TW201736394A - 人造轉錄因子之內體解糾纏 - Google Patents

Abstract

經由蛋白質轉導分域運送人造轉錄因子到細胞內對於開發新穎的治療有極大前景。但是習知的蛋白質轉導會有內體逃脫不佳以及後續人造轉錄因子蛋白質被內體降解的問題。其大部分原因是由於內體糾纏，膜結合蛋白質轉導分域限制該人造轉錄因子到內體膜，因而干擾運送到其他的次細胞位置。本發明係關於內體解糾纏，以及接續的內體逃脫增進，係藉由包入特定的內體蛋白酶切開部位到該人造轉錄因子蛋白質內以克服內體糾纏。

Description

人造轉錄因子之內體解糾纏

本發明係關於人造轉錄因子蛋白質，其設計成:藉由在此人造轉錄因子蛋白質引入特定的內體蛋白酶切開部位而利用增強的內體解糾纏有效率地運送到細胞的核隔室。

以蛋白質為主的療法由於其高專一性及多樣性，在解決醫藥需求及提供新的治療選擇方面十分有前景。但是，現有的以蛋白質為主的療法大大地受限於胞外的標靶，原因為細胞膜對於此種蛋白質接近胞內的治療標靶構成主要的阻隔。HIV衍生的TAT (SEQ ID NO: 1)蛋白質轉導分域(PTD) (Fawell, S., 1994,Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 664−668)以及其他此種肽的發現，對於治療性蛋白質接近胞內藥物標靶提供了希望。PTD是短肽，其促進附著於其的蛋白質或小分子等融合貨物運送通過細胞膜而進入細胞隔室。但是雖經近20年來的努力，目前仍無使用PTD到達胞內標靶的蛋白質為主的藥物。大部分的原因是在於:PTD媒介的運送對於將蛋白質遞送到所欲之正確的次細胞位置並非有效率，比如於人造轉錄因子的情形，運送到核隔室以調節基因表現之療法的情形為例。蛋白質轉導分域之無效率主要是起因於其作用模式。PTD藉由觸發胞吞作用或巨噬胞飲作用(macropinocytosis)而導致在細胞液形成含有融合PTD之蛋白質的胞吞或巨噬胞飲囊泡，藉以誘導細胞攝入。但是就拓樸學而言，在內體隔室“內”仍是“胞外”空間，所以嚴格來說，PTD-蛋白質的融合並未到達胞內空間。此外，在內溶酶體(endolysosomal)隔室含有許多的水解酵素，例如蛋白酶，會使PTD-蛋白質融合物快速地降解，從而限制如此的貨物蛋白質進一步在治療上利用的潛力。早期此現象是在蛋白質轉導的領域被了解，後來，則尋求所謂PTD-蛋白融合物之內體逃脫。已開發出各種用來克服內體陷入(endosomal entrapment)並增強PTD-蛋白融合物之內體逃脫的策略。此等策略包括:採用以下試劑以使內體隔室的滲透壓不安定，例如親內溶酶體試劑，例如氯奎寧(chloroquine)，所謂的質子海綿，例如多組胺酸標籤，或所謂的基因融合肽(fusogenic peptide)，例如HA2 (SEQ ID NO: 2)、GALA (SEQ ID NO: 3) 、 KALA (SEQ ID NO: 4) 、 GALAdelE3 (SEQ ID NO: 5)，或H5WYG (SEQ ID NO: 6)，此等能和內體膜交互作用並加以破壞。即便此等方法在PTD-蛋白質融合物之內體逃脫方面已有一些改善，在正確地將為PTD-蛋白質融合物之一部分的蛋白質正確地局部化到次細胞位置仍有不足。故對於PTD媒介之蛋白質遞送在治療用途仍有需求，例如達成使足量的人造轉錄因子進入到核隔室以供基因調節用途方面有所需求。

人造轉錄因子據認為是用於調節基因表現的有用工具(Sera T., 2009,Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526)。許多利用抑制或活化基因轉錄而影響基因表現的天然發生的轉錄因子都具有針對識別某一DNA序列之複雜的特定分域。此情形使得當想要修飾其專一性及標靶基因時，此等轉錄因子並非有吸引力的標靶。但是有某一類別的轉錄因子包括所謂的鋅指 (ZF)分域，其係可組合的，因而可供基因工程之用途。鋅指為短(30個胺基酸) DNA 結合模體，其幾乎獨立地靶向3個DNA鹼基對。若含有融合了數個此種鋅指的蛋白質則能識別更長的DNA序列。6元鋅指蛋白(ZFP)會識別18個鹼基對(bp)的DNA標靶，此標靶在整個人類基因體幾乎是獨一無二。起先據認為完全是獨立於文脈(context)，但更深入研究發現:針對鋅指有一些文脈的專一性(Klug A., 2010,Annu Rev Biochem 79, 213-231)。當鋅指的識別表面有某些胺基酸突變會改變ZF模組的結合專一性，造成針對大部分5’-GNN-3’、 5’-CNN-3’、5’-ANN-3’，及一些5’-TNN-3’ 密碼子有限定的ZF建成區塊(例如，稱為Barbas模組，參見Dreier B., Barbas C.F. 3^rd et al ., 2005,J Biol Chem 280, 35588-35597)。早期對人造轉錄因子的研究專注在基於組合預選的鋅指和已知的3 bp 標靶序列的組合的合理設計，了解到鋅指之某些文脈專一性後，迫使大鋅指庫的世代來臨，此庫係使用精密方法獲得，例如細菌或酵母菌單雜交(yeast one hybrid)、噬菌體呈現、隔室之核糖體呈現、或使用FACS 分析之活體內(in vivo) 選擇。

使用如此的人造鋅指蛋白能以高專一性地靶向位在人類基因體內的DNA 基因座。故此等鋅指蛋白是運送具有轉錄調節活性之蛋白質分域到特定的啟動子序列而調節關注基因之表現的理想工具。針對轉錄靜默的適當分域為Krueppel關連的分域(KRAB)作為N端(SEQ ID NO: 7)或C端 (SEQ ID NO: 8) KRAB分域、Sin3-交互作用分域(SID, SEQ ID NO: 9)，及ERF 抑制子分域(ERD, SEQ ID NO: 10)，基因轉錄活化則是經由單純皰疹病毒(herpes virus simplex) VP16 (SEQ ID NO: 11)或VP64 (VP16之四元重複，SEQ ID NO: 12)分域(Beerli R.R. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14628-14633)。其他據認為造成轉錄活化的分域有:CJ7 (SEQ ID NO: 13)、p65-TA1 (SEQ ID NO: 14), SAD (SEQ ID NO: 15) 、NF-1 (SEQ ID NO: 16), AP-2 (SEQ ID NO: 17) 、SP1-A (SEQ ID NO: 18) 、SP1-B (SEQ ID NO: 19) 、Oct-1 (SEQ ID NO: 20) 、Oct-2 (SEQ ID NO: 21) 、Oct-2_5x (SEQ ID NO: 22) 、MTF-1 (SEQ ID NO: 23), BTEB-2 (SEQ ID NO: 24) 及LKLF (SEQ ID NO: 25)。此外，由基因本體論(gene ontology GO) 0001071 (http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term_details?term=GO:0001071)定義的蛋白質之轉錄活化分域據認為會達成標靶蛋白質之轉錄調控。含有設計之鋅指蛋白與調控分域的融合蛋白質稱為人造轉錄因子。

包括會特定地靶向受體基因啟動子之融合於抑制性或活化性分域、核局部化序列及蛋白質轉導分域之多指鋅指之人造轉錄因子，及其使用在藉由結合特定效應子於如此的受體以調節的疾病的用途已有人公開(WO 2013/053719)。

許多已知的藥物標靶為受體分子，其藉由小分子藥物的作用而刺激或阻斷，常有相當多的靶外(off target)的活性。如此的受體，例如組織胺 H1受體或alpha- 及beta-腎上腺素受體，一般，是由基因本體論GO:0004888及GO:0004930定義的蛋白質。在以下的段落，將會介紹選擇作為以對應的本發明設計的人造轉錄因子靶向的成功例的一些設想的受體分子的背景資訊。

眼睛是一個精緻的器官，強烈地有賴於平衡和足夠的灌注以滿足其高需氧量。未能提供足夠的和穩定的氧供給會造成缺血再灌注損傷，導致神經膠質活化與神經元損害，如同在青光眼患者，即便眼內壓力正常或正常化，仍觀察到疾病進展。供血不足也會導致缺氧，造成新血管形成失控，以及進一步視網膜損傷的可能性，由糖尿病性視網膜病或濕性老年性黃斑變性顯然可見。眼組織血流灌注係受複雜的控制且取決於血壓、眼內壓以及調節血管直徑之局部因子。如此的局部因子例如:內皮素，其為有強血管收縮活性的短肽。內皮素轉變酵素會由位在血管壁的內皮細胞分泌的前驅體分子生產3種內皮素的同功型(ET-1、 ET-2，及ET-3)。已知針對成熟ET ，有2種同源的受體，ETRA 及ETRB。ETRA位在平滑肌細胞，形成血管壁並促進血管收縮，而ETRB主要在內皮細胞表現，並藉由促進釋放一氧化氮而作用於血管舒張，造成平滑肌放鬆。ETRA與ETRB屬於由7個穿膜螺旋受體偶合的一大類別的G-蛋白。ET結合於ETRA或ETRB會導致G蛋白活化，觸發細胞內鈣濃度增加，進而引起廣泛細胞反應。

作用於血管的內皮素系統在各種疾病的發病機制中起重要作用。另一方面，內皮素涉及調節血流供應，另一方面，是由缺氧誘導的一連串事件的主要參與者。例如，內皮素涉及血-腦障壁或血液-視網膜障壁的崩潰，並涉及新血管形成(neovascularisation)。內皮素進一步涉及神經退化，及調節痛覺的閾值，甚至口渴的感覺。

針對蛛網膜下腔或腦出血等許多疾病的治療，關注到全身性或局部性地影響內皮素系統。內皮素也會影響多發性硬化症的病程。內皮素促成(肺)高血壓，及動脈低血壓、心肌病、雷諾(Raynaud)症候群、變異型心絞痛及其他心血管疾病。內皮素涉及糖尿病性腎病和糖尿病性視網膜病。於眼睛，其更涉及青光眼神經退化、視網膜靜脈阻塞、巨細胞性關節炎、視網膜色素變性、老年黃斑有關變性、中心性漿液性脈絡膜視網膜病變、Morbus Leber、Susac症候群、眼內出血、視網膜膠質細胞增生以及其他一些病理情況。

細菌細胞壁成分，例如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，在各種疾病的發病拌演重要角色。體內有LPS存在會指引須要由免疫系統解決的細菌性感染。LPS是革蘭氏陰性菌的一般成分，LPS構成了會活化免疫系統的所謂的危險信號。LPS係由稱為類鐸受體(Toll- like receptor) 4 (TLR4)所識別，該受體為涉及識別涉及細菌或病毒感染的各種危險信號或病原相關分子樣式((PAMPs))的一大類鐸受體家族的成員。識別LPS作為危險信號係先天免疫的重要部分，但過度或長期刺激TLR4受體會關聯到許多和慢性發炎有關的病理狀況。舉例而言，例如各種肝病，例如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、慢性B型或C型肝炎病毒(HCV)感染、HIV-HCV合併感染。其他和TLR4傳信有關的疾病有: 類風濕性關節炎、動脈粥狀硬化、牛皮癬、克羅恩氏病、葡萄膜炎、隱形眼鏡相關性角膜炎和角膜發炎。此外，TLR4中介之傳信涉及癌症進展及對化療之抗性。

免疫球蛋白構造同型E (IgE)為後天免疫系統的一部分，涉及保護對抗感染及腫瘤轉形(neoplastic transformation)。IgE由位在肥胖細胞和嗜鹼細胞上的高親和力IgE受體(FcER1)結合。IgE結合於FcER1後，將此等的複合體經由稱為過敏原的特定抗原交聯會導致從肥胖細胞及嗜鹼細胞釋出各種因子，導致過敏應答。此等因子包括例如:組織胺、白三烯、各種細胞因子、溶菌酶、中性蛋白酶(tryptase)或β-己糖胺酶(β-hexosaminidase)。這些因子的釋放與過敏性疾病如過敏性鼻炎、哮喘、濕疹和過敏反應有關。

核受體是屬於配體活化的轉錄因子的蛋白超家族。其不像大部分其他的細胞受體，是以可溶性蛋白質位在細胞質或核質。核受體的配體是親脂分子，例如類固醇及甲狀腺激素、脂肪酸和膽酸、視黃酸、維生素D3和前列腺素(McEwan I.J.,Methods in Molecular Biology: The Nuclear Receptor Superfamily , 505, 3-17)。配體結合時，核受體會二元化，觸發結合於位在配體應答性基因啟動子內的特定的轉錄因子專一性DNA應答要素，因而活化或抑制基因表現。因為核受體負責中介許多廣效的荷爾蒙，例如類固醇及重要的代謝物的活性，核受體的缺失或失能會涉及許多疾病。

使用致效劑或拮抗劑調節核受體的活性已用於治療用途。使用皮質類固醇(corticosteroid)，如致效性地塞米松(dexamethasone)來調節糖皮質素(glucosteroid)受體(NR3C1)的功能是常見的用來影響發炎性疾病的臨床方法。核受體活性的另一種調節，可例舉口服避孕藥，其中，雌激素受體(ESR1)和孕酮受體的活化用來防止婦女的卵受精。在另一例，使用抗雄激素，如氟他胺(flutamide)或比卡魯胺(bicalutamide)阻斷雄激素受體(AR)，已證明對於治療AR依存性的前列腺癌有用。此外，通過阻斷雌激素的合成和雌激素之可得性來阻斷雌激素受體，是乳癌婦女或男子女性型乳房的男性的標準治療法。

基因突變位在許多遺傳性疾病的中心。一般，這樣的突變可以就其遺傳方式分類為顯性或隱性，具有顯性突變能夠導致疾病表型，即使只有一個的基因副本- 無論是母體或父系 - 受到影響，而對於一個隱性突變引起的疾病，須母親和父親兩者的基因副本突變。顯性突變能夠通過兩個一般機制之一導致疾病，即，顯性負作用或單倍不足(haploinsufficiency)。於顯性負突變，該基因產物獲得一個新的，有毒的異常功能，並導致疾病表型。例如多聚蛋白複合物之次單元，當突變時會妨礙該蛋白複合物之正常功能。以顯性方式遺傳的疾病也可以由單倍不足而導致，其中該致病突變使受影響的基因失活，因此降低了有效的基因劑量。在這些情況下，第二的完好的基因副本無法正常功能提供足夠的基因產物。估計有約12000個人類基因是單倍不足(Huanget al ., 2010,PLoS Genet. 6(10), e1001154)，其中約300個基因已知和疾病有關。

神經元的存活關鍵性地取決於粒線體功能，粒線體的失能是許多神經退化性疾病的中心(Karbowski M., Neutzner A., 2012,Acta Neuropathol 123(2), 157-71)。粒線體除了以ATP的形式提供能量之主要功能，其關鍵性地涉及鈣緩衝、多樣的分解代謝以及代謝過程，及程序性細胞死亡。粒線體的重要的功能反映在維持粒線體、防止粒線體功能衰竭、隨後的細胞死亡的許多細胞機制(Neutzner A.et al. , 2012,Semin Cell Dev Biol 23, 499-508)。這些過程的中心作用是維持有平衡的粒線體形態的動態粒線體網絡。此作用藉由所謂的粒線體形態決定因子(morphogen)達成，其在Drp1、Fis1、Mff、MiD49及MiD51的情形促進粒線體分裂，在Mfn1、Mfn2 及OPA1的情形則促進粒線體小管融合。平衡粒線體形態是必要的，因為已知粒線體喪失融合會促進ATP產生的損失和使細胞對凋亡刺激致敏，將此過程與神經退化疾病相關的神經元細胞死亡連結。

線粒體融合過程的主要角色是視神經萎縮(optic atrophy 1)1或OPA1。 OPA1是OPA1基因編碼的一個大的GTP酶，對於線粒體融合為必要。此外，OPA1在維持線粒體脊結構中起重要作用。已解明OPA1 基因表達的下調會因喪失融合導致線粒體破碎，並使細胞對於凋亡刺激敏化。OPA1 中之突變被鑑別為負責大約70%的Kjer的視神經病變或常染色體顯性萎縮(autosomal dominant atrophy ，ADOA)。在大多數人群中，ADOA以1 /10,000至3 /100,000之間之比例盛行，其特徵是從幼兒開始緩慢減少視力。從輕微到盲人的視力障礙是不可逆轉的，且係由視網膜神經節細胞的緩慢退化(RGCs)導致。在大多數情況下，是ADOA無症狀，但是在約15%的患者，會有眼外、神經肌肉表徵，如感音神經性聽力損失。直到現在，還沒有治療這種疾病的可用方法。有趣的是，某些OPA1 等位基因和正常眼壓青光眼相關，而非高眼壓性青光眼，再次凸顯OPA1對於維持正常的粒線體生理學的重要性。

綜上，將PTD中介的蛋白質遞送和人造轉錄因子的技術組合，受惠於標靶性、高專一性及基因表現的上調及下調，將能解決過多的醫療需求。但是PTD-蛋白質融合物之足量內體逃脫之此未解決之課題阻礙了可轉導的人造轉錄因子療法的有用性。

本發明係關於一種人造轉錄因子，其包含專一性地靶向基因啟動子的一多指之鋅指蛋白，該鋅指蛋白融合於一抑制性或活化性蛋白分域、核局部化序列、含1或多個蛋白質轉導分域之運送蛋白，及單一或數個，即2個以上的內體專一性蛋白酶切開位，其中，該單一內體專一性蛋白酶切開位和胺基酸序列 SEQ ID NO: 26不同。本發明係關於一種醫藥組成物，包含如此的人造轉錄因子，並關於一種哺乳動物，包含如此的人造轉錄因子，並關於一種表現載體，包含編碼為如此的人造轉錄因子的核酸。又，本發明係關於如此的人造轉錄因子之用途，係用於調節基因表現，並治療調節如此的基因表現為有益的疾病的用途。又，本發明係關於一種建構專一性標靶之治療劑的方法，關於一種專一性地將治療有效之蛋白質靶向於一對象之患病細胞之細胞質及/或細胞核及/或細胞質之胞器，並關於一種治療方法，包括對於須治療的對象投予治療有效的蛋白質。

於一特定具體例，該人造轉錄因子包含2或更多個內體專一性蛋白酶切開位(內體專一性蛋白酶切開位)，該內體專一性蛋白酶切開位會被不同的內體專一性蛋白酶切開。

於一特定具體例，該內體專一性蛋白酶切開位為細胞自溶酶(cathepsin)切開位，更具體而言，為一細胞自溶酶切開位，包含選自於由SEQ ID NO: 27至46構成之群組之胺基酸序列，更具體而言，為一細胞自溶酶切開位，包含選自於由SEQ ID NO: 29、30、31、32、35、36、40及41構成之群組之胺基酸序列，又更具體而言，為一細胞自溶酶切開位，包含選自於由SEQ ID NO: 31、35、36、40及41構成之群組之胺基酸序列。

於一更特定的具體例，該單一或2或更多個細胞自溶酶切開位中之一為細胞自溶酶D切開位。於另一具體例，該單一或2或更多個細胞自溶酶切開位中之一為細胞自溶酶K切開位。於又另一具體例，該單一或2或更多個細胞自溶酶切開位中之一為細胞自溶酶L切開位。於又另一具體例，該單一或2或更多個細胞自溶酶切開位中之一為細胞自溶酶S切開位。於又另一具體例，該單一或2或更多個細胞自溶酶切開位中之一為細胞自溶酶B切開位。

於另一特定具體例，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位各由至少2個不同的內體專一性蛋白酶切開。於另一特定具體例，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位各由至少2個不同的內體專一性蛋白酶切開，其中，該至少2個不同的內體專一性蛋白酶選自於由以下構成的群組： i) 細胞自溶酶B及D，ii) 細胞自溶酶B、D、K及S，iii) 細胞自溶酶K及S，iv) 細胞自溶酶D、K、L及S，v) 細胞自溶酶B、D、K、L及S，以及vi) 細胞自溶酶D與K。

該細胞自溶酶試管內 (in vitro ) 受質原腎活素(prorenin)含有的該細胞自溶酶切開位 CS1 (QPMKRLTLGN, SEQ ID NO: 26)為為細胞自溶酶B、D、K、L及S切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS2 (GKPILFFRLK, SEQ ID NO: 27)為細胞自溶酶B與K切開位。

本發明之另一細胞自溶酶切開位為切開位 CS3 (APISFFELG, SEQ ID NO: 28)。

該細胞自溶酶切開位CS4 (GRWPPMGLPWE, SEQ ID NO: 29)及CS5 (GRWHPMGAPWE, SEQ ID NO: 30)為細胞自溶酶K及S切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS6 (HPGGPQ, SEQ ID NO: 31)為細胞自溶酶D、K、L及S切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS7 (TFLGGPKPPQRVMFTEDLKLPASF, SEQ ID NO: 32)為細胞自溶酶B、D、K、L及S切開位。

本發明之另一細胞自溶酶切開位為切開位 CS8 (AVPAVTEGPIPEVLK, SEQ ID NO: 33)。

該細胞自溶酶切開位 CS9 (LSQDTVSVPCQSASSASALG, SEQ ID NO: 34) 為細胞自溶酶D與K切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS10 (KGKVFQEPLFYEAPRSVD, SEQ ID NO: 35) 為細胞自溶酶D、K、L及S切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS11 (ITYKSNPNRILPDSVD, SEQ ID NO: 36) 為細胞自溶酶D、K、L及S切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS12 (MSYREAASGNFSLF, SEQ ID NO: 37) 為細胞自溶酶K及S切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS13 (NALKFLASLLELPE, SEQ ID NO: 38) 為細胞自溶酶D切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS14 (AGLTTELFSPVDLN, SEQ ID NO: 39) 為細胞自溶酶D與K切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS15 (MQYFSHFIRSGNPN, SEQ ID NO: 40) 為細胞自溶酶D、K、L及S切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS16 (AQTKLLAVSGPFHY, SEQ ID NO: 41) 為細胞自溶酶B、D、K、L及S切開位。

該細胞自溶酶切開位 CS17 (YPYEFSRKVPTFAT, SEQ ID NO: 42) 為細胞自溶酶D與K切開位。

本發明之另一細胞自溶酶切開位為該細胞自溶酶D切開位 CS18 (TNSQLFRRAVLMGG, SEQ ID NO: 43)。

本發明之另一細胞自溶酶切開位為該細胞自溶酶B切開位 CS19 (KKKRKVGLEPGEKP, SEQ ID NO: 44) 。

本發明之另一細胞自溶酶切開位為該細胞自溶酶B切開位 CS20 (KRKVGLEPGE, SEQ ID NO: 45) 。

本發明之另一細胞自溶酶切開位為該細胞自溶酶B切開位 CS21 (RKVGLEPG, SEQ ID NO: 46) 。

於另一特定具體例，包含選自由SEQ ID NO: 27至SEQ ID NO: 46構成之群組之胺基酸序列的內體專一性蛋白酶切開位，係位在介於運送蛋白( 包含本發明之可轉導之人造轉錄因子一或更多蛋白質轉導分域)與一胺基酸序列(包含全部3個成分:調控分域、核局部化序列及多指之鋅指蛋白)之間。

於另一特定具體例，包含選自於由SEQ ID NO: 26至SEQ ID NO: 46構成之群組之胺基酸序列的至少2個內體專一性蛋白酶切開位之一，係位在介於運送蛋白( 包含本發明之可轉導之人造轉錄因子之1或更多個蛋白質轉導分域)與胺基酸序列(包含全部3成分:調控分域、 核局部化序列，與多指之鋅指蛋白)之間，且包含選自於由SEQ ID NO: 26 至SEQ ID NO: 46構成之群組之胺基酸序列的另一內體專一性蛋白酶切開位，位在介於核局部化序列與包含調控分域與該多指之鋅指蛋白之胺基酸序列之間，或位在介於調控分域與多指之鋅指蛋白間，及/或核局部化序列、調控分域、及/或多指之鋅指蛋白之內。

於另一特定具體例，包含選自於由SEQ ID NO: 26至SEQ ID NO: 46構成之群組之胺基酸序列的至少2個內體專一性蛋白酶切開位之一，係位在介於運送蛋白(包括本發明之可轉導之人造轉錄因子之1或多個蛋白質轉導分域)與胺基酸序列(包括核局部化序列、調控分域及多指之鋅指蛋白)之間。另一包含選自於由SEQ ID NO: 26至SEQ ID NO: 46構成之群組之胺基酸序列的內體專一性蛋白酶切開位，係位在介於調控分域、核局部化序列或該多指之鋅指蛋白之2個胺基酸序列之間，及/或位在核局部化序列、該調控分域及/或該多指之鋅指蛋白之內。

通常該運送蛋白包含1個蛋白質轉導分域。於一特定具體例，該運送蛋白包含2或更多個蛋白質轉導分域，宜為相同蛋白質轉導分域之2、3、4、或更多個副本，更佳為相同蛋白質轉導分域之4個副本。理想的蛋白質轉導分域為TAT 肽。

於本發明之一特定具體例，該人造轉錄因子更包含蛋白質標籤。通常，該蛋白質標籤選自於由以下構成的群組:由6至15個組胺酸組成之胺基酸序列、HA (流感血凝素) 抗原決定基標籤，及myc 抗原決定基標籤，更佳為選自於由以下構成的群組: 由6至15個組胺酸組成之胺基酸序列、SEQ ID NO: 343之 HA 抗原決定基標籤，及SEQ ID NO: 344之myc 抗原決定基標籤。又，該人造轉錄因子可包含2或更多連續的蛋白質標籤，例如1至5個連續的HA 抗原決定基標籤或1至5個連續的myc 抗原決定基標籤。尤其，該人造轉錄因子包含: 由6至15個組胺酸組成之胺基酸序列，較佳為6個組胺酸、HA 抗原決定基標籤，及3個連續的myc 抗原決定基標籤，更具體而言，包含: 由6至15個組胺酸組成之胺基酸序列，較佳為6個組胺酸、SEQ ID NO: 343之HA 抗原決定基標籤，及序列各為SEQ ID NO: 344之3個連續的myc 抗原決定基標籤 。較佳為，該蛋白質標籤位在該人造轉錄因子之N末端、介於該蛋白質轉導分域與內體專一性蛋白酶切開位之間，及/或位在C末端。於本發明之一特定具體例該人造轉錄因子更包含: 由6至15個組胺酸組成之胺基酸序列，宜在N末端。又更佳為，該胺基酸序列由8至15個組胺酸組成，更佳為10至15個組胺酸，最佳為6至10個組胺酸，尤其是6個組胺酸。

於一特定具體例，由本發明之該人造轉錄因子靶向的基因啟動子為一受體基因啟動子。

於一特定具體例，該受體基因啟動子為內皮素受體A (ETRA)啟動子 (SEQ ID NO: 47)。於另一特定具體例，本發明係關於如下之人造轉錄因子，其用在影響細胞對於內皮素之應答，用於降低或增加內皮素受體水平，並用於治療由內皮素調節之疾病，特別用於治療如此的眼疾。同樣，本發明係關於一種治療由內皮素調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之人造轉錄因子。

於另一特定具體例，該受體基因啟動子為內皮素受體B 啟動子 (SEQ ID NO: 48) 。於另一特定具體例，本發明係關於如下之人造轉錄因子，用於影響對於內皮素之細胞應答，用於降低或增加內皮素受體B水平，及用於治療由內皮素調節之疾病，尤關於用於治療如此之眼疾。同樣，本發明係關於一種治療由內皮素調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之人造轉錄因子。

於另一特定具體例，該受體基因啟動子為類鐸受體4 啟動子 (SEQ ID NO: 49)。於另一特定具體例，本發明係關於如下之人造轉錄因子，係用於影響對於脂多糖之細胞應答，用於降低或增加類鐸受體4水平，及用於治療由脂多糖調節之疾病，尤關於使用在治療眼疾。同樣，本發明係關於一種治療由脂多糖調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之人造轉錄因子。

於另一特定具體例，該受體基因啟動子為高親和性免疫球蛋白epsilon 受體次單元alpha (FcER1A ) 啟動子 (SEQ ID NO: 50)。於另一特定具體例，本發明係關於如下的人造轉錄因子，用於影響對於免疫球蛋白 E (IgE)之細胞應答，用於降低或增加高親和性IgE 受體水平，及用於治療由IgE調節之疾病，尤關於使用在治療眼疾。同樣，本發明係關於一種治療由IgE調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之人造轉錄因子。

於一特定具體例，該核受體基因之啟動子區為糖皮質素受體啟動子 (SEQ ID NO: 51)。於此特定具體例，本發明係關於靶向該糖皮質素受體啟動子之人造轉錄因子，用於影響對於糖皮質素之細胞應答，用於降低或增加糖皮質素受體水平，及用於治療由糖皮質素調節之疾病，尤關於使用在治療由糖皮質素調節之眼疾。同樣，本發明係關於一種治療由糖皮質素調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之靶向該糖皮質素受體啟動子之人造轉錄因子。

於另一特定具體例，該核受體基因之啟動子區為雄性素受體啟動子 (SEQ ID NO: 52)。於此特定具體例，本發明係關於靶向該雄性素受體啟動子之人造轉錄因子，用於影響對於睪固酮之細胞應答，用於降低或增加睪固酮受體水平，及用於治療由睪固酮調節之疾病。同樣，本發明係關於一種治療由睪固酮調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之靶向該雄性素受體啟動子之人造轉錄因子。

於另一特定具體例，該核受體基因之啟動子區為雌性素受體啟動子 (SEQ ID NO: 53)。於此特定具體例，本發明係關於靶向該雌性素受體啟動子之人造轉錄因子，用於影響對於雌性素之細胞應答，用於降低或增加雌性素受體水平，及用於治療由雌性素調節之疾病。同樣，本發明係關於一種治療由雌性素調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之靶向該雌性素受體啟動子之人造轉錄因子。

於另一特定具體例，本發明係關於經設計的哺乳動物細胞，能生產及分泌本發明之人造轉錄因子。

於另一特定具體例，本發明係關於將能生產及分泌本發明之人造轉錄因子的經設計的哺乳動物細胞包封於植入式裝置，該裝置能釋放人造轉錄因子到周圍組織。

於另一特定具體例，本發明係關於一種表現載體，其包含編碼為該本發明之人造轉錄因子之核酸，尤其DNA。理想的表現載體係基於pET 表現系 (Studier F.W., 1986,J Mol Biol. 189(1):113-30)或其他細菌表現系 (Chen R., 2011, Biotechnology Advances 30(5): 1102–1107)。特理想的表現載體將於實施例敘述。

又，本發明係關於如此的人造轉錄因子之用途，係用於增加從單倍不足基因啟動子之表現，並關於治療由如此的單倍不足基因啟動子造成或影響的疾病。同樣，本發明係關於一種治療由單倍不足造成或調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之靶向該單倍不足基因啟動子之人造轉錄因子。

於一特定具體例， 該單倍不足基因啟動子為OPA1 啟動子 (SEQ ID NO: 54)。於此特定具體例，本發明係關於一種人造轉錄因子，用於增強OPA1 基因之表現，並用於治療由於低OPA1水平導致或修飾之疾病，尤其使用於治療眼疾。於另一特定具體例，本發明係關於結合於OPA1_TS1 (SEQ ID NO: 193)、OPA1_TS2 (SEQ ID NO: 194)、或OPA1_TS3 (SEQ ID NO: 195)之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於一種治療由OPA1影響之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之人造轉錄因子。

本發明係關於增強的及細胞類型選擇性遞送人造轉錄因子到細胞之核隔室，並關於包含如此的人造轉錄因子的醫藥組成物。又，本發明係關於使用如此的人造轉錄因子來調節基因表現，例如(但不限於)受體基因之表現，例如膜結合或核受體基因或單倍不足基因，並關於治療由此基因編碼的蛋白質或其他基因產物所造成或調節的疾病，例如膜結合或核受體蛋白質，或由單倍不足基因產生的蛋白質之該基因之啟動子係由本發明之轉錄因子所靶向。例如(但不限於)受體蛋白質。本發明更關於一種建構專一性靶向之治療劑之方法，該治療劑係要遞送到患病細胞之該細胞質及/或該細胞核及/或該細胞質中之胞器。本發明更關於一種專一性地靶向治療上有效之蛋白質到一對象之患病細胞之該細胞質及/或該細胞核及/或細胞質中之胞器。本發明更關於治療方法，包含對於需要的對象投予治療上有效的蛋白質。

本發明之人造轉錄因子包含多指之鋅指蛋白，其專一性地靶向於一基因啟動子，該多指之鋅指蛋白融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、蛋白質轉導分域，及1或2或更多內體專一性蛋白酶切開位，此等係被選擇並放置在該人造轉錄因子內以促進細胞類型標靶之增強之內體逃脫。本發明之人造轉錄因子通常包含N-至C端排列之蛋白質轉導分域、 1或2或更多內體專一性蛋白酶切開位、抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列，及鋅指蛋白，其中，該抑制性或活化性蛋白質分域、該核局部化序列及該鋅指蛋白可為任意順序。故可設想人造轉錄因子從N-至C端包含列舉之蛋白質轉導分域、1或2或更多內體專一性蛋白酶切開位、核局部化序列、抑制性或活化性蛋白質分域及鋅指蛋白; 人造轉錄因子從N-至C端包含列舉之蛋白質轉導分域、1或2或更多內體專一性蛋白酶切開位、核局部化序列、鋅指蛋白及抑制性或活化性蛋白質分域; 人造轉錄因子從N-至C端包含列舉之蛋白質轉導分域、1或2或更多內體專一性蛋白酶切開位、鋅指蛋白、核局部化序列，及抑制性或活化性蛋白質分域; 人造轉錄因子從N-至C端包含列舉之蛋白質轉導分域、1或2或更多內體專一性蛋白酶切開位、鋅指蛋白、抑制性或活化性蛋白質分域，及核局部化序列; 人造轉錄因子從N-至C端包含列舉之蛋白質轉導分域、1或2或更多內體專一性蛋白酶切開位、抑制性或活化性蛋白質分域、鋅指蛋白，及核局部化序列; 人造轉錄因子從N-至C端包含列舉之蛋白質轉導分域、1或2或更多內體專一性蛋白酶切開位、抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列，及鋅指蛋白。本發明之人造轉錄因子較佳為從N-至C端包含列舉之蛋白質轉導分域、1或2或更多內體專一性蛋白酶切開位、抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列，及鋅指蛋白。

