JP2003534821A - T細胞レセプター融合体および結合体ならびにそれらの使用方法 - Google Patents
T細胞レセプター融合体および結合体ならびにそれらの使用方法Info
- Publication number
- JP2003534821A JP2003534821A JP2002501484A JP2002501484A JP2003534821A JP 2003534821 A JP2003534821 A JP 2003534821A JP 2002501484 A JP2002501484 A JP 2002501484A JP 2002501484 A JP2002501484 A JP 2002501484A JP 2003534821 A JP2003534821 A JP 2003534821A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell receptor
- biologically active
- soluble
- complex
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
Description
レセプター融合複合体および可溶性T細胞レセプター結合複合体に、そしてこの
ような分子を作製および使用するための方法に関する。提供される分子は、多様
な治療学的適用および診断の目的のために有用である。
を含む)の疾患のような疾患の治療に対する伝統的なアプローチは、外科手術、
放射線化学療法、抗体、またはそれらを組み合わせた治療を含んでいる。しかし
、このような治療は多数のこれらの徴候に対して有効であることが証明されてい
なかった。ヒト疾患の予防および/または治療するための代替の治療法の開発が
重大である。近年において、抗体およびTリンパ球を利用する免疫治療および遺
伝子治療アプローチが、ヒト疾患を治療するための新規で有望な方法として頭角
を現してきた。
たは診断的薬剤を標的化するための抗体の使用を包含している。多くのグループ
が、標的化薬剤としての抗体の使用を巡る開発をしている。このような開発は、
種々のエフェクター分子(放射性分子、化学療法剤、トキシン、およびさらなる
生体活性タンパク質)に抗体を連結する、抗体融合タンパク質および抗体結合分
子の構築を包含している。このような分子を使用して開発された治療または診断
は、連結された抗体によって標的される特定の効果を引き起こすように設計され
る。
クター、T細胞レセプター(TCR)は、治療を開発するための基盤として独特
の利点を有する。抗体は、血液および細胞外空間における病原体の、または細胞
表面上のタンパク質標的に対する認識に制限されるが、T細胞レセプターは、細
胞表面上のMHC分子で提示される抗原(細胞内タンパク質に由来する抗原を含
む)を認識し得る。提示される抗原を認識しおよび活性化になるT細胞のサブタ
イプに依存して、T細胞レセプターおよびT細胞レセプターを保有するT細胞は
、種々の免疫応答を制御することに関与し得る。例えば、T細胞は、抗体産生細
胞へのB細胞の分化を介して体液性免疫応答の調節に関与する。さらに、活性化
T細胞は、細胞媒介性免疫応答を開始するように作用する。従って、T細胞レセ
プターは抗体に利用可能でないさらなる標的を認識し得る。
る。TCRの1つのタイプは、免疫グロブリン可変(V)および定常(C)領域
と類似するαおよびβ鎖からなる膜結合性ヘテロ2量体である。TCRα鎖は共
有結合されたV−αおよびC−α鎖を含み、一方β鎖はC−β鎖に共有結合的に
連結されたV−β鎖を含む。V−αおよびV−β鎖は、超抗原または主要組織適
合複合体(MHC)(ヒトにおいてHLA複合体として知られる)の情況におい
て抗原を結合し得るポケットまたは間隙を形成する。概して、Davis An
n.Rev.of Immunology 3:537(1985) Fund
amental Immunology 第3版、W.Paul編、Rsen
Press LTD.New York(1993)を参照のこと。
例えば、TCRは細胞殺傷を媒介し、β細胞増殖を促進し、そしてガン、アレル
ギー、ウイルス感染および自己免疫異常を含む種々の疾患の進行および深刻度に
影響を与えることが報告されている。
び診断の設定のために、このような薬剤を生成および使用するための方法を提供
することは望ましい。抗体標的化に基づく先行技術の複合体に比較して利点を有
するような分子を提供することは特に望ましい。
れたTCR複合体を作製した。これらの改変されたTCRは、局在化された毒性
因子を、疾患のプロセスにおいて介入すべく、特定の部位に導き、標的化し、指
向するために用いられる。例えば、TCRは、MHC分子によって提示されるガ
ン関連性タンパク質に由来するペプチドを特異的に認識し、生物学的に活性な分
子に融合または結合され得、それによって、所望の治療学的結果を達成するため
に、この分子をガン細胞に導く。
変され得る。本発明は、このような結合を達成する為の方法として遺伝子融合お
よび化学的結合の用法を教示する。生物学的に活性な分子が付着できるTCRは
、ネイティブなTCRヘテロ2量体またはその可溶性のバージョン、詳細には可
溶性の、1本鎖TCRである。生物学的に活性な分子は、サイトカイン、ケモカ
イン、増殖因子、タンパク質、または非タンパク質トキシン、免疫グロブリンド
メイン、細胞傷害性因子、化学治療剤、放射性材料、検出可能な標識などを含む
がこれらに制限されない多様な生体活性エフェクター分子であり得る。
れたエフェクターまたはタグを含む。例えば、ある場合において、タグは融合タ
ンパク質に典型的に付随する天然に存在する細胞成分からTCRタンパク質融合
複合体を精製するのを補助するために用いられる。他の場合において、タンパク
質タグは、予め決定された化学的切断部位またはタンパク質分解性解裂部位を可
溶性タンパク質に導入するために用いられる。詳細には、意図されるのは、タグ
を、例えば、融合タンパク質およびエフェクター分子鎖または適切なフラグメン
トをコードする配列間で、コードするセグメントのDNAベクターへの導入であ
り、それによってTCR分子は、所望される場合エフェクター鎖またはフラグメ
ントから解裂(すなわち、分離)される。
細胞レセプターである。
はIgA、またはそれらのフラグメント(例えば、Fab、Fab’、 F(a
b’)2)のような免疫グロブリンに共有結合的に連結される。適切なTCR融
合複合体は、免疫グロブリンの定常領域に連結される。
ようなサイトカインに共有結合的に連結される。
−1βのようなケモカインに共有結合的に連結される。
CSFのような増殖因子に共有結合的に連結される。
うなタンパク質または非タンパク質トキシンに共有結合的に連結される。
キソルビシンのような細胞傷害性因子に共有結合的に連結される。
ような放射性材料に共有結合的に連結される。
放射性、または電子伝達因子のような検出可能な標識に共有結合的に連結される
。
学的研究に適切な検出可能に標識される原子もしくは化合物であるエフェクター
を含む可溶性TCR融合タンパク質およびTCR結合複合体である。TCR融合
複合体およびTCR結合複合体は、インビボでの細胞または組織の検出および/
または画像化、ならびにインビトロまたはインビボで細胞を傷害または殺傷する
ような治療学的使用を含む、多様な適用において用いられる。一般に、標的化さ
れる細胞または組織は、TCRを選択的に結合し得る1つ以上のリガンドを含む
。例示的な細胞としては、黒色腫のような腫瘍細胞およびウイルス感染された細
胞(例えば、それぞれサイトメガロウイルスまたはAIDSウイルスのような霊
長類DNAまたはRNAウイルスで感染された細胞)を包含する。
胞レセプター(TCR)の使用に基づく抗原特異的治療薬を開発した。TCRベ
ースの試薬は抗体分子よりもいくつかの利点を有する。第1に、抗体ベースの治
療はしばしば、腫瘍抗原の分断に起因して予測されるよりも低い腫瘍細胞殺傷効
果を伴う。MHC分断の報告があるが、特異的MHC/腫瘍ペプチドの循環レベ
ルは遊離に循環する腫瘍抗原よりも非常に低い。第2に、抗体分子は、これらは
細胞の表面上に曝露されず、抗体分子に接近可能でないので、多くの潜在的な腫
瘍抗原を認識できない。多くの潜在的な腫瘍特異的タンパク質は細胞内であるが
、通常は細胞内でペプチドにプロセスされて、これは次いで腫瘍細胞の表面にM
HCクラスIまたはMHCクラスII分子のいずれかで提示される。TCRとは
異なり、抗体は通常は、MHC分子の結合間隙を占有するこれらのプロセスされ
た抗原を認識しない。第3に、抗体によって認識される抗原の多くは、生来異種
遺伝子性であり、これは抗体の有効性を単一の腫瘍組織学に制限する。対照的に
、多くのT細胞エピトープは、いくつかの異なる組織から起源する広範な範囲の
腫瘍に共通である。
そして生物学的に活性なペプチドまたは分子に共有結合的に連結されるTCR分
子を含有する、このような複合体をコードする発現ベクター、そしてこのような
融合および結合複合体、ならびに発現ベクターおよび結合複合体の産生および使
用のための方法を作製した。
表面上に提示される抗体を認識する。TCRはジスルフィド結合されたヘテロ2
量体であり、大部分αおよびβ鎖糖タンパク質からなる。T細胞は、B細胞で機
能している抗体多様性を生み出すメカニズムに類似した方法で、T細胞もそのレ
セプター分子において多様性を生み出している(JanewayおよびTrav
ers;Immunobiology 1997)。免疫グロブリン遺伝子に類
似してTCR遺伝子はT細胞の発達の間に再配置するセグメントから構成される
。TCRポリペプチドはアミノ末端可変領域およびカルボキシ末端定常領域から
なる。カルボキシ末端領域は、膜貫通アンカーとして作用し、そしてレセプター
が占有されている場合細胞内シグナル伝達に関与し、可変領域は抗原の認識を担
う。TCRα鎖は、VおよびDセグメントのみによってコードされる可変領域を
含むが、β鎖は更なる結合(J)セグメントを含む。これらのセグメントの再配
置、ならびに可変領域の変異および成熟によって、それぞれのTCR分子の状況
に於いて提示される途方もなく多数の異なる抗原を認識し得るという、TCRの
多様なレパートリーを生じる。
るための技術が、以前に開発された。例えば、係属中の米国特許出願第08/8
13,781号、および米国特許出願第09/422,375号、本明細書中に
参考として援用される;ならびに国際特許出願PCT/US98/04274お
よびPCT/US99/24645、およびそこにおいて考察される参考文献は
、特異的TCRを調製するおよび使用する方法を開示する。さらに、特定の特異
的TCRが、可溶性の、1本鎖TCR(scTCR)として、組換え法によって
生成された。scTCRの生成および使用の方法が、係属中の米国特許出願第0
8/943,086号、および国際特許出願PCT/US98/20263にお
いて開示され、記載され、これらは本明細書中に参考として援用される。このよ
うなTCRおよびscTCRは、得られるTCRおよびscTCRを治療薬とし
て有用にするために融合物または結合体を作製するように変化され得る。本発明
のTCR複合体は、TCR融合複合体を生成するために組換え的に生成されたT
CRまたはscTCRコード領域を、生物学的に活性なタンパク質をコードする
遺伝子に遺伝子融合することによって作製され得る。あるいは、TCRまたはs
cTCRはまた、TCR結合体タンパク質を生成するために生物学的に活性な分
子と化学的に結合され得る。
子およびエフェクター分子の、通常組換え的、化学的、または他の適切な方法に
よって共有結合的に連結(すなわち融合される)タンパク質またはペプチド配列
が意味される。所望される場合、融合分子は、ペプチドリンカーを介して1つま
たはいくつかの部位で融合され得る。あるいは、ペプチドリンカーは、融合分子
の構築において補助するために用いられる。具体的に好ましい融合分子は、融合
タンパク質である。
のアミノ酸から本質的になるポリマーをいう。用語「タンパク質」はしばしば、
比較的大きなタンパク質に関して使用され、「ペプチド」は小さなポリペプチド
に関して使用されるが、当該分野におけるこれらの用語の使用はしばしば重複す
る。用語「ポリペプチド」は概して、他で注記されない限りタンパク質、ポリペ
プチド、およびペプチドをいう。概して本発明に有用なペプチドは、遠心分離ま
たはSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的な分子サイズ分析技
術によって判断されるように、約0.1〜100KDまたはより大きな約100
0KDの間の、好ましくは約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20
、30、50KDとの間である。
びエフェクター分子においては、通常化学的なまたは他の適切な方法によって共
有結合的に連結される(すなわち、融合される)化学的なまたは合成された分子
が意味される。所望される場合、結合分子は、1つまたはいくつかの部位にて、
ペプチドリンカー配列またはキャリア分子を介して融合され得る。あるいは、ペ
プチドリンカーまたはキャリアは、結合体分子の構築において補助するために用
いられる。具体的に好ましい結合分子は結合トキシンまたは検出可能な標識であ
る。
的に連結される生物学的に活性な分子またはエフェクター分子(本明細書中で交
換可能に使用される用語)を含有する。本明細書中で使用されるように、用語「
生物学的に活性な分子」または「エフェクター分子」は、タンパク質、ポリペプ
チド、またはペプチドのようなアミノ酸配列;糖または多糖;脂質または糖脂質
、糖タンパク質、リポタンパク質、または本明細書中で考察されるような所望さ
れる効果を生成し得る化学薬剤が意味される。また意図されるのは、生物学的に
活性なまたはエフェクタータンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコード
するエフェクター分子核酸である。従って、適切な分子は、調節因子、酵素、抗
体、または薬物、およびDNA、RNA、およびオリゴヌクレオチドを包含する
。生物学的に活性なまたはエフェクター分子は、天然に存在し得るか、または公
知の成分から、例えば、組換えまたは化学合成によって合成され得、および異種
成分を包含し得る。生物学的に活性なまたはエフェクター分子は一般に、約0.
