CZ8496A3 - Regulovaná apoptóza - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká materiálů, metod a použiTív^, týkajících se oligomerace chimerních proteinů s dimerní nebo multimerní, výhodně nepeptidickou organickou molekulou. Aspekty vynálezu jsou znázorněny příklady rekombinantních modifikací hostitelských buněk a jejich použitím v genové terapii nebo jiných aplikacích vyvolávajících genovou expres i .

Dosavadní stav techniky

Biologická specifita obvykle vzniká z vysoce specifických interakcí mnoha proteinů. Jako příklad tohoto principu je možno uvést signání transdukci, proces pří kterém extracelulární molekuly ovlivňují intracelulární vztahy.

Mnohé z drah pocházejí z vazby extracelulárních ligandů k receptorúm buněčného povrchu. V mnoha případech vede receptorová dimerizace ke transfosforylaci a posílení proteinu tak, že pokračuje signální kaskáda. Domněnka, že membránové receptory by mohly být aktivovány homodimerizací vznikly z pozorování, že receptory by mohly být aktivovány protilátkami, které křížově spojují dva receptory. Následně bylo nalezeno mnoho receptorů, které se podílejí na těchto vlastnostech. Extracelulární a transmembránové regiony mnoha receptorů jsou považovány za funkční při přenosu cytop 1asmických domén receptorů v těsné podobnosti na ligandu závislou dimerizací nebo oligomeri žací, protože cytoplasmické domény receptoru vedou specifické signály ke vnitřním prostorům buněk.

z

V dalších pracech byly hodnoceny 1igand-receptorové interakce v různých systémech. Například Clark a spol. Science (1992) 258, 123 popisuje cytoplasmické efektory B-buněčného antigen receptorového komplexu. Durand a spol. Mo1.Cel 1.Bio 1. (1988)8, 1715, Verweij a spol.,

J.Biol.Chem. (1990)265, 15788 a Shaw a spol., Science (1988)241, 202 uvádějí, že NF-AT-řízená transkripce je rigorózně pod kontrolou antigen receptoru. Inhibice NF-AT-řízené transkripce cyclosporinem A a FK506 je popsána Emmě 1em a spol., Science (1989), 246, 1617 a Flanaganem a spol., Nátuře (1991) 352, 803. Durand a spol., Mo1.Cel 1.Bio 1. (1988) 8, 1715 a Mattila a spol., EMBO J.(1990), 9, 4425 popisují NF-AT vazebná místa. Reference, popisující řetězec, zahrnují práce Orlova a spol., Nátuře(1990)347, 189-191;

Kinet a spol. Cell (1989) 57,' 351-354; Weisman a spol.,

Proč.Nat1.Acad.Sci. USA (1988)85,9709-9713 a Lanier, Nátuře (198) 342, 803-805. CD4 imunoadhesin je popsán Byrnem a spol. Nátuře (1990), 344, 667-670. CD8-zeta fúzovaný protein je popsán Irvingem a spol., Cell (1992), 64, 891. Viz také Letourner a Klausner, Science (1992) 255, 79.

Ilustrativní články, popisující transkripční faktorovou asociaci s promotorovými reginony a oddělenou aktivaci a DNA vazbu transkripčních faktorů zahrnují: Keegan a spol., Nátuře (1986) 231, 699; Fields a Song, ibid (1989) 340, 245; Jones,

Cell (1990) 61, 9; Lewin, Cell (1990) 61, 1161;Ptashne a gann, Nátuře (1990) 346, 329; Adams a Workman, Cell (1993)

72, 306.

Ilustrativní články popisující vesiklové cílení a fúzi zahrnují: Sollner a spol. (1993) Nátuře 362, 318-324 a

Bennett a Schellere (1993) Proč.Nat1.Acad.Sci.USA 90,

2559-2563 .

Ilustrativní články, popisující proteinovou degradaci zahrnují: Hochstrasser a spol., (1990) Cell 61, 697;

Scheffner M. a spol. (1993) Cell 75, 495, Rogers a spol. (1986) Science 234, 364-368.

Ilustrativní publikace poskytující další informace, týkající se syntézních technik a modifikaci ve vztahu k FK506 a příbuzných sloučenin zahrnují: GB 2244991 A; EP 0455427 Al; WO 91/17754; EP 0465426 Al; US 5023263 a WO 92/00278.

Ilustrativní články, týkající se Fas antigenu, p55 TNF receptorů (dále jako TNF receptor) a/nebo apoptosy, zahrnují: Itoh a spol.(1991) Cell 66, 233-243; Nagata a spol., evropská patentová publikace č. 510691 (1992); Suda a spol. Cell (1993), 75(6), 1169-78; Oehm a spol., J.Biological Chem. (1992) 267(15), 10709-10715; a Wong a Goeddel,

J.Immunol (1994), 152(4), 1751-5.

Ilustrativní diskuse metod a materiálů pro genovou terapii e nachází v Kapitole 26, Watson, Gilman, Witkowski a Zoller, RECOMBINANT DNA, 2.vydání (WH Freeman and Co, 1992) a v odpkazech citovaných v bibliografi i i, zejména na str. 564-565.

Nicméně jak bude zřejmé z tohoto popisu, žádný z předchozích autorů nepopisuje nebo nenaznačuje předložený vynález. Náš vynález, který bude dále podrobně popsán, zahrnuje obecně aplikovatelnou metodu a materiály pro použití proteinové homodimerízace, heterodimerizace a oligomerízace v žijících buňkách. (Jak jsou zde použity, zahrnují výrazy oligomer, oligomerizovat a o 1 igomerizace dimery, trimery a řádově vyšší oligomery a jejich formace). Chimérní odpovídající proteiny jsou intracelulárně exprimovány jako fuzní proteiny se specifickou receptorovou doménou.Ošetření buněk s pro buňky permeabilním multivalentním ligandovým činidlem, které se váže k receptorové doméně vede k dimerizaci nebo oligomerizaci chiméry. Analogicky k jiným chimérním receptorům (viz např. Weiss, Cell (1993) 73, 209), jsou chimérní proteiny vytvářeny tak, že oligomerozace spouští buněčnou smrt a v určitých provedeních popřípadě jiné požadované následné kroky, např. propagaci intracelulárního signálu přes následné interakce protein-protein a tím aktivaci specifické podskupiny transkripčních faktorů.

Počátek transkripce může být detegován použitím zkoušky reporter-genu. Intracelulární zesítění chimerních proteinů syntetickými ligandy má využití v základním hodnocení různých celulárních procesů, v regulovatelné iniciaci buněčné smrti v opracovaných buňkách a v regulaci syntézy proteinů, které jsou terapeuticky nebo agrikulturně důležité. Dále ligandem zprostředkovaná oligimerizace nyní umožňuje řízenou genovou terapii. Poskytuje značný posun ve zvýšení bezpečnosti, expresní hladiny a obecně účinnosti získané s genovou terapi i.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje materiály a metody pro genetický inženýring hostitelských buněk proto, aby buňky a jejich potomstvo byly náchylné, řízeným způsobem, k programované buněčné smrti (apoptosis). Tento vynález je vhodný jako prostředek pro eliminaci populace opracovaných buněk,které rostou v kultuře in vivo a tak poskytují, inter alia, mechanismus zajištěný pro případ selhání u geneticky inženýrovaných buněk použitých v genové terapii. Vynález zahrnuje nové chimérní (nebo fúzované) proteiny, DNA konstrukty, které je kódují a ligandové molekuly schopné o 1igomerizace chimérních proteinů. Chimerní proteiny obsahují alespoň jednu 1 igand-vázající (nebo receptor)doménu fúzovanou k akční doméně schopné iniciace apoptosis v buňce, jak je detailně popsáno dále. Jak bude také popsáno, mohou chimerní proteiny také obsahovat další domény. Tyto chimérní proteiny jsou rekombinantní v tom smyslu, že různé domény jsou odvozeny z různých zdrojů a jako takové nejsou společně v přírodě nacházeny (tj. jsou heterologní).

Tento vynález poskytuje DNA molekuly (konstrukty), které kódují nové chimerní proteiny a které mohou být použity pro genetické zpracování hostitelských buněk. Tyto konstrukty jsou rekombinantní ve smyslu, že podíly kompotent, např. kódující jednotlivou doménu nebo e.xpresi řídící sekvenci, nebyly nalezeny přímo vzájemně spojené v přírodě. Jsou také poskytnuty metody a kompozice pro produkci a použití modifikovaných buněk. Pro produkvi módifikovaných buněk se do hostitelských buněk zavede DNA, kódující požadovanou chimeru(y). Toto může být provedeno za použití konvenčních vektorů (různé z nich jsou komerčně dostupné) a technik. Je-li to žádoucí, mohou pak být modifikované buňky selektovány, odděleny od jiných buněk a kultivovány, opět konvenčními metodami.

01igomerizující ligandy vhodné pro provedení vynálezu jsou schopné se vázat ke dvěma (nebo více) receptorovým doménám.tj. ke dvěma nebo více chimérním proteinům, obsahujícím takové receptorové domény. 01igomerizující ligand může být vázán k chiméře bud po sobě nebo současně, výhodně s Kd hodnotou pod asi 10 ^_6, výhodněji pod asi 10~⁷, a ještě výhodněji pod asi 10^-8 a v některých provedeních pod asi 10^-9M. Ligand výhodně není protein a má molekulovou hmotnost menší než asi 5 kDa. Receptorové domény takto o 1 igomerizovaných chimérních proteinů mohou být stejné nebo rozdílné. Chimérní proteiny jsou schopny iniciace apoptosy svých hostitelských buněk po vystavení ligandu, tj. po o 1 igomerizaci chiméry. Apoptosis geneticky zpracovaných buněk podle vynálezu se objevuje po vystavení buněk ligandu schopnému o 1igomerizace chiméry. Uvedené rozdílně geneticky zpracované buňky podle tohoto vynálezu obsahují chimérní proteiny jak popsáno výše a odpovídají na přítomnost ligandu, který je schopen oligomerizovat tyto chiméry. Tato odpovídavost je manifestována iniciací buněčné smrti.

Kódovaný chimérní protein může dále obsahovat intracelulární cílovou doménu schopnou řízení chimérného proteinu k požadovanému buněčnému prostoru. Cílová doména může být například sekreční leader sekvence, membránová překlenovací doména, membránová vazebná doména nebo sekvence řízená k proteinu pro spojení s vesikly nebo s jádry.

Akční domény chimérních proteinů mohou být vybrány z jakýchkoliv proteinů nebo proteinových domén (výhodně lidského původu nebo sekvence), které spouštějí apoptosis po zesítění, a zahrnují, například cytoplasmickou doménu Fas antigenu.

Jak bude podrobněji uvedeno dále a v příkladech, je v různých provedeních tohoto vynálezu chimerní protein schopen vazby k FK506-typu ligandu, cyklosporin A-typu ligandu, tetracyklinovému nebo steroidovému ligandu. Takoá vazba vede k oligomerizaci chimerního proteinu s jinými chimerními proteinovými molekulami, které mohou být stejné nebo roždílné.

Navíc ke konstruktu(ům), kódujícími chiméru popsanou výše (primární chiméra), mohou buňky popřípadě dále obsahovat další heterologní DNA konstrukty pro regulovatelnou nebo konstitutivní expresi jednoho nebo více požadovaných genů. Například mohou buňky dále obsahovat jeden nebo více jiných konstruktů, kódujících případnou chiméru, jak popsáno výše, ale obsahujících akční domény, které, po ligandem indukované o 1 igomerizaci, spouštějí biologické děje jiné než apoptosis. Takové další akční domény mohou být vybrány ze širokého množství proteinových domén schopných ovlivňovat požadovaný biologický výsledek při oligomerizaci chimérního proteinu(ů).Například akční doména může obsahovat proteinovou doménu jako je CD3 zeta podjednotka schopná při vystavení ligandu a následné o 1igomerizaci, iniciace detegovatelného intracelulárního signálu; DNA-vazehný protein jako je Gal 4; nebo transkripční aktivační doména jako je VP16. Je zde poskytnuto mnoho dalších příkladů. Jedním z příkladů detegovatelného intracelulárního signálu je signál aktivující transkripci genu za transkripční kontroly transkripčního kontrolního prvku (např. prvky enhancer a/nebo promotor a podobně), který je odpovědný za oligomerizaci. Výhodně ligand(y), které oligomerizují primární chiméru a vedou k apoptosis nepůsobí oligomerizaci případných chimérních proteinů.Obvykle je i výhodnější, když ligand(y), které oligomeri zují případnou chiméru a působí přidané biologické dějě, jako je regulovaná transkripce genu, nevedou k o 1 igomerizaci primární chiméry nebo spuštění apoptosis. Různé sady ligandů jsou v tomto smyslu orthogonální.

Jak je dále podrobněji popsáno, v různých provedeních tohoto vynálezu jsou chimérní proteiny schopny se vázat k ligandu typu FK506, ligandu typu cyklosporinu A, tetracyklinovému nebo steroidnímu ligandu. Taková vazba vede k oligomerizaci molekul chimérního proteinu s jinými chimérními proteinovými molekulami, které mohou být stejné nebo rozdílné.

Buňky popřípadě mohou obsahovat ještě další rekombinantní konstrukt, nebo serie takového konstruktu(ů), obsahujících cílový gen za kontoly transkripce transkripčním kontrolním prvkem (např. promotor/enhancer) odpovědný za signál spouštěný 1 igandem-zprostředkovanou o 1igomerizací případných chimérních proteinů, tj. na vystavení buněk odpovídajícímu ligandu. Tyto konstrukty jsou rekombinantní v tom smyslu, že cílový gen je nepřirozený za transkripční kontroly odpovědného transkripčního kontrolního prvku.

Takový případbý cílový genový konstrukt může obsahovat (a) transkripční kontrolní element odpovědný za oligomerizaci případného chimérního proteinu jak je popsáno výše a (b) přiléhající DNA sekvenci od cílového genu zprostředkující homologní rekombinací transkripčního kontrolního prvku v hostitelské buňce ve spojení s cílovým genem. V jiných provedeních konstrukt obsahuje požadovaný gen a lemující sekvenci od cílového místa, zprostředkující homologní rekombinací cílového genu do požadovaného lokusu.(Viz např. Mansour a spol., 1988, Nátuře 336, 348-352 a následující články M.Capecchiho a spol.) Konstrukt může také obsahovat odpovědný transkripční kontrolní element, nebo odpovědný element může být poskytnut v lokusu. Cílové geny mohou kodovat např.povrchový membránový protein, sekretovaný protein, cytoplasmický protein nebo ribozym nebo pozitivní sekvenci.

Konstrukty podle vynálezu mohou také obsahovat selektující markér, zprostředkující transfekcí konstruktů do hostitelských buněk a selekci transfektantů, obsahujících konstrukt. Předložený vynález dále zahrnuje DNA vektory, obsahující různé zde popsané konstrukty, jak pro zavedení konstruktů do hostitelských buněk ve tkáňové kultuře nebo pro podání celému organismu pro zavedení do buněk in vivo. V každém případě může být konstrukt zaveden episomálně nebo chromosomální integrací. Vektor může být virální vektor, obsahující například adeno-, adeno asociovaný nebo retrovirální vektor.

Tento vynález dále zahrnuje chimérní protein, kódující jakýkoliv z našich DNA konstruktů, jakož i buňky jej obsahující a/nebo eprimující, zahrnující prokaryotické a eukaryotické buňky a zejména, kvasinkové, červové, hmyzí, myší buňky nebo buňky jiných hlodavců, a další savčí buňky, zahrnující lidské buňky různých typů a rodů,jak zmrazené tak aktivně rostoucí, jak v kultuře nebo v celém organismu je obsahuj ící.

Opakovaně - poskytuje tento vynález buňky, výhodně ale ne nezbytně savčí, které obsahují první DNA konstrukt, kódující primární chimérní protein, obsahující (i) alespoň jednu receptorovou doménu schopnou vazby k selektovanému oligomerizujíčímu ligandu podle tohoto vynálzu a (ii) další proteinovou doménu, heterologní s ohledem na receptorovou doménu, ale schopnou, za o 1igomerizace s jednou nebo více podobnými doménami, spuštění apoptosy buněk. Po vystavení buněk zvolenému ligandu, dochází k programované buněčné smrt i.

V některých provedeních, buňky, jak bylo právě popsáno, také obsahují jeden nebo více DNA konstruktů, kódujících jeden nebo více chimerních proteinů, obsahující (i) alespoň

IU jednu receptorovou doménu schopnou vazby k vybranému oligomerizujíčímu ligandu podle tohoto vynálezu a (ii) další proteinovou doménu, heterologní vzhledem k receptorové doméně, ale schopnou, po o 1 igomerizaci této případné chiméry, spuštění (přímo nebo nepřímo) aktivace transkripce cílového genu za transkripční kontroly transkripčním kontrolním prvkem odpovědným za uvedenou o 1 igomerizaci. Buňky budou také obsahovat cílový gen pod expresní kontrolou transkripčním kontrolním prvkem odpovědným za uvedenou oligomerizaci ligandu. Po vystavení selektovanému ligandu se exprimuje cílový gen. Opět by ligand schopný oligomerizace primární chiméry a ligand(y) schopné oligomerizace případné chiméry měly být orthogonální.

V dalším provedeních, buňky podle tohoto vynálezu také obsahují DNA konstrukt, kódujících první případný chimérní protein, obsahující DNA-vazebnou doménu a alespoň jednu receptorovou doménu schopnou vazby k první vybrané ligandové skupině. Buňky dále obsahují druhý případný chimérní protein, obsdahující transkripční aktivační doménu a alespoň jednu receptorovou doménu schopnou vazby ke druhé vybrané ligandové skupině (která může být stejná nebo se lišit od první vybrané ligandové skupiny). Buňky dále obsahují DNA konstrukt, kódující cílový gen pod transkripční kontrolou heterologní transkripční kontrolní sekvence s příbuzným vazebným místem pro DNA-vazebnou doménu a který je odpovídající na transkripční aktivační doménu tak, že buňky exprimuje cílový gen po vystavení oligomeruující ligand obsahující zvolené ligandové skupině(nám).

DNA kompozice vhodné z praktických aspektů vynálezu zahrnují ty, které kódují volitelnou chiméru. Tyto kompozice obsahují první DNA konstrukt, kódující chimérní protein,

1 obsahující alespoň jednu receptorovou doménu, schopnou vazby k selektovanému ligandu, fúzovanou k heterologní další proteinové doméně, schopný vazby k selektovanému ligandu, fúzovaný k heterologní další proteinové doméně schopné iniciace biologického procesu po vystavení oligomerizujíčímu ligandu, tj. za oligomerizace chimérního proteinu; a druhý DNA konstrukt, kódující cílový gen pod transkripční kontrolou transkripčním kontrolním prvkem odpovědným za oligomerizaci 1 i gandu.

Další příkladná DNA kompozice vhodné v praktických aspektech tohoto vynálezu obsahuje první serie DNA konstruktů, kódujících první a druhý chimérní protein a druhý DNA konstrukt, kódující cílový gen za transkripční kontroly transkripčním kontrolním prvkem odpovědným za oligomerizaci chimérních proteinových molekul. DNA konstrukt, kódující první chimérní protein obsahuje (a) alespoň jednu první receptorovou doménu schopnou vazby k vybraném první ligandové skupině, fúzovaný k (b) heterolognímu další proteinové doméně schopné iniciace biologického procesu po vystavení oligomerizačnímu ligandu, tj. po oligomerizaci prvního chimérního proteinu ke druhé chimérní proteinové molekule.

DNA konstrukt, kódující druhý chimérní protein obsahuje (i) alespoň jednu receptorovou doménu schopnou vazby k vybrané druhé ligandové skupině, fúzovaný k (ii) heterologní další proteinové doméně schopné iniciace biologického procesu při vystavení oligomerizačnímu ligandu, tj. při oligomerizaci k prvnímu chimérnímu proteiunu. První a druhá receptorová skupina mohou být v takových případech stejné nebo rozdílné a první a druhá vybraná ligandová skupina mohou být podobně stejné nebo rozdílné.

Naše ligandy jsou molekuly schopné vazby ke dvěma nebo více chimérním proteinovým molekulám podle tohoto vynálezu za tvorby jejich oligomeru a mají vzorec linker - {rbmi, rbm2,...rbm_n} kde n je celé číslo od 2 do asi 5, rbm<i)-rbmt_n) jsou receptor vázající skupiny, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou schopny vazby k chimérnímu proteinu(ům). rbm skupiny jsou kovalentně připojeny k linkerové skupině, kterou je bi- nebo multifunkční molekula schopná být kovalentně připojena (-) ke dvěma nebo více rbm skupinám. Výhodně má ligand molekulovou hmotnost menší než asi 5 kDa aa není to protein. Příklady takových ligandů zahrnují ty, ve kterých rbm skupiny jsou stejné nebo rozdílné a zahrnují skupinu FK506-typu, skupinu cyklosporinového typu, steroid nebo tetracyklín. Skupiny cyklosporinového typu zahrnují cyklosporin a jeho deriváty, které jsou schopny navázání k cyklofylinu, přirozeně se vyskytujícímu nebo modifikovanému, výhodně s Kd hodnotou pod asi 10-6M. V některých provedeních je výhodné, že se ligand váže k přirozeně se vyskytujícímu receptoru s Kd hodnotou větší než asi 10 ^_6M a výhodněji větší než asi 10“⁵M. Ilustrativní ligandy podle tohoto vynálezu jsou ty, ve kterých alespoň jeden rbm obsahuje molekulu FK506, FK520, rapamycinu nebo jeho derivátů, modifikovanou na C9, CIO nebo na obou, ligandy, vázajícími k modifikovanému receptoru nebo chimérní molekule, obsahující modifikovanou receptorovou doménu s Kd hodnotou alespoň jeden a výhodně 2 a výhodněji 3 a ještě výhodněji 4 nebo 5 nebo více řádově menších než jeich Kd hodnoty vzhledem k přirozeně se vyskytujícímu receptorovému proteinu. Linkerové skupiny jsou také popsány podrobněji dále, ale pro ilustraci zahrnují takové skupiny jako je C2-C20 alkylen, C4-C18 azalkylen, C6-C24 N-alkylenazalky1en,

C8-C18 arylen, C8-C24 ardialkylen nebo C8-C36 biskarboxamido akylenovou skupinu.

Monomerní rbm podle tohoto vynálezu, jakož i sloučeniny, obsahující prosté kopie rbm, které jsou schopny se vázat k našim chimérním proteinům, ale neovlivňovat dimerizaci nebo jejich o 1 igomerizaci vyššího řádu (z hlediska monomerního charakteru jednotlivého rbm) jsou oligomerizačními antagonisty.

V důležitém aspektu tohoto vynálezu geneticky zpracované buňky podle tohoto vynálezu mohou růst spolu s jinýi buňkami a být selektivně odstraněny ze směsi buněk přídavkem účinného množství o 1 igomeri zujícího ligandu, který odpovídá (tj. je schopen vazby k) primárnímu chimernímu proteinu. Kontakt buněk s oligomerizujícím ligandem spouští buněčnou smrt ve zpracovaných buňkách. Například takové buňky mohou být poskytnuty pro produkci endogenního nebo hetero1ogního produktu po určitou požadovanou periodu a mohou pak být deletovány přídavkem ligandu. V takových případech jsou buňky zpracovány pro produkci primární chiméry v souladu s tímto vynálezem. Buňky, které mohou být dále zpracovány pro expresi požadovaného genu za ligandem vyvolané regulace, mohou růst v kultuře za běžných podmínek. V takovém případě vede přídavek ligandu pro volitelnou chiméru ke kultivačnímu mediu k expresi požadovaného genu a produkci požadovaného proteinu. Exprese genu a produkce proteinu může být obrácena přídavkem činidla, které je antagonistou oligomerizace k mediu, jak je podrobněji popsáno dále. V jiném případě je produkce proteinu konstitutivní. V jakémkoliv případě, zpracované buňky pak mohou být eliminovány z buněčné kultury po té, co posloužily svému zamýšlenému účelu (např. produkci požadovaného proteinu nebo jiného produktu) přídavkem k mediu účinného množství vhodného oligomerizujíčího ligandu pro vyvolání oligomerizace primární chiméry a indukci apoptosis ve zpracovaných buňkách.

Zpracované buňky podle tohoto vynálezu mohou být také použity in vivo, k modifikaci celého organismu, výhodně zvířat, včetně lidí, např. tak, že buňky produkují požadovaný protein nebo jiné vedou k živočichovi, obsahujícímu takové buňky. Takové použití zahrnuje genovou terapii. Alternativně chimérické proteiny a oligomerizující molekuly mohou být použity extracelulárně k uvedení proteinů do vzájemného kontaktu, který působí tak, že iniciuje fyziologickou akci.

Tento vynález tak poskytuje materiály a metody pro selektivní odstranění buněk v odezvě na přídavek oligomerizujícího ligandu Metoda zahrnuje poskytnutí buněk zpracovaných v souladu s tímto vynálezem a vystavení buněk 1igandu.

Tento vynález tak poskytuje metodu pro použití buněk zpracovaných jak popsáno pro produkci heterologního proteinu přes regulovanou aktivaci transkripce cílového genu v buňkách a pro eliminaci zpracovaných buněk, je-li tato žádoucí.

Metoda zahrnuje poskytnutí buněk podle tohoto vynálezu, které exprimují primární chimerní protein schopný, po oligomerizaci, iniciace apoptosis a kde tyto buňky dále obsahují a jsou schopny exprese (a) alespoň jeden DNA konstrukt, kódující chimérní protein podle tohoto vynálezu schopný, po oligomerizaci, aktivace transkripce (b) cílového genu. Chimérní protein obsahuje alespoň jednu receptorovou doménu schopnou vazby k vybranému oligomerizadnímu ligandu. Receptorová doména je fúzována k akční doméně schopné - po vystavení oligomerizujíčímu ligandu, tj. za oligomerizace s jedním nebo více chimérními ligandu, tj. za oligomerizace s jedním nebo více chimérními proteiny, obsahujícími další kopii z akční domény- z iniciace intracelulárního signálu. Tento signál je schopen aktivace transkripce genu, jako je cílový gen v tomto případě, který je pod transkripční kontrolou transkripčního kontrolního prvku odpovědného za tento signál. Metoda tak zahrnuje vystavení buněk oligomerizačnímu ligandu schopnému vázat se k chimérnímu proteinu v množství účinném k dosažení exprese cílového genu. V případech, ve kterých buňky rostou v kultuře, jejich vystavení ligandu je ovlivněno přídavkem ligandu ke kulturnímu mediu. V případech, ve kterých jsou buňky přítomny v hostitelském organismu, je jejich vystavení ligandu ovlivněno podáním ligandu hostitelskému organismu. Například v příkladech, ve kterých je hostitelským organismem živočich, zejména savec (včetně člověka), je ligand podáván hostitelskému živočichovi orálně, bukálně, sublinguálně, transdermálně, subkutánně, intramuskulárně, intravenozně, intra-joint nebo inhalačním podáním ve vehikulu, které je pro něj vhodné. Pro odstranění zpracovaných buněk se přidá ke kultivačnímu mediu nebo podá hostitelskému organismu, podle situace, druhý oligomerizující ligand, který je schopen oligomerizovat primerní chiméru.

Tento vynález dále zahrnuje farmaceutické přípravky,pro eliminaci geneticky zpracovaných buněk podle tohoto vynálezu ze směsi různých buněk, získaných z živočišných tkání nebo ze subjektu, obsahujícího takové buňky. Takové farmaceutické přípravky obsahují oligomerizační ligand podle tohoto vynálezu ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem a popřípadě s jednou nebo více farmaceuticky přijatelnými přísadami. Oligomeri začni ligand může být homo-oligomerizační činidlo nebo heteroligomerizační činidlo jak je popsáno dále podrobněji, pokud je schopen vazby k primárnímu chimérnímu proteinu podle tohoto vynálezu nebo spuštění apoptosis

6 zpracovaných buněk podle tohoto vynálezu. Podobně tento vynález dále zahrnuje farmaceutický přípravek, obsahující antagonistu oligomerace podle tohoto vynálezu ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem a popřípadě s jednou nebo více farmaceuticky přijatelnými přísadami pro prevenci nebo redukci, vcelku nebo částečně, hladiny o 1igomerizace chimerních proteinů v zpracovaných buňkách podle tohoto vynálezu v buněčné kultuře nebo v subjektu a tak pro prevenci nebo deaktivaci buněčné smrti v relevantních buňkách. Použití oligomeri začni ch činidel a oli gomeri začni ch antagonistických činidel pro přípravu farmaceutických přípravků je zahrnuto do rozsahu tohoto vynálezu.

Tento vynález také poskytuje metodu pro získání hostitelského organismu, výhodně živočicha, a v mnoha případech savce, citlivého na oligomerizační ligand podle tohoto vynálezu. Metoda zahrnuje zavedení inženýrsky zpracovaných buněk v souladu s tímto vynálezem do organismu, tj. obsahujích DNA konstrukt, kódující chimérní protein a tak dále. Alternativně, je možno zavést DNA konstrukty podle tohoto vynálezu do hostitelského organismu, např. savce za podmínek způsobujících transfekci jedné nebo více buněk hostitelského savce in vivo.

Dále jsou poskytnuty kity pro výrobu buněk citlivých k ligandem regulované apoptosis. Jeden kit obsahuje alespoň jeden DNA konstrukt, kódující jeden z našich primárních chimérních proteinů, obsahující alespoň jednu receptorovou doménu a akční doménu (například cytopíasmickou doménu Fas nebo TNF receptor,jak popsáno jinde). V jednom provedení obsahuje DNA konstrukt konvenční polylinker pro poskytnutí praktického místa pro inkorporaci buněčně typově specifického expresního kontrolního elementu(ů) a/nebo enhancerového elementu(ů) pro poskytnutí buněčného typu tkáňově specifické exprese jedné nebo více chimér. Kit může obsahovat více ligandů podle tohoto vynálezu, schopných oligomerizovat molekuly chimérního proteinu, kódované DNA konstrukty kitu a může obsahovat přídavek množství o 1igomeri začniho antagonisty, např. monomerního ligandového činidla. Jestliže je samotný chimérní protein kodován konstruktem(ty), je oligomerizačni Íigand Íigand homooligomerizační. Jestliže je kodován více než jeden takový chimérní protein, může být zahrnut hetero-oligomerizační Íigand. Kit může dále obsahovat další DNA konstrukty, kódující volitelnou chiméru a/nebo cílový gen a/nebo transkripční kontzrolní element citlivý k oligomerizaci chimérních proteinových molekul. DNA konstrukty budou výhodně spojeny s jedním nebo více selekčními markéry pro běžnou selekci transfektantů, jakož i jinými běžnými vektorovými prvky vhodnými pro replikaci v prokaryotech, pro expresi v eukaryotech a podobně. Selekční markéry mohou být stejné nebo rozdílné pro každý rozdílný DNA konstrukt, umožňující selekci buněk, které obsahují různé kombinace takového DNA konstrukt(ů).

Například jeden z kitů podle tohoto vynálezu obsahuje DNA konstrukt, kódující primární chimérní protein jak popsán jinde; první volitelný DNA konstrukt, kódující chimérní protein, obsahující alespoň jednu receptorovou doménu (schopnou vazby k selektovanému Iigandu), fúzovanou k transkripční aktivátorové doméně; druhý volitelný DNA konstrukt, kódující druhý chimérní protein, obsahující alespoň jednu receptorovou doménu (schpný vazby k selektovanému Iigandu), fúzovaný k DNA vazebné doméně; a DNA konstrukt cílového genu, kódující cílový gen za kontroly transkripčním korifcolním prvkem, obsahujícím DNA sekvenci, ke které se váže DNA vazebná doména a která je transkripčně aktivována vystavením ligandů za přítomnosti prvního a druhého volitelného chimérního proteinu.

Alternativně, DNA konstrukt pro zavedení cílového genu pod kontrolou odpovědného transkripčního kontrolního prvku může obsahovat klonovací místo v cílovém genu za poskytnutí kitu pro inženýring buněk pro vyvolání exprese genu pro realizaci odborníkem.