本發明之人造轉錄因子可更包含一內體專一性蛋白酶切開位，其位在或介在對於該人造轉錄因子之活性為必要之分域內或之間。於本發明之人造轉錄因子之分域之上下文，對於活性為必要的分域是該核局部化序列、該抑制性或活化性分域或該多指之鋅指蛋白。

本發明之人造轉錄因子可更包含連結子，該連結子介於該人造轉錄因子之分域間，亦即，連結子介於蛋白質轉導分域、該抑制性或活化性蛋白質分域、該核局部化序列及/或鋅指蛋白之間。故於一特定具體例，該本發明之人造轉錄因子可更包含內體專一性蛋白酶切開位，其位在將該抑制性或活化性蛋白質分域、該核局部化序列及/或該鋅指蛋白連接之連結子區。

本發明之多指之鋅指蛋白係一融合蛋白質，其係依Gonzalez B., 2010,Nat Protoc 5, 791-810之4至10個鋅指模組的融合蛋白質，或是8或更多個鋅指模組，例如8至12個鋅指模組之融合蛋白質，該等模組係選擇或設計成結合於關注基因之啟動子中之12至30個鹼基對的標靶位。

於本發明之上下文，"專一性地"靶向於基因啟動子之多指之鋅指蛋白意指該蛋白質對於其DNA標靶具有20 nM或更小的結合親和性。故“專一性地靶向於基因啟動子之多指之鋅指蛋白”係指對於基因啟動子以20 nM或小於20nM 之結合親和性結合的多指之鋅指蛋白。結合親和性宜使用例如實施例所述之酵素連結之DNA交互作用分析法(ELDIA)測定。

於本發明之上下文，啟動子定義為該技術領域周知之基因之調控區。於此上下文，基因定義為如該技術領域所周知，含有調控序列及結果為生產蛋白質或RNA之基因產物之序列。

於本發明之上下文 ，調控分域係指活化性分域或抑制性分域。

於本發明之上下文，活化性分域或活化性蛋白質分域在此可互換使用，係指該技術領域所知之蛋白質分域，其當藉由多指之鋅指蛋白而接觸啟動子時，會比起正常狀態，使由該啟動子控制之基因之基因產物增加。

於本發明之上下文，抑制性分域或抑制性蛋白質分域在此可互換使用，係指該技術領域所知之蛋白質分域，其當藉由多指之鋅指蛋白而接觸啟動子時，會比起正常狀態，使由該啟動子控制之基因之基因產物減少。

本發明之人造轉錄因子也可包含其他由基因本體論 GO:0001071定義之蛋白質之轉錄上有活性蛋白質分域，例如選自於由N端KRAB、C末端KRAB、SID 與 ERD分域構成之群組之抑制性分域，較佳為KRAB或SID。考慮之活化性蛋白質分域係由基因本體論 GO:0001071定義之蛋白質之轉錄上有活性之分域，例如選自於由VP16、VP64 (VP16之4元重複)、CJ7、p65-TA1、SAD、NF-1、AP-2、SP1-A、SP1-B、Oct-1、Oct-2、Oct2-5x、MTF-1、BTEB-2 及LKLF構成之群組之活化性分域，較佳為VP64及LKLF。

於本發明之上下文，該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分通常包含抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列，及鋅指蛋白。

於本發明之上下文，內體專一性蛋白酶切開位，係由位在內體隔室之蛋白酶識別並以序列專一性方式切開的肽序列。在此所指之“由內體蛋白酶識別”之內體專一性蛋白酶切開位係關於被該內體專一性蛋白酶識別及切開的內體專一性蛋白酶切開位。如此的蛋白酶如該技術領域周知，一般稱為細胞自溶酶。故，通常內體專一性蛋白酶為細胞自溶酶，更具體而言，為存在內體之細胞自溶酶，即存在內體隔室之細胞自溶酶。本發明的上下文使用的“切開位”，代表一胺基酸序列，較佳為約2與約15個胺基酸間的胺基酸序列，更佳為約2與約10個胺基酸間的胺基酸序列，更佳為約4與約8個胺基酸間的胺基酸序列，其係由該特定的內體專一性蛋白酶識別及切開。本案發明人意外地發現:內體專一性蛋白酶結合於內體專一性蛋白酶結合位，該結合位位在由內體專一性蛋白酶識別及切開的肽序列的上游或下游，較佳為上游約1至約50個胺基酸，更佳為約5至約20個胺基酸，又更佳為約5至約15個胺基酸，即，由內體專一性蛋白酶切開的內體專一性蛋白酶切開位之上游或下游，較佳為上游。通常該內體專一性蛋白酶結合位包含至多20個胺基酸之胺基酸序列，例如1-20個胺基酸，較佳為至多15個胺基酸之胺基酸序列，例如1-15個胺基酸，更佳為5至15個胺基酸之胺基酸序列。意外地，修飾，亦即取代、插入或刪除1或更多個胺基酸，較佳為取代位在內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列內之1或更多個胺基酸會改變，即，增加或減少該內體專一性蛋白酶切開位之切開敏感性。故藉由修飾該內體專一性蛋白酶結合位，比起未經修飾之內體專一性蛋白酶結合位，該切開位之切開敏感性可增加，即切開位會被該內體專一性蛋白酶更快及/或更完全地消化，或該切開位之切開敏感性可減少，即切開位會被該內體專一性蛋白酶更慢及/或更不完全地消化。在此使用之“切開敏感性”係指特定內體專一性蛋白酶對於特定切開位之消化程度或速度。

於本發明之上下文，蛋白質轉導分域定義為能運送蛋白質例如人造轉錄因子，藉由胞吞或巨胞飲細胞攝入，以跨越細胞膜進入胞內隔室之肽。考慮之蛋白質分域例如:HIV衍生之TAT 肽(SEQ ID NO: 1)、mT02 (SEQ ID NO: 55) 、 mT03 (SEQ ID NO: 56) 、R9 (SEQ ID NO: 57) 、ANTP (SEQ ID NO: 58) 等。蛋白質轉導分域較佳為選自HIV衍生之TAT 肽 (SEQ ID NO: 1)、mT02 (SEQ ID NO: 55)、mT03 (SEQ ID NO: 56)、 R9 (SEQ ID NO: 57)、 ANTP (SEQ ID NO: 58)構成之群組。更佳為該HIV衍生之TAT 肽，又更佳為該HIV衍生之TAT 肽 (SEQ ID NO: 1)。

於本發明之上下文，用語“約”定義成正負10%;例如約50，係指45至55。

於本發明之上下文，膜結合受體基因會導致產生蛋白質或蛋白質複合體之部分之蛋白質，該蛋白質能結合於胞外配體並將結合配體之信號跨細胞膜傳達，而導致細胞回應。於本發明之上下文，核受體基因會導致產生位在細胞核或細胞質之可溶性蛋白質，該蛋白質能結合於可穿透細胞之配體且能在結合其同源配體時，作為轉錄因子作用或作為調節基因表現之輔助轉錄因子。

於本發明之上下文，單倍不足基因定義為:於所有情況所有細胞類型，只在基因體有2個功能性基因存在時才產生足量基因產物的基因。故將單倍不足基因之1個基因副本突變會造成在所有或一些生理情形下，有些或所有生物之細胞的基因產物生產不足。

又，該本發明之人造轉錄因子包含核局部化序列 (NLS)。考量之核局部化序列 係藉由結合於基因本體論GO:0008139定義之蛋白質而提供入核之胺基酸模體，例如，包含離胺酸殘基，接著是離胺酸或精胺酸，接著是任意胺基酸，接著是離胺酸或精胺酸殘基的鹼性胺基酸的簇集(K-K/R-X-K/R 共通序列, Chelsky D.et al ., 1989,Mol Cell Biol 9, 2487-2492)或SV40 NLS (SEQ ID NO: 59)，較佳為SV40 NLS。

本發明之人造轉錄因子也考慮含有4元、5元、6元、7元、8元、9元或10元鋅指蛋白，其中，各鋅指模組可互換以促進對各核受體啟動子基因之標靶位之結合親和性，或改變該鋅指蛋白之免疫輪廓以改進寬容性。人造轉錄因子較佳為包含8元或更高等級之鋅指蛋白，更佳為8元、9元、10元、11元及12元鋅指蛋白，尤特別為8元鋅指蛋白。特佳為選自於由SEQ ID NO: 345 與 SEQ ID NO: 346構成之群組之8元鋅指蛋白。

本發明之人造轉錄因子之該分域可藉由柔性或剛性連結子連結，尤其是包括介於約1與約50個胺基酸，更佳為介於約1與約30個胺基酸，又更佳為介於約1與約15個胺基酸之柔性或剛性連結子。考慮之特定連結子係選自於由以下構成之群組:GGSGGS (SEQ ID NO: 60)、EAAAK (SEQ ID NO: 61)、EAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 62)、EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 63)、AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 64)、APAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 65)，及EAAAKEAAAKKYPNEAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 66)。也考慮單胺基酸之連結子，例如有小的側鏈的胺基酸，例如甘胺酸或丙胺酸。連結子也考慮有2至5個胺基酸者，較佳為2個胺基酸，例如天冬胺酸與異白胺酸。人造轉錄因子可更包含標記(marker)，例如容易檢測及處理之(但不限於)抗原決定基標籤。 於本發明之一特定具體例，該人造轉錄因子更包含選自於由以下構成之群組之連結子: G、A、DI、GGSGGS (SEQ ID NO: 60)、EAAAK (SEQ ID NO: 61)、EAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 62)、EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 63)、AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 64)、APAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 65)，及EAAAKEAAAKKYPNEAAAKEAAAK (SEQ ID NO: 66)，較佳為選自於由以下構成之群組:G、A、DI及 GGSGGS (SEQ ID NO: 60)，更佳為選自於G 與DI構成之群組。連結子宜位在之蛋白質轉導分域上游，更宜是直接在蛋白質轉導分域之胺基酸序列前，介於該內體專一性蛋白酶切開位與該調控分域之間及/，或該人造轉錄因子之該鋅指蛋白之下游，尤其直接在該鋅指蛋白之胺基酸序列後。

許多疾病的治療係基於調節細胞受體傳信。例如高血壓，其中β受體阻斷劑抑制beta-腎上腺素受體的功能;抑鬱症，其中，血清素攝入阻斷劑增加致效劑濃度，及血清素受體傳信;或青光眼，其中，前列腺素類似物活化前列腺素受體，因而降低眼內壓力。一般，係使用受體致效劑或拮抗劑之小分子以供治療用途的影響受體傳信。但是也可藉由直接調節受體蛋白質表現以影響細胞受體傳信。

可直接調節受體表現水平之致病處理，如下: 因充血性心臟衰竭所致之先天性心臟疾病之病患將受益於β-腎上腺素受體表達上調，原是因此受體在心肌的下調與手術後心臟衰竭的風險相關連。於帕金森氏症，以多巴胺藥物治療會壓抑多巴胺受體之可得性，因而將多巴胺受體上調將改善多巴胺藥物的效力。於癲癇，在海馬體之大麻素(cannabinoid)受體S表現不足涉及病因，大麻素受體的上調將是用於治療癲癇病患之可行療法。

針對由於受體蛋白質之單倍不足造成之遺傳疾病，例如類胰島素生長因子I 受體之單倍不足會造成生長遲緩等，將其餘的功能性受體基因活化將對於該病患有幫助。誘導病態性自體免疫及使其永久化和來自類鐸受體之不適當傳信有關。故將類鐸受體下調會破壞各種自體免疫疾病的惡性循環。於過敏性疾病，利用高親和性IgE 受體防止IgE-媒介的傳信對於管理過敏反應有用。於癌症，將生長因子受體下調或將胞外基質受體上調有助於防止腫瘤進展。

此等受體分子之中，尤其是來自稱為7穿膜(seven trasmembrane)之蛋白質或G蛋白質偶聯之受體(GPCR)蛋白質家族的蛋白質，特徵為有7個穿膜分域使該受體固定在細胞膜，及G蛋白質依存性傳信級聯。如此的蛋白質，例如針對內皮素之受體 A與B。其他受體蛋白質係經由單一穿膜區固定，例如針對脂多糖之受體、類鐸受體4，或各種細胞介素受體，例如IL-4 受體。其他由多元蛋白質複合體組成之受體，例如針對IgE 抗體之高親和性受體，其由alpha、beta及gamma鏈組成，或T細胞受體，其由alpha、beta、gamma、 delta、 epsilon及zeta鏈組成。故納入“受體分子”用語的蛋白質，係來自有非常不同的作用模式的不同的蛋白質家族。

本發明考慮之受體為由以下所編碼的人受體分子:HTR1A 、 HTR1B 、 HTR1D 、 HTR1E 、 HTR1F 、 HTR2A 、 HTR2B 、 HTR2C 、 HTR4 、 HTR5A 、 HTR5BP 、 HTR6 、 HTR7 、 CHRM1 、 CHRM2 、 CHRM3 、 CHRM4 、 CHRM5 、 ADORA1 、 ADORA2A 、 ADORA2B 、 ADORA3 、 ADRA1A 、 ADRA1B 、 ADRA1D 、 ADRA2A 、 ADRA2B 、 ADRA2C 、 ADRB1 、 ADRB2 、 ADRB3 、 AGTR1 、 AGTR2 、 APLNR 、 GPBAR1 、 NMBR 、 GRPR 、 BRS3 、 BDKRB1 、 BDKRB2 、 CNR1 、 CNR2 、 CCR1 、 CCR2 、 CCR3 、 CCR4 、 CCR5 、 CCR6 、 CCR7 、 CCR8 、 CCR9 、 CCR10 、 CXCR1 、 CXCR2 、 CXCR3 、 CXCR4 、 CXCR5 、 CXCR6 、 CXCR7 、 CX3CR1 、 XCR1 、 CCKAR 、 CCKBR 、 C3AR1 、 C5AR1 、 GPR77 、 DRD1 、 DRD2 、 DRD3 、 DRD4 、 DRD5 、 EDNRA 、 EDNRB 、 GPER 、 FPR1 、 FPR2 、 FPR3 、 FFAR1 、 FFAR2 、 FFAR3 、 GPR42 、 GALR1 、 GALR2 、 GALR3 、 GHSR 、 FSHR 、 LHCGR 、 TSHR 、 GNRHR 、 GNRHR2 、 HRH1 、 HRH2 、 HRH3 、 HRH4 、 HCAR1 、 HCAR2 、 HCAR3 、 KISS1R 、 LTB4R 、 LTB4R2 、 CYSLTR1 、 CYSLTR2 、 OXER1 、 FPR2 、 LPAR1 、 LPAR2 、 LPAR3 、 LPAR4 、 LPAR5 、 S1PR1 、 S1PR2 、 S1PR3 、 S1PR4 、 S1PR5 、 MCHR1 、 MCHR2 、 MC1R 、 MC2R 、 MC3R 、 MC4R 、 MC5R 、 MTNR1A 、 MTNR1B 、 MLNR 、 NMUR1 、 NMUR2 、 NPFFR1 、 NPFFR2 、 NPSR1 、 NPBWR1 、 NPBWR2 、 NPY1R 、 NPY2R 、 PPYR1 、 NPY5R 、 NPY6R 、 NTSR1 、 NTSR2 、 OPRD1 、 OPRK1 、 OPRM1 、 OPRL1 、 HCRTR1 、 HCRTR2 、 P2RY1 、 P2RY2 、 P2RY4 、 P2RY6 、 P2RY11 、 P2RY12 、 P2RY13 、 P2RY14 、 QRFPR 、 PTAFR 、 PROKR1 、 PROKR2 、 PRLHR 、 PTGDR 、 PTGDR2 、 PTGER1 、 PTGER2 、 PTGER3 、 PTGER4 、 PTGFR 、 PTGIR 、 TBXA2R 、 F2R 、 F2RL1 、 F2RL2 、 F2RL3 、 RXFP1 、 RXFP2 、 RXFP3 、 RXFP4 、 SSTR1 、 SSTR2 、 SSTR3 、 SSTR4 、 SSTR5 、 TACR1 、 TACR2 、 TACR3 、 TRHR 、 TAAR1 、 UTS2R 、 AVPR1A 、 AVPR1B 、 AVPR2 、 OXTR 、 CCRL2 、 CMKLR1 、 GPR1 、 GPR3 、 GPR4 、 GPR6 、 GPR12 、 GPR15 、 GPR17 、 GPR18 、 GPR19 、 GPR20 、 GPR21 、 GPR22 、 GPR25 、 GPR26 、 GPR27 、 GPR31 、 GPR32 、 GPR33 、 GPR34 、 GPR35 、 GPR37 、 GPR37L1 、 GPR39 、 GPR42 、 GPR45 、 GPR50 、 GPR52 、 GPR55 、 GPR61 、 GPR62 、 GPR63 、 GPR65 、 GPR68 、 GPR75 、 GPR78 、 GPR79 、 GPR82 、 GPR83 、 GPR84 、 GPR85 、 GPR87 、 GPR88 、 GPR101 、 GPR119 、 O3FAR1 、 GPR132 、 GPR135 、 GPR139 、 GPR141 、 GPR142 、 GPR146 、 GPR148 、 GPR149 、 GPR150 、 GPR151 、 GPR152 、 GPR153 、 GPR160 、 GPR161 、 GPR162 、 GPR171 、 GPR173 、 GPR174 、 GPR176 、 GPR182 、 GPR183 、 LGR4 、 LGR5 、 LGR6 、 LPAR6 、 MAS1 、 MAS1L 、 MRGPRD 、 MRGPRE 、 MRGPRF 、 MRGPRG 、 MRGPRX1 、 MRGPRX2 、 MRGPRX3 、 MRGPRX4 、 OPN3 、 OPN5 、 OXGR1 、 P2RY8 、 P2RY10 、 SUCNR1 、 TAAR2 、 TAAR3 、 TAAR4P 、 TAAR5 、 TAAR6 、 TAAR8 、 TAAR9 、 CCBP2 、 CCRL1 、 DARC 、 CALCR 、 CALCRL 、 CRHR1 、 CRHR2 、 GHRHR 、 GIPR 、 GLP1R 、 GLP2R 、 GCGR 、 SCTR 、 PTH1R 、 PTH2R 、 ADCYAP1R1 、 VIPR1 、 VIPR2 、 BAI1 、 BAI2 、 BAI3 、 CD97 、 CELSR1 、 CELSR2 、 CELSR3 、 ELTD1 、 EMR1 、 EMR2 、 EMR3 、 EMR4P 、 GPR56 、 GPR64 、 GPR97 、 GPR98 、 GPR110 、 GPR111 、 GPR112 、 GPR113 、 GPR114 、 GPR115 、 GPR116 、 GPR123 、 GPR124 、 GPR125 、 GPR126 、 GPR128 、 GPR133 、 GPR144 、 GPR157 、 LPHN1 、 LPHN2 、 LPHN3 、 CASR 、 GPRC6A 、 GABBR1 、 GABBR2 、 GRM1 、 GRM2 、 GRM3 、 GRM4 、 GRM5 、 GRM6 、 GRM7 、 GRM8 、 GPR156 、 GPR158 、 GPR179 、 GPRC5A 、 GPRC5B 、 GPRC5C 、 GPRC5D 、 TAS1R1 、 TAS1R2 、 TAS1R3 、 FZD1 、 FZD2 、 FZD3 、 FZD4 、 FZD5 、 FZD6 、 FZD7 、 FZD8 、 FZD9 、 FZD10 、 SMO 、 GPR107 、 GPR137 、 OR51E1 、 TPRA1 、 GPR143 、 THRA 、 THRB 、 RARA 、 RARB 、 RARG 、 PPARA 、 PPARD 、 PPARG 、 NR1D1 、 NR1D2 、 RORA 、 RORB 、 RORC 、 NR1H4 、 NR1H5P 、 NR1H3 、 NR1H2 、 VDR 、 NR1I2 、 NR1I3 、 HNF4A 、 HNF4G 、 RXRA 、 RXRB 、 RXRG 、 NR2C1 、 NR2C2 、 NR2E1 、 NR2E3 、 NR2F1 、 NR2F2 、 NR2F6 、 ESR1 、 ESR2 、 ESRRA 、 ESRRB 、 ESRRG 、 AR 、 NR3C1 、 NR3C2 、 PGR 、 NR4A1 、 NR4A2 、 NR4A3 、 NR5A1 、 NR5A2 、 NR6A1 、 NR0B1 、 NR0B2 、 HTR3A 、 HTR3B 、 HTR3C 、 HTR3D 、 HTR3E 、 GABRA1 、 GABRA2 、 GABRA3 、 GABRA4 、 GABRA5 、 GABRA6 、 GABRB1 、 GABRB2 、 GABRB3 、 GABRG1 、 GABRG2 、 GABRG3 、 GABRD 、 GABRE 、 GABRQ 、 GABRP 、 GABRR1 、 GABRR2 、 GABRR3 、 GLRA1 、 GLRA2 、 GLRA3 、 GLRA4 、 GLRB 、 GRIA1 、 GRIA2 、 GRIA3 、 GRIA4 、 GRID1 、 GRID2 、 GRIK1 、 GRIK2 、 GRIK3 、 GRIK4 、 GRIK5 、 GRIN1 、 GRIN2A 、 GRIN2B 、 GRIN2C 、 GRIN2D 、 GRIN3A 、 GRIN3B 、 CHRNA1 、 CHRNA2 、 CHRNA3 、 CHRNA4 、 CHRNA5 、 CHRNA6 、 CHRNA7 、 CHRNA9 、 CHRNA10 、 CHRNB1 、 CHRNB2 、 CHRNB3 、 CHRNB4 、 CHRNG 、 CHRND 、 CHRNE 、 P2RX1 、 P2RX2 、 P2RX3 、 P2RX4 、 P2RX5 、 P2RX6 、 P2RX7 、 ZACN 、 AGER 、 TLR1 、 TLR2 、 TLR3 、 TLR4 、 TLR5 、 TLR6 、 TLR7 、 TLR8 、 TLR9 、 TLR10 、 TLR11 、 LILRA1 、 LILRA2 、 LILRA3 、 LILRA4 、 LILRA5 、 LILRA6 、 LILRB1 、 LILRB2 、 LILRB3a ,LILRB4 、 LILRB5 ,LILRB6 、 LILRB7 、 EGFR 、 ERBB2 、 ERBB3 、 ERBB4 、 GFRa1 、 GFRa2 、 GFRa3 、 GFRa4 、 NPR1 、 NPR2 、 NPR3 、 NPR4 、 NGFR 、 NTRK1 、 NTRK2 、 NTRK3 、 EGFR 、 ERB2 、 ERB3 、 ERB4 、 INSR 、 IRR 、 IG1R 、 PDGFalpha 、 PDGFbeta 、 Fms 、 Kit 、 Flt3 、 FGFR1 、 FGFR2 、 FGFR3 、 FGFR4 、 BFR2 、 VGR1 、 VGR2 、 VGR3 、 EPA1 、 EPA2 、 EPA3 、 EPA4 、 EPA5 、 EPA7 、 EPA8 、 EPB1 、 EPB2 、 EPB3 、 EPB4 、 EPB6 、 TrkA 、 TrkB 、 TrkC 、 UFO 、 TYRO3 、 MERK 、 TIE1 、 TIE2 、 RON 、 MET 、 DDR1 、 DDR2 、 RET 、 ROS 、 LTK 、 ROR1 、 ROR2 、 RYK 、 PTK7 及 KIT 。

更考慮之受體為識別以下的人受體: 介白素 (IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37、IL-38、瘦素、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、腫瘤壞死因子α、淋巴毒素、催乳素、制瘤素M、白血病抑制性因子、集落刺激因子、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、免疫球蛋白E、人白血球抗原(HLA)A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、轉化生長因子α、轉化生長因子β、神經生長因子、腦源性神經營養因子、神經營養素-3、神經營養素-4、腎上腺髓質素、血管生成素、自分泌運動因子、骨成形蛋白、促紅血球生成素、成纖維細胞生長因子、神經膠質細胞系來源的神經營養因子、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、生長分化因子-9、肝細胞生長因子、肝細胞瘤來源的生長因子、胰島素樣生長因子、胰島素、遷移刺激因子、肌肉生長抑制素(myostatin)、血小板衍生的生長因子、血小板生成素、血管內皮細胞生長因子、胎盤生長因子、結締組織生長因子，和生長激素。

更考慮同源的非人基因編碼的受體，例如: 豬、馬、牛、貓、犬、或鼠基因，及同源的植物基因編碼的受體，例如在作物找到的基因，例如: 小麥、大麥、玉米、水稻、黑麥、燕麥、大豆、花生、向日葵、番紅花、亞麻、豆、煙草、或牲畜飼料用草，水果植物找到的基因，例如: 蘋果、梨、香蕉、柑橘類水果、葡萄等。

和大部分其他細胞受體為膜固定且含有跨膜蛋白質組成或由其組成為相反，核受體為可溶性蛋白質，在一多肽中包含配體結合與轉錄因子活性。核受體位在細胞質或是核質，在此當配體結合時即活化，二元體化並且成為活化的轉錄因子，可調控各種轉錄程式。和上述膜固定受體係在細胞外和其配體結合並將信號轉導跨越細胞膜至細胞內為不同，核受體係結合於親脂配體，該配體成跨越細胞膜而接近其同源的受體。此外，大部分受體倚賴錯綜複雜的信號放大機制直到達成所欲之細胞結果。而核受體則直接結合於配體並進入細胞應答。

許多疾病之治療係基於調節核受體傳信。例如:發炎處理，其中糖皮質素活化糖皮質素受體;前列腺癌，其中雄性素受體之拮抗劑具有有益的治療作用;或乳癌，其中，阻斷雌性素受體傳信證實有用。一般，係使用的核受體致效劑或拮抗劑小分子以影響治療用途之受體傳信。但是核受體傳信也可藉由直接調節核受體蛋白質表現以影響，且如此的調節係本發明之目的。

本發明考量之核受體係由以下的基因編碼的人核受體:AR 、 ESR1 、 ESR2 、 ESRRA 、 ESRRB 、 ESRRG 、 HNF4A 、 HNF4G 、 NR0B1 、 NR0B2 、 NR1D1 、 NR1D2 、 NR1H2 、 NR1H3 、 NR1H4 、 NR1I2 、 NR1I3 、 NR2C1 、 NR2C2 、 NR2E1 、 NR2E3 、 NR2F1 、 NR2F2 、 NR2F6 、 NR3C1 、 NR3C2 、 NR4A1 、 NR4A2 、 NR4A3 、 NR5A1 、 NR5A2 、 NR6A1 、 PGR 、 PPARA 、 PPARD 、 PPARG 、 RARA 、 RARB 、 RARG 、 RORA 、 RORB 、 RORC 、 RXRA 、 RXRB 、 RXRG 、 THRA 、 THRB 及VDR 。

更考慮非人核受體，例如由和已述人核受體基因相關的基因所編碼的豬、馬、牛、貓、犬、或鼠轉錄因子。

針對由於基因啟動子之單倍不足造成的遺傳疾病，例如胰島素樣生長因子I 受體單倍不足導致生長遲緩，或OPA1 單倍不足造成顯性視神經萎縮等。活化其餘的功能性基因副本對於該病患有益。本發明之人造轉錄因子能增加單倍不足基因啟動子的表現，故適於治療和單倍不足有關的疾病。

本發明考量以下的人基因及和單倍不足相關之各啟動子，及可使用本發明之人造轉錄因子治療的疾病:PRKAR1A 、 FBN1 、 ELN 、 TCOF1 、 ENG 、 GLI3 、 TCF4 、 GRN 、 NKX2-1 、 SOX10 、 SHOX 、 MC4R 、 GATA3 、 NKX2-5 、 TBX1 、 COL10A1 、 PAX6 、 LMX1B 、 BMPR2 、 PAX9 、 SOX9 、 TRPV4 、 SPAST 、 TBX5 、 TWIST1 、 EHMT1 、 FOXC2 、 TBX3 、 TNXB 、 DSP 、 OPA1 、 TRPS1 、 RUNX2 、 SCN1A 、 HOXD13 、 NSD1 、 SATB2 、 PRPF31 、 SOX2 、 COL6A1 、 APC 、 RAI1 、 PAX3 、 ZEB2 、 SLC40A1 、 AFG3L2 、 KCNQ2 、 SALL1 、 PPARG 、 GDF5 、 GCH1 、 MYH9 、 SALL4 、 PITX2 、 FOXF1 、 RAD51 、 PKD2 、 NFKBIA 、 MSX1 、 MSX2 、 COL3A1 、 SH3TC2 、 SBDS 、 SIX6 、 KRIT1 、 SLC33A1 、 PARK2 、 ABCA4 、 MYOC 、 PAFAH1B1 、 CDKN1C 、 CREBBP 、 FGF3 、 MYF6 、 MPZ 、 ITPR1 、 EDN3 、 C3 、 TYRP1 、 OFC12 、 ATM 、 FOXP2 、 PHOX2B 、 COCH 、 PITX1 、 EYA1 、 FOXC1 、 KLF1 、 GATA4 、 KIT 、 MYCN 、 COL5A1 、 RNF135 、 MIR146A 、 SI 、 NLRP12 、 NDUFA13 、 SPRED1 、 REEP1 、 SLC6A19 、 CHD7 、 NCF1 、 IRF6 、 RXFP2 、 ZMPSTE24 、 ATL1 、 EGLN1 、 NLRP3 、 KIF1B 、 BCMO1 、 SLC6A20 、 FOXL2 、 RTN4R 、 TSC1 、 WWOX 、 POLG2 、 LGI1 、 RECQL3 、 CNTNAP2 、 ATP2C1 、 KCNQ4 、 RPS19 、 ABCC6 、 STXBP1 、 NBN 、 ROBO1 、 ROR2 、 AGRP 、 STK11 、 KCNJ10 、 LHX4 、 FGF10 、 LIG4 、 ACVRL1 、 CAV3 、 GDF6 、 SMAD4 、 MYBPC3 、 IRS2 、 MSH6 、 ABCC8 、 GARS 、 CDKN2A 、 PORCN 、 PHEX 、 ARX 、 DMD 、 TPM1 、 NOTCH1 、 ABL1 、 RYR1 、 PTH1R 、 PAX8 、 PAX2 、 BRAF 、 MAPT 、 MC3R 、 KCNH2 、 LMNA 、 KRT5 、 SOD1 、 IGF1 、 MNX1 、 HNF1A 、 SLC2A1 、 GCK 、 GABRG2 、 FUS 、 DSG2 、 DCC 、 OFC1 、 CHRNA4 、 BRCA1 、 BDNF 、 BMP2 、 ATP2A2 、 ALX4 、 MITF 、 SIX3 、 SMARCB1 、 RANBP2 、 GDNF 、 MYC 、 ATP1A2 、 SLC6A4 、 FOXG1 、 IGF1R 、 FGFR1 及SERPINA6 。

並考慮在單倍不足啟動子控制下的非人基因,例如: 豬、馬、牛、貓、犬、或鼠基因，及其同源的人基因及植物基因，例如在作物找到的基因，例如: 小麥、大麥、玉米、水稻、黑麥、燕麥、大豆、花生、向日葵、番紅花、亞麻、豆、煙草、或牲畜飼料用草，在水果植物找到的基因，例如: 蘋果、梨、香蕉、柑橘類水果、葡萄等。

使用傳統的小分子方法鑑別藉由調節蛋白質活性作用的治療上有活性的小分子，大部分倚賴對於從不同的類別的物質的各種不同分子的密集及耗時的篩選程序，目前尚無法藉由小分子來調節基因表現。相對地，本發明之人造轉錄因子均屬於有高度定義的整體組合物的同物質類別。靶向2種非常不同的啟動子序列的2個6元鋅指蛋白系人造轉錄因子，仍有最小的胺基酸序列同一性，整體有85 %為類似3級結構，故可利用標準方法以快速及經濟方式產生(將於下述)。故本發明之人造轉錄因子以整體類似的組成物，一類別分子以特別高專一性地針對非常廣及多樣的標靶組合。對於所有生物製品，抗藥抗體的形式的免疫原性及相關連的免疫反應都必須考慮。但是由於鋅指模組之高保守性，使用本發明之人造轉錄因子之免疫反應將會是較小或不存在，或可藉由對於整體結構進行能消除免疫原性但同時仍保持標靶位結合之小改變以避免或更極小化。又，以聚乙二醇修飾本發明之人造轉錄因子據認為可減少免疫原性。

因人造轉錄因子適合專一性地作用在特定基因的啟動子區，使用人造轉錄因子，即便是非常相關的蛋白質，仍能選擇性地靶向。原因是即便是非常相關的蛋白質，啟動子區只有鬆散之保守性。受惠於依本發明之該人造轉錄因子之高選擇性，基於使用人造轉錄因子可個別找到的某些給定之蛋白質家族之成員的時常組織專一性表現，即便是藥物作用之組織專一性靶向亦可行。

但是因為人造轉錄因子是經由調節基因表現以作用，其必須存在細胞之核隔室以便有效作用。至今，人造轉錄因子之治療性遞送的方法係經由轉染質體DNA或採用病毒性載體。針對治療用途，質體轉染的效力低，而病毒性載體有特別高的免疫原性的可能，故限制其使用在某一治療之重複使用。故須要例如以蛋白質形式而非以核酸形式遞送人造轉錄因子的模式。經由蛋白質轉導分域之蛋白質運送