1〜100KDまたはより大きな約1000KDまでの間、好ましくは、遠心分
離またはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的な分子サイズ
分け技術によって判断されるように、0.1、0.2、0.5、1、2、5、1
0、20、30、および50KDの間である。本発明の所望される効果は例えば
、細胞増殖または細胞死を誘導すること、免疫応答を開始すること、または以下
に開示されるアッセイによって決定されるように診断目的のための検出分子とし
て作用することのいずれかであり、アッセイは、細胞を細胞が増殖するように培
養し、そして細胞と本発明のTCR融合複合体とを接触し、および次いでTCR
融合複合体が細胞の発達をさらに阻害するか否かを評価する連続的な工程を包含
する。
子は、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質トキシン、免疫グロブ
リンドメイン、または酵素のような他の生体活性タンパク質を包含する。また含
まれるのは、非タンパク質トキシン、細胞傷害剤、化学治療剤、検出可能な標識
、放射性材料などである。
の複数の効果を担う細胞によって生成される任意の因子によって規定される。サ
イトカインの例としては、IL2、IL10、IL−4、IL−12、およびI
NF−γが挙げられるがこれらに制限されない。
、細胞性免疫の任意の多くの複数の効果を担う任意の化学因子または分子として
規定される。適切なケモカインは、MIP−1β、IL−8、MCP−1、およ
びRantesが挙げられるがこれらに制限されない。
または分化を誘導する任意の分子を包含する。増殖因子は、タンパク質および化
学分子を包含し、そのいくつかは:ヒト増殖因子および幹細胞増殖因子を包含す
る。さらなる増殖因子はまた、本明細書中に記載される用途のために適切である
。
対する阻害効果を有する任意の物質を包含する。より詳細には、エフェクター分
子は、例えば、ジフテリアトキシン(DT)、シガトキシン、アルビン、コレラ
トキシン、リシン、サポリン、シュードモナスエキソトキシン(PE)、ブタク
サ抗ウイルスタンパク質、またはゲロニンのような植物または細菌起源の細胞ト
キシンであり得る。このようなトキシンの生物学的に活性なフラグメントは当該
分野において周知であり、および例えば、DT A鎖およびリシンA鎖を包含す
る。さらに、トキシンは、例えば、ホスホリパーゼ酵素(例えば、ホスホリパー
ゼC)のような細胞表面で活性な薬剤であり得る。
スチン、メトトレキセート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、またはシスプ
ラチンのような化学治療の薬物であり得る。
ローム、またはテキサスレッドのような蛍光標識;または放射性核種、例えば、
ヨウ素−131、イットリウム−90、レニウム−188、またはビスマス−2
12のような診断または画像化研究のために適切な検出可能に標識された分子で
あり得る。エフェクターおよびタグを含むタンパク質を作製および使用すること
に関する開示について、例えば、Moskaugら、J.Biol.Chem.
264、15709(1989);Pastan、I.ら、Cell 47、6
41、1986:Pantanら、新規な治療剤としての組換えトキシン、An
n.Rev. Biochem、61、331、(1992);「化学トキシン
」OlsnesおよびPhil、Pharmac.Ther.、25、355(
1982);公開されたPCT出願第WO94/29350号;公開されたPC
T出願第WO94/04689号;および米国特許第5,620,939号を参
照のこと。
は、いくつかの重要な用途を有する。例えば、TCR融合または結合複合体は、
TCRを特異的に結合し得るある細胞にエフェクター分子を送達するために用い
られ得る。従って、TCR融合または結合複合体は、リガンドを含む細胞を選択
的に障害または殺傷する手段を提供する。TCR融合または結合複合体によって
障害または殺傷され得る細胞または組織の例は、TCRによって特異的に結合さ
れ得る1つ以上のリガンドを発現する、腫瘍細胞およびウイルスまたは細菌で感
染された細胞を包含する。障害または殺傷されることに敏感な細胞または組織は
、本明細書中に開示される方法によって容易にアッセイされ得る。
る;実施例5において以下に開示される、図1において図示される264 DN
Aベクターで哺乳動物の細胞をトランスフェクトすることによって生成され得る
p264scTCRのようなscTCR。sc−TCR p264タンパク質融
合複合体は、ヒトHLA抗原;HLA−2.1の情況において提示される野生型
p53腫瘍抑制タンパク質からのプロセスされたペプチドフラグメントを認識す
る。sc−TCR p264およびそのペプチドリガンドは、Thebald、
M.J.ら、PNAS(USA)(1995)、92:11993において開示
されている。ペプチド配列はLLGRNSFEVである。腫瘍抑制タンパク質p
53の発現は、悪性細胞においてアップレギュレートされる。全ての腫瘍細胞の
50%が、表面上でp53の増加されたレベルを発現した(Holliston
、M.D.ら、Science(1991)、253:49)。それゆえ、この
エピトープについて特異的なscTCR分子は、トキシンで標識され、p53ペ
プチドフラグメントHLA−2.1リガンドを発現する悪性細胞に送達される。
この標的特異的免疫治療は、悪性細胞のみを殺傷することに効果的である。イン
ビトロでの細胞傷害性を測定するための方法は周知であり、以下に記載されるよ
うな従来の生存度アッセイを包含する。
重要な用途を有する。例えば、sc−TCR分子は、264ペプチドを発現する
ヒト乳ガン細胞を選択的に殺傷するために用いられる。トキシンで標識された2
64細胞が乳ガン細胞を殺傷する能力は、Eu3+放出細胞傷害性アッセイを用
いる非放射性細胞・細胞傷害性アッセイで評価されるインビトロ研究が行われた
。(Bouma、G.J.ら、(1992)Hum.Immunol.35:8
5)。融合されたエフェクター分子を含有するsc−TCR分子はインビボで容
易に試験できる。例えば、インビトロ研究は、乳ガン細胞を発現するp264/
HLA.A21をHLA/A2トランスジェニックマウスに移植することによっ
て行われ得る(Theobaldら(1995)前出)。トキシンで標識された
scTCR p264分子は、予め決定された投薬量でマウスに注射され、sc
−TCR分子の効力を調べるために腫瘍の大きさに対する効果が測定される。さ
らに、寿命の延長が、新規な抗腫瘍治療の効果を評価するための第2の基準とし
て用いられる。
グは生理学的pHで電荷を保有するポリペプチド、例えば6×HISである。こ
の例において、TCR融合または結合複合体は、約pH6〜9にて6×HISタ
グを特異的に結合し得るNi−セファロースのような市販の金属−セファロース
基質によって精製され得る。EEエピトープおよびmycエピトープは、適切な
タンパク質タグのさらなる例であり、これらのエピトープは1つ以上の市販のモ
ノクローナル抗体によって特異的に結合される。
本発明の多原子価のTCR融合または結合複合体を作製することが有用であり得
る。簡潔に述べると、多価TCRタンパク質は、例えば、標準的なビオチン/ス
トレプトアビジン標識化技術を使用することによって、またはラテックスビーズ
のような適切な固体支持体への結合によって、1〜4個のタンパク質(同じもの
かまたは異なる)を共に共有結合的に連結することによって作製される。化学的
に架橋される(例えば、デンドリマーに架橋される)タンパク質はまた適切な多
価種である。例えば、タンパク質は、CysまたはHisのような化学的に反応
性の側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列によって改変され得る。化学的
に反応性の側鎖を伴うこのようなアミノ酸は、融合タンパク質中の種々の位置に
、好ましくはTCRの抗原結合領域に対して遠位に、配置され得る。例えば、可
溶性融合タンパク質のc−β鎖フラグメントのC末端は、タンパク質精製タグま
たはこのような反応性アミノ酸を含む他の融合されるタンパク質に共有結合的に
連結され得る。適切な側鎖は、多価分子作製において適切なデンドリマー粒子に
2つ以上の融合タンパク質を化学的に連結するために必要である。デンドリマー
は、それらの表面の多くの異なる官能基の任意の1つを有する合成化学ポリマー
である(D.Tomalia、Aldrichmina Acta、26:91
:101(1993))。本発明に従う使用のために適切なデンドリマーは、例
えば、E9スターバーストポリアミンデンドリマーおよびE9コンバーストポリ
アミンデンドリマーを包含し、これらはシステイン残基を連結し得る。
死細胞株、組織または器官におけるようなこのような細胞の任意の群を包含する
。好ましくは細胞は、哺乳動物、特にヒト起源のものであり、ならびに1つ以上
の病原体によって感染され得る。本発明に従う「宿主細胞」は、感染された細胞
であり得るか、またはこれは本明細書中に記載される核酸を増殖するために用い
られるE.coliのような細胞であり得る。
多くの異なる利点を提供する。単一のエフェクター分子を含む本発明のTCR融
合複合体が、生成され得、公知の構造のこのようなペプチドを包含する。さらに
、広範に多様なエフェクター分子が、類似のDNAベクターにおいて生成され得
る。すなわち、異なるエフェクター分子のライブラリーが、感染されたまたは罹
患された細胞の提示のためにTCR分子に連結され得る。さらに、被験体へのT
CR分子の投与ではなく、治療的適用のために、エフェクターペプチドに連結さ
れたTCR分子をコードするDNA発現ベクターが、TCR融合複合体のインビ
ボ発現のために投与され得る。このようなアプローチは、組換えタンパク質の調
製に典型的に付随される高価な精製工程を回避し、ならびに従来のアプローチに
付随される抗原取込みおよびプロセシングの複雑性を回避する。
カイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質トキシン、免疫グロブリンドメイン
または他の生体活性な分子、および任意のペプチドリンカーのような生物学的に
活性な産物は、ほとんど任意の様式において組織化され得るが、但し、融合タン
パク質はこれが意図される機能を有する。特に、融合タンパク質の各成分は、所
望により、別の成分から少なくとも1つ分の適当なペプチドリンカー配列間隔を
おいて配置される。さらに、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の同定
および/または精製を容易にするためにタグを含み得る。より特定の融合タンパ
ク質は以下の実施例にある。
チドとの間に挿入される柔軟なリンカー配列を包含する。リンカー配列は、TC
R分子結合溝に生物学的に活性なペプチドが効果的に配されるようにすべきで、
それによってT細胞レセプターは、提示されるMHCペプチド複合体を認識し、
所望の部位に生物学的に活性な分子を送達することができる。エフェクター分子
の首尾よい提示は、T細胞を細胞が増殖するように培養し、そしてT細胞と本発
明のTCR融合複合体とを接触し、および次いでTCR融合複合体がさらなる細
胞の発達を阻害するか否かを評価する連続的な工程を包含するインビトロアッセ
イを含む以下に開示されるアッセイによって決定されるように、T細胞増殖を誘
導もしくは阻害するための、または特定の部位に免疫応答を開始または阻害する
かのいずれかの細胞の活性を調節し得る。
(PCR)、プラスミドDNA調整、制限酵素でのDNAの解裂、オリゴヌクレ
オチドの調製、DNAのライゲーション、mRNAの単離、適切な細胞へのDN
Aの導入、宿主の形質転換または増殖、宿主の培養を含む、認識される組換えD
NA技術によって達成され得る。さらに、融合分子は、カオトロピック剤、なら
びに周知の電気泳動、遠心分離、およびクロマトグラフィー法を使用して単離し
精製され得る。これらの方法に関して開示されている、Sambrookら、M
olecular Cloning:A Laboratory Manual
(第2版(1989);およびAusubelら、Current Proto
cols in Molecular Biology、John Wiley
& Sons、New York(1989)を参照のこと。
るDNA配列を提供する。好ましくは、DNA配列は、ファージ、ウイルス、プ
ラスミド、ファージミド、コスミド、YAC、またはエピソームのような染色体
外複製に適するベクターによって保有される。特に、所望される融合タンパク質
をコードするDNAベクターは、本明細書中に記載される調製法を容易にするた
めに、また融合タンパく質の有意な量を得るために用いられる。DNA配列は、
適切な発現ベクター、すなわち、挿入されるタンパク質コード配列の転写および
翻訳について必要なエレメントを含むベクター中に挿入され得る。多様な宿主−
ベクター系が、タンパク質コード配列を発現するために利用される。これらとし
てはウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)で感染され
た哺乳動物細胞系;ウイルスで(例えば、バキュロウイルス)で感染された昆虫
細胞系;酵母ベクターを含む酵母、またはバクテリオファージDNA、プラスミ
ドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換された細菌等の微生物を包含する
。利用される宿主−ベクター系に応じて、多くの適切な転写および翻訳エレメン
トの任意の1つが用いられる。概要は前出、Sambrookら、およびAus
ubelら、を参照のこと。
、エフェクター分子をコードする配列に作動可能に連結されたTCR鎖をコード
する第1のヌクレオチド配列の導入のための第1のクローニング部位を含む、ホ
スホジエステル結合によって連結されるヌクレオチド配列を含む。
分は、「カセット」形式で提供されることが好ましい。用語「カセット」は、標
準的な組換え法によって、各成分が別の成分と容易に置換されることを意味する
。DNAベクターがコードする融合複合体が、抗原型を発生させる能力があるか
または発生させることができる病原体に対して使用される場合に、DNAベクタ
ーがカセットに組み込まれている形態が特に望ましい。
ドする配列は、適切なリガーゼの使用によってエフェクターペプチドをコードす
る配列に連結される。示されるペプチドについてのコード配列は、適切な細胞株
のような天然の供給源からDNAを単離することによって、または公知の合成法
、例えば、リン酸トリエステル法によって得ることができる。例えば、Olig
onucleotide Synthesis、IRL Press(M.J.
