JPH10507624A - 遺伝子発現、遺伝子産物機能および工学処理された宿主細胞の調節可能な除去 - Google Patents
遺伝子発現、遺伝子産物機能および工学処理された宿主細胞の調節可能な除去Info
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- JPH10507624A JPH10507624A JP8508238A JP50823895A JPH10507624A JP H10507624 A JPH10507624 A JP H10507624A JP 8508238 A JP8508238 A JP 8508238A JP 50823895 A JP50823895 A JP 50823895A JP H10507624 A JPH10507624 A JP H10507624A
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Abstract
(57)【要約】
遺伝子工学処理された細胞またはそれらを含む生物体において、標的遺伝子の発現またはその遺伝子産物の生物学的効果を調節的に妨害するための材料および方法が開示される。本発明の特色は、標的遺伝子の調節可能な阻止、標的遺伝子産物の機能または効果の妨害、または標的遺伝子の調節可能な除去のための宿主細胞の組換え修飾およびインビトロおよびインビボでのそれらの使用により例示される。
Description
【発明の詳細な説明】
遺伝子発現、遺伝子産物機能および工学処理された宿主細胞の調節可能な除去技術分野
本発明はキメラタンパク質とダイマーまたはマルチマーの、好ましくは非ペプ
チド有機分子とのマルチマー化に関する材料、方法および用途に関する。本発明
の態様は、宿主細胞の組換え修飾およびその標的遺伝子発現の調節可能な封鎖の
ための、標的遺伝子産物物の機能または影響を妨害するための、または標的遺伝
子の調節可能な除去のためのインビトロおよびインビボでの使用により例証され
る。本発明の材料、方法および用途は宿主細胞の組換え修飾により導入された遺
伝子の調節された発現のための手段を提供し、遺伝子工学処理された細胞集団の
完全な除去を含むので、遺伝子治療で使用される遺伝子工学処理された細胞制御
のためのフェイルセイフ機構が提供される。背景技術
宿主生物体における遺伝子の役割を研究する一つの方法は、それを除去するか
または機能傷害を持つ相対物で置換することである。このことは、例えば、培養
胎児幹(「ES」)細胞を遺伝子工学処理し、続いて工学処理した細胞を胎児内
へ導入し、遺伝子の機能的なコピーを欠く生物体へ発育させることにより達成さ
れる。典型的にはそのような実験はマウスで実施される。しかしながら、遺伝子
生成物が宿主生物体の正常な発育に必要とされる場合、単純に遺伝子を除去、ま
たは「ノックアウト」させると有用ではない重度の機能傷害を持つ動物となるか
、または動物ですらないであろう。
「条件付けノックアウト」、即ち、必要に応じ(即ち、任意の所望の発育段階
の後に)遺伝子を除去できる細胞または生物体を創造するため、または細胞型特
異性(非条件付け)ノックアウト、即ち、遺伝子が特定の型の細胞で除去される
生物体を創造するために多くのシステムが開発された。例えば、Watsonら
、組換えDNA,第2版(1992),特に14および24章;Guら、Sci ence
265(1994)103−106;Barinaga,”リサーチ
ニュース:ノックアウトマウス:第二報”Science 265(1994)
22
8;Laskoら”トランスジェニックマウスにおける部位特異的組換えによる
標的化された癌遺伝子活性化”Proc.Natl.Acad.Sci.USA
89(1992)6232−36;およびOrbanら”トランスジェニック
マウスにおける組織−および部位−特異的DNA組換え”Proc.Natl. Acad.Sci.USA
89(1992)6861−65を参照されたい。
それらの仕事とは独立して、イムノフィリン−および他の受容体に基づく組換
え体タンパク質のリガンド−媒介マルチマー化による生物学的スイッチが開発さ
れた。その研究の特色はSpencerら、Science 262(1993
)1019−1024および国際特許出願PCT/US94/01617および
PCT/US94/08008に記載されており、これら三つの内容は本明細書
において援用される。
合成リガンドによるキメラタンパク質の細胞内架橋は、治療用または農業用に
重要なタンパク質の合成の調節(これらの遺伝子の発現または機能の調節可能な
妨害を含む)、および工学処理された細胞の細胞死の調節された開始についての
様々な細胞過程の基本的研究における可能性を持っている。さらに、リガンドに
媒介されたオリゴマー化は、現在、調節的遺伝子療法を可能にしている。そのよ
うな場合、それは安全性、発現レベルおよび遺伝子療法によって得られる全体の
有効性の増加に対する新たなるアプローチを提供する。
興味深い、さらなる背景情報を記載している代表的な報告はPCT/US94
/01617、特に1から4ページに提供されている。しかしながら、この開示
から明かであるように、前述の著者はだれも本発明を記載していないし示唆して
もいない。発明の概要
本発明は、細胞、それを含む子孫および生物体を調節された様式で、選択され
た遺伝子発現の封鎖、遺伝子生成物の機能化の妨害、または選択された遺伝子の
除去または不活性化に対して感受性にするため、宿主細胞の遺伝子工学処理に用
いる材料および方法を提供する。本発明はさらに、細胞およびその子孫を調節さ
れた、プログラム化された細胞死(さもなくば、アポトーシスとして知られてい
る)に対して感受性にするため、宿主細胞の遺伝子工学処理に用いる材料および
方法を提供する。そのような細胞、ならびにそれらを含む生物体は、以下に記載
するように問題とする遺伝子または遺伝子産物の機能傷害または欠失により特徴
付けられる疾患の研究を含む研究目的のための生物学的試薬として有用である。
下記表1には遺伝子または遺伝子産物の機能傷害または欠失に関連した疾患の非
排他的、代表的リストが掲げられている。
本発明は生きている細胞における遺伝子転写の引き金を引くためのキメラ「レ
スポンダー(responder)」タンパク質のホモ−およびヘテロ−マルチ
マー化を用いるための方法および材料の適合を含んでいる。本明細書で使用され
る場合、用語マルチマー、マルチマー化するおよびマルチマー化とはダイマー、
トライマーおよびより高度のマルチマーおよびそれらの形成を含んでいる。キメ
ラレスポンダータンパク質は特異的受容体ドメインを含み、対応するマルチマー
化試薬の存在に応答性である細胞内発現融合タンパク質である。マルチマー化試
薬とは一つ以上のキメラタンパク質分子に結合できてキメラのダイマーまたはよ
り高度のマルチマーを生成する多価リガンドである。キメラタンパク質はそのよ
うなマルチマー化に応答性である要素の転写制御下、リガンド媒介マルチマー化
が遺伝子転写の引き金を引くように設計される。この遺伝子は、標的遺伝子また
は標的遺伝子の発現を妨害できるリボザイム、に相補的なアンチセンスメッセー
ジのような、および転写を妨害できる阻止因子をコードしている「阻止」遺伝子
であろう。或いは、阻止遺伝子は、標的遺伝子の遺伝子産物に結合できおよび好
ましくは生物学的効果を中和または阻止できる側鎖抗体のような抗体部分をコー
ドしているであろう。
阻止遺伝子はまた標的遺伝子産物の効果を阻止できる優性陰性遺伝子産物をコー
ドしていてもよいし、またはその作用が選択された遺伝子を完全に除去させるタ
ンパク質をコードしていてもよい。その作用が標的遺伝子を完全に除去させる阻
止遺伝子の例はCreリコンビナーゼを産生するタンパク質Creをコードして
いる遺伝子である。Creリコンビナーゼの発現は宿主細胞中の「loxP」配
列に特有に隣接している標的遺伝子の除去を起こす。もしくは、遺伝子は、培養
で増殖しているまたはインビボの工学処理された細胞の除去のための手段を提供
する遺伝子でもよく、それにより工学処理された細胞を調節および制御する機構
が提供される。
従って、本発明は一種またはそれ以上のキメラレスポンダータンパク質、それ
をコードしているDNA構築物(「レスポンダー」構築物、およびキメラタンパ
ク質をマルチマー化できる多価リガンド分子を含んでいる。キメラタンパク質は
少なくとも一つのリガンド結合(または受容体)ドメイン、およびキメラタンパ
ク質分子のマルチマー化により細胞内の阻止遺伝子または除去エフェクター遺伝
子の転写を開始できる作用ドメインを含んでいる。キメラタンパク質は、追加ド
メインも同様に含むことができる。これらのキメラタンパク質は、種々のドメイ
ンが異なる源に由来している意味での組換え体であり、天然においてそのままで
一緒に見出されることはない(すなわち、異種である)。上記マルチマー化レス
ポンダータンパク質の存在に応答性である制御要素の転写制御下の阻止遺伝子を
含む組換え「阻止」構築物も提供される。転写制御要素は、これらの構築物を含
む細胞において、マルチマー化レスポンダータンパク質の存在により阻止遺伝子
の転写が活性化されるという意味において応答性である。細胞をマルチマー化リ
ガンドに暴露すると阻止遺伝子の発現が生じる。本発明の構築物は1種類または
それ以上のネオマイシン耐性遺伝子(neor)およびヘルペス単純ウイルス−
チミジンキナーゼ(HSV−tk)のような選択可能マーカーを含んでいる。レ
スポンダーおよび阻止遺伝子を含むおよび発現するように遺伝子工学処理された
細胞がマルチマー化リガンドに暴露された場合、阻止遺伝子の発現が活性化され
、標的遺伝子の発現または標的遺伝子産物の機能性化が害される。
上記マルチマー化レスポンダータンパク質の存在に応答性である制御要素の転
写制御下にCreをコードしている組換え「Cre」構築物もまた提供される。
転写制御要素は、これらの構築物を含む細胞においてマルチマー化レスポンダー
キメラの存在によりCreの転写が活性化されるという意味において応答性であ
る。すなわち、細胞をマルチマー化リガンドに暴露するとCreの発現が生じる
。細胞は好ましくは、除去されるべき内因性遺伝子であり、loxP配列が隣接
した(「フロックス化」)「標的」遺伝子を含むが、必ずしも必要ではない。フ
ロックス化標的遺伝子は例えば、内因性標的遺伝子のコピーの一部または全部お
よび/またはその内因性フランキングDNA配列をloxP要素と一緒に含む組
換え「標的」構築物を用いる相同的組換えにより細胞内に導入される。本発明の
別の構築物の場合と同様に、フロックス化標的遺伝子構築物は1種類またはそれ
以上のネオマイシン耐性遺伝子(neor)およびヘルペス単純ウイルス−チミ
ジンキナーゼ(HSV−tk)のような選択可能マーカーを含んでいる。レスポ
ンダー、Creおよびフロックス化標的遺伝子構築物を含み、発現するように遺
伝子工学処理された細胞がマルチマー化リガンドに暴露された場合、Creの発
現が活性化され、標的遺伝子が除去される。
さらに、本発明の第一キメラタンパク質をコードしている組換え構築物はリガ
ンド制御アポトーシスを可能にする。これらのキメラ構築物は架橋によりほとん
どの細胞型でアポトーシスを誘導するfas抗原またはApo−1抗原の少なく
とも細胞質ドメインを含んでいる。Trauthら、Science 245(
1989)301−305;Watanaba−Fukunagaら、Natu re
356(1992)314を参照されたい。この方法で、工学処理した細
胞集団のリガンド誘導可能細胞死が提供できる。
修飾された細胞は、選択された宿主細胞内へ所望の構築物または複数の構築物
を導入することにより産生される。このことは通常のベクターおよび技術を用い
て達成され、それらは市販品として購入可能である。必要に応じ、1種類または
それ以上の構築物が成功理に導入されている修飾された細胞が選択され、他の細
胞から分離され、再び常法により培養される。
標的遺伝子が内因性遺伝子である場合、宿主細胞内への標的遺伝子構築物の取
り込みは、Guら、1994,Science 265:103−106のよう
な既知の方法による相同的組換えにより達成される。或いは、もし標的遺伝子の
内因性コピーが相同的組換えまたは突然変異により欠失または無機能化されてい
るなら、組換え標的遺伝子構築物は任意の所望の手段により導入される。レスポ
ンダー構築物およびCre構築物の取り込みもまた通常のトランスフェクション
ベクターおよび技術により達成される。
他の細胞と一緒に増殖でき、有効量の第一のキメラタンパク質へ結合できるオ
リゴマー化リガンドの添加により細胞の混合物から選択的に調節または除去でき
る遺伝子工学処理された細胞は本発明の重要な態様である。工学処理された細胞
とオリゴマー化リガンドを接触させることにより、標的遺伝子の機能を阻止また
は妨害できる標的遺伝子の発現を通して特異的遺伝子の発現の調節可能な妨害の
引き金を引くことができる。或いは、調節された遺伝子は、標的遺伝子の特異的
除去または工学処理された細胞の細胞死を導くものでも有り得る。例えば、その
ような細胞はある所望の期間、内因性または異種生成物を産生することが可能で
あり、その後リガンドの添加により欠失される。そのような場合、細胞は本発明
に従って第一キメラを産生するように工学処理される。
リガンド誘導調節下に所望の遺伝子を発現するようにさらに工学処理された細
胞は慣用的手段による培養で増殖させる。この場合、追加のキメラに対するリガ
ンドを培養培地に添加すると所望の遺伝子の発現および所望のタンパク質の産生
を導く。その後、遺伝子の発現およびタンパク質の産生は、以下に詳細に記述さ
れるようなオリゴマー化アンタゴニスト試薬を培地に添加することにより止める
ことができる。その他の場合、タンパク質の産生は本質的なものである。いずれ
においても、工学処理された細胞は意図された目的(例えば、所望のタンパク質
またはその他の生成物の産生)を果たした後、第一のキメラのオリゴマー化を起
こして工学処理された細胞にアポトーシスを誘導するため、培地に有効量の適切
なオリゴマー化リガンドを添加することにより細胞培養液から除去できる。本発
明の工学処理された細胞はインビボで完全な生物体、好ましくはヒトを含む動物
を修飾するために、すなわちそのような細胞を含む動物内で細胞が所望のタンパ
ク質または他の結果を産生するように使用できる。そのような使用には遺伝子療
法が含まれる。或いは、キメラタンパク質およびオリゴマー化分子を細胞外で用
いて、生理的作用を開始するように協力して作用するタンパク質を集めることが
できる。
本発明の修飾細胞を含むトランスジェニック動物を造るには、所望の構築物を
適当な細胞株、例えば、ES細胞内へトランスフェクトする。或いは、所望の構
築物を初期胎児に直接マイクロインジェクションしてもよい。例えば、Wats
onら、組換えDNA,第2版(1992),特に14および24章を参照され
たい。後者の場合、レスポンダー構築物中にプロモーターまたはエンハンサー配
列のような組織特異的発現制御配列を使用すると、キメラレスポンダータンパク
質(類)の組織特異的発現が可能になり、順に阻止遺伝子の組織特異的、調節可
能発現、および従って標的遺伝子またはその遺伝子産物の組織特異的封鎖が可能
である。動物がレスポンダーを含有し、発現可能であるような細胞を含むように
生産できることにさらに注目すべきである。別の動物は阻止遺伝子構築物を含有
する細胞を含むように生産される。二つの型の工学処理された動物を繁殖させる
と、前記の構築物の両方を含有する細胞を含む子孫が得られる。
レスポンダー構築物中の組織特異的発現制御配列(プロモーター/エンハンサ
ー)はまたキメラレスポンダータンパク質(類)の組織特異的発現を可能にし、
順にCreの組織特異的、調節可能発現、および従って標的遺伝子の組織特異的
除去を可能にする。動物がレスポンダーおよびCre構築物を含有し、発現可能
であるような細胞を含むように生産できることにさらに注目すべきである。別の
動物は所望の標的遺伝子構築物を含有する細胞を含むように生産される。二つの
型の工学処理された動物を繁殖させると、前記の構築物のすべてを含有する細胞
を含む子孫が得られる。動物およびその子孫は慣用的遺伝子分析により都合よく
特徴付けられる。ES細胞または初期胎児への導入に加え、本構築物は投与によ
り(例えば、適した担体またはベクター中で)完全な生物体の所望の組織に直接
導入してもよい。
本発明の実施に含まれている阻止遺伝子の発現の引き金を引くのに有用なマル
チマー化リガンドは、そのような受容体ドメインを含む2種類またはそれ以上の
キメラレスポンダータンパク質に結合できる。マルチマー化リガンドは、キメラ
に対して、順にまたは同時に、好ましくは約10-6M未満、さらに好ましくは約
10-7M未満、なお一層好ましくは約10-8M未満、そして若干の実施様態にお
いて約10-9M未満のKd値で結合することができる。リガンドは非タンパク質
であるのが好ましく、分子量は約5kDa未満である。そのようにマルチマー化
されたキメラタンパク質の受容体ドメインは同じであってもよいしまたは異なっ
ていてもよい。キメラタンパク質はリガンドに対する暴露、続いてのキメラのマ
ルチマー化により宿主細胞中で阻止遺伝子の発現を開始することができる。従っ
て、キメラをマルチマー化できるリガンドへの細胞の暴露に続いて、本発明の遺
伝子工学処理された細胞中で阻止遺伝子または除去エフェクター遺伝子の転写が
活性化される。該異なるように遺伝子工学処理された本発明の細胞は上記のよう
なキメラタンパク質を含んでおり、これらのキメラをマルチマー化することがで
きるリガンドの存在に応答する。応答性は標的遺伝子の発現の封鎖または標的遺
伝子産物の生物学的効果の阻止により明らかにされる。遺伝子の調節的除去が望
まれる場合、応答性はCre発現の開始により明らかにされ、フロックス化標的
遺伝子も存在する場合は標的遺伝子の除去により明らかにされる。
コード化されたキメラレスポンダータンパク質は、更に、キメラタンパク質を
望ましい細胞区分に対して向けることができる細胞内標的ドメインを含むことが
できる。標的ドメインは、分泌リーダ配列、膜スパニング(spanning)
ドメイン、結合膜ドメインまたは、例えば、小胞もしくは核と結合するようにタ
ンパク質を支配する配列でありうる。
キメラタンパク質の作用ドメインは、マルチマー化により、同起源の制御要素
の転写制御下に遺伝子(本系では阻止遺伝子または調節可能な除去エフェクター
遺伝子)の転写の活性化ができる任意のタンパク質またはタンパク質領域(好ま
しくは所望の宿主細胞または生物体の種の)から選択される。例えば、キメラレ
スポンダータンパク質の作用ドメインは、リガンドに対する暴露および引き続き
のマルチマー化によって、IL−2プロモーターを経る転写活性化を導く検出可
能な細胞内シグナルを開始することができるCD3ξ(ゼータサブユニット)の
ようなタンパク質ドメインを含むことができる。或いは、一つのレスポンダータ
ンパク質がその作用ドメインとしてGAL4のようなDNA結合タンパク質を含
み、一方、もう一つのものが作用ドメインとしてVP16のような転写活性化ド
メインを含む一連のレスポンダータンパク質であってもよい。GAL4−VP6
ダイマーを形成するそのようなレスポンダータンパク質のヘテロダイマー化は、
ヘテロダイマー化レスポンダータンパク質が結合できる要素の転写制御下での阻
止遺伝子または除去エフェクター遺伝子の転写を活性化する。多くの他の例が本
明細書に提供されている。そのような例においてマルチマー化は、マルチマー化
に応答性である転写制御要素エンハンサーおよび/またはプロモーター要素の転
写制御下での阻止遺伝子または除去エフェクター遺伝子の転写を活性化する。
本発明はさらに、組織培養中の宿主細胞内への導入のため、胎児内への導入の
ため、またはインビボで細胞内へ構築物を導入のために全生物体へ投与するため
のいずれにしろ、本明細書に記載した種々の構築物を含むDNAベクターも包含
している。ベクターは、例えばアデノ、アデノ関連性またはレトロウイルスベク
ターを含むウイルスベクターであろう。それらを含む構築物またはベクターはま
た構築物含有トランスフェクタントの選別を可能にする選別可能マーカーを含ん
でいてもよい。
本発明は、更に、本発明のDNA構築物のいずれかによってコードされたキメ
ラタンパク質、並びに該DNA構築物を含むおよび/または発現する細胞を包含
し、凍結されていようと活発に増殖中であろうと、培養中であろうとそれらを含
む完全な生物であろうと、様々な種および系統の原核細胞および真核細胞、特に
、酵母、蠕虫、昆虫、若しくは他の齧歯類動物およびヒト細胞を含む他の哺乳類
動物細胞を包含する。
本発明は、レスポンダータンパク質または一連のレスポンダータンパク質類、
およびレスポンダータンパク質(類)のマルチマー化に応答して阻止遺伝子を発
現できる阻止遺伝子構築物をコードしている1種類またはそれ以上の組換えDN
A構築物を含む細胞、好ましくは哺乳類細胞を提供する。さらに、本発明は、レ
スポンダータンパク質または一連のレスポンダータンパク質類、レスポンダータ
ンパク質(類)のマルチマー化に応答してCre遺伝子を発現できるCre構築
物、および随意に、Creの存在下、欠失に感受性であるloxP配列が隣接し
た標的遺伝子を含む標的遺伝子構築物をコードしている1種類またはそれ以上の
組換えDNA構築物を含む細胞を提供する。本発明はまたその発現が細胞の調節
されたアポトーシスを導くことができるタンパク質をコードしている組換えDN
A構築物を含む細胞も提供する。
マルチマー化リガンドは、マルチマーを生成するための本発明の2種類または
それ以上のキメラレスポンダータタンパク質分子に対して結合することができる
分子であり、式
リンカー−{rbm1,rbm2,・・・rbmn}
(式中、nは、2から約5の整数であり、rbm(1)〜rbm(n)、は、同じであ
ってもまたは異なっていてよく、且つ1種類または複数のキメラタンパク質に対
して結合することができる受容体結合残基である)
を有する。rbm残基は2個またはそれ以上のrbm残基に対して共有結合(「
−」)することができる二官能性または多官能性分子であるリンカー残基に対し
て共有結合している。好ましくは、リガンドは約5kDa未満の分子量であり、
タンパク質ではない。このようなリガンドの例には、rbm残基は同じかまたは
異なっており且つFK506型残基、シクロスポリン型残基、ステロイドまたは
テトラサイクリンを含むものが含まれる。シクロポリン型残基としてはシクロポ
リン、および天然に存在するかまたは修飾された、好ましくはKd値が約10-6
未満の、シクロスポリンにたいして結合することができるその誘導体がある。若
干の実施態様において、リガンドは、天然に存在する受容体に対して約10-6よ
り大、さらに好ましくは約10-5より大のKd値で結合することが好ましい。本
発明の典型的なリガンドは、少なくとも一つのrbmがFK506、FK520
、ラパマイシンまたはC9、C10若しくは両方が修飾されたそれらの誘導体の
分子を含むものであり、そのリガンドは、天然に存在する受容体タンパク質に関
するKd値より少なくとも一桁、好ましくは二桁、さらに好ましくは三桁、なお
一層好ましくは四桁若しくは五桁またはそれ以上少ないKd値の修飾受容体まて
は修飾受容体ドメインを含むキメラ分子に対して結合する。リンカー残基は以下
にさらに詳細に記載されるが、例示のためには、C2−C20アルキレン残基、
C4−C18アザアルキレン残基、C6−C24N−アルキレンアザアルキレン
残基、C6−C18アリーレン残基、C8−C24アルジアルキレン残基または
C8−C36ビスカルボキサミドアルキレン残基のような残基が挙げられる。
「生物学的イベントのラパマイシン調節」と題して1995年6月7日に出願さ
れた米国特許出願第08/481,941号、および「新規マルチマー化試薬」
と題して1994年8月18日に出願された米国特許出願第08/292,59
8号を参照されたい、その内容は本明細書において援用される。
本発明のモノマーrbm、更には本発明者のキメラタンパク質に対して結合す
ることができるが(個々のrbmのモノマー性のために)それらのダイマー化ま
たは高次オリゴマー化に影響を与えないrbmの単コピーを含む化合物は、マル
チマー化アンタゴニストである。
本発明は、培養培地に添加されたまたは完全な生物体に投与されたマルチマー
化リガンドの存在に応答して、工学処理された細胞中の標的遺伝子の発現または
影響を選択的に妨害するための材料および方法を提供する。場合により、本発明
はまた、培養培地に添加されたまたは完全な生物体に投与されたマルチマー化リ
ガンドの存在に応答して、工学処理された細胞中の標的遺伝子を選択的に除去す
るための材料および方法を提供する。本発明はさらにオリゴマー化リガンドの添
加に応答して選択的に細胞を除去するための材料および方法を提供する。
該方法は、(a)マルチマー化に続いて阻止遺伝子の転写を活性化できる1種
類またはそれ以上のキメラタンパク質をコードしている1種類またはそれ以上の
DNA構築物;(b)キメラタンパク質のマルチマーに応答性要素の転写調節下
の阻止遺伝子を含みおよび発現できる本発明の細胞またはそのような細胞を含む
生物体を提供することを含んでいる。従って該方法は、検出可能な阻止遺伝子の
発現を生じるのに十分な量の、キメラタンパク質へ結合できるマルチマー化リガ
ンドへ細胞を暴露することを含んでいる。
該方法はまた、(a)マルチマー化に続いてCreをコードしている遺伝子の
転写を活性化できる1種類またはそれ以上のキメラタンパク質をコードしている
1種類またはそれ以上のDNA構築物;(b)キメラタンパク質のマルチマーに
応答性要素の転写調節下のCreをコードしている遺伝子;および(c)Cre
存在下で組換えおよび除去に感受性であるフロックス化された標的遺伝子を含み
および発現できる本発明の細胞またはそのような細胞を含む生物体を提供するこ
とを含んでいる。従って該方法は、検出可能なCre遺伝子の発現を生じるのに
十分な量の、キメラタンパク質へ結合できるマルチマー化リガンドへ細胞を暴露
することを含んでいる。
細胞が培養中で増殖している場合、リガンドに対するそれらの暴露は、培地に
対してリガンドを加えることによって行われる。細胞が宿主生物中に存在してい
る場合、リガンドに対するそれらの暴露は、宿主生物に対してリガンドを投与す
ることによって行われる。例えば、宿主生物が動物、特に哺乳類である場合、リ
ガンドは、宿主動物に対して経口、頬、舌下、経皮、皮下、筋肉、静脈内、間接
内または吸入投与によって、投与に適当なビヒクル中で投与される。
標的遺伝子が健康な細胞または動物の正常な機能に必須である場合、本発明の
材料および方法を用いて遺伝子の発現を妨害すると(遺伝子産物の効果または全
遺伝子の除去)、細胞および動物モデルに対応する疾病状態にする。例えば、標
