JP2001514858A - アンテナペディアのホメオドメインを含むコンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ａ）アンテナペディアのホメオドメインまたはその変異体を含む第１の領域と、（ｂ）少なくとも１００アミノ酸のタンパク質を含む第１の領域と自然には結合しない第２の領域とを含む、コンジュゲート。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、特に、限定的ではないが、融合タンパク質またはタンパク質／核酸
複合体の形態での新規のコンジュゲート（複合体）に関する。

【０００２】 遺伝子治療は、選択された遺伝病を恒久的に治癒する潜在能力を提供する。し
かし、目的の遺伝子またはタンパク質を標的部位に効果的に送達させることが大
きな問題である。ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏストラテジーによって遺伝
子または遺伝子産物を、種々の細胞、組織および器官へ送達するための種々のウ
イルスまたは非ウイルスベクターが開発されている。ウイルスベースのベクター
のうち、レトロウイルス，アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペス
ウイルスが最も広く研究されている。非ウイルスベースのベクターのうち、プラ
スミドＤＮＡを直接細胞に移入するためにリポソームが使用されている。しかし
、遺伝子治療の主な試みの１つとして、効果的な送達系の作成が残されている。

【０００３】 遺伝子アンテナペディア（Ａｎｔｐ）は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ）胚の前部−後部形態形成を調節することが示されている転写因子をコー
ドする。アンテナペディアのタンパク質配列は特定のＤＮＡ標的エレメントに結
合する６０アミノ酸モチーフ（ホメオドメイン）の存在によって特徴づけられる
。アンテナペディアの相同染色体は、ほぼ全ての多細胞生物に見出されており、
アミノ酸配列の同一性の程度が非常に高いことが示されている。ヒトおよびショ
ジョウバエのアンテナペディアタンパク質は、ホメオドメインの配列において１
つの保存的アミノ酸置換により異なるだけである。

【０００４】 アンテナペディアおよびそのホメオドメインは、哺乳動物細胞の細胞膜を通過
して転移し得ることが観察されている。転移は、細胞エンドサイトーシスに依存
せず、転移が４℃と３７℃の両方で起こっていることが報告されている。Ｄアミ
ノ酸から作製されたホメオドメイン合成ペプチドは細胞膜を貫通することが出来
る。この知見はＡｎｔｐがレセプター媒介機構によって転移される可能性を除外
するであろう。この特性は小さなウイルス配列の培養細胞の細胞質への伝達する
こと、ならびにインフルエンザウイルスの核タンパク質に対するＭＨＣクラスＩ
制限細胞障害性免疫反応の惹起することにおいて利用されている。しかし、これ
までの所、Ａｎｔｐのホメオドメインは小さな合成ペプチドを輸送するためのみ
に用いられてる。Schutze-Redelmeier M-Pら、1996、「Introduction of Exogenous
Antigens into the MHC Class I Processing and Presentation Pathway by Dr
osophila Antennapedia Homeodomain Primers Cytotoxic T Cells In Vivo」、The
Journal of Immunology、650-655は、アンテナペディア分子のホメオドメインは
、細胞質にさらに５０アミノ酸までを送達するために使用し得ると言及している
。第３ヘリックスの１６アミノ酸を用いて、著者らは９４個までのアミノ酸を含
む融合タンパク質を調製し得たと言及しているが、ここでは示されていない。さ
らに開示の批判は、合成ペプチドの送達に対してのみ存在する。

【０００５】 本発明者らは、今回、非合成タンパク質を含むタンパク質の転移に使用され得
るＡｎｔｐのホメオドメインを見出した。本発明の１つの鍵となる利点は、機能
タンパク質および調節タンパク質を転移するために使用し得ることである。これ
は、特に医学的に応用する事は驚くべきことであり、かつ非常に重要である。

【０００６】 目的の遺伝子の発現産物を細胞に直接送達させる能力は、広い分野、特に医学
分野で応用可能である。驚くべきことに、本発明者らは、今回、核酸を転移し得
るホメオドメインもまた発見した。これは、特に遺伝子治療への応用に特に有利
である。

【０００７】 従って、本発明の１つの態様は、 （ａ）アンテナペディアのホメオドメインまたはその変異体を含む第１の領域
と、 （ｂ）第１の領域と自然には結合しない第２の領域とを含み、少なくとも第１
の領域は非変性である、コンジュゲートを提供することである。

【０００８】 １つの実施形態では、第１および第２の領域は、例えば、ジスルフィド結合を
介して結合されているか、第２の領域は核酸結合ドメイン、好ましくはさらに核
酸を含み得る。この態様はタンパク質／核酸複合体としてみなし得る。

【０００９】 さらなる実施形態では、コンジュゲートは、融合タンパク質の形態であり得る
。この実施形態において、好ましくは、第２の領域は機能性もしくは調節タンパ
ク質または抗原である。

【００１０】 本発明のさらなる態様では、 （ａ）作動可能に連結されるアンテナペディアのホメオドメインまたはその変
異体を含む第１の領域 （ｂ）少なくとも１００アミノ酸のタンパク質を含む第１の領域に自然には結
合しない第２の領域 を含むコンジュゲートを提供する。

【００１１】 「作動可能に連結された」とは、本発明者らは、第２の領域が細胞膜を転移し
得るように第１の領域と第２の領域が連結することを意味する。

【００１２】 好ましくは、全コンジュゲートは非変性である。

【００１３】 非変性とは、本発明者らは、特定の非変性工程を含意する必要がないが、これ
は場合による。

【００１４】 変性とは、タンパク質分子の３次元構造の形態をペプチド結合の切断なしにそ
の自然の状態から変化させるプロセスである。これらのプロセスがその全体的な
３次元構造の変化も伴う場合、タンパク質の特定の群のジスルフィド結合の切断
または化学修飾もまた含まれ得る。

【００１５】 本発明者らはまた、変性タンパク質または核酸が変性前に維持されたコンホメ
ーションに戻された再生タンパク質または核酸を排除しない。一般に、可逆的な
変性は、ジスルフィド還元因子および尿素、核酸に関しては熱および塩によって
引き起こされる。

【００１６】 疑義を回避するために、自然の状態とは、本発明者らは、タンパク質または核
酸が無傷の細胞中で生じ、その３次元構造が適切な水素結合の形成に依存してい
る形態を意味する。

【００１７】 好ましくは、第１の領域は第２の領域のＮ末端に位置する。

【００１８】 本発明の別の態様では、本発明のコンジュゲートをコードする核酸を提供する
。

【００１９】 本発明の別の態様では、プロモーターに作動可能に連結された本発明の核酸を
含む発現ベクターを提供する。

【００２０】 本発明のさらに別の態様では、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細
胞を提供する。

【００２１】 細菌溶菌液からコンジュゲートを得るための適切な方法の開発は重要であった
。従来の方法では、本発明者らは変性試薬へ晒すことがＡｎｔｐホメオドメイン
の転移特性に劇的な影響を与えることを見出した。本発明者らはまた、小さなｐ
Ｈの変化および容量オスモル濃度の相違がその転移特性に影響を与えることを見
出した。

【００２２】 本発明者らは、今回、本発明のコンジュゲートの一般的な調製法、特に、細菌
溶菌液から第１のドメインおよび融合タンパク質を精製する適切な手順を見出し
た。本法は、得るべきコンジュゲートが少なくとも１００アミノ酸からなるタン
パク質を細胞膜を通過して転移するコンジュゲートを提供する。

【００２３】 本発明の別の態様では、 （ｉ）宿主細胞内で発現ベクター由来のコンジュゲートの発現を提供する条件
下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、 （ｉｉ）回収工程がアミノ酸テイルのコンジュゲートへの融合工程を包含し、
該テイルが少なくとも１つの基質と結合し得るが別の基質とは結合し得ず、そし
て該コンジュゲートが該テイルを介して少なくとも１つの基質との結合を引き起
こすことにより宿主細胞の成分がこの基質と結合せず、そして該コンジュゲート
が他の物質と接触することにより該コンジュゲートが結合されずに宿主細胞の残
りの成分が他の基質に結合される、コンジュゲートを回収する工程を包含する、
コンジュゲートの調製法を提供する。

【００２４】 本発明のさらに別の態様では、（ｉ）プロモーターに作動可能に連結され、（
ａ）アンテナペディアのホメオドメインまたはその変異体を含む第１の領域と、
（ｂ）宿主内の発現ベクター由来のコンジュゲートの発現を提供する条件下で少
なくとも１００アミノ酸長のアミノ酸配列を含む第１の領域に自然には結合しな
い第２の領域をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を
培養する工程と、（ｉｉ）アミノ酸テイルをコンジュゲートに融合させる工程を
包含し、該テイルは少なくとも１つの基質と結合し得るが別の基質とは結合し得
ず、該コンジュゲートが該テイルを介して少なくとも１つの基質との結合を引き
起こすことにより宿主細胞の成分がこの基質と結合せず、該コンジュゲートが他
の基質と接触することにより該コンジュゲートが結合されずに宿主細胞の残りの
成分が他の基質に結合する、該コンジュゲートを回収する工程とを包含する、コ
ンジュゲートの調製法を提供する。

