HUT73100A - Regulated apoptosis - Google Patents

Description

előnyösen nem peptid típusú szerves molekulával történő oligomerizálásához való anyagok, eljárások és alkalmazások.

A találmány egyes vonatkozásainak megfelelően gazdasejtek rekombináns módosításait, valamint ezek génterápiában és az indukálható génexpresszió egyéb alkalmazási területein való felhasználását írjuk le.

A biológiai specifitás rendszerint a proteinek közötti nagymértékben specifikus kölcsönhatásokból származik. Erre példa a jelátalakítás (jel-transzdukció), az a folyamat, amellyel az extracelluláris molekulák intracelluláris eseményeket befolyásolnak. Sok reakcióút az extracelluláris ligandumok sejtfelületi receptorokhoz való kötődésével kezdődik. Sok esetben a receptor dimerizációja a proteinek transzfoszforilációját és toborzását eredményezi, melyekkel tovább folytatódik a jelzőkaszkád. Az a felismerés, hogy a membrán-receptorok homodimerizációval aktiválhatok, abból a megfigyelésből ered, hogy a receptorok két receptort kereszt-kötő antitestekkel aktiválhatok. Ezek után sok, ilyen tulajdonsággal rendelkező receptor vált ismertté. Sok receptor extracelluláris és transzmembrán régiójáról úgy vélik, hogy a receptorok citoplazmikus doménjeit ligandum-dependens dimerizációval vagy oligomerizációval egymás közelébe hozzák, míg a receptor citoplazmikus doménjei a sejt belső kompartmentjeibe specifikus jeleket szállítanak.

83098-6442-GI

Más kutatók különböző rendszerekben ligandum-receptor kölcsönhatásokat · vizsgáltak. Például, Clark és mtsi. (Science, 258. 123, 1992) a B-sejt antigén-receptor komplex citoplazmikus effektorait írják le. Durand és mtsi. (Mól. Cell. Bioi., 3, 1715, 1988), Verweij és mtsi. (J. Bioi. Chem., 265. 15788, 1990) és Shaw és mtsi. (Science, 241, 202, 1988) beszámolnak arról, hogy az NF-AT-irányította transzkripció szigorúan az antigén-receptor szabályozása alatt áll. Emmel és mtsi. (Science, 246. 1617, 1989) és Flanagan és mtsi. (Natúré, 352. 803, 1991) az NF-AT-irányította transzkripció ciclosporin A-val és FK506-tal való gátlásáról számolnak be.' Durand és mtsi. (Mól. Cell. Bioi., 2, 1715, 1988) és Mattila és mtsi. (EMBO J., 2, 4425,

1990) leírják az NF-AT kötőhelyeket. A zéta-láncot Orloff és mtsi. (Natúré, 347. 189-191, 1990), Kínét és mtsi. (Cell, 57, 351-354, 1989), Weissman és mtsi. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 9709-9713, 1988) és Lanier (Natúré, 342, 803-805, 1989) írták le. Byrn és mtsi. (Natúré, 344. 667-670, 1990) CD4 immunadhezint, Irving és mtsi. (Cell, 64. 891, 1992) pedig CD8-zéta fúzionált proteint írnak le. (Lásd még Letourner és Klausner, Science, 255. 79, 1992.)

A transzkripciós faktor promoter régiókkal való kapcsolódását és a transzkripciós faktorok külön aktiválását és DNS-kötődését többek között Keegan és mtsi. (Natúré, 231. 699, 1986), Fields és Song (Natúré, 340. 245, 1989), Jones (Cell, 61. 9, 1990), Lewin (Cell, fii, 1161, 1990), Ptashne és Gann (Natúré, 346. 329, 1990), Adams és Workman (Cell,

72, 306, 1993) írták le.

A vezikula-irányítást (targeting) és -fúziót Sollner és mtsi. (Natúré, 362. 318-324, 1993) és Bennett és Scheller (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2Ű, 2559-2563, 1993) írták le.

A szabályozott protein-lebomlást Hochstrasser és mtsi. (Cell, ül, 697, 1990), Scheffner, M. és mtsi. (Cell, 25, 495, 1993) és Rogers és mtsi. (Science, 23A, 364-368, 1986) írták le.

Az FK506-ra és rokon vegyületekre vonatkozó szintetikus technikákat és módosításokat illetően további információkat leíró publikációk közé tartoznak az alábbi szabadalmi bejelentések és szabadalmi leírások: GB 2 244 991 A;

EP 0 455 427 Al; WO 91/17754; EP 0 465 426 A1; US 5,023,263 és WO 92/00278.

A Fás antigént, p55 TNF receptort (a továbbiakban TNF receptor) és/vagy apoptózist Itoh és mtsi. (Cell, üfi, 233-243, 1991), Nagata és mtsi. (510 691 számú európai szabadalmi bejelentés); Suda és mtsi. (Cell, 75(6), 1169-1178, 1993); Oehm és mtsi. (J. Biological Chem, 267(15). 10709-10715, 1992); és Wong és Goeddel (J. Immunoi., 152(4). 175101755, 1994) írták le.

A génterápiában alkalmazható anyagok és eljárások leírását ld.: Watson, Gilman, Witkowski és Zoller, RECOMBINANT DNA,

2. kiadás, 28. fejezet (WH Freeman & Co, 1992), és a bibliográfiájában, különösen az 564-565. oldalon felsorolt hivatkozások.

Amint leírásunkból látható lesz, a felsorolt szerzők egyike sem érintette találmányunk tárgyát. Találmányunk tárgya általánosan alkalmazható eljárás és anyagok élő sejtekben a proteinek homodimerizációjának, hetero-dimerizációjának és oligomerizációjának felhasználásához. (Ahogy itt használjuk, az oligomer, oligomerizál és oligomerizálás kifejezések dimerekre, trimerekre és magasabbrendű oligomerekre, illetve ezek kialakítására vonatkozik.) A kiméra reagáló proteinek specifikus receptor doménnel intracellulárisan fúziós proteinekként expresszálódnak. A sejtek sejt-permeábilis, többértékű ligandum reagenssel (amely a receptor doménhoz kötődik) végzett kezelése a kiméra dimerizációját vagy oligomerizációját eredményezi. Egyéb kiméra receptorokhoz hasonlóan (ld. pl. Weiss, Cell, 73. 209, 1993) a kiméra proteineket úgy alakítjuk ki, hogy az oligomerizáció sejtpusztulást, és bizonyos megvalósítási módokban egyéb későbbi eseményeket váltson ki, pl. az intracelluláris jel további protein-protein kölcsönhatások útján történő terjedését, és ezáltal a transzkripciós faktorok specifikus alegységének aktiválását. A transzkripció beindítása riporter gén vizsgálattal mutatható ki. A kiméra proteinek intracelluláris keresztkötés-képzése a különböző celluláris folyamatok alapvető vizsgálatát, a génsebészetileg kezelt sejtek esetében a sejtpusztulás szabályozható módon történő beindítását, és gyógyászati vagy mezőgazdasági

jelentőségű	proteinek szintézisének szabályozását teszi
lehetővé. A	ligandum-közvetítette oligomerizáció továbbá
szabályozott	génterápiát tesz lehetővé, ilyen értelemben új

módját biztosítja a génterápia biztonságossága, expressziós szintje és általános hatékonysága fokozásának.

A találmány tárgya anyagok és eljárások gazdasejtek génsebészeti úton történő átalakítására, miáltal a sejtek és utódaik szabályozott módon fogékonnyá válnak a programozott sejtpusztulásra (apoptózisra). A találmány szerinti anyagok és eljárások alkalmasak a génsebészeti úton kezelt sejtek populációjának eliminálására, függetlenül attól, hogy azok tenyészetben vagy in vivő növekednek-e, és ilyenformán, többek között, biztonságos mechanizmust biztosítanak a génsebészetileg módosított sejtek génterápiában való alkalmazására.

A találmány tárgya új kiméra (vagy fuzionált) proteinek, az azokat kódoló DNS-konstrukciók, valamint a kiméra proteineket oligomerizálni képes kis szerves molekulák.

Amint az alábbiakban részletesebben leírjuk, a kiméra proteinek legalább egy ligandum-kötő (vagy receptor) domént tartalmaznak, amely egy másik, egy sejtben apoptózis beindítására képes (akciós) doménhez kapcsolódik. Amint szintén leírjuk, a kiméra proteinek tartalmazhatnak további doméneket is. Ezek a kiméra proteinek abban az értelemben rekombinánsak, hogy a különböző domének különféle forrásokból származnak, ilyenformán a természetben nem találhatók meg együtt (azaz heterológok).

A találmány egyik tárgya új kiméra proteineket kódoló

DNS-molekulák (konstrukciók) , amelyek gazdasejtek génsebészeti módosításáho alkalmazhatók.

Ezek konstrukciók abban az értelemben rekombinánsak, hogy komponense ik (pl egy adott domént vagy expressziós találhatók találmány kódoló részeik) a természetben nem meg közvetlenül egymáshoz további tárgya eljárások és kapcsolódva. A készítmények a módosított sejtek előállítására és alkalmazására.

A módosított sejtek előállításához a kiválasztott gazdasejtekbe a kívánt kimérá(ka)t kódoló DNS-t visszük be. Ez hagyományos vektorok (melyek különböző fajtái kereskedelmi úton beszerezhetők) és technikák alkalmazásával valósítható meg. Kívánt esetben, a módosított sejtek később szelektálhatok, más sejtektől elkülöníthetők és tenyészthetők, mely műveletekhez szintén hagyományos eljárások alkalmazhatók.

A találmány gyakorlati megvalósításában hasznos oligomerizáló ligandumok kettő (vagy több) receptor doménhez képesek kötődni, vagyis két vagy több, ilyen receptor domént tartalmazó kiméra proteinhez. Az oligomerizáló ligandum a kimérához sorrendben vagy egyidejűleg kötődhet, előnyösen kb. 10~⁶ M alatti, előnyösebben kb. 10^-T M alatti, még előnyösebben kb. ΙΟ^-8 M alatti, néhány megvalósítási módban pedig kb. 1O~⁹ M alatti Kd értékkel. A ligandum előnyösen nem protein, molekulatömege pedig 5 kD-nál kisebb. Az így oligomerizált kiméra proteinek receptor doménjei lehetnek egyformák vagy különbözők. A kiméra proteinek gazdasejtjeik apoptózisát a ligandum jelenlétének hatására, vagyis a kiméra oligomerizációját követően képesek beindítani. Ennek megfelelően, a találmány szerinti, génsebészetileg módosított sejtek apoptózisa azután következik be, hogy a sejteket olyan ligandum hatásának tettük ki, amely képes a kimérával oligomerizálódni. Más szóval, a találmány szerinti, génszebészetileg módosított sejtek kiméra proteineket tartalmaznak (amint azt fentebb leírtuk), és olyan ligandum jelenlétére érzékenyek, amely az említett kimérákkal oligomerizációra képes.

A kódolt kiméra proteinek tartalmazhatnak még egy intracelluláris irányító (targeting) domént, amely képes a kiméra proteint a kívánt sejt-kompartmentbe irányítani. Az irányító (targeting) dómén lehet szekréciós vezető (leader) szekvencia, membránt átívelő dómén, membránkötő dómén vagy a protein, például, vezikulákkal vagy sejtmaggal történő kapcsolódását irányító szekvencia.

A kiméra proteinek akciós doménjeit olyan (előnyösen humán

eredetű vagy	szekvenciája) proteinek protein domének közül
választhatjuk	ki, amelyek például a Fás antigén
citoplazmikus	doménje keresztkötése hatására apoptózist

váltanak ki.

Amint később részletesebben (és példaként) is leírjuk, a találmány különböző megvalósítási módjaiban a kiméra protein FK506 típusú ligandumhoz, ciklosporin A típusú ligandumhoz, tetraciklin vagy szteroid ligandumhoz képes kötődni. Az ilyen kötődés a kiméra protein más kiméra proteinmolekulákkal (melyek lehetnek egyformák vagy különbözők) történő oligomerizációját eredményezi.

A sejtek a fentebb leírt kimérát (primer kiméra) kódoló konstrukció(ko)n kívül, adott esetben, tartalmazhatnak további heterológ DNS-konstrukciókat, amelyek egy vagy több kívánt gén szabályozható vagy konstitutív expressziójához alkalmasak. A sejtek például tartalmazhatnak egy vagy több olyan konstrukciót is, amelyek egyébként a fentebb leírttal hatására azonos, de ligandum-indukálta oligomerizáció az apoptózistól eltérő biológiai eseményeket beindító akciós doméneket tartalmazó tetszőleges kimérákat kódolnak. Az ilyen egyéb akciós domének a kiméra proteint ek) oligomerizációj ának hatására egy kívánt biológiai eredményt megvalósítani képes számtalan protein dómén közül választhatók ki.

Az akciós dómén tartalmazhat például egy CD3-zéta alegység protein domént, amely a ligandum jelenléte és az azt követő oligomerizáció hatására kimutatható intracelluláris jel iniciálására képes; DNS-kötő proteint, mint például a Gál 4;

vagy transzkripciós aktiváló domént, mint például a VP16. A találmányban számos egyéb példát is bemutatunk. A kimutatható intracelluláris jel egyik példája olyan jel, amely az oligomerizációra érzékeny transzkripciós szabályozó elem (pl. enhancer és/vagy promoter elemek és hasonlók) transzkripciós szabályozása alatt álló gén transzkripcióját aktiválja. A primer kimérát oligomerizáló, és apoptózist eredményező ligandum(ok) előnyösen nem idézik elő az egyéb, tetszőleges kiméra proteinek oligomerizációját. Rendszerint még előnyösebb, ha a tetszőleges kimérákat oligomerizáló, és tetszőleges biológiai eseményeket (pl. szabályozott gén transzkripciót) kiváltó ligandum(ok) nem oligomerizálják a primer kimérát, illetve nem váltanak ki apoptózist. A ligandumok különböző sorozatai ilyen értelemben ortogonálisak.

Amint később részletesebben is leírjuk, a találmány különböző megvalósítási módjaiban a kiméra proteinek FK506 típusú ligandumhoz, ciklosporin A típusú ligandumhoz, tetraciklin vagy szteroid ligandumhoz képesek kötődni. Az ilyen kötődés a kiméra protein más kiméra protein-molekulákkal (melyek lehetnek egyformák vagy különbözők) történő oligomerizációját eredményezi.

A sejtek adott esetben egy további rekombináns genetikai konstrukciót vagy ilyen konstrukcióik) sorozatát is tartalmazhatják, amelyek a tetszőleges kiméra proteinek ligandum-közvetítette oligomerizációja által kiváltott jelre (azaz a releváns ligandum jelenlétének hatására) érzékeny transzkripciós szabályozó elem (pl. enhancer/promoter) transzkripciós szabályozása alatt álló célgént tartalmaznak. Ezek a konstrukciók abban az értelemben rekombinánsak, hogy a célgén természetes állapotban nem áll az érzékeny transzkripciós szabályozó elem transzkripciós szabályozása alatt.

Az említett tetszőleges célgén konstrukció tartalmazhat (a) egy fentebb leírt, tetszőleges kiméra protein oligomerizációjára érzékeny transzkripciós szabályozóelemet és (b) egy célgénből származó szegélyező DNS-szekvenciát, amely lehetővé teszi a transzkripciós szabályozóelem gazdasejtbe történő, célgénnel kapcsolatos homológ rekombinációját. Más megvalósítási módokban a konstrukció egy kívánt gént és egy céllókuszból származó szegélyező DNS-szekvenciát tartalmaz, mely utóbbi lehetővé teszi a célgén kívánt lókuszba történő homológ rekombinációját (ld. pl. Mansour és mtsi, Natúré, 336. 348-352, 1988; és az azt követő lapok EM. Capecchi és mtsi.]). A konstrukció tartalmazhat érzékeny transzkripciós szabályozóelemet is, illetve az érzékeny elemet a lókusz is biztosíthatja. A célgén kódolhat például felületi membránproteint, elválasztott (szekretált) proteint, citoplazmikus proteint, ribozimot vagy antiszensz szekvenciát.

A találmány szerinti konstrukciók tartalmazhatnak szelektálható markert is, amely lehetővé teszi a konstrukciók gazdasejtekbe történő transzfektálását és a konstrukciót tartalmazó transzfektánsok szelektálását. A találmány tárgya továbbá az itt leirt különböző konstrukciókat tartalmazó DNS vektorok. amelyek a konstrukciók szövettenyészetben lévő gazdasejtekbe történő beviteléhez, vagy (a sejtekbe ín vívó történő bevitel érdekében) az ép organizmusnak történő beadáshoz alkalmasak. A konstrukció mindkét esetben episzomálisan vagy kromoszomálisan integrálva építhető be. A vektor lehet vírus vektor, beleértve például az adenovírus, adenovírussal kapcsolatos vagy retrovírus vektorokat.

A találmány további tárgya a találmány szerinti DNS-konstrukciók bármelyike által kódolt kiméra protein, valamint az e konstrukciókat tartalmazó és/vagy expresszáló sejtek, köztük a prokarióta és eukarióta sejteket, közelebbről élesztő-, féreg-, rovar-, egér- és egyéb rágcsálósejteket, valamint egyéb emlőssejteket, beleértve a különböző típusú és különböző vonalba tartozó humán sejteket, függetlenül attól, hogy ezek fagyasztottak vagy aktív növekedést mutatnak, illetve, hogy tenyészetből vagy ép organizmusból származnak-e.

összegzésül, a találmány olyan sejtek (előnyösen, de nem szükségszerűen emlőssejtek), amelyek egy primer kiméra proteint kódoló első DNS-konstrukciót tartalmaznak, mely primer kiméra protein tartalmaz (i) legalább egy receptor domént, amely képes egy találmány szerinti kiválasztott oligomerizáló ligandumhoz kötődni, és (ii) egy másik protein domént, amely a receptor domént illetően heterológ eredetű, de egy vagy több más, hasonló doménnel történő oligomerizáció hatására képes kiváltani a sejtek apoptózisát. Ha a sejteket a kiválasztott ligandum hatásának tesszük ki, programozott sejtpusztulás következik be.

Néhány megvalósítási módban, a fentebb leírt sejtek egy vagy több egyéb, tetszőleges DNS-konstrukciót tartalmaznak, amelyek egy vagy több olyan kiméra proteint kódolnak, mely kiméra proteinek tartalmaznak (i) egy találmány szerinti kiválasztott oligomerizáló ligandumhoz kötődni képes legalább egy receptor domént, és (ii) egy másik protein domént, amely a receptor domént illetően heterológ eredetű, de amely a tetszőleges kimérákkal való oligomerizáció hatására (közvetlenül vagy közvetve) egy ilyen oligomerizációra érzékeny transzkripciós szabályozóelem szabályozása alatt álló célgén transzkripciójának aktiválását képes kiváltani. A sejtek rendszerint tartalmaznak még egy, az említett oligomerizáló ligandumra érzékeny transzkripciós szabályozóelem expressziós szabályozása alatt álló célgént is. A kiválasztott ligandum hatására a célgén expresszálódik. Még egyszer; a primer kimérát oligomerizálni képes ligandumnak és az egyéb, tetszőleges kimérák oligomerizálására képes ligandum(ok)nak ortogonálisnak kell lenniük.

Más megvalósítási módokban, a találmány szerinti sejtek tartalmaznak egy első tetszőleges kiméra proteint kódoló DNS-konstrukciót is. mely kiméra protein egy DNS-kötő domént és legalább egy (egy kiválasztott ligandum molekularészhez kötődni képes) receptor domént tartalmaz. A sejtek tartalmaznak továbbá egy második tetszőleges kiméra proteint, amely egy transzkripciós aktiváló domént, és legalább egy második kiválasztott ligandum molekularészhez (mely az első kiválasztott ligandum molakularésszel megegyező vagy attól eltérő lehet) kötődni képes receptor domént tartalmaz.

A sejtek ezenkívül tartalmaznak egy

DNS-kötő dómén számára közös kötőhellyel rendelkező, és a transzkripciós aktiváló doménre érzékeny heterológ transzkripciós szabályozó szekvencia transzkripciós szabályozása alatt álló — célgént kódoló DNS-konstrukciót, miáltal a kiválasztott ligandum molekularész(eke)t tartalmazó oligomerizáló ligandum jelenlétének hatására a sejt a célgént expresszálja.

A találmány tárgyainak gyakorlati megvalósításához alkalmas DNS készítmények közé tartoznak azok, amelyek tetszőleges kimérákat kódolnak. Ezek a készítmények tartalmaznak egy kiméra proteint kódoló első DNS-konstrukciót, amely legalább egy (egy kiválasztott ligandumhoz kötődni képes, az oligomerizáló ligandum jelenlétének hatására — azaz a kiméra protein oligomerizációjának hatására — biológiai folyamatot beindítani képes heterológ eredetű másik protein doménhez fuzionált) receptor domént tartalmaz; valamint egy második DNS-konstrukciót, amely az oligomerizáló ligandumra érzékeny transzkripciós szabályozóelem transzkripciós szabályozása alatt álló célgént kódol.

Egy másik, a találmány tárgyainak gyakorlati megvalósátására alkalmas, példaként szolgáló DNS-készítmény egy első és második kiméra proteint kódoló DNS-konstrukciók első sorozatából, és kiméra protein-molekulák oligomerizációjára érzékeny transzkripciós szabályozóelem transzkripciós szabályozása alatt álló célgént kódoló második DNS-konstrukcióból áll. Az első kiméra proteint kódoló DNS-konstrukció tartalmaz (a) legalább egy, egy kiválasztott receptor doménhez kötődni képes első receptor domént, amely (b) az oligomerizáló ligandum jelenlétének hatására — azaz az első kiméra protein második kiméra proteinnel történő oligomerizációjának hatására — biológiai folyamatot beindítani képes heterológ eredetű másik protein doménhez fúzionált. A második kiméra proteint kódoló DNSkonstrukció tartalmaz (i) legalább egy, egy kiválasztott második ligandumhoz kötődni képes receptor domént, amely (ii) az oligomerizáló ligandum jelenlétének hatására — azaz az első kiméra proteinhez történő oligomerizációjának hatására — biológiai folyamatot beindítani képes heterológ eredetű másik protein doménhez fuzionált. Ilyen esetekben az első és második receptor molekularész lehet egyforma vagy különböző, hasonlóan, az első és második kiválasztott ligandum molekularész is lehet azonos vagy eltérő.

A találmány szerinti ligandumok olyan molekulák, amelyek képesek két vagy több találmány szerinti kiméra molekulához kötődni, miáltal azok oligomerét hozzák létre. A ligandumok az alábbi képlettel írhatók le linker—{rbmi,rbm2,...rbmnl ahol n értéke 2 és kb. 5 kötötti egész szám, rbm<i>-rbm<n> .jelentése receptor-kötő molekularészek (receptor binding moieties), melyek lehetnek egyformák vagy különbözők, és amelyek kiméra protein(ek)hez képesek kötődni. Az rbm molekularészek kovalensen kapcsolódnak egy linker molekulához, amely két vagy több rbm molekularészhez kovalensen ( —) kapcsolódni képes két- vagy többfunkciós molekula. A ligandum molekulatömege előnyösen kevesebb, mint 5 kD, és előnyösen nem protein. Az ilyen ligandumok példái közé tartoznak azok, amelyekben az rbm molekularészek azonosak vagy különbözők, és amelyek FK506 típusú molekulából, ciklosporin típusú molekulából, szteroid- vagy tetraciklin típusú molekulából állnak. A ciklosporin típusú molekulák közé tartoznak a ciklosporin és származékai, melyek a természetben előforduló vagy módosított ciklofilinhez előnyösen kb. ΙΟ^-6 M alatti Kd értékkel képesek kötődni. Néhány megvalósítási módban előnyös, ha a ligandum kb. 10^-6 M-nál nagyobb, még előnyösebben kb. 10~⁵ M-nál nagyobb Kd értékkel egy természetben előforduló receptorhoz kötődik. A találmány szerinti jellemző ligandumok azok, amelyekben legalább egy rbm egy FK506-, FK520-, rapamicin-molekulából vagy ezek 9., 10. vagy 9. és

10. szénatomon módosított származékából áll, mely ligandumok olyan módosított receptor vagy kiméra molekulához kötődnek, amelyek saját, természetesen előforduló repceptor proteinekre vonatkozó Kd értékeiknél legalább egy, előnyösen kettő, előnyösebben három, még előnyösebben 4-5 vagy több nagyságrenddel kisebb Kd értékkel rendelkező módosított receptor domént tartalmaznak. A linker molekularészeket a későbbiekben szintén részletesen leírjuk; ezek közé olyan csoportok tartoznak, mint a 2-20 szénatomos alkilén-, 4-18 szénatomos azalkilén-, 6-24 szénatomos N-alkilén-azalkilén-, 6-18 szénatomos arilén-, 8-24 szénatomos arildialkilén- vagy 8-36 szénatomos bisz-karboxi-amido-alkilén-csoportok.

A találmány szerinti monomer rbm-ek, valamint egy rbm egyetlen példányát tartalmazó molekulák, melyek képesek a találmány szerinti kiméra proteinekhez kötődni, de (az egyetlen rbm monomer természete miatt) nem idézik elő azok dimerizációját vagy magasabb fokú oligomerizációját, oligomerizációs antagonistáknak minősülnek.

A találmány egyik lényeges megvalósítási módjában, a találmány szerinti, génsebészetileg módosított sejtek egyéb sejtekkel együtt növeszthetők, és a primer kiméra proteinnek megfelelő (vagyis ahhoz kötődni képes) oligomerizáló ligandum hatásos mennyiségének hozzáadásával szelektíven eltávolíthatók a sejtek elegyéből. Ennek megfelelően, ha a sejteket érintkezésbe hozzuk az oligomerizáló ligandummal, az oligomerizáló ligandum jelenléte a génsebészetileg módosított sejtek pusztulását váltja ki. Az ilyen sejtekkel például, bizonyos ideig endogén vagy heterológ termék termeltethető, és a sejtek a ligandum hozzáadásával elpusztíthatok. Ilyen esetekben a sejteket génsebészeti úton úgy módosítjuk, hogy egy találmány szerinti primer kimérát termeljenek.

A sejteket, melyeket génsebészetileg úgy módosíthatunk tovább, hogy ligandum-indukálta szabályozás alatt álló, kívánt gént expresszálj anak, hagyományos eljárásokkal tenyészthetők.

Ebben az esetben, a tetszőleges kimérához való ligandum tenyésztő tápközeghez történő hozzáadása kívánt gén expresszióját, és a kívánt protein termelését eredményezi. A gén expressziója és a protein termelése oligomerizáció-antagonista reagens közeghez történő hozzáadásával állítható le, amint azt a későbbiekben részletesen leírjuk. Más esetekben a protein konstitutivan termelődik. Valamennyi esetben, a génsebészetileg módosított sejtek, miután elvégezték tervezett feladatukat (pl. a kívánt protein vagy más termék termelését), az oligomerizáló ligandum (a primer kiméra oligomerizációjának előidézéséhez és a génsebészetileg kezelt sejtek apoptózisának indukálásához elégséges) hatásos mennyiségének tápközeghez történő hozzáadásával kivonhatok a sejttenyészetből. A találmány szerinti génsebészetileg kezelt sejtek in vivő is alkalmazhatók, ép (köztük emberek) sejtek az őket termeljék vagy (teljes) organizmusok, előnyösen emlősök oly módon történő módosításához, hogy a tartalmazó állatban a kívánt proteint más eredményt érjenek el. Az ilyen alkalmazások közé tartozik a génterápia. Más lehetőség szerint, a kiméra proteinek és az oligomerizáló molekulák extracellulárisan alkalmazhatók az együttesen fiziológiai működést beindító proteinek egymás közelébe juttatásához.

A fentieknek megfelelően, a találmány tárgya anyagok és eljárások a sejtek (egy oligomerizáló ligandum hozzáadásának hatására bekövetkező) szelektív eltávolítására. Az eljárás során találmányunk szerint génsebészetileg módosított sejteket állítunk elő, és ezeket a sejteket érintkezésbe hozzuk a ligandummal.

Ilyenformán, a találmány egyik tárgya eljárás a találmány szerint génsebészetileg módosított sejtek heterológ protein előállításában való alkalmazására (melyet a sejtekben egy célgén transzkripciójának szabályozott aktiválásával valósítunk meg), valamint eljárás a génsebészetileg kezelt sejt kívánt időpontban történő eliminálására. Az eljárás során olyan, találmány szerinti sejteket hozunk létre, amelyek oligomerizáció hatására apoptózis indukálására képes primer kiméra proteint expresszálnak, és amelyek (a) legalább egy, találmány szerinti kiméra proteint kódoló DNS-konstrukciót tartalmaznak (és képesek azt expresszálni), mely kiméra protein, az oligomerizációt követően, képes (b) egy célgén transzkripcióját aktiválni. A kiméra protein legalább egy receptor domént tartalmaz, amely képes egy kiválasztott oligomerizációs ligandumhoz kötődni. A receptor dómén egy akciós doménhoz van fuzionálva, amely az oligomerizáló ligandum jelenlétének hatására (vagyis az akciós dómén egy másik példányát tartalmazó egy vagy több másik kiméra proteinnel való oligomerizáció hatására) képes intracelluláris jelet iniciálni. Ez a jel egy gén (mint pl. esetünkben a célgén) transzkripciójának aktiválására képes, amely gén a szóban forgó jelre érzékeny transzkripciós szabályozóelem transzkripciós szabályozása alatt áll. Ennek megfelelően, az eljárás során a sejteket a kiméra proteinhez kötődni képes oligomerizációs ligandum olyan mennyiségével hozzuk érintkezésbe, amely elegendő a célgén expressziójának kiváltásához. Olyan esetekben, amikor a sejteket tenyészetben neveljük, úgy hozzuk őket érintkezésbe a ligandummal, hogy ligandumot a tenyésztő tápközegbe tesszük. Amennyiben a sejtek egy gazdaszervezetben helyezkednek el, úgy hozzuk őket érintkezésbe a ligandummal, hogy azt beadjuk a gazdaszervezetnek. Például, ha a gazdaszervezet állat, különösen, ha emlős (beleértve az embert is), a ligandumot megfelelő vivőanyagban orálisan, bukkálisan, szublingválisan, transzdermálisan, szubkután, intramuszkulárisan, intravénásán, Ízületekbe adva vagy inhalálással alkalmazzuk. A génsebészetileg módosított sejtek eltávolításához, a helyzettől függően, a tenyésztő tápközegbe vagy a gazdaszervezetnek egy második oligomerizáló ligandumot adunk, amely képes a primer kiméra oligomerizálására.

A találmány további tárgya gyógyszerészeti készítmények a találmány szerinti, génsebészetileg módosított sejtek más sejtek elegyéből (beleértve az ilyen módosított sejteket tartalmazó állati szövetet vagy szervezetet) történő eltávolításához. Az ilyen gyógyszerészeti készítmény egy találmány szerinti oligomerizációs ligandumot egy gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal elegyítve, és adott esetben egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható kötőanyaggal együtt tartalmaz. Az oligomerizációs ligandum lehet homo-oligomerizációs reagens vagy hetero-oligomerozációs reagens (részletes leírásukat ld. másutt), amennyiben azok képesek egy találmány szerinti primer kiméra proteinhez kötődni, illetve a találmány szerinti, génsebészetileg módosított sejtek apoptózisát kiváltani. A találmány további tárgya olyan gyógyszerészeti készítmény, amely egy találmány szerinti oligomerizációs antagonistát egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval (és adott esetben egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható kötőanyaggal) együtt tartalmaz. A készítmény sejttenyészetben vagy páciensben lévő, találmányunk szerinti, génsebészetileg módosított sejtekben a kiméra proteinek oligomerizációjának részbeni vagy teljes csökkentéséhez, s ilyenformán, releváns sejtekben a sejtpusztulás megakadályozásához alkalmazható.

Ennek megfelelően, a találmány további tárgya az oligomerizációs reagensek és az oligomerizációs antagonista reagensek alkalmazása gyógyszerészeti készítmények előállításához.

A találmány további tárgya eljárás egy találmány szerinti oligomerizációs ligandumra érzékeny gazdaszervezet, előnyösen állat, sok esetben emlős kialakítására. Az eljárás során a gazdaszervezetbe a találmány szerint ex vivő génsebészetileg módosított, azaz kiméra proteint kódoló DNS-konstrukciót, stb. tartalmazó sejteket viszünk be. Más módon, a találmány szerinti DNS-konstrukciókat olyan körülmények között vihetjük be a gazdaszervezetbe, például emlősbe, melyek lehetővé teszik az emlős egy vagy több sejtjének in vivő transzfekcióját.

A találmány további tárgya ligandum által szabályozott apoptózisra érzékeny sejtek előállításához alkalmazható készletek. Egy ilyen készlet legalább egy DNS-konstrukciót tartalmaz, amely legalább egy receptor domént és egy akciós domént (pl- a Fás vagy egy TNF receptor citoplazmikus doménjét, melyek leírása másutt megtalálható) tartalmazó, találmány szerinti primer kiméra proteinek egyikét kódolja. A találmány egyik megvalósítási módjában a DNS-kontrukció tartalmaz egy hagyományos polilinkert, ami helyet biztosít a sejttípus-specifikus expressziós szabályozó elem(ek) (promoter és/vagy enhancer elemek) beépítéséhez, melyek egy vagy több kiméra sejttípus- vagy szövet-specifikus expresszióját biztosítják. A készlet (kit) a találmány szerinti ligandum olyan mennyiségét tartalmazhatja, amely alkalmas a készletben lévő

DNS-konstrukciók által kódolt kiméra protein-molekulák oligomerizálására, továbbá tartalmazhat megfelelő mennyiségű oligomerizációs antagonistát, például monomer ligandum reagenst. Olyan esetben, amikor a konstrukcióik) egyetlen kiméra proteint kódol(nak), az oligomerizációs ligandum homo-oligomerizációs ligandum. Ha a konstrukciók több ilyen kiméra proteint kódolnak, a készletben hetero-oligomerizációs ligandumot kell alkalmazni. A készlet tartalmazhat még tetszőleges kimérákat kódoló további (kiegészítő) DNS-konstrukciókat és/vagy egy célgén konstrukciókat és/vagy a kiméra proteinmolekulák oligomerizációjára érzékeny transzkripciós szabályozóelemet is. A DNS-konstrukciókat a transzfektánsok könnyű kiszelektálása érdekében előnyösen egy vagy több szelekciós markerrel, valamint egyéb, prokariótákban történő replikációhoz vagy eukariótákban történő expresszióhoz, stb. alkalmas hagyományos vektor elemekkel kapcsoljuk össze. A szelekciós markerek a különböző DNS-konstrukciókat illetően lehetnek egyformák vagy különbözők, lehetővé téve az ilyen DNS-konstrukció(k) különböző kombinációit tartalmazó sejtek kiszelektálását.