由蛋白質轉導分域(PTD)媒介之胞內遞送人造轉錄因子，是以新方式受惠於人造轉錄因子之高選擇性及多樣性的新方法(WO/2013/053719 A2)。蛋白質轉導分域係小肽，能夠跨越細胞膜障壁並將貨物蛋白質遞送到細胞內。如此的蛋白質轉導分域，例如HIV衍生之TAT 肽、mT02、mT03、R9、ANTP 等。細胞攝入模式可能是藉由內吞作用，且據顯示TAT肽當融合於貨物蛋白質時，能誘導細胞類型獨立的巨胞飲攝入(Wadia J.S.et al ., 2004,Nat Med 10, 310-315)。跨越細胞膜障壁且被攝入內體小泡是進入細胞的第1步，拓樸學上，該內體隔室內和細胞外是相同的。故，內體內的局部化不等同於細胞質或核質局部化。同樣地，藉由該內體隔室洩漏及/或一些調節膜完整性的貨物或PTD的固有性質，已遞送的蛋白質能某個程度從內體脫逃並到達其他真的胞內標靶。但是能成功逃脫該內體隔室並到達所望之次細胞隔室的蛋白質的量少且嚴重地阻礙治療性蛋白質的效用，原因是在作用位的有效劑量低於施用的劑量相當多。當該內體隔室成熟並和溶酶體隔室融合，內體的內容物會暴露於各種蛋白質，且低pH會導致PTD遞送的蛋白質水解。此現象在開發PTD，例如TAT 肽供作治療性蛋白質遞送的早期即已知，並定性為內體的捕集。已開發出2種策略來對付內體捕集並達成蛋白質轉導後更有效率的內體逃脫。兩策略均為了破壞內體膜，以將內容物暴露於內體，並使PTD遞送的蛋白質暴露於該細胞質。其中一策略係利用親內溶酶體試劑，例如氯奎寧(chloroquine)或所謂的質子海綿，例如多組胺酸標籤以干擾內體的滲透壓。滲透壓之破壞導致內體腫脹，造成內體破裂。第2種增進內體逃脫之策略是同時遞送對膜為活性的基因融合肽 TATHA2或其他的，例如GALA或KALA 肽。此等肽能從內部和內體膜交互作用，並導致膜破裂。事實上，能破壞內體膜之最好機制是增加已使用蛋白質轉導分域遞送之貨物蛋白質之內體逃脫。靶向 ETRA 或 FcER1A 啟動子之人造轉錄因子

使用經修飾的酵母菌單雜交篩選，從鋅指蛋白庫基於對於選自人ETRA 或人FcER1A 啟動子之18 bp DNA 標靶位的結合，選擇6元鋅指蛋白。此等鋅指蛋白被包括在融合蛋白質中，該融合蛋白質從N-至C端列舉:六組胺酸標籤、TAT 蛋白質轉導分域、HA標籤、非必要之細胞自溶酶切開位、SID 負調控分域、SV40 核局部化序列、基因啟動子專一性6元鋅指蛋白，及三重myc 抗原決定基標籤。使用ETRA 啟動子專一性鋅指蛋白，產生缺少有目的地導入的細胞自溶酶切開位的該人造轉錄因子 ATF1488 (SEQ ID NO: 67)及含該細胞自溶酶切開位之ATF1688 (SEQ ID NO: 68)。經由將該鋅指蛋白中的所有鋅配位的半胱胺酸殘基突變，會造成喪失DNA結合能力，產生基於ATF1488之無活性的人造轉錄因子 ATF1714 (SEQ ID NO: 69)，及基於ATF1688之ATF1806 (SEQ ID NO: 70) 。使用FcER1A 啟動子專一性鋅指蛋白，產生缺少有目的地導入的細胞自溶酶切開位的該人造轉錄因子 ATF1488 ATF1572 (SEQ ID NO: 71)及含該細胞自溶酶切開位之ATF1880 (SEQ ID NO: 72)。基於ATF1880，產生含有ATF2729 (SEQ ID NO: 196)之8元鋅指蛋白 ZFP-147Aocta (SEQ ID NO: 346) ，其也靶向人FcER1A 啟動子。藉由將ATF1880的全部鋅配位半胱胺酸殘基突變，產生無活性的ATF1881 (SEQ ID NO: 73)。基因融合肽無法增加人造轉錄因子活性

膜破壞劑不如文獻報告般的有效率促進遞送。事實上，當以TATHA2 共同遞送時，在針對增加經轉導之人造轉錄因子之活性方面並未觀察到助益(圖1)。於存在ATF1488或無活性的對照(ATF1714)的情形，以基因融合肽 TATHA2處理以可藉由抗ETRA 專一性 人造轉錄因子 ATF1488調控之啟動子控制下的表現發光酶報告子的細胞，或不處理以作為對照。如同預期，以ATF1488處理時，對比於對照，會抑制發光酶報告子之表現，額外以基因融合肽處理並不會增加ATF1488之活性。故利用TATHA2之活性進一步使內體破裂，不會增進人造轉錄因子活性。蛋白質轉導分域所致之內體解糾纏

利用仔細地對於可轉導之人造轉錄因子之細胞攝入進行顯微鏡分析有意外的發現。有趣地，發現在針對TAT-人造轉錄因子染色的細胞有大比例已破壞的內體小泡對於該細胞質開放，內體膜清楚地被TAT 融合蛋白質裝飾，此和即便內體膜破壞內，仍有相當量之已遞送蛋白質被內體糾纏為一致。此意外且未意料的發現可能可以用蛋白質轉導分域之固有性質解釋。蛋白質轉導分域已知會和細胞膜強力交互作用。此強力之膜交互作用是該機制之一部分，藉此，蛋白質內化，並因而觸發蛋白質遞送。在內化到內體後，此蛋白質轉導分域之強力膜交互作用，現在是在內體膜內發生，即便在內體小泡破壞後，仍可能真正地抑制重分配到其他的次細胞位置。因此， TAT融合的人造轉錄因子可能主要存在於該內體隔室及一些核位置。因此，雖然蛋白質轉導分域對於攝入細胞為必要，但若蛋白質轉導發生，蛋白質轉導分域會阻礙有效率的次細胞局部化。PTD於貨物進入該內體隔室後為非必要(dispensable)，且於運送人造轉錄因子到核之時點移除PTD，可能反轉和內體膜之糾纏。經由人造轉錄因子之標靶性、內體專一性之蛋白水解性 處理之內體解糾纏

進入該內體隔室後，將TAT 蛋白質轉導分域從該人造轉錄因子移除會於成功地將人造轉錄因子遞送到核隔室有益。專一性細胞自溶酶切開位包括在TAT 蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子蛋白質之轉錄活性部分之間係有益，且會增進到達所望標靶之鋅指蛋白之量。如圖2，進入該內體隔室後，利用內體專一性蛋白酶之活性移除PTD，將會導致活性的人造轉錄蛋白質從內體膜的內部解糾纏。於一旦內體膜被破壞，將能使該活性的人造轉錄因子有效率地從該內體隔室離開，並促進其有效率的入核，並容許所望的標靶基因調控。

依該目前技術領域之狀態，教示使用親內溶酶體試劑，例如氯奎寧(chloroquine)，或基因融合肽例如TATHA2，只是將蛋白質轉導分域從該人造轉錄因子分開，預期不會促進內體逃脫及增加核局部化，但是將細胞自溶酶切開位包括到人造轉錄因子之介於PTD與該蛋白質之轉錄活性部分間則會意外地且顯著地增加核局部化(圖3)。人造轉錄因子之入核，係用經ETRA 專一性ATF1488或含額外的內體專一性蛋白酶切開位的ETRA 專一性 ATF1688處理之HeLa細胞分析。 證實ATF1688之入核增加，比起經ATF1488處理之對照細胞，經ATF1688處理之細胞的平均核螢光強度高4倍。又，於發光酶報告子分析， ATF1688比起ATF1488有較高活性，對於發光酶活性之抑制較佳(圖4)。又，細胞自溶酶切開位包括在FcER1A 專一性人造轉錄因子中會造成在發光酶報告子分析的活性增加，其係於以缺少專一性細胞自溶酶位之ATF1572處理之報告子細胞，對比於含該細胞自溶酶位之ATF1880之報告子細胞的結果顯示(圖5)。細胞自溶酶之細胞類型及組織專一性表現

細胞自溶酶媒介之內體解糾纏增進關鍵性地取決於針對將對應的切開位導入到人造轉錄因子之該細胞自溶酶之表現。在標靶細胞類型中之如此之細胞自溶酶表現不足時，將會防止內體解糾纏增進及核局部化增加。

故分析所望之標靶細胞類型中之細胞自溶酶表現，對於預測成功的內體解糾纏為必要。事實上，已知配對於給定標靶細胞類型之該細胞自溶酶，能供在設計用於增進內體解糾纏之可轉導之人造轉錄因子時採用適當細胞自溶酶切開位。如圖6，不同的細胞株，不同的細胞自溶酶表現水平不同，細胞自溶酶活性亦是如此。為了決定在不同的細胞類型中之不同細胞自溶酶之表現，決定視網膜色素上皮細胞(ARPE19)、人腦膜細胞 (Ben-Men-I)、人角質細胞(HaCat)、人胚胎腎細胞 (HEK293)、於正常或合成培養基生長之HeLa細胞、人內皮細胞(HMEC-1)、人星狀細胞、人初代角質細胞、人初代纖維母細胞、人外被細胞、人子宮平滑肌細胞 (hUtSMCs)，及人神經元樣細胞(SH-SY5Y)中之細胞自溶酶B、D、F、G、H、K、L及S 之mRNA水平，對比於GAPDH作為對照。有趣地， 並非所有細胞自溶酶均以類似水平表現，當和內務基因GAPDH對照，在某些細胞類型，細胞自溶酶B、H及 K可到達至多6 %之GAPDH表現水平，而於其他細胞自溶酶，例如F、G、L、及S，表現水平在GAPDH表現水平之1 %以下。有趣地，細胞自溶酶D可到達至多60 %之GAPDH表現水平。細胞自溶酶之平均表現水平有相當大的不同，細胞自溶酶F、G、L、S為低量，細胞自溶酶B、H及K為中量，細胞自溶酶D為高量，在不同細胞類型之間，細胞自溶酶表現水平也有相當大的不同。

基於此等數據及作為人平滑肌細胞之內體解糾纏之一例，包括對於細胞自溶酶B、D與K 消化為敏感之切開位優於對於細胞自溶酶G 為敏感的切開位。作為在人平滑肌細胞之內體解糾纏之另一例，包括對於細胞自溶酶B、D、  K及I敏感之切開位較理想，於此等例，在平滑肌細胞化達成增強的內體解糾纏。細胞自溶酶在眼睛組織之表現

在培養細胞之細胞自溶酶表現輪廓已有助於決定用於包括在人造轉錄因子以增強內體解糾纏之適當細胞自溶酶切開位，定義在標靶組織之有潛力的標靶細胞的細胞自溶酶表現對於合理地設計人造轉錄因子以供最大化及細胞類型專一性內體解糾纏係為重要。有趣地，於玻璃體注射後分析豬視網膜中之ATF1688局部化，顯示此種人造轉錄因子特殊的核易位進入神經視網膜之細胞，例如光受體或視網膜神經節細胞。但是ATF1688只有極少核易位被發現在視網膜血管之平滑肌細胞，其係針對此ETRA專一性人造轉錄因子之潛在標靶細胞。 ATF1688之此不同的藥動學輪廓可能歸因於細胞自溶酶在視網膜的不同細胞類型的差別表現，即內體解糾纏關鍵地取決於細胞之該細胞自溶酶存貨。

為了合理設計有組織專一性內體解糾纏之人造轉錄因子並改善ATF1688 在視網膜血管之平滑肌細胞之內體解糾纏，決定眼睛組織的該細胞自溶酶表現樣式。為此並使用特定抗體，決定人(表1)及非洲綠猴(表2)中的細胞自溶酶B、D、E、F、G、H、K、L及S的表現。分析細胞自溶酶在此等組織的表現發現:細胞自溶酶在視網膜血管之平滑肌細胞 及視網膜之其他細胞類型的表現有複雜的樣式。表 1: 藉由以特定的抗細胞自溶酶抗體將眼組織染色以評估細胞自溶酶 B 、 D 、 E 、 F 、 G 、 H 、 K 、 L 及 S 在人眼的血管的平滑肌細胞的表現 – :未表現; n.d.:未檢出

由有經驗的病理學家判斷:達到給定的細胞自溶酶之最高免疫反應性之至少20%之細胞自溶酶表現分級為高免疫反應性，不然細胞自溶酶表現分級為低。表 2: 藉由以特定的抗細胞自溶酶抗體將眼組織染色以評估細胞自溶酶 B 、 D 、 F 、 K 及 L 在 Chlorocebus sabaeus ( 非洲綠猴 ) 眼的血管的平滑肌細胞 (SMC ) 的表現 – :無表現; n.d.:未檢出

由有經驗的病理學家判斷:達到給定的細胞自溶酶之最高免疫反應性之至少20%之細胞自溶酶表現分級為高免疫反應性，不然細胞自溶酶表現分級為低。 於一特定具體例，本發明之人造轉錄因子靶向於人眼的血管的平滑肌細胞，即施用於人眼的血管的平滑肌細胞，其中，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位係藉由選自於由細胞自溶酶B、D、K及I構成之群組切開，更佳為藉由選自於由B、D與K構成之群組切開。

於特定具體例，本發明之人造轉錄因子包含單一或2或更多內體專一性蛋白酶切開位，其係依該內體專一性蛋白酶在該人造轉錄因子之標靶細胞類型中之豐度來選擇。“該內體專一性蛋白酶在該標靶細胞類型之豐度”在此係指內體專一性蛋白酶之豐度，其在標靶細胞類型表現之表現水平係:達到例如表 1及實施例測量的人眼的視網膜中央動脈的平滑肌細胞中，針對細胞自溶酶D之至少20%之免疫反應性的免疫反應性。改變人造轉錄因子向細胞自溶酶切開之敏感性藉以用標靶細胞依存性方式最適化內體解糾纏

藉由包括不同的細胞自溶酶切開位以調節人造轉錄因子向細胞自溶酶切開之敏感性，係指調節內體解糾纏，並進而入核到預定之標靶細胞類型。因為各種標靶細胞類型包括不同的細胞自溶酶存貨，納入於標靶細胞存在的細胞自溶酶識別之細胞自溶酶敏感性位將會促進內體解糾纏，而納入和該標靶細胞之特定細胞自溶酶存貨不相容的切開位將不會支援解糾纏。

大部分細胞自溶酶針對其內肽酶活性顯示一些序列專一性，在本文獻敘述針對不同細胞自溶酶的一些切開位及各種共通序列。但是定義供包含到本發明之人造轉錄因子以達成增強之內體解糾纏，特別是達成細胞類型專一性核轉導的有用切開位並非不重要。細胞自溶酶位嵌入在該人造轉錄因子中的文脈對於效力可能是重要的，藉此此等位置被各種細胞自溶酶切開。因此，須在人造轉錄因子之上下文定義有潛力的肽序列對於促進內體解糾纏之細胞自溶酶敏感性。為此，將ATF1688中之該細胞自溶酶-敏感性位 (CS1)更換成有潛力的切開位 (CS2-CS18，見表 3)，將獲得之人造轉錄因子和純化的細胞自溶酶B、D、K、L及S於試管內一起培育。以西方墨點法分析 該人造轉錄因子切開產物顯示該改變的細胞自溶酶位被不同的細胞自溶酶差別地識別並消化(切開)(表 4)。表 3 : 列出有潛力的切開位 (CS) 的名稱及胺基酸序列，及含此等序列的 ATF1688 為主的 ETRA 專一性 人造轉錄因子的名稱 表 4 : 本發明之人造轉錄因子之上下文中不同的有潛力的細胞自溶酶切開位對於以細胞自溶酶 B 、 D 、 K 、 L 及 S 進行試管內 (in vitro ) 消化之敏感性

有潛力的切開位對於特定細胞自溶酶之敏感性分級為低、中及高。不考慮小於26 kDa之標靶外切開產物。藉由預定細胞自溶酶在所望標靶位切開人造轉錄因子者，當峰部介於最大峰部高之約1與5%間時評為低，當峰部介於最大峰部的5以上與20%以下之間時評為中，當峰部介於最大峰部的20%以上時評為高。

造成有功能人造轉錄因子解糾纏之有生產性的切開會產生大小為26 kDa以上的C端切開產物。此等切開產物包括調控SID分域、該核局部化序列及DNA結合鋅指蛋白分域，且構成有活性的人造轉錄因子，即該人造轉錄因子之轉錄上有活性的部分。如此的切開產物可藉由將 ATF1688以細胞自溶酶B、D、K、L及S消化，將ATF2403以細胞自溶酶B與K消化，將ATF2405以細胞自溶酶K及S消化，將ATF2406以細胞自溶酶K及S消化，將ATF2407以細胞自溶酶D、K、L及S消化後檢測。又如此的切開產物可藉由將ATF2443以細胞自溶酶B、D、K、L及S消化，將ATF2445以細胞自溶酶D與K消化，將ATF2446與ATF 2447以細胞自溶酶D、K、L及S消化後檢測。也針對將ATF2448以細胞自溶酶K及S消化，將ATF2449以細胞自溶酶D消化，將ATF2450以細胞自溶酶D與K消化，將ATF2451以細胞自溶酶D、K、L及S消化，將ATF2452以B、D、K、L、S消化，將ATF2453以細胞自溶酶D與K消化，將ATF2454以細胞自溶酶D消化，來檢測有生產性的切開事件(表 4)。但是並非全部細胞自溶酶位藉由預定之細胞自溶酶以相同效率被切開。進一步分析人造轉錄因子消化，發現: 細胞自溶酶針對某些切開位有優先性。細胞自溶酶B對於CS1、CS2、CS7、及CS16顯示中活性，細胞自溶酶D對於CS1、CS7、CS9、CS10、CS11、 CS13、CS15、CS16及CS17顯示高活性，對於CS6 及CS14顯示中活性 。細胞自溶酶K對於CS1、CS6、CS7、CS11、CS15及CS16顯示高活性，對於CS2、CS4、CS5、CS9、CS10、CS12、CS14及CS17顯示中活性。細胞自溶酶L對於CS7及CS16顯示高活性，對於CS1、CS6、CS10、CS11及CS15顯示中活性。細胞自溶酶S對於CS1、CS6、 CS7及C16顯示高活性，對於CS4、CS5、CS10、CS11、CS12及CS15顯示中活性。有些在標靶外位處理受測人造轉錄因子之細胞自溶酶，可能會遮蔽所望切開產物之檢測。此特別針對以下情事為真:當以細胞自溶酶B消化可能導致低估某些人造轉錄因子對於細胞自溶酶B 之敏感性。在病理過程期間改變的細胞自溶酶表現

本發明之可轉導之人造轉錄因子對於治療病理狀態為有用。為此，如此人造轉錄因子必須到達涉及如此的病理過程的標靶細胞的核隔室。對於多數疾病，如此的標靶細胞在體內的此標靶細胞的整個群體只佔一小部分。在此上下文使用的標靶細胞的用語係用在生物學方面對細胞的一般分類的細胞類型，例如視網膜血管壁之平滑肌細胞及大主動脈壁之平滑肌細胞為同一細胞類型，即在此上下文使用的標靶細胞的用語係用在細胞生物學方面對細胞的一般分類的細胞類型，例如視網膜血管壁之平滑肌細胞與大主動脈壁之平滑肌細胞為同一細胞類型。故希望優先將治療性人造轉錄因子運送到標靶細胞如涉及病理過程之患病細胞之核隔室，以藉由不影響未涉及疾病過程之標靶細胞群體之基因表現以極小化副作用。有趣地，細胞自溶酶表現水平受病理情形影響，在涉及疾病過程的細胞群體中之各種細胞自溶酶係上調。於本發明之上下文，患病細胞係指有如下特定情形的細胞:(A)相較於正常或健康細胞之生理狀態有所改變，包括但不限於改變基因表現，及(B)為病理生理機制之一部分，位在受疾病狀態影響或貢獻於疾病狀態之組織。又，以生物學觀點對於細胞進行一般分類時，為相同細胞之細胞中的細胞自溶酶表現水平因其位置及生理狀況而有不同; 例如視網膜血管壁之平滑肌細胞和胎盤血管之平滑肌細胞有不同的細胞自溶酶表現樣式，即在細胞生物學觀點為相同細胞類型之細胞中的細胞自溶酶表現水平因其因其位置及生理狀況而有不同; 例如視網膜血管壁之平滑肌細胞和胎盤血管之平滑肌細胞有不同的細胞自溶酶表現樣式。因細胞自溶酶媒介之內體解糾纏為成功遞送治療性人造轉錄因子之主要因子，調適該人造轉錄因子之內體解糾纏是優先靶向患病細胞群體的一種方法。例如因應缺氧條件而增加之細胞自溶酶L表現可容許在缺氧區之細胞內的細胞自溶酶L-敏感性人造轉錄因子成功內體解糾纏，而在含氧正常區的相對低的細胞自溶酶L表現則較不容許內體解糾纏。故在細胞生物學觀點上相同的細胞間依據位置、生理及病理狀態調整人造轉錄因子對於不同的細胞自溶酶表現水平之不同之細胞自溶酶敏感性，可達成相對於未涉及該疾病之細胞，對於和疾病過程有關之細胞中的如此的治療性蛋白質的更有效率的內體解糾纏。因為未涉及疾病過程的細胞相較於直接涉及病理過程的細胞，會接受到相對較低劑量的有效人造轉錄因子，故此靶向的內體解糾纏可極小化副作用。改變人造轉錄因子之細胞自溶酶敏感性會影響運送到細胞之核隔室並影響在發光酶報告子分析之活性

為了評估有潛力的細胞自溶酶切開位於內體解糾纏之影響，決定不同的ATF1688 變異體之核易位(表 3)及其在發光酶報告子分析之活性。如表5，將包括不同的細胞自溶酶切開位之ATF1688 變異體轉導到HEK293細胞會導致不同程度的核易位，含細胞自溶酶切開位 CS18之ATF2454 為1 %，含細胞自溶酶切開位 CS15之ATF2451為34 %。有趣地，低核易位會造成此等人造轉錄因子之活性較低，增加之核易位則會有較高活性。表 5: 含有各種有潛力的細胞自溶酶切開位之 ATF1688 變異體之核易位與活性

人造轉錄因子之核易位評估，係於轉導進入HEK293細胞後，採用檢測在非常C端之3xmyc 抗原決定基標籤之抗-myc 抗體之免疫螢光分析實施。ATF1688 變異體之活性，係以相對於依據HEK293細胞之發光酶報告子分析測得之ATF1806之ATF1688活性之百分比表達。人造轉錄因子之細胞自溶酶敏感性與標靶細胞細胞自溶酶存貨決定入核之效率

內體解糾纏取決於該人造轉錄因子本身之該細胞自溶酶敏感性及該標靶細胞之該細胞自溶酶存貨。故就核易位而言之人造轉錄因子解糾纏，當細胞自溶酶敏感性與細胞自溶酶存貨重疊時會獲得較佳結果。為此，將帶有不同的細胞自溶酶敏感性之不同的人造轉錄因子(表 3)轉導到人星狀細胞、HEK293及HeLa細胞內，並分析核易位。確實觀察到人造轉錄因子之差別易位(圖7)。ATF1688、ATF2443及ATF2445，在人星狀細胞(HAC)相較於HEK239與HeLa細胞顯示有較高的平均核局部化，而ATF2446之核易位在此等3種細胞類型為可匹敵。ATF1688、ATF2443、ATF2446及ATF2450與HeLa細胞之核易位與在HEK293細胞之核易位為可匹敵。有趣地，ATF2445 易位到HEK293細胞之核隔室的情況不佳，而ATF2445對於HeLa細胞入核顯著較高。因星狀細胞、HEK293及HeLa細胞有各自不同的細胞自溶酶存貨且此被分析的人造轉錄因子有不同的細胞自溶酶敏感性，此等數據支持細胞類型專一性內體解糾纏是能在某一標靶細胞類型最大化人造轉錄因子之核運送並在另一細胞類型最小化核運送的方法。例如對於ATF2445顯示該細胞自溶酶敏感性之人造轉錄因子將可良好地易位進入分享星狀細胞或HeLa細胞之該細胞自溶酶存貨的標靶細胞，而和HEK293細胞有可匹敵的細胞自溶酶存貨的細胞類型的易位可能為低。有趣地，針對HEK293細胞之發光酶報告子分析顯示ATF2445的確有低活性。

綜上，匹配人造轉錄因子之細胞自溶酶敏感性和標靶細胞類型之細胞自溶酶存貨係達成標靶細胞中之內體解糾纏而能最小化有不同的細胞自溶酶存貨之非標靶細胞類型之核易位的方法。於活體內處理 人造轉錄因子

一般於試管內 (in vitro ) 以在或約pH 7至pH 5有活性的細胞自溶酶(B、D、K、L及S)消化人造轉錄因子對於評估可轉導之人造轉錄因子進入該內體隔室後之安定性為有用，且對於估計此等蛋白質耐受內體破壞與接著釋放到細胞質的事件發生前對於在早期內體之未專一性消化的潛力為有用。此外，將人造轉錄因子轉導到細胞內後回收該已轉導之蛋白質並進行西方墨點分析將能判斷如此的本發明之人造轉錄因子對於在活體內存在之細胞自溶酶之耐受性。

如圖8，於轉導後分析從人星狀細胞、HEK293及Hela細胞回收的ATF1688、ATF2443及ATF2450，顯示帶有不同的細胞自溶酶存貨的細胞依其細胞自溶酶敏感性而差別地處理人造轉錄因子。例如ATF2443有理想的增加的處理，導致相較於ATF1688，在星狀細胞、HEK293及HeLa細胞產生切開產物(約28 kDa)。有趣地，ATF2443之解糾纏量在星狀細胞高於在HeLa細胞，可能是因為此等細胞類型之細胞自溶酶表現不同所致(圖6)。又，顯然，細胞類型不同之不同的人造轉錄因子之細胞攝入不同。於星狀細胞與HeLa細胞對於ATF1668與ATF2443之攝入為可匹敵，但HEK293對於ATF1688與 ATF2443之攝入較低。有趣地， 星狀細胞對ATF2450之攝入和此等細胞對於ATF1688與之ATF2443之攝入為可匹敵。但是在HeLa 與HEK293細胞對於ATF2450之攝入相當低。此等數據顯示:藉由包括不同的細胞自溶酶切開位以修飾人造轉錄因子細胞自溶酶敏感性，是影響內體解糾纏及轉錄調控活性之一方法。

增加該人造轉錄因子對於在高pH有活性之細胞自溶酶之不欲消化之耐受性會增加正確處理的人造轉錄因子，並因此增加到達核隔室之人造轉錄因子之有效劑量。若欲增加對於在較低pH(例如pH4)有活性之細胞自溶酶之蛋白酶耐受性將不大可能會得到較高的人造轉錄因子活性，原因是:在低 pH條件，蛋白質在內體之專一性消化會讓位給非專一性的外肽酶活性而導致此等蛋白質完全降解。此概念指出了增進內體解糾纏及在內體破壞後增加人造轉錄因子之移動性的重要，因為在進入該內體隔室與於內溶酶體隔室開始非專一性之蛋白質水解間成功進行細胞質遞送的時間框相當的短暫。藉由組合內體解糾纏和細胞類型專一性內體蛋白酶媒介之失活進行人造轉錄因子之細胞類型專一性靶向

雖人造轉錄因子有高專一性且就改變之非標靶基因之基因表現而言只有極小標靶外活性，仍希望進一步限制如此的治療藥的作用到特定細胞類型的次組以更增加其專一性。藉由細胞自溶酶之作用之解糾纏增進大幅地改善了可轉導之人造轉錄因子之次細胞局部化及活性。故，以關於在標靶組織中之細胞自溶酶表現的知識適當選擇特定的細胞自溶酶位，能夠限制成功地運送人造轉錄因子至特定細胞類型之核隔室。例如對於未在某一細胞類型中表現之細胞自溶酶為專一之包括位在PTD及該可轉導之人造轉錄因子之轉錄上有活性部分間之細胞自溶酶切開位的人造轉錄因子，將不會增進此PTD蛋白質融合物的解糾纏。故納入未在標靶細胞類型表現但在其他細胞類型低表現或不表現之細胞自溶酶識別之切開位，將會限制有效地遞送該可轉導之人造轉錄因子到所望之標靶細胞。

於一特定具體例，本發明係關於一種人造轉錄因子，包含一細胞自溶酶切開位，該切開位由在該標靶細胞類型表現但在其他細胞類型低表現或不表現之細胞自溶酶識別，具體而言，如此之人造轉錄因子之該細胞自溶酶切開位位在PTD與該可轉導之人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間。更具體而言，該人造轉錄因子除了位在PTD與該可轉導之人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該細胞自溶酶切開位以外，不包括其他任何細胞自溶酶切開位。更具體而言，該所述細胞自溶酶切開位係由在該標靶細胞類型表現但在其他細胞類型低表現或不表現之2或更多不同的細胞自溶酶識別。

於另一特定具體例，本發明係關於一種人造轉錄因子，包含專一性地靶向於一基因啟動子之多指之鋅指蛋白，該鋅指蛋白融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、含有1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，及單一或2或更多內體專一性蛋白酶切開位，其中，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位位在該人造轉錄因子中之介於蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間，其中該人造轉錄因子除了位在蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外不包括其他的蛋白酶切開位。較佳為，除了位在蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外的任意其他蛋白酶切開位皆為細胞自溶酶B切開位。於另一特定具體例，本發明係關於一種人造轉錄因子，包含專一性地靶向基因啟動子之多指之鋅指蛋白，該鋅指蛋白融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、含有1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，及單一或2或更多內體專一性蛋白酶切開位，其中該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位位在該人造轉錄因子中之介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間，其中該人造轉錄因子除了位在蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外不包括任何細胞自溶酶B切開位。

於另一特定具體例，本發明係關於一種人造轉錄因子，包含專一性地靶向基因啟動子之多指之鋅指蛋白，該鋅指蛋白融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、含有1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，及單一或2或更多內體專一性蛋白酶切開位，其中該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位位在該人造轉錄因子中之介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間，其中該人造轉錄因子除了位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外，更包含1或更多蛋白酶切開位，其中該位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外之1或更多蛋白酶切開位修飾成降低切開敏感性。較佳為，該位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外之1或更多蛋白酶切開位為細胞自溶酶B切開位。

於另一特定具體例，本發明係關於一種人造轉錄因子，包含專一性地靶向基因啟動子之多指之鋅指蛋白，該鋅指蛋白融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、含有1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，及單一或2或更多內體專一性蛋白酶切開位，其中該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位位在該人造轉錄因子介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間，其中該人造轉錄因子除了位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外，更包含1或更多蛋白酶切開位，其中該位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外之1或更多蛋白酶切開位相對於SEQ ID NO: 67之人造轉錄因子(ATF1488)或SEQ ID NO: 94之人造轉錄因子(ATF2491)之切開敏感性，有降低之切開敏感性，較佳為相對於SEQ ID NO: 67之該人造轉錄因子(ATF1488)之切開敏感性，有較低之切開敏感性。

附加基於細胞自溶酶表現樣式之非標靶細胞之負選擇會更增加可轉導之人造轉錄因子對於所望標靶之細胞類型之專一性遞送。此係藉由納入額外的細胞自溶酶切開位到可轉導之人造轉錄因子之對於該蛋白質之活性為必要之分域，例如該核局部化序列、該調控分域或該鋅指蛋白以達成。該額外的負選擇性細胞自溶酶切開位係基於在標靶及非標靶細胞類型中之細胞自溶酶表現樣式以選擇，方式為:標靶細胞類型不表現或只含少量該對應細胞自溶酶，而非標靶細胞類型對於識別該負選擇性細胞自溶酶切開位之該細胞自溶酶為陽性(示意圖見圖9)。藉由，使用在標靶細胞類型不被識別但會被在各種非標靶細胞類型所表現之數種細胞自溶酶之一切開之多官能之細胞自溶酶切開位，可將負選擇延伸至包括額外的細胞類型。可藉由附加負選擇性細胞自溶酶切開位之組合以增加能在該人造轉錄因子之轉錄活性區切開之細胞自溶酶之量，可以更達成延伸此負選擇。較佳為，分別附加負選擇性細胞自溶酶切開位到連接該調控分域與該核局部化序列或該鋅指蛋白分域之連結子區。但是也可考慮納入如此的負選擇性細胞自溶酶切開位到調控分域、核局部化序列或鋅指蛋白內。

於一特定具體例，本發明係關於一種人造轉錄因子，包含一細胞自溶酶切開位，細胞自溶酶切開位係由在該標靶細胞類型中為低表現或不表現但是在非標靶細胞類型中表現之細胞自溶酶識別，其中，如此之細胞自溶酶切開位位在對於該蛋白質之活性為必要的分域內或分域之間。更具體而言，係關於一種人造轉錄因子，包含2或更多如此之細胞自溶酶切開位，該等切開位位在對於人造轉錄因子之活性為必要的分域內或分域之間，其中該2或更多細胞自溶酶切開位在該標靶細胞類型中為低表現或不表現但是在非標靶細胞類型中表現。又，更具體而言，如此的細胞自溶酶切開位或如此的多數細胞自溶酶切開位係由在該標靶細胞類型中為低表現或不表現但是在非標靶細胞類型中表現2或更多不同的細胞自溶酶識別。

於本發明之上下文 “由在標靶細胞類型低表現之內體專一性蛋白酶或細胞自溶酶識別之該內體專一性蛋白酶或細胞自溶酶切開位”，係指某一內體專一性蛋白酶或細胞自溶酶在該標靶細胞類型之表現水平相較於其他細胞至少少2倍，宜至少少3倍，更宜為至少少5倍，更具體而言，是相較於非標靶細胞類型。於本發明之上下文，“由在標靶細胞類型不表現之內體專一性蛋白酶或細胞自溶酶識別之該內體專一性蛋白酶或細胞自溶酶切開位”，係指某內體專一性蛋白酶或某細胞自溶酶在該標靶細胞類型完全不表現。

於一特定具體例，本發明係關於係關於一種人造轉錄因子，包含一內體專一性蛋白酶切開位，該內體專一性蛋白酶切開位係由在該標靶細胞類型中為低表現或不表現但是在非標靶細胞類型中表現之內體專一性蛋白酶識別，其中如此的內體專一性蛋白酶切開位位在對於該人造轉錄因子之活性為必要的分域內或分域之間。通常對於該人造轉錄因子之活性為必要的分域為該核局部化序列、抑制性或活化性分域或該多指之鋅指蛋白。