的遺伝子がエリスロポエチンの遺伝子の場合、その妨害または除去は貧血および
その可能性のある処置の研究のためのモデルが提供される。神経増殖因子または
ミエリン化タンパク質のための標的遺伝子では神経変性性疾患のモデルを提供す
る;骨形態発生因子では骨粗鬆症;トロンボポエチンでは血小板減少症;抗原受
容体または免疫細胞シグナリングタンパク質では免疫不全症;チロシンヒドロキ
シラーゼではパーキンソン病など。表1を参照されたい。
本発明はさらに、遺伝子の発現または効果を妨害するための、または動物から
またはそのような工学処理された細胞を持っている患者からの遺伝子工学処理さ
れた細胞自身の除去することを含む本発明の遺伝子工学処理された細胞から遺伝
子を除去するための医薬または家畜病治療用の組成物を包含している。そのよう
な医薬または家畜病治療用の組成物は医薬としてまたは家畜病治療用として受容
可能な担体および随意に1種類またはそれ以上の受容可能な賦形剤と混合された
本発明のマルチマー化リガンドを含んでいる。マルチマー化リガンドは、それが
本発明のキメラレスポンダータンパク質へ結合でき、本発明の工学処理された細
胞中で阻止遺伝子発現の引き金を引くかまたはCre発現の引き金を引くかぎり
はホモマルチマー化試薬またはヘテロマルチマー化試薬であることができる。同
様に本発明はさらに、本発明の工学処理された細胞、細胞培養または患者中のキ
メラレスポンダータンパク質のマルチマー化を防止またはそのレベルを減少させ
(全体または一部)、それにより関連細胞中の阻止遺伝子転写の活性化を防止ま
たは逆転させるため、医薬として受容可能な担体および随意に1種類またはそれ
以上の医薬としてまたは家畜病治療用として受容可能な賦形剤と混合された本発
明のマルチマー化アンタゴニストを含む医薬または家畜病治療用の組成物を包含
している。従って、医薬または家畜病治療用の組成物を製造するためのマルチマ
ー化試薬およびマルチマー化アンタゴニスト試薬の使用は本発明に包含される。
本発明のマルチマー化リガンドに応答する標的遺伝子の調節可能妨害に感受性
の宿主生物、好ましくは動物であり、多くの場合哺乳類を提供するための方法も
本発明は与えている。本方法は、本発明に従ってエクスビボで工学処理された、
即ちこれについてのキメラタンパク質をコードしているDNA構築物などを含む
細胞を生物中に導入することを含んでいる。或いは、本発明のDNA構築物を宿
主生物(例えば、哺乳類または胎児)内へ、インビボで宿主哺乳類の1種類また
はそれ以上のトランスフェクションを可能にする条件下で導入することができる
。
本発明はさらに、標的遺伝子のリガンド調節的妨害に感受性の細胞製造のため
のキットも提供する。一つのそのようなキットは少なくとも一つの受容体ドメイ
ンおよび少なくとも一つの作用ドメイン(他のところに記載されている)を含む
本発明者のキメラレスポンダータンパク質の少なくとも一つをコードしている少
なくとも一つのDNA構築物を含んでいる。一つの実施態様においてDNA構築
物は、1種類またはそれ以上のキメラの細胞型または組織特異的発現を提供する
ため、プロモーターおよび/またはエンハンサー要素のような細胞型特異的発現
制御要素(類)の取り込みのための従事部位を提供する通常のポリリンカーを含
んでいる。本キットは、本キットのDNA構築物によりコードされているキメラ
タンパク質分子をマルチマー化できる一定量の本発明のリガンドを含んでいても
よく、さらに一定量のマルチマー化アンタゴニスト、例えば単量体リガンド試薬
を含んでいてもよい。ただ一つのキメラタンパク質が構築物(類)によりコード
されている場合、マルチマー化試薬はホモマルチマー化リガンドである。一つ以
上のそのようなキメラタンパク質がコードされている場合、ヘテロマルチマー化
リガンドが含まれているであろう。キットにはキメラレスポンダータンパク質分
子のマルチマー化に応答性の転写調節要素に連結された阻止遺伝子構築物がさら
に含まれていてもよい。或いは、キットがキメラレスポンダータンパク質分子の
マルチマー化に応答性の転写調節要素に連結されたCre構築物および/または
loxP配列が隣接した標的遺伝子を含む標的遺伝子構築物を含んでいてもよい
。キットはまた少なくとも一つの受容体ドメインおよび一つの作用ドメイン(こ
こで一つの作用ドメインは以下に記載するようにFasまたはTNF受容体の細
胞質ドメインであろう)を含有している一次キメラタンパク質をコードしている
少なくとも一つのDNA構築物を含んでいるであろう。DNA構築物には好まし
くはトランスフェクタントの好都合な選択のための1種類またはそれ以上の選択
マーカー、ならびに原核生物での複製真核生物での発現などに有用な他の慣用的
なベクター要素が付随しているであろう。選択マーカーは各々の異なったDNA
構築物に対して同じであってもよいしまたは異なっていてもよく、そのようなD
NA構築物(類)の種々の組み合わせを含む細胞の選択を可能にする。
例えば、本発明の一つのキットは転写活性化ドメインに融合した少なくとも一
つの受容体ドメイン(選択されたリガンドへ結合できる)を含む第一のキメラレ
スポンダータンパク質をコードしている第一のDNA構築物;DNA結合ドメイ
ンに融合した少なくとも一つの受容体ドメインを含む第二のキメラレスポンダー
タンパク質をコードしている第二のDNA構築物;および随意に、第一および第
二のキメラレスポンダータンパク質のマルチマー化に応答性要素の転写制御下の
阻止遺伝子をコードしている第三のDNA構築物からなるベクターを含んでいる
。或いは、前もって選択された阻止遺伝子の代わりに従業者が任意の阻止遺伝子
を挿入するのを可能にするため阻止遺伝子構築物は例えば、ポリリンカー配列の
ようなクローニングを含んでいてもよい。
本キットはまた第一および第二のキメラレスポンダータンパク質のマルチマー
化に応答性要素の転写制御下のCreをコードしているDNA構築物、および随
意に、Cre存在下で標的遺伝子の欠失を可能にするloxP配列が隣接した標
的遺伝子をコードしているDNA構築物を含んでいてもよい。或いは、標的遺伝
子の代わりに従業者が所望の標的遺伝子を挿入するのを可能にするためのクロー
ニング部位を第五のDNA構築物が含んでいてもよい。
本発明の別のキットは1種類またはそれ以上の構築物が作用ドメイン(転写開
始シグナル発生因子、転写活性化因子、DNA結合タンパク質など)の代わりに
クローニング部位を含んでいるキメラタンパク質をコード化ている1種類、2種
類またはそれ以上のDNA構築物を含むことができ、どの作用ドメインでも使用
者が望むものを挿入することを可能にする。このようなキットは随意に、前記の
ような他の要素、例えば、応答性発現制御下の標的遺伝子のためのDNA構築物
、マルチマー化リガンド、アンタゴニストなどを含んでいてもよい。
キットはいずれも本発明の構築物によって安定して形質転換された陽性対照細
胞を含むことができ、それらはリガンドに対する細胞の暴露に応答して、CAT
(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)、ベーターガラクトシダーゼまた
は任意の他の好都合に検出可能な遺伝子産物を発現する。レポーター遺伝子の発
現を検出および/または定量するための試薬もまた提供される。図面の簡単な説明
図1は、プラスミドpSXNeo/IL2(IL2−SX)の略図である。N
F−AT−SXにおいて、IL−Wエンハンサー/プロモーターを有するIL−
2−SXからHindIII−ClaI DNAフラグメントは、基礎転写を与
える最小のIL−2プロモーターおよび三個のタンデムNFAT結合部位(以下
に記載される)を含む誘導要素によって置き換えられる。
図2は、細胞内シグナリングキメラプラスミドp#MXFnおよびp#MFn
Zの製造のフローダイヤグラムであり、nは結合ドメインの数を示す。
図3Aおよび3Bは、細胞外シグナリングキメラプラスミドP#1FK3/p
BJ5の製造のフローダイヤグラムである。
図4A、4Bおよび4Cは、本発明において用いられるプラスミド構築におい
て用いられるプライマーの配列である。
図5は、受容体TAC/CD3ζとリガンドとの反応に対する、異なるエンハ
ンサー基を有するリポーター構築物の反応のチャートである。
図6は、実施例1に記載のTAgジュルカット(Jurkat)細胞による各
種リガンドの活性チャートでる。
図7は、細胞外受容体1FK3(FKBPx3/CD3ζ)によるリガンドF
K1012A(8、図9B)の活性のチャートである。
図8は、ミリストイル化CD3ζ/FKBP12キメラによるシグナリングに
よるNFATリポーターの活性化チャートである。
図9Aおよび9Bは、アリル結合FK506変異型およびシクロヘキシル結合
FK506変異型それぞれの化学構造である。
図10は、FK520の誘導体合成のフローダイヤグラムである。
図11AおよびBは、FK520の誘導体合成のフローダイヤグラムおよびF
K520の化学構造であり、それらの下部構造は突然変異体FKBP12に対し
て結合するように設計される。
図12は、推定上の切片における修飾FK520を有する突然変異体FKBP
の図示である。
図13は、FK520およびシクロスポリンのヘテロダイマーの合成のフロー
ダイヤグラムである。
図14は、受容体ドメインとしてイムノフィリン残基を有するキメラタンパク
質によって図示されるキメラタンパク質のオリゴマー化の略図である。
図15は、キメラタンパク質のリガンドに媒介されたオレゴマー化を表わし、
転写開始シグナルの引き金を図式的に示す。
図16は、FK−506型残基を基剤とするHEDおよびHOD試薬について
の合成スキームを表す。
図17は、CsAで開始する(CsA)2の合成を表す。
図18は、融合cDNA構築物およびタンパク質MZF3Eの概観である。
図19は、細胞の低下した転写活性によって示されるような、ミリストイル化
Fas−FKBP12融合タンパク質(MFF3E)によってトランスフェクト
されたジュルカットT細胞系のFK1012に誘導された細胞死を示す。
図20Aは、一時的トランスフェクション検定におけるシクロスポリン−Fa
s(およびFas−シクロポリン)融合構築物の分析である。MC3FEはこの
系列において最も有効であることが分かった。
図20Bは、イムノフィリン−Fas抗原キメラ、および大型T抗原によって
安定して形質転換されたジュルカットT細胞における一時的発現実験結果を表す
。
Myr:残基1−14をコードしているpp60C-SRCから得られたミリスチル
化配列(Wilsonら、Mol & Cell Biol 9 4(1989
):1536−44);FKBP:ヒトFKBP12;CypC:残基36−2
12をコードしているネズミシクロフィリンC配列(Freidmanら、Ce ll
66 4(1991):799−806);Fas:残基179−319
をコードしているヒトFas抗原の細胞内ドメイン(Oehmら、J Biol Chem
26715(1992):10709−15)。細胞は、3個のタ
ンデムAP1プロモーターの制御下の分泌アルカリ性ホスファターゼリポーター
遺伝子をコードしているプラスミドを、6倍モル過剰のイムノフィリン融合構築
物と一緒に用いてエレクトロポレーションが行われた。24時間後、リポーター
遺伝子の合成および(CsA)2を刺激するPMA(50ng/ml)で細胞を
刺激した。48時間目に細胞のリポーター遺伝子活性を評価した。抗HAエピト
ープ抗体を用いて、ウェスタンブロットを24時間目に行った。
図21は、修飾FK506型化合物の合成を表す。説明
I.総論
本発明はキメラタンパク質、該キメラタンパク質をマルチマー化するための有
機分子およびそれらを用いるシステムを提供する。融合キメラタンパク質はマル
チマー化分子へ結合するための結合ドメイン、および生理学的作用または細胞過
程を果たすことができる作用ドメインを有する。好ましくはマルチマー化分子は
小形の有機分子である。キメラタンパク質のマルチマー化により有効になる生理
学的作用または細胞過程は一般的には調節可能な阻止遺伝子をコードしている遺
伝子の転写である。この遺伝子は、標的遺伝子またはリボザイムに相補的であり
およびその転写を妨害するアンチセンスメッセージのような阻止因子をコードし
、標的遺伝子の発現を妨げることができる「阻止」遺伝子であろう。或いは、阻
止遺伝子は標的遺伝子の遺伝子産物に結合でき、好ましくはその生物学的効果を
中和または阻止する単鎖抗体のような抗体残基をコードしてるであろう。阻止遺
伝子はまた標的遺伝子産物の効果を阻止できる優勢陰性遺伝子産物をコードして
もよいし、またはその作用が標的遺伝子産物の完全な除去を導くであろうタンパ
ク
質をコードしてもよい。後者の型の例はタンパク質Creをコードしている遺伝
子であり、それはCreリコンビナーゼを産生し、その発現は宿主細胞において
「loxP」配列に適切に隣接された標的遺伝子の除去を導く。或いは、構築物
はFas抗原またはTNF受容体の細胞質ドメインのような遺伝子産物をコード
しているであろうし、そのような構築物を含んでいる細胞は容易にアポトーシス
により除去される。
リガンド媒介マルチマー化の基本的概念は図14に示されている。ヘテロダイ
マー化またはヘテロマルチマー化(「HED」)試薬およびホモダイマー化また
はホモマルチマー化(「HOD」)試薬として機能しうる二価リガンドはダンベ
ル形構造として表されている。
用語「ホモダイマー化」または「ホモマルチマー化」とは類似の成分が会合し
てダイマーまたはマルチマーを形成することを示しており、それらは図14に示
されているように本発明の多価リガンドにより連結されている。用語「ヘテロダ
イマー化」または「ヘテロマルチマー化」とは類似しない成分が会合してダイマ
ーまたはより高次のマルチマーを形成することを示している。従って、ホモマル
チマーは特定の成分の多数のコピーの会合から成るが、一方ヘテロマルチマーは
異なった成分のコピーの会合から成る。接頭語を伴ってまたは伴うことなく本明
細書で用いられる「マルチマー化」、「マルチマー化する」および「マルチマー
」という用語は、それと反対の明白な表示を欠いた「ダイマー化」、「ダイマー
化する」および「ダイマー」を包含するつもりである。
図14およびSpencerらの図8に示されているのは作用ドメインおよび
マルチマー化リガンドへ結合できる、一つまたはそれ以上の受容体ドメインを含
む融合またはキメラタンパク質分子である。細胞内キメラタンパク質、即ちそれ
らが産生される細胞内に位置されるように意図されたタンパク質は、若干の実施
態様において好ましくは細胞性標的化配列(例えば、細胞小器官標的化アミノ酸
配列)を含んでいるであろう。受容体ドメインへのリガンドの結合は融合タンパ
ク質のマルチマー化を導く。マルチマー化は作用ドメインをお互いに極めて接近
させることにより、マルチマー化に応答性要素の転写制御下にある遺伝子の転写
活性化の引き金を引く。
受容体マルチマー化により引き起こされうる細胞性過程としては、例えば、立
体配座変化、結合パートナーの変化、細胞死、転写の開始、チャンネル開口、C
a+2イオンなどのイオン放出などの物理的状態または例えば、アシル化、メチル
化、加水分解、リン酸化もしくは脱リン酸化などの酵素的に触媒される化学反応
のような化学状態の変化が含まれる。従って、本明細書の主たる焦点は、その遺
伝子産物が選択された標的遺伝子の発現を阻止するようにまたは細胞から標的遺
伝子を除去するように機能できる遺伝子を含む阻止遺伝子の転写の活性化(直接
的にまたは間接的に)ではあるが、リガンド媒介マルチマー化により引き金が引
かれるそのような過程はいずれも本発明の範囲内に包含される。
本発明の中心的特色は、本明細書に記載した一次のキメラへ結合できる(およ
び従ってマルチマー化される)リガンド分子に応答性であるように細胞が修飾さ
れることである。そのような工学処理された細胞はマルチマー化キメラタンパク
質分子に応答性の転写制御要素による阻止遺伝子の転写活性化によることでマル
チマー化リガンドに応答する。
修飾された細胞は(a)対応する転写制御要素を経る阻止遺伝子のリガンド調
節転写活性化を可能にする本発明の一次キメラタンパク質(または一連の一次キ
メラタンパク質)をコードする遺伝子構築物(または一連の遺伝子構築物)、(
b)キメラタンパク質のマルチマー化により活性化される転写制御配列の転写制
御下の阻止遺伝子を含む組換えDNA配列含有阻止遺伝子構築物を含むゲノムに
より特徴付けられる。制御阻上遺伝子がタンパク質Creをコードしている場合
、細胞はさらに(c)Creタンパク質存在下で標的遺伝子の組換えおよび除去
を可能にする、loxP DNA配列が隣接した標的遺伝子を含んでいる。
阻止遺伝子の転写の活性化にホモダイマーを含むホモマルチマーが含まれてい
る場合、第一列の単一構築物のみが必要とされるが、ヘテロマルチマーが関与す
る場合、二つまたはそれ以上の構築物が必要とされる。第一列の構築物によって
コードされているキメラタンパク質は遺伝子転写の発動作用に関係し、そして通
常表面膜または核に対して向けられる。
本発明のキメラタンパク質をコードしている遺伝子構築物には二つの主なクラ
スが存在する。両方の場合とも、コードされたキメラタンパク質は少なくとも一
つの作用ドメインおよび少なくとも一つのリガンド結合ドメインを含んでいる。
二つのクラスは以下のように記載される:(1)コードされたキメラのリガンド
結合ドメインは細胞外または細胞内であるが、キメラタンパク質分子のリガンド
媒介、ホモまたはヘテロマルチマー化が選択された遺伝子の転写活性化を起こす
一連の出来事を生じる信号を誘導するように、作用ドメインは細胞内にある構築
物;(2)タンパク質分子のリガンド媒介、ホモまたはヘテロマルチマー化が選
択された阻止遺伝子の転写開始領域とマルチマーの複合体形成により直接転写の
開始を誘導するようにコードされたキメラのリガンド結合ドメインおよび作用ド
メインが細胞内にある構築物。II .転写調節
前記グループ(1)および(2)の構築物によりコードされているキメラタン
パク質は幾分その作用が異なる。グループ(1)キメラは間接的に転写を活性化
し、幾分多面的効果を持つことができる;即ち、導入された阻止遺伝子に加えて
多数の野生型遺伝子を活性化するであろう。さらに、グループ(1)キメラタン
パク質のマルチマー化に続く転写活性化は、グループ(2)キメラの場合よりそ
の開始がより遅い。グループ(2)構築物は転写をより直接的に、および選択さ
れた遺伝子により狭く限定する様式て活性化する。グループ(2)キメラタンパ
ク質のマルチマー化に応答する転写活性化は典型的には非常に迅速である。
キメラタンパク質は少なくとも一つのリガンド分子と結合できる「結合」また
は「受容体」ドメインを含んでいる。マルチマー化リガンドは、一つ以上の受容
体部位を含むという意味で多価であるので、本発明のキメラタンパク質とダイマ
ーまたはより高次のホモまたはヘテロマルチマーを形成することができる。例え
ば、二価のリガンドでホモマルチマーが形成できるようにキメラタンパク質は一
つまたは複数の結合部位を持つことができる。
キメラタンパク質はまた、キメラタンパク質分子のリガンド媒介マルチマー化
により転写を開始することができる(直接的にしろ間接的にしろ)「作用」ドメ
インも含んでいる。
グループ(1)または(2)が典型的には細胞内標的化ドメインを含んでいる
かどうかに関わらず、キメラタンパク質を所望の細胞区画(例えば、グループ
(1)の場合は表面膜、グループ(2)の場合は核)へ向かわせる配列または成
分をキメラタンパク質は含んでいる。
例示すると、グループ(1)キメラタンパク質は細胞内標的化ドメインとして
ミリスチン酸残基、受容体ドメインとして三つのFKBP12残基を含み;およ
び作用ドメインはT細胞受容体ζサブユニットを含んでいる。例えば、Spen
cerら、Science(1993)を参照されたい。グループ(2)キメラ
タンパク質は一般的に一連の少なくとも二つのキメラを含んでおり、一方の作用
ドメインはDNA結合ドメインを含み、他方の作用ドメインは転写活性化ドメイ
ンを含んでいる。グループ(2)キメラのマルチマー化はDNA結合ドメインお
よび転写活性化ドメインを非常に接近させる。生じたマルチマーとDNA結合ド
メインが結合したDNA配列との相互作用により応答性DNA要素に付随した遺
伝子の転写が開始される。
どちらの場合でも、所望のアンチセンスメッセージ、リボザイム、抗体残基、
優勢タンパク質またはタンパク質Creのような遺伝子配列の除去に機能できる
タンパク質をコードしている遺伝子は、マルチマー化リガンドの添加(即ち、グ
ループ(1)またはグループ(2)キメラタンパク質分子をマルチマー化するた
め)に応答性(直接的にしろ間接的にしろ)のDNA要素の転写制御下になるよ
うな様式で提供されなければならない。グループ(1)キメラの場合、阻止遺伝
子はキメラの作用ドメインのマルチマー化により活性化される転写調節配列に結
合されている。例えば、作用ドメインがT細胞CD3ζサブユニットである場合
、阻止遺伝子はNFAT配列に結合されているであろう。所望の調節可能遺伝子
がタンパク質Creをコードしている場合、フロックス化された標的遺伝子を含
む組換え構築物が提供され、全システムを完了するためのCre媒介組換えの目
標として働くであろう。A.表面膜受容体
本発明のグループ(1)キメラタンパク質は典型的には工学処理された細胞の
表面膜と結合する。そのようなタンパク質を含む細胞へマルチマー化試薬を添加
すると、一つまたはそれ以上の遺伝子の転写を導くシグナルを発生させる。選択
された遺伝子(類)に付随するプロモーター領域への転写因子の結合が最高に達
する一連の相互作用において多数の補助タンパク質が含まれる。他の遺伝子に付
随するプロモーターに転写因子が結合している場合、転写は同様にそこで開始さ
れる。この実施態様のキメラタンパク質をコードしている構築物は、プロセッシ
ングを受け、従って成熟キメラタンパク質中には存在しないシグナル配列をコー
ドできる。キメラタンパク質は少なくとも(a)前もって決定されているリガン
ドを結合できる結合ドメイン、(b)随意に(しかし多くの態様で好ましいが)
、融合タンパク質を細胞表面/膜に移し、表面膜へのタンパク質の結合を保持す
るための貫膜ドメインまたは結合された脂質を含む膜結合要素またはドメイン、
および(c)作用ドメインとして細胞質シグナル開始ドメインを含んでいる。細
胞質シグナル開始ドメインはシグナルを開始でき、それは転写開始領域に、開始
されたシグナルのための認識配列を持つ遺伝子の転写を生じさせる。
膜への結合のために提供されるキメラタンパク質の分子部分は「保持ドメイン
」とも称される。適した保持ドメインには膜中の脂質関与または膜を介する延長
などにより膜中の脂質層に直接結合する残基がある。そのような場合、図15に
示されたように、タンパク質は膜特に細胞膜に移され且つ結合されるようになる
。Spencerらの図8も参照されたい。B.核転写因子
グループ(2)キメラタンパク質は、タンパク質を核へ移すための細胞標的化
配列を含む。この(「シグナル共通」)配列は、二部分から成る塩基性反復と称
される多数の塩基性アミノ酸を有する(Garcia−Bustosら、Bio chimica et Biophysica Acta
(1991)1071
,83〜101において論及された)。この配列は、N−またはC末端の内部ま
たはそれに近い分子のいずれかの部分に現れることができ、しかも核の中にある
キメラタンパク質を生じる。本発明の一つの実施態様の実施は、少なくとも2種
類のグループ(2)キメラタンパク質を含んでいる;(1)阻止遺伝子構築物中
の阻止遺伝子に付随する転写開始領域のDNAに結合する作用ドメインを持つも
の、および(2)第一のキメラタンパク質のDNA結合ドメインと共同して阻止
遺伝
子構築物の転写を開始できる転写活性化ドメインを作用ドメインとして含む異な
ったキメラタンパク質。二つの作用ドメインまたは転写因子は同一のまたは異な
ったタンパク質分子から誘導できる。
転写因子は、細胞宿主に対して内因性または外因性であり得る。転写因子が外
因性であるが宿主中で機能性であり、しかも内因性RNAポリメラーゼと協同す
ることができる(外因性RNAポリメラーゼを必要とするよりもむしろ、そのた
めに遺伝子を導入しうる)場合、融合された転写因子によって機能性の外因性プ
ロモーター要素は、標的遺伝子の転写を調節するための第二構築物と一緒に与え
られることができる。これによって、転写の開始は、外因性プロモーター領域と
結合した1種類または複数の遺伝子、すなわち、1種類または複数の標的遺伝子
に限定されることができる。
活性に対して2種類のサブユニットを必要とする多数の転写因子が知られてい
る。もしくは、単一転写因子が二つの別個の機能性ドメイン(例えば、転写活性
化ドメインおよびDNA結合ドメイン9に分割されることができる場合、それぞ
れのドメインは、それ自体不活性であるがきわめて近づけられた場合、転写活性
が回復される。用いることができる転写因子としては、FieldsおよびSo
ng(上記文献)記載の二つのドメインに分割されることができる酵母GAL4
がある。著者らは、GAL4(1−147)−SNF1およびSNF4−GAL
4(768−881)の融合を使用しており、そこにおいてSNF1および−4
は、結合ドメインとしての問題の結合タンパク質によって置き換えることができ
る。GAL4およびVP16またはHNF−1の組み合わせを用いることができ
る。他の転写因子は、Jun、FosおよびATF/DREB系列、Oct1,
Sp1,HNF−3,ステロイド受容体超系列等のメンバーである。
DNA結合ドメインおよび天然に存在する活性ドメインまたはその修飾された
形の組み合わせを用いる代わりとして、活性化ドメインを、転写活性化ドメイン
と、制限されないがRNAポリメラーゼIIが挙げられるRNAポリメラーゼ都
の間の架橋によって結合した結合タンパク質の一つで置き換えることができる。
これらのタンパク質としては、TAFと称するタンパク質、TFIIタンパク質
、特にBおよびDまたは類似のものがある。したがって、DNA結合タンパク質
と
RNAポリメラーゼとの間の架橋に役立ち且つ転写を開始させる融合タンパク質
またはそれらの結合モチーフなどのタンパク質のいづれか1種類または組み合わ
せを用いることができる。好ましくは、RNAポリメラーゼに最も近いタンパク
質をDNA結合ドメインと一緒に用いて転写を開始させる。所望ならば、問題の
構築物は、3種類またはそれ以上、通常約4種類以下のタンパク質を集めて、転
写開始複合体を提供することができる。
転写活性化ドメインを作用ドメインとして有するよりもむしろ、不活性ドメイ
ン、例えば、ssn−6/TUP−1またはクリュッペル(Kruppel)系
列サプレッサードメインを用いることができる。この方法において、調節は、構
成的に発現される遺伝子の転写を停止させる。例えば、遺伝子療法の場合、成長
ホルモンなどのホルモン、血液タンパク質、免疫グロブリン等を構成的に発現さ