Például, az találmány szerinti egyik készlet tartalmaz egy (másutt leírt) primer kiméra proteint kódoló DNSkonstrukciót; egy transzkripciós aktivátor doménhez fúzionált legalább egy (kiválasztott ligandumhoz kötődni képes) receptor domént tartalmazó kiméra proteint kódoló első tetszőleges DNS-konstrukciót; egy DNS-kötő doménhez fúzionált legalább egy (kiválasztott ligandumhoz kötődni képes) receptor domént tartalmazó második tetszőleges kiméra proteint kódoló második DNS-konstrukciót; és egy transzkripciós szabályozóelem szabályozása alatt álló célgént tartalmazó célgén DNS-konstrukciót, mely célgén olyan DNS-szekvenciából áll, melyhez kötődik a DNS-kötő dómén, és amely az első és második tetszőleges kiméra proteinek jelenlétében a ligandummal érintkezésbe hozva a transzkripciót illetően aktiválódik.

Más lehetőség szerint, egy érzékeny transzkripciós szabályozóelem szabályozása alatt álló célgén beviteléhez való DNS-konstrukció a célgén helyett tartalmazhat egy klónozóhelyet, hogy a sejtek oly módon legyenek génsebészetileg módosíthatók, hogy indukálhatóan expresszáljanak egy, a szakember által bevinni kívánt gént.

A találmány szerinti egyéb készletek a kiméra proteineket kódoló egy vagy két (vagy több) DNS-konstrukciót tartalmazhatnak, melyek közül egy vagy több az akciós dómén (transzkripciós kezdőjel generátor, transzkripciós aktivátor, DNS-kötő protein, stb.) helyett klónozóhelyet tartalmaz, lehetővé téve a felhasználónak, hogy olyan akciós domént inszertáljon, amilyet kíván. Az ilyen készlet adott esetben a fentebb leírtakon kívül más elemeket is tartalmazhat, pl. érzékeny expressziós szabályozás alatt álló célgén tartalmazó DNS-konstrukciót, oligomerizációs ligandumot, antagonistát, stb.

Valamennyi készlet tartalmazhat a találmány szerinti konstrukciókkal stabilan transzformált pozitív kontroll- 24 -sejteket, hogy azok a sejtek ligandummal való érintkezésbe hozásának hatására riporter gént (CAT-hoz, β-galaktozidázhoz vagy bármely könnyen kimutatható géntermékhez) expresszáljanak. A riporter gén expressziójának kimutatásához és/vagy mennyiségi meghatározásához való reagensek szintén a találmány tárgyát képezik.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán a pSXNeo/IL2 (IL2-SX) plazmid vázlatát mutatjuk be. Az NF-AT-SX-ben az IL2 enhancer/promotert tartalmazó IL-SX-ből származó HindlII-Clal DNS-fragmenst egy alap-transzkripciót biztosító minimál IL-2 promoterrel és három tandem NFAT-kötőhelyet tartalmazó indukálható elemmel helyettesítettük (ld. alább).

A 2. ábrán a p#MXFn és p#MFnZ intracelluláris jelölő kiméra plazmid (melyekben n a kötő domének számát jelöli) előállításának műveleti sorrendjét mutatjuk be.

A	3/A	és 3/B	ábrán	a p#lFK3/pBJ5 intracelluláris jelölő
kiméra	plazmid	előállításának	műveleti sorrendjét mutatjuk
be.
A	4/A,	4/B és	4/C	ábrán a	találmányunkban alkalmazott

plazmidok előállításához felhasznált primerek szekvenciáit mutatjuk be.

Az 5. ábrán a különböző enhancer csoportokkal rendelkező riporter-konstrukciók TAC/CD3-zéta receptor és egy ligandum közötti reakcióra adott reakciójának grafikonját mutatjuk be.

A 6. ábrán különböző ligandumok 1. példában leírt TAg Jurkat sejtekkel mutatott aktivitásának grafikonja látható.

A 7. ábrán az FK1012A ligandum [(8) képletű vegyület, 9/C ábra] 1FK3 (FKBPx3/CD3-zéta) extracelluláris receptorral mutatott aktivitásának grafikonja látható.

A 8. ábrán az NFAT riporter mirisztoilált CD3-zéta/FKBP12 kimérával való jelöléssel végzett aktiválásának grafikonja látható.

A 9/A és 9/B ábrán az allil-kötésű FK506 változatok, illetve a ciklohexil-kötésű FK506 változatok kémiai szerkezetét mutatjuk be.

A 10. ábrán az FK520 származékai szintézisének reakcióvázlatát mutatjuk be.

A 11/A és 11/B ábrán Az FK520-származékok szintézisének reakcióvázlatát és az FK520 kémiai szerkezetét mutatjuk be; az alsó szerkezeteket az FKBP12 mutánshoz való kötődéshez terveztük.

A 12. ábrán sematikusan mutatjuk be az FKBP mutánst a feltételezett résében módosított FK520 ligandummal.

A 13. ábrán az FK520 és a ciklosporin heterodimereinek szintézisét bemutató reakcióvázlat látható.

A 14. ábrán sematikusan mutatjuk be a kiméra proteinek oligomerizációját; a kiméra proteineket receptor doménként immunofilin molekularészt tartalmazó kiméra proteinekként ábrázoljuk.

A 15. ábrán kiméra proteinek 1igandum-közvetítette oligomerizációját mutatjuk be, és sematikusan ábrázoljuk a transzkripciós indító jel kiváltásának menetét.

A 16. ábrán a HED és HÓD reagensek FK506 típusú molekularészeken alapuló szintézisének reakcióvázlatát mutatjuk be.

A 17. ábrán a (CsA)2 CsA-ból kiinduló szintézisét mutatjuk be.

A 18. ábrán a fúziós cDNS-konstrukció és az MZF3E protein vázlata látható.

A 19. ábrán a mirisztoilált Fas-FKBP12 fúziós proteinnel (MFF3E) transzfektált Jurkat T-sejtvonal FK1012-indukálta (a sejtek csökkent transzkripciós aktivitása által jelzett) sejtpusztulását mutatjuk be.

A 20/A ábrán a ciklofilin-Fas (és Fas-ciklofilin) fúziós konstrukciók átmeneti transzfekciós analízissel végzett vizsgálatának eredményét mutatjuk be. A vizsgálatokban az MC3FE bizonyult a leghatásosabbnak.

A 20/B ábrán az immunfilin-Fas antigén kimérákat és a nagy T-antigénnel stabilan transzformált Jurkat T-sejtekben végzett átmeneti expressziós vizsgálatok eredményeit mutatjuk be. Myr: a mirisztilációs szekvenciát az 1-14. gyököket kódoló pp60^c_arc-ből vettük (Wilson és mtsi, Mól. & Cell Bioi., H(4), 1536-1544, 1989); FKBP: humán FKBP12;

CypC: a 36-212. gyököket kódoló egér ciklofilin C szekvencia (Freidman és mtsi, Cell, 66(4). 799-806, 1991), Fás: a humán Fás antigén 179-319. gyököket kódoló intracelluláris doménje (Oehm és mtsi, J. Bioi. Chem., 267(15). 10709-15, 1992). A sejtekbe három tandem API promoter szabályozása alatt álló szekretált alkalikus foszfatáz riporter gént tartalmazó plazmidot vittünk be elektroporációval (az immunfilin fúzió hatszoros moláris feleslegével együtt). 24 óra elteltével a sejteket PMA-val (50 ng/ml) stimuláltuk, ami a riporter gén és a (CsA)2 szintézisét serkenti. A 48. órában a sejteket a riporter gén aktivitására teszteltük. A 24. órában anti-HA epitóp antitestek alkalmazásával Western biot analízist végeztünk.

A 21. ábrán a módosított FK506 típusú vegyületek szintézisét mutatjuk be.

A 22. ábrán a CsA és származékainak szerkezeti képletét mutatjuk be.

A 23. ábrán a módosított [MeVal^1;L]CsA származékok eléállításának reakcióvázlatát mutatjuk be.

I. Általános leírás

A találmány tárgya kiméra proteinek, a kiméra proteinek oligomerizációjához való szerves molekulák és alkalmazási rendszerük. A fúziónált proteinek (kimérák) a szerves oligomerizáló (előnyösen kis méretű) molekulához való kapcsolódáshoz kötő domént, valamint egy akciós domént tartalmaznak, mely utóbbi kiméra proteinek oligomerizációjának eredményeként fiziológiai működést vagy celluláris folyamatot képes megvalósítani.

Az indukálható protein-assszociáció alapelvét a 14. ábrán mutatjuk be.

heterodimerizációs (vagy hetero-oligomerizációs,

HED) és homodimerizációs (vagy homo-oligomerizációs, szerekként funkcionálni képes ligandumokat súlyzó alakú szerkezetként ábrázoljuk.

(A homodimerizáció és homo-oligomerizáció kifejezés hasonló komponensek dimereket szerinti ligandumok vagy oligomereket képező (találmány által megvalósuló) kapcsolódására vonatkozik. A heterodimerizáció vagy hetero-oligomerizáció kifejezés különböző komponensek dimereket vagy oligomereket képező kapcsolódására vonatkozik. Ilyenformán, a homo-oligomerek egy adott kapcsolódásából, míg a komponensek példányainak találmány leírásában oligomerizál és oligomer vagy anélkül) magukban komponens több példányának hetero-oligomerek különböző kapcsolódásából állnak. A használt oligomerizáció, kifejezések (előtaggal együtt foglalják a dimerizáció, dimerizál és dimer kifejezéseket, hacsak nem jelöljük egyértelműen az ellenkezőjét.)

A 14. ábrán fúziós protein-molekulákat is feltüntetünk, amelyek egy szóban forgó célprotein domént (akciós dómén) és egy vagy több, ligandumokhoz kötődni képes receptor domént tartalmaznak. Az intracelluláris kiméra proteinekben (vagyis az ezeket termelő sejteken belül elhelyezkedő kiméra proteinekben) előnyösen celluláris irányítószekvencia (beleértve az organellumokhoz irányító aminosavszekvenciákat) is jelen van. A ligandum receptor doménhez való kötődése hetero- vagy homodimerizálja a fúziós proteineket. Az oligomerizáció az akciós doméneket egymás közelébe hozza, ezáltal normálisan a megfelelő akciós doménnel kapcsolatos celluláris folyamatokat vált ki (mint pl. apoptózist vagy TCR-közvetítette jelátalakítást).

Az oligomerizációval kiváltható celluláris folyamatok közé tartozik valamilyen állapot, például fizikai állapot megváltozása (pl. konformációváltozás), a kötő-partner megváltozása, sejtpusztulás, transzkripció-indítás, csatorna megnyitása, ionfelszabadulás (pl. Ca²⁺-felszabadulás, stb.), illetve kémiai állapot megváltozása, például enzimatikusan katalizált kémiai reakció, mint pl. acilezés, metilálás, hidrolízis, foszforilálás vagy defoszforilálás, a redoxállapot megváltozása, átrendeződés vagy hasonlók. Annak ellenére, hogy a találmány elsődleges tárgya az apoptózis, a ligandum-közvetítette oligomerizációval kiváltható valamennyi folyamat a találmány tárgykörébe tartozik.

A találmány elsődleges megvalósításaként sejteket úgy módosítunk, hogy azok olyan ligandum molekulákra legyenek érzékenyek, amelyek kimérákhoz kötődni, s képesek a találmányban leírt primer ezáltal azokat oligomerizálni (ld. pl.

4/B és 4/C példa).

génsebészetileg módosított sejtek apoptózissal reagálnak a ligandum jelenlétére, és génterápiás és egyéb olyan alkalmazásokban, ahol a genetikailag módosított sejtek eltávolítása szükséges vagy kívánatos, eliminálhatók. Például, a módosított sejtek rákossá, vagy máshogyan károssá, illetve feleslegessé válhatnak.

A módosított sejtekre olyan genom jellemző, amely egy találmány szerinti primer kiméra proteint (amely lehetővé teszi a ligandum-közvetítette apoptózist) kódoló genetikai konstrukciót (vagy konstrukció-sorozatot) tartalmaz. A primer kiméra például, a Fás antigén vagy az Apo-1 antigén citoplazmkus doménjét. tartalmazza, amely keresztkötést képezve a legtöbb sejttípusban apoptózist indukál (Trauth és mtsi, Sience, 245. 301-305, 1989; Watanaba-Fukunaga és mtsi. Natúré, 356. 314, 1992). Ezen a módon génsebészetileg módosított sejtek populációjában ligandummal indukálható sejtpusztulást biztosíthatunk.

A sejtek úgy is módosíthatók, hogy tetszőleges kiegészítő kiméra proteineket termeljenek, amelyek képesek a kiválasztott molekulákhoz kötődni, és azokra érzékennyé válni. Az ilyen kiegészítő, tetszőleges génsebészeti módosítások sejtek számára további ligandummal szabályozható működéseket biztosítanak, amelyek ín vitro sejttenyésztésben és génterápiás alkalmazásokban alkalmazhatók.

Az ilyen további, módosított sejtek olyan alkalmazási területeken használhatók, ahol celluláris folyamatok, mint pl. egy célgén transzkripciója vagy transzlációja (mindkettőre az expresszió kifejezést használjuk) kívánatos.

Az ilyen egyéb sejtekre olyan genom jellemző, amely legalább egy, a tetszőleges kiegészítő kimérákat kódoló első genetikai konstrukciót vagy első genetikai konstrukció-sorozatot (a sorozat állhat csupán egyetlen konstrukcióból), és előnyösen egy második célgén-konstrukciót vagy célgén-konstrukciók második sorozatát (a sorozat állhat csupán egyetlen konstrukcióból) tartalmazza.

Az ilyen genetikai konstrukciók természete és száma a kiméra protein természetétől és a sejtben betöltött szerepétől függ. Például olyan megvalósítási módokban, amikor a tetszőleges kiegészítő kiméra proteint egy célgén expressziójával kívánjuk kapcsolatba hozni, (és a kiméra protein olyan intracelluláris irányítószekvenciát vagy domént tartalmaz, amely a protein sejtfelületi membránnal vagy sejtorganellummal, pl. sejtmaggal vagy vezikulával, való kapcsolódását irányítja, általában az ilyen kiegészítő konstrukciók legalább két további sorozatára van szükség: egy első sorozatra, amely kiméra protein(eke)t kódol, mely(ek) a ligandum-közvetítette oligomerizáció hatására jelet képez(nek), ami a célgén expresszióját irányítja, és előnyösen egy második sorozatra, amely a célgént és/vagy annak expressziós szabályozóelemeit tartalmazza, melyek érzékenyek az említett jelre.

Abban az esetben, ha homo-oligomerről (rendszerint homodimerről) van szó, az első sorozatban csupán egy konstrukcióra van szükség, míg hetero-oligomer esetén kettő vagy több (rendszerint nem több, mint három) konstrukció szükséges. Az első konstrukció-sorozat által kódolt kiméra proteineket a gén transzkripciójának beindulásával hozzuk összefüggésbe, s normális esetben a felületi membránhoz vagy a sejtmaghoz tartanak, ahol az oligomerizált kiméra protein közvetve vagy közvetlenül képes egy vagy több célgén transzkripciójának elindítására. Egy második konstrukció-sorozatra van szükség olyan esetekben, amikor exogén gén(eke)t juttatunk be, vagy amikor egy endogén gén expressziójához exogén vagy rekombináns expressziós szabályozószekvenciát juttatunk be (pl. homológ rekombinációval), mely gének transzkripcióját (mindkét esetben) a kiméra protein oligomerizációja aktiválja.

Az kiegészítő konstrukciók egy másik első sorozatát alkalmazzuk akkor, ha a kiméra proteinek intracellulárisak, és egy másik gén transzkripciójának beindítása nélkül közvetlenül képesek hatni. Például az exocitózissal kapcsolatos proteinek indukálhatóan vagy konst itűtIván expresszálhatók, ha a proteinek csak az oligomerizáló molekulák jelenlétében komplexálódnak normálisan. Ha a komplexképződés és a membránfúzió oligomerizáló molekula jelenlétében fokozódik, olyan proteineket alkalmazva, amelyek a gazdasejtben nem képeznek komplexet; amelyek komplexképzését más proteinek komplexképződése gátolja (mely gátlás a ligandummal való oligomerizációval megszüntethető); amelyek olyan folyamattal megvalósuló aktiválást igényelnek, amely a gazdasejtben nem áll rendelkezésre; illetve egy vezikula plazmamembránnal való fúzióját irányító proteineket kiméra proteinekké módosítva az exocitózis oligomerizáló molekulával indukálható, illetve lehetőség van az oligomerizáló molekulával történő indukálására.

Más intracelluláris proteinek, mint például a kinázok, foszfatázok és sejtciklus-szabályozó proteinek hasonlóan módosíthatók és alkalmazhatók.

A találmány gyakorlati megvalósításában hasznos tetszőleges kiegészítő genetikai konstrukciók különféle csoportjait az alábbiak szerint jellemezhetjük:

(1) konstrukciók, amelyek extracelluláris vagy intracelluláris kötő-domént és intracelluláris akciós domént tartalmazó kiméra proteint kódolnak; ebben az esetben a kiméra protein önmagával (homo-oligomer kialakulása) vagy egy másik akciós domént tartalmazó eltérő fúzionált proteinnel (hetero-oligomer kialakulása) megvalósuló ligandum-közvetítette oligomerizációja olyan jelet indukál, amely egy vagy több gén transzkripciós aktiválását okozó eseménysorozatot eredményez;

(2) konstrukciók, amelyek kötő-doménnel és akciós doménnel rendelkező kiméra proteint kódolnak, mely kötődőmén és akciós dómén a sejtmagban helyezkedik el; ebben az esetben a protein önmagával (homo-oligomer kialakulása) vagy egy másik akciós domént tartalmazó eltérő fúzionált proteinnel (hetero-oligomer kialakulása) megvalósuló ligandum-közvetítette oligomerizációja a transzkripció elindítását közvetlenül az oligomer(ek) DNS transzkripciós indítórégióval való komplexképzése útján indukálja;

(3) konstrukciók, amelyek citoplazmikus kötő-domént és citoplazmikus akciós domént tartalmazó kiméra proteineket kódolnak; ebben az esetben a protein önmagával (homo-oligomer kialakulása) vagy egy másik akciós domént tartalmazó eltérő fúzionált proteinnel (hetero-oligomer kialakulása) megvalósuló ligandum-közvetítette oligomerizációja exocitózist eredményez;

(4) konstrukciók, amelyek extracelluláris kötő-domént és intracelluláris akciós domént tartalmazó kiméra proteint kódolnak, és az akciós dómén biológiai működés beindításával kapcsolatos (nem korlátozó Jellegű példaként említjük, hogy az akciós dómén önmaga kötődhet egy anyaghoz, receptorhoz vagy más membránproteinhez, miáltal a kimérák ligandum-közvetítette oligomerizációjának hatására egy vagy több hasonló vagy különböző molekula vagy sejt között hidat képez); és (5) konstrukciók, amelyek kötő-doménnel és akciós doménnel rendelkező destabilizáló, inaktiváló vagy rövid élettartamú kiméra proteint kódolnak; ebben az esetben a protein egy eltérő akciós domént tartalmazó célproteinnel való ligandum-közvetítette oligomerizációja az említett oligomerizált célprotein destabilizálását és/vagy lebomlását, illetve inaktiválását eredményezi.

II. Transzkripciós szabályozás

Elsőként az 1. és 2. csoportba tartozó konstrukciókat tárgyaljuk. Az 1. csoportba tartozó konstrukciók hatásukban térnek el a 2. csoportba tartozóktól. Az 1. csoport konstrukciói némileg pleiotrópok, azaz számos vad típusú gént, valamint a célgén(eke)t képesek aktiválni. Ezenkívül, az 1. csoportba tartozó konstrukciók expressziós termékeinek ligandumra adott reakciója viszonylag lassú. A 2. csoportba tartozó konstrukciók egy specifikus célgénre irányíthatók, és képesek korlátozni a transzkriptálandó gének számát. A 2.

csoportba tartozó konstrukciók expressziós termékeinek ligandumra adott reakciója nagyon gyors.

Az 1. és

2. csoportok rendszerébe olyan első konstrukció-sorozat tartozik, amely kiméra proteineket kódoló DNS-szekvenciákat tartalmaz, és rendszerint egy-három, általában egy-két eltérő konstrukcióból áll.

A rendszer általában magában foglal egy második konstrukció-sorozatot is, amely egy vagy több gén, rendszerint egy exogén gén expresszióját teszi lehetővé. Az exogén gén kifejezésen olyan gént értünk.

amelyet a sejt normális esetben nem expresszál, például a sej t természete, a sejt genetikai hibája miatt vagy amiatt, hogy a gén eltérő fajból származik, vagy hogy mutált vagy szintetikus gén, stb. Az ilyen gén kódolhat proteint, antiszensz molekulát, ribozimot, stb., vagy lehet olyan DNS-szekvencia, amely egy olyan endogén génhez kapcsolt vagy kapcsolni kívánt expressziós szabályozószekvenciát tartalmaz, amellyel az expressziós szabályozószekvencia normális esetben nem áll kapcsolatban. Ennek megfelelően, amint fentebb említettük, a konstrukció egy endogén gén

1i gandum-induká11 a expressziójához tartalmazhat egy exogén vagy rekombináns expressziós szabályozószekvenciát.

2. és 3. csoportba tartozó konstrukció által kódolt kiméra protein rendelkezhet egy intracelluláris irányító előnyös) (targeting) doménnel (mint ahogy az gyakran amely a kiméra proteint a kívánt kompartmentbe, például felületi membránra, sejtmagba, vezikulamembránra vagy más helyre irányítja, ahol a kívánt fiziológiai működés a kiméra protein ligandum-közvetítette oligomerizációjával (vagy legalább dimerizációjával) beindítható.

A kiméra protein tartalmaz egy második (kötő- vagy receptor)

domént,	amely legalább egy ligandum molekulához képes
kötődni.	Mivel a ligandum egynél több kötőhelyet vagy
epitópot	is tartalmazhat, a ligandum molekula a találmány
szerinti	kiméra proteinekkel dimereket vagy magasabb rendű

homo- vagy hetero-oligomereket képezhet. A kiméra protein kötő-doménjei egy vagy több kötőhelyet tartalmazhatnak, így a homo-oligomerek kétértékű ligandummal alakulhatnak ki. Ezen a módon a ligandum a kiméra proteint azáltal képes oligomerizálni, hogy két vagy több epitóppal rendelkezik, melyekhez egy második dómén kapcsolódhat, s így a kiméra protein magasabb rendű oligomerizációját teszi lehetővé.

A kiméra protein	tartalmaz még egy harmadik (akciós)
domént is, amely	a kiméra protein-molekulák kötő-domének
útján megvalósuló	oligomerizációjának hatására biológiai

működést képes beindítani. Ilyenformán, az akciós dómén a ligandum-közvetítette oligomerizáció eredményeként egy jel transzdukclójával kapcsolódhat. Az ilyen jel például, a jel-transzdukcióban szerepet játszó adott komponensektől függően egy vagy több gén transzkripciójának beindítását eredményezheti. A 15. ábrán egy jellemző kiméra proteint mutatunk be; e proteinben az intracelluláris irányitó-domén

egy mirisztát részt tartalmaz, a receptor dómén három FKBP12-ből, az akciós dómén pedig egy zéta alegységből áll.

Más kiméra proteinekben az akciós domének tartalmazhatnak transzkripciós faktorokat, amelyek az oligomerizáció hatására egy vagy több (endogén és/vagy exogén) célgén transzkripciójának beindítását eredményezik. Az akciós domének tartalmazhatnak olyan proteineket vagy protein-részleteket, amelyek vezikulamembránok felületi- vagy egyéb membránokkal képzett fúziójával állnak kapcsolatban; ilyenek például a SNAP és SNARE csoportba tartozó proteinek (ld. Sollner és mtsi. Natúré, 362, 318 és 353, 1993; Cell, 22, 43, 1993).

A) Felületi membránreceptor

A találmány egyik megvalósítási módjában a kiegészítő, tetszőleges kiméra proteinek felületi membránnal állnak kapcsolatban, és képesek egy vág több gén transzkripcióját eredményező jel transzdukciójára. A folyamat egy kölcsönhatási sorozatban (amely a transzkripciós faktorok célgénnel [génekkel] kapcsolatban álló promoter régiókhoz való kötődésében csúcsosodik ki) számos járulékos proteint foglal magában. Olyan esetekben, amikor a transzkripciós faktorok egyéb génekkel kapcsolatos promoter régiókhoz kötődnek, a transzkripció beindítása is megtörténik. Egy e megvalósítási mód szerinti kiméra proteint kódoló konstrukció jelzőszekvenciát kódolhat, amely érési folyamaton mehet keresztül, miáltal nem biztos, hogy jelen

··»* «4 ·« • · * · · • ·· « · · · 4 » · ·· <· ·· lesz az érett kiméra proteinben. A kiméra protein minden esetben tartalmaz (a) egy kötő-domént, amely egy előre meghatározott ligandumhoz képes kötődni; (b) adott esetben (sok megvalósítási módban azonban előnyösen) membrán-kötő domént, amely a fuzionált proteinek sejtfelületi membránra való áthelyezése és a protein sejtfelületi membránhoz kötött állapotban való domént vagy egy megtartása érdekében egy transzmembrán kapcsolt lipidet foglal magában; és (c) akciós doménként egy citoplazmikus jelindító domént. A citoplazmikus jelindító dómén képes olyan jel kialakítására, amely (transzkripciós indítórégiójában a kialakított jel felismerésére alkalmas felismerő szekvenciával rendelkező) gén transzkripcióját eredményezi.

Azt a gént, amelynek expresszióját a kiméra proteinből származó jel szabályozza, célgénnek nevezzük, függetlenül attól, hogy exogén vagy endogén, s hogy endogén vagy exogén (vagy hibrid) expressziós szabályozószekvencia expressziós szabályozása alatt áll. A kiméra protein molekuláris részét, amely a membránhoz való kötődést biztosítja, rögzítő-doménnek (retention domain) is nevezzük. Az alkalmas rögzítő-dómén lehet olyan molekula, amely közvetlenül a membrán lipidrétegéhez kötődik, például a membrán lipid részén keresztül vagy a membránon átnyúlva, stb. Ilyen esetekben a protein a membránra, különösen a sejtmembránra helyeződik át, és kötődik hozzá, mit ahogy a 15. ábrán látható.

*νν« •· ··* *»·* ·«*

- 40 Β) Se.itmagi transzkripciós faktorok

Egy másik tetszőleges első konstrukció olyan kiméra proteint kódol, amely a protein sejtmagba történő áthelyeződését biztosító celluláris irányítószekvenciát tartalmaz. Ez a (jel konszenzus) szekvencia sok bázikus aminosavat tartalmaz, melyeket kettős bázikus ismétlődésnek (bipartite basic repeat) nevezünk (áttekintést ld. Garcia-Bustos és mtsi, Biochimica et Biophysica Acta, 1071. 83-101, 1991). Ez a szekvencia a molekula bármely belső vagy N- vagy C-terminálishoz közeli részében megjelenhet, és azt eredményezi, hogy a kiméra protein a sejtmagon belülre kerül. A találmány egyik tárgyának gyakorlati megvalósításához legalább két (első sorozatú) kiméra proteinre van szükség; (1) egy akciós doménnel rendelkező kiméra proteinre, amely akciós dómén a célgénnel kapcsolatban álló transzkripciós indítórégió DNS-éhez kötődik, és (2) egy másik kiméra proteinre, amely akciós doménként transzkripciós aktiváló domént tartalmaz, amely az első kiméra protein DNS-kötő doménjével együtt egy célgén transzkripciójának beindítására képes. A két akciós dómén vagy transzkripciós faktor azonos vagy különböző protein-molekulából származhat.

A transzkripciós faktorok a gazdasejtre nézve lehetnek endogének vagy exogének. Amennyiben a transzkripciós faktorok exogének, de a gazdán belül működőképesek és képesek együttműködni az endogén RNS-polimerázzal (ami előnyösebb, mint ha exogén RNS-polimerázt igényelnének, amihez egy gént kellene bevinni), úgy a célgén transzkripciój ának szabályozásához egy második konstrukcióval egy (fuzionált transzkripciós faktorokkal működőképes) exogén promoter elemet biztosíthatunk. Ezzel a módszerrel a transzkripció beindítása az exogén promoter régióval kapcsolatos gén(ek)re — azaz a célgén(ek)re — korlátozható.

Számos transzkripciós faktor ismert, amely működéséhez két alegységet igényel. Más lehetőség szerint, olyan esetekben, amikor egy transzkripciós faktor két külön funkcionális doménra osztható (pl. egy transzkripciós aktivátor doménre és egy DNS-kötő doménre), oly módon, hogy önmagában mindkét dómén inaktív legyen, ezeket egymás közelébe hozva a transzkripciós aktivitás helyreáll. Az alkalmazható transzkripciós faktorok közé tartozik az élesztő GAL4, amely két doménre osztható (Fields és Song, ld. fentebb). A szerzők a GAL4(1-147)-SNFl és SNF4-GAL4(768-881) fúzióját alkalmazzák, ahol az SNF1 és SNF4 (kötő-doménként) a találmány tárgyát képező kötő-proteinekkkel helyettesíthető. Alkalmazhatók a GAL4 és VP16 vagy HNF-1 kombinációi. Az egyéb transzkripciós faktorok közé tartoznak a Jun, Fos ATF/CREB családok tagjai, az Octl, Spl, HNF-3, a szteroid receptor szupercsalád és hasonlók.

Egy DNS-kötő dómén és egy természetesen előforduló aktiváló dómén vagy módosított formája kombinációjának más lehetőség szerinti alkalmazásaként az aktiváló domént egy vagy több kötő-proteinnel helyettesíthetjük, amelyek egy transzkripciós aktiváló dómén és egy RNS-polimeráz (köztük az RNS-polimeráz II) közötti hídképzéssel kapcsolatosak. Ezen proteinek közé tartoznak a TAF proteinek, a TFII proteinek, különösen a B és D, stb. Ilyenformán e proteinek (vagy ezek kombinációinak) bármelyike alkalmazható, például fúzionált proteinek vagy azok kötő-motívumai, amelyek a DNS-kötő protein és az RNS-polimeráz között hidat képeznek, s lehetővé teszik a transzkripció beindítását. Az RNS-polimerázhoz legközelebb álló proteint a transzkripció beindítása érdekében előnyösen a DNS-kötő doménnel együtt alkalmazzuk. Ha szükséges, a szóban forgó konstrukciók a transzkripciós iniciációs komplex kialakításához három vagy több (általában nem több, mint négy) portéin összekapcsolódását biztosíthatják.

Akciós doménként transzkripciós aktiváló dómén helyett inaktiváló dómén is alkalmazható, mint például az ssn-6/TUP-l vagy a Krüpper-családba tartozó szuppresszor dómén. Ezen a módon a szabályozás a konstitutívan expresszált gén transzkripciójának leállítását eredményezi. Például génterápia esetében egy hormon, például növekedési hormon, vérproteinek, immunglobulinok, stb. konstitutív expresszálását biztosíthatjuk. Olyan konstrukciók alkalmazásával, amelyek egy ligandum-kötő doménhoz kapcsolt DNS-kötő domént tartalmazó kiméra proteint, és egy ligandum-kötő doménhoz kapcsolt inaktiváló domént tartalmazó másik kiméra proteint kódolnak, a gén expressziója ligandum

-közvetitette oligomerizációval gátolható.

Azokat a konstrukciókat, amelyek többek között transzkripciós aktiváló doménhoz vagy alegységhez, transzkripciós inaktiváló doménhoz vagy DNS-kötő doménhoz fuzionált ligandum-kőtő domént tartalmazó kiméra proteint kódolnak, az egyéb konstrukciókhoz leírtakkal megegyező módon tervezzük és állítjuk össze.

A transzkripciós faktor

N-terminálisát gyakran

1igandum-kötő dómén

C-terminálisához kapcsoljuk, bár néhány esetben ennek fordítottja történik, például akkor, ha egy faktor két külön dóménjét két különböző transzkripciós kiméra között osztjuk meg.