於一特定具體例，本發明係關於一種人造轉錄因子，包含一內體專一性蛋白酶切開位，該切開位係由在該標靶細胞類型中為低表現或不表現但是在非標靶細胞類型中表現之內體專一性蛋白酶識別，其中如此的內體專一性蛋白酶切開位位在連接該調控分域與該核局部化序列或該鋅指蛋白分域之連結子區。

於本發明之上下文，標靶細胞類型或該人造轉錄因子之標靶細胞類型在此係可互換地使用，係指具如下之內體專一性蛋白酶存貨之細胞類型，即會表現至少1種會專一性地切開該單一或2或更多個位在該人造轉錄因子介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之內體專一性蛋白酶切開位之內體專一性蛋白酶。於本發明之具體上下文，標靶細胞類型或該人造轉錄因子之標靶細胞類型在此係可互換地使用，係指具如下之內體專一性蛋白酶存貨之細胞類型，即會表現至少1種會專一性地切開該單一或2或更多個位在該人造轉錄因子介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之內體專一性蛋白酶切開位但不會專一性地切開或較不專一性地切開在該人造轉錄因子包含之該內體專一性蛋白酶切開位以外的位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間的之其他之蛋白酶切開位的內體專一性蛋白酶。

於本發明之上下文，非標靶細胞類型或該人造轉錄因子之非標靶細胞類型在此係可互換地使用，係指具如下之內體專一性蛋白酶存貨之細胞類型，即會表現至少1種不會專一性地切開該單一或2或更多個位在該人造轉錄因子介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之內體專一性蛋白酶切開位或較不會專一性地切開在該人造轉錄因子包含之該內體專一性蛋白酶切開位以外的位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間的之其他之蛋白酶切開位的內體專一性蛋白酶。 於本發明之特定上下文，非標靶細胞類型或該人造轉錄因子之非標靶細胞類型在此係可互換地使用，係指具如下之內體專一性蛋白酶存貨之細胞類型，即會表現至少1種不會專一性地切開該單一或2或更多個位在該人造轉錄因子介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之內體專一性蛋白酶切開位或較不會專一性地切開在該人造轉錄因子包含之該內體專一性蛋白酶切開位以外的位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間的之其他之蛋白酶切開位的內體專一性蛋白酶，其中由非標靶細胞類型表現之該至少1種內體專一性蛋白酶會切開1或更多包括在該人造轉錄因子之位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外的蛋白酶切開位。

標靶或非標靶細胞類型可能在細胞生物學觀點，對於細胞一般分類係屬於相同類型，且差別只在該標靶細胞類型為患病細胞，非標靶細胞非患病細胞，或差別只在其在特定器官或器官的部分的位置，或可能差別只在其生理內容。

於此上下文，由1種內體專一性蛋白酶而非其他內體專一性蛋白酶專一性地切開一給定之內體專一性蛋白酶切開位係定義成:一內體專一性蛋白酶相對於其他的內體專一性蛋白酶，以2倍高，較佳為3倍高，更佳為4倍高處理含此切開位之蛋白質，即以2倍高，較佳為3倍高，更佳為4倍高消化此切開位。又，在此上下文，兩細胞類型之內體專一性蛋白酶表現樣式之差別係定義為:表現該內體專一性蛋白酶有2倍不同，較佳為3倍不同，更佳為4倍不同。改變人造轉錄因子對細胞自溶酶之敏感性以極小化通過該內體隔室期間之不欲之消化

在限定位切開可轉導之人造轉錄因子大幅地增進其正確局部化及活性，且可用於基於其細胞自溶酶表現樣式來縮窄對於某細胞類型之成功遞送，但細胞自溶酶在預設序列外之非專一性切開可能會干擾此等蛋白質的活性。故為了增加有功能的人造轉錄因子向核隔室之成功遞送，使此等蛋白質耐受於在故意導入之切開位外之細胞自溶酶切開可能證實有用。將各種可轉導之本發明之人造轉錄因子以純化的細胞自溶酶於試管內 (in vitro ) 消化(表 4)。

有趣地，將ATF1488與ATF1688以細胞自溶酶B、D、K、L及S消化後得知:主要消化產物很可能是截短，因而無活性的人造轉錄因子。依據尺寸的評估，得知一主要細胞自溶酶-敏感性位係位在可轉導之人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分內。確實的切開位係在將ATF1688於試管內 (in vitro ) 以細胞自溶酶B消化後，使用26 kDa片段之定序以決定，得知係位在SV40 核局部化序列與該調控分域間之連結子區。修飾介於ATF1688之NLS 與該調控分域間之區域會導致產生ATF2491 (SEQ ID NO: 94)與ATF2493 (SEQ ID NO: 95)。如圖10，移除此標靶外細胞自溶酶-敏感性位 大幅增加相對於ATF1688，對於ATF2491處理之優先性(峰以*標記)。故，移除人造轉錄因子之不欲細胞自溶酶切開位會大幅改善其在所欲切開位之正確處理，俾使其內體解糾纏改善。

本發明係關於人造轉錄因子，其中不欲之細胞自溶酶切開位已移除，尤其是關於ATF2491 (SEQ ID NO: 94)與ATF2493 (SEQ ID NO: 95)。細胞自溶酶媒介之人造轉錄因子之內體解糾纏係超過習知技術

使用內體蛋白酶切開部位例如細胞自溶酶B切開位及本發明其他之切開位等以改善貨物蛋白質例如人造轉錄因子之該內體解糾纏係最先進技術。不像已知的方法，不須引入額外的內體小泡破壞，只須於貨物蛋白質進入內體後將其從蛋白質轉導分域分離，事實上是從內體膜解糾纏，而容許在基線小泡破壞後有效率地從內體逃脫。

於其他已知例，細胞穿透肽係和蛋白酶切開位一起使用(EP 2 399 939, WO 2008/063113)，單純目的為增加蛋白質轉導即在進入該內體隔室前進入細胞之過程的選擇性。藉由以抑制性肽遮蔽該蛋白質轉導分域，可防止貨物運送跨過細胞膜。當遇到組織及/或細胞類型專一性胞外蛋白酶，此抑制性肽會被切開，使得蛋白質能運送跨過細胞膜。此習知技術的例實質上不同於本發明所述之導致增加內體解糾纏的特定建構物。在此，係敘述及主張基於該內體隔室內，不是在胞外空間的過程之該內體解糾纏及細胞類型專一性的人造轉錄因子去活。

於另一已知例，內體蛋白酶切開位係和蛋白質轉導分域一起使用(WO 2005/003315)。於此例，係提供運送 DNA (用於轉染)進入細胞的程序。該內體蛋白酶位係只用作標記以確認DNA複合體經由內體路徑進入，而不是增進DNA之內體逃脫。

和所述使用內體蛋白酶切開位作為標記的用途相反，本發明之建構物會提供增加之內體解糾纏及細胞類型專一性蛋白質去活，而不是作為供檢測DNA複合體經由內體路徑進入之標記。內體專一性、蛋白酶輔助之共遞送蛋白質與基因融合肽

共同遞送基因融合肽，例如TATHA2、GALA或KALA被設想會在蛋白質轉導後增加貨物蛋白質之內體逃脫 。但是共同遞送如此的肽對於增加活體內的蛋白質遞送可能並非可行的選項，原因是必須包括2成分系–基因融合肽與治療性蛋白質，而在活體系中此等成分的分布及消失行為可能不同。將基因融合肽納入治療性蛋白質係規避如上述2成分的問題的較佳選項。但是此等基因融合肽有如下的某些限制:大小、交互作用的可能性、及為了針對內體膜作用為融合蛋白質之N-及C-段胺基酸序列。故簡單地將基因融合肽納入到貨物蛋白質仍非增加內體逃脫之可行選項。但是經由內體蛋白酶-敏感性連結子區將基因融合肽納入到本發明之人造轉錄因子能容許同時遞送貨物蛋白質與基因融合肽進入內體腔。一旦位在內體內，會發生該人造轉錄因子從蛋白質轉導分域分離，及釋放基因融合肽。藉由包括多個基因融合肽重複，以內體蛋白酶位隔開各基因融合肽次單元，會將多個基因融合肽送到內體，進而增加內體破壞。本發明之包括如此的內體活化的基因融合肽的人造轉錄因子為ATF2383 (SEQ ID NO: 96)、 ATF2385 (SEQ ID NO: 97)、ATF2387 (SEQ ID NO: 98)及ATF2389 (SEQ ID NO: 99)。存在多組胺酸標籤會增加人造轉錄因子之活性

因只是將PTD從其蛋白質融合物夥伴分離在習知技術本身並未預測到會增加內體逃脫， 觀察到的相較於細胞自溶酶不敏感性人造轉錄因子，細胞自溶酶-敏感性之人造轉錄因子活性增加可能是由於第2機制，即協同作用。確實，藉由該分析的人造轉錄因子的固有質子海綿活性所致之內體膜之額外去安定化可能會幫助內體逃脫。採用於精製蛋白質之多組胺酸標籤已知會中和在酸化的內體隔室的質子，導致其不安定(Lo, S. L., 2008,Biomaterials 29, 2408−2414)。從ATF1688移除多組胺酸標籤(導致成為ATF2102)，相較於含有多組胺酸標籤之人造轉錄因子 ATF1688，會顯著地減少基因表現之抑制(圖11)。故該多組胺酸標籤改善ATF1688之活性，與質子海綿活性一致。

觀察內體解糾纏後人造轉錄因子活性之增加(圖4)支持以下的概念:只簡單地利用例如基因融合肽或質子海綿活性使該內體隔室去安定並不足以達成利用PTD遞送到細胞之蛋白質之全部活性。此外，由於移除多組胺酸標籤導致之質子海綿活性之喪失並不會完全地阻斷細胞自溶酶-敏感性人造轉錄因子之活性。因此，內體去安定化及內體解糾纏一起作用而達成利用最適之PTD機制遞送之貨物內體逃脫。基於此概念，將多組胺酸標籤從6元延長到例如10元，將會促進質子海綿活性，並且和最適內體解糾纏一起改善人造轉錄因子活性 (ATF2381 - SEQ ID NO: 100)。人造轉錄因子之活性取決於構成鋅指蛋白之鋅指模組之數目

藉由將6元鋅指蛋白增加2個額外的鋅指模組，以產生含8元鋅指蛋白之ATF1688變異體。此額外的鋅指模組係藉由酵母菌單雜交篩選(yeast-one-hybrid screen)選擇，其採用了基於類似於ATF1688含有的蛋白質的6元鋅指的8元鋅指庫。為了獲得ATF2467 (SEQ ID NO: 101)、ATF2468 (SEQ ID NO: 102)、ATF2469 (SEQ ID NO: 103)、ATF2470 (SEQ ID NO: 104)，將ATF1688之6元鋅指蛋白交換成對應的8元鋅指蛋白。由發光酶報告子分析之測量結果，此交換後，相較於ATF1688，ATF2468的活性增加1.44倍。此數據和8元鋅指蛋白對於其所望之標靶位的結合親和性增加一致。該人造轉錄因子的親和性較高可能會減少易位到核隔室所需的蛋白質量，故活性增加。蛋白質轉導的效率取決於局部 TAT 濃度

蛋白質之成功轉導取決於:誘導內體小泡形成，接著是將PTD 融合蛋白質推入如此的小泡及內體攝入。PTD 例如TAT肽有誘導內體小泡形成的固有能力，故此等肽對於運送貨物跨越細胞膜為有用。但是目為尚不知道是否融合於人造轉錄因子之單一TAT 肽能徹底地誘導內體小泡，或是否是否須要數個TAT結構靠近以有效率地完成其任務。據顯示:偶合於單一TAT 肽之螢光量子點無法進入細胞，而數個TAT 肽的隨機附著會有效率地攝入如此的化合物(Suzuki, Y., 2013,Mol.Cell. Biol. 33(15), 3036-3049)。同樣，增加局部的TAT 肽濃度能更有效率地攝入此等量子點。為了評價是否局部TAT濃度亦為攝入人造轉錄因子之限制步驟，於存在或不存在無活性的ATF1806的狀態，以發光酶為主之報告子分析測量ATF1688之半最大活性。藉由添加增加之無活性的ATF1806之量，會使用較少量的ATF1688來決定半最大活性，故局部TAT濃度會維持恆定。如圖12A，簡單地稀釋ATF1688，半最大活性的濃度成為143 +/- 11 nM。有趣地，藉由添加無活性的ATF1806維持穩定的高TAT濃度 (2 µM)，ATF1688之半最大活性的濃度決定的結果是72 +/- 18nM (圖12B)。此等數據和如下的概念為一致: TAT 蛋白質轉導分域的濃度對於攝入及人造轉錄因子之活性為速率限制因子。所以，成功運送人造轉錄因子到其核內標靶存在有3個瓶頸。第1，係經由蛋白質轉導分域例如TAT 肽之作用起始攝入到該內體隔室;第2，於該內體隔室內解糾纏;第3，從該內體隔室逃脫。內體解糾纏係藉由納入細胞自溶酶識別及切開位，而起始攝入之增加則須藉由操作局部TAT濃度。如前述，確實偶合許多TAT 肽到量子點可容許有效率地攝入此等化合物。但是此策略並不適用在人造轉錄因子，因為隨機偶合TAT 肽很可能會干擾其活性。又，隨機安排TAT 肽可能不會以最適方法誘導內體小泡形成。據推測: TAT分域存在有最佳的空間安排，能以最小的TAT結構誘導小泡形成。由以上的數據啟示須要有數個人造轉錄因子融合於TAT以能夠一起誘發小泡形成，但融合最佳安排的TAT分域到人造轉錄因子將有助於降低此前提，且有助於克服內體小泡形成的瓶頸。如此的人造轉錄因子可藉由將單一TAT 肽置換成經由特定連結子偶合之由4個TAT 結構組成的TetraTAT-I (SEQ ID NO: 105)以產生。ATF2505 (SEQ ID NO: 106)係為如此的靶向人ETRA 啟動子之人造轉錄因子。產生 8 元鋅指蛋白

可轉導之人造轉錄因子之專一性與效力取決於所含鋅指蛋白及其向其同源的標靶位的結合。於此觀點最重要的是該鋅指蛋白向其標靶位之結合親和性。結合親和性一方面由預定之鋅指蛋白之個別的鋅指的該蛋白質-DNA交互作用所界定，一方面由和DNA接觸之鋅指模組的量決定。目前，係使用4元至6元鋅指蛋白以建構人造轉錄因子。4元及6元係分別指使用4或6個個別的鋅指模組以供建構鋅指蛋白。6元比4元鋅指蛋白更理想，因為其可提供大而足夠的表面以區別非常相近的序列，而能夠指出人基因體內的單一標靶位。此外，因為涉及的庫的大小，要建構多於6個鋅指模組組成的鋅指蛋白非常困難，例如當使用Barbas 鋅指模組，要產生8元鋅指蛋白所涉及的庫大小會超過1.5*10⁹ 個選殖體，以習知篩選系，不可能鑑別針對給定的24 bp標靶位的最佳結合子。為了要建構有多於6個鋅指模組之多指鋅指蛋白，吾人發展出以下的2步策略:於第1回合，使用修飾的酵母單雜交 方案，以從鋅指蛋白庫選擇6元鋅指蛋白，此方案係使鋅指蛋白在酵母菌表現成融合於GAL4 活化分域，而表現Aureobasidin耐受性。但是也可採用任何其他的習知篩選法以獲得如此的6元鋅指蛋白。於第2步，基於如此的6元鋅指蛋白，藉由融合此6元鋅指蛋白到2或更多鋅指模組之隨機庫，以建構鋅指蛋白庫。事實上，會產生如下的多指鋅指蛋白之庫，即:藉由使用在第1回合獲得的6元鋅指蛋白，給出6個位置，並且有至多6個額外的位置被無規化。事實上，須要篩選例如12元鋅指蛋白的庫大小降低成約3x 10¹⁴ 至約6x 10⁶ 。此庫大小減小的步驟是必要的，但並不足以篩選由多於6個鋅指模組組成的鋅指蛋白。目前採用的篩選方法的敏感性不是特別適於區別在如此的擴大的庫中含有的不同的鋅指蛋白，因為此庫係基於已針對於對所望標靶位有高結合親和性之預選的6元鋅指蛋白。所以，須要改善篩選敏感性使其超越習知技術。此目標可藉由極端限制在篩選系統中之庫蛋白質表現以達成，須建構新穎的篩選系統。如此的篩選系統有賴於特別微弱的啟動子以驅動餌(bait)蛋白質之表現，並限制此餌建構物之基因劑量。為了建構如此的超越習知技術的篩選系統，吾人採用弱啟動子及低基因劑量兩者的策略。為了達成此目的，吾人修飾標準的酵母單雜交系統並且採用了ARS/CEN為主的載體而不採用標準的2micron載體。因為酵母菌中有約50個副本的2micron為主的載體，而只有約1~2個副本的ARS/CEN為主的載體，因此極端地限制該餌建構物的基因劑量。然後，吾人比較數個已知的酵母菌啟動子關於足以適合限制餌蛋白質表現之適合性。但是並無任一受測的酵母菌啟動子夠弱以達成所須的敏感性。有趣地及最意外的是，吾人產生的一哺乳動物SV40 啟動子 (SEQ ID NO: 197)之截短版本能足以弱表現以區別基於共同6元鋅指蛋白之非常相近的餌。表6顯示達成ADH及截短SV40 啟動子間之表現水平之不同的結果。將表現在ADH 啟動子或截短之SV40 啟動子控制下之GAL4AD-ZFP蛋白質 (SEQ ID NO: 198)並在含有針對該GAL4AD-ZFP之結合位的最小啟動子控制下之Aureobasidin A耐受性的酵母菌細胞進行系列稀釋到含有增加濃度之Aureobasidin A 之平板上。由ADH或截短之SV40 啟動子驅動之GAL4AD-ZFP表現之不同，各酵母菌細胞於生長在如此的選擇平板上的能力顯然不同。故，適合選擇有多於6個鋅指之多指鋅指蛋白(例如7元、8元或更高級之鋅指蛋白)之足夠弱啟動子之表現率定義如下:在含有整合於URA3 標記之餌質體 pAN2636 (SEQ ID NO: 199)之酵母菌Y1H Gold (Clontech)中，於如此的啟動子控制下表現SEQ ID NO: 198之GAL4AD-ZFP蛋白質，能使如此的酵母菌細胞只在含有少於2500 ng/ml Aureobasidin A之選擇平板上生長。此外，將1:10系列稀釋的如此的酵母菌細胞接種在含Aureobasidin A之選擇平板，結果:只有在含1000 ng/ml Aureobasidin A之選擇平板上有至多1:100稀釋步驟的細胞生長。在此，生長定義為:當施用5 µl之系列稀釋之細胞懸浮液並於30度培養3天後，形成酵母菌的封閉區域，其中無法鑑別出個別的酵母菌群落。此方析法對於酵母菌研究領域之人士已知為點測試(spot test)且應以此方式評估。所採用的藉由使用非常弱啟動子以極端低表現餌蛋白質及限制基因劑量的2步選擇策略並不限制於酵母單雜交為主的系統。細菌單雜交及其他篩選系統例如哺乳動物系統也可使用此新策略。吾人採用基於如此的目標載體(prey vector)之修飾的酵母單雜交為主的方案，以依據識別人ETRA 及人FcERIa 啟動子中之標靶位的6元鋅指蛋白來獲得8元鋅指蛋白。如圖13，基於8元鋅指蛋白之可轉導之人造轉錄因子相較於其6元的對應物有較高活性。綜上，吾人的新的超越習知技術的酵母單雜交系統能夠從基於共通之6元鋅指蛋白之餌庫選擇多指鋅指蛋白。此外利用增加選擇培養基中之Aureobasidin A 濃度以調整選擇壓力，則也可使用此目標載體以篩選基於9元、10元、11元，及12元鋅指之庫。

表 6: 使用截短之SV40 啟動子以獲得有適當表現之GAL4AD-ZFP 融合蛋白質以供使用酵母單雜交選擇更高級之鋅指蛋白 將含有SEQ ID NO: 199之餌質體，並在ADH或截短之SV40 啟動子之控制下表現SEQ ID NO: 198之GAL4AD-ZFP，該啟動子能夠結合最小啟動子以驅動含於餌質體之Aureobasidin A 耐受性基因表現之酵母菌細胞系列稀釋(1:10)，點到選擇平板上，該平板含有增加濃度之Aureobasidin A，並於在30度培養3天後評估生長。評估經系列稀釋之酵母菌細胞之生長，從左至右代表1:0、1:10、1:100、1:1000、1:10000稀釋，+代表各點有生長，–代表各點無生長。以靶向 FcER1a 之可轉導之人造轉錄因子處理後，抑制人初級嗜鹼細胞上之 IgE 受體表現

為了評估是否抑制FcER1a 表現會影響疾病關連之細胞模型內的IgE 全受體(holoreceptor)的量，將初級人嗜鹼細胞以靶向高親和性IgE 全受體之alpha 次單元FcER1a之可轉導之人造轉錄因子 ATF2729處理，或以載運體處理作為對照。如圖14，以ATF2729處理人初級嗜鹼細胞的結果，於處理後72及96小時後，相較於對照處理的細胞，在人嗜鹼細胞上的高親和性IgE 受體之表現減少。 含8 元鋅指蛋白比起含 6 元鋅指蛋白之人造轉錄因子活性增加

含於可轉導之人造轉錄因子之鋅指蛋白分域不只決定此等治療性分子的專一性還決定其特定活性。6元鋅指蛋白能夠結合於基因體之DNA跨18 bp，由更多鋅指模組組成的鋅指蛋白能識別跨越更長之DNA，例如8元鋅指蛋白會和24 bp的DNA交互作用。因此，相較於6元鋅指蛋白，如此的8元鋅指蛋白對於其同源的識別位的結合更強。事實上，如圖13，含8元鋅指蛋白之抗FcERIa ATF2615相較於含6元鋅指蛋白 之人造轉錄因子 AO501，在較低濃度有顯著較高活性。同樣，針對抗ETRA 人造轉錄因子(圖15)，含8元鋅指蛋白 ZFP+74AGocta (SEQ ID NO: 345) 之ATF2602 (SEQ ID NO: 200)的ED₅₀ 為0.016 +/- 0.002，低於ATF1688之0.039 +/- 0.005 nM，且相較於含6元鋅指蛋白之ATF1688，有較高的相對效價。此數據和以下為一致:含8元鋅指蛋白比起含6元鋅指蛋白之人造轉錄因子，活性較 高，有效劑量較低。綜上，組合內體解糾纏以及延長該鋅指蛋白的大小能增加可轉導之人造轉錄因子活性。玻璃體注射後， 含8 元鋅指蛋白比起含 6 元鋅指蛋白之人造轉錄因子的藥動學有所改善

雖然期待本發明之可轉導之人造轉錄因子之廣泛應用，且就標靶組織及應用途徑而言無限制，但仍評估玻璃體施用抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子以治療調節ETRA活性之疾病。為此，將含6元(ATF1688)或8元(ATF2468及ATF2602) 鋅指蛋白之可轉導之人造轉錄因子注入到活豬眼，並就其組織分布、穿透到視網膜核及眼之其他細胞評估。如表7，據發現:ATF1688分布在視網膜並進入一些血管關連之平滑肌細胞之核，ATF2468與ATF2602在玻璃體注射後顯示分布有大幅改善，特別良好地穿透進入到受分析的細胞的核。含8元鋅指之可轉導之人造轉錄因子在單一注射後至多7天被發現位在其標靶細胞類型 (血管關聯之平滑肌細胞) 之核。相對地，含6元鋅指蛋白之ATF1688在眼組織未顯示有此延長的滯留性。這些發現係未預期且意外地，強力支持含8元鋅指蛋白比起含6元鋅指蛋白之人造轉錄因子的藥動學為有利。

表 7: 玻璃體注射到豬眼後，抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子之位置。顯示在注射到豬眼內後24小時，可轉導之人造轉錄因子ATF1688、ATF2468及ATF2602S在眼的各種組織的核局部化之分級。NA代表未分析，–代表人造轉錄因子無核局部化，(+)代表在有些核有微弱陽性，+ 代表在高比例的核為陽性，++ 代表在幾乎所有的核有高陽性。抗 ETRA 可轉導之人造轉錄因子 於人大主動脈平滑肌細胞 (haSMCs) 有理想的試管內 (in vitro ) 活性

預期為了治療目的而以抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子處理，將會抑制ETRA 基因於平滑肌細胞之表現。為了要評估如此的可轉導之人造轉錄因子的效力，將初級人大主動脈平滑肌細胞以含8元鋅指蛋白之ATF2468或ATF2602處理，並以定量性RT-PCR定量地測量ETRA mRNA水平，並和經載運體處理的對照細胞比較。如圖16A，以ATF2468或ATF2602處理會相較於對照細胞抑制ETRA 表現58.1 %及64 %。接續於ETRA 表現抑制，預期ETRA蛋白質水平降低，ETRA依存性鈣傳信減少。確實(圖16B)，以ATF2602處理，相較於對照細胞真的減少了ET-1依存性鈣的流出(flux)，代表利用ETRA之傳信減少。綜上，抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子能夠於試管內抑制其疾病相關的標靶細胞群體的ETRA傳信。含 8 元鋅指蛋白之可轉導之人造轉錄因子在人組織有理想的離體 ( ex vivo) 活性

ET-1是已知最有效的血管收縮劑，其介由內皮素受體A(ETRA)作用。抗ETRA可轉導之人造轉錄因子預期會下降ETRA蛋白質在例如人平滑肌細胞之表現，因而使此等細胞對於ET-1較不回應，而減少血管收縮。為了評估抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子之活性，從胎盤分離人血管，並以含8元鋅指蛋白之ATF2468或無活性的對照蛋白質處理3天。處理後，使用肌動描記法(myography)測量回應於ET-1濃度增加之血管收縮。如圖17，於廣範圍的ET-1濃度，以ATF2468處理，對比於對照血管，ET-1-媒介之血管收縮減少。故抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子在單離的人組織顯示所望的藥動學活性，且能抑制ET-1依存性人血管之收縮。含 8 元鋅指蛋白之人造轉錄因子在豬視網膜血管有理想的活體內 (in vivo) 活性

為了決定野豬(Sus scrofa )作為測試靶向人ETRA 之抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子之動物模型的合適性，決定ATF2468的跨物種專一性。為此，將Gaussia 發光酶報告子基因置於由CMV 啟動子與同源的豬的ATF2468的標靶位組成的雜合啟動子的控制下。產生含此報告子基因建構物之細胞，並同樣產生含有ATF2468之人而非豬標靶位之類似報告子基因建構物的細胞。將此等報告子細胞株以ATF2468或無活性的對照蛋白質處理後，測量發光酶活性。如圖18，ATF2468擁有相當的跨物種專一性。以帶有ATF2468人ETRA 啟動子處理報告子細胞的結果：相較於對照處理的細胞，發光酶活性抑制成21 +/- 8 %，而發光酶活性在針對豬 ETRA 啟動子之報告子細胞，抑制成24 +/- 11 %。有趣地，針對牛 ETRA 啟動子處理之報告子細胞，結果：抑制發光酶活性至48 +/- 4 %，而在針對鼠或兔ETRA 啟動子之報告子細胞，ATF2468沒有活性。故，野豬(Sus scrofa )為測試抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子之適合動物模型。

為了評估是否抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子能在活體內實行其所欲功能，將ATF2602適用到豬眼。為此，以玻璃體注射ATF2602或載運體對照，注射後3天收集眼。ATF2602和ATF2468均有鋅指蛋白，故預期會顯示類似的跨物種專一性。為了決定ATF2602於眼之標靶組織之活性，將來自ATF2602及對照眼之視網膜血管以雷射顯微鏡摘取分離，並以定量RT-PCR決定ETRA mRNA之水平，將GAPDH 作為相對內部對照。如圖19，以ATF2602的結果，相較於對照，ETRA 表現抑制成78.3 +/- 14.1 %。故ATF2602能在體內施用後，下調ETRA 表現。此等數據證明抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子在相關動物模型的活體內概念。將含有原腎活素 (prorenin) 衍生之細胞自溶酶切開位及 SID 負調控分域之可轉導之人造轉錄因子以細胞自溶酶 D 切開

將含於本發明之可轉導之人造轉錄因子之次組的負調控SID分域以細胞自溶酶處理。ATF1688之細胞自溶酶D 消化產物之Edman定序顯示:有一切開位位在SID分域內LEAAD 肽序列之前(見圖20之示意圖)。ATF1688之突變分析顯示:細胞自溶酶D結合在ATF1688之原腎活素(prorenin)衍生之細胞自溶酶切開位與SID分域之間之界面。干擾細胞自溶酶D之結合會減少在細胞自溶酶D切開位之處理。有趣地，利用細胞自溶酶D處理含SID之人造轉錄因子可能干擾其活性。細胞自溶酶D 切開事實上有助內體解糾纏，將此負調控SID分域截短可能會干擾如此的人造轉錄因子的轉錄抑制。故包圍此原腎活素(prorenin)衍生的細胞自溶酶B切開位與該細胞自溶酶D 結合位 (SEQ ID NO: 201)之延長的細胞自溶酶識別位當納入到可轉導之人造轉錄因子時，會導致在表現高水平細胞自溶酶D之細胞相較於表現低水平細胞自溶酶D之細胞有差別的活性。使用 mRNA 展示以產生帶有改變的細胞自溶酶敏感性的可轉導之人造轉錄因子

內體解糾纏對於成功地遞送可轉導之人造轉錄因子到其作用位置為關鍵性的。為了到達核隔室，TAT 融合蛋白質須越過內體隔室，在此遇到屬於細胞自溶酶類別的各種蛋白酶。一些細胞自溶酶之序列專一性及細胞類型專一的表現與活性不同性可能會影響TAT媒介之蛋白質遞送並達成細胞類型專一性、有生產性的遞送貨物蛋白質，例如可轉導之人造轉錄因子。為了達成如此的細胞類型專一性遞送，必須要控制及操縱TAT 融合蛋白質 對於細胞自溶酶之敏感性。此目的可藉由在該TAT 融合蛋白質之各種必要分域中加入或移除針對某細胞自溶酶的切開位及結合位以達成。在此上下文中，重要的是細胞自溶酶結合位與切開位之區別。雖然是探討利用細胞自溶酶D切開可轉導之人造轉錄因子，吾人也觀察改變接近真正的切開位附近的序列會嚴重地影響到細胞自溶酶D處理如此的蛋白質的能力。故鄰近該切開位之序列(例如10至20個胺基酸上游或下游)會大幅影響某細胞自溶酶會如何地處理其受質。如圖20，例如細胞自溶酶D識別在負調控 SID分域內的切開位，如同切開產物之Edman定序結果。例如該SID分域由細胞自溶酶D在切開位 QML¦LEA (¦ 代表切開)切開，但是在此位置之消化強力地依存於鄰近 SID分域之序列。吾人意外地發現到: SID分域上游的序列 QPMKRLTLGNDI (SEQ ID NO: 341)會促進細胞自溶酶D消化，故包括細胞自溶酶D結合位。該細胞自溶酶D 結合及切開位係由胺基酸序列 QPMKRLTLGNDIMAAAVRMNIQMLLEAAD (SEQ ID NO: 202)構成， SID分域從第13位開始，第1至12位有改變，尤其第6至12位改變時會影響細胞自溶酶尤其細胞自溶酶D之結合並改變切開敏感性。因此，可能藉由干擾該細胞自溶酶之結合而不直接突變該真正的細胞自溶酶切開位，以抑制細胞自溶酶媒介之切開。吾人發現:插入符合帶電/極性、帶電、帶電/極性、非極性、非極性、非極性、極性胺基酸之樣式的胺基酸序列於切開位上游會強力地干擾細胞自溶酶D媒介的處理。另一如此的插入的樣式為:帶電、帶電/非極性、極性/非極性、極性/非極性、極性/非極性、極性/非極性、極性/非極性胺基酸。於表8顯示吾人的發現例，改變位在ATF2602之該細胞自溶酶結合位之LTLGNDI (SEQ ID NO: 342)會大幅地減少細胞自溶酶切開敏感性，即會大幅地抑制細胞自溶酶D依存性處理如此的可轉導之人造轉錄因子。 表 8：

顯示帶有改變之細胞自溶酶結合位之可轉導之人造轉錄因子相較於ATF2602，對於細胞自溶酶D消化之敏感性相對百分比。也顯示： 對於細胞自溶酶B 消化之敏感性(n.d.：未檢出; – 切開在檢測閾值以下; +/- 可檢測的切開; + 對於切開之敏感性和ATF2602可匹敵)。所示之胺基酸序列(以單字母密碼)記述ATF2602與各可轉導之人造轉錄因子間的差異。

於本發明之上下文，帶電胺基酸包括：精胺酸、離胺酸、天冬胺酸、及麩胺酸;極性胺基酸包括麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸及色胺酸;非極性胺基酸包括丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸及甘胺酸。

故於一特定具體例，本發明之人造轉錄因子包括內體專一性蛋白酶結合位 ，該結合位位在內體專一性蛋白酶切開位之上游或下游，較佳是上游約1至約50個胺基酸，較佳為約5至約20個胺基酸，更佳為約5至約15個胺基酸，其中該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列修飾成改變該內體專一性蛋白酶切開位之切開敏感性。通常，該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列藉由插入、刪除或取代以修飾，較佳為藉由插入或取代，更佳為利用取代。尤其該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列係藉由取代包括從胺基端至羧基端為依照如下胺基酸順序的胺基酸序列以進行修飾: i) 帶電或極性胺基酸、帶電胺基酸、帶電或極性胺基酸、非極性胺基酸、非極性胺基酸、非極性胺基酸、極性胺基酸; 或 ii) 帶電胺基酸、帶電或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸。故該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列係置換成包括從胺基端至羧酸端為依照如下胺基酸順序的胺基酸序列: i) 帶電或極性胺基酸、帶電胺基酸、帶電或極性胺基酸、非極性胺基酸、非極性胺基酸、非極性胺基酸、極性胺基酸;或 ii) 帶電胺基酸、帶電或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸。

