上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸、肺などのような細胞の様々な型が含 まれる。特に興味が持たれるのは造血細胞であり、リンパまたは骨髄性単球直系 に含まれるであろう核形成細胞が含まれる。特に興味が持たれるのはＴおよびＢ 細胞直系（マクロファージおよび単球）、筋芽細胞および線維芽細胞の一群であ る。また、特に興味をひくのは造血、神経、間質、筋肉、肝臓、肺、胃腸などの ような幹および始原細胞である。 細胞は自然に存在する細胞、同系細胞、同種細胞およびいくつかの場合は異種 細胞であろう。細胞は主要組織適合性複合体（”ＭＨＣ”）プロフィールを変化 させることにより、β２−ミクログロブリンを不活性化により改変してもよく、 機能性クラスＩＭＨＣ分子の生成（クラスII分子の不活性化）を妨げ、細胞毒性 活性などに関係する遺伝子の発現を促進または不活性化することにより細胞毒性 能力を促進または不活性化する一つまたはそれ以上のＭＨＣ分子の発現を提供す る。 いくつかの例において、特定のクローンまたはオリゴクローン細胞が興味を引 くが、その場合細胞は特異的抗原特異性または自動誘導標的部位特異性を持つＴ 細胞およびＢ細胞のような特別の特異性を持っている。VII．リガンド キメラ蛋白質分子のオリゴマー化を達成するため、天然に存在するおよび合成 による両方の物質を含む広範囲のリガンドが本発明に使用できる。リガンドを選 択するための応用可能な、容易に観察できるまたは測定可能な基準は：（Ａ）リ ガンドは生理学的に受容可能であり（即ち、使用される細胞または動物に対する 過度の毒性がない）、（Ｂ）妥当な治療用量範囲を持っている、（Ｃ）望ましく は（遺伝子治療応用を含む全動物での応用のために）経口で投与でき（胃腸で安 定であり、血管系内へ吸収される）、（Ｄ）細胞およびその他の膜を通過できる ことが必要であり、および（Ｅ）望まれる応用のため、かなりの親和性でレセプ タードメインへ結合することである。第一に望まれる基準は、化合物はそのレセ プターを活性化する能力に比較して生理学的に不活性なことである。天然のレセ プターへ弱く結合するほど天然のレセプターへ結合する全リガンドの割合が低く なり、高ければ応答は本来のものであろう。特に、リガンドは天然の蛋白質に強 い生物学的効果を持つべきではない。ほとんどの場合、リガンドはペプチドおよ び核酸ではないであろう。 問題とする化合物はそのほとんどが中央の連結基を通して結合された二つまた はそれ以上のユニットを持っており、ここでユニットは同一でも異なっていても よい。”ユニット”とはレセプタードメインを結合できる個々の部分（例えば、 ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、シクロスポリンＡ、ステロイドなど）であろう。ユニ ットの各々は通常同一の反応基を通して連結基に結合され、少なくともホモダイ マーかまたはより高度なホモオリゴマーであろう。 上記のように、上記の基準を満たした小さな有機分子であり、種々の部位で二 量化できて本発明に従ったリガンドを提供する小さな非蛋白質性有機分子のため の天然のレセプターが色々存在する。結合能力が保持され、所望の特異性を持つ 限りこれらの化合物のかなりの改変が認められる。化合物の多くはマクロサイク ル（例えば、マクロライド）であろう。適切な結合親和性はＫｄ値に反映され１ ０^-4以下がよく、好適には１０^-6以下、より好適には約１０^-7以下であるが、１ ０^-9または１０^-10以下の結合親和性も可能であり、いくつかの場合には最も望 ましいであろう。 現在のところ好適なリガンドはＦＫＢＰ蛋白質および／またはシクロフィリン 蛋白質へ結合可能な化合物のオリゴマー（通常二量体）である。そのようなリガ ンドには、天然のまたは突然変異を発生させた結合ドメインへの結合能力を保持 しているシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０およびラパマイシンのホモ ーまたはヘテロ多量体（通常２ー４、より普通には２ー３ユニット）が含まれる 。合成高親和性ＦＫＢＰリガンドを含むそのような化合物の多くの誘導体はすで に既知であり、本発明の実施に使用できる。例えば、Holt et al,J Am Chem Soc 1993,115,9925-9935を参照されたい。ＦＫ５０６およびその類似体の連結に興 味を引く部位には約１７から２４の輪状炭素原子を含む位置およびこれらの輪状 炭 素分子に結合した置換位（例えば、２１（アリル）、２２、３７、３８、３９お よび４０または３２（シクロヘキシル）が含まれ、２１を除いた同一の位置がＦ Ｋ５２０では興味を引かれる。シクロスポリンにおいて興味を引かれる部位とし てはＭｅＢｍｔ、３位および８位が挙げられる。 特に興味を引かれることは、結合特性を変化させる（特にリガンドの天然に存 在するレセプターに関して）リガンドへの修飾である。付随して、リガンドの変 化に適合するための結合蛋白質を変化させるであろう。例えば、立体的要求を高 めるように、ヒドロキシルをより大きな立体要求性を持つ基に置換することによ り、またはこの位置での大きさを増加させるため、例えばＮ−置換シッフ塩基ま たはイミンを形成させることによりカルボニルをより大きな立体要求性を持つ基 で置換するかまたはカルボニルを官能基化して１０位のカルボニルを修飾するこ とによりＦＫ５０６の９位または１０位の基を修飾できる（Van Duyne et al(19 91)Science 252,839）。これらの位置に都合よく導入できる種々の官能性はエー テルを形成するアルキル基、アシルアミド基、Ｎ−アルキル化アミン（２−ヒド ロキシエチルアミンもまた１，３−オキサゾリンを形成できる）などである。一 般的に、置換基は１から３の、通常１から２のヘテロ原子（通常酸素、硫黄、窒 素など）を含む１から６、通常１から４、およびもっと普通には１から３の炭素 原子からのものであろう。基本的構造の異なった誘導体を使用することにより、 結合に対して異なったコンホメーション要求性を持つ異なったリガンドを創り出 すことができる。突然変異を発生させたレセプターにより、著しくは構造が異な っていない改変リガンドに対し異なった親和性を持つ実質的に同一の配列の異な ったレセプターを作ることができる。 使用できるその他のリガンドはステロイドである。ステロイドは一つまたはそ れ以上のステロイドルセプタードメインを含むキメラ蛋白質に関しての結合素質 を失うことなくその天然の活性が実質的に減少するようにオリゴマー化できる。 高親和性で特定のレセプターへ結合することが知られている種々の薬剤も使用す ることができる。レセプターの結合ドメインは既知であり、従って全天然レセプ ター蛋白質よりもむしろ結合ドメインのみの本発明のキメラ蛋白質での使用を可 能にしているので特別である。この目的には酵素および酵素阻害剤が使用できる 。 Ａ．リンカー 様々な機能性は、アミド基、カルボン酸誘導体を含む、エーテル、エステル、 有機および無機のエステルを含む、アミノ、またはその類似物のような結合に含 まれうる。結合を提供するために、個々のモノマーは、酸化、ヒドロキシル化、 置換、還元等によって修飾され、カップリング部位を提供することができる。モ ノマーによって、様々な部位をカップリング部位として選択しうる。 マルチマーリガンドは、任意の便利な方法によって合成することができ、その ようなリガンドでは、結合基は、レセプターとリガンドの結合部位との結合を妨 害しない部位であろう。また、生理活性のための活性部位、およびレセプタード メインへのリガンドの結合部位は異なっており、通常、活性部位に結合してリガ ンドを不活性化するのが望ましいであろう。様々な結合基は、（水素以外の）２ 分子間の鎖に通常１−３０、より一般的には１−２０の原子を用いることができ 、結合基は、主に、炭素、水素、窒素、酸素、硫黄および燐で構成されるであろ う。結合基は、アミドおよびエステル、有機および無機の、アミン、エーテル、 チオエーテル、ジスルフィド、第四級アンモニウム塩、ヒドラジンなどの様な、 広範囲の機能性を含むことができる。鎖は、脂肪族、脂環式、芳香族、または複 素環式の基を含むことができる。鎖は、合成の簡単さおよびマルチマーリガンド の安定性を基本にして選択されるであろう。この様に、長期間の活性の維持を所 望する場合、比較的不活発な鎖が用いられ、その結果、マルチマーリガンド結合 は切断されないであろう。代わりに、血流中でのほんの短い半減期を所望する場 合、エステルおよびアミド、特にペプチドのような、容易に切断される様々な基 を用いることができ、この様な基では、循環しているおよび／または細胞内のプ ロテアーゼが結合基を切断することができる。 リガンド間の結合基として、アルキレン、通常２から２０の炭素原子からなる 、アザルキレン（通常、窒素が２つの炭素原子の間にあるであろう）、通常４か ら１８の炭素原子からなる、Ｎ−アルキレンアザルキレン（上記を参照のこと） 、通常６から２４の炭素原子からなる、アリレン、通常６から１８炭素原子から なる、アルジアルキレン、通常８から２４の炭素原子からなる、ビスカルボキシ アミドアルキレン、約８から３６の炭素原子からなる、等の様な様々な基を用い る ことができる。実例として、基は、デシレン、オクタデシレン、３−アザペンチ レン、５−アザデシレン、Ｎ−ブチレン ５−アザノニレン、フェニレン、キシ リエン、ｐ−ジプロピレンベンゼン、ビス−ベンゾイル １，８−ジアミノオク タンおよびその類似物を含む。上記のようなリンカーの部分を含む多価のまたは その他（下記を参照のこと）のリガンド分子は、以下の実施例に記載の物質およ び方法を用いて、関連するレセプタードメインを持つ本発明のキメラタンパク質 と共に、評価に値する。 Ｂ．リガンド特性 細胞内結合ドメインのためには、リガンドは生物活性形で細胞膜を通って運搬 されることが可能なように選択される、すなわち、膜透過性であろう。それぞれ のリガンドは、疎水性であるか、または親油性基で適当に修飾することによって 作ることができる。特に、結合橋は、約１２から２４の炭素原子からなる脂肪族 側鎖を提供することによって、リガンドの親油性の増強させることができる。代 わりに、望ましくはエンドゾームを形成せずに、膜透過輸送を増強するであろう 一つまたはそれより多い基を提供することができる。 ある場合には、マルチマーリガンは用いる必要がない。例えば、二つの異なる 結合部位がレセプターのダイマー化を提供するような分子を用いることができる 。その他の場合には、リガンドの結合は、結果としてレセプタードメインのコン フォメーション変化を生じ、その結果、レセプターの活性化、例えばオリゴマー 化、を生ずる。また、結果として細胞質ドメインの活性化を生ずるようなコンフ ォメーションの変化をともなって単一のレセプターを結合すると言ったような、 他の機構もまた、シグナルの誘導に効果をもたらすであろう。 他でも議論したように、標的遺伝子の転写と言ったような、任意の所望のさら なる細胞プロセスを開始する能力を持つリガンドは、望ましくは、人工細胞中の 主なキメラタンパク質と交差反応してアプトーシスを起こさないように選択され ねばならない。 Ｃ．リガンドアンタゴニスト モノマーリガンドは、すなわちオリゴマーの形成または維持を防御、阻害また は粉砕すると言ったような、マルチマーリガンドの効果を逆にするために用いる ことができる。この様に、細胞活性化の効果を急速に終結させようと所望するな らば、モノマーリガンドを用いることができる。都合良いことには、親リガント 部分は、多機能性化合物の代わりに単機能性化合物を用いることを除いて、同じ 方法で、マルチマーと同部位を修飾することができる。ポリアミンの代わりに、 エチルアミン、ヘキシルアミン、ベンジルアミン等と言ったようなモノアミン、 特に２から２０（より長くすることもできる）、通常２から１２の炭素原子から なる、を用いることができる。代わりに、親化合物が、甚だしく望ましくない生 理活性（例えば、免疫抑制、有糸分裂誘発、毒性等）を持たない場合には（また は投薬レベルでは）、単価の親化合物を用いることができる。 Ｄ． 補正的変異を含む変異体レセプターに結合しうる“突起部（ｂｕｍｐｓ） ”を持つヘテロ−オリゴマー化（ｈｅｔｅｒｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｉｎｇ） （ＨＥＤ）およびホモ−オリゴマー化（ｈｏｍｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｉｎｇ ）（ＨＯＤ）試薬の実例 上記のように、レセプターの結合ポケット内の側鎖残基と空間的に触れ合う試 薬上の置換基（”突起部”）の存在によってそれらの野生型のレセプター（例え ば、ＦＫＢＰ１２）と認めうるほどには結合出来ないであろう修飾ＨＥＤ／ＨＯ Ｄ試薬を調製することができる。また、干渉残基に変異を含み（“補正的変異” ）、それ故、突起部を持つリガンドを結合する能力を得た類似のレセプターを作 っても良い。“突起部”を持つリガンド部分および補正的変異を持つレセプター ドメインを用いると、本発明の試薬の特異性および有効性が高められるはずであ る。突起部を持つ試薬は、一方では、本来のリガンド部分を基本としたダイマー に対する“緩衝剤”として働くことの出来る、内在性の野生型レセプターと結合 しないはずである。さらに、新規のレセプター−リガンド対の形成は、ヘテロダ イマー化が必要なときに用いられるであろうＨＥＤ試薬を同時に生ずるはずであ る。例えば、制御されたベシクル融合は、ＨＥＤ試薬を用いてシンタキシン（ｓ ｙｎｔａｘｉｎ）（原形質膜融合タンパク質）およびシナプトブレビン（ｓｙｎ ａｐ ｔｏｂｒｅｖｉｎ）（ベシクル膜融合タンパク質）のヘテロダイマー化を誘導す ることによって達成されるであろう。これは、適当な修飾分泌細胞を用いる事に よって、単に研究用の道具を提供するだけでなく、糖尿病の遺伝子治療の基礎と しても供することができる。 “突起部のあるＦＫ１０１２ｓ”で示した方法に従って、ＦＫ５０６のＣ１０ アセトアミドおよびホルムアミド誘導体を調製した。図１６Ａならびに発見者ら の報告、Ｓｐｅｎｃｅｒら、“合成リガンドを伴うシグナル形質導入の制御（Ｃ ｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｌｉｇａｎｄｓ）”、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１０１９ −１０２４，１９９３、ＦＫ１０１２ｓＡ−ＣおよびＦＫ５０６Ｍの合成に関し てさらに詳細に記載した、を参照のこと。発見者らは、二種類の突起部を持つＦ Ｋ１０１２ｓ：一つはＣ１０に、もう一つはＣ９に突起部を持つ。ＦＫ５０６の Ｃ１０アセトアミドおよびホルムアミドのＲ−およびＳ−異性体は、図１６Ｂに 示した反応順序にしたがって合成した。これらの突起部を持つ誘導体は、ＦＫＢ Ｐ１２（図１６Ｂ）に対するそれらの結合親和性が少なくとも１０-3になった。 親和性は、ＦＫＢＰ１２のロタマーゼ活性を阻害する誘導体の能力を測定するこ とによって、定量した。 例に示したＣ９突起誘導体の第二級の構成員は、スピロ−エポキシド（図１６ Ｃに示す）であり、既知の方法を適応することによって調製した。例えば、Ｆｉ ｓｈｅｒら、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ，５６，８（１９９１）：２９００−７およ びＥｄｍｕｎｄｓら、Ｔｅｔ Ｌｅｔｔ，３２，４８（１９９１）：８１９−８ ２０を参照の事。特に興味ある一連のＣ９誘導体は、それらのｓｐ３ハイブリダ イゼーションおよびＣ９での酸化状態の減少によって特徴づけられる。幾つかの その様な化合物は、図１６Ｃに示した反応に従って合成された。 少なくともホモダイマーの汚染がヘテロダイマーの成功裡の使用に悪影響を及 ぼすような適用においては、ヘテロダイマー（およびその他のヘテロオリゴマー 化物）は、ホモダイマーとは別様に構築されなければならないことを正しく認識 すべきである。この問題を解決するために開発された一つの合成戦略の実例を図 １６Ｄに示す。過剰のトリエチルアミンを含む塩化メチレン中で、モノアロク保 護１，６−ヘキサンジアミン（Ｓｔａｈｌら、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ，４３，１ １（１９７８）：２２８５−６）をＦＫ５０６の誘導形とカップリングしたとこ ろ、アロク−アミン置換ＦＫ５０６を４４％の収率で得た。この中間体は、すぐ に、任意の活性化ＦＫ５０６（または突起ＦＫ５０６）分子とのカップリングに 用いることができる。ジメドン存在下、室温、ＴＨＦ中で、テトラキス−トリフ ェニルホスフィンパラジウムで脱保護すると、アミン保護基が除去される。すぐ に、活性化ＦＫ５０６誘導体で処理し、次いで脱シリル化するとダイマー生成物 が導かれる。この技術は、例として示したＨＯＤおよびＨＥＤ試薬を合成するた めに用いられた。 Ｅ． シクロスポリンを基本とする試薬の実例 シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、その細胞内レセプターシクロフィリン、１８ ｋＤａのモノマータンパク質、と高い親和性（６ｎＭ）で結合する環状のウンデ カペプチドである。ＦＫＢＰ１２−ＦＫ５０６複合体のように、得られた複合体 は、タンパク質ホスファターゼカルシネウリンと結合しこれを不活性化して、そ の結果、免疫抑制特性を持つ薬剤を生ずる。本発明のさらなる例として、そのＭ ｅＢｍｔ１側鎖を媒介としてＣｓＡを６段階、全体として３５％の収率で、ダイ マー化し、（ＣｓＡ）２を得た（図１７、段階１−４は、Ｅｂｅｒｌｅら、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ，５７，９（１９９２）：２６８９−９１に記載の通りに行っ た）。ＦＫ１０１２ｓを伴うので、ダイマー化の部位は、得られたダイマーが２ 分子のシクロフィリンと結合でき、カルシネウリンとは結合出来ず、次いでシク ロフィリン結合を作るように選択された。本発明者らは、（ＣｓＡ）２がシクロ フィリンＡと１：２の定比で結合することを示した。故に、ＦＫ１０１２ｓ様の （ＣｓＡ）２は、シグナル化経路を阻害せず、免疫抑制性でも毒性でもない。 ＶＩＩＩ． 標的遺伝子 Ａ． 転写開始領域 標的遺伝子構築物は、多分、上記のような転写開始シグナルの形成及び導入を 通して、リガンドが仲介するキメラレセプタータンパク質のオリゴマー化に応答 する応答エレメントを、５’領域に持つであろう。それ故、直接的あるいは間接 的のどちらかで細胞質ドメインによって活性化される、または２つのドメインの 連合によって活性化することの出来る、すくなくとも一つの転写開始システム、 例えば転写因子、を選択することが必要であろう。また、結果として得られた転 写開始システムに応答する少なくとも一つのプロモーター領域を選択することが 必要であろう。プロモーター領域またはその転写制御下の遺伝子のどちらかを選 択する必要がある。換言すれば、作用ドメインは、与えられたプロモーターまた は応答エレメントを通して転写を開始するその様な作用ドメインの役割を基礎に して、（一連の“第一”構築物によってコードされる）キメラタンパク質用に選 択することができる。例えば、上記のＶ（Ａ）“細胞質ドメイン”を参照のこと 。 応答エレメントは既知であるので、それを、標的遺伝子構築物の中に含め、（ エピソームに、または染色体に取り込まれる事によって）ゲノムへ組込むための 発現カセットを提供することができる。細胞質ドメインからなるタンパク質と結 合する未処理のリガンド上の細胞質ドメインによって転写活性化される遺伝子が 既知でありさえすれば、応答エレメントの個々の配列を分離する必要はない。次 いで、相同の組換えは、内在性のプロモーター領域の転写制御下にあるプロモー ター領域の下流に興味ある遺伝子を挿入するために用いることができた。特異的 な応答エレメントの配列が既知であるそれは、転写速度に関して言えば、高いま たは低い活性、特定の転写因子との結合およびそれに類似するものと言ったよう な、他の態様を持ちうる、異なる転写開始領域との結合に用いることができる。 それ故、発現構築物は、その５’末端に、転写方向で、応答エレメント、およ び興味ある標的遺伝子、通常は治療用遺伝子、の転写開始の誘導を可能にするプ ロモーター配列を持つであろう。転写終止領域は重要ではないが、生存期間を長 くする、またはｍＲＮＡの安定性を減少させ、それ故、タンパク質の作用期間を 制限するＡＵ配列の挿入によってｍＲＮＡの半減期を短くするために、用いるこ とができる。必要な転写の終止、および適当な翻訳の終止を提供する任意の領域 を用いることができる。 