せることができる。リガンド結合ドメインに対して結合した不活性化ドメインを
含む別のキメラタンパク質をコードしている構築物を用いることにより、遺伝子
の発現はリガンドに媒介されたマルチマー化によって阻害されることがある。
特に、転写活性化ドメイン若しくはサブユニットに対して融合したリガンド結
合ドメイン、転写不活性化ドメインまたはDNA結合ドメインを含むキメラタン
パク質をコードしている構築物は、他の構築物について記載されたのと同様に設
計され且つ組み立てられる。しばしば、転写因子のN末端は、リガンド結合ドメ
インのC末端に対して結合されるが、いくつかの場合、例えば、単一転写因子の
二つの個々のドメインが二つの異なるキメラ間に分かれている場合、逆も真であ
る。III .キメラタンパク質の成分およびその機能
成分ドメインの選択および本発明のキメラタンパク質の設計への取り込みには
かなりの融通性が存在する。表面膜との結合が意図されるキメラタンパク質に対
しては、もしリガンド結合ドメインが細胞外であるならば、キメラタンパク質は
種々の表面膜タンパク質から選択される細胞外ドメインを含むように設計できる
。同様に、どの内因性遺伝子が細胞質部分により調節されるかに依存して、シグ
ナルを伝達できる表面膜タンパク質の種々の細胞質または細胞内ドメインが使用
で
きる。キメラタンパク質が細胞の内部、表面膜タンパク質の内部に存在すべき場
合、または核または細胞質小胞のような細胞小器官に結合されている場合、リガ
ンド結合ドメインタンパク質は好ましくは表面膜または他の膜を交差できる分子
を結合できるようなものであろう。これらの結合ドメインは一般的に、好ましく
は核酸またはペプチド性ではない天然に存在するまたは合成のリガンド残基を含
む多価リガンドに結合するであろう。A.グループ(1)の細胞質ドメイン
グループ(1)のキメラタンパク質受容体は作用ドメインとして、細胞変異タ
ンパク質を含む種々の細胞表面膜受容体の一つからの細胞質ドメインを含むこと
ができ、そこにおいて、細胞質ドメインに関係した転写の開始に関与した認識配
列は知られているしまたはこのような配列に対して応答性の遺伝子は知られてい
る。目的の突然変異受容体は、有害な副作用、例えば、脱調節細胞増殖またはサ
イトカインの不適当な放出に関することがある遺伝子の活性化から標的遺伝子の
転写活性化を分離する。特に興味深い受容体結合細胞質ドメインは、以下の特性
を有する:受容体活性化は、細胞宿主中の比較的少ない(望ましくは100未満
の)、概して無害の遺伝子転写の開始をもたらし;受容体活性化によって開始さ
れる転写に必要な他の因子は細胞宿主中に存在し;選択された遺伝子以外を活性
化させる遺伝子は、これらの細胞が用いられている目的に影響を与えないし;細
胞質ドメインのマルチマー化または他の利用可能な機序はシグナル開始を引き起
こし;そして望ましいリガンド結合ドメインに対する細胞質ドメインの結合はシ
グナリングを防げない。多数の異なる細胞質ドメインが知られている。これらの
ドメインの多くはチロシンキナーゼであるかまたはチロシンキナーゼと複合体を
形成し、例えばCD3ζ,IL2−R,IL−3R等である。(Cantley
ら、Cell(1991)64,281を参照されたい。)架橋、または、ダイ
マー化によって活性化されるチロシンキナーゼ受容体には、Yardenおよび
Ulrich,Ann.Rev.Biochem.(1988)57,443に
よって最初に提唱された命名法に基づき、サブクラスI:EGF−R,ATR2
/neu,HER2/neu,HER3/c−erbB−3、Xmrk;サブク
ラスII:インスリン−R、IGF−1R[インスリン様成長因子受容体]、I
RR;サブクラスIII:PDGF−R−A、PDGF−R−B、CSF−1−
R(M−CSF/c−Fms)、c−kit、STK−1/F1k−2;および
サブクラスIV:FGF−R、f1g[酸性FGF]、bek[塩基性FGF]
;神経栄養チロシンキナーゼ:Trk系列としては、NGF−R、Ror1、2
がある。架橋によってチロシンキナーゼと結合する受容体としては、CD3ζ系
列:CD3ζおよびCD3η(主としてT細胞中で見出され、Fynと結合する
);Fc6RIのβおよびγ鎖(主としてマスト細胞および好塩基性細胞中で見
出される):FcγRIII/CD16のγ鎖(主としてマクロファージ、好中
球およびナチュラルキラー細胞中で見出される);CD3γ、−δおよび−ε(
主としてT細胞中で見出される);Ig−α/MB−1およびIg−β/B29
(主としてB細胞中に見出される)がある。多数のサイトカインおよび成長因子
キナーゼは、チロシンキナーゼおよび/または他のシグナリング分子と相互作用
し且つ本発明のキメラタンパク質中で細胞質ドメインとして用いることができる
共通のβサブユニットと結合する。これらには、(1)GM−CSF、IL−3
およびIL−5受容体によって共有された共通のβサブユニット;(2)IL−
6、白血病阻害因子(LIF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、オンコスタ
チンMおよびいL−11受容体に結合したβ鎖gp130;(3)IL−4、I
L−7およびIL−13(およびおそらくはIL−9)の受容体にも結合したI
L−2受容体γサブユニット;(4)G−CSF受容体の細胞質ドメインに対し
て相同であるIL−2受容体のβ鎖がある。
インターフェロンα/βおよびγ(チロシンキナーゼのJAK、Yyr系列の
1種類またはそれ以上のメンバーを活性化しうる)を含む受容体のインターフェ
ロン系列並べに成長ホルモン、エリトロポエチンおよびプオラクチン(JAK2
をさらに活性しうる)の受容体は、さらに、細胞質ドメイン源として用いること
ができる。
他の細胞質ドメイン源としては、細胞表面受容体のTGF−β系列がある(K
ingsley,D.、Genes and Development 199
4 8 133によって論及された)。受容体のこの系列は、架橋によって活性
化されると考えられるそれらの細胞質ドメイン中にセリン/トレオニンキナーゼ
活性を含む。
転写因子の活性化および不活性化に関係したチロシンキナーゼは、外因性遺伝
子の発現を開始するまたは阻害するように制御されうるし且つ用いられうる特定
の経路を提供する場合に特に興味深い。
下記の表は、多数の受容体および受容体に関係した特性並びに遺伝子を活性化
するそれらの核応答要素を提供する。表は完全ではないが、本発明において用い
るための典型的なシステムを提供する。
おおくの場合、突然変異細胞質ドメインは、導入されるシグナルが野生型とは
異なることがある場合に得られ、1種類または複数の野生型経路と比較して限定
されたまたは異なる経路を生じる。例えば、EGFおよびFGFなどの成長因子
の場合、突然変異は、シグナルが細胞増殖から切り離されているがなおc−Fo
sによって維持されている場合に報告された(Petersら、Nature(
1992)358,678)。
チロキシナーゼ受容体は、広範囲の全身にわたる細胞で見出しうる。対照的に
、CD3ζ−系列、Ig系列およびリンホカインβ鎖受体系列は、主として造血
系細胞、特に、T細胞、B細胞、マスト細胞、好塩基性細胞、マクロファージ、
好中球およびナチュラルキラー細胞で見られる。NF−AT転写に必要なシグナ
ルは、主として抗原受容体のゼータ(ζ)鎖に、そしてそれより少ないが、CD
3γ、δ、εに由来する。
細胞質ドメインは、それが天然に存在するようにまたはそれが切断され、修飾
され若しくは突然変異しうるように、少なくとも約10アミノ酸、通常少なくと
も約30アミノ酸、さらに通常は少なくとも約50アミノ酸、そして一般的には
約400アミノ酸以下、通常約200アミノ酸以下である。(Romeoら、C ell
(1992)68,889−893を参照されたい。)いずれの種も用い
ることができるが、通常、宿主細胞に対して内因性の種が好ましい。しかしなが
ら多くの場合異なる種からの細胞質ドメインを有効に用いることができる。上記
に示した細胞質ドメインはいずれも、更には現在知られているまたは引き続き発
見されるかもしれない他のものも用いることができる。
大部分に対し、転写因子に結合した他のキメラタンパク質は、主としてキメラ
タンパク質を核酸の内側に向ける細胞標的配列を有することおよび転写因子また
はそれらの作用ドメインとしての部分を有することが異なる。通常、転写因子作
用ドメインはDNA結合ドメインおよび活性化ドメインに分けることができる。
DNA結合ドメインには1種類またはそれ以上のリガンド結合ドメイン、および
活性化ドメインには1種類またはそれ以上のリガンド結合ドメインを与えること
ができる。この方法で、DNA結合ドメインを、多数の結合ドメインおよび/ま
たは活性化ドメインに対して結合させることができる。それ以外の場合、シグナ
ル導入のために表面膜と結合したキメラタンパク質についての理論は、ゲノムD
NAにたいする直接結合のためのキメラタンパク質にあてはまる。
B.細胞標的ドメイン
シグナルペプチドまたは配列は、細胞表面膜に対してキメラタンパク質を輸送
し、そこにおいて同一または他の配列は、細胞表面膜に対するキメラタンパク質
の結合をコードしている。2個または3個のN末端極性アミノ酸、続いて約15
−20個の主として疎水性のアミノ酸についての一般的なモチーフがシグナル配
列するには存在するが、個々のアミノ酸は広範囲に変化しうる。したがって、宿
主中で機能性であり且つキメラタンパク質の他のドメインの一つと結合していて
よいしまたはしていなくてよいほとんど全てのシグナルペプチドを用いることが
できる。通常、シグナルペプチドはプロセッシングされ、成熟キメラタンパク質
中に保持されない。シグナルペプチドをコードしている配列は、コーディング配
列の5’末端にあり、開始メチオニンコドンを含んでいる。
膜保持ドメインの選択は、このような膜保持ドメインが実質的に代替可能であ
り、しかも活性化のための別の膜部分に対して結合するまたは接着するのに必要
な臨界的アミノ酸は存在しないことが分かったので、本発明に対して臨界的では
ない。したがって、膜保持ドメインは、宿主細胞に対して内因性であろうとなか
ろうと、任意の好都合な表面膜または細胞膜タンパク質から単離することができ
る。
少なくとも2種類の異なる膜保持ドメイン、すなわち、膜を越えて伸長するア
ミノ酸配列である貫膜保持ドメイン;および脂質が細胞表面膜の脂質と結合して
いる脂質保持ドメインが存在する。
大部分は、構築の容易さのために、融合タンパク質の構築を単純化する性質が
ある細胞質ドメインまたは受容体ドメインの貫膜ドメインを用いることができる
。しかしながら、脂質膜保持ドメインのために、通常、プロセッシングシグナル
は、膜に対するN末端結合のコーディング配列5’末端におよびC末端結合の3
’末端近くに加えられる。脂質膜保持ドメインは、グリシンに結合した約12−
24個の炭素原子、具体的には14個の炭素原子を有する脂質、さらに具体的に
はミリストイルを有する。脂質結合ドメインのシグナル配列はN末端配列であり
、しかも広範囲に変化することができ、通常、残基2にグリシンおよび残基7に
リシンまたはアルギニンを有する(Kaplanら、Mol.Cell.Bio l.
(1988)8,2435)。脂質膜結合を与えるように翻訳後プロセッシ
ングを必要とするペプチド配列はCarrら、PNAS USA(1988)7
9,6128;Aikenら、FEBS Lett.(1982)150,31
4;Hendersonら、PNAS USA(1983)80,319;Sc
hulzら、Virology(1984),123,2131;Dellma
nら、Nature(1985)314,374に記載されており;およびAn n.Rev.of Biochem
.(1988)57,69に論及されている
。興味深いアミノ酸配列としては、配列M−G−S−S−K−S−K−P−K−
D−P−S−Q−Rがある。種々のDNA配列を用いて、融合受容体タンパク質
中のこ
のような配列をコードすることができる。
概して、貫膜ドメインは、約18−30アミノ酸、更に通常は約20−30ア
ミノ酸を有し、その中心部分は主として中性の無極性アミノ酸であり、ドメイン
の末端は極性アミノ酸、しばしば荷電アミノ酸であり、概して、貫膜ドメインの
末端に約1−2個の荷電した、主として塩基性アミノ酸、続いてらせん切断残基
、例えば、pro−またはgly−を有する。
C.キメラタンパク質の組織特異的発現
ある種の態様において、標的遺伝子は細胞特異的または組織特異的様式で調節
可能に除去されることが好ましいであろう。そのような特異性を達成するため、
キメラタンパク質の発現を細胞型特異性にした。そのような発現の特異性は、細
胞型特異性転写調節配列(例えば、プロモーター/エンハンサー)へキメラタン
パク質(類)をコードしている一つまたはそれ以上のDNA配列を連結すること
により達成される。多数の細胞型特異性転写調節配列が知られている。他のもの
は細胞特異的様式で発現されている遺伝子から得られるであろう。
例えば、キメラタンパク質を発現するための構築物は選択された組織での特異
的発現が知られている遺伝子から誘導された調節配列を含んでいるであろう。代
表的な例が下記の表に示されている:
組織特異的プロモーターの同定
遺伝子の細胞特異的発現を調節する配列を同定するため、タンパク質をコード
するエキソンから「上流」の配列を含む選択された遺伝子のゲノムコピーを単離
した。
これらの上流配列は次に通常、上流調節配列の制御下の遺伝子の発現を追いか
けることを可能にするため、ベーターガラクトシダーゼのような容易に検出可能
なレポーター遺伝子と融合させる。
細胞特異的様式で遺伝子発現を調節するのにどの上流配列が必要で、十分であ
るかを確立するため、完全上流配列を問題とする細胞内へ導入し、最初のクロー
ンが制御配列を含んでいるかどうかを決定する。レポーター遺伝子発現が発現の
証拠としてモニターされる。
もし、これらの配列が細胞型特異的発現に必要な配列を含んでいたら、どの配列
が細胞型特異的発現に最小限必要とされるかを決定するために5’フランキング
配列での欠失が行われる。このことは各々の構築物を持つトランスジェニックマ
ウスを作製し、ベータ−gal発現をモニターすることにより、または特定の培
養細胞での発現を最初に試験し、非特異的培養細胞での発現と比較することによ
り実行できる。
いくつかの連続的欠失分析により通常組織特異的発現に必要とされる最小配列
が指摘される。最終的にこれらの配列をトランスジェニックマウスに導入し、問
題とする細胞でのみ発現が検出可能であることを確認する。
D.リガンド結合ドメイン
本発明のキメラタンパク質のリガンド結合(「ダイマー化」または「受容体」
)ドメインは、天然または好ましくは合成リガンドに結合する任意の好都合なド
メインであり得る。細胞内に発現され位置するキメラタンパク質中の結合ドメイ
ンの位置はキメラタンパク質の性状およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対
して内部または外部であり得る。受容体を含む広範囲の結合タンパク質が知られ
ており、上記に示した細胞質部分と結合した受容体および結合タンパク質が含ま
れる。特に興味深いのは、そのためのリガンドが知られている、または容易に製
造されうる結合タンパク質である。これらのリガンドは好ましくは小形有機分子
である。これらの受容体またはリガンド結合ドメインとしては、FKBPおよび
シクロフィリン受容体;ステロイド受容体テトラサイクリン受容体;上記に記さ
れた他の受容体;並びに類似のもの;更には抗体、特に、重鎖または軽鎖サブユ
ニット、その突然変異配列、確率法、組み合わせ合成法によって得られたランダ
ムアミノ酸配列から得ることができる「非天然」受容体がある。大部分は、受容
体ドメインは、天然ドメインとしてかまたはその切断された活性部分として少な
くとも約50アミノ酸で約350アミノ酸未満、通常200アミノ酸未満である
。好ましくは、結合ドメインは、小形の(通常25KDa、ウイルスベクター中
での有効なトランスフェクションを可能にする)、モノマー性非免疫源である。
しかもダイマー化のための配置をとることができる合成的に利用可能な細胞透過
性の
無毒性リガンドを有するべきである。
宿主細胞により発現されるキメラタンパク質の受容体ドメインは、キメラタン
パク質をコードしている構築物の設計および適当なリガンドの利用可能性に応じ
て細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドについては、結合ドメインは
膜の両側にあり得るが、親水性リガンド、特にタンパク質リガンドについては結
合に利用可能である形のリガンドを内部化するための輸送系が存在しなければ、
通常結合ドメインは細胞膜の外側にある。細胞内受容体については、構築物はシ
グナルペプチドおよび受容体ドメイン配列の貫膜ドメイン5’もしくは3’また
は受容体ドメイン配列の脂質結合シグナル配列5’を有するところまでコードす
ることができる。受容体ドメインがシグナルペプチドと貫膜ドメインの間にある
場合、受容体ドメインは細胞外である。
受容体をコードしている構築物の一部は、様々な理由で突然変異を誘発させる
ことができる。突然変異が誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を与え
ることができるし、天然に存在する受容体および突然変異が誘発された受容体の
リガンドによる識別を可能にすることができるし、受容体−リガンド対を設計す
る機会を与えることなどができる。受容体の変化は、結合部分において組合せ技
術用いるランダム突然変異誘発であることが知られているアミノ酸変化を伴うこ
とがあり、その場合、結合部分と結合したアミノ酸または立体配座変化に関係し
た他のアミノ酸のコドンは、既知の変化によってかまたはランダムに、特定のア
ミノ酸の1種類または複数のコドンを変化させ、適当な原核細胞宿主において得
られたタンパク質を発現させた後、得られたタンパク質の結合をスクリーニング
することによって突然変異を誘発することができる。この状態を代表するものは
、FKBP12のPhe36をAlaにおよび/またはAsp37をGlyまた
はAlaに変更して、FK506またはFK520または関連するリガンドの9
位または10位の置換基を調節することである。特に、Tyr26、Phe36
、Asp37、Tyr82およびPhe99の内の一つまたはそれ以上の代わり
にVal、Ala、Gly、Metまたは他の小形アミノ酸を含む突然変異体F
KBP12部分は、C9および/またはC10に修飾を含むFK506型および
FK−520型の受容体ドメインとして特に興味深い。
抗体サブユニット、例えば、重鎖または軽鎖、特にフラグメント、更に特には
、可変部全体若しくは、一部分または高親和性結合を生じる重鎖および軽鎖の融
合体は、結合ドメインとして用いることができる。抗体は、生理学的に許容しう
るハプテン分子および結合親和性についてスクリーニングされた個々の抗体サブ
ユニットに対して製造することができる。サブユニットをコードしているcDN
Aを単離し、そして不変部の欠失、可変部の一部分、可変部の突然変異誘発等に
よって修飾して、リガンドに対して適当な親和性を有する結合タンパク質ドメイ
ンを得ることができる。この方法において、ほとんどすべての生理学的に許容し
うるハプテン化合物を、リガンドとしてまたはリガンドにエピトープを与えるよ
うに用いることができる。抗体ユニットの代わりに、天然受容体を用いることが
でき、そこでは結合ドメインは既知であり、結合に有用なリガンドが存在する。
タンパク質をコードしている配列のインビトロ突然変誘発または組み合わせ修
飾を用いる能力は、異なるリガンドの結合親和性についてスクリーニングされう
るタンパク質のライブラリーの製造を可能にする。例えば、結合タンパク質をコ
ードしているDNA配列中の一カ所またはそれ以上の部分において1−5種類、
10種類またはそれ以上のコドンの配列を全くランダムにし、発現構築物を製造
し、且つ該発現構築物を単細胞微生物中に導入し、そしてライブラリーを生じさ
せることができる。次に1種類または望ましくは多数のリガンドに対する結合親
和性についてライブラリーをスクリーニングすることができる。次にそれらが導
入される細胞と適合しうる最良の親和性配列を結合ドメインとして用いることが
できる。リガンドは、内因性タンパク質に対するリガンドの結合レベルを決定す
るのに用いられる宿主細胞によってスクリーニングされる。結合プロフィールは
、内因性タンパク質に対する結合親和性による突然変異が誘発された結合ドメイ
ンに対する結合親和性比率の増加を明確にすると考えられる。次に最良の結合プ
ロフィールを有するこれらのリガンドをリガンドとして用いうる。ファージ表示
技術は、非制限実施例と同様、前述の実施においても用いることができる。E.マルチマー化
導入されたシグナルは、通常、キメラタンパク質のリガンドに媒介されたマル
チマー化に起因する、すなわちリガンド結合後のマルチマー化の結果として得ら
れるが、他の結合結果、例えば、アロステリック活性化は、シグナルを開始する
のに用いることができる。キメラタンパク質の構築物は各種ドメインの順序およ
び個々のドメインの反復数に関して変化する。5’−3’方向の転写における細
胞が受容体ドメインについて、構築物は、シグナルペプチド、受容体ドメイン、
貫膜ドメインおよび細胞内(核または細胞質)であるシグナル開始ドメインを含
むタンパク質をコードする。しかしながら、受容体ドメインが細胞内である場合
、異なった順序を用いることができ、その場合、シグナルペプチド後に受容体か
またはシグナル開始ドメイン続いて残りのドメインが続くことができ、あるいは
、多数の受容体ドメインを含み、シグナル開始ドメインは、受容体ドメインの間
にはさまれることができる。通常シグナル開始ドメインの活性部位は配列に対し
て内部にあり、遊離カルボキシル末端を必要としない。各々のドメインは、複数
のコピーで存在でき(特に、受容体ドメイン)、通常約5回反復以下、更に通常
は約3回反復以下である。
受容体をマルチマー化するために、キメラ表面膜タンパク質の受容体ドメイン
のリガンドは、通常それが少なくとも2つの結合部位を有し、その結合部位それ
ぞれが受容体ドメインに対して結合することができる意味でマルチマー化される
。望ましくは、問題のリガンドはダイマーまたは高次オリゴマー、通常はほぼテ
トラマー以下の小形合成有機分子、典型的に、個々の分子は少なくとも約150
Dから約5KD未満、通常は約3KD未満である。合成リガンドおよび受容体の
各種対を用いることができる。例えば、天然受容体を必要とする実施態様におい
て、ダイマーFK506をFKBP受容体と一緒に用いることができ、ダイマー
化されたシクロスポリンAをシクロスポリン受容体と一緒に用いることができ、
ダイマー化されたエストロゲン受容体と一緒に用いることができダイマー化され
たグルココルチコイドをグルココルチコイド受容体と一緒に用いることができ、
ダイマー化されたテトラサイクリンをテトラサイクリン受容体と一緒に用いるこ
とができダイマー化されたビタミンDをビタミンD受容体と一緒に用いることな
どができる。あるいは、例えばトライマーなどの高次リガンドを用いることがで
きる。非天然受容体、例えば、抗体サブユニットまたは修飾受容体等を必要とす
る実施
態様において、種々様々な化合物のいずれも用いることがでる。これらのリガン
ドの重要な特徴は、それらが高親和性によって(好ましくは、Kd≦10-8Mで
)受容体を結合し且つ化学的にダイマー化されうることである。
リガンドは、異なるエピトープ(「HED」試薬とも称される)を持つ異なる
受容体結合分子を有することができ、それらは同一のまたは異なる結合ドメイン
を有するキメラタンパク質のヘテロダイマー化またはヘテロオリゴマー化を媒介
することができるからである。例えば、リガンドはFK506またはFK506
型残基およびCsAまたはシクロスポリン型残基を含んでいてよい。両方の残基
は共通のリンカー残基に対して共有結合している。このようなリガンドは、第一
キメラタンパク質がFK506型残基に対して結合することができるFKDP1
2などの受容体ドメインを含み、且つ第二キメラタンパク質がシクロスポリンA
型残基に対して結合することができるシクロフィリンなどの受容体ドメインを含
んでいる場合、第一および第二キメラタンパク質のマルチマー化を媒介するのに
有用であると考えられる。IV .細胞
すべてまたは実質的にすべての生物体の細胞を工学処理するには、胎児の標準
マイクロインジェクションまたはES細胞の使用が好ましい。細胞は原核細胞で
あってよいが、好ましくは、植物、酵母、蠕虫、昆虫および哺乳動物を含む真核
細胞である。これらの細胞は問題とする哺乳類、特に、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ
ネコ、ラット、マウスなどのような家畜動物からの哺乳類細胞である。これらの
種の中で、例えば、造血系、神経系、間葉、皮膚、粘膜、筋、脾臓、細網内皮、
上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸、肺などの種々の型の細胞が含まれる。リンパ系
または骨髄単球系統に関与しうる有核細胞を含む造血系細胞、T−およびB細胞
系統のメンバー、マクロファージおよび単球、筋芽細胞並びに線維芽細胞が特に
興味深い。造血系、神経系、支質、筋、肝臓、肺、および胃腸前駆細胞のような
幹細胞および前駆細胞もまた興味深い。
細胞は、オートロガス細胞、同系細胞、同種異系細胞および若干の場合として
も異種細胞であり得る。細胞は、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)プロフ
ィ
ールを変化させ、機能性クラスI MHC分子の生成を妨げるβ2−ミクログロ
ブリンを失活させ、クラスII分子を失活させ、1種類またはそれ以上のMHC
分子を発現させ、細胞障害能力を促進または失活させ、細胞障害活性に関係した
遺伝子の発現を促進するまたは阻害することによって修飾することができる。
若干の場合、細胞は特定の特異性を有し、例えば、特定の抗原特異性またはホ
ーミング標的部位特異性を有するT細胞およびB細胞である。V.リガンド
天然に存在する物質および合成物質両方を含む広範囲のリガンドを本発明にお
いて用いて、キメラタンパク質分子のオリゴマー化を行うことができる。リガン
ドを選択するための利用可能なおよび容易に観察可能なまたは測定可能な判定基
準は、(A)リガンドが生理学的に許容しうる(すなわち、それが用いられる細
胞または動物に対して過度の毒性がない)、(B)それが適当な薬用量範囲を有
する、(C)望ましくは、(遺伝子療法用途を含むすべての動物におけるようと
に対して)それを経口で与えることができる(胃腸系において安定であり且つ血