【００２５】 本発明のさらなる態様では、アミノ酸テイルがすくなくとも１つの基質に結合
され得るが、別の基質には結合され得ず、コンジュゲートが該テイルを介して少
なくとも１つの基質との結合を引き起こすことにより不純物がこの基質に結合せ
ず、該コンジュゲートが他の基質に接触することにより該コンジュゲートが結合
せず、残された不純物が他の基質に結合する、アミノ酸テイルをコンジュゲート
に融合する工程を包含する、コンジュゲートの精製法を提供する。

【００２６】 従って、広義では、本発明は正および負の精製工程を可能にするコンジュゲー
トに結合したテイルの使用と見なされ得る。

【００２７】 好ましくは、アミノ酸テイルはコンジュゲートのＣ末端に融合されている。

【００２８】 好ましくは、アミノ酸テイルはＨＨＨＨＨＨＧＳを含む。

【００２９】 好ましくは、基質はアミノ酸テイルに親和性のニッケルカラムかまたは抗体で
ある。

【００３０】 好ましい実施形態では、コンジュゲートは、アミノ酸テイルを介して親和性を
有する２つの基質に連続的に接触する。

【００３１】 従って、好ましくは、ニッケルカラムと抗体の両方が使用される。それらは任
意の順番で使用され得る。

【００３２】 第２の領域がＤＮＡ結合ドメインである場合、核酸との複合体は核酸を用いて
本発明に従って形成されたコンジュゲートと混合することによって形成され得る
。

【００３３】 本発明のさらなる態様は、本発明の方法によって調製されたコンジュゲート、
本発明のコンジュゲートを含む薬学的組成物および疾患または感染治療のための
薬剤の調製における本発明のコンジュゲートの使用を含む。

【００３４】 本発明では、当業者のレベルの範囲内での標準的な生物学的技術が使用され得
る。このような技術は論文に全て記載されている。例えば、Sambrookら、1989、Mo
lecular Cloning、a laboratory manual、Hames and Glover、1985〜1997、DNA Clon
ing、a practical approach、第1〜4巻(第2版)、McCaffertyら、1996のMethods for
the engineering of immunoblobulin genesの「Antibody Engineering、A Practic
al Approach」を参照のこと。

【００３５】 本発明の種々の好ましい特徴および実施形態を、以下の限定されない例によっ
て記載し、そして添付した図面を参照されたい。

【００３６】 第１の領域 本発明のコンジュゲートの第１の領域は、自然または合成のアンテナペディア
のホメオドメインを含み得る。

【００３７】 Drosophilaから得ることが出来るＡｎｔｐ遺伝子のホメオドメインを図１およ
び配列番号１に示す。このホメオドメインに相同な配列を他の生物（脊椎動物、
哺乳動物およびヒトを含む）から単離されており、これらは本発明に含まれる。
このホメオドメインは、Jolietら、1991、「Antennapedia homeobox peptide regul
ates neural morphogenesis」、Proc. Natl. acad. Sci.、88、1864〜1868に記載の 手順を用いるクローニングなどの標準的な技術を用いて調製され得る。前に示さ
れたように、このような多細胞生物の配列における相違は、一般的に、実質上保
存されている。しかしながら、これは必ずしも場合によらず、本発明において、
例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａから得ることが出来る配列と比較して約５０％以
上、例えば、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性がある、このよ
うな他の配列は含まれる。配列同一性は、ＧＡＰのような市販のプログラムを用
いて同定され得る。

【００３８】 さらに、膜への転移能力を保持している場合、合成変異体が使用され得る。一
般に、合成変異体は、置換、特に、保存的置換によって自然に存在するタンパク
質と異なる。保存的アミノ酸変化とは、本発明者らは、アミノ酸群（すなわち、
疎水性、極性、酸性または塩基性）のうちの１つ由来のアミノ酸と、同グループ
内由来のアミノ酸との置換を意味する。このような変化の例として、バリンのメ
チオニンとの置換およびその逆の置換がある。他の保存的置換の例は、以下の表
を参考と見なし得る。

【００３９】

【表１】

【００４０】 このような変異体は、部位特異的変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技術を
用いて調製され得る。挿入が行われる場所は、挿入部位をコードする合成ＤＮＡ
ならびに自然に存在する挿入部位のいずれか側の配列に相当する５および３フラ
ンキング領域である。フランキング領域は、配列が適切な酵素で切断され、そし
て合成ＤＮＡが切断部位に連結され得るように自然に存在する配列中の部位に相
当する便利な制限サイトを含む。次いで、コードされたタンパク質を作製するた
めに、本発明に従ってＤＮＡを発現させる。これらの方法はＤＮＡ配列操作のた
めの当該分野で公知の多数の標準的技術を例示したのみであり、他の公知の技術
も使用され得る。

【００４１】 自然に存在するかまたは合成の配列を膜に転移する能力は当該分野で公知の日
常的な方法で試験され、添付の実施例で例示され得る。

【００４２】 膜転移能力を保持するホメオドメインのいくつかの変異体が当該分野で報告さ
れており、これらは本発明の範囲ならびに利用可能な任意の範囲に含まれる。

【００４３】 例えば、ＣＮＲＳに対するＥＰ−Ｂ−０ ４８５ ５７８は、ｐＡｎｔｐのヘリ
ックス３配列を含むホメオペプチドを開示しており、これらは本明細書中に参照
として組み込まれる。

【００４４】 ＣＮＲＳに対するＷＯ９７／１２９１２もまた、ｐＡｎｔｐおよびその変異体
のヘリックス３の配列を実際に開示している。これらは、本明細書中に参照とし
て組み込まれる。特に、３ヘリックスは以下の配列、 Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを有するといわれ
ている。

【００４５】 変異体は以下の配列、 Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−
Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６ または Ｘ１６−Ｘ１５−Ｘ１４−Ｘ１３−Ｘ１２−Ｘ１１−Ｘ１０−Ｘ９−Ｘ８−Ｘ
７−Ｘ６−Ｘ５−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１ ここで、各Ｘはαアミノ酸を示し、Ｘ６はトリプトファンを示し、ペプチドは
６個と１０個との間の疎水性アミノ酸を含む、を有するといわれている。

【００４６】 他の変異体は、例えば、Gehring W、1987、「Homeo Boxes in the Study of Deve
lopment」にて開示されている。Science、236、1245〜1252は、６２アミノ酸のホメオ
ドメイン（すなわち、０位にｇｌｕと６１位にｌｙｓを有する）を開示している
。Bloch-Gallego Eら、1993、「Antennapedia Homebox Peptide Enhanes Growth an
d Branching of Embryonic Chicken Motoneurons In Vivo」、The Journal of Cel
l Biology、120、2、485〜492は、さらに、運動ニューロン膜を通過して転移され、
そして核に到達し得るｐＡｎｔｐ４０Ｐ２と呼ばれる変異体を開示している。こ
の変異体において、４０位および４１位のロイシンおよびトレオニン残基は、２
つのプロリン残基で置換された。Le Rouxら、1993、「Neurtropic activity of the
Antennapedia homeodomain depends on its specific DNA-binding properties
」、Proc. Natl. Acad. Sci.、90、9120〜9124は、ニューロン膜を通過して転移する
能力を保持する図２に記載の２つの変異体ｐＡｎｔｐ ５０ＡおよびｐＡｎｔｐ
４０Ｐ２を開示している。Schutze-Redelmeier M-Pら、1996、前出は、１６アミ ノ酸Ｃ末端（第３ヘリックス）セグメントが、オリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ペプチドを培養細胞中の細胞質および核に取り込むために使用されていることを
開示している。

【００４７】 しかしながら、いずれの理論にも束縛されることを望まないが、本発明のタン
パク質を送達させるために約６０のアミノ酸配列が好ましいと信じられている。

【００４８】 切断可能なリンカー領域 好ましくは、第１および第２の領域は、切断可能なリンカー領域によって連結
される。この領域はこの目的に適切な任意の領域であり得る。好ましくは、切断
可能なリンカー領域はプロテアーゼ切断可能リンカーであるが、例えば、小分子
で切断可能な他のリンカーも使用され得る。これらには、臭化シアンで切断可能
なＭｅｔ−Ｘ部位、ヒドロキシアミンで切断可能なＡｓｎ−Ｇｌｙ部位、弱酸で
切断可能なＡｓｐ−Ｐｒｏ部位およびｉｎｔｅｒ ａｌｉａ、ＮＢＳ−スカトー ルで切断可能なＴｒｐ−Ｘ部位が含まれる。プロテアーゼ切断可能部位は、穏や
かな切断条件を必要とするため好ましく、例えば、Ｘａ因子、トロンビンおよび
コラゲナーゼに見出される。これらの任意の酵素が使用され得る。当該分野にお
いて正確な配列が利用可能であり、当業者は、適切な切断可能部位を選択するこ
とは困難ではない。例として、Ｘａ因子に標的されるプロテアーゼ切断可能部位
は、ＩＥＧＲである。エンテロキナーゼに標的されるプロテアーゼ切断可能領域
は、ＤＤＤＤＫである。トロンビンに標的されるプロテアーゼ切断可能領域は、
ＬＶＰＲＧである。好ましくは、切断可能なリンカー領域は細胞内プロテアーゼ
に標的される領域である。