Gait編、1984)を参照のこと。合成オリゴヌクレオチドはまた、市販の
自動化オリゴヌクレオチド合成器を使用して調製される。一旦単離されると、T
CR分子をコードする遺伝子が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または当該
分野において公知の他の手段によって増幅され得る。TCRペプチド遺伝子を増
幅するために適切なPCRプライマーは、PCR産物に制限部位を付加する。P
CR産物は好ましくは、エフェクターペプチドについてのスプライス部位、およ
びTCR−エフェクター融合複合体の適切な発現および分泌に必要なリーダー配
列を含む。PCR産物はまた好ましくは、リンカー配列、このような配列のライ
ゲーションのための制限酵素部位をコードする配列を含む。
技術によって生成される。例えば、一旦TCRタンパク質をコードするDNA分
子が単離されると、配列は、エフェクターポリペプチドをコードする別のDNA
分子にライゲーションされ得る。TCR分子をコードするヌクレオチド配列は、
エフェクターペプチドをコードするDNA配列、またはより典型的には、TCR
分子をコードする配列と、エフェクターペプチドをコードする配列との間に挿入
され得る本明細書中に考察されるようなリンカー配列をコードするDNA配列に
直接的に結合され得、および適切なリガーゼを使用して結合される。得られるハ
イブリッドDNA分子は、TCR融合複合体を生成するために適切な宿主細胞中
で発現され得る。DNA分子は、ライゲーションの後に、コードされるポリペプ
チドの転写フレームが変化されない(すなわち、DNA分子は互いにインフレー
ムに連結される)ように、5’から3’の方向に互いに連結される。得られるD
NA分子は、インフレームな融合タンパク質をコードする。
ロモーター配列は、エフェクターペプチドに融合されたTCRペプチドをコード
する配列の発現を制御し、またはリーダー配列は、細胞表面もしくは培養培地に
TCR融合複合体を指向し、構築物中に含まれ得るか、または構築物が挿入され
る発現ベクターに存在し得る。免疫グロブリンまたはCMVプロモーターは特に
好ましい。
ど任意の順で組織化され得る。例えば、1つの実施態様において、TCRは、エ
フェクター分子のCまたはN末端に配置される。
なっているのが好ましい。本発明のエフェクター分子は、周知の化学架橋方法を
含む多様な方法によって作製されTCRに融合される。例えば、Means、G
.E.およびFeeney、R.E.(1974)タンパク質の化学修飾、Ho
lden−Dayを参照のこと。また、S.S.Wong(1991)タンパク
質結合および架橋の化学、CRC Pressを参照のこと。しかし、インフレ
ームな融合タンパク質を作製するために組換え操作を使用することが一般に好ま
しい。
によって組織化され得る。例示的な構築において、TCRのC末端が、エフェク
ター分子のN末端に作動可能に連結される。連結は、所望される場合、組換え法
によって達成され得る。しかし、別の構築においては、TCRのN末端が、エフ
ェクター分子のC末端に連結され得る。
じてTCR融合または結合複合体に挿入され得る。
連結される(NからC末端):1)TCR/1つ以上のリンカー分子/および生
物学的に活性な分子;2)TCR/リンカー分子/および生物学的に活性な分子
;ならびに3)TCR/第1のリンカー分子/第1の生物学的に活性な分子のサ
ブユニット/第2のリンカー分子/および第2の生物学的に活性な分子のサブユ
ニット。さらに、EE、HA、Myc、およびポリヒスチジン、特に6×HIS
のような1つ以上のタンパク質タグは、所望されるように、例えば、溶解度を改
善するためにまたはTCR融合および結合複合体の単離および同定を容易にする
ために、TCR鎖のN末端に融合され得る。
溝を効果的に配置し得るペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本明細
書中で使用されるように、句「TCR分子を連結する生物学的に活性なペプチド
は効果的に配置される」、または他の類似の句は、TCRタンパク質に連結され
る生物学的に活性なペプチドが、生物学的に活性なペプチドが、細胞増殖を誘導
するために、免疫反応を開始または阻害するために、または以下に開示されるア
ッセイによって決定されるように細胞発達を阻害または不活性化するためのいず
れかで、エフェクター分子と相互作用でき、提示する細胞の活性を調節すること
ができるように配置されることを意図的に意味するもので、アッセイは、細胞を
細胞が増殖するように培養し、そして細胞と本発明のTCR融合複合体とを接触
し、および次いでTCR融合タンパク質が細胞の発達をさらに阻害するか否かを
評価する連続的な工程を包含する。
16個のアミノ酸を含む。リンカー配列は好ましくは、単一の所望されない配座
において生物学的に活性なペプチドを保持しないように柔軟である。リンカー配
列は、例えば、融合された分子から認識部位を間隔を空けて配置するために用い
られる。具体的には、ペプチドリンカー配列は、TCR鎖とエフェクターペプチ
ドとの間に、例えば、これを化学的に架橋するために、および分子柔軟性を提供
するために配置され得る。リンカーは好ましくは優先的に、柔軟性を提供するた
めに、グリシン、アラニン、およびセリンのような、小さな側鎖のアミノ酸を含
む。好ましくは約80または90パーセントまたはそれ以上のリンカー配列は、
グリシン、アラニン、またはセリン残基、特にグリシンおよびセリン残基を含む
。ヘテロ2量体TCRを含むTCR融合複合体について、リンカー配列はTCR
分子のβ鎖に適切に連結されるが、リンカー配列はまた、TCR分子のα鎖に付
着され得る。あるいは、リンカー配列はまた、TCR分子のαおよびβ鎖に連結
され得る。TCR β鎖分子にエフェクター分子ペプチドを共有結合的に連結す
るために、リンカーのアミノ酸配列は、TCR β鎖のN末端残基からエフェク
ター分子ペプチドのC末端残基までの適切な距離をわたり得るべきである。この
ようなβ+ペプチド鎖がα鎖と共に発現される場合、図1において一般に描写さ
れるように、連結されたTCR−エフェクターペプチドは折り畳まれ、機能的な
TCR分子になる。1つの適切なリンカー配列は、ASGGGGSGGG(すな
わち、Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly G
ly Gly)であり、好ましくはTCRのβドメインの第1のアミノ酸に連結
される。異なるリンカー配列が使用され得、抗体可変領域をともに結合するため
に首尾よく使用されている任意の多くの柔軟性のリンカー設計を含む。Whit
low、M.ら、(1991)Methods:A Companion to
Methods in Enzymology2:97−105を参照のこと
。適切なリンカー配列は、経験的に容易に同定され得る。さらに、リンカー配列
の適切な大きさおよび配列はまた、TCR分子の予測される大きさおよび形状に
基づく従来のコンピューターモデリング技術によって決定され得る。
、上記のTCR遺伝子融合構築物は、ベクターに制限酵素で解裂を作り該構築物
を挿入するといった公知の手段によって適切なベクターに導入されライゲーショ
ンされる。次いで遺伝子構築物を含むベクターは、TCR融合ペプチドの発現の
ために適切な宿主に導入される。概要は前出、Sambrookらを参照のこと
。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関する因子に基づいて経
験的に作製され得る。例えば、ベクターは、用いられる宿主と適合性であり、お
よび宿主について正確な複製を有する。さらにベクターは、発現されるTCR融
合複合体をコードするDNA配列を備えていなければならない。適切な宿主細胞
は、真核生物および原核生物細胞、好ましくは容易に形質転換され得、および増
殖培地中で迅速な増殖を示し得るこれらの細胞を包含する。具体的に好ましい宿
主細胞は、E.coli、Bacillus subtillusなどのような
原核生物、および動物細胞および酵母株、例えばS.cerevisiaeのよ
うな真核生物である。哺乳動物細胞はまた一般に好ましく、特にJ558、NS
O、SP2−O、またはCHOが好ましい、他の適切な宿主は、例えば、Sf9
のような昆虫細胞を包含する。従来の培養条件が使用される。Sambrook
、前出を参照のこと。次いで、適切な形質転換されたまたはトランスフフェクト
された細胞株が選択される。本発明のTCR融合複合体を発現する細胞は、公知
の手順によって決定され得る。例えば、免疫グロブリンに連結されるTCR融合
複合体の発現は、連結された免疫グロブリンに特異的なELISAによって、お
よび/または免疫ブロッティングによって決定され得る。
を増殖するための調製目的のために用いられる。従って、宿主細胞は、融合タン
パク質の産生が特異的に意図される原核生物または真核生物細胞を包含し得る。
従って、宿主細胞は具体的には、融合物をコードする核酸を増殖し得る酵母、ハ
エ、ケムシ、植物、カエル、哺乳動物の細胞および器官を包含する。用いられる
哺乳動物細胞株の制限されない例は、CHOdhfr細胞(Urlaubおよび
Chasm、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:4216
(1980))、293細胞(Grahamら、J.Gen.Virol.、3
6:59(1977))、または黒色腫細胞様SP2もしくはNSOを包含する
(Galfre及びMilstein、Meth.Enzymol.、73(B
):3(1981))。
動物真核生物細胞をまた包含し、昆虫(例えば、Sp.fungiperda)
、酵母(例えば、S.cerevisiae、S.ponbe、P.pasto
ris、K.lactis、H.polymorpha;概して、Fleer、
R.、Current Opinion in Biotechnology、
3(5):486496(1992)によって概説される)、真菌、および植物
細胞を含む。また意図されるのは、E.coliおよびBacillusのよう
なある原核生物である。
ための標準的な技術によって宿主細胞に導入され得る。用語「トランスフェクト
する」または「トランスフェクション」は、核酸を宿主細胞に導入するための全
ての従来の技術を包含することが意図され、カルシウムリン酸共沈降、DEAE
−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポ
レーション、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入、および/または取
込を包含する。宿主細胞をトランスフェクトするための適切な方法は、Samb
rookら、前出および他の実験室教科書において見出され得る。
する。プロセスにおいて、宿主細胞(例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌、または
動物の細胞)は、調節配列に作動可能に連結される目的のタンパク質をコードす
る核酸が導入され、目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写
を刺激するための融合タンパク質の存在下で培養培地中で生成規模にて増殖され
る。続いて、目的の融合タンパク質は採集された宿主細胞から、または培養培地
から単離される。標準的なタンパク質精製技術が、培地からまたは採集された細
胞から目的のタンパク質を単離するために用いられる。特に、精製技術は、ロー
ラーボトル、スピナフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター、または発
酵器を含む多様な実施から大規模に(少なくともミリグラムの量において)所望
される融合タンパク質を発現および精製するために用いられる。
。典型的に培養培地は、遠心分離され、次いで上清は、親和性または免疫親和性
クロマトグラフィー、例えば、連結されるTCRまたはその免疫グロブリン領域
のような発現される融合複合体を結合するモノクローナル抗体の使用を含むプロ
テインAまたはプロテインG親和性クロマトグラフィーまたは免疫親和性クロマ
トグラフィープロトコルによって精製される。本発明の融合タンパク質は、公知
の技術の適切な組み合わせによって分離および精製される。これらの方法は、例
えば、塩沈降および溶媒沈降のような溶解度を使用する方法、透析、限外濾過、
ゲル濾過、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量にお
ける差異を使用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷に
おける差異を利用する方法、親和性クロマトグラフィーのような特異的な親和性
を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性における差異
を利用する方法、および等電点電気泳動のような等電点における差異を利用する
方法、Ni−NTAのような金属親和性カラムを包含する。これらの方法に関す
る開示について、概して、Sambrookら、前出およびAusubelら、
前出を参照のこと。
合タンパク質は、融合タンパク質が少なくとも80%または90%〜95%の均
一性(w/w)において好ましくは存在するように、これに天然に付随する細胞
基質から単離されている。少なくとも98〜99%の均一性を有する融合タンパ
ク質が、多くの薬学的な、臨床的な、および研究的な適用について最も好ましい
。一旦実質的に精製されると、融合タンパク質は治療学的適用についての混入物
が実質的にあってはならない。一旦、部分的にまたは実質的な純度に精製される
と、可溶性融合タンパク質は、治療学的に、または本明細書中に記載されるよう
なインビトロまたはインビボアッセイを行うにおいて、用いられる。実質的な純
度は、クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動のような多様な標準的な技術によ
って決定され得る。
地に分泌され得るように十分に短縮されるTCR分子を含む。従って、短縮され
たTCR融合複合体は、疎水性残基が豊富な領域、主としてTCR分子の膜貫通
および細胞質ドメインを含まない。従って、本発明の好ましい短縮されたDR1
TCR分子について、TCR分子のβ鎖の約199〜237残基およびα鎖の
約193〜230残基が、短縮されたTCR融合複合体中に含まれない。
完全にアンフォールドされる(すなわち、変性される)タンパク質が意味される
。融合タンパク質は、以下に考察されるような1つ以上のカオトロピック剤との
接触によって部分的にまたは完全に誤って折り畳まれる。より一般には、本明細
書中に開示される誤って折り畳まれた融合タンパク質は、対応するネイティブな
タンパク質の高いGibbs遊離エネルギー(ΔG)の形態の代表である。好ま
しいのは、通常正確に折り畳まれるネイティブな融合タンパク質であり、これは
水溶液中で十分に可溶性であり、およびこれは比較的低いΔGを有する。従って
、ネイティブな融合タンパク質はほとんどの例において安定性がある。
った折り畳みを検出することが可能である。例えば、誤った折り畳みは、ネイテ
ィブな(コントロール)の分子および誤った折り畳みの分子を使用する旋光性測
定を含む従来の生物理学的技術によって検出され得る。
ク質が、低い重力遠心分離(例えば、標準的な遠心分離における1分間あたり約
30,000未満の回転)のもとでは、水性緩衝液、例えば細胞培地から、容易
に沈降されないことが意味される。さらに、融合分子は、約5〜37℃以上の温
度にて、またアニオンまたは非イオン洗浄剤の低濃度での存在下または非存在下
、中性またはこれに近いpHで、水溶液中に残存する場合、可溶性である。これ
らの条件下、可溶性タンパク質はしばしば、低い沈降価、例えば、10〜50未
満のsvedberg単位を有する。
び約2mMと500mMとの間にイオン強度範囲を確立する緩衝化化合物を有す
る。時折、プロテアーゼインヒビターまたは穏やかな非イオン性洗浄剤が添加さ
れる。さらに、ウシ血清アルブミン(BSA)のようなキャリアタンパク質が、
所望される場合、数mg/mlに添加される。例示的な水性緩衝液は、標準的な
リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、または他の周知の緩衝液、
および細胞培地処方物を包含する。
、または感染され得る多様な細胞を用いる、インビトロまたはインビボでの使用
に適切である。
の病原体によって感染され、次いで感染された細胞は、インビトロで特定の融合
タンパク質と接触される。以前に考察されたように、融合タンパク質は、TCR
の会合によって、感染された細胞にトキシンドメインが提示されるように配置さ
れる。細胞に生体活性分子の導入を提供した後(一般的に約30分未満)、細胞
は約2〜24時間、通常約18時間までの間、その効力下に置かれ、その後適切
な緩衝液または細胞培地中で洗浄され、次いで生存度について評価される。融合
タンパク質による細胞殺傷または障害について割り当てられる時間は、選択され
る特定のエフェクター分子によって変わる。しかし生存度はしばしば、約2〜6
時間、長くとも約24時間後に評価される。以下により詳細に記載されるように