管系統に吸収される)、(D)それが細胞膜および他の膜を必要に応じて通過し
うる、および(E)所望のようとに適当な親和性によって受容体ドメインに対し
て結合することである。第一の望ましい判定基準は、化合物が、受容体によるそ
の活性化能力に対する以外は比較的生理学的に不活性であることである。天然受
容体に対して結合するリガンドが少なく且つ天然受容体に対して結合する全リガ
ンドの比率が低いほど、応答は優れているのが一般的である。特に、リガンドは
、天然のタンパク質に対して強力な生物学的作用を持つべきではない。大部分は
、リガンドは非ペプチドであり且つ非核酸である。
問題の化合物は、大部分は、2個またはそれ以上の単位を有し、該単位は、同
じでもあってもまたは異なっていてもよく、中心の結合基によって互いに結合し
ていることができる。「単位」とは、受容体ドメインを結合することができる個
々の残基(例えば、FK506、FK520、シクロスポリンA、ステロイド等
)である。通常、各々の、単位は少なくともホモダイマーまたは高次ホモマルチ
マーにおける同一反応性基によって結合基に結合されている。
前記のように、小形の非タンパク質性有機分子であって、上記判定基準を満た
し、しかも本発明によるリガンドを提供するように様々な部位でダイマー化する
ことができる該小形有機分子に対して、種々の天然に存在する受容体が存在する
。これらの化合物の実質的な修飾は、結合能力が保持され且つ望ましい特異性を
有する限りにおいて許される。化合物の多くは、大環式化合物、例えば、マクロ
ライドである。適当な結合親和性は、10-4未満、好ましくは、10-6未満、更
に好ましくは、約10-7未満のKd値に反映されるが、10-9または10-10未
満の結合親和性は、可能であり且つ若干の場合最も望ましい。
現在のところ好ましいリガンドは、FKBPタンパク質および/またはシクロ
フィリンタンパク質に対して結合することができる化合物のマルチマー、通常は
ダイマーを含む。このようなリガンドとしては、天然のまたは突然変異が誘発さ
れた結合ドメインに対する結合能力を保持しているシクロスポリンあ、FK50
6、FK520およびラパマイシン並びにそれらの誘導体のホモ−およびヘテロ
マルチマー(通常、2−4単位、更に通常は2−3単位)を含む。このような化
合物の多数の誘導体はすでに知られており、本発明の実施において用いることが
できる合成高親和性FKBPリガンドがある。例えば、Holtら、J.Am. Chem.Soc
.1993,115,9928−9935を参照されたい。F
K506およびその類似体の結合にとって興味深い部位としては、MeBmt、
3位および8位がある。
特に興味深いのは、特に、リガンドの天然に存在する受容体に関してその結合
特性を変化させるリガンドに対する修飾である。同時に、結合タンパク質を変化
させてリガンドの変化を調節することが考えられる。例えば、ヒドロキシルをよ
り大きい立体的必要条件を有する基で置き換えることにより、あるいは10位の
カルボニルをより大きい立体的必要条件を有する基で置換し、またはカルボニル
を基に追うかする(例えば、N置換シッフ塩基若しくはイミンを生成する基で置
き換えて、その位置の嵩を増加させることにより)ことによりFK506の9位
または10位の基を(Van Duyneら(1991)Science 25
2,839を参照されたい)それらの立体的必要条件を増加させるように修飾で
きる。このような部位に好都合に導入されうる各種官能基は、エーテルを生成す
るアルキル基、アシルアミド基、N−アルキル化アミン(但し、2−ヒドロキシ
エチルイミンも1,3−オキサゾリンを生成することができる)などである。概
して、置換基は、通常、酸素、硫黄、窒素等である1−3個、1−2個のヘテロ
原子を含む約1−6個、通常1−4個、そして更に通常は1−3個の炭素原子で
ある。基本的構造を有する異なる誘導体を用いることにより、結合のための異な
るコンホメーションの必要条件を有する異なるリガンドを生成することができる
。受容体に突然変異を誘発させることによって、構造がほとんど違わない修飾さ
れたリガンドに対して異なる親和性を有する実質的に同様の配列を有する異なる
受容体を得ることができる。
用いることができるほかのリガンドはステロイドである。ステロイドはマルチ
マー化することができるので、それらの天然の生物学的活性は、1種類またはそ
れ以上のステロイド受容体ドメインを含むキメラタンパク質に関するそれらの結
合能力を損なうことなく実質的に減少する。非制限実施例により、グルココルチ
コイドおよびエストロゲンをそのように用いることができる。各種薬剤も、該薬
剤が特定の受容体に対して高親和性で結合することが知られている場合に用いる
ことができる。これは、特に、受容体の結合ドメインが知られていて、それによ
って完全な天然受容体タンパク質よりもむしろ結合ドメインのみの本発明のキメ
ラタンパク質の使用が許されるような場合である。この目的には酵素および酵素
阻害剤を用いることができる。
A.リンカー
カルボン酸誘導体を含むアミド基、エーテル、有機および無機エステルを含む
エステル、アミノ等のような各種官能基は、結合に関与することができる。結合さ
せるためには、特定のモノマーを、酸化、ヒドロキシル化、置換、還元等によって
修飾して、カップリングのための部位を提供することができる。モノマーに応じ
て様々な部位をカップリングの部位として選択することができる。
マルチマーリガンドは、任意の好都合な手段によって合成することができ、そ
の場合の結合基は、受容体に対するリガンドの結合部位の結合を妨げない部位で
ある。生理学的活性のための活性部位および受容体ドメインに対するリガンドの
結合部位が異なる場合、通常、リガンドを失活させるように活性部位で結合するこ
とが望ましい。二つの分子(水素分子以外)間の鎖中に、通常1−30原子、更に
通常は約1−20原子の各種結合基を用いることができ、その場合、該結合基は主
として、炭素、水素、窒素、酸素、硫黄およびリンから成る。結合基は、広範囲の官
能基、例えば、アミドおよびエステル、有機及び無機両方のアミン、エーテル、
ジスルフィド、第四アンモニウム塩、ヒドラジン等を包含しうる。鎖としては、
脂肪族基,脂環式基、芳香族基または複素環式基がある。鎖は、合成の容易さおよ
びマルチマーリガンドの安定性に基づい選択される。したがって、長期活性を維持
することが望ましい場合、比較的不活性な鎖を用いて、マルチマーリガンド結合
が開裂されないようにする。或いは血流中での短い半減期のみが望ましい場合、容
易に開裂される様々な基、例えば、エステルおよびアミド、特にペプチドを用い
ることができ、その場合、循環性および/又は細胞内プロテアーゼが結合基を開
裂することができる。
リガンド間の結合基として、様々な基、例えば、通常2から20個の炭素原子
を有するアルキレン、通常4から18個の炭素原子を有するアザアルキレン(但
し、窒素は通常二つの炭素原子間に存在する)、通常6から24個の炭素原子を
有するN−アルキレンアザアルキレン(上記を参照されたい)、通常6から18
個の炭素原子を有するアリーレン、通常8から24個の炭素原子を有するアルジ
アルキレン、約8から36個の炭素原子を有するビス−カルボキサミドアルキレ
ン等を用いることができる。典型的な基としては、デシレン、オクタデシレン、
3−アザペンチレン、5−アザデシレン、N−ブチレン−5アザノニレン、フェ
ニレン、キシレン、p−ジプロピレンベンゼン、ビス−ベンゾイル−1、8−ジ
アミノオクタン等がある。前記のリンカー分子を含む多価または他のリガンド分
子は、対応する受容体ドメインを有する本発明のキメラタンパク質により、下記
の実施例に記載の材料および方法を用いて評価することができる。B.リガンド特性
細胞内結合ドメインに対して、リガンドは生理活性は膜を越えて移動するよう
うに選択される、すなわち、それは膜透過性である。各種リガンドは疎水性であ
り、またはリポフィリン基による適当な修飾によってそのように作製することが
できる。特に、結合橋は、約12から24個の炭素原子を有する脂肪族側鎖を提
供することによってリガンドの親油性を増大させるのに役立つことができる。或
いは、望ましくは、エンドソーム形成を伴うことなく、膜を超える輸送を促進す
る一個またはそれ以上の基を提供することができる。
いくつかの例において、マルチマーリガンドは用いる必要はない。例えば、二
種類の異なる結合部位が受容体のダイマー化に用意されている場合、本分子を用
いる必要はない。別の場合において、リガンドの結合は、受容体ドメインのコン
ホメーション変化を引き起こし、受容体の活性化、例えば、マルチマー化を引き
起こすことができる。他の機序は、更に、細胞質ドメインの活性化を引き起こす
コンホメーションの変化を伴う単一受容体の結合のようなシグナルの誘導に対し
て機能することができる。C.リガンドアンタゴニスト
モノマーリガンドは、マルチマーリガンドの作用を逆行させる、すなわち、マ
ルチマーの形成または維持を阻害するまたは破壊するのに用いることができる。
したがって、細胞活性化作用を急速に終結させることが望ましい場合、モノマー
リガンドを用いることができる。都合の良いことに、親リガンド残基は、マルチ
マーと同一の部位で、多官能性化合物の代わりに一官能性化合物を置換すること
以外は同様の方法を用いて修飾することができる。ポリアミンの代わりに、特に
、2から20個の炭素原子(それらはより長いこともあるが)、通常2から12
の炭素原子を有するモノアミン、例えばエチルアミン、ヘキシルアミン、ベンジ
ルアミンン等を用いることができる。或いは、一価の親化合物が過度の望ましく
ない(例えば免疫抑制、有糸分裂誘発、毒性等の)生理学的活性を有していない
場合またはその容量範囲で、該親化合物を用いることができる。D.代償性突然変異を含む突然変異受容体に対して結合することができる、隆起 部分を有する典型的なヘテロオリゴマー化(HED)およびホモオリゴマー化( HOD)試薬
前記で論及されたように、受容体の結合ポケット中の側鎖残基と立体的に衝突
する試薬上の置換基(隆起部分(bumps))の存在ゆえに、野生型受容体(
例えば、FKBP12)に対してあまり結合できない修飾HED/HOD試薬を
製造することができる。更に、干渉性残基に突然変異を含む(代償性突然変異)
対応する受容体を製造し、それによってリガンドを隆起部分と一緒に結合する能
力を得ることができる。隆起付き(bumped)リガンド残基及び代償性突然
変異を有する受容体ドメインの使用は、本試薬の特異性、例えば力価を増大させ
るべきである。隆起付き試薬は、他の場合は天然リガンド残基を基剤とするダイ
マーライザーに対して干渉剤として作用しうる内因性野生型受容体に対して結合
しないのは当然である。更に、新規の受容体−リガンド対の発生は、当然ヘテロ
ダイマー化が必要とされる場合に用いられるHED試薬を用いてシンタキシン(
原形質膜融合タンパク質)およびシナプトブレビン(小胞膜融合タンパク質)の
ヘテロダイマー化を誘導することによって達成することができる。これは、研究
手段を提供することのみならず、適当に修飾された分泌細胞を用いる用いる糖尿
病の遺伝子療法の根拠として役立ちうると考えられる。
典型的な隆起付き1012として、本発明者は、FK506のC10アセトア
ミドおよびホルムアミド誘導体を製造した。FK1012A−CおよびFK50
6の合成に関する更に詳細については、図16AおよびSpencerら、合成
リガンドによるシグナル導入の制御(Controlling Signal
Transduction with Synthetic ligands)Science
262 5136(1993):1019−1024を参照され
たい。本発明者は隆起付きFK1012の2種類の群もまた創作された:すなわ
ち、C10に隆起部分を有するものおよびC9に有するもの。FK506のC1
0アセトアミドおよびホルムアミドのR−およびS−異性体は、図16Bの配列
反応にしたがって合成された。これらの隆起付き誘導体は、FKBP12に対す
るそれらの結合親和性が少なくとも3桁減少した(図16B)。親和性は、FK
BP12のロータマーゼ活性を阻害する誘導体の能力を測定することによって決
定された。
C9隆起付き誘導体の第二の群の典型的なメンバーは、既知の方法の適応によ
っ
て製造されたスピロ−エポキシド(図16Cに表された)である。例えば、Fi
sherら、J Org Chem 56 8(1991):2900−7およ
びEdmundsら、Tet Lett 32 48(1991):891−8
20を参照されたい。C9誘導体の特に興味深い系列は、それらのsp3ハイブ
リッド形成を特徴とし、C9位の酸化状態を減少させる。いくつかのこのような
化合物は、図16Cに示された反応にしたがって合成された。
ヘテロダイマー(および他のヘテロオリゴマー)は少なくともホモダイマー混入
が、好結果の使用に悪影響を及ぼすことがある用途に対して、ホモダイマーとは
異なるように構築される必要があるということは理解されるべきである。この門
題を克服するように開発された一つの典型的な合成計画は、図16Dに概説され
ている。過剰のトリエチルアミン含有塩化メチレン中におけるモノアロク保護1
,6−ヘキサンジアミン(Stahlら、J Org Chem 43 11(
1978):2285−6)とFK506の誘導体とのカップリングは、アロク
ーアミン置換FK506を44パーセント収率で生成した。この中間体は、現在
任意の活性FK506(または隆起付きFK506)分子とのカップリングにおい
て用いることができる。THF中室温でのジメドンの存在下における触媒テトラ
キス−トリフェニルホスフィンパラジウムによる脱保護は、アミノ保護基を除去
する。活性化FK506誘導体による迅速な処理に続くデシル化は、ダイマー生
成物をもたらす。この技法を用いて、例示されたHODおよびHED試薬を合成
した。E、典型的なシクロスポリン基剤試薬
シクロスポリンA(CsA)は、高親和性(6nM)によってその細胞内受容
体シクロフィリン(18kDaモノマータンパク質)に対して結合する環状ウン
デカペプチドである。得られた複合体は、FKBP12−FK506複合体と同
様、薬剤の免疫抑制性を引き起こすタンパク質ホスファターゼカルシニューリン
に対して結合し且つそれを失活させる。本発明のもう一つの例証として、本発明
者は、CsAをそのMeBmt1側鎖によって6段階でおよび総収率35%でダ
イマー化して、(CsA)2を生成した(図17、工程1−4はEberleら
、J Org Chem
57 9(1992):2689−91により報告され
たように行われた)。FK1012と同様、ダイマー化のための部位は、得られ
たダイマーがシクロフィリン2分子に対して結合しうるが、シクロフィリン結合
後のカルシニューリンに対して、結合することができないように選択された。本
発明者は、(CsA)2がシクロフィリンAに対して1:2の化学量論によって
結合することを実証した。したがって、(CsA)2は、FK1012と同様、
シグナリング経路を阻害せず、したがって本発明の実施に有用な濃度では免疫抑
制性でも毒性でもない。VI .遺伝子発現または機能化の調節可能阻止および遺伝子除去のための遺伝子 A.阻止遺伝子構築物のための転写開始領域
阻止遺伝子構築物は、標的遺伝子の発現を阻止、標的遺伝子によりコードされ
ている遺伝子産物の機能の妨害または宿主細胞から完全に遺伝子を除去できる遺
伝子産物をコードしている。この後者の型の阻止遺伝子は、宿主細胞中loxP
配列が適切に隣接している標的遺伝子の除去をその発現が導くCreリコンビナ
ーゼのような遺伝子産物をコードしている遺伝子である。本発明の阻止遺伝子産
物をコードしている構築物は5’領域にキメラ受容体タンパク質のリガンド媒介
マルチマー化に応答する応答性要素を持っており、以下に論及されるようにおそ
らく、転写開始シグナルの発生および導入による。したがって、少なくとも一つ
の転写開始システム、例えば、細胞質ドメインによって直接的にか若しくは間接
的に活性化されるまたは二つのドメインの結合によって活性化されうる因子を選
択する必要がある。更に、得られた転写開始システムに対して応答性である少な
くとも一つのプロモーター領域を選択する必要がある。その転写制御下のプロモ
ーター領域かまたは遺伝子を選択する必要がある。言い換えると、作用ドメイン
はある与えられたプロモーターまたは応答性要素によって転写を開始する場合そ
の作用ドメインの役割に基づいて、「第一」系列構築物によってコードされたキ
メラタンパク質のために選択されうる。例えば、上記項目III(A)「細胞質ド
メイン」を参照されたい。
応答性要素が知られている場合、それを標的遺伝子構築物中に包含させて、ゲ
ノム中への組込用の発現カセットを提供することができる(エピソームによろう
と染色体取り込みによろうと)。細胞質ドメインを含むタンパク質に対する天然
リガンド結合にの際に細胞質ドメインによって転写的に活性化される遺伝子が知
られている限りにおいて、応答性要素の特定の配列が単離されている必要はない
。次に、挿入された遺伝子が内因性のプロモーター領域の転写調節下にあるよう
にプロモーター領域の下流に目的の遺伝子を挿入するために相同的組み換えを用
いることができる。特異的応答性要素の配列が既知である場合、転写の速いまた
は遅い速度のような別の利点または所望の特性を持つ異なった転写開始領域と共
に、組織特異的結合因子などを含む特定の転写因子と結合させて使用することが
できる。
したがって、発現構築物は、転写方向のその5’末端に、応答性要素および通
常は治療用遺伝子である目的の標的遺伝子の誘導転写開始を可能にするプロモー
ター配列を有する。転写終結領域はさほど重要ではないが、mRNAの安定性を
低下させ、その結果タンパク質の作用期間を制限するのに役立つAU配列を挿入
することによってmRNAの寿命を増加させるかまたは半減期を短くするのに用
いうることができる。不可欠な転写終結および適当に翻訳終結を与えるいずれの
領域も用いることができる。
応答性要素は単一配列でありうるしまたは反復配列でもありうるが、通常は約
5回以内で反復され、しばしば約3回反復される。
相同的組換えは、プロモーター、エンハンサーおよび上記のようなグループ(
1)およびグループ(2)キメラタンパク質のマルチマー化に応答性である他の
応答性要素を含む内因性転写制御配列の除去または不活性化に使用できる。さら
に、相同的組換えは、所望の内因性遺伝子の上流に応答性転写制御配列を挿入す
るために使用できる。B.標的遺伝子
標的遺伝子として広範囲の種々の遺伝子を使用できる。標的遺伝子は任意の問
題とする配列であり得、その不在が望ましい表現型を与える。標的遺伝子は、表
面膜タンパク質、分泌タンパク質、細胞質タンパク質を発現することができるし
、
または異なる種類の生成物を発現することができる多数の標的遺伝子が存在しう
る。コードされたタンパク質は、ホーミング、細胞毒性、増殖、免疫応答、炎症
性応答、血餅の形成若しくは溶解、ホルモン調節等(表1参照)を伴うことがあ
る。標的遺伝子は若しくは未知の機能の産物をコードしていてもよく、その場合
、標的遺伝子が調節可能なように妨害されている修飾細胞または生物体はその機
能の研究に使用できる。さらに、標的遺伝子は工学処理された細胞に対して内因
性である必要はない−いくつかの態様においてそれは感染体(例えば、細菌また
はウイルス)の遺伝子である。そのような態様において、それは調節的に妨害さ
れているウイルスまたは細菌性遺伝子または遺伝子産物である。C.阻止遺伝子
本発明の実施において、阻止試薬の選択に関していくつかのオプションおよび
かなりの融通性が存在する。すべての場合、阻止試薬をコードしている遺伝子は
他に詳細に記載したようにキメラタンパク質のマルチマー化に応答性の要素の転
写調節下に発現される。阻止遺伝子はアンチセンスメッセージまたはリボザイム
、抗体またはその関連形、または標的遺伝子産物の優勢陰性形をコードしていて
もよい。さらに、阻止遺伝子はCreリコンビナーゼを産生するタンパク質Cr
eをコードしている遺伝のように、宿主ゲノムから完全に標的遺伝子を除去でき
るような遺伝子でもありうる。このリコンビナーゼの発現は宿主中で、「lox
P」配列が適当に隣接した標的遺伝子の除去を導く。(i)標的遺伝子発現阻止のためのアンチセンスメッセージおよびリボザイム
標的遺伝子配列が既知の場合、その発現はアンチセンスメッセージまたはリボ
ザイムのリガンド調節発現により阻止できる。アンチセンスメッセージまたはリ
ボザイムは標的メッセージを特異的に認識し、その発現を阻止するように標的遺
伝子に相補的な十分の配列を含んでいる。有用な背景情報および指導を含む最新
の総説としてAltman,”RNA酵素が関する遺伝子療法”Proc.Na tl.Acad.Sci.USA
90(1993)10898−10900お
よびその中に論文が引用されており、Yuら、”ヘアピンリボザイムはヒト免疫
不全ウイルスタイプ1の多様な株の発現を阻害する”Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA
90(1993)6340−6344が含まれている、
を参照されたい。またEfratら、トランスジェニックマウスにおける膵臓β
細胞グルコキナーゼ発現のリボザイム媒介減少はグルコース誘導インシュリン分
泌を減少させた”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,20
51−2055もまた参照されたい。(ii)遺伝子機能を阻止するための抗体の細胞内発現
標的遺伝子産物の機能は、コードされた標的タンパク質を特異的に認識し、そ
の細胞機能を阻止する抗体、抗体断片またはその他の抗体様残基のリガンド調節
発現により阻止できる。このことは標的遺伝子産物に対する中和または阻止抗体
をコードする遺伝子を発現させることにより行われる。そのような抗体遺伝子を
調節的に発現することにより、標的タンパク質の機能化を調節的に妨害する。別
の態様では、このことは細胞型特異的プロモーターを用いてキメラタンパク質を
発現させることにより細胞型特異的様式で達成される。
この方法で、マルチマー化可能キメラタンパク質を発現する細胞のみが抗体を
発現でき、マルチマー化試薬の存在下または続いての暴露によってのみそのよう
に行える。
遺伝子産物機能を阻止する細胞内抗体残基発現の例としては、哺乳類細胞で発
現されるHIV Igp120タンパク質に対する抗体(Marascoら、P NAS
90:7889 1993)およびゼノパスの卵母細胞で発現される抗
−p21ras抗体(Bioccaら、BBRC 197:422 1993)
が挙げられる。抗−p21ras抗体の細胞内発現はエンベロープ前駆体のプロ
セッシングを阻止し、HIV−1粒子の感染性を減少させる。抗−ras抗体は
ゼノパス卵母細胞のインシュリン媒介減数分裂成熟化を阻止する。
抗体は、それが標的遺伝子または遺伝子産物へ結合し、その細胞機能を阻止す
るように選択されるべきである。抗体の好ましい形はいわゆる単一鎖形であり、
なぜならこれは重鎖および軽鎖が細胞内で会合するからである。二つの鎖抗体の
ような他の立体配座、特に二つの鎖FabまたはFv断片、または他のタンパク質
に融合した抗体鎖もまた可能である。抗体は、破壊されるべき所望の遺伝子産物
のように、同一の細胞区分に標的化される必要がある。このことは、局在化配列
を抗体コード配列に融合させることにより達成される。これはN−末端、C−末
端または抗体残基アミノ酸配列の埋め込まれた部分で行われる。
単一鎖抗体を含む組換え抗体を発生させる技術は本分野ではよく知られている
。最近の総説として、Houstonら、Int.Rev.Immunol10
(1993)195を参照されたい。(iii)優性陰性遺伝子産物による妨害
細胞過でに重大であるタンパク質−タンパク質相互作用はタンパク質対の一つ
の非機能的変異体の発現により選択的に阻止される。例えば、raf−1は増殖
因子刺激増殖経路に機能するセリン/トレオニンプロテインキナーゼである(S
chaapら、J.Biol.Chem.268:20232 1993)。そ
れは二つのドメイン、N−末端調節ドメインおよびC−末端キナーゼドメインか
ら成っている。培養細胞においてp74raf−1のN−末端ドメインの構成的
過発現は増殖因子により誘導される分裂促進を阻止する。このドメインはまた癌
遺伝子変異体p21rasによっても妨害される。そのようなシステムは癌のモ
デルまたは細胞増殖に対する増殖因子の役割の研究に有用であろう。
優性陰性遺伝子産物の他の例としては、ステロイド受容体、不活性プロテイン
キナーゼを持つまたはプロテインキナーゼドメインが全く欠けた増殖因子受容体
、非機能的細胞外リガンド結合ドメインまたは細胞内細胞質ドメインを持つ細胞
表面受容体、DNA結合ドメインおよび/またはトランス活性化ドメインを欠い
た転写因子変異体が含まれる。
優性陰性タンパク質は典型的には標的タンパク質を正常な相手から隔離するこ
とにより標的タンパク質の正常な機能を破壊する。優性陰性タンパク質はランダ
ム突然変異発生により、遺伝子セグメントの選択的欠失により、またはドメイン
構造およびタンパク質の機能が理解されている場合は合理的なタンパク質工学処
理により構築できる。しばしば、優性陰性タンパク質は、酵素活性を持つタンパ
ク質の不活性版である。
一つの重要な必要条件は、優性陰性タンパク質はその正常対応物に関して過発
現されることである。本発明のリガンド調節転写活性化により与えられた発現の
増加は本技術の特に有用な応用である。(iv)標的遺伝子を除去するためのCreの細胞内発現
本発明のこの態様に使用するCre構築物およびフロックス化された標的遺伝
子構築物は一般的にはBarinaga(1994)およびGuら(1994)
(前に引用、そこに参照文献が引用されている)により記載されているようなも
のであるが、ただし、CreコードDNA配列はグループ(1)キメラのマルチ
マー化に応答性のプロモーター/エンハンサー配列に、またはマルチマー化グル
ープ(2)キメラが結合できおよびCre転写が開始されるDNA配列に結合さ
れているであろう。
標的遺伝子が調節的に除去される修飾細胞または生物体は、細胞レベルまたは
生物体レベルで除去された遺伝子の機能の同定または研究に使用できる。
Cre構築物は5’領域にキメラ受容体タンパク質のリガンド媒介マルチマー
化に応答する応答性要素を持っており、以下に論及されるようにおそらく、転写
開始シグナルの発生および導入による。したがって、少なくとも一つの転写因子
を利用し、細胞質ドメインによって直接的にか若しくは間接的に活性化されるか
、または二つのドメインの結合によって活性化されうる少なくとも一つの転写開
始システムを選択する必要がある。更に、得られた転写開始システムに対して応
答性である少なくとも一つのプロモーター領域を選択する必要がある。その転写
制御下のプロモーター領域かまたは遺伝子を選択する必要がある。言い換えると