【００４９】 第２の領域 融合タンパク質 本発明のコンジュゲートの第２の領域は第１の領域に自然には結合しない任意
の目的のタンパク質配列（本明細書中で以下ＰＯＩ）を含み得る。通常、これは
、ＰＯＩが第１の領域をコードする遺伝子と異なる遺伝子によって実質的にコー
ドされていることを意味する。第２の領域は第１の領域と同種由来であり得るが
、自然状態と異なるかまたは異種の様式で本発明のコンジュゲート中に存在する
。

【００５０】 本発明の第２の領域は、好ましくは、少なくとも１００アミノ酸長である。本
発明は、特に、より長い配列（例えば、少なくとも１５０、２００、３００、４
００または１０００アミノ酸長）が有用である。疑義を回避するために、本明細
書中で使用される用語「タンパク質」もまた、必要な長さのポリペプチドを含む
が、用語「ポリペプチド」とは、本発明者らは、一般に２〜１００、通常２〜６
０までのアミノ酸長の配列を意味する。

【００５１】 タンパク質／核酸複合体 本発明では、核酸は、目的の任意の核酸（以下ＮＯＩと称する）を含み、例え
ば、ＮＯＩは治療的に活性がある、またはレポーター遺伝子であり得る。ＮＯＩ
はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＩはオリゴヌ
クレオチドである。

【００５２】 本発明がタンパク質／核酸複合体に関する場合、複合体は、好ましくは、第２
の領域の一部として核酸（またはＤＮＡ）結合ドメインをさらに含む。核酸結合
ドメインは、核酸成分を有するタンパク質成分の特異的で、高親和性で、かつ非
共有結合性の相互作用を媒介するように作用する。

【００５３】 核酸結合ドメインはＲＮＡ結合ドメインまたは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメ
イン、例えば、転写因子、特に酵母またはヒト転写因子のＤＮＡ結合ドメインで
あり得る。ＤＮＡ配列ＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧに対して本発明のタ
ンパク質の選択的結合を媒介するＧＡＬ４誘導ドメインが好ましい(Caveyら、J.
Mol. Biol.、209、423、1989)。最も好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインは２〜１４７
のＧＡＬ４アミノ酸からなる。ＤＮＡ結合ドメインは、第２のドメインの１本鎖
または２本鎖ＤＮＡに結合し得る。

【００５４】 別の適切なドメインはヒストンである。

【００５５】 本発明のコンジュゲートへの応用は、以下を包含する（これらの応用には重複
が存在し得る）。

【００５６】 １．抗原送達機構。抗原は、免疫担当動物に移入した場合、抗原に結合し得る
特異的な抗体の産生を刺激する任意の因子である。しかしながら、抗原は抗体産
生を刺激し得るキャリアに結合されることが必要であり得る。本発明が抗原を細
胞膜の一方から他方への輸送によるキャリアとして作用することによりそれが抗
体産生を刺激し得るため、本発明は役に立つ。例として、細胞質中のＡｎｔｐに
よって転移される細菌またはウイルス抗原が処理され、ＭＨＣクラスＩ分子に結
合され得る。この抗原の処理と提示の経路は、ＣＤ８細胞障害性リンパ球を特異
的に活性化させることにより知られている。

【００５７】 ２．遺伝子治療。遺伝子治療は、例えば、標的細胞などの１つまたはそれ以上
の標的部位中の１つまたはそれ以上の塩基配列の付加、置換、欠失、補足、操作
などのいずれか１つまたはそれ以上を含む。標的部位が標的細胞である場合、細
胞は組織または器官の一部であり得る。遺伝子治療における一般的な教示はMole
cular Biology(Robert Meyers編、VCH発行、例えば、556〜558など)に見出され得る
。

【００５８】 さらなる例として、遺伝子治療もまた以下の１つまたはそれ以上による手段を
提供し得る。遺伝子などの塩基配列は欠陥遺伝子の置換または補足に適用され得
る、遺伝子などの病原性塩基配列またはその発現産物が誘発され得る、遺伝子な
どの塩基配列またはその発現産物は、例えば、より好ましい表現型を作製するた
めに順番に付加または移入され得る、遺伝子などの塩基配列またはその発現産物
は、例えば、選択目的（すなわち、形質転換細胞および非形質転換細胞を選択す
るため）のために付加または移入され得る、癌(Schmidt-WolfおよびSchmidt-Wol
f、1994、Annals of Hematology、69、273〜279)などの罹患状態または免疫障害、心
臓血管障害、神経学的障害、炎症障害、感染障害などの罹患状態を治療、処置ま
たは防止するため、細胞は、分子レベルで操作され得る、抗原は遺伝的ワクチン
摂取などの免疫応答を惹起させるために操作または移入され得る。特に好ましい
実施形態では、Ａｎｔｐは、遺伝的に欠陥のある細胞型の細胞質中に機能的タン
パク質を移入するために使用され得る。

【００５９】 ３．癌治療。Ａｎｔｐは、転写因子であり且つ細胞サイクル制御を回復させる
かまたは分化を誘導し得るガン細胞分子に輸送するために使用され得る。例えば
、機能性Ｐ−５３分子がガン細胞の細胞質に移入された場合、多くのガン細胞が
アポトーシスを受けるであろうことが理解される。本発明は、このような遺伝子
産物を送達させるために使用され得る。

【００６０】 ４．抗細菌および抗ウイルス対策の開発。例えば、Ａｎｔｐは、感染細胞の細
胞質中で細菌またはウイルス複製の重大な工程に干渉する組換え抗体またはＤＮ
Ａ結合分子を輸送するために使用され得る。

【００６１】 本発明者らは、今回、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓの８５Ａ抗原またはマラリア抗原Ｐｂ２１に対する１本鎖組換え抗体のいずれ
かと融合したアンテナペディアのホメオドメインによって構築された組換えキメ
ラタンパク質を作製した。

【００６２】 ５．発現機構の使用。例えば、外来性タンパク質が正確に処理されるように、
真核細胞中に外因性タンパク質を発現させることが望ましい。しかし、多くの外
因性タンパク質は、真核細胞に対して毒性がある。従って、外因性タンパク質の
製造において、外因性タンパク質の一過性発現を達成することが望ましい。従っ
て、この機構はこのための誘導性プロモーターまたはこのような機構に関連する
任意の他のアプリケーションとともに使用され得る。このような機構（ｌｏｘＰ
／ｃｒｅ機構）において、真核細胞はリプレッサーに機能的に連結される目的の
タンパク質をコードする遺伝子を含む。従って、通常の条件下では、タンパク質
は発現されない。Ａｎｔｐホメオドメインは、リプレッサー遺伝子を切り出すＣ
ｒｅ組換え酵素に融合され得る。従って、真核細胞に対するこのコンジュゲート
の適用はタンパク質の発現を引き起こす。

【００６３】 ６．レセプター媒介シグナリング。レセプターは、細胞機能の変化を開始させ
るホルモン、神経伝達物質、薬物または細胞内メッセンジャーとの組み合わせを
受ける細胞性高分子である。レセプターは、細胞間または細胞内での化学的シグ
ナリングに直接的および特異的に関与する。レセプター媒介とは、本発明者らは
、レセプターの媒介性作用を必要とする応答を意味する。従って、本発明は細胞
機能の変化を開始させる必要がある。

【００６４】 ７．タンパク質の分類。

【００６５】 ８．ＤＮＡ合成。 本発明は特に重要である。なぜなら、遺伝子の内因性発現を干渉するおよび／
またはウイルスまたは細菌の複製プロセスを干渉する機能性転写因子を細胞の核
に輸送するからである。

【００６６】 適切なＮＯＩコード配列およびＰＯＩには、サイトカイン、ケモカイン、ホル
モン、抗体、操作された免疫グロブリン様分子、１本鎖抗体、コンジュゲート、
酵素、免疫共刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスＲＮＡ、標的タンパク質の
トランスドミナントネガティブ変異体、トキシン、例えばエンドトキシンＡ、コ
リシンＡ、ｄ−エンドトキシン、ジフテリアトキシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎ ｔｈｒｏｘトキシン、コレラトキシン、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓトキシン、Ｅ．ｃｏ
ｌｉトキシン、ＳｈｉｇａトキシンまたはＳｈｉｇａ様トキシン、条件的トキシ
ン、抗原、腫瘍サプレッサータンパク質および成長因子、膜タンパク質、血管作
用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、なら
びにそれらの誘導体（例えば、結合レポーター群を有する）をコードする配列か
またはＰＯＩなどの治療および／または診断へ応用されるものが含まれるがこれ
らに限定されない。含まれる場合、このようなコード配列は、代表的にはリボザ
イムの発現を駆動するプロモーターまたは異なるプロモーターであり得る適切な
プロモーターに作動可能に連結され得る。