応答エレメントは、単一の配列であることができるが、通常約５回の繰り返し より多くない、通常約３回の繰り返しを持つように、オリゴマー化することもで きる。 また、相同性の組換えは、プロモーターおよび／または応答エレメント、この エレメントはオリゴマー化の発生および／またはその様な応答性転写制御配列を 所望の内在性遺伝子の上流に挿入することに応答する、を含む、内在性の転写制 御配列を除去または不活性化するために用いることができる。 Ｂ． 生成物 興味あるタンパク質または興味あるアンチセンス配列または興味あるリボゾー ムをコードする遺伝子を含む、広範囲の遺伝子を標的遺伝子として使用すること ができる。標的遺伝子は、所望の表現型を提供する興味ある任意配列であること ができる。標的遺伝子は、表面膜タンパク質、分泌タンパク質、細胞質タンパク 質を発現出来る、または、異なる型の生成物を発現することの出来る多数の標的 遺伝子であることも出来る。標的遺伝子は、転写制御タンパク質を阻害すること によって特定の経路を調節できる、または経路の阻害因子の翻訳を阻害すること によって特定の経路を始めさせることのできる、アンチセンス配列であっても良 い。標的遺伝子は、関連する転写調節因子の発現または特定経路の阻害因子の発 現をＲＮＡレベルで妨害することによって、特定経路を調節するであろうリボゾ ームをコードすることができる。発現させるタンパク質は、単独でも組み合わせ でも良く、帰巣本能、細胞毒性、増殖、免疫応答、炎症応答、血餅の血餅化ある いは溶解、ホルモン調節、またはそれに類似する物を含むことができる。発現さ せるタンパク質は、自然発生の、自然発生タンパク質の変異体、唯一の配列また はその組み合わせであることができる。 遺伝子は、細胞によって分泌される任意の遺伝子であることができ、それ故、 コードされた生成物は、宿主によって所望される時または必要とされるときは何 時でも、随意に作ることができる。様々な分泌生成物には、インスリン、ヒト成 長ホルモン、グルカゴン、脳下垂体放出因子、ＡＣＴＨ、メラノトロピン、レラ キシン等のようなホルモン；ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−α、−β、ＰＤＧＦ 、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、エリスロポイエチン、巨核 球 刺激、成長因子等の様な成長因子；ＩＬ−１から−１３のようなインターロイキ ン；ＴＮＦ−αおよび−β等、および組織プラスミノーゲン活性化因子、相補的 カスケードの構成因子、ペルホリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、スーパーオキシドジ ムスターゼ、凝固因子、抗トロンビンＩＩＩ、ＶＩＩＩｃ因子、ＶＩＩＩｖＷ因 子、α−抗トリプシン、プロテインＣ、プロテインＳ、エンドルフィン、ダイノ ルフィン、骨形態形成タンパク質、ＣＦＴＲ等の様な酵素が含まれる。 遺伝子は、本来表面膜タンパク質であるか、または適当なシグナルペプチドお よびトランスメンブラン配列を誘導することによってそれらを作る、任意の遺伝 子であることができる。様々なタンパク質は、ホーミングレセプター、例えばＬ −セレクチン（Ｍｅｌ−１４）、特別にクリングル構造を持つ血液関連タンパク 質、例えばＶＩＩＩｃ因子、ＶＩＩＩｖＷ因子、造血細胞マーカー、例えばＣＤ ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞レセプター、ＴＣＲサブユニットα、β、γ、δ、 ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１等、インターロ イキンレセプターＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ等の様なレセプター、イオン、例えば Ｈ+、Ｃａ+2、Ｋ+、Ｎａ+、Ｃｌ-等、の流入または流出のためのチャンネルタン パク質、およびその類似物；ＣＦＴＲ、チロシン活性化モチーフ、ゼータ活性化 タンパク質等、を含む。 タンパク質は、エキソサイトーシスのためベシクルに輸送する様に修飾されて も良い。ベシクルの方向を向かせるタンパク質の配列を加えることによって、そ こで配列は一つまたはもう一つの末端の中央に近いほうを修飾されるか、または タンパク質源に対して類似した位置を与えられるかして、修飾されたタンパク質 は、ベシクル中にパッケージングされたゴルジ装置の方向を向くであろう。エキ ソサイトーシスのためにキメラタンパク質の存在とも関連するこのプロセスは、 細胞外培地中へのタンパク質の急速な運搬を可能にし、比較的高い局所濃度を可 能にする。 また、細胞内タンパク質は、代謝経路、調節タンパク質、ステロイドレセプタ ー、転写因子等の様な、とくに宿主細胞の本来の姿による、興味あるものが存在 する。また、上記のタンパク質の幾つかは、細胞内タンパク質として役に立つ。 次に、異なる遺伝子の実例を少し示す。Ｔ細胞では、Ｔ細胞レセプターの一つ または両方の鎖をコートする遺伝子を採用することが願わしい。Ｂ細胞では、分 泌されるイムノブロブリンの重鎖および軽鎖を提供することができた。皮膚細胞 、例えばケラチン細胞、特にケラチン細胞の幹細胞、では、α−、β−、または γ−インターフェロン、抗走化性因子、細菌の細胞壁タンパク質に特異的なプロ テアーゼ等、を分泌することによって感染防御を提供することができた。 治療価値を持つ遺伝子の発現を提供することに加えて、細胞を特定の部位に向 かわせる事が望まれる多くの状況が存在するであろう。その部位は、リンパ節、 粘膜組織、皮膚、滑膜、肺あるいは他の内臓のような解剖学的部位、または血餅 、負傷部位、外科的操作部位、炎症、感染等の様な機能部位を含むことができる 。宿主の標的部位での自然発生エピトープとの結合を提供することによって特定 部位に宿主細胞を向かわせるであろう表面膜タンパク質の発現を提供することに よって、分泌生成物の局在濃度を達成することができる。興味あるタンパク質に は、ホーミングレセプター、例えばＬ−セクレチン、ＧＭＰ１４０，ＣＬＡＭ− １等、またはアドレシング（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ）、例えばＥＬＡＭ−１、Ｐ ＮＡｄ、ＬＮＡｄ等、血餅結合タンパク質、または走化性因子の局在勾配に応答 する細胞表面タンパク質が含まれる。治療用生成物の放出が大きな価値を持つと ころの、特定の部位へ細胞を向かわせることを願望する非常に多くの状況がある 。 多くの状況において、修飾細胞を殺傷できることが所望される場合もあり、例 えば、そこでは細胞での治療の終結が望まれ、そこでは細胞は所望しない例えば 新形成になり、またはそこでは細胞によって供された目的がすでに要求を果たし 、それらが引き続き存在することが望ましくない。本発明の修飾細胞は、Ｆａｓ 抗原またはＴＮＦレセプターの細胞内ドメイン（Ｗａｔａｎａｂｌｅ−Ｆｕｋｕ ｎａｇａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５６，３１４−３１７）のようなドメ インを含む主なキメラタンパク質を発現する能力を有し、アプトーシス、次いで 主なキメラをオリゴマー化する能力を持つリガンドへの細胞の提示によって容易 に除去される。主なキメラをコードする構築物は、従来の物質または方法を用い て組織的に発現するようにデザインされて良く、それ故、修飾細胞はその表面上 の、またはそれらの細胞質に存在する、その様なタンパク質を有する。代わりに 、同一のまたは異なるオリゴマー化リガンドが主なキメラの発現を開始し、アプ トー シスを開始することの出来る、制御された発現を提供することもできる。興味あ る標的遺伝子の発現に関連する結合領域とは異なる結合領域と結合した細胞質内 にＦａｓ抗原またはＴＮＦレセプターの細胞質部分を提供することによって、制 御条件下で修飾細胞を殺傷することも出来る。 Ｃ． 模範的実例 実例として、心臓病患者または発作になりやすい患者は以下のように治療され てよい。本発明に記載したような修飾細胞は、患者に投与され、長期間保持され るであろう。実例として示す細胞には、血漿細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはその 他の造血細胞が含まれる。細胞は修飾されて、例えばクリングル（ｋｒｉｎｇｌ ｅ）ドメイン構造または粘着性の相互作用タンパク質、例えばＣＤ４１を持つ、 血液血餅と結合するタンパク質を発現し、さらに、血餅溶解タンパク質、例えば 組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ等、を発現する。この様 に、リガンド仲介のオリゴマー化では、細胞は、血餅の部位に蓄積され、血栓崩 壊性タンパク質の高い局在濃度を提供する。 もう一つの実例は、外傷である。生存期間の限られた細胞、例えばマクロファ ージまたは多形核白血球（“好中球”）を用いることができた。細胞は、外傷の 部位に細胞を向かわせる好中球のホーミングレセプターを持つであろう。また、 細胞は、スーパーオキシドジスムターゼを発現し、一重項酸素を破壊して組織へ のラジカル攻撃を阻害するであろう。 第三の実例は、自己免疫病である。生存期間を延長した細胞、例えばＴ細胞を 用いることができる。構築物は、自己免疫性の外傷の部位に帰巣するためのホー ミングレセプターおよび外傷の原因である細胞への細胞毒性攻撃を提供する。次 いで、治療は、外傷の原因細胞に対して直接行われるであろう。代わりに、可溶 性レセプターまたは他のペプチドあるいはタンパク質の分泌を提供することもで き、分泌生成物は外傷原因細胞の活性化を阻害する、またはアネルギーを誘導す るであろう。もう一つの代替法は、変性効果を減少させることの出来る、抗炎症 生成物を分泌することであろう。 第四の実例は、カプセル化したエンドルフィンでの慢性の疼痛の治療を含む。 ヒト繊維芽細胞の貯蔵物は、キメラ転写制御タンパク質がヒトのエンドルフィン の転写を調節する構築物と共に、移入される。ＤＮＡ構築物は、ＴＡＴＡＡＡ部 位の上流のＨＮＦ−１転写因子のための結合部位ＧＴＴＡＡＧＴＴＡＡＣの３コ ピー、および転写開始部位からなる。エンドルフィンｃＤＮＡは、開始部位の下 流で、ポリアデニル化および終止配列の上流に挿入されるであろう。所望により 、エンドルフィンｃＤＮＡは、タンパク質を不安定にする“ＰＥＳＴ”配列、ま たはそれが迅速に破壊されることを可能にするｍＲＮＡの３’非翻訳領域のＡＵ ＵＡ配列と共に、供給される。 また、繊維芽細胞は二つの転写単位を持つ構築物と共に移入され、そのうちの 一つは、繊維芽細胞中で機能する開始および終止調節領域の転写および翻訳制御 下で、トリマーのＦＫＢＰ結合ドメインに結合するアミノ酸１から２５０のＤＮ Ａ結合配列を正しくコードする先端の切断されたＨＮＦ−１ｃＤＮＡをコードす るであろう。構築物は、トリマーのＦＫＢＰに結合したＨＮＦ−４から誘導され た転写活性化ドメインの生成を支配する同一の調節領域によって運転されるさら なる転写単位を含むであろう。（プライマーは、修飾されたＦＫ５０６とｎＭ濃 度で結合する改造されたＦＫＢＰであろう。修飾物は内在性のＦＫＢＰとの結合 を阻害する。） これらの遺伝的に修飾された細胞は、カプセル化されて免疫認識をなくし、患 者の皮膚下またはその他の都合の良い体内の部位に置かれるであろう。患者が痛 みの薬物療法を必要とする場合、患者はダイマー化されたリガンドＦＫ５０６− ＦＫ５０６’を投与され、その投与量は約１μｇから１ｍｇで十分である。この 様式では、注射または常用癖の危険なしに痛みを除去することができる。 第五の実例は、骨粗鬆症の治療である。リンパ球は、治療される患者から培養 中に、クローンに発達する、または皮膚繊維芽細胞に成長することができる。細 胞は上記の方法にしたがって移入され、そこで、骨形態形成因子ｃＤＮＡ遺伝子 はエンドルフィン遺伝子と置き換えられるであろう。リンパ球では、ｓＩｇのイ ディオタイプに対する抗体でそれらを破壊することの出来る抗原特異的クローン を用いることができる。さらに、ｓＩｇのための抗原の投与は、細胞の母集団を 拡大させ、配達することの出来るタンパク質の量を増加させるであろう。骨形態 形成因子の生成に必要であるので、リンパ球クローンが注入され、リガンドが投 与されるであろう。リガンドへの応答をモニターすることによって、生成される 骨形態形成因子の量を調整することができ、その結果、必要とされる投薬量のレ ベルを調整することができる。 その他の状況は、抗原特異的Ｔ細胞を修飾することであり、そこではタンパク 質生成の発現を活性化して細胞を活性化することができる。Ｔ細胞レセプターは 、腫瘍細胞、病原体、細胞仲介自己免疫、およびそれに類似する物を支配するこ とができる。細胞の活性化を提供することによって、例えば、ＩＬ−２のような インターロイキンは、リガンドに応答する修飾されたＴ細胞の発展を提供する。 修飾Ｔ細胞は、その他では、細胞毒性、標的細胞、例えば内皮細胞、の表面膜タ ンパク質のアップレギュレーション、またはその他の生物学的事象が所望される であろう特異的部位に、Ｔ細胞を向かわせるためのホーミングレセプターの発現 に用いられるであろう。 代わりに、標的部位への細胞毒性因子の高投与量の分配が必要であるかも知れ ない。例えば、ホーミングレセプターを通して腫瘍抗原を認識する上で、腫瘍浸 潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｒｅ ｓ）（ＴＩＬｓ）は、ＴＮＦまたはその他の同様の生成物を毒性濃度で分配し始 めるかもしれない。 もう一つの代替法は、エキソサイトーシスされるホルモンまたは因子を外に出 すことである。エキソサイトーシスの強化を提供することによって、より多量の ホルモンまたは因子を外に出し；さらに、細胞質内のホルモンまたは因子の量を 基本としたフィードバック機構が存在するならば、結果として、ホルモンまたは 因子の生成が増加するであろう。または、ホルモンまたは因子の発現が誘導され 、その結果、発現および外への排出が付随して誘導されてもよい。 また、体液中、例えば血管システム、リンパシステム、脳脊髄液等、に保持さ れているタンパク質を供給してもよい。宿主、例えば造血細胞、ケラチン細胞、 筋肉細胞等、特に、幹細胞、の生存期間を延ばせるように細胞を修飾することに よって、タンパク質を、長期間、液体中に維持することが可能になる。細胞は、 分泌またはエンドサイトーシスを提供する構築物で修飾されて良い。分泌のため の構築物は、トランスロケーションドメインとして、シグナルペプチドを、さら に、他のキメラタンパク質の場合には、結合ドメインおよび作用ドメインを持つ であろう。作用ドメインは、同じまたは異なるタンパク質から誘導されて良い。 例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子と共に、作用ドメインとして血餅結合 領域、および異なる作用ドメインとしてプラスミノーゲン活性部位を持つことが できる。代わりに、一つの作用ドメインとしてＬＦＡ−１および第二の作用ドメ インとして選択のような結合タンパク質を持つことによって、ホーミング妨害の 強化を提供することができた。タンパク質、例えばインテグリン、Ｔ細胞レセプ ター、ｓＩｇ、またはその類似物、のサブユニットを修飾することによって、共 に分子への結合をもたらすことの出来る表面膜タンパク質を可溶形にするするこ とができた。他の好適なものは、相補的タンパク質、血餅に含まれる血小板膜タ ンパク質、細胞表面上の自己抗原、および感染作因表面上の病原性分子である。 ＩＸ． 細胞中への構築物の導入 本明細書に記載した構築物は、一つあるいはそれより多くのＤＮＡ分子または 構築物として導入することができ、これは、少なくとも一つのマーカーからなり 、さらに構築物を含む宿主細胞を選択できるようにするための２つあるいはそれ より多くのマーカーからなってよい。構築物は従来の方法で調製されることがで き、ここでは、遺伝子および制御領域が分離され、適当に結合し、適当にクロー ン化宿主にクローン化され、制限酵素あるいは配列決定またはその他の従来の手 段によって分析されてよい。特に、ＰＣＲを用いて、機能単位の全てまたは部分 を含む個々のフラグメントを分離してもよく、ここでは、一つまたはそれより多 くの変異を”プライマー修復”、結合、インビトロでの突然変異誘発等を適当に 用いて導入しても良い。適当な配列を持つように一度完成され実証された構築物 は、その後に、任意の従来の手段によって宿主細胞に導入されて良い。構築物は 、細胞内に感染または形質導入するために、レトロウイルスベクターを含む、ア デノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、あるいは単純ヘルペスウイルス （ＨＳＶ）のような複製不能の欠陥ウイルスゲノムまたはその他の内に組込みパ ッケージングしてもよい。構築物は、所望するならば、移入のためのウイルスの 配列 を含んでも良い。代わりに、構築物は、融合、エレクトロポレーション、バイオ リスティクス、トランスフェクション、リポフェクション、またはそれに類似す る方法によって導入されて良い。宿主細胞は、構築物が導入される前に、通常、 培養液中で増殖膨脹し、次いで、構築物の導入および構築物の組込みのために適 当に処理されるであろう。次いで、細胞は膨脹し、構築物中に存在するマーカー の効力によってスクリーニングされるであろう。好結果の得られた用いてよい様 々なマーカーには、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ヒグロマ イシン耐性等が含まれる。 ある場合には、相同の組換えのための標的部位を持つ場合もあり、そこでは構 築物が特定の座に組み込まれることが望まれる。例えば、内在性遺伝子をノック アウトし、相同の組換えのためのこの技術分野で既知の物質および方法を用いた 構築物によって、コードした遺伝子と共に（同じ座または他の場所に）それを置 き換えることができる。代替法として、遺伝子を提供する代わりに、内在性の遺 伝子の転写開始領域を、シグナル開始ドメインに応答するように、修飾しても良 い。その様な実施態様では、ＥＰＯ、ｔＰＡ、ＳＯＤ、またはその類似物の様な 内在性遺伝子の転写は、リガンドの投与によって調節されるであろう。相同の組 換えのために、Ω−またはＯ−ベクターのどちらかが用いられて良い。例えば、 ＴｈｏｍａｓｅおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ（１９８７）５１，５０３− ５１２；Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６，３４８−３５２ ；およびＪｏｙｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８，１５３−１５６を 参照のこと。 構築物は、遺伝子のすべてをコードする単一のＤＮＡ分子、または一つあるい はそれより多くの遺伝子を持つ異なるＤＮＡ分子として導入されて良い。構築物 は、同時にまたは連続して、それぞれ同一のまたは異なるマーカーと共に、導入 されて良い。実例として、一つの構築物は、特異的な応答エレメント（例えば、 ＮＦＡＴ）の制御下で治療用遺伝子を含み、もう一つは、（例えばＭＺＦ３Ｅ内 の様な）リガンドルセプタードメインと融合したシグナル化領域からなるレセプ ター融合タンパク質をコードするであろう。ホーミングレセプターまたは治療用 生成物の分配効率を増大させる他の生成物をコードする第三のＤＮＡ分子もまた 、 導入されて良い。 細菌または酵母起源の複製、選択可能および／または増幅可能なマーカー、原 核生物または真核生物で発現されるためのプロモーター／エンハンサーエレメン ト等のような、有用なエレメントを含み、構築物ＤＮＡのストックを調製するた め、および移入を行うために用いられるであろうベクターは、この技術分野で熟 知されており、その多くは商品として入手できる。 Ｘ． 細胞およびリガンドの投与 ＤＮＡ構築物で修飾された細胞は、その後に、選択条件下で培地中で増殖させ 、構築物を有することで選択された細胞は、次ぎに、膨脹させ、例えば、宿主細 胞内の構築物の存在を決定するためのポリメラーゼ鎖反応を用いて、さらに分析 した。一度、修飾された宿主細胞が同定されたならば、次いで、それらは、例え ば培地中での増殖または宿主生物体への導入といったような計画に用いられて良 い。 細胞の形に従って、細胞は、宿主生物体、例えば哺乳類、の中に広範囲の方法 で導入されて良い。