、作用ドメインはある与えられたプロモーターまたは応答性要素によって転写を
開始する場合その作用ドメインの役割に基づいて、「第一」系列構築物によって
コードされたキメラタンパク質のために選択されうる。例えば、上記項目III(
A)「細胞質ドメイン」を参照されたい。
応答性要素が知られている場合、それをCre遺伝子構築物中に包含させて、
ゲノム中への組込用の発現カセットを提供することができる(エピソームによろ
うと染色体取り込みによろうと)。細胞質ドメインを含むタンパク質に対する天
然リガンド結合にの際に細胞質ドメインによって転写的に活性化される遺伝子が
知られている限りにおいて、応答性要素の特定の配列が単離されている必要はな
い。次に、目的の遺伝子が内因性のプロモーター領域の転写調節下にあるように
プロモーター領域の下流に挿入するために相同的組み換えを用いることができる
。特異的応答性要素配列が既知である場合、転写の速度、特定の転写因子の結合
などの高いまたは低い活性のような他の特色を持つ異なった転写開始領域と共に
使用できる。
したがって、発現構築物は、転写方向のその5’末端に、応答性要素および通
常は治療用遺伝子である目的の標的遺伝子の誘導転写開始を可能にするプロモー
ター配列を有する。転写終結領域はさほど重要ではないが、mRNAの安定性を
低下させ、その結果タンパク質の作用期間を制限するのに役立つAU配列を挿入
することによってmRNAの寿命を増加させるかまたは半減期を短くするのに用
いうることができる。不可欠な転写終結および適当に翻訳終結を与えるいずれの
領域も用いることができる。
応答性要素は単一配列でありうるしまたはマルチマー化さていてもよいが、通
常は約5回以内で反復され、しばしば約3回反復される。
相同的組換えはまた、マルチマー化に応答性であるプロモーターおよび/また
は応答性要素を含む内因性転写制御配列の除去または不活性化に使用でき、およ
び/または、所望の内因性遺伝子の上流にそのような応答性転写制御配列を挿入
するために使用できる。
標的遺伝子として広範囲の種々の遺伝子を使用できる。標的遺伝子は任意の問
題とする配列であり得、その不在が望ましい表現型を与える。標的遺伝子は、表
面膜タンパク質、分泌タンパク質、細胞質タンパク質を発現することができるし
、または異なる種類の生成物を発現することができる多数の標的遺伝子が存在し
うる。コードされたタンパク質は、ホーミング、細胞毒性、増殖、免疫応答、炎
症性応答、血餅の形成若しくは溶解、ホルモン調節等(表1参照)を伴うことが
ある。標的遺伝子は若しくは未知の機能の産物をコードしていてもよく、その場
合、標的遺伝子が調節可能なように除去されている修飾細胞または生物体はその
機能の研究に使用できる。V.調節されたアポトーシス
修飾された細胞により提供された治療を停止させたい場合、細胞が特に患者で
新生物性になった場合、遺伝子療法が利点を与えるより悪化させる場合または工
学処理された細胞が所望のタンパク質を発現した後患者から(特に組換え動物)
除去する場合のように、多くの状況において遺伝子修飾した組換え細胞を殺すこ
とが望ましく研究の興味を引くであろう。この目的のため、結合ドメインに融合
されたFas抗原またはTNF受容体の発現が提供される。(Watanabe
−Fukunagaら、Nature 356(1992)314−317参照
。)そのような構築物を含む細胞は、細胞を一次キメラをオリゴマー化できるリ
ガンドに暴露した後のアポトーシスにより容易に除去できる。一次キメラをコー
ドした構築物は慣用的材料および方法を用いて構成的発現のために設計され、修
飾された細胞はそのようなタンパク質を表面に持っているかまたはタンパク質は
細胞質に存在する。或いは、同じかまたは異なったオリゴマー化リガンドが一次
キメラの発現を開始でき、およびアポトーシスを開始するような調節された発現
を提供できる。問題とする標的遺伝子の発現に関連した結合領域と異なった結合
領域に結合されたFas抗原またはTNF受容体の細胞質領域を細胞質に提供す
ることにより、制御された条件下で修飾された細胞を殺すことができる。
VII.細胞中への構築物の導入
構築物を含む宿主細胞の選択を可能にする少なくとも一つのマーカーが存在し
且つ2個またはそれ以上のマーカーが存在しうる場合、本明細書に記載の構築物
は、一個またはそれ以上のDNA分子または構築物として導入することができる
。構築物は、慣用的な方法で製造することができ、その場合、遺伝子および調節
領域を単離し、適当な場合連結し、適当なクローニング宿主中にクローン化し、
制限若しくは配列決定または他の好都合な手段によって分析することができる。
特に、「プライマー修復」、連結反応、インビトロ突然変異誘発等を適切に用い
て、機能性単位の全部または一部分を含む個々のフラグメントを単離することが
できる。次に構築物が完成され且つ適当な配列を有することが実証されたら、宿
主細
胞中に任意の好都合な手段によって導入することができる。構築物は細胞内への
感染若しくは形質導入のため、非複製欠陥ウイルスゲノム様アデノウイルス、ア
デノ関連性ウイルス(AAV)若しくは単純疱疹ウイルス(HSV)、またはレ
トロウイルスベクターを含む他のウイルス内へ、組み込ませおよびパッケージン
グすることができる。構築物は、所望ならば、トランスフェクションのためのウ
イルス配列を含んでいてもよい。或いは、構築物は、融合、エレクトロポレーシ
ョン、バイオリスティクス(biolistics)、トランスフェクション、
リポフェクションなどによって導入することができる。通常、宿主細胞を、1個
または複数の構築物を導入する前に培養中で増殖させ且つ増加させた後1個また
は複数の構築物の導入及び一個または複数の構築物の組み込みに適当な処理を行
う。次に、細胞を増加させ、そして構築物の中に存在するマーカーによってスク
リーニングする。うまく用いることができる各種マーカーとしては、hprt、
ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性等がある。
若干の場合において、構築物が特定の遺伝子座に組み込まれることが望ましい
場合、相同的組換えについて当該技術分野において知られているような材料およ
び方法を用いて、内因性遺伝子を欠失させ本発明の組み換え体構築物によって置
き換えることができる(同じ遺伝子座またはどこか他のところに)。本発明の組
換え構築物はまた、当該分野において知られている材料および方法を用いて、特
定の細胞へのフロックス化された標的遺伝子の導入に使用できる。相同的組み換
えのためには、Ωかまたは0ベクターを用いることができる。例えば、Thom
as及びCapecchi、Cell(1987)51,503−512;Ma
nsourら、Nature(1988)336,348−352;およびJo
ynerら、Nature(1989)338,153−156を参照されたい
。Guら(1994)はフロックス化された標的遺伝子の導入に使用できる別の
方法を提供している。
構築物は、遺伝子全部をコードしている単一DNA分子としてまたは1種類若
しくはそれ以上の遺伝子を有する異なったDNA分子として導入することができ
る。構築物は、同時にまたは連続して、それぞれ同じであるかまたは異なるマー
カーと一緒にに導入することができる。典型的な実施例において、一つの構築物
は、特異的応答性要素(例えば、NFAT)の制御下の治療用遺伝子を含み、受
容体融合タンパク質をコードしているもう一つは、リガンド受容体ドメイン(例
えば、MZF3Eの場合と同様)に対して融合されたシグナリング領域を含んで
いた。治療用生成物の供給効率を増加させるホーミング受容体または他の生成物
をコードしている第三のDNA構築物も更に導入することができる。
DNA構築物源を製造するのにおよびトランスフェクションを行うために用い
ることができる有用な要素、例えば、細菌または酵母の複製起点、選択可能なお
よび/または増幅可能なマーカー、原核生物または真核生物における発現のため
のプロモーター/エンハンサー要素等を有するベクターは当該技術分野において
周知であり、多くは商業的に入手可能である。VIII .細胞およびリガンドの投与
DNA構築物によって修飾された細胞を、選択的条件下の培養で増殖させた後
、構築物を有するように選択される細胞を増加させさらに分析する。例えば、宿
主細胞中の構築物の存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応が用いられる。
修飾された宿主細胞がいったん識別されたら、それを計画された目的に適応して
、培養中で増殖させるかまたは宿主生物中に導入される。
細胞の性状に応じて、広範囲の方法で細胞を宿主生物、例えば、哺乳動物中に
導入することができる。造血系細胞は、血管系中に注射によって投与することが
でき、通常、少なくとも約104個、概して約1010個以下、さらに通常は約1
08個以下の細胞が存在する。用いることができる細胞数は、修飾細胞が導入さ
れる目的、細胞の寿命、用いられるプロトコールを含む多くものに依存する。例
えば、投与回数、細胞の増殖能力、治療薬の安定性、治療薬に対する生理学的要
求等が投与されるべき修飾細胞の数の決定に考慮されるであろう。移植片として
用いることができる皮膚細胞についての修飾細胞数は、熱傷または他の損傷に対
して適用される層の寸法によると考えられる。概して、筋芽細胞または繊維芽細
胞についての細胞数は、少なくとも約104から約108個以下であり、そして分
散剤として適用することができ、一般的には目的の部位またはその付近に注射さ
れる。細胞は、通常、生理学的に許容しうる媒質中に存在している。
細胞のエクスビボ修飾の代わりに、多くの場合、細胞をインビボで修飾したい
ことがある。この目的で、標的組織および細胞のインビボでの修飾のための種々
の技法が開発されてきた。宿主中へのウイルスのトランスフェクションおよびラ
ンダム組み込みを可能にするアデノウイルスおよびレトロウイルス等の多数のウ
イルスベクターが開発されてきた。例えば,Dubenskyら(1984)P roc.Natl.Acad.Sci.USA
81,7529−7533;K
anedaら(1989)Science 243,375−378;Hieb
ertら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,
3594−3598;Hatzogluら(1990)J.Biol.Chem
.265,17285−17293およびFerryら(1991)Proc. Natl.Acad.Sci.USA
88,8377−8381を参照された
い。ベクターは、脈管内若しくは筋肉内などの注射、吸入または他の非経口方式
によって投与することができる。
インビボ遺伝子修飾に従うと、修飾の方法は組織の性状、必要な細胞修飾の効
率、特定の接近容易性等に依る。標的転写開始領域を有する弱毒化または修飾さ
れたレトロウイルスを用いることにより、所望ならば、問題の転写因子構築物の
一つを用いて、ウイルスが生産され且つ隣接する細胞をトランスフェクトするよ
うにウイルスを活性化させることができる。
DNA導入は、いずれの場合にも組み込みを生じる必要がない。若干の場合、
導入されたDNAの一時的維持は十分であろう。この方法において、細胞を宿主
中に導入した後、予め決定された時間後、例えば、細胞が特定部位にホーミング
することができた後に作動させることができた場合、短期効果が得られた。
細胞質ドメインを活性化させるリガンドを所望のように投与することができる
。リガンドの結合親和性に応じて、望まれる応答、投与方法、半減期、存在する
細胞数、各種プロトコルを用いることができる。リガンドは非経口かまたは経口
によって投与することができる。投与回数は前記の因子による。リガンドは、経
口によって丸剤、散剤若しくは分散剤として;口腔によって;舌下によって;脈
管内、腹腔内、皮下注射によって;または吸入などによって摂取することができ
る。リガンド(およびモノマー化合物)は、各種投与経路のために、当該技術分
野に
おいて周知の慣用的な方法および材料を用いて配合することができる。正確な投
与量および具体的な投与方法は、上記因子に依るし且つ担当医師またはヒト若し
くは動物の医療提供者によって決定される。大部分は、投与方法は経験的に決定
される。
リガンドによる活性化が逆行する場合、モノマー化合物を投与しまたはリガン
ドと競合しうる他の単一結合部位化合物であってよい。してがって、逆反応の場
合すなわち治療効果を終結させる要求において、速やかな逆転が望まれるならば
、モノマー結合化合物を何等かの好都合な方法で、特に脈管内に投与することが
できる。或いは、DNA結合ドメインと一緒に不活性化ドメインを存在させるこ
とができる。別の方法では、下記実施例4(B)に議論するようにFasまたは
TNF受容体を通したシグナリングを経るアポトーシスにより細胞が除去される
であろう。
任意の用途に対する具体的なリガンド用量は、治療薬物モニタリングに用いら
れる手順に従って決定することができ、そこでは、特定の発現レベルの維持が長
期間にわたって、例えば、約2週間を越えて望まれるかまたは個々の若しくは反
復用量のリガンドを用いる反復治療が、例えば、2週間若しくはそれ以上の長期
間隔を伴って短期間にわたって存在する。予め決定された範囲内のリガンド用量
を与え、そして時間−発現レベル関係を得るようにその応答を監視し、更には治
療応答も観察した。時間中に観察されたレベルおよび治療応答に対して、応答後
の次回により多いまたはより少ない用量を与えることができた。この方法を、治
療的範囲内の用量が得られるまで何度も繰り返した。リガンドを長期にわたって
投与して、リガンドの維持量がいったん決定されたら、次に、細胞系が適当な応
答およびレベルの発現生物を与えていることを確実にするために長期間隔で検定
を行うことができた。
該系が、多数の変数、例えば、リガンドに対する細胞応答、発現効率および適
当なところでは、分泌レベル、発現生成物の活性、患者の特別な要求(これらは
時間および環境によって変化しうる)、細胞の損失または個々の細胞の発現活性
の損失の結果としての細胞活性の減損速度によって左右されることは理解される
べきである。したがって、集団全体に投与されうる万能細胞がたとえ存在したと
しても、個々の患者それぞれについて、それぞれの患者の個々の適当な用量を監
視することが考えられる。
問題の方法論および組成物は、広範囲の症状および適応症の治療に用いること
ができる。例えば、B−およびT細胞は、癌、感染症、代謝欠損症、心臓血管病
、遺伝性凝固欠損病、自己免疫疾患、間接変形症(例えば、関節炎)、肺病、腎
臓病、内分泌異常等の検査および/または治療において用いることができる。繊
維芽細胞および筋芽細胞などの構造に関係した各種細胞は、遺伝的欠損症(例え
ば、結合組織欠損症)、関節炎、肝臓病等の治療において用いることができる。
以下の実施例は重要な追加の情報、例証および指示を含んでおり、それらは種
々の実施態様およびその均等物における本発明の実施に適用できる。実施例は例
示のために与えられており、本発明を制限するものではない。実施例 細胞の形質転換および評価 実施例1:T細胞受容体のCD3鎖を架橋することによる単離されたIL−2エ ンハンサー結合転写因子の誘導
。
ヒトIL−2プロモーター(−325〜+47;MCB(86)6,3042
)の制御下の胎盤分泌アルカリ性ホスファターゼ遺伝子を含むプラスミドpSX
Neo/IL−2(IL2−SX)(図1)、およびリポーター遺伝子が、種々
のプロモーター要素(すなわち、NFAT、NK B、OAP/Oct−1およ
びAP1それぞれ)を含む合成オリゴマーと組み合わされた最小限のIL−2プ
ロ
モーター(−325〜−294および−72〜+47)の転写制御下である関連
プラスミド変異型(すなわち、NFAT−SX、NF B−SX、OAP/Oc
t1−SXおよびAP−1−SX)は、(1)SspIおよびHindIIIに
よって切断されたpPL/SEAP(バーガー(Berger)ら、Gene(
1988)66,1);(2)NdeIによって切断され、クレノウでブラント
にされた後、PvuIによって切断されたpSV2/Neo(サザン(Sout
hern)およびベルグ(Berg)、J.Mol.Appl.Genet.(
1982)1,332);および(3)PvulおよびHindIIIによって
切断された各種プロモーター含有プラスミド(すなわち、NFAT−CD8、B
−CD8、cx121acZ−Oct−1、AP1−LUCIF3Hまたはcx
15IL2)(以下に記載された)の3部分連結反応によって製造された。NF
AT−CD8は、ヒトIL−2エンハンサーからのNFAT−結合部位(−28
6〜257;Genes and Dev.(1990)4,1823)の3コ
ピーを含み且つcx121acZ−Octは、OAP/Oct−1/(ARRE
−1)結合部位(MCB,(1988)8,1715)の4コピーを含み;B−
CD8は、ネズミ軽鎖(EMBO(1990)9,4425)からのNF B結
合部位結合部位の3コピーを含み、そしてAP1−LUCIF3Hは、メタロチ
オネンプロモーターからのAP−1部位(5′−TGACTCAGCGC−3′
)の5コピーを含む。
それぞれのトランスフェクションにおいて、キメラ受容体TAC/TAC/Z
(TTZ)(PNAS 88,8905〜8909)をコードしている発現ベク
ターpCDL−SR(MCB 8,466〜72)(Tac−IL2受容体鎖)
5μgを、TAgジュルカット細胞(SV40ラージT抗原によって安定してト
ランスフェクトされたヒトT細胞白血病系ジュルカットの誘導体(ノースラプ(
Northrup)ら、J.Biol.Chem.[1993])中において種
々の分泌アルカリ性ホスファターゼ基剤リポータープラスミド(図1のpSXN
eo/IL2の地図を参照されたい)と一緒に同時トランスフェクさせた。各リ
ポータープラスミドは、リポーター遺伝子上流の最小限のIL−2プロモーター
か、或いは完全なIL−2エンハンサー/プロモーターの文脈中に、独特のI
L−2エンハンサー結合転写因子の結合部位のマルチマー化オリゴヌクレオチド
を含む。24時間後、細胞のアリコート(約105個)を、結合抗TAC(CD
25)mAb(33B.1;AMAC,ウェストブルック(Westbrook
),ME)の対数希釈が入っている微量滴定ウェルに入れた。陽性対照としてお
よびトランスフェクション効率を調節するために、イオノマイシン(1μm)お
よびPMA(25ng/ml)を各トランスフェクションからのアリコートに対
して加えた。更に14時間インキュベーション後、上澄みのアルカリ性ホスファ
ターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性対照試料の活性と相対して表わ
した。FK506 1ng/mlの添加は、NFATによる全部の活性をバック
グラウンドレベルまで降下させ、脱活性化はFK506によって遮断されたのと
同様の経路であることが実証された。得られた各データポイントは二つの試料の
平均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。図5を参照されたい。
データは、既知の細胞外受容体を用いて、リポーター遺伝子および異なるエンハ
ンサーとの適当な反応が得られることを示している。TcR複合体(すなわち、
OKT3)に対するMAbを用いた場合、同様の結果が得られた。実施例2:免疫抑制薬FK506並びにシクロスポリンA(CsA)またはダイ マー誘導体化合物FK1012A(8)、FK1012B(5)およびCsAダ イマー(PB−1−218)の阻害活性
。
イオノマイシン(1μm)およびPMA(25ng/ml)を105個のTA
g−ジュルカット細胞に対して加えた。更に、各種薬剤の滴定を加えた。5時間
後、細胞を緩洗剤(すなわち、トリトンX−100)中で溶解させ、そして抽出
物をβ−ガラクトシダーゼ基質MUG(メチルガラクトシジルウンベリフェロン
)と一緒に1時間インキュベートした。グリシン/EDTA停止緩衝液を加え、
そして抽出物の蛍光を検定した。得られた各データポイントは二つの試料の平均
であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。意外にも、FK1012B
は、最高濃度(すなわち、5μg/ml)で僅かにマイトジェン活性を増加させ
るように見えるが;しかしながら、対照実験は、FK1012Bそれだけでは促
進性でないことを示す。図6を参照されたい。実施例3.キメラFKBP12/CD3(1FK3)受容体に対するダイマーF K506誘導体FK1012Aの活性
。
キメラ受容体(1FK3)を有する真核生物発現ベクターpBJ5(16Sス
プライス部位およびポリA部位間に挿入されたポリリンカーを含むpCDL−S
Rに基づく)5μgを、NFAT誘導分泌アルカリ性ホスファターゼリポーター
プラスミドNFAT−SXの4μgと同時トランスフェクトさせた。対照として
、平行トランスフェクションにおいて1FK3/pBJ5の代わりにpBJ5を
5μg用いた。24時間後、約105個の細胞を含む各トランスフェクションの
アリコートを、指示通りに薬剤FK1012Aの対数希釈と一緒にインキュベー
トした。陽性対照としておよびトランスフェクション効率を調節するために、イ
オノマイシン(1μm)およびPMA(25ng/ml)を各トランスフェクシ
ョンからのアリコートに対して加えた。更に14時間インキュベーション後、上
澄みのアルカリ性ホスファターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性対照
試料の活性と相対して表わした。FK506 2ng/mlの添加は、全部の刺
激をバックグラウンドレベルまで降下させ、活性化はFK506によって遮断さ
れたのと同様の経路であることが実証された。したがって、FK506またはシ
クロスポリンは、これらの化合物の使用に対して有効な解毒薬として役立つ。得
られた各データポイントは二つの試料の平均であり、実験は同様の結果を伴って
数回行なわれた。図7を参照されたい。実施例4A.ミリストイル化キメラCD3/FKBP12(MZF3E)受容体 に対するダイマーFK506誘導体FK1012Bの活性
。
本発明者は、「FK1012」と称するFK506基剤HOD試薬による陽性
結果を含むリガンド設計および合成に対する多数のアプローチをうまく実証した
。本発明者は、FK1012が、2:1結合化学量論(Kd(1)=0.1nM
;Kd(2)=0.8nM)の高親和性を達成し且つカルシニューリン媒介TC
Rシグナリングを阻害しないことを発見した。リガンドは、「免疫抑制性」でも
毒性でもない(細胞培養中最大0.1mMまで)。同様に、本発明者は、CsA
受容体シクロフィリンに対して1:2化学量論で結合するが、カルシニューリン
に対して結合しないシクロスポリンA基剤ホモダイマー化試薬を製造した。した
がって、FK1012と同様、(CsA)2はシグナリング経路を阻害しないし
、し
たがって免疫抑制性でも毒性でもない。
リガンドに媒介されたタンパク質結合についてのこれらのおよび他の本発明者
の実施例は、シグナル導入経路の制御を引き起こした。典型的な場合、これは、
翻訳後ミリストイル化に十分なSrcの小フラグメント(M)、ゼータの細胞質
尾部(Z;B細胞受容体の成分も用いた)、3個の逐次的FKBP12(F3)
およびfluエピトープ標識(E)から成る細胞内受容体を生成することによっ
て達成された。ヒト(ジュルカット)T細胞における構築物MZF3E(図18
)の発現によって、本発明者は、コード化されたキメラタンパク質が、FK10
12に媒介されたオリゴマー化を行なうことを確証した。付随したゼータ鎖の凝
集は、FK1012に応答したアルカリ性ホスファターゼの分泌(SEAP)に
よって実証されるように(EC50=50nM)、内因性TCRシグナリング経路
(図15)によるシグナリングをもたらした。SEAPリポーター遺伝子のプロ
モーターは、TCRシグナリング後に核において組み立てられる活性T細胞の核
因子(NFAT)によって転写活性化されるように構築された。FK1012に
誘導されたシグナリングは、FK506−Mと称するリガンドの無毒性モノマー
変型によって誘導された脱凝集過程によって終結させることができる。
具体的には、ミリストイル化キメラ受容体を有する真核生物発現ベクターpB
J5の5μgを、NFAT−SX 4μgと同時トランスフェクトさせた。MZ
E、MZF1E、MZF2EおよびMZF3Eは、ミリストイル化CD3細胞質
ドメインの下流にそれぞれFKBP12の0、1、2または3コピーを含む(図
2を参照されたい)。対照として、pBJ5の5μgを平行トランスフェクショ
ンにおいて用いた。24時間後、約105個の細胞を含む各トランスフェクショ
ンのアリコートを、指示通りに薬剤FK1012Bの対数希釈と一緒にインキュ
ベートした。陽性対照としておよびトランスフェクション効率を調節するために
、イオノマイシン(1μm)およびPMA(25ng/ml)を各トランスフェ
クションからのアリコートに対して加えた。更に12時間インキュベーション後
、上澄みのアルカリ性ホスファターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性
対照試料の活性と相対して表わした。FK506 1ng/mlの添加は、全部
の刺激をバックグラウンドレベル付近まで降下させ、活性化はFK506によっ
て
遮断されたのと同様の経路であることが実証された。この結果は、問題の細胞活
性の可逆性のもう一つの根拠である。得られた各データポイントは二つの試料の
平均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。図8を参照されたい。
ミリストイル化誘導体は、約一桁までの低濃度のリガンドに応答し且つNFAT
依存性転写を同様のレベルまで活性化するが、リガンドが異なることに注目すべ
きである。図7および図8を比較されたい。
インビボFK1012誘導タンパク質ダイマー化
本発明者は、次に、MZF3E受容体の細胞内凝集がFK1012によって実
際に誘導されるのを確実にすることを望んだ。したがって、MZF3E構築物の
インフルエンザ血球凝集素エピトープ標識(flu)を、別のエピトープ標識(
flag−M2)と交換した。近縁関係のキメラMZF3EfluおよびMZF3
Eflagを、ジュルカットT細胞において共発現させた。細胞をFK1012Aで
処理した後、アガロースビーズに結合した抗Flag抗体を用いて免疫沈降実験
を行なった。FK1012A(1μM)存在下において、タンパク質キメラMZ
F3Eflagは、MZF3Efluと相互作用し且つMZF3Eflagと一緒に共免疫
沈降する。FK1012A不存在下において、MZF3Efluとの共免疫沈降は