III. Exocitózis

A ligandum-közvetítette oligomerizációs mechanizmus másik alkalmazási lehetősége az exocitózis, ahol a ligandum a protein exportját, s nem a transzkripciót szabályozza. Ez a módszer egy vagy több szóban forgó protein expressziójával együtt a szóban forgó proteintek) szekréciós jelző-szekvencia útján történő szekréciója biztosításának alternatív lehetőségeként alkalmazható. E megvalósítási mód két különböző első konstrukciót foglal magában. Az egyik olyan kiméra proteint kódol, amely a proteint a vezikula-membránnal egyesíteni kívánt vezikulához irányítja (Sollner és mtsi, ld. fentebb). Vezikula-kötő proteinként alkalmazható (külön-külön vagy kombinációban) a VAMP (synaptobrevin), SNC2, rab3, SEC4, synaptotagmin, stb. Sejtmembrán proteinként a syntaxin, SSO1, SSO2, neurexin, stb. alkalmazható (szintén külön-külön vagy kombinációban). A másik konstrukció mirisztoil jelzőszekvencia, más plazmamembrán irányítószekvencia (pl. a prenilációhoz) vagy transzmembrán rögzító-domén falhasználásával a felületi membránhoz való transzportot biztosítja. A kódolt proteinek leírása a fenti hivatkozásokban található meg, s egésze vagy funkcionális része akciós doménként szolgálhat. E konstrukciók egy vezikulához való transzporthoz pontosan kódolt exogén protein vagy (az endogén protein exportjának fokozása érdekében) egy endocitózisos endogén protein expresszálásával kapcsolatban alkalmazhatók.

Az exocitózishoz különféle mechanizmusok alkalmazhatók. A sejt típusától és attól függően, hogy a sejtben az egy vagy több, a ligandum által aktivált érzékeny elemmel rendelkező kosntrukció egy vagy több, vezikulához kötött proteint vagy celluláris proteint kódolhat. Különösen jelentős a VAMP és a syntaxin kombinációja. Más lehetőség szerint, biztosíthatjuk az exocitózist szabályozó (nem korlátozó jellegű) proteinek konstitutív expresszióját, valamint az exocitózist korlátozó protein ligandum által szabályozott expresszióját is. Végül, biztosíthatjuk az exocitózissal kapcsolatos kiméra proteinek konstitutív expresszióját, oly módon, hogy az exocitózist a kiméra proteinek ligandummal történő oligomerizációja szabályozza. Megfelelő kötő-domének alkalmazásával aktív komplex kialakítása és/vagy a vezikula protein(ek) sejtmembrán felületi proteinnel ligandumon keresztül megvalósuló kapcsolódása érdekében különböző kiméra proteinek vezikula felszínén történő oligomerizációját valósíthatjuk meg. A kiméra proteinek a ligandumok hiányában nem biztosítják az exocitózist, köszönhetően a ligandum módosításainak (pl. deléciók, mutációk, stb.), amelyek jelentősen csökkentik az exocitózist irányító proteinek közötti affinitást. Ezek a módosítások az egyes proteinek átfedő fragmenseinek alkalmazásával és az aktivitást fenntartó fragmens azonosításával könnyen meghatározhatók. A fragmensek alanin szubsztitúciókkal tovább módosíthatók, hogy meghatározzuk azon aminosavakat, amelyek alapvetően befolyásolják a kötődést (Beohncke és mtsi, J. Immunoi., 150. 331-341, 1993; Evavold és mtsi, J. Immunoi., 148. 347-353, 1992).

Amint fentebb leírtuk, a vezikula üregében összeállított proteinek, valamint az exocitózissal kapcsolatos fúzionált proteinek konstitutívan vagy indukálhatóan expresszálhatók. Az exocitózis céljától, valamint attól függően, hogy endogén vagy exogén proteinről van-e szó; hogy az exportálni kívánt proteinek konstitutívan vagy indukálhatóan expresszálódnak-e; hogy az exocitózissal kapcsolatos fúzionált proteinek és az exportálni kívánt proteinek transzkripciójának beindításához ugyanazt a ligandumot alkalmazzuk-e; vagy hogy a különböző proteineket különböző indukálható jelek hatása alá kívánjuk-e helyezni; meghatározhatjuk az expresszió szabályozásának módját. Az egyik megvalósítási módban az exocitózisnak kell az egyetlen, ligandum által szabályozott eseménynek lenni. Más megvalósítási módokban az exocitózison kívül legalább egy proteint kell a ligandum szabályozása alá vonni.

A protein (fiziológiai aktivitásának vesztesége nélkül) egy vezikulába történő áthelyezéséhez alkalmazható celluláris irányítószekvencia bevitelével különböző proteineket módosíthatunk.

Szállító mechanizmusként az exocitőzist alkalmazva a protein nagy lokalizált szintjének vagy az érrendszerben nagy protein-koncentráció kialakítása érdekében (a gazdaszervezettől függően) rövid időn belül viszonylag nagy mennyiségű dózis szállítható. A szóban forgó proteinek közé tartoznak például az inzulin, szövetplazminogén aktivátor, citokinek, eritropoetin, kolóniastimuláló faktorok, növekedési faktorok, gyulladásos peptidek és sejtmigrációs faktorok.

A proteinek vezikulába történő irányításához alkalmas kódoló szekvenciák az exocitózissal kapcsolatos vezikula-kötő proteinekből származtathatók (pl. Sollner és mtsi, ld. fentebb).

Az oligomerizációs mechanizmus másik alkalmazási lehetősége a protein-lebomlás vagy inaktiválás szabályozása. Például, egy találmány szerinti viszonylag stabil, illetve hosszú élettartamú kiméra protein a találmány szerinti különböző kiméra proteinekkel megvalósuló ligandum-közvetitette oligomerizációjával destabilizálható, illetve lebomlásra

késztethető,	mely kiméra proteinek viszonylag rövid
élettartamúak	vagy másképpen destabilizálják vagy késztetik
az oligomert	lebomlásra. Ebben a megvalósítási módban a

ligandum-közvetitette oligomerizáció a proteinnek rövidebb felezési időt biztosítva annak biológiai működését szabályozza. Az utóbbi kiméra protein tartalmazhat egy olyan domént, amely a proteint a lizozimhoz irányítja, vagy amely a proteint a citoszolban, sejtmagban vagy nem lizoszomális organellumban lejátszódó proteolitikus hasításra érzékennyé teszi.

A proteinek sejten belüli felezési idejét számos tényező befolyásolja, mint például az említett proteinen belül prolinban, glutaminsavban, szerinben és treoninban gazdag (PEST) rövid aminosav-szekvenciák jelenléte, továbbá hasonló funkciójú egyéb szekvenciák, proteázokra érzékeny hasítási helyek jelenléte és az ubikitinizáció állapota. Az ubikitinizáció egy protein egy vagy több, rövid poliepeptid-láncból álló egységgel (ubikitinnel) végzett módosítása, ami a proteineket lebomlásra készteti. A proteinek ubikitinizációjának mértéke elsősorban a folyamaton átesett protein N-terminális aminosavának, és az N-terminális közelében egy vagy több egyedülálló lizin-gyök azonosításával határozható meg.

IV. Egyéb szabályozó-rendszerek

Az egyes proteinekkel kapcsolatos konkrét aktivitások oligomerizációjával szabályozható egyéb biológiai funkciók közé tartozik a protein-kináz vagy -foszfatáz aktivitás, reduktáz aktivitás, ciklooxigenáz aktivitás, proteáz aktivitás vagy bármely más, alegységek kapcsolódásától függő enzimatikus reakció. Ezenkívül megvalósíthatjuk a G proteinek sejtciklussal kapcsolatos receptor proteinnel, például ciklinekkel, cdc kinázokkal, többegységű méregtelenítő enzimekkel való kapcsolódását is.

V. A konstrukciók komponensei

Az

1. és 2.

proteinekkel kapcsolatos második vagy további tetszőleges konstrukciók (célgén-konstrukciók) transzkripciós indítórégiót tartalmaznak, amely a jelzett célfelismerő szekvenciával vagy érzékeny elemmel rendelkezik, miáltal érzékeny az aktivált receptorból vagy aktivált transzkripc iós faktorokból származó jelindításra, ami azt eredményezi, hogy legalább egy gén szóban forgó szekvenciává, általában mRNS-sé íródik át (transzkripció), amelynek transzlációja egy protein expresszióját és/vagy egyéb gének szabályozását eredményezi, pl. antiszensz, transzkripciós faktorok expresszióját, membrán-fúziós proteinek expresszióját, stb.

A különböző célokra és helyekre különféle kötő-doméneket és különféle citoplazmikus doméneket kell alkalmazni. A felületmembránnal kapcsolatos kiméra proteinek esetében, ha a ligandum-kötő dómén extracelluláris, a kiméra proteint úgy alakíthatjuk ki, hogy különböző felületi membránproteinek közül kiválasztott extracelluláris domént tartalmazzon.

Hasonlóan, felületmembrán proteinek különböző, jelátalakításra képes citoplazmikus vagy intracelluláris doménjeit alkalmazhatjuk, attól függően, hogy a citoplazmikus rész mely endogén géneket szabályozza.

Amennyiben a kiméra protein belső (a felületmembrán

-proteinhez képest), vagy egy organellummal (pl. sejtmaggal.

vezikulával, stb. ) áll kapcsolatban, a ligandum-kötő protein dómén azokra a doménekre korlátozódik, amelyek a felületi membránt vagy más membránt keresztülhatolni képes molekulákhoz tudnak kötődni. Ilyenformán ezek a kötő-domének általában kis méretű, természetben előforduló vagy szintetikus ligandum molekulákhoz kötődnek, amelyek nem tartalmaznak proteineket vagy nukleinsavakat.

A) Citoplazmikus domének

Egy 1. csoportba tartozó kiméra protein receptor a különböző sejtfelületi membránreceptorok (beleértve azok muteinjeit is) egyikéből származó citoplazmikus domént tartalmaz, mely esetben ismert a citoplazmikus doménnel kapcsolatos transzkripció indításában szerepet játszó felismerő szekvencia vagy egy ilyen szekvenciára érzékeny gén. A szóban forgó mutáns receptorok egy célgén transkripciós aktiválását különválasztják a gének aktiválásától, ami káros mellékhatásokkal, mint pl. szabályozatlan sejtnövekedéssel vagy a citokinek nem megfelelő kibocsátásával állhat kapcsolatban. A receptorral kapcsolatos, különösen jelentős citoplazmikus domének az alábbi jellemzőkkel rendelkeznek: a receptor-aktiválás a sejtes gazdában viszonylag kevés (előnyösen 100-nál kevesebb), és általában ártalmatlan gén transzkripciójának beindítását eredményezi; a receptor

-aktiválással beindított egyéb, transzkripcióhoz szükséges faktorok a sejtes gazdában vannak jelen; a célgének mellett aktivált egyéb gének nem befolyásolják azt a célt, melyhez ezeket a sejteket alkalmazni kívánjuk; a citoplazmikus dómén oligomerizációja vagy más rendelkezésre álló mechanizmus jelindítást eredményez; a citoplazmikus dómén kívánt ligandum-kötő doménhoz való kapcsolódása nem befolyásolja a jelölést. Számos különböző citoplazmikus dómén ismert. E domének közül sok tirozin-kináz, vagy tirozin-kinázzal komplexet képző dómén, pl. CD3-zéta, IL-2R, IL-3R, stb.

(áttekintést ld. Cantley és mtsi, Cell, 64. 281, 1991). A keresztkötés-képezéssel (azaz dimerizációval) aktivált tirozin-kináz receptorok közé tartozik (elsőként Yardén és Ulrich [Annu. Rév. Biochem., 57. 443, 1988] által javasolt nevezéktan alapján) az I. alosztály: EGF-R, ATR2/neu, Her2/neu, HER3/c-erb-3, Xmrk; II. alosztály: inzulin-R, IGF-l-R (inzulin-szerű növekedési faktor receptor), IRR;

III. alosztály: PDGF-R-A, PDGF-R-B, CSF-l-R (M-CSF/c-Fms), c-kit, STK-l/Flk-2; és IV. alosztály: FGF-R, flg [savas FGF], bek [bázisos FGF]; neutrofil tirozin-kinázok: Trk család, ebbe tartozik az NGF-R, Rorl,2. A keresztkötés-képzés hatására tirozin-kinázokkal kapcsolódó receptorok közé tartozik a CD3-zéta család: CD3-zéta és CD3-éta (elősorban T-sejtekben található, a Fyn-nel kapcsolódik); az Fc Rí béta és gamma lánca (elsősorban hízósejtekben és bazofil sejtekben találhatók); az Fc RIII/CD16 gamma lánca (elsősorban makrofágokban, neutrofil sejtekben és természetes killer sejtekben található); CD3-gamma, CD3-delta, CD3-epszilon (elsősorban T-sejtekben találhatók); Ig-alfa/MB-1 és Ig-béta/B29 (elsősorban B-sejtekben találhatók). Sok citokin és növekedési faktor receptor közös β-alegységekkel kapcsolódik, melyek tirozin-kinázokkal és/vagy más jelölő molekulákkal lépnek kölcsönhatásba, s amelyek a találmány szerinti kiméra proteinekben citoplazmikus doménként alkalmazhatók. Ezek közé tartozik (1) a GM-CSF, IL-3 és IL-5 receptorok közös S-alegysége; (2) az IL-6, leukémia-gátló faktor (LIF), csilló neutrofil faktor (CNTF), onkosztatin M és IL-11 receptorokkal kapcsolt gpl30 β-lánc; (3) az IL-4, IL-7 és IL-13 (és esetleg IL-9) receptorokkal kapcsolt IL-2 receptor gamma alegység; és (4) az IL-2 receptor β-lánca, amely homológ a G-CSF receptor citoplazmikus dóménjével.

Citoplazmikus domének forrásaként szintén alkalmazható a receptorok interferon családja, melyek közé az alfa, béta és gamma interferon tartozik (melyek a tirozin-kinázok JAK, Tyk családjának egy vagy több tagját képesek aktiválni), valamint a növekedési hormon, eritropoetin és prolaktin receptorai (amelyek szintén képesek aktiválni a JAK2-t).

A citoplazmikus domének egyéb forrásai közé tartozik a sejtfelületi receptorok TGF-B családja (áttekintést ld. Kingsley, D., Genes and Development, fi, 133, 1994). Ez a receptorcsalád citoplazmikus doménjeiben szerin/treonin kinéz aktivitást tartalmaz, melyről úgy tartjuk, hogy a keresztkötés-képzés aktiválja.

A transzkripciós faktorok aktiválásával és inaktiválásával kapcsolatos tirozin-kinázok különös jelentőséggel bírnak abban a tekintetben, hogy specifikus, szabályozható reakcióutakat biztosítanak, amelyek exogén gén expressziójának beindítására vagy gátlására alkalmazhatók.

Az 1. táblázatban receptorokat és a receptorokkal kapcsolatos jellemzőket, valamint géneket aktiváló sejtmagi reagáló elemeket mutatunk be. A felsorolás nem teljes, de példákat mutat be a talámányban alkalmazható rendszerekre.

Sok esetben mutációval módosított citoplazmikus doméneket nyerhetünk, ha az átalakított jel eltér a vad típustól, ami a vad típusú reakcióúthoz (utakhoz) képest korlátozott vagy eltérő reakcióutat eredményez. Például a növekedési faktorok (mint pl. EGF és FGF) esetében olyan mutációkról számoltak be, amelyek esetében a jel független a sejt növekedésétől, de a c-fos-sel megmarad (Peters és mtsi.. Natúré, 358, 678, 1992).

A tirozin-kináz receptorok a test egészében mindenféle sejtben megtalálhatók. Ezzel szemben, a CD3-zéta család, az lg család és a limfokin β-lánc receptorcsalád elsősorban vérképzési sejtekben, különösen T-sejtekben, B-sejtekben, hízósejtekben, bazofil sejtekben, makrofágokban, neutrofil sejtekben és természetes killer sejtekben található meg. Az NF-AT transzkripcióhoz szükséges jelek elsősorban az antigén receptor zéta láncából, és kisebb mennyiségben a CD3-gamma, -delta és -epszilon láncból származnak.

A citoplazmikus dómén természetes állapotában vagy csonkított, módosított vagy mutációval megváltoztatott formában legalább kb. 10 aminosavból, rendszerint legalább kb. 30 aminosavból, gyakrabban legalább kb. 50 aminosavból, és általában nem több, mint 400 aminosavból, rendszerint nem több, mint 200 aminosavból áll (ld. Rómeó és mtsi, Cell, 68, 889-893, 1992). Annak ellenére, hogy bármelyik fajta alkalmazható, rendszerint a gazdasejt szempotjából endogén fajtákat részesítjük előnyben. Sok esetben azonban más fajból származó citoplazmikus dómén alkalmazható hatásosan.

A feltüntetett citoplazmikus domének bármelyike alkalmazható, továbbá azok is, amelyek jelenleg ismertek vagy amelyeket esetleg ezután fedeznek fel.

1. TÁBLÁZAT

Ligandum	DNS elem	Kötő faktor(ok)	Gén	Hivatkozás
Inzulin és	cAMP	LRFI	jun-B	Mól. Cell Bioi. , 12,
egyebek	érzékeny	elem	sok gén	4654, (1992),
	(ere)			PNAS, 22, 3439,
PDGF, FGF	SRE	SRF/SR	c-fos	Mól. Cell Bioi. , 12,
TGF és mások		EBP		4769, (1992)
EGF	VL30		RVL-3	Mól. Cell Bioi. , 12,
	RSRF		vírus	2793, (1992), ugyan-
			c-jun	ott, 12, 4472 (1992)
IFN-alfa	ISRE	ISGF-3		Gene Dev., 2, 1362,
				(1989)
IFN-gamma	GAS	GAF	GBP	Mól. Cell Bioi., 11,
				182, (1987)
PMA és		AP-1	sok	Cell, 12, 729-739,
TCR			gén	(1987)
TNF		NFkB	sok	Cell, 22, 1019-1029,
			gén	(1990)
Antigén	ARRE-1	OAP/O	sok	Mól. Cell Bioi., 2,
		ct-1	gén	1715, (1988)
Antigén	ARRE-2	NFAT	IL-2	Science, 241, 202,
			enhancer (1988)

A transzkripciós faktorokkal kapcsolatos egyéb kiméra proteinek többnyire elsősorban abban különböznek, hogy olyan celluláris irányítószekvenciákkal rendelkeznek, amelyek a kiméra proteineket a sejtmagi membrán belső oldalára irányítják, akciós doménekként pedig transzkripciós faktorokat vagy azok részeit tartalmazzák. A transzkripciós faktor akciós domének rendszerint DNS-kötő doménekre és aktivációs doménekre oszthatók. DNS-kötő domént kialakíthatunk egy vagy több ligandum-kötő doménnel, és aktivációs domént egy vagy több ligandum-kötő doménnel. Ilyen módon a DNS-kötő dómén sokféle kötő-doménhez és/vagy aktivációs doménhez kapcsolható. A felületmembránnal kapcsolatos, jel transzdukcióhoz való kiméra proteinek leírása alkalmazható a genom DNS-hez történő közvetlen kötődéshez való kiméra proteinekre is. Az exocitózissal kapcsolatos kiméra protein elsősorban abban különbözik, hogy proteinek a jelátalakító citoplazmikus proteinek helyett a vezikulamembrán és felületi membrán közötti fúzióval állnak kapcsolatban.

B) Celluláris irányító domének

A jelzőpeptid vagy -szekvencia a kiméra protein sejtfelületi

membránhoz	való szállítását biztosítja, miközben ugyanezen
vagy más	szekvenciák a kiméra proteinek sejtfelületi
membránhoz	való kötődését kódolhatják. Bár a

jelzőszekvenciák általános motívummal rendelkeznek (két vagy három N-terminális poláros aminosavat 15-20, elsősorban hidrofób aminosav követ), az egyes aminosavak sokfélék lehetnek. Következésképpen lényegében bármely olyan jelzőpeptid alkalmazható, amely működőképes a gazdában, és kapcsolódhat a kiméra protein egyik vagy másik doménjével. Normális esetben a jelzőpeptid érési folyamaton megy át, s nem marad meg az érett kiméra proteinben. A jelzőpeptidet kódoló szekvencia a kódolószekvencia 5'-végén található, s metionin kezdőkodont tartalmaz.

A membrán-retenciós (rögzítő) dómén kiválasztása a találmány szempontjából nem kulcsfontosságú, mivel azt találtuk, hogy az ilyen membrán-retenciós domének lényegében helyettesíthetők, s az aktiváláshoz szükséges másik membránrégióhoz való kötődéshez nincs szükség kulcsfontosságú aminosavra. Ennek megfelelően, a membrán-retenciós dómén bármely hagyományos felületi membránból vagy citoplazmikus doménból izolálható, függetlenül attól, hogy a gazdasejtre nézve endogén vagy sem.

Legalább két különböző membrán-retenciós dómén létezik: egy transzmembrán-retenciós dómén, amelynek aminosav-szekvenciája átnyúlik a membránon; és egy lipid membrán-retenciós dómén, amely lipid kapcsolódik a sejtfelületi membrán lipidjeivel.

Az összeállítás könnyebbsége érdekében többnyire a citoplazmikus dómén vagy a receptor dómén transzmembrán doménje alkalmazható, ami egyszerűsítheti a fúzionált protein kialakítását. A lipid membrán-retenciós dómén esetében azonban a processing jelet az N-terminális membránhoz való kötődése érdekében rendszerint a kódoló szekvencia 5'-végéhez, a C-terminális kötődése érdekében pedig a 3'-vég közelében adjuk. A lipid membrán-retenciós dómén kb. 12-24 szénatomos lipiddel, közelebbről 14 szénatomos lipiddel, konkrétan glicinhez kapcsolt mirisztoil molekulával rendelkezik. A lipid kötő-domén jelzöszekvenciája N-terminális szekvencia, amely nagyon különböző lehet; rendszerint a 2. aminosavként glicint, 7. aminosavként pedig lizint vagy arginint tartalmaz (Káplán és mtsi, Mól. Cell Bioi., β, 2435, 1988). A lipidmembrán kötődéshez poszt-transzlációs érési folyamaton átesett peptid-szekvenciákat Carr és mtsi. (PNAS USA, 72, 6128,

1988), Aitken és mtsi. (FEBS Lett., 150. 314, 1982), Henderson és mtsi. (PNAS USA, 80. 319, 1983), Schulz és mtsi. (Virology, 123. 2131, 1984), Dellman és mtsi. (Natúré, 314. 374, 1985) írták le (áttekintést ld. Ann. Rév. of Biochem, 27, 69, 1988). Egy szóban forgó aminosav-szekvencia az MGSSKSKPKDPSQR szekvenciát foglalja magában. A fúzionált receptor proteinben ilyen szekvencia kódolósához különböző DNS-szekvenciák alkalmazhatók.

A transzmembrán dómén általában kb. 18-30 aminosavval, gyakrabban kb. 20-20 aminosavval rendelkezik, s a középső rész elsősorban semleges, apoláris aminosavakból áll, a dómén végei pedig poláris, gyakran töltéssel rendelkező aminosavakból állnak, melyek közül általában 1-2 rendelkezik töltéssel (a transzmembrán dómén végén), melyeket hélixrontó gyökök, pl. prolin és glicin követnek.

C) Ligandumkötő dómén

A találmány szerinti bármely kiméra proteinek ligandumkötő (dimerizációs vagy receptor) doménje bármely olyan dómén lehet, amely természetes vagy nem természetes, előnyösen nem természetes, szintetikus ligandum alkalmazásával indukciót tesz lehetővé, illetve ahhoz kötődni képes. A kötő-domén a konstrukció természetétől és a ligandum kiválasztásától függően a sejtmembránra vonatkoztatva lehet belső vagy külső. Sokféle kötő-protein ismert (köztük a receptorok), belértve a fentebb említett citoplazmikus régiókkal kapcsolatos kötő-proteineket. Különös jelentőségűek azok a kötő-proteinek, amelyekhez ismert vagy könnyen előállítható ligandumok (előnyösen kis szerves ligandumok) léteznek. Ezen receptorok vagy ligandum-kötő domének közé tartoznak az FKBP-k és a ciklofilin receptorok, a szteroid receptorok, a tetraciklin receptor, a fentebb említett receptorok és hasonlók, valamint a nem természetes receptorok, melyek antitestekből nyerhetők, elsősorban a nehéz vagy könnyű lánc alegység, azok mutált szekvenciái, sztochasztikus eljárásokkal, kombinációs szintézissel előállított véletlenszerű aminosav-szekvenciák, stb. A receptor domének többnyire legalább kb. 50 aminosavból és kevesebb, mint kb. 350 aminosavból, rendszerint kevesebb, mint 200 aminosavból állnak, akár a természetes dómén alakjában, akár annak csonkított aktív részéből álló alakban. A kötő-domén előnyösen kis méretű (25 kD-nál kisebb molekulatömeg, a virális vektorokban való hatékony transzfekció elősegítése érdekében), monomer (ez kizárja az avidin-biotin rendszert), nem immunogén, továbbá szintetikus módszerekkel előállítható, sejt-permeábilis, nem toxikus ligandumokkal kell rendelkeznie, amelyek a dimerizációhoz alakíthatók ki.

A receptor dómén a kiméra proteint kódoló konstrukció típusától és az alkalmas ligandum hozzáférhetőségétől függően intracelluláris vagy extracelluláris lehet. A hidrofób ligandumok esetében a kötő-domén a membrán mindkét oldalán elhelyezkedhet, de a hidrofil ligandumok, különösen a protein ligandumok esetében a kötő-domén rendszerint (a sejtmembránhoz képest) külső, bár létezik a ligandum olyan alakba történő internalizálásához alkalmas transzport-rendszer, mely alakban alkalmas a kötődéshez. Az intracelluláris receptorok esetében a konstrukció a receptor dómén szekvenciájától 5' vagy 3' irányban lévő Jelzőpeptidet és transzmembrán domént kódolhat, vagy a receptor dómén szekvenciájától 5' vagy 3' irányban lipidkapcsolódási jelzőszekvenciával rendelkezhet. Amennyiben a receptor dómén a jelzőpeptid és a transzmembrán dómén között helyezkedik el, a receptor dómén extracelluláris lesz.

A konstrukció receptort kódoló részét különböző célok érdekében mutagenezisnek vethetjük alá. A mutagenezissel kezelt protein nagyobb kötési affinitást biztosíthat, lehetővé teszi a természetben előforduló receptor és a mutagenezissel kezelt receptor ligandum alapján történő megkülönböztetését és lehetőséget nyújt receptor-ligandum pár kialakításához, stb. A receptort érintő változás lehet a kötőhelyen jelenlevő aminosavakban bekövetkező változás, kombinációs technikával végzett random mutagenezis, amely esetben a kötőhellyel kapcsolatos aminosavak kodonjai vagy más, konformációs változásokkal kapcsolatos aminosavak kodonjai oly módon vethető(k) alá mutagenezisnek, hogy az adott aminosav kodonját (kodonjait) más ismert kodonokra cseréljük vagy véletlenszerű cseréket végzünk, s a kapott proteineket megfelelő prokarióta gazdában expresszálva kötési tulajdonságaikra szűrjük (sőréénéljük). Például, az FKBP12 36. fenilalaninját alaninra és/vagy 37. aszpraginsavát glicinre vagy alaninra változtatjuk, hogy az FK506 vagy FK520 9. vagy 10. helyéhez szubsztituenst illesszünk. Azok az FKBP12 molekulák, amelyek a 26. tirozin, 36. fenilalanin, 37. aszparaginsav, 82. tirozin és 99. fenilalanin közül egy vagy több helyett valint, alanint, glicint, metionint vagy egyéb kis méretű aminosavat tartalmaznak, különösen jelentősek a 9. és/vagy 10. szénatomjuknál módosításokat tartalmazó FK506 és FK-520 típusú ligandumok receptor doménjeiként.

Kötő-doménként antitest alegységek, pl. nehéz vagy könnyű lánc, közelebbről a fragmensek, méginkább a variábilis régió része vagy egésze, vagy a könnyű és nehéz lánc nagy affinitású kötés kialakításához létrehozott fúziói alkalmazhatók. Antitesteket állíthatunk elő fiziológiailag elfogadható haptén sajátságú molekulák ellen, s az egyes antigén alegységeket kötési affinitásra szűrhetjük (screening). Az alegységeket kódoló cDNS-t izolálhatjuk, a konstans régió és a variábilis régió részeinek deléciójával vagy a variábilis régió mutagenezisével, stb. módosíthatjuk, hogy a ligandumhoz megfelelő affinitással rendelkező kötő-protein domént állítsunk elő. Ilyen módon ligandumként vagy a ligandum epitópjának kialakításához majdnem valamennyi haptén sajátságú vegyület alkalmazható. Olyan esetekben, amikor a kötő-domén ismert, és létezik a kötődéshez megfelelő ligandum, az antitest-egységek helyett természetes receptorok is alkalmazhatók.

A proteineket kódoló szekvenciák in vitro mutagenezisének vagy kombinációs módosításának alkalmazásával protein-könyvtárakat állíthatunk elő, amelyeket különböző ligandumokra vonatkozó kötési affinitásra sereenelhetünk. Például, egy kötő-proteint kódoló DNS-szekvencia egy vagy több helyén véletlenszerűen 1-5, 10 vagy több kodon hosszúságú szekvenciát rendezhetünk el, s expressziós konstrukciót készítve azt egysejtű mikroorganizmusba vihetjük, melyben könyvtárat alakíthatunk ki, amelyet egy (vagy előnyösen több) ligandumhoz való kötési affinitásra screenelhetünk. Kötő-doménként később azokat a legnagyobb affinitást mutató szekvenciákat alkalmazzuk, amelyek kompatibilisek azokkal a sejtekkel, amelyekbe be kívánjuk juttatni. A ligandum endogén proteinekhez való kötődési szintjének meghatározása érdekében a ligandumot az alkalmazni kívánt gazdasejttel screeneljük. A kötési profil úgy határozható meg, hogy a mutagenizált kötő-doménra vonatkozó kötési affinitást az endogén proteinre vonatkozó kötési affinitással súlyozzuk. Azokat a ligandumokat alkalmazzuk, amelyek a legjobb kötési profillal rendelkeznek. A fentiek kivitelezéséhez fág kijelzéses (phage display) technikát alkalmazhatunk.

D) Mulhimerizáció

Az átalakított (transzdukált) jel normális esetben a kiméra protein-molekulák ligandum-közvetítette oligomerizációjából származik, azaz a ligandum kötődését követő oligomerizáció eredménye, bár egyéb kötési események, például alloszterikus aktiválás is használható a jelindításhoz. A kiméra protein konstrukciója a különböző domének sorrendjének és az egyes domének ismétlődései számának megfelelően változik. Az 5'-3' irányú transzkripcióban az extracelluláris receptor dómén esetében a konstrukció olyan proteint kódol, amely jelző pepiidből, receptor doménből, transzmembrán doménból és jelindító doménból áll, amely utóbbi intracelluláris (citoplazmikus).

Ha azonban a receptor dómén intracelluláris, eltérő sorrendet alkalmazhatunk, ahol a jelzőpeptidet a receptor dómén vagy a jelindító dómén követi, s utánuk következik a többi dómén (vagy több receptor dómén esetében a jelindítő dómén a receptor domének közé ékelődhet). A jelindító dómén aktív helye általában a

- 63 szekvencia belsejében helyezkedik el, s nem igényel szabad C-terminálist. Valamennyi dómén, különösen a receptor dómén, jelen lehet több példányban, rendszerint kb. ötnél nem több, előnyösebben kb. háromnál nem több ismétlődéssel.

A receptor sokszorosításához a felületimembrán kiméra proteinek receptor dóménjeihez való ligandumnak abban az értelemben kell többszörösnek lennie, hogy legalább két kötőhellyel rendelkezzen, amelyek mindegyike képes a

receptor	doménhez kötődni. A szóban forgó ligandumok
előnyösen	kis szintetikus szerves molekulák dimerei vagy
magasabb	rendű oligomerei (általában tetramernél nem

nagyobbak), melyekben az egyes molekulák molekulatömege legalább kb. 150 D, és kb. 5 kD-nál, rendszerint kb. 3 kD nál kisebb. Különböző szintetikus ligandum-receptor párok alkalmazhatók. Például, a természetes receptorokat alkalmazó megvalósítási módokban az FK506 dimer FKBP receptorral, a dimerizált ciklosporin A a ciklofilin receptorral, a dimerizált ösztrogén egy ösztrogén receptorral, a dimerizált glükokortikoidok glükokortikoid receptorral, a dimerizált tetraciklin a tetraciklin receptorral, a dimerizált D vitamin a D vitamin receptorral, stb. alkalmazható. Más lehetőség szerint magasabb rendű ligandumok, pl. trimer ligandumok is alkalmazhatók. A nem természetes receptorokat, például antitest-alegységeket, módosított antitest-alegységeket vagy módosított receptorokat, stb. alkalmazó megvalósítási módokban számos különböző molekula alkalmazható. Ezen ligandum egységek lényeges jellemzője.

- 64 hogy nagy affinitással kötik a receptort (előnyösen Ka < ΙΟ^-8 M) és képesek kémiailag dimerizálódni.

A ligandum különböző epitópokat tartalmazó különféle receptorkötő molekulákkal (melyeket HED reagenseknek is neveznek, mivel azonos vagy különböző kiméra proteinek hetero-dimerizációját vagy hetero-oligomerizációját képesek közvetíteni) rendelkezhet. Például, a ligandum FK506 vagy FK506 típusú molekulát és CsA vagy ciklosporin típusú molekulát tartalmazhat. Mindkét molekula kovalensen kapcsolódik egy közös linker molekulához. Az ilyen ligandum egy első és egy második kiméra protein oligomerizációsának közvetítéséhez lehet alkalmas, amely első kiméra protein egy FK506 típusú molekulához kötődni képes receptor domént (pl.

FKBP12-t), és a második kiméra protein egy ciklosporin A típusú molekulához kötődni képes receptor domént (pl. ciklofilint) tartalmaz.