【００６７】 本発明のコンジュゲートは、ＷＯ−Ａ−９８／０５６３５に列挙されている疾
患の治療に有用な１つまたはそれ以上のＮＯＩまたはＰＯＩを送達するために使
用され得る。参照を容易にするために、以下にそのリストの一部を提供する：癌
、炎症または炎症性疾患、皮膚科学的障害、発熱、心血管性効果、出血、血液凝
固および急性期反応、悪液質、摂食障害、急性感染、ＨＩＶ感染、ショック状態
、移植片対宿主反応、自己免疫病、再潅流損傷、髄膜炎、偏頭痛およびアスピリ
ン依存性抗血栓、腫瘍増殖、浸潤および伝播、血管形成、転移、悪性、腹水およ
び悪性胸水、脳虚血、虚血性心疾患、骨関節炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、喘息
、多発性硬化症、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、脳卒
中、血管炎、クローン病および潰瘍性大腸炎、歯周病、歯肉炎、乾癬、アトピー
性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水泡症、角膜潰瘍、網膜症、外科手術創傷治療、鼻炎
、アレルギー性結膜炎、湿疹、過敏症（アナフィラキシー）、再狭窄、鬱血性心
不全、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症または内膜硬化症。

【００６８】 さらに、またはそれに代えて、本発明のコンジュゲートは、ＷＯ−Ａ−９８／
０７８５９に列挙された障害の治療に有用な１つまたはそれ以上のＮＯＩまたは
ＰＯＩを送達させるために使用され得る。参照を容易にするために、今回、その
リストの一部を提供する：サイトカインおよび細胞増殖／分化活性、免疫抑制ま
たは免疫刺激活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルス感染を含む免疫不全の治療、
リンパ球増殖の制御、癌および多くの自己免疫病の治療、ならびに移植拒絶の回
避または腫瘍免疫の誘導のため）、造血の制御、例えば、骨髄系またはリンパ系
疾患の治療、骨、軟骨、腱、靭帯および神経組織の成長の促進、例えば、創傷の
治癒、火傷、潰瘍および歯周病ならびに神経変性の治療、卵胞刺激ホルモンの阻
害または活性化（稔性の調節）、走化性／ケモキネシス活性（例えば、損傷また
は感染部位に特定の細胞型を移動させる）、止血性および血栓溶解活性（例えば
、血友病および脳卒中の治療用）、抗炎症性活性（例えば、敗血症性ショックま
たはクローン病）、抗菌剤として、例えば、代謝または行動のモジュレーター、
鎮痛薬として、特異的な欠損症の治療、ヒトまたは獣医学における例えば乾癬の
治療。

【００６９】 さらに、またはそれに代えて、本発明のコンジュゲートは、ＷＯ−Ａ−９８／
０９９８５に列挙された障害の治療に有用な１つまたはそれ以上のＮＯＩまたは
ＰＯＩを送達させるために使用され得る。参照を容易にするために、今回、その
リストの一部を提供する：マクロファージ阻害活性および／またはＴ細胞阻害活
性、すなわち、抗炎症活性、抗炎症活性、すなわち、炎症に関連しない応答を含
む細胞および／またはヒト免疫応答に対する阻害効果により、マクロファージお
よびＴ細胞の細胞外マトリクス成分およびフィブロネクチンを接着させる能力な
らびにＴ細胞におけるアップレギュレートされたｆａｓレセプターを阻害し、所
望でない免疫反応および炎症（関節炎（関節リウマチを含む）を含む）、過敏症
関連炎症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病および他の
自己免疫病、アテローム性動脈硬化症関連炎症、動脈硬化症、動脈硬化精神疾患
、再潅流損傷、心疾患、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群または他の
心肺疾患、消化性潰瘍関連炎症、潰瘍性大腸炎および他の消化管疾患、肝線維症
、肝硬変または肝疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎疾
患および神経性疾患、耳炎または耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の経皮疾患、歯
周病または他の歯疾患、睾丸炎または副睾丸炎、不妊症、睾丸外傷または他の免
疫関連精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症および
他の免疫および／または炎症関連婦人病、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、
前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症（
例えば、網膜炎）、胞状黄斑浮腫、交感神経性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、
退行性眼底疾患の免疫および炎症成分、眼球外傷の炎症成分、感染によって生じ
る眼球の炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、過剰瘢痕（例えば、
緑内障濾過操作の後）、眼球移植に対する免疫および／または炎症反応ならびに
他の免疫および炎症関連眼疾患、自己免疫病関連炎症、中枢神経系（ＣＮＳ）ま
たは他の任意の器官の両方において、免疫および／または炎症の抑制が利点を持
つような条件または疾患、パーキンソン病、パーキンソン病治療由来の合併症お
よび／または副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆複合体、ＨＩＶ関連脳症、ドヴィック症
、シドナム舞踏病、アルツハイマー病および他の退行性疾患、ＣＮＳの条件また
は障害、ストークスの炎症成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫および炎症成
分、髄膜炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳髄膜炎、急性神経障害、亜急性神経
障害、慢性神経障害、ギャン−バレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、
偽腫瘍大脳、ダウン症候群、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ
圧迫またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳ感染の炎症成分、筋萎縮および筋ジストロフ
ィーの炎症成分、中枢および末梢神経系の免疫および炎症関連疾患、条件または
障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染疾患、手術に伴う炎症性合併症また
は副作用、骨髄移植または他の移植による合併症および／または副作用、遺伝子
治療による炎症および／または免疫合併症および副作用（例えば、ウイルスキャ
リアでの感染）、ＡＩＤＳ関連炎症、を阻害する。ヒトおよび／または細胞免疫
応答を抑制または阻害し、単球または白血球増殖疾患（例えば、白血病）を単球
またはリンパ球を減少させることによって治療または回復させるために、自然ま
たは人工の細胞、組織および器官（角膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカー
、自然または人工皮膚など）を移植する場合の移植拒絶を回避および／または治
療するために使用され得る。

【００７０】 本発明はまた、遺伝子治療による個体の治療のための薬学的組成物を提供し、
この薬学的組成物には有効量の本発明のコンジュゲートが含まれている。薬学的
組成物は、ヒトまたは動物に使用される物であり得る。代表的には、医師は、各
被験体に最も適する実際の投薬を決定し、これは年齢、体重および反応によって
変化する。

【００７１】 組成物は、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤また
は補助剤を含む。薬学的キャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、目的の投与経
路および標準的な薬学的業務に応じて選択され得る。薬学的組成物は、キャリア
、賦形剤または希釈剤、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コート剤、溶解
剤、および標的部位（例えば脂質送達機構）への侵入を援助または増大させるキ
ャリア剤を含むかまたは添加され得る。

【００７２】 適切な場所に、薬学的組成物が以下の任意の１つまたはそれ以上の方法によっ
て投与され得る：吸入、座薬または膣座薬の形態での投与、ローション、溶液、
クリーム、軟膏または粉剤の形態での局所投与、皮膚パッチの使用による投与、
デンプンまたはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤または単独または賦形剤と混
合したカプセルまたは卵または香料および着色料を含むエリキシル、溶液または
懸濁液の形態での経口投与、または、それらは非経口的（例えば、空洞内、静脈
内、筋肉内または皮下）に注射され得る。非経口投与用には、組成物は他の物質
（例えば、血液と等脹の溶液を作製するのに十分な塩または単糖）を含み得る滅
菌水溶液の形態で使用されるのが最良であり得る。頬側または舌下投与用には、
組成物は、従来の方法で処方され得る錠剤またはロゼンジの形態で投与され得る
。

【００７３】 本発明の１つまたはそれ以上の治療遺伝子またはタンパク質の送達は、単独ま
たは他の処理または処理成分と組み合わせて使用され得る。処理され得る疾患に
は、癌、神経症、遺伝病、心疾患、脳卒中、関節炎、ウイルス感染および免疫機
構の疾患が含まれるが、これらに限定されない。適切な治療遺伝子には、腫瘍サ
プレッサータンパク質、酵素、プロドラッグ活性酵素、免疫調節分子、抗体、操
作された免疫グロブリン様分子、コンジュゲート、ホルモン、膜タンパク質、血
管作動性タンパク質またはペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗ウイルスタ
ンパク質、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムをコードする遺伝子が含まれる
。

【００７４】 コンジュゲートはまた、１つまたはそれ以上のサイトカインコードＮＯＩまた
はサイトカインを含む。適切なサイトカインおよび成長因子には、ＡｐｏＥ、Ａ
ｐｏ−ＳＡＡ、ＢＮＤＦ、Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１、ＥＧＦ、ＥＮＡ−
７８、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｅｏｔａｘｉｎ−２、Ｅｘｏｄｕｓ−２、酸性ＦＧＦ、
塩基性ＦＧＦ、線維芽細胞成長因子−１０(Marshall、1998、Nature Biotechnolog
y、16、129)、ＥＬＴ３リガンド(Kimuraら、1997)、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ（ＣＸ
３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、インスリン、ＩＦ
Ｎ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ
−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２アミノ酸）、
ＩＬ−８（７７アミノ酸）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、
ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、
Ｉｎｈｉｂｉｎα、Ｉｎｈｉｂｉｎβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト成長因子−
２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、Ｌｅｐｔｉｎ、ＬＩＦ、Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ
、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質(M
arshall、1998、同書)、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７アミノ酸）、ＭＤＣ（６９アミ
ノ酸）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤ
Ｃ（６７アミノ酸）、ＭＤＣ（６９アミノ酸）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ
−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄球前駆体阻害因子−１
（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ、神経成長因子、β−ＮＧ
Ｆ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧ Ｆ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β
、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＳＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−
β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮ
Ｆ−β、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、Ｇ
ＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、１−３０９が含まれるがこれらに限定されな
い。