造血細胞は、血管システム内に、通常、少なくとも約１０4 細胞および一般的には約１０10より多くなく、より一般的には約１０8より多く ない細胞を、注射によって投与して良い。用いられる細胞数は、数多くの環境、 導入の目的、細胞の生存期間、用いられる処方箋、例えば、投与の数、細胞の繁 殖能力、治療薬の安定性、治療薬の生理学的必要性、およびそれに類似した物に 依存するであろう。代わりに、移植片として用いる場合もある皮膚細胞では、細 胞の数は、火傷またはその他の障害に適用する層の大きさに依存するであろう。 一般的には、筋芽細胞または繊維芽細胞では、細胞の数は、少なくとも約１０4 であり、約１０8より大きくなく、分散溶液として適用されて良く、一般的には 、興味のある部位にまたはその近くに注射される。細胞は、通常、生理学的に許 容しうる培地中にあるであろう。 エキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で細胞を修飾する代わりに、多くの状況下では 、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で細胞を修飾することが望まれるであろう。この 目的のために、インビボで標的組織および細胞を修飾するための様々な技術が開 発されてきた。宿主内へのウイルスの移入およびランダムな組込みを可能にする 、 アデノウイルスおよびレトロウイルスのような、数多くのウイルスベクターが開 発されてきた。例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，７５２９−７５３３；Ｋａｎｅｄａら（１ ９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３，３７５−３７８；Ｈｉｅｂｅｒｔら（１９ ８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，３５９４−３ ５９８；Ｈａｔｚｏｇｌｕら（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５， １７２８５−１７２９３；およびＦｅｒｒｙら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，８２７７−８３８１を参照のこと。ベク ターは、注射、例えば血管内あるいは筋肉内、吸入、または他の非経口の方法に よって、投与されて良い。 インビボでの遺伝子修飾に従って、修飾方法は、組織の形、必要とされる細胞 修飾の効率、特定の細胞を修飾する機会の数、導入されるＤＮＡ組成物と組織と の近付きやすさ、およびそれに類似した物、に依存するであろう。標的の転写開 始領域を運搬するレトロウイルスを弱毒化または修飾して用いることによって、 所望するならば、一つの従属転写因子構築物を用いてウイルスを活性化すること ができ、その結果、ウイルスが生産され、隣接細胞に移入されるであろう。 ＤＮＡ導入の結果、すべての場合に組込みを生ずることは、必要ではなくなる 。幾つかの状況下では、導入されたＤＮＡの維持は、一過性で充分な場合もある 。この場合には、細胞は宿主内に導入され、あらかじめ決められた時間の後、例 えば細胞が特定の部位に帰巣することができた後、その後、攻撃されて良い。 細胞質ドメインの活性化を提供するリガンドは、次いで、所望のように投与さ れて良い。リガンドの結合親和性、所望される応答、投与の方法、半減期、存在 する細胞数によって、様々な処方箋を用いて良い。リガンドは非経口または経口 で投与されて良い。投与の数は、上記の因子によるであろう。リガンドは、丸剤 、粉末、または懸濁液の様な経口；頬側；舌下；血管内、腹膜内、皮下への注射 ；吸入、またはその類似の方法で取り込まれて良い。リガンド（モノマー化合物 ）は、この技術分野で熟知されている従来の方法および物質を用いて、様々な投 与経路用に、調合されて良い。投与の正確な量および特定の方法は、上記の因子 に依存し、関係する医者、またはヒトあるいは動物の健康管理者によって決定さ れ るであろう。ほどんどの場合、投与の方法は、経験的に決定されるであろう。 リガンドによる活性化が可逆的である場合、モノマー化合物を投与して良く、 、またはリガンドと競合できるその他の単一の結合部位をもつ化合物でも良い。 この様に、可逆的反応の場合、または治療効果の終結を望む場合、モノマー結合 化合物は、任意の従来の方法で、特に、急速な可逆反応を所望する場合は血管内 に、投与することができる。代わりに、ＤＮＡ結合ドメインと共に、不活性化ド メイン（または転写サイレンサー（ｓｉｌｅｎｃｅｒ））を存在させても良い。 もう一つの方法として、細胞は、他でも記載したように、ＦａｓまたはＴＮＦレ セプターを通したシグナル化を経由するアポプトーシスを通して除去されて良い 。 任意の適用のためのリガンドの特別な投薬量は、治療投薬量のモニターに用い られる方法にしたがって、決められて良く、そこでは、特定の発現レベルの維持 は、長期間、例えば約二週間より長く、要求され、繰り返し治療では、個々のま たは繰り返しのリガンドの投薬は、短期間であり、間隔が長く、例えば二週間ま たはそれより長い。あらかじめ決めておいた範囲でリガンドの投薬がなされ、時 間−発現レベルの関係を得るために応答についてモニターされ、治療応答を観察 する。期間中観察されたレベルおよび治療応答によって、次回はより多いまたは より少ない量を投薬し、次いで応答を観察する。このプロセスは治療範囲での投 薬が得られるまで、何回も繰り返されるであろう。リガンドが慢性的に投与され る場合には、一度、リガンドの維持投与量を決定し、次いで、細胞システムが適 当な応答およびレベルの発現生成物を提供することが確実になるまで、間隔を延 ばしてアッセイした。 システムが、リガンドに対する細胞応答、発現効率、および、適当な、分泌の 程度、発現生成物の活性、時間および環境によって変わりうる患者の特別な必要 性、細胞および個々の細胞の発現活性の損失の結果としての細胞活性の損失速度 、およびそれに類似した物、の様な多くの変数に委ねられていることを正しく認 識すべきである。それ故、それそれの個人の患者では、全人口に投与することの 出来る一般的な細胞であっても、それぞれの患者は個人に関する適当な投与量を モニターされるであろうことが期待される。 主題の方法論および組成物は、広範囲の状況および徴候の治療のために用いら れて良い。例えば、ＢおよびＴ細胞は、癌、感染症、代謝欠損症、心臓血管病、 遺伝性凝固欠損症、自己免疫病、関節変性症、例えば関節炎、肺病、腎臓病、内 分泌異常、等の治療に用いられて良い。線維芽細胞および筋芽細胞の様な構造を 持つ様々な細胞は、結合組織欠損、関節炎、肝炎等の様な遺伝的欠損症の治療に 用いられて良い。多量のタンパク質が、欠損を補うために、または肝臓または門 静脈循環に治療生成物を配達するために作られねばならない場合に、肝細胞を用 いることができる。 以下の実施例は、例として提供されるものであって、限定の目的で提供されるも のではない。 実施例 細胞の形質転換および評価 実施例１：Ｔ細胞レセプターのＣＤ３鎖の架橋による、分離ＩＬ−２エンハンサ ー結合転写因子の誘導。 ヒトＩＬ−２プロモーター（−３２５から＋４７；ＭＣＢ（８６）６，３０４ ２）制御下の胎盤分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＸ Ｎｅｏ／ＩＬ２（ＩＬ２−ＳＸ）（図１）、およびレプーター遺伝子が様々なプ ロモーター要素（すなわち、それぞれＮＦＡＴ、ＮＫＢ、ＯＡＰ／Ｏｃｔ−１お よびＡＰ１）を含む合成オリゴマーと結合したＩＬ−２最小プロモーター（−３ ２５から−２９４および−７２から＋４７）の転写制御下にある関連プラスミド 変異体（すなわち、ＮＦＡＴ−ＳＸ、ＮＦＢ−ＳＸ、ＯＡＰ／Ｏｃｔ１−ＳＸ、 およびＡＰ−１−ＳＸ）は、三つの断片；１）ＳｓｐＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで 切断したｐＰＬ／ＳＥＡＰ（Ｂｅｒｇｅｒら、Ｇｅｎｅ（１９８８）６６）；２ ）ＮｄｅＩで切断し、クレノーでブラントエンドにし、次いでＰｖｕＩで切断し た、ｐＳＶ２／Ｎｅｏ（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ ｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８２）１，３３２）；および３）ＰｖｕＩおよびＨｉｎ ｄＩＩＩで切断した、様々なプロモーター含有プラスミド（即ち、ＮＦＡＴ−Ｃ Ｄ８、 Ｂ−ＣＤ８、ｃｘ１２１ａｃＺ−Ｏｃｔ−１、ＡＰ１−ＬＵＣＩＦ３Ｈ、または ｃｘ１５ＩＬ２）（以下に記載）；の結合によって作成された。ＮＦＡＴ−ＣＤ ８はＮＦＡＴ結合部位（−２８６から−２５７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． （１９９０）４，１８２３）を３コピー含み、ｃｘ１２１ａｃＺ−Ｏｃｔはヒト ＩＬ−２エンハンサーからのＯＡＰ／Ｏｃｔ−１／（ＡＲＲＥ−１）結合部位（ ＭＣＢ（１９８８）８，１７１５）を４コピー含み；Ｂ−ＣＤ８はマウス軽鎖（ ＥＭＢＯ（１９９０）９，４４２５）からのＮＦＢ結合部位を３コピー含み、Ａ Ｐ１−ＬＵＣＩＦ３ＨはメタロチオネインプロモーターからのＡＰ−１部位（５ '-ＴＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣ−３’）を５コピー含む。 それぞれの移入では、キメラレセプターＴＡＣ／ＴＡＣ／Ｚ（ＴＴＺ）（ＰＮ ＡＳ，８８，８９０５−８９０９）をコードする５μｇの発現ベクター、ｐＣＤ Ｌ−ＳＲ（ＭＣＢ８，４６６−７２）（Ｔａｃ−ＩＬ２レセプター鎖）が、様々 な分泌型アルカリホスファターゼを基本としたレポータープラスミド（図１、ｐ ＳＸＮｅｏ／ＩＬ２の地図を参照の事）と共に、ＴＡｇＪｕｒｋａｔ細胞（ＳＶ ４０大Ｔ抗原と共に安定に移入されたヒトＴ細胞白血病系Ｊｕｒｋａｔの誘導体 （Ｎｏｒｔｈｕｐら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３））内に、共移入さ れた。それぞれのレポータープラスミドは、最小ＩＬ−２プロモーターまたは代 わりとしてレポーター遺伝子の上流にある完全なＩＬ−２エンハンサー／プロモ ーターに関連するが、別個のＩＬ−２エンハンサー結合転写因子のための結合部 位のマルチマー化オリゴヌクレオチドを含む。２４時間後、細胞のアリコート（ おおよそ１０5）は、結合した抗ＴＡＣ（ＣＤ２５）ｍＡｂ（３３Ｂ３．１；Ａ ＭＡＣ，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）の対数希釈物を含むミクロタイターの穴の 中に置いた。正の対照として、および移入効率を調節するために、イオノマイシ ン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれの移入物からのアリコ ートに加えた。さらに１４時間インキュベーションの後、上澄液をアルカリホス ファターゼ活性についてアッセイし、その結果、これらの活性は正の対照サンプ ルのそれとの比例で表した。１ｎｇ／ｍｌのＦＫ５０６を添加するとＮＦＡＴに よる活性がすべてバックグラウンドレベルにまで落ちたことは、脱活性化がＦＫ ５０６によってブロックされたそれと同じ経路内にあることを示している。得 られたそれぞれのデータ点は２サンプルの平均であり、実験は、同じ様な結果が 得られるように数回行なった。図５を参照の事。データは、既知の細胞外レセプ ターと共に、レポーター遺伝子および異なるエンハンサーでも適当な応答が得ら れることを示している。同様の結果は、ＴｃＲ複合体に対するＭＡｂ（即ちＯＫ Ｔ３）を用いた場合にも得られた。 実施例２：免疫抑制薬ＦＫ５０６およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはダイ マー誘導体化合物ＦＫ１０１２Ａ（８）、ＦＫ１０１２Ｂ（５）およびＣｓＡダ イマー（ＰＢ−１−２１８）の阻害活性 イオノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を１０5 ＴＡｇ− Ｊｕｒｋａｔ細胞に加えた。さらに、様々な薬剤を滴定で加えた。５時間後、細 胞を穏やかな洗浄剤（即ち、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に溶解し、抽出液はβ− ガラクトシダーゼ基質、ＭＵＧ（ｍｅｔｈｙｌ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｙｌ ｕ ｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎ）（メチルガラクトシジルウンベルリフェロン）と共に 、１時間インキュベーションした。グリシン／ＥＤＴＡ停止緩衝液を加え、抽出 液を蛍光アッセイした。得られたそれぞれのデータ点は２サンプルの平均値であ り、実験は同様の結果が得られるように数回行なった。奇妙なことに、ＦＫ１０ １２Ｂは、最も高い濃度（即ち５μｇ／ｍｌ）で僅かにマイトジェン活性の増加 を示すが；対照実験では、ＦＫ１０１２Ｂはそれ自身によっては刺激されないこ とが示された。図６参照の事。 実施例３：キメラＦＫＢＰ１２／ＣＤ３（１ＦＫ３）レセプター上のダイマーＦ Ｋ５０６誘導体，ＦＫ１０１２Ａの活性。 ５μｇの真核生物の発現ベクター、ｐＢＪ５、（１６Ｓスプライス部位とポリ Ａ部位の間に挿入されたポリリンカーを持つｐＣＤＬ−ＳＲを基本にしており） 、キメラレセプター（１ＦＫ３）を含む、は４μｇのＮＦＡＴ−誘導の分泌型ア ルカリホスファターゼレポータープラスミド、ＮＦＡＴ−ＳＸと共に移入された 。対照として、１ＦＫ３／ｐＢＪ５の代わりに、５μｇのｐＢＪ５を平行移入に 用いた。２４時間後、おおよそ１０5細胞を含むそれぞれの移入物のアリコート を、 指示薬としてのＦＫ１０１２Ａの対数希釈物と共にインキュベーションした。正 の対照としておよび移入効率を制御するため、イオノマイシン（１μｍ）および ＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれの移入物からのアリコートに加えた。さら に１４時間インキュベーションした後、上澄液をアルカリホスファターゼ活性に ついてアッセイし、これらの活性を正の対照サンプルのそれとの比例で表した。 ２ｎｇ／ｍｌのＦＫ５０６を添加するとすべての刺激がバックグラウンドレベル に低下することは、活性化がＦＫ５０６によってブロックされたそれと同一の経 路内にあることを示している。それ故、ＦＫ５０６またはシクロスポリンは、こ れらの化合物を用いる場合の有効な解毒剤として役に立つであろう。それぞれの データ点は、２サンンプルの平均であり、実験は同様の結果が得られるように数 回行なった。図７を参照のこと。 実施例４Ａ．ミリストイル化キメラＣＤ３／ＦＫＢＰ１２（ＭＺＦ３Ｅ）レセプ ター上の、ダイマーＦＫ５０６誘導体、ＦＫ１０１２Ｂ、の活性 本発明者らは、正の結果としてのＦＫ５０６を基礎としたＨＯＤ試薬“ＦＫ１ ０１２ｓ”を含む、リガンドのデザインおよび合成への数多くの研究方法を示す ことに成功した。本発明者らは、ＦＫ１０１２ｓが高い親和性、２：１結合化学 量論（Ｋｄ（１）＝０．１ｎＭ；Ｋｄ（２）＝０．８ｎＭ）、を達成し、カルシ ネウリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）仲介のＴＣＲシグナル化を阻害しないこと を見出だした。リガンドは、“免疫抑制”でも毒性（細胞培養液中，最大で０． １ｍＭ）でもない。同様に、ＣｓＡレセプター：シクロフィリンを１：２の化学 量論で結合しているがカルシネウリンとは結合していない、シクロスポリンＡを 基礎としたホモジダイマー化試薬“（ＣｓＡ）２”を調製した。この様に、ＦＫ １０１２ｓに類似の、（ＣｓＡ）２は経路のシグナル化を阻害せず、それ故、免 疫抑制性でもなく毒性も持たない。 リガンド仲介のタンパク質を組み合わせたこれらおよびその他の実施例は、結 果として、シグナル形質導入経路を制御した。実例では、このことは、翻訳後の ミリストイル化（Ｍ）、細胞質のゼータ（Ｚ；Ｂ細胞レセプターの成分がまた用 いられた）尾、３つの連続的なＦＫＢＰ１２ｓ（Ｆ３）およびインフルエンザの エピトープ標識（Ｅ）に十分なＳｒｃ小フラグメントからなる細胞内レセプター を作り出すことによって成し遂げられた。ヒト（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞内の構築 物ＭＺＦ３Ｅ（図１８）の発現によって、コードしたキメラタンパク質がＦＫ１ ０１２仲介のオリゴマー化を受ける事を確認した。それに伴って凝集したゼータ 鎖は、ＦＫ１０１２（ＥＣ50＝５０ｎＭ）に応答するアルカリホスファターゼの 分泌（ＳＥＡＰ）によって証明されるように、内在性ＴＣＲシグナル化経路（図 １５）を経てシグナル化される。ＳＥＡＰレポーター遺伝子プロモーターは、構 築され、活性化Ｔ細胞核因子（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉ ｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）（ＮＦＡＴ）、これは核内で組み立てられその後 ＴＣＲ−シグナル化される、によって転写活性化された。ＦＫ１０１２誘導シグ ナル化は、ＦＫ５０６−Ｍと呼ばれる毒性を持たないモノマー形リガンドによっ て誘導される脱凝集過程によって終結させる事が出来る。 具体的には、ミリストイル化キメラレセプターを含む５μｇの真核生物発現ベ クターｐＢＪ５は、４μｇのＮＦＡＴ−ＳＸと共に移入された。ＭＺＥ、ＭＺＦ １Ｅ、ＭＺＦ２ＥおよびＭＺＦ３Ｅは、ミリストイル化されたＣＤ３細胞質ドメ インの下流にそれぞれ、０、１、２、または３コピーのＦＫＢＰ１２を含む（図 ２を参照の事）。対照として、５μｇのｐＢＪ５を、平行移入に用いた。２４時 間後、おおよそ１０5細胞を含むそれぞれの移入物のアリコートを、指示薬とし てのＦＫ１０１２Ｂ薬剤の対数希釈物と共に、インキュベーションした。正の対 照としておよび移入効率を制御するために、イオノマイシン（１μＭ）およびＰ ＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を、それぞれの移入物のアリコートに加えた。さらに１ ２時間インキュベーションした後、上澄液をアルカリホスファターゼ活性につい てアッセイし、これらの活性を正の対照サンプルのそれとの比例で表した。１ｎ ｇ／ｍｌのＦＫ５０６を添加するとすべての状況がバックグラウンドレベルに近 くなるまで低下することは、活性化がＦＫ５０６によってブロックされるそれと 同じ経路内にあることを、示している。この結果は、さらに、患者の細胞活性化 の可逆性の証明となる。得られたそれぞれのデータ点は、２サンプルの平均であ り、実験は同じ結果が得られるように数回行なった。図８を参照のこと。ミリス トイル化誘導体は、約１０-1のより低濃度のリガンドに応答し、比較できる程度 にＮＦＡＴ依存性転写を活性化するが、リガンドが異なることに注意しなければ ならない。図７および８を比較のこと。 インビボＦＫ１０１２誘導タンパク質のダイマー化 次に、ＭＺＦ３Ｅレセプターの細胞内凝集が本当にＦＫ１０１２によって誘導 されることを確認しようとした。ＭＺＦ３Ｅ−構築物のインフルエンザ赤血球凝 集素エピトープ標識（ｆｌｕ）は、それ故、異なるエピトープ標識（ｆｌａｇ− Ｍ２）と交換した。密接な関係にあるキメラ、ＭＺＦ３ＥfluおよびＭＺＦ３Ｅf lag、はＪｕｒｋａｔＴ細胞内で共に発現した。アガロースビースに結合した抗 −Ｆｌａｇ−抗体を用いた免疫沈降実験は、細胞をＦＫ１０１２Ａで処理した後 に、行なった。ＦＫ１０１２Ａ（１μＭ）存在下、タンパク質キメラＭＺＦ３Ｅ flagはＭＺＦ３Ｅfluと反応し、ＭＺＭ３Ｅflagと共に免疫沈降した。ＦＫ１０ １２Ａ非存在下では、ＭＺＦ３Ｅfluの共免疫沈降は認められない。ＦＫＢＰモ ノマー構築物ＭＺＦ１ＥfluおよびＭＺＦ１Ｅflag、シグナルとしては働かない 、との関連実験は、それらもまたＦＫ１０１２Ａによってダイマー化されること を示した。このことは、凝集の必要条件が内在性Ｔ細胞レセプターと本発明者ら による人口のレセプターＭＺＦ３Ｅの両方で認められたことを表している。 ＦＫ１０１２誘導のタンパク質−チロシンのリン酸化 ＴＣＲ、ＣＤ３およびゼータ鎖の細胞内ドメインは、細胞質タンパク質チロシ ンキナーゼと反応し、次いで、抗原を刺激する。