VI. Sejtek de előnyösen eukarióta sejteket alkalmazunk belértve növény-, élesztő-, féreg-, rovar- és emlőssejteket.

Jelenleg különösen előnyösek az emlőssejtek, különösen a sejtjei;

legelőnyösebbek az emberi sejtek, de bármilyen emlőssejt alkalmazható, különösen háziállatok, mint a ló, szarvasmarha, rágcsálók, juh, kutya, macska, stb. sejtjei. E fajok különböző típusú sejtjei alkalmazhatók, mint például a vérképzősejtek, idegsejtek, kötőszöveti sejtek, bőrsejtek, nyálkahártya-sejtek, sztrómasejtek, izomsejtek, lépsejtek, retikulo-endoteliális sejtek, epitél- és endotél sejtek, májsejtek, vesesejtek, gyomor-bélsejtek, tüdősejtek, stb. Különösen jelentősek a vérképzési sejtek, melyek közé a limfoid vagy gerincevelői monocita sejtvonalak magvas sejtjei tartoznak. Különösen fontosak a T- és B-sejtvonalak tagjai, a makrofágok és monociták, valamint a mioblasztok és fibroblasztok. Szintén igen jelentősek a stem-sejtek és az őssejtek, mint pl. a vérképző sejtek, idegsejtek, sztrómasejtek, izomsejtek májsejtek, tüdősejtek, gyomor-bélsejtek, stb.

A sejtek lehetnek autológok, szingénikusak, allogénikusak, sőt néhány esetben xenogénikusak. A sejteket módosíthatjuk a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) profil megváltoztatásával, a működőképes I. osztályú MHC molekulák kialakulásának megakadályozása érdekében a Ba-mikroglobulin inaktiválásával, a II. osztályú MHC molekulák inaktiválásával, egy vagy több MHC molekula expressziójának megvalósításával, a citotoxikus aktivitással kapcsolatos gének expresszióját fokozva vagy gátolva a citotoxikus képességek fokozásával vagy inaktiválásával, stb.

Néhány esetben lényegesek lehetnek specifikus kiónok vagy oligoklonális sejtek, mely sejtek egy bizonyos specifitással rendelkeznek, mint pl. a specifikus antigén-specifitással vagy célhely-specifitással rendelkező T-sejtek és B-sejtek.

VII. Ligandumok

A találmányban a kiméra protein-molekulák oligomerizációjának elősegítéséhez sokféle ligandum alkalmazható, belértve a természetesen előforduló és a szintetikus anyagokat egyaránt. Egy ligandum kiválasztásának alkalmazható és könnyen vizsgálható, ill. mérhető feltételei a következők: (A) a ligandum fiziológiailag elfogadható (azaz mentes a sejtet vagy állatot [amelyben a ligandumot alkalmazni kívánjuk] érintő nem kívánatos toxicitástol); (B) elfogadható gyógyászati dózis-tartománnyal rendelkezik; (C) állatokban való alkalmazás esetében, beleértve a génterápiát, orálisan adható (a gyomor-bélrendszerben stabil és felszívódik a keringési rendszerbe); (D) szükség szerint képes álthatolni a sejtmembránon vagy egyéb membránokon; és (E) a kívánt alkalmazás affinitással kötődik a legfontosabb szükséges fiziológiailag viszonylag receptorokkal való aktiváló mértékben kötődik a ligandum mód szempontjából megfelelő receptor doménhoz. Az egyik feltétel, hogy a vegyület inért legyen, de ami a képességet illeti, minél kisebb a természetes receptorokhoz, és minél kisebb a természetes receptorokhoz kötődő összes ligandumok aránya, általában annál jobb minőségű a reakció. A ligandum nem gyakorolhat erős biológiai hatást a természetes proteinekre. A ligandumok többnyire nem peptidek és nem nukleinsavak.

A kérdéses vegyületek többnyire két vagy több egységből állnak, mely egységek lehetnek egyformák vagy különbözők, s egymáshoz egy központi kötőcsoporton keresztül kapcsolódnak. Az egységek a receptor doménhez kötődni képes különálló molekulák (pl. FK506, FK520, ciklosporin A, valamilyen szteroid, stb. ) . Rendszerint valamennyi egység ugyanazon aktív részen keresztül a kötőcsoporthoz kapcsolódik, legalább homodimerek vagy magasabb rendű homo-oligomerek formájában.

Amint fentebb említettük, a kis méretű, nem protein jellegű szerves molekulákhoz (amelyek megfelelnek a fenti feltételeknek, s a találmány szerinti ligandum kialakításához különböző helyeken dimerizációra képesek) sokféle természetben előforduló receptor létezik. E vegyületek jelentős módosításai megengedettek, mindaddig, amíg a kívánt specifitású kötési képesség megmarad. A vegyületek közül sok makrociklusos, pl. a makrolidek. A megfelelő kötési affinitást a jóval 10~⁴ alatti, előnyösen 10^-6 alatti, előnyösebben kb. 10^-7 alatti Kd értékek jelentik, bár lehetséges a 10~⁹ vagy 10^-1° alatti Kd értékű kötési affinitás, s néhány esetben ezek az előnyösebbek.

A jelenleg előnyben részesített ligandumok közé FKBP proteinhez és/vagy ciklofilin proteinhez kötődni képes oligomerek, általában dimerek tartoznak. Az ilyen ligandumok közé a ciklosporin A, FK506, FK520 és rapamicin homo- vagy hetero-multimerei (melyek általában 2-4, gyakrabban 2-3 egységből állnak), valamint ezek természetes vagy mutagenizált kötő-doménhoz való kötési képességüket megtartó származékai tartoznak. Az ilyen vegyületek sok származéka ismert, belértve a szintetikus, nagy affinitású FKBP ligandumokat, melyek felhasználhatók a találmány megvalósításában (ld. pl. Holt és mtsi., J. Am. Chem. Soc., 1±5, 9925-9935, 1993). Az FK506 és analógjainak kötődését illetően Jelentős helyek közé tartoznak a kb. 17-24. gyűrűalkotó szénatomok, valamint az ezen szénatomokhoz kapcsolódó szubsztituens helyek, pl. a 21. (allil), 22., 37., 38., 39. és 40. vagy 32. (ciklohexil), illetve a 21. kivételével ugyanezen helyek jelentősek az FK520 szempontjából. A ciklosporint illetően a jelentős helyek közé tartozik a MeBmt, a 3. és 8. szénatom.

Különösen fontosak a ligandum azon módosításai, amelyek megváltoztatják kötési tulajdonságait, különösen a ligandum természetben előforduló receptorának vonatkozásában. Ezzel egyidejűleg a kötő-protein is megváltoztatható, hogy alkalmazkodjon a ligandumban bekövetkezett változáshoz.

Például megváltoztathatjuk az

FK506 9. vagy 10. helyén lévő csoportokat (ld.

Van Duyne és mtsi, Science, 252.

839,

1991), hogy növeljük térigényüket, például hidroxilcsoportot nagyobb térigényű csoporttal helyettesítve, vagy a 10. helyzetben lévő karbonilcsoportot módosítva (nagyobb térigényű csoporttal helyettesítve vagy funkciós csoporttal ellátva,

PlN-szubsztituált

Schiff-bázist vagy imint kialakítva), helyen lévő csoport térfogata. Az miáltal nő az említett e helyekre bevihető különböző funkciós csoportok közé taxak az alkilcsoportok (éterek kialakításához), -amido-csoportok, N-alkilezett aminok, ahol a 2-hidroxil-imin 1,3-oxazolint is képezhet, stb. A szubsztituensetalában kb. 1-6 szénatomosak, rendszerint 1-4, gyakan 1-3 szénatomosak, s tartalmazhatnak 1-3, rendsit 1-2 heteroatomot, melyek általában oxigénatom, jnatom, nitrogénatom vagy hasonlók lehetnek. Az al$rkezet különféle származékainak alkalmazásával .önböző ligandumokat alakíthatunk ki, amelyek a kötődéshe;önböző konformációs igényekkel rendelkeznek. A iptorok műtagenzisével lényegében azonos szekvenciájú, a sitott

1i gandumokhoz (amelyek szerkezetükben nem hböznek jelentősen) különböző affinitással rendelkező önféle receptorokat nyerhetünk.

Egyéb alkalmazható ligandumok a szteroidoknelyek úgy oligomerizálhatók, hogy természetes Lógiai aktivitásuk jelentősen csökken, anélkül, hogy aj vagy több szteroid receptor domént tartalmazó kiméra pinekre vonatkozó kötődési képességük elveszne. Nem Látozó jellegű példaként megemlítjük a glükokortikoid<és az ösztrogéneket, melyek a fenti módon alkalmazhatók. ínböző gyógyszer-hatóanyagok is alkalmazhatók, melyekr«mert, hogy nagy affinitással kötődnek egy bizonyos recepiz. Ez elsősorban akkor van így, ha a receptor kötő-doménjnert, lehetővé téve ezáltal a találmány szerin’.iméra proteinekben kizárólag a kötő-domén, s nem a teljíedeti • · · *

- 70 receptor protein alkalmazását. Erre a célra enzimek és enzim inhibitorok alkalmazhatók.

A) Linkerek

A kötéshez különböző funkciós csoportok alkalmazhatók, mint pl. az amidcsoportok, karbonsav-származékok, éterek, észterek, köztük szerves és szervetlen észterek, aminocsoportok és hasonlók. A kötődés biztosításához az adott monomer a kapcsolódáshoz alkalmas hely kialakítása érdekében oxidációval, hidroxilezéssel, szubsztitúcióval, redukcióval, stb. módosítható. A monomertől függően kapcsolódási helyként különböző helyeket választhatunk ki.

A multimer ligandumok bármilyen alkalmas módszerrel szintetizálhatok, melyek alkalmazásával a kapcsoló csoportok olyan helyre kerülnek, ahol nem befolyásolják a ligandum kötőhelyének receptorhoz való kötődését. Olyan esetben, ha a fiziológiai aktivitást eredményező aktív hely és a ligandum receptor doménhoz kötődő kötőhelye különbözik, a ligandum inaktiválása érdekében rendszerint kívánatos a kapcsolást az aktív helynél végezni. Különböző kapcsoló csoportok alkalmazhatók, melyek láncában a két (nem hidrogén) molekula között rendszerint 1-30, többnyire 1-20 atom helyezkedik el, s a kapcsoló csoportok elsősorban szén-, hidrogén-, oxigén-, kén- és foszforatomokból állnak. A kapcsoló csoportok közé számos funkciós csoport tartozik, mint pl. az amidok és észterek (szerves és szervetlen egyaránt), aminok, éterek, • *« ·

- 71 tioéterek, diszulfidok. kvaterner ammóniumsók, hidrazinok, stb. A lánc tartalmazhat alifás, aliciklusos, aromás vagy heterociklusos csoportokat. A láncot szintézisének egyszerűsége és a multimer ligandum stabilitása alapján választjuk ki. Ilyenformán, ha hosszú időtartamú aktivitást kívánunk fenntartani, viszonylag inért láncot alkalmazunk, hogy a multimer ligandumos kapcsolat ne hasítódjék szét. Más módon, ha a véráramban rövid felezési időre van szükség, úgy különböző, könnyen hasítható csoportok alkalmazhatók, mint pl. az észterek és amidok, különösen a peptidek, melyek esetében a véráramban keringő vagy intracelluláris proteázok hasíthatják a kapcsoló csoportokat.

A ligandumok közötti kapcsoló csoportokként különféle csoportok alkalmazhatók, mint pl. az általában 2-20 szénatomos alkiléncsoportok, az általában 4-18 szénatomos aza-alkiléncsoportok (melyekben a nitrogénatom rendszerint két szénatom között helyezkedik el), az általában 6-24 szénatomos N-alkilén-aza-alkiléncsoportok, (ld. fentebb), a rendszerint 6-18 szénatomos ariléncsoportok, a rendszerint

8-24 szénatomos aril-dialkilén-csoprotok, a kb. 8-36 szénatomos bisz-karboxi-amido-alkilén-csoportok, stb. A Jellemző csoportok közé tartoznak a decilén-, oktadecilén-, 3-aza-pentilén-, 5-aza-decilén-, N-butilén-5-aza-nonilén-, fenilén-, xililén-, p-dipropilén-benzol-, bisz-benzoil-(1,8-diamino)-oktán-csoport és hasonlók. A fentiekben leírt linkereket tartalmazó többértékű vagy egyéb (ld. alább) ligandum molekulák a példákban leírt anyagok és módszerek • 4 ·* · · · « 4 4 · 4 alkalmazásával a megfelelő receptor doméneket hordozó, találmány szerinti kiméra proteinekkel együtt értékelhetők.

B) Ligandum jellemzők

Az intracelluláris kötő-doménekhez a ligandumot úgy választjuk ki, hogy biológiailag aktív alakjukban átvihetők legyenek a membránon, vagyis membrán-permeábilisak legyenek.

Különféle ligandumok léteznek, amelyek hidrofóbok, vagy amelyek lipofil csoportokkal végzett megfelelő módosítással hidrofóbbá tehetők.

A kapcsoló lánc a ligandum lipofilitásának fokozására szolgálhat, oly módon, hogy a ligandumhoz kb. 12-24 szénatomos alifás oldalláncokat kapcsolunk. Más lehetőség szerint egy vagy több olyan csoportot is adhatunk a ligandumokhoz, amelyek fokozzák a membránon való áthaladást, előnyösen endoszómák kialakulása nélkül.

Bizonyos esetekben multimer ligandumok nem alkalmazhatók.

Például, molekulákat alkalmazhatunk, ha a receptor dimerizációját két különböző kötőhely biztosítja. Más esetekben a ligandum kötődése a receptor dómén konformációs változását idézheti elő, ami a receptor aktiválását, pl.

oligomerizációját hatásosak lehetnek a eredményezi. Más mechanizmusok is jel indukálásában, pl. egy konformációs változásokon átesett receptor kötődése, ami a citoplazmikus dómén aktiválását eredményezi.

·· <Μ» ·· «V • ·· · ·♦ · ·

Amint másutt említettük, a tetszőleges kiegészítő celluláris folyamatok bármelyikének (pl. egy célgén transzkripciójának) beindítására képes ligandumokat előnyösen úgy kell kiválasztani, hogy az apoptózis indukálása érdekében módosított sejtekben ne lépjen keresztreakcióba a primer kiméra proteinekkel.

C) Ligandum antagonisták

A multimer ligandum hatásának megfordítása, vagyis az oligomerek kialakulásának vagy fennmaradásának megelőzésre, gátlása vagy megakadályozása érdekében monomer ligandumok alkalmazhatók. Ilyenformán, ha a celluláris aktiválás hatását gyorsan meg akarjuk szüntetni, monomer ligandumokat alkalmazhatunk. Az eredeti ligandum alkalmas módon ugyanazon eljárás alkalmazásával (kivéve a több funkciós csoportot tartalmazó vegyület egy funkciós csoportot tartalmazó vegyülettel való helyettesítését) ugyanazon a helyen módosítható, mint a multimer. A poliaminok helyett elsősorban

2-20 szénatomos (bár hosszabbak is lehetnek), rendszerint

2-12 szénatomos monoaminok alkalmazhatók, mint például az etil-amin.

hexil-amin, benzil-amin, stb. Más módon, az egyértékű eredeti vegyület olyan esetekben (vagy dózis-szinteknél) alkalmazható, amikor az eredeti vegyület nem rendelkezik nem kívánatos fiziológiai aktivitással (pl. immunszuppresszió, mitogenezis, toxicitás, stb.).

• · • 44 ·· ·· « « ·

4 · 4

(HÓD)	reagensek.	amelvek kiegvenlítő	hatású mutációkat
tartalmazó mutáns	receptorokhoz kötődni	kéoes dudorokkal

rendelkeznek

Amint fentebb leírtuk.

előállíthatok olyan módosított

HED/HOD reagensek, amelyek láthatóan nem kötődnek vad típusú receptoraikhoz, mivel a reagenseken olyan szubsztituensek (dudorok) vannak Jelen, amelyek szférikusán nem illenek össze a receptor kötődési zsebében lévő oldallánc-gyökökkel).

Előállíthatok olyan megfelelő receptorok, amelyek a zavaró gyököknél mutációkat tartalmaznak (kiegyenlítő hatású mutációk), amelyek lehetővé teszik a ligandumok dudorokkal való kötődését. Dudoros ligandumok és kiegyenlítő mutációkat hordozó receptor domének alkalmazásával növelhető reagenseink specifitása, s ezáltal hatékonysága is. A dudorokkal rendelkező reagensek nem kötődnek a vad típusú endogén receptorokhoz, melyek egyébként a természetes ligandumokon alapuló dimerizáló szerek pufférjéiként működnek. Ráadásul az új receptor-ligandum párok kialakítása egyidejűleg HED reagenseket is eredményez, amelyeket olyan esetekben alkalmazunk, amikor hetero-dimerizációra van szükség. Például a szintaxin (egy plazmamembán fúziós protein) és a szinaptobrevin (egy vezikulamembrán fúziós protein) heterodimerizációjának HED reagens alkalmazásával végzett indukálásával szabályozott vezikula-fúziót valósíthatunk meg. Ez nem csak kutatási eszközként, hanem megfelelően módosított szekréciós ·· ·««· *4 ·♦ « · · r · « · «·· « ♦♦ * · « · · « « · · sejtek felhasználásával — cukorbetegség génterápiás kezeléséhez is alkalmazható.

A dudorokkal rendelkező FK1012-k bemutatásaként az FK506 C10 acetamid és formamid származékait állítottuk elő (ld. 16/A ábra,illetve az FK1012 A-C és FK506M szintézisére vonatkozó további részleteket illetően: Spencer és mtsi, Controlling Signal Transduction with Synthetic Ligands, Science, 262. 1019-1024, 1993). A dudoros FK1012-k két osztályát választottuk ki előállításra: az egyik a 10. szénatomnál, a másik a 9. szénatomnál rendelkezik dudorral. Az FK506 C10 acetamidjának és formamidjának R- és S-izomereit a 16/B ábrán bemutatott reakcióvázlat szerint szintetizáltuk. Ezek a dudoros származékok legalább három nagyságrenddel kisebb FKBP12-re vonatkozó kötési affinitást mutatnak (16/B ábra). Az affinitást a származékok FKBP12 rotamáz aktivitását gátló képességének mérésével határoztuk meg.

A 9. szénatomnál kidudorodást tartalmazó származékok második osztályának jellemző tagja a spiro-epoxid (16/C ábra), amelyet ismert eljárások alkalmazásával állítottunk elő (ld. pl. Fischer és mtsi, J. Org. Chem., 56. (8), 2900-2907, 1991: és Edmunds és mtsi. Tét. Lett., 32, (48), 819-820,

1991). A C9 származékok különösen érdekes csoportjára a 9. szénatomnál sp³ hibridizáció és redukált oxidációs állapot jellemző. A 16/C ábrán bemutatott reakciók szerint több ilyen vegyületet állítottunk elő.

Tudni kell, hogy a heterodimereket (és az egyéb hetero-oligomereket) másképpen kell előállítani, mint a homodimereket, legalábbis olyan esetekben, ahol a homodimer szennyeződés zavaróan befolyásolhatná sikeres alkalmazásukat.

Az e nehézség kiküszöbölésére kifejlesztett egyik jellemző szintetizálási eljárást a 16/D ábrán mutatjuk be. A mono alloc-védett 1,6-hexán-diamint (Stahl és mtsi, J. Org. Chem., 42, (11), 2285-2286, 1978) metilén-kloridban trietil-amin felesleg jelenlétében FK506-származékkal kapcsolva 44 %-os kitermeléssel alloc-aminnal szubsztituált FK506-ot kaptunk. Ezt a köztesterméket bármely aktivált (vagy dudoros FK506) molekulával történő összekapcsoláshoz alkalmazhatjuk. Az amin védőcsoport tetrahidrofuránban dimedon jelenlétében, szobahőmérsékleten katalitikus mennyiségű tétrakisz-trifenil-foszfin-palládiummal eltávolítható. Ezután azonnal aktivált FK506-származékkal kezelést végezve, majd deszililálással a dimer terméket kapjuk. Ezt az eljárást a bemutatott HÓD és HED reagensek szintéziséhez alkalmaztuk.

E) Jellemző ciklosporin-alapú reagensek

A ciklosporin A (CsA) ciklusos undekapeptid, amely nagy affinitással (6 nM) kötődik intracelluláris receptorához, a ciklofilinhez, amely egy 18 kD molekulatömegű monomer protein. A kialakuló komplex az FKBP12-FK506 komplexhez hasonlóan a kalcineurin proteáz-foszfatázhoz kötődik és inaktiválja azt, ami a hatóanyag immunszuppresszív ·♦· • · · tulajdonságait eredményezi. A találmány további jellemzéseként a CsA-t MeBmtl oldalláncán keresztül hat lépésben dimerizáltuk, és 35 %-os összes hozammal (CsA)2-t kaptunk (17. ábra; az 1-4. lépéseket Éberle és mtsi. leírása szerint [ J. Org. Chem., 57. 9 (1992): 2689-91] végeztük). Az FK1O12 molekulákhoz hasonlóan a dimerizáció helyét úgy választottuk ki, hogy a kialakuló dimer két ciklofilin molekulához tudjon kötődni, de a ciklofilinhez való kötődés után ne tudjon a kalcineurinhoz kötődni. Bebizonyítottuk, hogy a (CsA)2 1:2 sztöchiometrikus arányban kötődik a ciklofilin A-hoz. Következésképpen, a (CsA)2 — az FK1012 molekulákhoz hasonlóan — nem gátolja a jelölési reakcióutakat, s így nem immunszuppresszív és nem toxikus.

VIII. Célgén

A) Transzkripciós indítórégió

A célgén-konstrukciók az 5' régióban érzékeny elemet tartalmaznak, amely reagál a kiméra receptor protein ligandum-közvetítette oligomerizációjára, feltehetően a transzkripciós jel kialakulása és átvitele útján (Id. fentebb). Ennek megfelelően legalább egy olyan transzkripciós indítórendszert (pl. transzkripciós faktort) kell kiválasztani, amelyet (közvetlenül vagy közvetett módon) a citoplazmikus dómén aktivál, vagy amely két dómén kapcsolódásával aktiválható. Ki kell választani legalább egy olyan promoter régiót is, amely érzékeny a transzkripciós indítórendszerre. Vagy a promoter régiót, vagy a promoter transzkripciós szabályozása alatt álló gént kell kiválasztani. Más szavakkal; az akciós dómén egy adott promoter vagy érzékeny elem útján a transzkripció beindításában játszott szerepe alapján a kiméra proteinekhez egy első sorozatba tartozó konstrukció által kódolt akciós domént választhatunk ki. (ld. pl. a fenti V/A Citoplazmikus domének szakaszt).

Amennyiben az érzékeny elem ismert, azt a célgén konstrukcióba foglalhatjuk, hogy a genomba (akár episzomális, akár kromoszomális beépítéssel) történő bevitelhez expressziós kazettát készítsünk. Nem szükséges, hogy az érzékeny elem adott szekvenciája izolálva legyen, ha ismert olyan gén, amelyet a citoplazmikus dómén a citoplazmikus domént tartalmazó proteinhez való természetes ligandum-kötődés hatására a transzkripciót illetően aktivál. A szóban forgó gén promoter régiótól downstream irányban történő inszerciójához homológ rekombinációt alkalmazhatunk, hogy az endogén promoter régió transzkripciós irányítása alá kerüljön. Amennyiben a specifikus érzékeny elem ismert, azt más transzkripciós indítórégióval együtt alkalmazhatjuk, melynek lehetnek egyéb vonatkozásai, mint pl. nagy vagy kis aktivitás, például a transzkripció sebességét, adott transzkripciós faktorok kötődését, stb. illetően.

Az expressziós konstrukció ennek megfelelően 5'-végén, a transzkripció irányában, érzékeny elemet és promoter szekvenciát tartalmaz, melyek lehetővé teszik a szóban forgó célgén (rendszerint gyógyhatású gén) transzkripciójának indukált beindítását. A transzkripciós terminációs régió nem olyan lényeges, és felhasználható az mRNS életidejének növelésére vagy AU szekvenciákat inszertálva rövid felezési idejű mRNS hozható létre, ami csökkenti az mRNS stabilitását, s ezáltal korlátozza a protein működési időtartamát. Bármely régió alkalmazható, amely biztosítja a szükséges transzkripciós, és alkalmas módon, transzlációs terminációt.

Az érzékeny elem lehet különálló szekvencia vagy lehet oligomerizált, amely rendszerint kb. öt vagy kevesebb, általában kb. három ismétlődésből áll.

Az endogén transzkripciós szabályozó szekvenciák (promoter és/vagy az oligomerizációs eseményre érzékeny elemek) eltávolításához vagy inaktiválásához és/vagy az érzékeny transzkripciós szabályozó szekvenciák kívánt endogén géntől upstream irányban történő inszertálásához homológ rekombináció is alkalmazható.

B) Géntermék

Célgénként sokféle gén alkalmazható, köztük a találmány tárgyát képező proteineket kódoló gének, az antiszensz szekvenciák vagy a ribozimok. A célgén bármely olyan szekvencia lehet, amely kívánt fenotípust biztosít. A célgén «· ···· «♦ « · « « expresszálhat felületimembrán-proteint, szekretált proteint, citoplazmikus proteint, illetve számos célgén létezhet, amelyek különböző típusú termékeket képesek expresszálni. A célgén lehet antiszensz szekvencia, amely egy transzkripciós szabályozó protein gátlásával módosíthat egy bizonyos reakcióutat, illetve a reakcióút inhibitora transzlációjának gátlásával megnyithatja azt a bizonyos reakcióutat. A célgén kódolhat rlbozimot, amely az RNS szintjén egy releváns tranzkripciós regulator expressziójának megakadályozásával vagy az adott reakcióút inhibitorának expresszálásával módosíthatja az adott reakcióutat. Az expresszált proteinek (külön-külön vagy együttesen) a homing jelenségben, citotoxicitásban, proliferációban, immunreakclókban, gyulladásos reakciókban, alvadásban vagy vérrögök feloldásában, hormonális szabályozásban és hasonlókban játszhatnak szerepet.

A gén lehet bármely, sejt által szekretált gén, így a kódolt termék tetszés szerint hozzáférhetővé tehető, amikor arra a gazdaszervezetnek szüksége van. A különböző szekretált termékek közé tartoznak a hormonok, mint pl. az inzulin, humán növekedési hormon, glukagon, nyálkakiválasztó faktor, ACTH, melanotropin, relaxin, stb.; a növekedési faktorok, mint pl. az EGF, IGF-1, TGF-alfa, TGF-béta, PDGF, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, FGF, eritropoetin, megakariocita sitmuláló és növekedési faktorok, stb.; az interleukinek, mint pl. az IL1-13; a TNF-alfa és TNF-béta, stb.; és az enzimek, mint pl. a szövetplamzinogén aktivátor, a komplement kaszkád tagjai, w· ·«·· · * ·· • · V · · · · • · · · ··« · perforinek, szuperoxid-dizmutáz, véralvadási faktorok, antitrombin-III, VIIIc faktor, VIIIvW faktor, alfa-anti-tripszin, protein C, protein S, endorfinok, dinorfin, csont-alakfejlődési protein, CFTR, stb.

A gén bármely gén lehet, amely olyan proteint kódol, amely természetes állapotban felületimembrán-protein, vagy amelyet megfelelő jelzőpeptid és transzmembrán szekvencia bevitelével ilyenné alakítottunk. A különböző proteinek közé tartoznak a homing receptorok, pl. L-szelektin (Mel-14), vérrel kapcsolatos proteinek, különösen a kringle szerkezettel rendelkezők, pl. a VIIIc faktor, a VIIIvW faktor, a vérképzősejt-markerek, pl. CD3, CD4, CD8, B-sejt receptor, TCR alfa-, béta-, gamma- és delta-alegységek, CD10, CD19, CD28, CD33, CD38, CD41, stb.; receptorok, mint pl. az IL-2R, IL-4R, stb. interleukin receptorok; csatorna proteinek ionok (pl. H⁴-, Ca²⁺, K*, Na^, Cl^-, stb.) be- és kiáramlásához és hasonlók; CFTR, tirozin-aktiváló motívum, zéta-aktiváló protein, stb.

A proteinek módosíthatók úgy, hogy az exocitózis érdekében egy vezikulába szállítódjanak. A proteinhez egy vezikulákhoz irányított proteinből származó szekvenciát adva, mely szekvencia az egyik vagy másik véghez közeli részen módosított, vagy a forrásproteinhez képest azonos elhelyezkedésű, a módosított proteint a Golgi apparátusba irányítjuk, ahol vezikulába csomagolódik. Ez a folyamat az exocitózishoz jelenlévő kiméra proteinekkel összefüggésben a • ··· «· ·' ·

- 82 proteinek extracelluláris közegbe való gyors átvitelét és vizsonylag magas helyi koncentráció kialakulását teszi lehetővé.

Intracelluláris proteinek, mint például az anyagcsere reakcióútjainak proteinjei, a szabályozó proteinek, szteroid receptorok, transzkripciós faktorok, stb., elsősorban a gazdasejt természetétől függően, szintén lényegesek lehetnek. A fentebb jelzett proteinek közül néhány szintén szolgálhat intracelluláris proteinként.

Az alábbiakban a különböző gének néhány jellemzőjét írjuk le. T-sejtek esetében szükség lehet egy T-sejt receptor egyik vagy mindkét láncának bevitelére. A B-sejtek esetében egy immunglobulin nehéz és könnyű láncát biztosíthatjuk a szekrécióhoz. A bőrsejtek, pl. keratinociták, különösen a keratinocita őssejtek esetében alfa-, béta- vagy gamma-interferon, antikemotaktikus faktorok, baktérium sejtfal proteinekre specifikus proteinek, stb. szekréciójával fertőzések elleni védelmet biztosíthatunk.

A gyógyászati értékű gén expressziójának biztosításán kívül számos eset létezhet, amikor egy sejtet egy adott helyre kívánunk juttatni. Ezek közé anatómiai helyek, mint pl. nyirokcsomók, nyálkahártya-szövet, bőr, izületi hártya, tüdő vagy egyéb belső szervek vagy funkcionális helyszínek, mint például vérrögök, sérült helyek, sebészeti beavatkozás helyei, gyulladásos, fertőzések helyszínek, stb. tartoznak.

A gazdasejtet (a gazda célhelyén egy természetesen előforduló epitóphoz való kötődést biztosítva) az adott helyre irányító felületmembrán-proteinek expressziójának biztosításával egy szekretált termék lokalizált koncentrációja alakítható ki. Az e szempontból jelentős proteinek közé tartoznak a homing receptorok, pl. Lszelektin, GMP140, CLAM-1, stb., valamint az addresszinek, pl. ELAM-1, PNAd, LNAd, stb., a vérrög-kötő proteinek vagy a kemotaktikus faktorok lokalizált gradiensére reagáló sejtfelületi proteinek. Számos olyan helyzet létezik, amikor a sejteket egy bizonyos helyre kívánjuk irányítani, ahol valamilyen gyógyszerészeti termék felszabadulása nagy jelentőségű lehet.

Sok esetben szükség lehet a módosított sejtek elpusztítására, például, sejtekkel végzett kezelés esetében, ha a sejtek átralmassá, pl. daganatossá válnak, vagy ha a sejtek által szolgált cél megvalósult, és a sejtek további jelenléte nem kívánatos. A találmány szerinti módosított sejtek, amelyek egy domént (pl. a Fás antigén vagy a TNF receptor (Watanable-Fukunaga és mtsi, Natúré, 356. 314-317,

1992) citoplazmikus doménjét) tartalmazó primer kiméra proteint képesek expresszálni, apoptózis útján könnyen eliminálhatók, oly módon, hogy a sejteket a primer kimérákkal oligomerizálódni képes ligandummal hozzuk érintkezésbe. A primer kimérát kódoló konstrukciókat hagyományos anyagok és eljárások alkalmazásával konstitutív expresszióhoz alakíthatjuk ki, oly módon, hogy a módosított sejtek felületükön vagy citoplazmájukban ilyen proteineket tartalmazzanak.

Más lehetőség szerint, szabályozott expressziót biztosíthatunk olyan esetben, ha a primer kiméra expresszióját és az apoptózist ugyanazon vagy különböző oligomerizáló ligandumok indítják be. A módosított sejteket kontrollált feltételek között pusztíthatjuk el, ha a citoplazmában biztosítjuk a Fás antigén vagy TNF receptor (a szóban forgó célgén expressziójával kapcsolatos kötőrégióktól eltérő kötőrégiókhoz kapcsolt) citoplazmikus részeit.

C) Jellemző példák

Bemutatási céllal leírjuk, hogy szívbetegek vagy agyvérzésre hajlamos páciensek az alábbiak szerint kezelhetők. A találmányban leírtak szerint módosított sejteket adunk be a pácienseknek, s ezeket hosszú ideig bennük tartjuk. A jellemző sejtek közé plazmasejtek, B-sejtek, T-sejtek vagy egyéb vérképzési sejtek tartoznak. A sejtek úgy módosíthatók, hogy vérröghöz kötődő, például kringle dómén szerkezettel rendelkező proteint vagy adhezív interaktív proteint (pl. CD41), valamint vérrög-oldó proteint, pl. szövetplazminogén aktivátort, sztreptokinázt, stb. expresszáljanak. Ilyenformán, a sejtek ligandum-közvetítette oligomerizáció hatására a vérrög helyén felhalmozódnak, s a trombolitikus protein nagy lokalizált koncentrációját biztosítják.

Egy másik példa a reperfúziós sérülés. Ilyen esetben korlátozott élettartamú sejtek alkalmazhatók, pl. makrofágok vagy polimorf magvú (neutrofil) leukociták. A sejteknek neutrofil homing receptorral kell rendelkezniük, hogy az a reperfúziós sérülés helyére irányítsa őket. A sejtnek továbbá szuperoxid-dizmutázt kell expresszálnia, hogy leépítse a szingulett oxigént és gátolja a szövetet érő gyök-támadást.