於本發明之上下文，和ATF2602有至多7個胺基酸位置不同的可轉導之人造轉錄因子，而且此等7個胺基酸不是胺基酸序列LTLGNDI QPMKRLTLGNDIMAAAVRMNIQMLLEAAD (SEQ ID NO: 202)而符合以下單字母胺基酸碼的樣式也可認為是帶有改變的細胞自溶酶敏感性：D/E/I/K/LN/P/Q/R/S/T/V/Y、A/D/E/F/J/K/L/M/N/Q/R/S/T/V/Y、C/D/E/F/H/I/K/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y、D/F/H/I/L/M/N/Q/R/S/T/V、 D/E/F/H/I/L/N/M/P/Q/R/T/V/Y、A/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/Y、 A/C/F/H/I/L/Q/R/S/T/V/Y。更理想的取代是如下樣式：D/Q/T/Y、R/E/K、H/Y/V/K、L/R/I、L/E/V/T、I/V/F、S/YT/L，以下的取代樣式亦為理想：T/D/E/I/P/R、 L/E/R、L/S/T/V/Y、L/I/T/S、L/T/F/I、L/T/I/H/F、L/I/F，最理想的樣式是：T/D、L/E/R、L/S/T、L/I/T、L/T/F、L/T/I、L/I/F。以下樣式亦為理想：E/D/Y/L、L/E/F/R、F/H/Y/T、I/L/T、L/H/I/R、H/V/L/I、A/Y/S/F。

故於一特定具體例，該人造轉錄因子包含一內體專一性蛋白酶結合位，其中該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列係藉由取代至少2至7個胺基酸以修飾，其中該至少2至7個胺基酸置換為成包括從胺基端至羧酸端為依照如下胺基酸順序的胺基酸序列： 選自於由以下構成之群組之胺基酸：D/E/I/K/LN/P/Q/R/S/T/V/Y； 選自於由以下構成之群組之胺基酸：A/D/E/F/J/K/L/M/N/Q/R/S/T/V/Y； 選自於由以下構成之群組之胺基酸：C/D/E/F/H/I/K/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y； 選自於由以下構成之群組之胺基酸：D/F/H/I/L/M/N/Q/R/S/T/V； 選自於由以下構成之群組之胺基酸：D/E/F/H/I/L/N/M/P/Q/R/T/V/Y； 選自於由以下構成之群組之胺基酸：A/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/Y； 選自於由以下構成之群組之胺基酸：A/C/F/H/I/L/Q/R/S/T/V/Y。

基於ATF2602並使用此方法，可製造出帶有可改變之細胞自溶酶敏感性之可轉導之人造轉錄因子： ATF2869 (SEQ ID NO: 245)、ATF2870 (SEQ ID NO: 246、ATF2871 (SEQ ID NO: 247)、ATF2872 (SEQ ID NO: 248)、ATF2873 (SEQ ID NO: 249)、ATF2874 (SEQ ID NO: 250)、ATF2875 (SEQ ID NO: 251)、ATF2876 (SEQ ID NO: 252)、ATF2877 (SEQ ID NO: 253)、ATF2878 (SEQ ID NO: 254)、ATF2879 (SEQ ID NO: 255)、ATF2880 (SEQ ID NO: 256)、ATF2881 (SEQ ID NO: 257)、ATF2882 (SEQ ID NO: 258)、ATF2883 (SEQ ID NO: 259)、ATF2884 (SEQ ID NO: 260)、ATF2885 (SEQ ID NO: 261)、ATF2886 (SEQ ID NO: 262)、ATF2887 (SEQ ID NO: 263)、ATF2888 (SEQ ID NO: 264)、ATF2889 (SEQ ID NO: 265)、ATF2890 (SEQ ID NO: 266)、ATF2891 (SEQ ID NO: 267)、ATF2892 (SEQ ID NO: 268)、ATF2893 (SEQ ID NO: 269)、ATF2894 (SEQ ID NO: 270)、ATF2895 (SEQ ID NO: 271)、ATF2896 (SEQ ID NO: 272)、ATF2897 (SEQ ID NO: 273)、ATF2898 (SEQ ID NO: 274)、ATF2899 (SEQ ID NO: 275)、ATF2909 (SEQ ID NO: 276)、ATF2910 (SEQ ID NO: 277)、ATF2911 (SEQ ID NO: 278)、ATF2912 (SEQ ID NO: 279)、ATF2913 (SEQ ID NO: 280)、ATF2914(SEQ ID NO: 281)、ATF2915 (SEQ ID NO: 282)、ATF2916 (SEQ ID NO: 283)、ATF2917 (SEQ ID NO: 284)、ATF2918 (SEQ ID NO: 285)、及 ATF2919 (SEQ ID NO: 286)，此等是本發明之較佳具體例。

於一特定具體例，該人造轉錄因子包含一內體專一性蛋白酶結合位，其中該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列包括胺基酸序列 LTLGNDI (SEQ ID NO: 342)且其中該內體專一性蛋白酶結合位係藉由將胺基酸序列 LTLGNDI (SEQ ID NO: 342)替換成選自於由以下構成之群組中的胺基酸序列以修飾:DRHLIIS (SEQ ID NO: 203)、DLVTLLT(SEQ ID NO: 204)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、PLTLPTI (SEQ ID NO: 207)、PRLMFLC (SEQ ID NO: 208)、TAYLPHI (SEQ ID NO: 209)、TETLPHI (SEQ ID NO: 210)、TDYLDPH (SEQ ID NO: 211)、QRYLEIT (SEQ ID NO: 212)、NLHTIHI (SEQ ID NO: 213)、NLCSVTQ (SEQ ID NO: 214)、LAKFDMI (SEQ ID NO: 215)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、DLTHISI (SEQ ID NO: 217)、DFKSVQF (SEQ ID NO: 218)、REYLIIS (SEQ ID NO: 219)、RIDQLTL (SEQ ID NO: 220)、RQVTLAL (SEQ ID NO: 221)、YEKITVT (SEQ ID NO: 222)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、YFSIHGL (SEQ ID NO: 224)、ELNIDIL (SEQ ID NO: 225)、PSLSFIV (SEQ ID NO: 226)、SLLITNL (SEQ ID NO: 227)、EISTTLF (SEQ ID NO: 228)、NMSTTNL (SEQ ID NO: 229)、IKTDYSL (SEQ ID NO: 230)、TKVRVFL (SEQ ID NO: 231)、EYILNYY (SEQ ID NO: 232)、TTVNLTI (SEQ ID NO: 233)、IVLNLSI (SEQ ID NO: 234)、TSLLYTC (SEQ ID NO: 235)、PTISFAL (SEQ ID NO: 236)、KESFTLI (SEQ ID NO: 237)、KLDVNFF (SEQ ID NO: 238)、TELSYTL (SEQ ID NO: 239)、IERFQFA (SEQ ID NO: 240)、INQMLSH (SEQ ID NO: 241)、ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、VYPILPI (SEQ ID NO: 243)、及 RRELFLL (SEQ ID NO: 244)，常為DLVTLLT(SEQ ID NO: 204)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、PLTLPTI (SEQ ID NO: 207)、PRLMFLC (SEQ ID NO: 208)、TAYLPHI (SEQ ID NO: 209)、TETLPHI (SEQ ID NO: 210)、TDYLDPH (SEQ ID NO: 211)、QRYLEIT (SEQ ID NO: 212)、NLHTIHI (SEQ ID NO: 213)、NLCSVTQ (SEQ ID NO: 214)、LAKFDMI (SEQ ID NO: 215)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、DLTHISI (SEQ ID NO: 217)、DFKSVQF (SEQ ID NO: 218)、REYLIIS (SEQ ID NO: 219)、RIDQLTL (SEQ ID NO: 220)、RQVTLAL (SEQ ID NO: 221)、YEKITVT (SEQ ID NO: 222)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、ELNIDIL (SEQ ID NO: 225)、PSLSFIV (SEQ ID NO: 226)、SLLITNL (SEQ ID NO: 227)、EISTTLF (SEQ ID NO: 228)、NMSTTNL (SEQ ID NO: 229)、IKTDYSL (SEQ ID NO: 230)、TKVRVFL (SEQ ID NO: 231)、EYILNYY (SEQ ID NO: 232)、TTVNLTI (SEQ ID NO: 233)、IVLNLSI (SEQ ID NO: 234)、TSLLYTC (SEQ ID NO: 235)、PTISFAL (SEQ ID NO: 236)、KESFTLI (SEQ ID NO: 237)、KLDVNFF (SEQ ID NO: 238)、TELSYTL (SEQ ID NO: 239)、IERFQFA (SEQ ID NO: 240)、INQMLSH (SEQ ID NO: 241)、ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、VYPILPI (SEQ ID NO: 243)、及 RRELFLL (SEQ ID NO: 244)、 較佳為:ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、DRHLIIS (SEQ ID NO: 203)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、YFSIHGL (SEQ ID NO: 224)、INQMLSH (SEQ ID NO: 241)、QRYLEIT (SEQ ID NO: 212)、TTVNLTI (SEQ ID NO: 233)、KLDVNFF (SEQ ID NO: 238)、TDYLDPH (SEQ ID NO: 211)、NLHTIHI (SEQ ID NO: 213)、DLTHISI (SEQ ID NO: 217)、PLTLPTI (SEQ ID NO: 207)，更佳為ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、TAYLPHI (SEQ ID NO: 209)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、PSLSFIV (SEQ ID NO: 226)、TKVRVFL (SEQ ID NO: 231) 及 INQMLSH (SEQ ID NO: 241)，更佳為TKVRVFL (SEQ ID NO: 231)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、ELFILHA  (SEQ ID NO: 242)、及 DEHLLVY (SEQ ID NO: 205) ，尤其LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、ELFILHA  (SEQ ID NO: 242)、及 DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)。

本發明之另一態樣中，該人造轉錄因子包含一多指之鋅指蛋白，該多指之鋅指蛋白專一地靶向於基因啟動子，融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、包含1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，及內體專一性蛋白酶切開位，其中該人造轉錄因子包含選自於由以下構成之群組中之胺基酸序列：　DRHLIIS (SEQ ID NO: 203)、DLVTLLT(SEQ ID NO: 204)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、PLTLPTI (SEQ ID NO: 207)、PRLMFLC (SEQ ID NO: 208)、TAYLPHI (SEQ ID NO: 209)、TETLPHI (SEQ ID NO: 210)、TDYLDPH (SEQ ID NO: 211)、QRYLEIT (SEQ ID NO: 212)、NLHTIHI (SEQ ID NO: 213)、NLCSVTQ (SEQ ID NO: 214)、LAKFDMI (SEQ ID NO: 215)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、DLTHISI (SEQ ID NO: 217)、DFKSVQF (SEQ ID NO: 218)、REYLIIS (SEQ ID NO: 219)、RIDQLTL (SEQ ID NO: 220)、RQVTLAL (SEQ ID NO: 221)、YEKITVT (SEQ ID NO: 222)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、YFSIHGL (SEQ ID NO: 224)、ELNIDIL (SEQ ID NO: 225)、PSLSFIV (SEQ ID NO: 226)、SLLITNL (SEQ ID NO: 227)、EISTTLF (SEQ ID NO: 228)、NMSTTNL (SEQ ID NO: 229)、IKTDYSL (SEQ ID NO: 230)、TKVRVFL (SEQ ID NO: 231)、EYILNYY (SEQ ID NO: 232)、TTVNLTI (SEQ ID NO: 233)、IVLNLSI (SEQ ID NO: 234)、TSLLYTC (SEQ ID NO: 235)、PTISFAL (SEQ ID NO: 236)、KESFTLI (SEQ ID NO: 237)、KLDVNFF (SEQ ID NO: 238)、TELSYTL (SEQ ID NO: 239)、IERFQFA (SEQ ID NO: 240)、INQMLSH (SEQ ID NO: 241)、ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、VYPILPI (SEQ ID NO: 243)及RRELFLL (SEQ ID NO: 244)，通常為　DLVTLLT(SEQ ID NO: 204)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、PLTLPTI (SEQ ID NO: 207)、PRLMFLC (SEQ ID NO: 208)、TAYLPHI (SEQ ID NO: 209)、TETLPHI (SEQ ID NO: 210)、TDYLDPH (SEQ ID NO: 211)、QRYLEIT (SEQ ID NO: 212)、NLHTIHI (SEQ ID NO: 213)、NLCSVTQ (SEQ ID NO: 214)、LAKFDMI (SEQ ID NO: 215)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、DLTHISI (SEQ ID NO: 217)、DFKSVQF (SEQ ID NO: 218)、REYLIIS (SEQ ID NO: 219)、RIDQLTL (SEQ ID NO: 220)、RQVTLAL (SEQ ID NO: 221)、YEKITVT (SEQ ID NO: 222)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、ELNIDIL (SEQ ID NO: 225)、PSLSFIV (SEQ ID NO: 226)、SLLITNL (SEQ ID NO: 227)、EISTTLF (SEQ ID NO: 228)、NMSTTNL (SEQ ID NO: 229)、IKTDYSL (SEQ ID NO: 230)、TKVRVFL (SEQ ID NO: 231)、EYILNYY (SEQ ID NO: 232)、TTVNLTI (SEQ ID NO: 233)、IVLNLSI (SEQ ID NO: 234)、TSLLYTC (SEQ ID NO: 235)、PTISFAL (SEQ ID NO: 236)、KESFTLI (SEQ ID NO: 237)、KLDVNFF (SEQ ID NO: 238)、TELSYTL (SEQ ID NO: 239)、IERFQFA (SEQ ID NO: 240)、INQMLSH (SEQ ID NO: 241)、ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、VYPILPI (SEQ ID NO: 243)、及 RRELFLL (SEQ ID NO: 244)、 較佳為　ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、DRHLIIS (SEQ ID NO: 203)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、YFSIHGL (SEQ ID NO: 224)、INQMLSH (SEQ ID NO: 241)、QRYLEIT (SEQ ID NO: 212)、TTVNLTI (SEQ ID NO: 233)、KLDVNFF (SEQ ID NO: 238)、TDYLDPH (SEQ ID NO: 211)、NLHTIHI (SEQ ID NO: 213)、DLTHISI (SEQ ID NO: 217)、PLTLPTI (SEQ ID NO: 207)，更佳為　ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、TAYLPHI (SEQ ID NO: 209)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、PSLSFIV (SEQ ID NO: 226)、TKVRVFL (SEQ ID NO: 231)及INQMLSH (SEQ ID NO: 241)，最佳為　TKVRVFL (SEQ ID NO: 231)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、ELFILHA  (SEQ ID NO: 242)、及 DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)，尤其　LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、ELFILHA  (SEQ ID NO: 242)及DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)。

於本發明之另一態樣，該人造轉錄因子包含一多指之鋅指蛋白，該多指之鋅指蛋白專一地靶向於基因啟動子，融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、包含1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，及內體專一性蛋白酶切開位，其中該人造轉錄因子選自於由以下構成之群組：ATF2869 (SEQ ID NO: 245)、ATF2870 (SEQ ID NO: 246、ATF2871 (SEQ ID NO: 247)、ATF2872 (SEQ ID NO: 248)、ATF2873 (SEQ ID NO: 249)、ATF2874 (SEQ ID NO: 250)、ATF2875 (SEQ ID NO: 251)、ATF2876 (SEQ ID NO: 252)、ATF2877 (SEQ ID NO: 253)、ATF2878 (SEQ ID NO: 254)、ATF2879 (SEQ ID NO: 255)、ATF2880 (SEQ ID NO: 256)、ATF2881 (SEQ ID NO: 257)、ATF2882 (SEQ ID NO: 258)、ATF2883 (SEQ ID NO: 259)、ATF2884 (SEQ ID NO: 260)、ATF2885 (SEQ ID NO: 261)、ATF2886 (SEQ ID NO: 262)、ATF2887 (SEQ ID NO: 263)、ATF2888 (SEQ ID NO: 264)、ATF2889 (SEQ ID NO: 265)、ATF2890 (SEQ ID NO: 266)、ATF2891 (SEQ ID NO: 267)、ATF2892 (SEQ ID NO: 268)、ATF2893 (SEQ ID NO: 269)、ATF2894 (SEQ ID NO: 270)、ATF2895 (SEQ ID NO: 271)、ATF2896 (SEQ ID NO: 272)、ATF2897 (SEQ ID NO: 273)、ATF2898 (SEQ ID NO: 274)、ATF2899 (SEQ ID NO: 275)、ATF2909 (SEQ ID NO: 276)、ATF2910 (SEQ ID NO: 277)、ATF2911 (SEQ ID NO: 278)、ATF2912 (SEQ ID NO: 279)、ATF2913 (SEQ ID NO: 280)、ATF2914(SEQ ID NO: 281)、ATF2915 (SEQ ID NO: 282)、ATF2916 (SEQ ID NO: 283)、ATF2917 (SEQ ID NO: 284)、ATF2918 (SEQ ID NO: 285)、及 ATF2919 (SEQ ID NO: 286)、通常選自於由以下構成之群組：ATF2870 (SEQ ID NO: 246、ATF2871 (SEQ ID NO: 247)、ATF2872 (SEQ ID NO: 248)、ATF2873 (SEQ ID NO: 249)、ATF2874 (SEQ ID NO: 250)、ATF2875 (SEQ ID NO: 251)、ATF2876 (SEQ ID NO: 252)、ATF2877 (SEQ ID NO: 253)、ATF2878 (SEQ ID NO: 254)、ATF2879 (SEQ ID NO: 255)、ATF2880 (SEQ ID NO: 256)、ATF2881 (SEQ ID NO: 257)、ATF2882 (SEQ ID NO: 258)、ATF2883 (SEQ ID NO: 259)、ATF2884 (SEQ ID NO: 260)、ATF2885 (SEQ ID NO: 261)、ATF2886 (SEQ ID NO: 262)、ATF2887 (SEQ ID NO: 263)、ATF2888 (SEQ ID NO: 264)、ATF2889 (SEQ ID NO: 265)、ATF2891 (SEQ ID NO: 267)、ATF2892 (SEQ ID NO: 268)、ATF2893 (SEQ ID NO: 269)、ATF2894 (SEQ ID NO: 270)、ATF2895 (SEQ ID NO: 271)、ATF2896 (SEQ ID NO: 272)、ATF2897 (SEQ ID NO: 273)、ATF2898 (SEQ ID NO: 274)、ATF2899 (SEQ ID NO: 275)、ATF2909 (SEQ ID NO: 276)、ATF2910 (SEQ ID NO: 277)、ATF2911 (SEQ ID NO: 278)、ATF2912 (SEQ ID NO: 279)、ATF2913 (SEQ ID NO: 280)、ATF2914(SEQ ID NO: 281)、ATF2915 (SEQ ID NO: 282)、ATF2916 (SEQ ID NO: 283)、ATF2917 (SEQ ID NO: 284)、ATF2918 (SEQ ID NO: 285)、及 ATF2919 (SEQ ID NO: 286)， 較佳為選自由以下構成之群組：ATF2869、ATF2871、ATF2872、ATF2875、ATF2882、ATF2890、ATF2892、ATF2897、ATF2917、及ATF2919，更佳為選自於由以下構成之群組：ATF2917、ATF2871、ATF2872、ATF2875、ATF2889、ATF2882、ATF2892、ATF2897及ATF2916，最佳為選自於由以下構成之群組：ATF2882、ATF2917、ATF2871及ATF2897，尤其選自於由以下構成之群組：ATF2882、ATF2917 及 ATF2871，特別是選自於由以下構成之群組：ATF2882與ATF2917。

所列的實施例並不只針對細胞自溶酶D，也可用在存在切開位的所有細胞自溶酶，或可包括到或介於必要蛋白質序列之間。現在要調節可有生產性地轉導人造轉錄因子之細胞類型範圍，在此必要分域內處理之細胞自溶酶可以改變。但是不能只簡單地刪除該細胞自溶酶切開位，因為改變必要分域，例如SID序列，可能會損及其功能。為此，吾人設計了以下方法以克服此限制。如圖21，組合編碼為該可轉導之人造轉錄因子之DNA庫以在該細胞自溶酶結合區內包括一隨機序列區，其鄰近於靶向於調節的細胞自溶酶切開位的必要分域。如此的隨機序列在基因庫建構時經由寡核苷酸的退化而導入，例如含有21個隨機的核苷酸會成為有約10¹³ 個不同的DNA分子之DNA庫。使用此DNA庫於mRNA提示 (Lipovsek D., Plückthun A., 2004, J Immunol Methods. 290(1-2):51-67; Barendt PA., Ng DT., McQuade CN., Sarkar CA., 2013, ACS Comb Sci. 15(2):77-81; Kurz M., Gu K., Lohse PA., 2000, Nucleic Acids Res. 28(18):E83)。簡言之，將此已轉錄的mRNA庫連結於含嘌呤黴素之寡核苷酸，並於試管內 (in vitro ) 轉譯成蛋白質(經由嘌呤黴素連結到mRNA)，其由核糖體轉錄成個別的蛋白質分子。於某些情形，該核糖體能使用嘌呤黴素而不使用tRNA轉移到未成熟的蛋白質鏈。因該mRNA庫在其3’端含有如此的嘌呤黴素結構，編碼的mRNA會轉移到未成熟的蛋白質 ，將表型和基因型關聯。表型與基因型間的連結(linkage)對於基因篩選為必要，且可容許試管內 (in vitro ) 進化 ( evolution)過程。將已完成mRNA呈現的mRNA-蛋白質庫經由內含的親和性標籤結合到固體支持體，並接受細胞自溶酶消化。取決於所望的結果，當使用上清於下一回合的試管內 (in vitro ) 選擇，將可選擇針對細胞自溶酶消化之蛋白質敏感性，而使用已結合於支持體的級分則會富化耐受細胞自溶酶消化之蛋白質。藉由組合數回合的細胞自溶酶消化與從前次選擇回合結果的重複庫產生，可產生帶有所望細胞自溶酶敏感性之蛋白質。例如以細胞自溶酶D消化已結合支持體之mRNA提示庫再以細胞自溶酶B消化時，會於上清獲得細胞自溶酶D耐受性、細胞自溶酶B-敏感性人造轉錄因子。此等蛋白質相較於其細胞自溶酶D-敏感性對應物，較有利於遞送到有高細胞自溶酶D表現之細胞類型。但是此理想的方法一般可用於獲得本發明之可轉導之人造轉錄因子，並不只限於細胞自溶酶B或D或含有SID分域部分的序列。

於本發明之另一特定具體例，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位包括胺基酸序列 SEQ ID NO: 26。於另一特定具體例，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位包括選自於由SEQ ID NO: 26至SEQ ID NO: 46構成之群組之胺基酸序列。

於本發明之另一態樣，該人造轉錄因子包括一多指之鋅指蛋白，該多指之鋅指蛋白專一地靶向於基因啟動子且融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、包含1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，及內體專一性蛋白酶切開位，其中該多指之鋅指蛋白為8元或更高級之鋅指蛋白。該8元或更高級鋅指蛋白係選自於由8元、9元、10元、11元及12元鋅指蛋白構成之群組，更宜為該多指之鋅指蛋白為8元鋅指蛋白。

該多指之鋅指蛋白較佳為選自於由SEQ ID NO: 345與SEQ ID NO: 346構成之群組之8元鋅指蛋白。該鋅指蛋白之各單元體較佳為和其他單元體的胺基酸序列不同，例如8元或更高級鋅指蛋白之單元體和其他單元體的胺基酸序列不同。

於一較佳具體例，該人造轉錄因子更包含如前述之蛋白質標籤。於一較佳具體例，該人造轉錄因子更包含前述連結子。該抑制性或活化性蛋白質分域、該核局部化序列、該蛋白質轉導分域及內體專一性蛋白酶切開位，各分域在該人造轉錄因子內從N端至C端之位置，可以和前述針對本發明之人造轉錄因子所述相同。

於一較佳具體例，該內體專一性蛋白酶切開位位在該人造轉錄因子中之介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間，且其中該人造轉錄因子更包含位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外的1或更多個蛋白酶切開位。於一特定具體例，位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外的該1或更多個蛋白酶切開位修飾成改變，宜是修飾成降低切開敏感性。

於一較佳具體例，該內體專一性蛋白酶切開位位在該人造轉錄因子中之介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間，其中該人造轉錄因子不包括在該人造轉錄因子內介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄上有活性之部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外的任何其他的蛋白酶切開位。醫藥組成物

本發明也關於包含如上定義之人造轉錄因子的醫藥組成物。所考慮之醫藥組成物為對於溫血動物，尤其是人針對非經口全身性投予，尤其靜脈內投予之組成物，針對吸入用之組成物，及局部投予用之組成物，特別是眼用局部投予，例如作為眼藥水，或玻璃體內、結膜下、眼球周或球後投予。較理想為眼藥水或用於玻璃體內、結膜下、眼球周或球後投予之組合物。該組成物單獨包含活性成分，或較佳為共同包含活性成分與醫藥上可接受之擔體。更考慮的是緩釋性配方。活性成分的劑量取決於欲治療的疾病及物種，年紀、體重、個別情形、個別的藥動學數據及投予模式。

進一步考慮有用於口服遞送之醫藥組成物，尤其是包含可適合地包覆的活性成分或保護免於在腸降解的成分的組成物。例如如此的醫藥組成物可包括膜通透增進劑、蛋白酶酵素抑制劑，及可由腸衣包住。

該醫藥組成物包括約1 %至約95 % 活性成分。單位劑形例如:安瓿、小玻璃瓶、吸入器、眼藥水等。

本發明之醫藥組成物係以已知方法製備，例如可藉由習知的混合、溶解或冷凍乾燥處理製備。

較佳為使用活性成分之溶液，亦可使用懸浮液或分散液，尤其是等張水溶液、分散液或懸浮液，例如單獨包含活性成分或同時又更含擔體例如甘露醇之冷凍乾燥組成物可於使用前製作。該醫藥組成物可經殺菌及/或更包含賦形劑，例如保存劑、安定劑、潤濕劑及/或乳化劑、助溶劑、調整滲透壓的鹽及/或緩衝液，且係依本身公知的方法製備，例如藉由習知的溶解及冷凍乾燥處理製備。該溶液或懸浮液可包含增黏劑，一般為羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯基吡咯烷酮或明膠，或助溶劑，例如Tween 80* (聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)。

油中懸浮液包括蔬菜油、合成油或半合成油習慣作為油成分以供注射用途。其中可特別提及脂肪酸酯，其包括有8至22個碳，特別是12至22個碳之長鏈脂肪酸酸成分。此等脂肪酸酯之醇成分最多有6個碳，且為單元或多元例如單元、二元或三元醇，尤其甘醇及丙三醇。就脂肪酸酯之混合物而言，例如棉籽油、杏仁油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油、大豆油和花生油等蔬菜油特別有用。

製造可注射之製備物通常在無菌條件實施，即，在無菌條件實施填入安瓿或小玻璃瓶，將容器密封。

針對非經口投予，特別適合者為於水可溶形式之活性成分之水溶液，例如包括增黏物質之水可溶鹽或水性注射懸浮液，增黏物質例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或葡聚糖，若有必要，可包括安定劑。活性成分，及非必要的賦形劑，也可為冷凍乾燥形式，可於非經口投予前藉由加入適當溶劑以製成溶液。

吸入用組成物可以氣溶膠形式投予，作為噴劑、霧劑或滴劑形式。氣溶膠可可從溶液或懸浮液製備，可利用有劑量刻度的吸入器或噴霧器，亦即藉由使用適當推進劑以短暫地衝出使患者吸入的氣溶化的藥物以遞送特定量的用藥到呼吸道或肺的裝置遞送，推進劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適當的氣體。也可以用適當的粉基，例如乳糖或澱粉以提供吸入用的粉噴劑。

眼藥水宜為活性成分之等張水溶液，包含適當藥劑以使組成物和淚液成為等張(295-305 mOsm/l)。可考慮的藥劑有: 氯化鈉、檸檬酸、甘油、山梨醇、甘露醇、乙二醇、丙二醇、葡萄糖等。又，該組成物包括緩衝劑，例如磷酸鹽緩衝液、磷酸-檸檬酸鹽緩衝液或Tris 緩衝液 (參(羧甲基)-胺甲烷)以維持pH介於5與8之間，較佳為7.0至7.4之間。該組成物可更包括抗微生物性保存劑，例如對羥基苯甲酸酯類、4級銨鹽例如苯扎氯銨、聚六亞甲基雙胍(PHMB)等。該眼藥水可更包括黃原膠(xanthan gum)以產生凝膠狀的眼藥水，及/或其他增黏劑，例如透明質酸、甲基纖維素、聚乙烯醇，或聚乙烯基吡咯烷酮。

共價鍵結聚乙二醇結構(PEGylation)到本發明之人造轉錄因子據認為會增加該人造轉錄因子之溶解性，降低其腎廓清率，並控制其免疫原性。可考慮胺基及硫醇反應性聚乙二醇，大小範圍為1至40 KD。使用硫醇反應性聚乙二醇可將該人造轉錄因子進行位置專一性聚乙二醇化。本發明之人造轉錄因子之包括必要硫醇基之胺基酸只有半胱胺酸殘基，該殘基位在該鋅指模組，對於鋅配位為必要。此等硫醇基因為鋅配位，無法被聚乙二醇化，故若使用硫醇專一性聚乙二醇試劑來包括1或數個半胱胺酸殘基到該本發明之人造轉錄因子內能提供聚乙二醇化的游離硫醇基。人造轉錄因子於治療方法中之用途

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其係針對前述該內皮素受體A啟動子，以供影響對於內皮素之細胞回應、降低或增加內皮素受體水平，及用在治療由內皮素調節之疾病，特別用於治療如此的眼疾。同樣，本發明係關於治療由內皮素調節之疾病之方法，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對該內皮素受體A啟動子之人造轉錄因子。

同樣，本發明係關於一種人造轉錄因子，係用於治療由內皮素調節之疾病，藉由對於須要的病患投予治療上有效量之針對該內皮素受體A啟動子之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於人造轉錄因子之用途，以製造供治療由內皮素調節之疾病之藥物。

由內皮素調節之疾病，例如心血管疾病，例如原發性高血壓、肺動脈高壓、慢性心臟衰竭、及慢性腎功能衰竭。此外藉由鈍化該內皮素回應，可於造影劑施用前、中及後保護腎臟。此外多發性硬化症由該內皮素系統負影響。

其他由內皮素調節的疾病為：糖尿病性腎疾或眼疾，例如青光眼神經退化、眼部血液循環的血管功能失調、視網膜靜脈阻塞、視網膜動脈阻塞、黃斑水腫、與年齡有關的黃斑變性、視神經病變、中心性漿液性脈絡膜視網膜病變、色素性視網膜炎、Susac症候群和Leber氏遺傳性視神經病變。 同樣本發明係關於一種治療由內皮素調節之疾病之方法，包括對於須要的患者投予治療上有效量之本發明之人造轉錄因子。尤其本發明係關於一種治療青光眼神經退化、眼部血液循環的血管功能失調，特別是治療視網膜靜脈阻塞、視網膜動脈阻塞、黃斑水腫、與年齡有關的黃斑變性、視神經病變、中心性漿液性脈絡膜視網膜病變、色素性視網膜炎、Susac症候群和Leber氏遺傳性視神經病變之方法，包括對於須要的患者投予治療上有效量之本發明之人造轉錄因子。本發明之人造轉錄因子之有效量取決於欲治療之疾病之特定形態，及物種、年紀、重量及個別情形、個體之藥動學數據、及投予模式。向眼內投予時，宜每月進行玻璃體注射0.5至1 mg 。針對全身性施用，宜每月注射10 mg/kg。此外，向眼內之玻璃體植入緩釋沉積物亦為理想。

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其針對前述內皮素受體B 啟動子，用在影響細胞對於內皮素之應答，用於降低或增加內皮素受體B水平，並用於治療由內皮素調節之疾病，特別用於治療如此的眼疾。同樣，本發明係關於一種治療由內皮素調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的針對該內皮素受體B 啟動子之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於一種人造轉錄因子，係用於治療由內皮素調節之疾病，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對該內皮素受體B啟動子之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於人造轉錄因子之用途，以製造供治療由內皮素調節之疾病之藥物。

由ET-1-依存性、ETRB媒介之人造轉錄因子調節的疾病有某些癌、神經退化及發炎相關病症。 又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其針對前述TLR4 啟動子，用在影響細胞對於LPS之應答，用於降低或增加TLR4水平，並用於治療由LPS調節之疾病，特別用於治療如此的眼疾。同樣，本發明係關於一種治療由LPS調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的針對該TLR4 啟動子之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於一種人造轉錄因子，係用於治療由LPS調節之疾病，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對該TLR4 啟動子之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於人造轉錄因子之用途，以製造供治療由LPS調節之疾病之藥物。 由LPS調節之疾病有: 類風濕性關節炎、動脈粥狀硬化、牛皮癬、克羅恩氏病、葡萄膜炎、隱形眼鏡相關角膜炎、角膜發炎、對癌化療之耐受性等。

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其針對前述FcER1A 啟動子，用在影響細胞對於IgE或IgE-抗原複合體之應答，用於降低或增加FcER1水平，並用於治療由IgE或IgE-抗原複合體調節之疾病，特別用於治療如此的眼疾。

同樣，本發明係關於一種治療由IgE或IgE-抗原複合體調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的針對該FcER1A 啟動子之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於一種人造轉錄因子，係用於治療由IgE或IgE-抗原複合體調節之疾病，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對該FcER1A 啟動子之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於人造轉錄因子之用途，以製造供治療由IgE或IgE-抗原複合體調節之疾病之藥物。

IgE或IgE-抗原複合體調節的疾病為依Coombs與Gell分類法分為一般類型I的反應(Gell P. and Coombs R. (eds), 1968, Clinical Aspects fo Immunology, Blackwell Scientific, Oxford)。如此的反應包括但不限於: 過敏性鼻炎、哮喘、特應性皮炎、花粉過敏、食物過敏、花粉症、呼吸道過敏、寵物過敏、粉塵過敏、塵蟎過敏、過敏性蕁麻疹、過敏性肺泡炎、過敏性麴黴病、過敏性支氣管炎、過敏性眼瞼炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性結膜炎、過敏性真菌性鼻竇炎、過敏性腸胃炎、過敏性間質性腎炎、過敏性角膜炎、過敏性咽喉炎、過敏性紫癜、過敏性尿道炎、過敏性血管炎、濕疹、急性過敏(anaphylaxis)等。