観察されない。シグナルを与えないFKBPモノマー構築物MZFIEfluおよ
びMZF1Eflagを用いる関連実験は、それらがFK1012Aによって更にダ
イマー化されることを示した(図19A)。これは、内因性T細胞受容体および
本発明者の人工受容体MZF3E両方で観察された凝集の必要条件を反映してい
る。
FK1012誘導タンパク質チロシンリン酸化
TCR、CD3およびゼータ鎖の細胞内ドメインは、抗原刺激後に細胞質タン
パク質チロシンキナーゼと相互作用する。Src系列の具体的なメンバー(lc
kおよび/またはfyn)は、これらの細胞内ドメイン中の活性化モチーフ(チ
ロシン活性化モチーフ、TAM)の1個またはそれ以上のチロシン残基をリン酸
化する。チロシンキナーゼZAP−70は、(その2種類のSH2ドメインによ
って)チロシンリン酸化T細胞受容体に対して補充され、活性化され、そしてお
そらくホスホリパーゼCの更に下流の活性化に関与する。MZF3Eによって安
定
してトランスフェクトされたジュルカット細胞に対する抗CD3 MAbかまた
はFK1012Aの添加は、内因性T細胞受容体ゼータ鎖およびMZF3E構築
物それぞれの免疫沈降後のインビトロキナーゼ検定によって測定されたように、
ゼータ鎖に対するキナーゼ活性の強化をもたらした。抗CD3 MAbかまたは
FK1012による細胞の処理後のチロシンリン酸化は、単クローン性α−ホス
ホチロシン抗体を用いて検出された。全細胞溶解産物を、刺激後の種々の時間に
分析した。チロシンリン酸化タンパク質の同様のパターンは、抗CD3 MAb
かまたはFK1012による刺激後に観察された。パターンは、おそらくはZA
P−70である70kDaの主バンドおよび120kDa、62kDa、55k
Daおよび42kDaの副バンドから成った。実施例4(B):イムノフィリンFas抗原キメラによるプログラム化された細 胞死の調節
Fas抗原は、細胞表面受容体の神経成長因子(NGF)/腫瘍壊死因子(T
NF)受容体超系列のメンバーである。Fas抗原と抗体との、その細胞外ドメ
インに対する架橋は、プログラム化された細胞死すなわちアポプトシスを引き起
こすまだ十分に理解されていないシグナリング経路を活性化する。Fas抗原お
よびそれに関係したアポプトシス性シグナリング経路は、おそらくは全部の腫瘍
細胞を含む大部分の細胞に存在している。該経路は、壊死性細胞死においては見
られない凝縮された細胞質、炎症反応の不存在およびヌクレオソームDNAのフ
ラグメント化を特徴とする急速且つ独特の細胞死(2時間)をもたらす。
本発明者は、更に、アポプトーシス性細胞死をもたらす第二の誘導シグナリン
グシステムを開発した。MZF3E経路と同様、この一つは、構成的に発現され
た「応答個体」遺伝子の生産物である人工受容体を活性化することによって開始
される。しかしながら、新しい経路は、本発明者のHOD試薬が、トランスフェ
クトされた誘導(例えば、リポーター)遺伝子産物よりもむししろ内因性経路の
生産物を誘導する点で第一とは異なる。
Fas経路に対する増加性制御は、将来の生物学的研究および医学にとって重
要な意味がありうる。細胞特異的プロモーターの制御下の「死滅」応答個体遺伝
子によって形質転換された動物が生じるかもしれない。次に、標的細胞は、動物
成体をHOD試薬で処置することによってそこで化学的に除去されうる。この方
法で、自己免疫疾患の誘導および維持における記憶若しくは認識または免疫細胞
中の特定の脳細胞の役割を評価しうる。死滅応答個体遺伝子は、M.ブレーズ(
Blaese)および共同研究者(カルバー(Culver)ら、Scienc e
256 5063(1992),1550〜2)によって開発されたヒト遺
伝子療法を用いて腫瘍中に導入された後、(脳腫瘍の治療に関して最近報告され
た「ガンシクロビア(gancyclovir)」遺伝子療法臨床試験を類推し
て)HOD試薬で患者を治療することによって引続き活性化されるかもしれない
。最後に、本発明者は、死滅応答個体遺伝子と治療用遺伝子との共投与を包含す
る将来の遺伝子治療の成分を考えている。これは、遺伝子療法に対して「フェー
ルセーフ」成分を提供すると考えられる。何かがうまくいかない場合(一般的に
論及された問題は、癌をもたらす腫瘍サプレッサー遺伝子の組込みに誘導された
減損である)、遺伝子療法患者は、トランスフェクトされた細胞全部を死滅させ
る「フェールセーフ」丸剤を服用しうる。この概念は、本発明者をHOD試薬の
直交システムの開発に集中させた。したがって、本発明者は、第一と交差反応す
る可能性がなく、しかも治療用遺伝子の転写を開始させるまたは停止させるのに
用いられると考えられる試薬の第二セットを望んだ。
Fas抗原の細胞質シグナリングドメインに対して融合した3個のFKBP1
2ドメインから成るキメラcDNAを構築した(図20)。この構築物は、ヒト
ジュルカット細胞およびネズミD10T細胞において発現された場合、FK10
12試薬によってダイマー化し且つシグナリングカスケードを開始するように誘
導されて、FK1012依存性アポプトシスを引き起こすことがある。MFF3
Eによって一時的にトランスフェクトされた細胞の、FK1012Aに媒介され
た死滅についてのLD50は、リポーター遺伝子活性の減損によって決定したとこ
ろ15nMである(図20;検定の論及については。図21の標題を参照された
い)。これらのデータは、安定してトランスフェクトされた細胞系における細胞
死の測定値と一致する。安定なトランスフェクタントは均一な細胞集団を表わす
ので、それらは、死が壊死(膜ブレブ形成、ヌクレオソームDNAフラグメント
化)によるよりもむしろアポプトシスによることを確かめるのに用いられてきた
。
しかしながら、一時的トランスフェクションプロトコルは、はるかに少ない作業
しか必要としないので、以下に記載のように、初期検定システムとして用いられ
てきた。実施例4(C):シクロフィリンFas抗原キメラによるプログラム化された細 胞死の調節
本発明者は、更に、一連のシクロフィリンC−Fas抗原構築物を製造し且つ
一時的発現検定において(CsA)2依存性アポプトシスを誘導するそれらの能
力を検定した(図21A)。更に、(CsA)2依存性アポプトシスは、系列M
C3FE(M=Srcのミリストイル化ドメイン、C=シクロフィリンドメイン
、F=Fasの細胞質尾部、E=fluエピトープ標識)中の最も活性な構築物
によって安定してトランスフェクトされたヒトジュルカットT細胞を用いて実証
された。Fasの細胞質尾部は、1、2、3または4個の逐次的シクロフィリン
ドメインの前か後に融合された。更に、Fasドメインを欠いている二つの対照
構築物を製造した。この場合、本発明者は、シグナリングドメインが、ダイマー
化ドメインの後におかれた場合にのみ機能することを観察した。(ゼータ鎖構築
物は、ダイマー化ドメインの前か後におかれた場合にシグナルを与える。)ウェ
スタンブロッティングによって確かめたところ、8種類のシグナリング構築物の
発現レベルおよびそれらの活性は両方とも定量的に異なった(図21B)。これ
までのところで、最適システムは、MC3FEであることが分かった。MC3F
Eによる(CsA)2に媒介された細胞死のLD50は約200nMである。これ
らのデータは、細胞内タンパク質結合を調節するためのシクロフィリン−シクロ
スポリン相互作用の有用性を実証し且つFKBP12−FK1012システムと
交差反応しない直交試薬システムを例証する。更に、この場合、データは、Fa
s細胞質尾部によるシグナル導入の開始にはダイマー化のみが必要とされ、凝集
は必要とされないことを示している。
ミリストイル化シグナルのN末端グリシンのアラニンへの突然変異は、ミリス
トイル化を、したがって膜局在化を妨げる。本発明者は、更に、突然変異した構
築物(ΔMFF3E)が、FK1012依存性アポプトシスの誘導物質として同
様に強力であったことを観察しており、Fasに媒介された細胞死に膜局在化が
不可欠ではないことが示された。実施例5.ネズミシグナリングキメラタンパク質の構築
図4に記載のプライマーを用いることによって種々のフラグメントが得られた
。プライマー番号の論及する場合、図4を参考にすべきである。
ネズミクラスII MHC受容体(Cell,32,745)のI−E鎖を含
む約1.2kb kcDNAフラグメントをシグナルペプチド源として用い、P
#6048およびP#6049を用い、供給者(プロメガ(Promega))
によって記載のようにPCRを用いて70bp SacII−XhoIフラグメ
ントを生成した。第二フラグメントは、CD3(PNAS,88,8905)の
貫膜および細胞質ドメインに対して結合したTac(IL2受容体鎖)を含むプ
ラスミドを用いて得られた。P#6050およびP#6051を用い、CD3の
貫膜および細胞質ドメインを含むPCRによって320bp XhoI−Eco
RIフラグメントが得られた。これら二つのフラグメントを連結し且つSacI
I−EcoRIによって消化されたpBluescript(ストラタジーン(
Stratagene))中に挿入してプラスミドSPZ/KSを提供した。
FK506のための結合ドメインを得るために、プラスミドrhFKBP(S
.シュライバー(Schreiber)、Nature(1990)346,6
74によって提供された)をP#6052およびP#6053と一緒に用いて、
ヒトFKBP12を含む340bp XhoI−SalIフラグメントを得た。
このフラグメントを、XhoI−SalIによって消化されたpBluescr
ipt中に挿入して、プラスミドFK12/KSを提供し、これがFKBP12
結合ドメイン源であった。SPZ/KSをXhoIによって消化し、ホスファタ
ーゼ処理して(細胞腸アルカリ性ホスファターゼ;CIP)自己アニーリングを
防止し、そしてFK12/KSからの10倍モル過剰のXhoI−SalI F
KBP12含有フラグメントと組合せた。FKBP12のモノマー、ダイマーお
よびトリマーを正しい配置で含むクローンを単離した。クローン1FK1/KS
、1FK2/KSおよび1FK3/KSは、転写方向に、ネズミMHCクラスI
I遺伝子I−Eからのシグナルペプチド、ヒトFKBP12のモノマー、ダイマ
ーまたはトリマーそれぞれ、およびCD3の貫膜および細胞質部分から成る。最
後
に、SacII−EcoRIフラグメントを、制限酵素を用いてpBluesc
riptから切断し、そしてSacIIおよびEcoRIによって消化されたp
BJ5のポリリンカー中に連結して、プラスミド1FK1/pBJ5、1FK2
/pBJ5および1FK3/pBJ5をそれぞれ生成した。図3および図4を参
照されたい。実施例6 A.細胞内シグナリングキメラの構築
。
c−srcからのミリストイル化配列は、ペルマン(Pellman)ら、N ature
314,374から得られ、それをCD3の相補的配列に対して結
合して、P#8908と称する貫膜ドメインの3′配列に対して相補的であるプ
ライマーを提供した。このプライマーは、ミリストイル化配列の5′末端に隣接
したSacII部位および3′末端に隣接したXhoI配列を有する。他のプラ
イマーP#8462は、CD3の3′末端に対して相補的な配列のSalI認識
部位3′、停止コドンおよびEcoRI認識部位を有する。PCRを用いて、4
50bp SacII−EcoRIフラグメントを得たが、これは5′〜3′方
向に融合したミリストイル化配列およびCD3配列から成った。このフラグメン
トをSacII/EcoRI消化pBJ5(XhoI)(SalI)中に連結し
且つクローン化して、プラスミドMZ/pBJ5を生成した。最後に、MZ/p
BJ5をSalIによって消化し、ホスファターゼ処理し、そしてFK12/K
Sからの10倍モル過剰のXhoI−SalI FKBP12含有フラグメント
と組み合わせ且つ連結させた。クローニング後、5′〜3′方向にミリストイル
化配列、CD3およびFKBP12マルチマーを有する所望の構築物を含むプラ
スミドを単離し、そして正しい構造を有すると立証した。図2および図4を参照
されたい。B.細胞内シグナリングキメラの発現カセットの構築
。
構築物MZ/pBJ5(MZE/pBJ5)を、制限酵素XhoIおよびSa
lIによって消化し、TCRζフラグメントを除去し、そして得られたベクター
を10倍モル過剰のFKBP12のモノマー、ダイマー、トリマーまたは高次マ
ルチマーと連結して、MF1E、MF2E、MF3Eまたは、MFnE/PBJ
5を製造する。次に、和合性フランキング制限部位(すなわち、XhoIおよび
SalI)を含むように設計された活性ドメインを、MFnE/pBJ5の独特
のXhoIまたはSalI制限部位中にクローン化することができる。実施例7.核キメラの構築
A.GAL4 DNA結合ドメイン−1個または複数のFKBPドメイン−エ ピトープ標識
。
GAL4 DNA結合ドメイン(アミノ酸1〜147)を、Kozac配列の
上流のSacII部位および翻訳開始部位を有する5′プライマー(#37)並
びにSalI部位を有する3′プライマー(#38)を用いてPCRによって増
幅させた。PCR生成物を単離し、SacIIおよびSalIによって消化し、
そしてSacIIおよびSalI部位においてpBluescriptII K
S(+)中に連結して、構築物pBS−GAL4を生成した。構築物を配列決定
によって確認した。pBS−GAL4からのSacII/SalIフラグメント
を単離し、そしてSacIIおよびXhoI部位において構築物1FK1/pB
J5および1FK3/pBJ5(ミリストイル化配列を含む、実施例6を参照さ
れたい)中に連結して、構築物GF1E、GF2EおよびGF3Eを生成した。
PCR増幅生成物の5′末端:
PCR増幅生成物の3′末端:
B.HNF1ダイマー化/DNA結合ドメイン−1個または複数のFKBPド メイン−標識
。
HNF1aダイマー化/DNA結合ドメイン(アミノ酸1〜282)を、Ko
zac配列の上流のSacII部位および翻訳開始部位を有する5′プライマー
(#39)並びにSalI部位を有する3′プライマー(#40)を用いてPC
Rによって増幅させた。PCR生成物を単離し、SacIIおよびSalIによ
って消化し、そしてSacIIおよびSalI部位においてpBluescri
ptII KS(+)中に連結して、構築物pBS−HNFを生成した。構築物
を配列決定によって確認した。pBS−HNFからのSacII/SalIフラ
グメントを単離し、そしてSacIIおよびXhoI部位において構築物1FK
1/pBJ5および1FK3/pBJ5中に連結して、構築物HF1E、HF2
EおよびHF3Eを生成した。
PCR増幅生成物の5′末端:
PCR増幅生成物の3′末端:
C.1個または複数のFKBPドメイン−1個または複数のVP16転写活性 化ドメイン−エピトープ標識
。
これらの構築物は三段階で、すなわち、(i)ミリストイル化配列がXhoI
部位のすぐ上流の開始部位で置き換えられた1FK3/pBJ5から構築物を生
成して、構築物SF3Eを生成し;(ii)核局在化配列を該XhoI部位中に
挿入して構築物NF3Eを生成し;(iii)VP16活性化ドメインを、NF
3EのSalI部位中にクローン化して構築物NF3V1Eを生成することで製
造された。
(i)SacIIおよびXhoI部位に隣接されたKozac配列および開始
部位をコートしている相補的オリゴヌクレオチド(#45および#46)をアニ
ーリングし、リン酸化し、そしてMF3EのSacIIおよびXhoI部位中に
連結して構築物SF3Eを生成した。
一般的な開始部位の挿入
(ii)5′SalI部位および3′XhoI部位に隣接されたSV40 T
抗原核局在化配列をコートしている相補的オリゴヌクレオチド(#47および#
48)をアニーリングし、リン酸化し、そしてSFIEのXhoI部位中に連結
して、構築物NF1Eを生成した。構築物をDNA配列決定によって確認した。
128位のリシンの代わりにトレオニンが置換されている核局在化配列の突然変
異体または欠陥型を含む構築物を更に単離した。これをNF1E−Mと称する。
FKBP12ドメインのマルチマーは、FKBP12配列をpBS−FKBP1
2からのXhoI/SalIフラグメントとして単離し且つこのフラグメントを
、XhoIによって直鎖状にされたNF1E中に連結することによって得られた
。これによって構築物NF2EおよびNF3Eが生成された。
一般的な開始部位へのNLSの挿入
128位のトレオニンは欠陥NLSを生じる。
(iii)VP16転写活性化ドメイン(アミノ酸413〜490)を、Sa
lI部位を有する5′プライマー(#43)およびXhoI部位を有する3′プ
ライマー(#44)を用いてPCRによって増幅させた。PCR生成物を単離し
、SalIおよびXhoIによって消化し、そしてXhoIおよびSalI部位
においてMF3E中に連結して、構築物MV1Eを生成した。構築物を配列決定
によって確認した。マルチマー化されたVP16ドメインは、単−VP16配列
をXhoI/SalIフラグメントとしてMV1Eから単離し、そしてこのフラ
グメントを、XhoIによって直鎖状にされたMV1E中に連結することによっ
て生成された。構築物MV2E、MV3EおよびMV4Eをこの方法で生成した
。1種類またはそれ以上の多重VP16ドメインをコードしているDNAフラグ
メントは、XhoI/SalIフラグメントとしてMV1EまたはMV2Eから
単離され、そしてSalIによって直鎖状にされたNF1E中に連結されて、構
築物NF1V1EおよびNF1V3Eを生成した。FKBP12ドメインのマル
チマーは、FKBP12配列をXhoI/SalIフラグメントとしてpBS−
FKBP12から単離し、そしてこのフラグメントを、XhoIによって直鎖状
にされたNF1V1E中に連結することによって得られた。これによって構築物
NF2V1EおよびNF3V1Eが生成された。
PCR増幅生成物の5′末端:
PCR増幅生成物の3′末端:
オリゴヌクレオチド:
実施例8.転写誘導の実証。
ジュルカットTAg細胞を、エレクトロポレーション(960μF、250v
)によって指定された構築物(各構築物5μg)を用いてトランスフェクトした
。24時間後、細胞を新しい培地中に再懸濁させ且つ分別した。各トランスフェ
クションの半分を、最終濃度1μMでのダイマーFK506誘導体(実施例14
)と一緒にインキュベートした。12時間後、細胞を洗浄し、そして細胞抽出物
を反復凍結融解によって調製した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ(CAT)活性を、標準的なプロトコルによって測定した。Molecular Cloning;A Laboratory Manual
,サムブルック(Sambrook)ら監修(1989)CSHラ
ボラトリー、16〜59頁および次の数頁。データ(図22)は、37℃で18
時間インキュベーション後の抽出物(全抽出物量は120μL)70μL中に存
在するCAT活性を実証する。検定に用いられた試料は以下の通りである。
1. G5E4TCAT(GAL4-CATリポータープラスミド)
2. G5E4TCAT,GAL4-VP16
3. G5E4TCAT,NF3V1E
4. G5E4TCAT,GF2E
5. G5E4TCAT,GF2E,NF3V1E
6. G5E4TCAT,GF3E,NF3V1E
合成化学例
他の箇所で指摘したように、オリゴマー化剤として存在する特に重要な化合物
は、以下の構造:
リンカー−{rbm1,rbm2,…rbmn}
[式中、“リンカー”は、同一または異なっていてもよい“n”(2〜約5の
整数、通常、2もしくは3)レセプター結合部分(“rbm類”)に共有結合した、
例えば、本明細書に記載するリンカー部分である。]
を有する。本明細書の他の箇所で検討したように、レセプター結合部分は、例え
ば、セクションV(C)に列挙したような公知のレセプターに対するリガンド(
またはその類縁体)であり、FKBPに結合することのできるFK506、FK
520、ラパマイシンおよびその類縁体、ならびに、それぞれのレセプターに結
合することのできるシクロスポリン類、テトラサイクリン類、その他の抗微生物
剤およびマクロライド類ならびにステロイド類を包含する。
リンカーは、二以上のレセプター結合部分に共有結合(“−”)することので
きる二官能性または多官能性分子である。リンカー部分の例は、セクションVI
(A)および種々の実施例で開示してあり、とりわけ、C2〜C20アルキレン
、C4〜C18アザアルキレン、C6〜C24N−アルキレンアザアルキレン、
C6〜C18アリーレン、C8〜C24アルジアルキレンおよびC8〜C36ビ
スカルボキサアミドアルキレンが挙げられる。
これらの化合物は、市販されている物質および/または当分野公知の方法を用
いて製造することができる。これら化合物に対する人工のレセプターは、以降に
記載するようにして得ることができる。特に重要な化合物は、KD10-6未満、
好ましくは、約10-7未満、さらにより好ましくは、10-8未満でレセプターに
結合する化合物である。
重要なオリゴマー化剤の一つの亜類は、一以上のレセプター結合部分がFK5
06、FK−506タイプの化合物またはその誘導体であるものであり、レセプ
ター結合部分は、図23Aにおける化合物5または13当たり(FK506ナン
バリングを用いて)、C21でアリル基を介するか、または、シクロヘキシル環
(C29〜C34)、例えば、図23Bにおける化合物8、16、17当たりC
32ヒドロキシルを介して、リンカー部分に共有結合される。この類の化合物は
、以下の実施例も含め、本明細書に開示された方法を採用することによって製造
することができる。
重要なオリゴマー化剤のもう一つの亜類は、レセプター結合部分の少なくとも
一つがFK520またはその誘導体であり、FK520またはその誘導体の分子
が、図10におけるFK1040AまたはFK1040Bのように、リンカー部
分に共有結合しているものである。この類の化合物は、図10のスキーム1もし
くは図11Aおよび図11Bのスキーム2または図12および図13のスキーム
3を採用することによって製造することができる。
重要なオリゴマー化剤のさらなる亜類は、レセプター結合部分の少なくとも一
つがシクロスポリンAまたはその誘導体であるものである。
本発明のこれらおよびその他のオリゴマー化剤が、ホモオリゴマー化試薬(rb
mが同一である)またはヘテロオリゴマー化剤(rbmが異なる)であってもよいこ
とを理解する必要がある。ヘテロオリゴマー化剤は、本明細書中の処理方法、例
えば、図13のスキーム3および本明細書のその他の箇所で検討した処理方法に
類似した方法によって製造することができる。
以下の合成例は、例として示すものである。A. 一般的な処理方法
反応は、全て、窒素またはアルゴン加圧下、オーブン
で乾燥させたガラス器具中で行った。空気および水分に鋭敏な化合物は、ゴム栓
を介して、シリンジまたはカニューレで導入した。B. 物理的なデータ
プロトン核磁気共鳴スペクトル(1HNMR)は、Bruke
r AM-500(500MHz)およびAM-400(400MHz)分光器で記録した。ケミカルシフトは、
内部標準としての溶剤共鳴(クロロホルム,7.27ppm)を用いて、テトラメチ
ルシランからのppmで報告する。データは、以下の通り、ケミカルシフト、多重
度(s=シングレット、d=ダブレット、t=トリプレット、q=カルテット、br=
広がった、m=マルチプレット)、カップリングコンスタント(Hz)、積分で報告す
る。低分解能および高分解能質量スペクトルが得られた。C. クロマトグラフィ
反応は、E.Merkのシリカゲル60Fガラスプレート(0
.25mm)を用いて、薄層クロマトグラフィ(TLC)によりモニターした。成
分
は、長波長の紫外光による照射、ヨード蒸気への暴露、および/または、セリッ
クアンモニウムモリブデート水溶液への浸漬、続く、加熱によって目視した。ク
ロマトグラフィ用の溶剤は、HPLC等級であった。E.Merkシリカゲル60(2
30〜400メッシュ)について指示された溶剤システムの強制流(フラッシュ
クロマトグラフィ)を用いて、液体クロマトグラフィを行った。D. 溶剤および試薬
試薬および溶剤は、全て、分析用等級であり、以下、例
外的と受け取られるように使用した。
テトラヒドロフラン(THF)、ベンゼン、トルエンおよびジエチルエーテル
は、ナトリウム金属ベンゾフェノンケチルから蒸留した。トリエチルアミンおよ
びアセトニトリルは、カルシウムハイドライドから蒸留した。ジクロロメタンは
、五酸化リンから蒸留した。ジメチルホルムアミド(DMF)は、減圧でカルシ
ウムハイドライドから蒸留し、4Aモレキュラーシーブ上で貯蔵した。FK506誘導体の製造 実施例 9 FK506−TBS2のハイドロボレーション/酸化(1〜2)
ハイドロボレーションは、Evansの方法[Evans,et al.,JACS(1992)114,6679
; ibid.(1992)6679-6685]に従い行った[ナンバリングについては、Harding,et
al.,Nature(1989)341,758参照]。10mlのフラスコに、24,32−ビス[
(t−ブチルジメチルシリル)オキシ]FK506(33.8mg,0.033mm
ol)と[Rh(nbd)(diphos-4)]BF4(3.1mg,0.004mmol,13mol%)とを充
填した。オレンジ色の混合物をトルエン(2.0ml)に溶解し、溶剤を減圧下4
時間かけて除去した。フラスコを窒素で注意深くパージし、オレンジ色の油状物
をTHF(3.0ml,最終濃度10mM)に溶解し、氷冷バスで0℃に冷却した。
カテコールボラン(98μl,0.098mmol,THF1.0M溶液,3.0当量
)をシリンジで加え、得られた溶液を0℃で45分間撹拌した。0.2mlTHF
/EtOH(1:1)で反応を0℃でクエンチし、続いて、pH7.0緩衝液(F
isher; 0.05Mリン酸塩)0.2mlを加え、ついで、30%H2O20.2mlを加え
た。溶液を室温で少なくとも12時間撹拌した。減圧下、溶剤を除去し、残る油
状物をベンゼン(10ml)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(10ml)
で洗浄した。相を分離し、水相をベンゼン(2×10ml)で逆抽出した。有
機相を合わせ、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(10ml)で一回洗浄した。ベン
ゼン相をMgSO4で乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ(ヘキサン
:酢酸エチル2:1)に付すと、透明無色の油状物(12.8mg,0.012mm
ol,37%)として、所望の第1級アルコールを与えた。
混合カーボネートの製造(2〜3)
混合カーボネートの製造は、Ghoshの方法[Ghosh,et 1.,Tetrahedron Lett.