A harmadik példa az autoimmun betegség. Ilyen esetben hosszú élettartamú sejtek, pl. T-sejtek alkalmazhatók. A konstrukcióknak az autoimmun sérülés helyére történő irányításhoz (homing) és a sérülést okozó sejtek citotoxikus támadásához homing receptort kell biztosítania. A kezelést ezután a sérülést okozó sejtek ellen irányíthatjuk. Más módon, szolubilis receptorok vagy más peptid vagy protein szekrécióját is biztosíthatjuk, mely esetben a szekréció terméke gátolja a sérülést okozó sejtek aktiválását, vagy anergiát indukál.

Negyedik példaként a krónikus fájdalom endorfinnal, enkapszulálás útján történő kezelését említjük. Humán fibroblaszt törzset olyan konstrukcióval transzfektálunk, amelyben a kiméra transzkripciós szabályozó protein irányítja a humán endorfin transzkripcióját. A DNS-konstrukció egy TATAAAA helytől és egy transzkripciós indítóhelytől upstream irányban a HNF-1* transzkripciós faktor GTTAAGTTAAC kötőhelyének három kópiáját tartalmazza. Az endorfin cDNS az indítóhelytől downstream irányban és a poliadenilációs jeltől és terminációs szekvenciáktól upstream irányban inszertálható. Adott esetben az endorfin cDNS-t PEST szekvenciákkal is elláthatjuk, hogy a proteint bomlékonnyá tegyük, vagy az mRNS 3' transzlálatlan régiójához AUUA szekvenciákat adhatunk, hogy lehetővé tegyük gyors lebomlását.

A fibroblasztokat két transzkripciós egységgel rendelkező konstrukcióval is transzferálhatjuk, melyek egyike a fibroblasztokban működőképes indító és terminátor régiók transzkripciós és transzlációs irányítása alatt az olyan mértékben csonkított HNF-1* cDNS-t kódolja, hogy az csak az 1-250. aminosavakat magában foglaló DNS-kötő szekvenciákat kódolja, amelyek egy trimer FKBP kötő-doménhoz kapcsolódnak. A konstrukció tartalmazhat egy további, az előzővel megegyező szabályozó régiók által irányított transzkripciós egységet, amely a trimer FKBP'-hez kapcsolt HNF-4-ből származó transzkripciós aktivációs dómén termelődését szabályozza. (A vessző egy megváltoztatott FKBP-t jelöl, amely nM nagyságrendű koncentrációban módosított FK506-hoz kötődik. A módosítás gátolja az endogén FKBP-hez való kötődést.)

Ezek a genetikailag módosított sejtek az immunfelismerés gátlása érdekében enkapszulálhatók (tokba zárhatók) és a páciens bőre alá vagy más alkalmas belső helyre helyezhetők. Amikor a páciensnek gyógyszeres fájdalomcsillapításra van szüksége, FK506-FK506' dimer ligandumot vesz be, melyből kb. 1 pg és 1 mg közötti mennyiség elegendő. Ezzel a módszerrel injekció nélkül, illetve gyógyszerrabság veszélye nélkül biztosítható a fájdalomcsillapítás.

ötödik példa a csontritkulás (osteoporosis) kezelése. A kezelni kívánt páciensből klonálisan limfociták fejleszthetők ki vagy tenyészetben fibroblasztok növeszthetők. A sejtek a fentebb leírtak szerint transzfektálhatók, mely esetben az endorfin gén csont-alakfejlődési faktor cDNS génnel helyettesíthető. A limfociták esetében antigén-specifikus kiónok alkalmazhatók, amelyek az antitestekkel az sIG idiotípusává alakulhatnak. Az sIG-hez való antigén beadásával kiterjeszthető a sejtpopuláció, hogy növekedjen a bevinni kívánt protein mennyisége. A limfocita kiónok és a ligandum a csont-alakfejlődési faktor termelődésének megfelelően adhatók be. A ligandumra adott reakció ellenőrzésével a termelődött csont-alakfejlődési faktor mennyisége úgy szabályozható, hogy az adagolást a kívánt szintre állítjuk.

Az antigén-specifikus sejtek módosításának egy másik esete, amikor a sejtek aktiválásához egy protein termék expressziójának aktiválására van lehetőség. A T-sejt receptor tumorsejtek, patogének, autóimmunitást közvetítő sejtek és hasonlók ellen irányítható. A sejtek aktiválásának biztosításával, például egy interleukin, mint az IL-2, a ligandumra adott válaszként a módosított T-sejtek szaporíthatok el. A módosított T-sejtek egyéb alkalmazási lehetőségei közé tartozik a T-sejtek specifikus helyre irányításához való homing receptorok expresszálása, amikor citotoxicitás, célsejtek, pl. endothel sejtek felületimembrán-proteinjének felülszabályozása vagy más biológiai esemény kívánatos.

Más lehetőség szerint, szükség lehet a citotoxikus faktorok célhelyre történő szállítására. Például, tumorantigének homing receptor útján történő felismerésének hatására tumorba hatoló limfociták (TIL-ek) indukálhatok, hogy TNF vagy más hasonló termék toxikus koncentrációját szállítsák.

További alkalmazási lehetőség az exocitózison átesett hormonok vagy faktorok exportja. Fokozott exocitózis biztosításával a hormon vagy faktor nagyobb mennyisége exportálható, sőt, amennyiben a citoplazmában a hormon vagy faktor mennyiségét illetően feedback mechanizmus érvényesül, a hormon vagy faktor fokozott termelődése lesz az eredmény. A hormon vagy faktor indukált expressziója is megvalósítható, miáltal az expresszió és az export együttesen indukálható.

A testfolyadékokban, például a véredényrendszerben, nyirokrendszerben, agy-gerincvelői folyadékban, stb. maradó proteint is biztosíthatunk. Olyan sejteket módosítva, amelyek hosszú élettartamot érhetnek el, (például vérképző sejtek, keratinociták, izomsejtek, stb.), a proteinek hosszú ideig tarhatók a folyadékokban. A sejtek olyan konstrukciókkal módosíthatók, amelyek szekréciót vagy endocitózist biztosítanak. A szekréciót biztosító konstrukciók transzlokációs doménként egy jelzőpeptidet, s ezután — az egyéb kiméra proteinekhez hasonlóan — egy kötő-domént és egy akciós domént tartalmazhatnak. Az akciós domének azonos vagy különböző proteinekből származhatnak. Például, a szövetplazminogén aktivátor esetében, az egyik akciós doménként a vérrög-kötő régió, egy másik akciós doménként pedig a plazminogén aktív hely alkalmazható. Más lehetőség szerint, az egyik akciós doménként kötő proteinnel, például LFA-l-gyel, s egy másik akciós doménként egy szelektinnel a homing folyamat fokozott blokkolását idézhetjük elő. A proteinek alegységeinek (pl. integrinek, T-sejt receptor, sIG vagy hasonlók) módosításával felületi membránbroteinek szolubilis alakjai hozhatók létre, melyek egymással összehozva egy molekulához kötődnek. Egyéb lehetőségek a komplement proteinek, a véralvadásban szerepet játszó vérlemezkemembrán-proteinek, a sejtek felületén jelenlévő autoantigének, valamint a fertőző anyagok felületén lévő patogén molekulák.

IX. A konstrukciók bevitele a sejtekbe

Az itt leírt konstrukciók egy vagy több DNS-molekulaként vagy -konstrukcióként vihetők be a sejtekbe, s ezek legalább * J t / egy markerrel rendelkeznek (de lehet két vagy több marker is), melyek lehetővé teszik a konstrukció(ka)t tartalmazó gazdasejtek kiszelektálását. A konstrukciókat hagyományos eljárásokkal állíthatjuk elő, melyek során alkalmas módon izoláljuk a géneket és szabályozó régiókat, ezeket ligáljuk, megfelelő klónozó gazdába klónozzuk, majd restrikciós enzimes emésztéssel, szekvenálással vagy más alkalmas _w módszerrel analizáljuk. PCR-technika alkalmazásával egy funkcionális egység egészét vagy részeit magában foglaló különálló fragmensek izolálhatok, melyekbe alkalmas módon primer repair módszer, ligálás, in viti'O mutagenezis, stb. alkalmazásával egy vagy több mutációt vihetünk be. A végső formájukban kialakított és bizonyítottan megfelelő szekvenciákkal rendelkező konstrukció(ka)t ezután bármely hagyományos eljárással bevihetjük a gazdasejtbe. A konstrukciók a sejtek fertőzéséhez vagy a sejtekbe történő transzdukcióhoz nem replikálódó, detektív vírusgenomokba (mint pl. adenovírus, adeno-rokon vírus [AAV], Herpes simplex vírus [HSV]), és egyéb, például retrovírus vektorokba építhetők. A konstrukciók szükség szerint tartalmazhatnak a transzfekcióhoz virális szekvenciákat is. Más lehetőség szerint, a konstrukció bevihető fúzióval, elektroporációval, transzfekcióval, lipofekcióval vagy hasonló módszerekkel. A konstrukcióik) bevitele előtt a gazdasejteket rendszerint tenyészetben növesztjük és szaporítjuk, amit a konstrukcióik) beviteléhez szükséges megfelelő kezelés, illetve a konstrukció(k) bevitele követ.

A sejteket ezután elszaporítjuk és a konstrukcióban

jelenlévő marker segítségével szelektáljuk. A sikeresen alkalmazható különböző markerek közé tartozik a hprt, a neomicin-rezisztencia, timidin-kináz, higromicinrezisztencia, stb.

Néhány esetben, ha a konstrukciót egy bizonyos lokuszra kívánjuk beépíteni, homológ rekombinációhoz célhelyre lehet szükség. Például kiüthetünk egy endogén gént és (ugyanazon a lókuszon vagy másutt) a homológ rekombinációval kapcsolatban ismert anyagok és eljárások alkalmazásával a konstrukció által kódolt génnel helyettesíthetjük. Más módon, egy új gén bevitele helyett úgy módosíthatjuk egy endogén gén transzkripciós indítórégióját, hogy érzékennyé váljon a jelindító doménre. Ilyen esetekben a ligandum beadásával endogén gének, mint pl. az EPO, tPA, SÓD vagy hasonlók transzkripcióját szabályozhatjuk. A homológ rekombinációhoz ómega vagy O-vektorok alkalmazhatók (ld. pl. Thomas és Capecchi, Cell, 51. 503-512, 1987; Mansour és mtsi, Natúré, 336, 348-352, 1988; és Joyner és mtsi, Natúré, 338, 153-156,

1989).

A konstrukciók a gének mindegyikét magában foglaló egyetlen DNS-molekulaként vagy egy vagy több génnel rendelkező különböző DNS-molekulákként vihetők be a sejtekbe, és a bevitel történhet egyidejűleg vagy egymás után, ugyanazon vagy különböző markerekkel egyaránt. Egy jellemző példában egy konstrukció tartalmazhat egy specifikus érzékeny elem (pl. NFAT) szabályozása alatt álló gyógyhatású gént, valamint egy másik, a ligandum receptor doménhez fúzionált jelölő régiót tartalmazó receptor-fúziós proteint kódoló gént (mint pl. az MZF3E-ben). Bevihető egy harmadik DNS-molekula is, amely homing receptort vagy egyéb, a gyógyhatású termék bevitelének hatékonyságát fokozó terméket kódol.

Jól ismertek azok a vektorok, amelyek olyan hasznos elemeket, például baktérium vagy élesztő replikációs kezdőhelyeket, szelektálható és/vagy amplifikálható markereket, prokariótákban vagy eukariótákban történő expresszióhoz promoter/enhancer elemeket, stb. tartalmaznak, s amelyek DNS-konstrukciók törzseinek előállításához és a transzfekció megvalósításához alkalmazhatók.

X. A sejtek és ligandumok beadása

DNS-konstrukciókkal módosított sejteket szelektív feltételek mellett tenyészetben növesztjük, s azon sejteket, melyekről bebizonyosodott, hogy tartalmazzák a konstrukciót, elszaporíthatjuk, és például polimeráz láncreakció alkalmazásával a gazdasejtben lévő konstrukció meghatározása érdekében vizsgálhatjuk. A módosított sejteket, azonosítás után, a terveknek megfelelően alkalmazhatjuk, pl. tenyészetben növeszthetjük vagy gazdaszervezetbe vihetjük.

A sejteket (természetétől függően) sokféle módon vihetjük be a gazdaszervezetbe (pl. emlősbe). A vérképzési sejtek injektálás útján a keringési rendszerbe adhatók be, melynek során rendszerint legalább 10⁴ sejtet, általában nem több, mint kb. 10¹⁰ sejtet, még gyakrabban nem több, mint kb. 1O^S sejtet alkalmazunk. Az alkalmazott sejtszám több körülménytől függ, így a bevitel céljától, a beadások számától, a sejtek élettartamától, az alkalmazandó eljárástól, a sejtek szaporodási képességétől, a gyógyszer stabilitásától, a gyógyszert igénylő fiziológiai szükséglettől és hasonlóktól.

Más lehetőség szerint, transzplantátumként alkalmazható bőrsejtek esetében a sejtek száma az égett vagy más módon sérült felület méretétől függ. Az izomsejtek (myoblast) és kötőszöveti sejtek (fibroblast) esetében általában leglább kb. 10⁴ darab, és nem több, mint kb. 10® darab sejtet alkalmazunk, melyeket diszperzió formájában rendszerint a szóban forgó helyre vagy közelébe injektálunk.

sejteket rendszerint fiziológiailag elfogadható vivőanyagban adjuk be.

Sok esetben szükség lehet a sejtek ex vivő módosítása helyett in vivő módosítást végezni. E cél érdekében, a célszövet és sejtek in vivő módosítására különböző módszereket és számos vírus vektort (mint pl. az adenovírus és retrovírusok) fejlesztettek ki, melyek lehetővé teszik a vírus gazdaszervezetbe történő transzfekcióját és véletlenszerű beépülését (ld. pl. Dubensky és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 21, 7529-7533, 1984); Kaneda és mtsi, Science, 243. 375-378, 1989; Hiebert és mtsi, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 86, 3594-3598, 1989; Hatzcglu és mtsi, J. BIol. Chem.. 265. 17285-17293, 1990; és Ferry és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 . 8377-8381, 1991). A vektort injekcióval, például intravaszkulárisan vagy intramuszkulárisan, inhalálással vagy más parenterális módon adhatjuk be.

Az ín vivő genetikai módosításokat illetően a változtatás módja a szövet természetétől, a szükséges celluláris módosítás hatékonyságától, az adott sejt módosítása lehetőségeinek számától, a szövet bevinni kívánt DNS-készítmény számára való hozzáférhetőségétől és hasonló tényezőktől függ. Egy megcélzott transzkripciós indítórégiót hordozó legyengített vagy módosított retrovírust felhasználva a vírus kívánság szerint a találmány tárgyát képező valamely transzkripciós faktor konstrukció alkalmazásával aktiválható, hogy a vírus termelődjön és szomszédos sejteket fertőzzön.

Nem minden esetben van szükség arra, hogy a DNS-bevitel beépülést eredményezzen. Néhány esetben a bevitt DNS átmeneti fenntartása is elegendő lehet. Ezen a módon rövid időtartamú hatást érhetünk el, ha a sejteket be tudjuk vinni a gazdaszervezetbe, és azok meghatározott idő elteltével (pl. miután a sejtek egy adott helyen megtelepedtek) bekapcsolhatók.

A citoplazmikus dómén aktiválását biztosító ligandum ezután kívánság szerint adható be. A ligandum kötési affinitásától, a kívánt reakciótól, a beadási módtól, a felezési időtől és a jelenlévő sejtek számától függően különböző eljárások alkalmazhatók. A ligandum parenterálisan vagy orálisan adható be. A beadások száma a fenti tényezőktől függ. A ligandum orálisan (pirula, por vagy diszperzió); bukkálisan, szublingválisan; intravaszkuláris, intraperitoneális vagy szubkután injekcióval; inhalálással, stb. adható be. A ligandum (és a monomer vegyület) a különböző beadási módokhoz jól ismert hagyományos eljárásokkal alakítható készítménnyé. A pontos dózis és az adott beadási mód a fenti tényezőktől függ, s meghatározása a kezelést végző szakember feladata. A beadási módot többnyire kísérleti alapon határozzuk meg.

Abban az esetben, ha a ligandum aktiválását meg akarjuk fordítani, a monomer vegyületet vagy más, a ligandummal kompetens, egy kötőhellyel rendelkező vegyületet adhatunk be. Ilyenformán zavaró reakció vagy a gyógyászati hatás befejezésének igénye esetén, ha gyors visszfordításra van szükség, a monomer kötővegyületet bármely alkalmas módon (elsősorban intravaszkulárisan) beadhatjuk. Más módon, DNS-kötő doménnel inaktivációs dómén (vagy transzkripciós silencer) jelenlétét biztosíthatjuk. Ismét más lehetőség szerint, a sejtek (másutt leírt) Fás vagy TNF receptorral végzett jelöléssel apoptózis útján eliminálhatók.

A különböző alkalmazásokhoz a ligandum adott adagolása a gyógyászati dózis ellenőrzéséhez alkalmazott eljárások szerint határozható meg, ha hosszabb ideig (például több, mint kb. két hétig) kívánatos egy adott szintű expresszió fenntartása, vagy rövid időtartamú ismétléses kezelés esetében egyszeri vagy ismételt ligandum dózisokkal, a dózisok között hosszabb intervallumokkal (pl. két hét vagy több). Előre meghatározott tartományon belüli ligandum dózist adunk be, s úgy vizsgáljuk, hogy idő - expressziós szint kapcsolatot kapjunk, miközben vizsgáljuk a gyógyászati válaszreakciókat is. Az adott időtartam alatt megfigyelt szintektől függően a következő alkalommal nagyobb vagy kisebb dózist adhatunk be. Ez az eljárás addig ismételhető, amíg a gyógyászati tartományba eső adagolást nem sikerül kialakítani. Amennyiben a ligandumot hosszú ideig alkalmazzuk, a ligandum fenntartási dózisának meghatározása után hosszabb időközökkel megbizonyosodjunk arról, megfelelő válaszreakciót expressziós termék megfelelő vizsgálatokat végezhetünk, hogy vajon a celluláris rendszer ad-e, és biztosítja-e az szintjét.

Tudni kell, hogy a rendszert sok változó befolyásolhatja, mint pl. a ligandumra adott celluláris reakció, az expresszió hatékonysága, adott esetben a szekréció szintje, az expressziós termék aktivitása, a páciens adott szükségletei, melyek az időtől és körülményektől, a sejtek számának vagy az egyes sejtek expressziós aktivitásának csökkenése, stb. miatt bekövetkező celluláris aktivitáscsökkenés mértékétől függően változhatnak. Következésképpen, t

minden egyes páciens esetében ellenőrizni kell az egyén számára pontos dózist, még akkor is, ha a populáció nagy részének beadható univerzális sejtek állnak rendelkezésre.

A találmány szerinti eljárás és készítmények sokféle betegség és állapot kezelésére alkalmazhatók. Például a B- és T-sejtek rák, fertőző betegségek, anyagcserezavarok, szív és érrendszeri betegségek, örökletes véralvadási elégtelenségek, autoimmun betegségek, izületi degeneratív betegségek (pl. arthritis), tüdőbetegségek, vesebetegségek, endokrin rendellenességek, stb. kezelésére alkalmazhatók. Különböző, szerkezettel kapcsolatos sejtek, mint a fibroblasztok és az izomsejtek, genetikai rendellenességek, mint pl. kötőszöveti rendellenességek, arthritis, májbetegségek, stb. kezelésében alkalmazhatók. Olyan esetekben, amikor valamilyen hiányosság kiegészítéséhez vagy egy gyógyhatású termék májba vagy portális keringésbe történő juttatásához nagy mennyiségű protein előállítására van szükség, máj sejtek alkalmazhatók.

Az alábbi példákat a találmány szemléltetéseként, s nem korlátozásaként írjuk le.

Celluláris transzformáció és értékelés

1. példa

Izolált IL-2 enhancer-kötő transzkripciós faktorok indukciója a T-sejt receptor CD3 láncának kereszt-kötésével

A humán IL-2 promoter (-325-től +47-ig; MCB Q, 3042, 1986) szabályozása alatt álló, méhlepény eredetű szekretált alkalikus foszfatáz gént tartalmazó pSXNeo/IL2 (IL2-SX) plazmidot (1. ábra) és rokon plazmid-változatait (NFAT-SX, NF B-SX, 0AP/0ctl-SX és AP-l-SX), melyekben a riporter gén a különböző promoter elemeket (NFAT, NK B, OAP/Oct-1, ill. API) tartalmazó szintetikus oligomerekkel kombinált minimál IL-2 promoter (-325-től -294-ig és -72-től +47-ig) transzkripciós szabályozása alatt áll, az alábbi plazmidok három részligálásával állítottuk elő: (1) az Sspl és HindlII enzimmel hasított pPL/SEAP (Berger és mtsi, Gene, 1,

1988); (2) az Ndel-gyel emésztett, Klenow-polimerázzal tompa végűvé alakított, majd Pvul-gyel hasított pSV2/Neo (Southern és Berg,

J. Mól. Appl.

Génét., 1,

332, 1982); és (3) Pvul-gyei és

HindiII-mal hasított, különböző promotereket tartalmazó plazmidok (NFAT-CD8,

B-CD8, cxl21acZ-0ct-l,

AP1-LUCIF3H vagy cxl5IL2; ld. alább).

Az NFAT-CD8 az NFATkötőhely (-286-tól -257-ig; Genes and

Dev. ,

A, 1823, 1990) három kópiáját, a cxl21acZ-0ct pedig a humán

IL-2 enhancerbői származó OAP/Oct-1 (ARRE-1) kötőhely

1988) négy kópiáját tartalmazza, míg a B-CD8 (MCB, B, 1715, az egér könnyű láncból származó NF B kötőhely (EMBO, H, 4425, 1990) három kópiáját, az AP1-LUCIF3H pedig a metallotionén promoterből származó AP-1 hely (5'-TGACTCAGCGC-3') öt kópiáját tartalmazza.

Valamennyi transzfektálásnál TAC/TAC/Z kiméra receptort kódoló 5 pg pCDL-SR expressziós vektort (MCB, fi, 466-472) (Tac-IL2 receptor lánc) TAg Jurkat sejtekben (a humán Jurkat T-sejt leukémia sejtvonal SV40 nagy T antigénnel stabilan expresszált származéka [Northrup és mtsi, J. BIol. Chem.,

1993]) különböző szekretált alkalikus foszfatáz-alapú riporter plazmidokkal együttesen transzfektáltunk.

Valamennyi riporter plazmid a minimál IL-2 promoterrel összefüggésben egy különálló IL-2 enhancer-kötő transzkripciós faktor kötőhelyének, vagy más módon, a upstream irányban lévő teljes IL-2 enhancer/promoter egy múltimerizált oligonukleotidj át tartalmazza. 24 óra elteltével a sejtek egy-egy adagját (kb. 10⁵ sejt) a kötött anti-TAC (CD25) monoklonális antitest (mAb; 33B3.1; AMAC, Westbrook, ME) log-hígitásait tartalmazó mikrotiter üregekbe helyeztük.

Pozitív kontrollként, és a transzfekció hatékonyságának kontrollálása érdekében minden transzfektálásből származó adaghoz ionomycint (1 pn) és PMA-t (25 ng/ml) adtunk.

További 14 órás inkubálás után a felülúszókat alkalikus foszfatáz aktivitásra teszteltük, s a kapott aktivitásokat a pozitív kontroll minták aktivitásához viszonyítva fejeztük ki. 1 ng/ml FK506 hozzáadása az NFAT-nek betudható összes aktivitást háttérszintre csökkentette, ami azt bizonyítja, • * · *

- 100 hogy a deaktiválás ugyanabban a reakcióútban zajlik, mint amit az FK506 blokkol.

Valamennyi kapott adatpont két minta átlagából származik, kísérletet többször hasonló eredménnyel ismételtük meg (ld. 5. ábra). Az adatok azt mutatj ák, hogy ismert extracelluláris receptor alkalmazásával egy riporter génnnel és különböző enhancer-ekkel megfelelő szintű reakciót kapunk.

Hasonló eredményeket kaptunk, amikor a TcR komplex elleni monoklonális antitestet (pl. 0KT3) alkalmaztunk.

2. példa

Az FK506 és ciklosporin A (CsA) immunszuppresszív hatóanyagok, illetve az FK1012A (8), FK1012B (5) és CsA dimer (PB-1-218) dimer származékok inhibitor aktivitása

10⁵ TAg-Jurkat sejthez ionomycint (1 pm) és PMA-t (25 ng/ml) adtunk, majd a különböző hatóanyagok titrálásait adtuk hozzá, öt óra elteltével a sejteket gyenge detergenssel (Triton X-100) lizáltuk, s az extraktumokat a MUG (metil-galaktozidil-umbelliferon) β-galaktozidáz szubsztráttal egy óra hosszat inkubáltuk. Ehhez glicin/EDTA leállító puffért adtunk, s a kivonatokat fluoreszcenciára vizsgáltuk.

Valamennyi adatpont két minta átlagából származik, kísérletet többször hasonló eredményekkel ismételtük meg.

Különös módon az

FK1012B, úgy tűnik, a legnagyobb koncentrációban (5 pg/ml) némileg fokozza a mitogén aktivitást, a kontroll kísérlet azoban azt mutatja, hogy az

FK1O12B önmagában nem serkentő hatású (ld. 6. ábra).

101

3. példa

Az FK1012A dimer FK506-származék hatása a kiméra FKBP12/CD3 (1FK3) receptorra

A pCDL-SR vektoron alapuló, a 16S splice-hely és a poliA hely közé inszertált polilinkert tartalmazó pBJ5 eukarióta expressziős vektor (amely 1FK3 kiméra receptort tartalmaz) 5 /jg-ját az NFAT-vel indukálható NFAT-SX szekretált alkalikus foszfatáz riporter plazmid 4 pg-jával együttesen transzfektáltuk. Kontrollként az lFK3/pBJ5 helyett 5 ug pBJ5 vektort alkalmaztunk, párhuzamos transzfekcióban. 24 óra elteltével a hozzávetőleg 10® sejtet tartalmazó transzfektálásokat az FK1012A logaritmikus hígításaival inkubáltuk, amint azt feltüntettük. Pozitív kontrollként, és a transzfekció hatékonyságának kontrollálása érdekében minden transzfektálásból származó adaghoz ionomycint (1 um) és PMA-t (25 ng/ml) adtunk. További 14 órás inkubálás után a felülúszókat alkalikus foszfatáz aktivitásra teszteltük, s a kapott aktivitásokat a pozitív kontroll minták aktivitásához viszonyítva fejeztük ki. 2 ng/ml FK506 hozzáadása valamennyi serkentő hatást háttérszintre csökkentette, ami azt bizonyítja, hogy az aktiválások ugyanabban a reakcióútban zajlanak, mint amit az FK506 blokkol. Következésképpen, az FK506 vagy a ciklosporin ezen vegyületek alkalmazásának hatásos ellenszereként szolgálnak. Valamennyi adatpontot két minta eredményeinek átlaga alapján kaptuk, s a kísérletet többször hasonló eredménnyel elvégeztük (ld. 7. ábra).

4/A példa

Az FK1012B dimer FK506-származék hatása a mirisztoilált kiméra CD3/FKBP12 (MZF3E) receptorra

Sikerrel bizonyítottuk a ligandumok tervezésének és szintézisének számos lehetőségét, ide számítva az FK506-alapú HÓD reagensekkel, nevezetesen az FK1012-kkel kapott pozitív eredményeket. Azt talátuk, hogy az FK1012-k nagy affinitást és 2:1 kötési sztöchiometriái arányt (Kd(l)= 0,1 nM; Ka(2) - 0,8 nM) biztosítanak, és nem gátolják a kalcineurin-közvetítette TOR jelölést. A ligandumok nem immunszuppresszívek és nem toxikusak (sejttenyészetben 0,1 nM koncentrációig). Hasonló módon, ciklosporín A-n alapuló homodimerizáló szert £(CsA)2] állítottunk elő, amely 1:2 sztöchiometriai arányban a ciklofilin CsA receptorhoz kötődik, a kalcineurinhoz azonban nem. Ilyenformán, az FK1012-khöz hasonlóan a (CsA)2 nem gátolja a Jelölési reakcióutakat, s így nem immunszuppresszív és nem toxikus.

A ligandum-közvetitette proteinkapcsolódás ezen és egyéb példái jelátalakító reakcióút szabályozását eredményezték. Egy jellemző esetben ezt úgy valósítottuk meg, hogy egy intracelluláris receptort készítettünk, amely az Src poszttranszlációs mirisztoiláláshoz elégséges kis fragmensét (M), a zéta-lánc citoplazmikus farkát (Z; a B-sejt receptor egy komponensét is felhasználtuk), három egymást követő FKBP12-t, (F3) és egy flu (influenza hemagglutinin) epitóp toldalékot (E) tartalmaz. Az MZF3E konstrukciót (18. ábra) ί

- 103 «··* ·9 • « · · » ·♦ · humán Jurkat T-sejtekben expresszálva bebizonyítottuk, hogy a kódolt kiméra protein FK1012-közvetítette oligomerizáción esett át. A zéta-láncok oligomerizációval együttjáró aggregáoiója az endogén TCR-jelölő reakcióúton történő jelölést eredményezett (15. ábra), amit az alkalikus foszfatáz (SEAP) FK1012-re adott (ECso nM) reakcióként bekövetkező szekréciója bizonyított.

A SEAP riporter gén promoterét úgy konstruáltuk, hogy transzkripcionálisan aktiválható legyen az aktivált T-sejtek sejtmagi faktora (NFAT) által, amely a jelölés után a sejtmagban épül

FK1012-indukálta jelölés a ligandum nem toxikus, fel. Az

FK506-M nevű monomer változatával indukált deaggregációs folyamattal fejezhető be.

A mirisztoilált kiméra receptort tartalmazó pJB5 eukarióta expressziós vektor 5 /;g-ját 4 pg NFAT-SX-szel, MZE-vel, MZFIE-vel, MZF2E-vel és MZF3E-vel (mely utóbbiak a mirisztoilált CD3 citoplazmikus doméntól downstream irányban az FKBP12 0, 1, 2, ill. 3 kópiáját tartalmazzák; ld. 2. ábra) együttesen transzfektáltuk. Kontrollként párhuzamos transzfekcióban 5 pg pBJ5 vektort alkalmaztunk. 24 óra elteltével mindegyik transzfektálásból kb. 10⁵ sejtet tartalmazó adagokat az FK1012B hatóanyag feltüntetett log-hígításaival inkubáltuk. Pozitív kontrollként, és a transzfekció hatékonyságának kontrollálása érdekében minden transzfektálásból származó adaghoz ionomycint (1 /.m) és PMA-t (25 ng/ml) adtunk. További 14 órás inkubálás után a felülúszókat alkalikus foszfatáz aktivitásra teszteltük, s a ·*·· «·

- 104 kapott aktivitásokat a pozitív kontroll minták aktivitásához viszonyítva fejeztük ki. 1 ng/ml FK506 hozzáadása valamennyi serkentő hatást háttérszintre csökkentette. ami azt bizonyítja, hogy az aktiválások ugyanabban a reakcióútban zajlanak, mint amit az FK506 blokkol. Ez az eredmény további bizonyítékot szolgáltat a találmány tárgyát képező sejtaktiválás reverzibilitására. Valamennyi adatpontot két minta eredményeinek átlagából kaptuk, s a kísérletet többször hasonló eredménnyel végeztük el (ld. 8. ábra). A mirisztoilált származékok a ligandum körülbelül egy nagyságrenddel kisebb koncentrációjára reagálnak, s hasonló szinten aktiválják az NF-AT-dependens transzkripciót, de meg kell jegyeznünk, hogy a ligandumok különbözők (vö. 7. és 8. ábra).

In vivő FK1012-indukálta protein-dimerizáció

Ezután azt kívántuk bebizonyítani, hogy az MZF3E receptor intracelluláris aggregációját valójában az FK1012 indukálja. Az MZF3E konstrukció influenza hemagglutinin epitóp toldalékét (flu) ezért egy másik epitop toldalékra (flag-M2) cseréltük. A közeli rokonságban álló kimérákat (MZF3Efiu és MZF3Efia._g) Jurkat T-sejtekben együttesen expresszáltuk. Miután a sejteket FK1012A-val kezeltük, agaróz gyöngyökhöz kapcsolt anti-Flag antitestekkel immunprecipitációs kísérleteket végeztünk. FK1012A (1 ;ü) jelenlétében az MZF3Efias kiméra protein kölcsönhatásba lép az MZF3Efiu-val, és együtt immunprecipitálódik az MZF3Efia_S proteinnel.

105 ·· ···· ·· • · · · · · •*· · ·♦ · • * · * * · ·* ·· »4 ·« f

FK1012A hiányában az MZF3Efiu együttes immunprecipitálódása nem figyelhető meg. Az MZFlEfiu és MZFlEfiag monomer FKBP konstrukciókkal (melyek nem jelölnek) végzett rokon kísérletekkel kimutattuk, hogy ezeket az FK1012A szintén dimerizálja. Ez az endogén T-sejt receptor és a mesterséges MZF3E receptorunk esetében egyaránt megfigyelt aggregáció szükségességét tükrözi.