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，組合成靶向前述核受體之啟動子區，以供用在影響對於該核受體配體之細胞應答，用於降低或增加該核受體水平，並用於治療由如此的該核受體調節之疾病。同樣，本發明係關於一種治療由核受體配體調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的針對該核受體啟動子之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於一種人造轉錄因子，係用於治療由核受體配體調節之疾病，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對核受體啟動子之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於人造轉錄因子之用途，以製造供治療由核受體配體調節之疾病之藥物。

由核受體配體調節之疾病例如： 腎上腺功能不全、腎上腺皮質功能不全、酒精中毒、阿爾茨海默氏病、雄性素不敏感症候群、神經性厭食症、大主動脈動脈瘤、大主動脈瓣硬化、關節炎、哮喘、動脈粥狀硬化、注意力缺陷多動障礙、自閉症、無精症、膽道初級肝硬化、雙向極性紊亂、膀胱癌、骨癌、乳癌、心血管疾病、心血管心肌梗塞、腹腔疾病、膽汁鬱積、慢性腎功能衰竭和代謝症候群、肝硬化、腭裂、結腸直腸癌、先天性腎上腺發育不全、冠狀動脈心臟疾病、隱睪、深靜 脈血栓形成、癡呆、抑鬱症、糖尿病性視網膜病變、子宮內膜異位、子宮內膜癌、增強的S-錐體症候群、原發性高血壓、家族性部分脂肪營養障礙、成膠質細胞瘤、糖皮質素耐受性、Graves'病、高血脂水平、高脫輔基β-脂蛋白血症(hyperapobetalipoproteinemia)、高脂血症、高血壓、高甘油三酯血症、性腺機能減退、尿道下裂、不育症、炎性腸疾病、胰島素耐受性、缺血性心臟疾病、肝脂肪變性、肺癌、紅斑狼瘡、重性抑鬱症、男性乳腺癌、代謝血漿脂質水平、代謝症候群、偏頭痛、多發性硬化、心肌梗塞、腎病症候群、非何傑金氏淋巴瘤、肥胖、骨關節炎、骨質減少、骨質疏鬆、卵巢癌、帕金森氏病、先兆子癇、孕酮耐受性、前列腺癌、假性醛甾酮過少(pseudohypoaldosteronism) 、牛皮癬、精神病精神分裂症、精神病、色素性視網膜炎-37、精神分裂症、硬化性膽管炎、性逆轉、皮膚癌、肯尼迪的脊髓和延髓萎縮、易患心肌梗塞、易患牛皮癬、睾丸癌、I型糖尿病、II型糖尿病、子宮癌和眩暈。

同樣，本發明係關於一種治療由核受體配體調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的本發明之人造轉錄因子。尤其本發明係關於一種治療腎上腺功能不全、腎上腺皮質功能不全、酒精中毒、阿爾茨海默氏病、雄性素不敏感症候群、神經性厭食症、大主動脈動脈瘤、大主動脈瓣硬化、關節炎、哮喘、動脈粥狀硬化、注意力缺陷多動障礙、自閉症、無精症、膽道初級肝硬化、雙向極性紊亂、膀胱癌、骨癌、乳癌、心血管疾病、心血管心肌梗塞、腹腔疾病、膽汁鬱積、慢性腎功能衰竭和代謝症候群、肝硬化、腭裂、結腸直腸癌、先天性腎上腺發育不全、冠狀動脈心臟疾病、隱睪、深靜 脈血栓形成、癡呆、抑鬱症、糖尿病性視網膜病變、子宮內膜異位、子宮內膜癌、增強的S-錐體症候群、原發性高血壓、家族性部分脂肪營養障礙、成膠質細胞瘤、糖皮質素耐受性、Graves'病、高血脂水平、高脫輔基β-脂蛋白血症(hyperapobetalipoproteinemia)、高脂血症、高血壓、高甘油三酯血症、性腺機能減退、尿道下裂、不育症、炎性腸疾病、胰島素耐受性、缺血性心臟疾病、肝脂肪變性、肺癌、紅斑狼瘡、重性抑鬱症、男性乳腺癌、代謝血漿脂質水平、代謝症候群、偏頭痛、多發性硬化、心肌梗塞、腎病症候群、非何傑金氏淋巴瘤、肥胖、骨關節炎、骨質減少、骨質疏鬆、卵巢癌、帕金森氏病、先兆子癇、孕酮耐受性、前列腺癌、假性醛甾酮過少(pseudohypoaldosteronism) 、牛皮癬、精神病精神分裂症、精神病、色素性視網膜炎-37、精神分裂症、硬化性膽管炎、性逆轉、皮膚癌、肯尼迪的脊髓和延髓萎縮、易患心肌梗塞、易患牛皮癬、睾丸癌、I型糖尿病、II型糖尿病、子宮癌和眩暈之方法，包括對於須要的患者投予有效量之本發明之人造轉錄因子。本發明之人造轉錄因子之有效量取決於欲治療的疾病及物種，年紀、體重、個別情形、個別的藥動學數據及投予模式。向眼內投予時，宜每月進行玻璃體注射0.5至1 mg 。針對全身性施用，宜每月注射10 mg/kg。此外，向眼內之玻璃體植入緩釋沉積物亦為理想。

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其針對前述糖皮質素受體，用在影響細胞對於糖皮質素受體之配體之應答，用於降低或增加糖皮質素受體水平，並用於治療由糖皮質素受體之配體調節之疾病。 同樣，本發明係關於一種治療由糖皮質素受體之配體調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的針對該糖皮質素受體之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於一種人造轉錄因子，係用於治療由糖皮質素受體之配體調節之疾病，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對該糖皮質素受體之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於人造轉錄因子之用途，以製造供治療由糖皮質素受體之配體調節之疾病之藥物。 考慮的疾病有：糖皮質素耐受性、II型糖尿病、肥胖症、冠狀動脈粥狀硬化、冠狀動脈疾病、哮喘、腹腔疾病、紅斑狼瘡、抑鬱症、緊張和腎病症候群。本發明之人造轉錄因子之有效量取決於欲治療的疾病及物種，年紀、體重、個別情形、個別的藥動學數據及投予模式。向眼內投予時，宜每月進行玻璃體注射0.5至1 mg 。針對全身性施用，宜每月注射10 mg/kg。此外，向眼內之玻璃體植入緩釋沉積物亦為理想。

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其針對前述雄性素受體，用在影響細胞對於雄性素受體之配體之應答，用於降低或增加雄性素受體水平，並用於治療由雄性素受體之配體調節之疾病。同樣，本發明係關於一種治療由雄性素受體之配體調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的針對該雄性素受體之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於一種人造轉錄因子，係用於治療由雄性素受體之配體調節之疾病，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對該雄性素受體之人造轉錄因子。

同樣，本發明係關於人造轉錄因子之用途，以製造供治療由雄性素受體之配體調節之疾病之藥物。 考慮的疾病有: 前列腺癌、男性乳腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、睪丸癌、冠狀動脈動脈病、I型糖尿病、糖尿病性視網膜病、肥胖症、雄性素不敏感症候群、骨質疏鬆症、骨關節炎、II型糖尿病、阿爾茨海默氏病、偏頭痛、注意缺陷多動障礙、抑鬱症、精神分裂症、無精症、子宮內膜異位症，和肯尼迪的脊髓和延髓萎縮。 本發明之人造轉錄因子之有效量取決於欲治療的疾病及物種，年紀、體重、個別情形、個別的藥動學數據及投予模式。向眼內投予時，宜每月進行玻璃體注射0.5至1 mg 。針對全身性施用，宜每月注射10 mg/kg。此外，向眼內之玻璃體植入緩釋沉積物亦為理想。

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其針對前述雌性素受體，用在影響細胞對於雌性素受體之配體之應答，用於降低或增加雌性素受體水平，並用於治療由雌性素受體之配體調節之疾病。同樣，本發明係關於一種治療由雌性素受體之配體調節之疾病之方法，包含對於需要的患者投予治療上有效量的針對該雌性素受體之人造轉錄因子。同樣，本發明係關於一種人造轉錄因子，係用於治療由雌性素受體之配體調節之疾病，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對該雌性素受體之人造轉錄因子。

同樣，本發明係關於人造轉錄因子之用途，以製造供治療由雌性素受體之配體調節之疾病之藥物。 考慮的疾病為：骨癌、乳腺癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、酒精中毒、偏頭痛、大主動脈動脈瘤、易患心肌梗塞、大主動脈瓣硬化、心血管疾病、冠狀動脈疾病、高血壓、深部靜脈血栓形成、Graves'病、關節炎、多發硬化症、肝硬化、乙型肝炎、慢性肝病、膽汁淤積、尿道下裂、肥胖、骨關節炎、骨質減少、骨質疏鬆症、阿爾茨海默氏症、帕金森氏病、偏頭痛、眩暈)、神經性厭食症、注意力缺陷多動障礙、癡呆症、抑鬱症、精神病、子宮內膜異位症和不孕症。 本發明之人造轉錄因子之有效量取決於欲治療的疾病及物種，年紀、體重、個別情形、個別的藥動學數據及投予模式。向眼內投予時，宜每月進行玻璃體注射0.5至1 mg 。針對全身性施用，宜每月注射10 mg/kg。此外，向眼內之玻璃體植入緩釋沉積物亦為理想。

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其組合成靶向如前述單倍不足基因之啟動子區，以用於回復基因生產至生理水平，以為了減輕因由於基因產物表現不足所致之病理表型。同樣，本發明係關於一種治療由於單倍不足所造成或調節之疾病之方法，包括對於須要之病患投予治療上有效量之針對單倍不足基因啟動子之人造轉錄因子。同樣本發明係關於一種人造轉錄因子，係用治療由單倍不足調節之疾病，包括對於須要之病患投予治療上有效量之針對單倍不足基因啟動子之人造轉錄因子。同樣本發明係關於一種人造轉錄因子之用途，係用於製造針對治療由單倍不足調節之疾病之藥物。

本發明考慮之疾病為： Léri-Weill 軟骨骨生成障礙綜合症、有TDP43包含體的額顳葉退化、Kleefstra症候群、迪喬治症候群、神經纖維瘤病Ⅰ型、皮特·霍普金斯症候群、有小頭畸形之頜面骨發育不全、威廉姆斯 - 博伊倫症候群、常染色體顯性遺傳埃勒斯 - 當洛症候群IV型、sepiapterin還原酶缺乏導致之多巴反應性肌張力障礙、眼皮膚白化病Ⅱ型、史密斯 - 馬蓋尼斯症候群、副甲狀腺功能減退、神經性耳聾和腎病(HDR)、斯蒂克勒症候群I型、莫厄特 - 威爾遜症候群、病徵小眼球3、埃勒斯 - 當洛症候群III型、無虹膜、假性副甲狀腺功能減退Ia型、早期嬰兒癲癇性腦病4、皮膚脆弱-毛狀毛髮症候群、Miller-Dieker平腦症症候群、沃爾夫 - 赫塞豪恩症候群、毛髮鼻指症候群 第1型(trichorhinophalangeal syndrome Type I)、耳牙發育不良(otodental dysplasia)、伴缺損之耳牙症候群、強直性肌營養不良1、特雷徹 - 柯林斯症候群1、家族性反常性痤瘡1、埃勒斯 - 當洛症候群I型、短指-智力低下症候群、顎-心-臉症候群、尺骨-乳腺綜合症、短指發育不良、早期嬰兒癲癇性腦病5、Koolen-De Vries症候群、前空腦(holoprosencephaly)5、症候群型小眼球6、Dravet症候群、Glut1缺失症候群1、神經退化與腦鐵堆積3、常染色體隱性少年帕金森病2、并指多指畸形1、大主動脈瓣膜上狹窄、顯性視神經萎縮1、卡尼複雜類型1(Carney complex Type 1) 、帕里斯特霍爾症候群(Pallister-Hall syndrome)、霍爾特 - 奧拉姆症候群(Holt-Oram syndrome)、α-地中海貧血/智力低下症候群、癲癇、良性家族性新生兒1(benign familial neonatal 1) 、Alagille症候群1、短指C型、家族性血小板紊亂與相關的骨髓惡性腫瘤、胰不發育與先天性心臟缺陷、端粒相關的肺纖維化及/或骨髓衰竭1、鏡子動作2(mirror movements 2)、語音語言障礙1、常染色體顯性遺傳性耳聾9、肯尼 - 卡菲症候群1型、共濟失調 - 毛細血管擴張症、頂葉椎間孔、法因戈爾德症候群1、指甲髕骨症候群、常染色體顯性遺傳智力低下1、全前腦症(holoprosencephaly)3、先天性馬蹄內翻足及有或無缺陷的長骨及/或鏡像多趾、索托斯症候群1、Loeys-Dietz 症候群4型、特發性基底節鈣化3、三角頭症(trigonocephaly)2、中央核肌病3、有或無小腦性共濟失調之認知功能障礙、家族部分脂肪代謝障礙4型、正中神經單神經病、瓦登伯革氏症候群4b型、瓦登伯革氏症候群4b型、非典型溶血性尿毒症候群5、常染色體顯性遺傳性痙攣性截癱42、假性副甲狀腺功能減退、常染色體顯性遺傳性痙攣性截癱31、常染色體顯性進行性外眼肌麻痺與線粒體DNA缺失4、脊髓小腦性共濟失調27、腓骨肌萎縮症類型2a2、常染色體顯性遺傳聽神經病1、并指多指症2、肢帶型肌營養不良症類型1c、平腦症1、脊髓小腦性共濟失調15、埃勒斯 - 當洛樣症候群、遺傳性運動和感覺神經病變類型IIC、毛狀胳膊及身材矮小的面部異形和發育遲緩、Axenfeld-Rieger症候群3型、家族性嬰兒驚厥伴發作性手足舞蹈徐動症(familial infantile convulsions with paroxysmal choreoathetosis)、急性髓系白血病、腓骨肌萎縮症類型2d、先天性白內障與感覺神經性耳聾、唐氏症候群樣面容及身材矮小和智力遲鈍、常染色體顯性遺傳性耳聾5、有或無白內障之高鐵蛋白血症(hyperferritinemia)、顏面斜裂1、常染色體顯性遺傳性耳聾2a、早期嬰兒癲癇性腦病1、易患孤獨症X連鎖2(autism X-Linked 2) 、Usher症候群IIIa、血小板過低合併橈骨缺失症候群(thrombocytopenia-absent Radius syndrome)、常染色體隱性遺傳Robinow症候群、肺泡毛細血管發育不良錯位肺靜脈S、彈性假黃瘤(pseudoxanthoma elasticum)、家族性高胰島素低血糖1、烏爾里希先天性肌營養不良、亞胺基甘胺酸尿(iminoglycinuria)、Charge症候群、威爾姆氏腫瘤( Wilms' Tumor) 、無虹膜、泌尿生殖異常和智力發育遲緩症候群、法洛四聯症、常染色體顯性遺傳性痙攣性截癱4、家族性進行性硬皮病、CREST症候群、常染色體顯性Emery-Dreifuss肌營養不良症2、唾淚腺發育不全、視網膜母細胞瘤、Dowling-Degos病、原發性肺動脈高壓1、Currarino症候群、骶骨不發育症候群、Prader-Willi症候群、Greig症候群(Greig cephalopolysyndactyly syndrome)、幼年性息肉病/遺傳性出血性毛細血管擴張症、斑駁病(Piebald Trait)、肢帶型肌營養不良症類型1b、貝斯蘭氏(Bethlem)肌病、考登病、馬方症候群、腎低鎂血症2、小頭畸形暨有或無脈絡膜視網膜病變、淋巴水腫或精神發育遲滯侵填體暨食道癌(mental retardation tylosis with esophageal cancer)、歌舞伎症候群1、雅各布森症候群、膈疝、先天性橋本甲狀腺炎、開角型青光眼1、貝克威思 - 威德曼症候群、多巴反應性肌張力障礙、發作性運動誘發性運動障礙1、先天性牙萌出障礙、Darier-White病、常染色體顯性皮膚鬆弛症1、Cornelia De Lange症候群1、鎖骨顱骨發育不良、口面裂1、Van Der Woude症候群1、巨頷症(cherubism)、腦海綿狀血管瘤、家族性肥厚型心肌病4、心顏皮膚(cardiofaciocutaneous)症候群、短指D型、基底細胞痣症候群、軟骨發育不全、頂葉椎間孔2、波托茨基- 謝弗症候群、常染色體顯性遺傳先天性角化不良2、有語言障礙和自閉症特徵的智力低下、常染色體顯性遺傳無汗性外胚層發育不良與T細胞免疫缺陷、皮質類固醇結合位球蛋白缺乏症、舞蹈手足徐動症、甲狀腺功能減退及新生兒呼吸窘迫、主要輔酶Q10缺失1、杜安-放射線症候群、家族性偏癱型偏頭痛2、鏡子動作1、Nager型肢端顏面骨發育不全1、掌蹠角化病點狀Ia型、及促性腺素低下性性腺功能減退合併有或無嗅覺喪失2。

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其針對前述OPA1 啟動子，用於增加OPA1生產，及用於治療由OPA1影響的疾病，特別用於治療如此的眼疾。由OPA1調節之疾病有: 常染色體顯性遺傳性視神經萎縮，常染色體顯性遺傳性視神經萎縮加(autosomal dominant optic atrophy plus)及正常眼壓青光眼。

同樣本發明係關於一種治療由OPA1影響之疾病之方法，包含對於須要的病患投予治療上有效量之針對OPA1 啟動子之人造轉錄因子。同樣本發明係關於一種人造轉錄因子，用於治療由OPA1影響之疾病，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對OPA1 啟動子之人造轉錄因子。同樣本發明係關於一種人造轉錄因子之用途，用於製造治療由OPA1影響之疾病之藥物。

尤其本發明係關於一種治療和正常眼壓青光眼或顯性顯性遺傳性視神經萎縮相關之神經退化的方法。本發明之人造轉錄因子之有效量取決於欲治療的疾病及物種，年紀、體重、個別情形、個別的藥動學數據及投予模式。向眼內投予時，宜每月進行玻璃體注射0.5至1 mg 。針對全身性施用，宜每月注射10 mg/kg。此外，向眼內之玻璃體植入緩釋沉積物亦為理想。

又，本發明係關於一種人造轉錄因子，其針對前述TGFbR1 啟動子，用於增加或減少TGFbR1生產，及用於治療由TGFbR1影響的病理過程，特別用於治療眼之如此的病理過程。由TGFbR1調節之病理過程有: 眼手術後傷口癒合不良。

同樣本發明係關於一種治療由TGFBR1影響之疾病之方法，包含對於須要的病患投予治療上有效量之針對TGFBR1啟動子之人造轉錄因子。同樣本發明係關於一種人造轉錄因子，用於治療由TGFBR1影響之疾病，包括對於須要的病患投予治療上有效量之針對TGFBR1啟動子之人造轉錄因子。同樣本發明係關於一種人造轉錄因子之用途，用於製造治療由TGFBR1影響之疾病之藥物。

尤其本發明係關於一種治療和正常眼壓青光眼或顯性顯性遺傳性視神經萎縮相關之神經退化的方法。本發明之人造轉錄因子之有效量取決於欲治療的疾病及物種，年紀、體重、個別情形、個別的藥動學數據及投予模式。向眼內投予時，宜每月進行玻璃體注射0.5至1 mg 。針對全身性施用，宜每月注射10 mg/kg。此外，向眼內之玻璃體植入緩釋沉積物亦為理想。人造轉錄因子於植物之用途

又，本發明係關於一種人造轉錄因子之用途，其針對植物啟動子以增加基因產物生產。較佳為選殖編碼為該人造轉錄因子之DNA到載體內供轉形植物轉殖微生物或植物。或該人造轉錄因子直接使用在適當的組成物以供對於植物局部施用。人造轉錄因子 於非人動物之用途

又，本發明係關於人造轉錄因子之用途，其靶向非人動物啟動子、單倍不足，以增進基因產物生產。該人造轉錄因子宜直接使用在適當的組成物以供對於須要的非人動物局部施用。生產多指之鋅指蛋白之方法

尤其本發明係關於一種生產包含8元或更高級鋅指蛋白之多指之鋅指蛋白的方法，包括以下步驟： i) 從第1鋅指蛋白庫選擇6元鋅指蛋白； ii) 基於在 i)選出的6元鋅指蛋白，利用將此6元鋅指蛋白融合於2或更多鋅指之隨機庫以建構第2鋅指蛋白庫； iii) 選擇包括8元或更高級鋅指蛋白之多指之鋅指蛋白。

該第1鋅指蛋白庫及第2鋅指蛋白庫宜包括包括一表現載體，該載體在該蛋白質庫之寄主生物有1-2個副本，該表現載體包括可操縱地連結於該8元或更高級鋅指蛋白之一啟動子，該啟動子在Saccharomyces cerevisae 中表現8元或更高級鋅指蛋白之表現率等於或低於在同樣Saccharomyces cerevisae 之SEQ ID NO: 197啟動子表現8元或更高級鋅指蛋白之表現率。

較佳為該第1鋅指蛋白庫與該第2鋅指蛋白庫包括一表現載體，該載體在該蛋白質庫之寄主生物有1-2個副本，該表現載體包括可操縱地連結於該8元或更高級鋅指蛋白之SEQ ID NO: 197之啟動子。

該方法使用的寄主生物係選自於由哺乳動物、昆蟲、真菌、酵母菌及細菌構成的群組，較佳為酵母菌。

於一較佳具體例，6元鋅指蛋白係從  i)之該鋅指蛋白庫利用修飾的酵母單雜交 方案選出，其中，鋅指蛋白係以融合於酵母菌之GAL4活化分域的方式表現，以表現出Aureobasidin耐受性。選擇蛋白質之篩選系統

尤其本發明係關於選擇蛋白質之篩選系統，包括： i) 能表現該蛋白質之寄主生物； ii)表現載體，其在i)之寄主生物中有1-2個副本存在，其中該表現載體包括可操縱地連結於該蛋白質之一啟動子，該啟動子在寄主生物中表現該蛋白質之表現率等於或低於在同樣寄主生物之可操縱地連結於啟動子之相同蛋白質之表現率。較佳為該表現載體包括可操縱地連結於該蛋白質之SEQ ID NO: 197之啟動子。較佳為該表現載體包括ARS/CEN複製起點。

故本發明更關於一表現載體，其包括ARS/CEN複製起點及可操縱地連結於一蛋白質之啟動子，其中該啟動子在寄主生物中表現關注蛋白質之表現率等於或低於在同樣寄主生物之可操縱地連結於SEQ ID NO: 197啟動子之相同蛋白質之表現率。較佳為該表現載體包括可操縱地連結於該蛋白質之SEQ ID NO: 197之啟動子。

可操縱地連結於一蛋白質例如鋅指蛋白之SEQ ID NO: 197之啟動子表現率定義如下： 當於如此的啟動子控制下於含有整合到URA3 標記之餌質體 pAN2636 (SEQ ID NO: 199)之酵母菌Y1H Gold (Clontech)表現SEQ ID NO: 198之GAL4AD-ZFP蛋白質時，如此的酵母菌細胞會只能在含有少於2500 ng/ml 之Aureobasidin A之選擇平板上生長。建構專一性靶向之治療劑之方法

本發明更包括一種建構用於遞送到患病細胞之細胞質及/或細胞核及/或細胞質中之胞器之專一性靶向之治療劑之方法，包括以下步驟： (a) 選擇一治療上有效之蛋白質，其當遞送到患病細胞之細胞質及/或細胞核及/或細胞質中之胞器時具有有益性質； (b) 決定該患病細胞中之內體專一性蛋白酶之相對量； (c) 決定和患病細胞為同細胞類型之健康細胞中之內體專一性蛋白酶之相對量； (d) 比較步驟(b)與(c)之內體專一性蛋白酶之相對量，並選出在患病細胞中比起在同細胞類型之健康細胞中有實質較高的相對濃度之至少1種內體專一性蛋白酶； (e) 建構該專一性標靶的治療劑，係藉由融合步驟(a)之該治療上有效的蛋白質至包含1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，並將在步驟(d)選出之對於該內體專一性蛋白酶為專一的至少1個內體專一性蛋白酶切開位併入於該治療上有效之蛋白質與該蛋白質轉導分域之間。專一性地靶向治療上有效之蛋白質之方法

本發明更關於對於對象之患病細胞之細胞質及/或細胞核及/或細胞質中之胞器靶向治療上有效之蛋白質之方法，包括以下步驟： (a) 選擇一治療上有效之蛋白質，其當遞送到對象之患病細胞之細胞質及/或細胞核及/或細胞質中之胞器時具有有益性質； (b)  決定該患病細胞中之內體專一性蛋白酶之相對量； (c) 決定和患病細胞為同細胞類型之健康細胞中之內體專一性蛋白酶之相對量； (d)  比較步驟(b)與(c)之內體專一性蛋白酶之相對量，並選出在患病細胞中比起在同細胞類型之健康細胞中有實質較高的相對濃度之至少1種內體專一性蛋白酶； (e) 融合步驟(a)之該治療上有效的蛋白質至包含1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，並將在步驟(d)選出之對於該內體專一性蛋白酶為專一的至少1個內體專一性蛋白酶切開位併入於該治療上有效之蛋白質與該蛋白質轉導分域之間。 (f)  將步驟(e)之產物對於對象投予以使得步驟(a)之治療上有效之蛋白質遞送到該對象之患病細胞之細胞質及/或細胞核及/或細胞質中之胞器。包括對於須要的對象投予治療上有效之蛋白質之治療方法

本發明更關於一種包括對於須要的對象投予治療上有效之蛋白質之治療方法，包含以下步驟： (a) 選擇一治療上有效之蛋白質，其當遞送到對象之患病細胞之細胞質及/或細胞核及/或細胞質中之胞器時具有有益性質； (b) 決定該患病細胞中之內體專一性蛋白酶之相對量； (c) 決定和患病細胞為同細胞類型之健康細胞中之內體專一性蛋白酶之相對量； (d) 比較步驟(b)與(c)之內體專一性蛋白酶之相對量，並選出在患病細胞中比起在同細胞類型之健康細胞中有實質較高的相對濃度之至少1種內體專一性蛋白酶； (e) 融合步驟(a)之該治療上有效的蛋白質至包含1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，並將在步驟(d)選出之對於該內體專一性蛋白酶為專一的至少1個內體專一性蛋白酶切開位併入於該治療上有效之蛋白質與該蛋白質轉導分域之間。 (f) 將步驟(e)之產物對於對象投予以使得步驟(a)之治療上有效之蛋白質遞送到該對象之患病細胞之細胞質及/或細胞核及/或細胞質中之胞器。

於本發明之上下文，對於所望細胞時具有有益性質之治療上有效之蛋白質係指蛋白質具有酵素性或結構性質，當從外部對於對象給予時會改善細胞生理及/或治癒或預防病理失調。

上述方法包括以下的特定具體例。於一特定具體例，該治療上有效之蛋白質以其N端融合於運送蛋白之C端 。蛋白質轉導分域如同上述，較佳為HIV衍生之TAT 肽，最佳為HIV衍生之TAT 肽 (SEQ ID NO:1)。於一特定具體例，該運送蛋白更包含一肽序列，其導向次細胞局部化。導向次細胞局部化之肽序列，定義為：能直接運送含如此序列之蛋白質到不同的胞內胞器的胺基酸序列。缺少如此的序列的蛋白質預設為留在該細胞質。於一特定具體例，導向次細胞局部化之該肽序列 為核局部化序列，尤其是SV40 核局部化序列。於一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為抗體，尤其全長抗體，較佳為人或人化抗體，其結合於胞內蛋白質，或為抗體衍生物，其保持抗體對於胞內蛋白質之結合專一性。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為單鏈抗體。較佳為人或人化單鏈抗體，其結合於胞內蛋白質。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為DARPin，宜為結合於胞內蛋白質之DARPin。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為單體(monobody)，宜為結合於胞內蛋白質之單體。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為奈米體(nanobody)，較佳為結合於胞內蛋白質之之奈米體。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為親和體(affibody)，較佳為結合於胞內蛋白質之親和體。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為anticalin，較佳為結合於胞內蛋白質之anticalin。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為avimer，較佳為結合於胞內蛋白質之avimer。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為affilin，較佳為結合於胞內蛋白質之affilin。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為nanofitin，較佳為結合於胞內蛋白質之nanofitin。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為DNA結合蛋白質。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為RNA結合蛋白質。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為人造轉錄因子，其包括:專一性靶向於基因啟動子之多指之鋅指蛋白，該鋅指蛋白融合於抑制性或活化性蛋白質分域，其中較佳為該基因啟動子為受體基因啟動子。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為胞內蛋白質之顯性負突變。於另一特定具體例，該治療上有效之蛋白質為有酵素活性的蛋白質。

於一特定具體例，本發明也係關於一種治療劑，其包括治療上有效之蛋白質，融合於包含1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白並包含1個單一或2或更多內體專一性蛋白酶切開位，較佳係關於一種治療劑，包含治療上有效之蛋白質，融合於包含1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白並並包含1個單一或2或更多內體專一性蛋白酶切開位，其中該單一內體專一性蛋白酶切開位不同於SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。 實施例 DNA 質體之選殖

所有選殖步驟中的限制內切酶及T4 DNA 連接酶係從New England Biolabs購買。蝦鹼性磷解酶(SAP)係從Promega購買。使用高保真度Platinum Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen)於所有標準PCR反應。使用NucleoSpin Gel 及PCR Clean-up套組 、NucleoSpin質體套組或NucleoBond Xtra Midi Plus套組 (Macherey-Nagel)依廠商說明書單離DNA片段與質體。寡核苷酸從Sigma-Aldrich購買。新產生的質體的相關DNA序列以定序(Microsynth)驗證。 選殖針對酵母 單 雜交 之 6 元鋅指蛋白庫

用以下的改良並依照Gonzalez B.et al,. 2010,Nat Protoc 5, 791-810之方法選殖含有GNN及/或CNN及/或ANN 結合鋅指 (ZF)模組之6元鋅指蛋白庫。合成編碼為GNN、CNN及ANN ZF之模組DNA序列並插入到pUC57 (GenScript)，獲得pAN1049 (SEQ ID NO: 107)、pAN1073 (SEQ ID NO: 108) 及pAN1670 (SEQ ID NO: 109)。於pBluescript SK (+) 載體逐步組合鋅指蛋白 (ZFP)庫。為了防止在個別的選殖步驟插入多重ZF模組而產生無功能蛋白質，將 pBluescript (及包括1ZFP、2ZFPs或3ZFP之其衍生產物)及pAN1049、pAN1073或pAN1670先與一限制酶培育後，再以SAP處理。於添加第2限制內切酶前，使用NucleoSpin Gel與PCR Clean-up套組移除酵素。

pBluescript-1ZFPL之選殖係藉由用Xho I、SAP處理5 μg pBluescript，接著以Spe I 處理。利用將10 μg pAN1049 (釋出16種不同的GNN ZF模組)或pAN1073 (釋出15種不同的CNN ZF模組)或pAN1670 (釋出15種不同的ANN ZF模組)和Spe I、SAP及接著Xho I一起培育以生產。為了產生pBluescript-2ZFPL 與pBluescript-3ZFPL，將7 μg pBluescript-1ZFPL或pBluescript-2ZFPL 以Age I切開，去磷酸化，並以Spe I切開。藉由施用Spe I、SAP及接續的Xma I到10 μg pAN1049或pAN1073或pAN1670而獲得插入物。pBluescript-6ZFPL之選殖係藉由以Age I、SAP處理，再以Spe I處理14 μg  pBluescript-3ZFPL，以將載體切開以獲得。藉由將20 ug pBluescript-3ZFPL 和Spe I、SAP及接續的Xma I一起培育，釋出3ZFPL插入物。

將包括1、2或3個ZFP之庫用接合反應物，使用200 ng 切開載體、400 U T4 DNA 連接酶安排成插入物:載體成為3:1莫耳比，總體積20 μl，於RT (室溫)整夜。將包括2000 ng pBluescript-3ZFPL、500 ng 3ZFPL 插入物、4000 U T4 DNA 連接酶之6元鋅指蛋白庫之接合反應物，體積共200 μl分成10份個20 μl，並分開地於室溫培育整夜。將接合反應物的部分針對各庫所須之選殖體的數量，以數種方法轉形到Escherichia coli 內。為了產生pBluescript-1ZFPL 與pBluescript-2ZFPL，直接使用3 μl 的接合反應物以供熱休克轉形E. coli NEB 5-alph。將pBluescript-3ZFPL之接合反應之質體 DNA 使用NucleoSpin Gel與PCR Clean-up套組精製，並轉形到電勝任(electrocompetent)的E. coli NEB 5-alpha (來自EquiBio之EasyjecT Plus electroporator，或來自Eppendorf 之Multiporator，2.5 kV 與25 μF2 mm 電穿孔光析管，來自Bio-Rad)。將pBluescript-6ZFP庫之接合反應施用到NucleoSpin Gel與PCR Clean-up套組，於15 μl去離子水中提取DNA。將約60 ng的脫鹽DNA和50 μl NEB 10-beta 電勝任E. coli (New England Biolabs) 混合，並使用EasyjecT Plus或Multiporator 2.5 kV, 25 μF 與2 mm 電穿孔光析管依製造商建議實施電穿孔。針對各庫實施多次電穿孔，並於之後直接合併細胞以增大庫的大小。熱休克轉形或電穿孔後，將SOC培養基施用於該細菌，於37°C 及250 rpm的條件培育1小時後，使用30 μl的SOC培養物供系列稀釋，並接種在含安皮西林的LB平板。次日，決定所獲之庫選殖體的總數。此外從各庫選出10個選殖體以單離質體 DNA，並利用限制酶消化確認插入物之包入。至少定序此等質體中的3個以驗證該庫之多樣性。將其餘的SOC培養物移至含安皮西林的100 ml LB培養基，於37°C 與250 rpm 培養整夜。使用此等細胞以製備針對各庫的質體 Midi DNA。