Jiné kity podle tohoto vynálezu mohou obsahovat jeden nebo dva (nebo více) DNA konstruktů pro chimérní proteiny, ve kterých jeden nebo více obsahuje klonovací místo v akční doméně (transkripční iniciační signální generátor, transkripční aktivátor, DNA vazebný protein atd.), umožňující uživateli inzertovat jakoukoliv z akčních domén podle požadavků. Takový kit může popřípadě obsahovat jiné prvky jak je popsáno výše, např. DNA konstrukt pro cílový gen zaodpovědné expresní kontroly, oligomerizační ligand, antagonistů atd.

Jakýkoliv z těchto kitů může také obsahovat pozitivní kontrolní buňky, které byly stabilně transformovány konstrukty podle vynálezu, jako jsou ty, které exprimují reporterový gen (pro CAT, beta-galaktosidásu nebo jakýkoliv běžně detegovatelný genový produkt) v odpovědi na vystavení buněk ligandů. Mohou být také poskytnuta činidla pro detekci a/nebo kvantifikaci exprese reporterovébo genu.

Popis obrázků na přiložených výkresech

Obr. 1 je diagram plasmidu pSXNeo/IL2 (IL2-SX). V NF-AT-SX je

HindlII-Clal DNA fragment z IL2-SX, obsahující IL2 enhancer/promotor, nahrazen minimálně IL-2 promotorem, náhradní list umožňujícím bazální transkripci a indukovatelný element, obsahující tři tandemy NFAT-vazebná místa (popsáno dále).

Obr. 2 je průtokový diagram přípravy intracelulárních signálních chimérních plasmidů p#MXFn a p#MFnZ, kde n znamená počet vazebných domén.

Obr. 3A a 3B jsou průtokové diagramy přípravy extracelulárního chimérního plasmidu p#lFK3/pBJ5.

Obr. 4A, 4B a 4C jsou sekvence primérů použitých v konstrukci plasmidů použitých v tomto vynálezu.

Obr. 5 představuje indukci různých transkripčních faktorů zesítěním TAC/CD3 zmapováním odezvy reporterovývh konstruktů, majících různé enhancerové skupiny reakce receptorů TAC/CD3 s ligandem.

Obr. 6 je mapa aktivity různých ligandů s TAg Jurkat buňkami popsanými v příkladu l.Obr.óA představuje inhibiční aktivitu dimerního FL506 a cyklosporinu A.

Obr. 7 je mapa aktivity ligandu FK1012A (8, obr. 9B) s extracelulárním receptorem 1FK3 (FKBPx3/CD3 ).

Obr. 8 je mapa aktivace NFAT reportéru signalizací přes myristoylatovanou CD3 /FKBP12 chiméru.

Obr. 9A a 9B jsou chemické vzore allyl-napojených FK506 variant a cyklohexyl-napojených FK506 variant.

Obr. 10 je průtokový diagram syntézy derivátů FK520.

Obr. 11A a B jsou diagramy syntézy derivátů FK520 a chemických struktur FK520. Struktury na obr.llBč2 jsou tvarovány pro specifickou vazbu k mutantu FKBP12(obsahuje jednu nebo více substitucí, např.alanin, pro F36,F99 a/nebo Y26) .

Obr. 12 je diagramové znázornění mutanta FKBP s modifikovaným FK520 v domnělém rozštěpení.

Obr. 13 je průtokový diagram syntézy heterodimeru

FK520A-HNCO-R s cyklosporinem. Způsob syntézy může být snadno zobecněn pro syntézu jiných dimerů (homodimerů nebo náhradní list heterodimerů) FK520 a/nebo cyclosporinu(nebo jeho derivátů). Obr. 14 je schematické znázornění oligomerizace chimerních proteinů, ilustrované chimérními proteiny, obsahujícími imunofi 1inovou skupinu jako receptorovou doménu.

Obr. 15 znázorňuje ligandem zprostředkovanou oligomerizaci chimérních proteinů,se schematickým uvedením spuštění transkripčního iniciačního signálu.

Obr. 16 znázorňuje schémata syntézy HED a HOD činidel na bázi skupin typu FK-506.

Obr. 17 znázorňuje syntézu (CsA)2 začínající s CsA.

Obr. 18 je přehled fúze cDNA konstruktu a proteinu MZF3E. Obr. 19 představuje FK1012-indukovanou buněčnou smrt Jurkat T-buněčné linie transfektované s myristoylovaným Fas-FKBP12 fuzním proteinem (MFF3E), jak je indikováno sníženou transkripční aktivitou buněk.

Obr. 20A je analýza cyklofi 1in-Fas (a Fas-cyklofi 1in) fúzních konstruktů v přechodné transfekční zkoušce. MC3FE byl v této sérii nejaktivnější.

Obr. 20B znázorňuje imunofi 1in-Fas antigen chiméry a výsledky

Z. X pokusů přechodné exprese v Jurkat T buňkách stabilně transformovaných velkým T-antigenem. Myr: myristylační sekvence odebraná z pp60^c_src kódující zbytky 1-14 (Wilson a spol., Mol & Cell Biol 9 4 (1989); FKBP: lidský FKBP12; CypC: myší cyklofilin C sekvence, kódující zbytky 36-212 (Freidman a spol., Cell 66 4 (191): 799-806); Fas: intracelulárni doména lidského Fas antigenu, kódující zbytky 179-319 (Oehm a spol., J.Biol.Chem. 267 15 (1992): 10709-15). Buňky byly e1ektroporovány plasmidem, kódujícím reporterový gen sekretované alkaické fosfatásy pod kontrolou 3 tandemu API promotorů spolu se šesti násobným molárním přebytkem imunofi 1inového fúzního konstruktu. Po 24 hodinách byly buňky stimulovány s PMA (50 ng/ml), který stimuluje syntézu reporterového genu a (CsA(2. Za 48 hodin byly buňky zkoumány na aktivitu reporterového genu. Western bloty byly provedeny po 24 h za použití anti-HA epitopových protilátek.

Obr. 21 znázorňuje syntézu modifikovaných sloučenin typu FK-506.

Popi s

1. Obecná diskuse

Tento vynález poskytuje chimérní proteiny, organické molekuly pro oligomerizaci chimérních proteinů a systém pro jejich použití. Fúzované proteiny mají vazebnou doménu pro vazbu k (výhodně malým) organickým oligomerizujícím molekulám a akční doménu, která může ovlivňovat fyziologické působení nebo celulární proces jako výsledek oligomerizace chimérních proteinů.

Základní koncept pro vyvolání proteinové asociace je ilustrován na obr. 14. Ligandy, které mohou působit jako heterodimerizační (nebo heterooligomerizační, HED) a homodimerizačni (nebo homo-oligomerizační HOD) činidla, jsou znázorněny jako činkovitě tvarované struktury.

Homodimerizace a homoo1 igomerizace označuje asociaci podobných složek za tvorby dimerů nebo oligomerů, spojených ligandy podle tohoto vynálezu. Heterodimerizace a heteroo1 igomerizace označuje asociaci podobných složek za tvorby dimerů nebo oligomerů. Homooligomery tak obsahují asociaci mnoha kopií jednotlivé složky, zatímco heteroo1igomery obsahují asociaci kopií různých složek.

igomerizace, o 1igomerizovat a oligomer , jak jsou zde používány, s nebo bez prefixů, jsou míněny jako zahrnující dimerizaci, dimerizovat a dimer,pokud není výslovně uvedeno j inak).

Na obr. 14 jsou také znázorněny molekuly fuzních proteinů, obsahující cílovou proteinovou doménu , která je středem zájmu (akční doména) a jednu nebo více receptorových domén, které se mohou vázat k ligandům. Pro intracelulární chimérní proteiny, tj. proteiny, které jsou umístěny v buňkách, ve kterých jsou produkovány, budou výhodně také přítomny celulární cílové sekvence (zahrnující organelovově cílové aminokyselinové sekvence). Vazba ligandu k receptorovým doménám hetero- nebo homodimeri zuje fuzní proteiny. 01igomerizace přináší akční domény do vzájemné těsné blízkosti a tím spouští buněčné procesy normálně spojené s příslušnou akční doménou - například jako je apoptosis nebo TCR-zprostředkovaná signální transdukce.

Buněčné procesy, které mohou být spuštěny oligomerizaci, zahrnují změnu stavu jako je fyzický stav, např. konformační změnu, změnu ve vazebném partnerovi, buněčnou smrt, iniciaci transkripce, otevření kanálků, iontové uvolnění, např Ca²⁺ atd, nebo chemického stavu, jako je enzymaticky katalyzovaná chemická reakce, např. acylace, methylace, hydrolýza, fosforylace nebo defosforylace, změnu v redox stavu, přesmyk nebo podobně. Tak je jakýkoliv proces, který může být spuštěn ligandem zprostředkovanou o 1 igomerizacί,je zahrnut v rozsahu tohoto vynálezu i když primárním záměrem zde je apoptosis.

V hlavním rysu tohoto vynálezu jsou buňky modifikovány tak, že odpovídají na ligandové molekuly, které jsou schopny vazby ke a tím oligomerizace, zde popsaným chimérám. Viz např. příklady 4(B) a 4(C), infra. Takové zpracované buňky odpovídají na přítomnost ligandu podstoupením apoptosis a mohou tak být eliminovány v aplikacích genové terapie a jiných situacích, kdy je nezbytné nebo žádoucí odstranit geneticky modifikované buňky. Například modifikované buňky mohou kancerogenní nebo jinak škodlivé nebo nadbytečné.

Modifikované buňky jsou charakterizovány genomem, obsahujícím genetický konstrukt (nebo jeho serie), kódující promární chimérní protein podle tohoto vynálezu, který umožňuje ligandem regulovanou apoptosis. Primární chiméra obsahuje např. cytoplasmickou doménu fas antigenu nebo Apo-1 antigen, který, je-li zesítěn, indukuje apoptosis u většiny buněčných typů (Trauth a spol, (1989) Science 245, 301-305; Watanaba-Fukunaga a spol. (1992) Nátuře 356, 314). Tímto způsobem může být poskytnuta ligandem indukovatelná buněčná smrt zpracované populace buněk.

Buňky mohou být dále zpracovány pro produkci volitelných dalších proteinů schopných vazby s a odpovídajících na, vybrané ligandové molekuly. Takové další zpracování přináší další ligandem regulovatelnou funkčnost buňkám, které mohou být použity v aplikacích, zahrnujících in vitro buněčné kultury a v aplikacích genové terapie. Výhodně, ligandové molekuly, které jsou schopny vazby volitelné další chiméry(chimér) a regulace volitelných dalších buněčných procesů (například jako je genová transkripce) nereagují křížově s molekulami primární chiméry a proto nespouštějí apoptosis ve zpracovaných buňkách.

Takové dále modifikované buňky mohou být použity v aplikacích, kde je požadována regulace buněčných procesů jako je transkripce nebo translace (obě jsou zahrnuty pod výrazem exprese) cílového genu. Takové buňky jsou charakterizovány genomem, obsahujícím alespoň první nebo první serie (serie mohou obsahovat pouze jeden konstrukt) genetických konstruktů, kódujících volitelné další chiméry a je-li to žádoucí druhou nebo druhé serie (serie mohou obsahovat pouze jeden konstrukt) konstruktů cílového genu.

Charakter a počet takových genetických konstruktů budou záviset na charakteru chimérního proteinu a roli, kterou hraje v buňce. Například v provedeních, kde volitelný další chimérní protein má být spojen s expresí cílového genu (a který může obsahovat intracelulární cílovou sekvenci nebo doménu, která řídí chimérní protein aby byl spojen s buněčnou povrchovou membránou nebo s organelou např. jádra nebo vesiklu), budou normálně alespoň dvě serie takových dalších konstruktů: první série, kódující chimérní protei(y), který po ligandem zprostředkované oligomerizaci iniciuje signální řízení cílové genové exprese a podle potřeby druhé serie, které obsahují cílový gen a/nebo expresní kontrolní prvky, které jsou citlivé k signálu.

Pouze jediný konstrukt v první sérii bude vyžadován, je-li obsažen homoo1 igomer, obvykle homodimer, zatímco mohou být obsaženy dva nebo více, obvykle ne více než tři konstrukty tam, kde je obsažen heteroligomer. Chimérní proteiny, kódované prvními seriemi konstruktů budou spojeny se spuštěním genové transkripce a budou normálně řízeny k povrchové membráně jádra, je-li oligomerizovaný chimérní protein schopen iniciovat, přímo nebo nepřímo, transkripci jednoho nebo více cílových genů. druhé serie dalších konstruktů budou vyžadovány tam, kde je zaváděn exogenní gen(y) nebo kde je zaváděn exogenní nebo rekombinantní expresní kontrolní sekvence (např. homologní rekombinací) pro expresi endogenního genu, v jiném případě, jehož transkripce bude aktivována oligomerizaci chimérního proteinu.

Různé první serie dalších konstruktů se používají tam, kde jsou chimérní proteiny intracelulární a mohou působit přímo bez iniciace transkripce dalšího genu. Například proteiny spojené s exocystosou mohou být exprimovány induktivně nebo konstitutivně, kde se proteiny nebudou normálně komplexovat s výjimkou za přítomnosti oligomerizuj icí molekuly. Při použití proteinů, které mají jakoukoliv nebo všechny z těchto vlastností, které nekomplexují v hostitelské buňce; jsou inhibovány komplexací s jinými proteiny a tato inhibice může být překonána o 1igomeri žací s 1igandem;vyžadují aktivaci procesem, který není dostupný v hostitelské buňce; nebo modifikací proteinů, která řídí fúzi vesiklu a plasmovou membránou za vzniku chimérních proteinů, kde rozsah tvorby komplexu a membránové fúze je zvýšen za přítomnosti oligomerizující molekuly, je nebo byla exocystosa schopna být indukována o 1igomerizující mmo1ekulou.

Jiné intracelulární proteiny jako je kinása, fosfatása a buněčný cyklus řídící proteiny, mohou být podobně modifikovány a použity.

Různé třídy volitelných dalších genetických konstruktů použitelných v provedení vynálezu jsou popsány dále:

(1) konstrukty, které kódují chimérní protein, obsahující vazebnou doménu a akční doménu, kde vazebná doména je extrace1u1ární nebo inracelulární a akční doména je intracelulární jako je 1igand-zprostředkující oligomerizaci chimérního proteinu, samu o sobě (za vzniku homo-oligomeru) nebo s rozdílným fuzním proteinem, obsahujícím jinou akční doménu (za vzniku hetero-oligomeru), indukuje signál, který vede k sérii událostí vedoucí k transkripční aktivaci jednoho nebo více genů;

(2) konstrukty, které kódují chimérní protein, mající vazebnou doménu a akční doménu, kde vazebná doména a akční doména jsou v jádru, jako je ligandem zprostředkovaná oligomerizace proteinu, samu o sobě (za vzniku homo-o1 igomeru) nebo s jiným fuzním proteinem, obsahujícím jinou akční doménu (za vzniku hetero-oligomeru), indukuje iniciaci transkripce přímo přes komplexaci oligomerů) s DNA transkripčním iniciačním regionem;

(3) konstrukty, které kódují chimérní protein, obsahující vazebnou doménu a akční doménu, kde vazebná doména a akční doména jsou cytoplasmické, jako je ligandem zprostředkovaná oligomerizace proteinu, sama o sobě (za vzniku homo-oligomeru) nebo s jiným fuzním proteinem, obsahujícím jinou akční doménu (za vzniku hetero-oligomeru), což vede k exocytose; a (4) konstrukty, které kódují chimérní protein, obsahující vazebnou doménu a akční doménu, kde vazebná doména a akční doména jsou extraceklulární a akční doména je spojena s iniciací biologické aktivity (jen pro ilustraci, akční doména se může sama vázat k substanci, receptoru nebo jinému membránovému proteinu za získání, při ligandem zprostředkované o 1 igomerizaci chimér, spojení jedné nebo více podobných nebo rozdílných molekul nebo buněk) a (5) konstrukty, které kódují destabi1 i začni, inaktivační nebo krátkodobý chimérní protein, mající vazebnou doménu a akční doménu jako je ligandem zprostředkovaná oligomerízace proteinu s cílovým proteinem, obsahujícím odlišnou akční doménu, vede k destabilizaci a/nebo degradaci nebo inaktivaci uvedeného o 1igomerizovaného cílového proteinu.

II. Transkripční regulace

Konstrukt(v) skupiny (1) a (2) budou vzaty v úvahu jako první. Skupina (1) konstruktů se liší od skupiny (2) konstruktů svým účinkem. Skupina (1) konstruktů je poněkud pleiotropní, tj. schopna aktivace mnoha standardních typů genů, jakož i cílového genu(ů). Dále, odezva expresních produktů genů skupiny (1) k ligandu je relativně pomalá. Skupina (2) konstruktů může být směrována ke specifickému cílovému genu a je schopna omezení počtu genů, které budou transkribovány.Odezva expresních produktů konstruktů skupiny (2) k ligandu je velmi rychlá.

Vlastní systém skupin (1) a (2) bude zahrnovat první serie konstruktů, které obsahují DNA sekvence, kódující chimérní DNA sekvence, kódující chimérní proteiny, obvykle obsahující od jednoho do tří, běžně jeden až dva, různé konstrukty. Systém bude obvykle také obsahovat druhé serie konstruktů, které budou poskytovat expresi jednoho nebo více genů, obvykle exogenní gen. Exogenním genem je míněn gen, který není jinak normálně exprimován buňkou, např. kvůli charakteru buňky, pro genetický defekt buňky, protože gen je jiného druhu nebo je to mutovaný nebo syntetický gen, nebo podobně. Takový gen může kodovat protein, pozitivní molekulu, ribozym atd., nebo to může být DNA sekvence, obsahující expresní kontrolní sekvenci spojenou nebo mající být spojenou s endogenním genem, který s expresní kontrolní sekvencí není normálně spojen. Jak tedy je uvedeno výše, mohou konstrukty obsahovat exogenní nebo rekombinantní expresní kontrolní sekvenci pro ligandem indukovanou expresi endogenního genu.

Chimérní protein kódovaný konstrukty skupin (1), (2) a (3) může mít, jak je to často preferováno, intracelulární cílovou doménu, obsahující sekvenci, která směruje chimérní protein do požadovaného prostoru, např. povrchové membrány, jádra, vesikulární membrány, nebo na jiné místo, kde může být požadovaná fyziologická aktivita iniciována ligandem zprostředkovanou o 1 igomerizacί,při alespoň dimerizaci chimérního proteinu.

Chimérní protein obsahuje druhou (vazebnou nebo receptorovou) doménu, která je schopna vazby k alespoň jedné ligandové molekule. Protože ligand může obsahovat více než jedno vazebné místo nebo epitop, může tvořit diméry nebo homo- nebo hetero-oligomery vyššího řádu s chimérními proteiny podle vynálezu. Vazebná doména chimérního proteinu může mít jedno nebo více vazebných míst, takže homooligomerizace může proběhnout se dvojvazným ligandem. Tímto způsobemligand může oligomerizovat chimérní protein tím, že má dva nebo více epitopů, ke kterým se druhá doména může vázat a vzniká tak oligomerizace chimérního proteinu vyššího řádu.

Chimérní protein také obsahuje třetí (akční) doménu schopnou iniciovat biologickou aktivitu při ligandem zprostředkované o 1 igomerizaci molekul chimérního proteinu přes vazebné domény. Takto může být akční doména spojena s transdukcí signálu jako výsledkem ligandem zprostředkované oligomerizace. Takový signál, například, by mohl vést k iniciaci transkripce jednoho nebo více genů, v závislosti na jednotlivých meziproduktových složkách zúčastněných v signální transdukci. Viz obr. 15, který znázorňuje ilustrativní chimérní protein, ve kterém intracelulární cílová doména obsahuje myristátovou skupinu; receptorová doména obsahuje tři FKBP12 skupiny a akční doména obsahuje zeta podjednotku. V jiných chimérních proteinech mohou akční domény obsahovat transkripční fatory, které za oligomerizace vedou k iniciaci transkripce jednoho nebo více cílových genů, endogenních a./nebo exogenní ch. Akční domény mohou obsahovat proteiny nebo jejich části, které jsou spojeny s fúzí vesiklových membrán s povrchem nebo jinou membránou, např. proteiny SNAP a SNARE skupin (viz Sollner a spol., Nátuře (1993) 362, 318 a 353; Cell (1993) 72, 43).

A. Povrchový membránový receptor

Chimerní proteiny z jedné třídy podle tohoto vynálezu jsou zahrnuty v povrchové membráně a jsou schopny vyvolat signál vedoucí k transkripci jednoho nebo více genů. Proces zahrnuje mnoho pomocných proteinův sériích interakcí vrcholících vazbou transkripčních faktorů k promotorovým regionům spojeným s cílovým genem (geny). V případech, kdy se transkripční faktory vážou k promotorovým oblastem spojeným s jinými geny, je tak iniciována transkripce. Konstrukt, kódující chimérní protein podle tohoto provedení vynálezu, může kodovat signální sekvenci, která může být podrobena zpracování a proto nemůže být přítomna ve zralém chimérním proteinu. Chimérní protein bude v každém případě obsahovat (a) vazebnou doménu schopnou vazby předem stanpveného ligandu, (b) popřípadě (i když v mnoha provedeních výhodně) membránovou vazebnou doménu, která zahrnuje transmembránovou doménu nebo propojený lipid pro translokaci fuzního proteinu k buněčnému povrchu/membráně a zajištění proteinu navázaného k buněčné povrchové membráně a (c) akční doménu, cytopasmickou signální iniciační doménu. Cytoplasmická signální iniciační doména je schopna iniciace signálu, který vede k transkripci genu, majícího rozpoznávací sekvenci pro iniciovaný signál v transkripční iniciační oblasti.

Gen, jehož exprese je regulována signálem z chimérního proteinu je zde označován jako cílový gen, který je gen exogenní nebo endogenní pod expresní kontrolou endogenní nebo exogenní (nebo hybridní) expresní kontrolní sekvence. Molekulární část chimérního proteinu, která poskytuje vazbu k membráně, je také označována jako retenční doména. Vhodné retenční domény zahrnují skupiny, které se přímo vážou k lipidové vrstvě membrány, jako přes lipidovou součást membrány nebo rozložením membránou, nebo podobně. V takových případech je protein translokován k a váže se k membráně, zejména buněčné membráně, jak je znázorněno na obr. 15.

B. Jaderné transkripční faktory

Další volitelný první konstrukt kóduje chimérní protein, obsahující buněčnou cílovou sekvenci, která umožňuje, aby protein byl translokován k jádru. Tato (signální konsensus) sekvence má mnoho bázických aminokyselin, označovaných jako dvojdílné bázické opakování (popsáno v práci Garcia-Bustos a spol., Biochimica et Biophysica Acta (1991) 1071, 83-101). Tato sekvence se může objevovat v jakékoliv části molekuly uvnitř nebo blízko N- nebo C-konce a vede k tomu, že chimérní protein je mimo jádro. Prakticky bude jedno z provedení tohoto vynálezu obsahovat alespoň dva (první serie) chimérních proteinů: (1) jeden, mjící akční doménu, která se váže k DNA transkripční iniciační oblasti spojené s cílovým genem a (2) odlišný chimérní protein, obsahující akční doménu, transkripční aktivační doménu schopnou, ve spojení s DNA vazebnou doménou prvního chimérního proteinu, iniciace transkripce cílového genu. Dvě akční domény nebo transkripční faktory mohou být odvozeny od stejné nebo odlišné proteinové mo1ekuly.

J z.

Transkripční faktory mohou být endogenní nebo exogenní k buněčnému hostiteli. Jsou-li transkripční faktory exogenní, ale funkční s hostitelem a mohou kooperovat s endogenní RNA polymerasou (spíše než vyžadovat exogenní RNA polymerásu, pro ktero by mohl být gen zaveden), potom může být poskytnut exogenní promotorový prvek funkční s fúzovanými transkripčními faktory s druhým konstruktem pro regulaci transkripce cílového genu. Tímto způsobem může být iniciace transkripce omezena na gen(y) spojené s exogenní promotorovou oblastí, tj. cílovým genem(geny).

Je známo velké množství transkripčních faktorů, které vyžadují dvě podjednotky pro aktivitu. Alternativně v případech, kde může být jediný transkripční faktor rozdělen do dvou separátních funkčních domén (např. transkripční aktivátorou doménu a DNA-vazebnou doménu), takže každá doména je sama o sobě neaktivní; jestliže se však uvedou do vzájemné velmi těsné blízkosti, je transkripční aktivita obnovena. Transkripční faktory, které mohou být použity, zahrnují kvasinky GAL4, které budou rozděleny do dvou domén jak popsal Fields a Song., supra. Autoři použili fúzi GAL4(1-147)-SNF a SNF4-GAL4(768-881), kde SNF1 a -4 může být nahrazen subjektem vázajícím proteiny jako vazebnými doménami. Může být použita kombinace GAL4 a VP16 nebo HNF-Í. Jiné transkripční faktory jsou členy Jun, Fos a ATF/CREB rodin, Octl, Spi, HNF-3, steroid receptorové superrodiny a podobně.

Jako alternativa k pouití kombinace DNA vazebné domény a přirozeně se vyskytující aktivační domény nebo její modifikované formy, může být aktivační doména nahrazena jedním z vazebných proteinů spojených se spojem mezi transkripční aktivační doménou a RNA polymerásou, zahrnující, ale neomezující se na RNA polymerásu II. tyto proteiny zahrnují proteiny označené jako TAF, TFII proteiny, zejména B a D a podobně. Je tak možno použít jakéhokoliv jednoho nebo kombinace proteinů, například fúzovaných proteinů nebo jejich vazebných motivů, které slouží ve spoji mezi DNA vazebným proteinem a RNA polymerasou a umožňujíiniciaci transkripce. Výhodně bude použit protein nejbližší k RNA polymerása ve spojení s DNA vazebnou doménou pro umožnění iniciace transkripce. Je-li to žádoucí, mohou být tyto konstrukty poskytnuty pro tři nebo více, obvykle ne více než asi 4, proteiny, které společně poskytnou transkripční iniciační komplex.

Spíše než transkripční aktivační doména jako je akční doména, může být použita inaktivační doména jako je ssn-6/TUP-.t nebo supresorová doména Kruppelovy rodiny.Tímto způsobem vede regulace ke přerušení transkripce genu, který je konstitutivně exprimován. Například v případě genové terapie může být poskytnuta konstitutivní exprese hormonu jako je růstový hormon, krevní proteiny, imunoglobuliny atd. Při použití konstruktů, kódujících jeden chimérní protein, obsahující DNA vazebnou doménu připojenou k ligandové vazebné doméně a další chimérní protein, obsahující inaktivační doménu připojenou k llganové vazebné doméně, může být exprese genu inhibována přes ligandem zprostředkovanou o 1igomerizaci.

Jsou navrženy konstrukty, kódující chimérní protein, obsahující inter alia ligandovou vazebnou doménu fúzovanou k transkripční aktivační doméně nebo podjednotce, transkripční inaktivační doméně nebo DNA vazebné doméně a sestaveny stejným způsobem jak je popsáno pro jiné konstrukty, často bude N-konec transkripčního faktoru navázán k C-konci 1igan-vazebné domény, i když v některých případech ú -t bude opak pravdou, například tam, kde jsou dvě jednotlivé domény jediného transkripčního faktoru rozděleny mezi dvě různé chiméry.

III. Exocystosa

Další aplikací ligandem zprostředkovaného o 1igomeri začniho mechanismu je exocystosa, kde je kontrolován ligandem spíše export proteinu než transkripce. Toto může být použito ve spojení s expresí jednoho nebo více proteinů, které jsou středem zájmu, jako alternativa k dosažení sekrece proteinu(ů), které jsou středem zájmu přes sekreční signální sekvenci. Toto provedení zahrnuje dva různé první konstrukty. Jeden konstrukt kóduje chimérní protein, který směruje protein k vesiklu proto, aby byl integrován do vesikulární membrány jak je popsáno Sollnerem a spol., supra. Proteiny mohou být použity jako vesikkulární vazebný protein, obsahující VAMP (synaptobrevin), SNC2, rab3, SEC4, synaptotagmin atd., jednotlivě nebo v kombinaci. Buněčný membránový protein může zahrnovat syntaxin, SSO1, SSO2, neurexin atd., jednotlivě nebo v kombinaci. Jiný konstrukt umožňuje transport k povrchové membráně a využívá myristoyl signální sekvenci, jinou plasmovou membránovou cílovou sekvenci (např. pro prenylaci) nebo transmembránovou retenční doménu jako je popsána výše. Kódované proteiny jsou popsány ve výše citovaných odkazech a celé nebo jako funkční část, mohou sloužit jako akční domény.Tyto konstrukty by mohly být použity ve spojení s expresí exogenního proteinu, správně kočovaného pro transport k vesiklu nebo pro endocytotický endogenní protein, pro zvýšení exportu endogenního proteinu.

Pro exocystosu mohou být použity různé mechanismy. V závislosti na buněčném typu a proteinu, který je limitující pro exocystosu v buňce, může být jeden nebo více konstruktů, majících citlivý prvek, který je aktivován ligandem. Zvláště zajímavá je kombinace VAMP a syntaxinu. Alternativně, může být konstrukt poskytnut pro konstruktivní expresi neomezujících proteinů řídících exocystosu a být poskytnut pro ligandem regulovanou expresi exocystosu omezujícího proteinu. Konečně, může být konstrukt poskytnut pro konstitutivní expresi chimérních proteinů spojených s exocystosou takže je exocystosa řízena oligomerací chimérních proteinů s ligandem. Použitím vhodných vazebných domén, je monžno poskytnout konstrukty pro rozdílné chimérní proteiny, které budou oligomerovat na povrchu vesiklu za tvorby aktivního komplexu a/nebo spojení vesiklového proteinu(ů) s proteinem povrchu buněčné membrány přes ligand. Chimérní proteiny nesmí poskytovat exocystosu za nepřítomnosti ligandu díky modifikacím v ligandu, které podstatně redukují vazebnou afinitu mezi proteiny řídícími exocystosu, jako jsou delece, mutace atd. Tyto modifikace mohou být snadno stanoveny využitím přesahujících fragmentů jednotlivých proteinů a stanovením, které proteiny zachovávají aktivitu. Fragmenty mohou být dále modifikovány použitím alaninových substitucí pro stanovení jednotlivých aminokyselin, které v podstatě ovlivňuji vazbu (Boehncke a spol., J.Immunol. (1993)150, 331-334; Evavold a spol., ibid (1992) 148, 347-353).

Proteiny sestavené v lumenu vesiklu, jakož i fúzované proteiny spojené s exocystosou mohou být exprimovány konstitutivně nebo inducibilně, jak je popsáno výše. V závislosti na účelu exocystosy, zda jsou zahrnuty endogenní nebo exogenní proteiny, zda proteiny, které jsou exportovány jsou exprimovány konstitutivně nebo inducibilně, zda může být stejný ligand použit pro iniciaci trabskripce fúzovaných proteinů spojených s exocystosou a proteiny, které budou exportovány, nebo zda jsou různé proteiny subjektem pro různé inducibilní signály, mohou determinovat způsob, kterým je exprese řízena. V jednom aspektu by měl mchanismus exocystosy byt řízen pouze ligandem. V jiných aspektech, jak exprese alespoň jednoho proteinu a exocystosa mohou být pod kontrolou ligandů.

Různé proteiny mohou být modifikovány zavedením buněčné cílové sekvence pro translokaci proteinu do vesiklu bez ztráty fyziologické aktivity proteinu. Při použití exocystosy jako doručovacího mechanismu, mohou být relativně vysoké dávky doručovány během krátké časové periody za získání vysoce lokalizované hladiny proteinu nebo vysoké koncentrace ve vaskulárním systému, v závislosti na charakteru hostitele. Proteiny, které jsou středem zájmu, zahrnují např. inzulín, aktivátor tkáňového plasminogenu, cytokiny, erythropoieti η, faktory stimulující kolonie, růstové faktory, zánělivé peptidy, faktory buněčné migrace.