FK1012-indukálta protein-tirozin foszforilálás

A TCR, CD3 és zéta-láncok intracelluláris doménjei antigénes stimulációt követően kölcsönhatásba lépnek a citoplazmikus protein tirozin kinázokkal. Az Src család specifikus tagjai (lek és/vagy fyn) az említett intracelluláris doméneken belüli aktivációs motívumok (tirozin-aktivációs motívum; TAM) egy vagy több tirozin-gyökét foszforilálják. A ZAP-70 tirozin-kináz (két SH2 doménje útján) a tirozin-foszforilált T-sejt receptorhoz gyűlik, aktiválódik, s ez valószínűleg szerepet játszik a foszfolipáz C további downstream aktiválásában. Az MZF3E-vel stabilan transzfektált Jurkat sejtekhez anti-CD3 MAb-t (monoklonális antitestet) vagy FK1012A-t adva a kináz-aktivitás a zéta-lánchoz gyűlik, amit az endogén T-sejt receptor zéta-lánc, illetve az MZF3E konstrukció immunprecipitációját követően in vitro kinéz vizsgálattal mértünk. A sejtek anti-CD3 monoklonális antitesttel vagy FK1012-vel végzett kezelése után a tirozin-foszforilációt alfa-foszfotirozin monoklonális antitestek alkalmazásával mutattuk ki. A teljes sejtlizátumokat a

- 106 w stimulálás után különböző idővel vizsgáltuk. A tirozin-főszfóriIáit meg az anti-CD3 stimulálás után.

proteinek hasonló mintázatát figyeltük

MAb-vel, illetve FK1012-vel végzett

A mintázat egy 70 kD-os fő sávból (feltehetően ZAP-70), és 120, kD-os, 62 kD-os, 55 kD-os és kD-os kis sávokból állt.

4/B példa

A programozott sejtpusztulás szabályozása immunofilin-Fas antigén kimérákkal

A Fás antigén a sejtfelületi receptorok idegsejt növekedési faktor (NGF)/tumor nekrózis faktor (TNF) receptor szupercsaládjának tagja. A Fás antigén extracelluláris doménjéhez való (antitestekkel végzett) keresztkötés-képzése egy kevéssé tisztázott jelölési utat aktivál, ami programozott sejtpusztulást vagy apoptozist eredményez. A Fás antigén és a vele kapcsolatos apoptozisos jelölési út a legtöbb sejtben, valószínűleg valamennyi tumorsejtben jelen van. A Jelölési út gyors (két órán belüli) és egyedülálló sejtpusztuláshoz vezet, amit kondenzált citoplazma, valamint a gyulladásos reakció és a nukleoszomális DNS fragmentálódásának hiánya jellemez, melyek egyike sem jellemző a nekrotikus sejtpusztulásra.

Kifejlesztettünk egy másik indukálható Jelölési rendszert is, amely apoptozisos sejtpusztulást eredményez. AZ MZF3E reakcióúthoz hasonlóan ezt is egy mesterséges receptor

- 107 aktiválása indítja el, mely receptor egy konstitutivan expresszált reagáló gén terméke. Ez az új reakcióút abban tér el az elsőtől, hogy HÓD reagensünk egy transzfektált, indukáltható (azaz riporter) gén terméke helyett egy endogén reakcióút termékeinek szintézisét indukálja.

A Fás reakcióút szabályozásának biztosítása a biológiai kutatások és az orvostudomány szempontjából jelentős lehetőségeket teremt. Sejt-specifikus promoterek szabályozása alatt álló, pusztulásra reagáló génekkel transzgénikus állatokat hozhatók létre. A felnőtt állatoknak HÓD reagenst beadva a célsejtek kémiai úton eltávolíthatók. Ezen a módon értékelhető lenne a specifikus agysejtek emlékezésben vagy megismerésben, illetve az immunsej tek autoimmun betegségek kialakításában és fenntartásában Játszott szerepe. A pusztulásra reagáló gének M. Blaese és munkatársai által kifejlesztett humán génterápiás eljárással (Culver és mtsi, Science, 256. 5063, 1992: 1550-1552) tumorokba vihetők be, s ezután (hasonlóan az utóbbi időben agytumorok kezelésére leírt gancyclovir génterápiás klinikai kísérletekhez) a páciens HÓD reagenssel végzett kezelésével aktiválhatok. Végül, a génterápiában egy pusztulásra reagáló gén gyógyhatású génnel együttes alkalmazását tervezzük. Ez a génterápia üzembiztos összetevőjét biztosítaná. Ha valami rosszul sikerül (például egy tumor-szuppresszor gén integráció-indukálta elvesztése, ami rákot eredményez), a génterápiával kezelt páciens

108 bevehet egy üzembiztos pirulát, ami valamennyi transzfektált sejtet elpusztítja. Következésképpen, ilyen célokra ortogonális oligomerizáló reagensekből álló rendszert terveztünk.

Ennek megfelelően, a ligandumok és a reagáló kiméra proteinek két készletének alkalmazását tesszük lehetővé;

az egyik a gazdasejtekben az apoptózis másik gyógyhatású gének transzkripciójának szabályozásához alkalmas. A gyógyhatású, illetve kívánság szerinti gén transzkripciój ának szabályozásához alkalmazott ligandumokat úgy tervezzük (vagy választjuk ki), hogy ne legyenek kereszt-reaktívak, és ne indukáljanak apoptózist.

Egy példaként szolgáló kiméra cDNS-t készítettünk, amely három, a Fás antigén citoplazmikus jelölő doménjéhez fúzionált FKBP12 domént tartalmazott (19.

ábra). Ez a konstrukció humán Jurkat.

T-sejtekben vagy egér D10 T-sej tekben expresszálva

FK1012 reagenssel dimerizációra indukálható és jelölő kaszkádot indít el, ami

FK1012-dependens apoptozist eredményez.

Az MFF3E-vel ideiglenesen transzfektált sejtek FK1012A-közvetítette pusztulására vonatkozó LDso értéke 15 nM, amit a riporter gén aktivitásának csökkenéséből határoztunk meg (19. ábra; a vizsgálat leírását ld. a 20. ábra leírásában). Ezek az adatok jó egyezést mutatnak a stabilan transzfektált sejtvonalakban mért sejtpusztulási értékekkel. Mivel a stabil transzfektánsok homogén sejtpopulációt képviselnek, ezeket használtuk annak bizonyítására, hogy a sejtpusztulást

109 az apoptózis, és nem a nekrózis (membránhólyagosodás, nukleoszomális DNS-fragmentálódás) okozza. Az ideiglenes transzfektálási eljárás azonban sokkal kényelmesebb, s emiatt ezt használtuk kiindulási vizsgálati rendszerként (amint azt a későbbiekben leírjuk).

4/C példa

A programozott sejtpusztulás szabályozása ciklofilin-Fas antigén kimérákkal

Ciklofilin C-Fas antigén konstrukciók sorozatát is elkészítettük, és ideiglenes expressziós vizsgálatokban a (CsA)2-dependens apoptózist indukáló képességüket vizsgáltuk (20/A ábra). A sorozat legaktívabb tagjával, az MC3FE-vel (M - az Src mirisztoilációs doménje; C - ciklofilin dómén; F = a Fás citoplazmikus farka; E = flu epitóp toldalék) stabilan transzfektált humán Jurkat T-sejtek esetében (CsA)2-dependens apoptozist mutattunk ki. A Fás citoplazmikus farkát 1, 2, 3 vagy 4 egymás utáni ciklofilin dómén előtt vagy után fúzionáltuk. Két kontroll konstrukciót is készítettünk, melyekből hiányzott a Fás dómén. Ebben az esetben azt tapasztaltuk, hogy a jelölő dómén csak akkor működik, ha a dimerizációs domének után helyezkedik el. (A zéta-lánc a dimerizációs dómén előtt és után elhelyezkedve is hoz létre jelet.) A nyolc jelölő konstrukció Western biot technikával kimutatott expressziós szintje, illetve aktivitása mérhetően különbözött (20/B ábra). Az optimális rendszernek az

MC3FE bizonyult. Az MC3FE esetében a

110 (CsA)2-közvetítette sejtpuszulásra vonatkozó LDbo érték kb.

200 nM. Ezek az adatok bizonyítják a ciklofilin-ciklosporin kölcsönhatások intracelluláris protein-asszociáció szabályozásában való alkalmazhatóságát, és olyan ortogonális reagens-rendszert jellemeznek, amely nem kereszt-reaktív az FKBP12-FK1012 rendszerrel. Ebben az esetben az adatok azt is bizonyítják, hogy a Fás citoplazmikus farok által bekövetkező jelátalakítás beindításához csak dimerizáció, s nem aggregáció szükséges.

A mirisztoilációs jel N-terminális glicinjének alaninná való mutációja megakadályozza a mirisztoilálást, s így a membrán-lokalizációt is. Megfigyeltük továbbá, hogy a mutált konstrukció (4MFF3E·) az FK1012-dependens apoptózis indukálójaként ugyanolyan hatásos volt, ami azt jelzi, hogy a membrán-lokalizáció nem szükséges a Fas-közvetítette sej tpusztuláshoz.

5. példa

Egér jelző kiméra protein kialakítása

A különböző fragmenseket a 4. ábrán bemutatott primerek alkalmazásával kaptuk. A primerek számozásánál a 4. ábrán látható számozást vesszük figyelembe.

A jelzőpeptid forrásaként az egér II. osztályú MHC receptorának (Cell, 32, 745) I-E láncát tartalmazó kb. 1,2 kb-os cDNS-fragmenst használtuk, és a forgalmazó (Promega)

111 útmutatásai szerint végzett PCR-ral a P6048 és P6049 prímért alkalmazva egy 70 bp-os SacII-XhoI fragmenst kaptunk. A CD3 transzmembrán doménjéhez és citoplazmikus doménjéhez kapcsolt Tac-ot (IL-2 receptor lánc) tartalmazó plazmid alkalmazásával egy második fragmenst kaptunk. A P6050 és P6051 prímért alkalmazva PCR-ral egy 320 bp-os, a CD3 (PNAS, 88. 8905) transzmembrán doménjét és citoplazmikus doménjét tartalmazó XhoI-EcoRI fragmenst kaptunk. Ezt a két fragmenst ligáltuk és egy SacII-EcoRI enzimekkel emésztett pBluescript vektorba (Stratagene) inszertáltuk, miáltal az SPZ/KS plazmidot kaptuk.

Az FK506-hoz való kötő-domén kialakításához az rhFKBP plazmidot (melyet S. Schreiber bocsátott rendelkezésünkre; Natúré, 346. 674, 1990) a 6052-es és 6053-as primerrel együtt alkalmaztuk, miáltal a humán FKBP12-t tartalmazó 340 bp-os Xhol-Sall fragmenst kaptuk. Ezt a fragmenst Xhol és Sáli enzimekkel emésztett pBluescript vektorba inszertáltuk, hogy az FK12/KS plazmidot kapjuk, amely az FKBP12 kötő-domén forrása lett. Az SPZ-KS plazmidot Xhol-gyel emséztettük, az önhibridizáció megelőzése érdekében foszfatázzal (sejtbelseji alkalikus foszfatázzal; CIP) kezeltük, majd az FK12/KS plazmidból származó, FKBP12-t tartalmazó Xhol-Sall fragmens tízszeres moláris feleslegével elegyítettük. Az FKBP12 monomereit, dimereit, illetve trimereit helyes orientációban tatalmazó kiónokat izoláltuk. Az 1FK1/KS, 1FK2/KS, illetve 1FK3/KS klón a transzkripció irányában a egér II. osztályú MHC I-E génből származó

- 112 jelzőpeptidet; a humán FKBP12 monomerét, dimerét. illetve trimerét; és a CD3 transzmembrán és citoplazmikus részét tartalmazza. A SacII-EcoTI fragmenseket restrikciós enzimekkel végül kivágtuk a pBluescript. vektorból, és a SacII-vel és EcoRI-gyel emésztett pBJ5 polilinkerébe ligáltuk, miáltal az lFKl/pBJ5, lFK2/pBJ5, illetve lFK3/pBJ5 plazmidokat hoztuk létre (ld. 3. és 4. ábra).

6. példa

A) Intracelluláris jelzőkiméra kialakítása

Egy c-src-ből származó mirisztoilációs szekvenciát (Pellman és mtsi, Natúré, 314. 374) a CD3 komplementer szekvenciájához kapcsoltunk, hogy a transzmembrán doméntől 3' irányban lévő szekvenciával komplementer prímért (8908-as primer) állítsunk elő. Ez a primer 5' végével szomszédos SacII hellyel és a mirisztoilációs szekvencia 3' végével szomszédos Xhol szekvenciával rendelkezik. A 8462-es másik primer a CD3 3' végével komplementer szekvenciától 3' irányban egy Sáli felismerési hellyel, stop kodonnal és egy EcoRI felismerési hellyel rendelkezik. PCR alkalmazásával 450 bp-os SacII-EcoRI fragmenst kaptunk, amely az 5'-3' irányban fuzionált mirisztoilációs szekvenciából és CD3 szekvenciából állt. Ezt a fragmenst SacII-vel és EcoRI-gyel emésztett pBJ5(Xhol)(Sáli) plazmidba ligáltuk és klónoztuk, miáltal az MZ/pBJ5 plazmidot kaptuk. Az MZ/pBJ5 plazmidot végül Sáli

113 plazmáddal emésztettük, foszfatázzal kezeltük, az FK12/KS-ből származó, FKBP12-t tartalmazó Xhol-Sall fragmens tízszeres moláris feleslegével elegyítettük és ligáltuk. Klónozás után az 5'-3' irányban mirisztoilációs szekvenciával, CD3-mal és FKBP12 múltimerekkel rendelkező konstrukciókat tartalmazó plazmidokat izoláltuk és igazoltuk, hogy a megfelelő szerkezettel rendelkeznek (ld. 2. és 4. ábra).

B) Intracelluláris íelzőkimérák expressziós kazettáinak előállítása

Az MZ/pBJ5 (MZE/pBJ5) kosntrukciót Xhol és Sáli restrikciós enzimekkel emésztettük, a TCR zéta fragmenst eltávolítottuk, és a kapott vektort az FKBP12 monomerének, dimerének, trimerének vagy magasabb rendű multimerének tízszeres feleslegével ligáltuk, hogy MF1E, MF2E, MF3E vagy MF_nE/pBJ5 plazmidot kapjunk. Ezután az MF_nE/pBJ5 Xhol vagy Sáli restrikciós helyeire olyan aktív doméneket klónozhatunk, amelyeket úgy alakítunk ki, hogy megfelelő szegélyező restrikciós felismerési helyeket (Xhol és Sáli) tartalmazzanak.

- 114 -

7. példa

Sejtmagi kiméra előállítása

A) GAL4 DNS-kötő dómén - FKBP domén(ek) - epitóp toldalék

A GAL4 DNS-kötő domént (1-147. aminosavak) a Kozák szekvenciától upstream irányban SacII helyet és transzlációs start helyet tartalmazó 5' primer (37-es) és egy Sáli helyet tartalmazó 3' primer (38-as) alkalmazásával PCR-ral amplifikáltuk. A PCR terméket izoláltuk, SacII és Sáli enzimekkel emésztettük, és a pBluescript II KS (+) vektor SacII és Sáli helyeire ligáltuk, miáltal a pBS-GAL4 konstrukciót hoztuk létre. A konstrukció szerkezetét szekvenálással igazoltuk. A pBS-GAL4 Sacll/Sall fragmensét izoláltuk és az IFKl/pBJ5 és IFK3/pBJ5 konstrukciók (melyek mirisztoilációs szekvenciát tartalmaznak; ld. 6. példa) SacII és Xhol helyeire ligáltuk, miáltal a GF1E, GF2E és GF3E konstrukciókat hoztuk létre.

A PCR-ral amplifikált termék 5' vége:

|----Gal4( 1-147)----»

SacII Μ K L L S S I

5' CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCG

Kozák • · • · · ·

- 115 A PCR-ral amplifikált termék 3' vége:

«----Gal4( 1-147----)|

R Q L T V S

5' GACAGTTGACTGTATCGGTCGACTGTCG

3' C-TGTCAACTGACATAGCCAGCTGACAGC

Sáli

Hl ΗΝΕ1 dimerizáció/DNS-kötő dómén- FKBP dómén(ek) toldalék

A HNFla dimerizáció/DNS-kötő domént (1-282. aminosavak) a Kozák szekvenciától és a transzlációs start helytől upstream irányban SacII helyet tartalmazó 5' primer (39-es) és egy Sáli helyet tartalmazó 3' primer (40-es) alkalmazásával PCR-ral amplifikáltuk. A PCR terméket izoláltuk, SacII és Sáli enzimekkel emésztettük, és a pBluescript II KS (+) vektor SacII és Sáli helyeire ligáltuk, miáltal a pBS-HNF konstrukciót hoztuk létre. A konstrukció szerkezetét szekvenálással igazoltuk. A pBS-HNF SacII/Sall fragmensét izoláltuk és az IFKl/pBJ5 és IFK3/pBJ5 konstrukciók SacII és Xhol helyeire ligáltuk, miáltal a HF1E, HF2E és HF3E konstrukciókat kaptuk.

A PCR-ral amplifikált termék 5' vége:

| —HNF1( 1-281)---»

SaoLI . Μ V S K L S

5' CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC

Kozák « · • · · · • · · · · * · • · · · ·«· · • * · · · · ·

- 116 A PCR-ral amplifikált termék 3' vége:

«-----HNF1 (1-282)-]

A F R Η K L

5' CCTTCCGGCACAAGTTGGTCGACTGTCG

3' GGAAGGCCGTGTTCAACCAGCTGACAGC

Sáli

C) FKBP domén(ek) - VP16 transzkripciós aktivációs domén(ek)

- epitQR..tQldalék

Ezeket a konstrukciókat három lépésben állítottuk elő: (i) az IFK3/pBJ5-ből olyan konstrukciót készítettünk, amelyben a mirisztoilációs szekvenciát egy Xhol helytől közvetlenül upstram irányban start hellyel helyettesítettük, miáltal az SF3E konstrukciót kaptuk; (ii) az Xhol helyre egy sejtmagi lokalizációs szekvenciát inszertáltunk, s így az NF3E konstrukciót hoztuk létre; (iii) a VP16 aktivációs domént az NF3E Sáli helyére klónoztuk, miáltal az NF3V1E konstrukciót alakítottuk ki.

(i) SacII és Xhol helyek között egy Kozák szekvenciát és egy start helyet tartalmazó komplementer oligonukleotidokat(45. és 46.) hibridizáltunk, foszforiláltunk, és ezeket az MF3E SacII és Xhol helyére ligáltuk, miáltal az SF3E konstrukciót hoztuk létre.

- 117 Általános start hely inszerciója

Kozák _____M L E

GGCCACCATGC

CGCCGGTGGTACGAGCT

SacII Xhol túlnyúló túlnyúló (ii) Az SV40 T antigén sejtmagi lokalizációs szekvenciáját 5' Sáli hely és 3' Xhol hely között tartalmazó 47-es és 48-as komplementer oligonukleotidokat hibridizáltuk, foszforiláltuk és az SF1E Xhol helyére ligáltuk, miáltal az NF1E konstrukciót hoztuk létre. A konstrukció szerkezetét DNS-szekvenálással igazoltuk. A sejtmagi lokalizációs szekvencia mutáns vagy hibás formáját (melyben a 128. helyen lévő lizin helyett treonin van Jelen) tartalmazó konstrukciót szintén izoláltuk, és ezt NFlE-M-nek neveztük el. Az FKBP12 dómén multimereit úgy kaptuk, hogy az FKBP12 szekvenciát a pBS-FKBP12-ből Xhol/Sall fragmensként izoláltuk, és ezt a fragmenst az Xhol-gyel linearizált NFlE-be ligáltuk, miáltal az NF2E és NF3E konstrukciókat hoztuk létre.

118

Az NLS inszerciója az általános start helyre:

T (ACN)

126 132

LDPKKKRKVLE

5' TCGACCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTAC ____GGGATTCTTCTTCTCTTTCCATGAGCT

Sáli Xhol

A 128. helyen álló treonin hibás NLS-t eredményez.

(iii) A VP16 transzkripciós aktivációs domént (413-490. aminosavak) a Sáli helyet tartalmazó 43-as 5' prímért és Xhol helyet tartalmazó 44-es 3' prímért alkalmazva PCR-ral amplifikáltuk. A PCR terméket izoláltuk, Sáli és Xhol enzimekkel emésztettük és az MF3E Xhol és Sáli helyeire ligáltuk, miáltal az MV1E konstrukciót hoztuk létre. A konstrukció szerkezetét szekvenálással igazoltuk. Az MV1E konstrukcióból a VP16 szekvenciát Xhol/Sall fragmensként izolálva, és ezt a fragmenst az Xhol-gyel linearizált MVlE-be ligáivá múltimerizált VP16 domént alakítottunk ki.

Ezen a módon az MV2E, MV3E és MV4E konstrukciókat állítottuk elő. Az egy vagy több VP16 domént kódoló DNS-fragmenseket az MV1E vagy MV2E konstrukcióból Xhol/Sall fragmensként izoláltuk, és a Sall-gyel linearizált NFlE-be ligáltuk, miáltal az NF1V1E és NF1V3E konstrukciókat állítottuk elő.

Az FKBP12 dómén multimereit úgy kaptuk, hogy az FKBP12 szekvenciát a pBS-FKBP12-ből

Xhol/Sall fragmensként izoláltuk, és ezt a fragmenst az Xhol-gyel linearizált

NFIVlE-be ligáltuk, miáltal az NF2V1E és NF3V1E ·· ·*ί·

- 119 konstrukciókat kaptuk.

A PCR-ral amplifikált termék 5' vége:

Sáli |—VP16( 413-490)---» ______ A P P T D V

5' CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC

A PCR-ral amplifikált termék 3' vége:

«—VP16( 413-490)-------1

D E Y G G

5' GACGAGTACGGTGGGCTCGAGTGTCG

3' CTGCTCATGCCACCCGAGCTCACAGC

Xhol

Oligonukleotidok:

37- es: 38mer/0,2 jum/OFF 5'CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTT

CTATCG

38- as: 28mer/0,2 tan/OFF 5'CGACAGTCGACCGATACAGTCAACTGTC

39- es: 34mer/0,2 wn/OFF 5'CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC

40- es: 28mer/0,2 jum/OFF 5'CGACAGTCGACCAACTTGTGCCGGAAGG

43- as: 29mer/0,2 /.m/OFF 5'CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC

44- es: 26mer/0,2 jum/OFF 5' CGACACTCGAGCCCACCGTACTCGTC

45- ös: 26mer/0,2 μιη/OFF 5'GGCCACCATGC

46- os: 18mer/0,2 um/OFF 5'TCGAGCATGGTGGCCGC

47- es: 27mer/0,2 ^m/OFF 5'TCGACCCTAAGA-(C/A)-GAAGAGAAAGGTAC

48- as: 27mer/0,2 um/OFF 5'TCGAGTACCTTTCTCTTC-(G/T)-TCTTAGGG

120

8. példa

A transzkripciós indukció bizonyítása

Jurkat TAg sejteket elektroporációval (960 pF, 250 V) a feltüntetett konstrukciókkal (mindegyikből 5 ug) transzfektáltunk. 24 óra elteltével a sejteket friss tápközegben újraszuszpendáltuk és adagokra osztottuk. Valamennyi transzfektálás felét az FK506 dimer származékkal (14. példa) (1 μΜ végkoncentráció) inkubáltuk. 12 óra elteltével a sejteket mostuk és ismételt fagyasztással és felolvasztással sejtkivonatokat készítettünk. Standard eljárással klóramfenikol-acetiltranszferáz (CAT) aktivitást mértünk (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, szerk.: Sambrook és mtsi., CSH Laboratory, 16-59. old. és a következő lapokon, 1989). Az adatok azt bizonyítják, hogy a várakozásoknak megfelelően (2. példában, ligandummal vagy anélkül; az 5. és 6. példában, ligandum jelenlétében) 37 ’Con 18 óráig végzett inkubálás után az extraktum 70 μΐ-ében (a kivonat összes térfogata 120 μΐ} van jelen CAT aktivitás. A vizsgálathoz alkalmazott minták az alábbiak:

1. G5E4TCAT (GAL4-CAT riporter plazmid)

2. G5E4TCAT, GAL4-VP16

3. G5E4TCAT, NF3V1E

4. G5E4TCAT, GF2E

5. G5E4TCAT, GF2E, NF3V1E

6. G5E4TCAT, GF3E, NF3V1E

121

Szintetikus kémiai példák

Amint már korábban említettük, az oligomerizációs szerekként jelenleg különösen nagy jelentőségű vegyületek a linker—{rmbi,rbm2,...rbm_n} szerkezettel rendelkeznek, ahol a linker olyan kapcsolómolekula (mint pl. a találmányunkban leírtak), amely n számú (n értéke 2-5, rendszerint 2 vagy 3) , egyforma vagy különböző receptor-kötő molekularészhez (rbm; receptor bindin moiety) kovalensen kapcsolódik. Amint azt a találmány leírásában másutt említettük, a receptor-kötő molekularész egy ismert receptor (mint pl. az V.(C) szakaszban felsoroltak) liganduma, melyek közé az FK506, FK520, rapamicin és ezek FKBP-hez kötődni képes analógjai, valamint a ciklosporinok, tetraciklinek, egyéb antibiotikumok és makrolidek, illetve szteroidok tartoznak, melyek képesek a megfelelő receptorokhoz kötődni.

A linker két vagy több funkciós csoportot tartalmazó molekula, amely két vagy több receptor-kötő molekularészhez kovalensen (—) kötődik. A linker jellemzően legfeljebb kb. 40 atomból állhat, s a szén- és hidrogénatomokon kívül tartalmazhat nitrogén-, oxigén- és kénatomokat is. A jellemző linkereket a VI(A) szakaszban és a különböző példákban mutatjuk be, s többek között ezek közé tartoznak az 1-30 szénatomos alkil-, alkilén- vagy aril-alkil-csoportok, melyek lehetnek szubsztituáltak vagy szubsztituálatlanok, illetve lehetnek egyenes vagy elágazó

122 láncúak, illetve ciklusosak. Az alkil szubsztituensek például telített, egyenes láncú, ciklusos vagy elágazó láncú, előnyösen kb. 1-12 szénatomos szénhidrogén csoportok lehetnek, mint pl. metil-, etil-, η-propil-, i-propil-, ciklopropil-, η-butil-, i-butil-, t-butil-, ciklobutil-, ciklopropil-metilén-, pentil-, hexil-, heptil-, oktil-csoport, stb., melyek egy vagy több szubsztituenssel, mint pl. kis szénatomszámú alkoxi-, karboxil-, (szubsztituált vagy szubsztituálatlan) amino-, fenil-, aril-, merkapto-, azido- vagy cianocsoporttal, illetve halogénatommal (fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal) lehetnek szubsztituáltak.

Ezek a vegyületek a tudományban ismert szokványos anyagok és/vagy eljárások alkalmazásával állíthatók elő. Ezekhez a vegyületekhez a fentebb leírtak szerint génsebészetileg előállított receptorokat biztosíthatunk. Különösen jelentősek azok a vegyületek, amelyek 10^-6 M-nál, előnyösen ΙΟ^-7 M-nál, még előnyösebben 10^-8 M-nál kisebb Kd értékkel kötődnek egy receptorhoz.

A szóban forgó oligomerizáló szerek egyik alosztályába azok a molekulák tartoznak, amelyekben egy vagy több receptor-kötő molekularész FK506, FK506-típusú vegyület vagy annak származéka, s a receptor-kötő molekularészek — az FK506 számozása szerint — a 21. szénatomnál lévő allilcsoporton keresztül [a 9/A ábrán az (5) vagy (13) vegyület esetében], vagy a ciklohexil gyűrűn keresztül (29-34. szénatom), pl. a 32. szénatomon lévő hidroxilcsoporton keresztül [a 9/B ábrán

123 a (8), (16), és (17) vegyület esetében] keresztül kapcsolódnak a linkerhez. Az ezen alosztályba tartozó molekulák a találmányban az alábbi példákban leirt eljárások alkalmazásával állíthatók elő.

A szóban forgó oligomerizáló szerek másik alosztályát azok a molekulák képezik, amelyekben a receptor-kötő molekularészek legalább egyike FK520 vagy annak származéka, s az FK520 vagy származékainak molekulái kovalensen kapcsolódnak a linkerhez, mint pl. a 10. ábrán látható FK1040A vagy FK1040B esetében. Az ezen alosztályba tartozó vegyületek a 10. ábrán látható 1. reakcióvázlat, a 11/A és 11/B ábrán látható 2. reakcióvázlat vagy a 12. és 13. ábrán látható 3. reakcióvázlat alapján állíthatók elő.

A szóban forgó oligomerizáló szerek további alosztályát azok a molekulák képezik, amelyekben a receptor-kötő molekularészek legalább egyike ciklosporin A vagy annak származéka.

Tudni kell, hogy a fenti és egyéb találmány szerinti oligomerizáló szerek lehetnek homo-oligomerizáló szerek, melyekben az rbm-ek azonosak, illetve hetero-oligomerlzáló szerek, melyekben az rbm-ek különbözők. A hetero-oligomerizáló szerek a találmányban bemutatott eljárások, köztük a 13. ábrán látható 3. reakcióvázlat alapján, valamint a találmány leírásában másutt leírtak szerint állíthatók elő.

124

Az alábbi szintézises példákat, jellemzésként írjuk le.

A) Általános eljárások

Valamennyi reakciót mesterségesen szárított üvegedényben, pozitív nyomású nitrogén- vagy argongáz alatt végeztük. A levegőre vagy nedvességre érzékeny vegyületeket gumi válaszfalon keresztül fecskendő vagy kanül alkalmazásával adagoltuk.

B) Fizikai adatok

A protonmágnesen rezonancia-spektrumot (^XH NMR) Bruker AM-500 (500 MHz) és AM-400 (400 MHz) spektrométerben mértük.

A kémiai eltolódást a tetrametil-szilán jelétől ppm-ben adjuk meg, belső standardként az oldószer rezonanciáját haszálva (kloroform, 7,27 ppm). Az adatokat az alábbiak szerint adjuk meg: kémiai eltolódás, jelfelhasadás (s = szingulett, d = dublett, t = triplett, q = kvartett, br = széles, m = multiplet), csatolási állandó, integráció. Kisés nagyfelbontású tömegspektrumot kaptunk.

C) Kromatográfia

A reakciókat vékonyréteg-kromatográfiával (TLC)

ellenőriztük,	nelyhez E. Merek szilikagél 60F üveglemezeket
(0,25 mm)	használtunk. A komponenseket jódgőzben
hosszúhullámú	ultraibolya fénnyel megvilágítva és/vagy

- 125 cérium(IV)-ammónium-molibdát-oldatban áztatva és melegítve tettük láthatóvá. A kromatografáláshoz HPLC minőségű oldószereket alkalmaztunk. A feltüntetett oldószer-rendszer E. Merek szilikagél 60 oszlopon (230-400-as szemcseméret) végzett kényszeráramoItatásával (flash kromatográfia) folyadékkromatográfiát végeztünk.

D) Oldószerek és reagensek

Valamenni reagens és oldószer analitikai tisztaságú volt, s az alábbi kivételektől eltekintve valamennyit további kezelés nélkül alkalmaztuk. A tetrahidrofuránt (THF), benzolt, toluolt és dietil-étert nátrium-fém-benzofenon-ketilből desztilláltuk. A trietil-amint és acetonitrilt kalcium-hidridből, a diklór-metánt foszfor-pentoxidból desztilláltuk. A dimetil-formamidot (DMF) csökkentett nyomáson kalcium-hidridből desztilláltuk és 4 A-ös molekulaszűrókön tároltuk.

FK506-származékok előállítása

9. példa

Az FK506-TBS2 hidrobórozása/oxidálása [(1) —> (2)]

A hidrobórozást Evans eljárása (Evans és mtsi, JACS, 114. 6679, 1992; JACS, 114. 6679-6685; 1992) szerint végeztük (a számozást illetően ld. Harding és mtsi, Natúré, 341. 758, 1989). Egy 10 ml-es lombikba 24,32-bisz[ ( tei'c-butil-dimetil- 126 -szilil)-oxi]-FK506-ot (33,8 mg, 0,033 mmól) és

CRh(nbd)(diphos-4)]BF4-et (3,1 mg, 0,004 mmól), 13 mól%) töltöttünk. A narancssárga elegyet toluolban (2,0 ml) feloldottuk, és az oldószert csökkentett nyomáson négy óra alatt eltávolítottuk. A lombikot nitrogéngázzal óvatosan átöblítettük, a narancssárgás olajat THF-ban feloldottuk (3,0 ml, mM végkoncentráció), és jégfürdőben 0 °C-ra hűtöttűk.

Az oldathoz fecskendővel pirokatechin-boránt (98 ul, 0,098 mmól, 1,0 M THF-os oldat,

3,0 egyenérték) adtunk, s a keletkezett oldatot 0 °C-on percig kevertük. A reakciót 0 °C-on 0,2 ml THF/EtOH (1:1), majd 0,2 ml pH = 7,0 puffer (Fischer; 0,05 M foszfát-puffér), végül 0,2 ml 30 %-os hidrogén-peroxid hozzáadásával elfojtottuk. Az oldatot szobahőmérsékleten legalább 12 óra hosszat kevertük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítottuk, a visszamaradt olajat benzolban (10 ml) feloldottuk és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldattal (10 ml) mostuk. A fázisokat elkülönítettük, és a vizes fázist benzollal (2 x 10 ml) visszaextraháltuk. A szerves fázisokat elegyítettük és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldattal (10 ml) mostuk. A benzolos fázist magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk és flash kromatográfiának vetettük alá (2:1 arányú hexán/etil-acetát eleggyel), miáltal a kívánt primer alkoholt tiszta színtelen olajként kaptuk (12,8 mg; 0,012 mmól, 37 %).