(1992)33,2781-2784]によって達成された。10mlのフラスコに、第1級アルコ
ール(29.2mg,0.0278mmol)とベンゼン(4ml)とを充填した。減圧
下、60分間かけて、溶剤を除去した。油状物をアセトニトリル(2.0ml,最
終濃度14mM)に溶解し、トリエチルアミン(77μl,0.56mmol)を加え
つつ、20℃で撹拌した。N,N’−ジスクシンイミジルカーボネート(36mg
,0.14mmol)を一度に加え、溶液を200Cで46時間撹拌した。反応混合物
をジクロロメタンで希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(10ml)で洗浄し
た。相を分離し、水層をジクロロメタン(2×10ml)で逆抽出した(back-extr
acted)。有機相を合わせ、(MgSO4で)乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマ
トグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル3:1〜2:1〜1:1)に付した。所望の
混合カーボネートは、透明な無色の油状物(16.8mg,0.014mmol,51
%)として、単離された。
FK506の二量化(3〜4)
乾燥した1mlのコニカルガラスビーカー(Kontes Scientific Glassware)に、
混合カーボネート(7.3mg,0.0061mmol)とアセトニトリル(250μl
,最終濃度25mM)とを充填した。トリエチルアミン(10μl,0.075mmol
)を加え、続いて、p−キシリーレンジアミン(8.3μl,0.0027mmol
,0.32MDMF溶液)を加えた。反応物を20℃で22時間撹拌し、ジクロ
ロメタン(10ml)で希釈することによってクエンチした。溶液を炭酸水素ナト
リウム飽和水溶液(10ml)で洗浄した。相を分離し、水層をジクロロメタン(
2×10ml)で逆抽出した。有機相を合わせ、(MgSO4で)乾燥し、濃縮し
、フラッシュクロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル3:1〜2:1〜1:1
)に付すと、透明な無色の油状物(4.3mg,1.9μmol,70%)として、
所
望の保護されたダイマーを与えた。
FK506ダイマーの脱保護(4〜5)
回転翼を取り付けた1.5mlのポリプロピレンチューブに、保護されたダイマ
ー(3.3mg,1.4μmol)を入れた。アセトニトリル(0.5ml,最終濃度
3mM)を加え、HF(55μl,48%水溶液;Fisher)を加えつつ、溶液を20
℃で撹拌した。溶液を室温で18時間撹拌した。ついで、脱保護されたFK50
6誘導体を、15ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液
との間で分配させた。両相を混合するために、試験管に激しい渦流を生じさせ、
分離後、有機相をピペットで除去した。水相をジクロロメタン(4×2ml)で逆
抽出し、合わせた有機相を(MgSO4で)乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマ
トグラフィ(ヘキサン:THF:エーテル1:1:1〜THF:エーテル1:1
)に付すと、透明な無色の油状物(1.7mg,0.93μmol,65%)として
、所望のダイマーを与えた。
上記処理法に従い、他のモノアミン類およびジアミン類、例えば、ベンジルア
ミン(14)、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン等を使用するこ
とができる。実施例 10 FK506のL−セレクトライドによる還元(FK506〜6)
Danishefskyと共同研究者達は、FK506をL−セレクトライドで処理する
と、C24およびC22ヒドロキシル基で形成するボロネートエステルを有する
22−ジヒドロ−FK506を与えることを示した[Coleman and Danishefsky,
Heterocycles(1989)28,157-161; Fisher,et al.,J.Org.Chem.(1991)56
,2900-2907]。
混合カーボネートの製造(6〜7)
10mlのフラスコに、22−ジヒドロ−FK506−sec-ブチルボロネート(
125.3mg,0.144mmol)とアセトニトリル(3.0ml,最終濃度50mM)
とを充填し、トリエチルアミン(200μl,1.44mmol,10当量)を透明
な溶液に加えつつ、室温で撹拌した。N,N −ジスクシンイミジルカーボネー
ト(184.0mg,0.719mmol)を一度に加え、透明な溶液を室温で44時
間撹拌した。溶液を酢酸エチル(20ml)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和
水溶液(10ml)で洗浄し、相を分離した。ついで、水相を酢酸エチル(2×1
0ml)で逆抽出し、有機相を合わせ、(MgSO4で)乾燥し、得られた油状物
をフラッシュクロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル1:1〜1:2)に付す
と、透明な無色の油状物(89.0mg,0.088mmol,61%)として所望の
混合カーボネートを与えた。
FK506混合カーボネートの二量化(7〜8)
乾燥した1mlのコニカルガラスビーカー(Kontes Scientific Glassware)に、
混合カーボネート(15.0mg,0.0148mmol)とジクロロメタン(500
μl,最終濃度30mM)とを充填した。トリエチルアミン(9μl,0.067mmo
l,10当量)を加えつつ、溶液を室温で撹拌し、続いて、p−キシリーレンジ
アミン(0.8mg,0.0059mmol)を加えた。反応物を20℃で16時間撹
拌し、ジクロロメタン(5ml)で希釈することによってクエンチした。炭酸水素
ナトリウム飽和水溶液(5ml)で溶液を洗浄した。相を分離し、水層をジクロロ
メタン(2×5ml)で逆抽出した。有機相を合わせ、(MgSO4で)乾燥し、
濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル1:1〜1:2)
に付すと、透明な無色の油状物(7.4mg,3.8μmol,65%)として、所
望のダイマーを与えた。
上記処理法に従い、キシリーレンジアミンの代わりに、その他のモノアミン類
、ジアミン類またはトリアミン類、例えば、ベンジルアミン(15)、オクチレ
ンジアミン、デカメチレンジアミン(16)、ビス−p−ジベンジルアミン、N
−メチルジエチレンアミン、トリス−アミノエチルアミン(17)、トリス−ア
ミノプロピルアミン、1,3,5−トリアミノメチルシクロヘキサン等を使用す
ることができる。実施例 11 FK506(1〜9)の酸化開裂および還元
Kellyの処理方法[VanRheenen et al.,Tetrahedron Lett.(1976)17,1973-1
976]に従い、オスミレーション(osmylation)を行った。Danishefskyの処理方法
[Zell,et al.,J.Org.Chem.(1986)51,5032-5036]に従い、開裂を行った
。Krishnamurthyの処理方法[J.Org.Chem.,(1981)46,4628-4691]に従い、
アルデヒド還元を行った。10mlのフラスコに、24,32−ビス[(t−ブチ
ルジメチルシリル)]オキシ]−FK506(84.4mg,0.082mmol)、
4−メチルモルホリンN−オキシド(48mg,0.41mmol,5当量)およびT
HF(2.0ml,最終濃度41mM)を充填した。オスミウムテトラオキシド(4
5μl,0.008mmol,0.1当量)をシリンジを介して加えた。透明な無色
の溶液を室温で5時間撹拌した。ついで、反応物を50%水性メタノール(1.
0ml)で希釈し、過ヨウ素酸ナトリウムを一度に加えた。曇った混合物を室温で
40分間撹拌し、エーテル(10ml)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液
(5ml)で洗浄した。相を分離し、水層をエーテル(2×5ml)で逆抽出した。
合わせた有機層は、(MgSO4で)乾燥し、固体のナトリウムサルファイト(
50mg)で処理した。ついで、有機相を濾過し、濃縮し、油状物をフラッシュク
ロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル3:1〜2:1)に付すと、透明な無色
の油状物として、中間体の不安定なアルデヒド(53.6mg)を与えた。このア
ルデヒドを直ちにTHF(4.0ml)に溶解し、窒素雰囲気下、−78℃に冷却
し、リチウムトリス[(3−エチル−3−ペンチル)オキシ]アルミニウムハイ
ドライド(0.60ml,0.082mmol,0.14MTHF溶液,1.0当量)
で処理した。透明な溶液は、−78℃で10分間撹拌し、ついで、エーテル(4
ml)で希釈し、塩化アンモニウム飽和水溶液を加えることによってクエンチした
。混合物を室温まで暖め、溶液を乾燥するために、固体の硫酸ナトリウムを加え
た。ついで、混合物を濾過し、濃縮し、得られた油状物をフラッシュクロマトグ
ラフィ(ヘキサン:酢酸エチル2:1)に付すと、透明な無色の油状物(39.
5mg,0.038mmol,47%)として、所望のアルコールを与えた。
混合カーボネート類の製造(9〜10)
混合カーボネートの製造は、Ghosh,Tetrahedron Lett.(1992)33,2781-2784
の方法によって達成された。10mlのフラスコに、第1級アルコール(38.2
mg,0.0369mmol)とアセトニトリル(2.0ml,最終濃度10mM)とを充
填し、2,6−ルチジン(43μl,0.37mmol,10当量)を加えつつ、室
温で撹拌した。N,N’−ジスクシンイミジルカーボネート(48mg,0.18
mmol)を一度に加え、溶液を室温で24時間撹拌した。反応混合物をエーテル(
10ml)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(10ml)で洗浄した。相
を分離し、水層をエーテル(2×10ml)で逆抽出した。有機相を合わせ、(M
gSO4で)乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エ
チル2:1〜1:1)に付した。所望の混合カーボネートが、透明な無色の油状
物(32.6mg,0.028mmol,75%)として単離された。
ベンジルカルバメートの製造(10〜11)
乾燥した1mlのコニカルガラスビーカー(Kontes Scientific Glassware)に、
混合カーボネート10(8.7mg,0.0074mmol)とアセトニトリル(50
0μl,最終濃度15mM)とを充填した。トリエチルアミン(10μl,0.07
4mmol,10当量)を加えつつ、溶液を室温で撹拌し、続いて、ベンジルアミン
(1.6μl,0.015mmol,2当量)を加えた。反応物を室温で4時間撹拌
した。乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フラッシュクロマトグラフィ(
ヘキサン:酢酸エチル3:1〜2:1)に付すと、透明な無色の油状物(6.2
mg,5.3μmol,72%)として、所望の保護されたモノマーを与えた。
回転翼を取り付けた1.5mlポリプロピレンチューブに、保護されたモノマー
(0.2mg,5.3μmol)を入れた。アセトニトリル(0.5ml,最終濃度1
1mM)を加え、HF(55μl,48%水溶液:Fisher,最終濃度3.0N)を加
えつつ、溶液を室温で撹拌した。溶液を室温で18時間撹拌した。ついで、15
ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で、脱保護
されたFK506誘導体を分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて両相を
混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン(4×2ml)で
、水相を逆抽出し、合わせた有機相を(MgSO4で)乾燥し、濃縮し、フラッ
シュクロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル1:1〜0:1)に付すと、透明
な無色の油状物(3.9mg,4.1μmol,78%)として、所望の脱保護され
たベンジルカルバメートを与えた。
ベンジルカルバメート(13)をジアミン、例えば、キシリーレンジアミン(
12)、ヘキサメチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジア
ミン(13)またはその他のジアミン類で置き換えることによって、本発明のダ
イマー化合物類が製造される。実施例 12 FK506の混合カーボネート(12)の製造
10mlのフラスコに、24,32−ビス[(t−ブチルジメチルシリル)]オ
キシ]−FK506(339.5mg,0.329mmol)、4−メチルモルホリン
N−オキシド(193mg,1.64mmol,5当量)、水(0.20ml)およびT
HF(8.0ml,最終濃度41mN)を充填した。オスミウムテトラオキシド(0
.183ml,0.033mmol,0.1当量,0.18M水溶液)をシリンジを介
して加えた。透明な無色の溶液を室温で4.5時間撹拌した。反応物を50%水
性メタノール(4.0ml)で希釈し、過ヨウ素酸ナトリウム(700mg,3.2
9mmol,10当量)を一度に加えた。曇った混合物を室温で25分間撹拌し、エ
ーテル(20ml)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(10ml)で洗浄し
た。相を分離し、水層をエーテル(2×10ml)で逆抽出した。合わせた有機相
は、MgSO4および固体のナトリウムサルファイト(50mg)上で乾燥させた
。ついで、有機相を濾過し、濃縮し、得られたアルデヒドを直ちにTHF(8.
0ml)に溶解し、窒素雰囲気下で、−78℃に冷却し、リチウムトリス[(3−
エチル−3−ペンチル)オキシ]アルミニウムハイドライド(2.35ml,0.
329mmol,THFの0.14M溶液,1.0当量)で処理した。透明な溶液は
、−78℃で60分間撹拌し(TLCによって綿密にモニターした)、ついで、
エーテル(5ml)で希釈し、塩化アンモニウム飽和水溶液(0.3ml)を加える
ことによってクエンチした。混合物を室温まで暖め、溶液を乾燥するために、固
体の硫酸ナトリウムを加えた。混合物を20分間撹拌し、濾過し、濃縮し、得ら
れた油状物を直ちにアセトニトリル(10ml)に溶解した。得られた第1級アル
コールのCH3CN溶液に、2,6−ルチジン(0.380ml,3.3mmol,1
0当量)とN,N −ジスクシンイミジルカーボネート(420mg,1.65mm
ol,5当量)とを加えた。不均一な混合物を室温で19時間撹拌し、その時点で
、溶液をエーテル(30ml)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(20ml
)で洗浄した。水相をエーテル(2×10ml)で逆抽出した。有機相を合わせ、
(MgSO4で)乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ(ヘキサン:酢
酸エチル3:1〜2:1〜1:1)に付した。所望される混合カーボネート12
は、透明な無色の油状物(217mg,0.184mmol,4工程を通して56%)
として単離された。実施例 13 24,24’,32,32’−テトラキス[(t−ブチルジメチ ルシリル)オキシ]−FK1012−A(p−キシリーレンジアミン架橋)の製 造
乾燥した1mlのコニカルガラスビーカーに、混合カーボネート(23.9mg,
0.023mmol)とアセトニトリル(500μl,最終濃度41mM)とを充填し
た。トリエチルアミン(28μl,0.20mmol,10当量)を加え、続いて、
p−キシリーレンジアミン(46μl,0.0101mmol,0.22MDMF溶液
)を加えた。反応物を室温で18時間撹拌し、乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状
物を直接フラッシュクロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル3:1〜2:1〜
1:1)に付すと、透明な無色の油状物(11.9mg,5.3μmol,52%)
として、所望の保護されたダイマーを与えた。実施例 14 FK1012−A(p−キシリーレンジアミン架橋)(13)の 製造
回転翼を取り付けた1.5mlポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー
(11.0mg,4.9μmol)を入れた。アセトニトリル(0.50ml,最終濃
度10mM)を加え、HF(55μl,48%水溶液;Fisher,最終濃度3.0N)
を加えつつ、溶液を20℃で撹拌した。溶液を室温で16時間撹拌した。ついで
、15ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で、
脱保護されたFK506誘導体を分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて
相を混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン(4×2ml
)で、水相を逆抽出し、合わせた有機相を(MgSO4で)乾燥し、濃縮し、フ
ラッシュクロマトグラフィ(ヘキサン/THF/エーテル:1:1:1〜THF
/エーテル1:1)に付すと、透明な無色の油状物(5.5mg,3.0μmol,
63%)として、FK1012−Aを与えた。実施例 15 24,24’,32,32’−テトラキス[(t−ブチルジメチ ルシリル)オキシ]−FK1012−B(ジアミノデカン架橋)の製造
乾燥した1mlのコニカルガラスビーカーに、混合カーボネート(53.3mg,
0.0453mmol)とアセトニトリル(2.0ml,最終濃度11mM)とを充填し
た。トリエチルアミン(16μl,0.11mmol,5当量)を加え、続いて、
ジアミノデカン(61μl,0.0226mmol,0.37MDMF溶液)を加えた
。反応物を室温で12時間撹拌し、乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フ
ラッシュクロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル3:1〜2:1〜1:1)に
付すと、透明な無色の油状物(18.0mg,7.8μmol,35%)として、所
望の保護されたダイマーを与えた。実施例 16 FK1012−B(ジアミノデカン−1,10架橋)(14)の 製造
撹拌翼を取り付けた1.5mlポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー
(18.0mg,7.8μmol)を入れた。アセトニトリル(0.45ml,最終濃
度16mM)を加え、HF(55μl,48%水溶液;Fisher,最終濃度3.6N)
を加えつつ、溶液を20℃で撹拌した。溶液を23℃で17時間撹拌した。つい
で、15ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で
、生成物FK1012−Bを分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて相を
混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン(4×2ml)で
、水相を逆抽出し、合わせた有機相を(MgSO4で)乾燥し、濃縮し、フラッ
シュクロマトグラフィ(100%酢酸エチル〜酢酸エチル/メタノール20:1
)に付すと、透明な無色の油状物(5.3mg,2.9μmol,37%)として、
FK1012−Bを与えた。実施例 17 24,24’,32,32’−テトラキス[(t−ブチルジメチ ルシリル)オキシ]FK1012−C(ヒス−p−アミノメチルベンゾイルジア ミノデカン架橋)の製造
乾燥した25mlテイア形(tear-shaped)フラスコに、ジアミンリンカー(15
.1mg,0.0344mmol)とDMF1.0mlとを充填した。別のフラスコで、
混合カーボネートとトリエチルアミン(0.100ml,0.700mmol,20当
量)とをジクロロメタン2.0mlに溶解し、ついで、緩やかに(4×0.50ml
)、ヒス−p−アミノメチルベンゾイルジアミノデカン−1,10の撹拌溶液に
加えた。混合カーボネート12を入れたフラスコをジクロロメタン(2×0.5
0ml)で洗浄し、混合カーボネート12を完全に移した。反応物を23℃で16
時間撹拌し、乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フラッシュクロマトグラ
フィ
(ヘキサン/酢酸エチル1:1〜1:2)に付すと、透明な無色の油状物(29
.6mg,11.5μmol,34%)として、所望の保護されたダイマーを与えた
。実施例 18 FK1012−C(15)の製造
撹拌翼を取り付けた1.5mlポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー
(29.6mg,11.5μmol)(17)を入れた。アセトニトリル(0.45m
l,最終濃度23mM)を加え、HF(55μl,48%水溶液;Fisher,最終濃度
3.6N)を加えつつ、溶液を室温で撹拌した。溶液を室温で17時間撹拌した
。ついで、15ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液と
の間で、所望される対称なダイマーを分配させた。試験管に激しい渦流を生じさ
せて相を混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン(4×
2ml)で、水相を逆抽出し、合わせた有機相を(MgSO4で)乾燥し、濃縮し
、フラッシュクロマトグラフィ(100%酢酸エチル〜酢酸エチル/メタノール
15:1)に付すと、透明な無色の油状物(11.5mg,5.5μmol,47%
)として、FK1012−Cを与えた。CsA誘導体の製造 実施例 19 MeBmt(OAc)・・OH1CsA(2)
MeBmt(OAc)・・OAc1・CsA(1)(161mg,124mmol)
[Eberle and Nuninger,J.Org.Chem.(1992)57,2689参照。]をメタノール
(10ml)に溶解した。KOH(196mg)を水(8ml)に溶解した。KOH溶
液297ml(0.130mmol,1.05当量)を(1)のMeOH溶液に加えた
。この新たな溶液を不活性雰囲気下室温で4時間撹拌し、その時点で、反応を酢
酸(2ml)でクエンチした。5cm×25cm,12μ,100A.C18カラムを
用い、0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸を含有する70%アセトニトリル/H2O
で溶離する逆相HPLCによって反応混合物を精製すると、所望のモノアセテー
ト(2)112mg(72%)を与えた。
MeBmt(OAc)・・OCOIm1CsA(3)
MeBmt(OAc)・・OH1CsA(2)(57mg,45.5μmol)とカ
ルボニルジイミダゾール(15mg,2当量,91μmol)とを50ml丸底フラス
コに移し、乾燥THF(6ml)に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(32
μl,4当量,182μmol)を加え、ついで、ロータリーエバポレータで、溶剤
を室温で除去した。酢酸エチルを溶離液として用いるシリカゲル上、フラッシュ
クロマトグラフィによって残渣を精製すると、所望のカルバメート(3)45mg
(73%)を与えた。
トリス(2−アミノエチル)アミンCsAトリマートリアセテート(6)
MeBmt(OAc)・・OCOlm1CsA(3)(7.5mg,5.54μm
ol,3.1当量)をTHF(100μl)に溶解した。ジイソプロピルエチルア
ミン(62μl,5当量,アミン100μlをTHF4mlに含有する溶液8.93
μmol)を加え、続いて、トリス(2−アミノエチル)アミン(26μl,1.7
9μmol,トリスアミン101mgを10mlTHFに含有する溶液1当量)を加え
た。この溶液をN2雰囲気下5日間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、ついで、
0〜5%メタノールクロロホルムを用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグ
ラフィにより精製すると、所望の生成物(6)4.1mgを与えた。実施例 20 ジアミノデカンCsAダイマー(8)
固体のNa金属(200mg,過剰)を乾燥メタノール(10ml)と0℃で反
応させた。ジアミノデカンCsAダイマージアセテート(5)(4.0mg)をM
eOH(5ml)に溶解させた。NaOMe溶液2.5mlを(5)の溶液に加えた
。不活性雰囲気下室温で撹拌2.5時間後、酢酸(2ml)で溶液をクエンチし、
5mm×25mm,12μ,100A.C18カラムを用い、0.1%(v/v)トリフ
ルオロ酢酸を含有する70〜95%アセトニトリル/H2Oで20分間かけて溶
離する逆相HPLCによって反応生成物を精製すると、所望のジオール2.5mg
(60%)を与えた。
トリス(2−アミノエチル)アミンを0.45当量の1,10−ジアミノデカ
ンで置き換えることによって、ジアミノデカンCsAジアセテート(5)を製造
した。実施例 21 p−キシリーレンジアミンCsAダイマー(4)
トリス(2−アミノエチル)アミンを0.45当量のp−キシリーレンジアミ
ンで置き換えることによって、p−キシリーレンジアミンCsAダイマー(4)
を製造した。
文献に記載された処理方法に従い、1(MeBmt1)部位以外の部位をリン
カーすることによって、シクロフィリンのその他の誘導体を製造した。
位置8D異性体類縁体は、生成有機体にD−アミノ類縁体を供給して特にその
部位に組み込むことによって製造される。Patchett,et al.,J.Antibiotics(1
992)45,943(β-MeSO)D-Ala8-CsA): Traber,et al.,ibid,(1989)42,591参照
。位置3の類縁体は、特にSac3の炭素部位でのCsAのポリリチェーション
/アルキレーションによって製造される。(シクロフィリン結合および活性プロ
フィル、特に、D-MePhe3-CsAに対しては)Wenger,Transplant Proceeeding(198
6)18,213,supp.5;および、(誘導体の製造に対しては)1987年10月27日に発
行されたSeebachの米国特許No.4,703,033参照。
シクロスポリンAの代わりに、上記処理方法に従うと、CsAのその他天然産
の変種を本発明での使用のために多量化(multimerized)することができる。実施 例21A CsAダイマーの別の合成法
MeBmt(OH)−η−OCOIm1−CsA
MeBmt(OH)−η−OH1−CsA(38mg、31mmol、1218.6
g/mol)およびカルボニルジイミダゾール(20mg、4当量、124mm
ol、162.15g/mol)を10mLの丸底フラスコに移し、乾燥THF
(2mL)で溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(22mL、4当量、12
5mmol、129.25g/mol)を加え、溶媒をロータリーエバポレータ
ーにて室温で除去した。残渣はシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーを用
い、酢酸エチル中0−20%のアセトンで溶出させて精製すると32mg(収率
78%)の白色固形物を得た。
(CsA)2キシレンジアミンCsAダイマー
MeBmt(OH)−η−OCOIm1−CsA(12.5mg、9.52m
mol、1312.7g/mol)をDCM(200mL)に溶解した。この溶
液に22ml(0.5当量、4.75mmol)のキシレンジアミン(14.7
mg、136.2g/mol)のDMSO(0.5mL)溶液を加え、反応混合
物は窒素雰囲気下、室温で72時間ゆっくり撹拌した。反応液をアセトニトリル
(2mL)で希釈し、ガラスウールを通して濾過し、逆相HPLC(Beckm
an C18,10m,100A,1cmx25cm,5mL/分,30分で5
0から90%ACN/H2O(+0.1%TFA),70℃)で精製すると6.
1mg(収率49%)の白色固形物を得た。
実施例21B.FK506−CsAダイマー−MeBmt(OAc)−η−CH 2COOEt−CsAの合成
MeBmt(OAc)−η−Br1−CsA(26mg、約80%純度、15
.7mmol、1323.57g/mol)をTHF(500mL)に溶解した
。この溶液をシリンジポンプにより、iPrMgCl(2.15mL、2.34
Mエーテル溶液)を0℃のマロン酸水素エチル(Lancaster、2.5m
mol,132.12g/mol)のTHF(4.7mL)に加え続いて室温ま
で暖めることにより製造したマロン酸水素エチル(過剰)のマグネシウムエノレ
ートTHF(4.7mL)溶液に15時間以上かけて添加した。反応混合物は1
NHCl(50mL)で反応を停止させ、酢酸エチル(2x50mL)で抽出し
た。
有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過して蒸発させた。
粗生成物をDMF(1mL)に溶解した。Et4NOAc・4H2O(150
mg、過剰)を加えて、混合物は90℃で2時間加熱した。反応混合物を室温ま
で冷却し、H2O(50mL)で希釈し、エーテルで抽出した(2x50mL)
。合併した有機物をNa2SO4で乾燥させ、濾過して蒸発させた。残渣はシリカ
ゲルを用い、75−100%酢酸エチル/ヘキサンで溶出するフラッシュクロマ
トグラフィーで精製すると11.4mg(55%)の白色固形物を得た。
MeBmt(OH)−η−CH2COOH1−CsA
MeBmt(OAc)−η−CH2COOEt1−CsA(11.0mg、8.