、細胞生存度は、周知の染料(例えば、トリパンブルー)または蛍光の取り込み
をモニターすることによって容易に測定され、および定量される。
度についてアッセイできる。1つのアプローチにおいて、細胞生存度は、形質導
入後またはその間に、DNA複製を測定することによって容易にアッセイされる
。例えば、好ましいアッセイは、放射線標識されたチミジンのような1つ以上の
検出可能に標識されたヌクレオシドの細胞取り込みを包含する。取り込みは、ト
リクロロ酢酸(TCA)沈降、続いてシンチレーションカウンティングを含むい
くつかの従来のアプローチによって簡便に測定され得る。他の細胞生存度法は、
周知のトリパンブルー排除技術を包含する。
ば、ヒト、マウス、または他のげっ歯類、または他の哺乳動物のTCR分子にア
ミノ酸配列において対応する。
T細胞レセプターアンタゴニストエフェクター分子を含むTCR複合体を包含す
る。好ましくは、「短縮された」可溶性TCR複合体が投与され、すなわちTC
R複合体は膜貫通部分を含まない。投与された可溶性TCR融合複合体のエフェ
クター分子としては、ある細胞に特異的であるか、所望される結果を作製するの
に特異的であるものが選択され得る。このようなエフェクター分子は、当業者の
方法によって容易に同定および選択され得る。エフェクターペプチド、すなわち
、T細胞レセプターアンタゴニストまたは部分的なアゴニストを含むTCR融合
複合体は、アレルギーおよび自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症、インシュリ
ン依存性真性糖尿病、および慢性リウマチ関節)の治療に有用である。
意の同時刺激性エフェクター分子の存在下での本発明の1つ以上のTCR誘導複
合体の有効量の投与を提供し、それによってTCRを結合する提示される抗原の
位置で所望される免疫応答を誘導する。TCR融合複合体は、上記のように短縮
された形態であり得、および可溶性タンパク質として投与され得る。あるいはT
CR融合複合体は完全長であり得、すなわち、膜貫通部分を含む。これらの複合
体での治療は、本発明の完全長TCR融合複合体およびエフェクター分子をコー
ドするDNAベクターを含む有効量のDNA配列を哺乳動物に投与することを包
含する。
るために、組み合わせて用いてもよいし、抗炎症薬等、他の公知の治療剤ととも
に用いてもよい。例えば、自己免疫異常およびアレルギーの治療のために、免疫
抑制TCR融合複合体は、コルチコステロイドおよび非ステロイド剤等の抗炎症
剤と組み合わせて用いてもよい。
者に特に有用である。本発明の化合物は、ヒト患者において特定の腫瘍抗原を標
的化するのに特に有用である。本発明により治療される疾患の特定の例は、ガン
(例えば、乳ガン、前立腺ガンなど);ウイルス感染(例えば、HCV、HIV
など)、ならびに本明細書中に言及される特定の疾患を包含する。
の化合物(すなわち、少なくとも1つのTCRと組み合わされた少なくとも1つ
の同定される抗ガン薬物)は、例えば被験体(患者)各々における標的抗原に薬
物の標的化を増進することによって、抗ガン薬の効力を有意に向上させる。
に同時に対象の細胞に提示するが、該効果は、共有結合を伴わない本化合物の薬
剤を「カクテル(混合)」処方にて投与する形態に於いては容易に得られないで
あろう。
あった。従って、本発明の結合体を介する被験体細胞への、抗ガン薬およびTC
Rの基本的に同時の提示は、例えば、相乗効果的結果を提供することによって、
および/または免疫応答の産生を増進することによって、薬物活性を向上させる
。
内、および非経口(腹腔内、皮下、静脈内、皮内、または筋肉内注射を含む)を
含む多くの適切な経路によってなされ得、経口または非経口が一般に好ましい。
投与の好ましい方法および投薬量は、例えば、レシピエント(患者)の状態およ
び年齢によって異なる。
された薬理学的活性を伴う医薬等、他の医薬と組み合わせて、用いられる。例示
的な医薬としては、外科手術、放射線、化学治療、および他の形態の免疫治療(
例えば、ワクチン、抗体ベースの治療)等、認識された治療を包含する。本発明
の化合物は、必要に応じて、該治療の前に、間に、または後に投与される。
形剤、すなわち非経口、経口、または他の所望される投与に適切であり、および
活性な化合物と有害に反応せず、およびそのレシピエントに対しても有害でない
薬学的に受容される有機または無機キャリア物質との混合物中の薬学的組成物の
部分として示される。本発明の薬学的組成物は一般に、本発明の1つ以上のTC
R融合複合体、またはこのような融合複合体をコードするDNA構築物を、1つ
以上の好ましいキャリアとともに包含する。キャリアは構築物の他の成分と適合
性があるという意味で、「好ましい」のもでなくてはならず、およびそのレシピ
エント(患者)に対して有害であってはならない。適切な薬学的に受容されるキ
ャリアは、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチ
ン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘
性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド、ジグリセリド、petroeth
ral、ヒドロキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドンなどを含むが、
これらに制限されない。薬学的調製物は滅菌され、そして所望により、補助剤、
例えば、活性な化合物と有害に反応しない、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤化
剤、乳化剤、浸透圧を影響するための塩、緩衝液、着色剤、香料、および/また
は芳香族物質などとともに混合される。
溶液、ならびに懸濁液、乳化液、または座薬のような植え込み錠である。アンプ
ルは、簡便な単位投薬量である。
しくは炭水化物キャリア結合剤を有するカプセルなどであり、キャリアは好まし
くはラクトースおよび/またはコーンスターチ、および/またはジャガイモスタ
ーチである。甘味の媒体(vehicle)用にはシロップ、エリキシルなどが用いられ
る。これらを含む持続性放出組成物が処方され、その有効成分は、例えばマイク
ロカプセル化、多重コーティングのような、差別化分解性コーティング剤で保護
される。
のリポソーム調製手順、例えば超音波処理および押し出し成形処理等のに従って
行われる。リポソーム調製に適する従来の方法としては、例えば、A.D.Ba
nghamら、J.Mol.Biol.、23:238−252(1965);
F.Olsonら、Biochim.Biophys.Acta、557:9〜
23(1979);F.Szokaら、Proc.Nat.Acad.Sci.
、75:4194〜4198(1978);S.Kimら、Biochem.B
iophys.Acta、728:339〜348(1983);およびMay
erら、Biochim.Biophys.Acta、858:161〜168
(1986)に開示される。
し、感染因子またはガンのような標的される疾患に対して、ヒトのような哺乳動
物をワクチン接種する工程を包含する。
むDNA配列の有効な量を哺乳動物に投与する工程を包含する。TCR融合複合
体の発現ベクターの調製は上記され、および以降の実施例において記載される。
プラスミドDNAの投与のための方法、投与された被験体の細胞によるDNAの
取込み、およびタンパク質の発現は報告されている。例えば、Ulmer、J.
B.ら、Science(1993)259:1745〜1749を参照のこと
。
内注入によってヒトを含む哺乳動物に適切に投与される。哺乳動物の骨格筋肉へ
のcDNAの投与は、その後の筋肉細胞による投与される発現ベクターの取込み
、およびDNAによってコードされるタンパク質の発現とともに、Ulmerら
によって記載されており、および例示的なプロトコルを示す[Ulmer、J.
B.ら、Science 259:1745〜1749]。所定の治療に最適な
投与量は従来の方法で決定される。
のような融合複合体をコードする本発明のDNA構築物は、獣医学的適用、例え
ばウシ、ヒツジなどのような家畜、ならびにイヌおよび猫のようなペットの疾患
の治療に有意に用いられる。
構築物の好ましい実際の投与量は、特定の活性化合物または使用される化合物、
処方される特定の組成物、投与の態様、投与の特定の部位、患者の体重、健常度
全般、性別等、治療されるべき特定の症状等、また担当医または獣医を含む当業
者によって認識されるその他の因子によっても異なる。投与の所定のプロトコル
についての最適な投与比率は、例えば、上述の指針に関して行われる従来の投薬
量決定試験および本明細書中に開示されるアッセイにより、当業者によって容易
に決定される。
用される。以下の制限されない実施例は、本発明の説明である。
腫瘍抑制タンパク質p53のペプチドフラグメント(アミノ酸264〜272;
LLGRNSFEV)を認識する。T細胞受容体遺伝子は、可溶性TCRおよび
機能的受容体分子を生成するために以前に示された3つのドメインの1本鎖形式
にクローン化された。
rathon)cDNA増幅キット(Clontech)を使用して作製された。cD
NAクローンの配列決定は2つの異なるVα鎖(Vα3およびVα13)、なら
びに単一のVβ鎖(Vβ3)を同定した。cDNAは、プライマーKC228お
よびKC229またはKC226およびKC227を用いるポリメラーゼ連鎖反
応(PCR)における鋳型として使用されて、5’SfiI−3’SpeI V
α3またはVα13フラグメントをそれぞれ生成した。次いで同じDNAを、プ
ライマーPRIB4およびKC176を用いるPCR鋳型として使用して、5’
XhoI−3’XmaI VβCβ鎖フラグメントを作製した。Cβ鎖は、完全
長Cβ鎖のアミノ酸127でのシステイン残基の直前を短縮された。
y Vector System(Promega)にクローン化された。正確
なフラグメントは、制限消化され、そして発現ベクターpKC60(係属中の米
国特許出願第08/813,731号において以前に記載される)にクローン化
されて、2つのVα−(G4S)4Vβ Cβ scTCR分子の、264−A
(Vα3を伴う)および264−B(Vα13を伴う)を作製した。
ーET−TCRF1およびKC170またはET−TCRF2およびKC170
を用いるPCRによって再増幅されて、5’AgeI−3’ClaI DNAフ
ラグメントを作製した。フラグメントは、DNA配列決定のためにpGEM−T
Easy Vector Systemにクローン化された。
ライマーKC232およびKC208またはKC231およびKC208を用い
るPCRにおいて鋳型として使用されて、CD3ζ融合分子(以下に記載される
)および最終的に264 IL−2融合分子(以下に記載される)へのクローニ
ングのための、5’AgeI−3’HpaI DNAフラグメントを生成した。
264−B scTCRの両方が、CD3ζ融合分子として発現された。
において以前に記載されている。
ローン化してVα−(G4S)4 Vβ Cβ scTCR分子を作製した。新
規なベクターはpNAG2と命名された(図9)。次いで、pNAG2はプライ
マーKC203およびKC208を用いるPCRによって再増幅されて、5’A
geI−3’HpaI/BspEI/NruI/ClaI DNAフラグメント
を作製した。scTCRフラグメントは、pGEM−T Easy Vecto
r Systemにクローン化されて、そしてこの新規なpGEMベースのベク
ターは次いで、二特異的sc分子を作製するために他のDNAフラグメントの導
入のための「シャトルベクター」として使用された。
トルベクター」にクローン化された。scTCRおよびscSc−Fvをともに
、1本鎖融合タンパク質として連結するために、「シャトルベクター」を適切な
制限酵素で消化して、以前のリンカーDNAフラグメントを除き、そしてscT
CRとSc−Fvとの間のリンカー配列のライゲーションを可能にした。
びスプライス部位が、「バック」プライマーKC208を用いるscTCRのP
CR増幅の部分としてNruI制限部位とClaI制限部位との間に導入された
。二特異的scタンパク質の下流精製を補助するために、アニールされたオリゴ
(KC237およびKC238)のセットを、停止コドンおよびスプライス部位
とともに3’EEタグ(EEEEYMPME)を導入するために設計した。アニ
ールされたオリゴ対は、5’NruI−3’ClaIを、すでに完全な二特異的
sc分子をコードする「シャトルベクター」にクローン化した。
トルベクター」にクローニングして、二特異的sc分子設計を完了した後、DN
Aを制限消化(AgeI−ClaI)し、そして哺乳動物細胞発現ベクターpS
UN27にクローン化した(図10)(pBISP/149を作製するための係
属中の米国特許出願第08/943,086号において以前に記載される)(図
11)。
るポリメラーゼ連鎖反応における鋳型として使用して、5’HpaI−3’Cl
aIマウスCD3ζフラグメントを生成した。
sy Vector Systemにクローン化した。正確なフラグメントを制
限消化し、そして「シャトルベクター」にクローン化し、効果的に既存のリンカ
ー、scFV、およびEEタグを除去した。
eI−HpaIで消化して、264−Aおよび264−B scTCRフラグメ
ント(上記される)とのライゲーションを許容して、2つの新規なscTCR/
CD3ζ融合体を作製した。最後に、新規なDNA調製物を制限消化(AgeI
−ClaI)し、そして係属中の米国特許出願第09/422,375号におい
て以前に記載される哺乳動物細胞発現ベクターpSUN28(pBISP/DO
11.10ベクター)、図11にクローン化した。
ンのために調製した。細胞をDPBS中に再懸濁し、そして20μgのPvuI
直鎖化264−A/CD3ζまたは264−B/CD3ζDNAとともに混合し
た。氷上で5分間後、細胞を、250ボルトの1回のパルス、960u Fdま
たは0.25u Fdを送達するために設定されたGene Pulser(B
ioRad)を使用してエレクトロポレートした。パルスされた細胞を、氷上に
5分間置いた。細胞を10mlの10% IMDM培地(IMDM、10% F
BS、2mM グルタミン)中に希釈し、そしてT−25cm2TCフラスコ中
で、一晩、37℃にて5%CO2で増殖した。翌日、細胞を選択的な培地(10
% IMDM+1.0mg/ml G418)を伴う96ウェルプレート中に置
いた。1週間後、G418の濃度を2mg/mlに増加した。増殖するコロニー
をトランスフェクションの約2週間後に再栄養補充し、そして約1週間後にスク
リーニングした。
用してscTCRの表面発現についてスクリーニングした。ポジティブなトラン
スフェクト体を、マウスTCRのCβドメインの部分を検出する、蛍光でタグさ
れたmAb(H57−597)で染色することによって同定した。
るトランスフェクトされたジャーカット細胞を、細胞活性化アッセイにおいて使
用した。アッセイにおいて、HLA−A2提示細胞株T2が、APCとして使用
された。T2細胞を、264ペプチド(または非関連性のペプチド)とともに、
一晩、37℃にて、5%CO2で負荷された。翌日、トランスフェクトされたジ
ャーカット株を添加し、そしてペプチドでパルスされたAPCとの相互作用を一
晩許容した。
−2 ELISAを使用して評価された。抗ヒトIL−2 mAbを受動的に一
晩、96ウェルプレート上でコートした。プレートを洗浄し、そして10% F
BS/DPBSで1時間ブロックした。ブロッキング試薬を弾き落とし、そして
アッセイからの上清をプレートに1時間37℃にて添加した。洗浄後、結合され
たIL−2を、ビオチンに結合された別の抗IL−2mAbを使用して検出した
。37℃で45分間後、プレートを洗浄し、そしてストレプトアビジン−HRP
を15分間添加した。最後、プレートを洗浄し、そしてABTS基質を使用して
呈色した。吸光度を、405nmにて読み取った。
A分子のみが、264ペプチドで負荷されたAPCの存在下でIL−2を生成す
るために刺激された。
NA発現ベクターにクローン化されることが必要であった。
)およびQiashredder(Qiagen)を使用して、ヒトジャーカッ
ト細胞から単離した。RNAを濃縮し、そして逆転写酵素および特異的なバック
プライマー、KC328Bとの反応において使用し、そしてcDNAを作製した
。cDNAを、プライマーKC327BおよびKC328Bを用いるPCRにお
ける鋳型として使用して、5’BspI−3‘NruIヒトIL−2遺伝子フラ
グメントを生成した。
ector Systemにクローン化した。正確なフラグメントを制限消化し
、そして「シャトルベクター」にクローン化し、効果的に既存するscFv遺伝
子を取り出した。
I)、そしてscTCR(上記される)をライゲーションして、scTCR/I
L−2設計を完了した。最後に、DNAをAgeI−ClaI切断し、そして哺
乳動物細胞発現ベクターpSUN28にクローン化した。
いて詳細に記載される)バージョンを作製するために、149scTCRを、5
’AgeI−3’HpaIフラグメントとして「シャトルベクター」から切り出
し(特許出願第09/422,375号の実施例7を参照のこと)、次いで「I
L−2改変シャトルベクター」(上記される)にライゲーションした。次いで1