«· ·«·· · · ·· • · · · · · · ··· · ·· « · • * · · · · ·

- 127 Vegyes karbonát előállítása [(2) —> (3)]

A vegyes karbonát előállítását Ghosh eljárása szerint (Ghosh és mtsi, Tetrahedron Lett., 52, 2731-2784, 1992) végeztük. Egy 10 ml-es lombikba a primer alkoholt (29,2 mg; 0,0278 mmól) és benzolt (4 ml) töltöttünk. Az oldószert csökkentett nyomáson 60 perc alatt eltávolítottuk. Az olajat acetonitrilben (2,0 ml, 14 mM végkoncentráció) feloldottuk és 20 °C-on kevertük, miközben trietil-amint (77 μΐ, 0,56 mmól) adtunk hozzá. Az oldathoz egy részletbben

N, N'-diszukcin-imidil-karbonátot (36 mg, 0,14 mmól) adtunk, s az oldatot 20 °C-on 46 óra hosszat kevertük. A reakcióelegyet diklór-metánnal hígítottuk és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldattal (10 ml) mostuk. A fázisokat elkülönítettük, és a vizes fázist diklór-metánnal (2 x 10 ml) visszaextraháltuk. A szerves fázisokat elegyítettük, magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk és flash kromatografiának vetettük alá (3:1 - 2:1 - 1:1 arányú hexán/etil-acetát elegy alkalmazásával). A kívánt vegyes karbonátot tiszta, színtelen olajként izoláltuk (16,8 mg,

O, 014 mmól, 51 %).

Az FK506 dimerizációja [(3) —> (4)]

Egy száraz, 1 ml-es kúpos üvegfiolába (Kontes Scientific Glassware) az előző lépésben kapott vegyes karbonátot (7,3 mg, 0,0061 mmól) és acetonitrilt (250 pl, 25 mM végkoncentráció) töltöttünk. Az elegyhez trietil-amint (10 • 4 ·»«* ·*·· • 4 V · · «· ·«· · · ♦ · · 4 » · · · ·4

- 128 μΐ, 0,075 mmól), majd p-xililén-diamint (8,3 μΐ, 0,0027 mmól, 0,32 M oldat DMF-ben) adtunk. A reakcióélegyet 20 °C-on 22 órán keresztül kevertük, s diklór-metánnal (10 ml) hígítva elfojtottuk. Az oldatot telített vizes nátrium-bikarbonát-oldattal (10 ml) mostuk, a fázisokat elkülönítettük, és a vizes fázist diklór-metánnal (2 x 10 ml) visszaextraháltuk. A szerves fázisokat elegyítettük, magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk és 3:1 2:1 - 1:1 arányú hexán/etil-acetát elegy alkalmazásával flash kromatográfiát végeztünk, miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt védett dimert kaptuk (4,3 mg, 1,9 umól, 70 %) .

Az FK506 dimer védőcsoportjónak eltávolítása [(4) —> (5)]

A védett dimert (3,3 mg, 1,4 umól) keverőlapáttal felszerelt

1,5 ml-es polipropilén csőbe helyeztük, majd acetonitrilt (0,5 ml, 3 mM végkoncentráció) adtunk hozzá, és az oldatot 20 °C-on kevertük, miközben HF-ot (55 pl, 48 %-os vizes oldat; Fischer) adtunk hozzá. Az oldatot szobahőmérsékleten 18 óra hosszat kevertük. A védőcsoport nélküli FK506-ot ezután 15 ml-es kémcsőben diklór-metán és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldat között megosztottuk. A kémcsövet a fázisok összekeverése érdekében alaposan vortexeztük, és elkülönítés után a szerves fázist pipettával eltávolítottuk. A vizes fázist diklór-metánban (4 x 2 ml) visszaextraháltuk, az elegyített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk és 1:1:1 arányú hexán/THF/éter •a ···· • 4 * · · * · «*· ·· ·♦ · • 9 * « * ·

- 129 - 1:1 THF/éter elegy alkalmazásával flash kromatográfiát végeztünk, miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt dimert kaptuk (1,7 mg, 0,93 umól, 65 %}.

A fenti eljárás alapján egyéb monoaminok vagy diaminok, mint pl. benzil-amin (14), oktametilén-diamin, dekametilén-diamin, stb. is alkalmazhatók.

10. példa

Az FK506 redukálása L-szelektriddel [FK506 —> (6)J

Danishefsky és munkatársai kimutatták, hogy az FK506 L-szelektriddel végzett kezelése 22-dihidro-FK506-ot eredményez, melyben a 24. és 22. szénatom hidroxilcsoportjait boronát-észter köti le. (Coleman és Danishefsky, Heterocycles, 28. 157-161, 1989; Fischer és mtsi, J. Org. Chem., 56. 2900-2907, 1991).

A vegyes karbonát előállítása [(6) —> <7)J

Egy 10 ml-es lombikba 22-dihidro-FK506-sec-butil-boronátot (125,3 mg, 0,144 mmól) és acetonitrilt (3,0 ml, 50 mM végkoncentráció) töltöttünk, s ezt szobahőmérsékleten kevertük, miközben a tiszta oldathoz trietil-amint (200 pl, 1,44 mmól, 10 egyenérték) adtunk. Az oldathoz egy részletben N,N'-diszukcinimidil-karbonátot (184,0 mg, 0,719 mmól) adtunk, és a tiszta oldatot szobahőmérsékleten 44 órán keresztül kevertük. Az oldatot etil-acetáttal (20 ml)

130 hígítottuk és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldattal (10 ml) mostuk, majd- elkülönítettük a fázisokat. A vizes fázist etil-acetáttal (2 x 10 ml) visszaextraháltuk, a szerves fázisokat elegyítettük, magnézium-szulfáton szárítottuk, s a kapott olajat flash kromatográfiának (1:1 - 1:2 hexán/etil-acetát elegy) vetettük alá, miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt vegyes karbonátot kaptuk (89,0 mg, 0,088 mmó1, 61 %).

Az FK506 vegyes karbonát dimerizálása [(7) —> (8)]

Egy 1 ml-es száraz, kúpos üvegfiolába (Kontes Scientific Glassware) kevert karbonátot (15,0 mg, 0,0148 mmól) és diklór-metánt (500 μΐ, 30 mM végkoncentráció) adtunk. Az oldatot szobahőmérsékleten kevertük, miközben trietil-amint (9 r?l, 0,067 mmól, 10 egyenérték) , majd p-xililén-diamint (0,8 mg, 0,0059 mmól) adtunk hozzá. A reakcióelegyet 20 °Con 16 órán keresztül kevertük, majd diklór-metánnal (5 ml) hígítva elfojtottuk. Az oldatot telített vizes nátriumbikarbonát-oldattal (5 ml) mostuk, a fázisokat elkülönítettük, és a vizes fázist diklór-metánban (2x5 ml) visszaextraháltuk. A szerves fázisokat elegyítettük, magnézium-szulfáton szárítottuk, flash kromatográfiának (1:1 - 1:2 hexán/etil-acetát elegy) vetettük alá, miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt dimert kaptuk (7,4 mg, 3,8 ;mól, 65 %).

A fenti eljárást követve a xililén-diamin helyett egyéb

131 monoaminok, diaminok vagy triaminok (mint pl. benzil-amin (15), oktilén-diamin, dekametilén-diamin (16), bisz-p-dibenzil-amin, N-metil-dietilén-amin, trisz-amino-etil-amin (17), trisz-amino-propil-amin, 1,3,5-triamino-metil-ciklohexán, stb.) is alkalmazhatók.

11. példa

Az FK506 oxidatív hasítása és redukciója [(1) —> (9)]

Kelly eljárása szerint (VanRheenen és mtsi, Tetrahedron Lett.., ÍZ, 1973-1976, 1976) ozmilezést végeztünk. A hasítást Danishefsky eljárása szerint (Zell és mtsi, J. Org. Chem., fii, 5032-5036, 1986) végeztük. Az aldehid redukcióját Krishnamurthy eljárása szerint (J. Org. Chem., 46, 4628-4691, 1981) végeztük. Egy 10 ml-es lombikba 24,32-bisz[tero-butil-dimetil-szilil)-oxi]-FK506-ot (84,4 mg, 0,082 mmól), 4-metil-morfolin-N-oxidot (48 mg, 0,41 mmól, 5 egyenérték és THF-t (2,0 ml, 41 mM végkoncentráció) töltöttünk. Az elegyhez fecskendővel ozmium-tetroxidot (45 μ 1, 0,008 mmól, 0,1 egyenérték) adtunk. A tiszta, színtelen oldatot szobahőmérsékleten 5 óra hosszat kevertük. A reakcióelegyet ezután 50 %-os vizes metanollal (1,0 ml) hígítottuk, és egy részletben nátrium-perjodátot (175 mg, 0,82 mmól, 10 egyenérték) adtunk hozzá. A zavaros elegyet szobahőmérsékleten 40 percig kevertük, éterrel (10 ml) hígítottuk, majd telített vizes nátrium-bikarbonát-oldattal (5 ml) mostuk. A fázisokat elkülönítettük, és a vizes fázist éterrel (2 x 5 ml) visszaextraháltuk. Az elegyített szerves

132 fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk és szilárd nátrium-szulfittál (50 mg) kezeltük.

A szerves fázist leszűrtük és bekoncentráltuk, majd az olajat flash kromatográfiának vetettük alá (3:1 - 2:1 arányú hexán/etil-acetát elegy) miáltal tiszta, színtelen olajként bomlékony aldehid köztesterméket (53,6 mg) kaptuk.

Az aldehidet

THF-ban (4,0 ml) azonnal feloldottuk és nitrogéngáz alatt

-78 °C-ra hűtöttűk, majd lítiumtrisz[(3-etil-3-pentil)-oxi]-alumínium-hidriddel (0,60 ml,

0,082 mmól; 0,14 M oldat THF-ban, 1,0 egyenérték) kezeltük. A tiszta oldatot -78 ’C-on 10 percig kevertük, majd éterrel (4 ml) hígítva és telített vizes ammónium-klorid-oldatot (0,3 ml) hozzáadva elfojtottuk a reakciót. Az elegyet hagytuk szobahőmérsékletre felmelegedni, majd az oldat szárítása érdekében szilárd nátrium-szulfátot adtunk hozzá. Az elegyet ezután leszűrtük és bekoncentráltuk, s a kapott olajat flash kromatográfiával (2:1 arányú hexán/etil-acetát elegy) kezeltük, miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt alkoholt kaptuk (39,5 mg, 0,038 mmól, 47 %).

A vegyes karbonát előállítása [(9) —> (10)]

A vegyes karbonátot Ghosh eljárása szerint (Ghosh és mtsi, Tetrahedron Lett., 23, 2781-2784, 1992) állítottuk elő. Egy 10 ml-es lombikba a primer alkoholt (38,2 mg, 0,0369 mmól) és acetonitrilt (2,0 ml, 10 mM végkoncentráció) töltöttünk, s az elegyet szobahőmérsékleten kevertük, miközben

2,6-dimet il-piridint (43 /71, 0,37 mmól, 10 egyenérték)

133 adtunk hozzá. Az elegyhez egy részletben N,N'-diszukcin-imidil-karbonátot (48 mg, 0,18 mmól) adtunk, s az oldatot szobahőmérsékleten 24 óra hosszat kevertük. A reakcióelegyet éterrel (10 ml) hígítottuk és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldattal (10 ml) mostuk. A szerves fázisokat elkülönítettük, majd a vizes fázist éterrel (2 x 10 ml) visszaextraháltuk. A szerves fázisokat elegyítettük, magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk, majd flash kromatográfiának vetettük alá (2:1 - 1:1 hexán/etil-acetát elegy). A kívánt vegyes karbonátot tiszta, színtelen olajként izoláltuk (32,6 mg, 0,028 mmól, 75 %).

Benzil-karbamát előállítása [(10) —> (11)]

Egy száraz, 1 ml-es kúpos üvegfiolába (Kontes Scientific Glassware) a vegyes karbonátot (10) (8,7 mg, 0,0074 mmól) és acetonitrilt (500 pl, 15 mM végkoncentráció) töltöttünk. Az oldatot szobahőmérsékleten kevertük, miközben trietil-amint (10 pl, 0,074 mmól, 10 egyenérték), majd benzil-amint (1,6 pl, 0,015 mmól, 2 egyenérték) adtunk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 óra hosszat kevertük. Az oldószert vízmentes nitrogén-árammal eltávolítottuk, és az olajat közvetlenül flash kromatográfiának vetettük alá (3:1 - 2:1 hexán/etil-acetát), miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt védett monomert kaptuk (6,2 mg, 5,3 /mól, 72 %).

A védett monomert (6,2 mg, 5,3 /mól) forgólapáttal felszerelt 1,5 ml-es csőbe helyeztük, acetonitrilt (0,5 ml,

134 mM végkoncentráció) adtunk hozzá, s az oldatot szobahőmérsékleten kevertük, miközben HF-ot (55 μΐ, 48 %-os vizes oldat, Fischer, 3,0 N végkoncentráció) adtunk hozzá. Az oldatot szobahőmérsékleten 18 órán keresztül kevertük. A védőcsoport nélküli FK506-származékot ezután 15 ml kémcsőben diklór-metán és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldat között osztottuk meg. A kémcsövet a fázisok elegyítése érdekében alaposan vortexeztük, majd elválasztás után a szerves fázist pipettával eltávolítottuk. A vizes fázist diklór-metánnal (4 x 2 ml) visszaextraháltuk, s az elegyített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk és flash kromatográfiának vetettük alá (1:1 - 0:1 hexán/etil-acetát), miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt, védőcsoport nélküli benzil-karbamátot kaptuk (3,9 mg, 4,1 umól, 78 %).

A benzil-amint diaminnal, például xililén-diaminnal (12), hexametilén-diaminnal, oktametilén-diaminnal, dekametiléndiaminnal (13) vagy egyéb diaminokkal helyettesítve a találmány szerinti dimer vegyületek állíthatók elő.

12. példa

Az FK506 vegyes karbonátjainak (12) előállítása ml-es lombikba 24,32-bisz[(terc-butil-dimetil-szilil)-oxi]-FK506-ot (339,5 mg, 0,329 mmól), 4-metil-morfolin-N-oxidot (193 mg, 1,64 mmól, 5 egyenérték), vizet (0,20 ml) és THF-t (8,0 ml, 41 mN végkoncentráció) töltöttünk. Az

135 elegyhez fecskendővel ozmium-tetroxidot (0,183 ml, 0,033 mmól, 0,1 egyenérték, 0,18 M vizes oldat) adtunk. A tiszta, színtelen oldatot szobahőmérsékleten 4,5 óra hosszat kevertük. A reakcióelegyet 50 %-os vizes metanollal (4,0 ml) hígítottuk, és egy részletben nátrium-perjodátot (700 mg, 3,29 mmól, 10 egyenérték) adtunk hozzá. A zavaros elegyet szobahőmérsékleten 25 percig kevertük, éterrel (20 ml) hígítottuk és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldattal (10 ml) mostuk. A fázisokat elkülönítettük, majd a vizes fázist éterrel (2 x 10 ml) visszaextraháltuk. Az elegyített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk, és szilárd nátrium-szulfitot (50 mg) adtunk hozzá. A szerves fázist leszűrtük és bekoncentráltuk, a kialakult aldehidet THF-ban (8,0 ml) azonnal feloldottuk, majd nitrogéngáz alatt -78 °C-ra hűtöttük és lítium-trisz-[(3-etil-3-pentil)-oxi]-alumínium-hidriddel (2,35 ml, 0,329 mmól, 1,0 egyenérték; 0,14 M oldat THF-ban) kezeltük. A tiszta oldatot -78 °C-on 60 percig kevertük (TLC-vel gondosan ellenőriztük), majd a reakciót -78 °C-on éteres hígítással (5 ml) és telített vizes ammónium-klorid-oldat (0,3 ml) hozzáadásával elfojtottuk. Az elegyet hagytuk szobahőmérsékletre felmelegedni, majd a oldat szárítása érdekében szilárd nátrium-szulfátot adtunk hozzá. Az elegyet 20 percig kevertük, leszűrtük, bekoncentráltuk, s a kapott olajat acetonitrilben (10 ml) azonnal feloldottuk. A kapott primer alkohol acetonitriles oldatához 2,6-dimetil-piridint (0,380 ml, 3,3 mmól, 10 egyenérték) és Ν,N'-diszukcin-imidil-karbonátot (420 mg, 1,65 mmól, 5 egyenérték) adtunk. A

136 heterogén elegyet szobahőmérsékleten 19 órán keresztül kevertük, s ezalatt az oldatot éterrel (30 ml) hígítottuk és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldattal (20 ml) mostuk. A vizes fázist éterrel (2 x 10 ml) visszaextraháltuk, a szerves fázisokat elegyítettük és magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk, majd flash kromatográfiának vetettük alá (3:1 - 2:1 - 1:1 arányú hexán/etil-acetát). A kívánt vegyes karbonátot (12) tiszta, színtelen olajként izoláltuk (217 mg, 0,184 mmól; a négy lépésre összesen 56 %-os kitermelés).

13. példa

24,24',32,32'-tetrakisz-[(terc-butil-dimetil-szilil)-oxi]-FK1012-A előállítása (p-xililén-diamin híd)

Száraz, 1 ml-es kúpos üvegfiolába a vegyes karbonátot (23,9 mg, 0,0203 mmól) és acetonitrilt (500 μΐ, 41 mM végkoncentráció) töltöttünk. Az elegyhez trietil-amint (28 pl, 0,20 mmól, 10 egyenérték), majd p-xililén-diamint (46 pl, 0,0101 mmól, 0,22 M oldat DMF-ben) adtunk. A reakcióélegyet szobahőmérsékleten órán keresztül kevertük, az oldószert vízmentes nitrogén-árammal eltávolítottuk, majd az olajat közvetlenül flash kromatográfiának vetettük alá (3:1 - 2:1 - 1:1 hexán/etil-acetát elegy), miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt védett dimert kaptuk (11,9 mg, 5,3 jumól, 52 %).

137

14. példa

FK1012-A (13) előállítása (p-xililén-diamin híd)

A védett dimert (11,0 mg, 4,9 umól) keverőlapáttal felszerelt 1,5 ml-es polipropilén csőbe helyeztük, acetonitrilt (0,50 ml, 10 mM végkoncentráció) adtunk hozzá, s az oldatot 20 ’C-on kevertük, miközben HF-ot (55 μΐ, 48 %-os vizes oldat, 3,0 N végkoncentráció; Fischer) adtunk hozzá. Az oldatot szobahőmérsékleten 16 órán keresztül kevertük. A védőcsoport nélküli FK506-származékot 15 ml-es kémcsőbben diklór-metán és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldat között osztottuk meg. A kémcsövet a fázisok elegyítése érdekében alaposan vortexeztük, majd elválasztás után a szerves fázist pipettával eltávolítottuk.

A vizes fázist diklór-metánnal (4 x 2 ml) visszaextraháltuk, az elegyített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk és flash kromatográfiának vetettük alá (1:1:1 hexán/THF/éter - 1:1 THF/éter), miáltal tiszta, színtelen olajként az FK1012-A-t kaptuk (5,5 mg, 3,0 /.mól, 63 %).

15. példa

24,24',32,32'-tetrakisz[(terc-butil-dimetil-szilil)-oxi]-FK1012-B előállítása (diamino-dekán híd)

Száraz, 1 ml-es kúpos üvegfiolába a vegyes karbonátot (53,3 mg, 0,0453 mmól) és acetonitrilt (2,0 ml, 11 mM végkoncentráció) töltöttünk. Az elegyhez trietil-amint (16

138 pl, 0,11 mmól, 5 egyenérték), majd diamino-dekánt (61 pl, 0,0226 mmól, 0,37 M oldat DMF-ben) adtunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 órán keresztül kevertük, az oldószert vízmentes nitrogén-árammal eltávolítottuk, majd az olajat közvetlenül flash kromatográfiának vetettük alá (3:1 - 2:1 1:1 arányú hexán/etil-acetát elegy), miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt védett dimert kaptuk (18,0 mg, 7,8 /mól, 35 %) .

16. példa

FK1012-B (14) előállítása (1,10-diamino-dekán híd)

A védett dimert (18,0 mg, 7,8 /.mól) keverőlappal ellátott

1,5 ml-es polipropilén csőbe helyeztük, acetonitrilt (0,45 ml, 16 mM végtérfogat) adtunk hozzá, s az oldatot szobahőmérsékleten kevertük, miközben HF-ot (55 pl, 48 %-os vizes oldat, 3,6 N végkoncentráció; Fischer) adtunk hozzá. Az oldatot 23 °C-on 17 óra hosszat kevertük. Az FK1012-B terméket 15 ml-es kémcsőben diklór-metán és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldat között osztottuk meg. A kémcsövet a fázisok elegyítése érdekében alaposan vortexeztük, majd elkülönítés után a szerves fázist pipettával eltávolítottuk.

A vizes fázist diklór-metánnal (4 x 2 ml) visszaextraháltuk, az elegyített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk és flash kromatográfiának vetettük alá (100 %-os etil-acetáttól 20:1 arányú etilacetát/metanol elegyig), miáltal tiszta, színtelen olajként az FK1012-B-t kaptuk (5,3 mg, 2,9 pmól, 37 %).

139

17. példa

24,24',32,32'-tetrakisz-[(terc-butil-dimetil-szilil)-oxi]-FK1012-C előállítása (bisz-p-amino-metil-benzoil-diamino-dekán híd)

Száraz 25 ml-es cseppalakú lombikba a diamin linkért (15,1 mg, 0,0344 mmól) és 1,0 ml DMF-ot töltöttünk. A vegyes karbonátot és trietil-amint (0,100 ml, 0,700 mmól, 20 egyenérték) elválasztólombikban 2,0 ml diklór-metánban oldottunk, majd lassan (4 x 0,50 ml) bisz-p-amino-metil-1,10-diamino-dekán kevert oldatához adtuk. A vegyes karbonátot (12) tartalmazó lombikot diklór-metánnal (2 x 0,50 ml) mostuk, hogy biztosítsuk a kevert karbonát (12) tökéletes átvitelét. A reakcióelegyet 23 °C-on 16 óra hosszat kevertük, az oldószert vízmentes nitrogén-árammal eltávolítottuk, s a kapott olajat közvetlenül flash kromatográfiának vetettük alá (1:1 - 1:2 arányú hexán/etil-acetát elegy), miáltal tiszta, színtelen olajként a kívánt védett dimert kaptuk (29,6 mg, 11,5 /mól, 34 %).

18. példa

Az FK1012-C (15) előállítása

A védett dimert (17) (29,6 mg, 11,5 /mól) keverőlappal ellátott 1,5 ml-es polipropilén csőbe töltöttük, majd acetonitrilt (0,45 ml, 23 mM végkoncentráció) adtunk hozzá, s az oldatot szobahőmérsékleten kevertük, miközben HF-ot (55 Ul, 48 %-os vizes oldat, 3,6 N végkoncentráció; Fischer)

140 adtunk hozzá. Az oldatot szobahőmérsékleten 17 óra hosszat kevertük. A kívánt szimmetrikus dimert 15 ml-es kémcsőben diklór-metán és telített vizes nátrium-bikarbonát-oldat között osztottuk meg. A kémcsövet a fázisok elegyítése érdekében alaposan vortexeztük, majd elkülönítés után a szerves fázist pipettával eltávolítottuk. A vizes fázist diklór-metánnal (4 x 2 ml) visszaextraháltuk. az elegyített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk, bekoncentráltuk és flash kromatográfiának vetettük alá (100 %-os etil-acetáttól 15:1 arányú etil-acetát/metanol elegyig), miáltal tiszta, színtelen olajként az FK1012-C-t kaptuk (11,5 mg, 5,5 janól, 47 %).

CsA-származékok előállítása

19. példa

Me&nt(0Ac)-J?-OHⁱCsA (2)

MeBmt(OAc)-·»j-OAc¹-CsA-t (1) (161 mg, 124 mmól) (ld. Éber le és Nuninger, J. Org. Chem., 57, 2689, 1992) metanolban (10 ml feloldottunk. KOH-t (196 mg) vízben (8 ml) oldottunk. A KOH-oldat 297 /zl-ét (130 mmól, 1,05 egyenérték az (1) vegyület metanolos oldatához adtuk. A kapott oldatot szobahőmérsékleten inért atmoszféra alatt 4 órán keresztül kevertük, majd a reakciót ecetsavval (2 ml) elfojtottuk. A reakcióelegyet 5 cm x 25 cm-es (12 μ, 100 A) C18 oszlop alkalmazásával 70 ’C-on reverz fázisú HPLC-vel tisztítottuk, melynek során eluensként 0,1 % (V/V) trifluor-ecetsavat

141 tartalmazó 70 %-os acetonitril/víz elegyet használtunk. Tisztítás után a kívánt monoacetát (2) 112 mg-ját (72 %) kaptuk.

MeBmt(OAc)-?7-OCOIin¹CsA (3)

MeBmt(OAc)-ty-OH¹-CsA-t (2) (57 mg, 45,5 umól) és karbonil-diimidazolt (15 mg, 91 umól, 2 egyenérték) 50 ml-es gömbölyű fenekű lombikba helyeztünk és vízmentes THF-ban (6 ml) feloldottunk. Az oldathoz diizopropil-etil-amint (32 yl, 182 /mól, 4 egyenérték) adtunk, majd az oldószert szobahőmérsékleten forgó párologtatón eltávolítottuk. A maradékot szilikagélen, eluensként etil-acetát alkalmazásával flash kromatográfiával tisztítottuk, miáltal a kívánt karbamát (3) 45 mg-ját (73 %) kaptuk.

Trisz-(2-amino-etil)-amin-CsA trimer triacetát (6)

MeBmt(0Ac)-»?-0C0Im¹CsA-t (3) (7,5 mg, 5,54 ymól, 3,1 egyenérték) THF-ban (100 yl) oldottunk. Az oldathoz diizopropil-etil-amint (8,93 ymól, 5 egyenérték; 4 ml THF-ban 100 yl amint tartalamzó oldat 62 yl-e), majd trisz-(2-amino-etil)-amint (10 ml THF-ban 101 mg trisz-amint tartalmazó oldat 26 yl-e; 1,79 ymól, 1 egyenérték) adtunk. Ezt az oldatot nitrogéngáz alatt 5 napon keresztül kevertük. A reakcióelegyet bepároltuk, majd szilikagélen Flash kromatográfiával (eluensként 0-5 % metanolt tartalmazó kloroformmal) tisztítottuk, miáltal a kívánt termék (6) 4,1

142 mg-ját kaptuk.

20. példa

Diamino-dekán-CsA dimer (8)

Szilárd nátriumot (200 mg, feleslegben) 0 ’C-on vízmentes metanollal (10 ml) reagáltattunk. Metanolban (5 ml) diamino-dekán-CsA dimer diacetátot (5) (4,0 mg) oldottunk. A

NaOMe-oldat 2,5 ml-ét hozzáadtuk az (5) vegyület oldatához.

Szobahőmérsékleten inért atmoszférában 2,5 órás keverés után az oldatot ecetsavval (2 ml) elfojtottuk, s a terméket 70 °C-on 5 mm x 25 mm-es (12 /jI , 100 A) C18 oszlopon, eluensként 20 percig 0,1 % (V/V) trifluor-ecetsavat tartalmazó 70-95 % acetonitril/víz elegy alkalmazásával flash kromatográfiával tisztítottuk, miáltal a kívánt diói

2,5 mg-ját (60 %) kaptuk.

A diamino-dekán-CsA dimer diacetátot (5) úgy állítottuk elő, hogy a trisz(2-amino-etil)-amint 0,45 egyenérték 1,10-diamino-dekánnal helyettesítettük.

21. példa p-xililén-diamin-CsA dimer (4)

A p-xililén-diamin-CsA dimert (4) előállításához a trisz(2-amino-etil)-amint 0,45 egyenérték p-xililén-diaminnal helyettesítettük.

143

Az idevonatkozó szakirodalomban leírt eljárások alapján az KMeBmt 1) helytől eltérő helyhez való kapcsolással egyéb ciklofilin-származékok állíthatók elő.

8-as helyzetű D-izomer analógokat úgy állítunk elő, hogy a termelő organizmust D-amino aanalóggal tápláljuk, hogy a beépülést specifikusan erre a helyre irányítsuk (ld. Patchett és mtsi, J. Antibiotics, 42, 943, 1992, [6-MeS0)D-Ala³-CsA]; Traber és mtsi, J. Antibiotics, 42, 591, 1989). A 3-as helyzetű analógokat a CsA (elsősorban a Sac3 -szénatomján végzett) poli-litionálásával/alkilezésével állítjuk elő (ld. Wenger, Transplant Proceeding, 12, 213,

1986, 5. kiegészítés [ciklofilin — elsősorban D-MePhe³-CsA — kötési és aktivitási profilok]; Seebach, 4 703 033 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalom,

1987. október 27., a származékok előállítása]).

A fentebb leírt eljárások alapján a ciklosporin A helyett egyéb természetesen előforduló CsA változatok is múltimerizálhatók a találmányban való alkalmazáshoz.

21/A példa

A CsA dimer más módon végzett szintézise

MeBmt (OH ) -tj -0C0Im^xCsA

MeBmt(0H)-»7-0C0Im¹CsA-t (38 mg, 31 ;mól, 1218,6 g/mól) és karbonil-diimidazolt (20 mg, 4 egyenérték, 162,15 g/mól) 10

144 ml-es gömbölyű fenekű lombikban vízmentes THF-ban (2 ml) oldottunk. Az oldathoz diizopropil-etil-amint (22 μΐ, 4 egyenérték, 125 ymól, 129,25 g/mól) adtunk, majd az oldószert szobahőmérsékleten rotációs párologtatóval eltávolítottuk. A visszamaradt anyagot szilikagélen, eluensként 0-20 % acetont tartalmazó etil-acetáttal, flash kromatográfiával tisztítottuk, miáltal 32 mg (78 %-os kitermelés) fehér, szilárd anyagot kaptunk [(I) képletű vegyület].

(CsA)2-xililén-diamin CsA-dimer

MeBmt (OH)-η-OCOImüsA-t (12,5 mg, 9,52 Mmól, 1312,7 g/mól) DCM-ben (200 μ1) oldottunk. A kapott oldathoz xililén-diamin (14,7 mg, 136,2 g/mól) DMSO-ban (0,5 ml) készített oldatának 22 ul-ét (0,5 egyenérték, 4,75 umól) adtuk, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten, nitrogén atmoszféra alatt lassan bekoncentrálva 72 óráig kevertük. A reakcióelegyet acetonitrillel (2 ml) hígítottuk, üveggyapoton leszűrtük, és reverz fázisú HPLC-vel tisztítottuk (Beckman C18, 10μ, 100A, 1 cm x 25 cm, 5 ml/perc átfolyási sebesség, eluens: 50-90 % ACN/H2O (+0,1 % TFA) 30 percig, 70 ’C-on), miáltal 6,1 mg (49 %-os kitermelés) fehér, szilárd anyagot kaptunk [(II) képletű vegyület].

- 145 21/B példa FK506-CsA dimer szintézise

MeBmt(OAc)-η-CHzCOOEt-CsA

MeBmt (OH)->7-Br¹-CsA-t (26 mg, kb. 80 %-os tisztaság, 15,7 /.mól, 1323,57 g/mól) THF-ban (0,5 ml) oldottunk. Ezt az oldatot fecskendővel 15 órán keresztül etil-hidrogén-malonát magnézium-enolátjának (feleslegben lévő) THF-os oldatához adtuk, mely oldatot úgy készítettük, hogy etil-hidrogén-malonát (Lancaster, 2,5 mmól, 332 mg, 132,12 g/mól) THF-ban (4,7 ml) készített 0 ’C-os oldatához iPrMgCl-ot (2,15 ml, 2,34 M éteres oldat) adtunk, és az elegyet szobahőmérsékletre melegítettük. Az reakcióelegyet IN sósavval (50 ml) blokkoltuk, majd etil-acetáttal (2 x 50 ml) extraháltuk. A szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítottuk, leszűrtük és bepároltuk.

A nyers terméket DMF-ben (1 ml) feloldottuk, Et4.NOAc - áHsO-t (150 mg, felesleg) adtunk hozzá, és az elegyet 2 órán át 90 ’C-on melegítettük. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre hűtöttük, vízzel (50 ml) hígítottuk, majd éterrel (2 x 50 ml) extraháltuk. Az elegyített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítottuk, leszűrtük és bepároltuk. A visszamaradt anyagot szilikagélen, eluensként 75-100 % etil-acetát/hexán elegy alkalmazásával, flash kromatográfiával tisztítottuk, miáltal 11,4 mg (55 %) fehér, szilárd anyagot kaptunk [(III) képletű vegyület].

·· t<·· · a ··· ·· : * * · · · « · ·* ·* *♦ *9

- 146

MeBmt(OH)-O-CHzCOOH^-CsA

MeBmt (OAc ^-CHsCOOEÜ-CsA-t (11,0 mg, 8,27 /mól, 1330,76 g/mól) metanolban (2 ml) oldottunk, és a kapott oldatot

NaOMe 1,30 M metanolos oldatához (10 ml) adtuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten nitrogén atmoszféra alatt órán keresztül kevertük, majd 2 ml vizet adtunk az

elégyhez, s	további két óráig kevertük. A reakciót
jégecettel (1	ml) elfojtottuk, üveggyapoton leszűrtük, és
reverz fázisú	HPLC-vel (Rainin C18 dynamax, 5p, 21,4 mm x

250 mm, 20 ml/perc, 50-90 % ACN/H2O (+0,1 % TFA) 30 percig, ’C-on) tisztítottuk, miáltal 5,5 mg (53 % kitermelés) fehér, szilárd anyagot kaptunk [(IV) képletű vegyület].

Bisz-TBS-N-(6-(Boc-amino)-hexil)-FK506-karbamát

Bisz-TBS-FK506-szukcinimidil-karbonátot (5,8 mg, 1177,62 g/mól, 4,93 /mól) [a (tbs)4-FK1012 prekurzora is] DCM-ben oldottunk. Az oldathoz N-Boc-1,6-diamino-hexánt (7,25 mg, felesleg) adtunk. Szobahőmérsékleten 10 perces keverés után a reakcióelegyet bepároltuk, és a terméket flash kromatográfiával, 10-40 % etil-acetát/hexán eleggyel eluálva tisztítottuk, miáltal 5,9 mg (94 %-os kitermelés) (V) képletű vegyületet kaptunk.