【００７５】 本発明のコンジュゲートは、さらに適切なドメインを含み得る。これらは当業
者に公知である。例えば、小胞体は、保持シグナルが本発明の内部移行したコン
ジュゲートまたはタンパク質／核酸複合体の細胞内経路決定に影響するように機
能する。適切な内質の保持シグナルは、哺乳動物小胞体保持シグナルであり得る
。

【００７６】 本発明の転移ドメインは、細胞小胞機構から逃れた核酸またはタンパク質を増
加させ、それによりこの経路による核酸導入を増加させる様に作用する転移ドメ
インでもあり得る。このドメインはタンパク質／核酸の標的細胞への内部移行後
にリソソーム分解を減少または回避するように作用し得る。適切な転移ドメイン
は、トキシン、特に、エキソトキシンＡ、Ｃｏｌｉｃｉｎ Ａ、ｄ−エンドトキ シン、ジフテリアトキシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒｏｘトキシン、コレ ラトキシン、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓトキシン、Ｅ．ｃｏｌｉトキシン、Ｓｈｉｇａ
ｔｏｘｉｎまたはＳｈｉｇａ様トキシンなどの細菌トキシンに由来する。

【００７７】 本発明の第１のドメインは、核以外の細胞部位に標的するように修飾され得る
。

【００７８】 さらに、またはそれに代えて、本発明のドメインは、標的細胞のレセプタータ
ンパク質または表面抗原などの細胞表面構造を認識する標的細胞特異的結合ドメ
インでもあり得る。

【００７９】 核酸。 本発明はまた、本発明のコンジュゲートをコードする核酸を提供する。これら
は標準的なＤＮＡ方法論を用いて構築され得る。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであ
り得、好ましくはＤＮＡである。ＲＮＡである場合、操作は、中間物としてｃＤ
ＮＡを介して行われ得る。一般に、第１の領域をコードする核酸配列が調製され
、５’および／または３’末端であれば適切な制限部位である。都合の良いこと
には、配列はｐＢＲ３２２、またはｐＵＣ１９を基本としたプラスミドベクター
などの標準的な実験室ベクター中で操作される（以下を参照のこと）。Sambrook
らのMolecular Cloning(Cold Spring Harbor、1989)を参考としたが、適当な技術
の詳細を正確に把握するために類似の標準的な文献を参考とされ得る。

【００８０】 第２の領域をコードする核酸もまた、類似のベクター機構において提供され得
る。核酸の出所は、発行済みの文献またはＧｅｎｂａｎｋなどのデータベースを
参考にして確認され得る。

【００８１】 所望の第１または第２の領域をコードする核酸は、核酸をご厚意で提供してく
れる場合は大学または市販の出所から、配列データのみが利用可能な場合は適切
な配列を合成またはクローニングすることによって得ることが出来る。一般に、
これは、目的の遺伝子のクローニングが記載されている文献を参考として行われ
得る。

【００８２】 あるいは、制限配列データが利用可能である場合かまたは公知の核酸配列に相
同であるかまたは関連する核酸を発現することが所望される場合、例示的な核酸
は当該分野で公知の核酸にハイブリダイズするそれらのヌクレオチドとして特徴
づけられ得る。

【００８３】 ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリダイゼ
ーションが安定である条件をいう。このような条件は当業者で証明されている。
当業者に公知であるように、ハイブリダイゼーションの安定性はハイブリダイゼ
ーションの融解温度（Ｔｍ）に影響され、それは約１〜１．５℃で配列相同性が
１％ずつ減少している。一般に、ハイブリダイゼーションの安定性はナトリウム
イオン濃度および温度の関数である。代表的には、ハイブリダイゼーション反応
は高ストリンジェンシー条件下で行われ、その後種々のストリンジェンシーを洗
浄する。

【００８４】 本明細書中で使用されるように、高ストリンジェンシーとは、６５〜６８℃の
１Ｍ Ｎａ＋中で安定なハイブリダイゼーションを形成する核酸配列のみをハイ
ブリダイゼーションさせる条件をいう。高ストリンジェンシーは、例えば、６×
ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０
．１ピロリン酸ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（非特異的競
合物として使用）を含む水溶液中でのハイブリダイゼーションによって提供され
得る。ハイブリダイゼーション後、数工程で高ストリンジェンシー洗浄を行い、
最後の洗浄（約３０分間）はハイブリダイゼーション温度の０．２〜０．１×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で行った。

【００８５】 中位のストリンジェンシーとは、上記の溶液であるが約６０〜６２℃でハイブ
リダイゼーションするのに等しい条件をいう。この場合、最後の洗浄はハイブリ
ダイゼーション温度の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で行った。

【００８６】 低ストリンジェンシーとは、上記の溶液であるが約５０〜５２℃でハイブリダ
イゼーションするのに等しい条件をいう。この場合、最後の洗浄はハイブリダイ
ゼーション温度の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で行った。

【００８７】 これらの条件は、種々の緩衝液（例えば、ホルムアミドベースの緩衝液）およ
び温度を用いて適用されそして繰り返され得ると理解された。Ｄｅｎｈａｒｄｔ
液およびＳＳＣは他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液(例えば、Sambrookら
編、1989、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laborat
ory Press、New YorkまたはAusbelら編、1990、Curent Protocols in Molecular Bi
ology、John Wiley&Sons社を参照のこと)であるように、当業者に周知である。プ
ローブの長さおよびＧＣ含有率もまた役割をはたすような最適なハイブリダイゼ
ーション条件が経験的に決定されなければならない。

【００８８】 発現ベクターおよび宿主細胞 本発明のコンジュゲートをコードする核酸またはその構築部分は、さらなる操
作のためにベクターに組み込まれ得る。本明細書中で使用されるように、ベクタ
ー（またはプラスミド）は、その発現または複製のいずれかのために細胞に異種
ＤＮＡを移入するために使用される分離型エレメントをいう。このような伝達体
の選択および使用は十分に当業者の技術の範囲内である。多くのベクターが利用
可能であり、適切なベクターの選択はベクターの使用目的（すなわち、ベクター
がＤＮＡの増幅用またはＤＮＡ発現用のいずれに使用されるか）、ベクターに挿
入されるべきＤＮＡのサイズおよびベクター内で形質転換されるべき宿主細胞に
依存する。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）および
可逆的な宿主に依存する種々の成分を含む。一般に、ベクター成分は、以下の１
つまたはそれ以上を含むが、これらに限定されない：複製起点、１つまたはそれ
以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終止配列
およびシグナル配列。

【００８９】 抗体産生 本発明のコンジュゲートは、さらなるアジュバントを使用することなく、抗血
清および単球抗体を作製するための免疫原として直接使用され得る。

【００９０】 本発明のさらに別の実施形態では、本発明のコンジュゲートを特異的に認識し
て結合する抗体を提供する。しかし、より好ましくは、抗体はコンジュゲートの
第２の領域に特異的であり、抗体はその発現を達成するために本発明の遺伝子産
物に融合されるポリペプチドである。都合の良いことに、コンジュゲートの第２
の領域は、自然の状況で抗体によって認識される。従って、第２の領域がより大
きなタンパク質から単離されたペプチドまたはドメインである場合、そのペプチ
ドまたはドメインは、より大きなタンパク質の全体の状況において本発明の抗体
によって認識される。

【００９１】 本発明は、さらに、 ａ）動物を本発明のコンジュゲートで免疫する工程と、 ｂ）コンジュゲート領域に特異的な免疫グロブリンを該動物の血清から回収す
る工程とを包含する、免疫グロブリンの調製法を提供する。

【００９２】 抗体（つまり免疫グロブリン）は、コンジュゲートに対するアフィニティーク
ロマトグラフィーによって粗調製物、すなわち、抗血清の形態で単離される。

【００９３】 Ａｎｔｐ−コンジュゲートの発現および精製 いずれの理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは細胞表面膜を通
過して転移するＡｎｔｐ−コンジュゲートの能力は組換えタンパク質のコンホメ
ーションに非常に大きく依存し得ると信じている。本発明者らは、少量の界面活
性剤（イオン系および非イオン系）または変性剤（尿素またはグアニジニウム）
に晒した細菌細胞抽出液または精製タンパク質のいずれかを使用することによっ
てもポリペプチドの転移を観察することが出来なかった。これまでに発行されて
きた全ての報告が合成ペプチドまたは細菌細胞抽出物を使用しているので、この
コンホメーション依存特性は、インビトロおよびインビボ実験の両方でのＡｎｔ
ｐ−コンジュゲート使用における一連の問題を示している。本発明者らは、本発
明における自然の条件下でのＡｎｔｐ−コンジュゲートの精製により、これらの
制限を克服した。