Ｓｒｃファミリー（ｌｃｋおよ び／またはｆｙｎ）の特定の構成員は、活性化モチーフの一つまたはそれより多 くのチロシン残基を、これらの細胞内ドメイン（チロシン活性化モチーフ、ｔｙ ｒｏｓｉｎｅ ａｃｔｉｂａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＴＡＭ）内で、リン酸化す る。チロシンキナーゼＺＡＰ−７０は（その２つのＳＨ２ドメインを経て）チロ シンリン酸化Ｔ細胞レセプターに補充され、活性化され、さらに下流のホスホリ パーゼＣの活性化に含まれると思われる。ＭＺＦ３Ｅと共に安定に移入されたＪ ｕｒｋａｔ細胞へ抗ＣＤ３ ＭＡｂかまたはＦＫ１０１２Ａのどちらかを加える と、インビトロでのキナーゼアッセイによる測定では、結果として、ゼータ鎖へ キナーゼ活性を補充し、次に、内在性Ｔ細胞レセプターゼータ鎖およびＭＺＦ３ Ｅ構築物をそれぞれ免疫沈降した。抗ＣＤ３ ＭＡｂまたはＦＫ１０１２のどち らかで細胞を処理した後のチロシンリン酸化は、モノクローナルαホスホチロシ ン抗体を用いて検出した。全細胞溶解物は、刺激後、時間を変化させて分析した 。チロシン−リン酸化タンパク質の同様のパターンは、抗ＣＤ３ ＭＡｂかまた はＦＫ１０１２のどちらかで刺激した後に、認められた。パターンは、７０ｋＤ ａの主バンド、多分ＺＡＰ−７０、および１２０ｋＤａ、６２ｋＤａ、５５ｋＤ ａ、および４２ｋＤａの副バンドからなっていた。 実施例４（Ｂ）：イムノフィリン−Ｆａｓ抗原キメラでのプログラム化された細 胞死の調節 Ｆａｓ抗原は細胞表面レセプターの神経成長因子（ＮＧＦ）／腫瘍壊死因子（ ＴＮＦ）レセプタースーパーファミリーの一構成員である。Ｆａｓ抗原と、その 細胞外ドメインに対する抗体との架橋は、ほとんど理解されていないシグナル伝 達経路を活性化し、このことがプログラム化された細胞死すなわちアポトーシス をもたらす。Ｆａｓ抗原およびそれが会合するアポトーシス性シグナル伝達経路 は恐らく全ての腫瘍細胞を含む大半の細胞中に存在する。この経路は、凝集した 細胞質、炎症性応答の不在、およびヌクレオソームＤＮＡの分断化を特徴とする 迅速かつ独特な細胞死（２時間）を誘導し、これらの特徴の内のいずれのものも 壊死的細胞死においては観察されない。 我々は更に、アポトーシス的細胞死を誘導する第二の誘導性シグナル伝達系を 開発した。ＭＺＦ３Ｅ経路同様にこの経路も、構成的に発現される「応答性個体 」遺伝子の産物である人工レセプターを活性化させることにより開始される。し かしながら我々のＨＯＤ試薬は形質転換化誘導性（例えばレポーター）遺伝子の 産物よりはむしろ内因性経路の産物の合成を誘導するという点で、この新規の経 路は最初のものとは異なる。 Ｆａｓ経路に関する制御を獲得することは生物学的研究および医療薬ついての 重大な機会を意味する。細胞特異的プロモーターの制御下にある「死」応答性個 体遺伝子を有する形質転換動物を設計することが可能である。その後にＨＯＧ試 薬をその動物に投与することによりその成体動物中で標的細胞を化学的に除去す ることができる。このようにして記憶もしくは認識における特異的脳細胞、ある いは自己免疫性疾患の誘導および管理における免疫細胞の役割を評定することが できる。死応答性個体遺伝子は、Ｍ．Ｂｌａｅｓｅおよび共同研究者（Ｃｕｌｖ ｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６ ５０６３（１９９２）：１５５ ０−２）により開発されたヒト遺伝子療法技術を用いて腫瘍内へと組み込ませ、 その後にそれに次いでＨＯＤ試薬でその患者を治療することにより活性化させる こともできる（脳腫瘍の治療について最近報告された「ガンシクロビル（ｇａｎ ｃｙｃｌｏｖｉｒ）」遺伝子療法の臨床試験に類似する様式で）。最終的に我々 は遺伝子療法の実施の際の、治療用遺伝子と一緒の死応答性個体遺伝子の同時投 与を企画している。これは遺伝子療法への「絶対安全な」構成成分を提供するで あろう。何らかの不都合が生じたとしても（一般的に論議される問題は、癌を誘 導する腫瘍抑制性遺伝子の組込み誘導性喪失である）、この遺伝子療法患者は全 ての形質転換化細胞を死滅させるであろう「絶対安全」用ピル剤を服用すること ができる。従って我々はこのような目的のためのオルトゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏ ｎａｌ）オリゴマー化剤の系を設計した。従って我々は宿主細胞内のアポトーシ スを制御するための一連のリガンドおよびキメラ応答性個体蛋白質、ならびに治 療用遺伝子の転写を制御するための他の一連のものを提供する。治療用遺伝子も しくは所望の遺伝子の転写を調節するのに用いられるリガンドは、交差反応を行 いそしてアポトーシスを開始させることのないように設計（もしくは選択）する 。 Ｆａｓ抗原の細胞質性シグナル伝達ドメインに融合される３つのＦＫＢＰ１２ ドメインからなる一例としてのキメラｃＤＮＡを構築した（図１９）。ヒトＪｕ ｒｋａｔおよびマウスＤ１０ Ｔ細胞内で発現される際には、この構築物はＦＫ １０１２試薬により誘導化されて二量化を行い、かつシグナル伝達カスケードを 開始させることが可能であり、このことがＦＫ１０１２−依存的アポトーシスを もたらす。ＭＦＦ３Ｅで一時的に形質転換させた細胞のＦＫ１０１２Ａ−媒介性 の死についてのＬＤ₅₀は、レポーター遺伝子活性の喪失により決定すると１５ｎ Ｍとなる（図１９、アッセイの論述については図２０の説明文を参照せよ）。こ れらのデータは安定に形質転換させた細胞株における細胞死の測定値と一致する 。 安定な形質転換体は均一な細胞集団を意味するため、これらを用いて、死が壊死 よりはむしろアポトーシスに起因することを確認した（膜の水泡形成、ヌクレオ ソームＤＮＡの分断化）。しかしながら一時的形質転換プロトコールはより簡便 であり、そしてそのためこれを以下に記載される最初のアッセイ系として用いた 。 実施例４（Ｃ）：シクロフィリン−Ｆａｓ抗原キメラでのプログラム化された細 胞死の調節 我々は更に一連のシクロフィリンＣ−Ｆａｓ抗原構築物を調製し、そして一過 性発現アッセイにおいて（ＣｓＡ）２−依存的アポトーシスを誘導するそれらの 能力をアッセイした（図２０Ａ）。その上、（ＣｓＡ）２−依存的アポトーシス はその一連の構築物の内で最も活性の高いものであるＭＣ３ＦＥ（Ｍ＝Ｓｒｃの ミリストイル化ドメインであり、Ｃ＝シクロフィリンドメインであり、Ｆ＝Ｆａ ｓの細胞質テイルであり、Ｅ＝ｆｌｕエピトープ標識である）で安定にトランス フェクトされたヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に関して示した。１、２、３、もしく は４つの連続的シクロフィリンドメインの前もしくは後のいずれかにＦａｓの細 胞質テイルを融合させた。Ｆａｓドメインを欠く２つの制御用構築物も調製した 。この場合には我々は、シグナル伝達ドメインは二量化ドメインの後に設置した 場合にのみ機能するという所見を得た。（ゼータ鎖は二量化ドメインの前もしく は後のいずれかに設置する場合にシグナルを構築する）。ウエスタンブロットに より確認される８つのシグナル伝達構築物の発現レベルとそれらの活性との両方 は定量的に異なっていた（図２０Ｂ）。至適な系はＭＣ３ＦＥであることがこれ までに判明している。ＭＣ３ＦＥでの（ＣｓＡ）２−媒介性細胞死についてのＬ Ｄ₅₀は約２００ｎＭである。これらのデータは細胞内蛋白質会合を調節するため のシクロフィリン−シクロスポリン相互作用の利用性を示し、そしてＦＫＢＰ１ ２−ＦＫ１０１２系と交差反応しないであろうオルトゴナル試薬系を説明する。 更にこの場合、このデータは、凝集ではなく二量化のみがＦａｓ細胞質テイルに よるシグナル伝達の開始に必要であることを示す。 ミリストイル化シグナルのＮ−末端グリシンのアラニンへの突然変異はミリス トイル化を妨げ、そしてそのため膜局在化を妨げる。我々は更に、突然変異化構 築物（△ＭＦＦ３Ｅ）がＦＫ１０１２−依存的アポトーシスの誘導因子として同 様の効力を示すという所見を得ており、このことは膜局在化がＦａｓ−媒介性細 胞死にとって必須ではないことを示す。 実施例５． マウスシグナル伝達用キメラ蛋白質の構築 図４に記載されるプライマーを用いて様々な断片を取得した。プライマー番号 を参照にする際には図４を参照すべきである。 マウスのクラスＩＩ ＭＨＣレセプターのＩ−Ｅ鎖を含む約１．２ｋｂのｃＤ ＮＡ断片（Ｃｅｌｌ、３２、７４５）をシグナルペプチドの源として用い、Ｐ♯ ６０４８およびＰ♯６０４９を利用し、供給元（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により記載 される要領でＰＣＲを使用して７０ｋｂのＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した 。第二断片は、ＣＤ３の貫膜および細胞質ドメインに連結させたＴａｃ（ＩＬ２ レセプター鎖）を含むプラスミドを用いて取得した（ＰＮＡＳ、８８、８９０５ ）。Ｐ♯６０５０およびＰ♯６０５１を用いるＰＣＲにより、ＣＤ３の貫膜およ び細胞質ドメインを含む３２０ｂｐのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片を取得した。こ れら２つの断片を連結させ、そしてＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ消化させたｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内に挿入してプラスミドＳＰＺ／Ｋ Ｓを生じた。 ＦＫ５０６のための結合性ドメインを取得するために、プラスミドｒｈＦＫＢ Ｐ（Ｓ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６、６７４、によ り提供される）をＰ♯６０５２およびＰ♯６０５３と共に用いて、ヒトＦＫＢＰ １２を含む３４０ｂｐのＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。この断片をＸｈｏ Ｉ−ＳａｌＩで消化させたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内に挿入してプラスミドＦＫ １２／ＫＳを生じ、これをＦＫＢＰ１２結合性ドメインのための源とした。ＳＰ Ｚ／ＫＳをＸｈｏＩで消化し、ホスファターゼ処理を施して（細胞の腸アルカリ 性ホスファターゼ；ＣＩＰ）自己アニーリングを妨げ、そしてＦＫ１２／ＫＳか らの１０倍モル過剰のＸｈｏＩ−ＳａｌＩ ＦＫＢＰ１２−含有性断片と合わせ た。正しい向きに単量体、二量体、および三量体のＦＫＢＰ１２を含むクローン を単離した。クローン１ＦＫ１／ＫＳ、１ＦＫ２／ＫＳ、および１ＦＫ３／Ｋ Ｓは転写の向きに、マウスＭＨＣクラスＩＩ遺伝子Ｉ−Ｅからのシグナルペプチ ド、各々単量体、二量体、もしくは三量体のヒトＦＫＢＰ１２、およびＣＤ３の 貫膜および細胞質部分でできている。最後にＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を制限 酵素を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから切り出し、そしてＳａｃＩＩおよびＥ ｃｏ ＲＩで消化させたｐＢＪ５のポリリンカー内に連結して、各々プラスミド１ ＦＫ１／ｐＢＪ５、１ＦＫ２／ｐＢＪ５、および１ＦＫ３／ｐＢＪ５を作成した 。図３および図４を参照せよ。 実施例６ Ａ． 細胞内シグナル伝達用キメラの構築 ｃ−ｓｒｃからのミリストイル化配列をＰｅｌｌｍａｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａ ｔｕｒｅ ３１４、３７４、から取得し、そしてＣＤ３の相補的配列に連結させ て、貫膜ドメインの３’側配列に相補的なプライマー、すなわちＰ♯８９０８を 生じた。このプライマーは５’末端の近傍にＳａｃＩＩ部位を、かつミリストイ ル化配列の３’末端の近傍にＸｈｏＩ配列を有する。他のプライマーＰ♯８４６ ２はＣＤ３の３’末端に相補的な配列の３’側ＳａｌＩ認識部位、停止コドン、 およびＥｃｏＲＩ認識部位を有する。ＰＣＲを用いて４５０ｂｐのＳａｃＩＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片を取得したが、これは５’−３’方向に融合されるミリストイル 化配列およびＣＤ３配列からできていた。この断片をＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩ− 消化させたｐＢＪ５（ＸｈｏＩ）（ＳａｌＩ）内に連結させ、そしてクローン化 してプラスミドＭＺ／ｐＢＪ５をもたらした。最後にＭＺ／ｐＢＪ５をＳａｌＩ で消化し、ホスファターゼ処理を施し、そしてＦＫ１２／ＫＳからの１０倍モル 過剰のＸｈｏＩ−ＳａｌＩ ＦＫＢＰ１２−含有性断片と合わせ、そして連結し た。クローニング後に、ミリストイル化配列、ＣＤ３、およびＦＫＢＰ１２多量 体を５’−３’の向きに有する所望の構築物を含むプラスミドを単離し、そして 正しい構造を有することを確認した。図２および４を参照せよ。 Ｂ． 細胞内シグナル伝達用キメラのための発現カセットの構築 構築物ＭＺ／ｐＢＪ５（ＭＺＥ／ｐＢＪ５）を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｌ Ｉで消化し、ＴＣＲ ζ断片を除去し、そして得られるベクターをＦＫＢＰ１２ の１０倍過剰の単量体、二量体、三量体、もしくは高次多量体と連結させてＭＦ ＩＥ、ＭＦ２Ｅ、ＭＦ３Ｅ、もしくはＭＦｎＥ／ｐＢＪ５を作成した。適合性フ ランク制限部位（すなわちＸｈｏＩおよびＳａｌＩ）を含むように設計した活性 ドメインをその後にこのＭＦｎＥ／ｐＢＪ５の非反復ＸｈｏＩもしくはＳａｌＩ 制限部位内にクローン化することができる。 実施例７． 核キメラの構築 Ａ． ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合性ドメイン−ＦＫＢＰドメイン（一つもしくは複 数）−エピトープ標識。ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合性ドメイン（アミノ酸１〜１４７ ）を、Ｋｏｚａｋ配列上流のＳａｌＩ部位および翻訳開始部位を含む５’プライ マー（♯３７）、ならびにＳａｌＩ部位を含む３’プライマー（＃３８）を用い るＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物を単離し、ＳａｃＩＩおよびＳａｌＩ で消化し、そしてそのＳａｃＩＩおよびＳａｌＩ部位でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）内に連結して構築物ｐＢＳ−ＧＡＬ４を作成した。この構築物 を配列決定により確認した。ｐＢＳ−ＧＡＬ４からのＳａｃＩＩ／ＳａｌＩ断片 を単離し、そしてＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位でＩＦＫ１／ｐＢＪ５およびＩ ＦＫ３／ｐＢＪ５構築物（ミリストイル化配列を含む。実施例６を参照せよ）内 に連結して構築物ＧＦ１Ｅ、ＧＦ２Ｅ、およびＧＦ３Ｅを作成した。 ＰＣＲ増幅化産物の５’末端： ＰＣＲ増幅化産物の３’末端： Ｂ． ＫＮＦ１二量化／ＤＮＡ結合性ドメイン−ＦＫＢＰドメイン（一つもし くは複数）−標識。ＨＮＦ１ａ二量化／ＤＮＡ結合性ドメイン（アミノ酸１〜２ ８２）を、Ｋｏｚａｋ配列上流のＳａｃＩＩ部位および翻訳開始部位を含む５’ プライマー（♯３９）、ならびにＳａｌＩ部位を含む３’プライマー（♯４０） を用いるＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物を単離し、ＳａｃＩＩおよびＳ ａｌ Ｉで消化し、そしてそのＳａｃＩＩおよびＳａｌＩ部位でｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）内に連結して構築物ｐＢＳ−ＨＮＦを作成した。この 構築物を配列決定により確認した。ｐＢＳ−ＨＮＦからのＳａｃＩＩ／ＳａｌＩ 断片を単離し、そしてＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位でＩＦＫ１／ｐＢＪ５およ びＩＦＫ３／ｐＢＪ５構築物内に連結して構築物ＨＦ１Ｅ、ＨＦ２Ｅ、およびＨ Ｆ３Ｅを作成した。 ＰＣＲ増幅化産物の５’末端： ＰＣＲ増幅化産物の３’末端： Ｃ． ＦＫＢＰドメイン（一つもしくは複数）−ＶＰ１６転写活性化ドメイン （一つもしくは複数）−エピトープ標識。 これらの構築物は以下の３段階で作成した。（ｉ）ＸｈｏＩ部位のすぐ上流で ミリストイル化配列が開始部位により置換されている構築物を作成して構築物Ｓ Ｆ３Ｅを作成し、（ｉｉ）核局在化配列をそのＸｈｏＩ部位内に挿入して構築物 ＮＦ３Ｅを作成し、（ｉｉｉ）ＶＰ１６活性化ドメインをＮＦ３ＥのＳａｌＩ部 位内にクローン化して構築物ＮＦ３Ｖ１Ｅを作成した。 （ｉ）． ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩにより両脇を挟まれるＫｏｚａｋ配列お よび開始部位をコードする相補的オリコヌクレオチド（♯４５および♯４６）を アニールし、ホスファターゼ処理を施し、そしてＭＦ３ＥのＳａｃＩＩおよびＸ ｈｏ Ｉ部位内に連結して構築物ＳＦ３Ｅを作成した。 全般的な開始部位の挿入 （ｉｉ）． ５’ ＳａｌＩ部位および３’ ＸｈｏＩ部位により両脇を挟ま れるＳＶ４０ Ｔ抗原核局在化配列をコードする相補的オリゴヌクレオチド（♯ ４７および♯４８）をアニールし、ホスファターゼ処理を施し、そしてＳＦ１Ｅ のＸｈｏＩ部位内に連結して構築物ＮＦ１Ｅを作成した。この構築物をＤＮＡ配 列決定により確認した。核局在化配列の突然変異体もしくは欠損形態（ここでは 、位置１２８でスレオニンがリシンに置換されている）を含む構築物も単離した 。これをＮＦ１Ｅ−Ｍと表示する。ＦＫＢＰ１２ドメインの多量体は、ｐＢＳ− ＦＫＢＰ１２からのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ断片としてＦＫＢＰ１２配列を単離し、 そしてこの断片をＸｈｏＩで直線化したＮＦ１Ｅ内に連結させることにより取得 し た。このことにより構築物ＮＦ２ＥおよびＮＦ３Ｅの作成がもたらされた。 全般的な開始部位内へのＮＬＳの挿入 位置１２８でのスレオニンは欠陥性ＮＬＳをもたらす。 （ｉｉｉ）． ＶＰ１６転写活性化ドメイン（アミノ酸４１３〜４９０）を、Ｓａｌ Ｉ部位を含む５’プライマー（♯４３）ならびにＸｈｏＩ部位を含む３’ プライマー（♯４４）を用いるＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物を単離し 、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてそのＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位で ＭＦ３Ｅ内に連結して構築物ＭＶ１Ｅを作成した。この構築物を配列決定により 確認した。多量化させたＶＰ１６ドメインは、ＭＶ１ＥからのＸｈｏＩ／Ｓａｌ Ｉ断片として単一のＶＰ１６配列を単離し、そしてこの断片をＸｈｏＩで直線化 したＭＶ１Ｅ内に連結することにより作成した。構築物ＭＶ２Ｅ、ＭＶ３Ｅ、お よびＭＶ４Ｅをこの様式で作成した。一つもしくは複数のＶＰ１６ドメインをコ ードするＤＮＡ断片をＭＶ１ＥもしくはＭＶ２ＥからのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ断片 として単離し、そしてＳａｌＩで直線化したＮＦ１Ｅ内に連結して構築物ＮＦ１ Ｖ１ＥおよびＮＦ１Ｖ３Ｅを作成した。ＦＫＢＰ１２ドメインの多量体は、ｐＢ Ｓ−ＦＫＢＰ１２からのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ断片としてＦＫＢＰ１２配列を単離 し、そしてこの断片をＸｈｏＩで直線化したＮＦ１Ｖ１Ｅ内に連結することによ り取得した。このことにより構築物ＮＦ２Ｖ１ＥおよびＮＦ３Ｖ１Ｅの作成がも たらされた。 ＰＣＲ増幅化産物の５’末端： ＰＣＲ増幅化産物の３’末端： オリゴヌクレオチド類： 実施例８． 転写誘導の証明 Ｊｕｒｋａｔ ＴＡｇ細胞を電気穿孔（９６０μＦ、２５０ｖ）により指示さ れる構築物（５μｇの各構築物）でトランスフェクトした。２４時間後に細胞を 新鮮な培地内に再懸濁し、そしてアリコートに分けた。各トランスフェクション 物の半分を１μＭの最終濃度で二量体ＦＫ５０６誘導体（実施例１４）と共にイ ンキュベートした。