Kódující sekvence pro řízení proteinů k vesiklu jsou dostupné z vesiklových vazebných proteinů spojených s exocystosou. Viz například Sollner a spol., supra.

Dalším použitím oligomerizačního mechanismu je kontrola proteinové degradace nebo inaktivace. Například relativně stabilní chimérní protein nebo protein s dlouhou živostností podle vynálezu mohou být destabilizovány nebo cíleny pro degradaci ligandem zprostředkované o 1igomerizace s rozdílným chimérním proteinem podle tohoto vynálezu, který má relativně krátký poločas životnosti nebo který jinak destabilizuje nebo cílí oligomer pro degradaci. V tomto provedení ligandem zprostředkovaná oligomerizace reguluje biologické působení proteinu tím, že zkracuje jeho poločas životnosti. Posledně uvedený chimérní protein může obsahovat doménu cílení proteinu k lysozomu nebo doménu, činící protein náchylný k proteolytickému štěpení v cytosolu nebo jádru nebo nelysosomální organele.

Poločas života proteinů v buňkách je determinován mnoha faktory, které zahrnují přítomnost krátkých aminokyselinových sekvencí v uvedeném proteinu bohatých na aminokyselinové zbytky prolinu, kyseliny glutamové, šeřinu a threoninu,odtud PĚST, jiné sekvence s podobnou funkcí, místa citlivá ke štěpení proteásou a stav ubiquitinizace. Ubiquitinizace je modifikace proteinu jednou nebo více jednotkami krátkého polypeptidového řetězce, ubiquitinu, který cílí proteiny pro degradaci.Rychlost ubiquitinizace proteinů je považována za omezenou zejména identitou N-terminální aminokyseliny zpracovávaného proteinu a jedním nebo více unikátními lysinovými zbytky blízkými aminokonci.

IV. Jiné regulátorové systémy

Jiné biologické funkce, které mohou být kontrolovány o 1 igomerizací jednotlivých aktivit spojených s individuálními proteiny jsou protein kinásová nebo foafatásová aktivita, reduktásová aktivita, cyklooxygenásová aktivita, proteásová aktivita nebo jakékoliv jiné enzymatické reakce závislé na subjednotkové asociaci. Také může poskytovat asociaci G-proteinů s receptorovým proteinem spojeným s buněčným cyklem, např. cycliny a cdc kinásy, multijednotkovými detoxifikačními enzymy.

V. Složky konstruktů

Druhý nebo další volitelné konstrukty (genové konstrukty) spojené se skupinou (1) a (2) volitelných dalších

3ο chimérních proteinů zahrnují transkripční iniciační region, mající indikující cílovou rozpoznávací sekvenci nebo odpovídající element, takže budou odpovídat na signál iniciace z aktivovaného receptoru nebo aktivovaných transkripčních faktorů, což vede k tomu, že alespoň jeden gen, který je středem zájmu, je transkribován so sekvence(í), které jsou středem zájmu, obvykle mRNA, jehož transkripce a, výhodně, translace, mohou vést k expresi proteinu a/nebo regulaci jiných genů, např. antisense, expresi transkripčních faktorů, expresi membránových fuzních proteinů atd.

Pro různé účely a různámísta budou použity různé vazebn domény a různé cytoplasmické domény. Pro chimérní proteinové receptory spojené s povrchovou membránou, je-li ligand vázající doména extracelulární, mohou být chimérní proteiny konstruovány tak, aby obsahovaly extracelulární doménu vybranou z mnoha povrchových membránových proteinů. Podobně mohou být použity různé cytoplasmické nebo intracelulární domény povrchových membránových proteinů, které jsou schopné převádět signál, v závislosti na kterých jsou regulovány endogenní geny cytoplasmickou částí. Tam, kde je chimérní protein vnitřní, vnitřní k povrchovému membránovému proteinu nebo spojeny s organelou, např. jádrem, vesiklem atd., bude ligand vázající doména proteinu omezena na domény, které mohou vázat molekuly, které mohou zesíťovat povrchovou membránu nebo jinou membránu, podle potřeby. Proto se tyto vazebné domény budou obecně vázat k malým přirozeně se vyskytujícím nebo syntetickým ligandovým molekulám, které nezahrnují proteiny nebo nukleové kyseliny.

A. Cytoplasmické domény

9

Chimérní proteinový receptor skupiny (1) může obsahovat cytoplasmickou doménu jednoho z různých buněčných povrchových membránových receptorů, včetně jejich muteinů, kde rozpoznávací sekvence zahrnutá v iniciaci transkripce spojené s cytoplasmickou doménou je známá nebo je znám gen, odpovídajíc takové sekvenci. Mutantové receptory, které jsou středem zájmu, budou disociovat transkripční aktivaci cílového genu z aktivace genů, které mohou být spojeny s nežádoucími vedlejšími účinky, jako je deregulovaný buněčný růst nebo nevhodné uvolnění cytokinú. S receptorem spojené cytoplasmické domény, které jsou zvláště zajímavé, budou mít následující charakteristiky: aktivace receptorů vede k iniciaci transkripce relativně málo (žádoucí je méně než 100) a obecně neškodných genů v buněčném hostiteli; jiné faktory nezbytné pro transkripci iniciovanou receptorovou aktivací jsou přítomny v buněčném hostiteli; geny, které jsou aktivovány jinými než cílovými geny nebudou ovlivňovat zamýšůený účel, pro který by tyto buňky měly být použity; oligomerizace cytoplasmické domény nebo jiného dostupného mechanismu vede k iniciaci signálu; a spojení cytoplasmické domény k požadované 1igand-vázající doméně nebude interferovat se signalizaci.Je známo mnoho různých cytoplasmických domén. Mnohé z těchto domén jsou tyrosin kinásy nebo jsou komplexovány s tyrosin kinásami, např. CD3 , IL-2R, IL-3R atd. Přehled viz Cantley a spol., Ce11 (1991)64 ,

281. Receptory tyrosin kinásy, které jsou aktivovány zesíťovací vazbou, anpř. dimerizací (podle nomenklatury poprvé navržené Yardenem a Ulrichem,

Annu.Rev.Biochem.(1988)57, 443, zahrnují podtřídu I; EGF-R, ATR2(neu, HER2/neu, HER3/c-erbB-3, Xmrk; podtřídu II: inzulin-R, IGF-l-R řreceptor inzulínu podobného růstového faktoru, IRR; podtřídu III: PDGF-R-A, PDGF-R-B, CSF-l-R (M-CSF/c-Fms), c-kit, STK-l/Flk-2 a podtřídu IV: FGR-R, fig

4ϋ kyselý FGF, bek bazický FGF; neurotrofní tryosin kinásy; Trk rodinu, zahrnující NGF-R, Rorl,2. Receptory, které asociují s tyrosin kinásami při zesítění, zahrnují CD3 -rodinu: CD3 a CD3 (nalezeny zejména v T buňkách, spojené s Fyn); β a řetězce Fc RI (nacházené zejména v obrovských buňkách a basofilech); řetězec Fc RII/CD16 (nacházen zejména v makrofázích, neurofilech a přirozených zabíječských buňkách; CD3gama, - 6 a -e (nacházený zejména v T buňkách); Ig-α/ΜΒ-Ι a Ig~3/B29 (nacházený zejména v B buňkách). Mnoho receptorů cytokinu a růstového faktoru asociuje s běžnými β podjednotkami, které interagují s tyrosin kinásami a /nebo jinými signálními molekulami a mohou být použity jako cytoplasmické domény v chimérních proteinech podle vynálezu. Tyto zahrnují (1) běžnou β podjednotku sdílenou GM-CSF, IL-3 a IL-5 receptory; (2) β řetězec gp 130 spojený s IL-6, leukémii inhibující faktor (LIF), ciliární neurotrofní faktor (CNTF), oncostatin M a IL-lí receptory; (3)IL-2 receptor gama podjednotku asociovanou také s receptory pro IL-4, IL-7 a IL-3 (a možná IL-9) a (4) β řetězec IL-2 receptorů, který je homologní k cytoplasmické doméně G-CSF receptorů.

Jako zdroje cytoplasmických domén mohou být rovněž použity receptory interferonové rodiny, které zahrnují interferony α/β a gama (které mohou aktivovat jednoho nebo více členů JAK, Tyk rodiny tyrosin kinás) jakož i receptory pro růstový hormon, erythropoietin a prolaktin (které také mohou aktivovat JAK2).

Jiné zdroje cytoplasmických domén zahrnují TGF-β rodinu buněčných povrchových receptorů (viz Kongsley D., Genes and

Development 1994 8 133). Tato rodina receptorů obsahuje serin/threonin kinásovou aktivitu ve svých cytoplasmických doménách, o kterých se předpokládá, že budou aktivovány zesítěním.

Tyrosin kinásy spojené s aktivací a inaktivací transkripčních faktorů jsou zvláště zajímavé při poskytnutí specifických drah, které mohou být kontrolovány a mohou být použity pro iniciaci nebo inhibici exprese exogenního genu.

Následující tabulka poskytuje mnoho receptorů a charakteristik spojených s receptorem a jeho jadernými odovídajícími prvky,které aktivují geny. Seznam není omezující, ale poskytuje příklady systémů pro použití v předloženém vynálezu.

V mnoha situacích mohou být získány mutované cytoplasmické domény, kde signál, který je převáděn se může lišit od standardního typu, což vede k omezené nebo jiné dráze ve srovnání s drahami(drahou) standardního typu. Například, v případě růstových faktorů jako je EGF a FGF, byly uvedeny mutace, kde signál je nekopulován z buněčného růstu, ale je ještě udržován s c-fos (Peters a spol., Nátuře (1992) 358, 678).

Tyrosin kinásové receptory mohou být v lidském těle nalezeny na mnoha různých buňkách. Naopak, CD3 -rodina, Ig rodina a rodina lymfokin β-řetězcového receptorů jsou nacházeny zejména na hematopoietických buňkách, zejména T-buňkách, B-buňkách, obrovských buňkách, basofilů, makrofágů, neutrofilů a přírodních zabíječských buňkách. Signály vyžadované pro NF-AT transkripci pocházejí převážně ze zeta (^) řetězce antigen receptorů a v menším rozsahu zasahují CD3gama, <5, epsilon.

4· 2

Cytoplasmická doména, jak existuje v přírodě nebo jak může být zkrácena, modifikována nebo mutována, bude mít alespoň asi 10, obvykle alespoň asi 30 aminokyseliny, méně obvykle alespoň asi 50 aminokyselin a obecně ne více než asi 400 aminokyselin, obvykle ne více než asi 200 aminokyselin, (viz Romeo a spol., Cell (1992)68, 889-893). I když mohou být použity jakékoliv druhy, jsou obvykle preferovány druhy endogenní k hostitelské buňce. Nicméně v jakémkliv případě, může být účinně použita cytoplasmická doména z odlišných druhů. Jakokoliv z výše uvedených cytoplasmických domén může být použita, jakož i jiné, které jsou v současnosti známy nebo mohou být následně objeveny.

Tabulka 1
Ligand	DNA e1ement	vazebné faktor(y)	gen	odkaz
inzulin a jiné	cAMP citlivý prvek (cre)	LRFI	jun-B mnoho genů	Mol.Cell Biol.(1992),12, 4654 PNAS,83,3439
PDGF FGF,TGF a j iné	SRE	SRF/SR EBP	c-f os	Mol.Cell Biol.(1992),12, 4769
EGF	VL30 RSFR		RVL-3 virus c-jun	Mol.Cell.Biol.(1992),12, 2793 do.(1992) , 12, 4472
IFN-a	ISRE	ISGF-3		Gene Dev.(1989)3, 1362

3

IFN- GAS	GAF	GBP	Mol.Cell.Biol.(1991)11, 182
PMA a	AP-1	mnoho	Cell (1987) 49, 729-739
TCP		genů
TNF	NFkB	mnoho	Cell(1990)62, 1019-1029
		genů
anti- ARRE-1	OAP/O	mnoho	Mol.Cel 1.Biol.(1988) 8,1715
gen	ct-1	genů
anti- ARRE-2	NFAT	IL-2	Science (1988) 241, 202
		enhancer
Většinou se	jiné chimérní proteiny spojené
s transkripčními	faktory,	se budou	zejména lišit v tom,
že mají buněčnou	cílovou	sekvenci,	která směruje chimérní

protein ke vnitřnímu povrchu jaderné membrány a mají transkripční faktory nebo jejich části jako akční domény.

Obvykle akční domény transkripčního faktoru mohou být rozděleny na DNA vazebné domény a aktivační domény. Může být poskytnuta DNA vazebná doména s jednou nebo více ligand vázajícími doménami. V této cestě může být DNA vazebná doména kopulována k mnoha vazebným doménám a/nebo aktivačním doménám. Jinak je diskuse pro chimérní protein spojený s povrchovou membránou pro signální transdukci aplikovatelná na chimérní proteiny pro přímou vazbu ke genomové DNA. Podobně se bude chimérní protein spojený s exocystosou rozlišovat zejména proteiny spojené s fúzí vesikulové membrány s buněčnou mebránou, místo transdukce cytoplasmických proteinů.

B.Buněčné cílové domény

Signální peptid nebo sekvence poskytuje transport chimérního proteinu k buněčné povrchové membráně,kde stejné nebo jiné sekvence mohou kodovat vazbu chimérního proteinu k buněčné povrchové membráně. Protože je zde obecný motiv signálních sekvencí, dvě nebo tři N-terminální polární aminokyseliny následované asi 15-20 zejména hydrofobními aminokyselinami, mohou být jednotlivé aminokyseliny v širokém rozsahu měněny. Proto může být použit v podstatě jakýkolic signální peptid, který je funkční v hostiteli a může nebo nemusí být spojen s jednou z dalších domén chimérního proteinu. Normálně je zpracován signální peptid a nebude ve zralém chimérním proteinu zachován. Sekvence, kódující signální peptid je na 5’-konci kódující sekvence a bude obsahovat iniciační methioninový kodon.

Volba membránové retenční domény není kritická pro tento vynález, protože bylo zjištěno, že takové membránové retenční domény jsou v podstatě zaměnitelné a není zde žádná podstatná aminokyselina vyžadovaná pro vazbu nebo navázání k jiným membránovým regionům pro aktivaci. Membránová retenční doména tak může být izolována z jakéhokoliv povrchového membránového nebo cytoplasmického proteinu, af je či není endogenní k hostitelské buňce.

Jsou zde alespoň dvě rozdílné membránové retenční domény transmembránová retenční doména, kterou je aminokyselinová sekvence, která se prostírá přes membránu a lipidová membránová retenční doména, která lipidy spojuje s lipidy buněčné povrchové membrány.

Většinou, pro snadnost konstrukce, mohou být použity transmembránová doména cytoplasmické domény nebo receptorová doména,, kter mají sklon zjednodušit konstrukci fúzovaného proteinu. Nicméně u lipidové membránové retenční domény bude obvykle zpracovávaní signál přidán na 5' konec kódující sekvence pro N-terminální vazbu k membráně a nejblíže ke 3' konci pro C-terminální vazbu. Lipidová membránová retenční doména bude mít lipid od asi 12 do 24 atomů uhlíku, zejména 14 atomů uhlíku, zvláště myristoyl, připojený ke glycinu. Signální sekvence pro lipidovou vazebnou doménu je N-terminální sekvence a může být v širokém rozsahu měněna, a má obvykle glycin na zbytku 2 a lysin nebo arginin na zbytku 7 (kaplan a spol., Mo1.Ce11.Bio 1. (1988)8, 2435). Peptidové sekvence, obsahující posttranslační zpracování pro poskytnutí lipidové membránové vazby jsou popsány Carrem a spol., PNAS USA (1988) 79, 6128; Aitken a spol., FEBS Lett.(1982) 150 ,

314, Henderson a spol., PNAS USA (1983)80, 319, Schulz a spol., Virology (1984), 123, 2131, Dellman a spol.. Nátuře (198) 314, 374 a přehled v Ann.Rev.of Biochem. /(1988) 57,

69. Aminokyselinová sekvence, která je středem zájmu, zahrnuje sekvenci M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R. Mohou být použity různé DNA sekvence pro kódování takové sekvence ve fúzovaném receptorovém proteinu.

Obecně bude mít transmembránová doména asi 18 až 30 aminokyselin, obvykleji asi 20-30 aminokyselin, kde centrální část budou zejména neutrální, nepolární aminokyseliny a konec domény budou polární aminokyseliny, často nabité aminokyseliny, obecně mající asi 1-2 nabité, převážně bázické aminokyseliny na konci transmembránové domény následované zbytkem přetržené šroubovice, např. pro- nebo gly-.

C. Ligandová vazebná doména

Ligandová vazebná (dimeri začni nebo receptorová) doména jakéhokoliv z chimérních proteinů podle tohoto vynálezu může být běžná doména, která umožňuje pro indukci využití, nebo vazbu k, přírodnímu nebo nepřírodnímu ligandu, výhodně nepřírodního syntetického ligandu. Vazebná doména

O může být vnitřní nebo vnější k buněčné membráně, v závislosti na charakteru konstruktu a volbě ligandu.Je známo mnoho vazebných proteinů, bsahujících receptory, zahrnující vazebné proteiny spojené s cytoplasmickými regiony uvedenými výše. Zvláště zajímavé jsou vazebné proteiny pro které jsou ligandy (výhodně malé organické ligandy) známy nebo mohou být snadno produkovány. Tyto receptory nebo ligand vazebné domény zahrnují FKBP a cyc1ofi 1inové receptory, steroidní receptory, tetracyklinové receptory, jiné receptory uvedené výše a podobně jakož i nepřírodní receptory, které mohou být získány z protilátek, zejména podjednotek těžkých nebo lehkých řetězců, náhodných aminokyselinových sekvencí získaných stochastickými postupy, komhinatorními syntézami a podobně. Většinou budou receptorové domény mít nejvýše asi 500 aminokyselin a méně než asi 350 aminokyselin, obvykle méně než 200 aminokyselin, bud jako při rozené domény nebo jejich zkrácené aktivní části. Výhodně budou vazebné domény malé (<25 kDa, pro umožnění účinné transfekce ve virálních vektorech), monomerní (toto neplatí v systému avidin-biotin) a měly by být synteticky dostupné, permeabilni pro buňky, netoxické ligandy, které mohou být konfigurovány pro dimerizaci.

Receptorová domééna může být intracelulární nebo extracelulární v závislosti na dezénu konstruktu, kódujícího chimérní protein a dostupná pro vhodný ligand. Pro hydrofobní ligandy může být vazebná doména na jedné straně membrány, ale pro hydrofilní ligandy, zejména proteinové ligandy, bude vazebná doména obvykle vnější k buněčné membráně, pokud zde není transportní systém pro internalizaci ligandu do formy, ve které je dostupná pro vazbu. U intracelulárního receptorů konstrukt může kodovat signální peptid a transmembránovou doménu 5' nebo 3' receptorové doménové sekvence nebo mít

7 lipidovou připojenou signální sekvenci 5' nebo 3' receptorové doménové sekvence. Je-li receptorové doména mezi signálním peptidem a transmembránovou doménou, bude receptorové doména extracelulární.

Část konstruktu, kódujícího receptor, může býtpodrobena mutagenesí z různých důvodů. Mutagenizovaný protein může poskytovat vyšší vazebnou afinitu, umožňovat diskriminaci ligandem přirozeně se vyskytujícího receptorů, poskytovat protějšky k dezénu reptor-1igandového páru nebo podobně.

Změna v receptorů může zahrnovat změny v aminokyselinách známé jako jsoucí na vazebném místě, náhodnou mutagenesí za použití kombinatorních technik, kde kodony aminokyselin spojené s vazebným místem nebo jiných aminokyselin spojených s konformačními změnami mohou být subjektem mutagenese změnou kodonu(ů) pro jednotlivou aminokyselinu, bud se známou změnou nebo náhodnou, exprimující výsledné proteiny ve vhodném prokaryontním hostiteli a pak screening výsledných proteinů na vazbu. Ilustrativní pro tuto situaci je modifikace Phe36 v FKBP12' na Ala a/nebo Asp37 na Gly nebo Ala pro přizpůsobení substituentu v polohách 9 nebo 10 FK506 nebo FK520. Zejména skupiny mutantu FKBP12, které obsahují Val, Ala, Gly, Met nebo jiné malé aminokyseliny místo jednoho nebo více Tyr26, Phe36, Asp37, Tyr82 a Phe99, jsou zvláště zajímavé jako receptorové domény pro ligandy typů FP506 a FK520, obsahující modifikace na C9 a/nebo CIO.

Podjednotky protilátek, např. těžký nebo lehký řetězec, zejména fragmenty, zvláště celý nebo část variabilního regionu, nebo fúze těžkého a lehkého řetězce pro vytvoření vysoce afinitní vazby, mohou být použity jako vazebná doména. Protilátky mohou být připraveny proti haptenickým molekulám, které jsou fyziologicky přijatelné a jednotlivé protilátkové

8 podjednotky byly screenovány na vazebnou afinitu. cDNA, kódující podjednotky může být izolována a modifikována delecí konstantního regionu, částí variabilního regionu, mutagenesx variabilního ragionu, pro získání vazebné proteinové domény, která má vhodnou afinitu pro ligand. V tomto postupu, většinou může být použita jakákoliv fyziologicky přijatelná haptenická sloučenina jako ligand nebo pro poskytnutí epitopu pro ligand. Místo proti látkových jednotek mohou být použity přírodní receptory, kde je vazebná doména známá a je vhodná jako ligand pro vazbu.

Schopnost použít in vitro mutagenesi nebo kombinační modifikace sekvencí, kódujících proteiny umožňují produkci knihoven proteinů, které mohou být screenovány na vazebnou afinitu pro různé ligandy. Například je možno zcela náhodně zpracovat sekvenci 1 až 5, 10 nebo více kodonů, na jednom nebo více místech v DNA sekvenci kódující vazebný protein, vyrobit expresní konstrukt a zavést expresní konstrukt do jednobuněčného mikroorganismu a vyvinout knihovnu. Je možno knihovnu screenovat na vazebnou afinitu k jednomu, je-li to žádoucí k více ligandům. Nejlepší afinitní sekvence, které jsou kompatibilní s buňkami, do kterých by měly být zavedeny, mohou být pak použity jako vazebná doména. Ligand by měl být screenován s hostitelskými buňkami , které se používají pro stanovení hladiny vazby ligandu k endogenním proteinům. Vazebný profil by mohl být definován zhodnocením poměru vazebné afinity k mutgenizované vazebné doméně s vazebnou afinitou k endogenním proteinům. Tyto ligandy, které mají nejlepší vazebný profil by pak mohly být použity jako ligand. Při provedení výše uvedeného je možno použít techniky zobrazování fágů, které jsou uvedeny jako neomezující příklad.

D. Multimerizace

Převodový signál bude normálně vznikat z ligandem zprostředkované oligomerizace chimérních proteinových molekul,tj. jako výsledek oligomerizace po ligandové vazbě, i když pro iniciaci signálu mohou být použity i jiné vazebné momenty, například allosterická aktivace. Konstrukt chimérního proteinu se bude měnit podle uspořádání různých domén a podle počtu opakování jednotlivých domén.

Pro extracelulární receptorovou doménu ve směru 5'-3' transkripce, bude konstrukt kodovat protein, obsahující signální peptid, receptorovou doménu, transmembránovou doménu a signální iniciační doménu,kde poslední doména bude intracelulární (cytoplasmická). Nicméně je-li receptorová doména intracelulární, mohou být použita různá uspořádání,kde signální peptid může být následován bud receptorovou nebo signální iniciační doménou, následovanou zbývající doménou nebo s více receptorovými doménami, signální iniciační doména může být uložena mezi recptorovými doménami. Obvykle bude aktivní místo signální iniciační domény vnitřní vzhledem k sekvenci a nevyžaduje volný karboxylový konec. Kterákoliv z domén může být multimerizována, zejména receptorová doména, obvykle nemající více než asi 5 opakování, obvykleji ne více než asi 3 opakování.

Pro multimerizaci receptorů bude ligand pro receptorově domény chimérních povrchových membránových proteinů obvykle multimerizován v tom smyslu, že bude mít alespoň dvě vazebná místa,s každým vazebným místem schopným vazby k receptorově doméně. Je žádoucí, aby tyto ligandy byly dimer nebo vyšší oligomer, obvykle ne větší než asi tetramer, malých syntetických organických molekul, kde jednotlivé molekuly typicky jsou velikosti alespoň asi 150 D a menší než asi 5 οϋ kD, obvykle menší než asi 3 kD. Mohou být použity různé páry syntetických ligandů a receptoru. Na příklad, v provedeních, zahrnujících přirozené receptory, může být použit dimernx FK506 s FKBP receptorem, dimerizovaný cyclosporin A může být použit s cyc1ofi 1inovým receptorem, dimerizovaný estrogen s estrogenovým receptore, dimerizované glukokortikoidy s glutikortikoidovým receptorem, dimerizovaný tetracyklín s tetracyklinovým receptorem, dimerizovaný vitamin D s vitamin D receptorem a podobně. Alternativně mohou být použita vyšší uspořádání ligandů, např. trimery. V provedeních, zahrnujících nepřírodní receptory, např. protilátkové podjednotky, modifikované protilátkové podjednotky nebo modifikované receptory a podobně,mohou být použity jakékoliv velké variace sloučenin. Signifikantní charakteristikou těchto ligandových jednotek je, že vážou receptor s vysokou afinitou (výhodně s Kd< 10~⁸M) a jsou schopny být dimerizovány chemicky.

Ligand může mít různé receptor vázající molekuly s různými epitopy (označované také jako HED činidla), protože tyto mohou zprostředkovat heterodimerizaci nebo heteroo1 igomerizaci chimérních proteinů, majících stejné nebo rozdílné vazebné domény. Například může ligand obsahovat skupiny typu FK506 nebo FK506 a skupinu typu CsA nebo cyklosporinu. Obě skupiny jsou kovalentně připojeny k obvyklé linkerové skupině. Takový ligand by mohl být vhodný pro zprostředkování oligomerizace prvního a druhého chimérního proteinu, kde první chimérní protein obsahuje receptorovou doménu jako je FKBP12, která je schopna vazby ke skupině typu FK506 a druhý chimérní protein obsahuje receptorovou doménu jako je cyklofilin, který je schopen vazby ke skupině typu cyklosporinu A.

VI. Buňky

Buňky mohou být prokaryotní, ale výhodně jsou eukaryotní zahrnující buňky rostlinné, kvasinkové, červů, hmyzu a savců. Zvláště preferováno je, aby byly buňky buňky savčí, zejména primátů, zvláště lidí, ale mohou být asociovány s jakýmikoliv zajímavými živočichy, zejména domestikovanými zvířaty jako jsou vepři, myši, psi, kočky atd. Z těchto druhů mohou být použity různé typy buněk, jako jsou buňky hematopietické, neurální, mesenchymální, kutánní, mukosální, stromální, svalové, slezinové, retikuloendotheliání, epitheliální, endothe1iální, jaterní, ledvinové, gastrointestinální, plicní atd. Zvláště zajímavé jsou hematopoietické buňky, které zahrnují jakékoliv jaderné buňky, které mohou být zahrnuty v lymfoidních nebo myelomonocytických spojeních. Zvláště zajímavé jsou membrány T- a B-buněčného spojení, makrofágy a monocyty, myoblasty a fibroblasty. Zvláště zajímavé jsou také kmenové a progenitorové buňky jako jsou hepatopoietické, neurální, stromální, muskulární, jaterní, plicní, gastrointestinální atd.

Buňky mohou být autologní buňky, syngenní buňky, allogenní buňky a v některých případech i xenogenní buňky. Buňky mohou být modifikovány změnou hlavního histokompatibilního komplexního (MHC) profilu, při inaktivaci β2-mikroglobulinu pro zabránění tvorby molekul funkční třídy I MHC, inaktivaci molekul třídy II, za poskytnutí exprese jedné nebo více MHC molekul, zvýšení nebo inaktivace cytotoxických schopností zvýšením nebo inhibici exprese genů spojených s cytotoxickou aktivitou a podobně.

V některých případech mohou být zajímavé specifické klony nebo oligoklonální buňky, kde buňky mají zvláštní

2 specifítu, jako jsou T buňky a B buňky, mající specifickou antigenní specífitu nebo specifítu usazení do cílového místa.

VII. Ligandy

Mnoho různých ligandů, zahrnujících jak přirozeně se vyskytující tak syntetické substance, může být použito v tomto vynálezu pro ovlivnění o 1 igomerizace molekul cnimérních proteinů. Použitelnými a snadno sledovatelnými nebo měřitelnými kriterii pro výběr ligandu jsou: (A) ligand je fyziologicky přijatelný (např.postrádá toxicitu vůči buňkám nebo živočichovi, pro které je použit), (B) má přiměřený terapeutický dávkový rozsah, (C) je žádoucí (pro použití v celých živočiších, zahrnujících genové terapeutické aplikace), aby mohl být podáván orálně (je stabilní v gastrointestinálním systému a absorbován do vaskulárního systému), (D) může zesíťovat buněčné a jiné memmbrány je-li to nezbytné a (E) váže se k receptorové doméně s odpovídající afinitou pro požadovanou aplikaci. Prvním žádoucím kriteriem je, že sloučenina je relativně fyziologicky inertní, ale je schopná aktivace s receptory.Cím méně ligandu se váže k přírodním receptorům a čím menší je podíl celého ligandu, který se váže k přírodním receptorům, tím lepší bude normální odezva. Zvláště by ligand neměl mít silný biologický vliv na nativní proteiny. Z větší části budou ligandy nepeptidická a nenukleová kyselina.

Tyto sloučeniny budou mít většinou dvě nebo více jednotek, kde jednotky mohou být stejné nebo rozdílné, spojené spolu přes centrální spojovací skupinu. Jednotky budou jednotlivé skupiny (např. FK506, FK520, cyklosporin A, steroid atd.) schopné vázat receptorovou doménu. Každá z těchto jednotek bude obvykle připojena ke spojovací skupině přes stejné reaktivní skupiny, alespoň v homodimerech nebo vyšších homooligomerech.

Jak je výše uvedeno, existuje mnoho přirozeně se vyskytujících receptorů pro malé neproteinové organické molekuly, kde malé organické molekuly splňují výše uvedená kriteria a mohou být dimerizovány na různých místech za poskytnutí ligandu podle předloženého vynálezu. Možné jsou podstatné modifikace těchto sloučenin, pokud je zachována jejich vazebná kapacita a s požadovanou specifitou. Mnohé z těchto sloučenin budou makrocyklické, např. makrolidy. Vhodné vazebné afinity budou zobrazeny v Kd hodnotách pod 10 ⁴, výhodně pod 10'^&, výhodněji pod asi 10^-7, i když jsou možné i afinity pod 10^-9 nebo 10^_1° a v některých případech budou ne j žádaně jší.

V současnosti preferované ligandy zahrnují oligomery, výhodně dimery, sloučenin schopných vazby k FKBP proteinu a/nebo cyklofilin proteinu. Takové ligandy zahrnují homo- a heteromultimery (obvykle 2-4, obvykleji 2-3 jednotky) cyklosporinu A, FK506, FK520 a rapamycinu a jejich derivátů, které si zachovávají svoji vazebnou schopnost k přírodním nebo mutagenizovaným vazebným doménám. Mnohé deriváty těchto sloučenin jsou již známé, včetně syntetických vysoce afinitních FKBP ligandů, které mohou být použity v praktickém provedení tohoto vynálezu. Viz např. Holt a spol.,

J.Am.Chem.Soc. 1993, 115, 9925-9935. Zajímavá místa pro napojení FK506 a jeho analogů zahrnují polohy zahrnující kruhové uhlíkové atomy od asi 17 do 24 a polohy substituentů navázané k těmto kruhovým atomům, např. 21 (allyl), 22,37,38,39 a 40 nebo 32 (cyklohexyl), zatímco tytéž polohy s výjimkou 21 jsou zajímavé pro FK520, Pro cyklosporin jsou zajímavými místy MeBmt, poloha 3 a poloha 8.