針對酵母單雜交 篩選，將6元鋅指蛋白庫轉移到可相容的目標載體。為此用途，藉由以Xho I/Eco RI 切開該載體並且插入黏合的寡核苷酸OAN971 (TCGACAGGCCCAGGCGGCCCTCGAGGATATCATGATG ACTAGTGGCCAGGCCGGCCC, SEQ ID NO: 110)與OAN972 (AATTGGGCCGGC CTGGCCACTAGTCATCATGATATCCTCGAGGGCCGCCTGGGCCTG, SEQ ID NO: 111)　以修飾pGAD10 (Clontech)之多重選殖位。將獲得的載體 pAN1025 (SEQ ID NO: 112)切開並去磷酸化，利用Xho I/Spe I 使6ZFP庫插入物從pBluescript-6ZFPL釋出。進行接合反應及電穿孔到NEB 10-beta 電勝任E. Coli 內 ， 如同 針對pBluescript-6ZFP庫所述。

針對已改良的酵母單雜交篩選，亦將6元鋅指庫轉移到已改良的目標載體 pAN1375 (SEQ ID NO: 113)。此目標載體以如下方式建構：以Apa I/Nar I切開pRS315 (SEQ ID NO: 114)，並插入黏合OAN1143 (CGCCGCATGCATTCATGCAGGCC, SEQ ID NO: 115)與OAN1144 (TGCATGAATGCATGCGG, SEQ ID NO: 116)，以獲得pAN1373 (SEQ ID NO: 117)。將來自pAN1025之Sph I插入物連接到以Sph I切開的pAN1373，以獲得pAN1375。

針對更改善的酵母單雜交篩選，亦將6元鋅指庫轉移到一改良的目標載體 pAN1920 (SEQ ID NO: 118)內。

針對更改善的酵母單雜交篩選，將6元鋅指庫插入到目標載體 pAN1992 (SEQ ID NO: 119)內。 選殖針對酵母單雜交篩選之餌質體

針對各餌質體，選擇在中央包括18 bp 之人造轉錄因子標靶位之一段60 bp序列，並於其中納入Nco I位以供限制分析。設計寡核苷酸並黏合成產生5’Hin dIII 及3’Xho I位以供直接接合到經Hin dIII/Xh oI切開的pAbAi (Clontech)。將產物以Nco I消化並定序以確認餌質體之組合。 酵母菌品系及培養基

Saccharomyces cerevisiae Y1H Gold係從Clontech購買，YPD培養基及YPD 瓊脂係叢Carl Roth購買。合成的成分欠缺(drop-out)(SD)培養基包含: 20 g/l 葡萄糖、6.8 g/l Na₂ HPO₄ ·2H₂ O、9.7 g/l NaH₂ PO₄ ·2H₂ O (均購自Carl Roth)、1.4 g/l 酵母菌合成drop-out培養基補充物、6.7 g/l 酵母菌氮基、0.1 g/l L‑色胺酸、0.1 g/l L-白胺酸、0.05 g/l L-腺嘌呤、 0.05 g/l L-組胺酸、0.05 g/l 尿嘧啶 (均購自Sigma-Aldrich)。SD‑U 培養基包括尿嘧啶以外的各種成分，SD‑L 係製備成不含L-白胺酸。SD瓊脂平板不含磷酸鈉，含16 g/l Bacto Agar (BD)。Aureobasidin A (AbA) 購自Clontech。 製備餌酵母菌品系

將各餌質體約5 μg以Bst BI直線化成總體積20 μl，將反應混合物中的一半直接用在對於S. cerevisiae Y1H Gold熱休克轉形。於轉形前一天使用酵母菌細胞接種5 ml YPD培養基，並於輥上於室溫生長整夜。將此預培養物1毫升以新鮮的YPD 培養基稀釋1:20，並於30°C, 225 rpm 培育2-3小時。針對各轉形反應，以離心收集1 OD₆₀₀ 細胞，將酵母菌細胞以1 ml無菌水洗1次，以1 ml TE/LiAc (10 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 100 mM 乙酸鋰)洗1次。最後，將酵母菌細胞再懸浮於50 μl TE/LiAc ，與來自鮭魚精巢的50 μg 單股DNA (Sigma-Aldrich)、10 µl 之Bst BI-直線化餌質體 (見上)、及300 μl PEG/TE/LiAc (10 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 100 mM 乙酸鋰, 50 % (w/v) PEG 3350)混合。將細胞與DNA在輥上於室溫培育20分鐘，之後放進42°C 水浴15分鐘。最後，以離心收集酵母菌細胞，再懸浮於100 μl無菌水，並散播在SD-U瓊脂板上。於30°C 培育3天後，從各轉形反應中在SD-U上生長的選殖體中選出8個以分析其對於Aureobasidin A (AbA)的敏感性。將預培養物於輥上在室溫培養整夜。針對各培養物，測量OD₆₀₀ ，並以無菌水調整成OD₆₀₀ =0.3 。從此第1稀釋段，另以無菌水進行額外的5次1:10 稀釋步驟。針對各選殖體，將各稀釋步驟中的5 μl點到含SD‑U、SD‑U 100 ng/ml AbA、SD‑U 150 ng/ml AbA、及SD‑U 200 ng/ml AbA 的瓊脂板上。於30°C培育3天後，選出在SD-U生長良好且對於AbA最有敏感性的3個選殖體供進一步分析。使用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Clontech)依廠商說明書驗證餌質體已安定地嵌入到酵母菌基因體內。將3個選殖體中的1個用於後續的Y1H篩選。 以多指之鋅指蛋白庫進行餌酵母菌品系之轉形

將約500 μl的酵母菌餌品系預培養物於1 l YPD 培養基稀釋，於30°C 與225 rpm之條件培育直到成為OD₆₀₀ =1.6-2.0 (約20小時)。於甩開轉子內離心以收集細胞(5 min, 1500´g , 4°C)。依Benatuil L.et al ., 2010,Protein Eng Des Sel 23, 155-159製備電勝任細胞。針對各轉形反應，將400 μl 的電勝任餌酵母菌細胞和編碼為6ZFP庫之1 μg 目標質體混合，於冰上培育3 min。將細胞-DNA懸浮液轉移到預冷凍的2 mm 電穿孔光析管。實施多次電穿孔反應(EasyjecT Plus electroporator或Multiporator, 2.5 kV 與 25 μF)直到所有的酵母菌細胞懸浮液被轉形。電穿孔後，將酵母菌細胞移到100 ml之YPD:1 M 山梨醇之1:1 混合物，於30°C與225 rpm的條件培育60分鐘。以離心收集細胞，再懸浮於1-2 ml的SD-L培養基。將200 μl散播在含1000-4000 ng/ml AbA 之15 cm SD-L 瓊脂平板上。此外使用50 μl 的細胞懸浮液製作1/100及1/1000稀釋物，將 50 μl之未稀釋及已稀釋的細胞接種在SD-L上。將所有的平板於30°C培育3天。從帶有已稀釋之轉形體的平板計算獲得之選殖體的總數。帶有未稀釋細胞之SD-L平板顯示所有轉形體生長，而含AbA之SD-L平板只有在目標多指ZFP成功地結合於其餌標靶位時才有群落形成。 陽性交互作用之驗證及編碼為多指之鋅指蛋白之目標質體之回收

為了初步分析，從含最高濃度AbA之SD-L 平板挑取40個形狀良好的群落，將酵母菌細胞在含 1000-4000 ng/ml AbA 之SD-L上劃兩次以獲得單一群落。針對各選殖體。使用1個群落接種到5 ml SD-L培養基，使細胞於室溫生長整夜。次日，以無菌水調整成OD₆₀₀ =0.3，製備5份額外的1/10 稀釋物，將各稀釋步驟的各5 μl點到SD-L、SD-L 500 ng/ml AbA、1000 ng/ml AbA、SD-L 1500 ng/ml AbA、SD-L 2000 ng/ml AbA、SD-L 2500 ng/ml AbA、SD-L 3000 ng/ml AbA及SD-L 4000 ng/ml AbA 平板。將選殖體其依在高 AbA濃度生長的能力評分。從生長最良好的選殖體使用5 ml的起始SD-L預培養物旋降細胞，並將其再懸浮於100 μl水或其餘的培養基。添加50 U lyticase (Sigma-Aldrich, L2524)後，將細胞於37°C 與300 rpm的條件在水平振盪器上培育數小時。將產生的球狀體利用添加10 μl 20 % (w/v) SDS 溶液以溶解，於渦流混合器劇烈混合1分鐘，並於-20°C冷凍至少1小時。之後，加入來自NucleoSpin質體套組 之250 μl A1 緩衝液及1尖匙玻璃珠(Sigma-Aldrich, G8772)，將試管利用渦流混合器劇烈混合1分鐘。藉由在繼續進行標準NucleoSpin質體套組實驗步驟前，添加來自NucleoSpin質體套組之250 μl A2 緩衝液，並於室溫培育至少15 min，可進一步改善質體單離。以30 μl 提取緩衝液提取後，將5 μl的質體 DNA利用熱休克轉形轉形到E. coli DH5 alpha 內。從含安皮西林的LB平板挑取額外的2個群落，單離質體，並定序庫插入物。獲得的結果用來分析針對各標靶位之多指ZFP的共通序列。 選殖基因啟動子以供組合式之外泌的發光酶及鹼性磷解酶分析法

將包括啟動子區之DNA 片段選殖到pAN1485 (NEG-PG04, GemeCopeia)或pAN1486 (EF1a-PG04, GemeCopeia)以獲得報告子質體，該質體包含在單倍不足基因啟動子控制下的外泌Gaussia 發光酶及在固有性 CMV 啟動子控制下的外泌的胚胎鹼性磷解酶，以能標準化發光酶為鹼性磷解酶信號。 選殖報告子質體以產生穩定的發光酶 / 外泌性鹼性磷解酶報告子細胞株，供 測試可轉導之人造轉錄因子活性

為了產生包含在雜合CMV/人造轉錄因子標靶位啟動子控制下的Gaussia 發光酶以及在固有性 CMV 啟動子控制下的外泌性鹼性磷解酶的報告子建構物，將含該人造轉錄因子結合位之42 bp使用 Afl III/Spe I 選殖到pAN1660 (SEQ ID NO: 120)。此等報告子建構物包括FlpIn位以供穩定地嵌入含FlpIn位之細胞，例如HEK293 FlpIn TRex (Invitrogen)細胞。選殖人造轉錄因子以供哺乳動物轉染

將由Gensynthesis (GenScript)或由酵母單雜交選出的編碼為多指鋅指蛋白之DNA片段 使用標準程序(Age I/Xho I)選殖到哺乳動物表現載體，以供於哺乳動物中表現成介於關注的該鋅指陣列、SV40 NLS、3x myc 抗原決定基標籤及N端KRAB分域(pAN1255 - SEQ ID NO: 121)、C端 KRAB分域(pAN1258 - SEQ ID NO: 122)、SID分域(pAN1257 - SEQ ID NO: 123)或VP64 活化分域(pAN1510 - SEQ ID NO: 124)間的融合蛋白質。

依以下方法產生供產生穩定轉染、可誘導四環黴素之細胞的質體:將編碼為包括多指鋅指分域、調控分域(N端KRAB、C端 KRAB、SID或VP64)、SV40 NLS及3x myc 抗原決定基標籤之人造轉錄因子的DNA片段使用Eco RV/Not I選殖到pcDNA5/FRT/TO (Invitrogen)。

依以下方法產生供產生穩定轉染、可誘導四環黴素之細胞的質體:將編碼為包括多指鋅指分域、調控分域(N端KRAB、C端 KRAB、SID或VP64)、SV40 NLS之人造轉錄因子的DNA片段使用Eco RV/Age I選殖到pAN2071 (SEQ ID NO: 125)。此等人造轉錄因子表現質體可藉由和AAVS1 Left TALEN 與 AAVS1 Right TALEN (GeneCopoeia)共同轉染以嵌入到人基因體的AAVS1 基因座。細胞培養及轉染

HeLa細胞於補充4.5 g/l 葡萄糖、10 % 熱失活的胎牛血清、2 mM L-麩醯胺酸及1 mM 丙酮酸鈉(均購自Sigma-Aldrich)之Dulbecco’s 修飾Eagle’s 培養基(DMEM)，於5 % CO₂ 、37°C生長。針對發光酶報告子分析，將7000 HeLa細胞/井接種到96井平板。次日，使用Effectene Transfection Reagent (Qiagen)依廠商說明書實施共同轉染。編碼為人造轉錄因子與發光酶之質體 midi製備物以3:1的比例使用。於轉染後的6小時及24小時，將培養基以每井100 μl更換成新鮮的DMEM。 產生與維持 Flp-In^Tm T-Rex^TM 293 表現細胞株

藉由Flp Recombinase-媒介的嵌入以產生穩定的，可誘導四環黴素的Flp-In^Tm T-Rex^TM 293表現細胞株。使用Flp-In^Tm T-Rex^TM Core 套組，藉由轉染pFRT/lacZeo標靶位載體與pcDNA6/TR 載體以產生Flp-In^Tm T-Rex^TM 寄主細胞株。為了產生可誘導的293表現細胞株，將包括關注基因的pcDNA5/FRT/TO表現載體經由Flp recombinase-媒介之DNA重組而嵌入到Flp-In^Tm T-Rex^TM 寄主細胞株之FRT位。將穩定的Flp-In^Tm T-Rex^TM 表現細胞株在選擇培養基(含有DMEM; 10 % Tet-FBS; 2 mM 麩醯胺酸; 15 µg/ml blasticidine 及100 µg/ml 濕黴素)中維持。為了誘導基因表現，添加四環黴素至最終濃度成為1 µg/ml。 使用 TALENs 產生與維持穩定表現人造轉錄因子之細胞株

為了產生在四環黴素可誘導之啟動子控制下穩定表現人造轉錄因子之細胞株，使用Effectene (Qiagen) transfection reagent)按照廠商建議，將細胞以包括關注之人造轉錄因子之pAN2071系表現建構物、AAVS1 Left TALEN及AAVS1 Right TALEN (GeneCopoeia)質體共同轉染。轉染後8小時，抽走生長培養基，將細胞以PBS洗滌，添加新鮮的生長培養基。轉染後24小時，將細胞以不含抗生素之含Tet-認可的FBS (無四環黴素之FBS，Takara)之生長培養基分開成1:10的比例。轉染48小時後，以細胞類型特定的濃度開始嘌呤黴素選擇，細胞維持在選擇壓力達7-10天。合併穩定的細胞的群落，並於選擇培養基中維持。為了評估蛋白質轉導後之人造轉錄因子活性之發光酶報告子分析

製備穩定的HEK293 FlpIn細胞，其包括在雜合CMV 啟動子控制下的Gaussia 發光酶，及在固有性 CMV 啟動子控制下的SEAP，該雜合CMV 啟動子包括適於各人造轉錄因子的標靶位。

將HEK293 FlpIn細胞以pAN1660或pAN1705 (SEQ ID NO: 126)轉染以產生供測試靶向ETRA 或FcER1A 啟動子之人造轉錄因子的細胞株。

將此等細胞於OptiMem處理2小時，其中含有適當人造轉錄因子(1 uM)，或作為對照的無關連或無活性的人造轉錄因子的緩衝液。蛋白質轉導後，收集細胞並重新接種於正常生長培養基，於24小時後依照廠商(Gaussia Luciferase Glow Assay Kit, Thermo Scientific；SEAP Reporter Gene Assay Chemiluminescence, Roche)建議測量發光酶及SEAP活性。發光酶值標準化成SEAP活性，並和設為100 %之對照細胞比較。利用定量 RT-PCR 決定基因表現水平

使用RNeasy Plus Mini 套組 (Qiagen, Hilden, Germany)依廠商建議，從細胞單離總RNA。將冷凍的細胞丸粒再懸浮於RLT Plus Lysis 緩衝液，該緩衝液含有10 μl / ml ß-巰基乙醇。使用QIAshredder 旋轉管柱均質後，將所有的溶解物移到gDNA Eliminator 旋轉管柱以去除基因體DNA。加入一份70 %乙醇，並將全部溶解物移到RNeasy 旋轉管柱。數次洗滌步驟後，將RNA 提取到總體積30 μl 之不含RNase的水中。將RNA保存在-80°C直到進一步使用為止。cDNA之合成係使用High Capacity cDNA Reverse Transcription 套組 (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA)依廠商說明書進行。cDNA的合成係於總體積20 μl的反應液中實施，該反應液包括:2 μl 10x 緩衝液、0.8 μl 25x dNTP Mix、2 μl 10x RT Random Primers、1 μl Multiscribe Reverse Transcriptase 及4.2 μl H₂ O。加入總體積10 μl RNA，並於以下的條件實施反應:於25°C 進行10分鐘，於37°C 進行2小時，最後於85°C 5分鐘。定量PCR係於係於總體積20 μl的反應液中實施，該反應液包括:1 µl 20x TaqMan 基因 Expression Master Mix、10.0 μl TaqMan^® Universal PCR Master Mix (both Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA)及8 μl H₂ O。 每1次反應，加入1 μl的cDNA。qPCR係使用ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA) 依以下的條件進行: 起始步驟於50°C 進行2分鐘，接著第1次變性於95°C進行10分鐘，進一步的步驟則是95°C 15秒及60°C 1分鐘作為1次循環，進行40個循環。 使用 SYBR green 利用 RT-PCR 決定細胞自溶酶表現水平

即時PCR在總反應液體積10 μl中進行，該反應液包括:5 μl之FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche, Mannheim, Germany)、針對各細胞自溶酶之0.1 μl之30 µM 之正向及反向引子(Roche, Basel,  Switzerland)，及3.8 μl H₂ O。針對每1次反應，加入1 μl之cDNA (10ng/ μl –如前述製備)。即時PCR係使用ABI ViiATM7 即時PCR系統 (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA)依以下的條件實施: 保持階段: 50°C 2分鐘，及95°C 10分鐘;接著， PCR 步驟: 在95°C 15秒及60°C 1分鐘作為1次循環，進行40個循環。為了評估PCR 放大的專一性，加入最終熔融曲線步驟。

用於決定細胞自溶酶與GAPDH表現之寡核苷酸列於表9。表 9 : 用於決定細胞自溶酶 B 、 D 、 F 、 G 、 H 、 K 、 L 及 S 相較於內務基因甘油醛 3- 磷酸去氫酶 (GAPDH) 之表現水平的寡核苷酸的序列 以經純化之細胞自溶酶所為之人造轉錄因子限制性消化

將2 µg 的經純化的人造轉錄因子蛋白質於37°C 以3.0或0.3  mU 細胞自溶酶B (Enzo Life Science; BML-SE198)、30或3 mU 細胞自溶酶D (Enzo Life Science; BML-SE199)、0.0003或0.00003 mU 細胞自溶酶K (Enzo Life Science; BML-SE 553)、0.003或0.0003 mU 細胞自溶酶L (Enzo Life Science; BML-SE201)及0.3或0.03 mU 細胞自溶酶S (Enzo Life Science; BML-SE453)消化2小時。消化針對細胞自溶酶B、D、K與L，係於100 mM 乙酸鈉(Merck; 1.01539.0500)、2 mM DTT (Roth; 6908.3)及pH 5.5進行，針對細胞自溶酶S，係於100 mM Bis-Tris (Roth; 9140.2), 2 mM DTT, pH 6.5 進行。 評估人造轉錄因子於活體內對於消化的感受性

使Hela細胞於10公分培養皿生長至80 %匯合，並於37°C 及5 % CO₂ 以1 µM之已純化的人造轉錄因子蛋白質於OptiMEM 10 ml (Gibco; 11058-021)轉導2小時。轉導後，將細胞以胰蛋白酶分解，以PBS洗滌，並於100 µl RIPA 緩衝液 (Pierce; 89901)溶解。將溶解物以14,000xg 離心5分鐘，分離出上清。以BCA分析法(Pierce; 23225)決定蛋白質濃度。以基因 融合肽 TATHA2 處理細胞

將細胞於OptiMEM 中，於37°C 與 5 % CO₂ 同時以1 µM 之經純化的人造轉錄因子蛋白質與5 µM TATHA2 肽處理2小時。 選殖人造轉錄因子供細菌表現

使用標準程序，利用Eco RV/Not I 將編碼為人造轉錄因子之DNA 片段轉殖到基於pET41a+ (Novagen)之細菌表現載體 pAN983 (SEQ ID NO: 145)，以供表現於E. coli 成連接著人造轉錄因子與TAT 蛋白質轉導分域之帶有His₆ 標籤之融合蛋白質。為了表現包括SEQ ID NO: 26之細胞自溶酶B切開位的細胞自溶酶B敏感性人造轉錄因子，使用標準程序(Eco RV/Not I)將編碼為人造轉錄因子之DNA 片段轉殖到細菌表現載體 pAN1688 (SEQ ID NO: 146)。

在適合的E. coli 寄主細胞例如BL21(DE3)產生可轉導之人造轉錄因子之表現建構物為: pAN1488 (SEQ ID NO: 147)、pAN1572 (SEQ ID NO: 148)、pAN1688、pAN1880 (SEQ ID NO: 149)、pAN2381 (SEQ ID NO: 150)、pAN2383 (SEQ ID NO: 151)、pAN2385 (SEQ ID NO: 152)、pAN2387 (SEQ ID NO: 153)、pAN2389 (SEQ ID NO: 154)、pAN2403 (SEQ ID NO: 155)、pAN2404 (SEQ ID NO: 156)、pAN2405 (SEQ ID NO: 157)、pAN2406 (SEQ ID NO: 158)、pAN2407 (SEQ ID NO: 159)、pAN2443 (SEQ ID NO: 160)、pAN2444 (SEQ ID NO: 161)、pAN2445 (SEQ ID NO: 162)、pAN2446 (SEQ ID NO: 163)、pAN2447 (SEQ ID NO: 164)、pAN2448 (SEQ ID NO: 165)、pAN2449 (SEQ ID NO: 166)、pAN2450 (SEQ ID NO: 167)、pAN2451 (SEQ ID NO: 168)、pAN2452 (SEQ ID NO: 169)、pAN2453 (SEQ ID NO: 170)、pAN2454 (SEQ ID NO: 171)、pAN2467 (SEQ ID NO: 172)、pAN2468 (SEQ ID NO: 173)、pAN2469 (SEQ ID NO: 174)、pAN2470 (SEQ ID NO: 175)、pAN2474 (SEQ ID NO: 176)、pAN2491 (SEQ ID NO: 177)、pAN2493 (SEQ ID NO: 178)、pAN2499 (SEQ ID NO: 179)、pAN2501 (SEQ ID NO: 180)、pAN2503 (SEQ ID NO: 181)、pAN2505 (SEQ ID NO: 182)、pAN2510 (SEQ ID NO: 183)、pAN2511 (SEQ ID NO: 184)、pAN2512 (SEQ ID NO: 185)、pAN2513 (SEQ ID NO: 186)、pAN2523 (SEQ ID NO: 187)、pAN2524 (SEQ ID NO: 188)、及pAN2525 (SEQ ID NO: 189),　 pAN2869 (SEQ ID NO: 287)、pAN2870 (SEQ ID NO: 288)、pAN2871 (SEQ ID NO: 289)、pAN2872 (SEQ ID NO: 290)、pAN2873 (SEQ ID NO: 291)、pAN2874 (SEQ ID NO: 292)、pAN2875 (SEQ ID NO: 293)、pAN2876 (SEQ ID NO: 294)、pAN2877 (SEQ ID NO: 295)、pAN2878 (SEQ ID NO: 296)、pAN2879 (SEQ ID NO: 297)、pAN2880 (SEQ ID NO: 298)、pAN2881 (SEQ ID NO: 299)、pAN2882 (SEQ ID NO: 300)、pAN2883 (SEQ ID NO: 301)、pAN2884 (SEQ ID NO: 302)、pAN2885 (SEQ ID NO: 303)、pAN2886 (SEQ ID NO: 304)、pAN2887 (SEQ ID NO: 305)、pAN2888 (SEQ ID NO: 306)、pAN2889 (SEQ ID NO: 307)、pAN2890 (SEQ ID NO: 308)、pAN2891 (SEQ ID NO: 309)、pAN2892 (SEQ ID NO: 310)、pAN2893 (SEQ ID NO: 311)、pAN2894 (SEQ ID NO: 312)、pAN2895 (SEQ ID NO: 313)、pAN2896 (SEQ ID NO: 314、pAN2897 (SEQ ID NO: 315)、pAN2898 (SEQ ID NO: 316)、pAN2899 (SEQ ID NO: 317)、pAN2909 (SEQ ID NO: 318)、pAN2910 (SEQ ID NO: 319)、pAN2911 (SEQ ID NO: 320)、pAN2912 (SEQ ID NO: 321)、pAN2913 (SEQ ID NO: 322)、pAN2914 (SEQ ID NO: 323、pAN2915 (SEQ ID NO: 324)、pAN2916 (SEQ ID NO: 325)、pAN2917 (SEQ ID NO: 326)、pAN2918 (SEQ ID NO: 327)、pAN2919 (SEQ ID NO: 328) 、pAN2973 (SEQ ID NO: 329) 、pAN2974 (SEQ ID NO: 330) 、pAN2975 (SEQ ID NO: 331) 、pAN2976 (SEQ ID NO: 332)、與 pAN2977 (SEQ ID NO: 333)。

用於對照之在細菌生產無活性的可轉導之人造轉錄因子的表現建構物為：pAN1714 (SEQ ID NO: 190)、pAN1806 (SEQ ID NO: 191)及pAN1881 (SEQ ID NO: 192)。

命名方法如下: 人造轉錄因子蛋白質以ATF後加上數字命名，例如ATF1688；編碼為人造轉錄因子之質體係以pAN加上數字命名，pAN1688係編碼ATF1688。 人造 轉錄因子蛋白質之生產

使已針對給定的人造轉錄因子以表現質體轉形的E. coli BL21(DE3)於補充了:100 μM ZnCl₂ 的1升LB培養基中生長到OD₆₀₀ 成為介於0.8與1之間，以1 mM IPTG誘導2小時。以離心收集菌體，以超音波製作細菌溶解物，並純化包含體。為此，以離心收集包含體(5000g, 4°C, 15分鐘)，以20 ml的結合緩衝液洗3次(50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM 咪唑; pH 7.5)。將已純化的包含體於冰上在30 ml 的結合緩衝液 A (50 mM HEPES, 500 mM NaCl、10 mM 咪唑、6 M GuHCl; pH 7.5)中溶解。將已溶解的包含體於4°C 與13,000g離心40分鐘，經0.45 μm PVDF濾器過濾。使用結合緩衝液 A 與 提取緩衝液 B (50 mM HEPES、500 mM NaCl、500 mM 咪唑、6 M GuHCl; pH 7.5)，在Äktaprime FPLC (GEHealthcare) 上使用His-Trap 管柱將有His標籤的人造轉錄因子純化。合併含有已純化的人造轉錄因子的級分，於該人造轉錄因子含有SID分域時於4°C以緩衝液 S (50 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、200 mM 精胺酸、100 µM ZnCl₂ 、5 mM GSH、0.5 mM GSSG、50 % 甘油; pH 7.5)透析整夜，於人造轉錄因子含KRAB分域時，以緩衝液 K (50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、500 mM 精胺酸、100 µM ZnCl₂ 、5 mM GSH、0.5 mM GSSG、50 % 甘油; pH 8.5)透析。透析後，將蛋白質樣本於4°C 以14,000rpm離心30分鐘，並使用0.22 μm Millex-GV濾嘴頭(Millipore)無菌過濾。針對含VP64 活化分域之人造轉錄因子，使用His-Bond Ni-NTA 樹脂 (Novagen)依廠商建議從可溶級分(結合緩衝液: 50 mM NaPO₄ pH 7.5、500 mM NaCl、10 mM 咪唑;提取緩衝液 50 mM HEPES pH 7.5、500 mM NaCl、500 mM 咪唑)製出該蛋白質。將蛋白質對VP64-緩衝液 (550 mM NaCl pH 7.4, 400 mM 精胺酸, 100 µM ZnCl₂ )透析。藉由測量OD₂₈₀ 以決定蛋白質濃度。 使用 ELDIA ( 酵素結合之 DNA 交互作用分析法 ) 決定 人造轉錄因子之 DNA 結合 活性

將BSA預阻斷之鎳包被平板(Pierce)以清洗緩衝液 (25 mM Tris/HCl pH 7.5、150 mM NaCl、0.1 % BSA、0.05 % Tween-20)洗3次。於保存緩衝液中，將平板於飽和條件(50 pmol/井)以純化的人造轉錄因子包被，並於室溫以溫和的振盪培育1小時。3次清洗步驟後，將1x 10^-12 至5x 10^-7 M 之含已黏合、已生物素化之寡聚核苷酸的60 bp 啟動子序列於室溫，和已結合之人造轉錄因子一起，於存在非專一性競爭者(取自鮭魚精子的0.1 mg/ml ssDNA ，Sigma)存在下，於結合緩衝液 (10 mM Tris/HCl pH 7.5, 60 mM KCl, 1 mM DTT, 2 % 甘油, 5 mM MgCl₂ 與 100 µM ZnCl₂ )中培育1小時。清洗後(5 次)，將井以3 % BSA於室溫阻斷30分鐘。於室溫將抗鏈親合素-HRP加到結合緩衝液1小時。清洗5次後，加入TMB 受質(Sigma)，於室溫培育2至30分鐘。反應藉由加入TMB停止溶液(Sigma)以停止，於450 nm讀取樣本的消失。依Hill，使用Sigma Plot V8.1分析配體結合動力學數據。蛋白質轉導

將長成約80 %匯合的細胞以0.01至1 µM 人造轉錄因子處理或虛擬(mock)處理2至120小時，視情形於OptiMEM或生長培養基中，於37°C 每24小時加入人造轉錄因子。針對免疫螢光，將細胞於PBS洗1次，以胰蛋白酶處理，並接種到蓋玻片上以供進一步檢查。 免疫螢光

將細胞以4 %三聚甲醛於PBS中固定，以0.15 % Triton X-100處理15分鐘，以10 % BSA/PBS阻斷，並和小鼠抗HA 抗體 (1:500, H9658, Sigma)或小鼠抗-myc (1:500, M5546, Sigma)一起培育整晚。將樣本以PBS/1 % BSA洗3次，與偶合於Alexa Fluor 546 (1:1000, Invitrogen)的山羊抗小鼠抗體一起培育，並使用DAPI(1:1000 之1 mg/ml 染色3分鐘，Sigma)進行負染色。樣本使用螢光顯微鏡分析。 分析 組織中之細胞自溶酶表現

將已包埋於石蠟的組織切片使用標準免疫組織學程序，以抗細胞自溶酶B (abcam, ab58802)、細胞自溶酶D(abcam, ab75852)、細胞自溶酶E (abcam, ab36996)、細胞自溶酶F(proteintech, 11055-1-AP)、細胞自溶酶G(abcam, ab50845)、細胞自溶酶K(origene, TA318065)、細胞自溶酶L(abcam, ab6314)、細胞自溶酶H (abcam, ab115229)及細胞自溶酶S(abcam, ab135651)的抗體染色。 西方墨點法

為了測量蛋白質水平，使用RIPA 緩衝液 (Pierce)溶解細胞，將蛋白質溶解物和Laemmli 樣本緩衝液混合並加熱。針對已純化的蛋白質，將蛋白質和Laemmli樣本緩衝液混合並加熱。將蛋白質利用SDS-PAGE依大小分離，並利用電子轉印法轉移到硝化纖維素膜上。使用大鼠或兔產生的特定1級抗體實施蛋白質之檢測。1級抗體之檢測係利用偶合於辣根過氧化酶之2級抗體及冷光為主的檢測(ECL plus, Pierce)實施，或者利用偶合於DyLight700或DyLight800之2級抗體，使用遠紅外雷射掃描器檢測並定量螢光實施。 肌動描記法 ( Myography)

將從當地的產房擇期剖宮產後獲得的胎盤，立即進行解剖取得人胎盤血管。將切開的血管切成環形，長約2 mm，並於補充了盤尼西林(1000 IU/ml)、鏈黴素(100 µg/ml)、兩性黴素(0.25 µg/ml)以及對照或1 uM 可轉導之人造轉錄因子的RPMI培養基中培養。將血管培養在37 °C之培養箱中，氣體環境是空氣，含濕潤的5 % CO2。培養基每日更換成含1 uM 可轉導之人造轉錄因子或相應之對照之新鮮培養基。然後，於含生理食鹽水溶液的預熱的5 ml肌動描記浴中，將血管環利用穿過血管腔的直徑40 µm的金屬線附著在不銹鋼頭(PSS，成分如下: 119.0 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4、24.9 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4、2.5 mM CaCl2及11.1 mM 葡萄糖)，通入95 % O2與5 % CO2，維持在37 °C。使用Multi Wire Myograph System-610M (Danish Myo Technology Aarhus, Denmark)記錄張力的改變。使此等節段平衡至少30分鐘。為了評估血管功能，使血管節段暴露於高鉀PSS (KPSS; 62.5 mM)3次以測量其收縮回應，在其間進行清洗。然後將血管節段以PSS沖洗，使回到基線，於暴露於contractile mediator U46619 (100 nM)前，於回應的高原期後，藉由添加已知的內皮依存性舒張劑舒緩素(bradykinin)(BK; 10 µM)以評估內皮依存性鬆弛。然後沖洗血管使其回到基線超過至少1小時。回到基線後，使血管節段暴露於血管收縮劑即肽內皮素-1 (ET-1)，從0.1 nM至100 nM以半對數實施累積濃度回應曲線(CCRC)。不清洗，將血管再次暴露於內皮素依存性舒張劑BK (10 µM)。未回應KPSS、U46619或BK 之血管節段被視為無功能。 mRNA 呈現