１２時間後に細胞を洗浄し、そして細胞抽出物を反復凍結− 解凍により調製した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ Ｔ）活性を標準的プロトコールにより測定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ（１９８９） ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ．１６−５９ ｆｆ。このデータは、ＣＡＴ活性は予想どうり（リガンド添加もしくは非添加の 試料２中、ならびにリガンドの存在下での試料５および６）、３７℃で１８時間 のインキュベーション後に７０μＬの抽出物中に存在する（総抽出物容量は１２ ０μＬである）ことを示した。このアッセイに利用した試料は以下のとうりであ る。 合成化学の実施例 いずれかの場所に指示されるように、オリゴマー化剤として目下特に目的とさ れる化合物は以下の構造を有する。 リンカー−｛ｒｂｍ₁、ｒｂｍ₂、．．．ｒｂｍ_n｝ ［式中、「リンカー」は例えば本明細書に記載されるようなリンカー部分であ り、これは「ｎ」（２から約５までの整数であり、通常は２もしくは３である） のレセプター結合性部分（「ｒｂｍ」）に共有結合により連結されており、この レセプター結合部分は同一であることも異なることもある。本明細書のいずれか の場所に論議されるように、このレセプター結合性部分は例えばセクションＶ（ Ｃ）に列挙されるような既知のレセプターのためのリガンド（もしくはそのアナ ログ）であり、かつＦＫ５０６、ＦＫＢＰ、ラパマイシン、およびＦＫＢＰに結 合することが可能なそれらのアナログ、ならびにシクロスポリン類、テトラサイ クリン類、他の抗生物質類、およびマクロライド系抗生物質類、ならびに各々の レセプターに結合することが可能なステロイド類を含む。 リンカーは、２つもしくはそれを上回る数の結合性部分に共有結合（「―」） により結合することが可能な二官能性もしくは多官能性分子である。典型的には リンカーは約４０までの原子を含むであろうし、そして炭素および水素に加えて 窒素、酸素、およびイオウを含むことができる。例示的なリンカー部分がセクシ ョンＶＩ（Ａ）および様々な実施例中に開示されており、そして中でもＣ１−Ｃ ３０アルキル、アルキレン、もしくはアリールアルキル基（それらの基は置換さ れることも、もしくは未置換であることもでき、かつ直鎖状、分岐状、もしくは 環状であることができる）を含む。例えばアルキル置換基は、飽和される直鎖状 、環状、もしくは分岐状の、好ましくは１〜約１２の炭素原子でできている炭化 水素部分であり、これらにはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、シ クロプロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロブチル、シクロプ ロピルメチレン、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチルなどが含まれ 、そして場合によっては一つもしくは複数の置換基で置換されることができ、そ のような置換基の例は、低級アルコキシ、カルボキシ、アミノ（置換されるもし くは未置換の）、フェニル、アリール、メルカプト、ハロ（フルオロ、クロロ、 ブロモ、もしくはヨード）、アジド、あるいはシアノである。 これらの化合物は市販品として入手可能な物質および／または当該技術分野に 知られる方法を用いて製造することができる。これらの化合物について工学的に 作成されたレセプターは、これ以降に記載される要領で取得することができる。 特に目的とされる化合物は、１０^-6を下回る、好ましくは約１０^-7を下回る、そ して更に一層好ましくは１０^-8を下回るＫｄでレセプターに結合するものである 。 あるサブクラスの目的のオリゴマー化剤は、一つもしくは複数のレセプター結 合性部分がＦＫ５０６、ＦＫ５０６タイプの化合物、もしくはそれらの誘導体で あるものであり、この場合このレセプター結合性部分は、図９Ａの化合物５もし くは１３によりＣ２１のアリル基（ＦＫ５０６の番号付けを用いる）を通してか 、あるいはシクロヘキシル環（Ｃ２９〜Ｃ３４）を通して（この例は、図９Ｂの 化合物８、１６、１７によりＣ３２ヒドロキシルを通すものである）リンカー部 分に共有結合により結合する。このクラスの化合物は本明細書に開示される方法 （これには以下に記載される実施例が含まれる）の適用により製造することがで きる。 他のサブクラスの目的のオリゴマー化剤は、少なくとも一つのレセプター結合 部分がＦＫ５２０もしくはその誘導体であるものであり、この場合ＦＫ５０６も しくはその誘導体の分子は図１０のＦＫ１０４０ＡもしくはＦＫ１０４０Ｂにお けるものと同様にリンカー部分に共有結合により結合する。このクラスの化合物 は図１０のスキーム１、図１１Ａおよび１１Ｂのスキーム２、もしくは図１２お よび図１３のスキーム３の適用により製造することができる。 更に別のサブクラスの目的のオリゴマー化剤は、少なくとも一つのレセプター 結合性部分がシクロスポリンＡもしくは誘導体であるものである。 本発明のこれらおよびその他のオリゴマー化剤はホモオリゴマー化剤（この場 合ｒｂｍは同一である）もしくはヘテロオリゴマー化剤（この場合ｒｂｍは異な る）であることができる。ヘテロオリゴマー化剤は本明細書に存在する方法（こ れには図１３のスキーム３および本明細書のいずれかの場所に論議されるものが 含まれる）への類似法により製造することができる。 以下の合成実施例は説明的であることが意図される。 Ａ． 一般方法。全ての反応はオーブン乾燥させたガラス器具中、窒素もしく はアルゴンの正の圧力下で実施した。空気もしくは湿気に敏感な化合物はゴム製 隔膜を通して注射針もしくはカニューレを介して導入した。 Ｂ． 物理学的データ。陽子核磁気共鳴スペクトル（¹Ｈ ＮＭＲ）はＢｒｕ ｋｅｒ ＡＭ−５００（５００ＭＨｚ）およびＡＭ−４００（４００ＭＨｚ）ス ペクトロメーターで記録した。化学シフトはテトラメチルシランから内部標準（ クロロホルム、７．２７ｐｐｍ）としての溶媒共鳴を用いてｐｐｍで報告される 。データは以下の要領で報告される。化学シフト、多重度（ｓ＝シングレット、 ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｂｒ＝ブロード、ｍ＝マ ルティプレット）、カップリング係数（Ｈｚ）、積分法。低分解能および高分解 能マススペクトルを取得した。 Ｃ． クロマトグラフィー。反応は、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社のシリカゲル６０Ｆガ ラスプート（０．２５ｍｍ）を用いる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により モニターした。構成成分は、、長波長紫外線光での照射により、ヨウ素蒸気に露 出させて、および／またはモリブデン酸セリウムアンモニウム水溶液中に浸し、 その後に加熱することにより可視化させた。クロマトグラフィー用の溶媒はＨＰ ＬＣ等級であった。液体クロマトグラフィーは、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社のシリカゲル ６０（２３０〜４００メッシュ）上で指示された溶媒系の強制流出（フラッシュ クロマトグラフィー）を用いて実施した。 Ｄ． 溶媒および試薬。全ての試薬および溶媒は分析用等級であり、かつ搬入 されたままで使用したが、以下の例外が存在した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ ）、ベンゼン、トルエン、およびジエチルエーテルはナトリウム金属ベンゾフェ ノンケチルから蒸留した。トリエチルアミンおよびアセトニトリルは水素化カル シウムから蒸留した。ジクロロメタンは過酸化リンから蒸留した。ジメチルホル ムアミド（ＤＭＦ）は減圧下で水素化カルシウムから蒸留し、そして４Åの分子 ふるいに通して保存した。 ＦＫ５０６誘導体の製造 実施例９． ＦＫ５０６−ＴＢＳ₂のヒドロホウ素化／酸化（１から２へ）。 ヒドロホウ素化は、Ｅｖａｎｓ（Ｅｖａｎｓ）ｅｔ ａｌ．、ＪＡＣＳ（１９ ９２）１１４、６６７９、既出。（１９９２）６６７９−６６８５）の方法に従 って実施した。（番号付けについては、Ｈａｒｄｉｎｇ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ ｕｒｅ（１９８９）３４１、７５８、を参照せよ）。１０ｍＬのフラスコに２４ ， ３２−ビス［（第三級−ブチルジメチルシリル）オキシ］−ＦＫ５０６（３３． ８ｍｇ、０．０３３ｍモル）および［Ｒｈ（ｎｂｄ）（ジホス−４）］ＢＦ₄（ ３．１ｍｇ、０．００４ｍモル、１３モル％）を充填した。この橙色混合物をト ルエン（２．０ｍＬ）中に溶解し、そして溶媒を減圧下で４時間にわたり除去し た。このフラスコに注意深く窒素パージを施し、そして薄橙色油状物をＴＨＦ（ ３．０ｍＬ、１０ｍＭの最終濃度）中に溶解し、そして氷水浴槽で０℃に冷却し た。カテコールボラン（９８μＬ、０．０９８ｍモル、ＴＨＦ中の１．０Ｍ溶液 、３．０等量）を注射針を介して添加し、そして得られる溶液を０℃で４５分間 撹拌した。この反応を０℃下、０．２ｍＬのＴＨＦ／ＥｔＯＨ（１：１）、次い で０．２ｍＬのｐＨ７．０緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ；０．０５Ｍリン酸塩）、その 後に０．２ｍＬの３０％Ｈ₂Ｏ₂で失活させた。この溶液を室温で少なくとも１２ 時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして残存する油状物をベンゼン（１０ ｍＬ）中に溶解し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した 。それぞれの相を分離させ、そして水相をベンゼン（２×１０ｍＬ）で逆抽出し た。これらの有機相を合わせ、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ） で一度洗浄した。このベンゼン相をＭｇＳＯ₄で脱水し、濃縮し、そしてフラッ シュクロマトグラフィー（２：１ ヘキサン：酢酸エチル）に供して、所望の第 一級アルコールを無色透明油状物として生じた（１２．８ｍｇ、０．０１２ｍモ ル、３７％）。 混合カーボネートの製造（２から３へ）。混合カーボネートの製造は、Ｇｈｏ ｓｈ（Ｇｈｏｓｈ、ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９ ９２）３３、２７８１−２７８４）の方法により達成した。１０ｍＬのフラスコ に先の第一級アルコール（２９．２ｍｇ、０．０２７８ｍモル）およびベンゼン （４ｍＬ）を充填した。溶媒を減圧下で６０分間にわたり除去した。油状物をア セトニトリル（２．０ｍＬ、１４ｍＭの最終濃度）中に溶解し、そしてトリエチ ルアミン（７７μＬ、０．５６ｍモル）を添加しながら２０℃で撹拌した。Ｎ， Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（３６ｍｇ、０．１４ｍモル）を一度に 添加し、そしてその溶液を２０℃で４６時間撹拌した。この反応混合物をジクロ ロメタンで希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した 。 それぞれの相を分離させ、そして水層をジクロロメタン（２×１０ｍＬ）で逆抽 出した。これらの有機相を合わせ、そして脱水し（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、そし てフラッシュクロマトグラフィー（３：１〜２：１〜１：１ ヘキサン：酢酸エ チル）に供した。所望の混合カーボネートが無色透明油状物として単離された（ １６．８ｍｇ、０．０１４ｍモル、５１％）。 ＦＫ５０６の二量化（３から４へ）。乾燥した１ｍＬ用コニカルガラスバイア ル（Ｋｏｎｔｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｌａｓｓｗａｒｅ社）に先の混合 カーボネート（７．３ｍｇ、０．００６１ｍモル）およびアセトニトリル（２５ ０μＬ、２５ｍＭの最終濃度）を充填した。トリエチルアミン（１０μＬ、０． ０７５ｍモル）、次いでｐ−キシリレンジアミン（８．３μＬ、０．００２７ｍ モル、ＤＭＦ中の０．３２Ｍ溶液）を添加した。この反応物を２０℃で２２時間 撹拌し、そしてジクロロメタン（１０ｍＬ）での希釈により失活させた。この溶 液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。それぞれの相を分離 させ、そして水層をジクロロメタン（２×１０ｍＬ）で逆抽出した。これらの有 機相を合わせ、そして脱水し（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、そしてフラッシュクロマ トグラフィー（３：１〜２：１〜１：１ ヘキサン：酢酸エチル）に供して、所 望の保護化二量体を無色透明油状物として生じた（４．３ｍｇ、１．９μモル、 ７０％）。 ＦＫ５０６二量体の脱保護化（４から５へ）。先の保護化二量体（３．３ｍｇ 、１．４μモル）をスピン翼をはめてある１．５ｍＬのポリプロピレン製試験管 内に入れた。アセトニトリル（０．５ｍＬ、３ｍＭの最終濃度）を添加し、そし てＨＦ（５５μ１、４８％の水溶液、Ｆｉｓｈｅｒ）を添加しながらこの溶液を ２０℃で撹拌した。この溶液を室温で１８時間撹拌した。脱保護化されたＦＫ５ ０６誘導体をその後に、１５ｍＬの試験管中、ジクロロメタンと飽和重炭酸ナト リウム水溶液との間で分配した。この試験管をボルテックスミキサーに長時間か けてそれらの相を混合し、そして分離後に有機相をピペットで除去した。水相を ジクロロメタン（４×２ｍＬ）で逆抽出し、そして合わせた有機相を脱水し（Ｍ ｇＳＯ₄）、濃縮し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（１：１：１ ヘキ サン：ＴＨＦ：エーテル〜１：１ ＴＨＦ：エーテル）に供して、所望の二量体 を 無色透明油状物として生じた（１．７ｍｇ、０．９３μモル、６５％）。 先の方法に従って、例えばベンジルアミン（１４）、オクタメチレンジアミン 、デカメチレンンジアミンなどのような他のモノアミン類およびジアミン類を用 いることができる。 実施例１０． Ｌ−セレクトリド（Ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ）でのＦＫ５０６の還 元（ＦＫ５０６から６へ）。Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙおよび共同研究者は、Ｌ− セレクトリド（Ｓｅｌｅｃｔｏｒｉｄｅ）でのＦＫ５０６の処理は、Ｃ２４およ びＣ２２のヒドロキシル基に結合するホウ酸エステルを有する２２−ジヒドロ− ＦＫ５０６を生じることを示した（Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｄａｎｉｓｈｅｆ ｓｋｙ、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ（１９８９）２８、１５７−１６１；Ｆｉｓ ｈｅｒ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）５６、２９００− ２９０７）。 混合カーボネートの製造（６から７へ）。１０ｍＬのフラスコに２２−ジヒド ロ−ＦＫ５０６−第二級−ブチルボロネート（１２５．３ｍｇ、０．１４４ｍモ ル）およびアセトニトリル（３．０ｍＬ、５０ｍＭの最終濃度）を充填し、そし てこの透明溶液にトリエチルアミン（２００μＬ、１．４４ｍモル、１０等量） を添加しながら室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ １８４．０ｍｇ、０．７１９ｍモル）を一度に添加し、そしてこの透明溶液を室 温で４４時間撹拌した。この溶液を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、そして飽 和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、そしてそれぞれの相を分離さ せた。その後に水相を酢酸エチル（２×１０ｍＬ）で逆抽出し、そしてこれらの 有機相を合わせ、脱水し（ＭｇＳＯ₄）、そして得られる油状物をフラッシュク ロマトグラフィー（１：１〜１：２ ヘキサン：酢酸エチル）に供して、所望の 混合カーボネートを無色透明油状物として生じた（８９．０ｍｇ、０．０８８ｍ モル、６１％）。 ＦＫ５０６混合カーボネートの二量化（７から８へ）。乾燥した１ｍＬ用コニ カルガラスバイアル（Ｋｏｎｔｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｌａｓｓｗａｒ ｅ社）に先の混合カーボネート（１５．０ｍｇ、０．０１４８ｍモル）およびジ クロロメタン（５００μＬ、３０ｍＭの最終濃度）を充填した。トリエチルアミ ン（９μＬ、０．０６７ｍモル、１０等量）、次いでｐ−キシリレンジアミン（ ０．８ｍｇ、０．００５９ｍモル）を添加した。この反応物を２０℃で１６時間 撹拌し、そしてジクロロメタン（５ｍＬ）での希釈により失活させた。この溶液 を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５ｍＬ）で洗浄した。それぞれの相を分離させ 、そして水相をジクロロメタン（２×５ｍＬ）で逆抽出した。これらの有機相を 合わせ、そして脱水し（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、そしてフラッシュクロマトグラ フィー（１：１〜１：２ ヘキサン：酢酸エチル）に供して、所望の二量体を無 色透明油状物として生じた（７．４ｍｇ、３．８μモル、６５％）。 先の方法に従って、例えばベンジルアミン（１５）、オクチレンジアミン、デ カメチレンジアミン（１６）、ビス−ｐ−ジベンジルアミン、Ｎ−メチルジエチ レンアミン、トリス−アミノエチルアミン（１７）、トリス−アミノプロピルア ミン、１，３，５−トリアミノメチルシクロヘキサンなどのような他のモノアミ ン類、ジアミン類、もしくはトリアミン類をキシリレンジアミンの代わりに用い ることができる。 実施例１１． ＦＫ５０６の酸化的開裂および還元（１から９へ） オスミル化は、Ｋｅｌｌｙ（ＶａｎＲｈｅｅｎｅｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９７６）１７、１９７３−１９７６）の方法に 従って実施した。開裂はＤａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ（Ｚｅｌｌ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９８６）５１、５０３２−５０３６）の方法に従って 実施した。アルデヒドの還元は、Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ ｈｅｍ．、（１９８１）４６、４６２８−４６９１）の方法に従って実施した。 １０ｍＬのフラスコに２４，３２−ビス［第三級−ブチルジメチルシリル）オキ シ］−ＦＫ５０６（８４．４ｍｇ、０．０８２ｍモル）、４−メチルモルホリン のＮ−オキシド（４８ｍｇ、０．４１ｍモル、５等量）、およびＴＨＦ（２．０ ｍＬ、４１ｍＭの最終濃度）を充填した。四酸化オスミウム（４５μＬ、０．０ ０８ｍモル、０．１等量）を注射針を介して添加した。この無色透明溶液を室温 で５時間撹拌した。その後にこの反応物を５０％のメタノール水溶液（１．０ｍ Ｌ）で 希釈し、そして過ヨウ素酸ナトリウム（１７５ｍｇ、０．８２ｍモル、１０等量 ）を一度に添加した。濁った混合物を室温で４０分間撹拌し、エーテル（１０ｍ Ｌ）で希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５ｍＬ）で洗浄した。それ ぞれの相を分離させ、そして水層をエーテル（２×５ｍＬ）で逆抽出した。これ らの合わせた有機層を脱水し（ＭｇＳＯ₄）、そして固形亜硫酸ナトリウム（５ ０ｍｇ）で処理した。その後にこの有機相を濾過および濃縮し、そして油状物を フラッシュクロマトグラフィー（３：１〜２：１ ヘキサン：酢酸エチル）に供 して、中間体である不安定なアルデヒド（５３．６ｍｇ）を無色透明油状物とし て生じた。このアルデヒドを即座にＴＨＦ（４．