Zvláště zajímavé jsou modifikace Iigandu, které mění jeho vazebné charakteristiky, zejména s ohledem na ligandový přirozeně se vyskatující receptor. Průvodním jevem je, že by mohl být měněn vazebný protein pro přizpůsobení se změně v Iigandu. Například je možno modifikovat skupiny v poloze 9 nebo 10 FK506 (viz Van Duyne a spol.(1991) Science 252, 839) tak, že se zvyšuje jejich sterický požadavek, nahrazením hydroxylu skupinou, mající větší sférické nároky nebo modifikací karbonylu v poloze 10, nahrazením karbonylu skupinou, mající větší sférické nároky nebo funkcionalizací karbonylu, např. tvorbou N-substituované Schiffovy báze nebo iminu, pro zvětšení objemu v této poloze. Různé funkčností, které mohou být běžně zavedeny na tato místa jsou alkylové skupiny pro tvorbu etherů, acylamidoskupiny, N-alkylované aminy, kde 2-hydroxyethy1imin může také tvořit 1,3-oxazolin nebo podobně. Obecně budou substituenty mít od asi 1 do 6, výhodně 1 až 4 a výhodněji 1 až 3 atomy uhlíku s 1 až 3, výhodně 1 až 2 heteroatomy, kterými ovykle budou kyslík, síra, dusík a podobně. Při použití derivátů bázické struktury je možno vytvořit rozdílné ligandy s různými strukturními požadavky na vazbu. U mutagenizovaných receptorů mohou mít různé receptory v podstatě stejnou sekvenci, mající rozdílné afinity pro modifikované ligandy významně se nelišící ve struktuře.

Jinými ligandy, které mohou být použity jsou steroidy. Steroidy mohou být oligomerizovány, takže je jejich přirozená biologická aktivita v podstatě potlačena bez ztráty jejich vazebné schopnosti k chimérnímu proteinu, obsahujícímu jednu nebo více steroid receptorových domén.Jako neomezující příklady je možno uvést ^Lukokort iko idy a estrogeny. Mohou být také použita různá léčiva, kde je o léčivu známo, že se váže k jednotlivému receptoru s vysokou afinitou. Toto je zejména tam, kde vazebná doména receptorů je známá, což umožňuje použít v chimérních proteinech podle vynálezu pouze vazebné domény, spíše než celého nativního receptorového proteinu.

Pro tento účel mohou být použity enzymy a inhibitory enzymů.

A. Linkery

Ve spojení mohu být zahrnuty různé funkčnosti, jako jsou amidové skupiny, zahrnující deriváty kyseliny uhličité, ehery, estery, zahrnující organické a anorganické estery, amino nebo podobně. Proposkytnutí spojení může být jednotlivý monomer modifikován oxidací, hydroxylací, substitucí, redukcí atd., za poskytnutí místa pro kondenzaci. V závislosti na monomeru mohou být zvolena různá místa jako místa kondenzace.

Multimerní ligandy mohou být syntetizovány jakýmikoliv obvyklými způsoby, kde spojovací skupina bude v místě, které neiterferuje s navázáním vazebného místa ligandu k receptorů. Jestliže se aktivní místo pro fyziologickou aktivitu a vazebné místo k receptorově doméně liší, bude obvykle žádoucí připojit aktivní místo pro inaktivaci ligandu. Různé spojovací skupiny mohou být použity, obvykle o 1-30, výhodněji od asi 1 do 20 atomů v řetězci mezi dvěma molekulami (jiné než vodík), kde spojovací skupiny budou převážně složeny z uhlíku, dusíku, vodíku, síry a fosforu. Spojovací skupiny mohou obsahovat mnoho různých funkčností, jako jsou amidy a estery, jak organické tak anorganické, aminy, ethery, thioethery, disulfidy, kvartérní amoniové soli, hydraziny atd.Řetězec může obsahovat alifatické, alicyklické, aromatické nebo heterocyklické skupiny. Řetězec bude vybrán podle snadnosti syntézy a stability mulimerního ligandu. Jestliže je žádoucí udržet dlouhodobou aktivitu, bude použit relativně inertní řetězec, takže multimerní ligandové spoj nebude štěpen. Alternativně, je-li požadována pouze krátkodobá životnot v krevním proudu, pak mohou být použity různé skupiny, které se snadno štěpí, jako jsou estery a amidy, zejména peptidy, kde cirkulující a/nebo intracelulární proteásy mohou štěpit spojovací skupinu.

Jako spojovací skupina mezi ligandy mohou být použity různé skupiny jako je alkylen, obvykle se 2 až 20 atomy uhlíku, azalkylen (kde dusík bude obvykle mezi dvěma atomy uhlíku), výhodně mající od 4 do 18 atomů uhlíku), N-alkylenazalkylen(viz výše), s obvykle 6 až 24 atomy uhlíku, arylen, obvykle se 6 až 18 atomy uhlíku, ardialkylen, obvykle s 8 až 24 atomy uhlíku, bis-karboxamidoalky1en s asi 8 až 36 atomy uhlíku atd. Ilustrativní skupiny zahrnují decylen, oktadecylen, 3-azapentylen, 5-azapenty1en,

N-butylen-5-azanonylen, fenylen, xylylen, p-dipropy1enbenzen, bis-benzoy1-1,8-diaminoktan a podobně. Multivalentní nebo jiné (viz dále) ligandové molekuly, obsahující linkerové skupiny jak jsou popsány výše, mohou být hodnoceny chimérními proteiny podle předloženého vynálezu, nesoucími odpovídající receptorové domény za použití materiálů a metod popsaných v příkladech, keré následují.

B. Charekteristiky ligandů.

Pro intracelulární vazebné domény bude ligand vybrán tak, aby byl schopen být transferován přes membránu v bioaktivní formě, ti jest, aby byl prostupný membránou. Různé ligandy jsou hydrofobní nebo mohou být vyrobeny za vhodné modifikace lipofilními skupinami . Výhodně může spojovací můstek sloužit ke zvýšení lipofilicity ligandu poskytnutím alifatického postranního řetězce, majícího asi 12 až 24 atomů uhlíku. Alternativně, mohou být poskytnuty jedna nebo více

7 skupin, které budou zvyšovat transport membránou a jak je žádoucí bez tvorby endosomů.

V některých případech není nutné používat multimerní ligandy. .Například mohou být použity molekuly, kde jsou poskytnuta dvě rozdílná vazebná místa pro dimerizaci receptoru. V jiných případech může navázání ligandu vést ke konformační změně, vedoucí k aktivaci, např. oligomerizaci, receptoru. Jiný mechanismus může být také použitelný pro indukci signálu, jako je vazba jediného receptoru se změnou v konformaci vedoucí k aktivaci cytoplasmické domény.

C. Antagonisté ligandů

Pro obrácení účinku multimerního ligandu mohou být použity monomerní ligandy, tj. pro prevenci, inhibici nebo přerušení nebo udržování tvorby oligomeru. Jestliže je třeba rychle ukončit vliv buněčné aktivace, může být použit monomerní ligand. Běžně může být rodičovská ligandová skupina modifikována na stejných místech jako multimer, za použití stejného postupu s výjimkou náhrady monofunkční sloučeniny za polyfunkční sloučeninu. Místo polyaminů mohou být použity monoaminy, zejména mající od 2 do 20 (i když mohou být delší) a obvykle mající 2 až 12 atomů uhlíku, jako je ethylamin, hexyiamin, benzylamin atd. Alternativně může být použita monovalentní rodičovská sloučenina, v případech (nebo v dávkových hladinách), ve kterých rodičovská sloučenina neposkytuje nežádoucí fyziologickou aktivitu (např. imunosupresi, mitogenesi, toxicitu atd.).

D. Ilustrativní heterooligomerizující (HED) a homoo1igomeri zující (HOD) činidla s hrboly, které se mohou vázat k mutantovým receptorům, obsahujícím kompenzátorové mutace

Jak je uvedeno výše, je možno připravit HED/HOD, která se budou vázat ke svým receptorům standardního typu (např. FKBP12) díky přítomnosti substituentů (hrbolů) na činidlech, které stéricky srážejí se zbytky postranního řetězce v receptorové vazebné kapse. Je také možno připravit odpovídající receptory, které obsahují mutace interferujících zbytků (kompenzátorové mutace) a proto získávají schopnost vázat ligandy hrboly. Použitím hrbolatých ligandových skupin a receptorových domén, nesoucích kompenzátorové mutace, bu měla být zvýšena specifita a tak potence našich činidel. Činidla s hrboly by se neměla vázat k endogenním receptorům standardního typu, které jinak mohou působit jako pufr vůči dimerizaci založené na přírodních ligandových skupinách. Navíc by generování nových párů receptor-1igand mohlo současně vést k získání HED činidel, která budou použita, je-li vyžadována heterodimerizace. Například regulované vesiklové fúze může být dosaženo indukcí heterodimerizace syntaxinu (plasmový membránový fuzní protein) a synaptobrevinu (vesiklový membránový fuzní protein) za použití HED činidla. Toto by mohlo nejen poskytovat výzkumný nástroj, ale mělo by také sloužit jako základ genově terapeutické léčby diabetů za použití vhodně modifikovaných sekrečních buněk.

Jak je ilustrováno hrbolatými FK1012, jsme připravili CIO acetamidové a formamidové deriváty FK506. Viz obr. 16A a naše zpráva, Spencer a spol., Controlling Signál

Transduction with Synthetic Ligands, Science 262, (1993): 1019-1024 pro další podrobnosti zahrnující syntézy

FK1012 A-C a FK506M. Zvolili jsme vytvoření dvou tříd o9 hrbolatých FK1012: jednu s hrbolem na CIO a jednu na C9. R- a S-isomery CIO acetamidu a formamidu FK506 byly syntetizovány podle reakční sekvence na obr. 16B. Tyto hrbolaté deriváty mají alespoň o tri řády menší svoji vazebnou afinitu k FKBP12 (obr.lóB). Afinity jsou determinovány měřením schopnosti derivátů inhibovat rotamasové aktivity FKBP12.

Ilustrativní člen druhé třídy C9-hrbolatých derivátů je spiro-epoxid (znázorněn na obr. 16C), který byl připraven úpravou známých postupů. Viz např. Fisher a spol.,

J.Org.Chem. 56 8(1991):2900-7 a Edmunds a spol., Tet.Lett.

32, 48(1991):819-820. Zvláště zajímavé serie C9 derivátů jsou charakterizovány jejich sp3 hybridizací a redukčně oxidačním stavem na C9. Některé takové sloučeniny byly syntetizovány podle reakcí uvedených na obr. 16C.

Je třeba, aby heterodimery (a jiné heterooligomery) byly konstruovány rozdílně od homodimerů, alespoň pro aplikace, kde by homodimerová kontaminace mohla nežádoucím způsobem ovlivnit jejich úspěšné použití.Ilustrativní strategie vyvinutá pro překonání tohoto problému je znázorněna na obr. 16D. Kondenzací mono al1oc-chráněného 1,6-hexandiaminu (Stáhl a spol., J.Org.Chem. 43 1 1 (1978): 2285-6) s der ivat izovanou formou FK506 v methylenchloridu s přebytkem triethylaminu za získání al1oc-amin-substituovaného FK506 ve 44% výtěžku.

Tento meziprodukt může být nyní použit v kondenzaci s jakoukoliv aktivovanou FK506 (nebo hrbolatou FK-506) molekulou. Odchránění s katalytickým tetrakis-trifenylfofinpalladiem za přítomnosti dimedonu při t.m. v THF odstraňuje chránící skupinu aminoskupiny. Bezprostřední zpracování s aktivovaným FK506 derivátem s následující desilylací vede k dimernímu produktu. Tato technika může být použita k syntetizování ilustrovaných HOD a bij

HED činidel.

E. Ilustrativní činidla na bázi cyklosporinu

Cyklosporin A /CsA) je cyklický undekapeptid, který se váže s vysokou afinitou (6nM) ke svému intracelulárnímu receptorů cyklofilinu, 18 kDa monomerní protein. Výsledný komplex, podobný komplexu FKBP12-FK506, se vážek a inaktivuje protein fosfatásu calcineurin, což vede k imunosupresivním vlastnostem léčiva. Pro další ilustraci tohoto vynálezu jsme dimerizovali CsA přes jeho MeBmtl postranní řetězec v 6 stupních a 35% celkovém výtěžku (CsA)2 (obr. 17, stupně 1-4 byly provedeny jak je uvedeno v Eberle a spol., J.Org.Chem.

9 (1992): 2689-91). Jako s FK1012, místo pro dimerizaci bylo zvoleno tak, že výsledný dimer se může vázat ke dvěma molekulám cyklofilinu a ještě se nemůže vázat ke calcineurinu po vazbě cyclofilinu. Demonstrovali jsme, že (CsA)2 se váže k cyclofilinu se stechiometrií 1:2. Proto (CsA)2 podobně jako FK1012 neinhibuje signální dráhy a není tak ani imunosupresivní ani toxický.

VIII. Cílové geny

Konstrukty cílových genů budou mít citlivý prvek v 5' regionu, který odpovídá na ligandem zprostředkovanou oligomerizaci chimérního receptorového proteinu, pravděpodobně přes generaci a transdukci transkripčního iniciačního signálu jak popsáno infra. Proto bude nutné vybrat alespoň jeden transkripční iniciační systém, např. faktor, který je aktivovát bud přímo nebo nepřímo, cytoplasmickou doménou nebo může být aktivován spojením dvou domén. Bude také nezbytné vybrat alespoň jeden promotorový region, který odpovídá na výsledný transkripční iniciační

1 systém. Je třeba vybrat bud promotorovou oblast nebo gen pod nímž probíhá kontrola transkripce. Jinými slovy, akční doména může být vybrána pro chimérní proteiny (kódované prvními” seriemi konstruktu) na základě úlohy takové akční domény v iniciaci transkripce přes daný promotor nebo citlivý prvek. Viz např. sekce V(A)-cytoplasmické domény výše.

Jestliže je znám ciltivý prvek, může být zahrnut v cílovém genovém konstruktu za poskytnutí expresní kazety pro integraci do genomu (episomální nebo chromosomální inkorporací). Není nutné, aby byla izolována jednotlivá sekvence citlivého prvku, pokud je znám gen, který je transkripčně aktivován cytoplasmickou doménou za přirozené ligandové vazby k proteinu, obsahujícímu cytoplasmickou doménu. Homologní rekombinace by mohly pak být použity pro inzerci zájmového genu po směru od promotorového regionu aby byl pod transkripční konrolou endogenního promotorového regionu. Je-li známa specifická sekvence citlivého prvku, může být použita ve spojení s různými transkripčními iniciačními oblastmi, které mohou mít jiné aspekty, jako je vysoká nebo nízká aktivita jako je rychlost transkripce, vazba jednotlivých transkripčních faktorů a podobně.

Expresní konstrukt bude proto mít na svém 5'konci ve směru transkripce, cilivý prvek a promotorovou sekvenci, která umožňuje indukovanou transkripční iniciaci zájmového cílového genu, obvykle terapeutického genu. Transkripční terminační region není důležitý a může být použit pro zvýšení životnosti nebo vyrobení mRNA s krátkým poločasem životnosti inzertováním AU sekvencí, které slouží ke snížení stability mRNA a tím omezení periody působení proteinu. Jakýkoliv region může být použit, který poskytuje nezbytné transkripční zakončení a podle potřeby, zakončení translace.

Citlivý prvek může být jediná sekvence nebo může být o 1igomerizován, obvykle nemá více než asi 5 opakování a obvykle má asi 3 opakování.

Homologní rekombinace může být také použita pro odstranění nebo inaktivaci endogenních transkripčních kontrolních sekvencί,obsahujících promotor a/nebo citlivé prvky, které jsou odpovědné za oligomerizaci a/nebo pro inzert takových citlivých transkripčních konrolních sekvencí ve směru od požadovaného endogenního genu.

B.Produkt

Jako cílových genů je možno použít velmi mnoha genů jako cílový gen, zahrnujících geny, které kódují zájmový protein nebo kladnou zájmovou sekvenci nebo zájmový ibozym. Cílový gen může být jakákoliv zájmová sekvence, která poskytuje požadovaný fenotyp. Cílový gen může exprimovat protein povrchové membrány, sekretovaný protein, nebo to může být více cílových genů, které mohou exprimovat různé typy produktů. Cílový gen může být kladná sekvence, která může modulovat jednotlivou dráhu inhibici transkripčního regulačního proteinu nebo spustit jednotlivou dráhu inhibici translace inhibitoru dráhy. Cílový gen může kodovat ribozym, který může modulovat jednotlivou dráhu interferováním, na úrovni RNA, expresí relevantního transkripčního regulátoru nebo expresí inhibitoru jednotlivé dráhy. Proteiny, které jsou exprimovány, jednotlivě nebo v kombinaci, mohou zahrnovat usazení, cytotoxici tu, proliferaci, imunitní odezvu, zánětlivou odpověd, tvorbu nebo rozpuštění vmetků, hormonální regulaci a podobně. Exprimované proteiny by měly být přirozeně se vyskytující, mutanty přirozeně se vyskytujících proteinů, unikátní sekvence, nebo jejich b b kombinace .

Genem může být jakýkoliv gen, který je sekretován buňkou, takže kódovaný produkt může být vyroben dostupný podle potřeby kdykoliv je to žádoucí nebo nezbytné u hostitele. Různé sekretované prdukty zahrnují hormony jako je inzulín, lidský růstový hormon, glukagon, faktor spouštějící porod, ACTH, melanotropin, relaxin atd.; růstové faktory jako je EGF, IGF-1, TGF-α, -β, RDGF, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, FGF, erythropoietin, megakaryotické stimulační a růstové faktory atd; interleukiny jako je IL—1 až -13; TNF-α, -β atd.; a enzymy jako je tkáňový plasminogenový aktivátor, členové komplementové kaskády, perforiny, superoxid dismutasa, koagulační fakttory, antithrombin-II, faktor VIIIc, faktor VIIIvW, α-anti-trypsin, protein C, protein S, endorfiny, dynorfiny, kostní morfogenetický protein, CFTR atd.

Gen může být jakýkoliv gen, který je přirozený protein povrchové membrány nebo vyroben zavedením vhodného signálního peptidu a transmembránové sekvence. Různé proteiny zahrnují usazovací receptory např. L-selektin (Mel-14), proteiny získané z krve, mající zejména kringle strukturu, např. faktor VIIIc, faktor VIIIvW, hematopoietické buněčné markéry např. CD3, CD4, CD8, B buněčný receptor, TCB podjednotky α, β, gama, Ó, CD10, CD19, CD28, CD33, CD38, CD41 atd., receptory jako jsou interleukin receptory IL-2R, IL-4R, atd, kanálkové proteiny, pro influx nebo eflux iontů, např, H⁺,Ca²⁺, K⁺,Na⁺, Cl“ atd a podobně, CFTR, motiv aktivace tyrosinu, zeta aktivační protein atd.

Proteiny mohou být modifikovány pro transport k vesiklu pro exocystosis. Při přidání sekvence, který je z proteinu, který je směrován k vesiklu, kde je sekvence modifikována blízko k jednomu nebo druhému konci, nebo umístěna v analogické poloze k proteinovému zdroji, bude modifikovaný protein směrován ke Golgiho aparátu pro zahrnutí do vesiklu. Tento proces ve spojení s přítomností chimérních proteinů pro exocystosu umožňují rychlý transfer proteinů k extracelulárnímu mediu a relativně vysokou místní koncentraci.

Také mohou být zajímavé intracelulární proteiny, jako jsou proteiny v metabo1 ických drahách, regulátorové proteiny, steroidní receptory, transkripční faktory atd., zejména v závislosti na charakteru hostitelské buňky. Některé z proteinů uvedených výše mohou také sloužit jako intracelulární proteiny.

Následuje několik málo ilustrací různých genů. V T-buňkách je možno požadovat zavedení genů, kódujících jeden nebo oba řetězce T-buněčného receptoru. U B-buněk by mohly být poskytnuty těžké a lehké řetězce pro imunoglobulin pro sekreci. Pro kutánní buňky, např. keratinocyty, zejména kmenové buňky keratinocyty, by mohly být poskytnuty pro ochranu před infekcí, sekretováním α-, β- nebo gama inteferonu, antischemotaktických faktorů, proteás specifických pro proteiny bakteriální buněčné stěny atd.

Navíc pro poskytnutí exprese genu, majícího terapeutickou hodnotu, zde může být mnoho situací, kde je žádoucí řídit buňku na jednotlivé místo. Místo může zahrnovat anatomické místo, jako jsou lymfatické uzliny, mukosní tkáň, kůže, synovium, plíce nebo jiné vnitřní orgány nebo funkční místa, jako jsou sraženiny, poškozená místa, místa chirurgických zásahů, zánět, infekce atd. Při poskytnutí exprese povrchových membránových proteinů, které budou řídit hostitelskou buňku k jednotlivému místu poskytnutím vazby k hostitelskému cílovému místu k přirozeně se vyskytujícímu epitopu, je možno dosáhnout místních koncentrací sekretovaného produktu. Zájmové proteiny zahrnují usazovací receptory, např. L-selektin, GMP140, CLAM-1 atd., nebo addeessiny, např. ELAM-1, PNAd, LNA d atd, proteiny, vázající se ke sraženině, nebo buněčné povrchové proteiny, které odpovídají na lokalizované gradienty chemotaktických faktorů. Je zde mnoho situací, kde by mohlo být žádoucí řídit buňky k jednotlivému místu, kde by uvolnění terapeutického produktu mohlo mít velký význam.

V mnoha situacích by mohlo být žádoucí, aby bylo možno zabít modifikované buňky,např. jestliže je žádoucí ukončit léčbu buňkami, kdy se buňky staly nežádoucími,např. neoplastickými nebo kdy bylo dosaženo účelu, ke kterému buňky vždy sloužily a jejich pokračující přítomnost je nežádoucí. Modifikované buňky podle vynálezu, které jsou schopny exprese primárního chimerního proteinu, obsahujícího doménu jako je cytoplasmická doména fas antigenu nebo TNF receptor.

(Watanable-Fukunaga a spol., Nátuře (1992), 356, 314-317) jsou snadněji odstranitelné pomocí apoptosis po vystavení buněk ligandu schopnému oligomerizace primárních chimér. Konstrukty kódující primární chiméru mohou být formovány pro konstitutivní expresi za použiti konvenčních materiálů a metod,tak, že modifikované buňky mají takové proteiny na svém povrchu nebo přítomné ve své cytoplasmě. Alternativně může být poskytnuta řízená exprese, kde může stejný nebo rozdílný o 1 igomerizující ligand iniciovat expresi primární chiméry a iniciovat apoptosis.Poskytnutím cytoplasmických částí Fas antigenu nebo TNF receptoru v cytoplasmě napojený k vazebným regionům lišícím se od vazebných regionů spojených s expresí zájmového cílového genu, je možno usmrcovat modifikované b b buňky za řízených podmínek.

C. Ilustrativní příklady

Pro ilustraci byly kardiací nebo pacienti náchylní k mrtvici, léčeni následovně Pacientům byly podány buňky modifikované jak popsáno výše a po určitý čas udržovány. Ilustrativní buňky zahrnují plasmové buňky, B-buňky, T-buňky nebo jiné hematopoietické buňky. Buňky by měla být modifikována tak, aby exprimovala protein, který se váže ke krevní sraženině, mající kringlr doménovou strukturu nebo adhezivní interaktivní protein, např. CD41 a pro expresi proteinu, rozpouštějícího krevní sraženinu, např. aktivátoru tkáňového plasminogenu, streptokinasy atd.

V tomto způsobu při ligandem zprostředkované o 1 igomerizaci, by se buňky měly akumulovat na místě sraženiny a poskytnout vysoce lokalizované koncentrace trombolytického proteinu.Jiným způsobem je reperfuzní poškození. Buňky omezené životnosti by mohly být použity, např. makrofágy nebo polymorfojaderné leukocyty (neutrofily). Buňky by mohly mít k neutrofi 1ovům směřující receptor k řízení buněk k místu reperfuzního poškození. Buňky by také měly exprimovat superoxid dismutasu pro likvidaci jednoduchého kyslíku a inhibovat radikálový atak na tkáň.

Třetím příkladem je autoimunitní choroba. Mohou být použity buňky prodloužené životnosti, např. T-buňky. Konstrukty by měly poskytovat zaváděcí receptor pro zavedení k místu autoimunního poškození a pro cytotoxický atak na buňky, vyvolávající poškození. Terapie by pak měla být řízena proti buňkám, vyvolávajícím takové poškození. Alternativně by mohly poskytovat sekreci rozpustných receptorů nebo peptidu /

nebo proteinu, kde by produkt sekrece inhiboval aktivaci poškození vyvolaného buňkami nebo indukovat anergii. Jiné alternativy by mohly sekretovat proti zánět 1ivý produkt, který by mohl sloužit ke zmírnění degenerativních účinků.

Čtvrtý příklad zahrnuje ošetření chronické bolesti s endorfinem přes ankapsulaci.Zásobní lidské fibroblasty se transfektují konstruktem, ve kterém chimérní transkripční regulátorový protein kontroluje transkripci lidského endorfinu. DNA konstrukt obsahuje tři kopie vazebného místa pro HNF-1* transkripční faktor GTTAAGTTAAC ve směru od TATAAA místa a transkripční iniciační místo. Endorfin cDNA by mohla být inzertována ve směru iniciačního místa a ve směru od polyadenylační a terminační sekvence. Výhodně je endorfin cDNA vybavena PĚST sekvencemi, které činí protein nestabilním nebo AUUA sekvencemi ve 3' netranslaťovaném regionu mRNA umožňujícími, aby byla rychle degradována.

Fibroblasty jsou také transfektovány konstruktem, majícím dvě transkripční jednotky z nichž jedna by měla kodovat HNF-1* cDNA osekanou tak, aby kódovala právě DNA vazebné sekvence od aminokyselin 1 až 250 kondenzované k trimerní FKBP vazebné doméně za transkripční a translační kontrol regulátorových iniciačních a terminačních regionů funkčních ve fibroblastěch. Konstrukt by měl obsahovat další transkripční jednotku nesenou stejnými regulátorovými regiony řídící produkci transkripční aktivační domény odvozené z HNF-4 kondenzované ke trimerní FKBP'. ( Prvotním záměrem je změněný FKBP, který se váže v nM koncentraci k modifikovanému FK506. Modifikace inhibuje vazbu k endogennímu FKBP).

Tyto geneticky modifikované buňky by měly být enkapsulovány pro inhibici imunitního rozpoznání a umístěny pod pacientovu kůži nebo na jiné obvyklé vnitřní místo.

Jestliže pacient vyžaduje medikaci bolesti, podává se pacientovi dimerní ligand FK506-FK506', přičemž by asi 1 pg až 1 mg <v\ěl být dostačuj ící,Tímto způsobem by mohla být zmírněna bolest bez injekcí nebo nebezpečí návyku.

Pátým příkladem je léčba osteoporosy. Lymfocyty mohou být klonálně vyvinuty nebo kožní fibroblasty v kulturách od pacienta, který je léčen. Buňky by měly být transfektovány jak je popsáno výše, kde cDNA gen kostního morfogenního faktoru by měl nahradit endorfinový gen. Pro lymfocyty by měly být použity antigen specifické klony, které by měly umožnit jejich destrukci protilátkami k idiotypu sig.Navíc podání antigenu pro sig by mohlo rozšířit buněčnou populaci pro zvýšení množství proteinu, který má být doručován.

Lymfocytové klony by měly být podávány infuzí a ligand podáván podle potřeby pro produkci kostního morfogenního faktoru. Při sledování odpovědi na ligand je možno upravit množství kostního morfognního faktoru, který je produkován tak, že se upraví dávka na požadovanou hladinu.

Další situace je modifikace antigen specifických T-buněk, kde je možno aktivovat expresi proteinu produktu pro aktivaci buněk. T buněčný receptor by mohl být řízen proti nádorovým buňkám, patogenům, buňkám, zprostředkujícím autoimunitu a podobně. Při poskytnutí pro aktivaci buněk, například, by mohl být poskytnut interleukin jako je iL-2 pro expanzi modifikovaných T buněk v odezvě na ligand. Jiné použití modofikovaných T buněk by mohlo zahrnovat expresi usměrňujících receptorů pro řízení T buněk ke specifickým místům, kde by byla žádoucí cytotoxicita, přeregulace povrchového membránového proteinu cílových buněk, např. endotheliálních buněk.

Alternativně je možno toto očekávat při doručení vysokých dávek cytotoxických faktorů k cílovému místu. Například při rozpoznávání nádorových antigenů přes usměrňovači receptor, mohou být nádorová infiltrující lymfocyty (TIL) spuštěny pro doručení toxických koncentrací TNF nebo jiných podobných produktů.

Jinou alternativou je exportování hormonů nebo faktorů, které jsou exocytosovány. Při zvýšené exocytosis bude exportováno větší množství hormonu nebo faktoru; navíc jestliže je zde mechanismus zpětné vazby založen na množství hormonu nebo faktoru v cytoplasmě,bude docházet ke zvýšené produkci hormonu nebo faktoru. Nebo může být poskytnuta indukovaná exprese hormonu nebo faktoru tak, že exprese a export mohou být indukovány současně.

Mohou být také poskytnuty proteiny v zadržených tělesných kapalinách, např. vaskulárním systému, lymfatickém systému, cerebrospinální kapalině atd. Při modifikaci buněk, které mohou mít prodlouženou životnost v hostiteli, např. hematopoietických buněk, keratinocytů, svalových buněk atd. zejména kmenových buněk, mohou být proteiny udrženy v kapalinách po prodlouženou časovou periodu. Buňky mohou být modifikovány konstrukty, které poskytují sekreci nebo endocytosis. Konstrukty pro sekreci by měly mít translokační doménu, signální peptid a pak jako v případě chimérních proteinů, vazebnou doménu a akční doménu. Akční domény mohou být odvozeny od stejných nebo odlišných proteinů. Například s tkáňovým plasminogenovým aktivátorem,by měly mít sraženinový vazebný region jako jednu akční doménu a plasminogenové aktivní místo jako odlišnou akční doménu. Alternativně by mohla být poskytnuta zvýšená blokáda usměrnění tím, že je přítomen vazebný protein, jako je LFA-1 jako jedna akční doména a selekce jako druhá akční doména. Při modifikaci podjednotek proteinů, např. integrinů, T-buněčný receptor, slg nebo podobně, by mohly poskytovat rozpustné formy povrchových membránových proteinů, které by se mohly spolu vázat k molekule. Jinou vhodnou příležitostí jsou komplementové proteiny, destičkové membránové proteiny obsažené ve sraženině, autoantigeny na povrchu buněk a pathogenní molekuly na povrchu infekčních činidel.

IX. Zavedení konstruktů do buněk

Konstrukty mohou být zavedeny jako jedna nebo více DNA molekul nebo konstruktů, kde tyto budou obvykle mít alespoň jeden markér a musí mít dva nebo více markérů, které umožní selekci hostitelských buněk, které obsahují konstrukt(y) . Konstrukty mohou být připraveny obvyklými postupy, kdy geny a regulátorové regiony mohou být izolovány, podle potřeby, ligovány, klonovány ve vhodném klonovacím hostiteli, analyzovány restrikcí nebo sekvenováním nebo jinými obvyklými prostředky. Obvykle za použití PCR, mohou být izolovány jednotlivé fragmenty zahrnující celé nebo části unkční jednotky, kde může být zavedena jedna nebo více mutací za použití primer opravy, ligací, in vitro mutagenesí atd. podle potřeby. Konstruk(y) takto kompletované a doložené, že mají vhodné sekvence pak mohou být zavedeny do hostitelské buňky jakýmikoliv obvyklými prostředky. Konstrukty mohou být integrovány a uzavřeny do nereplikujících, defektních virálních genomú podobných Adenoviru, adeno-asociovanému viru (AAV) nebo Herpes simplex viru (HSV) nebo jiných, zahrnujících retrovirální vektory, pro infekci nebo transdukci do buněk. Konstrukty mohou obsahvat virální sekvence pro transfekci, je-li to žádoucí. Alternativně může být konstrukt zaveden fúzí, elektroporací, biolisticky, transfekci, lipofekci nebo podobně. Hostitelská buňka bude obvykle růst a expandovat v kultuře před zavedením konstruktu(ů), s následujícím vhodným ošetřením pro zavedení konstruktu(ů) a integraci konstruktu(ů). Buňky budou pak expandovat a být screenovány pomocí markéru přítomného v konstruktu. Různé markéry, které mohou být použity zahrnují hprt, neomycinovou rezistenci, thymidin kinásu, hygromycin rezistenci atd.