【００９４】 〔実施例１〕 本発明者らは、組換えタンパク質のＣ末端に、これらのタンパク質にニッケル
イオンに対する高親和性を付与する６ヒスチジンテイルを移入した。組換えタン
パク質を発現する細菌細胞を、超音波に繰り返し晒すことによって溶解した。細
胞溶菌液を遠心してニッケルカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）に装填した。カラムに結
合させたタンパク質を、緩衝液のｐＨ変化により段階溶出した。これらの条件下
で、Ａｎｔｐ−コンジュゲートは、選択的に濃縮され得る。本発明者らは、ゲル
電気泳動によってｐＨ４．０〜５．０の範囲でニッケルカラムから溶出された７
５％までの物質がＡｎｔｐ−コンジュゲートによるものと評価した。Ａｎｔｐ組
換えタンパク質を、ヒスチジンテイルに対する抗体４Ｄ１１を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーによってさらに精製した。該組換えタンパク質を、緩衝
液のｐＨを変化させることによってカラムから溶出した。本発明者らの結果は、
ｐＨ２．８で溶出させた画分がいずれの細菌不純物もほとんど含まない組換えタ
ンパク質含むことを示す。次いで、これらのタンパク質画分を、ポリミキシンカ
ラムに添加してＬＰＳおよび細菌関連不純物を選択的に除いた。ゲル電気泳動分
析では、ポリミキシンカラムの溶出液が細菌不純物を含まない（精製度９９．５
％）組換えタンパク質を含むことを示した。精製Ａｎｔｐ−コンジュゲートを、
異なる細胞型の細胞表面膜を通過して転移する能力について試験した。本発明者
らの結果は、精製コンジュゲートＡｎｔｐ−８５Ａは種々の細胞株（Ｈｅｌａ、
Ｈｅｐ−Ｇ２、Ｐ８１５ ＥＬ４）およびヒト単球を通過して転移され得ること
を示す。高分子を細胞膜を通過して輸送させるＡｎｔｐの能力は、コンジュゲー
トの特定のアミノ酸組成に影響されない。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅ ｉのマラリア抗原である約１５０アミノ酸のトロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｐｏｎｄｉｎ）無名（anomymous）タンパク質（ＴＲＡＰ）を用いて作製さ れた異なるＡｎｔｐ−融合分子(Robson KJら、Mol Biochem Parasitol、1997、84、1
、1〜12)は、８５Ａ構築物と同等に効果的に細胞膜を通過して移入された。

【００９５】 モノクローナル抗体４Ｄ１１ モノクローナル抗体（ｍＡｂ）４Ｄ１１は、そのＮ末端に６ヒスチジンテイル
を含む組換えタンパク質で免疫されたマウスから作製されたハイブリドーマをＥ
ＬＩＳＡでスクリーニングすることによって見出される。抗体は、Innovations 社、47 Princes Gate、London SW7 2AZ、UK気付、Imperial College of Science、Te
chnology and Medicine、Sherfield Building Exhbition Rd、London SW7 2AZ、UK から入手可能である。エピトープ分子の特徴として、このｍＡｂは組換えタンパ
ク質のＮ末端およびＣ末端の両方でアミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨＧＳを認識するこ
とを示した。抗体は、ＩｇＧ１イソタイプを有し、プロテインＡカラムにより容
易に精製され得る。本発明者らの結果は、ＥＬＩＳＡ免疫ブロット、免疫蛍光法
において４Ｄ１１がＨＨＨＨＨＨＧＳを含む組換えタンパク質を認識すること示
す。さらに、ビーズ（ａｆｆｉ−ｇｅｌまたはＣＮＢＲ活性化セファロース）に
結合した精製４Ｄ１１は自然条件下で組換えタンパク質を精製するために使用さ
れ得る。

【００９６】 ＴＢＣワクチン 本発明は、ヒトならびに細胞媒介ヘルパーおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ抗原に対する細胞障害性免疫応答を誘導し得る組換えワクチンを提供するため
に使用され得る。ＭＣＨクラスＩ制限細胞障害性免疫応答を惹起させるために、
ワクチンにおいて使用される抗原を免疫化生物の掲示細胞中の細胞質コンパート
メントにアクセスすべきであった。８５Ａタンパク質は抗原複合体８５ＡＢＣの
メンバーの１つであり、培養培地中および細菌感染間にＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓから分泌される最も豊富な分子種を示す。さらに、自然の感染によって誘
導される防御免疫応答は、主に抗原８５Ａに指向し、このタンパク質は抗体およ
びサイトカインの産生を惹起し、細胞障害性Ｔ細胞を刺激する。これは、Ｍ．ｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの自然の感染およびＢＣＧを用いた免疫手順の間に処理
および提示系とをを再生する。理論に拘束されることを望まないが、このような
ワクチンの開発が、細胞膜を通過して細菌タンパク質を細胞質コンパートメント
に転移するための分子伝達体を必要とするであろうということが信じられる。

【００９７】 〔実施例２〕 送達機構としてのＡｎｔｐの使用の可能性を示すために、以下の実験活動が遂
行された：（ｉ）発現プラスミド中での８５Ａの全長をクローニングすること、
（ｉｉ）Ａｎｔのホメオドメインがタンパク質８５ＡのＮ末端に挿入されている
キメラタンパク質をコードする合成遺伝子の開発、（ｉｉｉ）Ｅ． ｃｏｌｉ中 での発現および組換えタンパク質の精製、（ｉｖ）８５Ａに対する特定の抗血清
の開発、および（ｖ）ミコバクテリアの（mycobacterial）ポリペプチド８５Ａ を培養中のＨｅＬａ細胞の細胞質に伝達させるＡｎｔｐの能力の分析。

【００９８】 Ａ．発現プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩにおける８５Ａコード配列のクロ
ーニング 全長８５Ａ遺伝子を、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒｖ株から抽出し
たテンプレートＤＮＡとして使用したＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ反応のプライ
マーとして、本発明者らは８５Ａのアミノ酸配列から推測されるオリゴヌクレオ
チドを使用した。発現ベクターのクローニングを容易にするため、プライマーの
５’末端に制限サイトＢａｍ ＨＩおよびＳａｌ Ｉを含むようにプライマーを作
成した。増幅配列を発現プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ中でクローニングし
、その結果プラスミドｐＤＳ／８５Ａが産生された。増幅された配列８５Ａを配
列決定して、増幅反応中にもたらされた変異の存在を除外した。プラスミドｐＤ
Ｓ５６ ＲＢＳＩＩの発現ユニットはＩＰＴＧ誘導プロモーターの調節下であり 、Ｎ末端またはＣ末端に６ヒスチジンを含むコンジュゲートを生じる。ヒスチジ
ンの存在は、タンパク質にニッケルイオンに対する高親和性を付与する。組換え
タンパク質８５Ａを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてニッケルカラムのアフ
ィニティークロマトグラフィーで精製する。精製工程後に回収したタンパク質の
収量および質を、アフィニティーカラムから溶出したサンプルをＳＤＳアクリル
アミドゲル電気泳動で分析することによって評価した。

【００９９】 Ｂ．キメラタンパク質Ａｎｔｐ−８５Ａをコードする合成遺伝子の開発 アンテナペディアのホメオドメインをコードする配列を、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒの胚細胞から抽出したＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲ実
験において増幅させた。ホメオドメインはアミノ酸２９７〜３５６由来のＡｎｔ
ｐの配列を含み、イントロンによって干渉されない遺伝子配列によってコードさ
れる。プライマーとして、本発明者らは、ホメオドメイン配列を基にして推測さ
れ、５’末端にＢａｍ ＨＩ制限サイトを含むオリゴヌクレオチドを使用した。 ＰＣＲ産物を配列決定し、ホメオドメイン配列中のＰＣＲによってもたらされた
変異体の存在を除外した。制限サイトＢａｍ ＨＩは、キメラタンパク質Ａｎｔ ｐ−８５ＡをコードするプラスミドｐＤＳ／８５Ａ中の８５Ａ配列の前部に、正
確な読みとりが来るようなＰＣＲ産物のクローニングを可能にした。このタンパ
ク質は、ＡｎｔｐのホメオドメインならびにＮ末端およびＣ末端それぞれでのヒ
スチジンテイルの存在によって特徴づけられる。キメラタンパク質配列の情況に
おけるこのドメインの正確な折りたたみを促進するために、Ａｎｔｐ配列をＮ末
端に入れた。キメラタンパク質Ａｎｔｐ−８５Ａの発現を、細菌溶菌液をＳＤＳ
アクリルアミドゲルで分析することによって評価した。免疫ブロット実験におい
て、血清ｓ−８５Ａは、Ａｎｔｐ−８５Ａで推測された分子量を有する分子の移
動を認識した。

【０１００】 Ｃ．キメラタンパク質Ａｎｔｐ−８５Ａの機能分析 細胞膜を通過して転移するキメラタンパク質の能力を評価するために、漸増量
の精製Ａｎｔｐ−８５Ａを培養中のＨｅＬａ細胞に添加した。対照として、細胞
をそのＮ末端にＡｎｔｐのホメオドメインを欠く組換えタンパク質８５Ａと共に
インキュベートした。３７℃で３時間のインキュベーション後、細胞をホルムア
ルデヒド中で混合し、抗血清ｓ−８５Ａで分析して、８５Ａエピトープの細胞質
への転移を明らかにした。免疫蛍光実験では、血清ｓ−８５Ａは、８５Ａを含む
細菌溶菌液と予めインキュベートしたＨｅＬａ細胞に反応しなかった。この知見
は、これらのポリペプチドが細胞膜を通過し得ないことを示すであろう。それに
対して、抗血清ｓ−２５は、キメラタンパク質Ａｎｔｐ−８５Ａと共にインキュ
ベートしたＨｅＬａ細胞に対する明確な細胞質反応性を示した。この最後の結果
は、８５ＡエピトープがＡｎｔｐ−８５Ａとインキュベートした細胞の細胞質内
に局在化していることを強く示し、従ってＡｎｔｐのホメオドメインは、キメラ
タンパク質に表面膜を通過して転移する能力を付与することを示している。これ
らの知見の全てから、細胞膜を通過して抗原を細胞質に伝達するために用いられ
るストラテジーは結核に対する実験ワクチンを開発するために使用され得る。精
製キメラタンパク質Ａｎｔｐ−８５Ａは、免疫動物においてヒトおよび細胞媒介
ヘルパーおよび細胞障害性免疫応答を惹起し得ることが予想される。

【０１０１】 〔実施例３〕 真核細胞におけるタンパク質のＰ／ｃｒｅ調節発現 Ｃｒｅ組換え酵素は、特定の部位（ＬｏｘＰ）で２本鎖ＤＮＡを切断するファ
ージ由来の酵素である。これらの部位の２つが正の方向に存在する場合、介在Ｄ
ＮＡ配列が切り出される。Ｃｒｅ組換え酵素は、細菌、酵母および哺乳動物細胞
などの遠縁の生物において作用することが示されている。Ａｎｔｐは、細胞の核
の内側にＣｒｅ組換え体を送達させるためおよび一過性調節様式で正確な位置で
ゲノムＤＮＡを操作するために使用され得る。Ａｎｔｐ−Ｃｒｅ融合の可能な適
用の１つは、真核細胞における遺伝子発現のための高度に調節された機構の開発
である。形質転換ベクターは、２つのＬｏｘＰ部位内で、転写リプレッサー因子
に対する標的配列として機能するＤＮＡエレメントを含むプロモーターの転写調
節下での遺伝子発現用に作成され得る。Ｃｒｅ組換え酵素の非存在下で、リプレ
ッサー配列の存在は、ベクター中でクローニングされた遺伝子をプロモーターに
転写させないであろう。Ａｎｔｐ−Ｃｒｅコンジュゲートを細胞に添加すること
によって、リプレッサー配列はプロモーターから切り出され、それにより転写が
開始される。この型の発現ベクターは、真核遺伝子の機能の研究ならびに生物学
的に活性な分子の大量発現に非常に有用であり得る。

【０１０２】 〔実施例４〕 組換え転写因子のアンテナペディア送達によるウイルス発現の調節 本発明者らは、さらに、転写抑制因子Ｏｃｔ−２．４の機能形態の培養細胞の
核への輸送能力を評価することによりＡｎｔｐ送達技術を調査する。この因子は
、転写因子のＰＯＵ（Ｐｉｔ−Ｃｃｔ−Ｕｎｃ）ファミリーのメンバーであり、
神経細胞においてのみ生じるＯｃｔ−２遺伝子転写の選択的スプライシングを起
源とする。

【０１０３】 Ｏｃｔ−２．４は、８量体ＤＮＡ調節エレメントＡＧＴＣＡＡＴに結合する能
力を保持するが、Ｏｃｔ−２のＣ末端に位置する活性化ドメインを欠く。Ｂリン
パ球プロモーターにおける正の調節因子として作用するＯｃｔ−２に対して、Ｏ
ｃｔ−２．４は転写リプレッサーとして機能し得る。特に、Ｏｃｔ−２．４は、
ＩＥ遺伝子プロモーター中の８量体関連調節エレメントへの結合による単純ヘル
ペスウイルス（ＨＳＶ）直後初期（immediate early，ＩＥ）遺伝子の転写を抑 制することが示された。さらに、ＨＳＶ許容細胞におけるＯｃｔ２．４の異所性
発現は、ＩＥ遺伝子発現をダウンレギュレートし、そしてウイルス溶菌サイクル
を阻害することを細胞において可能にした。したがってこれは、この因子がＨＳ
Ｖ複製に対する神経細胞の耐性の決定における重要な機能を果たし得ることを示
す。Ｏｃｔ−２．４のＮ末端にＡｎｔｐのホメオドメインを含み細胞表面膜を通
過する組換えコンジュゲートは、細胞核に到達し、ウイルスＩＥプロモーターを
ダウンレギュレートする。

【０１０４】 この提案は、生細胞の表面膜を通過してＯｃｔ−２．４を輸送するｈＡｎｔｐ
の能力を評価するという目的を有する。この目的を達成するために本発明者らは
、ｉ）ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４融合タンパク質を作製し、ｉｉ）融合タンパ
ク質のＨＳＶ ＩＥプロモーターへの結合能力および細胞膜を通過して転写する 能力を評価し、ｉｉｉ）ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４融合タンパク質で処理され
た細胞におけるＩＥプロモーターの転写活性を分析する。本実験は非侵入性タン
パク質送達機構の使用による細胞およびウイルス遺伝子の発現の操作実行可能性
を証明し、新規のクラスの抗ウイルス剤の開発を導く。

【０１０５】 〔方法〕 ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４構築物の開発 Ｏｃｔ−２．４をヒトＢリンパ球のｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡをテンプレ
ートとして使用したＰＣＲで増幅した。これらの細胞は全長 Ｏｃｔ−２転写因 子を発現することが以前から示されている。Ｏｃｔ−２．４のＰＣＲ産物を配列
決定し、それを使用してＥ． ｃｏｌｉ中で組換えタンパク質を発現する構築物 を作製した。Ａｎｔｐのホメオドメインの２９７〜３５６アミノ酸をコードする
配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＤＮＡから増幅されている。この配列は、その ＤＮＡ結合特性を排除するためにｉｎ ｓｉｔｕ変異誘発で修飾されており、生 細胞の表面膜を通過して転移されることが示されている。ｈＡｎｔｐ配列は、Ｏ
ｃｔ−２．４遺伝子の５’末端クローニングされ、従って、Ｏｃｔ−２．４ ｈ Ａｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４のＮ末端にｈＡｎｔｐを含む構築物ｈＡｎｔｐ−Ｏｃ
ｔ−２．４の作製はＡｎｔｐのホメオドメインによって転移されたタンパク質の
サイズ範囲内である約４０ｋＤａの分子量を有する。Ｏｃｔ−２．４の機能特性
は、ｈＡｎｔｐ配列の挿入によって影響されない。構造分析は、Ｏｃｔ−２．４
の抑制およびＤＮＡ結合活性が、異なる構造状況ならびにキメラタンパク質にお
けるそれらの機能を両方とも保持する４２アミノ酸配列（残基１４１〜１８２）
およびＰＯＵドメインによってそれぞれ媒介されることを示す。本発明者らはま
た、４２アミノ酸抑制配列およびＰＯＵ ＤＮＡ結合ドメインを含む欠損Ｏｃｔ −２．４因子をコードするように作成されている構築物ｈＡｎｔｐ−ΔＯｃｔ−
２．４を作製する。ｈＡｎｔｐ−ΔＯｃｔ−２．４はその転写抑制活性を保持し
、分子量が減ることにより、ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４よりも効果的に細胞膜
を通過して転移される。

【０１０６】 Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＯｃｔ−２．４およびｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４キメ
ラタンパク質の発現 Ｃ末端に６ヒスチジンが挿入されたベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ中でｈ
Ａｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４、ｈＡｎｔｐ−ΔＯｃｔ−２．４およびＯｃｔ−２．
４を発現させた。Ｈｉｓ末端の存在はニッケルキレートクロマトグラフィーによ
る組換えタンパク質の精製を可能にする。実験的証明は、この構造体制を有する
タンパク質が細胞膜を通過して効果的に転移されることを示す。

【０１０７】 不正確に折りたたまれたタンパク質を回避するために、本発明者らは、ｈＡｎ
ｔｐ−Ｏｃｔ−２．４、ｈＡｎｔｐ−ΔＯｃｔ−２．４およびＯｃｔ−２．４の
Ｎ末端に、細菌のペリプラズムへの組換えタンパク質の分泌を指示するＰｅｌ Ｂのシグナル配列を挿入する。このストラテジーは、非常に便利でＥ．ｃｏｌｉ
における機能性異種タンパク質を回収すると証明されている。Ｅ．ｃｏｌｉにお
ける組換えタンパク質の発現を、ヒスチジンテイルを認識するＭＡｂ ４Ｄ１１ を使用する免疫ブロット実験によって評価する。

【０１０８】 膜転移およびＤＮＡ結合特性分析 組換えタンパク質ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４、ｈＡｎｔｐ−ΔＯｃｔ−２．
４およびＯｃｔ−２．４のＤＮＡ結合特性を、自然および関連ＨＳＶ８量体配列
を含むオリゴヌクレオチドを用いるゲル遅延アッセイにて評価した。相互作用の
特異性を野生型および変異８量体オリゴヌクレオチドを用いた競合アッセイにお
いて調査する。ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４構築物は、ＢＨＫ細胞（ＡＴＣＣ：
ＣＲＬ−１６３２）を含むいくつかの細胞株（この細胞株は、ＨＳＶ感染に敏感
でＯｃｔ−２転写因子を欠く）の表面膜を通過するそれらの活性をさらに調査し
た。ＢＨＫ細胞をアフィニティー精製されたｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４、ｈＡ
ｎｔｐ−ΔＯｃｔ−２と共にインキュベートする。対照実験を、組換えＯｃｔ−
２．４および非関連のｈＡｎｔｐ−融合タンパク質と共にインキュベートするこ
とによって行った。処理細胞における組換え構築物の存在および分布を、免疫蛍
光実験において分析する。ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４、ｈＡｎｔｐ−ΔＯｃｔ
−２．４およびＯｃｔ−２．４と共にインキュベートしたＢＨＫ細胞を固定し、
浸透し、そしてＭＡｂ４Ｄ１１を用いた免疫蛍光の処理をする。

【０１０９】 ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４およびｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４の転写活性の
分析 ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４およびｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４の転写抑制活
性をＨＳＶ ＩＥプロモーター レポーター構築物で形質転換されたＢＨＫ細胞で
評価する。ヌクレオチド−３３０〜＋３３由来のＩＥ遺伝子３プロモーターを含
むＤＮＡ配列を、形質転換構築物ＩＥ３−Ｌｕｃ中のルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）
遺伝子に連結する。切断したＤＮＡは、８量体関連調節配列ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ
を含み、ＢＨＫ細胞内で転写活性がある。ＩＥ３−Ｌｕｃ構築物はまた、ｉ）Ｍ
ＭＴＶ−ＬＴＲレトロウイルスプロモーター、ｉｉ）ｎｅｏ遺伝子およびｉｉｉ
）ＳＶ４０スプライシングおよびポリアデニル化部位からなる、Ｇ４１８耐性遺
伝子（ｎｅｏ）転写単位を含む。形質転換ＢＨＫ細胞クローンは、ゲネチシン（
Ｇ４１８）で選択され、サザンブロットで分析される。実験的証明は、ＨＳＶ ＩＥ３プロモーターはＩＥ３−Ｌｕｃ形質転換ＢＨＫ細胞において高レベルのル
シフェラーゼを本質的に発現することを示す。ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４、ｈ
Ａｎｔｐ−ΔＯｃｔ−２．４の能力を評価し、ＨＳＶ ＩＥ３プロモーターの転 写活性を抑制するために、ＩＥ３−Ｌｕｃ形質転換ＢＨＫ細胞を異なる濃度のア
フィニティー精製ｈＡｎｔｐキメラタンパク質の非存在下または存在下のいずれ
かで培養する。対照として、形質転換細胞を、組換えＯｃｔ−２．４および非関
連のｈＡｎｔｐ融合タンパク質と共にインキュベートした。ＨＳＶ ＩＥ３プロ モーターの転写レベルを、処理後の異なる時点で回収したＢＨＫ細胞抽出物にお
けるルシフェラーゼ活性を測定することによって評価する。ＩＥ３−Ｌｕｃ形質
転換ＢＨＫの細胞核に転移された機能性ｈＡｎｔｐ−Ｏｃｔ−２．４、ｈＡｎｔ
ｐ−ΔＯｃｔ−２．４キメラタンパク質は、ＨＳＶ ＩＥ３プロモーターのベー スライン活性を顕著にダウンレギュレートする。

【０１１０】 提案した実験の関連性は、ＨＳＶの溶菌サイクルを潜在的に干渉し得る送達機
構の開発を越えるものである。Ａｎｔｐのホメオドメインは、生物学的および医
学的に非常に価値の高い機能性タンパク質の範囲で細胞表面膜を通過して移入す
る能力を有する。

【０１１１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａから得ることが出来るアンテナペディアホメオドメイン
の構造および配列を示す。

【図２】 作成したｐＡｎｔｐ ５０ＨおよびＡｎｔｐ ４０Ｐ２をさらに示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月２日（２０００．３．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA07 CA10 CA12 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA11 4B064 CA02 CA10 CA19 CC24 CE12 DA01 4B065 AA26X AA90X AA93X AB01 BA02 CA24 CA44 4C076 AA95 CC27 CC31 CC35 CC41 CC50 4H045 AA10 BA41 CA50 EA20 FA72 FA74 GA26

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）アンテナペディアのホメオドメインまたはその変異体
   を含む第１の領域と、（ｂ）第１の領域と自然には結合しない第２の領域とを含
   み、ここで、少なくとも第１の領域が非変性である、コンジュゲート。
2. 【請求項２】 第１および第２の領域がジスルフィド結合を介して結合して
   いる、請求項１記載のコンジュゲート。
3. 【請求項３】 第２の領域がＮＯＩを含む、請求項１または２記載のコンジ
   ュゲート。
4. 【請求項４】 融合タンパク質の形態にある、請求項１記載のコンジュゲー
   ト。
5. 【請求項５】 第２の領域が機能的または調節タンパク質である、請求項４
   記載のコンジュゲート。
6. 【請求項６】 第２の領域が抗原である、請求項４記載のコンジュゲート。
7. 【請求項７】 第２の領域がＤＮＡ結合ドメインである、請求項４記載のコ
   ンジュゲート。
8. 【請求項８】 第２の領域がＮＯＩをさらに含む、請求項７記載のコンジュ
   ゲート。
9. 【請求項９】 （ａ）アンテナペディアのホメオドメインまたはその変異体
   を含む第１の領域と、（ｂ）少なくとも１００アミノ酸のタンパク質を含む、第
   １の領域と自然に結合しない第２の領域とを含む、融合タンパク質の形態のコン
   ジュゲート。
10. 【請求項１０】 前記請求項のいずれか１項に記載のコンジュゲートをコー
    ドする核酸。
11. 【請求項１１】 プロモーターに作動可能に連結されている請求項１０記載
    の核酸を含む発現ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細
    胞。
13. 【請求項１３】 （ｉ）宿主細胞内で発現ベクター由来のコンジュゲートの
    発現を提供する条件下で、請求項１２記載の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ
    ）アミノ酸テイルをコンジュゲートのＣ末端に融合する工程を包含し、該テイル
    が第２の基質ではなく第１の基質に結合可能であり、コンジュゲートが該テイル
    を介して第１の基質への結合を引き起こすことにより宿主細胞の成分が第１の基
    質に結合せず、そしてコンジュゲートが第２の基質に接触することによりコンジ
    ュゲートが結合せず、宿主細胞の残りの成分が第２の基質結合する、コンジュゲ
    ートを回収する工程とを含む、コンジュゲートの調製法。
14. 【請求項１４】 （ｉ）宿主内で発現ベクター由来のコンジュゲートの発現
    を提供する条件下で、プロモーターに作動可能に連結され、（ａ）アンテナペデ
    ィアのホメオドメインまたはその変異体を含む第１の領域と、（ｂ）第１の領域
    と自然には結合しない第２の領域とをコードする核酸を含む発現ベクターで形質
    転換された宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）アミノ酸テイルをコンジュゲー
    トのＣ末端に融合させる工程を包含し、該テイルが第２の基質ではなく第１の基
    質と結合し得るが第２の基質と結合し得ず、コンジュゲートが該テイルを介して
    第１の基質との結合を引き起こすことによって宿主細胞の成分が第１の基質に結
    合せず、そしてコンジュゲートが第２の基質に接触することによってコンジュゲ
    ートが結合せず、宿主細胞の残りの成分が第２の基質に結合する、コンジュゲー
    トを回収する工程とを含む、コンジュゲートの調製法。
15. 【請求項１５】 請求項１３または請求項１４に記載の方法によって調製さ
    れたコンジュゲート。
16. 【請求項１６】 薬学的に受容できるキャリアを組み合わせた、請求項１か
    ら９のいずれか１項または請求項１５に記載のコンジュゲートを含む、薬学的組
    成物。
17. 【請求項１７】 ワクチンの形態にある、請求項１６記載の薬学的組成物。
18. 【請求項１８】 癌、遺伝病、および細菌またはウイルス感染の治療または
    予防のための薬剤の調製における、請求項１から９のいずれか１項または請求項
    １５に記載のコンジュゲートの使用。
19. 【請求項１９】 発現機構における使用のための、請求項１から９のいずれ
    か１項または請求項１５に記載のコンジュゲート。