０ｍｌ）中に溶解し、そして− ７８℃に窒素雰囲気下で冷却し、そして水素化リチウムトリス［（３−エチル− ３−ペンチル）オキシ］アルミニウム（０．６０ｍＬ、０．０８２ｍモル、ＴＨ Ｆ中の０．１４Ｍ溶液、１．０等量）で処理した。この透明溶液を−７８℃下で １０分間撹拌し、その後にエーテル（４ｍＬ）での希釈および飽和塩化アンモニ ウム水溶液（０．３ｍＬ）の添加により失活させた。この混合物を室温に暖め、 そして固形硫酸ナトリウムを添加してこの溶液を脱水させた。その後にこの混合 物を濾過および濃縮し、そして得られる油状物をフラッシュクロマトグラフィー （２：１ ヘキサン：酢酸エチル）に供して、所望のアルコールを無色透明油状 物（３９．５ｍｇ、０．０３８ｍモル、４７％）として取得した。 混合カーボネートの製造（９から１０へ）。混合カーボネートの製造は、Ｇｈ ｏｓｈ、ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９２）３３ 、２７８１−２７８４）の方法により達成した。１０ｍＬのフラスコに先の第一 級アミン（３８．２ｍｇ、０．０３６９ｍモル）およびアセトニトリル（２．０ ｍＬ、１０ｍＭの最終濃度）を充填し、そして２，６−ルチジン（４３μＬ、０ ．０３７ｍモル、１０等量）を添加しながら室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジスク シンイミジルカーボネート（４８ｍｇ、０．１８ｍモル）を一度に添加し、そし てこの溶液を室温で２４時間撹拌した。この反応混合物をエーテル（１０ｍＬ） で希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。それぞ れの相を分離させ、そして水層をエーテル（２×１０ｍＬ）で逆抽出した。これ らの有機相を合わせ、そして脱水し（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、そしてフラッシュ ク ロマトグラフィー（２：１〜１：１ ヘキサン：酢酸エチル）に供した。所望の 混合カーボネートが無色透明油状物として単離された（３２．６ｍｇ、０．０２ ８ｍモル、７５％）。 ベンジルカルバメートの製造（１０から１１へ）。乾燥した１ｍＬ用コニカル ガラスバイアル（Ｋｏｎｔｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｌａｓｓｗａｒｅ社 ）に混合カーボネート １０（８．７ｍｇ、０．００７４ｍモル）およびアセト ニトリル（５００μＬ、１５ｍＭの最終濃度）を充填した。この溶液をトリエチ ルアミン（１０μＬ、０．０７４ｍモル、１０等量）、次いでベンジルアミン（ １．６μＬ、０．０１５ｍモル、２等量）を添加しながら室温で撹拌した。この 反応物を室温で４時間撹拌した。溶媒を無水窒素の気流で除去し、そしてこの油 状物を直接フラッシュクロマトグラフィー（３：１〜２：１ ヘキサン：酢酸エ チル）に供して、所望の保護化単量体を無色透明油状物として生じた（６．２ｍ ｇ、５．３μモル、７２％）。 この保護化単量体（６．２ｍｇ、５．３μモル）を、スピン翼をはめてある１ ．５ｍＬのポリプロピレン製試験管内に入れた。アセトニトリル（０．５ｍＬ、 １１ｍＭの最終濃度）を添加し、そしてＨＦ（５５μｌ、４８％の水溶液、Ｆｉ ｓｈｅｒ、３．０Ｎの最終濃度）を添加しながらこの溶液を室温で撹拌した。こ の溶液を室温で１８時間撹拌した。脱保護化したＦＫ５０６誘導体をその後に、 １５ｍＬの試験管中、ジクロロメタンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間で分 配した。この試験管をボルテックスミキサーに長時間かけてそれらの相を混合し 、そして分離後に有機相をピペットで除去した。水相をジクロロメタン（４×２ ｍＬ）で逆抽出し、そして合わせた有機相を脱水し（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、そ してフラッシュクロマトグラフィー（１：１〜０：１ ヘキサン：酢酸エチル） に供して、所望の保護化ベンジルカルバメートを無色透明油状物として生じた（ ３．９ｍｇ、４．１μモル、７８％）。 例えばキシリレンジアミン（１２）、ヘキサメチレンジアミン、オクタメチレ ンジアミン、デカメチレンジアミン（１３）のようなジアミンもしくは他のジア ミン類でベンジルアミンを置換することにより、本発明の二量体化合物が製造さ れる。 実施例１２． ＦＫ５０６の混合カーボネート（１２）の製造 １０ｍＬのフラスコに２４，３２−ビス［（第三級−ブチルジメチルシリル） オキシ］−ＦＫ５０６（３３９．５ｍｇ、０．３２９ｍモル）、４−メチルモル ホリンのＮ−オキシド（１９３ｍｇ、１．６４ｍモル、５等量）、水（０．２０ ｍＬ）、およびＴＨＦ（０．８ｍＬ、４１ｍＮの最終濃度）を充填した。四酸化 オスミウム（０．１８３ｍＬ、０．０３３ｍモル、０．１等量、水中の０．１８ Ｍ溶液）を注射針を介して添加した。この無色透明溶液を室温で４．５時間撹拌 した。この反応物を５０％のメタノール水溶液（４．０ｍＬ）で希釈し、そして 過ヨウ素酸ナトリウム（７００ｍｇ、３．２９ｍモル、１０等量）を一度に添加 した。この濁った混合物を室温で２５分間撹拌し、エーテル（２０ｍＬ）で希釈 し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。それぞれの相 を分離させ、そして水層をエーテル（２×１０ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有 機層をＭｇＳＯ₄および固形亜硫酸ナトリウム（５０ｍｇ）に通して脱水した。 この有機相をその後に濾過および濃縮し、そして得られるアルデヒドを即座にＴ ＨＦ（８．０ｍＬ）中に溶解し、そして窒素雰囲気下で−７８℃に冷却し、そし て水素化リチウムトリス［（３−エチル−３−ペンチル）オキシ］アルミニウム （２．３５ｍＬ、０．３２９ｍモル、ＴＨＦの０．１４Ｍ溶液、１．０等量）で 処理した。この透明溶液を−７８℃で６０分間撹拌し（ＴＬＣにより相接してモ ニターされる）、その後にエーテル（５ｍＬ）での希釈および飽和塩化アンモニ ウム水溶液（０．３ｍＬ）の添加により失活させた。この混合物を室温に暖め、 そして固形硫酸ナトリウムを添加してこの溶液を乾燥させた。この混合物を２０ 分間撹拌し、濾過し、濃縮し、そして得られる油状物を即座にアセトニトリル（ １０ｍＬ）中に溶解した。得られる第一級アルコールのＣＨ₃ＣＮ中の溶液に、 ２，６−ルチジン（０．３８０ｍＬ、３．３ｍモル、１０等量）およびＮ，Ｎ’ −ジスクシンイミジルカーボネート（４２０ｍｇ、１．６５ｍモル、５等量）を 添加した。この不均一混合物を室温で１９時間撹拌し、この際にこの溶液をエー テル（３０ｍＬ）で希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で 洗浄した。水相をエーテル（２×１０ｍＬ）で逆抽出した。これらの有機相を合 わせ、そして脱水し（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、そしてフラッシュクロマトグラフ ィ ー（３：１〜２：１〜１：１ ヘキサン／酢酸エチル）に供した。所望の混合カ ーボネート １２が無色透明油状物として単離された（２１７ｍｇ、０．１８４ ｍモル、４回の総計で５６％）。 実施例１３． ２４，２４’，３２，３２’−テトラキス［（第三級−ブチルジ メチルシリル）オキシ］−ＦＫ１０１２−Ａ（ｐ−キシリレンジアミンブリッジ ）の製造。乾燥した１ｍＬ用コニカルガラスバイアルに先の混合カーボネート（ ２３．９ｍｇ、０．０２０３ｍモル）およびアセトニトリル（５００μＬ、４１ ｍＭの最終濃度）を充填した。トリエチルアミン（２８μＬ、０．２０ｍモル、 １０等量）、次いでｐ−キシリレンジアミン（４６μＬ、０．０１０１ｍモル、 ＤＭＦ中の０．２２Ｍ溶液）を添加した。この反応物を室温で１８時間撹拌し、 溶媒を無水窒素の気流で除去し、そしてこの油状物を直接フラッシュクロマトグ ラフィー（３：１〜２：１〜１：１ ヘキサン：酢酸エチル）に供して、所望の 保護化二量体を無色透明油状物として取得した（１１．９ｍｇ、５．３μモル、 ５２％）。 実施例１４． ＦＫ１０１２−Ａ（ｐ−キシリレンジアミンブリッジ）（１３） の製造。先の保護化二量体（１１．０ｍｇ、４．９μモル）を、スピン翼をはめ てある１．５ｍＬのポリプロピレン製試験管内に入れた。アセトニトリル（０． ５０ｍＬ、１０ｍＭの最終濃度）を添加し、そしてＨＦ（５５μＬ、４８％の水 溶液、Ｆｉｓｈｅｒ、３．０Ｎの最終濃度）を添加しながらこの溶液を２０℃で 撹拌した。この溶液を室温で１６時間撹拌した。脱保護化されたＦＫ５０６誘導 体をその後に、１５ｍＬの試験管中、ジクロロメタンと飽和重炭酸ナトリウム水 溶液との間で分配した。この試験管をボルテックスミキサーに長時間かけてそれ らの相を混合し、そして分離後に有機相をピペットで除去した。水相をジクロロ メタン（４×２ｍＬ）で逆抽出し、そして合わせた有機相を脱水し（ＭｇＳＯ₄ ）、濃縮し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（１：１：１ ヘキサン／Ｔ ＨＦ／エーテル〜１：１ ＴＨＦ／エーテル）に供して、ＦＫ１０１２−Ａを無 色透明油状物として生じた（５．５ｍｇ、３．０μモル、６８％）。 実施例１５． ２４，２４’，３２，３２’−テトラキス［（第三級−ブチルジ メチルシリル）オキシ］−ＦＫ１０１２−Ｂ（ジアミノデカンブリッジ）の製造 。乾燥した１ｍＬ用コニカルガラスバイアルに先の混合カーボネート（５３．３ ｍｇ、０．０４５３ｍモル）およびアセトニトリル（２．０ｍＬ、１１ｍＭの最 終濃度）を充填した。トリエチルアミン（１６μＬ、０．１１ｍモル、５等量） 、次いでジアミノデカン（６１μＬ、０．０２２６ｍモル、ＤＭＦ中の０．３７ Ｍ溶液）を添加した。この反応物を室温で１２時間撹拌し、溶媒を無水窒素の気 流で除去し、そしてこの油状物を直接フラッシュクロマトグラフィー（３：１〜 ２：１〜１：１ ヘキサン：酢酸エチル）に供して、所望の保護化二量体を無色 透明油状物として取得した（１８．０ｍｇ、７．８μモル、３５％）。 実施例１６． ＦＫ１０１２−Ｂ（ジアミノデカン−１，１０ブリッジ）（１４ ）の製造。先の保護化二量体（１８．０ｍｇ、７．８μモル）を、撹拌翼をはめ てある１．５ｍＬのポリプロピレン製試験管内に入れた。アセトニトリル（０． ４５ｍＬ、１６ｍＭの最終濃度）を添加し、そしてＨＦ（５５μＬ、４８％の水 溶液、Ｆｉｓｈｅｒ、３．６Ｎの最終濃度）を添加しながらこの溶液を室温で撹 拌した。この溶液を２３℃で１７時間撹拌した。保護化ＦＫ５０６をその後に、 １５ｍＬの試験管中、ジクロロメタンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間で分 配した。この試験管をボルテックスミキサーに長時間かけてそれらの相を混合し 、そして分離後に有機相をピペットで除去した。水相をジクロロメタン（４×２ ｍＬ）で逆抽出し、そして合わせた有機相を脱水し（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、そ してフラッシュクロマトグラフィー（１００％酢酸エチル〜２０：１ 酢酸エチ ル／メタノール）に供して、ＦＫ１０１２−Ｂを無色透明油状物として取得た（ ５．３ｍｇ、２．９μモル、３７％）。 実施例１７． ２４，２４’，３２，３２’−テトラキス［（第三級−ブチルジ メチルシリル）オキシ］−ＦＫ１０１２−Ｃ（ビス−ｐ−アミノメチルベンゾイ ルジアミノデカンブリッジ）の製造。乾燥した２５ｍＬ用のナス型フラスコにジ アミンリンカー（１５．１ｍｇ、０．０３４４ｍモル）および１．０ｍＬのＤＭ Ｆを充填した。別のフラスコに混合カーボネートおよびトリエチルアミン（０． １００ｍＬ、０．７００ｍモル、２０等量）を２．０ｍＬのジクロロメタン中に 溶解し、その後にゆっくりと、ビス−ｐ−アミノメチルベンゾイル、ジアミノデ カン−１，１０の撹拌溶液に添加した（４×０．５０ｍＬ）。この混合カーボネ ート １２を含むフラスコをジクロロメタン（２×０．５０ｍＬ）で洗浄して確 実に混合カーボネート １２の移動を完了させた。この反応物を２３℃で１６時 間撹拌し、溶媒を無水窒素の気流で除去し、そしてこの油状物を直接フラッシュ クロマトグラフィー（１：１〜１：２ ヘキサン／酢酸エチル）に供して、所望 の保護化二量体を無色透明油状物として取得した（２９．６ｍｇ、１１．５μモ ル、３４％）。 実施例１８． ＦＫ１０１２−Ｃ（１５）の製造。先の保護化二量体（２９．６ ｍｇ、１１．５μモル）（１７）を、撹拌翼をはめてある１．５ｍＬのポリプロ ピレン製試験管内に入れた。アセトニトリル（０．４５ｍＬ、２３ｍＭの最終濃 度）を添加し、そしてＨＦ（５５μＬ、４８％の水溶液、Ｆｉｓｈｅｒ、３．６ Ｎの最終濃度）を添加しながらこの溶液を室温で撹拌した。この溶液を室温で１ ７時間撹拌した。所望の対称性二量体をその後に、１５ｍＬの試験管中、ジクロ ロメタンと飽和重炭酸ナトリウム水溶液との間で分配した。この試験管をボルテ ックスミキサーに長時間かけてそれらの相を混合し、そして分離後に有機相をピ ペットで除去した。水相をジクロロメタン（４×２ｍＬ）で逆抽出し、そして合 わせた有機相を脱水し（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、そしてフラッシュクロマトグラ フィー（１００％酢酸エチル〜１５：１ 酢酸エチル／メタノール）に供して、 ＦＫ１０１２−Ｃを無色透明油状物として取得た（１１．５ｍｇ、５．５μモル 、４７％）。 ＣｓＡ誘導体の製造 実施例１９． ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−−ＯＨ¹ＣｓＡ（２）。ＭｅＢｍｔ（Ｏ Ａｃ）−−ＯＨ¹−ＣｓＡ（１）（１６１ｍｇ、１２４ｍモル）（Ｅｂｅｒｌｅ ａｎｄ Ｎｕｎｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）５７、２６ ８９）をメタノール（１０ｍＬ）中に溶解した。ＫＯＨ（１９６ｍｇ）を水（８ ｍＬ）中に溶解した。２９７μＬのＫＯＨ溶液（．１３０ｍモル、１．０５等量 ）をメタノール中の溶液（１）に添加した。この新しい溶液を室温、不活性雰囲 気下で４時間撹拌し、この際にこの反応物を酢酸（２ｍＬ）で失活させた。この 反応混合物を、７０％アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を 含むＨ₂Ｏで溶出させる５ｃｍ×２５ｃｍ、１２μ、１００Ａ、Ｃ１８カラムを ７０℃で用いる逆相ＨＰＬＣにより精製して、１１２ｍｇ（７２％）の所望のモ ノアセテート（２）を取得した。 ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−−ＯＣＯＩｍ¹ＣｓＡ（３）。ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ） −−ＯＨ¹−ＣｓＡ（２）（５７ｍｇ、４５．５ｍモル）およびカルボニルジイ ミダゾール（１５ｍｇ、２等量、９１μモル）を５０ｍＬの丸底フラスコ内に移 し、そして無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（ ３２μＬ、４等量、１８２μモル）を添加し、そしてその後に溶媒をロータリー エバポレーター上で室温で除去した。残渣を、溶出液として酢酸エチルを用いる シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、４５ｍｇ（７ ３％）の所望のカルバメート（３）を取得した。 トリス−（２−アミノエチル）アミンのＣｓＡ三量体トリアセテート（６）。 ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−−ＯＣＯＩｍ¹−ＣｓＡ（３）（７．５ｍｇ、５．５４ μモル、３．１等量）をＴＨＦ（１００μＬ）中に溶解した。ジイソプロピルエ チルアミン（６２μＬ、５等量、４ｍＬのＴＨＦ中の１００μＬのアミンを含む ８．９３μモルの溶液）、次いでトリス（２−アミノエチル）アミン（２６μＬ 、１．７９μモル、１０ｍＬのＴＨＦ中の１０１ｍｇのトリス−アミンを含む１ 等量の溶液）を添加した。この溶液をＮ₂雰囲気下で５日間撹拌した。この反応 混合物を蒸発させ、そしてその後にクロロホルム中の０〜５％のメタノールを用 いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、４．１ｍ ｇの所望の生成物（６）を取得した。実施例２０．ジアミノデカンＣｓＡ二量体（８） 固体金属Ｎａ（２００ｍｇ、過剰）を乾燥メタノール（１０ｍＬ）と０℃で反 応させた。二酢酸ジアミノデカンＣｓＡ二量体（５）（４．０ｍｇ）をＭｅＯＨ （５ｍＬ）中に溶解させた。ＮａＯＭｅ溶液２．５ｍＬを（５）の溶液に対して 加えた。不活性雰囲気下において室温で２．５時間撹拌後、溶液を酢酸（２ｍＬ ）で急冷し、そして５ｍｍｘ２５ｍｍ、１２μ、１００Ａ、Ｃ１８カラムを用い て０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む７０〜９５％アセトニトリル／Ｈ₂ Ｏによって７０℃で２０分間にわたって溶離する逆相高速液体クロマトグラフ ィーによって生成物を精製して、所望のジオール２．５ｍｇ（６０％）を生成し た。 二酢酸ジアミノデカンＣｓＡ二量体（５）は、トリス（２−アミノエチル）ア ミンを０．４５当量の１，１０−ジアミノデカンと置き換えることによって製造 された。実施例２１．ｐ−キシリレンジアミンＣｓＡ二量体（４） ｐ−キシレンジアミンＣｓＡ二量体（４）は、トリス（２−アミノエチル）ア ミノを０．４５当量のｐ−キシリレンジアミンと置き換えることによって製造さ れた。 文献に記載された手順にしたがって、シクロフィリンの他の誘導体は、部位１ （ＭｅＢｍｔ１）以外の部位に結合することによって製造される。 ８位Ｄ−異性体類似体は、生産性生物にＤ−アミノ類似体を供給してその部位 に特異的な取込みをさせることによって生産される。パチェット（Ｐａｔｃｈｅ ｔｔ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（１９９２）４５，９４３（β−ＭｅＳ Ｏ）Ｄ−Ａｌａ⁸−ＣｓＡ）；トラバー（Ｔｒａｂｅｒ）ら、同書（１９８９） ４２，５９１を参照されたい。３位類似体は、Ｓａｃ３炭素位に特異的なＣｓＡ のポリ−リチウム化／アルキル化によって製造される。ウェンガー（Ｗｅｎｇｅ ｒ）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ（１９８６）１８，２１３ ，補遺５（シクロフィリン結合および活性プロィール、特に、Ｄ−ＭｅＰｈｅ³ −ＣｓＡについて）；シーバック（Ｓｅｅｂａｃｈ）、１９８７年１０月２７日 発行の米国特許第４，７０３，０３３号明細書（誘導体の製造について）を参照 さ れたい。 上記手順にしたがって、シクロスポリンＡの代わりに他の天然に存在するＣｓ Ａ変種を、本発明において用いるために多量体化することができる。実施例２１Ａ．ＣｓＡ二量体の別の合成 ＭｅＢｍｔ（ＯＨ）−η−ＯＣＯＩｍ¹−ＣｓＡ ＭｅＢｍｔ（ＯＨ）−η−ＯＨ¹−ＣｓＡ（３８ｍｇ、３１μモル、１２１８ ．６ｇ／モル）およびカルボニルジイミダゾール（２０ｍｇ、４当量、１２４μ モル、１６２．１５ｇ／モル）を１０ｍＬ丸底フラスコ中に入れ、乾燥ＴＨＦ（ ２ｍＬ）中に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン（２２μＬ、４当量、１ ２５μモル、１２９．２５ｇ／モル）を加えた後、溶媒を室温においてロータリ ーエバポレーターで除去した。残留物を、溶離剤として酢酸エチル中０〜２０％ アセトンを用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製し て、白色固体３２ｍｇ（収率７８％）を生成した。 （ＣｓＡ）２キシリレンジアミンＣｓＡ二量体 ＭｅＢｍｔ（ＯＨ）−η−ＯＣＯＩｍ¹−ＣｓＡ（１２．５ｍｇ、９．５２μ モル、１３１２．７ｇ／モル）をＤＣＭ（２００μＬ）中に溶解させた。この溶 液に対してキシリレンジアミン（１４．７ｍｇ、１３６．２ｇ／モル）のＤＭＳ Ｏ（０．５ｍＬ）中溶液２２μｌ（０．５当量、４．７５μモル）を加え、そし て反応混合物を窒素雰囲気下において室温で７２時間撹拌して徐々に濃縮させた 。