49scTCR/IL−2フラグメントを制限消化(AgeI−ClaI)し、
そして哺乳動物細胞発現ベクターpSUN28にクローン化した。
ために調製した。細胞をDPBS中に再懸濁し、そして20μgのPvuI直鎖
化264scTCR/IL−2または149scTCR/IL−2とともに混合
した。氷上で5分間後、細胞を、250ボルトの1回のパルス、960u Fd
または0.25u Fdを送達するために設定されたGene Pulserを
使用してエレクトロポレートした。パルスされた細胞を、氷上に5分間置いた。
細胞を10mlの10% IMDM培地(IMDM、10% FBS、2mM
グルタミン)中に希釈し、そしてT−25cm2TCフラスコ中で、一晩、37
℃にて5%CO2で増殖した。翌日、細胞を選択的な培地(10% IMDM+
1mg/ml G418)を伴う96ウェルプレート中に置き、約7日間後に再
栄養補充した。
についてスクリーニングした。抗ヒトIL−2抗体を、受動的に一晩96ウェル
プレート上にコートした。アッセイの日に、プレートを10%FBS/PBSで
1時間ブロックした。ウェルを洗浄し、そしてトランスフェクト体からの上清を
プレートに添加した。インキュベートおよび洗浄後、ビオチン化された抗Cβ
mAb H57−597(細胞株はATCCから購入した)をプレートに添加し
、続いて洗浄し、そしてストレプトアビジン−HRPとともにインキュベーショ
ンした。ポジティブなウェルをTMB基質の添加によって同定し、1N硫酸でク
エンチし、そして450nMの吸光度にて読み取った。少数のポジティブなクロ
ーンが、増大のために使用され、そして限界希釈クローニングを、安定なトラン
スフェクト細胞株を確立するために行った。
を使用するELISAアッセイ形式において融合分子の発現についてスクリーニ
ングされ、続いてビオチン化抗Cβ mAbおよびストレプトアビジン−HRP
で検出された。149融合分子について、Vαドメイン(B20.1、Phar
magen)に対する立体配座的なmAbが、コーティング抗体として使用され
た。264融合分子は、そのVβドメインに対する立体配座的なmAbを使用し
て検出された(KJ25、Pharmingen)。
使用して、トランスフェクト体上清から精製した。融合タンパク質を、濃縮する
ために抗TCR Coo特異的CNBr結合化アガロースカラムに適用した。簡
潔には、上清は、カラム床を1回通過させ、PBSでの洗浄後、低pHのグリシ
ン緩衝液(pH3.0)の添加によって結合したタンパク質をカラムから溶出し
て取り出し、そして1〜10希釈の2M Tris、pH8.0を添加して即座
に中和した。次いで精製されたタンパク質を、30kD MVカットオフ濃度単
位を使用してPBSに緩衝液交換した。最終的なタンパク質濃度は、OD280
読み取りによって決定された。精製されたタンパク質のクマシーブルー染色(図
2)および精製されたタンパク質の免疫ブロット解析(図2)は、264 sc
TCR−IL−2融合タンパク質の濃縮化を示す。
を使用して、264 scTCR−IL−2融合タンパク質のIL−2活性を評
価するために使用した。264 scTCR−D融合タンパク質を、ネガティブ
コントロールとしてアッセイにおいて使用した。簡潔には、アッセイのために使
用されたCTLL−2細胞を104細胞/mlで播種し、そして残余のIL−2
を涸渇するために48時間増殖させた。48時間経過後、細胞は1.15×10
5細胞/mlの密度に増殖した。次いで細胞を採集し、そして10% IMDM
(w/o IL−2)を使用して数回洗浄して、任意の残存するIL−2を除去
した。96ウェル平底プレートをアッセイのために使用した。先ず、50μlの
培地(10% IMDM)、培地w/IL−2または精製された264−IL−
2もしくは264−k融合タンパク質を各ウェルに添加した。CTLL−2細胞
を105細胞/50μlにて各ウェルに添加した。IL−2標準を同じプレート
に対して行った。プレートを37℃にて5%CO2を伴って一晩インキュベート
した。翌日、細胞死は、顕微鏡を使用して明らかに明白であった。細胞増殖/生
存度を、Celltiter Assayを使用して評価した。CellTit
er96アッセイは、Promega Corp.によって販売される水性の非
放射性細胞増殖アッセイである。アッセイは、新規なテトラゾリウム化合物、M
TS、および電子結合試薬;PMSの溶液から構成される。MTSは細胞によっ
て、組織培養培地中で可溶性であるホルマザン(formazan)に生体還元
される。490nmでのホルマザンの吸光度は、さらなるプロセシングを伴わな
いで96ウェルアッセイプレートから直接的に測定される。水性可溶性ホルマザ
ンへのMTSの変換は代謝的に活性な細胞において見出される脱水素酵素によっ
て達成される。490nm吸光度の量によって測定されるホルマザン産物の量は
、培養物中における生存細胞の数の直接的な割合である。264/IL−2およ
び264−k融合タンパク質は、1.25μg/ウェル〜0.0098μg/ウ
ェルに希釈することによって活性について試験された。
胞株、CTLL−2は、非放射性細胞増殖アッセイで264 scTCR−IL
−2融合タンパク質のIL−2活性を評価するために使用された。264 sc
TCR−k融合タンパク質は、ネガティブコントロールとしてアッセイにおいて
使用された。
色は機能的なscTCRを実証する。
面上でのペプチド/HLA−A2複合体への、そのTCRを介する融合タンパク
質の直接的な結合を示すために使用された(図4)。 A)0.5μg(10μg/ml)の264 scTCR−IL−2融合タン
パク質での149または264ペプチドパルス化T2細胞の染色。264 sc
TCR−IL−2融合タンパク質は、264ペプチドを提示するT2細胞に特異
的に結合するが、149ペプチドを提示するT2細胞には特異的に結合しない。 B)T2細胞を50μgの149または264ペプチドのいずれかでパルスし
た。各ペプチドのA2負荷を評価するために、ペプチドでの細胞の一晩のインキ
ュベーション後に、細胞をHLA−A2特異的mAb BB7.2(0.05μ
g)で染色した。これらの実験からの結果は、いずれかのペプチドでパルスされ
たT2細胞上での等価なレベルのHLA−A2表面発現を示し、両方のペプチド
の効果的なHLA−A2結合を示す。
胞間結合 本実施例において、T2細胞は149または264ペプチドのいずれかでパル
スされた。CTLL−2細胞を、ハイドロジエチジューム(HE)標識し、そし
て20分間室温で、50μgの149または264ペプチドのいずれかでパルス
された等数のカルセイン−AM標識化T2細胞とともにインキュベートした。図
5は、1μgの融合タンパク質が、CTLL−2細胞および264ペプチドで負
荷されたT2細胞を含有するインキュベーション混合物に添加された場合の細胞
間の結合を示す(A;3.25%)。対照的に、149ペプチドでパルスされた
T2細胞を含んだ混合物では結合体形成は観察されなかった(B;0.88%)
。細胞サンプルを、フローサイトメーターでの分析の前に1回洗浄した。
9/422,375号において以前に記載され、本明細書中に参考として援用さ
れる。
としてではない発現は非常に低いことが認識されていた。理論に拘束されること
を望まないが、sc−Fv発現の低いレベルは、二特異的分子の発現における制
限因子であり得る。ネイティブな145−2C 11ハイブリドーマ細胞株を抗
体供給源として使用し、そして細胞をマウスIgG2b重鎖と融合されたscT
CRでトランスフェクトした(図12)。トランスフェクトされたハイブリドー
マ細胞株は、宿主ハムスターIgGがマウスIgG2b重鎖と効果的に対合され
得る場合、いくつかの145−2C11/scTCRキメラ分子を分泌するはず
である。
特異的変異誘発を使用して、内部EcoRI制限部位を変異した。簡潔には所望
される変異を含む、相補的なオリゴヌクレオチド、KC293およびKC294
の対を設計した。pNAG2 DNA構築物を、Pfu DNAポリメラーゼを
使用するプライマーを用いるPCRによって増幅した。得られるPCR産物を、
親DNA鋳型を消化するDpnIで消化し、変異されたDNAインタクトを残し
た。変異されたscTCR DNAを配列決定し、次いでプライマーKC276
およびKC268を用いるPCRによって再増幅して、5’NruI−3’Ec
oRI DNAフラグメントを作製した。変異されたscTCR DNAをDN
A配列決定のために、pGEM−T Easy Vector Systemに
クローン化した。正確なscTCR DNAを制限消化し、そして哺乳動物細胞
発現ベクターpSUN7にクローン化して、p149 scTCR/IgG融合
分子を作製した。
るPCRによって再増幅して、5’NruI−3’EcoRI DNAフラグメ
ントを作製した。scTCRフラグメントを、DNA配列決定のためにpGEM
−T Easy Vector Systemにクローン化した。正確なscT
CR DNAを制限消化し、そして哺乳動物細胞発現ベクターpSUN7にクロ
ーン化して、DO 11.10scTCR/IgG融合分子(図12A/12B
を参照のこと)を作製した。
ーの主鎖は、プラスミドpCDNA3(Invitrogen)であった。プラ
スミドをHindIIIおよびXhoIで切断し、そして「軽鎖ポリリンカー」
DNAフラグメントを挿入して、開始材料の「軽鎖ベクター」pCDNA3.L
CPLを作製した。このリンカーは、制限部位HindIII、KpnI、Cl
aI、PmII、EcoRV、XmaI、BarnHI、およびXhoIを含み
、その後のクローニング工程を容易にした。軽鎖リーダー、マウス抗CKMBκ
軽鎖ゲノムフラグメント、および3’UTRを含有するSmaI−BclI D
NAフラグメントを、pCDNA3.LCPLのEcoRV−BarnHI部位
にクローン化した。次いで変異誘発を、NruI、MluI、およびBstBI
部位を排除するために、ならびにNheIおよびBarnHI部位を導入するた
めに行い、プラスミドpCDNA3mut.LCPL.LCVKを作製した。
III−XhoI)を制限部位、HpaI、BspEI、EcoRV、KpnI
、およびXhoIからなる「重鎖ポリリンカー」で置き換えることによって、p
CDNA3mut.LCPL.LCVKプラスミドから構築した。このプラスミ
ドは、EcoRVおよびKpnIで消化された。重鎖リーダーおよび抗CKMB
IgG2bマウス重鎖ゲノムフラグメントを含むSmaIKpnI消化DNA
フラグメント(Nearら、Molecular Immun.1990を参照
のこと)は次いで、EcoRV−KpnI消化プラスミドにライゲーションされ
た。3’UTRおよびSalI部位の上流のNotI部位を含有するKpnI−
SalIオリゴヌクレオチドフラグメントが続いて、KpnI−XhoI消化プ
ラスミドにクローン化されて(XhoI部位をノックアウトする)、プラスミド
pCDNA3mut.HCPL.HCV2bを作製し、これはまたマウスIgG
2b発現ベクターpSUN7として知られる(図13)。
へのscTCR264のクローニング、およびIgG1融合体としての発現)。 Kin Cardによって提供された264 scTCRのDNA調製物を、
このscTCR構築物のPCR増幅のための鋳型として使用した。scTCRの
再増幅を、264 TCR1sおよびKC268のプライマーセットを使用して
行った。新規に設計された264 TCR1s配列は以下のように読める、5’
−TTTCgTACgTCTTgTCCCAgTCAgTgACgCAgC−3
’。このオリゴヌクレオチドは、Bsi WI制限エンドヌクレアーゼ部位およ
びB6.2リーダーを伴うように設計された。Takara ExTagポリメ
ラーゼを、標準的なPCRプロトコルに従う増幅反応において使用した。増幅プ
ロフィールは以下のようであった、1サイクルについて96℃/2分間;5サイ
クルについて96℃/30秒間、62℃/15秒間、72℃/30秒間;および
30サイクルについて96℃/30秒間、68℃/1分間。Clontechプ
ロトコルに従って正確なMW(約1.3Kbまでの)DNAバンドをゲル精製し
、そしてPromegaのpGem−T easyベクターにクローン化した。
ライゲーションおよびXL−1 Blue細胞への形質転換後、6つのクローン
が選択され、そしてKim Cardによって提供された2つのプライマー、K
C285およびKC288を用いた診断PCRによってスクリーニングされた。
6つのうちの5つのクローンが、正確なMWのDNAバンドを生成した。DNA
配列分析を、2つのクローン、scTCR264/pGemAおよびBに対して
行い、各クローンは正確であることが見出された。二重消化(Bsi WIおよ
びRcoRI)反応を、クローンAおよびBについて設定した。正確なDNAフ
ラグメントをゲル精製し、そしてともにプールした。精製された264 scT
CRを、以前に調製されたpJRS355ベクターDNAにクローン化した。ラ
イゲーションおよびXL−1 Blueへの形質転換後、2つのコロニーを選択
した(A2およびB1)。それらのDNAのAlw NI消化は正確な制限パタ
ーンを示した。A2 DNAを用いた一過性のトランスフェクションは、TCR
およびIgG1イソタイプに特異的な抗体を用いるELISAアッセイを使用し
て決定されるように、264 scTCr/IgG1分子を生成した。
胞と、正確なペプチドでパルスされた抗原提示細胞との間の結合を媒介し得るこ
とを示した。本発明者らは今や、融合タンパク質によって媒介される架橋が、標
的細胞の破壊を生じるか否かに興味がある。実際にそうであるか否かを決定する
ために、本発明者らはインビトロ殺傷アッセイを使用する。簡潔には、エフェク
ター細胞が、単離されたマウス脾細胞から作製され、および3日間、37℃にて
5%CO2中、可溶性組換えヒトIL−2(50ng/ml)および抗CD30
mAb(145−2C11;10ng/ml)での刺激の存在下、培養する。刺
激を伴った3日間の培養後、抗CD8および抗CD25 mAbを使用する細胞
の二重染色、ならびにフローサイトメトリーを行う。二重にポジティブな集団の
検出は、エフェクターCTLの首尾よい生成の指標である。
パルス化T2細胞、種々のガン腫)を用いて行う。生存細胞(標的)は染料を取
り込み、次いで洗浄され、そしてエフェクター細胞およびTCR/IL−2融合
タンパク質またはポジティブもしくはネガティブなコントロールタンパク質のI
L−2およびTCR−k融合体をそれぞれ含有する96ウェルプレートに添加さ
れる。エフェクター対標的細胞の比率は一般に5:1、10:1、および20:
1である。アッセイ成分は次いで、2〜4時間、37℃にてインキュベートされ
、そして培養上清へのカルセイン−AMの放出が測定される。カルセイン−AM
の特異的な放出が測定されるか、または自発的に放出されるカルセイン−AMの
非特異的コントロールに比較される。
るヒト腫瘍の排除を促進する能力を試験するために、本発明者らは、このような
腫瘍が、NudeおよびSCIDマウスにおいて確立されたモデルを用いる。こ
のモデルはまた、T細胞クローンおよびヒト腫瘍に対して指向される免疫サイト
カインの効力を試験するためにSherman博士の実験室において使用されて
いる。p53を発現することが知られ、および264特異的CTLによって特異
的に殺傷される腫瘍は、NudeおよびSCIDマウスにおいて増殖するそれら
の能力について試験される。候補は、MDA−238、BT549、MCF−7
、Caski(頚ガン腫)、およびHepG2細胞を含む。細胞(1×106)
は、NudeおよびSCIDマウスの皮下に移植され、そして治療の前の7日間
確立させる。最初に、本発明者らは、TCR−IL−2融合分子を単独でマウス
が受ける場合、腫瘍増殖が阻害されるか否かの評価の下で各構築物について決定
する。本発明者らは、T細胞が腫瘍排除のためにエフェクター細胞として必要と
されることを予測しているが、NudeおよびSCIDに存在する漏出に起因す
る他のリンパ細胞が、融合タンパク質によって誘起されるエフェクター機能を有
し、これが腫瘍増殖を阻害することも考えられる。これは特に、生得的な免疫系
の非リンパ成分を刺激し得るFcDorサイトカインを有する二特異的抗体分子
の存在下で確かに起こり得る。一旦本発明者らが、融合タンパク質が腫瘍増殖を
影響する能力を決定すると、次いで本発明者らは、エフェクター機能について異
なるT細胞集団を試験する。マウス腫瘍モデルにおける以前の実験は、ナイーブ
なまたは活性化T細胞が送達されるか否かを決定するために必要な情報を提供す
る。コントロールの目的のために、本発明者らは、同時のTCR−IL−2融合
治療を伴わないで、活性化T細胞をエフェクターとしてマウスに送達する。
徴付け。 本実施例の目的は、264 scTCR−kおよびドキソルビシンのような細
胞傷害性薬物を使用する免疫結合体を開発することである。Dox、薬物の多く
のアントラサイクリンファミリーは、公知の最も強力な抗ガン薬物の1つである
が、臨床的な適用はその心毒性に起因して制限されている。心毒性を克服するた
めの試みは、腫瘍部位に特異的に薬物を送達するために、抗腫瘍mAbのような
キャリア分子にDoxを付着することであった。前臨床モデルにおける研究から
の結果は、Dox−免疫結合体が、等量の遊離薬物よりも少ない毒性で腫瘍細胞