N-(6-amino-hexil)-FK506-karbamát

Bisz-TBS-N-(6-(Boc-amino)-hexil)-FK506-karbamátot (5,9 mg,

V··· - 147 1278,88 g/mól, 4,61 umól) polipropilén csőben ACN-hez (700 ifi) adtuk, majd vizes HF-ot (49 %. 100 pl) adtunk hozzá. A reakció szobahőmérsékleten hat óra elteltével teljesen lejátszódott, s telített NaHC03-oldat lassú adagolásával elfojtottuk. Az elegyet telített NaHCOs-oldattal (4 ml) és vízzel (4 ml) hígítottuk és DCM-mel (3 x 10 ml) extraháltuk. Az elegyített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk, leszűrtük és bepároltuk, miáltal 3,6 mg (82 %-os kitermelés) nyers terméket kaptunk [(VI) képletű vegyület].

FKCsA

MeBmt(OH)-^-CH₂COOHi-CsA-t (2,86 mg, 2,27 pmól, 1260,66 g/mól) és N-(6-amino-hexil)-FK506-karbamátot (nyers, 2,16 mg, 2,28 pmól, 949,21 g/mól) DCM-ben (900 pl) oldottunk. A kapott oldathoz BOP (11,9 mg, 442,5 g/mól) DCM-ben (500 pl) készített oldatának 127 pl-ét (3,0 egyenérték, 6,8 pmól), majd diizopropil-etil-amin (20 pl, d = 0,742129,25 g/mól) DCM-ben (1,0 ml) készített oldatának 45 pl-ét (2,25 egyenérték, 5,1 pmól) adtuk. Az oldathoz végül DMF-et (40 pl) adtunk, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten áramló nitrogéngáz alatt 12 óra alatt bepároltuk. A reakcióelegyet acetonitrillel (1 ml) hígítottuk, üveggyapoton keresztül leszűrtük, és reverz fázisú HPLC-vel (Beckman C18, 1 cm x 25 cm, 5 ml/perc átfolyási sebesség, eluens: 50-90 % ACN/H2O 25 percig, 50 °C-on) tisztítottuk, miáltal 2,4 mg (48 %-os kitermelés) fehér, szilárd anyagot kaptunk [(VII) képletű ··· •· • · » ··

V ί·

- 148 vegyület].

22. példa (A) A dudoros FK1012 vegyületek és a kiegyenlítő hatású mutációkkal rendelkező FKBP12-k szerkezeten alapuló tervezése és szintézise

Az FK506 9. és 10. szénatomján lévő szubsztituensek, melyek szintézis útján férhetők hozzá, nem illenek össze az FKBP12 oldallánc-gyökeinek egy elhatárolható csoportjával, így az ilyen ligamdumokhoz való mutáns receptoroknak megfelelő módosításokat kell tartalmazniuk, hogy a 10. szénatom szubsztituenséhez, illetve a 9. szénatom szubsztituenséhez megfelelő üregek álljanak rendelkezésre. A 10. szénatomot szelektíven úgy módosítottuk, hogy (az FK506 hidroxilcsoportja helyett) a szénatomtól kiszögellő N-acetil- vagy N-formil-csoporttal rendelkezzen. E származékok kötési tulajdonságai világosan mutatják, hogy a 10. szénatomnál lévő dudorok hatásosan befolyásolják az eredeti FKBP12-höz való kötődést. A 21. ábrán további, 9. szénatomon lévő dudorokkal rendelkező FK506 típusú molekulák szintéziseit mutatjuk be. E ligandumokat a találmány szerinti linker molekulákkal összekapcsolva a kiegyenlítő mutációkat hordozó megfelelő kötő-doméneket tartalamzó kiméra proteinekhez HED és HÓD (és antagonista) reagenseket állíthatunk elő. A 21. ábrán bemutatunk egy jellemző HED reagenst, amely a C9 és C10' szénatomon

149 módosításokat tartalmaz.

Ilyenformán, a találmány tárgya azon FK506-típusú vegyületek csoportja, amelyek a 9. és 10. szénatomok egyikén (vagy mindkettőn) -0R, -R, -(CO)OR, -NH(C0)H vagy -NH(C0)R funkciós csoportot tartalmazó (R jelentése szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkil- vagy aril-alkil-csoport, amely lehet egyenes vagy elágazó láncú vagy ciklusos, beleértve a szubsztituált vagy szubsztituálatlan peroxidokat és karbonátokat) FK506-típusú molekulát tartalmaznak. Az FK506-típusú molekulák közé tartozik az FK506, FK520 és szintetikus vagy természetben előforduló változataik, analógjaik vagy származékaik (köztük a rapamiein), melyek az FK506 gyűrűs szerkezetének legalább a 2. és 15. szénatom közötti (szubsztituált vagy szubsztituálatlan) részével rendelkeznek, és (előnyösen kb. 10~⁶ M alatti Kd értékkel) képesek a természetes vagy módosított FKBP-hez kötődni.

A találmány további tárgya homo- és hetero-dimerek, valamint magasabbrendű oligomerek, melyek egy találmány szerinti linker molekulához kovalensen kapcsolva egy vagy több FK506-típusú vegyületet tartalmaznak. Ezen FK506-típusú vegyületek monomerei szintén jelentősek, függetelenül attól, hogy kovalensen kapcsolódnak-e linker molekulához vagy sem, illetve, hogy tartalmaznak-e másféle módosításokat (melyek nem szüntetik meg a megfelelő FKBP-hez való kötési affinitásukat. Az ilyen monomer vegyületek oligomerizációs antegonista reagensekként, azaz hasonló FK506-típusú

150 vegyületen alapuló oligomerizáló reagensek antagonistáiként alkalmazhatók. A találmány szerinti vegyületek és az ezeket tartalmazó oligomerek természetes vagy előnyösen mutáns FKBP-khez az FK506 FKBP12-re vonatkozó kötési affinitásának legalább 0,1 %-ának, előnyösen legalább kb. 1 %-ának, még előnyösebben legalább kb. 10 %-ának megfelelő affinitással kötődnek (ld. pl. Holt és mtsi, fentebb).

A találmány szerinti ligandumokhoz alkalmas receptor domének szerkezeten alapuló, helyre irányuló vagy random műtagenezissei hozhatók létre. A 9. és/vagy

10. szénatomnál módosításokat tartalmazó

FK506 és

FK-520 típusú

1i gandumokho z alkalmas receptor doménekként olyan FKBP12 molekulák családját tervezzük, amelyek a

26. tirozin, 36.

fenil-alanin, 37.

aszparaginsav, 82.

tirozin és 99.

fenil-alanin közül egy vagy több helyett valint, alanint, glicint, metionint vagy más kis aminosavat tartalmaznak.

Közelebbről, kisebb cseréket, például a 37. aszparaginsav helyett glicint vagy alanint tartalmazó FKBP-k FK506-típusú és FK-520-típusú ligandumokkal (melyek a 10. szénatomon szubsztituenseket, például -NHCOR csoportot, melyben R

Jelentése alkilcsoport, előnyösen kis szénatomszámú alkilcsoport, mint pl. metilcsoport;

vagy -NHCHO csoportot tartalmaznak) együttes alkalmazásával, illetve kisebb cseréket, például a 36. fenilalanin, a 99.

fenil-alanin és a

26. tirozin helyett glicint vagy alanint tartalmazó FKBP-k

FK506-típusú és FK-520-típusú ligandumokkal (melyek a 9.

szénatomnál tartalmaznak helyettesítéseket, például

151 oxazolineket vagy imineket) együttes alkalmazásával foglalkozunk.

A helyre irányuló mutagenezist a megaprimer mutagenezis eljárás (ld. Sakar és Dommer, BioTechniques, fi, (4), 404-407, 1990) alkalmazásával valósíthatjuk meg. A cDNS-szekvenálást Sequenase készlettel végezzük. A mutáns FKBP-k az XA90 E. coli törzsben a ρΗΝ1⁺ plazmidban expresszálhatók, mivel ebben a rendszerben sok FKBP12 mutánst expresszáltak hatásosan. A mutáns proteinek DE52 anioncserélő gyantán frakcionálva és Sepharose oszlopon méretkizárásos kromatográfiával tisztíthatok (ld. pl. Aldape és mtsi, J. Bioi. Chem., 267. (23), 16029-16032, 1992; és Park és mtsi,

J. BIol. Chem., 267. (5), 3316-3324, 1992). A kötési állandók a két eljárás valamelyikével könnyen meghatározhatók. Ha a mutáns FKBP-k elégséges rotamáz aktivitást tartanak fenn, a standard rotamáz vizsgálatot alkalmazhatjuk (ld. pl. Gálát és mtsi, Biochemistry, 31. 2427-2434, 1992). Más lehetőség szerint, a mutáns FKBP-ket LH20 gyanta és radioaktívan jelölt ³H2-dihidro-FK506 és ³H2-dihidro-CsA alkalmazásával (melyeket korábban FKBP-kkel és ciklofilinekkel alkalmaztunk) kötési vizsgálatnak vethetjük alá (Bierer és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, fii, (4), 555-569, 1993).

152 (B) Az FKBP12 dudoros·' FK506-okhoz megfelelő kiegyenlítő mutációinak szelektálása az élesztő kéthibrides rendszer alkalmazásával

A receptor proteinek vagy domének (köztük az FKBP12) változatainak megtalálásának egyik módja az élesztő kéthibrides vagy interakciós csapda rendszer. A kéthibrides proteinek aktivációs rendszert egymással kölcsönhatásba lépő kimutatására használták. A transzkripciós doménhez fuzionált célproteinből álló csali fúziós proteint DNS-kötő doménhez fuzionált lehetséges horgok cDNS könyvtárával együttesen expresszáljuk. A protein-protein (csali-horog) interakciót egy riporter gén termékének megjelenésével mutatjuk ki, melynek szintéziséhez a DNS-kötő dómén és az aktivációs dómén kapcsolódására van szükség. Az itt említett élesztő kéthibrides rendszert eredetileg Elledge és munkatársai fejlesztették ki (Durfee és mtsi, Genes & Development, Z (4), 555-569, 1993; és Harper és mtsi, Cell, 75. (4), 805-816, 1993).

Mivel a kéthibrides rendszer önmagában nem nyújt betekintést a kis molekulákat, szerves ligamdumokat érintő receptor-ligandum interakciókba, egy új, FK1012-vel indukálható transzkripciós aktivációs rendszert fejlesztettünk ki (ld. alább). E rendszer alkalmazásával a kéthibrides rendszer kiterjeszthető úgy, hogy kis molekulák (pl. a találmány szerinti FK506-ok, FK1012-k vagy FK506 típusú molekulák) is vizsgálhatók legyenek. Először a mutáns FKBP-k

153 (horgok) — melyek az FK506 9. és 10 szénatomját övező helyeken található mutációkkal rendelkeznek — cDNS

-könyvtárát készítjük el. A csalihoz két különböző stratégiát követhetünk. Az elsőben az FK506 azon képességét használjuk ki, hogy képes az FKBP-khez kötődni, és a kalcineurinhoz kötődő összetett felületet alakít ki.

Ilyenformán, a szekvencia-specifikus transzkripciós aktivator a következő összetétellel rendelkezik: DNS

-kötő dómén—mutáns FKBP12—dudorosFK506—kalcineurin A— —aktivációs dómén (ahol — nem kovalens kötésű interakciót jelöl). A második stratégia szerint az FK1012-k azon képességét használjuk ki, hogy egyidejűleg két FKBP-hez kötődnek. Az FK1012 HED változata az alábbi összeállítás screeneléséhez alkalmazható: DNS-kötő dómén—mutáns FKBP12— —dudoros FK506—normális FK506—vad típusú FKBP12— —aktivációs dómén.

1) Kalcineurin-Galá aktivációs dómén fúzió, mint csali

A Gal4 aktivációs domént és a kalcineurin A alegység fúziós konstrukciót tartalmazó pSE1107-származékot készítettünk. Csaliként működő képességét kéthibrides rendszer alkalmazásával a kalcineurin FKBP-FK506 kötőhelyének feltérképezése érdekében végzett vizsgálattal igazoltuk.

154

2) hFKBP12-Ga!4 aktivációs dómén fúzió, mint csali

A hFKBP12 cDNS EcoRI-HindlII fragmensként vágható ki, amely lefedi a teljes nyitott leolvasási keretet. E fragmenst tompa végűvé alakítjuk és a pSE1107 tompa végű Xhol helyére ligáljuk, miáltal a teljes hosszúságú hFKBP-Gal4 aktivációs dómén protein fúziót kapjuk.

3) Mutáns hFKBP12 cDNS könyvtárak

A hFKBP12-t EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztjük, tompa végűvé alakítjuk, és előzetesen Ncol-gyel hasított és tompa végűvé alakított pASl plazmidba (Durfee és mtsi, ld. fentebb) klónozzuk. A kapott plazmidot a pASl polilinker szekvenciájában lévő Ndel hely és a hFKBP12 5'-vége közötti Ndel fragmens eltávolítása érdekében Ndel enzimmel emésztjük és újra összeligáljuk. Ezen a módon a hFKBP12-Gal4 DNS-kötő dómén protein fúziót kapjuk. A hFKBP-t a 11206-os és 11210-es primerekkel újraampllfikáljuk.

- 155 -

II. TÁBLÁZAT

A kienegylítő mutációk screenelésére alkalmas területileg lokalizált hFKBP12 cDNS könyvtár készítéséhez alkalmazott primerek

11206 Ndel

5NdFK: 5' GGAATTC CAT ATG GGC GTG CAG G-3'

Η M G V Q

11207		Smal
3SmFK37:	5'	-CTGTC CCG	GGA	NNN	NNN	NNN	TTT	CTT	TCC	ATC	TTC
		R	S	X	X	X	K	K	G	D	E
		AAG C-3'
		L
11208		Smal
3SmFK27:	5'	-CTGTC CCG	GGA	GGA	ATC	AAA	TTT	CTT	TCC	ATC	TTC
		R	S	S	D	F	K	K	G	D	E

	AAG L	CAT M	NNN X	NNN X	NNN GTG GAC	CAC GCA GG-3'
X	H	V	V	C
11209
3BmFK98:	5'-CGC	GGA	TCC	TCA	TTC	CAG	TTT	TAG	AAG	CTC CAC	ATC
				Vég	E	L	K	L	L	E V	D
	NNN	NNN	NNN	AGT	GGC	ATG	TGG-	-3'
	X	X	X	T	A	H	P

11210 BamHI

3BmFK: 5'-CGC GGA TCC TCA TTC CAG TTT TAG AAG C-3'

Vég E L K L L

156

A mutáns hFKBP12 cDNS-fragmenseket a meghatározott helyzetekben randomizált hFKBP mutáns szekvenciákat tartalmazó fentebb felsorolt primerek alkalmazásával polimeráz láncreakcióval állítottuk elő, s a Gal4 DNS-kötő domén-hFKBP(Ndel/BamHI) konstrukcióba inszertáltuk.

4. Élesztő .tárás

Az Y153 Saccharomyces oerevisíae törzs két, a genomba integrálódott és a Gal4 promoterek irányítása alatt álló szelektálható marker gént (his3/ö-galaktozidáz) tartalmaz (Durfee, ld. fentebb).

A Kalcineurin-Gal4 aktivációs dómén alkalmazása csaliként

Az FKBP12-FK506 komplex nagy affinitással kötődik a kalcineurinhoz (2B típusú protein-foszfatáz). Mivel a kéthibrides rendszerben hídként olyan ligandumokat alkalmazunk, amelyek a 9. vagy 10. szénatomnál tartalmaznak dudorokat, a cDNS-könyvtárból származó FKBP-k közül csak azok képeznek transzkripciós aktivátort, amelyek kiegyenlítő mutációkat tartalmaznak. Az egyszerűség kedvéért legalább három különböző könyvtárat kell készíteni (a 11207-11209-es primerek alkalmazásával, I. táblázat), melyek mindegyike

8000 mutáns FKBP12-t tartalmaz. Az FKBP12-FK506 szerkezetet megvizsgálva véletlenszerű helyeket választottunk ki, melyek olyan gyökök halmazát képezik, amelyek mutációja lehetővé teheti a dudoros FK506-ok 9. vagy 10. szénatomján lévő • * » 9

- 157 szubsztituensek kötődését. A könyvtárakat ezután a 9., illetve 10. szénatomon dudoros” FK506-ok alkalmazásával külön-külön screeneljük. Egy dudoros FK506 és egy kiegyenlítő mutációt tartalmazó hFKBP12 közötti interakció a gazda élesztősejt hís-hiányos táptalajon való növekedési képessége és B-galaktozidáz gén expresszálása alapján detektálható. Mivel ez a szelekció a dudoros FK506 jelenlététől függ, a hamis pozitív eredmények dudoros FK506 ligandumokkal kiegészített (vagy azokat nem tartalmazó) másolati lemezek (replika) szubsztraktív screenelésével küszöbölhetők ki.

hFKBP12-Ga!4 aktivációs dómén alkalmazása '‘csaliként

A kalcineurin A-Gal4 aktivációs dómén alkalmazása a hFKBP12 mutáns cDNS-könyvtárak screeneléséhez egyszerű módját biztosítja az FKBP12 kiegyenlítő mutációi azonosításának. Azok a mutációk azonban, amelyek lehetővé teszik, hogy a dudoros FK506-ok a hFKBP12-höz kötődjenek, károsíthatják a mutáns FKBP12--dudoros FK506 komplex és a kalcineurin közötti interakciót. Ha a csaliként kalcineurinnal végzett kezdeti screenelés nem vezet eredményre, a vad típusú hFKBP12-Gal4 aktivációs domént kell alkalmazni. Egy természetes FK506—dudoros FK506 összetételű FK1012 HED reagenst (16. ábra) szintetizálhatunk, melyet horogként alkalmazhatunk. Az FK1012 FK506 része az FKBP12-Gal4 aktivációs doménhoz képes kötődni. Az FK1012 dudoros FK506 része és a kiegyenlítő mutációt tartalmazó FKBP12 lehetővé <·· α«·« «4

158

teszi, hogy a gazda élesztőseit his-hiányos tápközegen növekedjen és β-galaktozidázt expresszáljon. Ezen a módon a szelekció kizárólag a hFKBP12 mutáns dudoros FK506-tal való interakciós képességén alapul. A hamis pozitív eredmények kiküszöbölése érdekében a fentivel azonos szubsztraktív screenelést alkalmazhatunk.

A dudoros FK506-ok kiegyenlítő mutációt tartalmazó hFKBP12 mutánsra vonatkozó kötési affinitásának meghatározásához a korábban leírt in vitro kötési vizsgálatokon kívül egy in vivő vizsgálat is alkalmazható. A kéthibrides rendszerben a a β-galaktozidáz aktivitást a csali és a zsákmány közötti interakció mértéke alapján határozzuk meg. Ennek megfelelően, a dudoros FK506 és a kiegyenlítő mutációt tartalmazó FKBP12 mutáns közötti affinitás a gazda élesztősejtek által különböző HED (természetes FK506—dudoros FK5O6) koncentrációknál mutatott β-galaktozidás aktivitása alapján értékelhető.

Ugyanezen módszerrel egyéb, dudorral érintkező gyökökkel további véletlenszerű mutáns cDNS könyvtárak készíthetők (templátként alacsony affinitású kiegyenlítő mutációt tartalmazó FKBP12 mutánsok alkalmazásával), melyek hasonló módon screenelhetők.

159

Δ__nagy__affinitású__kiegyenlítő- ,ΕΚΒΡ .mutációk fág display screenelése

A dudoros FK506-hoz alkalmas néhány nagy affinitású hFKBP12 mutáns a protein különböző régióiban több kombinált pontmutációt tartalmazhat. A megfelelő kombinált mutációkat tartalmazó könyvtár mérete az élesztő kéthibrides rendszer kapacitásához túl nagy lehet (pl. 10⁸-nál több mutáció). A teljes funkcionális proteinek feltárásához hordozóként bakteriofág alkalmazása nagyszámú mutációk screenelését teszi lehetővé (ld. pl. Bass és mtsi, Proteins: Structure, Function & Genetics, fi, 4, 309-314, 1990; McCafferty és mtsi, Natúré, 348. 6301, 552-554, 1990; és Hoogenboom, Nucl. Acids Rés., Ifi, 15, 4133, 4137, 1991). Ha a kívánt nagy affinitású kiegyenlítő mutánst az élesztő kéthibrides rendszerrel nem sikerül azonosítani, a hFKBP12-n fág vektor hordozóval nagyszámú kombinált mutációt hozhatunk létre. A mutáns hFKBP12 fúziós fágok affinitási közegként dudoros FK506-Sepharose (melyet az eredeti FK506 alapú affinitási alapanyagainkhoz hasonlóan szintetizálhatunk) alkalmazásával screenelhetők (Fretz és mtsi, J. Am. Chem. Soc., 113. 4, 1409-1411, 1991). A kötés és fág-amplifikáció ismétlődő szakaszai nagy affinitású kiegyenlítő mutánsok azonosítását eredményezik.

160 (C) A dudoros (CsA)2-k szintézise; a MeVal(ll)CsA módosítása

Amint fentebb részleteztük, a sejtpusztulás jelölési reakcióút összefüggésében bebizonyítottuk a ciklofilin dimerizációs doménként és a (CsA)2 HÓD reagensként való alkalmazásának lehetőségét. A (CsA)2 reagens celluláris aktivitásának további javítása érdekében az FK1012-k esetében leírtakhoz hasonló stratégiákra támaszkodhatunk. Olyan esetekben, amikor különösen fontos, hogy a reagens képes legyen megkülönböztetni célját (a mesterséges protein-konstrukciót) az endogén ciklofilinektől, a módosított (dudoros) CsA-n alapuló oligomerizáló reagenseket részesítjük előnyben.

A találmány szerinti módosított CsA-származékok egyik csoportját azok a CsA analógok képezik, amelyekben (a) az NMeValll helyén NMePhe (amely lehet szubsztituált vagy szubsztituálatlan) vagy NMeThr (amely lehet szubsztituálatlan vagy a treonin β-hidroxil-csoportján szubsztituált); vagy (b) az NMeValll pro-S-metil-csoportja helyén legalább két, előnyösen három vagy több szénatomos, nagy kiterjedésű csoport áll, amely lehet egyenes vagy elágazó láncú és/vagy tartalmazhat ciklusos részt, s lehet aril- (etil- vagy előnyösen propil-, butil- [beleértve a t-butil-csoportot], stb.), aril- vagy aril-alkil-csoport. E vegyületek közé tartoznak azok a CsA analógok, amelyek az MeValll helyén NMeLeu-t, NMelle-t, NMePhe-t, illetve

161 specifikusan a nem természetes NMe[3-MePhe]-t tartalmazzák. A (b) csoportba tartozó CsA vegyületek a 22. ábra (2) képletével írhatók le, melyben R jelentése a fentebb leírt funkciós csoportok valamelyike.

A találmány további tárgya az egy vagy több említett CsA analógot tartalmazó homo- és hetero-dimerek és magasabbrendű oligomerek. A találmány szerinti vegyületek és az azokat tartalmazó oligomerek természetes vagy előnyösen mutáns ciklofilin proteinekhez kötődnek, a CsA ciklofinilre vonatkozó affinitásának legalább 0,1 %-ának, előnyösen legalább kb. 1 %-ának, még előnyösebben legalább kb. 10 %-ának megfelelő affinitással.

A módosított [MeVal^xl]CsA származékok előállításához a CsA-ból kiindulva kétlépéses eljárás alkalmazható. Az első lépésben a makrociklusos vegyületről eltávolítjuk az MeValll gyököt, majd második lépésben a kiválasztott aminosavat a korábbi MeValll helyre visszük be, s a lineáris peptidet gyűrűvé zárjuk. E módszer előnye, hogy a teljes szintézishez képest több módosított CMeVaüüCsA-származékhoz juthatunk hozzá. A szintézis vázlatát a 23. ábrán mutatjuk be.

Az amid-kötések megkülönböztetése érdekében az MeBmtl aminoés hidroxilcsoportjai között N,0 eltolást hajtunk végre, hogy izo-CsA-t kapjunk (Ruegger és mtsi, Helv. Chim. Acta, 59. (4), 1075-1092, 1976) (ld. 23. ábra). A reakciót THF-ban metán-szulfonsav jelenlétében végeztük (Oliyai és mtsi.

162

Pharm. Rés., H, (5), 617-622, 1992). A szabad amint egy reakcióedényben végzett reakcióval piridin és ecetsavanhidrid alkalmazásával acetilcsoporttal védtük. Az

N-acetil-védett izo-CsA összes kitermelése 90 %. Az

MeBmtl-MeValll észterkötést

N-metil-amid-kötések jelenlétében szelektíven redukáljuk, pl. DIBAL-H alkalmazásával. A képződött dióit aazután egy újabb sav-indukálta N,0 eltolással a megfelelő diészterré alakítjuk. Ezzel az N-acetil-csoportot és az MeValll gyököt előkészítjük az újonnan képződött észterek vizes bázissal való hidrolízésével történő eltávolításra.

A szabad aminocsoport védőcsoportjának eltávolítása után az új aminosav-gyököt pl. PyBrop kapcsoló ágenssel visszük be. A (2) képletű vegyület szintézisét DMAP jelenlétében BOP-vel a lineáris peptid védőcsoportjának eltávolításával és a molekula gyűrűvé zárásával fejezzük be (Alberg és Schreiber, Science, 262. (5131), 248-250, 1993). A dudoros CsA-k ciklofilinekhez való kötődését az FK506-ok és FK1012-k esetében leírtakkal azonos eljárásokkal értékelhetjük. Ha a ciklofilineket a kiegyenlítő mutációkkal azonosítottuk, a korábban leírt eljárások szerint dudoros (CsA)2 HED és HÓD reagenseket szintetizálhatunk. Különösen jelentősek a dimereket képező dudoros CsA vegyületek, amelyek önmagukban 1:2 sztöchiometriai arányban képesek ciklofilin molekulához kötődni. Legalább egy ilyen CsA-t vagy módosított CsA molekulát tartalmazó homo-dimerek és homo-oligomerek, heterodimerek és magasabbrendű hetero-oligomerek alakíthatók ki, s ezek az FK1012A-hoz és (CsA)2-höz kifejlesztett módszerekkel értékelhetők, és az FK1012 vizsgálatokhoz hasonlóan javítják a linker elemet.

A fentiek alapján előállíthatok azok a mutáns ciklofilinek, amelyek a ligandumon lévő többlet térigényű csoportok folytán a (2) képletű, 11. helyzetben módosított CsA változatunkat képesek megkötni. Az ilyen kiegyenlítő mutációkat tartalmazó ciklofilinek az FK1012 vizsgálataiban leírt szerkezet-alapú, helyre irányuló és random mutagenezises és screenelési módszerekkel azonosíthatók.

A fenti eredmények alapján nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás és készítmények sokféle célra alkalmazható sejtek létrehozásában biztosítanak sokoldalú alkalmazhatóságot. A találmány szerinti konstrukciók alkalmazásával gyógyászati célokra alkalmazhatunk sejteket, melyek kellő ideig inaktívak maradnak, majd biztonságos hatóanyag beadásával aktiválhatok. Mivel a sejtek a gazdaszervezetben nagyon különböző élettartamúak lehetnek, krónikus és akut betegségek kezelésére egyaránt lehetőség van, oly módon, hogy rövid vagy hosszú időtartamú védettséget biztosítunk. Olyan sejteket is kialakíthatunk, amelyek egy adott helyre, pl. anatómiai vagy funkcionális helyre irányíthatók, ahol a gyógyászati hatás kifejthető.

Olyan sejtek hozhatók létre, amelyek sokféle protein szekrécióját biztosítják, melyek egy nem kívánatos esemény

164 által okozott hiány kijavítását vagy az esemény gátlását eredményezhetik, pl. citolitikus sejtek aktiválását, romboló hatású szerek inaktiválását. egy szűk sejtpopuláció elpusztítását, stb. Ha a sejtek a gazdaszervezetben meghatározott ideig jelen vannak, könnyen aktiválhatok a hatóanyag olyan dózisban történő beadásával, ami a gazdaszervezetben lévő sejtek gyors reagálását eredményezi. Olyan sejteket alakíthatunk ki, amelyekben az expresszált kiméra receptor intracelluláris, miáltal elkerülhető a sejtfelületen jelenlévő idegen protein által okozott bármilyen immunreakció. Az intracelluláris kiméra receptor pro.tein továbbá a ligandum-kötődés hatására hatékony jelátalakítást biztosít, láthatóan hatékonyabban, mint egy extracelluláris receptor doménen bekövetkező receptor-kötődés.

Viszonylag egyszerű, membrán-kötött kiméra receptorokhoz kötődő molekulák alkalmazásával — ami a szóban forgó termékek expresszálását vagy bizonyos termékek expressziójának gátlását eredményezi — celluláris gyógykezelést végezhetünk. A beadandó vegyületek biztonságosak, számos különböző módon beadhatók és nagyon specifikus reakciót képesek biztosítani, amellyel nem borítják fel a homeosztázist.

A találmány leírásában említett valamennyi publikációt és szabadalmi bejelentést hivatkozásul említjük.

165

Bár a találmányt részletesebben jellemzésként és a megértés könnyítése érdekében írtuk le. a szakemberek számára nyilvánvaló, hogy bizonyos változtatások és módosítások végezhetők anélkül, hogy eltérnénk a mellékelt szabadalmi igénypontok tárgykörétől.

• ·

Claims (16)

1. - 166 Szabadalmi igénypontok

   1. DNS-konstrukció, amely olyan kiméra proteint kódol, amely tartalmaz (a) egy kiválasztott ligandumhoz kötődni képes legalább egy receptor domént, és (b) egy heterológ protein domént, amely az említett kiméra proteint tartalmazó sejtben, a sejtet a ligandum hatásának kitéve, apoptózis beindítására képes;

   és az említett ligandum két vagy több kiméra protein-molekulához képes kötődni.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-konstrukció, amely olyan kiméra proteint kódol, amely tartalmaz még egy, a kiméra proteint egy kívánt celluláris kompartmentbe irányítani képes intracelluláris irányító domént is.
3. 3. A 2. igénypont szerinti DNS-konstrukció, amely olyan kiméra proteint kódol, melynek intracelluláris irányító doménje egy szekréciós vezetőszekvenciát, egy membránt átívelő domént, egy membránkötő domént vagy egy, a protein vezikulákkal vagy sejtmaggal való kapcsolódását irányító domént tartalmaz.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti DNS-konstrukció, amely olyan kiméra proteint kódol, melynek a kiválasztott ligandumra vonatkozó Ka értéke körülbelül 10^-6 M vagy kevesebb.

   167
5. 5. Az 1. igénypont szerinti DNS-konstrukció, amely körülbelül 5 kD-nál kisebb molekulatömegű ligandumhoz kötődni képes kiméra proteint kódol.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti DNS-konstrukció, amely olyan kiméra proteint kódol, amelyben a heterológ protein dómén a humán Fás citoplazmikus doménjét vagy humán TNF-alfa receptort tartalmaz.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrukció, amely egy FK506-tipusú ligandumhoz, ciklosporin A-tipusú ligandumhoz, tetraciklinhez vagy szteroid ligandumhoz kötődni képes kiméra proteint kódol.
8. 8. DNS vektor. amely egy 1-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrukciót, és a DNS-konstrukció gazdasejtekbe való transzfekcióját és a konstrukciót tartalmazó transzfektánsok kiszelektálását elősegítő szelektálható markert tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti DNS vektor, amely virális vektor.
10. 10. A 9. igénypont szerinti virális vektor, amely adenovírus, adenovírussal rokon vagy retrovírus vektor.
11. 11. Kiméra protein, amelyet az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrukció kódol.

    *

    168
12. 12. Sejt, amely legalább egy, 1-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrukciót tartalmaz. illetve képes azt expresszálni.
13. 13. Egy 12. igénypont szerinti sejt, amely a kiválasztott ligandummal való érintkezést követően apoptózisossá válik és elpusztul.
14. 14. Egy 12. igénypont szerinti sejt, amely emlős sejt.
15. 15. Egy 12. igénypont szerinti sejt, amely tartalmaz még (a) egy DNS-konstrukciót, amely (i) egy második kiválasztott ligandumhoz kötődni képes legalább egy receptor domént és (ii) egy másik protein domént tartalmaz, amely a receptor dómén szempontjából heterológ, de egy vagy több ilyen doménnal való oligomerizáció hatására képes egy ilyen oligomerizációra érzékeny transzkripciós szabályozó elem transzkripciós szabályozása alatt álló célgén transzkripciójának aktiválását kiváltani; és (b) egy, az említett oligomerizációra érzékeny transzkripciós szabályozó elem expressziós szabályozása alatt álló célgént;

    és amely a sejtet az említett második kiválasztott ligandum hatásának kitéve képes a célgént expresszálni.
16. 16. Egy 13. igénypont szerinti sejt, amely tartalmaz egy DNS-konstrukció sorozatot, amely » «

    - 169 - (a) egy DNS-kötő domént és egy első kiválasztott ligandum molekularészhez kötődni képes legalább egy első receptor· domént tartalmazó első kiegészítő kiméra proteint; és (b) egy transzkripciós aktiváló domént és legalább egy, egy második kiválasztott (az első kiválasztott ligandum molekularésszel megegyező vagy attól eltérő) ligandumhoz kötődni képes receptor domént tartalmazó második kiegészítő kiméra proteint kódol;

    és tartalmaz egy második DNS-konstrukciót, amely a DNS-kötő doménhez kötődő, és a transzkripciós aktiváló doménre érzékeny heterológ transzkripciós szabályozó szekvencia transzkripciós szabályozása alatt álló célgént kódol;