首先，使用Phusion 聚合酶(NEB)以OAN1953 (SEQ ID NO: 334)、OAN1954 (SEQ ID NO: 335)、OAN1955 (SEQ ID NO: 336)、OAN1956 (SEQ ID NO: 337)、OAN1957 (SEQ ID NO: 338)，及OAN1981 (SEQ ID NO: 339)組合DNA庫。將此DNA庫使用HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis 套組 (NEB)於試管內(in vitro ) 轉錄為mRNA。然後，以DNAse I (NEB)處理此mRNA庫以移去投入的DNA。使用NucleoSpin RNA Clean-up (Macherey-Nagel)純化RNA，並以365 nm的光照射以連結於OAN1979 (SEQ ID NO: 340) (5’-Psora-(UAGCGGAUGC )-(dA)13-Spacer18-dCdC-Puro-3‘ (斜體序列代表2’-OMe-RNA))，該OAN1979於5’端以補骨脂素(psoralen)修飾，3’ 端以嘌呤黴素(Microsynth)修飾。將已交聯的mRNA庫使用Amicon Ultra-0.5 離心過濾裝置精製。將已純化的經嘌呤黴素修飾的mRNA庫使用PURExpress 試管內(in vitro ) 蛋白質合成套組 (NEB)於試管內(in vitro ) 轉譯，並結合於磁性抗FLAG珠粒(Sigma-Aldrich)或磁性HIS-選擇珠粒(Sigma-Aldrich)。將已結合的庫按順序使用細胞自溶酶D (Enzo Life Sciences) 及細胞自溶酶B (Enzo Life Sciences)消化。消化後，將按順序消化後的上清中的mRNA使用ProtoScript II reverse transcriptase (NEB)反轉錄為cDNA，並再用於mRNA呈現程序。

圖 1 : 於發光酶為主的報告子分析中，該基因融合肽 TATHA2 未增加 ETRA 專一性可轉導之人造轉錄因子之活性 將包括受混合CMV/ETRA-TS+74 啟動子控制之Gaussia 發光酶及受固有性 CMV 啟動子控制之外泌性鹼性磷解酶之HEK293 FlpIn細胞，於存在(+)或不存在(-)基因融合肽 TATHA2之情況下，以抑制性ATF1488或其失效的對照蛋白質 (ATF1714)處理。將標準化成外泌性鹼性磷解酶活性 (RLA，相對發光酶活性)的發光酶值，以ATF1714 對照蛋白質之百分比表達。於存在及不存在活性ATF1488下，經或不經TATHA2處理之細胞間未觀察到有顯著差異。誤差槓代表標準偏差。統計上的顯著性係使用配對t檢定，依Bonferroni 法調整p值以評估。

圖 2 : 使用蛋白酶敏感性可轉導之人造轉錄因子以調節基因表現的示意圖 (A區)人造轉錄因子經由胞吞機制進入細胞，該人造轉錄因子包含：蛋白質轉導分域(PTD)、內體專一性蛋白酶切開位 (X及/或Y)、具有轉錄調節活性之分域(RD)、 核局部化序列 (NLS)，及針對基因(G)之啟動子區(P)為專一之多指之鋅指蛋白 (ZFP)。如此的人造轉錄因子被捕捉在內體隔室(記號E)，不能有效率地到達其標靶所在的細胞核(記號N)。於內體成熟期間，內體專一性蛋白酶(以剪刀X代表)活化，識別切開位 X，並將該人造轉錄因子切開，因而將PTD從RD-NLS-ZFP分離。  (B區) 內體小泡破裂後，該已切開的人造轉錄因子從內體膜解糾纏，因而能離開內體隔室，並運送到細胞核。 (C區) 結合於其在基因G之啟動子區P之標靶位時，取決於RD之本性，上調(上箭頭)或下調(下箭頭)mRNA (m)之生產。

圖 3 : ATF1688 比起 ATF1488 ，內體逃脫增加 將HeLa細胞，和1 µM 細胞自溶酶B-不敏感性 ATF1488或細胞自溶酶B-敏感性ATF1688一起於OptiMEM培養基培育2小時。將細胞固定，使用抗-myc 抗原決定基抗體染色以檢測人造轉錄因子，並拍照。使用影像分析決定人造轉錄因子之入核(Nuclear import ，NI)，並以最大螢光信號的百分比表達。顯示3次獨立實驗的平均，每實驗200個細胞。

圖 4 : 納入細胞自溶酶切開位使發光酶報告子分析中之 ETRA 專一性人造轉錄因子活性增加 將安定地表現受混合CMV/ETRA-TS+74 啟動子(ATF1488/ATF1688之標靶位)控制之Gaussia 發光酶及受固有性 CMV 啟動子控制之外泌性鹼性磷解酶之HEK293 FlpIn細胞，以ATF1688 (含有細胞自溶酶位)或ATF1488 (不含細胞自溶酶位)處理。以ATF1806處理作為對照，其係ATF1688之失活突變體，缺少所有的鋅複合半胱胺酸殘基。於處理後24小時測量發光酶與外泌性鹼性磷解酶活性。將發光酶活性標準化成外泌性鹼性磷解酶活性，並以對照的百分比表達(RLA，相對發光酶活性)。顯示3次獨立的實驗的平均，各3個技術重複。誤差槓代表SD。

圖 5 : 納入細胞自溶酶切開位使發光酶報告子分析中之 FcER1A 專一性人造轉錄因子活性增加 將安定地表現受混合CMV/ETRA-TS+74 啟動子(ATF1572/ATF1880之標靶位)控制之Gaussia 發光酶及受固有性 CMV 啟動子控制之外泌性鹼性磷解酶之HEK293 FlpIn細胞，以ATF1880 (含有細胞自溶酶位)或ATF1572 (不含細胞自溶酶位)處理。以ATF1881處理作為對照，其係ATF1880之失活變異體。於處理後24小時測量發光酶與外泌性鹼性磷解酶活性。將發光酶活性標準化成外泌性鹼性磷解酶活性，並以對照的百分比表達(RLA，相對發光酶活性)。顯示3次獨立的實驗的平均，各3個技術重複。誤差槓代表SD。

圖 6 : 在各種細胞株中，不同細胞自溶酶之表現水平 使用定量性RT-PCR，決定細胞自溶酶B (cath B)、D (cath D)、F (cath F)、G (cath G)、H (cath H)、K (cath K)、L (cath L)、及S (cath S)之表現水平相對於ARPE19、Ben-Men-I、HaCat、HEK293、培養於正常培養基(HeLa NM)及合成培養基(HeLa SM)中之HeLa細胞、HMEC-1、人星狀細胞(HAC)、人角質細胞(HK)、人初代纖維母細胞 (HpF)、人外被細胞(HP)、人子宮平滑肌細胞 (hUtSMC)、及SH-SY5Y細胞之內務基因GAPDH的表現水平。顯示該細胞自溶酶表現水平 (CE)相對於GAPDH 表現水平之百分比。

圖 7 : 於帶有不同的細胞自溶酶庫存的細胞株中，含有不同之細胞自溶酶敏感性位之人造轉錄因子之入核 將人星狀細胞(HAC)、HEK293、及HeLa細胞以帶有不同的細胞自溶酶敏感性的ATF1688或ATF1688 變異體 ATF2443、 ATF2445、 ATF2446、ATF2450處理，或以緩衝液(記為b)處理作為對照。蛋白質轉導後，使用螢光顯微鏡及檢測經抗myc染色之樣本中之經轉導之人造轉錄因子之影像分析，以定量此等人造轉錄因子之入核 (NF[a.u.] = 核螢光，任意單位)。

圖 8 : 轉導進入內體隔室後， ATF1688 與 ATF1688 變異體之活體內 (in vivo) 蛋白分解性處理 將人星狀細胞(HAC)、HEK293及HeLa 以ATF1688或ATF1688 變異體ATF2443及ATF2450處理2小時。收集細胞，並製備全細胞溶解物，以西方點墨法使用抗-myc抗體分析。顯示:西方點墨線及標記蛋白質(註記m)之以任意單位表達之螢光值(註記F)的密度圖，在37、 26及19 kDa用垂直線強調。

圖 9 : 細胞類型專一性蛋白酶媒介之可轉導之人造轉錄因子之內體逃脫之示意圖 由內體蛋白酶所為之差別的標靶的消化被用於細胞類型專一性遞送可轉導之人造轉錄因子至細胞核隔室。為此，製作一可轉導之本發明之人造轉錄因子，包含:蛋白質轉導分域(PTD)、介於PTD與核局部化序列 (NLS)間之內體蛋白酶切開位 (標記 X) 、介於該調控分域(RD)與NLS間之另一內體蛋白酶切開位 (標記 Y) ，及鋅指蛋白 (ZFP)。將如此的人造轉錄因子使用在包括A型細胞及B型細胞(標記 A代表A型， B代表B型)之組織或生物會導致該轉錄因子之差別的細胞核局部化(ü 代表成功核局部化; û 代表徒勞的核局部化，條件是A型細胞表現內體蛋白酶X (標記 C-X)，但不表現內體蛋白酶Y (標記 C-Y)，且若B型細胞表現或不表現內體蛋白酶X但表現內體蛋白酶Y。A或B型細胞不一定在細胞生物學方面要為同型，但在此只就其內體蛋白酶表現樣式分別。此外，如此的人造轉錄因子中的內體切開位 Y也可位在該調控分域(RD)與鋅指蛋白 (ZFP)之間，或可納入核局部化序列、該調控分域或鋅指蛋白內。又，可納入額外的內體蛋白酶切開部位於核局部化序列、調控分域及鋅指蛋白內或之間，以能夠於A型細胞不表現此額外的內體蛋白酶位而非A型細胞表現如此的蛋白酶時在細胞類型間更有選擇性。

圖 10 : 人造轉錄因子對於不欲細胞自溶酶消化之耐受性增加 將ATF1688，及帶有經突變的細胞自溶酶B 標靶外位的ATF1688變異體 ATF2491和純化的細胞自溶酶B (cath B)、D (cath D) 、K (cath K) 、L (cath L)或S (cath S)一起培育。將消化產物以紅外雷射系西方點墨法分析，分析時使用識別位在該人造轉錄因子蛋白質之非常C端的3xmyc 抗原決定基的抗-myc 抗體 。顯示: 經細胞自溶酶消化的ATF1688、ATF2491蛋白質及標記蛋白質 (標記 m)之西方點墨線之以任意單位表達之螢光值(註記F)的密度圖，在37、 26及19 kDa用垂直線強調大小的標記。ATF2491與ATF1688之所望細胞自溶酶B 切開產物以*標記。

圖 11 : 多組胺酸標籤的移除嚴重影響 ATF1688 活性 將包括受雜合CMV/ETRA-TS+74 啟動子控制之Gaussia 發光酶及受固有性 CMV 啟動子控制之外泌性鹼性磷解酶之HEK293 FlpIn細胞，以ATF1688 (包括六組胺酸標籤)或ATF2102 (已移除六組胺酸標籤)處理，或以ATF1806處理(其為ATF1688之失活變異體)以作為對照。於處理後24小時測量發光酶與外泌性鹼性磷解酶活性。將發光酶活性標準化成外泌性鹼性磷解酶活性，並以對照的百分比表達(RLA，相對發光酶活性)。顯示3次獨立的實驗的平均，各3個技術重複。誤差槓代表SD。

圖 12 : 決定在 TAT 蛋白質轉導分域之減少及恆定濃度時， ATF1688 之半最大活性 將包括受ATF1688-敏感性CMV/ETRA-TS+74 雜合啟動子控制之Gaussia 發光酶及受固有性 CMV 啟動子控制之外泌性鹼性磷解酶之HEK293細胞，以如下條件處理:(A) ATF1688 之濃度從1 µM 至0 µM之範圍內降低，或(B) 2 µM之活性ATF1688與失活ATF1806之混合物，其中，混合物中之ATF1688之濃度從2 µM至0 µM之範圍降低。測量發光酶活性，以發光酶對外泌性鹼性磷解酶活性之比值表示，並標準化(act [a.u.])。將4參數對數邏輯模型擬合於此數據，並計算半最大有效劑量(記載為ED50)。

圖 13: 納入 8 元鋅指蛋白到人造轉錄因子中使其活性增加 將包括受CMV/FcERIa 雜合啟動子控制之Gaussia 發光酶之HEK293細胞，以0.25、 0.5或1 uM 6元抗FcERIa ATF AO501或AO501衍生之含ATF2615之8元鋅指蛋白處理，測量發光酶活性之抑制，並以相對於對照之經處理細胞，發光酶活性之抑制百分比表示。兩種人造轉錄因子 在濃度1 µM 有可比較的活性，但明顯地，於較低、非飽和的濃度，8元ATF2615較有活性，對於發光酶活性之抑制顯著較高。

圖 14: 以 FcERIa 專一性可轉導之人造轉錄因子處理影響在初級人嗜鹼細胞中下調 IgE 受體之下調 將從周邊血分離的初級人嗜鹼細胞以1 µM ATF2729處理96小時，或以載運體處理作為對照，使用流式細胞計數法分析測量表面上之IgE 受體之表現。顯示IgE 受體經時之中間表現(median expression)。注意:在72與96小時以ATF2729處理造成IgE 受體表現抑制。

圖 15: 含 8 元鋅指之抗 ETRA 可轉導之人造轉錄因子相較於含 6 元鋅指之抗 ETRA 可轉導之人造轉錄因子活性增加 將包括受CMV/ETRA 雜合啟動子控制之Gaussia 發光酶之報告子細胞各以含ATF1688或ATF2602之降低濃度(1至0 µM) 之6元或8元鋅指處理。為了防止TAT媒介之運送受限，將採用的轉錄因子蛋白質的總濃度藉由添加無關，在本文，是添加失活的可轉導之人造轉錄因子維持在固定1 µM。 (A)繪示劑量-回應曲線， y軸代表相對之發光酶活性 (標記 R代表回應)， x軸代表ATF1688(實線)或ATF2602 (點線)之部分劑量(標記D)。(B) 繪示就以回應水平(RL)測量之發光酶活性水平， ATF2602相較於ATF1688之相對效價 (RP)。

圖 16: 含抗 ETRA 可轉導之人造轉錄因子之 8 元鋅指蛋白抑制人大主動脈平滑肌細胞中之 ETRA 表現及傳信 (A) 將在無血清培養基生長的人大主動脈平滑肌細胞以1 µM ATF2468、ATF2602處理2小時，或以緩衝液處理2小時作為對照，於處理後24小時，利用定量RT-PCR 決定ETRA相較於GAPDH之表現水平。顯示Δct 值之箱型圖點(標記 Δct)，其代表偵測到的以緩衝液(標記 b)、ATF2468或ATF2602處理細胞時，ETRA mRNA與之GAPDH mRNA的曲線閾值 (ct)之不同。(B) 將在無血清培養基生長的人大主動脈平滑肌細胞以1 µM ATF2602處理2小時，或以緩衝液處理2小時作為對照。於處理後24小時，測量回應於以1、5、10或100 nM ET-1 (標記 1、5、10、100)刺激之鈣流，以基線之百分比加以表達(標記 cf [% bl])。注意:經抗ETRA 可轉導之人造轉錄因子ATF2602 (點線)處理後，相較於對照處理之細胞 (實線)，ET-1依存性鈣流有抑制現象。

圖 17: 8 元 ATF2468 減少人胎盤血管之活體外 (ex vivo ) 之 ET-1 依存性收縮 從擇期剖宮產後之人胎盤單離血管，和1 µM ATF2468或無活性的對照蛋白質(標記為c)一起培育3天，藉由添加指示之ET-1之劑量增加，測量相對於無關的血管收縮劑U46619引起的收縮之ET-1依存性收縮。注意:相較於對照處理的血管，經ATF2468處理的收縮性損失。

圖 18: 野豬 (Sus scrofa ) 係測試人抗 ETRA 可轉導之人造轉錄因子之效力的適當的模型 將包括受雜合CMV/人(Homo sapiens 標記為H.s)、CMV/豬(Sus scrofa 標記為S.s.)、CMV/牛(Bos taurus 標記為B.t.)、CMV/鼠 (Mus musculus 標記為M.m.)，或CMV/兔 (Oryctolagus cuniculus 標記為O.c.)控制之ETRA 啟動子標靶位的Gaussia 發光酶的HEK 293細胞以ATF2468處理或以無活性的對照蛋白質(標記為c)處理，並決定發光酶活性。請注意:ATF2468為負調控的可轉導之人造轉錄因子，故發光酶活性之抑制係轉錄因子活性之度量。

圖 19: 抗 ETRA 可轉導之人造轉錄因子在豬視網膜血管有所望之活體內 (in vivo ) 活性 將ATF2602或作為對照的載運體利用玻璃體內注射到豬眼。6天後摘取眼睛，從經ATF2602處理及經載運體處理之眼睛利用雷射捕捉顯微鏡(laser capture microscopy)單離視網膜血管組織。使用定量RT-PCR，決定ETRA mRNA相對於作為對照之GAPDH (內務)基因之水平。顯示ΔCt 值 (標記 Δct)之箱形圖，其代表經ATF2602處理及經緩衝液(標記為B)處理之豬眼， 針對檢測ETRA mRNA 與GAPDH mRNA 之曲線閾值 (ct)之差異。雙尾、獨立學生t檢定顯示經緩衝液與經ATF2602處理之眼(p = 0.02088)有差異，此現象和經ATF2602處理之眼之ETRA mRNA 下調為一致。

圖 20: SID 分域包括標靶外細胞自溶酶 D 位 示意顯示一可轉導之本發明之人造轉錄因子，其包括TAT 蛋白質轉導分域(標記TAT)、細胞自溶酶識別位 (標記 CAT)、負調控分域(SID)，及多指之鋅指蛋白 (ZFP)，但省去核局部化序列。胞吞攝入後，如此之可轉導之人造轉錄因子由位在該細胞自溶酶識別位內的細胞自溶酶B(標記 CatB)處理而導致內體解糾纏。細胞自溶酶D (CatD)也能結合於有潛力的CAT位之次組。但是CatD切在其結合位的中心外導致如此的可轉導之人造轉錄因子在SID分域內處理。而如此的CatD的標靶外處理也會導致內體解糾纏，在SID分域內處理導致可轉導之人造轉錄因子無活性。

圖 21: 細胞自溶酶沒介之可轉導之人造轉錄因子之處理之最適化 示意顯示能產生有經修飾之細胞自溶酶敏感性的可轉導之人造轉錄因子的試管內 (in vitro ) 選擇處理。產生一DNA庫，其包括位在細胞自溶酶結合位(CAT-BS)內並接近有潛力之細胞自溶酶切開(CATp)位之無規序列 (CAT-RS)，該細胞自溶酶切開(CATp)位在對於該人造轉錄因子之作用為必要之分域(ED)內。使用此DNA庫以產生適於mRNA呈現(MD)之雜合mRNA蛋白質分子庫。藉由以各種細胞自溶酶(以卵形及六角形標記CAT代表)消化如此的mRNA呈現庫，可達成選擇有增加(敏感標記為S)或降低(耐受標記為R)之細胞自溶酶敏感性之人造轉錄因子之選擇。在MD-庫之不同實體之消化處理以雙箭頭/問號表示。藉由依序以細胞自溶酶消化，產生向各種細胞自溶酶有既定之耐受性(標記 R)及敏感性(標記 S)的人造轉錄因子。

Claims (47)

1. 一種人造轉錄因子，包含專一性地靶向基因啟動子之多指之鋅指蛋白，該鋅指蛋白融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、含有1或更多蛋白質轉導分域之副本之運送蛋白，及單一或2或更多內體專一性蛋白酶切開位;該單一內體專一性蛋白酶切開位和胺基酸序列 SEQ ID NO: 26不同。
2. 如申請專利範圍第1項之人造轉錄因子，包含2或更多內體專一性蛋白酶切開位，其中，該內體專一性蛋白酶切開位由不同的內體專一性蛋白酶切開。
3. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該蛋白質轉導分域為該TAT肽。
4. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶切開位為細胞自溶酶切開位。
5. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該2或更多內體專一性蛋白酶切開位中之一係由細胞自溶酶B切開。
6. 如申請專利範圍第5項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶切開位包含選自於由SEQ ID NO: 27、32、41、44、45及46構成之群組之胺基酸序列。
7. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，一內體專一性蛋白酶切開位係由細胞自溶酶D切開。
8. 如申請專利範圍第7項之人造轉錄因子, 其中，該內體專一性蛋白酶切開位包含選自於由SEQ ID NO: 31、32、34、35、36、38、39、40、41、42及43構成之群組之胺基酸序列。
9. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，一內體專一性蛋白酶切開位係由細胞自溶酶K切開。
10. 如申請專利範圍第9項之人造轉錄因子, 其中，該內體專一性蛋白酶切開位包含選自於由SEQ ID NO: 27、29、30、31、32、34、35、36、37、39、40、41及42構成之群組中之胺基酸序列。
11. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子,其中，一 內體專一性蛋白酶切開位係由細胞自溶酶L切開。
12. 如申請專利範圍第11項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶切開位包含選自於由SEQ ID NO: 31、32、35、36、40及41構成之群組中之胺基酸序列。
13. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶切開位係由細胞自溶酶S切開。
14. 如申請專利範圍第13項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶切開位包含選自於由SEQ ID NO: 29、30、31、32、35、36、37、40及41構成之群組中之胺基酸序列。
15. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該人造轉錄因子包含一內體專一性蛋白酶切開位，該內體專一性蛋白酶切開位係由在該標靶細胞類型中為低表現或不表現但是在非標靶細胞類型中表現之內體專一性蛋白酶識別，其中，如此之內體專一性蛋白酶切開位位在對於該人造轉錄因子之活性為必要的分域內或分域之間。
16. 如申請專利範圍第15項之人造轉錄因子，其中，對於該人造轉錄因子之活性為必要的分域為該核局部化序列、該抑制性或活化性分域、或該多指之鋅指蛋白。
17. 如申請專利範圍第15項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶切開位位在連接該調控分域與該核局部化序列或該鋅指蛋白分域之連接子區。
18. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位位在該人造轉錄因子中，介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄活性部分之間，其中，該人造轉錄因子除了位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄活性部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外，不包括其他蛋白酶切開位。
19. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位位在該人造轉錄因子中，介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄活性部分之間，其中，該人造轉錄因子除了位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄活性部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外，更包含1或更多個蛋白酶切開位，         其中，該位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄活性部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外之1或更多個蛋白酶切開位修飾成降低切開敏感性。
20. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位位在該人造轉錄因子中，介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄活性部分之間，其中，該人造轉錄因子除了位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄活性部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外，更包含1或更多個蛋白酶切開位，         該位在介於該蛋白質轉導分域與該人造轉錄因子之轉錄活性部分之間之該內體專一性蛋白酶切開位以外之1或更多個蛋白酶切開位，相較於位在SEQ ID NO: 67 (ATF1488)之該人造轉錄因子包括之該蛋白質轉導分域間之該內體專一性蛋白酶切開位以外的該蛋白酶切開位，切開敏感性較低。
21. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位包含該胺基酸序列 SEQ ID NO: 26。
22. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶切開位由至少2種不同的內體專一性蛋白酶分別切開。
23. 如申請專利範圍第22項之人造轉錄因子，其中，該至少2種不同的內體專一性蛋白酶係選自於由下列構成之群組： i) 細胞自溶酶B 與 D ii) 細胞自溶酶B、D、K及S iii) 細胞自溶酶K及S iv) 細胞自溶酶D、K、L及S v) 細胞自溶酶B、D、K、L及S ，及 vi) 細胞自溶酶D與K。
24. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該人造轉錄因子之該標靶細胞類型為人眼之血管之平滑肌細胞。
25. 如申請專利範圍第24項之人造轉錄因子，其中，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位係選自於由細胞自溶酶B、D、K及I切開之內體專一性蛋白酶切開位構成之群組。
26. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，其中，該單一或2或更多個內體專一性蛋白酶切開位係依照在該人造轉錄因子之標靶細胞類型中之該內體專一性蛋白酶之含量來選擇。
27. 如申請專利範圍第1或2項之人造轉錄因子，包含一內體專一性蛋白酶結合位，該結合位位在內體專一性蛋白酶切開位之上游或下游的約1至約50個胺基酸處，其中，該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列修飾成改變該內體專一性蛋白酶切開位之切開敏感性。
28. 如申請專利範圍第27項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列藉由插入或取代從胺基端向羧酸基包含以下順序之胺基酸的一胺基酸序列以修飾： i) 帶電或極性胺基酸、帶電胺基酸、帶電或極性胺基酸、非極性胺基酸、非極性胺基酸、非極性胺基酸、極性胺基酸；或 ii) 帶電胺基酸、帶電或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸、極性或非極性胺基酸。
29. 如申請專利範圍第27項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列包含胺基酸序列 LTLGNDI (SEQ ID NO: 342)，其中，該內體專一性蛋白酶結合位藉由取代該胺基酸序列 LTLGNDI (SEQ ID NO: 342)成為選自於由下列構成之群組中之胺基酸序列以修飾： DRHLIIS (SEQ ID NO: 203)、DLVTLLT(SEQ ID NO: 204)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、PLTLPTI (SEQ ID NO: 207)、PRLMFLC (SEQ ID NO: 208)、TAYLPHI (SEQ ID NO: 209)、TETLPHI (SEQ ID NO: 210)、TDYLDPH (SEQ ID NO: 211)、QRYLEIT (SEQ ID NO: 212)、NLHTIHI (SEQ ID NO: 213)、NLCSVTQ (SEQ ID NO: 214)、LAKFDMI (SEQ ID NO: 215)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、DLTHISI (SEQ ID NO: 217)、DFKSVQF (SEQ ID NO: 218)、REYLIIS (SEQ ID NO: 219)、RIDQLTL (SEQ ID NO: 220)、RQVTLAL (SEQ ID NO: 221)、YEKITVT (SEQ ID NO: 222)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、YFSIHGL (SEQ ID NO: 224)、ELNIDIL (SEQ ID NO: 225)、PSLSFIV (SEQ ID NO: 226)、SLLITNL (SEQ ID NO: 227)、EISTTLF (SEQ ID NO: 228)、NMSTTNL (SEQ ID NO: 229)、IKTDYSL (SEQ ID NO: 230)、TKVRVFL (SEQ ID NO: 231)、EYILNYY (SEQ ID NO: 232)、TTVNLTI (SEQ ID NO: 233)、IVLNLSI (SEQ ID NO: 234)、TSLLYTC (SEQ ID NO: 235)、PTISFAL (SEQ ID NO: 236)、KESFTLI (SEQ ID NO: 237)、KLDVNFF (SEQ ID NO: 238)、TELSYTL (SEQ ID NO: 239)、IERFQFA (SEQ ID NO: 240)、INQMLSH (SEQ ID NO: 241)、ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、VYPILPI (SEQ ID NO: 243)，及RRELFLL (SEQ ID NO: 244)。
30. 如申請專利範圍第27項之人造轉錄因子，其中，該內體專一性蛋白酶結合位之胺基酸序列藉由取代至少2至多7個胺基酸以修飾，其中，該至少2至多7個胺基酸取代成從胺基端向羧基端為如以下順序的胺基酸： 選自於由下列D/E/I/K/LN/P/Q/R/S/T/V/Y之群組中之胺基酸； 選自於由  A/D/E/F/J/K/L/M/N/Q/R/S/T/V/Y構成之群組中之胺基酸； 選自於由C/D/E/F/H/I/K/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y構成之群組中之胺基酸； 選自於由D/F/H/I/L/M/N/Q/R/S/T/V構成之群組中之胺基酸； 選自於由  D/E/F/H/I/L/N/M/P/Q/R/T/V/Y構成之群組中之胺基酸； 選自於由A/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/Y構成之群組中之胺基酸； 選自於由  A/C/F/H/I/L/Q/R/S/T/V/Y構成之群組中之胺基酸。
31. 一種人造轉錄因子，包含專一性地靶向基因啟動子之多指之鋅指蛋白，該鋅指蛋白融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、含有蛋白質轉導分域之1或更多副本之運送蛋白，及一內體專一性蛋白酶切開位，其中，該多指之鋅指蛋白為8元或更高等級之鋅指蛋白。
32. 如申請專利範圍第31項之人造轉錄因子，其中，該8元或更高等級之鋅指蛋白選自於由8元、9元、10元、11元及12元鋅指蛋白構成之群組。
33. 如申請專利範圍第31項之人造轉錄因子，其中，該多指之鋅指蛋白為8元鋅指蛋白。
34. 如申請專利範圍第33項之人造轉錄因子，其中，該8元鋅指蛋白選自於由SEQ ID NO: 345 與SEQ ID NO: 346構成之群組。
35. 如申請專利範圍第31項之人造轉錄因子，其中，該8元或更高等級之鋅指蛋白之各單元體和其他的單元體有不同的胺基酸序列。
36. 如申請專利範圍第31至35項中任一項之人造轉錄因子，其中，該人造轉錄因子更包含蛋白質標籤。
37. 如申請專利範圍第31至35項中任一項之人造轉錄因子，其中，該人造轉錄因子更包含一連結子。
38. 一種人造轉錄因子，包含專一性地靶向基因啟動子之多指之鋅指蛋白，該鋅指蛋白融合於抑制性或活化性蛋白質分域、核局部化序列、含有蛋白質轉導分域之1或更多副本之運送蛋白，及一內體專一性蛋白酶切開位，其中，該人造轉錄因子包含選自於由下列構成之群組中之胺基酸序列 : DRHLIIS (SEQ ID NO: 203)、DLVTLLT(SEQ ID NO: 204)、DEHLLVY (SEQ ID NO: 205)、DFYTHLA (SEQ ID NO: 206)、PLTLPTI (SEQ ID NO: 207)、PRLMFLC (SEQ ID NO: 208)、TAYLPHI (SEQ ID NO: 209)、TETLPHI (SEQ ID NO: 210)、TDYLDPH (SEQ ID NO: 211)、QRYLEIT (SEQ ID NO: 212)、NLHTIHI (SEQ ID NO: 213)、NLCSVTQ (SEQ ID NO: 214)、LAKFDMI (SEQ ID NO: 215)、LYLTQFR (SEQ ID NO: 216)、DLTHISI (SEQ ID NO: 217)、DFKSVQF (SEQ ID NO: 218)、REYLIIS (SEQ ID NO: 219)、RIDQLTL (SEQ ID NO: 220)、RQVTLAL (SEQ ID NO: 221)、YEKITVT (SEQ ID NO: 222)、YVTIRLF (SEQ ID NO: 223)、YFSIHGL (SEQ ID NO: 224)、ELNIDIL (SEQ ID NO: 225)、PSLSFIV (SEQ ID NO: 226)、SLLITNL (SEQ ID NO: 227)、EISTTLF (SEQ ID NO: 228)、NMSTTNL (SEQ ID NO: 229)、IKTDYSL (SEQ ID NO: 230)、TKVRVFL (SEQ ID NO: 231)、EYILNYY (SEQ ID NO: 232)、TTVNLTI (SEQ ID NO: 233)、IVLNLSI (SEQ ID NO: 234)、TSLLYTC (SEQ ID NO: 235)、PTISFAL (SEQ ID NO: 236)、KESFTLI (SEQ ID NO: 237)、KLDVNFF (SEQ ID NO: 238)、TELSYTL (SEQ ID NO: 239)、IERFQFA (SEQ ID NO: 240)、INQMLSH (SEQ ID NO: 241)、ELFILHA (SEQ ID NO: 242)、VYPILPI (SEQ ID NO: 243)及RRELFLL (SEQ ID NO: 244)。
39. 一種哺乳動物細胞株，其分泌如申請專利範圍第1至38項中任一項之人造轉錄因子。
40. 一種寄主細胞，含有表現建構物，該表現建構物選自於由編碼為如申請專利範圍第1至38項中任一項之人造轉錄因子之SEQ ID NO: 146至189及SEQ ID NO: 287至333 構成之群組。
41. 一種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第1至38項中任一項之人造轉錄因子。
42. 一種生產包含8元或更高等級之鋅指蛋白之多指之鋅指蛋白之方法，包含以下步驟： i) 從第1鋅指蛋白庫選擇6元鋅指蛋白； ii) 基於在1)選擇之該6元鋅指蛋白，藉由將此6元鋅指蛋白融合於2或更多鋅指之隨機庫以建構第2鋅指蛋白庫； iii) 選擇包含8元或更高等級之鋅指蛋白之多指之鋅指蛋白。
43. 如申請專利範圍第42項之生產包含8元或更高等級之鋅指蛋白之多指之鋅指蛋白之方法，其中，該第1鋅指蛋白庫與該第2鋅指蛋白庫包含一表現載體，該表現載體在該蛋白質庫之該寄主生物有1-2個副本存在，其中該表現載體包括可操縱地連結於該8元或更高等級之鋅指蛋白之一啟動子，該表現載體在Saccharomyces cerevisae中表現該8元或更高等級之鋅指蛋白之表現率等於或低於在同樣Saccharomyces cerevisae 之可操縱地連結於SEQ ID NO: 197啟動子之8元或更高等級之鋅指蛋白之表現率。
44. 如申請專利範圍第43項之生產包含8元或更高等級之鋅指蛋白之多指之鋅指蛋白之方法，其中，該寄主生物係選自於由哺乳動物、昆蟲、真菌、酵母菌及細菌構成之群組。
45. 如申請專利範圍第42至44項中任一項之生產包含8元或更高等級之鋅指蛋白之多指之鋅指蛋白之方法，其中，該6元鋅指蛋白係從i)之該鋅指蛋白庫使用修飾的酵母菌單雜交方案選擇，鋅指蛋白係在酵母菌中以融合於該GAL4 活化分域之形式表現以該表現Aureobasidin耐受性。
46. 一種選擇蛋白質之篩選系統，包括： i) 能表現該蛋白質之寄主生物； ii)表現載體，其在i)之寄主生物中有1-2個副本存在，其中該表現載體包括可操縱地連結於該蛋白質之一啟動子，該蛋白質在寄主生物中表現之表現率等於或低於在同樣寄主生物之可操縱地連結於SEQ ID NO: 197啟動子之該同樣蛋白質之表現率。
47. 一種表現載體，包含 ARS/CEN複製起點及可操縱地連結於一蛋白質之啟動子，該啟動子在寄主生物表現關注的該蛋白質，表現率等於或慢於可操縱地連結於同寄主生物中之同蛋白質之SEQ ID NO: 197之啟動子之表現率。