をより効果的に殺傷し得ることを実証した。
および精製し、次いでインビトロおよびインビボでのその腫瘍殺傷効果を特徴づ
けするために免疫結合体を用いるいくつかの研究を行う。先ず、scTCR−k
融合タンパク質に結合される最適な数のDox分子が決定される。細胞によって
内部移行されるDoxの量は、腫瘍殺傷の度合いおよび効果に直接的に影響する
。それゆえ、本発明者らが、腫瘍細胞上で提示されるペプチド/MHC標的の数
が制限されると考える場合、漸増数のDox分子をscTCR上に結合すること
が所望され得る。しかし、scTCRとDox群との間の結合の安定性は、Do
xの分断と関連されるインビボでの非特異的細胞傷害性を防止するために十分に
高くなければならない。集合的に、これらの研究からの知見は、前臨床研究にお
いてTCR−Dox結合体の性能を予測するために用いられる。
記載は例示の目的のためのみであり、および請求の範囲の精神または範囲から逸
脱することなく変化および改変がなされ得ることが理解される。
パク質(TCR−κ)の構築物設計および発現である。 図1Aは、κ定常鎖領域に共有結合的に連結される3つのドメインscTCR
として構築された264TCRを表す模式図。 図1Bは、還元および非還元の条件下で泳動された、精製された264scT
CR−κ融合タンパク質ゲルを含有するクマシーブルー染色。 図1Cは、抗κ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で標識された結合体で
プローブされた精製された264scTCR−κ融合タンパク質の免疫ブロット
。
よび発現を示す。 図2Aは、分子の検出を容易にするために含まれたEEペプチドタグを用いて
IL−2遺伝子に共有結合的に連結された264 scTCR遺伝子を示す模式
図。 図2Bは、精製された264scTCR−IL−2および264 scTCR
−κ融合タンパク質を含有するタンパク質ゲルのクマシーブルー染色。 図2Cは、抗EEタグmAbおよびヤギ抗マウスHRP結合体でプローブされ
た精製された264scTCR−IL−2融合タンパク質の免疫ブロット解析。
細胞の例証的な結果を示す。
る。
である。
の模式図である。
よびpBISP/149を示す図である。
る。方法は、細胞の内側でsc−TCR/Ig融合分子(軽鎖)と結合する抗体
鎖(重鎖)を作製するためにハイブリドーマ発現細胞(145−2C11ハイブ
リドーマ)を使用する。 図12Bはsc−TCR/Ig分子についての好ましい構造を説明する。
Claims (80)
- 【請求項1】 可溶性T細胞レセプター融合複合体であって、ペプチドリン
カーによって結合されるT細胞レセプターおよび生物学的に活性なポリペプチド
を含有し、ここでT細胞レセプターが1つの認識結合部位を有し、および生物学
的に活性なポリペプチドが異なる認識結合部位を有する、可溶性T細胞レセプタ
ー融合複合体。 - 【請求項2】 T細胞レセプターが特定の抗原の認識に特異的である、請求
項1に記載の可溶性T細胞レセプター融合複合体。 - 【請求項3】 T細胞レセプターがαおよびβ鎖TCRを含有するヘテロ2
量体である、請求項1または2に記載の可溶性T細胞レセプター融合複合体。 - 【請求項4】 T細胞レセプターαおよびβ鎖が非共有結合を介して連結さ
れる、請求項1〜3に記載の可溶性T細胞レセプター融合複合体。 - 【請求項5】 T細胞レセプターが1本鎖T細胞レセプターポリペプチドを
含有する、請求項1または2に記載の可溶性T細胞レセプター融合複合体。 - 【請求項6】 生物学的に活性なポリペプチドがエフェクター細胞の認識に
ついて特異的である、請求項1〜5に記載の可溶性T細胞レセプター融合複合体
。 - 【請求項7】 生物学的に活性なポリペプチドが免疫グロブリンドメインま
たはそのフラグメントを含有する、請求項1〜6に記載の可溶性T細胞レセプタ
ー融合複合体。 - 【請求項8】 生物学的に活性なポリペプチドがκ定常鎖免疫グロブリンド
メインまたはそのフラグメントを含有する、請求項1〜7に記載の可溶性T細胞
レセプター融合複合体。 - 【請求項9】 生物学的に活性なポリペプチドがサイトカインまたはそのフ
ラグメントを含有する、請求項1〜8に記載の可溶性T細胞レセプター融合複合
体。 - 【請求項10】 生物学的に活性なポリペプチドがIL−2サイトカインま
たはそのフラグメントを含有する、請求項1〜9に記載の可溶性T細胞レセプタ
ー融合複合体。 - 【請求項11】 生物学的に活性なポリペプチドがIL−10サイトカイン
またはそのフラグメントを含有する、請求項1〜10に記載の可溶性T細胞レセ
プター融合複合体。 - 【請求項12】 生物学的に活性なポリペプチドがケモカインまたはそのフ
ラグメントを含有する、請求項1〜11に記載の可溶性T細胞レセプター融合複
合体。 - 【請求項13】 生物学的に活性なポリペプチドが増殖因子またはそのフラ
グメントを含有する、請求項1〜12に記載の可溶性T細胞レセプター融合複合
体。 - 【請求項14】 生物学的に活性なポリペプチドがG−CSFまたはそのフ
ラグメントを含有する、請求項1〜13に記載の可溶性T細胞レセプター融合複
合体。 - 【請求項15】 生物学的に活性なポリペプチドがタンパク質トキシンドメ
インまたはそのフラグメントを含有する、請求項1〜14に記載の可溶性T細胞
レセプター融合複合体。 - 【請求項16】 可溶性T細胞レセプター融合複合体を調整する方法であっ
て、方法は以下の工程: T細胞レセプター鎖またはそのサブフラグメントを提供する工程; 第2の鎖に対応する生物学的に活性なポリペプチドまたはそのサブフラグメン
トを提供する工程; T細胞レセプターおよび第2の鎖をペプチドリンカーに連結する工程;ならび
に 連結されたT細胞レセプター融合ポリペプチド複合体を回収し、それによって
T細胞レセプター融合複合体を作製する工程、を包含する、方法。 - 【請求項17】 T細胞レセプターおよび生物学的に活性なポリペプチドが
異なる認識部位を有する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 T細胞レセプターが特定の抗原の認識について特異的であ
る、請求項16または17に記載の方法。 - 【請求項19】 T細胞レセプターがTCRα鎖である、請求項16〜18
に記載の方法。 - 【請求項20】 T細胞レセプターがTCRβ鎖である、請求項16〜19
に記載の方法。 - 【請求項21】 T細胞レセプターが1本鎖T細胞レセプターポリペプチド
を含有する、請求項16〜20に記載の方法。 - 【請求項22】 生物学的に活性なポリペプチドが免疫グロブリンドメイン
またはそのフラグメントである、請求項16〜21に記載の方法。 - 【請求項23】 生物学的に活性なポリペプチドがκ定常鎖免疫グロブリン
ドメインまたはそのフラグメントを含有する、請求項16〜22に記載の方法。 - 【請求項24】 生物学的に活性なポリペプチドがサイトカインまたはその
フラグメントを含有する、請求項16〜23に記載の方法。 - 【請求項25】 生物学的に活性なポリペプチドがIL−2サイトカインを
含有する、請求項16〜24に記載の方法。 - 【請求項26】 生物学的に活性なポリペプチドがIL−10サイトカイン
またはそのフラグメントを含有する、請求項16〜25に記載の方法。 - 【請求項27】 生物学的に活性なポリペプチドがケモカインまたはそのフ
ラグメントを含有する、請求項16〜26に記載の方法。 - 【請求項28】 生物学的に活性なポリペプチドが増殖因子またはそのフラ
グメントを含有する、請求項16〜27に記載の方法。 - 【請求項29】 生物学的に活性なポリペプチドがG−CSFまたはそのフ
ラグメントを含有する、請求項16〜28に記載の方法。 - 【請求項30】 生物学的に活性なポリペプチドがタンパク質トキシンドメ
インまたはそのフラグメントを含有する、請求項16〜29に記載の方法。 - 【請求項31】 可溶性T細胞レセプター結合複合体であって、少なくとも
1つの残存する遊離アミン基を有するキャリアに共有結合される複数の生物学的
に活性な分子を含み、キャリアは1本鎖T細胞レセプターの1部分に共有結合さ
れ、ここで得られる結合体は可溶性である、可溶性T細胞レセプター結合複合体
。 - 【請求項32】 T細胞レセプターが特定の抗原の認識について特異的であ
る、請求項31に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項33】 T細胞レセプターがTCRαおよびβ鎖を含有するヘテロ
2量体である、請求項31または32に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合
体。 - 【請求項34】 T細胞レセプターαおよびβ鎖が非共有結合を介して連結
される、請求項31〜33に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項35】 T細胞レセプターが1本鎖T細胞レセプターである、請求
項31〜34に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項36】 生物学的に活性な分子が細胞傷害性分子である、請求項3
1〜35に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項37】 生物学的に活性な分子がトキシンである、請求項31〜3
6に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項38】 生物学的に活性な分子が化学治療剤である、請求項31〜
37に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項39】 生物学的に活性な分子が抗がん薬物である、請求項31〜
38に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項40】 生物学的に活性な分子が検出可能な標識である、請求項3
1〜39に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項41】 生物学的に活性な分子が蛍光化合物または電子伝達因子で
ある、請求項31〜40に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項42】 生物学的に活性な分子が酵素である、請求項31〜41に
記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項43】 生物学的に活性な分子が放射性化合物である、請求項31
〜42に記載の可溶性T細胞レセプター結合複合体。 - 【請求項44】 可溶性T細胞レセプター結合複合体を調製する方法であっ
て、以下の工程: 共有結合される複数の生物学的に活性な分子を有するポリマーキャリアと、T
細胞レセプター鎖とを反応させる工程、および 得られる結合分子を還元的に安定化する工程であって、ここで得られる結合T
細胞レセプター分子が可溶性である、工程、を包含する、方法。 - 【請求項45】 T細胞レセプターが1本鎖T細胞レセプターである、請求
項44に記載の方法。 - 【請求項46】 1本鎖T細胞レセプターが抗原の認識について特異的であ
る、請求項44または45に記載の方法。 - 【請求項47】 生物学的に活性な分子が細胞傷害性分子である、請求項4
4〜46に記載の方法。 - 【請求項48】 生物学的に活性な分子がトキシンである、請求項44〜4
7に記載の方法。 - 【請求項49】 生物学的に活性な分子が化学治療剤である、請求項44〜
48に記載の方法。 - 【請求項50】 生物学的に活性な分子が抗がん薬物である、請求項44〜
49に記載の方法。 - 【請求項51】 生物学的に活性な分子が検出可能な標識である、請求項4
4〜50に記載の方法。 - 【請求項52】 生物学的に活性な分子が蛍光化合物または電子伝達因子で
ある、請求項44〜51に記載の方法。 - 【請求項53】 生物学的に活性な分子が酵素である、請求項44〜52に
記載の方法。 - 【請求項54】 生物学的に活性な分子が放射性化合物である、請求項44
〜53に記載の方法。 - 【請求項55】 疾患を治療するための治療成物であって、治療的に有効な
量の請求項1〜15のいずれかに記載のT細胞レセプター融合複合体、および滅
菌の、薬学的に受容される担体を含有する、治療組成物。 - 【請求項56】 疾患を治療するための治療組成物であって、治療的に有効
な量の請求項31〜43のいずれかに記載のT細胞レセプター結合複合体、およ
び滅菌の、薬学的に受容される担体を含有する、治療組成物。 - 【請求項57】 複合体が悪性の疾患の治療のために指向される、請求項5
5または56に記載の治療組成物。 - 【請求項58】 複合体が自己免疫の疾患の治療に指向される、請求項55
または56に記載の治療組成物。 - 【請求項59】 複合体が炎症性応答の治療に指向される、請求項55また
は56に記載の治療組成物。 - 【請求項60】 複合体が感染性疾患の治療に指向される、請求項55また
は56に記載の治療組成物。 - 【請求項61】 複合体がウイルス感染の治療に指向される、請求項55ま
たは56に記載の治療組成物。 - 【請求項62】 疾患の指標のための診断的組成物であって、診断的に有効
な量の請求項31〜43のいずれかに記載のT細胞レセプター結合複合体、およ
び滅菌の、薬学的に受容される担体を含有する、診断的組成物。 - 【請求項63】 T細胞レセプター結合複合体が、診断的または画像化研究
に適切な検出可能に標識される分子である、請求項62に記載の診断的組成物。 - 【請求項64】 ペプチドリンカーによって連結されたT細胞レセプターお
よび生物学的に活性なポリペプチドを含有するT細胞レセプター融合複合体をコ
ードする核酸配列であって、ここでT細胞レセプターが1つの認識結合部位を有
し、および生物学的に活性なポリペプチドが異なる認識結合部位を有する、核酸
配列。 - 【請求項65】 T細胞レセプターが特定の抗原の認識に特異的である、請
求項64に記載の核酸配列。 - 【請求項66】 T細胞レセプターがαおよびβ鎖TCRを含有するヘテロ
2量体である、請求項64または65に記載の核酸配列。 - 【請求項67】 T細胞レセプターαおよびβ鎖が非共有結合を介して連結
される、請求項64〜66に記載の核酸配列。 - 【請求項68】 T細胞レセプターが1本鎖T細胞レセプターポリペプチド
を含有する、請求項64または65に記載の核酸配列。 - 【請求項69】 生物学的に活性なポリペプチドがエフェクター細胞の認識
について特異的である、請求項64〜68に記載の核酸配列。 - 【請求項70】 生物学的に活性なポリペプチドが免疫グロブリンドメイン
またはそのフラグメントを含有する、請求項64〜69に記載の核酸配列。 - 【請求項71】 生物学的に活性なポリペプチドがκ定常鎖免疫グロブリン
ドメインまたはそのフラグメントを含有する、請求項64〜70に記載の核酸配
列。 - 【請求項72】 生物学的に活性なポリペプチドがサイトカインまたはその
フラグメントを含有する、請求項64〜71に記載の核酸配列。 - 【請求項73】 生物学的に活性なポリペプチドがIL−2サイトカインま
たはそのフラグメントを含有する、請求項64〜72に記載の核酸配列。 - 【請求項74】 生物学的に活性なポリペプチドがIL−10サイトカイン
またはそのフラグメントを含有する、請求項64〜73に記載の核酸配列。 - 【請求項75】 生物学的に活性なポリペプチドがケモカインまたはそのフ
ラグメントを含有する、請求項64〜74に記載の核酸配列。 - 【請求項76】 生物学的に活性なポリペプチドが増殖因子またはそのフラ
グメントを含有する、請求項64〜75に記載の核酸配列。 - 【請求項77】 生物学的に活性なポリペプチドがG−CSFまたはそのフ
ラグメントを含有する、請求項64〜76に記載の核酸配列。 - 【請求項78】 生物学的に活性なポリペプチドがタンパク質トキシンドメ
インまたはそのフラグメントを含有する、請求項64〜77に記載の核酸配列。 - 【請求項79】 核酸がDNAである、請求項64〜78のいずれかに記載
の核酸配列。 - 【請求項80】 核酸がRNAである、請求項64〜78のいずれかに記載
の核酸配列。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20953600P | 2000-06-05 | 2000-06-05 | |
US60/209,536 | 2000-06-05 | ||
PCT/US2001/018145 WO2001093913A2 (en) | 2000-06-05 | 2001-06-05 | T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003534821A true JP2003534821A (ja) | 2003-11-25 |
JP4439808B2 JP4439808B2 (ja) | 2010-03-24 |
Family
ID=22779138