反応を、グラスウールを介して濾過されたアセトニトリル（２ｍＬ）で希釈し 、そして逆相高速液体クロマトグラフィー（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｃ１ ８、 １０μ、１００Ａ、１ｃｍｘ２５ｃｍ、５ｍＬ／分、３０分間にわたる５０〜９ ０％ＡＣＮ／Ｈ₂Ｏ（＋０．１％ＴＦＡ）、７０℃）によって精製して、白色固 体６．１ｍｇ（収率４９％）を生成した。 実施例２１Ｂ．ＦＫ５０６−ＣｓＡ二量体の合成 ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−η−ＣＨ₂ＣＯＯＥｔ−ＣｓＡ ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−η−Ｂｒ¹−ＣｓＡ（２６ｍｇ、純度約８０％、１５ ．７μモル、１３２３．５７ｇ／モル）をＴＨＦ（５００μＬ）中に溶解させた 。この溶液を、マロン酸水素エチル（ランカスター（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）、２ ．５ミリモル、３３２ｍｇ、１３２．１２ｇ／モル）のＴＨＦ（４．７ｍＬ）中 ０℃溶液に対してＰｒＭｇＣｌ（２．１５ｍＬ、エーテル中２．３４Ｍ）を加え ることによって調製されたマロン酸水素エチル（過剰）のマグネシウムエノレー トのＴＨＦ溶液に対してシリンジポンプによって１５時間にわたって加えた後に 室温まで加温した。反応混合物を１Ｎ ＨＣｌ（５０ｍＬ）で急冷し且つ酢酸エ チル（２ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、 そして蒸発させた。 粗生成物をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解させた。Ｅｔ₄ＮＯＡｃ．４Ｈ₂Ｏ（１５ ０ｍｇ、過剰）を加え、混合物を９０℃で２時間加熱した。反応混合物を室温ま で冷却し、Ｈ₂Ｏ（５０ｍＬ）で希釈し、そしてエーテル（２ｘ５０ｍＬ）で抽 出した。合わせた有機物をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させた 。残留物を、７５〜１００％酢酸エチル／ヘキサンによって溶離するシリカゲル 上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、白色固体１１．４ｍｇ（ ５５％）を生成した。 ＭｅＢｍｔ（ＯＨ）−η−ＣＨ₂ＣＯＯＨ¹−ＣｓＡ ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−η−ＣＨ₂ＣＯＯＥｔ¹−ＣｓＡ（１１．０ｍｇ、８． ２７μモル、１３３０．７６ｇ／モル）をＭｅＯＨ（２ｍＬ）中に溶解させ且つ ＮａＯＭｅの溶液（ＭｅＯＨ中１．３０Ｍ、１０ｍＬ）に対して加えた。反応混 合物を窒素雰囲気下において室温で５時間撹拌し、その時点でＨ₂Ｏ（２ｍＬ） を加え、そして混合物を更に２時間撹拌した。反応を氷酢酸（１ｍＬ）で急冷し 、グラスウールを介して濾過し、そして逆相高速液体クロマトグラフィー（レイ ニン（Ｒａｉｎｉｎ）Ｃ１８ダイナマクス、５μ、３００Ａ、２１．４ｍｍｘ２ ５０ｍｍ、２０ｍＬ／分、３０分間にわたる５０〜９０％ＡＣＮ／Ｈ₂Ｏ（＋０ ．１％ＴＦＡ）、７０℃）によって精製して、白色固体５．５ｍｇ（収率５３％ ）を生成した。 ビス−ＴＢＳ−Ｎ−（６−Ｂｏｃ−アミノ）ヘキシル）ＦＫ５０６カルバメート ビス−ＴＢＳ−ＦＫ５０６スクシンイミジルカーボネート（（ｔｂｓ）４−Ｆ Ｋ１０１２に対する前駆物質も）（５．８ｍｇ、１１７７．６２ｇ／モル、４． ９３μモル）をＤＣＭ中に溶解させた。これに対してＮ−Ｂｏｃ−１，６−ジア ミノヘキサン（７．２５ｍｇ、過剰）を加えた。室温で１０分間撹拌後、反応混 合物を蒸発させ、そして生成物を１０〜４０％酢酸エチル／ヘキサンで溶離する フラッシュクロマトグラフィーによって精製して５．９ｍｇ（収率９４％）を得 た。 Ｎ−（６−アミノヘキシル）ＦＫ５０６カルバメート ビス−ＴＢＳ−Ｎ−（６−（Ｂｏｃ−アミノ）ヘキシル）ＦＫ５０６カルバメ ート（５．９ｍｇ、１２７８．８８ｇ／モル、４．６１μモル）をポリプロピレ ン試験管に入れて、ＡＣＮ（７００μｌ）、続いて水性ＨＦ（４９％、１００μ Ｌ）中に入れた。反応を室温で６時間後に完了させ、そしてＮａＨＣＯ₃の飽和 溶液を徐々に加えることによって急冷した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ₃（４ｍＬ ）、Ｈ₂Ｏ（４ｍＬ）で希釈し、そしてＤＣＭ（３ｘ１０ｍＬ）で抽出した。合 わせた有機相をＭｇＳＯ₄によって乾燥させ、濾過し、そして蒸発させて粗生成 物３．６ｍｇ（収率８２％）を生成した。 ＦＫＣｓＡ ＭｅＢｍｔ（ＯＨ）−η−ＣＨ₂ＣＯＯＨ¹−ＣｓＡ（２．８６ｍｇ、２．２７ μモル、１２６０．６６ｇ／モル）およびＮ−（６−アミノヘキシル）ＦＫ５０ ６カルバメート（粗製、２．１６ｍｇ、２．２８μモル、９４９．２１ｇ／モル ）をＤＣＭ（９００μＬ）中に溶解させた。この溶液に対して、ＢＯＰ（１１． ９ｍｇ、４４２．５ｇ／モル）のＤＣＭ（５００μＬ）中溶液１２７μｌ（３． ０当量、６．８μモル）を、続いてジイソプロピルエチルアミン（２０μＬ、ｄ ＝０．７４２１２９．２５ｇ／モル）のＤＣＭ（１．０ｍＬ）中溶液４５μＬ（ ２．２５当量、５．１μモル）を加えた。最後に、ＤＭＦ（４０μＬ）を加え、 反応混合物を窒素流下において室温で１２時間にわたって徐々に蒸発させた。反 応混合物を、グラスウールを介して濾過されたアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈 し、そして逆相高速液体クロマトグラフィー（ベックマンＣ１８、１ｃｍｘ２５ ｃｍ、５ｍＬ／分、２５分間にわたる５０〜９０％ＡＣＮ／Ｈ₂Ｏ、５０℃）に よって精製して、白色固体２．４ｍｇ（収率４８％）を生成した。 実施例２２．（Ａ）補償突然変異によるＦＫ１０１２−「突起（Ｂｕｍｐ）」化 合物およびＦＫＢＰ１２の構造に基づく設計および合成 合成によって達成しうる且つされたＦＫ５０６のＣ９位およびＣ１０位の置換 基は、ＦＫＢＰ１２側鎖残基の別のセットとかち合う。したがって、このような リガンドのための突然変異受容体の一つのクラスは異なる修飾を含むべきであり 、一つはＣ１０置換基のためのおよび一つはＣ９置換のための補償の穴を作るべ きである。炭素１０は、（ＦＫ５０６におけるヒドロキシル基に対して）炭素か ら 突出したＮ−アセチル基かまたはＮ−ホルミル基を有するように選択的に修飾さ れた。これらの誘導体の結合性は、これらＣ１０突起が天然のＦＫＢＰ１２に対 する結合を効果的に廃棄することを明らかに示している。図２１は、追加のＣ９ 突起を含むＦＫ５０６型残基の合成を図示する。本発明のリンカー残基を用いて このようなリガンドを組み立てることにより、補償突然変異を有する対応する結 合性ドメインを含むキメラタンパク質のためのＨＥＤおよびＨＯＤ（並びにアン タゴニスト）試薬を構築することができる。Ｃ９位およびＣ１０′位に修飾を有 する典型的なＨＥＤ試薬を図２１に示す。 本発明は、したがって、−ＯＲ、−Ｒ、−（ＣＯ）ＯＲ、−ＮＨ（ＣＯ）Ｈま たは−ＮＨ（ＣＯ）Ｒ（式中、Ｒは、置換または非置換のペルオキシドおよびカ ーボネートを含む直鎖、分岐状または環状であってよい置換または非置換のアル キルまたはアリールアルキルである）を含む官能基をＣ９位およびＣ１０位の一 方または両方に有するＦＫ５０６型残基を含むＦＫ５０６型化合物のクラスを包 含する。「ＦＫ５０６型残基」としては、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、並びにＦＫ ５０６の環構造の少なくとも（置換または非置換の）Ｃ２からＣ１５部分までを 維持していて且つ天然のまたは修飾ＦＫＢＰと、好ましくは約１０^-6Ｍ未満のＫ ｄ値で結合することができる合成または天然に存在するそれらの変種、類似体お よび誘導体（ラパマイシンを含む）がある。 本発明は、更に、本発明のリンカー残基に対して共有結合したこのようなＦＫ ５０６型化合物を一つまたはそれ以上含むホモ−およびヘテロ二量体並びに高次 オリゴマーを包含する。これらのＦＫ５０６型化合物のモノマーは、更に、リン カー残基に対して共有結合しているか否か、またはさもなければ対応するＦＫＢ Ｐに対するそれらの結合親和性を廃棄することなく修飾されているか否か興味が ある。このようなモノマー化合物は、オリゴマー化アンタゴニスト試薬として、 すなわち、同様のＦＫ５０６型化合物を基剤とするオリゴマー化試薬のアンタゴ ニストとして用いることができる。好ましくは、本発明による化合物およびそれ らを含むオリゴマーは、天然のまたは好ましくは突然変異体のＦＫＢＰに対して 少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも約１％、そしてなお一層好ましくは 、ＦＫＢＰ１２に対するＦＫ５０６の親和性と同程度の少なくとも約１０％の親 和 性で結合する。例えば、ホルト（Ｈｏｌｔ）ら、以下を参照されたい。 本発明のこれらのおよび他のリガンドの受容体ドメインは、構造に基づく、特 定部位のまたはランダムの突然変異誘発法によって得ることができる。本発明者 は、Ｃ９位および／またはＣ１０位に修飾を有するＦＫ５０６型およびＦＫ−５ ２０型リガンドの受容体ドメインとして、Ｔｙｒ２６、Ｐｈｅ３６、Ａｓｐ３７ 、Ｔｙｒ８２およびＰｈｅ９９の一つのまたはそれ以上の代わりにＶａｌ、Ａｌ ａ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔまたは他の小アミノ酸を有するＦＫＢＰ１２残基の系列を考 えている。特に、本発明者は、Ｃ１０位に置換基を有するＦＫ５０６型およびＦ Ｋ−５２０型リガンドに関連してＡｓｐ３７の代わりにＧｌｙまたはＡｌａなど の小置換を有するＦＫＢＰ（例えば、−ＮＨＣＯＲ、式中、Ｒはアルキル、好ま しくは例えばメチルなどの低級アルキルである；または−ＮＨＣＨＯ）およびＣ ９位に置換を有するＦＫ５０６型およびＦＫ−５２０型リガンドに関連してＰｈ ｅ３６、Ｐｈｅ９９およびＴｙｒ２６の代わりにＧｌｙまたはＡｌａなどの小置 換を有するＦＫＢＰ（例えば、オキサザリンまたはイミン）の使用を考えている 。 特定部位の突然変異誘発は、メガプライマー突然変異誘発プロコトル（例えば 、セイカー（Ｓａｋｅｒ）およびソマー（Ｓｏｍｍｅｒ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ ８ ４（１９９０）：４０４〜４０７を参照されたい）を用いて行な うことができる。ｃＤＮＡ配列順序決定は、シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓ ｅ）キットを用いて行なうことができる。突然変異体ＦＫＢＰ１２の発現は、大 腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＸＡ９０のプラスミドｐＨＮ１⁺において多数のＦＫ ＢＰ１２突然変異体が効率よく発現されたので、この系で行なうことができる。 突然変異体タンパク質は、便宜上、どこか他に記載されたように、ＤＥ５２陰イ オン交換樹脂での分別に続いてセファロースでのサイズ排除によって精製するこ とができる。例えば、アルデイプ（Ａｌｄａｐｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６７ ２３（１９９２）：１６０２９〜３２およびパーク（Ｐａｒｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６７ ５（１９９２）：３３１６〜３３２４を参照 されたい。結合定数は、二つの方法の内の一つによって容易に決定することがで きる。突然変異体ＦＫＢＰが十分なロタマーゼ活性を維持している場合、標準的 なロタマーゼ検定を用いることができる。例えば、ガラト（Ｇａｌａｔ）ら、Ｂ ｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１ （１９９２）：２４２７〜２４３４を参照されたい。他 には、突然変異体ＦＫＢＰ１２は、本発明者が前にＦＫＢＰおよびシクロフィリ ンについて用いたＬＨ２０樹脂並びに放射性標識された³Ｈ₂−ジヒドロＦＫ５０ ６および³Ｈ₂−ジヒドロＣｓＡを用いる結合検定に供することができる。ビアラ ー（Ｂｉｅｒｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７ ４（１９９３）：５５５〜６９。（Ｂ）酵母二雑種系を用いる突起−ＦＫ５０６のためのＦＫＢＰ１２における補 償突然変異の選択 ＦＫＢＰ１２を含む受容体タンパク質またはドメインの変種を得るための一つ のアプローチは、酵母「二雑種」または「相互作用トラップ」系である。二雑種 系は、互いに相互作用するタンパク質を検出するのに用いられてきた。転写活性 化ドメインに対して融合した標的タンパク質から成る「餌（ｂａｉｔ）」融合タ ンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインに対して融合した可能な「釣針（ｈｏｏｋｓ） 」のｃＤＮＡライブラリーと同時発現される。タンパク質−タンパク質（餌−釣 針）相互作用は、その合成にＤＮＡ結合および活性化ドメインの結合を必要とす る受容体遺伝子産物の発現によって検出される。ここに記載の酵母二雑種系は、 エレジ（Ｅｌｌｅｄｇｅ）および共同研究者によって最初に開発された。ダーフ ィー（Ｄｕｒｆｅｅ）ら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７ ４（ １９９３）：５５５〜６９およびハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ ７５ ４（１９９３）：８０５〜８１６。 二雑種系だけでは小分子有機リガンドに関係した受容体−リガンド相互作用を 洞察することができないので、本発明者は、新規のＦＫ１０１２誘導転写活性化 系（以下に論及される）を開発した。その系を用いると、小分子（例えば、本発 明のＦＫ５０６若しくはＦＫ１０１２またはＦＫ５０６型分子）を研究すること ができるように二雑種系を拡大することができる。最初に、ＦＫ５０６のＣ９お よびＣ１０を取り囲む部位に局在している突然変異によって突然変異体ＦＫＢＰ （釣針）のｃＤＮＡライブラリーを作成する。餌には、二つの異なる方策を遂行 することができる。第一は、ＦＫＢＰ１２に対して結合し且つカルシニューリン に結合する複合表面を作るＦＫ５０６の能力を用いる。配列特異的転写活性化因 子は、したがって、ＤＮＡ結合ドメイン−突然変異体ＦＫＢＰ１２−突起ＦＫ５ ０６−カルシニューリンＡ−活性化ドメイン（−は非共有結合相互作用を意味す る）から成る。第二の方策は、二つのＦＫＢＰに対して同時に結合するＦＫ１０ １２の能力を用いる。ＦＫ１０１２のＨＥＤ変種は、以下のアンサンブル、すな わち、ＤＮＡ結合ドメイン−突然変異体ＦＫＢＰ１２−突起ＦＫ５０６−正常Ｆ Ｋ５０６−野生型ＦＫＢＰ１２−活性化ドメインをスクリーニングするのに用い ることができる。 １．餌としてのカルシニューリン−Ｇａｌ４活性化ドメイン融合： Ｇａｌ４活性化ドメインおよびカルシニューリンＡサブユニット融合構築物を 含むｐＳＥ１１０７の誘導体を構築した。提案された様式で餌として働くその能 力は、二雑種系を用いてカルシニューリンのＦＫＢＰ−ＦＫ５０６結合部位を作 図する研究によって確証された。 ２．餌としてのｈＦＫＢＰ１２−Ｇａｌ４活性化ドメイン融合： ｈＦＫＢＰ１２ｃＤＮＡは、完全長さｈＦＫＢＰ−Ｇａｌ４活性化ドメインタ ンパク質融合を生じるようにブラント末端付きで且つｐＳＥ１１０７のブラント 末端付きＸｈｏＩ部位に連結した完全な読み取り枠を包含するＥｃｏＲＩ−Ｈｉ ｎｄＩＩＩフラグメントとして作成することができる。 ３．突然変異体ｈＦＫＢＰ１２ｃＤＮＡライブラリー ｈＦＫＢＰ１２は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、ブラン トにし、そしてＮｃｏＩによって切断され且つブラントにされたｐＡＳ１（ダー フィーら、上記）にクローン化することができる。このプラスミドは、更に、Ｎ ｄｅＩで消化されて、ｐＡＳ１のポリリンカー配列中のＮｄｅＩ部位とｈＦＫＢ Ｐ１２の５′末端との間のＮｄｅＩフラグメントを除去し、そして再度連結され る。これは、ｈＦＫＢＰ１２−Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインタンパク質融合を 生じた。ｈＦＫＢＰは、プライマー♯１１２０６および♯１１２１０によって再 増幅された。 プライマー表： 補償突然変異をスクリーニンクするのに用いるための局在し たｈＦＫＢＰ１２ｃＤＮＡライブラリーの構築に用いられたプライマー。 次に、ポリメラーゼ連鎖反応によって一定の位置にｈＦＫＢＰのランダム化さ れた突然変異体配列を有する以下に記載のプライマーを用いて突然変異体ｈＦＫ ＢＰ１２ｃＤＮＡフラグメントを製造し、そしてそれをＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメ イン−ｈＦＫＢＰ（ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ）構築物中に挿入した。 ４．酵母菌株 Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙ１５３は、ゲノム中に組込まれ且 つＧａｌ４プロモーターによって作動される二つの選択可能なマーカー遺伝子（ ｈｉｓ３／β−ガラクトシダーゼ）を有する。（ダーフィー、上記。）カルシニューリン−Ｇａｌ４活性化ドメインの餌としての使用 ＦＫＢＰ１２−ＦＫ５０６複合体は、２Ｂ型タンパク質ホスファターゼである カルシニューリンに対して高親和性によって結合する。本発明者はＣ９−および Ｃ１０−突起付きリガンドを用いて二雑種系の架橋として役立てるので、補償突 然変異を含むｃＤＮＡライブラリーからのそれらのＦＫＢＰのみが転写活性化因 子を生じる。便宜上、８，０００個の突然変異体ＦＫＢＰ１２をそれぞれ含む少 なくとも３種類の異なるライブラリーを（プライマー表のプライマー１１２０７ 〜１１２０９を用いて）製造することができる。ランダム化された部位は、ＦＫ ＢＰ１２−ＦＫ５０６構造を調べることによって選択され、突起付きＦＫ５０６ 上の障害性Ｃ９またはＣ１０置換基が突然変異によって結合しうるかもしれない 残基群が示唆された。次に、Ｃ９−およびＣ１０−突起付きＦＫ５０６両方を用 いてライブラリーを個々にスクリーニングした。突起付きＦＫ５０６と補償ｈＦ ＫＢＰ突然変異体との相互作用は、宿主酵母がその脱落培地上で増殖する能力に よっておよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現によって検出することができる 。この選択は突起付きＦＫ５０６の存在に依るので、突起付きＦＫ５０６リガン ドが補足されているまたはされていないレプリカプレートを用いる消去スクリー ニングによって偽陽性を排除することができる。ｈＦＫＢＰ１２−Ｇａｌ４活性化ドメインの餌としての使用 ｈＦＫＢＰ１２突然変異体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための カルシニューリンＡ−Ｇａｌ４活性化ドメインの使用は、ＦＫＢＰ１２上の補償 突然変異を識別する簡単な方法である。しかしながら、突起付きＦＫ５０６がｈ ＦＫＢＰ１２を結合するようにさせる突然変異は、突然変異体ＦＫＢＰ１２−突 起付きＦＫ５０６複合体とカルシニューリンとの相互作用を破壊することがある 。餌としてカルシニューリンを用いる最初のスクリーニングが失敗した場合、野 生型ｈＦＫＢＰ１２−Ｇａｌ４活性化ドメインを代わりに用いる。天然ＦＫ５０ ６−突起付きＦＫ５０６から成るＦＫ１０１２ＨＥＤ試薬（図１６）を合成し且 つ釣針として用いることができる。ＦＫ１０１２のＦＫ５０６残基はＦＫＢＰ１ ２−Ｇａｌ４活性化ドメインを結合することができる。ＦＫ１０１２の突起付き ＦＫ５０６残基とＦＫＢＰ１２の補償突然変異体との相互作用は、宿主酵母がそ の脱落培地で増殖することおよびβ−ガラクトシダーゼを発現することを可能に する。この方法において、選択は、突起付きＦＫ５０６と相互作用するｈＦＫＢ Ｐ１２突然変異体の能力にのみ基づく。同様の消去スクリーニング法を用いて偽 陽性を排除することができる。 初めに論及されたインビトロ結合検定の他に、インビボ検定を用いて、補償ｈ ＦＫＢＰ１２突然変異体に対する突起付きＦＫ５０６の結合親和性を決定するこ とができる。