27mmol、1330.76g/mol)をMeOH(2mL)に溶解し、N
aOMe(1.30M MeOH溶液、10mL)溶液を加えた。反応混合物は
窒素雰囲気下、室温で5時間撹拌し、その時点でH2O(2mL)を加え、さら
に2時間混合物を撹拌した。反応は氷酢酸(1mL)を加えて停止させ、ガラス
ウールを通して濾過し、逆相HPLC(Rainin,C18dynamax,
5m,300A,21.4mmx250mm,20mL/分,30分で50から
90%ACN/H2O(+0.1%TFA),70℃)で精製すると5.5mg
(収率53%)の白色固形物を得た。
ビス−TBS−N−(6−(Boc−アミノ)ヘキシル)FK506カーバメー
ト
ビス−TBS−FK506スクシンイミジル カーボネート((tbs)4−
FK1012の前駆体でもある)(5.8mg、1177.62g/mol、4
.93mmol)をDCMに溶解した。これにN−Boc−1,6−ジアミノヘ
キサン(7.25mg、過剰)を加えた。室温で10分間撹拌後、反応混合物を
蒸発させ、10−40%酢酸エチル/ヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグ
ラフィーで精製すると5.9mg(収率94%)の生成物を得た。
N−(6−アミノヘキシル)FK506 カーバメート
ビス−TBS−N−(6−(Boc−アミノ)ヘキシル)FK506カーバメ
ート(5.9mg、1278.88g/mol、4.61mmol)をACN(
700ml)を含むポリプロピレンチューブに移し、続いてHF水溶液(49%
、100mL)を加えた。反応は室温で6時間後に完了し、NaHCO3の飽和
溶液を徐々に加えて停止させた。混合物は飽和NaHCO3(4mL)、H2O
(4mL)て希釈し、DCM(3x10mL)で抽出した。合併した有機層をM
gSO4で乾燥し、濾過して蒸発させると3.6mg(収率82%)の粗生成物
を得た。
FKCsA
MeBmt(OH)−η−CH2COOH1−CsA(2.86mg、2.27
mmol、1260.66g/mol)およびN−(6−アミノヘキシル)FK
506 カーバメート(粗、2.16mg、2.28mmol、946.21g
/mol)をDCM(900mL)に溶解した。この溶液に127mL(3.0
当量、6.8mmol)のBOP(11.9mg、442.5g/mol)のD
CM(500mL)溶液、続いて45mL(2.25当量、5.1mmol)の
ジイソプロピルアミン(20mL、d=0.74 2129.25g/mol)
のDCM(1.0mL)溶液を加えた。最後に、DMF(40mL)を加え、反
応混合物は窒素気流下、室温で12時間以上かけて蒸発させた。反応混合物はア
セトニトリル(1mL)で希釈し、ガラスウールを通して濾過し、逆相HPLC
(Beckman C18,1cmx25cm,5mL/分,25分で50から
90%ACN/H2O(+0.1%TFA),50℃)で精製すると2.4mg
(収率48%)の白色固形物を得た。
実施例 22 (A)FK1012“バンプ(Bump)”化合物およびFKBP12 類の代償性突然変異(Compensatory Mutations)による構造基体のデザインおよび 合
成
FK506のC9およびC10における置換基は、合成によってもアクセスす
ることができ、合成によってアクセスされているが、異なる一連のFKBP12
側鎖残基と相反する。かくして、このようなリガンドに対する突然変異によって
生じるレセプターの一つの類は、異なる修飾基を含有し、あるものは、C10置
換基に対する代償穴を形成し、また、あるものは、C9置換基に対する代償穴を
形成する。炭素10は、選択的に修飾され、(FK506でのヒドロキシル基に
対して)炭素から突出するN−アセチルまたはN−ホルミル基を有する。これら
誘導体の結合性は、これらC10バンプが固有のFKBP12に対する結合を有
効に失うことを明瞭に現す。図23は、追加のC9バンプを含有するFK506
−タイプ部分の合成のためのスキームを示す。このようなリガンドを本発明のリ
ンカー部分と結合させることによって、代償性突然変異を有する対応結合領域を
含有するキメラ蛋白質に対するHEDおよびHOD(ならびに拮抗剤)を構成す
ることができる。C9およびC10に修飾基を含有するHED試薬の例を図23
に示す。
かくして、本発明は、C9およびC10のいずれか、もしくは、両方に、−O
R、−R、−(CO)OR、−NH(CO)Hまたは−NH(CO)R[式中、
Rは、直鎖、分岐または環式であってもよい、置換もしくは非置換パーオキシド
類およびカーボネート類を含む、置換または非置換アルキルまたはアリールアル
キルである。]を含む官能基を含有するFK−506−タイプ部分を含む一つの
類のFK−506−タイプの化合物を包含する。“FK506−タイプ部分”と
しては、FK−506の環構造の少なくとも(置換もしくは非置換)C2〜C1
5部分を保持し、天然または修飾FKBPと結合することができ、好ましくは、
約10-6以下のKd値を有する、(ラパマイシンをも含む)FK506、FK5
20、および、合成もしくは天然産の変種、類縁体およびその誘導体が挙げられ
る。
本発明は、さらに、本発明のリンカー部分に共有結合した、このような一以上
のFK−506−タイプの化合物を含有するホモダイマーおよびヘテロダイマー
ならびにそれより高次のオリゴマー類を包含する。これらFK−506−タイプ
の化合物のモノマー類も、また、リンカー部分に共有結合されていてもいなくと
も重要であり、あるいは、対応するFKBPに対するそれらの結合親和性が失わ
れないように修飾されていてもいなくとも重要である。このようなモノマー化合
物は、オリゴマー化拮抗試薬、すなわち、類似のFK−506−タイプ化合物に
基づくオリゴマー化試薬に対する拮抗剤として使用することができる。好ましく
は、本発明に従うこれらを含む化合物およびオリゴマー類は、FKBP12に対
するFK506の親和性よりも少なくとも0.1%、好ましくは、少なくとも約
1%、さらに好ましくは、少なくとも約10%大きい親和性を有する、天然、ま
たは、好ましくは、突然変異によって生ずる、FKBP類と結合する。例えば、
以下のHolt et al.参照。
本発明のこれらおよびその他リガンドに対するレセプター領域は、構造基体、
部位指向またはランダム突然変異法によって得ることができる。我々は、C9お
よび/またはC10に修飾基を含有するFK506−タイプおよびFK−520
−タイプのリガンドに対するレセプター領域として、一以上のTyr26、Ph
e36、Asp37、Tyr82およびPhe99の代わりに、Val、Ala
、Gly、Metまたはその他の小さなアミノ酸を含有するFKBP12部分の
系統を考えている。
部位指向突然変異は、メガプライマー突然変異プロトコールを用いて行うこと
ができる[例えば、Sakar and Sommer,Bio Techniques 84(1990):404-407参照
]。cDNAシーケンスは、シーケナーゼキットで行われる。突然変異を生ずる
FKBP12類の発現は、多くのFKBP突然変異体がE.Coli菌株XA90で
発現されているので、E.Coli菌株XA90中のプラスミド(plasmid)pHN1+で
行うことができる。突然変異を生ずる蛋白質は、便宜上、DE52アニオン交換
樹脂上で分画によって精製され、続いて、他の箇所で記載したように、セファロ
ース上のサイズ排除によって精製される。例えば、Aldape et al,J.Biol.Che
m 267 23(1992):16029-32およびPark et al.,J.Biol Chem 267 5(1992):331
6-3324参照。結合定数は、二つの方法のうちの一つによって、容易に決定するこ
とができる。突然変異を生ずるFKBP類が十分なロータマーゼ(rotamase)活性
を維持する場合には、標準ロータマーゼ分析法を利用することができる。例えば
、Galat et al,Biochemistry 31(1992):2427-2434参照。これとは別に、
突然変異を生ずるFKBP12類は、我々が先にFKBP類およびシクロフィリ
ン類で使用した、LH20樹脂と放射性標識したT2−ジヒドロFK506およ
びT2−ジヒドロCsAとを用いる結合分析法に付すことができる。Bierer et
al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87 4(1993):555-69。(B) 酵母の2−ハイブリッドシステムを用いるバンプ−FK506類に対す るFKBP12中での代償性突然変異の選択
FKBP12を含めて、レセプター蛋白質またはレセプター領域を得るための
一つのアプローチは、強力な酵母の“2−ハイブリッド”または“相互作用トラ
ップ”システムである。2−ハイブリッドシステムは、相互に相互作用する蛋白
質を検出するために使用されている。転写活性領域に融合されたターゲット蛋白
質からなる“ベイト(bait)”融合蛋白質は、DNA結合領域に融合された強力な
“フック(hooks)”のcDNAライブラリーで共同発現される(co-expressed)。蛋
白質−蛋白質(ベイト−フック)相互作用は、その合成がDNA結合の合体と活
性領域とを必要とする、レポータージーン生成物の発現によって検出される。こ
こでいう酵母の2−ハイブリッドシステムは、本来、Elledgeと共同研究者によ
って開発された。Durfee et al,Genes & Development 74(1993): 555-69および
Harper et al,Cell 75 4(1993);805-816。
2−ハイブリッドシステムそれ自体は、小さな分子、有機リガンドを含むレセ
プター−リガンド相互作用に洞察を与えることができないので、我々は、(以下
に記載する)新しいFK1012誘発可能な転写活性システムを開発した。この
システムを用いると、小さな分子(例えば、本発明のFK506類もしくはFK
1012類またはFK506−タイプの分子)を調べることができるように、2
−ハイブリッドシステムを拡張することができる。最初に、FK506のC9お
よびC10を取り囲む部位に局所的に局在させた突然変異体で突然変異を生ずる
FKBP類(フック)のcDNAライブラリーを発生させる。ベイトに対しては
、二つの異なる方法を追及することができる。第1の方法は、FK506がFK
BP12と結合し、カルシニューリンと結合する複合表面を形成する能力を使用
する。かくして、シーケンス特異転写活性化剤は、DNA結合領域−突然変異体
FKBP12…バンプ−FK506…カルシニューリンA−活性化領域(ここで
、
…は、非共有結合相互作用を表す。)を構成する。第2の方法は、FK1012
類が二つのFKBPに同時に結合することのできる能力を使用する。FK101
2のHEDバージョンは、以下のアンサンブルに対してスクリーニングするため
に使用される。DNA−結合領域−突然変異体FKBP12…バンプ−FK50
6−正常なFK506…ワイルドタイプのFKBP−活性化領域。
1. ベイトとしてのカルシニューリンGa14活性化領域融合
Ga14活性化領域とカルシニューリンAサブユニット融合構造とを含有する
pSE1107の誘導体を構成した。提案された様式でベイトとして機能するそ
の能力は、カルシニューリンのFKBP−FK506結合部位をマップ(map out
)するための2−ハイブリッドシステムを用いる研究によって立証された。
2. ベイトとしてのhFKBP12−Ga14活性化領域融合:
hFKBP12cDNAは、開放読み取りフレーム(open reading frame)全体を
カバーするEcoRI−HindIIIフラグメントとして削除され、平滑末端
化され、平滑末端化されたpSE1107のXhoI部位に連結されて、全長に
わたるhFKBP−Ga14活性化領域蛋白質融合を生ずる。
3. 突然変異体hFKBP12cDNAライブラリー
hFKBP12は、EcoRIとHindIIIとで消化され、平滑化され、
NColで切断され、平滑化されたpAS1(Durfee et al.supra)にクローン化
することができる。このプラスミドは、さらに、NdeIで消化されて、pAS
1のポリリンカーシーケンスのNdeI部位とhFKBP12の5’末端との間
でNdeIフラグメントを脱離し、再度連結される。これは、hFKBP12−
Ga14DNA結合領域蛋白質融合を生ずる。hFKBPは、プライマー#11
206および#11210で再度増幅された。プライマーの表:
ついで、ポリメラーゼ連鎖反応によって限られた位置にランダム化されたhF
KBPの突然変異体シーケンスを含有する以下に掲示したプライマーを用いて、
突然変異体hFKBP12cDNAフラグメントを製造し、Ga14DNA結合領
域−hFKBP(NdeI/BamHI)構造に挿入した。
4. 酵母菌株
S,cerevisiae Y153は、ゲノムに結合された二つの選択可能な標識ジーン(h
is3/β−ガルクトシダーゼ)を担持し、Ga14プロモータによって駆動さ
れる(Durfee,supra)。
ベイトとしてのカルシニューリン−Ga14活性化領域の使用
FKBP12−FK506錯体は、高い親和性で、カルシニューリンタイプ2
B蛋白質ホスファターゼに結合する。我々は、2−ハイブリッドシステムで架橋
として機能させるためにC9−またはC10−バンプリガンドを使用するので、
代償性突然変異を含有するcDNAライブラリーよりのこれらFKBP類のみが
転写活性化剤を生成する。便宜上、各々、8,000個の突然変異体FKBP1
2類を含有する(プライマー表のプライマー11207〜11209を用いて)
、少なくとも3種の異なるライブラリーを製造することができる。FKBP12
−FK506構造を点検することによって、ランダム化された部位が選択され、
これは、その突然変異がバンプされたFK506類上のC9またはC10置換基
に逆らって結合することを可能とする残基のクラスターを示唆する。ついで、ラ
イブラリーは、C9−およびC10−バンプFK506類を用いて、個々に、ス
クリーニングされる。バンプ−FK506と代償性hFKBP12突然変異体と
の間の相互作用は、ホスト酵母のhisドロップアウト培地上で成長する能力と
β−ガラクトシダーゼジーンの発現とによって検出することができる。この選択
は、バンプFK506の存在に依存し、虚偽の陽性は、バンプFK506リガン
ドを満たすか、満たさないレプリカプレートで消去スクリーニングすることによ
って除くことができる。
ベイトとしてのhFKBP12−Ga14活性化領域の使用
hFKBP12突然変異を生ずるcDNAライブラリーをスクリーニングするた
めにカルシニューリンA−Ga14活性化領域を使用することは、FKBP12
上の代償性突然変異を同定する簡単な方法である。しかし、バンプFK506類
をhFKBP12と結合可能とする突然変異は、突然変異体FKBP12…バン
プFK506錯体とカルシニューリンとの間の相互作用を妨げる。ベイトとして
カルシニューリンを用いる最初のスクリーニングが失敗した場合、ワイルドタイ
プのhFKBP12−Ga14活性化領域が、代わりに、使用される。固有のF
K506−バンプFK506(図16)からなるFK1012HED試薬が合成
され、フックとして使用することが可能てある。FK1012のFK506部分
は、FKBP12−Ga14活性化領域と結合することができる。FK1012
のバンプFK506部分とFKBP12の代償性突然変異体との間の相互作用は
、
ホスト酵母をhisドロップアウト培地上で成長可能とし、β−ガラクトシダー
ゼを発現する。このように、選択は、hFKBP12突然変異体のバンプFK5
06と相互作用する能力にのみ基づく。虚偽の陽性を除くために、同様の消去ス
クリーニング法を使用することができる。
バンプ−FK506類の代償性hFKBP12突然変異体に対する結合親和性
を決定するために、先に検討したインビトロの結合分析法以外に、インビボ分析
法を使用することができる。酵母の2−ハイブリッドシステムにおいて、β−ga
l活性は、“ベイト(bait)”と“プレイ(prey)”との間の相互作用の度合いによ
って決定される。かくして、バンプFK506と代償性FKBP12突然変異体
との間の親和性は、異なるHED(固有のFK506−バンプFK506)濃度
でホスト酵母によって生成される対応するβ−ガラクトシダーゼ活性によって評
価することができる。
同様の方法を用いると、原型として低親和性代償性FKBP12突然変異体を
有する他のバンプ接触残基中に、さらにランダム化された突然変異を生ずるFK
BP12cDNAライブラリーを生成し、同様にスクリーニングすることができ
る。高親和性代償性FKBP突然変異に対するファージデイスプレイスクリーニング
バンプFK506に対するある種の高親和性hFKBP12突然変異体は、別
個の蛋白質領域で数個の組み合わせ点突然変異を含有する。適当な組み合わせ突
然変異を含有するライブラリーの寸法は、酵母の2−ハイブリッドシステムの容
量に対しては大きすぎる(例えば、>108突然変異)。全ての機能官能性蛋白
質を暴露するためのビヒクルとしてのバクテリオファージの使用は、大多数の突
然変異をスクリーニングする能力を著しく増大させる。例えば、Bass et al.,P
roteins: Structure,Function & Genetics 8 4(1990):309-14; McCaffery et a
l.,Nature 348 6301(1990): 552-4;および、Hoogenboom,Nucl Acid Res 19 15
(1991): 4133-7参照。所望の高親和性代償性突然変異体が酵母の2−ハイブリッ
ドシステムで同定できない場合には、大多数の組み合わせ突然変異は、キャリヤ
ーとしてのファージベクトルを有するhFKBP12上に形成することができる
。突然変異を生ずるhFKBP12融合ファージは、親和性マトリックスとして
の
バンプFK506−セファロースでスクリーニングすることができ、これは、我
々の独特のFK506−基体親和性マトリックスに類似した方法で合成すること
ができる。Fretz et al.,J.Am.Chem.Soc.113 4(1991):1409-1411。結合お
よびファージ増幅を繰り返し行うと、高親和性の代償性突然変異体を同定するこ
とができる。(C) “バンプ(bumped)(CsA)2類”の合成:MeVal(11)Cs Aの修飾
上記詳細に記載したように、我々は、二量化領域としてのシクロフィリンの使
用および細胞死信号伝達路のコンテキスト中でのHOD試薬としての(CsA)
2の使用の実現を示した。しかし、(CsA)2試薬の細胞活性をさらに最適化
するために、FK1012類で記載したのと類似の方法に従うのがよい。かくし
て、特に、試薬がそのターゲットを識別できることが望ましい用途に、修飾され
た(バンプ)CsA基体のオリゴマー化試薬を使用するのが好ましく、人工の蛋
白質を内因性シクロフィリン類より構成する。
本発明の修飾CsA誘導体の一つの類は、(a)NMeVal11が、NMe
Phe(置換もしくは非置換であってもよい)またはNMeThr(スレオニン
β−ヒドロキシル基が非置換もしくは置換であってもよい)で置換されているか
、あるいは、(b)NMeVal11のpro−Sメチル基が、炭素原子少なくと
も2個を有するか、好ましくは、3個以上を有する嵩高い基で置換されており、
これは、直鎖、分岐であってもよく、および/または、環式部分を含有していて
もよく、アルキル(エチル、もしくは、好ましくは、プロピル、t−ブチル等の
ブチル)、アリール、または、アリールアルキルであってもよい、CsA類縁体
である。これらの化合物としては、MeVal11の代わりに、NMeLeu、
NMeIIe、NMePhe、または、特に、非天然産のNMe[β−MePh
e]を含有するCsA類縁体が挙げられる。“(b)”CsA化合物は、式2:
[式中、Rは、上記検討した官能基を表す。]の化合物である。
本発明は、さらに、一以上のこのようなCsA類縁体を含有する、ホモダイマ
ーおよびヘテロダイマーならびにそれより高次のオリゴマー類を包含する。好ま
しくは、本発明に従いこれらを含む化合物およびオリゴマー類は、天然、もしく
は、好ましくは、突然変異体シクロフィリン蛋白質に、シクロフィリンに対する
CsAの親和性より少なくとも0.1%、好ましくは、少なくとも約1%、さら
に好ましくは、少なくとも10%大きい親和性で結合する。
CsAから出発して、修飾[MeVal11]CsA誘導体を製造するために、
2工程法を使用することもできる。第1の工程では、残基MeVal11が、マ
クロサイクルから除かれる。第2の工程では、選択されたアミノ酸が、(前者の
)MeVal11部位に導入され、鎖状のペプチドが環化される。この方法の利
点は、全合成と比較して、数個の修飾[MeVal11]CsA誘導体に容易にア
クセスすることができることである。合成スキームは、以下の通りである。
アミド結合を識別するために、アミノ基とMeBmt1からのヒドロキシル基
との間で、N,Oシフトを達成すると、IsoCsA[Ruegger et al.,Helv.C
him.Acta.59 4(1976): 1075-91]を与えた(上記スキーム参照)。反応は、メ
タンスルホン酸の存在で、THF中で行った[Oliyai et al.,Pharm Res 9 5(1
992):617-22]。ピリジンと無水酢酸とのワンポット処理法で、遊離のアミンを
アセチル基で保護した。N−アセチル保護IsoCsAの総収率は90%である
。ついで、エステルMeBmt1−MeVal11結合を、N−メチルアミド結
合の存在中、例えば、DIBALHを用いて、選択的に還元する。ついで、得ら
れるジオールをもう一つの酸誘導N,Oシフトで対応するジエステルに変換する
。これは、新たに形成されたエステルの水性塩基による加水分解を通して除去す
るために、N−アセチル基とMeVal11残基とを用意する。
遊離のアミノ基を保護した後、新たなアミノ酸残基を、例えば、ピブロップ(P
yBrop)のカップリング剤で導入する。鎖状ペプチドのDMAP[Alberg and Schr
eiber,Science 262 5131(1993):248-250]存在中でのBOPによる脱保護および
環化は、2の合成を完了させる。バンプCsA類のシクロフィリン類への結合は
、FK506類およびFK1012類に対して記載したのと同様の方法によって
測定することができる。シクロフィリンを代償性突然変異で一度同定すると、バ
ンプ(CsA)2HEDおよびHOD試薬は、先に検討した方法に従い合成する
ことができる。それら自体シクロフィリン蛋白質と1:2の化学量論比で結合す
ることのできるダイマーを形成するバンプCsA化合物が特に重要である。少な
くとも一つのこのようなCsAまたは修飾CsA部分を含有するホモダイマーお
よびそれより高次のホモオリゴマー類、ヘテロダイマーおよびそれより高次のヘ
テロオリゴマー類は、FK1012Aおよび(CsA)2に対して開発された方
法によってデザインされ、測定され、FK1012の研究に類似した方法でリン
カー素子を最適化する。
リガンド上に特に嵩高い基を収容することによって、我々の位置11CsA変
種(2)を結合する突然変異体シクロフィリン類を新たに製造することができる
。これらの代償性突然変異を有するシクロフィリン類は、FK1012の研究で
記載した構造基体部位指向およびランダム突然変異/スクリーニングプロトコー
ルを介して同定することができる。
上記結果より、本方法および組成物が多種多様な目的のための細胞の生産にお
いて非常な融通性を与えることは明らかである。本構造物を使用することによっ
て、治療目的に細胞を使用することが可能であり、この場合、細胞は、必要とさ
れるまで不活性なままであり、ついで、安全な薬剤を投与することによって活性
化される。細胞は、ホスト中で、多種多様の寿命を有することができるので、短
期間または長期間の保護を付与するために、慢性および急性の徴候を処置する機
会が存在する。また、特別な部位、例えば、解剖部位または官能部位に応じた細
胞を提供することができ、それら部位で、治療効果を生ずる。
多種多様な蛋白質の分泌を生ずる細胞を提供することができ、これは、不足分
を補ったり、望ましくない結果、例えば、破壊剤を失活させたり、限られた細胞
ポピュレーションを殺したりする細胞溶解細胞の活性化を抑制する機能を果たす
。ホスト中に限られた期間細胞を存在させることによって、細胞は、ホスト中の
細
胞の迅速な応答を生ずることのできる用量で薬剤を取り込み、容易に活性化する
ことができる。発現したキメラレセプターが細胞内に存在する細胞が提供され、
細胞表面上での異質蛋白質による免疫応答を回避することができる。さらに、細
胞内キメラレセプター蛋白質は、リガンドが結合する際に、有効な信号変換を生
じ、細胞外レセプター領域でのレセプター結合よりも明らかに有効である。キメ
ラ膜に結合したレセプターに結合する比較的単純な分子を使用し、重要な生成物
の発現を生じさせたり、生成物の発現を抑制したりすることによって、細胞治療
処置法を提供することができる。投与することのできる化合物は、安全であり、
種々の方法で投与することができ、極めて特異的な応答を確実に生じ、動的平衡
を損なわない。
本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特
許出願を、参考のために、特別、かつ、個々に指摘して、本明細書中に引用した
。
理解しやすくするために、本発明を図および実施例によって幾分詳細に説明し
たが、当業者であれば、本発明の請求の精神および範囲から逸脱することなく、
ある種の変形および変更をなすことができることは、本発明の教示に照らして容
易に理解できるであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 08/292,597
(32)優先日 1994年8月18日
(33)優先権主張国 米国(US)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),AU,CA,GB,JP,K
R,US
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 1種類またはそれ以上のリガンド結合ドメインおよび1種類またはそれ以 上の作用ドメインを含むキメラレスポンダータンパク質であって、 リガンドの存在下マルチマー化でき、リガンドの存在に応答して活性化される 発現制御要素の転写制御下に阻止遺伝子の転写を活性化でき、ここで阻止遺伝子 は選択された遺伝子へ方向付けられるアンチセンスメッセージまたはリボザイム 、選択されたタンパク質に対する中和抗体、選択されたタンパク質の優性陰性形 またはタンパク質Creをコードしているキメラレスポンダータンパク質。 2. 請求項1に記載のキメラレスポンダータンパク質をコードしているDNA 構築物。 3. 請求項2に記載のDNA構築物を含み且つ発現できる細胞。 4. リガンドの存在に応答して活性化される発現制御要素の転写制御下の阻止 遺伝子を含むDNA構築物をさらに含む請求項3に記載の細胞。 5. 阻止遺伝子を含むDNA構築物をさらに含む請求項4に記載の細胞であっ て、阻止遺伝子はその機能が選択された遺伝子の除去を導くタンパク質をコード している細胞。 6. 阻止遺伝子を含むDNA構築物をさらに含む請求項5に記載の細胞であっ て、阻止遺伝子はタンパク質Creをコードしている細胞。 7. Cre存在下、標的遺伝子の除去を可能にするloxP配列に隣接された 標的遺伝子をさらに含む請求項6に記載の細胞。 8. 阻止遺伝子を含むDNA構築物をさらに含む請求項4に記載の細胞であっ て、阻止遺伝子はアンチセンスメッセージをコードしている細胞。 9. 阻止遺伝子を含むDNA構築物をさらに含む請求項4に記載の細胞であっ て、阻止遺伝子は選択された遺伝子に方向付けられるリボザイムをコードしてい る細胞。 10.阻止遺伝子を含むDNA構築物をさらに含む請求項4に記載の細胞であっ て、阻止遺伝子は選択されたタンパク質に対して方向付けられる中和抗体残基を コードしている細胞。 11.阻止遺伝子を含むDNA構築物をさらに含む請求項4に記載の細胞であっ て、阻止遺伝子は選択されたタンパク質の優性陰性形をコードしている細胞。 12.少なくとも一つの請求項4に記載の細胞を含む生物体。 13.生物体がマウスである請求項12に記載の生物体。 14.Cre存在下、標的遺伝子の除去を可能にするloxP配列に隣接された 標的遺伝子をさらに含む請求項12に記載の生物体。 15.生物体がマウスである請求項14に記載の生物体。
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