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002501484A Expired - Lifetime JP4439808B2 (ja) | 2000-06-05 | 2001-06-05 | T細胞レセプター融合体および結合体ならびにそれらの使用方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20030144474A1 (ja) |
EP (2) | EP2322228B1 (ja) |
JP (1) | JP4439808B2 (ja) |
CN (2) | CN101712721A (ja) |
AU (2) | AU7524601A (ja) |
CA (1) | CA2411470C (ja) |
ES (1) | ES2659376T3 (ja) |
WO (1) | WO2001093913A2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012527439A (ja) * | 2009-05-20 | 2012-11-08 | イムノコア リミテッド | 二機能性ポリペプチド |
WO2018026018A1 (ja) * | 2016-08-05 | 2018-02-08 | 国立大学法人東北大学 | T細胞受容体の認識機構を用いたがん又は感染症の治療及び診断 |
JPWO2019151392A1 (ja) * | 2018-01-31 | 2021-02-04 | 国立大学法人東北大学 | 抗原特異的mhc発現調節法 |
Families Citing this family (61)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU8330401A (en) * | 2000-08-11 | 2002-02-25 | Favrille Inc | Method and composition for altering a t cell mediated pathology |
DK1546188T3 (da) | 2001-06-05 | 2008-10-27 | Altor Bioscience Corp | P53-bindende T-cellereceptormolekyler og anvendelser deraf |
CA2513287A1 (en) * | 2002-01-14 | 2003-07-17 | William Herman | Multispecific binding molecules |
US20060135418A1 (en) * | 2002-12-03 | 2006-06-22 | Avidex Ltd. | Receptors |
KR101131297B1 (ko) | 2003-11-10 | 2012-03-30 | 알토 바이오사이언스 코포레이션 | 가용성 티씨알 분자 및 이용 방법 |
EP2007911A4 (en) * | 2006-04-05 | 2009-08-05 | Gen Hospital Corp | COMPOSITIONS BASED ON T-CELL RECEPTORS SPECIFIC TO SOLUBLE VIRUSES |
EP2064325B1 (en) * | 2006-09-01 | 2011-12-07 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals |
CA2690825C (en) | 2007-05-11 | 2019-02-12 | Altor Bioscience Corporation | Fusion molecules and il-15 variants |
US20110070191A1 (en) * | 2008-03-19 | 2011-03-24 | Wong Hing C | T cell receptor fusions and conjugates and methods of use there of |
EP2258719A1 (en) * | 2009-05-19 | 2010-12-08 | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) | Multiple target T cell receptor |
CA2777053A1 (en) | 2009-10-06 | 2011-04-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Human single-chain t cell receptors |
KR20140020228A (ko) | 2010-09-21 | 2014-02-18 | 알토 바이오사이언스 코포레이션 | 다량체성 아이엘 15 용해성 융합 분자 및 그의 제조 및 사용 방법 |
US11053299B2 (en) | 2010-09-21 | 2021-07-06 | Immunity Bio, Inc. | Superkine |
AU2013208003B2 (en) | 2012-01-09 | 2017-12-14 | The Scripps Research Institute | Ultralong complementarity determining regions and uses thereof |
CN105073781A (zh) | 2013-01-11 | 2015-11-18 | 加州生物医学研究所 | 牛融合抗体 |
TWI775117B (zh) | 2013-08-05 | 2022-08-21 | 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 | 新穎肽類,細胞及其用於治療多種腫瘤的用途,其製造方法及包含其等之醫藥組成物(二) |
GB201319446D0 (en) | 2013-11-04 | 2013-12-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors |
WO2015168656A2 (en) * | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Adheren Incorporated | Biological complexes and methods for using same |
GB201408255D0 (en) | 2014-05-09 | 2014-06-25 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML) |
KR20170010893A (ko) * | 2014-06-06 | 2017-02-01 | 더 캘리포니아 인스티튜트 포 바이오메디칼 리써치 | 아미노 말단 면역글로불린 융합 단백질 및 이의 조성물을 구축하는 방법 |
GB201411037D0 (en) | 2014-06-20 | 2014-08-06 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemai (CLL) |
US9925247B2 (en) | 2014-06-30 | 2018-03-27 | Altor Bioscience Corporation | IL-15-based molecules and methods of use thereof |
CN107223133B (zh) | 2014-11-07 | 2021-01-29 | 广东香雪精准医疗技术有限公司 | 一种可溶的异质二聚t细胞受体及其制法和应用 |
GB201501017D0 (en) | 2014-12-23 | 2015-03-04 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers |
GB201505585D0 (en) | 2015-03-31 | 2015-05-13 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers |
GB201507030D0 (en) | 2015-04-24 | 2015-06-10 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC |
GB201507719D0 (en) | 2015-05-06 | 2015-06-17 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers |
GB201511546D0 (en) | 2015-07-01 | 2015-08-12 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers |
EP3919507A3 (en) | 2015-07-01 | 2022-01-12 | Immatics Biotechnologies GmbH | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers |
HUE052628T2 (hu) | 2015-07-06 | 2021-05-28 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Új peptidek és peptidkombináció a nyelõcsõrák és más ráktípusok elleni immunterápiában történõ használatra |
GB201513921D0 (en) | 2015-08-05 | 2015-09-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers |
GB201522667D0 (en) | 2015-12-22 | 2016-02-03 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers |
JP7161938B2 (ja) | 2016-01-10 | 2022-10-27 | ネオティーエックス セラピューティクス リミテッド | スーパー抗原媒介性癌免疫療法の能力を増強するための方法および組成物 |
GB201602918D0 (en) | 2016-02-19 | 2016-04-06 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against NHL and other cancers |
CN116375797A (zh) | 2016-03-01 | 2023-07-04 | 伊玛提克斯生物技术有限公司 | 用于膀胱癌和其他癌症免疫治疗的肽、肽组合物和细胞类药物 |
DK3430037T3 (da) | 2016-03-16 | 2022-11-21 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Transficerede t-celler og t-cellereceptorer til anvendelse i immunterapi mod cancere |
TWI826891B (zh) | 2016-03-16 | 2023-12-21 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 轉染 t 細胞和 t 細胞受體用於癌症免疫治療 |
SG10202008013TA (en) | 2016-04-06 | 2020-10-29 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against aml and other cancers |
AU2017273147A1 (en) | 2016-06-02 | 2019-01-03 | Immunocore Limited | Dosing regimen for GP100-specific TCR - anti-CD3 SCFV fusion protein |
TW202304970A (zh) | 2016-08-26 | 2023-02-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於頭頸鱗狀細胞癌和其他癌症免疫治療的新型肽和支架 |
SG11201903306SA (en) | 2016-10-21 | 2019-05-30 | Altor Bioscience Corp | Multimeric il-15-based molecules |
MA47367B1 (fr) | 2017-01-27 | 2023-06-28 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers |
WO2018189148A1 (en) | 2017-04-10 | 2018-10-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination thereof for use in the immunotherapy against cancers |
CA3059644A1 (en) | 2017-04-10 | 2018-10-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination thereof for use in the immunotherapy against cancers |
WO2018189152A2 (en) | 2017-04-10 | 2018-10-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against leukemias and other cancers |
US10800823B2 (en) | 2017-07-07 | 2020-10-13 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against lung cancer, including NSCLC, SCLC and other cancers |
CR20200059A (es) | 2017-07-07 | 2020-06-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nuevos péptidos y nuevas combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de pulmón, incluyendo el nsclc, el sclc y otros cánceres |
DE102018107224A1 (de) | 2018-02-21 | 2019-08-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten |
TW202016131A (zh) | 2018-05-16 | 2020-05-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於抗癌免疫治療的肽 |
US10925947B2 (en) | 2018-06-29 | 2021-02-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | A*03 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods |
TW202019955A (zh) | 2018-07-31 | 2020-06-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | B*07 限制肽和肽組合的抗癌免疫治療和相關方法 |
US11945850B2 (en) | 2018-09-17 | 2024-04-02 | Immatics Biotechnologies Gmbh | B*44 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods |
TW202024121A (zh) | 2018-09-18 | 2020-07-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | A*01 限制肽和肽組合物在抗癌免疫治療中的用途和相關方法 |
TW202039535A (zh) | 2018-12-18 | 2020-11-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | B*08限制肽和肽組合物抗癌免疫治療和相關方法 |
MX2021013908A (es) | 2019-05-15 | 2022-03-11 | Neotx Therapeutics Ltd | Tratamiento para el cáncer. |
KR20220150353A (ko) | 2020-03-05 | 2022-11-10 | 네오티엑스 테라퓨틱스 엘티디. | 면역 세포를 사용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