V některých případech může zde být cílové místo pro homologní rekombinaci, je-li žádoucí, aby byl konstrukt integrován na jednotlivý lokus. Například může vyřadit endogenní gen a nahradit jej (na témže místě nebo někde jinde) genem, kódujícím v konstruktu za použití materiálů a metod, které jsou známé v oboru pro homologní rekombinaci. Alternativně, místo poskytnutí genu, je možno modifikovat transkripční iniciační region endogenního genu aby byl odpovídající k signální iniciační doméně, takových provedení, transkripcí endogenního genu jako je EPO, tPA, SOD nebo podobně by mohla být kontrolována podáním ligandu. Pro homologní rekombinaci je možno použít bud 2 nebo O-vektory. Viz například Thomas a Capecchi, Cell (1987) 51, 503-512; Mansour a spol., Nátuře (1988) 336, 348-352 a Joyner a spol., Nátuře (1989) 338, 153-156.

Konstrukty mohou být zavedeny jako jediná DNA molekula, kódující všechny geny nebo různé molekuly, mající jeden nebo více genů. KOnstrukty mohou být zavedeny současně nebo postupně, každý se stejnými nebo rozdílnými markéry. V ilustrativním příkladu by měl jeden konstrukt obsahovat terapeutický gen pod kontrolou specifického odpovídajícího elementu (např. NFAT), další kódující receptorový fuzní protein, obsahující signální region fúzovaný k ligandové receptorové doméně (např. jako v MZF3E). Může být také zavedenatTřetí DNA molekula, kódující usměrňující receptor nebo jiný produkt, který zvyšuje účinnost doručení terapeutického produktu.

Vektory, obsahující vhodné prvky jako bakteriálního nebo kvasinkového původu replikace, selektující a/nebo amplifikující markéry, prvky promotor/enhancer pro expresi v prokaryotech nebo eukaryotech, atd. které mohou být použity pro přípravu zásobních konstruktových DNA a pro provedení transfekce, jsou dobře známé v oboru a mnoho z nich je obchodně dostupných.

X. Podání buněk a ligandů

Buňky, které byly modifikovány DNA konstrukty pak rostou v kultuře za selektivních podmínek a buňky, které jsou vybrány jako mající konstrukt mohou pak být expandovány a dále analyzovány za použití například polymerásové řetězové reakce pro stanovení přítomnosti konstruktu v hostitelské buňce. Jakmile byla hostitelská buňky identifikována, může pak být použita podle záměru, např. pěstována v kultuře nebo zavedena do hostitelského organismu.

Podle charakteru buněk mohou být buňky zavedeny do hostitelského organismu, např. savce, mnoha způsoby. Hematopoietické buňky mohou být podány injekcí do vaskulárního systému,obvykle v množství alespoň asi 10⁴ buněk a obecně ne více než asi 10¹⁰, obvykleji ne více než asi 10⁸ buněk. Počet buněk, které se použijí bude záviset na mnoha okolnostech, účelu podáni, životnosti buněk, použitém protokolu, například počtu podání, schopnosti buněk se pomnožovat, stabilitě terapeutického činidla, fyziologické potřebě terapeutického činidla a podobně. Alternativně, u kožních buněk, které mohou být použity jako transplantáty, bude počet buněk záviset na velikosti vrstvy, která má být aplikována na spáleninu nebo jinou lézi. Obecně pro myoblasty nebo fibroblasty bude počet buněk alespoň asi 10⁴ a ne více než asi 10⁸ a tyto mohou být aplikovány jako disperze, obecně injekcí nebo blízko zájmového místa. Buňky obvykle budou ve fyziologicky přijatelném mediu.

Místo modifikace buněk ex vivo je v mnoha případech žádoucí modifikovat buňky in vivo. Pro tento účel byly vyvinuty různé techniky pro modifikaci cílové tkáně a buněk in vivo. Bylo vyvinuto mnoho virových vektorů, jako je adenovirus a retroviry, které umožňují transfekci a náhodnou integraci viru do hostitele. Viz např. Dubensky a spol.

(1984) Proč.Nat1.Acad.Sci.USA 81, 7529-7533; Kaneda a spol., (1989) Science 243, 375-378; Hiebrt a spol. (1989)

Proč.Nati.Acad.Sci. USA 86, 3594-3598; Hatzoglu a spol.

(1990) J.Biol.Chem. 265, 17285-17293 a Ferry a spol. (1991) Proč.Nati.Acad.Sci.USA 88, 8377-8381. Vektor může být podán injekčně, např. intravaskulárně nebo intramuskulárně, inhalací nebo parenterálním způsobem.

V souladu s in vivo genetickou modifikací bude způsob modifikace záviset na charakteru tkáně, účinnosti vyžadované buněčné modifikace, počtu příležitostí k modifikaci jednotlivých buněk, dosažitelnosti tkáně, ke které bude DNA přípravek zaváděn a podobně. Při použití zeslabeného nebo modifikovaného retroviru nesoucího cílový transkripční iniciační region, je možno virus aktivovat použitím jednoho z konstruktů transkripčních faktorů tak, že virus může být ί A produkován a transfektovat připojené buňky.

Zavedení DNA nemusí vést k integraci v každém případě. V některých situacích může být dostačující přechodné uchování zavedené DNA. V tomto postupu zde bude krátkodobý účinek, kdy buňky by měly být zavedeny do hostitele a pak obráceny v předem stanovené době, například, po té, co buňky byly schopny se usadit na jednotlivé místo.

Ligand poskytující aktivaci ctoplasmické domény pak může být podán, je-li to žádoucí. V závislosti na vezebné afinitě ligandů, požadované odezvě, způsobu podáni, poločasu života, počtu přítomných buněk, mohou být použity různé protokoly. Ligand může být podán parenterálně nebo orálně. Počet podání bude záviset na výše poopsaných faktorech. Ligand může být přijímán orálně jako pilulka, prášek nebo disperze; bukálně; sublinguálně; injekt^ován intravaskulárně, intraperitoneálně, subkutánně; inhalací nebo podobně. Ligand (a monomerní sloučenina) mohou být formulovány za použití obvyklých metod a materiálů známých v oboru pro různé způsoby podání. Přesná dávka a jednotlivá metoda podání budou záviset na výše uvedených faktorech a budou stanoveny příslušným lékařem nebo humánním nebo veterinárním ošetřovatelem. Většinou bude způsob podání stanoven empiricky.

V případě, že aktivace ligandů by měla být reverzní, může být monomerní sloučenina podána nebo jiná sloučenina s jediným vazebným místem, která bude souěžit s ligandem. Tak v případě nežádoucí reakce nebo potřeby ukončit terapeutický efekt, může být monomerní vazebná sloučenina podána jakýmkoliv obvyklým způsobem, zejména intravaskulárně, je-li žádoucí rychlá reverze. Alternativně je možno poskytnout přítomnost inaktivační doménu (nebo transkripční tlumič) s DNA vazebnou doménou. V dalším řešení mohou být buňky eliminovány přes apoptosis signalizací přes Fas nebo THF receptor jak je popsáno jinde.

Jednotlivá dávka ligandu pro jakoukoliv aplikaci může být stanovena v souladu s postupy použitými pro terapeutický dávkovýmonitoring, kde je udržení jednotlivé hladiny exprese požadováno během prodloužené časové periody, například větší než asi dva týdy, nebo tam, kde je žádoucí opakovaná terapie, s jednotlivou nebo opakujícími se dávkami ligandu během krátké časové periody, s prodlouženými intervaly, například, dva týdny nebo více. Dávka ligandu v předemstanoveném rozsahu bude podána a sledována na odezvu takže se získá vztah mezi časem a hladinou exprese, jakož i pozorování teraputické odezvy. V závislosti na hladinách pozorovných během časové periody a terapeutické odezvě, by měla bý poskytnu ta větší nebo menší dávka během následující doby po odezvě. Tento postup by měl být opakovaně opakován dokud se nedosáhne dávky v terapeutickém rozmezí. Je-li chronicky podáván ligand,po stanovení udržovací dávky ligandu je pak třeba stanovit při prodloužených intervalech, zda buněčný systém poskytuje vhodnou odezvu a hladinu produktu exprese.

Je třeba chápat, že systém je podroben mnoha proměnným jako je buněčná odezva na ligand, účinnost exprese a, podle potřeby, hladina sekrece, aktivita expresního produktu, konkrétní potřeba pacienta, která se může měnit s časem a okolnostmi, rychlost ztráty buněčné aktivity jako výsledek ztráty buněk nebo expresní aktivity jednotlivých buněk a podobně. Proto se očekává, že pro každého jednotlivého pacienta, ikdyž se použije univerzálních buněk, které by mohly být podávány rozsáhlé populaci, bude každý pacient sledován pro určení správné dávky pro jednotlivce.

Předložená metodologie a kompozice mohou být použity pro léčbu různých stavů a indikací. Například B- a T-buňky mohou být použity pro léčbu rakoviny, infekčních chorob, metabo1 ických poruch, kardiovaskulárních chorob, dědičných koagulačních nedostatků, autoimunitnich chorob, kloubových degenerativních chorob např. arthritis, plicních chorob, ledninových chorob, endokrinních abnormalit atd. Různé buňky obsažené ve struktuře, jako jsou fibroblasty a myoblasty, mohou být použity v léčbě genetických poruch jako jsou nedostatečnost pojivové tkáně, arthritis, jaterní onemocnění atd. Hepatocyty by mohly být použity v případech, kdy musí být vyrobena velká množství proteinu pro doplnění nedostatku nebo pro doručení terapeutického produktu k játrům nebo portálnímu oběhu.

Následující příklady slouží pouze k ilustraci a v žádném případě ne k omezení.

Příklady provedení vynálezu

Buněčná transformace a hodnocení

Příklad 1

Indukce izolovaný IL-2 enhancer-vazebné transkripčních faktorů zesítěním CD3 řetězce T-buněčného receptorů

Plasmid pSXNeo/IL2 (IL2-SX)(obr. 1), který obsahuje gen placentálně sekretované alkalické fosfatásy pod kontrolou lidského IL-2 promotoru (-325 až +47; MCB(86),6, 3042) a příbuzné plasmidové varianty (např.NFAT-SX, NF B-SX, OAP/Octl-SX a AP-l-SX), ve kterých je reporterový gen pod transkripční kontrolou minimálně IL-2 promotoru (-325 až -294 a -72 až +47) kombinované se syntetickými oligomery, obsahujícími různé promotorové elementy (tj. NFAT, NK B, OAP/Oct-1 a API) byly vyrobeny třemi ligacemi 1) pPL/SEAP (Berger a spol., Gene (1988) 66,1) za štěpení s SsPl a HindIII;2) pSV2/Neo (Southern a Berg, J.Mol.Appl.Genet. (1982)1,332), štěpen s Ndel, ztupen Klenowem, potom štěpen s Pvul a 3) různé promotor obsahující plasmidy (tj. NFAT-CD8, B-CD8, cxl21acZ-0ct-l, AP1-LUCIF3H, nebo cxl5IL2)(popsány dále) štěpeny s Pvul a HindlII. NFAT-CD8 obsahuje 3 kopie NFAT-vazebného místa (-286 až -257; Genes a Dev.(1990)4,

1823) a cxl21acZ-Oct obsahuje 4 kopie OAP/Oct-1 (ARBE-1) vazebného místa (MCB,(1988)8,1715) z lidského 11-2 enhanceru; B-CD8 obsahuje 3 kopie NF B vazebného místa z myšího lehkého řetězce (EMBO (1990)9, 4425) a AP1-LUCIF3H obsahuje 5 kopií AP-1 místa (5'-TGACTCAGCGC-3') z metalothionenového promotoru.

V každé transfekci bylo 5 pg expresního vektoru, pCDL-SR (MCB 8,466-72)(Tac-IL-2-receptor-řetězec), kódujícího chimérní receptor TAC/TAC/Z (TTZ)(PNAS 88, 8905-8909), bylo kotransfektováno spolu s různými sekretujíčími reportérovými plasmidy na bázi alkalické fosfatásy (viz mapa pSXNeo/IL2 na obr. 1) v TAg Jurkat nuftkách (deriváty lidské T-buněčné leukemické linie Jurkat stabilně transfektované s SV40 velkým T antigenem (Northrup a spol., J.Biol.Chem.[1993]. Každý reporterový plasmid obsahuje více oligonukleotidů vazebného místa pro rozlišení IL-2 enhancer-vazba transkripčního faktoru v kontextu s minimálním IL-2 promotorem nebo, alternativně,celý IL-2 enhancer/promotor proti směru reporterového genu. Po 24 hodinách byly podíly buněk (přibližně 10⁵) umístěny do mikrotitračních jamek, obsahujících log ředění navázaného anti-TAC (CD25) mAB (33B3,1; AMAC, Westbrook, ME). Jako pozitivní kontrola a pro kontrolu účinnosti transfekce byl přidán ionomycin (i pm) a

PMA (25 mg/ml) k podílům z každé transfekce. Po dalších 14 hodinách inkubace byly supernatanty zkoušeny na aktivitu alkalické fosfatásy a tyto aktivity byly vyjádřeny ve vztahu k aktivitám pozitivních kontrolních vzorků. Přídavek 1 ng/ml FK506 potlačuje všechnu aktivitu díky NFAT na základní hladinu, což demonstruje, že deaktivace jsou ve stejné dráze jako je ta, která je blokována FK506. Každá získaná hodnota je průměr ze dvou vzorků a pokus byl proveden několikrát s podobnými výsledky. Viz obr. 5. Uvedené hodnoty ukazují, že se známým extracelulárním receptorem je možno získat vhodnouodpověd s reportérovým genem a různými enhancery. Podobné výsledky byly získány jestliže se použije MAb proti TcR komplexu (tj. OKT3).

Příklad 2

Inhibiční aktivita imunosupresantových léčiv FK506 a cyklosporinu A (CsA) nebo dimerních příbuzných sloučenin FK1012A (8), FK1012B (5) a CsA dimeru (PB-1-218)

Ionomycin (1 pm) a PMA (25 ng/ml) byly přidány k 10⁵TAg-Jurkat buňkám. Dále byly přidány titrace různých léčiv. Po 5 hodinách byly buňky lyžovány v mírném detergentu (tj.Tritonu X-100) a extrakty byly inkubovány s β-galaktosidásovým substrátem, MUG (methylgalaktosidylumbel1iferon) po 1 hodinu. Byl přidán glycin/EDTA stop pufr a extrakty byly zkoušeny na fluorescenci. Každý údaj byl průměr ze dvou vzorků a pokus byl několikrát proveden se stejnými výsledky.Je kuriózní, že FK1012B projevuje přírůstek aktivity slabý při nejvyšší koncentraci (tj. 5 pg/ml), avšak kontrolní pokusy ukazují, že FK1012B je samotný nestimulační. Viz obr. 6.

Příklad 3

Aktivita dimerního FK506 derivátu, FK1012A, k chimérnímu FKBP12/CD3 (1FK3) receptoru pg eukaryotického expresního vektoru, pBJ5 (na bázi pCDL-SR s polylinkerem inzertovaným mezi 165 štěpné místo a póly A místo), obsahujícího chimerní receptor (1FK3), byl kotransfektován se 4 pg NFAT-indukované alkalickou fosfatásu sekretujíčího reporterového plasmidu, NFAT-SX. Jako kontrola bylo použito 5 pg pBJ5 místo lFK3/pBJ5, v paralelní transfekci. Po 24 hodinách byly podíly každé transfekce, obsahující přibližně 10⁵ buněk inkubovány s log ředěními léčiva, FK1012A, jak je uvedeno. Jako pozitivní kontrola a pro kontrlu transfekční účinnosti byly přidány ionomycin (1 pm) a PMA (25 ng/ml ) k podílům z každé transfekce. Po dalších 14 hodinách inkubace byly supernatanty zkoušeny na aktivitu alkalické fosfatásy a tyto aktivity byly vyjádřeny ve vztahu k aktivitám pozitivních kontrolních vzorků. Přídavek 2 ngml FK506 snižuje stimulace na základní hladiny, což demnstruje, že aktivace jsou ve stejné dráze jako je ta, která je blokována FK506.Proto FK506 nebo cyklosporinbudou sloužit jako účinná antidota k použití těchto sloučenin. Všechny získané hodnoty jsou průměr ze dvou vzorků a pokus byl proveden několikrát s podobnými výsledky. Viz obr. 7.

Příklad 4A

Aktivita dimerního FK506 derivátu, FK1012B, na myristoylovaném chimerním CD3/FKBP12 (MEF3E) receptoru

Úspěšně jsme demonstrovali mnoho přiblížení k ligandovému dezénu, zahrnující pozitivní výsledky s HOD činidly na bázi FK506 činidly pojmenovanými FK1012. Bylo zjištěno, že FK1012 dosahuje vysokou afinitu, 2:1 vazebnou stechiometrii (Ka(2)= 0,8 nM) a neinhibuje calcineurin-zprostředkovanou TCR signalizaci. Ligandy nejsou ani imunosupresivní ani toxické (až do 0,1 mM v buněčné kultuře). Podobně jsme připravili homodimerizačni inidlo na bázi cyklosporinu A, (CsA)2, které se váže k CsA receptoru, cyclofylin, se stechiometrií 1:2, ale neváže se ke calcineurinu. Takto podobně jako FK1012, (CsA)2 neinhibuje signální dráhy a není proto ani imunosupresivní ani toxická.

Tyto a jiné naše příklady ligandem zprostředkované proteinové asociace vedou ke kontrole signální transdukční dráhy. V ilustrativním případě je toto uskutečněno vytvořením intracelulárního receptoru, obsahujícího malý fragment Src dostačující pro posttranslační myristoylaci (M), cytoplasmický konec zeta (Z; složka B buněčného receptoru byla také použita), tři po sobě jdoucí FKBP12(F3) a flu pitop tag (E). Při expresi konstruktu MZF3E (obr.18) v lidských (Jurkat) T buňkách, jsme potvrdili, že kódovaný chimérní protein prochází FK1012- zprostředkovanou oligomerizací. Doprovodná agregace zeta řetězce vede k signalizaci přes endogenní TCR-signální dráhu (obr. 15), jak je zřejmé při sekreci alkalické fosfatásy (SEAP) v dpovědi na FK1012 (EC50=50 nM). Promotor SEAP reporterového genu byl konstruován, aby byl transkripčně aktivován jaderným faktorem aktivovaných T buněk (NFAT), který je sestaven v jádru po TCR-signalizaci. FK1012 indukovaná signalizace může být zakončena deagregačním procesem vyvolaným netoxickou, monomerní verzí ligandu nazvaného FK506-M.

Specificky, 5 pg eukaryotického expresního vektoru, pBJ5, obsahujícího myristoylovaný chimérní receptor bylo kotransfektováno se 4 pg NFAT-SX. MZE, MZF1E, MZF2E a MZF3E obsahují 0,1,2 nebo 3 kopie FKPB12, po směru myristoylované CD3 cytoplasmické domény (viz obr.2). Jako kontrola bylo použito 5 pg pBJ5 v paralelní transfekci. Po 24 hodinách byly podíly každé transfekce, obsahující přibližně 10⁵ buněk inkubovány s log ředěními léčiva, FK1012B, jak je uvedeno. Jako pozitivní kontrola a pro kontrolu transfekční účinnosti byl ionomycin (1 pm) a PMA (25 ng/ml) přidány k podílům z každé transfekce. Po dalších 12 hodinách inkubace byly supernatanty zkoušeny na aktivitu alkalické fosfatásy a tyto aktivity byly vyjádřeny ve vztahu k aktivitám pozitivních kontrolních vzorků. Přídavek 1 ng/ml FK506 potlačuje všechny stimulace blízko k základním hladinám což demonstruje, že aktivace jsou ve stejné dráze jako ty, které jsou blokovány u FK506. Tento výsledek je dále zřejmý z reverzibi1 i ty předložené buněčné aktivace. Každý z údajů byl průměrem ze dvou vzorků a pokus byl prováděn několikrát s podobnými výsledky. Viz obr.8. Myristoylované deriváty odpovídají nižším koncentracím ligandu asi řádově a aktivují NFAT závislou transkripci na odpovídající hladiny ,ale mělo by být uvedeno, že ligandy jsou odlišné. Srovnej obr. 7 a 8.

In vivo FK1012 vyvolaná proteinová dimerizace. Dále jsme očekávali potvrzení, že intracelulární agregace MSF3E receptorů je nepochybně vyvolána FK1012. Influenza hemaglutinový epitop-tag(flu) MZF3E-konstruktu byl proto vyměněn odlišným epitop-tag(flag-M2). Velmi blízce příbuzné chiméry, MZF3Efiu a MZF3Efiag, byly koexpreimvány v Jurkat T buňkách. Imunoprecipitační pokusy za použití anti-Flag-proti látek kondenzovaných k agarosovým kuličkám, byly provedeny po ošetření buněk s FK1012. Za přítomnosti FK1012 (1 μΜ) proteinová chiméra MZF3Efiag interaguje s MZF3Efiu a je koimunoprecipitována s MZF3Efiag. Za nepřítomnosti FK1012A nebyla pozorována žádná koimunoprecipitáce MZF3Efiu. Podobné pokusy sFKBP monomerovými konstrukty MZFIEfiu a MZFIEfiag, které neposkytují signál, odhalují, že tyto jsou také dimerizovány FK1012A (obr.l9A). Toto odráží požadavky na agregaci pozorovanou jak s endogenním T buněčným receptorem a naším umělým receptorem MZF3E.

FK1012 indukovaná protein-tyrosin fosforylace. Intracelulární domény TCR, CD3 a zeta-řetězců interagují s cytoplasmickými protein tyrosin kinásami s následující antigenovou stimulací. Specifičtí členové Src rodiny (lek a/nebo fyn) fosforylují jeden nebo více tyrosinových zbytků aktivačních motivů ve kterých tyto intracelulární domény (tyrosin aktivační motiv, TAM). Tyrosin kinása ZAP-70 je zavedena (přes své dvě SH2 domény) k tyrosin fosforylovanému T-buněčnému receptoru a je pravděpodobně zahrnuta v další poproudné aktivaci fosfolipásy C. Ani přídavek anti-CD3MAb nebo FK1012 k Jurkat buňkám stabilně transfektovaným s MZF3E nevede k zavedení kinásové aktivity k zeta-řetězci podle měření v in vitro kinásové zkoušce po imunoprecipitaci endogenního T buněčného receptorového zeta řetězce a MZF3E-konstruktu. tyrosin fosforylace po ošetření buněk kde jak anti-CD3 M Ab nebo FK1012 byly detegovány za použití monoklonálních alfa-fosfotyrosin protilátek. Celé buněčné lyzáty byly analyzovány v různých časech po stimulaci.

Podobný model tyrosin-fosforylovaných proteinů bylo pozorováno po stimulaci jak s anti-CD3 MAb nebo FK1012. Model zahrnující hlavní pás 70 kDa, pravděpodobně ZAP-70, a malé pásy 120 kDa, 62 kDa, 55 kDa a 42 kDa.

Příklad 4(B): Regulace programované buněčné smrti s chimérami imunofi 1in-Fas antigen

Fas antigen je člen superrodiny buněčných povrchových receptorů nervový růstový faktor(NGF)/nádorový nekrozní faktor (TNF) . Zesítění Fas antigenu s protilátkami k jeho extracelulární doméně aktivuje špatně poznanou sgnální dráhu, což vede k programované buněčné smrti nebo apoptosis. Fas antigen a s ním spojená apoptotická signální dráha jsou přítomny ve většině buněk, zahrnujících možná všechny nádorové buňky. Dráha vede k rychlé a unikátní buněčné smrti (2 h), která je charakterizována kondenzovanou cytoplasmou, nepřítomností zánětlivé odezvy a fragmentací nukleosomální DNA, žádný z těchto jevů není zjevný v nekrotické buněčné smrt i.

Vyvinuli jsme tako druhý, indukující signální systém, který vede k apoptotické smrti buněk. Podobně jako MZF3E dráha, je tato iniciována aktivací umělého receptorů, který je produktem konstitutivně exprimovaného responder genu. Avšak tato nová dráha se liší od první tím, že naše HOC činidla indukují syntézu produktů endogenní dráhy spíše než produkt transfektovaného, indukujícího (např.reporterového) genu.

Výsledek kontroly Fas dráhy představuje důležitou možnost pro biologický výzkum a medicínu.

Transgenní zvířata mohou být vytvořena se smrtí responder genů pod kontrolou buněčně specifických promotorů. Cílové buňky by pak mohly být chemicky ablatovány v dospělém zvířeti při podání HOD činidla zvířeti. V této cestě by mohla být hodnocena úloha specifických mozkových buněk v paměti nebo poznání nebo imunitních buněk ve vyvolání a udržení autoimunitních poruch. Smrt responder genů by mohla být zavedena do nádorů za použití humánních genových terapeutických techik vyvinutých M.Blaesem a spolupracovníky (Culver a spol., Science 256 5063(1992):1550-2) a potom být následně aktivovány ošetřením pacienta s HOD činidlem (analogicky k gancyclovirovým genově terapeutickým klinickým pokusům v současnosti uváděným pro léčbu mozkových nádorů). Nakonec jsme uvažovali o společném podání smrt-responder genu spolu s terapeutickým genem při praktickém provedení genové terapie. Toto by mohlo poskytnout proti selhání bezpečnou (failsafe) složku pro genovou terapii. Jestliže bylo něco provedeno špatně (obvyklá diskuse se týká integrace-indukované ztráty nádorového supresorového genu vedoucí k rakovině), genová terapie pacienta by mohla způsobit protiselhání bezpečnou pilulku, která by mohla usmrtit všechny transřektované buňky. Nyní jsme vytvořili systém orthogonálních oligomerizuji cích činidel pro takové účely. Je tak poskytnuto použiti setu ligandů a chimérních responder proteinů pro regulaci apoptosis v hostitelských buňkách a další set pro regulaci transkripce terapeutických genů. Ligandy vhodné pro regulaci transkripce terapeutického nebo žádoucícho genu jsou navrženy (nebo zvoleny) tak, že nereagují křížově a iniciují apoptos i s.

Příkladná chimérní cDNA, obsahující tři FKBP12 domény fúzované k cytoplasmické signální doméně Fas antigenu (obr. 19) byla konstruována. Tento konstrukt, je-li exprimován v lidských Jurkat a myších D10 T buňkách, může být indukován k dimerizaci FK1012 činidlem a iniciovat signální kaskádu vedoucí k FK1012-závislé apoptosis. LDso pro FK1012A-zprostředkovanou smrt buněk přechodně transfektovaných s MFF3E je 15 nM stanoveno ztrátou aktivity reportér genu (obr. 19, diskuse ke zkoušce viz legenda k obr.20). Tato data jsou v souladu s měřeními buněčné smrti ve stabilně transfektovaných buněčných liniích. Protože tíó stabilní transfektanti představují homogenní populaci buněk, byli použiti ke zjištění, že smrt je způsobena apoptosou spíše než nekrosou (membránové puchýřkování, nukleosomální DNA fragmentace). Nicméně protokol přechodné transfekce je mnohem běžnější a byl proto použit jako počáteční zkušební systém jak je popsáno dále.

Příklad 4(C)

Regulace programované buněčné smrti s cyclofi 1in-Fas antigen chimérami

Připravili jsme serie konstruktů cyclofilin C-Fas antigen a studovali jsme jejich schopnost indukovat (CsA)2-závislou apoptosis ve studiii přechodné exprese (obr.20A). Dále (CsA)2-závislá apoptosis byla demonstrována s lidskými Jurkat T buňkami stabilně transfektovanými nejaktivnějším konstruktem v sériích, MC3FE (M= myristoylační doména Src, C= cyclofi 1inové doména, F=cytoplasmický konec Fas, E-flu epitop tag). Cytoplasmický konec Fas byl fúzován bud před nebo po 1,2,3 nebo 4 po sobě jdoucích cyclofi 1inových doménách. Dva kontrolní konstrukty byly také připraveny, které postrádají Fas doménu. V tomto případě jsme pozorovali, že signalizační doména působí pouze je-li umístěna po dimerizačních doménách.(Zeta řetězcové konstrukty signalizují jsou-li umístěny bud před nebo po dimeizačních doménách).Obě expresní hladiny osmi signaálních konstruktů, byly hodnoceny Western blottingem a jejich aktivity se kvatitativně liší (obr.21B). Jako optimální systém byl takto hodnocen MC3FE. LDso pro (CsA)2-zprostředkovanou buněčnou smrt s MC3FE je » 200 nM. Tyto údaje demonstrují použitelnost interakcí cyclofi 1in-cyclosporin pro regulaci intracelulárni proteinové asociace a ilustrují orthogonální činidlový systém, který nebude křížově reagovat se systémem

FKBP12-FK1012. Dále v tomto případě údaje ukazují, že pouze dimerizace a ne agregace je vyžadována pro iniciaci signální transdukce Fas cytoplasmickým koncem.

Mutace N-terminálního myristoylačního signálu k alaninu brání myrístoylaci a tím membránové lokalizaci, také jsme pozorovali, že mutovaný konstrukt ( MFF3E) byly stejně potentní jako induktor FK1012-závis1é apoptosis,což indikuje, že membránová lokalizace není nezbytná pro

Fas-zprostředkovanou buněčnou smrt.

Příklad 5

Konstrukce myšího signalizačního chimérního proteinu

Byly získány různé proteiny za použití primeru popsaných na obr.4. Při uvádění čísel primeru je třeba odkázat na obr.4.

Přibližně 1,2 kb cDNA fragment, obsahující I-E řetězec myšího třída II MHC receptoru (Cell, 32, 745) byl použit jako zdroj signálního peptidu za použití P#6048 a P#6049 za získání 70 bp SacII-Xhol fragmentu za použití PCR jak je popsáno dodavatelem (Promega). Druhý fragment byl získán za použití plasmidu, obsahujícího Tac (IL2 receptorový řetězec), připojeného k transmembránovým acytoplasmickým doménám CD3 (PNAS, 88, 8905). Za použití P#6050 a P#6051 byl získán Xhol-EcoRI fragment PCR, obsahující transmembránové a cytoplasmické domény CD3. Tyto dva fragmenty byly ligovány a inzertovány do SacII-EcoRI štěpeného pBluescript (Stratagene) pro poskytnutí plasmidu, SPZ/KS.

K získání vazebné domény pro FK506, byl použit plasmid rhFKBP (poskytnut S.Schreiberem, Nature(1990) 346, 674) s

7

P#6052 a P#6053 pro získání 340 bp Hhol-Sall fragmentu, obsahujícího lidský FKBP12. Tento fragment byl inzertován do pBluescriptštěpeného s Xhol a Sáli pro poskytnutí plasmidu FK12/KS, který byl zdrojem pro FKBP12 vazebnou doménu. SPZ/KS byl štěpen s Xhol, fosfatázován (buněčná intestinálni alkalická fosfatása; CIP) k zabránění samoteplotní hybridizaci a spojen s lOnásobným molárním přebytkem

Xhol-sall FKBP12-obsahujícím fragment z FK12/KS. Byly izolovány klony, obsahující monomery, dimery a trimery FKBP12 ve správné orientaci. Klony 1FK1/KS, 1FK2/KS a 1FK3/KS zahrnují ve směru transkripce; signální peptid z myšího MHC třída II genu I-E, monomer, dimer nebo trimer lidského FKBP12 a transmembránové a cytoplasmické podíly CD3 . Nakonec byly SacII-EcoRI fragmenty vyříznuty z pBluescript za použití restrikčních enzymů a ligovány do polylinkeru pBJ5 štěpeného s SacII a EcoRI pro vytvoření plasmidů IFKl/pBJS, lFK2/pBJ5 a 1FK3/PBJ5. Viz obr.3 a 4.

Příklad 6

A. Konstrukce intracelulární signální chiméry

Myristoylační sekvence z c-src byla získána od Pellmana a spol., Nátuře 314,374 a napojena ke komplementární sekvenci CD3 za získání primerů, který byl komplementární ksekvenci 3 z transmembránové domény, jmenovitě P#8908. Tento primer má SacII místo připojené k 5' konci a Xhol sekvenci připojenou k myristoylační sekvenci. Druhý primer P#8462 má Sáli rozponávací místo 3' ze sekvence komplementární ke 3' konci CD3, stop kodon a EcoRI rozpoznávací místo. Použitím PCR byl získán 450 bp SacII-EcoRI fragment, který obsahuje myristoylační sekvenci a CD3 skvenci fúzované ve směro od 5' ke 3'. Tento fragment byl ligován do SacII/EcoRI štěpeného pBJ5(XhoI)(Sáli) a klonován za vzniku plasmidu MZ/pBJ5.

Ó ó

Nakonec byl MZ/pBJ5 štěpen se Sall, fosfatásován a spojen s lOmolárním přebytkem Xhol-Sall FKBP12-obsahujícím fragment z FK12/KS a ligován. Po klonování plasmidy obsahující požadované konstrukty, mající myristoylační sekvenci, CD3 a FKBP12 multimery ve směru 5'-3' byly izolovány a ověřeny, zda mají správnou strukturu. Viz obr.2 a 4

B Konstrukce expresních kazet pro intracelulární signální chiméry.

Konstrukt MZ/pBJ5 (MZE/pBJ5) je štěpen s restrikčními enzymy Xhol a Sáli, TCR fragment je ostraněn a výsledný vektor je ligován s lOnásobným přebytkem monomeru, dimeru, trimeru nebo vyššího multimeru FKBP12 za vzniku MF1E, MF2E, MF3E nebo mF_nE/pBJ5. Aktivní domény tvarované tak, že obsahují kompatibilní přiléhající restrikční místa (t. Xhol a Sáli) pak byly klonovány do jedinečných Xhol nebo Sáli restrikčních míst MF_nE/pBJ5.

Příklad 7

Konstrukce jaderné chiméry

A. GAL4 DNA vazebná doména - FKBP doména(y)-epitop tag.

Gal4 DNA vazebná doména (aminokyseliny 1-147) byla amplifikována PCR za použití 5' primeru (#37),který obsahuje SacII místo proti směru Kozák sekvence a translační start místo a 3' primeru (#38), který obsahuje Sáli místo. PCR produkt byl izolován, štěpen s SacII a ligován do pBluescript II KS(+) na SacII a Sáli místech, za vzniku konstruktu pBS-GAL4. Konstrukt byl ověřen sekvenováním. SacII/SalI fragment z pBS-GAL4 byl izolován a ligován do IFKl/pBJ5 a

IFK3/pBJ5 konstruktů (obsahujících myristoylační sekvenci, viz příklad 6) na SacII a Xhol místa, za vzniku konstruktů GF1E, GF2E a GF3E.

5' konec PCR amplifikovaného produktu:

SacII |----Gal4 (1-147)-—» _ Μ K L L S S I ¹ CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCG

Kozák

3' konec PCR amplifikovaného produktu:

«----Gal4 (1-147----) |

R Q L T V S ' GACAGTTGACTGTATCGGTCGACTGTCG 3 ' CTGTCAACTGACATAGCCAGCTGACAGC

Sall

B. NF1 dimerizační/DNA vazebná doména - FKBP doména(y) - tag

HNFla dimerizační/DNA vazebná doména (aminokyseliny 1-282) byla amplifikována PCR za použití 5' primeru (#39), který obsahuje SacII místo proti směru Kozák sekvence a translační start místo, a 3' přimetu (#40), který obsahuje Sall místo. PCR produkt byl izolován, štěpen s Sad a Sall a ligován do pBluescript II KS(+) na místa SacII a Sall, za vzniku konstruktu pBS-HNF. Konstrukt byl ověřen sekvenováním. SacII/SalI fragment z pBS-HNF byl izolován a ligován k IFKl/pBJ5 a IFK/pBJ5 kontruktům na SacII a Xhol místa za vzniku konstruktů HF1E, HF2E a HF3E.

5' konec PCR amplifikovaného produktu:

Sadí |--HNF1 (1-281)—» __ Μ V S K L S

5¹ CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC

Kozák

3' konec PCR amplifikovaného produktu:

«--HNF1 (1-282)---1

A F R Η K L

5' CCTTCCGGCACAAGTTGGTCGACTGTCG 3' GGAAGGCCGTGTTCAACCAGCTGACAGC

Sall

C. FKBP doména(y)-VP16 transkrip.akt ivační doména(y)-epitop tag.

Tyto konstrukty byly vyrobeny ve dvou stupních: (i) byl vytvořen konstrukt z IFK3/pBJ5, ve kterém byla myristoylační sekvence nahrazena start místem bezprostředně proti směru od Xhol místa, za vzniku konstruktu SF3E; (ii) jaderně lokalizující sekvence byla izertována do Xhol místa za vzniku konstruktu NF3E; (iii) VP16 aktivační doména byla klonována do Sall místa NF3E za vzniku konstruktu NF3V1E.

(i) Komplementární oligonukleotidy (#45 a #46), kódující Kozák sekvenci a start místo přiléhající k SacII a Xhol místům byly teplotně hybridizovány, fosforylovány a ligovány do SacII a Xhol místa MF3E, za vzniku konstruktu SF3E.

Inzerce generického start místa

Kozák _M L E

GGCCACCATGC CGCCGGTGGTACGAGCT

5' 3 ¹

Sacll' Xhol přesah přesah (ii) Komplementární oligonukleotidy (#47 a #48), kódující SV40 T antigen jaderně lokalizující sekvence přiléhající k 5 Sáli místu a 3'Xhol místu byly teplotně hybridizovány, fosforylovány a ligovány do Xhol místa SF1E, za vzniku konstruktu NF1E. Konstrukt byl ověřen DNA sekvenováním. Konstrukt, obsahující mutant nebo defekní formu jaderně lokalizující sekvence, ve které threonin nahrazuje lysin v poloze 128, byl také izolován. Tento je onačen NF1E-M. Multimery FKBP12 domény byly získány izolací FKBP12 sekvence jako Xhol/Sall fragmentu z pBS-FKBP12 a ligací tohoto fragmentu do NF1E linearizován s Xhol. Toto vedlo k poskytnutí konstruktů NF2E a NF3E.

Inzerce NLS do generického start místa

T (ACN)

126 .132

LDPKKKRKVLE ' TCGACCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTAC 3 ' GGGATTCTTCTTCTCTTTCCATGAGCT

Sall Xhol

Threonin v poloze 128 vede k defektní NLS.

(iii) VP16 transkripční aktivační doména (aminokyseliny 413-490) byla amplifikována PCR za použití 5' primeru (#43) , který obsahuje Sall místo a 3' primeru (#44), který obsahuje Xhol místo. PCR produkt byl izolován, štěpen s Sall a Xhol a ligován do MF3E na Xhol a Sall místa, za poskytnutí konstruktu MV1E. Konstrukt byl ověřen sekvenováním.

Multimerizované VP16 domény byly vytvořeny izolací jednotlivé vP16 sekvence jako Xhol/Sall fragmentu z MV1E a ligací tohoto fragmentu do MV1E 1inearizovaného s Xhol. Konstrukty MV2E, MV3E a MV4E byly generovány témto způsobem. DNA fragmenty, kódující jednu nebo více VP16 domén byly izolovány jako Xhol/Sall fragmenty z MV1E nebo MV2E a ligovány do NF1E 1inearizovaného s Sall, za vzniku konstruktů NF1V1E a NF1V3E. Multimery FKBP12 domény byly získány izolací FKPBP12 sekvence jako Xhol/Sall fragment z pBS-FKBP12 a ligací tohoto fragmentu do NF1V1E 1inearizovaného s Xhol. Toto vede k vytvoření konstruktů NF2V1E a NF3V1E.

5' konec PCR amplifikovaného produktu:

SalI 1—VP16 (413-490)—-» ______ A P P ^{T D V}

CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC

3' konec PCR amplifikovaného produktu:

«— VP16 (413-490)----|

D E Y G G ' GACGAGTACGGTGGGCTCGAGTGTCG 3 ' CTGCTCATGCCACCCGAGCTCACAGC

Xhol

Oligonukleot idy:

#37 38mer/0.2um/OFF 5’CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCT ATCG #38.28mer/0.2um/OFF 5'CGACAGTCGACCGATACAGTCAACTGTC #39 34mer/0.2um/OFF 5'CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC #40 28mer/0.2um/OFF 5'CGACAGTCGACCAACTTGTGCCGGAAGG #43 29mer/0.2um/OFF 5'CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC #44 26mer/0.2um/OFF 5'CGACACTCGAGCCCACCGTACTCGTC #45 26mer/0.2um/OFF 5'GGCCACCATGC #46 18mer/0.2um/OFF 5'TCGAGCATGGTGGCCGC #47 27mer/0.2um/OFF 5'TCGACCCTAAGA-(C/A)-GAAGAGAAAGGTAC #48 27mer/0.2um/OFF 5'TCGAGTACCTTTCTCTTC-(G/T)-TCTTAGGG

Příklad 8

Demonstracee transkripční indukce

Jurkat TAg buňky byly transfektovány s uvedenými konstrukty (5 pg každého konstruktu) elektroporací (960 pF, 250 V). Po 24 hodinách byly buňky resuspendovány v čertvém mediu a odebrány podíly. Polovina každé transfekce byla inkubována s dimerním FK506 derivátem (příklad 14) za konečné koncentrace 1 pM. Po 12 hodinách byly buňky promyty a buněčné extrakty byly připraveny opakovaným zmražením-táním.

Chloramfenikol acetyltransferásová (CAT) aktivita byla měřena podle standardních protokolů. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a spol.,vyd.(1989) CSH Laboratory, str.

16-59. Data dokládají CAT aktivitu přítomnou podle očekávání (ve vzorku 2 s nebo bez ligandu; a ve vzorcích 5 a 6 za přítomnosti ligandu) v 70 pl extraktu (celkový objem extraktu byl 120 pl) po inkubaci při 37 °C po 18 hodin. Vzorky použité ve zkoušce jsou následující:

1. G5E4TCAT (GAL4-CAT reportér plasmid)

2. G5E4TCAT, GAL4-VP16

3. G5E4TCAT, NF3V1E

4. G5E4TCAT, GF2E

5. G5E4TCAT, GF2E, NF3V1E

6. G5E4TCAT, GF3E, NF3V1E

Příklady chemické syntéza

Jak již bylo jinde uvedeno, zvláště sloučeniny zvláště zajímavé jako oligomerizační činidla, mají následující strukturu:

linker —[rbmi,rbnn ...rbm_n], kde linker je linkerová skupina jak je zde popsána, která je kovalentně navázána k n (celé číslo od 2 do asi 5, obvykle 2 nebo 3) receptor vázajícím skupinám (rbm ), které jsou stejné nebo rozdílné. Jak již zde bylo na jiném místě uvedeno, receptor vázající skupinou je ligand (nebo jeho analog) pro známý receptor, jak jsou uvedeny v Sekci V(C) a zahrnují FK506, FK520, rapamycin a jeho analogy, které jsou schopny vazby k FKBP jakož i cyklosporiny, tetracykliny, jiná antibiotika a makrolidy a steroidy, které jsou schopny se vázat k příslušným receptorům.

Linker je bi- nebo multi-funkční molekula schopná být kovalentně navázána (-) ke dvěma nebo více receptor vázajícím skupinám. Typicky bu linker měl zahrnovat až asi 40 atomů a může obsahovat navíc k uhlíku a vodíku dusík, kyslík a síru. Ilustrativní linkerové skupiny jsou popsány v Sekci VI(A) a v různých příkladech a zahrnují mezi jinými C1-C30 alkylové, alkylenové nebo arylalkylové skupiny, které mohou být substituovány nebo nesubstituovány a mohou mít přímý řetězec, být rozvětvené nebo cyklické. Například alkylové substituenty jsou skupiny s nasyceným přímým řetězcem, cyklické nebo rozvětvené skupiny, výhodně s jedním až dvanácti atomy uhlíku, zahrnujcí methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, cyklopropyl, n-butyl, terč.butyl, cyklobutyl, cyklopropylmethylen, pentyi, hexyl, heptyl, oktyl atd. a mohou být ppřípadě substituovány jedním nebo více substituenty jako je nižší alkoxy, karboxy, amino (substituovaný nebo nesubstituovaný), fenyl, aryl, merkapto, halogen (fluor, chlor, brom nebo jod), azido nebo kyano.

Tyto sloučeniny mohou být připraveny za použití komerčně dostupných materiálů a/nebo postupů v oboru známých.Zpracované receptory pro tyto sloučeniny mohou být získány jak popsáno výše. Zvláště zajímavé sloučeniny jsou ty, které se vážou k receptorů s Kd menší než 10^-6, výhodně menší než asi 10^-7 a výhodněji menší než 10⁸M.

Jedna podtřída oligomerizačních činidel jsou ty, ve kterých je jednou nebo více receptor vázajícími skupinami FK506, sloučeniny typu FK506 nebo její deriváty, kde receptor vázající skupiny jsou kovalentně připojeny k linkerové skupině přes allylskupinu na C21 (použito číslování FK506) jako za pomoci sloučeniny 5 nebo 13 na obr.9A nebo přes cyklohexylový kruh (C29-C34), např. přes C32 hydroxyl jako u sloučenin 8,16,17 na obr.9B. Sloučeniny této třídy mohou být připraveny úpravou metod zde popsaných, uvedených v následujících příkladech.

Další podtřída zajímavých oligomerizačních čnidel je ta, ve které alespoň jedna z receptor vázajících skupin je FK520 nebo její derivát, kde molekuly FK520 nebo jejich deriváty jsou kovalentně připojeny k linkerové skupině jako je FK1040A nebo FK1040B na obr. 10. Sloučeniny této třídy mohou být připraveny úpravou schéma 1 na obr.10, schéma 2 na obr.llA a 11B nebo schéma 3 na obr.12 a obr.13.

Další podtřída zajímavých oligomerizačních činidel, ve kterých alespoň jednou z receptor vázajících skupin je cyclosporin A nebo jeho derivát.

Je třeba chápat, že tato a jiná oligomerizační činidla podle vynálezu mohou být homo-oligomerizačni činidla (kde rbm jsou stejné) nebo hetero-oligomerizační činidla (kde rbm jsou rozdílné). Hetero-oligomerizační činidla mohou být připravena analogicky zde uvedeným postupům, zahrnutým ve schéma 3 na obr.13 a jinde zde popsaným.

Následující syntetické příklady jsou míněny jako ilustrat ivní.

A. Obecné postupy

Všechny reakce byly provedeny ve skle vysušeném v sušárně za pozitivního tlaku dusíku nebo argonu. Vzduch a sloučeniny citlivé k vlhkosti byly zaváděny přes stříkačku nebo kanylu přes gumovou přepážku.

B. Fyzikální údaje.

Spektra protonové magnetické rezonance OH NMR) byla zaznamenána na spektrometrech Bruker AM-500 (500 MHz) a AM-400 (400 MHz). Chemické posuny jsou uváděny v ppm tetramethylsilanu za použití rezonance rozpouštědla jako vnitřního standardu (chloroform, 7,27 ppm). Hodnoty jsou uváděny takto: chemický posun, multiplicita (s= singlet, d= dublet, t= triplet, q= kvartet, br= rozšířený, m= multiplet), kopulační konstanty (Hz), integrace. Byla získána nízko a vysokoroz1 išující hmotová spektra.

C. Chromatografie

Reakce byly sledovány chromatografií na tenké vrstvě (TLC) za použití E.Merck silikagel 60F skleněných desek (0,25 mm). Složky byly vizualizovány osvětlením dlouhovlnovým ultrafialovým světlem, vystavením jodovým parám a/nebo ponořením do vodného roztoku molybdenátu ceritoamonného s následujícím zahřátím. Rozpouštědla pro chromatografi i byla čistoty HPLC. Kapalinová chromatografie byla provedena za použití zesíleného toku (rychlá chromatografie) uvedeného rozpouštědlového systému na E-Merck silikagelu 60 (230-400 mesh).

D.Rozpouštědla a činidla.

Všechna použitá činidla a rozpouštědla byla analytické čistoty a byla použita jak byla získána s následujícími výjimkami. Tetrahydrofuran (THF), benzen, toluen diethylether byly destilovány z kovový sodík benzofenon ketylu. Triethylamin a acetonitril byly destilovány z hydridu vápníku. Dichlormethan byl destilován z oxidu fosforečného. Dimethy1formamid (DMF) byl destilován z hydridu vápníku za sníženého tlaku a uchováván nad molekulovým sítem 4 .

Příprava FK506 derivátů

Příklad 9

Hydroborace/oxidace FK506-TBS2 (1 až 2)

Hydroborace byla provedena podle postupu Evanse (Evans a spol., JACS (1992)114, 6679; ibid (1992) 6679-6685). (Viz Harding a spol., Nátuře (1989) 341, 758 pro číslování). lOml baňka byla naplněna

24,32-bi[(terč.butyldimethylsilyl)oxy]-FK506 (33,8 mg, 0,033 mmol) a [Rh(nbd)(difos-4)]BF4 (3,1 mg, 0,004 mmol, 13 % mol.). Oranžová směs byla rozpuštěna v toluenu (2,0 ml) a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku během čtyř hodin. Baňka byla pečlivě profouknuta dusíkem a naoranžovělý olej byl rozpuštěn v THF (3,0 ml, 10 M konečná koncentrace) a ochlazen na 0 °C v lázni ledové vody. Katecholboran (98 μΐ, 0,098 mmol, i,0M roztok v THF, 3,0 ekv.) byl přidán přes stříkačku a výsledný roztok byl míchán při 0 °C 45 minut. Reakce byla přerušena při 0 °C 0,2 ml THF/EtOH (l:l)a pak 0,2 ml pufru pH 7,0 (Fisher, 0,05M fosfát) a pak 0,2 ml 30% H2O2. Roztok byl míchán při teplotě místnosti alespoň 12 hodin. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku a zbylý olej byl rozpuštěn v benzenu (10 ml) a promyt nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Fáze se oddělí a vodná fáze se zpětně extrahuje benzenem (2 x 10 ml).

Organické fáze se spojí a promyjí se jednou nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Benzenová fáze se suší MgSO4, zahustí a podrobí rychlé chromatografii (2:1 hexan:ethylacetát) a získá se požadovaný primární alkohol jako čirý, bezbarvý olej (12,8 mg, 0,012 mmol, 37 %).

Příprava směsného karbonátu (2 až 3).

Příprava směsného karbonátu byla provedena metodou

Ghoshe (Ghosh a spol. Tetrahedron Lett.(1992) 33, 2781-2784. lOml baňka byla naplněna primárním alkoholem (29,2 mg, 0,028 mmol) a benzenem (4 ml). Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku během 60 minut. Olej byl rozpuštěn v acetonitrilu (2,0 ml, 14 mM konečná koncentrace) a míchán při 20 °C při přidávání triethylaminu (77 μΐ, 0,56 mmol).

N,N'-disukcinimidylkarbonát (36 mg, 0,14 mmol) byl přidán najednou a roztok byl míchán při 20 °C 46 hodin. Reakční směs byla zředěna dichlormethanem a promyta nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Fáze byly odděleny a vodná vrstva byla zpětně extrahována

100 dichlormethanem (2 x 10 ml). Organické fáze byly spojeny a sušeny (MgSOí), zahuštěny a podrobeny rychlé chromatografi i (3:1 až 2:1 až 1:1 hexan:ethylacetát). Požadovaný směsný karbonát byl izolován jako čirý, bezbarvý olej (16,8 mg,

0,014 mmol, 51%).

Dimerizace FK506 (3 až 4). Suchá, lml konická lahvička (Kontes Scientific Glassware) byla naplněna směsným karbonátem (7,3 mg, 0,0061 mmol) a acetonitri 1em (250 μΐ, 25 mM konečná koncentrace).Byl přidán triethylamin (10 μΐ, 0,075 mmol) a pak p-xyly1endiamin (8,3 μΐ, 0,0027 mmol, 0,32M roztok v DMF). Reakce byla míchána 22 h při 20 °C a pak byla přerušena zředěním dichlormethanem (10 ml). Roztok byl promyt nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Fáze byly odděleny a vodná vrstva byla zpětně extrahována dichlormethanem (2 x 10 ml). Organické fáze byly spojeny a sušeny (MgSO*), zahuštěny a podrobeny rychlé chromatografi i (3:1 až 2:1 až 1:1 hexan:ethylacetát) za poskytnutí požadovaného chráněného dimeru jako čirého, bezbarvého oleje (4,3 mg,1,9 pmmol, 70 %) .

Odchránění FK506 dimeru (4 až 5). Chráněný dimer (3,3 mg, 1,4 pmol) byl umístěn do l,5ml polypropylenové zkumavky opatřené vysoustruženým průzorem. Acetonitril (0,5 ml, 3 mM onečná koncentrace) byl přidán a roztok byl míchán při 20 °C při přidávání HF (55 μΐ, 48% vodný roztok, Fisher). Roztok byl míchán 18 h při teplotě místnosti. Odchráněný FK506 derivát byl pak rozdělen mezi dichlormethan a nasycený vodný hydrogenuhličitan v 15,1 zkušební zkumavce. Zkumavka byla intenzivně míchána pro promíení fází a po oddělení byla organická fáze odstraněna pipetou. Vodná byla zpětně extrahována dichlormethanem (4x2 ml). Organické fáze byly spojeny a sušeny (MgSOzQ , zahuštěny a podrobeny rychlé ΐ υ i chromatografi i (1: 1:1 hexan:THF:ether až 1:1 THF:ether) za poskytnutí požadovaného dimeru jako čirého, bezbarvého oleje (1,7 mg, 0,93 pmmol, 65 %).

Ve výše uvedených postupech mohou být použity jiné monoaminy a diaminy jako je benzylamin (14) oktamethylendiamin, dekamethy1endiamin atd.

102

Příklad 10

Redukce FK506 s L-selectridem (FK506 až 6)

Danishevsky a spolupracovníci prokázali, že zpracování FK506 s L-selectridem poskytuje 22-dihydro-FK506 s boronátovým esterem upoutaným na C24 a C22 hydroxylové skupiny (Coleman a Danishefsky, Heterocycles (1989) 28, 157-161; Fisher a spol., J.Org.Chem. (1991) 56, 2900-2907).

Příprava směsného karbonátu (6 až 7). lOml baňka byla naplněna 22-dihydro-FK506-sek.butylboronátem (125,3 mg, 0,144 mmol) a acetonitri 1em (3,0 ml, 50 mM konečná koncentrace) a míchána při teplotě místnosti při přidávání triethylaminu (200 μΐ, 1,44 mmol, 10 ekv.) k čirému roztoku.

N,N'-Disukcinimidylkarbonát (184,0 mg, 0,719 mmol) byl přidán najednou a čirý roztok byl míchán při teplotě místnosti 44 h. Roztok byl zředěn ethylacetátem (20 ml) a promyt nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (10 ml) a fáze byly odděleny.

Vodná fáze pak byla zpětně extrahována ethylacetátem (2 x 10 ml) a organické fáze byly spojeny, sušeny (MgSCU) a výsledný olej byl podroben rychlé chromatografi i i (1:1 až 1:2 hexan:ethylacetát) za poskytnutí požadovaného směsného

I karbonátu jako čirého, bezbarvého ole^,. (89,0 mg, 0,088 mmol, 61 %) .

Dimerizace FK506 směsného karbonátu (7 až 8).

Suchá, lml konická skleněná lahvička (Kontes Scientific Glassware) byla naplněna směsným karbonátem (15,0 mg, 0,0148 mmol) a dichlormethanem (500 μΐ, 30 mM konečná koncentrace). Roztok byl míchán při teplotě místnosti při přidávání triethylaminu (9 μΐ, 0,067 mmol, 10 ekv.) s následujícím

103 pidáváním p-xylylendiaminu (0,8 mg, 0,0059 mmol). Reakce byla míchána 16 h při 20 °C a byla přerušena zředěním dichlormethanem (5 ml). Roztok byl promyt nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu (5 ral). Fáze byly odděleny a vodná vrstva byla zpětně extrahována dichlormethanem (2x5 ml). Organické fáze byly spojeny a sušeny (MgSOň), zahuštěny a podrobeny rychlé chromatografii (1:1 až 1:2 hexan:ethylacetát) za poskytnutí požadovaného dimeru jako čirého bezbarvého oleje (7,4 mg, 3,8 pmol, 65 %) .

Ve výše uvedeném postupu je možno použít jiné monoaminy, diaminy nebo triaminy místo xyly1endiaminu, jako je benzylamin (15), oktylendiamin, dekamethylendiamin(16), bis-p-dibenzylamin, N-methyldiethylenamin, tris-aminoethylamin(17), tris-aminopropylamin,

I, 3,5-triainomethylcyklohexan atd.

Příklad 11

Oxidativní štěpení a redukce FK506 (1 až 9).

Osmylace byla provedena podle postupuKellyho (VanRheenen a spol., Tetrahedron Lett. (1976) 17, 1973-1976). Štěpení bylo provedeno podle postupu Danishefsky-ho (Zeli a spol.,

J. Org.Chem.(1986) 51,5032-5036). Aldehydová redukce byla provedena podle postupu Krishnamurthy-ho (J.Org.Chem.

(1981)46,4628-4691). lOml baňka byla naplněna

24,32-bis[terc.butyldimethylsily1oxy]-FK506 (84,4 mg,0,082 mmol), 4-methylmorfolin-N-oxidem (48 mg, 0,41 mmol, 5 ekv.) a THF (2,0 ml, 41 nM konečná koncentrace). Oxid osmičelý (45 μΐ, 0,08 mmol, 0,1 ekv) byl přidán stříkačkou. Čirý, bezbarvý roztok byl míchán při teplotě místnosti 5 hodin. Reakce pak byla zředěna 50% vodným methanolem (1,0 ml) a najednou byl

104 přidán jodistan sodný (175 mg, 0,82 mmol, 10 ekv.). Kalná směs byla míchána 40 min při teplotě místnosti, zředěna etherem (10 ml) a promyta nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5 ml). Fáze byly odděleny a vodná vrstva byla zpětně extrahována dichlormethanem (2x5 ml). Organické fáze byly spojeny a sušeny (MgSO4),zpracovány se siřičitanera sodným (50 mg). Organická fáze pak byla filtrována a zahuštěna a olej byl podroben rychlé chromatografi i (3:1 až 2:1 hexan:ethylacetát) za poskytnutí meziproduktu, nestabilního aldehydu (53,6 mg) jako čirého bezbarvého oleje. Aldehyd byl ihned rozpuštěn v THF (4,0 ml) a ochlazen na -78 °C pod atmosférou dusíku a zpracován s i thium-tris[(3-ethyl-3-pentyl)oxy]aluminiumhydridem (0,60 ml, 0,082 mmol, 0,14 M roztok v THF, 1,0 ekv.). Čirý roztokbyl ponechán míchat lOmin při -78 °C pak přerušen zředěním etherem (4 ml) a přídavkem nasyceného voného chloridu amonného (0,3 ml). Směs byla ponechána ohřát na teplotu místnosti a k suchému roztoku byl přidán pevný síran sodný. Směs pak byla filtrována a zahuštěna a výsledný olej byl podroben rychlé chromatografi i (2:1 hexan:ethylacetát) za poskytnutí požadovaného alkoholu jako čirého, bezbarvého oleje (39,5 mg, 0,038 mmol, 74 %).

Příprava směsného karbonátu (9 až 10).

Příprava směsného karbonátu byla provedena metodou Ghoshe a spol., Tetrahedron Lett. (1992) 33, 2781-2784). lOml baňka byla naplněna primárním alkoholem (38,2 mg, 0,0369 mmol) a acetonitri lem (2,0 ml, 10 mM konečná koncentrace) a míchána při teplotě místnosti za přidávání 2,6-lutidinu (43 μΐ, 0,37 mmol, 10 ekv.). N,N'-disukcinimidylkarbonát (48 mg,

0,18 mmol) byl přidán najednou a roztok byl míchán při teplotě místnosti 24 hodin. Reakční směs byla zředěna etherem (10 ml) a promyta nasyceným vodným roztokem ¹ y, ‘ i ogonub I i <’ i 1 anu sodného (10 ml). Fáze byly odděleny a vodná vrstva byla zpětně extrahována etherem (2 x 10 ml). Organické fáze byly spojeny a sušeny (MgSCU) , zahuštěny a podrobeny rychlé chromatografi i (2:1 až 1:1 hexan:ethylacetát). Požadovaný směsný karbonát byl izolován jako čirý, bezbarvý olej (32,6 mg, 0,028 mmol, 75 %).

Příprava benzylkarbamátu (10 až 11).

Suchá, lml konická skleněná lahvička (Kontes Scientific Glassware) byla naplněna směsným karbonátem 10 (8,7 mg,

0,0074 mmol) a acetonitri 1em (500 μΐ, 15 mM konečná koncentrace) Roztok byl míchán při teplotě místnosti při přidávání triethylaminu (10 μΐ, 0,074 mmol, 10 ekv.) a pak benzylamidu (1,6 μΐ , 0,015 tnmol, 2 ekv.). Reakce byla míchána 4 h při teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo odstraněno v proudu suchého dusíku a olej byl přímo podroben rychlé chromatografií (3:1 až 2:1 hxan:ethylacetát) za poskytnutí _; ad .ariéhi) chráněného monomeru jako čirého, bezbarvého oleje (6,2 mg, 5,3 pmol, 72 %).

Chráněný monomer (0,2 mg, 5,3 μαιαΐ) byl umístěn do l,5ml propylenové zkumavky opatřené vysoustruženým průřezem. Acetonitril (0,5 ml, 11 mM konečná koncentrace) byl přidán a roztok byl míchán při teplotě místnosti při přidávání HF (55 μΐ, 48 % vodný roztok; Fisher, 3,ON konečná koncentrace).Roztok byl míchán 18 h při teplotě místnosti. Odchráněný FK506 derivát se pak rozdělil mezi dichlormethan a nasycený vodný hydrogenuhličitan sodný v 15ml zkušební zkumavce. Zkumavka byla intenzivně míchána pro promísení fází a po oddělení byla oorganická fáze odstraněna pipetou. Vodná vodná vrstva byla zpětně extrahována dichlonnethanem (4 x 2

106 ml). Organické fáze byly spojeny a sušeny (MgSO4), zahuštěny a podrobeny rychlé chromátografi i (1:1 až 0:1 hexan:ethylacetát) za poskytnutí požadovaného odchráněného benzylkarbamátu jako čirého, bezbarvého oleje (3,9 mg, 4,1 pmol 78 %) .

Nahrazením benzylaminu diaminem jako je xylylendiamin (12), hexamethylendiaminem, oktamethylendiaminem, dekamethylendiaminem (13) nebo jinými diaminy se připraví dimerní sloučeniny podle předloženého vynálezu.

Příklad 12

Příprava směsného karbonátu FK506 (12).

lOml baňka byla naplněna

24,32-bis[(terč.butyldimethy1silyl)oxy]-FK506 (339,5 mg,

0,329 mmol), 4-methylmorfolin-N-oxidem (193 mg, 1,64 mmol, 5 ekv.), vodou (0,20 ml) a THF (8,0 ml, 41 mN konečná koncentrace). Oxid osmičelý (0,183 ml, 0,033 mmol, 0,1 ekv., 0,18M rozt. ve vodě) byl přidán stříkačkou. Čirý, bezbarvý roztok byl míchán při teplotě místnosti 4,5 hodiny. Reakce byla zředěna 50% vodným methanolem (4,0 ml) a najednou byl přidán jodistan sodný (700 mg, 3,29 mmol, 10 ekv.). Kalná směs byla míchána 25 min při teplotě místnosti, zředěna etherem (20 ml) a promyta nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Fáze byly odděleny a vodná vrstva zpětně extrahována etherem (2 x 10 ml). Spojené organické vrstvy byly sušeny nad MgSOí a pevným síranem sodným (50 mg). Organická fáze pak byla filtrována a zahuštěna a výsledný aldehyd byl ihned rozpuštěn v THF (8,0 ml) a ochlazen na -78 °C pod atmosférou dusíku a zpracován s lithium tris[(3-ethyl-3-pentl)oxy]aluminiumhydridem (2,35 ml, 0,329 mmol, 0,14M roztok v THF, 1,0 ekv.). Čirý roztok byl

107 ponechán míchat 60 min při -78 °C (sledován pomocí TLC) a pak přerušen při -78 °C zředěním s etherem (5 ml) a přídavkem nasyceného vodného chloridu amonného (0,3 ml). Směs byla ponechána ohřát na teplotu místnosti a pro sušení roztoku byl přidán pevný síran amonný. Směs byla míchána 20 min, odfiltrována, zahuštěna a výsledný olej byl ihned rozpuštěn v acetonitrilu (10 ml). K roztoku vzniklého primárního alkoholu v CH3CN byl přidán 2,6-lutidin (0,380 ml, 3,3 mmol, 10 ekv.) a N,N'-disukcininidylkarbonát (420 mg, 1,65 mmol, 5 ekv.). Heterogenní směs byla míchána při teplotě místnosti 19 hodin, pak byl roztok zředěn etherem (30 ml) a promyt nasyceným vodným hydrogenuhliči taném sodným (20 ml).

Vodná vrstva byla zpětně extrahována etherem (2 x 10 ml). Organické fáze byly spojeny a sušeny (MgSO*), zahuštěny a podrobeny rychlé chromatografi i (3:1 až 2:1 až 1:1 hexan:ethylacetát). Požadovaný směsný karbonát 12 byl izolován jako čirý, bezbarvý olej (217 mg, 0,184 mmol, 56 % pro všechny 4 stupně).

Příklad 13

Příprava 24, 24', 32,

32'-tetrakis[(terč.butyldimethylsilyl)oxy]-FK1012-A.

(p-Xylylendiaminový můstek)

Suchá, Imi konická nádobka byla naplněna směsným karbonátem (23,9 mg, 0,0203 mmol) a acetonitri lem (500 μΐ, 41 mM konečná koncentrace). Byl přidán triethylamin (28 μΐ, 0,20 mmol, 10 ekv) a pak p-xylylendiamin (46 μΐ, 0,0101 mmol,

0,22M oztok v DMF). Reakce byla míchána 18 h při teplotě místnosti, rozpouštědlo bylo odstraněno proudem suchého dusíku a olej byl přímo podroben rychlé chromatografi i (3:1 až 2:1 až 1:1 hexan/ethylacetát) za poskytnutí požadovaného

108 chráněného dimeru jako čirého, bezbarvého oleje (11,9 mg, 5,3 pmo1, 52 %).

Příklad 14

Příprava FK1012-A (p-xylylendiaminový můstek)(13).

Chráněný dimer (11,0 mg, 4,9 pmol) byl umístěn do l,5ml polypropylenové zkumavky opatřené vysoustruř_^ženým zářezem. Byl přidán acetonitril (0,50 ml, 10 mM konečná koncentrace) a roztok byl míchán při 20 °C při přidávání HF (55 μΐ, 48% vodný roztok, Fisher, 3,ON konečná koncentrace). Roztok byl míchán 16 h při teplotě místnosti. Odchráněný FK506 derivát byl pak rozdělen mezi dichlormethan a nasycený vodný hydrogenuhli čitan sodný v 15ml zkušební zkumavce. Zkumavka byla míchána pro promísení fází a po oddělení byla organická fáze odstraněna pipetou. Vodná fáze byla zpětně extrahována dichlormethanem (4x2 ml) a spojené organické fáze byly sušena (MgSCM), zahuštěny a podrobeny rychlé chromatografií (1:1:1 hexan/THF/ether až 1:1 THF/ether) za poskytnutí FK1012-A jako bezbarvého, čirého oleje (5,5 mg, 3,0 pmol, 63 %).

Příklad 15

Příprava 24, 24', 32,

32’-tetraki s[(terc.butyldimethylsilyl)oxy]-FK1012-B.

(diaminodekanový můstek)

Suchá, lml konická skleněná lahvička byla naplněna směsným karbonátem (53,3 mg, 0,0453 mmol) a acetonitri 1em (2,0 ml, 11 mM konečná koncentrace). Triethylamin (16 μΐ,

0,11 mmol, 5 ekv.) byl přidán s následujícím přídavkem diaminodekanu (61 μΐ, 0,0226 mmol, 0,37 M roztok v DMF).

Reakce se míchá 12 h při teplotě místnosti, rozpouštědlo se odstraní proudem suchého dusíku a olej se přímo podrobí

109 rychlé chromatografii (3:1 až 2:1 až 1:1 hexan/ethylacetát) a získá se požadovaný dimer jako čirý, bezbarvý olej (18,0 mg,

7,8 pmo1,35%).

Příklad 16

Příprava FK1012-B (Diaminodekan-1,10 můstek)(14)

Chráněný imer(18,0 mg, 7,8 pmol) byl umístěn do l,5ml polypropylenové zkumavky opatřené vysoustruženým výřezem. Acetonitril (0,45 ml, 16 mM konečná koncentrace) byl přidán a roztok byl míchán při teplotě místnosti při přidávání HF (55 μΐ, 48% voný roztok ; 3,6N konečná koncentrace). Roztok bylmíchán 17 h při 23 °C. Produkt FK10Í2-B byl pal rozdělen mezi dichlormethan a nasycený vodný hydrogenuhličitan sodný v 15ml zkušební zkumavce. Zkumavka byla míchána intenzivně pro promísení fází a po oddělení byla organická fáze odstraněna pipetou. Vodná vrstva byla zpětně extrahována dichlormethanem (4x2 ml).Organické fáze byly spojeny a sušeny (MgSOí), zahuštěny a podrobeny rychlé chromatografii (100% ethylacetát až 20:1 ethylacetát/methanol).Získá se FK1012-B jako čirý, bezbarvý olej (5,3 mg, 2,9 pmol, 37 %).

Příklad 17

Příprava 24, 24', 32,

32'-tetrakis [(terc.butyldimethylsilyl)oxy]-FK1012-C.

(bis-p-aminomethylbenzoyldiaminodekanový můstek)

Suchá 25ml slzovitě tvarovaná nádobka byla naplněna diaminovým linkerem (15,1 mg, 0,0344 mmol) a 1,0 ml DMF. V oddlené nádobě byly směsný karbonát a triethylamin (0,100 ml, 20 ekv.) rozpuštěny ve 2,0 ml dichlormethanu a pak pomalu přidány (4x50 ml) k míchanému roztoku bis-p-aminomethylbenzoyl,diaminodekanu-l,10. Nádoba

110 obsahující směsný karbonát 12 byla promyta dichlormethanem (2 x 0,50 ml) pro dosažení kompletního převedení směsného karbonátu 12. Reakce se míchá 16 h při 23 °C, rozpouštědlo se odstraní proudem suchého dusíku a olej se přímo podrobí rychlé chromatografi i (1:1 až 1:2 hexan/ethylacetát) a získá se požadovaný chráněný dimer jako čirý, bezbarvý olej (29,6 mg, 11,5 pmo1, 34 %) .

Příklad 18

Příprava FK1012-C (15)

Chráněný dimer (29,6 mg, 11,5 pmol)(17) se umístí do l,5ml polypropylenové zkumavky opatřené míchací tyčkou. Přidá se acetonitril (0,45 ml, 23 mM konečná koncentrace) a roztok se míchá při teplotě místnosti při přidávání HF (55 μΐ, 48% vodný roztok; Fisher, 3,6 N konečná koncentrace). Roztok se míchá 17 h při teplotě místnosti. Požadovaný symetrický dimer se pak rozdělí mezi dichlormethan a nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného v 15ml zkušební zkumavce. Zkumavka se intenzivně míchá pro promísení fází a po oddělení se organická fáze odstraní pipetou. Vodná fáze se zpětně extrahuje dichlormethanem (4x2 ml) a spojené organické fáze se suší (MgSO4), zahustí a podrobí se rychlé chromatografi i (100% ethylacetát až 15:1 ethylacetát/methanol) a získá se FK1012-C jako čirý, bezbarvý olej (11,5 mg, 5,5 μιηοΐ, 47 %) .

Příprava CsA derivátů

Příklad 19

MeBmt(OAc)—OH¹CsA (2).

MeBmt(OAc)—OAciCsA (1) (161 mg, 124 mmol)viz Ebrle a

Nuninger, J.Org.Chem. (1992)57, 2689) se rozpustí v methanolu

11 (10 ml). KOH (196 mg) se rozpustí ve vodě (8 ml). 297 ml KOH roztoku (0,130 mmol, 1,05 ekv.) se přidá k roztoku (1) v MeOH. Tento nový roztok se míchá při teplotě místnosti pod inertní atmosférou po 4 hodiny a pak se reakce přeruší kyselinou octovou (2 ml). Reakční směs se čistí HPLC s reverzní fází za použití 5 cm x 25 cm, 12 μ, 100 A, C18 kolony při 70 °C za eluce 70% acetonitri 1em/vodou, obsahujícím 0,1 % (obj./obj.) kyseliny trifluoroctové za získání 112 mg (72 %) požadovaného monoacetátu (2).

MeBmt(OAc)--OCOIm¹CsA (3) MeBmt (OAc)—OH^sA (2)(57 mg, 45,5 pmol) a karbonyldiimidazol (15 mg, 2 ekv., 91 pmol) se přenesou do 50ml baňky s kulatým dnem a rozpustí se v suchém THF (6 ml). Přidá se diisopropylethylamin (32 pl, 4 ekv., 182 pmol) a pak se rozpouštědlo odstraní na rotační odparce při teplotě místnosti. Zbytek se čistí rychlou chromatografíí na silikagelu za použití ethylacetátu jako elučního činidla a získá se 45 mg (73 %) požadovaného karbamátu (3).

Tris-(2-aminoethyl)amin CsA trimer triacetát (6).

MeBmt (OAc)—OCOIirUCsA (3) (7,5 mg, 5,54 pmol, 3,1 ekv.) se rozpustí v THF (100 pl). Přidá se diisopropylethylamin (62 pl, 5 ekv., 8,93 pmol roztok, obsahující 100 pl aminu ve 4 ml THF) a potom tris(2-aminoethyl)amin (26 pl, 1,79 pmol, 1 ekv. roztoku obsahuje 101 mg tris- aminu vlO ml THF).Tento roztok se míchá pod atmosférou dusíku 5 dnů. Reakčni směs se odpaří a pak se čistí rychlou chromatografíí na silikagelu za použití 0-5 % methanolu v chloroformu a získá se 4,1 mg požadovaného produktu (6).

Příklad 20

Diaminodekan CsA dimer (8)

112

Pevný kovový Na (200 mg, přebytek) se nechá reagovat se suchým methanolem (10 ml) při 0 °C. Diaminodekan CsA dimer diacetát (5)(4,0 mg) se rozpustí v MeOH (5 ml). 2,5 ml NaOMe roztoku se přidá k roztoku (5). Po 2,5 hodinách míchání při teplotě místnosti pod inertní atmosférou, roztok se rozloží s kyselinou octovou (2 ml) a produkt se čistí pomocí HPLC s reverzní fází za použití 5 mm x 25 mm, 12 μ, 100 A, C18 kolona při 70 °C za eluce 70-95% acetonitri 1em/vodou během 20 minut, obsahujícím 0,1 % (obj./obj.) kyseliny trifluoroctové a získá se 2,5 mg (60 %) požadovaného diolu.

Diaminodekan CsA dimer diacetát (5) byl připraven nahrazením tris(2-aminoethyl)aminu 0,45 ekv.1,10-diaminodekanu.

Příklad 21 p-Xylylendiamin CsA dimer (4).

p-Xylendiamin CsA dimer (4) se připraví nahrazením tris(2-aminoethyl)aminnu 0,45 ekv. p-xyly1endiaminu.

Postupy popsanými v literatuře se připraví jiné deriváty cyclofilinu spojením na jiném místě než 1(MeBmt 1).

Polohové 8 D-isomerové analogy se vyrobí zásobováním produkčního organismu D-aminoanalogem pro získání inkorporace specificky na toto místo. Viz Patchett a spol., J.Antibiotics (1992) 45, 943 (β-MeSO)D-Ala⁸CsA); Traber a spol., ibid (1989) 42, 591). Polohové 3 analogy se připraví poly-1ithiací/alkylací CsA, specificky na -uhlíku SaC3. Viz

Wenger, Transplant Proceeding (1986) 18, 213, supp.5 (pro cyclofi 1inový vazebný a aktivitní profil, zejména

D-MePhe³-CsA); Seebach, US patent č. 4703033, vydaný 27.řijna

113

1987 (pro přípravu derivátů).

Místo cyclosporinu A mohou být podle výše uvedených postupů multimerizovány jiné přirozeně se vyskytující varianty CsA pro použití v předloženém vynálezu.

Příklad 21A

Alternativní syntéza CsA dimeru

MeBmt(OH)-n-OCO¹-CsA

MeBmt(OH)-n-OCOi-CsA (38 mg, 31 pmol, 1218,6 g/mol) a karbonyldiimidazol (20 mg, 4 ekv., 124 pmol, 162,15 g/mol) se přenesou do lOml baňky s kulatým dnem a rozpustí v suchém THF (2 ml). Přidá se diisopropylethylamin (22 μΐ, 4 ekv., 125 pmol, 129,25 g/mol) a pak se rozpouštědlo odstraní na rotační odparce při teplotě místnosti. Zbytek se čistí rychlou chromatografíí na silikagelu za použití 0-20% acetátu v ethylacetátu jako elučního činidla a získá se 32 mg (78% výtěžek) bílé pevné látky.

114 (CsA)xylylendiaminový CsA dimer

MeBmt(OH)-n-OCOImi-CsA (12,5 mg, 9,52 pmol, 1312,7 g/mol) se rozpustí v DCM (200 μΐ). K tomuto roztoku se přidá 22 μΐ (0,5 ekv., 4,75 pmol) roztoku xylylendiaminu (14,7 mg, 136,2 g/mol) v DMSO (0,5 ml) a reakční směs se míchá 72 h při teplotě místnosti pod atmosférou dusíku za pomalého zahušťování. Reakce se zředí acetonitri 1em (2 ml), filtruje přes skelnou vlnu a čistí pomocí HPLC s reverzní fází (Beckman C18, 10μ, 100A, 1 cm x 25 cm, 5 ml/min, 50 až 90 % ACN/H20(+0,1 % TFA) během 30 min, 70 °C) za získání 6,1 mg (49% výtěžek) bílé pevné látky.

Příklad 21B

Syntéza FK506-CsA dimeru

MeBmt(OAc)-n-CH₂COOET-CsA

MeBmt(OAc)-n-CH2COOET-CsA (26 mg, asi 80% čistota, 15,7 pmol, 1323,57 g/mol) se rozpustí v THF (500 μΐ). Tento roztok se přidá stříkačkovým čerpadlem během 15 hodin k THF roztoku magnesiumenolátu ethylhydrogenmalonátu (přebytek)

115 připravenému přídavkem iPrMgCl (2,15 ml, 2,34 M v etheru) k O °C roztoku ethylhydrogenmalonátu (Lancaster, 2,5 mmol), 332 mg, 132,12 g/mol) v THF (4,7 ml) s následujícím ohřátím na teplotu místnosti. Reakční směs se rozloží IN HC1 )50 ml) a extrahuje ethylacetátem (2 x 50 ml). Organické vrstvy se suší nad síranem sodným, filtrují a odpaří.

Surový produkt se rozpustí v DMF (1 ml), přidá se Et4NOAc.4H2O (150 mg přebytek) a směs se zahřívá na 90 °C 2 hodiny. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti, zředí vodou (50 ml) a extrahuje etherem (2 x 50 ml). Spojené organické podíly se čistí rychlou chromatografii na silikagelu, eluují 75 až 100% ethylacetátem/hexany a získá se 11,4 mg (55 %) bílé pevné látky.

116

MeBmt(OH)-n-CHzCOOH¹-CsA

MeBmt (OH)-n-C^COOH¹-CsA (11,0 mg, 8,27 μιηοΐ, 1330,76 g/mol) se rozpustí v MeOH (2 ml) a přidá se k roztoku NaOMe (l,30M v meOH, 10 ml). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti pod atmosférou dusíku 5 hodin a pak se přidá voda (2 ml) a směs se míchá další 2 hodiny. Reakce se přeruší ledovou kyselinou octovou (1 ml), filtruje přes skelnou vlnu a čistí HPLC s reverzní fází (Rainin C18 dynamax, 5 μ, 300A, 21,4 mm x 250 mm, 20 ml/min, 50 až 90% ACN/H2(+0,1%TFA) během 30 minut, 70 °C) a získá se 5,5 mg (53% výtěžek) bílé pevné látky.

bis-TBS-N-(6-(Boc-amino)hexyl) FK506 karbamát biS-TBS-FK506 sukcinimidylkarbonát (také prekurzor k (tbs)4-FK1012)(5,8 mg, 1177,62 g/mol, 4,93 pmol) se rozpustí v DCM. Přidá se k němu N-Boc-1,6-diaminohexan (7,25 mg, přebytek). Po 10 min míchání při teplotě místnosti se reakční směs odpaří a produkt se čistí rychlou chromatografií za eluce 10 až 40 % ethylacetátu/hexany a získá se 5,9 mg (94 % « · · · « · · · • ·· · · · · • · ·· ·· ·· • · · • ··· • · ·« *··· • · * • · · »« ♦ · · * • · « ·* *·· výtěžek) .

N- (ó-amínohexy 1) FK506 karbamát bis“TBS-N-(6-(Bóc-amino)hexyl.) FK506 karbamát (5.9 mg 1278,88 g/mol. 4,61 umol) se převede do polypropylenové zkumavky v ACN (700 μΐ) a pak se přidá vodný HF (49 %, !00 μΐ). Reakce je ukončena po 6 hodinách při teplotě místnost rozloží se pomalým přídavkem nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Směs se zředí nasycený, hydrogenuhli či taném sodným (4 ml), vodou (4 ml) a extrahuji se DCM (3 x 10 ml). Spojené organické fáze se suší síranem horečnatým, filtrují a odpařením se získá. 3,6 mg (82% výtěžek) surového produktu.

·· v··· • · -i · · · ·· ·· • · · * · · * · · · • ··· · ··«« 9 · · * • Λ * · · · · ··»··· • · · · · 5 · »····♦· · · “ · · * * · ·

Mé O,

H„ Ν'

7°γί<4Λ'

Ma,. J O K

.. O=\H '_T| ^Mt> OH O

M

H 1 ,N^ ,0. J Me Me íl

O

..· γγ γ ile Me k A

OMe

OH

FKCsA

MeBmt(OH)-n-CHžCOOHi-CsA (2,86 mg, 2,27 pmol. !260,6b g/mol) a N-(6™ aminohexy1) FKS06 karbamát (surový, 2,16 mg. 2,28 pmol, 949,21 g/mol) se rozpustí v DCM (900 pl). K tomuf· roztoku se přidá 127 pi )3,0 ekv., 6,8 pmol) roztoku EOF (11,9 mg. 442,5 g/mol) v DCM (500 pl) a pak 45 pl (2.25 ekv. 5,1 pmol) roztoku diisopropyiethylaminu (20 pl, d~· 0,742129,25 g/mol) v DCM (1,0 ml). Nakonec se přidá DMF (40 pí) a reakční směs se pomalu odpaří při teplotě místnosti po; proudem dusíku během 12 hodin. Reakční směs se zředí acetonitri 1em (1 mi) filtruje přes skelnou vlnu a čistí HPLC s reverzní fází (Beckman Cl8, 1 cm x 25 cm, 5 ml/min, 50 až 90 % ACN/voda během 25 minut, 50 ^rtC) a získá se 7,4 mg (48% výtěžek) bíle pevné látky.

i 9

Příklad 22 (A) Tvarování struktury a syntéza FK1O12-hrbolatých sloučenin a FKBP12 s kompenzátorovými mutacemi

Substituenty na C9 a CIO FK506, které mohou být a byly zavedeny syntézou, se liší různými vedlejšími zbytky v FKBP12. Jedna třída mutantových receptorů pro takové ligandy by měla obsahovat odlišné modifikace, jednu vytvořením kompenzátorového otvoru pro CIO substituent a jednu pro C9 substituent. Uhlík 10 byl selektivně modifikován aby měl bud acetyl nebo N-formylskupinu vycházející z uhlíku (vs.hydroxy1ová skupina v FK506). Vazebné vlastnosti těchto derivátů jasně prokazují, že tyto CIO hrboly účinně ruší vazbu k nativnímu FKBP12. Obr.23 znázorňuje schéma pro syntézu FK506-typových skupin, obsahujících další C9 hrboly. Při sestavení takových ligandů s linkerovými skupinami podle vynálezu je možno konstruovat HED a HOD (a antagonisty) činidla pro chimerní proteiny, obsahující odpovídající vazebné domény, nesoucí kompenzátorové mutace. Ilustrativní

120

HED činidlo je znázorněno na obr. 23 a nese modifikace na C9 a CIO'.

Tento vynález také zahrnuje třídu sloučenin typu FK-506, obsahující skupinu typu FK-506, která obsahuje, na jednom nebo obou C9 a CIO, funkční skupinu, obsahující -OR, -R,-(CO)OR, -NH(CO)H nebo -NH(CO)R, kde R je substituovaný nebo nesubstituovaný, alkyl nebo arylalkyl, který může být přímý, rozvětvený nebo cyklický, zahrnující substituované nebo nesubstituované peroxidy a karbonáty. Skupiny typu FK506 zahrnují FK506, FK520 a jejich syntetické nebo přirozeně se vyskytující varianty, analogy a deriváty (zahrnující rapamycin), které zachovávají alespoň (substituovanou nebo nesubstituovanou( C12 až C15 část kruhové struktury FK506 a jsou schopny se vázat s přirozeným nebo modifikovaným FKBP, výhodně s Kd hodnotou asi 10~⁶M.

Tento vynález dále zahrnuje homo- a heterodimery a vyšší oligomery, obsahující jednu nebo více takových sloučenin typu FK506 kovalentně navázaných k linkerové skupině podle tohoto vynálezu. Monomery těchto sloučenin typu FK506 jsou také zajímavé ať nekovalentně připojené k linkerové skupině nebo jinak modifikované bez narušení jejich vazebné afinity pro odpovídající FKBP. Takové monomerní sloučeniny mohou být použity jako oligomerizační antagonistická činidla,tj. jako antagonisté pro o 1igomeri začni činidla na bázi podobných sloučenin typu FK506. Výhodně sloučeniny a oligomery, které je obsahují, se podle tohoto vynálezu vážou k přirozeným nebo výhodně mutantním, FKBP s afinitou alespoň 0,2 % a výhodně alespoň asi 1 % a ještě výhodněji alespoň asi 10 % ve srovnání s afinitou FK506 pro FKBP12. Viz např. Holt a spol., infra.

121

Receptorové domény pro tyto a jiné ligandy podle tohoto vynálezu mohou být získány metodami strukturních, místně řízených nebo náhodných mutagenezí. Sledovali jsme rodinu FKBO12 skupin, která obsahuje Val, Ala, Gly, Met nebo jiné malé aminokyseliny místo jedné nebo více Tyr26, Phe36, Asp37, Tyr82 a Phe99 jako receptorové domény pro ligandy typu FK506 a FK520, obsahující modifikace na C9 a/nebo CIO. Zejména jsme sledovali použití FPBR s malými náhradami jako Gly nebo Ala za Asp37 ve spojení s typem ligandu FK506 a FK-520, obsahujícím substituenty na CIO (např. -NHCOR, kde R je alkyl, výhodně nižší alkyl jako je například methyl; nebo -NHCHO) a FKBP s malými náhradami jako je Gly nebo Ala za Phe36, Phe99 a Tyr26 ve spojení s typem ligandu F506 a FK-520, obsahujícím náhrady na C9 (např. oxazoliny nebo iminy).

Místně řízená mutageneze může být provedena za použití protokolu megaprimerové mutageneze (viz např. Sakař a Sommer, BioTechniques 8 4 (1990): 404-407). cDNA sekvenování se provede sekvenásovým kitem. Exprese mutantu FKBP12 může být provedena v plasmidu pHNl⁺ protože mnohoFKBP12 mutantů bylo v tomto systému účinně exprimováno. Mutantové proteiny mohou být běžně čištěny frakcionací nad DE52 aniontovýměnnou pryskyřicí s následujícím dělením podle velikosti na Sepharose jak jinde popsáno. Viz např. Aldape a spol.,

J.Biol.Chem. 267 23 (1992): 16029-32 a Park a spol., J.BiolChem. 267 5 (1992): 3316-3324. Vazebné konstanty mohou být snadno stanoveny jednou nebo dvěma metodami. Jestliže si mutantní FKBP udržují dostatečnou rotamasovou aktivitu, může být použita standardní rotamasová zkouška. Viz např. Galat a spol., Biochemistry 31 (1992): 2427-2434. Jinak mutantní FKBP12 mohou být podrobeny vazebné zkoušce za použití LH20 pryskyřice a radioaktivně značeny ³H2-dihydroFK506 a

122 ³H2-dihydroCsA, které jsme dříve použili s FKBP a cyclofiliny Bierer a spol., Proč.Nat1.Acad.Sci. USA 87 4 (1993): 555-69.

(B) Výběr kompenzátorových mutací v FKBP12 pro hrbo1ové-FK506 za použití kvasinkového dvouhyhridního systému

Jednou z možností získat varianty receptorových proteinů nebo domén, zahrnujících FKBP12 je účinný kvasinkový dvouhybridní nebo interakce zachycující systém. Dvou hybridní systém byl použit pro detekci proteinů, které interagují vzájemně. Návnadový fuzní protein obsahuící cílový protein fúzovaný k transkripční aktivační doméně je ko-exprimován s cDNA knihovnou potenciálních háčků fúzovaných k DNA-vazebné doméně. Interakce protein-protein (návnada-háček) je detegována objevením se reportér genového produktu, jehož syntéza vyžaduje spojení DNA-vazebné a aktivační domény. Kvasinkový dvouhybridní systém zde zmíněný byl původně vyvinut Elledgem a spolupracovníky. Durfee a spol., Genes and Development 7 4 (1993):555-69 a Harper a spol., Cell 75 4 (1993):805-816.

Protože dvouhybridní systém per se nemůže poskytovat proniknutí do interakcí receptor-1igand, zahrnujících malé molekuly, organické ligandy, vyvinuli jsme nový,

FK1012-indukující transkripční aktivační systém (popsaný dále). Použitím takového systému je možno rozšířit dvouhybridní systém tak, že mohou být hodnoceny malé molekuly (např. FK506 nebo FK1012 nebo FK506-typy molekul podle tohoto vynálezu). Nejprve se generuje cDNA knihovna FKBP (háčky) s mutacemi, které jsou regionálně lokalizovány na místa obklopující C9 a CIO FK506. Pro návnadu mohou být zvoleny dvě rozdílné strategie. První používá schopnost FK06 se vázat k FKBP12 a tvořit kompozitní povrch, který se váže ke

123 calcineurinu. Sekvenčně- specifický transkripční aktivátor je takto složen z: DNA-vazebná doména-mutant

FKBP12---hrbol-FK506---kalcineurin A-aktivační doména (kde

--- označuje nekovlentní vazebnou interakci). Druhá strategie používá schopnost FK1012 se vázat ke dvěma FKBP současně. HED verze FK1012 může být použita pro prohledání následující sestavy: DNA-vazebná doména-mutant

FKBP12---hrbol-FK506-normální FK506---standardní

FKBP12-aktivační doména.

1. Kalcineurin~Gal4 aktivační doménová fuze jako návnada:

Byl zkonstruován derivát pSE1107, který obsahuje Gal4 aktivační doménu a kalcineurin A podjednotkový fuzní konstrukt Jeho schopnost působit jako návnada v navrženém způsobu byla ověřena studiemi využívajícími dvouhybridní systém pro mapování kalcineurinového FKBP-FK506 vazebného místa.

2. hFKBP12 aktivační doménová fuze jako návnada: hFKBP12 cDNA může být vyříznuta jako EcoRI-HindlII fragment, který pokrývá celý otevřený čtecí ráměček, tupě zakončený a ligovaný k tupě zakončenému Xho I místo pSE1107 pro generování celé délky hFKBP-Gal4 aktivační doménové proteinové fuze.

3. Mutantní hFKPB12 cDNA knihovny hFKBP12 může být štěpen s EcoRI a HindlII, ztupen a klonován do pASl (Durfee spol., supra), který byl štěpen s Ncol a zatupen. Tento plasmid je dále štěpen s Ndel pro odstranění Ndel fragmentu mezi Ndel místem polylinkerové sekvence pASl a 5' konce hFKBP12 a religován. Toto generuje hFKBP12-Gal4 DNA vazebnou doménovou proteinovou fúzi. hFKBP byl reamplifikován s primery #11206 a #11210, primerová tabulka:

124

5NdFK: 5'-GGAATTC CAT ATG GGC GTG CAG G-3'

Η M G V Q 11207 Smál

3SmFK37: 5'-CTGTC CCG GGA	NNN	NNN	NNN	TTT	CTT	TCC	ATC	TTC	AAG	C-3'
R S	X	X	X	K	K	G	D	E	L
11208 Smol
3SmFK2/: S’-CTCTC CCG GGA	GGA	ATC	AAA	TTT	CTT	TCC	ATC	TTC	AAG	CAT
R S	S	D	F	K	K	G	D	E	L	M
NNN NNN NNN GTG CAC CAC GCA GG-3'

X	X X	H	V	v c
11209	BamHI
3BmFK98: 5’-CGC	GGA TCC	TCA	TTC	CAG TTT	TAG AAG	CTC CAC ATC	NNN
		END	E	L K	L	L	Ε V D	X
NNN	NNN AGT	GGC	ATG	TGG-3'
X	X T	A	H	P
11210	BamHI
JtJmFK: 5’-CGC GGA TCC	TCA TTC	CAG TTT	TAG	AAG	C-3'
		END	E	L K	L	L

Primerová tabulka; Příměry použité v konstrukci regionálně lokalizované hFKBP12 cDNA knihovny pro použití ve screeningu pro kompenzátorové mutace.

Mutantní hFKBP12 cDNA fragmenty pak byly připraveny za použití primerů uvedených dále, které obsahují náhodně mutantní sekvence hFKBP v definovaných polohách polymerásovou řetězcovou reakcí a byly inzertovány do Gal4 DNA vazebná doména-hFKBP(Ndel/BamHI) konstruktu.

4. Kvasinkový kmen S.Cerevisiae Y153 nese dva selektující markerové geny (his3/p-galaktosidasa), které jsou integrovány do genomu a jsou neseny Gal4 promotory (Durfee, supra).

Použití kalcineurin-Gal4 aktivační domény jako návnady

FKBP12-FK506 komplex se váže s vysokou afinitou ke

125 kalcineurinu, typ 2B protein fosfatásy. Protože jsme použili C9- nebo ClO-hrbolaté ligandy proto, aby sloužily jako můstek ve dvouhybridním systému, pouze ty FKBP z cDNA knihovny, které obsahují kopenzátorové mutace generují transkripční aktivátor. Obvykle je možno připravit alespoň tři odlišné knihovny (za použití primerů 11207-11209, primerová tabulka), které obsahují každý 8000 mutantů FKBP. Náhodná místa byla zvolena prozkoumáním struktury FKBP12-FK506, které potvrzuje klastry zbytků, jejichž mutace umožňují vazbu chybných C9 nebo CIO substituentů na hrbolaté FK506. Knihovny pak byly individuálně screenovány za použití jak C9- tak

ClO-hrbolatých FK506. Interakce mezi hrbolatým FK506 a kompenzátorovým hFKBP12 mutantem mohou být detegovány schopností hostitelské kvasinky růst ve his potlačeném mediu a expresí β-galaktosidásového genu. Protože tato selekce je závislá na přítomnosti hrbolatého FK506, může být falešná pozitivita eliminována substraktivním screeningem s replika plotnami, které jsou doplněny nebo nejsou hrbolatými-FK506 linady.

Použití hFKBP12-Gal14 aktivační domény jako návnady Použití kalcineurin A-Gal4 aktivační domény pro screening hFKBP12 mutantních cDNA knihoven je jednoduchou cestou k identifikaci kompenzátorových mutací na FKBP12. Nicméně mutace, které umožňují hrbolatý-FK506 vázat k hFKBP12 mohou přerušit interakci mezi komplexem mutant

FKB12---hrbolatý-FK506 a kalcineurinem. Jestliže počáteční screening s kalcineurinem jako návnadou selže, může místo něj být použita standardní hFKBP12-G14 aktivační doména. FK1012 HED činidlo, obsahující: nativní FK506-hrbolatý-FK506 (obr.16) může být syntetizován a použit jako háček. FK506 skupina z FK1012 může vázat FKBP12-Gal4 aktivační doménu. Interakce mezi hrbolatou-FK506 skupinou z FK1012 a

126 kompenzátorovým mutantem FKBP12 umožní hostitelské kvasince růst na his potlačeném mediu a pro expresi β-galaktosidásy.Tímto způsobem je výběr založen pouze na schopnosti hFKBP12 mutanta k inerakci s hrbolatým-FK506.

Stejná substraktivní screeningová strategie může být použita pro odstranění falešně pozitivních výsledků.

Navíc k in vitro vazebné zkoušce právě diskutované může být použita in vivo zkouška ke stanovení vazebné afinity hrbolatých-FK506 ke kompenzátorovým hFKBP12 mutantům. Ve kvasinkovém dvouhybridním systému, β-gal aktivita se stanoví jako stupeň interakce mezi návnadou a dravcem. Takto, afinita mezi hrbolatým-FK506 a kompenzátorovými FKBP12 mutanty, může být hodnocena odpovídajícími β-galaktosidásovými aktivitami produkovanými hostitelskými kvasinkami při různých HED (nativní-FK506-hrbolatý-FK506) koncentracích.

Použitím stejné strategie mohou být vytvořeny další náhodně mutované FKBP12 cDNA knihovny v jiných hrbol-kontaktních zbytcích s nízkoafinitními kompenzátorovými FKBP12 mutanty jako templáty a mohou být jednoduše screenovány

Fágový display screening pro vysoce afinitní kompenzátorové FKBP mutace

Některé vysoce afinitní hFKBP12 mutanty pro hrbol-FK506 mohou obsahovat několik kombinovaných bodů mutace v diskrétních regionech proteinu. Velikost knihovny, která obsahuje vhodně kombinované mutace může být příliš velká pro kapacitu kvasinkového dvouhybridního systému (např. nad 10⁸ mutací). Použití bakteriofága jako vehikula pro vystavení celým funkčním proteinům by měla značně zvýšit schopnost i 2 Ί screeningu velkého počtu mutací. Vz. např. Bass a spol., Proteins: Structure, Function and Genetics 8 4 (1990):309-14; McCafferty a spol., Nátuře 348 6301(1990): 552-4 a

Hoogenboom, Nucl Acids Res 19,15 (1991): 4133. Jestliže vysoceafinitni kompenzátorové mutanty nejsou identifikovatelné kvasinkovým dvouhybridním systémem, může být vytvořen velký počet mutaci na hFKBP12 s fágovým vektorem jako nosičem. Mutantní hFKBP12 fuzní fágy mohou být screenovány s hrbolatou-FK506-Sepharosou jako matricí, která může být syntetizována analogicky k našim originálním afinitním matricím na bázi FK506. Fretz a spol.,

J.Am.Chem.Soc. 113 4 (1991): 1409-1411. Opakované běhy vazebné a fágové amplifikace by měly vést k identifikaci vysoceafinitních kompenzátorových mutantů.

(C) Syntéza hrbolatých(CsA)2): Modifikace MeVal(ll)CsA jak je detailně uvedeno výše, demonstrovali jsme proveditelnost použití cyklofilinu jako dimerizační domény a (CsA)2 jako HOD činidla v kontextu buněčnou smrt signálizující dráhy. Nicméně pro další optimalizaci buněčné aktivity (CsA)2 činidla je možno se spoléhat na podobné strategie jak jsou popsány u FJ1012. Takto modifikovaná(hrbolatá) o 1igomerizující činidla na bázi CsA by měla být preferována v aplikacích, kde je zvláště žádoucí, aby činidlo bylo schopno rozlišovat svůj cíl, umělé proteinové konstrukty od endogenních cyklofilinů.

Jednou třídou modifikovaných CsA derivátů podle vynálezu jsou CsA analogy, ve kterých (a) NMeValll je nahrazen NMePhe (který může být substituován nebo nesuhstituován) nebo NMeThr (který může být substituován nebo nesubstituován na threoninové betahydroxylové skupině) nebo (b) pro-S methylová

128 skupina NMeValíl je nahrazena objemnou skupinou s alespoň 2 atomy uhlíku, výhodně třemi nebo více, která může být přímá, rozvětvená a/nebo obsahuje cyklickou skupinu a může být alkyl(ethyl,propyl, butyl, včetně terc.butylu a tak dále), aryl nebo arylalkyl. Tyto sloučeniny zahrnují ty CsA analogy, které obsahují NMeLeu, NMelle, NMePhe nebo specificky nepřirozený NMe[betaMePhe] místo MeValll. (b) CsA sloučeniny mají vzorec 2, kde R představuje funkční skupinu jak je popsána výše.

(R=Me):CsA (R není Me): modifikovaný [MeVal^!1]CsA

9

Tento vynález dále zahrnuje homo-a hetero-dimery a vyšší oligomery, obsahující jeden nebo více takových CsA analogů. Výhodně se sloučeniny a oligomery, obsahující tyto v souladu s předloženým vynálezem, vážou k přírodním nebo výhodně mutantním, cyklofi 1inovým proteinům s afinitou alespoň 0,1 % a výhodně alespoň asi 1 % a ještě výhodněji alespoň asi 10 % vzhledem k hodnotě afinity CsA pro cyklofilin.

Dvoustupňová strategie může být použita pro přípravu modifikovaných [MeVal^1!]CsA derivátů, při které se vychází z CsA. V prvním stupni se odstraní zbytek MeValll z makrocyklu. Ve druhém stupni se zavede vybraná aminokyselina na (dřívější) MeVal¹¹ místo a lineární peptid je cyklizován. Výhoda této strategie je snadný přístup k některým modifikovaným [MeVaPijCsA derivátům ve srovnání s celkovou syntézou. Schéma syntéza je následující:

i 30

1. (BOC)₂O, dmap,

CH2CI2____

2. 3 (R- ^fBu), PyBrop DIEA

1. TFA, CH₂CI₂

2. BOP, DMAP, ch₂ci₂

Me

131

Pro rozlišení amidových vazeb byl dosažen N,0 posun mezi amino a hydroxy1ovými skupinami od MeBmt1 za vzniku IsocsA (Ruegger a spol., Helv.Chim.Acta 59 4 (1976): 1075-92 (viz schéma výše). Reakce byla provedena v THF za přítomnosti methansulfonové kyseliny. (Oliyai a spol., Pharm.Res. 9 5 (1992): 617-622). Volná aminokyselina byla chráněna acetylovou skupinou s pyridinem a acetanhydridem v postupu v jedné nádobě. Celkový výtěžek N-acetyl chráněného IsoCsA je 90 %. Ester MeBmt1-MeVal11 vazba se pak redukuje selektivně za přítomnosti N-methylamidových vazeb, např. použitím DIBAL-H. Výsledný diol se pak transformuje na odpovídající diester jinou kyselinou vyvolaným N,0 posunem. Takto se připraví jak N-acetylová skupina tak MeValll zbytky pro odstranění hydrolýzou nově vytvořených esterů s vodnou bází.

Po chránění volné aminoskupiny se nový aminokyselinový zbytek zavede např. PyBrop kondenzačním činidlem. Odchránění a cyklizace lineárního peptidu s BOP za přítomnosti DMAP (Alberg a Schreiber, Science 262 5131 (1993):248-250) dokončuje syntézu 2. vazba hrbolatých CsA k cyklofilinu může být hodnocena stejnými metodami jak byly popsány pro FK506 a FKÍ012. Jakmile jsou cyklofiliny identifikovány s kompenzátorovými mutacemi,, mohou být syntetizovány hrbolatá (CsA)2 HED a HOD činidla metodami popsanými dříve. Zvláště zajímavé jsou hrbolaté CsA sloučeniny, které mohou tvořit dimery, které se samy mohou vázat k cyklofi 1inovému proteinu se stechiometrií 1:2. Homodimery a vyšší homoligomery, heterodimery a heterovyšší oligomery, obsahující alespoň jednu takovou CsA nebo modifikovanou CsA skupinu mohou být tvarovány a hodnoceny metodami vyvinutými pro FK1012A a (CsA)2 a optimalizovat linkerový element analogicky k FK1012 studi ím.

132

Mohou nyní být připtaveny mutantní cyklofiliny, které vážou naši polohu 11 CsA variant (2) nahromaděním extraobjemu na Iigandu. Cyklofiliny s těmito kompenzátorovými mutacemi mohou být identifikovány screeningovými protokoly na struktuře založených místně řízených a náhodných mutagenesí popsaných v FK1012 studiích.

Z výše uvedených výsledků je zřejmé, že předložená metoda a kompozice poskytnuté pro velkou přizpůsobivost v produkci buněk pro široký rozsah účelů. Při použití předložených konstruktů je možno použít buňky pro terapeutické účely, kde buňky mohou zůstávat neaktivní pokud je potřeba a pak být aktivovány podáním bezpečného léčiva. Protože buňky mohou mít široký rozsah životnosti v hostiteli,je zde příležitost k léčbě jak chronických tak akutních indikací tak, že se dosáhne krátkodobé nebo dlouhodobé ochrany. Navíc je možno poskytnout buňky, které budou řízeny k jednotlivému místu jako je anatomické místo nebo funkční místo.

Mohou být poskytnuty buňky, které povedou k sekreci velmi rozsáhlého množství proteinů, kterémohou sloužit po opravu deficitu nebo inhibici nežádoucího výsledku, jako je aktivace cytolytických buněk, pro inaktivaci destruktivního činidla, pro usmrcení omezené buněčné populace nebo podobně. Jsou-li buňky přítomny v hostiteli během definovaného časového období, mohou být buňky snadno aktivovány přijetím léčiva v dávce, která může vést k rychlé odezvě buněk v hostiteli. Mohou být poskytnuty buňky, kde je exprimovaný chimérní receptor intracelulární, s vyloučením jakékoliv imunitní odezvy k cizímu proteinu na buněčném povrchu. Dále intracelulární chimérní receptorový protein poskytuje účinnou signální transdukci při ligandové vazbě, zjevně účinnější než

133 je receptorová vazba na extracelulární receptorovou doménu.

Při použití relativně jednoduchých molekul, které se vážou k chimérním membránovým vazebným receptorům,do jde k expresi zájmových produktů nebo inhibici exprese produktů a lze tak dosáhnout celulárního terapeutického ošetření.

Sloučeniny, které mohou být podávány jsou bezpečné, mohou být podávány mnoha způsoby a mohou dosáhnout velmi specifické odezvy, takže nedochází k homeostasis.

Všechny publikace a patentové přihlášky citované v tomto popise jsou zde zahrnuty jako odkazy, vždy pro každou jednotlivou publikaci nebo patentovou přihlášku bylo specificky aa jednotlivě uvedeno, že je zde zahrnuta jako odkaz.

I když byl předložený vynález popsán podrobně pro ilustraci a příklady pro usnadnění pochopení, bude zřejmé pro odborníky v oboru na základě tohoto vynálezu, že mohou být provedeny určité změny a modifikace, aniž by došlo k narušení ducha a rozsahu připojených nároků.

Claims (2)

1. ZPATENTOVÉ

   — D ř=' < 1— 71 > CJ> W s G __ -¹ < ώ Ξ £ > o <= σ -1 < 2 ΓΤ» λ Ž

   IK3 ςπ<

   t£>

   OD ο

   ο

   C/5<

   ο <ο

   I 05 cn cn 05

   NÁROKY

   1. DNA konstrukt, kódující chimérní protein, obsahující (a) alespoň jednu receptorovou doménu, schopnou se vázat k vybranému ligandu, a (b) heterologní proteinovou doménu schopnou iniciace apoptosis v buňce, obsahující uvedený chimérní protein po vystaveni buňky ligandu, kde uvedený ligand je schopen vazby ke dvěma nebo více chimérním proteinovým molekulám.

   2. DNA konstrukt podle nároku 1, kde chimérní protein dále obsahuje intracelulární cílovou doménu schopnou řízení chimérního proteinu k požadovaném buněčném prostoru.

   3. DNA konstrukt podle nároku 2, kde intracelulární cílová doména obsahuje sekreční leader sekvenci, membránovou překlenovací doménu, membránovou vazebnou doménu nebo sekvenci, řídící protein ke spojení s vesiklem nebo s jádrem.

   4. DNA konstrukt podle nároku 1, kde chimérní protein má Ka hodnotu pro vazbu k vybranému ligandu menší nebo rovnou asi IO-θ m.

   5. DNA konstrukt podle nároku 1, kde vybraný ligand má molekulovou hmotnost menší než asi 5 kDa.

   6. DNA konstrukt podle nároku 1, kde heterologní proteinová doména obsahuje cytoplasmickou doménu lidského Fas nebo lidského TNFa receptorů.

   7. DNA konstrukt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde chimérní protein je schopen vazby k ligandu typu FK506, ligandu typu cyklosporinu A, tetracyklinovému nebo steroidnímu ligandu.

   8. DNA vektor, obsahující DNA konstrukt podle kteréhokoliv znároků 1 až 7 a selektující markér, umožňující transfekci DNA konstruktu do hostitelských buněk a výběr transfektantů obsahujících konstrukt.

   9. DNA vektor podle nároku 8, kde vektorem je virální vektor.

   10. Virální vektor podle nároku 9, kterým je adeno-, adeno spojený- nebo retrovirální vektor.

   11. Chimérní protein, kódovaný DNA konstruktem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.

   12. Buňka, obsahující a schopná exprese alespoň jednoho DNA konstruktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.

   13. Buňka podle nároku 12, která se stala apoptotickou a umírí po kontaktu s vybraným ligandem.

   14. Buňka podle nároku 12, kterou je savčí buňka.

   15. Buňka podle nároku 13, která dále obsahuje (a) DNA konstrukt, kódující chimérní protein, obsahující (i) alespoň jednu receptorovou doménu schopnou vazby ke druhému vybranému ligandu a (i) další proteinovou

   136 doménu, heterologní vzhledem k receptorové doméně, ale sschopnou, při oligomerizaci s jednou nebo více jinými podobnými doménami, spuštění aktivace transkripce cílového genu pod transkripční kontrolou transkripčního kontrolního prvku citlivého k uvedené oligomerizací a (b) cílový gen pod expresní kontrolou transkripčního kontrolního prvku citlivého k uvedené oligomerizací a která je schopna exprese cílového genu po vystavení buňky druhému vybranému ligandu.

   16. Buňka podle nároku 13, která obsahuje serie DNA konstruktů, kódujících (a) první další chimérní protein, obsahující DNA vazebnou doménu a alespoň jednu receptorovou doménu schopnou vazby k první vybrané ligandové skupině a (b) druhý další]/ chimérní protein, obsahující transkripční aktivační doménu a alespoň jednu receptorovou doménu schopnou vazby k druhému vybranému ligandu (který může být stejný nebo rozdílný od první vybrané ligandové skupiny) a druhý DNA konstrukt, kódující cílový gen pod transkripční kontrolou heterologní transkripční kontrolní sekvence, , která se váže s DNA-vazebnou doménou a je citlivá k transkripční aktivační doméně, kde tato buňka exprimuje cílový gen po vystavení substanci, obsahující vybrané ligandové skupiny(u).

   17. Použití, pro přípravu farmaceutického přípravku pro odstranění populace geneticky zpracovaných buněk podle nároku

   13, ligandu schopného iniciace apoptosis v uvedených buňkách kde uvedený 1igand má vzorec

   1inker—[rbmi,rbm2...rbmn] kde n je celé čislo od 2 do asi 5, rbm<i)-rbm(n) jsou receptorové vazebné skupiny, které mohou být stejné nebo rozdílné a které jsou schopny vázat se k chimérnímu proteinu(ům), kde uvedené rbm skupiny jsou kovalentně připojeny k linkerové skupině, kterou je bi- nebo multifunkční molekula schopná být navázána kovalentně (-) ke dvěma nebo více rbm skupinám.

   18. Použití podle nároku 17 ligandu pro přípravu farmaceutického přípravkupro odstranění populace geneticky zpracovaných buněk,kde 1igand má molekulovou hmotnost menší než asi 5 kDa.

   19. Použití podle nároku 17, ligandu pro přípravu farmaceutického přípravku pro odstranění populace geneticky zpracovaných buněk, kde 1igand obsahuje skupiny typu FK506, skupiny typu cyklosporinu, steroidu nebo tetracyklinu.

   20. Použití podle nároku 17, ligandu pro přípravu farmaceutického přípravku pro odstranění populace geneticky zpracovaných buněk, kde se 1igand váže k přirozeně se vyskytujícímu receptorů s Kd hodnotou větší než asi 10^_5M.

   21. Použití podle nároku 17, ligandu pro přípravu farmaceutického přípravku pro odstranění populace geneticky zpracovaných buněk, kde ligand obsahuje molekulu FK506,

   FK520, rapamycinu nebo jeho derivátu, modifikovanou na C9,

   CIO nebo na obou těchto uhlících.

   138

   22. Použití podle nároku 20, ligandu pro přípravu farmaceutického přípravku pro odstranění populace geneticky zpracovaných buněk, kde ligand obsahuje C2-C20alky1enovou, C4-C18azalkylenovou, C6-C24 N-alkylenazalkylenovou, C6-C18arylenovou, C8-C24ardialkylenovou nebo C8-C36 bi s-karboxamidoalkylenovou skupinu.

   23. Způsob odstranění populace geneticky zpracovaných buněk podle nároku 13, vyznačující se tím, že zahrnuje vystavení buněk ligandu schopnému se vázat k chimérnímu proteinu v množství účinném pro iniciaci buněčné smrti.

   24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že buňky rostou v kultivačním mediu a vystavení se provede přidáním ligandu ke kultivačnímu mediu.

   25. Způsob produkce buněk, které mohou být selektivně usmrcovány, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení DNA konstruktu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 do hostitelské buňky.

   26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že dále zahrnuje výběr těch buněk, které obsahují zavedený DNA konstrukt.

   27. Kit, obsahující alespoň jeden DNA konstrukt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.

   28. Kit podle nároku 30, který dále obsahuje ligand, ke kterému se váže jeden nebo více chimérních proteinů kódovaných DNA konstruktem(y).

   íjy

   29. Kit podle nároku 28, který dále obsahuje monomerní ligandové činidlo jako antagonistu pro vazbu 1igand-chimérní protein.

   amp/pbp) obr. 4IM

   Konstrukce intracelulární signální chiméry ..PCR myristoylovaný CD3^

   A Myristoylační sekvence z c-Src Xhol P#8908

   SacII

   SacII/Xhol

   SalI/EcoRI

   003ζ y

   myristoy1ační sekvence ^H ligace SacII EcoRI

   2.Rez a klon PCR fragment *MZE serie obsahuje 9aa HA epitop na 3' konci pBJ5 (Xhol)(SaII)

   SalI/EcoRI

   Xhol Sall v

   SacII/Xhol

   CD3C

   p#MZ

   FKBP!2

   Obr.2/21 plasmid #MFnZ

   -γ &

   Konstrukce extracelulární signální chiméry:

   l.PCR myší signální peptid

   2. PCR CD3 trans-membrána a cytoplasmické domény \\ P#6049

   Sacll Xhol

   SP/IE

   EcoRI pBluescript

   Sacll Xhol EcoRI plasmid #SPZ/KS Sekvence inzert*

   Cut Xhol v

   Obr.3A/21

   3. PCRFKBP12

   P#6052

   FKBP 12

   P#6053

   Xhol

   Sail

   Xhol

   Sall

   Xhol

   FKBP12 pBluescript

   Sall

   Xhol

   Sall

   FK8P12

   Cut Xhol/Sall

   ---FKBP12

   Sacll Xhol

   Xhol plasmid #FK12/KS Sekvence*

   EcoRI pBluescript

   SP

   CD3C p#SPZ (XholjCIP)

   Sacll Xhol (Sall/Xhol)

   SP

   FKBP pBluescript pBluescript

   EcoRI

   CD3

   -ζP#1FK1/KS liguj FKBP12 izoluj Z/FKBP dimer opakuj XholjCIP izoluj Z/DKBP trimer (S)(X) (S)(X) (S)(X) izoluj SacII-EcoRI fragment klonuj do

   Sacll Xhol

   polylinkeru expr.vektoru, (na bázi pCDL5-SR α • SP FKBP12 FKBP12 FKBP12 | f Οϋ3ζ

   MCB:8,466-472) plasmid #1FK3/KS

   EcoRI

   0br.3B/21

   6048

   IE_ak-SP

   6049 homologie

   Sacll

   6048: 5 ’-CGACA CCGCGG CCACC ATG GCC AC A ATT GG A GC - 3'

   Kozák M A T I G homologie

   Xhol

   6049:

   5 '-CGACACTCGAG AGCCCATGACTTCTGG

   L A W S

   Tac

   6050 ε03ζ

   Asp-Gyl#1

   Xhol

   6051 homologie

   6050:

   5' CG ACA CTCG AG CTC TGC TAC TTG CTA GGT GGA ATC CTC TTC - 3' ELCYLLGGI L F

   6051 *AtoG homologie ^EcoRI | Γ|

   5' GCGAATTCTTAGCGAGGGGCCAGC-3'

   St R P A L *G to C

   3'Sal #B

   8462: 5' homo1ogi e

   EcoRI Sall | ~ |

   GC GAATTCTTA GTCG AC GCG AGG GGC CAG GGT C - 3'

   St R PAL

   Cys-Gly #2 7129: 5' homologie

   I Xhol * I

   GGG CTČGAG CTC GGC TAC TTG CTA G - 3'

   L G Y L L *T toG

   Obr.4A/21

   CYCC

   6568:

   6569 homologie Xhol |-—-1

   5 '-CG ACA CTCG AG GTG ACG GAC AAG GTC - 3' homologie Sall ,-,

   5 '-CGACA GTCGAC CCA ATC AGG GAC CTC - 3'

   EPITOPE

   78.50: 5 '-TCGAG TAT CCGTACGAC GTA CCA GACTAC GCA G - 3'

   Xhol

   BsiWI

   YPYD VPDYA

   Sall

   7851:

   5 '-TCGACTGC GTA GTCTGG TAC GTC GTA CGG ATA C - 3'

   EPITOPE: 5SEP, 3XEP

   Sall

   8922: 5'-TCGACTAT CCG TAC GAC GTA CCA GAC TAC GCA C - 3'

   Xhol

   8923: 5 '-TCGAG TGC GTA GTCTGG TAC GTC GTA CGG ATA G - 3'

   Myristoylace z c-src 5SMXZ '

   SacII | '

   8908: 5 '-CGACACCGCGGCCACCATGGGGAGTAGCAAGAGCAAGCCT

   KOZÁK MGSSKSKP , c-| homologie

   -1 Xhol |-.-₍

   AAG GAC CCC AGC CAG CGC CTCG AG AGG AGT GCA GAG ACT G - 3'

   KD PSQRL ERS A ET

   5XTZ

   Tac | B CĎ3Č homolog

   8912:

   Xhol | |

   5 '-CGACA CTCG AG GAG CTCTGT GAC GAT G - 3' E L C D D

   Obr.4B/21 homologie

   Asp-Lys #4 Xhol | “ j

   8061: 5 ’-CGACA CTCGAG CTCTGCTACTTG CTA AAG GGA ATC CTCTTC - 3'

   ELCYLLKGILF *GATtoAAG homologie #4 prodloužení Xhol j j

   8907: 5 '-CG AC A CTCGAG CTG CTG GAT CCG AAG CTCTGCTACTTG CTA AAG - 3'

   EL LDP KLCYLLK

   TAC-Tm #3

   7220:

   homologie

   Xhol |-1

   5 '-CG ACA CTCGAG AC A ACA G AG T AC C AG GT A GC - 3'

   Ε Τ Τ Ε Y Q V j” imunofilin

   V

   FKBP12 homologie

   Xhol

   6052: 5 '-CG AC A CTCGAG GGC GTG CAG GTG GAG AC - 3 ’

   E G V Q V Ě homologie

   SaH 1----i

   6053: 5 ’-CGACA GTCG AC TTC CAG TTTT AG AAG C - 3'

   V E L K L L

   FKBP13

   8460:

   8461:

   homo1ogi e

   Xhol |-1

   5 '-TCG AC A CTCGAG ACG GGG GCC GAG GGC - 3'

   Ε T G A E G homologie

   Sall |— -1

   5'-CCGACA GTCGACCTCTATTTT GAG CAGC - 3'

   V Ε I

   Obr.4C/21

   Indukce různých transkripčních faktorů zesítěním TAC/CD3 zeta alkalická fosfatasa (% P +1 indukce)

   Obr.5/21 /W4 maximální mitogenní aktivace

   Inhibiční aktivita dimerního FK506 a CSA

   Obr.6/21

   M -ty

   Sacll Xhol (S/X) (S/X) (S/X) _ I I_1 I =EEsMsIilSSiSlSšEÍ

   MZF3E

   Sall (X/S) EooR!

   Cut Xhol/Sall; CIP; + FKBP12 X 3

   Sacll Xhol (S/X) (S/X)

   I jWMwmiuwwmwB ..............mu ³ M|lFK8P12 14FKBP12 HFKBP12

   MF3E

   Sall (X/5) EcoRI

   V

   Sacll Xhol

   4a

   Xhol (S/X) (S/X) Sall (X/S) EcoRI

   FKBP12 1 FKBP12 J

   1 FKBP12

   Xhol

   Sall

   1 gen

   Sacll Xhol (S/X) (S/X)

   1.cytoplasmická skupina povrch.receptoru

   Z 2.tyrosin kinasa

   3. transkripční faktor

   4. j iné (S/X) Sall (X/S) EcoRI =ab

   2sŽl gen.

   ·*'·»Λ *'ΛΙΑ·.4ΜΛ_<ζ<;.Γ.Γ^Λ.^·.·νΛ'Λ·

   HZ

   Obr.6B/21 aktivita FK1012 na chimerním FKBPX3/CD3 zeta receptorů aktivita alkalické fosfatasy (*Λ P ♦ I Indu4t&*)

   Obr.7/21

   Aktivace NFAT reportéru signalizací přes myristoyllovanou CD3 zeta/FKBP12 chiméru aktivace vzhledem [FK1012B] ng/ml

   Obr.8/21

   OMe ^MeO(

   OMe MeO

   Obr. 9A J#2)/21 ζι ZI £>=< g>=<

   Obr.9B

   Obr. 9g í (#2)/21

   Me

   FK.1040B

   Me

   Obr..10/21

   Schéma 2: Syntéza dimerů

   Lit ref: N.H. Sigal & F.J. Dumont, Ann. Rev. Immunol. p519 1992
2. 2)kys.mravenčí/ acetanhydrid nebo acetanhydrid

   Lit refs: D.K. Donald et.al. Tetrahedron Letters p 1375, 1991, P.Kocovsky, Tetrahedron Letters p5521, 1992

   Obr.11A/21 //-//

   ΟΜθ fíf ~~<?£ <

   CN >O ,O

   G <

   σχ σ\

   P.

   o £>

   o

   G <

   Ό cc

   Pm

   Další modifikovaný FK520 (FK1040), který interferuje s FKBP12

   G

   Λ

   M->

   G

   S

   CN

   O

   Obr. ub

   Pm pa w

   Pm <D

   4-» co <i> n o <0 cO > c •M <d >n a •G o S >φ Λ 4M o ><n ·>Μ G) ·!-» •ϊ—S <U *T—S '>>

   G O <D ,Q M-> <D Λ4 G

   Φ

   Schéma 3

   FKBP mutant #1 mutace je kompenzátorové s hrbolem#!

   FKBP mutant #2 mutace je kompenzátorová s hrbolem#2

   Obr.12/21 (fy Schéma 3: Syntéza heterodimerů

   Obr. 13/21

   Λ

   1 3 ο 1 Ο •ή «) ·· Ό 3 ν X 3 4-^ ·ι-4 3 Ο 3 γΜ 3 3 λ ε α, a ε tu •τ-4 Ο XJ -3 Ό 24 3 3 3 3 >3 —< Μ > > • · ·τΗ Ο Ο

   )- - >3 .Ο

   Ν ¢0 3 > 3 •W

   .. <ΰ 'W 3 X 3 3 3 3 3 '3 3 τ*Ή > > 3 3 Λ Ο Ο 23 •Ή ε 24 3 3 ο •τΗ Ο 3 ,—4 24 «Η --J--Í 3 3 ·γ“4 24 '3 24 »“Μ Ό 3 ε • · Ο <Μ ο 3 Ό 24

   Obr. 14/21

   V

   A—Α ww

   3 Ό h CS ο (ί Ολ S ΜΗ Q •ιΗ ·ι-| PC Ο

   Χ3 S-ZHg

   Η | 'fH ·ιΗ

   0 3 3 3 3 ·Ή Ν Ί-> 3 —¹ 3 Ο g -τ-Ι <4—4 Η •r^ «Η CL,

   obr.15/21 '«.•Χ

   A FK1012s

   FK506Í monomer

   S>> <Λ >

   Obr.17/21

   CDNA konstrukt

   N-konec 'Src (14 aa) cytopí asmi cký ^> tail of ζ

   MZF3E

   Exprimovaný protein extracelulární prostor nmmmimtftftmo _cytoplasma

   MZF3E

   1> 2 nebo 3 > FKBP12 domény (FKBP12)n n= 1,2,3

   Obr. 18A/21'

   Obr.18B/21

   LU £

   LU

   Obr. 19/21 á;tab^ dV3S %

   LU LU LU LU LU LU LU LU LU LU T~ CM CO LU LU LU LU CO o δ £ a £ O U. Τ- Ο s CO O δ 2 2 2 2 2 2 2 2 2

   o o

   vo

   CM o

   o o

   CM

   O o

   vo o

   o o

   o o

   vo o

   c

   CM <

   «

   O irn/Su OS =/VWd/ nosE^-ejoj no^on^HI¹³ nouvAopjps ^uszjj njo;ouiojd jjy ν;τΛτ;Χ® iuat;bj3j o

   o o

   cn

   Obr.20 A/ 21

   Jurkat _rei_ativní LD50J buňky proteinová

   CD w

   o

   ÍH

   CX

   X

   0)

   iiii + + + 1 -+· + + + Σ < Z < Z < Z < z c o o c o o c o o < z Z) o LO co C\J co Λ

   + +

   + +

   □ o

   co

   Λ

   Obr.20B/21

   FK506

   1 PhCHjNj 2HF.CHjCN

   FK506

   1TBSOT1

   2NaBH,

   10ISAL-H

   1 PhjfiifOAcjj 2HF. CHjCN

   FK506

   Obr.21/21