酵母二雑種系において、β−ｇａｌ活性は、「餌」と「獲物」との 相互作用の程度によって決定される。例えば、突起付きＦＫ５０６と補償ＦＫＢ Ｐ１２突然変異体との親和性は、異なるＨＥＤ（天然ＦＫ５０６−突起付きＦＫ ５０６）濃度において宿主酵母によって生じた対応するβ−ガラクトシダーゼ活 性によって概算しうる。 同様の方策を用いると、更に別のランダム化された突然変異体ＦＫＢＰ１２ｃ ＤＮＡライブラリーを、鋳型として低親和性補償ＦＫＢＰ１２突然変異体を用い る他の突起接触残基において作成することができるし且つ同様にスクリーニング することができる。高親和性補償ＦＫＢＰ突然変異についてのファージ表示スクリーニング 突起ＦＫ５０６の若干の高親和性ｈＦＫＢＰ１２突然変異体は、タンパク質の 別々の部分にいくつか組合わされた点突然変異を有することがある。適当に組み 合わされた突然変異を有するライブラリーの大きさは、酵母二雑種系の容量（例 えば、＞１０⁸の突然変異）に対して大きすぎることがある。機能性タンパク質 全体を暴露するための伝達体としてのバクテリオファージの使用は、多数の突然 変異をスクリーニングするための容量を大きく増大させるはずである。例えば、 バス（Ｂａｓｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏ ｎ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８ ４（１９９０）：３０９〜１４；マカファティ ー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８ ６３０１（１９９０） ；５５２〜４；およびフーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）、Ｎｕｃｌ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９ １５（１９９１）：４１３３〜７を参照されたい。所 望の高親和性補償突然変異体が酵母二雑種系によって識別されない場合、多数の 組み合わせの突然変異は、ファージベクターを担体として用いてｈＦＫＢＰ１２ 上で生じることができる。突然変異体ｈＦＫＢＰ１２融合ファージは、親和性基 質として突起付きＦＫ５０６−セファロースを用いてスクリーニングすることが でき、それは本発明者の最初のＦＫ５０６基剤親和性基質を類推して合成するこ とができる。フレッツ（Ｆｒｅｔｚ）ら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１３ ４（１９９１）：１４０９〜１４１１。結合およびファージ増幅の繰り返しは 、高親和性補償突然変異体の識別をもたらすはずである。（Ｃ）「突起付き（ＣｓＡ）２ｓ」の合成：ＭｅＶａｌ（１１）ＣｓＡの修飾 上記に詳述されたように、本発明者は、細胞死シグナリング経路の文脈中の二 量体化ドメインとしてシクロフィリンおよびＨＯＤ試薬として（ＣｓＡ）２を用 いる可能性を実証した。しかしながら、（ＣｓＡ）２試薬の細胞活性を更に最適 にするためには、ＦＫ１０１２について記載されたのと同様の方策に頼ることが できる。したがって、修飾された（突起付き）ＣｓＡ基剤オリゴマー化試薬は、 その試薬が、人工的タンパク質構築物であるその標的を内因性シクロフィリンと 区別しうることが特に望まれる用途において好適であるはずである。 本発明の修飾されたＣｓＡ誘導体の一つのクラスは、（ａ）ＮＭｅＶａｌ１１ がＮＭｅＰｈｅ（置換されていてよいしまたは非置換であってよい）またはＮＭ ｅＴｈｒ（非置換であってよいしまたはトレオニンβヒドロキシル基に置換され ていてよい）で置換されている、或いは（ｂ）ＮＭｅＶａｌ１１のプロ−Ｓメチ ル基が、直鎖状、分岐状であってよいおよび／または環状残基を含んでいてよい し且つアルキル（エチル、または好ましくはプロピル、ｔ−ブチルを含むブチル 等）、アリールまたはアリールアルキルであってよい少なくとも２個の炭素原子 、好ましくは３個またはそれ以上を有する嵩高基によって置換されているＣｓＡ 類似体である。これらの化合物としては、ＭｅＶａｌ１１の代わりにＭＮｅＬｅ ｕ、ＮＭｅＩｌｅ、ＮＭｅＰｈｅまたは特に人工的なＮＭｅ［βＭｅＰｈｅ］を 有するそれらのＣｓＡ類似体がある。「（ｂ）」ＣｓＡ化合物は、Ｒが上記で論 及された官能基である式２を有する。 本発明は、更に、１種類またはそれ以上のこのようなＣｓＡ類似体を有するホ モ−およびヘテロ二量体並びに高次オリゴマーを包含する。好ましくは、本発明 による化合物およびそれらを含むオリゴマーは、天然のまたは好ましくは突然変 異体のシクロフィリンタンパク質に対して少なくとも０．１％、好ましくは少な くとも約１％、そしてなお一層好ましくは、シクロフィリンに対するＣｓＡの親 和性と同程度の少なくとも約１０％の親和性で結合する。 二段階方策を用いて、ＣｓＡから出発する修飾［ＭｅＶａｌ¹¹］ＣｓＡ誘導体 を製造することができる。第一段階において、残基ＭｅＶａｌ１１をマクロ環か ら除去する。第二段階において、選択されたアミノ酸を（前の）ＭｅＶａｌ１１ 部位に導入し、そして直鎖状ペプチドを環化させる。この方策の利点は、全体の 合成と比較していくつかの修飾［ＭｅＶａｌ¹¹］ＣｓＡ誘導体が容易に得られる ことである。合成スキームは以下の通りである。 アミド結合を区別するために、ＭｅＢｍｔ１からのアミノ基とヒドロキシル基 との間にＮ，Ｏシフトを達成させてイソＣｓＡを生じる（ルーガー（Ｒｕｅｇｇ ｅｒ）ら、Ｈｅｌｖ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ５９ ４（１９７６）：１０７５〜 ９２）（上記スキームを参照されたい）。反応は、メタンスルホン酸存在下のＴ ＨＦ中において行なわれた。（オリヤイ（Ｏｌｉｙａｉ）ら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅ ｓ ９ ５（１９９２）：６１７〜２２）。遊離アミンを、ワンポット法におい てピリジンおよび無水酢酸を用いてアセチル基で保護した。Ｎ−アセチル保護さ れたイソＣｓＡの全収率は９０％である。次に、エステルＭｅＢｍｔ１−ＭｅＶ ａｌ１１結合を、Ｎ−メチルアミド結合の存在下において、例えば、ＤＩＢＡＬ −Ｈを用いて選択的に還元する。次に、得られたジオールを、別の酸に誘導され たＮ，Ｏシフトによって対応するジエステルに変換する。これは、水性塩基によ る新たに生成されたエステルの加水分解によって除去されるＮ−アセチル基およ びＭｅＶａｌ１１残基両方を製造する。 遊離アミノ基を保護した後、新規のアミノ酸残基を、例えばＰｙＢｒｏｐカッ プリング試薬によって導入する。ＤＭＡＰ存在下においてＢＯＰを用いる直鎖状 ペプチドの脱保護および環化（アルバーグ（Ａｌｂｅｒｇ）およびシュライバー （Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２ ５１３１（１９９３）：２ ４８〜２５０）は２の合成を完成させる。シクロフィリンに対する突起付きＣｓ Ａの結合は、ＦＫ５０６およびＦＫ１０１２について記載されたのと同様の方法 によって評価することができる。シクロフィリンが補償突然変異によっていった ん識別されると、突起付き（ＣｓＡ）２ＨＥＤおよびＨＯＤ試薬は前に論及され た方法にしたがって合成することができる。特に興味深いのは、シクロフィリン タンパク質に対して１：２の化学量論的量でそれ自体結合することができる二量 体を形成することができる突起付きＣｓＡ化合物である。少なくとも一つのこの ようなＣｓＡまたは修飾ＣｓＡ残基を含むホモ二量体および高次ホモオリゴマー 、ヘテロ二量体およびヘテロ高次オリゴマーは、ＦＫ１０１２Ａおよび（ＣｓＡ ）２に対して開発された方法によって設計され且つ評価されることができ、しか もＦＫ１０１２研究を類推してリンカー要素を最適にしうる。 リガンド上に余分の嵩を与えることによって本発明の１１位ＣｓＡ変種（２） を結合する突然変異体シクロフィリンをここで製造することができる。これらの 補償突然変異を有するシクロフィリンは、ＦＫ１０１２研究で記載された構造に 基づく特定部位のおよびランダムの突然変異誘発／スクリーニングプロトコルに よって識別することができる。 上記結果から、本方法および組成物が広範囲の目的のための細胞の生産におい て大きな有用性を与えることは明らかである。本構築物を用いることにより、細 胞が必要とされるまで不活性の状態のままであって、そして次に安全な薬剤の投 与により活性化することができる場合、その細胞を治療目的に用いることができ る。宿主中における細胞の寿命は広範囲でありうるので、短期または長期の保護 を与えるように、慢性および急性両方の徴候を治療する機会がある。更に、治療 効果を与えることができる解剖学的部位または機能性部位などの特定部位に対し て向けられる細胞を提供することができる。 欠陥を訂正する若しくは細胞溶解性細胞の活性化などの望ましくない結果を阻 害する、有害物質を失活させる、限定された細胞集団を死滅させるまたは類似の ことに役立ちうる広範囲のタンパク質の分泌を引き起こす細胞を提供することが できる。宿主中に一定期間にわたって存在する細胞を有することにより、細胞は 、宿主において細胞の急速な反応を引き起こすことができる用量で薬剤を摂取す ることによって容易に活性化されうる。発現されたキメラ受容体が細胞内である 細胞を提供することができ、細胞表面上の外来タンパク質による免疫応答はすべ て回避される。更に、細胞内キメラ受容体タンパク質は、リガンド結合による有 効なシグナル変換を、細胞外受容体ドメインにおける受容体結合よりも明らかに 効率よく与える。 キメラ膜結合受容体に対して結合して目的の生産物の発現を引き起こすまたは 生産物の発現を阻害する比較的単純な分子を用いることにより、細胞性の治療的 処置を提供することができる。投与しうる化合物は安全であり、種々の方法で投 与することができ、そしてホメオスタシスを混乱させないように極めて特異的な 反応を確実にすることができる。 本明細書中に引用された刊行物および特許出願はいずれも、個々の刊行物およ び特許出願がそれぞれ具体的に且つ個々に援用されることになっていたかのよう に本明細書中に援用される。 前述の発明は、理解を明確にするために例証および実施例によって若干詳細に 記載されたが、本発明の内容を考慮すれば、添付の請求範囲の精神または範囲を 逸脱することなく若干の変更および修正を行なうことができるということは当業 者に容易に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１６１７ (32)優先日 1994年２月14日 (33)優先権主張国 世界知的所有権機構（ＷＯ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クラブトリー，ジェラルド・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94062, ウッドサイド，ダーラム・ロード ７ (72)発明者 シュレイバー，スチュアート・エル アメリカ合衆国マサチューセッツ州02138, ケンブリッジ，オックスフォード・ストリ ート 12，ハーバード・ユニバーシティ, デパートメント・オブ・ケミストリー (72)発明者 スペンサー，デービッド・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州94022, ロス・アルトス，イースト・エディス・ア ベニュー 115 (72)発明者 ワンドレス，トーマス・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02138, ケンブリッジ，オックスフォード・ストリ ート 12，ハーバード・ユニバーシティ, デパートメント・オブ・ケミストリー (72)発明者 ベルショー，ピーター アメリカ合衆国マサチューセッツ州02138, ケンブリッジ，オックスフォード・ストリ ート 12，ハーバード・ユニバーシティ, デパートメント・オブ・ケミストリー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物であって、 （ａ）ある選択されたリガンドに対して結合することができる少なくとも一つ の受容体ドメイン、および （ｂ）該キメラタンパク質を含む細胞中において、該リガンドに対する該細胞 の暴露後にアポトーシスを開始することができる異種タンパク質ドメインを含み 、該リガンドが２個またはそれ以上のキメラタンパク質分子に対して結合するこ とができるＤＮＡ構築物。 ２． 前記キメラタンパク質が、所望の細胞内コンパートメントに対して該キ メラタンパク質を向けることができる細胞内標的集中性ドメインを更に含む請求 項１に記載のＤＮＡ構築物。 ３． 前記細胞内標的集中性ドメインが、分泌リーダー配列、膜スパニングド メイン、膜結合ドメイン、またはタンパク質が小胞若しくは核と結合するように 支配する配列を含む請求項２に記載のＤＮＡ構築物。 ４． 前記キメラタンパク質の該選択されたリガンドに対して結合するための Ｋｄ値が約１０^-6Ｍであるかまたはそれ未満である請求項１に記載のＤＮＡ構築 物。 ５． 前記選択されたリガンドの分子量が約５ｋＤａ未満である請求項１に記 載のＤＮＡ構築物。 ６． 前記異種タンパク質ドメインが、ヒトＦａｓまたはヒトＴＮＦα受容体 の細胞質ドメインを含む請求項１に記載のＤＮＡ構築物。 ７． 前記キメラタンパク質が、ＦＫ５０６型リガンド、シクロスポリンＡ型 リガンド、テトラサイクリンまたはステロイドリガンドに対して結合することが できる請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。 ８． 請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ構築物並びに該ＤＮＡ構築物の 宿主細胞中へのトランスフェクションおよび該構築物を含むトランスフェクタン トの選択を可能にする選択可能なマーカーを含むＤＮＡベクター。 ９． 前記ベクターがウイルスベクターである請求項８に記載のＤＮＡベクタ ー。 １０．アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターまたはレトロウ イルスベクターである請求項９に記載のウイルスベクター。 １１．請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ構築物によってコードされたキ メラタンパク質。 １２．請求項１〜７のいずれかに記載の少なくとも一つのＤＮＡ構築物を含み 且つ発現することができる細胞。 １３．前記選択されたリガンドとの接触後にアポトーシスするようになり且つ 死滅する請求項１２に記載の細胞。 １４．哺乳動物細胞である請求項１２に記載の細胞。 １５．（ａ）（ｉ）第二の選択されたリガンドに対して結合することができる 少なくとも一つの受容体ドメインおよび（ｉｉ）該受容体ドメインに関して異種 であるが一つ若しくはそれ以上の他の同様のドメインとのオリゴマー化によって 、該オリゴマー化に対して反応性の転写制御要素の転写制御下の標的遺伝子の転 写の活性化を引き起こすことができるもう一つのタンパク質ドメインを含むキメ ラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物；並びに （ｂ）該オリゴマー化に対して反応性の転写制御要素の発現制御下の標的遺伝 子 を更に含み且つ該第二の選択されたリガンドに対する細胞の暴露後に該標的遺伝 子を発現することができる請求項１３に記載の細胞。 １６．（ａ）ＤＮＡ結合ドメインおよび第一の選択されたリガンド残基に対し て結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインを含む第一の追加のキ メラタンパク質；および （ｂ）転写活性化ドメインおよび第二の選択されたリガンド（第一の選択され たリガンド残基と同じであってよいしまたは異なっていてよい）に対して結合す ることができる少なくとも一つの受容体ドメインを含む第二の追加のキメラタン パク質 をコードしている一連のＤＮＡ構築物；並びに 該ＤＮＡ結合ドメインと結合し且つ該転写活性化ドメインに対して反応性であ る異種転写制御配列の転写制御下の標的遺伝子をコードしている第二のＤＮＡ構 築物を含む請求項１３に記載の細胞であって； 一つまたは複数の該選択されたリガンド残基を含む物質に対する暴露後に該標 的遺伝子を発現する上記細胞。 １７．請求項１３に記載の遺伝子工学処理された細胞集団を除去する薬剤組成 物を製造するための、該細胞によってアポトーシスを開始することができるリガ ンドであって、式 リンカー−｛ｒｂｍ₁，ｒｂｍ₂，．．．ｒｂｍ_n｝ （式中、ｎは２〜約５の整数であり、ｒｂｍ₍₁₎〜ｒｂｍ_(n)は、同じであってよ いしまたは異なっていてよいし且つ一つまたは複数のキメラタンパク質に対して 結合することができる受容体結合残基であり、該ｒｂｍ残基は、２個またはそれ 以上のｒｂｍ残基に対して共有結合（「−」）することができる二官能性または 多官能性分子であるリンカー残基に対して共有結合している） を有する上記リガンドの使用。 １８．前記リガンドの分子量が約５ｋＤａ未満である請求項１７に記載の遺伝 子工学処理された細胞集団を除去する薬剤組成物を製造するためのリガンドの使 用。 １９．前記リガンドがＦＫ５０６型残基、シクロスポリン型残基、ステロイド またはテトラサイクリンを含む請求項１７に記載の遺伝子工学処理された細胞集 団を除去する薬剤組成物を製造するためのリガンドの使用。 ２０．前記リガンドが、約１０^-5Ｍより大のＫｄ値によって天然に存在する受 容体に対して結合している請求項１７に記載の遺伝子工学処理された細胞集団を 除去する薬剤組成物を製造するためのリガンドの使用。 ２１．前記リガンドが、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ラパマイシン、またはそれ らのＣ９位、Ｃ１０位若しくは両方に修飾された誘導体の分子を含む請求項１７ に記載の遺伝子工学処理された細胞集団を除去する薬剤組成物を製造するための リガンドの使用。 ２２．前記リガンドが、Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン残基、Ｃ４〜Ｃ１８アザアル キレン残基、Ｃ６〜Ｃ２４ Ｎ−アルキレンアザアルキレン残基、Ｃ６〜Ｃ１８ アリーレン残基、Ｃ８〜Ｃ２４アルジアルキレン残基またはＣ８〜Ｃ３６ビスカ ルボキサミドアルキレン残基を含むリンカー残基を有する請求項２０に記載の遺 伝子工学処理された細胞集団を除去する薬剤組成物を製造するためのリガンドの 使用。 ２３．キメラタンパク質に対して結合することができるリガンドに対して、細 胞死の開始を引き起こす有効量で細胞を暴露させることを含む請求項１３に記載 の遺伝子工学処理された細胞集団を除去する方法。 ２４．前記細胞を培地中で増殖させ且つ暴露を該培地に対して前記リガンドを 加えることによって行なう請求項２３に記載の方法。 ２５．前記細胞が宿主生物中に存在し且つ暴露を該宿主生物に対して前記リガ ンドを投与することによって行なう請求項２３に記載の方法。 ２６．前記宿主生物が哺乳動物であり、そして前記リガンドを経口投与、口腔 内投与、舌下投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、関節内投与 または吸入投与によってそれらに適当なビヒクル中で投与する請求項２５に記載 の方法。 ２７．請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を宿主細胞中に導入する ことを含む、選択的に死滅させることができる細胞を製造する方法。 ２８．導入されたＤＮＡ構築物を含む前記細胞を選択することを更に含む請求 項２７に記載の方法。 ２９．請求項１〜７のいずれかに記載の少なくとも一つのＤＮＡ構築物を含む キット。 ３０．一つまたは複数のＤＮＡ構築物によってコードされた一つまたはそれ以 上のキメラタンパク質が結合しているリガンドを更に含む請求項２９に記載のキ ット。 ３１．リガンド−キメラタンパク質結合に対するアンタゴニストとしてモノマ ー性リガンド試薬を更に含む請求項２９に記載のキット。 ３２．請求項１２〜１６のいずれかに記載の細胞を含む宿主生物。 ３３．植物または動物である請求項３２に記載の宿主生物。 ３４．蠕虫、昆虫または哺乳動物である請求項３３に記載の動物。 ３５．ネズミ若しくは他の齧歯類動物またはヒトである請求項３４に記載の哺 乳動物。