DE102020125465A1 (de) | 2020-09-29 | 2022-03-31 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch nicht-HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten |
TW202229312A (zh) | 2020-09-29 | 2022-08-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 由非hla-a*02顯露以用於不同類型癌症之免疫治療的醯胺化肽及其脫醯胺化對應物 |
DE102020125457A1 (de) | 2020-09-29 | 2022-03-31 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten |
TW202241925A (zh) | 2021-01-15 | 2022-11-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 用於不同類型癌症免疫治療的hla展示肽 |
WO2023187127A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Enterome S.A. | Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6399368B1 (en) * | 1992-01-17 | 2002-06-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Secretion of T cell receptor fragments from recombinant Escherichia coli cells |
US5679641A (en) * | 1992-05-26 | 1997-10-21 | Rijksuniversiteit Leiden | Peptides of human P53 protein for use in human T cell response inducing compositions, and human P53 protein-specific cytotoxic t-lymphocytes |
AU5098393A (en) | 1992-08-14 | 1994-03-15 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Recombinant toxin with increased half-life |
FR2698880B1 (fr) * | 1992-11-25 | 1995-02-24 | Inst Nat Sante Rech Med | Procédé de production de récepteurs T solubles, produits ainsi obtenus et leur utilisation dans des compositions diagnostiques ou thérapeutiques. |
US5747654A (en) | 1993-06-14 | 1998-05-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity |
EP0659438A1 (en) * | 1993-12-23 | 1995-06-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Conjugates consisting of peptidic T cell antigens and cell binding groups, and their use for therapy |
WO1996013593A2 (en) * | 1994-10-26 | 1996-05-09 | Procept, Inc. | Soluble single chain t cell receptors |
US5534592A (en) | 1995-09-22 | 1996-07-09 | The Goodyear Tire & Rubber Company | High performance blend for tire treads |
EP0977886A4 (en) * | 1997-03-07 | 2002-10-23 | Sunol Molecular Corp | FUSION PROTEINS, WHICH CONTAIN A BACTERIOPHAGE ENVELOPE PROTEIN AND A SINGLE CHAIN T-CELL RECEPTOR |
KR100712256B1 (ko) * | 1997-10-02 | 2007-04-27 | 알토 바이오사이언스 코포레이션 | 가용성 단일쇄 t-세포 수용체 단백질 |
JP4467188B2 (ja) * | 1998-10-21 | 2010-05-26 | アルター・バイオサイエンス・コーポレーション | 多重特異的結合分子とその使用 |
DK1546188T3 (da) * | 2001-06-05 | 2008-10-27 | Altor Bioscience Corp | P53-bindende T-cellereceptormolekyler og anvendelser deraf |
US9281917B2 (en) | 2007-01-03 | 2016-03-08 | Nokia Technologies Oy | Shared control channel structure |
PL228457B1 (pl) | 2013-08-30 | 2018-03-30 | Univ Jagiellonski | Tomograf hybrydowy TOF-PET/CT |
US9924645B2 (en) | 2015-12-21 | 2018-03-27 | International Business Machines Corporation | Controlling valve operation using pressure |
-
2001
- 2001-06-05 WO PCT/US2001/018145 patent/WO2001093913A2/en active Application Filing
- 2001-06-05 AU AU7524601A patent/AU7524601A/xx active Pending
- 2001-06-05 CA CA2411470A patent/CA2411470C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-05 ES ES10182289.8T patent/ES2659376T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-05 AU AU2001275246A patent/AU2001275246B2/en not_active Expired
- 2001-06-05 JP JP2002501484A patent/JP4439808B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-05 US US09/874,907 patent/US20030144474A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-05 EP EP10182289.8A patent/EP2322228B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-05 EP EP01941935.7A patent/EP1289564B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-05 CN CN200910168162A patent/CN101712721A/zh active Pending
- 2001-06-05 CN CN01810346A patent/CN1464790A/zh active Pending
-
2012
- 2012-09-12 US US13/612,178 patent/US20130115191A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-05-03 US US15/585,956 patent/US20180086810A1/en not_active Abandoned
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012527439A (ja) * | 2009-05-20 | 2012-11-08 | イムノコア リミテッド | 二機能性ポリペプチド |
JP2015096527A (ja) * | 2009-05-20 | 2015-05-21 | イムノコア リミテッド | 二機能性ポリペプチド |
JP2017110019A (ja) * | 2009-05-20 | 2017-06-22 | イムノコア リミテッド | 二機能性ポリペプチド |
JP2019172678A (ja) * | 2009-05-20 | 2019-10-10 | イムノコア リミテッド | 二機能性ポリペプチド |
WO2018026018A1 (ja) * | 2016-08-05 | 2018-02-08 | 国立大学法人東北大学 | T細胞受容体の認識機構を用いたがん又は感染症の治療及び診断 |
JPWO2018026018A1 (ja) * | 2016-08-05 | 2019-06-27 | 国立大学法人東北大学 | T細胞受容体の認識機構を用いたがん又は感染症の治療及び診断 |
JP7012364B2 (ja) | 2016-08-05 | 2022-02-14 | 国立大学法人東北大学 | T細胞受容体の認識機構を用いたがん又は感染症の治療及び診断 |
US11325961B2 (en) | 2016-08-05 | 2022-05-10 | Tohoku University | Natural killer cell function enhancer |
JPWO2019151392A1 (ja) * | 2018-01-31 | 2021-02-04 | 国立大学法人東北大学 | 抗原特異的mhc発現調節法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1464790A (zh) | 2003-12-31 |
WO2001093913A3 (en) | 2003-01-16 |
CA2411470A1 (en) | 2001-12-13 |
AU2001275246B2 (en) | 2006-06-29 |
EP1289564B1 (en) | 2018-07-18 |
WO2001093913A2 (en) | 2001-12-13 |
EP2322228A1 (en) | 2011-05-18 |
JP4439808B2 (ja) | 2010-03-24 |
ES2659376T3 (es) | 2018-03-15 |
CA2411470C (en) | 2020-05-05 |
US20030144474A1 (en) | 2003-07-31 |
US20180086810A1 (en) | 2018-03-29 |
CN101712721A (zh) | 2010-05-26 |
US20130115191A1 (en) | 2013-05-09 |
EP2322228B1 (en) | 2018-01-10 |
EP1289564A2 (en) | 2003-03-12 |
AU7524601A (en) | 2001-12-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4439808B2 (ja) | T細胞レセプター融合体および結合体ならびにそれらの使用方法 | |
US20200283498A1 (en) | T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof | |
AU2001275246A1 (en) | T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof | |
CN104109200B (zh) | 融合分子与il‑15变异体 | |
JP4350301B2 (ja) | 可溶性mhc複合体とその利用法 | |
US7396911B2 (en) | Chimeric polypeptides containing chemokine domains | |
JP3171268B2 (ja) | 治療抗体基融合タンパク質 | |
JP2001519143A (ja) | 可溶性の一本鎖t細胞レセプタータンパク質 | |
JPH06502301A (ja) | 安定タンパク質コアに結合されたタンパク質ポリリガンド | |
AU758576B2 (en) | Chemokines with amino-terminal modifications | |
JP4845381B2 (ja) | タンパク質性化合物の毒性作用を修飾する組成物および方法 | |
US7456263B2 (en) | P53 binding T cell receptor molecules | |
US20060018912A1 (en) | Snares for pathogenic or infectious agents and uses related thereto | |
US20210008167A1 (en) | T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof | |
Abbasi-Kenarsari et al. | Cloning and expression of CD19, a human B-cell marker in NIH-3T3 cell line | |
WO2004087058A2 (en) | Targeted mhc class i alpha3 vaccine delivery systems | |
JPH06503956A (ja) | 腫瘍細胞に対する標的決定IgEエフェクター細胞 | |
JP2979321B2 (ja) | 新規組み換え型リンホトキシン |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20040608 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040611 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040610 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070417 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070710 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070718 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070813 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070820 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070912 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070920 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071016 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080805 |
|
RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20090212 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090218 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090213 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090220 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090917 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091019 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100106 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4439808 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |