KR20140020228A - 다량체성 아이엘 15 용해성 융합 분자 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

다량체성 아이엘 15 용해성 융합 분자 및 그의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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KR20140020228A
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complex
protein complex
soluble
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힝 씨. 웡
피터 로데
바이 리우
지아오윤 주
카이-핑 한
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알토 바이오사이언스 코포레이션
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Abstract

본 발명은 2 개 이상의 용해성 융합 단백질을 갖는 용해성 융합 단백질 복합체를 제공한다. 제 1 융합 단백질은 인터류킨-15(IL-15) 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 제 1 생물 활성 폴리펩타이드이다. 제 2 융합 단백질은 용해성 인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 제 2 생물 활성 폴리펩타이드이다. 본 발명의 복합체에서, 상기 제 1 및 제 2 융합 단백질 중 어느 하나 또는 둘 다는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 작용 단편을 추가로 포함하며; 상기 제 1 융합 단백질은 상기 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인에 결합하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성한다. 본 발명은 본 발명의 복합체의 제조 및 사용 방법을 추가로 제공한다.

Description

다량체성 아이엘 15 용해성 융합 분자 및 그의 제조 및 사용 방법{MULTIMERIC IL-15 SOLUBLE FUSION MOLECULES AND METHODS OF MAKING AND USING SAME}
본 발명은 2 개 이상의 용해성 융합 단백질을 갖는 용해성 융합 단백질 복합체및 이를 제조하는 방법과 용도에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은 2010년 9월 21일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/384,817 호 및 2011년 8월 26일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/527,911 호의 이점을 청구하며, 이들의 전체 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.
정부 지원
본 출원을 지지하는 연구는 미국 보건 복지부 장관에 의해 대변되는 미국에 의해 수행되었다.
발명의 배경
선행의 연구들은 다가 분자의 형성을 통해 유효한 친화성을 증대시키거나 또는 다수의 특이적인 분자의 형성을 통해 인식 범위를 확장시킬 목적으로 다량체성 표적화 단백질을 생성시키는 유용성을 입증하였다. 다양한 단백질 상호작용 도메인들을 사용하여 이량체성 및 다량체성 결합 부위를 갖는 재조합 단백질들을 생성시켰다. 처음에, 류신 지퍼 도메인에 대한 상기 표적화 도메인의 융합이 이량체화를 위해 통상적으로 사용되었다. 상기 접근법에서, 류신 지퍼 도메인의 소수성 상호작용은 α-나선과 나란히 규칙적으로 이격된 류신들에 의해 매개되는 반면, 상기 이량체화 상대는 상기 소수성 코어 바로 밖의 다른 아미노산들, 주로 염 가교를 형성하는 하전된 잔기들에 의해 결정된다(1-3). 이러한 상호작용은 단백질의 Fos 및 Jun 과에 의해 예시되며, 이들은 상기 표적 도메인 특이성의 현저한 방해 없이 이종이량체를 우선적으로 형성한다. 상기 접근법은 다양한 스캐폴드를 제공하여 다량체성 복합체를 생성시킨다(4,5). 그러나, 치료 단백질 개발을 위한 상기 접근법의 유용성에 현저한 영향을 미치는 제한들이 존재한다. 가장 현저하게는, Fos 및 Jun은 거의 독점적으로 핵 내에서 축적되는 세포 내 단백질들이다. 따라서, 용해성 및 분비된 Fos 및 Jun 융합물을 대개는 바큘로바이러스-감염되거나 또는 안정하게 형질전환된 곤충 세포 시스템, 비교적 낮은 수율 및 용이하게 규모 조절할 수 없는 제조 공정을 사용하여 생성시킨다(6,7). 이중특이성 분자를 생성시키고자, Fos-Jun에 결합된 항체 도메인을 세균 또는 포유동물 세포에서 생성시켰으나, 주요 제한은, 정제 공정을 복잡하게 하고 전체 수율을 감소시키는 서브유닛 동종이량체화였다(8,9). 더욱 또한, 곤충 또는 세균 세포에 의해 생산된 단백질의 글리코실화 패턴의 차이는 치료 용도로 사용될 때 상기 생성물의 잠재적인 면역원성의 우려를 제기한다.
류신 지퍼 동기 외에, 면역글로불린(IgG) 불변 도메인, 나선-회전-나선 자기 이량체화 펩타이드, 콜라겐의 삼량체 및 사량체성 서브도메인 및 p53이 다가 분자를 생성시키는 스캐폴드로서 사용되어 왔다(8, 10-13). IgG 단편은 차치하고, 이들 상호작용 도메인은 주로 분자 스캐폴드로서 작용하며 다른 작용 활성 자체는 없다. 더욱이, 이들 도메인을 함유하는 융합 단백질은 종종 안정한 다량체 형성을 촉진하기 위한 추가의 최적화, 및 치료제 개발을 위해 장황하거나 조절 장애물이 부과되는 특수 생산 세포주 및 정제 방법을 요한다(10,12). 이러한 스캐폴드 중 다수는, 불량한 약동학을 나타내고 치료 가능성을 제한할 수 있는 면역원성 반응의 위험을 나타내는 비인간 단백질 도메인 또는 혈장의 비-천연 성분의 유도체들이다.
본 발명은 2 개 이상의 용해성 융합 단백질을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체로,
제 1 융합 단백질이 (b) 인터류킨-15(IL-15) 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 (a) 제 1 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하고;
제 2 융합 단백질이 (d) 용해성 인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 (c) 제 2 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하며,
상기 제 1 및 제 2 융합 단백질 중 어느 하나 또는 둘 다가 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 작용 단편을 또한 포함하고,
상기 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인이 상기 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인에 결합하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성하는
용해성 융합 단백질 복합체, 이의 제조 방법 및 용도를 제공하고자 한다.
발명의 요약
본 발명은 2 개 이상의 용해성 융합 단백질을 갖는 용해성 융합 단백질 복합체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 제 1 융합 단백질은 인터류킨-15(IL-15) 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 제 1 생물 활성 폴리펩타이드를 포함한다. 제 2 융합 단백질은 용해성 인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 제 2 생물 활성 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 복합체에서, 상기 제 1 및 제 2 융합 단백질 중 어느 하나 또는 둘 다는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 작용 단편을 추가로 포함한다. 상기 복합체에서, 상기 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인은 상기 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인에 결합하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 용해성 융합 단백질 복합체에서, 상기 제 1 및 제 2 생물 활성 폴리펩타이드들 중 하나는 제 1 용해성 T-세포 수용체(TCR) 또는 그의 작용 단편을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 제 1 용해성 TCR을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체는 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드로서 제 2 용해성 TCR을 포함하며, 이에 의해 증가된 결합 활성을 갖는 다가 TCR 융합 단백질 복합체를 생성시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 복합체 중의 TCR들은 2 개 이상의 상이한 TCR들을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 TCR들은 모두 동일하다. 몇몇 실시태양에서 2 개 이상의 상이한 TCR들이 존재하는 경우, 상기 TCR들은 별도의 표적 분자에 결합한다. 몇몇 실시태양에서 2 개 이상의 상이한 TCR들이 존재하는 경우, 상기 TCR들은 동일한 표적 분자 상의 별도의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 TCR들은 특정 항원의 인식에 특이적이다.
본 발명의 용해성 융합 복합체에서, 몇몇 실시태양에서, 상기 TCR들은 α 및 β 쇄 TCR 및 단일 쇄 TCR 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체 중에서 독립적으로 선택된다. 몇몇 실시태양에서, 상기 단일 쇄 TCR은 펩타이드 링커 서열에 의해 TCR V-β 쇄에 공유 결합된 TCR V-α 쇄를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 단일 쇄 TCR은 TCR V-β 쇄에 공유 결합된 용해성 TCR Cβ 쇄 단편을 추가로 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 단일 쇄 TCR은 TCR V-α 쇄에 공유 결합된 용해성 TCR Cα 쇄 단편을 추가로 포함한다. 상기 용해성 융합 단백질 복합체의 몇몇 실시태양에서, 상기 제 1 생물 활성 폴리펩타이드는 TCRα 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함하고 상기 제 2 생물 활성 폴리펩타이드는 TCRβ 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 용해성 융합 단백질 복합체에서 상기 제 1 및 제 2 생물 활성 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 항체 또는 그의 작용 단편을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 복합체 중의 항체는 2 개 이상의 상이한 항체를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항체들은 모두 동일하다. 몇몇 실시태양에서 2 개 이상의 상이한 항체들이 존재하는 경우, 상기 항체들은 별도의 표적 분자에 결합한다. 몇몇 실시태양에서 2 개 이상의 상이한 항체들이 존재하는 경우, 상기 항체들은 동일한 표적 분자 상의 별도의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항체들은 특정 항원의 인식에 특이적이다.
상기 용해성 융합 단백질 복합체의 몇몇 실시태양에서, 상기 항체는 단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv이다. 몇몇 실시태양에서 상기 단일 쇄 항체는 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 면역글로불린 중쇄 가변 도메인에 공유 결합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 제 1 생물 활성 폴리펩타이드는 항체 중쇄 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함하고 상기 제 2 생물 활성 폴리펩타이드는 항체 경쇄 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함한다.
본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체의 몇몇 실시태양에서, 상기 IL-15 폴리펩타이드는 고유 IL-15 폴리펩타이드와 상이한 아미노산 서열을 갖는 IL-15 변체이다. 상기 인간 IL-15 폴리펩타이드를 본 발명에서 huIL-15, hIL-15, huIL15, hIL15라 칭하며, IL-15 야생형(wt) 등 및 그의 변체는 고유 아미노산, 성숙한 서열 중 그의 위치 및 변형 아미노산을 사용하는데 지칭된다. 예를 들어, huIL15N72D는 72번 위치의 N에서 D로의 치환을 포함하는 인간 IL-15를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 IL-15 변체는, 예를 들어 고유 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15RβγC 수용체에 대해 증가된 결합 활성에 의해 입증되는 바와 같이 IL-15 작용물질로서 작용한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 IL-15 변체는, 예를 들어 고유 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15RβγC 수용체에 대해 감소된 결합 활성에 의해 입증되는 바와 같이 IL-15 길항물질로서 작용한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 IL-15 변체는 고유 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15RβγC 수용체에 대해 증가된 결합 친화성 또는 감소된 결합 활성을 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 상기 IL-15 변체의 서열은 고유 IL-15 서열에 비해 하나 이상(즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)의 아미노산 변화를 갖는다. 상기 아미노산 변화는 IL-15Rβ 및/또는 IL-15RγC와 상호작용하는 IL15의 도메인 중 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 아미노산 변화는 성숙한 인간 IL-15 서열(서열번호 1)의 6, 61, 65, 72, 92, 101, 108, 또는 111 번 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실이다. 예를 들어, 상기 아미노산 변화는 성숙한 인간 IL-15 서열의 8 번 위치에서 D에서 N 또는 A, 61 번 위치에서 D에서 A, 65 번 위치에서 N에서 A, 72 번 위치에서 N에서 R 또는 108 번 위치에서 Q에서 A로의 치환 또는 이들 치환의 임의의 조합이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 아미노산 변화는 성숙한 인간 IL-15 서열의 72 번 위치에서 N에서 D로의 치환이다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 상기 용해성 융합 단백질 복합체에서, Fc 도메인 또는 그의 작용 단편은 IgG Fc 도메인, 인간 IgG1 Fc 도메인, 인간 IgG2 Fc 도메인, 인간 IgG3 Fc 도메인, 인간 IgG4 Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgG Fc 도메인, IgE Fc 도메인 및 IgM Fc 도메인으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 Fc 도메인; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 변경된 보체 또는 Fc 수용체 결합 성질을 갖는 Fc 도메인을 생성시키는 아미노산 변화를 포함한다. 변경된 보체 또는 Fc 수용체 결합 성질을 갖는 Fc 도메인을 생성시키는 아미노산 변화는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 IgG1 CH2(항체 공통 서열에 근거한 넘버링)의 234 및 235 번 위치의 류신 잔기(즉 ...PE LL GG...)의 알라닌 잔기(즉 ...PE AA GG...)에 의한 치환은 Fc 감마 수용체의 상실을 생성시키는 반면 IgG1 CH2(항체 공통 서열에 근거한 넘버링)의 322 번 위치의 리신 잔기(즉 ...KC K SL...)의 알라닌 잔기(즉 ...KC A SL...)에 의한 치환은 보체 활성화의 상실을 생성시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기와 같은 돌연변이들을 합할 수 있다.
상기 용해성 융합 단백질 복합체의 몇몇 실시태양에서, 상기 제 1 생물 활성 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 IL-15 폴리펩타이드(또는 그의 작용 단편)에 공유 결합된다. 상기 용해성 융합 단백질 복합체의 몇몇 실시태양에서, 상기 제 2 생물 활성 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 IL-15Rα 폴리펩타이드(또는 그의 작용 단편)에 공유 결합된다. 상기 용해성 융합 단백질 복합체의 몇몇 실시태양에서, 상기 IL-15Rα 폴리펩타이드(또는 그의 작용 단편)는 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 Fc 도메인(또는 그의 작용 단편)에 공유 결합된다. 각각의 폴리펩타이드 링커 서열은 독립적으로 선택될 수 있다. 몇몇 실시태양에서 상기 폴리펩타이드 링커 서열들은 동일하다. 몇몇 실시태양에서, 이들은 상이하다.
몇몇 실시태양에서, 상기 TCR 도메인에 대한 항원은 MHC 또는 HLA 분자 중에 존재하는 펩타이드 항원을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 펩타이드 항원은 종양 관련된 폴리펩타이드 또는 바이러스 암호화된 폴리펩타이드로부터 유래한다(즉 적어도 이들 폴리펩타이드의 부분 서열을 포함한다). 몇몇 실시태양에서, 상기 항체 도메인에 대한 항원은 세포 표면 수용체 또는 리간드를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 항체 도메인에 대한 항원은 CD 항원, 사이토킨 또는 케모킨 수용체 또는 리간드, 성장 인자 수용체 또는 리간드, 세포 부착 분자, MHC/MHC-유사 분자, Fc 수용체, 톨형 수용체, NK 수용체, TCR, BCR, 양성/음성 동시-자극 수용체 또는 리간드, 치사 수용체 또는 리간드, 종양 관련된 항원 및 바이러스 암호화된 항원 중 하나 이상이다.
상기 용해성 융합 단백질 복합체의 몇몇 실시태양에서, 상기 IL-15Rα 폴리펩타이드는 IL-15 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 IL-15 수용체 알파의 세포 외 도메인을 포함한다. 상기 용해성 인간 IL-15Rα 폴리펩타이드를 본 발명에서 hIL-15Rα, huIL-15Rα, hIL-15Rα, huIL-15Rα 등으로서 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 IL-15Rα 폴리펩타이드는 IL-15Rα 스시(Su) 도메인 및 IL-15RαΔE3 도메인 중 어느 하나를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체는 다량체화된다, 예를 들어 이량체화, 삼량체화 또는 달리 다량체화된다(예를 들어 4 복합체, 5 복합체 등). 몇몇 실시태양에서, 상기 다량체는 동종다량체이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 다량체는 이종다량체이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 용해성 융합 단백질 복합체는 공유 결합, 예를 들어 다이설파이드 결합, 화학적 가교결합제에 의해 결합된다. 몇몇 실시태양에서, 상기 다이설파이드 결합은 상기 제 1 용해성 융합 단백질 복합체의 제 2 폴리펩타이드의 Fc 도메인을 상기 제 2 용해성 융합 단백질 복합체의 제 2 폴리펩타이드의 Fc 도메인에 공유 결합시킨다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체는 IL-15 폴리펩타이드, IL-15 변체 또는 그의 작용 단편 및 용해성 IL-15Rα 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함하며, 여기에서 상기 IL-15 및 IL-15Rα 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 작용 단편을 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체는 검출 가능한 표지를 포함하는 상기 용해성 융합 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 검출 가능한 표지는 비제한적으로 비오틴, 스트렙트아비딘, 그의 효소 또는 촉매 활성 단편, 방사성핵종, 나노입자, 상자성 금속 이온, 또는 형광, 인광, 또는 화학발광 분자; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 융합 단백질들 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 핵산 서열은 하나 이상의 번역 및/또는 전사 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 번역 개시 신호 및 리더 서열을 추가로 포함하고; 상기 융합 단백질을 암호화하는 서열에 작동적으로 결합된다. 몇몇 실시태양에서, 상기 핵산 서열은 복제, 발현 또는 이들 모두를 위한 벡터 중에 있다.
본 발명은 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은
a) 제 1 숙주 세포에 제 1 융합 단백질을 암호화하는 적합한 조절 서열을 갖는 DNA 벡터를 도입시키고;
b) 상기 제 1 숙주 세포를 상기 세포 또는 배지에서 상기 제 1 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에 배양하고;
c) 상기 제 1 융합 단백질을 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 정제하고,
d) 제 2 숙주 세포에 제 2 융합 단백질을 암호화하는 적합한 조절 서열을 갖는 DNA 벡터를 도입시키고;
e) 상기 제 2 숙주 세포를 상기 세포 또는 배지에서 상기 제 2 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에 배양하고;
f) 상기 제 2 융합 단백질을 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 정제하고,
g) 상기 제 1 및 제 2 융합 단백질을 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인과 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인 간의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 혼합하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성시키는
단계들을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 제 1 및 제 2 융합 단백질을 상기 발현 벡터들로부터 발현된 폴리펩타이드들 간의 다이설파이드 결합의 형성을 허용하기에 충분한 조건 하에서 혼합함을 또한 포함한다.
본 발명은 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 숙주 세포에 제 1 융합 단백질을 암호화하는 적합한 조절 서열을 갖는 DNA 벡터 및 제 2 융합 단백질을 암호화하는 적합한 조절 서열을 갖는 DNA 벡터를 도입시키고;
b) 상기 숙주 세포를 상기 세포 또는 배지에서 상기 융합 단백질을 발현하고 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인과 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인 간의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에 배지에서 배양하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성시키고;
c) 상기 용해성 융합 단백질 복합체를 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 정제하는
단계들을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 제 1 및 제 2 융합 단백질을 상기 발현 벡터들로부터 발현된 폴리펩타이드들 간의 다이설파이드 결합의 형성을 허용하기에 충분한 조건 하에서 혼합함을 또한 포함한다.
본 발명은 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 숙주 세포에 제 1 및 제 2 융합 단백질을 암호화하는 적합한 조절 서열을 갖는 DNA 벡터를 도입시키고;
b) 상기 숙주 세포를 상기 세포 또는 배지에서 상기 융합 단백질을 발현하고 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인과 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인 간의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에 배지에서 배양하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성시키고, 제 46 항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드들 간의 다이설파이드 결합의 형성을 허용하고;
c) 상기 용해성 융합 단백질 복합체를 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 정제하는
단계들을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 제 1 및 제 2 융합 단백질을 상기 발현 벡터들로부터 발현된 폴리펩타이드들 간의 다이설파이드 결합의 형성을 허용하기에 충분한 조건 하에서 혼합함을 또한 포함한다.
본 발명은 표적 세포의 살해 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 다수의 세포를 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체와 접촉시키고, 여기에서 상기 다수의 세포가 IL-15 도메인에 의해 인식되는 IL-15R 쇄를 갖는 면역 세포, 또는 Fc 도메인에 의해 인식되는 Fc 수용체 쇄를 갖는 면역 세포, 및 생물 활성 폴리펩타이드들 중 하나 이상에 의해 인식되는 항원을 갖는 표적 세포를 또한 포함하고,
b) 상기 면역 세포와 결합하여 이를 활성화하기에 충분한, 상기 표적 세포 상의 항원과 상기 면역 세포 상의 IL-15R 또는 Fc 수용체 쇄간의 특이적인 결합 복합체(가교)를 형성시키고;
c) 상기 표적 세포를 상기 결합된 활성화된 면역 세포에 의해 살해하는
단계들을 포함한다.
상기 살해 방법의 몇몇 실시태양에서, 상기 표적 세포는 종양 세포 또는 바이러스 감염된 세포이다.
상기 살해 방법의 몇몇 실시태양에서, 상기 생물 활성 폴리펩타이드는 TCR을 포함한다.
상기 살해 방법의 몇몇 실시태양에서, 상기 표적 세포 상의 항원은, MHC 또는 HLA 분자 중에 존재하고 TCR에 의해 인식되는 종양 또는 바이러스 암호화된 펩타이드 항원을 포함한다. 상기 면역 세포는 예를 들어 T-세포, LAK 세포, NK 세포, 대식세포, 단핵구 또는 과립구이다.
본 발명은 병든 세포가 질병 관련된 항원을 발현하는 환자에게서 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 상기 환자에게 질병-관련된 항원을 인식하는 생물 활성 폴리펩타이드를 갖는 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체를 투여하고;
b) 면역 세포를 국소화하기에 충분한, 항원-발현 병든 세포와 IL-15R 또는 Fc 수용체 발현 면역 세포 간의 특이적인 결합 복합체(가교)를 형성시키고;
c) 상기 환자에게서 상기 질병을 예방하거나 치료하기에 충분히 상기 병든 세포를 손상시키거나 살해하는
단계들을 포함한다.
본 발명은 병든 세포가 질병 관련된 항원을 발현하는 환자에게서 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) IL-15R 쇄 또는 Fc 수용체 쇄를 갖는 면역 세포를 질병-관련된 항원을 인식하는 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체와 혼합하고;
b) 상기 환자에게 상기 면역 세포-융합 단백질 복합체 혼합물을 투여하고;
c) 면역 세포를 국소화하기에 충분한, 항원-발현 병든 세포와 IL-15R 또는 Fc 수용체 발현 면역 세포 간의 특이적인 결합 복합체(가교)를 형성시키고;
d) 상기 환자에게서 상기 질병을 예방하거나 치료하기에 충분히 상기 병든 세포를 손상시키거나 살해하는
단계들을 포함한다.
병든 세포가 질병 관련된 항원을 발현하는 환자에게서 질병을 예방하거나 치료하기 위한 방법의 몇몇 실시태양에서, 상기 질병은 암 또는 바이러스 감염이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 질병 관련된 항원은 펩타이드/MHC 복합체이다.
본 발명은 포유동물에게 유효량의 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체를 투여함으로써 상기 포유동물에게서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
본 발명은 포유동물에게 유효량의 본 발명의 임의의 하나의 용해성 융합 단백질 복합체를 투여함으로써 상기 포유동물에게서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포 또는 조직상에 존재하는 항원을 갖는 상기 세포 또는 조직의 검출 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 상기 세포 또는 조직을, 상기 항원과 본 발명의 하나 이상의 용해성 융합 단백질 복합체의 생물 활성 폴리펩타이드 간의 특이적인 결합 복합체를 형성하는 조건 하에서 검출 가능한 표지를 포함하는 상기 용해성 융합 단백질 복합체와 접촉시키고,
b) 상기 세포 또는 조직을 상기 항원에 결합하지 않은 임의의 용해성 융합 단백질 복합체를 제거하기에 적합한 조건 하에서 세척하고;
c) 상기 특이적인 결합 복합체를 상기 항원을 포함하는 세포 또는 조직을 가리키는 것으로서 검출하는
단계들을 포함한다.
상기 검출 방법의 몇몇 실시태양에서, 상기 생물 활성 폴리펩타이드는 TCR을 포함하고 상기 항원은 상기 TCR에 의해 인식되는 MHC 또는 HLA 분자 중에 존재하는 펩타이드 항원을 포함한다. 본 발명에서 제공된 상기 검출 방법은 고도로 민감하다. 예를 들어, 상기 방법에서, 상기 존재하는 항원의 사본수는 세포당 1000 개 이하이다. 본 발명에서 제공된 검출 방법을 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 실행할 수 있다.
본 발명은 제 1 용해성 융합 단백질 복합체 및 제 2 용해성 융합 단백질 복합체의 이량체를 형성시킴으로써 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체의 분자당 결합 활성을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 각각의 융합 단백질 복합체의 제 1 생물 활성 폴리펩타이드와 제 2 생물 활성 펩타이드의 결합 부위는 동일하거나 상이하다. 몇몇 실시태양에서, 상기 분자당 결합 활성을 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상까지 증가시킨다.
본 발명은 또한 제 1 용해성 융합 단백질 복합체와 제 2 용해성 융합 단백질 복합체의 이량체를 형성시킴으로써 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체의 분자당 IL-15 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 인터류킨-15(IL-15):인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 융합 단백질 복합체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 숙주 세포(예를 들어 포유동물 세포)에 IL-15(또는 IL-15 변체)를 암호화하는 제 1 DNA 벡터 및 IL-15Rα 융합 단백질을 암호화하는 제 2 DNA 벡터를 도입시키고; 상기 숙주 세포를 상기 IL-15(또는 IL-15 변체) 및 IL-15Rα 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에서 배지에서 배양하고; 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15:IL-15Rα 융합 단백질 복합체를 정제함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 함유하는 IL-15:IL-15Rα 복합체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 숙주 세포에 IL-15(또는 IL-15 변체)를 암호화하는 제 1 DNA 및 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 암호화하는 제 2 DNA를 도입시키고; 상기 숙주 세포를 상기 IL-15(또는 IL-15 변체) 및 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에서 배지에서 배양하고; 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15:IL-15Rα/Fc 복합체를 정제함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 함유하는 IL-15:IL-15Rα 융합 단백질 복합체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 숙주 세포에서 IL-15(또는 IL-15 변체) 및 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 동시-발현시키고; 상기 숙주 세포를 상기 IL-15(또는 IL-15 변체) 및 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에서 배지에서 배양하고; 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15:IL-15Rα/Fc 융합 단백질 복합체를 정제함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 숙주 세포에서 IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질을 동시-발현시키고; 상기 숙주 세포를 상기 IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에서 배지에서 배양하고; 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체를 정제함을 포함하며, 이때 IL-15N72D:IL15RαSu/Fc 복합체의 IL-15 결합 부위는 모두 완전히 점유된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 IL-15 또는 IL-15 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 IL-15 수용체 융합 단백질을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 세포를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포는 IL-15N72D를 암호화하는 제 1 발현 벡터 및 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질을 암호화하는 제 2 발현 벡터를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 이량체성 IL-15RαSu/Fc 및 2 개의 IL-15N72D 분자를 함유하는 단리된 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 복합체는 90 내지 95% 이상 정제되고 완전히 점유되며; 5.6 내지 6.5의 등전점을 갖고; 약 114 kDa의 분자량을 갖고/갖거나; IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc 폴리펩타이드 중 어느 하나 또는 둘 다 상에서 글리코실화된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 임의의 발현 및 정제 방법에 따라 생성된 단리된 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 면역 반응을 조절(예를 들어 증가 또는 감소)하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체를 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서 본 발명은 종양이 있는 환자에게서 면역 반응을 증대시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체를 투여함을 포함한다.
본 발명에 기술된 본 발명의 상기 태양들 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 상기 IL-15Rα 융합 단백질은 생물 활성 폴리펩타이드(예를 들어 IgG의 중쇄 불변 도메인, IgG의 중쇄 불변 도메인의 Fc 도메인)에 공유 결합된 용해성 IL-15Rα를 포함한다. 상기 태양의 본 발명의 다른 실시태양에서, IL-15는 제 2 생물 활성 폴리펩타이드에 공유 결합된 IL-15를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15:IL-15Rα 복합체의 정제는 상기 IL-15:IL-15Rα 융합 단백질 복합체와 특이적으로 결합하는 친화성 시약 상에 상기 IL-15:IL-15Rα 복합체를 포획함을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 IL-15Rα 융합 단백질은 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 함유하며, 상기 친화성 시약은 상기 Fc 도메인과 특이적으로 결합한다. 다른 실시태양에서, 상기 친화성 시약은 단백질 A 또는 단백질 G이다. 다른 실시태양에서, 상기 친화성 시약은 항체이다. 다른 실시태양에서, 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15:IL-15Rα 복합체를 정제함은 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15:IL-15Rα 복합체를 정제함은 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 IL-15Rα는 IL-15Rα스시(IL-15RαSu)를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 IL-15는 변형 IL-15(예를 들어 IL-15N72D)이다. 다른 실시태양에서, 상기 IL-15:IL-15Rα 복합체의 IL-15 결합 부위는 완전히 점유된다. 다른 실시태양에서, 상기 IL-15:IL-15RαSu/Fc 복합체의 IL-15 결합 부위는 모두 완전히 점유된다. 다른 실시태양에서, 상기 IL-15:IL-15Rα 복합체를 상기 복합체 전하 또는 크기 성질을 근거로 정제한다. 다른 실시태양에서, 상기 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체는 상기 복합체 전하 성질을 근거로 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 다른 실시태양에서, 상기 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체는 저 이온 강도 중성 pH 완충제를 사용하는 결합 조건 및 증가하는 이온 강도의 완충제를 사용하는 용출 조건과 함께 4급 아민 기재 수지를 사용하여 정제된다.
본 발명은 또한 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체들 중 하나 이상, 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체의 제조를 위한 하나 이상의 특정한 시약(예를 들어 본 발명의 하나 이상의 용해성 융합 단백질 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드), 및/또는 본 발명의 하나 이상의 용해성 융합 단백질 복합체를 사용하기 위한 특정한 물질을 포함하는 키트를 포함한다. 키트 중 물질들을, 전형적으로는 사용 설명서와 함께 적합한 포장으로 제공한다.
다른 실시태양들은 하기 명세로부터 분명할 것이다.
본 발명에 따른 상기 효과기 분자의 본 발명의 융합 단백질 복합체에의 공유 결합은 다수의 중요한 이점들을 제공한다. 공지된 구조의 상기와 같은 펩타이드를 포함하는, 단일 효과기 분자를 함유하는 본 발명의 융합 단백질 복합체를 생성시킬 수 있다. 또한, 광범위하게 다양한 효과기 분자를 유사한 DNA 벡터에서 생성시킬 수 있다. 즉, 상이한 효과기 분자의 라이브러리를, 감염되거나 병든 세포의 인식을 위해 상기 융합 단백질 복합체에 결합시킬 수 있다. 더욱이, 치료 용도를 위해서, 환자에게 본 발명의 융합 단백질 복합체의 투여보다는 상기 융합 단백질 복합체를 암호화하는 DNA 발현 벡터를 상기 융합 단백질 복합체의 생체 내 발현을 위해 투여할 수 있다. 상기와 같은 접근법은 재조합 단백질의 제조와 전형적으로 관련된 비용이 많이 드는 정제 단계를 피하고 통상적인 접근법과 관련된 항원 흡수 및 처리의 복잡성을 피한다.
나타낸 바와 같이, 본 발명에 개시된 융합 단백질의 성분, 예를 들어 효과기 분자, 예를 들어 사이토킨, 케모킨, 성장 인자, 단백질 독소, 면역글로불린 도메인 또는 다른 생물활성 분자 및 임의의 펩타이드 링커를, 상기 융합 단백질이 상기가 의도하는 작용을 갖는 한, 거의 모든 방식으로 구성할 수 있다. 특히, 상기 융합 단백질의 각각의 성분을, 목적하는 경우, 하나 이상의 적합한 펩타이드 링커 서열에 의해 또 다른 성분으로부터 이격시킬 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질은, 예를 들어 상기 융합 단백질의 변형, 확인 및/또는 정제를 촉진하기 위해 태그를 포함할 수도 있다.
도 1은 다중 쇄 폴리펩타이드로 이루어지는 T2 분자(T2M)라 지칭되는 융합 단백질을 도시한다.
도 2는 정확한 인간 IL-15Rα스시 유전자 삽입물을 함유하는 벡터(pMC.c264scTCR-Su/IgG1.PUR)를 도시한다.
도 3은 상기 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 핵산 서열의 서열을 도시한다.
도 4는 상기 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 펩타이드의 단백질 서열을 도시한다.
도 5는 c264scTCR/스시/hIgG1-pMSGVc 또는 pMSGVc264SuIgfhtj 표시하는 벡터를 도시한다.
도 6은 상기 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 핵산 서열의 서열을 도시한다.
도 7은 상기 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 펩타이드의 단백질 서열을 도시한다.
도 8은 c149scTCR/IL15N72D-pMSGVn 또는 pMSGV-c149IL15N72D로서 표시하는 벡터를 도시한다.
도 9는 상기 c149scTCR/huIL15N72D 핵산 서열의 서열을 도시한다.
도 10은 상기 c149scTCR/huIL15N72D 펩타이드의 단백질 서열을 도시한다.
도 11은 환원 및 비-환원 조건 하에서 상기 T2, c264scTCR/huIgG1 및 c264scTCR/huIgG1ΔCH1 융합 단백질의 정제 분획들의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 환원 조건 하에서, 상기 T2 분자 밴드는 상기 c264scTCR/huIL15 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 폴리펩타이드와 일치하는 분자량에서 이동한다. 비-환원 변성 조건 하에서, 상기 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 밴드는 이량체성 다이설파이드-결합된 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 복합체 및 c264scTCR/huIL15N72D 폴리펩타이드와 일치하는 분자량에서 이동한다.
도 12는 고유 T2 단백질이 4-쇄(2 x c264scTCR/IL15N72D, 2 x c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1) 분자의 예상 분자량에서 용출됨을 입증하는 크기 배제 젤 여과 크로마토그래피로부터의 결과를 도시한다.
도 13은 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성된 동몰량의 정제된 T2 단백질, 또는 정제된 c264scTCR/huIgG1 융합 단백질을 항-인간 IgG1 항체로 코팅된 웰 상에 포획하는 시험관 내 결합 분석으로부터의 결과를 도시한다. 결합에 이어서, 표준 ELISA 조건 하에서 항-인간 IgG1 항체를 사용하여 단백질을 검출하였다.
도 14는 동몰량의 T2 또는 c264scTCR/huIgG1 단백질을 항-인간 IgG1 Ab 코팅된 웰 상에 포획하고 항-인간 TCR Cβ 항체(W4F)로 검출하는 시험관 내 결합 분석으로부터의 결과를 도시한다.
도 15는 상기 T2 분자의 TCR 도메인의 펩타이드/MHC 결합 활성을 평가하는 시험관 내 결합 분석으로부터의 결과를 도시한다. 동몰량의 T2(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨) 또는 c264scTCR/huIgG1 단백질을 항-인간 IgG1 Ab 코팅된 웰 상에 포획하고 p53(aa 264-272) 펩타이드/HLA-A2 스트렙트아비딘-HRP 사량체로 검출하였다.
도 16은 상기 T2 분자의 IL-15 도메인의 활성을 입증하는 시험관 내 분석으로부터의 결과를 도시한다. 미세적정 웰을 항-인간 IL-15 항체로 코팅하고 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성된 동몰량의 정제된 T2 단백질, 또는 정제된 c264scTCR/huIL15N72D 융합 단백질을 상기 웰에 적용하였다. 결합 및 세척 단계에 이어서, 상기 결합된 단백질들을 표준 ELISA 조건 하에서 항-인간 IL-15 항체로 검출하였다.
도 17은 사이토킨-의존성 32Dβ 세포주를 사용하여 상기 T2 분자의 IL-15 도메인의 작용 활성을 추가로 특성화하는 증식 분석으로부터의 결과를 도시한다. 세포 증식을 측정하기 위해서, 32Dβ 세포(2 x 104 세포/웰)를 37 ℃에서 48 시간 동안 증가하는 농도의 T2 단백질(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨), 또는 c264scTCR/huIL15N72D 융합 단백질과 함께 배양하였다. 세포 증식 시약 WST-1(로슈(Roche)(등록상표) 어플라이드 사이언스(Applied Science))를 제조사의 과정에 따라 세포 생육의 최종 4 시간 동안 첨가하였다. 대사 활성 세포에 의한 WST-1의 착색된 포르마잔 염료로의 전환을 440 ㎚에서 흡광도 측정을 통해 측정하였다.
도 18A-B는 IL-15 반응성 면역 세포의 증식을 촉진하는 상기 T2 단백질의 능력을 측정하기 위한 생체 내 영장류 모델로부터의 결과를 도시한다. 혈액을 T2 단백질 주사 후 5일째에 채혈하고 CD8 기억 T 세포 마커(CD8 및 CD95)(A) 및 NK 세포 마커(CD56 및 CD16)(B)를 염색하고 처리 전 채혈한 혈액과 비교하였다.
도 19A-B는 상기 T2 분자의 IgG1 Fc 도메인의 결합 활성을 특성화하는 세포 결합 분석을 도시한다. A. Fc-감마 수용체 함유 U937 세포를 33 nM의 T2 단백질(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨), c264scTCR/huIgG1 또는 A2AL9scTCR/IgG1(음성 대조군)과 함께 20 분간 배양하는 분석으로부터의 결과를 나타내는 유식 세포측정 분석. 세포를 1 회 세척하고 20 분간 PE-접합된 p53(aa 264-272) 펩타이드/HLA-A2 사량체와 함께 배양하였다. U937 세포 표면상의 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 유식 세포측정에 의해 분석하였다. B. 지시된 바와 같은 일련의 단백질 농도를 사용하는 유사한 U937 결합 연구로부터의 결과를 나타내는 유식 세포측정 분석을 수행하였으며 상기 염색된 세포의 평균 형광 강도를 플롯팅하였다.
도 20은 항체 의존성 세포 세포독성 활성을 매개하는 상기 T2 분자의 Fc 도메인의 생물 활성을 평가하는 분석으로부터의 결과를 도시한다. T2 단백질, c264scTCR/huIgG1 또는 A2AL9scTCR/IgG1(음성 대조군)을 0.137 nM 내지 100 nM의 농도로 96-웰 플레이트에 가하였다. HLA-A2-양성 T2 표적 세포를 10 μM의 p53 aa264-272 펩타이드로 펄스화하고 50 ㎍/㎖의 칼세인(Calcein)-AM으로 표지하였다. 상기 융합 단백질을 웰당 1 x 104의 표적 세포와 혼합하고 1 x 106/웰의 새로운 인간 PBMC를 가하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 CO2 배양기 중에서 2 시간 동안 배양하고 100 ㎕의 조건 배지를 수거하고 용해된 세포로부터 방출된 칼세인에 대해 정량 분석하였다.
도 21A 및 B는 HLA-A2-양성 T2 세포를 다양한 양의 p53 aa264-272 펩타이드로 펄스화하여 세포 표면상의 펩타이드/MHC 표적에 대한 T2 단백질의 결합 활성을 평가하는 분석으로부터의 결과를 도시한다. 상기 펩타이드-로딩된 세포를 T2 단백질(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨), c264scTCR/huIgG1 또는 A2AL9scTCR/IgG1(음성 대조군)(각각 83 nM에서)와 함께 배양하였다. 상기 세포를 비오틴화된 항-TCR Ab(BF1) 및 스트렙트아비딘-PE와 함께 배양하였다. 이어서 상기 세포를 A에 대해 유식 세포측정에 의해 항체 염색에 대해 분석하고 상이한 농도의 펩타이드 로딩된 세포의 평균 형광 염색 강도를 B에 대해 플롯팅한다.
도 22는 c149scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 또는 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1의 T2 분자(세포 배양 상등액 중의)를 항-인간 TCR 항체 BF1으로 코팅된 미세적정 플레이트 상에서 포획하는 ELISA로부터의 결과를 도시하며, 상기 결합된 T2 분자를 상기 항-인간 TCR 항체 W4F-BN을 사용하여 검출하였다.
도 23은 c149scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 또는 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1의 T2 분자(세포 배양 상등액 중의)를 염소 항-인간 IgG 항체로 코팅된 미세적정 플레이트 상에서 포획하는 ELISA로부터의 결과를 도시하며, 상기 결합된 T2 분자를 상기 항-인간 IL-15 항체를 사용하여 검출하였다.
도 24는 c149scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1의 T2 분자(세포 배양 상등액 중의)를 염소 항-인간 IgG 항체 또는 항-인간 TCR 항체 BF1으로 코팅된 미세적정 플레이트 상에서 포획하는 ELISA로부터의 결과를 도시한다. 상기 BF1-포회된 T2 분자를 항-인간 TCR 항체 W4F-BN 또는 항-인간 IL-15 항체를 사용하여 검출하였다. 상기 염소 항-인간 IgG Ab-포획된 T2 분자를 p53(aa 149-157) 펩타이드/HLA-A2 스트렙트아비딘-HRP 사량체 또는 p53(aa 264-272) 펩타이드/HLA-A2 스트렙트아비딘-HRP 사량체로 검출하였다.
도 25는 2 개의 상이한 TCR 도메인, 즉 c264scTCR/huIL15N72D 및 c149scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄를 포함하는 T2 분자를 특성화한 유식 세포 측정 분석으로부터의 결과를 도시한다. 이들 분자의 Fc 및 TCR 활성을 Fc-감마 수용체 함유 U937 세포에 대한 결합 및 p53(aa 264-272) 펩타이드/HLA-A2 사량체에 의한 검출에 이어서 유식 세포측정에 따라 평가하였다.
도 26A 및 B는 A. 마우스 또는 B. 원숭이에게 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성된 정제된 T2 단백질을 주사한 약동학 분석으로부터의 결과를 도시한다. 샘플들을 지시된 시간에서 수거하였다. A. 염소 항-인간 IgG Ab를 사용하여 상기 웰을 코팅하고, 항-인간 TCR Ab(W4F-BN)를 검출에 사용하거나; 또는 염소 항-인간 IgG Ab를 상기 플레이트의 코팅에 사용하고, 항-인간 IL-15 Ab를 지시된 바와 같이 검출에 사용하여 지시된 시간에서 혈액 중 상기 T2 단백질의 양을 정량분석하는 ELISA 포맷 분석. B. 항-인간 TCR Ab(βF-1)를 사용하여 상기 웰을 코팅하고, HRP 접합된 염소 항-인간 IgG Ab를 검출에 사용하거나; 또는 항-인간 IL-15 Ab를 상기 플레이트의 코팅에 사용하고, HRP 접합된 염소 항-인간 IgG Ab를 검출에 사용하거나; 또는 항-인간 IL-15 Ab를 상기 플레이트의 코팅에 사용하고 항-인간 TCR Ab(W4F-BN)를 검출에 사용하였다.
도 27은 누드 마우스에서 인간 p53+HLA-A2 + A375 흑색종 세포주를 사용하는 원발성 종양 성장 모델로부터의 결과를 도시한다. 종양-함유 마우스에게 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성된 T2 단백질 32 ㎍/용량(1.6 ㎎/㎏), c264scTCR/huIL2 32 ㎍/용량(1.6 ㎎/㎏) 또는 264scTCR/huIgG1 60 ㎍/용량(3 ㎎/㎏)을 정맥 내 주사하였다. 종양 성장을 측정하고 데이터를 도면에 나타낸다.
도 28은 32Dβ 세포의 증식에 의해 측정된 바와 같은 IL-15 도메인에서 다양한 점 돌연변이를 갖는 T2 분자의 IL-15 활성 분석으로부터의 결과를 도시한다.
도 29는 펩타이드-로딩된 T2 표적 세포의 PBMC-의존성 용해에 의해 측정된 바와 같은 IL-15 및 IgG Fc 도메인에서 다양한 점 돌연변이를 갖는 T2 분자를 사용하는 항체 의존성 세포 세포독성 분석으로부터의 결과를 도시한다.
도 30은 인간 NK 및 T 세포 반응을 자극하는 상기 T2 분자의 능력에 대한 상기 IL-15 및 Fc 돌연변이의 영향을 검출하는 분석으로부터의 결과를 도시한다. 1.8 내지 5 x 105 세포/㎖의 인간 PBMC를 지시된 돌연변이를 포함하는 1 nM T2 분자 또는 대조용으로서 재조합 인간 IL-2 또는 IL-15 10 ng/㎖를 함유하는 배지에서 37 ℃에서 4일간 배양하였다. 이어서 NK 세포 세포독성을 50 ug/㎖의 칼세인-AM으로 표지 후에 표적 세포로서 NK-민감성 K-562 세포를 사용하여 평가하였다.
도 31은 인간 PBMC를 IL-15 및 IgG Fc 도메인에서 다양한 점 돌연변이를 포함하는 T2 분자와 함께 또는 대조용으로서 재조합 인간 IL-2 또는 IL-15와 함께 배양하였다. 상기 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄를 포함하는 T2 분자 또는 Fc 도메인 LALA 및 KA 변체를 갖는 T2 분자는 CD56+ NK 세포의 증식의 증가를 생성시킨 반면, IL-15 N65D 또는 D8N 치환을 포함하는 T2 분자는 NK 세포 증식 활성만큼 제공하지 못했다.
도 32 A 및 B는 로딩된 p53 펩타이드의 존재(T2.265) 및 부재(T2) 하에 T2 세포에 대한 IL-15 및 Fc 돌연변이를 포함하는 T2 분자의 항원 특이성 결합을 시험하기 위한 유식 세포측정 분석으로부터의 결과를 도시한다. A는 유식 세포측정 막대그래프를 도시하고 B는 펩타이드-특이성 대 비-특이성 세포 염색의 신호 대 소음 비를 도시한다.
도 33A 내지 C는 다양한 T2 분자 및 IL-15 분자의 활성을 검출하기 위한 분석으로부터의 결과를 도시한다. A. 32Dβ 세포 생육을 지지하는, B. 다양한 T 세포 집단의 확대를 자극하는, 및 C. NK 세포 활성을 자극하는 것에 대한 것이다.
도 34는 유식 세포측정을 사용하여 검출한 바와 같은 혈액 및 비장 세포에서 CD8+ T-세포 및 NK 세포의 백분율의 변화에 의해 지시되는 바와 같은 마우스에서 다양한 T2 분자의 면역자극 활성을 측정하기 위한 생체 내 분석으로부터의 결과를 도시한다.
도 35A 및 B는 1) 오브알부민의 아미노산 257-264로부터의 펩타이드에 특이적인 scTCR에 융합된 huIL15N72D 도메인 및 2) huIL15Rα스시/huIgG1 융합물에 결합된 단일 쇄 CD8α/β 도메인을 포함하는 다중 특이성 T2 분자를 사용하는 ELISA로부터의 결과를 도시한다. OT1-CD8-T2M의 결합 활성을 ELISA에 의해 OT1scTCR/huIL15N72D 융합물의 경우와 비교하였다. 동몰량의 각각의 단백질을 항-TCR Cβ mAb(H57)로 코팅하고 OVA aa257-264/H-2Kb 사량체 또는 IL15, CD8α, CD8β 또는 TCR Vα2에 대한 mAb로 탐침 처리한 웰 상에서 포획하였다. 분석을 또한 항-인간 Ig로 코팅하고 항-TCR Vα2로 탐침 처리한 웰을 사용하여 수행하였다.
도 36. A. 상기 c264scTCR/hIL-15:c264scTCR/hIL-15RαSu/birA 복합체(c264TCR 이량체)의 도식적인 다이어그램을 도시한다. 상기 이량체성 hIL-15:hIL-15RαSu 도메인의 모델은 인간 IL-15:IL-15Rα 복합체의 공개된 결정 구조를 기본으로 한다(33)(PDB 2Z3Q). B. c264scTCR 융합 단백질의 SEC 분석을 도시한다. 패널들은 c264scTCR/hIL-15(상부), c264scTCR/hIL-15RαSu/birA(중간), 및 c264scTCR/hIL-15:c264scTCR/hIL-15RαSu/birA 복합체(c264scTCR 이량체)(기부)의 크기 분석을 도시하며, 점선은 상대적인 단백질 피크들을 가리킨다.
도 37은 c264scTCR/hIL-15:c264scTCR/hIL-15RαSu/birA 복합체를 포함하는 c264scTCR 이량체 및 c149scTCR/hIL-15:c264scTCR/hIL-15RαSu/birA 복합체를 포함하는 c264scTCR/c149scTCR 이종이량체의 결합 활성의 특성화를 도시한다. A. T2 세포를 0 내지 62.5 nM의 p53(aa264-272) 펩타이드로 펄스화하였다. 상기 세포를 동량(80 nM)의 c264scTCR 이량체 또는 c264TCR/birA의 PE-접합된 다량체로 염색하였다. B. c264scTCR 이량체와 c264TCR/birA 시약을 비교하는 세포 염색에 있어서 상대적인 증가를 상이한 펩타이드 농도에서 측정하였다. 증가 배수 = (c264scTCR 이량체에 의해 염색된 T2 세포의 Geo 평균)/(c264TCR/birA에 의해 염색된 T2 세포의 Geo 평균). C. c264scTCR/c149TCR 이종이량체의 p53 펩타이드/HLA-A*0201 결합 활성을 ELISA에 의해 측정하였다. 항-hIL-15 단클론 항체(R&D 시스템)를 포획 항체로서 사용하였다. A2/p53.264-272.HRP 또는 A2/p53.149-157.HRP 사량체를 탐침으로서 사용하였다. 데이터는 3회 측정의 평균±SD를 나타낸다.
도 38은 OT1scTCR/hIL-15:OT1scTCR/hIL-15RαSu/birA 복합체를 포함하는 OT1scTCR 이량체의 결합 활성의 특성화를 도시한다. EL4 세포에 OVA(aa257-264) 펩타이드를 로딩하고 OT1scTCR/birA-SA-PE(상부) 및 OT1scTCR 이량체-SA-PE(기부)로 200 nM로 염색하였다.
도 39는 OT1scTCR/hIL-15:scCD8/hIL-15RαSu/birA 복합체를 포함하는 OTscTCR/scCD8 이종이량체가 증대된 pMHCI 결합 활성을 나타냄을 도시한다. A. OT1scTCR/scCD8 이종이량체의 쥐 CD8 발현을 ELISA에 의해 측정하였다. 항-mTCR H57-597 mAb를 포획 항체로서 사용하였다. 비오틴화된 항-쥐 CD8α 또는 CD8βmAb를 탐침으로서 사용한 다음 SA-HRP를 사용하였다. 데이터는 3 회 측정의 평균±SD를 나타낸다. B. EL4 세포에 지시된 농도의 OVA(aa257-264) 펩타이드를 로딩하고 OT1scTCR 이량체-SA-PE(상부) 및 OT1scTCR/scCD8 이종이량체-SA-PE(기부)로 200 nM로 염색하였다.
도 40은 TCRα/hIL-15:TCRβ/hIL-15RαSu/birA 복합체를 포함하는 TCRα/β 이종이량체를 함유하는 융합 단백질이 pMHCI 결합 활성을 유지함을 도시한다. A. OVA(aa257-264)/H-2Kb 복합체에 대한 OT1scTCR/birA 및 OT1TCRα/β 이종이량체의 결합 활성을 ELISA에 의해 측정하였다. 항-mTCR H57-597 mAb를 포획 항체로서 사용하였다. Kb/OVA.257-264.HRP 사량체를 탐침으로서 사용하였다. B. p53(aa264-272)/HLA-A*0201 복합체에 대한 264scTCR/birA 및 264 TCRα/β 이종이량체의 결합 활성을 ELISA에 의해 측정하였다. 항-TCR mAb를 포획 탐침으로서 사용하였다. A2/p53.264-272.HRP 사량체를 탐침으로서 사용하였다. 데이터는 3 회 측정의 평균±SD를 나타낸다.
도 41은 융합 단백질의 IL-15 결합 및 작용 활성을 도시한다. A. 32Dβ 세포를 320 nM의, IL-15 야생형 또는 IL-15N72D 또는 IL-15D8N 뮤테인 도메인을 포함하는 c264scTCR 이량체와 배양하였다. 차례로 상기 융합 단백질의 결합을 항-인간 TCR Cβ Ab로 검출하였다. B. 32Dβ 세포의 증식을 지지하는, IL-15 야생형 또는 뮤테인 도메인을 포함하는 c264scTCR 이량체의 능력을 실시예에 개시된 바와 같이 측정하였다. 데이터는 2 회 측정의 평균±범위를 나타낸다.
도 42는 ELISA에 의해 측정된 OT1scTCR/hIL-15D8N, OT1scTCR/hIL-15Rα/birA 및 OTIscTCR 이량체의 OVA(aa257-264)/H-2Kb 결합 활성을 도시한다. 항-mTCR H57-597 mAb를 포획 항체로서 사용하였다. Kb/OVA.257-264.HRP 사량체를 탐침으로서 사용하였다. 데이터는 3 회 측정의 평균±범위를 나타낸다.
도 43은 SPR에 의해 측정된 OVA(aa257-264)/H-2Kb 및 대조용 VSV/H-2Kb 복합체에 대한 OT1scTCR 융합 단백질 결합 곡선을 도시한다.
도 44A 및 B는 면역능력 마우스에서 쥐 B16 종양 세포주를 사용하는 원발성 종양 성장 모델로부터의 결과를 도시한다. 종양 함유 마우스에게 rhIL-15, T2M, T2MΔCH1 및 T2MΔTCRΔCH1 단백질 또는 PBS(대조용)를 정맥 내 주사하였다. 종양 성장을 측정하고 데이터를 A에 나타낸다. 처리 후 동물 체중의 변화를 B에 나타낸다.
도 45A 및 B는 면역능력 마우스에서 쥐 EG7 종양 세포주를 사용하는 원발성 종양 성장 모델로부터의 결과를 도시한다. 종양 함유 마우스에게 rhIL-15, T2M, 및 T2MΔTCRΔCH1 단백질 또는 PBS(대조용)를 정맥 내 주사하였다. 종양 성장을 측정하고 데이터를 A에 나타낸다. 처리 후 동물 체중의 변화를 B에 나타낸다.
도 46은 다른 단백질 도메인들과 공유적으로 및/또는 유전자에 의해 융합되어 융합 단백질 복합체를 생성시키는 인간 IgG1 CH2-CH3 도메인 또는 Fc 도메인의 단백질 서열을 도시한다.
도 47은 펩타이드 MHC 표적을 발현하는 세포에 대해 T2M 및 scTCR-huIgG1 단백질에 의해 매개된 항체 의존성 세포 세포독성 활성을 측정하는 분석의 결과를 도시한다. 다양한 양의 융합 단백질(T2M, T2M2 또는 c264scTCR-Ig)을 새로운 인간 PBMC 및 p53 펩타이드-펄스화된 HLA-A2-양성 T2 세포(칼세인 표지된)(E:T 비, 40:1)와 혼합하였다. 2 시간 배양 후, 상기 배양 배지를 수거하고 용해된 세포로부터 방출된 칼세인을 정량 분석하였다.
도 48은 마우스에서 다양한 T2 분자의 면역자극 활성을 측정하는 생체 내 분석으로부터의 결과를 도시한다. C57BL/6 마우스를 동몰의 IL-15 용량의 hIL-15(1 ㎎/㎏), IL15N72D:IL15Rα-Fc(3.6 ㎎/㎏), T2M(11 ㎎/㎏), T2M2(10 ㎎/㎏) 또는 동 부피의 PBS로 연구 1일째에 i.v. 처리하였다. 연구 4일째에, 상기 마우스를 죽이고 혈액 WBC 수 및 비장 중량을 패널 A에 도시된 바와 같이 측정하였다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC) CD8+ 및 NKp46+ 세포의 백분율 변화를 패널 B에 도시된 바와 같이 유식 세포측정에 의해 평가하였다. PBMC를 또한 패널 C에 나타낸 바와 같이 칼세인 방출 분석에서 NK-민감성 Yac-1 표적 세포의 용해에 근거한 NK 세포 활성 평가에 사용하였다.
도 49는 마우스에서 면역 활성에 대한 다양한 T2 분자의 용량 및 일시적인 반응을 측정하는 생체 내 분석으로부터의 결과를 도시한다. A. C57BL/6 마우스를 동몰의 IL-15 용량의 hIL-15(1 ㎎/㎏), IL15N72D:IL15Rα-Fc(4 ㎎/㎏), T2M(다양한 용량) 또는 동 부피의 PBS로 연구 1일째에 i.v. 처리하였다. 연구 4일째에, PBMC CD8+ 및 NKp46+ 세포의 백분율을 유식 세포측정에 의해 평가하였다. B. 누드 마우스를 연구 1일째의 IL15N72D/IL15Rα-Fc(0.2 ㎎/㎏), 또는 T2M2(2 ㎎/㎏)로 i.v. 처리하였다. 처리 후 4일 및 7일째에, PBMC NKp46+ 세포의 백분율을 유식 세포측정에 의해 평가하였다.
도 50은 누드 마우스에서 인간 p53+HLA-A2+A375 흑색종 세포주를 사용하는 원발성 종양 성장 모델로부터의 결과를 도시한다. A. A375 인간 흑색종 종양 세포(1 x 106)를 누드 마우스(5-6/그룹)에 s.c. 주사하였다. 종양을 확립시키고 마우스를 동몰 용량의 hIL-15(0.35 ㎎/㎏), scTCR-IL15 융합물(1.6 ㎎/㎏), scTCR-IL15/scTCR-IL15Rα 복합체(3.2 ㎎/㎏), 또는 PBS로 i.v. 처리하였다. 상기 마우스를 연구 11일째에 시작하여 3 주간 한 주에 3 회 처리하였다. B. A375 종양 함유 누드 마우스를 또한 A에서와 같이 T2M 4 ㎎/㎏으로 i.v. 처리하였다. C. A375 종양 함유 누드 마우스를 동 몰 용량의 IL-15(0.2 ㎎/㎏), T2M2(2 ㎎/㎏) 또는 PBS로 i.v.하였다. 종양을 이틀마다 측정하고 종양 부피(평균±SEM)를 플롯팅하였다.
도 51은 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 CH2-CH3(Fc) 구조물(또한 T2MΔTCRΔCH1 및 T2M2라 칭한다)의 핵산 서열을 도시한다.
도 52는 성숙한 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 CH2-CH3(Fc) 융합 단백질(또한 T2MΔTCRΔCH1 및 T2M2라 칭한다)의 단백질 서열을 도시한다.
도 53은 항-CD20 scAb/hIL-15N72D 구조물의 핵산 서열을 도시한다.
도 54는 성숙한 항-CD20 scAb/hIL-15N72D 융합 단백질의 단백질 서열을 도시한다.
도 55는 항-CD20 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc 구조물의 핵산 서열을 도시한다.
도 56은 성숙한 항-CD20 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc 융합 단백질의 단백질 서열을 도시한다.
도 57은 다우디(Daudi) 세포에 대한 항-CD20 scAb T2M 분자의 CD20 항원 특이성 결합을 시험하는 유식 세포측정 분석으로부터의 결과를 도시한다.
도 58은 CD20+ 인간 종양 세포에 대한 항-CD20 scAb T2M에 의해 매개되는 항체 의존성 세포 세포독성 활성을 측정하는 분석으로부터의 결과를 도시한다. 다양한 양의 융합 단백질(항-CD20 scAb T2M, c264scTCR T2M(음성 대조군) 또는 키메릭 항-CD20 mAb(양성 대조군))을 새로운 인간 PBMC(2 개의 상이한 공여자로부터) 및 다우디 세포(칼세인 표지된)(E:T 비, 100:1)와 혼합하였다. 배양 기간 후에, 상기 배양 배지를 수거하고 용해된 세포로부터 방출된 칼세인에 대해 정량 분석하였다.
도 59는 CD20+ 인간 종양 세포에 대한 항-CD20 scAb T2M에 의해 매개되는 항체 의존성 세포 세포독성 활성을 측정하는 분석의 결과를 도시한다. 융합 단백질(항-CD20 scAb T2M, c264scTCR T2M(음성 대조군) 또는 키메릭 항-CD20 mAb(양성 대조군))을 새로운 인간 PBMC(2 명의 상이한 공여자로부터) 및 다우디 세포(칼세인 표지된)(E:T 비, 100:1)와 혼합하였다. 배양 기간 후에, 상기 배양 배지를 수거하고 용해된 세포로부터 방출된 칼세인에 대해 정량 분석하였다.
도 60은 항-CD20 경쇄 V 도메인/인간 카파 불변 도메인/hIL-15N72D 구조물의 핵산 서열을 도시한다.
도 61은 성숙한 항-CD20 경쇄 V 도메인/인간 카파 불변 도메인/hIL-15N72D 융합 단백질의 단백질 서열을 도시한다.
도 62는 항-CD20 중쇄 V 도메인/인간 IgG1 CH1 도메인/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc 구조물의 핵산 서열을 도시한다.
도 63은 항-CD20 중쇄 V 도메인/인간 IgG1 CH1 도메인/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc 융합 단백질의 단백질 서열을 도시한다.
도 64는 상기 이량체성 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질과 비공유 결합된 IL-15N72D로 이루어진 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체의 도식적인 도면이다.
도 65(A-D)는 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 제제의 젤 전기영동 분석 프로파일의 사진이다. (A) IEF pH 3-10 젤 분석. 레인 1, IEF 마커. 레인 2, r단백질 A 컬럼에 의해 정제된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체. 레인 3, IL-15RαSu/Fc. 레인 4, IL-15wt. (B) IEF pH 3-10 젤 분석. 레인 1, IEF 마커. 레인 2, Q 단계 1 용출에 의해 정제된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체. 레인 3, Q 단계 2 용출에 의한 Q1c. 레인 4, Q 단계 2 용출에 의한 Q2c. (C) SDS-PAGE(환원된) 분석. 레인 1, MW 마커. 레인 2, r단백질 A 컬럼에 의해 정제된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체. 레인 3, Q 단계 2 용출에 의한 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc(Q2c). 레인 4, IL-15RαSu/Fc(Q 관통으로부터). (D) 단백질 탈글리코실화를 나타내는 SDS-PAGE(환원된) 분석. 레인 1, MW 마커, 레인 2 및 3은 각각 N-글리코시다제 F 절단된 및 비절단된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 단백질을 나타낸다. 레인 4, IL-15wt.
도 66은 수퍼덱스(Superdex) 200 HR 10/30 젤 여과 컬럼을 사용하는 SEC 크로마토그램의 그래프이다. 정제된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체가 단일 피크로서 용출된다.
도 67은 CD-1 마우스에서 정맥 내 투여에 따른 IL-15wt 및 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체의 약동학 프로파일의 비교를 나타내는 그래프이다. 항-IL-15 Ab ELISA는 IL-15wt의 농도(■)를 측정한다. 항-IL-15 Ab ELISA는 완전한 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 분자의 농도(△)를 측정하는 반면, 항-인간 IgG Fc Ab ELISA는 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질의 혈청 농도(▼)를 측정한다. 관찰된 농도들은 기호에 의해 나타내며 모델-맞춤 곡선은 선으로 나타낸다.
도 68은 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc와 시험관 내 조립된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc IVA)의 생물 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 32Dβ 세포를 4 시간 동안 WST-1의 첨가 전에 72 시간 동안 증가하는 농도의 시험관 내 조립된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc(■) 또는 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc(□)와 함께 배양하였다. 세포 증식을 440 ㎚에서의 흡광도 판독에 의해 정량분석하여 포르마잔 수준을 평가하였다. 나타낸 데이터 점들은 3 중 샘플의 평균(±표준 오차)이었으며 선들은 EC50 측정을 위한 S자 용량-반응 곡선 맞춤을 나타낸다.
도 69는 비장 중량 및 백혈구 수준에 대한 IL-15W 및 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체의 영향을 나타내는 그래프 세트이다. C57BL/6 마우스(그룹당 5 마리 마우스)에게 단일 용량의 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 복합체 1 ㎎/㎏, IL-15wt 0.28 ㎎/㎏(동 당량 용량), 또는 음성 대조용으로서 PBS를 정맥 내 주사하였다. 비장 중량(좌측 패널) 및 혈중 백혈구 수(우측 패널)를 주사 후 4일째에 측정하였다. 막대는 평균±표준 오차(n=5)를 나타낸다. *P > 0.05를 PBS 및 IL-15wt에 비교하였다. 결과는 2 회 이상의 실험을 나타낸다.
도 70은 마우스 림프구에 대한 IL-15wt 및 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체의 영향을 나타내는 그래프 세트이다. C57BL/6 마우스(그룹당 5 마리 마우스)에게 단일 용량의 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 복합체 1 ㎎/㎏, IL-15wt 0.28 ㎎/㎏(동 당량 용량), 또는 음성 대조용으로서 PBS를 정맥 내 주사하였다. B 세포(CD19), CD4 T 세포(CD4), NK 세포(NKp46) 및 CD8 T 세포(CD8)의 백분율을 비장세포(좌측 패널: 평균±표준 오차(n=5)) 및 PBMC(우측 패널: 채혈한 혈액 중 수준(n=5))를 주사 후 4일째에 측정하였다. *P > 0.05를 PBS에 비교하고, **P>0.05를 IL-15wt에 비교하였다. 결과는 2 회 이상의 실험을 나타낸다.
정의
하기의 정의들을 하기 작성된 명세서에 사용되는 특정한 용어들에 대해 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "포함하는"이란 용어는 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 요소들을 제외하는 것은 아님을 의미하고자 한다. "로 필수적으로 이루어지는"은 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때, 상기 조합에 대한 임의의 본질적으로 중요한 다른 요소들을 제외함을 의미할 것이다. 따라서, 본 발명에 정의된 바와 같은 요소들로 필수적으로 이루어지는 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 잔류 오염물질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어 포스페이트 완충된 염수, 보존제 등은 제외하지 않을 것이다. "로 이루어지는"은 잔류 초과의 다른 성분들의 요소 및 본 발명의 조성물의 실질적인 투여 방법 단계는 제외함을 의미할 것이다. 이러한 변이 용어들 각각에 의해 한정되는 실시태양들은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "IL-15:IL-15Rα 융합 단백질 복합체"란 용어는 생물 활성 폴리펩타이드에 공유 결합된 용해성 IL-15Rα의 IL-15Rα 도메인에 비공유 결합된 IL-15를 갖는 복합체이다. 상기 IL-15는 IL-15 또는 제 2 생물 활성 폴리펩타이드에 공유 결합된 IL-15일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "동시-발현된"이란 용어는 2 개의 폴리펩타이드가 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지에서 상호작용하거나 결합하여 복합체를 형성할 수 있도록 상기 숙주 세포에서 동시에 발현됨을 의미하고자 한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "친화성 시약"이란 용어는 또 다른 분자에 특이적으로 결합하는 임의의 조성물을 의미하고자 한다. 친화성 시약의 예는 다클론 항체, 단클론 항체, 단백질 A 및 단백질 G를 포함한다.
"항체"는 특이적인 에피토프에 결합하는, 항체 및 그의 단편을 포함한 임의의 면역글로불린이다. 상기 용어는 다클론, 단클론, 키메릭, Fab, Fvs, 단일-쇄 항체 및 단일 또는 다중 면역글로불린 가변 쇄 또는 CDR 도메인 디자인뿐만 아니라 이중특이성 및 다중특이성 항체를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "항원"이란 용어는 면역 시스템이 항체 또는 그에 대한 특이적인 세포-매개된 면역 반응을 생성시키도록 하는 임의의 물질을 의미한다. 질병 관련된 항원은 상기 면역 시스템이 항체 또는 그에 대한 특이적인 세포-매개된 반응을 생성시키도록 하는 임의의 질병과 관련된 임의의 물질이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "생물 활성 폴리펩타이드"란 용어는 본 발명에 논의된 바와 같은 목적하는 효과를 생성시킬 수 있는 아미노산 서열, 예를 들어 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드; 당 또는 폴라사카라이드; 지질 또는 당지질, 당단백질, 또는 지단백질, 예를 들어 항원 결합 활성을 갖는 TCR 또는 항체, CD8을 포함하는 CD 분자 또는 Fc 도메인을 포함하는 항체 도메인을 지칭함을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "세포"란 용어는 조직 또는 기관 중의 임의의 원핵생물, 진핵생물, 1차 세포 또는 불멸화된 세포 주, 상기와 같은 세포의 임의의 그룹을 포함함을 의미한다. 바람직하게는 상기 세포는 포유동물 및 특히 인간 기원의 것이며, 하나 이상의 병원체에 의해 감염될 수 있다. 본 발명에 따라 "숙주 세포"는 임의의 기원의 형질감염되거나, 형질전환되거나, 형질도입되거나 또는 감염된 세포, 예를 들어 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 조류, 곤충, 식물 또는 세균 세포이거나, 또는 본 발명에 개시된 핵산을 전파하는데 사용될 수 있는 임의의 기원의 세포일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "접합체 분자"란 용어는 TCR 또는 항체 분자 및 효과기 분자, 대개는 화학적 또는 다른 적합한 방법에 의해 공유 결합된(즉 융합된) 화학적 또는 합성된 분자를 지칭함을 의미한다. 경우에 따라, 상기 접합체 분자를 펩타이드 링커 서열 또는 담체 분자를 통해 하나 또는 다수의 부위에서 융합시킬 수 있다. 한편으로, 상기 펩타이드 링커 또는 담체를 사용하여 상기 접합체 분자의 구성을 지원할 수 있다. 특히 바람직한 접합체 분자는 접합체 독소 또는 검출 가능한 표지이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "효과기 분자"란 용어는 본 발명에 논의된 바와 같은 목적하는 효과를 생성시킬 수 있는 아미노산 서열, 예를 들어 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드; 당 또는 폴라사카라이드; 지질 또는 당지질, 당단백질, 지단백질, 또는 화학적 작용제, 예를 들어 IL-15 도메인, IL-15 변체 또는 IL-15 수용체, 예를 들어 IL-15R-알파, IL-15RαSu, IL-15Rα엑손 3 결실, IL-2R-베타 또는 감마-C, 또는 그의 작용 단편을 지칭함을 의미하며, 상기와 같은 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 작용 단편을 추가로 포함한다.
"융합 분자" 및 "융합 단백질"이란 용어는 호환적으로 사용되며 생물 활성 폴리펩타이드, 대개는 TCR 또는 항체 및 효과기 분자, 대개는 재조합, 화학적 또는 다른 적합한 방법에 의해 공유 결합된(즉 융합된) 단백질 또는 펩타이드 서열을 지칭함을 의미한다. 경우에 따라, 상기 융합 분자를 펩타이드 링커 서열을 통해 하나 또는 다수의 부위에서 융합시킬 수 있다. 한편으로, 상기 펩타이드 링커를 사용하여 상기 접합체 분자의 구성을 지원할 수 있다. 특히 바람직한 융합 분자는 융합 단백질이다. 일반적으로 융합 분자는 또한 접합체 분자를 포함할 수 있다.
"숙주 세포"란 용어는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 함유하는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 지칭함을 의미한다. 상기 용어는 또한 상기 숙주 세포의 염색체 또는 게놈 중의 클로닝된 유전자(들)를 함유하도록 유전자 가공된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "면역 반응"이란 용어는 면역 세포가 자극되고/되거나 별도의 부착제 및/또는 활성화 단계를 포함하는 다인자 과정을 통해 혈액으로부터 림프뿐만 아니라 비-림프 조직으로 보충되는 과정을 지칭함을 의미한다. 활성화 조건은 사이토킨, 성장 인자, 케모킨 및 다른 인자의 방출을 일으키고, 면역 세포 상에서 부착 및 다른 활성화 분자의 발현을 상향조절하고, 부착, 형태 변화 및/또는 상기 조직을 통한 주화성과 동반된 혈관 밖 유출을 촉진하고, 세포 증식 및 세포독성 활성을 증가시키고, 항원 제공을 자극하고, 기억 세포 유형의 발생을 포함하는 다른 표현형 변화를 제공한다. 면역 반응은 또한 다른 면역 세포의 염증 또는 세포독성 활성을 억제하거나 조절하는 면역 세포의 활성을 지칭함을 또한 의미한다. 면역 반응은 생체 내 또는 시험관 내 면역 세포의 활성을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산 분자"란 용어는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태를 지칭하는데 호환적으로 사용된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 및/또는 이들의 동족체를 함유할 수도 있다. 뉴클레오타이드는 임의의 3-차원 구조를 가질 수 있으며, 임의의 공지되거나 공지되지 않은 작용을 수행할 수 있다. "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 예를 들어 단일-, 이중-가닥 및 삼중 나선 분자, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, 안티센스 분자, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 앱타머, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침, 및 프라이머를 포함한다. 핵산 분자는 또한 변형된 핵산 분자를 포함할 수도 있다(예를 들어 변형된 염기, 당, 및/또는 뉴클레오타이드간 링커를 포함한다).
"폴리펩타이드"란 용어는 바람직하게는 크기에 관계없이 20 개의 천연 아미노산 중 어느 하나로 필수적으로 이루어지는 임의의 중합체를 지칭함을 의미한다. "단백질"이란 용어는 종종 비교적 큰 단백질의 언급에 사용되고, "펩타이드"는 종종 작은 폴리펩타이드의 언급에 사용되며, 당해 분야에서 이들 용어의 사용은 종종 겹친다. "폴리펩타이드"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 일반적으로 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 지칭한다. 본 발명에 따라 유용한 펩타이드는 일반적으로 표준 분자 크기 분류 기법, 예를 들어 원심분리 또는 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 판단 시 약 0.1 내지 100 KD 이상 약 1000 KD 이하, 바람직하게는 약 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30 내지 50 KD일 것이다.
"예방하다", "예방하는", "예방", "예방학적 치료" 등의 용어는 질환 또는 병이 있지는 않지만, 발병할 위험이 있거나 발병하기 쉬운 환자에게서 질환 또는 병이 발생할 확률을 감소시킴을 지칭함을 의미한다. 예방 등은 환자가 특정한 질병 또는 질환에 절대 걸리지 않게 방지함을 의미하지 않는다. 예방은 수회 용량의 투여를 요할 수도 있다. 예방은 모든 질병 증상이 제거된 환자에게서 질병의 재발을 방지하거나, 또는 재발-이장성 질병의 재발을 방지함을 포함할 수 있다.
"단일 쇄 항체"란 용어는 단일 쇄 포맷을 기본으로 하는 항체를 지칭함을 의미한다. 단일 쇄 항체는 항체들의 최소 결합 서브유닛으로 이루어질 수 있다. 단일-쇄 항체는 오직 단일의 안정하게-폴딩된 폴리페타이드 쇄 상에서 항체의 항원-결합 영역(예를 들어 상보성 결정 영역 중 일부 또는 전부, 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 중에 존재하는 CDR)들을 결합시킬 수 있다. 그 자체로서, 단일 쇄 항체는 전통적인 면역글로불린보다 상당히 더 작은 크기를 갖지만 항체의 항원-특이성 결합 성질을 유지한다. 단일 쇄 항체를 광범위한 리간드, 예를 들어 효과기 분자 또는 약물 접합체에 결합시킬 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "용해성"이란 용어는 낮은 G-력 원심분리(예를 들어 표준 원심분리기에서 분당 약 30,000 회전수 미만) 하에서 수성 완충제, 예를 들어 세포 배지로부터 쉽게 침전되지 않는 융합 분자 및 특히 융합 단백질을 의미한다. 더욱이, 상기 융합 분자는 약 5 내지 37 ℃ 초과의 온도 및 낮은 농도의 음이온성 또는 비이온성 세제의 존재 또는 부재 하에서 중성 pH 또는 그 부근에서 수용액 중에 남아있는 경우 용해성이다. 이러한 조건 하에서, 용해성 단백질은 종종 낮은 침전 값, 예를 들어 약 10 내지 50 svedberg 단위를 가질 것이다.
본 발명에서 언급된 수용액은 전형적으로는 약 5 내지 9의 pH 범위 내의 pH 및 약 2 mM 내지 500 mM의 이온 강도 범위를 확립시키는 완충 화합물을 갖는다. 때때로 프로테아제 억제제 또는 순한 비-이온성 세제를 첨가한다. 또한, 경우에 따라 담체 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민(BSA)을 수 ㎎/㎖로 가할 수도 있다. 예시적인 수성 완충제는 표준 포스페이트 완충 염수, 트리스-완충된 염수, 또는 다른 널리 공지된 완충제 및 세포 배지 제형을 포함한다.
"자극하다" 또는 "자극하는"이란 용어는 생리 활성, 예를 들어 면역 반응을 증가, 증폭, 증대, 밀어 올림을 지칭함을 의미한다. 자극은 양의 변경일 수 있다. 예시적인 증가는 예를 들어 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어 90 내지 100%까지일 수 있다. 다른 예시적인 증가는 2배, 5배, 10배, 20배, 40배, 또는 심지어 100배를 포함한다.
"억제하다" 또는 "억제하는"이란 용어는 생리 활성, 예를 들어 면역 반응을 감소, 약화, 축소, 억제, 또는 안정화함을 지칭함 의미한다. 억제는 음의 변경일 수 있다. 예시적인 감소는 예를 들어 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어 90 내지 100%까지일 수 있다. 예시적인 감소는 2배, 5배, 10배, 20배, 40배, 또는 심지어 100배를 포함한다.
"T-세포 수용체"(TCR)란 용어는 항원의 제공에 반응하여 T 세포의 활성화에 관여하는 내재하는 막 단백질의 복합체로부터 유도되거나 그의 폴리펩타이드를 지칭함을 의미한다. 일부의 경우에, T 세포는 αβ 또는 γδ-이종이량체성 T 세포 수용체(TCR)를 통해 MHC 생성물에 결합된 펩타이드를 인식한다. 상기 TCR 레퍼토리는 항체 중쇄 및 경쇄 유전자에 사용된 동일한 유전자 재배열 기전에 의해 생성된 광범위한 분기를 갖는다(문헌[Tonegawa, S. (1988) Biosci . Rep . 8:3-26]). 상기 분기의 대부분은 상기 α 및 β 쇄의 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 암호화하는 가변(V) 및 결합(J)(또는 분기, D) 영역의 교차점에서 발생한다(문헌[Davis and Bjorkman (1988) Nature 334:395-402]). 그러나, TCR은 항체가 하는 것처럼 체세포 점 돌연변이를 겪지 않으며, 추정 상 동시적으로 겪지 않는다. TCR은 또한 항체와 동일한 정도의 친화성 성숙을 겪지 않는다. 자연에서 존재하는 TCR은 105 내지 107 M-1 범위의 친화성을 갖는 것으로 보이는 반면, 항체는 전형적으로는 105 내지 109 M-1 범위의 친화성을 갖는다(문헌[Davis et al. (1998) Annu . Rev . Immunol . 16:523-544]; [Eisen et al. (1996) Adv. Protein Chem. 49:1-56]). TCR에서 체세포 돌연변이의 부재는 보다 낮은 친화성과 관련될 수도 있지만, 더 높은 친화성을 갖는 TCR 선택의 이점은 없음이 또한 주장되었다. 실제로, T 세포 활성화의 일련의 촉발(문헌[Valitutti et al. (1995) Nature 375:148-151]) 및 동역학적 교정(문헌[Rabinowitz et al. (1996) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 93:1401-1405]) 모델은 모두 더 긴 중단율(off-rate)(더 큰 친화성과 관련됨)이 상기 신호전달 과정에 유해할 것임을 암시한다. 더 높은 친화성 TCR이 T 세포 반응에 필요한 펩타이드 특이성을 유지하지 않을 수도 있음이 또한 가능하다. 예를 들어, 상기 MHC 홈 내에 결합된 펩타이드는 제한된 접근 가능한 표면을 나타내며(문헌[Bjorkman, P. J. (1997) Cell 89:167-170]), 이는 차례로 상기 상호작용에서 발생할 수 있는 에너지의 양을 제한할 수도 있다. 다른 한편으로, 상기 에너지를 MHC 나선을 향하게 함으로써 TCR의 친화성을 상승시키는 것은 추정 상 음의 선택 중에 흉선 결실을 도출할 것이다(문헌[Bevan, M. J. (1997) Immunity 7:175-178]). "TCR"이란 용어는 다클론, 단클론, 키메릭, 인간화된, 이종이량체 및 단일-쇄 T-세포 수용체 또는 그의 작용 단편, 예를 들어 TCR Vα 및 Vβ 도메인을 포함하는 분자를 포함한다. "TCR"이란 용어는 또한 예를 들어 2008년 3월 19일자로 출원된 "세포 수용체 융합물 및 접합체 및 이들의 사용 방법"이란 표제 하의 미국 가 출원 및 미국 특허 공보 US 20030144474에 개시된, T-세포 수용체를 포함한다.
"벡터"란 용어는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 핵산 분자이며 외부 DNA를 수용할 수 있다. 벡터는 그 자신의 복제 기원, 외부 DNA의 삽입에 사용될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 하나 이상의 독특한 인식 부위, 및 대개는 선택성 마커, 예를 들어 항생제 내성을 암호화하는 유전자, 및 종종 상기 삽입된 DNA의 발현에 대한 인식 서열(예를 들어 프로모터)을 지닌다. 통상적인 벡터는 플라스미드 벡터 및 파지 벡터를 포함한다.
"Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"이란 용어는 면역글로불린 중쇄 "단편 결정화 가능한" 영역을 지칭함을 의미한다. 일반적으로, Fc 도메인은 제 2 Fc 도메인과 상호작용하여 이량체성 복합체를 형성할 수 있다. 상기 Fc 도메인은 보체 시스템의 Fc 수용체 및/또는 단백질이라 칭하는 세포 표면 수용체와 결합하거나 또는 이들 결합 활성을 감소시키거나 증대시키도록 변형될 수도 있다. 상기 Fc 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgM 또는 IgE 항체 아이소타입으로부터 유도될 수 있으며 옵소닌화, 세포 용해, 비만 세포, 호염기구 및 호산구의 탈과립화, 및 다른 Fc 수용체-의존 과정; 상기 보체 경로의 활성화; 및 생체 내 단백질 안정성을 초래할 수 있다.
사용되는 약어는 하기와 같다: IgG, 면역글로불린; h, 인간; IL, 인터류킨; R, 수용체; Su, 스시 도메인; TCR, T 세포 수용체; sc, 단일 쇄; sTNFR, 용해성 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수용체; NK, 천연 살해; KD, 평형 해리 상수; CTL, 세포독성 T 림프구; aa, 아미노산(들); OVA, 오브알부민; VSV, 수포성 구내염 바이러스; IMDM, 아이스코베의 변형된 둘베코의 배지; CHO, 중국 햄스터 난소; mAb, 단클론 항체; β2m, β2 미소글로불린; SA, 스트렙트아비딘; HRP, 양고추냉이 퍼옥시다제; PE, 피코에리쓰린; ABTS, 2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산]-다이암모늄 염; PLE, 펩타이드 로딩 인헨서; c264scTCR, 인간 p53(aa264-272) 펩타이드/HLA-A*0201 복합체에 특이성인 용해성 단일 쇄 TCR; c149scTCR, 인간 p53(aa149-157) 펩타이드/HLA-A*0201 복합체에 특이성인 용해성 단일 쇄 TCR; OT1scTCR, OVA(aa257-264) 펩타이드/H-2Kb 복합체에 특이성인 용해성 단일 쇄 TCR; SEC, 크기 배제 크로마토그래피; pMHCI, 펩타이드/MHC 부류 I; SPR, 표면 플라스몬 공명; MW, 분자량; m, 쥐; A, 흡광도; RU, 반응 단위.
본 발명에 제공된 범위는 상기 범위 내의 모든 값들에 대한 속기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 그룹 중의 임의의 수, 수들의 조합, 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
"하나보다 많은"은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 100 등 또는 이들 사이의 임의의 값으로서 이해된다. 특정 값 "이상"은 상기 값 및 상기 값보다 큰 모든 값들인 것으로 이해된다.
구체적으로 서술되거나 내용상 명백하지 않은 한, 본 발명에 사용된 바와 같이, "또는"이란 용어는 포함되는 것으로 이해된다.
구체적으로 서술되거나 내용상 명백하지 않은 한, 본 발명에 사용된 바와 같이, "하나의" 및 "상기"란 용어들은 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
구체적으로 서술되거나 내용상 명백하지 않은 한, 본 발명에 사용된 바와 같이, "약"이란 용어는 당해 분야에서 통상적으로 허용되는 범위 이내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 이내로서 이해된다. 약을 서술된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내인 것으로 이해할 수 있다. 달리 내용상 명백하지 않은 한, 본 발명에 제공된 모든 수치들은 약이란 용어에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에서 변수의 임의의 정의에 있어서 화학 그룹의 목록의 인용은 나열된 그룹 중 임의의 단일 그룹 또는 조합으로서 상기 변수의 정의를 포함한다. 본 발명의 변수 또는 태양의 실시태양의 인용은 임의의 단일 실시태양으로서 또는 임의의 다른 실시태양 또는 그의 일부와의 실시태양을 포함한다.
본 발명에 제공된 임의의 조성물 또는 방법을 본 발명에 제공된 다른 조성물 및 방법들 중 임의의 하나 이상과 병용할 수 있다.
Fc 도메인
IgG 부류의 면역글로불린은 인간 혈액 중 가장 풍부한 단백질 중 하나이다. 이의 순환 반감기는 21일 정도에 달할 수 있다. IgG의 Fc 영역과 또 다른 단백질, 예를 들어 다양한 사이토킨 및 용해성 수용체의 도메인을 결합시키는 융합 단백질이 보고되었다(예를 들어 문헌[Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989]; [Chamow et al., Trends Biotechnol., 14:52-60, 1996]; 미국 특허 제 5,116,964 및 5,541,087 호를 참조하시오). 원형 융합 단백질은 IgG Fc의 힌지 영역 중의 시스테인 잔기를 통해 결합되어, 중쇄 가변 및 CH1 도메인 및 경쇄가 없는 IgG 분자와 유사한 분자를 생성시키는 동종이량체 단백질이다. 상기 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 이량체 성질은 다른 분자와의 더 높은 정도의 상호작용(즉 2가 또는 이중특이성 결합)을 제공함에 있어서 유리할 수도 있다. 구조적 상동성으로 인해, Fc 융합 단백질은 유사한 아이소타입을 갖는 인간 IgG의 경우에 필적하는 생체 내 약동학 프로파일을 나타낸다. IL-15 또는 IL-15 융합 단백질의 순환 반감기를 연장시키고/시키거나 그의 생물 활성을 증가시키기 위해서, 본 발명에 개시되거나 기술된 바와 같은 인간 중쇄 IgG 단백질의 Fc 부분에 공유 결합된 IL-15Rα에 비-공유 결합된 IL-15 도메인을 함유하는 융합 단백질 복합체를 제조하는 것이 바람직하다.
"Fc"란 용어는 단량체 형태든 다량체 형태든 간에, 전체 항체의 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. 고유 Fc의 원래 면역글로불린 공급원은 바람직하게는 인간 기원이며 면역글로불린 중 임의의 것일 수 있지만, IgG1 및 IgG2가 바람직하다. 고유 Fc는 공유(즉 다이설파이드 결합) 및 비-공유 결합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 결합될 수 있는 단량체성 폴리펩타이드로 구성된다. 고유 Fc 분자의 단량체성 서브유닛 간의 분자간 다이설파이드 결합의 수는 부류(예를 들어 IgG, IgA, IgE) 또는 하위부류(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2)에 따라 1 내지 4의 범위이다. 고유 Fc의 일례는 IgG의 파파인 절단으로부터 생성되는 다이설파이드-결합된 이량체이다(예를 들어 문헌[see Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9]을 참조하시오). 본 발명에 사용된 바와 같은 "고유 Fc"란 용어는 상기 단량체, 이량체 및 다량체 형태들에 대한 일반명이다. Fc 도메인은 단백질 A, 단백질 G, 다양한 Fc 수용체 및 보체 단백질에 대한 결합 부위를 함유한다.
일부 실시태양에서, "Fc 변체"란 용어는 고유 Fc로부터 변형되지만 우회 수용체, FcRn에 대한 결합 부위를 여전히 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. 국제 출원 WO 97/34631(1997년 9월 25일자로 공개됨) 및 WO 96/32478은 예시적인 Fc 변체뿐만 아니라 상기 우회 수용체와의 상호작용을 개시하며, 이들 출원은 본 발명에 참고로 인용된다. 따라서, "Fc 변체"란 용어는 비-인간 고유 Fc로부터 인간화된 분자 또는 서열을 포함한다. 더욱 또한, 고유 Fc는 본 발명의 융합 단백질을 필요로 하지 않는 구조 특징 또는 생물 활성을 제공하기 때문에 제거될 수도 있는 부위를 포함한다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, "Fc 변체"란 용어는 (1) 다이설파이드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와 양립 불능, (3) 선택된 숙주 세포에서 발현 시 N-말단 이질성, (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 우회 수용체 이외의 Fc 수용체에 대한 결합, 또는 (7) 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)에 영향을 미치거나 이에 관련된 하나 이상의 고유 Fc 부위 또는 잔기가 없는 분자 또는 서열을 포함한다. Fc 변체를 이후에 더욱 상세히 개시한다.
"Fc 도메인"이란 용어는 상기 정의한 바와 같은 고유 Fc 및 Fc 변체 분자 및 서열을 포함한다. Fc 변체 및 고유 Fc와 같이, "Fc 도메인"이란 용어는 전체 항체로부터 절단되든지 또는 재조합 유전자 발현에 의해서 또는 다른 수단에 의해서 생성되든지간에, 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다.
T-세포 수용체( TCR )
T-세포는 다른 면역 세포 유형들(다형핵 백혈구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, B-세포, NK 세포)과 함께, 면역계의 세포 성분을 구성하는 세포들의 하위그룹이다. 생리 조건 하에서 T 세포는 외부 항원의 면역 감독 및 제거에 작용한다. 그러나, 생리 조건 하에서 T-세포가 질병의 원인 및 전파에 주요 역할을 한다는 강력한 증거가 존재한다. 상기 질환에서, T-세포 면역 허용성의 파괴는 중추든 말초든, 자가면역 질병의 원인에 근본적인 과정이다.
상기 TCR 복합체는 7 개 이상의 막관통 단백질로 구성된다. 다이설파이드-결합된(αβ 또는 γδ) 이종이량체는 모노타입 항원 인식 단위를 형성하는 반면, ε, γ, δ, ζ 및 η 쇄로 이루어지는 CD43의 불변 쇄는, T-세포 활성화 및 세포 면역 반응의 정교화를 생성시키는 신호전달 경로에 상기 리간드 결합을 결부시키는데 기여한다. 상기 TCR 쇄의 유전자 분기에도 불구하고, 2 개의 구조적 특징이 모든 공지된 서브유닛들에 공통이다. 먼저, 상기는 단일 막관통 스패닝 도메인(추정 상 알파-나선)을 갖는 막관통 단백질이다. 두 번째, 상기 TCR 쇄는 모두 예견되는 막관통 도메인 내에 하전된 아미노산을 소유하는 특별한 특징을 갖는다. 상기 불변 쇄는 마우스와 인간 사이에 보존된 단일의 음 전하를 가지며, 상기 변형 쇄는 하나(TCR-β) 또는 2 개(TCR-α)의 양 전하를 갖는다. 상기 TCR-α의 막관통 서열은 다수의 종들에서 고도로 보존되며 따라서 계통발생적으로 중요한 작용상 역할을 제공할 수 있다. 친수성 아미노산 아르기닌 및 리신을 함유하는 옥타펩타이드 서열은 종들 간에 동일하다.
T-세포 반응을 TCR에 대한 항원 결합에 의해 조절한다. TCR의 한 가지 유형은 면역글로불린 가변(V) 및 불변(C) 영역을 닮은 α 및 β 쇄로 이루어지는 막 결합된 이종이량체이다. 상기 TCR α 쇄는 공유 결합된 V-α 및 C-α 쇄를 포함하는 반면, 상기 β 쇄는 C-β 쇄에 공유 결합된 V-β 쇄를 포함한다. 상기 V-α 및 V-β 쇄는 주요 조직적합성 복합체(MHC)(인간에서 HLA 복합체로서 공지됨)와 관련하여 초항원 또는 항원과 결합할 수 있는 포켓 또는 갈라진 틈을 형성한다. 일반적으로 문헌[Davis Ann . Rev . of Immunology 3: 537 (1985)]; [Fundamental Immunology 3rd Ed., W. Paul Ed. Rsen Press LTD. New York (1993)]을 참조하시오.
상기 TCR 쇄(αβ 또는 γδ)의 세포외 도메인을 또한 세포 표면상에서의 발현을 위해 이종 막관통 도메인에 대한 융합물로서 가공할 수 있다. 상기와 같은 TCR은 CD3, CD28, CD8, 4-1BB 및/또는 키메릭 활성화 수용체(CAR) 막관통 또는 활성화 도메인에 대한 융합물을 포함할 수도 있다. TCR은 또한 αβ 또는 γδ 쇄의 항원 결합 도메인 중 하나 이상을 포함하는 용해성 단백질일 수 있다. 상기와 같은 TCR은 TCR 불변 도메인의 존재 또는 부재 하에서 상기 TCR 가변 도메인 또는 그의 융합 단편을 포함할 수도 있다. 용해성 TCR은 이종이량체 또는 단일 쇄 분자일 수도 있다.
융합 단백질 복합체
본 발명의 용해성 융합 단백질 및 접합체 분자 복합체는 2 개 이상의 용해성 융합 단백질을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 제 1 융합 단백질은 인터류킨-15(IL-15) 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 제 1 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하고; 상기 제 2 융합 단백질은 용해성 인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 제 2 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하며; 여기에서 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인은 상기 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인에 결합하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성한다. 본 발명의 융합 단백질 복합체는 또한 상기 제 1 및 제 2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 다에 결합된 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 작용 단편을 포함한다. 바람직하게는 상기 제 1 및 제 2 융합 단백질에 결합된 Fc 도메인들은 상호작용하여 융합 단백질 복합체를 형성한다. 상기와 같은 복합체는 상기 면역글로불린 Fc 도메인들 사이의 다이설파이드 결합 형성에 의해 안정화될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 용해성 융합 단백질 복합체는 IL-15 폴리펩타이드, IL-15 변체 또는 그의 작용 단편 및 용해성 IL-15Rα 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함하고, 여기에서 상기 IL-15 및 IL-15Rα 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 작용 단편을 추가로 포함한다.
몇몇 예에서, 상기 생물 활성 폴리펩타이드 중 하나는 제 1 용해성 TCR 또는 그의 단편을 포함한다. 상기 다른 또는 제 2 생물 활성 폴리펩타이드는 상기 제 1 용해성 TCR 또는 그의 작용 단편을 포함하고 따라서 1가 TCR에 비해 동족 리간드에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 다가 TCR 융합 단백질 복합체를 생성시킨다. 더욱이, 상기 다른 생물 활성 폴리펩타이드는 상기 제 1 용해성 TCR과 상이한, 제 2 용해성 TCR 또는 그의 작용 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 예를 들어 고유 TCR에 비해 동족 리간드에 대해 더 높은 친화성 또는 증가된 결합 친화성을 갖는 TCR이 생성된다. 본 발명에 개시된 본 발명의 용해성 TCR이 그의 리간드에 대해 더 높은 결합능 또는 친화성을 갖는 경우, 상기는 세포-표면 결합된 항원에 특이적인 탐침으로서 유용하다. 본 발명의 몇몇 바람직한 예에서, 상기 TCR은 특정 항원의 인식에 특이적이다.
예시적인 실시태양에서, TCR은 α 쇄(본 발명에서 α, 알파 또는 a 쇄라 칭한다) 및 β 쇄(본 발명에서 β, 베타 또는 b 쇄라 칭한다)를 포함하는 이종이량체이다. 다른 예시적인 실시태양에서, 상기 TCR은 단일 쇄 TCR 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 단일 쇄 TCR은 펩타이드 링커 서열에 의해 TCR V-β 쇄에 공유 결합된 TCR V-α 쇄를 포함할 수도 있다. 상기 단일 쇄 TCR은 TCR V-β 쇄에 공유 결합된 용해성 TCR Cβ 쇄 단편을 추가로 포함할 수도 있다. 상기 단일 쇄 TCR은 TCR V-α 쇄에 공유 결합된 용해성 TCR Cα 쇄 단편을 추가로 포함할 수도 있다.
추가의 실시태양에서, 상기 제 1 및 제 2 생물 활성 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 항체 또는 그의 작용 단편을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 TCR 도메인에 대한 항원은 MHC 또는 HLA 분자 중에 존재하는 펩타이드 항원을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 펩타이드 항원은 종양 관련된 폴리펩타이드 또는 바이러스 암호화된 폴리펩타이드로부터 유도된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 항체 도메인에 대한 항원은 세포 표면 수용체 또는 리간드를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 항원은 CD 항원, 사이토킨 또는 케모킨 수용체 또는 리간드, 성장 인자 수용체 또는 리간드, 조직 인자, 세포 부착 분자, MHC/MHC-유사 분자, Fc 수용체, 톨형 수용체, NK 수용체, TCR, BCR, 양성/음성 동시-자극 수용체 또는 리간드, 치사 수용체 또는 리간드, 종양 관련된 항원 또는 바이러스 암호화된 항원을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "생물 활성 폴리펩타이드" 또는 "효과기 분자"란 용어는 본 발명에 논의된 바와 같은 목적하는 효과를 생성시킬 수 있는 아미노산 서열, 예를 들어 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드; 당 또는 폴리사카라이드; 지질 또는 당지질, 당단백질, 또는 지단백질을 의미한다. 효과기 분자는 또한 화학적 작용제를 포함한다. 생물 활성 또는 효과기 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 효과기 분자 핵산이 또한 고려된다. 따라서, 적합한 분자는 조절 인자, 효소, 항체, 또는 약물뿐만 아니라 DNA, RNA, 및 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 생물 활성 폴리펩타이드 또는 효과기 분자는 천연이거나 또는 공지된 성분으로부터, 예를 들어 재조합 또는 화학 합성에 의해 합성될 수 있으며 이종 성분을 포함할 수 있다. 생물 활성 폴리펩타이드 또는 효과기 분자는 표준 분자 크기 분류 기법, 예를 들어 원심분리 또는 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 판단 시 일반적으로 약 0.1 내지 100 KD 이상 약 1000 KD 이하, 바람직하게는 약 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30 내지 50 KD일 것이다. 본 발명의 목적하는 효과는 비제한적으로 예를 들어 증가된 결합 활성을 갖는 본 발명의 융합 단백질 복합체의 형성, 예를 들어 세포 증식 또는 세포사를 유도하기 위한 표적 세포의 살해, 질병의 예방 또는 치료에서 면역 반응 개시, 또는 진단 목적으로 검출 분자로서 작용을 포함한다. 상기와 같은 검출을 위해서, 분석, 예를 들어 세포를 그의 증식을 위해 배양하고, 상기 세포를 본 발명의 TCR 융합 복합체와 접촉시키고, 이어서 상기 TCR 융합 복합체가 상기 세포의 추가의 발생을 억제하는지의 여부를 평가하는 연속적인 단계들을 포함하는 분석을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 효과기 분자의 본 발명의 융합 단백질 복합체에의 공유 결합은 다수의 중요한 이점들을 제공한다. 공지된 구조의 상기와 같은 펩타이드를 포함하는, 단일 효과기 분자를 함유하는 본 발명의 융합 단백질 복합체를 생성시킬 수 있다. 또한, 광범위하게 다양한 효과기 분자를 유사한 DNA 벡터에서 생성시킬 수 있다. 즉, 상이한 효과기 분자의 라이브러리를, 감염되거나 병든 세포의 인식을 위해 상기 융합 단백질 복합체에 결합시킬 수 있다. 더욱이, 치료 용도를 위해서, 환자에게 본 발명의 융합 단백질 복합체의 투여보다는 상기 융합 단백질 복합체를 암호화하는 DNA 발현 벡터를 상기 융합 단백질 복합체의 생체 내 발현을 위해 투여할 수 있다. 상기와 같은 접근법은 재조합 단백질의 제조와 전형적으로 관련된 비용이 많이 드는 정제 단계를 피하고 통상적인 접근법과 관련된 항원 흡수 및 처리의 복잡성을 피한다.
나타낸 바와 같이, 본 발명에 개시된 융합 단백질의 성분, 예를 들어 효과기 분자, 예를 들어 사이토킨, 케모킨, 성장 인자, 단백질 독소, 면역글로불린 도메인 또는 다른 생물활성 분자 및 임의의 펩타이드 링커를, 상기 융합 단백질이 상기가 의도하는 작용을 갖는 한, 거의 모든 방식으로 구성할 수 있다. 특히, 상기 융합 단백질의 각각의 성분을, 목적하는 경우, 하나 이상의 적합한 펩타이드 링커 서열에 의해 또 다른 성분으로부터 이격시킬 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질은, 예를 들어 상기 융합 단백질의 변형, 확인 및/또는 정제를 촉진하기 위해 태그를 포함할 수도 있다. 보다 구체적인 융합 단백질들은 하기 개시된 실시예에 있다.
링커
본 발명의 융합 복합체는 바람직하게는 IL-15 또는 IL-15Rα 도메인과 상기 생물 활성 폴리펩타이드 사이에 삽입된 가요성 링커 서열을 또한 포함한다. 상기 링커 서열은 상기 생물 활성 폴리펩타이드의 상기 IL-15 또는 IL-15Rα 도메인에 대한 유효한 위치 결정을 허용하여 상기 두 도메인 모두의 작용 활성을 허용할 것이다. 상기 생물 활성 폴리펩타이드가 TCR인 실시태양에서, 상기 링커 서열은 T 세포 수용체가 MHC-펩타이드 복합체를 제공함을 인식하고 상기 효과기 분자를 목적하는 부위로 전달할 수 있도록 상기 TCR 분자 결합 홈에 위치한다. 상기 효과기 분자의 성공적인 제공은 하기 개시된 분석들, 예를 들어 T 세포를 그의 증식을 위해 배양하고, 상기 T 세포를 본 발명의 TCR 융합 복합체와 접촉시키고, 이어서 상기 TCR 융합 복합체가 상기 세포의 추가의 발생을 억제하는지의 여부를 평가하는 연속적인 단계들을 포함하는 시험관 내 분석에 의해 측정된 바와 같이, T-세포 증식을 유도 또는 억제하거나, 또는 특정 부위에 대한 면역 반응을 개시 또는 억제하는 세포의 활성을 조절할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 상기 용해성 융합 단백질 복합체는 상기 제 1 생물 활성 폴리펩타이드가 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 IL-15(또는 그의 작용 단편)에 공유 결합되는 링커를 갖는다.
다른 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 용해성 융합 단백질 복합체는 상기 제 2 생물 활성 폴리펩타이드가 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 IL-15Rα 폴리펩타이드(또는 그의 작용 단편)에 공유 결합되는 링커를 갖는다.
상기 링커 서열은 바람직하게는 제공 항원의 인식을 위한 TCR 분자의 결합 홈 또는 항원 인식을 위한 항체 분자의 결합 도메인을 유효하게 배치시킬 수 있는 펩타이드를 생성시키는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "IL-15 또는 IL-15Rα 도메인에 대한 생물 활성 폴리펩타이드의 유효한 배치"란 어구 또는 다른 유사한 어구는 상기 IL-15 또는 IL-15Rα 도메인에 결합된 생물 활성 폴리펩타이드가, 상기 IL-15 또는 IL-15Rα 도메인이 서로 상호작용하여 단백질 복합체를 형성할 수 있도록 배치됨을 의미하고자 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 IL-15 또는 IL-15Rα 도메인은 면역 반응을 개시 또는 억제하거나, 또는 세포 발생을 억제 또는 자극하도록 면역 세포와의 상호작용을 허용하도록 유효하게 배치된다.
본 발명의 융합 복합체는 바람직하게는 또한 상기 IL-15 또는 IL-15Rα 도메인과 면역글로불린 Fc 도메인 사이에 삽입된 가요성 링커 서열을 포함한다. 상기 링커 서열은 상기 Fc 도메인, 생물 활성 폴리펩타이드 및 IL-15 또는 IL-15Rα 도메인 각각의 작용 활성을 허용하도록 상기 각 도메인의 유효한 배치를 허용할 것이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 옵소닌화, 세포 용해, 비만 세포, 호염기구 및 호산구의 탈과립화, 및 다른 Fc 수용체-의존성 과정; 보체 경로의 활성화; 및 융합 단백질 복합체의 증대된 생체 내 반감기를 포함한 Fc-매개된 효과를 자극하도록 상기 보체 시스템의 면역 세포 또는 단백질 상에서 적합한 융합 단백질 복합체 형성 및/또는 Fc 수용체와의 상호작용을 허용하도록 유효하게 배치된다.
링커 서열을 또한 상기 생물 활성 폴리펩타이드의 2 개 이상의 폴리펩타이드를 목적하는 작용 활성을 갖는 생성된 단일 쇄 분자에 결합시키는데 사용할 수 있다.
바람직하게는 상기 링커 서열은 약 7 내지 20 개의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 8 내지 16 개의 아미노산을 포함한다. 상기 링커 서열은 바람직하게는 상기 생물 활성 폴리펩타이드 또는 효과기 분자가 단일의 바람직하지 못한 형태로 유지되지 않도록 가요성이다. 상기 링커 서열을, 예를 들어 상기 융합된 단백질로부터 인식 부위를 이격시키기 위해 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드 링커 서열을, 상기 생물 활성 폴리펩타이드와 효과기 분자 사이에 배치시켜, 예를 들어 이들을 화학적으로 가교결합시키고 분자 가요성을 제공할 수 있다. 상기 링커는 가요성을 제공하기 위해서, 바람직하게는 작은 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 글리신, 알라닌 및 세린을 우세하게 포함한다. 바람직하게는 상기 링커 서열의 약 80 또는 90 퍼센트 이상이 글리신, 알라닌 또는 세린 잔기, 특히 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 이종이량체 TCR을 포함하는 융합 단백질 복합체의 경우에, 상기 링커 서열을 적합하게는 상기 TCR 분자의 β 쇄에 결합시키지만, 상기 링커 서열을 또한 상기 TCR 분자의 a 쇄에 부착시킬 수도 있다. 한편으로, 링커 서열을 상기 TCR 분자의 α 및 β 쇄 모두에 결합시킬 수도 있다. 상기와 같은 β 펩타이드 쇄가 상기 α 쇄와 함께 발현되는 경우, 상기 결합된 TCR 폴리펩타이드는 도 1에 일반적으로 도시된 바와 같이 폴딩하여 작용성 TCR 분자를 생성시킬 것이다. 하나의 적합한 링커 서열은, 바람직하게는 상기 TCR의 β 도메인의 제 1 아미노산에 결합된 ASGGGGSGGG (즉, Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly)이다. 항체 가변 영역들을 함께 연결하기 위해 성공적으로 사용된 다수의 가요성 링커 디자인 중 임의의 것을 포함하여 상이한 링커 서열들을 사용할 수 있다(문헌[Whitlow, M. et al., (1991) Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2:97-105] 참조). 일부 예에서, 효과기 분자를 TCR β 쇄 분자에 공유 결합시키기 위해서, 상기 링커의 아미노산 서열은 상기 TCR β 쇄의 C-말단 잔기에서부터 상기 효과기 분자의 N-말단 잔기까지 적합한 거리에 걸쳐 있을 수 있어야 한다. 적합한 링커 서열들을 경험상 쉽게 확인할 수 있다. 또한, 링커 서열의 적합한 크기 및 서열을 또한 상기 TCR 분자의 예상된 크기 및 모양을 근거로 통상적인 컴퓨터 설계 기법에 의해 측정할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 융합 단백질 복합체의 제조를 본 발명에 개시된 과정 및 인정된 재조합 DNA 기법들, 예를 들어 폴리머라제 쇄 증폭 반응(PCR), 플라스미드 DNA의 제조, 제한 효소에 의한 DNA의 절단, 올리고뉴클레오타이드의 제조, DNA의 연결, mRNA의 단리, 적합한 세포 내로의 DNA의 도입, 숙주의 형질전환 또는 형질감염, 상기 숙주의 배양에 의해 수행할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질을 카오트로프제(chaotropic agent) 및 잘 알려진 전기영동, 원심분리 및 크로마토그래피 방법을 사용하여 단리 및 정제할 수 있다. 일반적으로 이들 방법에 관한 명세에 대해 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd ed. (1989)]; 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)]을 참조하시오.
본 발명에 사용된 바와 같이, 본 발명의 생물 활성 폴리펩타이드 또는 효과기 분자는 사이토킨, 케모킨, 성장 인자, 단백질 독소, 면역글로불린 도메인 또는 다른 생물활성 단백질, 예를 들어 효소와 같은 인자들을 포함할 수 있다. 또한 생물 활성 폴리펩타이드는 비-단백질 독소, 세포독성제, 화학요법제, 검출 가능한 표지, 방사성 물질 등과 같은 다른 화합물들에 대한 접합체를 포함할 수도 있다.
본 발명의 케모킨은, 다른 세포에 영향을 미치고 세포 면역성의 다수의 다중 효과들 중 어느 하나의 원인이 되는 세포에 의해 생성되는 임의의 인자들에 의해 한정된다. 사이토킨의 예는 비제한적으로 IL-2 과, 인터페론(IFN), IL-10, IL-1, IL-17, TGF 및 TNF 사이토킨 과, 및 IL-1 내지 IL-35, IFN-α, IFN-β, IFNγ, TGF-β, TNF-α 및 TNFβ를 포함한다.
본 발명의 한 태양에서, 상기 제 1 융합 단백질은 인터류킨-IL(IL-15) 도메인 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 제 1 생물 활성 폴리펩타이드를 포함한다. IL-15는 T-세포 활성화 및 증식에 영향을 미치는 사이토킨이다. 면역 세포 활성화 및 증식에 영향을 미치는 IL-15 활성은 어떤 면에서 IL-2와 유사하지만, 근본적인 차이는 잘 특성화되었다(문헌[Waldmann, T A, 2006, Nature Rev . Immunol. 6:595-601]).
본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 제 1 융합 단백질은 IL-15 변체(또한 본 발명에서 IL-15 돌연변이체라고도 칭함)인 인터류킨-15(IL-15) 도메인을 포함한다. 상기 IL-15 변체는 바람직하게는 고유(또는 야생형) IL-15 단백질과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 IL-15 변체는 바람직하게는 IL-15Rα 폴리펩타이드에 결합하고 IL-15 작용물질 또는 길항물질로서 작용한다. 바람직하게는 작용물질 활성을 갖는 IL-15 변체는 초 작용물질 활성을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 IL-15 변체는 IL-15Rα와의 결합과 무관하게 IL-15 작용물질 또는 길항물질로서 작용할 수 있다. IL-15 작용물질은 야생형 IL-15에 비해 필적하거나 증가된 생물 활성에 의해 예시된다. IL-15 길항물질은 야생형 IL-15에 비해 감소된 생물 활성에 의해 또는 IL-15-매개된 반응을 억제하는 능력에 의해 예시된다. 일부 예에서, 상기 IL-15 변체는 상기 IL-15RβγC 수용체에 대해 증가되거나 감소된 활성으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 IL-15 변체의 서열은 하나 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 고유 IL-2 서열과 비교된 치환 또는 결실을 가지며, 상기와 같은 변화는 IL-15 작용물질 또는 길항물질 활성을 생성시킨다. 바람직하게는 상기 아미노산 치환/결실은 IL-15Rβ 및/또는 γC와 상호작용하는 IL-15의 도메인 중에 있다. 보다 바람직하게, 상기 아미노산 치환/결실은 상기 IL-15Rα 폴리펩타이드에 대한 결합 또는 IL-15 변체를 생성시키는 능력에 대해 영향을 미치지 않는다. IL-15 변체를 생성시키기에 적합한 아미노산 치환/결실은 본 발명에 제공된 바와 같은 온당한 또는 랜덤한 돌연변이 및 작용 분석, 또는 다른 실험적인 방법을 통해, 추정적이거나 공지된 IL-15 구조, 공지된 구조를 갖는 IL-2와 같은 상동 분자와 IL-15의 비교를 근거로 확인될 수 있다. 추가의 적합한 아미노산 치환은 추가적인 아미노산의 보존 또는 비-보존적인 변화 및 삽입일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 IL-15 변체는 성숙한 인간 IL-15 서열의 6, 8, 10, 61, 65, 72, 92, 101, 104, 105, 108, 109, 111, 또는 112번 위치의 하나 이상의 아미노산 치환/결실을 함유하며; 특히, D8N("D8"은 고유의 성숙한 인간 IL-15 서열 중 아미노산 및 잔기 위치를 지칭하고 "N"은 상기 IL-15 변체 중 상기 위치에서 치환된 아미노산 잔기를 지칭한다), I6S, D8A, D61A, N65A, N72R, V104P 또는 Q108A 치환은 길항물질 활성을 갖는 IL-15 변체를 생성시키고 N72D 치환은 작용물질 활성을 갖는 IL-15 변체를 생성시킨다.
케모킨은 사이토킨과 유사하게, 다른 세포에 노출 시 세포 면역의 다수의 다중 효과들 중 임의의 것의 원인일 수 있는 임의의 화학적 인자 또는 분자로서 정의된다. 적합한 케모킨은 비제한적으로 CXC, CC, C, 및 CX3C 케모킨 과 및 CCL-1 내지 CCL-28, CXC-1 내지 CXC-17, XCL-1, XCL-2, CX3CL1, MIP-1b, IL-8, MCP-1, 및 란테스(Rantes)를 포함할 수 있다.
성장 인자는, 특정 세포에 노출 시 영향을 받은 세포의 증식 및/또는 분화를 유도하는 임의의 분자를 포함한다. 성장 인자는 단백질 및 화학적 분자를 포함하며, 이들 중 일부는 GM-CSF, G-CSF, 인간 성장 인자 및 줄기 세포 생육 인자를 포함한다. 추가의 성장 인자들이 또한 본 발명에 개시된 바와 같이 사용하기에 적합할 수 있다.
독소 또는 세포독성제는 세포에 노출 시 치사 효과 또는 성장에 대한 억제 효과를 갖는 임의의 물질을 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 효과기 분자는 예를 들어 식물 또는 세균 기원의 세포 독소, 예를 들어 디프테리아 독소(DT), 시가 독소, 아브린, 콜레라 독소, 리신, 사포린, 슈도모나스 외독소(PE), 포크위드 항바이러스 단백질, 또는 젤로닌일 수 있다. 상기와 같은 독소의 생물 활성 단편은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어 DT A 쇄 및 리신 A 쇄를 포함한다. 또한, 상기 독소는 세포 표면에서 활성인 작용제, 예를 들어 포스포리파제 효소(예를 들어 포스포리파제 C)일 수 있다.
더욱이, 상기 효과기 분자는 화학요법 약물, 예를 들어 빈데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 블레오마이신, 또는 시스플라틴일 수 있다.
또한, 상기 효과기 분자는 진단 또는 영상화 연구에 적합한 검출 가능하게-표지된 분자일 수 있다. 상기와 같은 표지는 비오틴 또는 스트렙트아비딘/아비딘, 검출 가능한 나노입자 또는 결정, 효소 또는 그의 촉매 활성 단편, 형광 표지, 예를 들어 녹색 형광 단백질, FITC, 피코에리쓰린, 사이콤, 텍사스 레드 또는 양자점; 방사성핵종, 예를 들어 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-188 또는 비스무트-212; 인광 또는 화학발광 분자 또는 PET, 초음파 또는 MRI에 의해 검출 가능한 표지, 예를 들어 Gd- 또는 상자성 금속 이온-기재 콘트라스트제를 포함한다. 예를 들어 효과기 또는 태그를 포함하는 단백질의 제조 및 사용에 관한 명세에 대해서 문헌[Moskaug, et al. J. Biol . Chem. 264, 15709 (1989)]; [Pastan, I. et al. Cell 47, 641, 1986]; [Pastan et al., Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann . Rev . Biochem. 61, 331, (1992)]; ["Chimeric Toxins" Olsnes and Phil, Pharmac . Ther., 25, 355 (1982)]; 공개된 PCT 출원 제 WO 94/29350 호; 공개된 PCT 출원 제 WO 94/04689 호; 공개된 PCT 출원 제 WO2005046449 호 및 미국 특허 제 5,620,939 호를 참조하시오.
공유 결합된 IL-15 및 IL-15Rα 도메인을 포함하는 단백질 융합 또는 접합 복합체는 여러 가지 중요한 용도를 갖는다. 예를 들어, TCR을 포함하는 상기 단백질 융합 또는 접합 복합체를 사용하여 상기 IL-15:IL-15Rα 복합체를 상기 TCR과 특이적으로 결합할 수 있는 몇몇 세포로 전달할 수 있다. 따라서, 상기 단백질 융합 또는 접합 복합체는 상기 리간드를 포함하는 세포를 선택적으로 손상시키거나 살해하는 수단을 제공한다. 상기 TCR을 포함하는 단백질 융합 또는 접합 복합체에 의해 손상되거나 살해될 수 있는 세포 또는 조직의 예는 상기 TCR에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 하나 이상의 리간드를 발현하는 종양 및 바이러스 또는 세균 감염된 세포를 포함한다. 손상되거나 살해되기 쉬운 세포 또는 조직을 본 발명에 개시된 방법에 의해 쉽게 분석할 수 있다.
본 발명의 IL-15 및 IL-15Rα 폴리펩타이드는 천연 IL-15 및 IL-15Rα 분자, 예를 들어 인간, 마우스 또는 다른 설치류, 또는 다른 포유동물의 IL-15 및 IL-15Rα 분자에 대해 아미노산 서열에 있어서 적합하게 상응한다. 이들 폴리펩타이드 및 암호화 핵산의 서열은 예를 들어 인간 인터류킨 15(IL15)mRNA-GenBank: U14407.1, 무스 무스쿨루스 인터류킨 15(IL15)mRNA-GenBank: U14332.1, 인간 인터류킨-15 수용체 알파 쇄 전구체(IL15RA)mRNA-GenBank: U31628.1, 무스 무스쿨루스 인터류킨 15 수용체, 알파 쇄-GenBank: BC095982.1을 포함하여 문헌에 공지되어 있다.
일부 환경에서 본 발명의 단백질 융합 또는 접합 복합체는, 예를 들어 sc-TCR 또는 sc-항체의 원자가를 증가시키기 위해 다가로 제조하는 것이 유용할 수 있다. 특히, 상기 융합 단백질 복합체의 상기 IL-15와 IL-15Rα 도메인 간의 상호작용은 다가 복합체를 생성시키는 수단을 제공한다. 또한, 상기 다가 융합 단백질을, 예를 들어 표준 비오틴-스트렙트아비딘 표지화 기법을 사용하거나 또는 라텍스 비드와 같은 적합한 고체 지지체에 대한 접합에 의해 1 내지 4 개의 단백질(동일하거나 상이함) 간의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 제조할 수 있다. 화학적으로 가교결합된 단백질(예를 들어 덴드리머에 가교결합된)이 또한 적합한 다가 종들이다. 예를 들어, 상기 단백질을, 비오틴화 BirA 태그와 같이 변형될 수 있는 태그 서열을 암호화하는 서열 또는 화학 반응성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들어 Cys 또는 His를 포함시킴으로써 변형시킬 수 있다. 상기와 같은 아미노산 태그 또는 화학 반응성 아미노산을, 바람직하게는 상기 생물 활성 폴리펩타이드 또는 효과기 분자의 활성 부위에 대해 원위인, 상기 융합 단백질 중의 다양한 위치들에 배치시킬 수도 있다. 예를 들어 용해성 융합 단백질의 C-말단을 상기와 같은 반응성 아미노산(들)을 포함하는 태그 또는 다른 융합된 단백질에 공유 결합시킬 수 있다. 적합한 측쇄를 포함시켜 2 개 이상의 융합 단백질을 적합한 덴드리머 또는 다른 나노입자에 화학적으로 결합시켜 다가 분자를 제공할 수 있다. 덴드리머는 다수의 상이한 표면 작용기들 중 임의의 하나를 가질 수 있는 합성 화학 중합체이다(문헌[D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26:91:101 (1993)]). 본 발명에 따라 사용하기 위한 예시적인 덴드리머는 예를 들어 E9 스타버스트 폴리아민 덴드리머 및 E9 컴버스트 폴리아민 덴드리머를 포함하며, 이들은 시스틴 잔기들을 결합시킬 수 있다. 예시적인 나노입자는 리포솜, 코어-쉘 입자 또는 PLGA-기재 입자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 융합 단백질 복합체의 폴리펩타이드들 중 하나 또는 둘 모두는 면역글로불린 도메인을 포함한다. 한편으로, 상기 단백질 결합 도메인-IL-15 융합 단백질을 면역글로불린 도메인에 추가로 결합시킬 수 있다. 바람직한 면역글로불린 도메인은 다른 면역글로불린 도메인과 상호작용하여 상기 제공된 바와 같은 다중 쇄 단백질을 형성시키는 영역들을 포함한다. 예를 들어, 상기 면역글로불린 중쇄 영역, 예를 들어 IgG1 CH2-CH3은 안정하게 상호작용하여 Fc 영역을 생성시킬 수 있다. Fc 도메인을 포함하는 바람직한 면역글로불린 도메인은 효과기 작용, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체 단백질 결합 활성, 및/또는 글리코실화 부위를 갖는 영역들을 또한 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 융합 단백질 복합체의 면역글로불린 도메인은 Fc 수용체 또는 보체 결합 활성 또는 글리코실화를 감소시키거나 증대시키고, 이에 의해 생성 단백질의 생물 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 함유한다. 예를 들어, Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 돌연변이를 함유하는 면역글로불린 도메인을 사용하여 Fc 수용체-함유 세포에 대해 더 낮은 결합 활성을 갖는 본 발명의 융합 단백질 복합체를 생성시킬 수 있으며, 이는 특이 항원을 인식하거나 검출하도록 설계된 시약들에 유리할 수 있다.
핵산 및 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 특히 DNA 서열을 제공한다. 바람직하게는, 상기 DNA 서열은 염색체외 복제에 적합한 벡터, 예를 들어 파지, 바이러스, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, YAC, 또는 에피솜에 의해 운반된다. 특히, 목적하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 벡터를 사용하여 본 발명에 개시된 제조 방법을 용이하게 하고 상당량의 상기 융합 단백질을 수득할 수 있다. 상기 DNA 서열을 적합한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질-암호화 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소들을 함유하는 벡터 내에 삽입할 수 있다. 다양한 숙주-벡터 시스템을 사용하여 상기 단백질-암호화 서열을 발현시킬 수 있다. 여기에는 바이러스(예를 들어 우두 바이러스, 아데노바이러스 등)로 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예를 들어 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 효소 벡터를 함유하는 효소, 또는 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 세균과 같은 미생물이 있다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적합한 전사 및 번역 요소들 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 일반적으로 상기 샘브룩 등 및 아우수벨 등의 문헌을 참조하시오.
용해성 융합 단백질 복합체의 제조 방법이 본 발명에 포함되며, 상기 방법은 숙주 세포 내에 제 1 및 제 2 융합 단백질을 암호화하는 본 발명에 개시된 바와 같은 DNA 벡터를 도입시키고, 상기 숙주 세포를, 상기 융합 단백질을 상기 세포 또는 배지 중에서 발현시키고 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인과 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인 간의 결합을 허용하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성시키기에 충분한 조건 하에 배지 중에서 배양하고, 상기 용해성 융합 단백질 복합체를 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 정제함을 포함한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 바람직한 DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 효과기 분자를 암호화하는 서열에 작동적으로 결합된, 생물 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 제 1 뉴클레오타이드 서열의 도입을 위한 제 1 클로닝 부위를 포함하는, 포스포다이에스터 결합에 의해 결합된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 DNA 벡터에 의해 암호화된 융합 단백질 성분을 카세트 포맷으로 제공할 수 있다. "카세트"란 용어는 각각의 성분이 표준 재조합 방법에 의해 또 다른 성분에 대해 쉽게 대체될 수 있음을 의미한다. 특히, 카세트 포맷으로 형성된 DNA 벡터는, 상기 암호화된 융합 복합체를 혈청형을 발생시키는 능력을 갖거나 가질 수도 있는 병원체에 대해 사용해야 하는 경우 특히 바람직하다.
융합 단백질 복합체를 암호화하는 벡터를 제조하기 위해서, 상기 생물 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 적합한 리가제의 사용에 의해 효과기 펩타이드를 암호화하는 서열에 결합시킨다. 상기 제공되는 펩타이드를 암호화하는 DNA를 천연 공급원으로부터, 예를 들어 적합한 세포주로부터 DNA를 단리하거나, 또는 공지된 합성 방법, 예를 들어 포스페이트 트라이에스터 방법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어 문헌[Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. J. Gait, ed., 1984)]을 참조하시오. 합성 올리고뉴클레오타이드를 또한 상업적으로 입수할 수 있는 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 제조할 수 있다. 일단 단리되었으면, 상기 생물 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 또는 당해 분야에 공지된 다른 수단들에 의해 증폭시킬 수 있다. 상기 생물 활성 폴리펩타이드 유전자를 증폭시키기에 적합한 PCR 프라이머는 상기 PCR 산물에 제한 부위를 가할 수 있다. 상기 PCR 산물은 바람직하게는 상기 효과기 펩타이드에 대한 연접 부위 및 상기 생물 활성 폴리펩타이드-효과기 융합 복합체의 적합한 발현 및 분비에 필요한 리더 서열을 포함한다. 상기 PCR 산물은 또한 바람직하게는 상기 링커 서열을 암호화하는 서열, 또는 상기와 같은 서열의 연결을 위한 제한 효소 부위를 포함한다.
본 발명에 개시된 융합 단백질을 바람직하게는 표준 재조합 DNA 기법에 의해 생성시킨다. 예를 들어, 일단 상기 생물 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자가 단리되면, 서열을 상기 효과기 폴리펩타이드를 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 연결시킬 수 있다. 생물 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 상기 효과기 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 직접 연결시키거나, 또는 보다 전형적으로는 본 발명에 논의된 바와 같은 링커 서열을 암호화하는 DNA 서열을, 상기 생물 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 상기 효과기 펩타이드를 암호화하는 서열 사이에 삽입하고 적합한 리가제를 사용하여 연결시킬 수 있다. 생성된 하이브리드 DNA 분자를 적합한 숙주 세포에서 발현시켜 융합 단백질 복합체를 생성시킬 수 있다. 상기 DNA 분자를, 연결 후 암호화된 폴리펩타이드의 번역 프레임이 변경되지 않도록 5'에서 3' 배향으로 서로 연결시킨다(즉 상기 DNA 분자를 서로 인-프레임 연결시킨다). 상기 생성되는 DNA 분자는 인-프레임 융합 단백질을 암호화한다.
다른 뉴클레오타이드 서열을 또한 상기 유전자 구조물 중에 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 효과기 펩타이드에 융합된 생물 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 발현을 조절하는 프로모터 서열, 또는 상기 융합 단백질을 상기 세포 표면 또는 배양 배지로 향하게 하는 리더 서열을 상기 구조물 중에 포함시키거나, 또는 상기 구조물이 삽입되는 발현 벡터 중에 제공할 수 있다. 면역글로불린 또는 CMV 프로모터가 특히 바람직하다.
변형 생물 활성 폴리펩타이드, IL-15, IL-15Rα 또는 Fc 도메인 암호화 서열의 수득에 있어서, 당해 분야의 통상적인 숙련가들은 상기 폴리펩타이드를 몇몇 아미노산 치환, 첨가, 결실, 및 번역 후 변형에 의해, 생물 활성의 상실 또는 감소 없이 변형시킬 수도 있음을 알 것이다. 특히, 보존적인 아미노산 치환, 즉 유사한 크기, 전하, 극성 및 형태의 또 다른 아미노산에 대한 한 아미노산의 치환이 단백잘 작용을 현저하게 변경시키지는 않을 듯함은 널리 공지되어 있다. 단백질의 구성성분들인 20 개 표준 아미노산은 하기와 같이 4 개의 보존적인 아미노산 치환 그룹으로 광범위하게 분류될 수 있다: 비극성(소수성) 그룹은 알라닌, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판 및 발린을 포함하고; 극성(하전되지 않은, 중성) 그룹은 아스파라진, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 쓰레오닌 및 타이로신을 포함하며; 양으로 하전된(염기성) 그룹은 아르기닌, 히스티딘 및 리신을 함유하고; 음으로 하전된(산성) 그룹은 아스파트산 및 글루탐산을 함유한다. 동일한 그룹 내에서 하나의 아미노산의 또 다른 아미노산에 대한 단백질 중 치환은 상기 단백질의 생물 활성에 불리한 영향을 미치지는 않을 듯하다. 다른 예에서, 아미노산 위치에 대한 변형을 수행하여 상기 단백질의 생물 활성을 감소 또는 증대시킬 수 있다. 상기와 같은 변화를, 표적화된 잔기(들)의 공지되거나 추정된 구조 또는 작용 성질을 근거로 랜덤하게 또는 부위-특이적인 돌연변이를 통해 도입시킬 수 있다. 상기 변형 단백질의 발현에 이어서, 상기 변형으로 인한 생물 활성의 변화를 결합 또는 작용 분석을 사용하여 쉽게 평가할 수 있다.
뉴클레오타이드 서열들 간의 상동성을 DNA 하이브리드화 분석에 의해 측정할 수 있으며, 여기에서 상기 이중 가닥 DNA 하이브리드의 안정성은 존재하는 염기 짝짓기의 정도에 따라 변한다. 고온 및/또는 저 염 함량의 조건은 상기 하이브리드의 안정성을 감소시키며, 이를 선택된 정도보다 적은 상동성을 갖는 서열들의 어닐링을 방지하도록 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 약 55% G-C 함량을 갖는 서열의 경우, 40-50 C, 6 x SSC(염화 나트륨/나트륨 시트레이트 완충제) 및 0.1% SDS(나트륨 도데실 설페이트)의 하이브리드화 및 세척 조건은 약 60 내지 70%의 상동성을 나타내며, 50-65 C, 1 x SSC 및 0.1% SDS의 하이브리드화 및 세척 조건은 약 82 내지 97%의 상동성을 나타내고, 52C, 0.1 x SSC 및 0.1% SDS의 하이브리드화 세척 조건은 약 99 내지 100%의 상동성을 나타낸다. 뉴클레오타이드와 아미노산 서열을 비교(및 상동성 정도를 측정)하기 위한 광범위한 컴퓨터 프로그램을 또한 이용할 수 있으며, 상업적으로 입수할 수 있는 소프트웨어 및 무료 소프트웨어 모드의 공급원을 제공하는 목록이 아우수벨 등(1999)에서 발견된다. 쉽게 입수할 수 있는 서열 비교 및 다중 서열 정렬 연산은 각각 베이직 로컬 얼라인먼트 써치 툴(the Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST) (Altschul et al., 1997) 및 클러스탈(Clustal)W 프로그램이다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 입수할 수 있고 클러스탈 W의 한 버전은 2.ebi.ac.uk에서 입수할 수 있다.
상기 융합 단백질의 성분들을 제공된 거의 모든 순서로 구성할 수 있으며, 이들은 각각 의도된 작용을 수행할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 상기 생물 활성 폴리펩타이드를 상기 효과기 분자의 C 또는 N 말단 단부에 놓는다.
본 발명의 바람직한 효과기 분자는 상기 도메인들의 의도하는 작용에 도움이 되는 크기를 가질 것이다. 본 발명의 효과기 분자를 제조하고 널리 공지된 화학적 가교결합 방법을 포함한 다양한 방법들에 의해 상기 생물 활성 폴리펩타이드에 융합시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[Means, G. E. and Feeney, R. E. (1974) in Chemical Modification of Proteins, Holden-Day]을 참조하시오. 또한 문헌[S. S. Wong (1991) in Chemistry of Protein Conjugation and Cross - Linking, CRC Press]을 참조하시오. 그러나, 인-프레임 융합 단백질을 제조하기 위한 재조합 조작을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.
나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 융합 분자 또는 접합체 분자를 여러 방식으로 구성할 수 있다. 예시적인 구성에서, 상기 생물 활성 폴리펩타이드의 C-말단을 상기 효과기 분자의 N-말단에 작동적으로 결합시킨다. 상기 결합을 경우에 따라 재조합 방법에 의해 성취할 수 있다. 그러나, 또 다른 형태에서, 상기 생물 활성 폴리펩타이드의 N-말단을 상기 효과기 분자의 C-말단에 결합시킨다.
한편으로, 또는 또한, 하나 이상의 추가적인 효과기 분자를 필요한 경우 상기 생물 활성 폴리펩타이드 또는 접합 복합체에 삽입할 수 있다.
벡터 및 발현
다수의 전략을 사용하여 본 발명의 단백질 융합 복합체를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 상술한 융합 단백질 구조물을 공지된 수단에 의해, 예를 들어 상기 구조물의 삽입을 위해 상기 벡터 중에 절단부를 만들기 위해 제한 효소를 사용한 다음 연결시킴으로써 적합한 벡터에 통합시킬 수 있다. 이어서 상기 유전자 구조물을 함유하는 벡터를 상기 융합 단백질의 발현에 적합한 숙주 내에 도입시킨다. 일븐적으로 상기 샘브룩 등을 참조하시오. 적합한 벡터의 선택은 클로닝 프로토콜과 관련된 인자들을 기준으로 실험적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 사용되는 숙주와 상용성이어야 하고 그에 대한 적합한 레플리콘을 가져야 한다. 더욱이, 상기 벡터는 발현시켜야 하는 융합 단백질 복합체를 암호화하는 DNA 서열을 수용할 수 있어야 한다. 적합한 숙주 세포는 진핵생물 및 원핵생물 세포, 바람직하게는 쉽게 형질전환되고 배양 배지에서 빠른 성장을 나타낼 수 있는 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어 이 콜라이, 바실러스 서브틸리스 등, 및 진핵생물, 예를 들어 동물 세포 및 효모 균주, 예를 들어 에스 세레비지아에를 포함한다. 포유동물 세포, 특히 J558, NSO, SP2-O 또는 CHO가 일반적으로 바람직하다. 다른 적합한 숙주는 예를 들어 곤충 세포, 예를 들어 Sf9를 포함한다. 통상적인 배양 조건을 사용한다. 상기 샘브룩을 참조하시오. 이어서 안정한 형질전환된 또는 형질감염된 세포주를 선택할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질 복합체를 발현하는 세포를 공지된 과정에 의해 정할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린에 결합된 융합 단백질 복합체의 발현을 상기 결합된 면역글로불린에 특이적인 ELISA 및/또는 면역블럿팅에 의해 측정할 수 있다. IL-15 또는 IL-15Rα 도메인에 결합된 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 발현을 검출하기 위한 다른 방법들이 실시예에 개시되어 있다.
상기에 일반적으로 언급한 바와 같이, 숙주 세포를 목적하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 전파할 예비 목적으로 사용할 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 상기 융합 단백질의 생산이 특별히 의도되는 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함할 수 있다. 따라서 숙주 세포는 상기 융합물을 암호화하는 핵산을 전파할 수 있는 효모, 파리, 벌레, 식물, 개구리, 포유동물 세포 및 기관을 특별히 포함한다. 사용될 수 있는 포유동물 세포주의 비제한적인 예는 CHO dhfr-세포(문헌[Urlaub and Chasm, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)]), 293 세포(문헌[Graham et al., J Gen . Virol., 36:59 (1977)]) 또는 SP2 또는 NSO와 같은 골수종 세포(문헌[Galfre and Milstein, Meth. Enzymol., 73(B):3 (1981)])를 포함한다.
목적하는 융합 단백질 복합체를 암호화하는 핵산을 전파할 수 있는 숙주 세포는 또한 비-포유동물 진핵생물 세포, 예를 들어 곤충(예를 들어 에스피 프루기페르다(Sp. frugiperda)), 효모(예를 들어, 에스 세레비지아에(S. cerevisiae ), 에스 폼베(S. pombe), 피 파스토리스(P. pastoris .), 케이 락티스(K. lactis ), 에이치 폴리모르파(H. polymorpha)를 포함하며; 문헌[Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3(5):486496 (1992)]에 일반적으로 고찰된 바와 같이, 진균 및 식물 세포를 포함한다. 또한 이 콜라이 및 바실러스와 같은 몇몇 원핵생물도 고려된다.
목적하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 세포의 형질감염을 위한 표준 기법에 의해 숙주 세포 내에 도입시킬 수 있다. "형질감염시키는" 또는 "형질감염"이란 용어는 핵산을 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 모든 통상적인 기법들, 예를 들어 칼슘 포스페이트 공-침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션, 일렉트로포레이션, 미세주입, 바이러스 형질도입 및/또는 통합을 포함함을 의미한다. 숙주 세포의 형질감염에 적합한 방법을 상기 샘브룩 등 및 다른 실험 서적들에서 찾을 수 있다.
다양한 프로모터(전사 개시 조절 영역)를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 적합한 프로모터의 선택은 제안된 발현 숙주에 따라 다르다. 이종 공급원으로부터의 프로모터를, 상기 프로모터가 선택된 숙주에서 작용성인 한 사용할 수 있다.
프로모터 선택은 또한 펩타이드 또는 단백질 생산의 목적하는 효율 및 수준에 따라 변한다. 유도 프로모터, 예를 들어 tac를 종종 이 콜라이에서 단백질 발현 수준을 극적으로 증가시키기 위해 사용한다. 단백질의 과발현은 숙주 세포에 유해할 수도 있다. 결과적으로, 숙주 세포 성장이 제한될 수 있다. 유도 프로모터 시스템의 사용은 상기 숙주 세포가 유전자 발현의 유도 전에 허용 가능한 밀도로 배양되게 하여, 더 높은 생성물 수율을 촉진시킨다.
다양한 신호 서열들을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 상기 생물 활성 폴리펩타이드 암호화 서열에 상동성인 신호 서열을 사용할 수 있다. 한편으로, 발현 숙주에서 효율적인 분비 및 처리를 위해 선택되거나 설계된 신호 서열을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 적합한 신호 서열/숙주 세포 쌍은 비 서브틸리스에서의 분비를 위한 비 서브틸리스 sacB 신호 서열 및 피 파스토리스 분비를 위한 사카로마이세스 세레비지아에 α-교배 인자 또는 피 파스토리스 산 포스파타제 phoI 신호 서열을 포함한다. 상기 신호 서열을 상기 신호 펩티다제 절단 부위를 암호화하는 서열을 통해 상기 단백질 암호화 서열에 직접 연결시키거나, 또는 대개는 10 개 미만의 코돈으로 이루어지는 짧은 뉴클레오타이드 가교를 통해 직접 연결시킬 수 있으며, 이때 상기 가교는 하류 TCR 서열의 정확한 판독 프레임을 보장한다.
전사 및 번역을 증대시키기 위한 요소들을 진핵생물 단백질 발현 시스템에 대해서 확인하였다. 예를 들어, 이종 프로모터의 어느 한 쪽에 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 프로모터 1000 bp를 위치시키는 것은 식물 세포에서 전사 수준을 10- 내지 400-배까지 상승시킬 수 있다. 상기 발현 구조물은 적합한 번역 개시 서열을 또한 포함할 것이다. 적합한 번역 개시를 위한 코작 공통 서열을 포함하는 발현 구조물의 변형은 번역 수준을 10 배까지 증가시킬 수 있다.
선택성 마커가 종종 사용되며, 이는 발현 구조물의 부분이거나 상기로부터 분리될 수 있고(예를 들어 발현 벡터에 의해 운반되고), 따라서 상기 마커를 관심 유전자와 상이한 부위에서 통합시킬 수도 있다. 예로는 항생제에 대한 내성을 부여하는 마커(예를 들어 bla는 이 콜라이 숙주 세포에 암피실린 내성을 부여하고, nptII는 광범위하게 다양한 원핵생물 및 진핵생물 세포에 가나마이신 내성을 부여한다) 또는 최소 배지 상에서 상기 숙주의 성장을 허용하는 마커(예를 들어 HIS4는 히스티딘의 부재 하에서 피 파스토리스 또는 His- 에스 세레비지아에가 생육할 수 있게 한다)가 있다. 상기 선택성 마커는 상기 마커의 독립적인 발현을 허용하도록 그 자신의 전사 및 번역 개시 및 종결 조절 영역을 갖는다. 항생제 내성을 마커로서 사용하는 경우, 상기 선택을 위한 항생제의 농도는 상기 항생제에 따라, 일반적으로 10 내지 600 ㎍의 항생제/㎖의 배지의 범위로 다양할 것이다.
상기 발현 구조물을 공지된 재조합 DNA 기법(문헌[Sambrook et al., 1989]; [Ausubel et al., 1999])을 사용하여 조립한다. 제한 효소 절단 및 연결은 DNA의 2 개 단편을 결합시키기 위해 사용되는 기본 단계들이다. 상기 DNA 단편의 단부를 연결 전에 변형시킬 필요가 있을 수 있으며, 이를, 돌출부를 충전하고, 상기 단편(들)의 말단 부분을 뉴클레아제(예를 들어 ExoIII)로 결실시키고, 위치 선택적 돌연변이에 의해 수행하거나, 또는 PCR에 의해 새로운 염기쌍을 가함으로써 수행할 수 있다. 다중 링커 및 어댑터를 사용하여 선택된 단편들의 결합을 촉진시킬 수 있다. 상기 발현 구조물을 전형적으로는 이 콜라이의 제한, 연결 및 형질전환 라운드를 사용하는 단계들로 조립한다. 상기 발현 구조물의 제작에 적합한 다수의 클로닝 벡터들이 당해 분야에 공지되어 있으며(λZAP 및 pBLUESCRIPT SK-1, 스트라타진(Stratagene, La Jolla, CA), pET, 노바겐 인코포레이티드(Novagen Inc., Madison, WI), 아우수벨 등(1999)에 인용됨), 특별한 선택은 본 발명에 중요하지 않다. 클로닝 벡터의 선택은 상기 발현 구조물의 숙주 세포 내로의 도입을 위해 선택된 유전자 전달 시스템에 의해 영향을 받을 것이다. 각 단계의 끝에서, 생성되는 구조물을 제한, DNA 서열, 하이브리드화 및 PCR 분석에 의해 분석할 수 있다.
상기 발현 구조물을 선형 또는 환상의 클로닝 벡터 구조물로서 숙주 내로 형질전환시키거나, 또는 상기 클로닝 벡터로부터 제거하여 그대로 사용하거나, 또는 전달 벡터 상에 도입시킬 수 있다. 상기 전달 벡터는 상기 발현 구조물을 상기 선택된 숙주 세포 유형에 도입 및 유지시키는 것을 촉진한다. 상기 발현 구조물을 다수의 공지된 유전자 전달 시스템(예를 들어 자연적인 능력, 화학적으로 매개된 형질전환, 원형질체 형질전환, 일렉트로포레이션, 생물학적 형질전환, 형질감염, 또는 접합) 중 어느 하나에 의해 숙주 세포 내로 도입시킨다(문헌[Ausubel et al., 1999]; [Sambrook et al., 1989]). 상기 선택된 유전자 전달 시스템은 사용된 숙주 세포 및 벡터 시스템에 따라 다르다.
예를 들어, 상기 발현 구조물을 원형질체 형질전환 또는 일렉트로포레이션에 의해 에스 세레비지아에 내로 도입시킬 수 있다. 에스 세레비지아에의 일렉트로포레이션은 쉽게 수행되며, 스페로플라스트 형질전환에 필적하는 형질전환 효율을 제공한다.
본 발명은 또한 관심 융합 단백질의 단리를 위한 제조 공정을 제공한다. 상기 공정에서, 조절 서열에 작동적으로 결합된 관심 단백질을 암호화하는 핵산이 도입되는 숙주 세포(예를 들어 효모, 진균, 곤충, 세균 또는 동물 세포)를 배양 배지 중에서 생산 규모로 증식시켜 상기 관심 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사를 자극한다. 후속으로, 상기 관심 융합 단백질을 수확된 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 단리한다. 표준 단백질 정제 기법을 사용하여 상기 배지 또는 상기 수확된 세포로부터 관심 단백질을 단리할 수 있다. 특히, 상기 정제 기법을 사용하여, 롤러 병, 스피너 플라스크, 조직 배양 플레이트, 생물반응기 또는 발효기를 포함하는 다양한 실행으로부터 목적하는 융합 단백질을 대규모(즉 최소한 밀리그램 양으로)로 발현 및 정제할 수 있다.
발현된 단백질 융합 복합체를 공지된 방법에 의해 단리 및 정제할 수 있다. 전형적으로 상기 배양 배지를 원심분리하거나 여과하고 이어서 상등액을 친화성 또는 면역친화성 크로마토그래피, 예를 들어 단백질-A 또는 단백질-G 친화성 크로마토그래피, 또는 발현된 융합 복합체, 예를 들어 결합된 TCR 또는 그의 면역글로불린 영역과 결합하는 단클론 항체의 사용을 포함하는 면역친화성 프로토콜에 의해 정제한다. 본 발명의 융합 단백질을 공지된 기법들의 적합한 조합에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 이들 방법은 예를 들어 용해도를 이용하는 방법, 예를 들어 침전 및 용매 침전, 분자량의 차이를 이용하는 방법, 예를 들어 투석, 한외 여과, 젤-여과 및 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동, 전기전하의 차이를 이용하는 방법, 예를 들어 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 특정한 친화성을 이용하는 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 소수성 차이를 이용하는 방법, 예를 들어 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 및 등전점 차이를 이용하는 방법, 예를 들어 등전점 집중 전기영동, 금속 친화성 컬럼, 예를 들어 Ni-NTA를 포함한다. 이러한 방법들과 관련된 명세에 대해 일반적으로 상기 샘브룩 등 및 아우수벨 등의 문헌을 참조하시오.
본 발명의 융합 단백질은 실질적으로 순수한 것이 바람직하다. 즉, 상기 융합 단백질을 상기 융합 단백질이 바람직하게는 80% 또는 90% 내지 95% 이상의 균일성(w/w)으로 존재하도록 상기 단백질을 천연으로 수반하는 세포 대용물로부터 단리하였다. 98% 이상 99%의 균일성(w/w)을 갖는 융합 단백질이 다수의 약학, 임상 및 연구 용도에 가장 바람직하다. 실질적으로 정제되었으면, 상기 융합 단백질은 치료 용도의 경우 오염물질이 실질적으로 없어야 한다. 일단 부분적으로 또는 실질적인 순도로 정제되었으면, 상기 용해성 융합 단백질을 치료학적으로, 또는 본 발명에 개시된 바와 같은 시험관 내 또는 생체 내 분석을 수행하는데 사용할 수 있다. 실질적인 순도를 다양한 표준 기법들, 예를 들어 크로마토그래피 및 젤 전기영동에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 용해성 TCR 융합 복합체는 충분히 절두된 TCR 도메인을 함유하며, 따라서 상기 TCR 융합 복합체는 발현 후 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 따라서, 절두된 TCR 융합 복합체는 소수성 잔기가 풍부한 영역, 전형적으로는 상기 TCR 분자의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않을 것이다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 바람직한 절두된 TCR 분자의 경우, 상기 절두된 TCR 융합 복합체 중에 바람직하게는 대략 최종 시스테인에서부터 상기 β 쇄의 C-말단 잔기까지 및 대략 최종 시스테인에서부터 상기 TCR 분자의 α 쇄의 C-말단 잔기까지는 포함되지 않는다.
본 발명의 융합 단백질 복합체는 암성이거나 감염되거나, 또는 하나 이상의 질병에 의해 감염될 수 있는 다양한 세포와 함께 시험관 내 또는 생체 내에서 사용하기에 적합하다.
상세한 설명
인간 인터류킨-15(hIL-15)는 항원 제공 세포 상에서 발현된 인간 IL-15 수용체 α 쇄(hIL-15Rα)에 의해 면역 효과기 세포에 트랜스-제공된다. IL-15Rα는 hIL-15와 주로 세포 외 스시 도메인(hIL-15RαSu)을 통해 높은 친화성(38 pM)으로 결합한다. 여기에서 우리는 상기 hIL-15 및 hIL-15RαSu 도메인을 다중 도메인 융합 복합체의 제작에 스캐폴드로서 사용할 수 있음을 설명한다. 2가 및 이중 특이성 T 세포 수용체(TCR) 융합 복합체는 모두 상기 hIL-15 및 hIL-15RαSu 쇄의 N-말단에 융합된 다양한 단일-쇄(sc) TCR 도메인의 조합을 통해 상기 스캐폴드를 사용하여 형성되었다. 이러한 융합물에서, 상기 scTCR 도메인은 항원 결합 활성을 유지하며 상기 hIL-15 도메인은 수용체 결합 및 생물 활성을 나타낸다. 2가 scTCR 융합물은 증가된 분자 결합능으로 인해 개선된 항원 결합 능력을 나타낸 반면, 2 개의 상이한 scTCR 도메인을 포함하는 융합물은 2 개의 동족 펩타이드/MHC 복합체를 결합시킬 수 있었다. scTCR 및 scCD8αβ 도메인을 함유하는 이중특이성 분자는 또한 상기 2가 또는 1가 scTCR 분자보다 동족 펩타이드/MHC 복합체에 대해 현저하게 더 양호한 결합을 나타내며, 이는 상기 IL-15:IL-15Rα 스캐폴드가 주어진 표적과의 다중-도메인 상호작용을 지지하기 위해 필요한 가요성을 나타냄을 입증한다. 놀랍게도, 작용성 TCR을 또한 상기 hIL-15 및 hIL-15RαSu 도메인에 대한 융합물로서 별도로 상기 TCR α 및 β 쇄를 동시-발현시킴으로써 형성시킬 수 있다. 최종적으로 우리는 상기 융합된 hIL-15 도메인을 부위-특이적 돌연변이를 통해 조작하여 초작용물질 또는 길항물질 사이토킨 활성을 제공할 수 있다. 함께, 이러한 성질은 상기 hIL-15 및 hIL-15RαSu 도메인이 신규의 표적화된 면역 분자를 생성시키기 위한 다방면의 작용성 스캐폴드로서 사용될 수 있음을 가리킨다.
IgG 도메인, 특히 Fc 단편은 승인된 생물학적 약물을 포함하여 다수의 치료 분자들에 대한 이량체성 스캐폴드로서 성공적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, 에타너셉트는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 결합된 용해성 인간 p75 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 수용체(sTNFR)의 이량체이다. 이러한 이량체화는 에타너셉트를 TNF-α 활성의 억제 있어서 단량체성 sTNFR보다 1,000 배까지 더 효능 있게 하며, 단량체 형태보다 5 배 더 긴 혈청 반감기를 갖는 융합물을 제공한다. 그 결과, 에타너셉트는 생체 내에서 TNF-α의 염증 유발 활성의 중화에 유효하며 다수의 상이한 자가면역 적응증들에 대한 환자 성과의 개선에 유효하다.
상기 Fc 단편은 그의 이량체화 활성 외에, 보체 활성화 및 천연 살해(NK) 세포, 호중구, 식세포 및 수지상 세포 상에 나타난 Fcγ 수용체와의 상호작용을 통해 세포독성 효과기 작용들을 또한 제공한다. 항암 치료 항체 및 다른 항체 도메인-Fc 융합 단백질과 관련하여, 이러한 활성은 동물 종양 모델 및 암 환자에게서 관찰되는 효능에 중요한 역할을 하는 듯하다. 그러나, 이러한 세포독성 효과기 반응은 다수의 치료 용도에 충분하지 않을 수도 있다. 따라서, 상기 Fc 도메인의 효과기 활성의 개선 및 확대 및 표적화된 치료 분자를 통해 질병 부위로 T 세포 활성을 포함한 세포용해 면역 반응을 보충하는 다른 수단의 개발에 상당한 관심이 존재하였다. IgG 도메인을 스캐폴드로서 사용하여 이중특이성 항체를 형성시켜 전통적인 하이브리도마 융합 기술에 의해 생성된 생성물의 질 및 양을 개선시켰다. 이러한 방법은 다른 스캐폴드의 단점들을 우회하지만, 포유동물 세포에서 임상 개발 및 사용을 지지하기에 충분한 수준으로 이중특이성 항체를 생성시키는 것은 어려웠다.
새로운, 인간-유래된 면역자극 다량체 스캐폴드를 개발하고자, 우리는 인간 IL-15(hIL-15) 및 IL-15 수용체 도메인의 사용에 초점을 맞추었다. hIL-15는 높은 결합 친화성(평형 해리 상수(KD) 약 10-11 M)으로 hIL-15 수용체 α-쇄(hIL-15Rα)와 결합하는 사이토킨의 작은 4 α-나선 다발 계열의 구성원이다. 이어서 상기 생성되는 복합체를 T 세포 및 NK 세포의 표면상에 나타난 인간 IL-2/15 수용체 β/공통 γ 쇄(hIL-15RβγC) 복합체에 트랜스-제공한다. 상기 사이토킨/수용체 상호작용은, 바이러스 감염된 세포 및 악성 세포의 근절에 중요한 역할을 하는 효과기 T 세포 및 NK 세포의 확대 및 활성화를 생성시킨다. 통상적으로, hIL-15 및 hIL-15Rα를 수지상 세포에서 공동생성시켜 세포 내 복합체를 형성시키며 이는 후속적으로 분비되고 세포 표면상에서 이종이량체 분자로서 나타난다. 따라서, hIL-15 및 hIL-15Rα 상호작용의 특징은 이들 쇄-간 결합 도메인이 신규의 인간-유래된 면역자극 스캐폴드로서 작용하여 표적-특이적 결합이 가능한 용해성 이량체 분자를 제조할 수 있음을 암시한다. 여기에서, 우리는 다중-부위-특이성 단백질 복합체에 대한 표적 항원 및 이종이량체에 대해 증가된 작용적 결합 친화성으로 용해성 동종이량체를 모두 생성시키는 hIL-15:hIL-15Rα 스캐폴드의 사용 가능성을 설명하기 위해서 T 세포 수용체(TCR) 및 CD8 결합 도메인을 포함하는 다수의 융합 단백질의 생성 및 특성화를 개시한다. 우리는 또한 이들 융합 단백질이 면역 효과기 세포 반응을 자극할 수 있는 효능 있는 hIL-15 활성을 보유함을 보인다.
여기에서, 우리는 새로운 이량체 분자를 생성시키기 위한 hIL-15:hIL-15RαSu 기재 스캐폴드의 잠재적인 용도를 설명한다. 상기 이량체 융합 단백질 복합체는 그의 hIL-15 도메인 및 결합 도메인의 면역자극 및 표적-특이성 생물 활성을 보유하였으며, 이는 상기 hIL-15 및 hIL-15Rα의 첨가가 상기 융합 도메인의 공간 배열을 현저하게 변경시키지 않고 사이토킨 활성에 영향을 미치지 않으면서 적합한 정도의 형태적 융통성을 제공하였음을 가리킨다. 따라서, 상기 스캐폴드를 사용하여 다가 융합 복합체, 예를 들어 c264scTCR 이량체를 형성시켜 분자 또는 이중특이성 분자, 예를 들어 c264scTCR/c149scTCR 이종이량체의 전체 결합 친화성을 증가시킬 수 있었다. 모든 경우에, 상기 용해성 융합 단백질을 재조합 CHO 세포 배양물에서 비교적 높은 수준으로 생성시켰으며(광범위한 세포주 선별 또는 최적화 없이 세포 배양 상등액 중에 리터당 ㎎) 상기 세포 배양 상등액으로부터 쉽게 정제할 수 있었다. 우리는 또한 상기 hIL-15:hIL-15RαSu-기재 스캐폴드의 유용성을, 상기 hIL-15 및 hIL-15RαSu의 N-말단들에 2 개의 폴리펩타이드 쇄의 세포 외 도메인을 융합시킴으로써 확대시켜, 용해성, 생물 활성의 2-쇄 분자, 예를 들어 α/β TCR을 생성시킬 수 있음을 입증하였다. 이러한 포맷은 가능하게는 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 복합체의 원위 N-말단에 융합된 맞접은 TCR α/β 쇄와 상기 복합체 중간에 위치한 hIL-15RβγC 결합 부위간의 입체 장애로 인해, hIL-15 활성을 보통으로 감소시켰다. 다른 포맷들이 가능하며 이들을 통상적인 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다.
상기 hIL-15:hIL-15RαSu 기재 스캐폴드를 또한 사용하여, 상기 CD8 α/β 및 TCR 도메인이 동일한 pMHCI 복합체에, 그러나 공간적으로 다른 부위에 결합할 수 있는 OT1scTCR/scCD8 이종이량체를 생성시켰다. 용해성 pMHCI 시약을 사용하는 선행 연구는 CD8이 개시/중단율 모두에 대한 영향을 통해 세포 표면에서 TCR:pMHCI 상호작용을 안정화하고 증대시킴을 측정하였다. 이러한 영향은 CD8 공-수용체 활성에 대한 상기 T 세포의 의존성을 측정하는데 중요하며, 따라서 pMHCI-특이성 T 세포 활성화에 대한 CD8의 요구는 TCR:pMHCI 친화성과 역으로 상관된다. 그러나, 용해성의 정제된 CD8 α/β, TCR 및 pMHCI 단백질을 사용하는 여러 가지 결합 연구들은 TCR:pMHCI 상호작용이 CD8의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받지 않음을 입증하였으며, 이는 협력적인 결합 효과가 없음을 암시한다.
우리의 세포-기재 및 OT1scTCR/scCD8 이종이량체를 사용한 SPR 결합 연구의 결과는 동일한 용해성 분자 상에 나타난 TCR 및 CD8 도메인이 1가 또는 2가 TCR 도메인을 지니는 분자에 대해 관찰된 경우보다 훨씬 더 양호한 펩타이드/MHC 결합 활성을 나타냄을 보이는 초기의 보고서와 대조적이다. 이러한 효과는 상기 pMHCI:OT1scTCR/scCD8 이종이량체 복합체의 보다 느린 중단율 및 보다 빠른 개시율 모두에서 반영되며, 이는 T 세포 상의 CD8 및 TCR 분자에 대한 pMHCI 결합에 관한 관찰과 일치한다. 따라서, 상기 OT1scTCR/scCD8 이종이량체는 T 세포 상의 상기 OT1 TCR의 결합을 모방하며, 이는 pMHC 상호작용에 대한 CD8 공-수용체 활성의 강한 의존성을 나타낸다. 이러한 결과는 상기 scTCR/scCD8 이종이량체 및 상기 분자의 변체가 무세포 시스템에서 3급 TCR:pMHCI:CD8 복합체 간의 분자 상호작용을 추가로 분석하기에 매우 유용한 도구로서 작용할 수 있음을 가리킨다. 또한, 증대된 pMHCI 결합 활성을 갖는 scTCR/scCD8 이종이량체-기재 시약은 증가된 결합 친화성을 위해 상기 TCR 도메인을 돌연변이시킬 필요 없이, 병든 세포 상의 항원 제공을 검출함에 있어서 유용성을 가질 수 있다.
상기 OTIscTCR 융합물에 대한 우리의 SPR 실험의 결과는 알람(Alam) 등에 의해 보고된 경우(고정화된 OVA 펩타이드/H-2Kb 복합체에 대한 1가 OT1 TCRα/β 이종이량체의 결합 친화성은 대략 6 μM인 것으로 나타났다)와 상이하다. 우리의 연구에서, 우리는 상기 OT1scTCR/birA 단량체의 OVA 펩타이드/H-2Kb-결합을 검출할 수 없었으며 상기 OT1scTCR/birA 이량체는 30 μM의 겉보기 KD를 나타내었다. 상기 OT1 TCR은 단일-쇄 Vα-링커-Vβ-Cβ 분자로서 포맷화될 때 결합 활성을 상실할 수 있다. 그러나, 우리는 OT1scTCR/birA와 2-쇄 구조물을 비교할 때 동등한 활성을 관찰하였다. 더욱이, 선행의 연구들은 CD8 결합을 없애는 Kb 돌연변이를 갖는 OVA 펩타이드/H-2Kb 사량체가 고 농도의 사량체를 사용하는 경우에조차도 OT1 TCR-함유 세포에 대해 특이적인 결합 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않음을 입증하였으며, 이는 OT1 TCR과 그의 동족 pMHCI 간의 매우 낮은 친화성 상호작용을 암시한다. 대조적으로, 상기 CD8 결합 돌연변이가 없는 OVA 펩타이드/H-2Kb 사량체는 OT1 TCR-함유 세포를 밝게 염색할 수 있었으며, 이는 본 연구에서 관찰된 OT1 TCR 결합 활성을 증대시키는 CD8의 능력과 일치한다.
상기 hIL-15:hIL-15RαSu-기재 스캐폴드를 다가 또는 다중특이성 표적 요법을 생성시키기 위한 IgG 스캐폴드의 Fc 도메인처럼 활용할 수 있다. 상기 hIL-15 도메인은 효과기 NK 및 CD8+ 기억 T 세포의 증식 및 활성화를 자극하기 위한 그의 효능 있는 활성과 함께, 항체-의존성 세포 세포독성 및 IgG-기본 접근법과 관련된 보체 활성화 이상으로 잠재적인 면역요법 기전들의 범위를 확대한다. 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 활성을 조작하기 위해 사용되는 것들과 유사한 접근법을 사용하여, 우리는 상기 IL-15 도메인을 그의 작용 활성을 증가 또는 감소시키기 위해 돌연변이시킬 수 있음을 입증한다. 우리는 상기 IL-15 도메인 중에 N72D 돌연변이를 함유하는 hIL-15:hIL-15RαSu 융합 분자가 생물 활성에 있어서 3 내지 4 배 증가를 나타내는 반면, IL-15 D8N 돌연변이는 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않음을 보인다. IL-15 초작용물질-기재 융합 단백질은 암 및 감염성 질병에 대한 표적 면역요법제로서 작용할 수 있지만, 질병 부위에서 IL-15 반응성 세포를 억제할 수 있는 IL-15 길항물질은 동종이식편 거부 및 염증성 자가면역 질병의 치료에, 특히 기억 CD8 T 세포가 질병 병리학에 한 역할을 하는 경우, 치료 가능성을 가질 수도 있다. 비-표적 IL-15 돌연변이체/Fcγ2a 길항물질 단백질은 이미 실험 동물 모델에서 섬 및 심장 동종이식편 거부를 억제하고 관절염의 발생 및 진행을 방지하는데 유효함이 입증되었다. 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 융합 단백질과 관련하여 IL-15 길항물질 도메인을 사용한 유사한 접근법이 가능하다. 또한, 몇몇 상황 하에서, 다량체 분자의 생성을 위해 작용 불활성 스캐폴드를 갖는 것이 바람직할 수도 있다. 예를 들어 우리는 hIL-15Rβγ와의 상호작용을 제거하는 IL-15 D8N 돌연변이를 함유하는 scTCR/hIL-15:scTCR/hIL-15RαSu 융합물이 IL-15 수용체 복합체를 나타내는 세포의 보다 양호한 TCR 항원-특이성 염색을 제공함을 발견하였다.
우리는 본 발명에서 설명을 위해 표적화 도메인으로서 TCR 및 CD8 분자에 초점을 두었지만, 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 스캐폴드를 사용하여 항체, 부착 분자, 또는 다른 수용체로부터 유도된 단백질 도메인과 함께 다른 신규의 분자들을 제작할 수 있음을 안다. 또한 결정 구조에 근거하여, 변형에 이용될 수 있는 상기 hIL-15 및 hIL-15RαSu의 C-말단에 대한 단백질 도메인 융합을 생성시킬 수 있다. 상기 생성 분자는 4 개 이하의 상이한 표적-인식 능력을 함유할 수 있다. 적합한 융합 상대와 함께, 이러한 유형의 분자는 면역 효과기 세포와 표적 세포의 접합을 촉진하고 표적 세포의 유효한 살해를 성취할 수 있다. 또한, 상기 복합체의 IL-15 도메인은 면역자극 활성을 제공하여 효과기 세포 증식 및 세포독성을 지지함으로써 상기 과정을 더욱 증대시킬 수 있다. 이러한 개념에 근거하여 다양한 다중-작용성 분자들을 항암제 또는 항바이러스 면역요법제로서 사용한다.
본래는, 표준 포유동물 세포 시스템에서의 불량한 발현 수준은 치료제로서 재조합 hIL-15의 개발을 제한하였다. 본 발명에서 입증된 바와 같이, 임상적인 개발 및 잠재적인 제품 상업화를 지지할 수 있는 수준으로 scTCR/hIL-15:scTCR/hIL-15RαSu 복합체의 발현을 성취할 수 있다. 또한, 상기 IL-15Rα 쇄는 가능하게는 상기 사이토킨의 약동학을 개선시킴으로써, 기전에 얽매이지 않고 hIL-15의 생체 내 활성을 증대시킴이 입증되었다. hIL-15:hIL-15RαSu 복합체의 다가 성질 및/또는 다중 특이성 표적화 디자인과 함께 상기 복합체의 상기 2 개의 특성은 암 및 바이러스 감염에 대한 면역요법제로서 hIL-15의 충분한 가능성을 포착할 기회를 제공한다.
실시예에 제공된 바와 같이, 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 hIL-15:hIL-15RαSu 융합 단백질 복합체는 추가적인 이점들을 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 Fc 도메인의 결합은 다가 및 다중특이성 상호작용을 가능하게 하는 다중 쇄 분자의 생성을 허용한다. 실제로, 동일한 scTCR의 다중 도메인을 포함하는 본 발명의 융합 단백질 복합체는 상기 이량체성 scTCR 융합의 활성을 근거로 예상되는 경우보다 증대된 항원 결합 활성을 나타내었다. 일부의 경우에, 본 발명의 융합 복합체는 IL-15RβγC-함유 면역 세포 및 Fc 수용체-함유 면역 세포 모두와 결합하고 이들을 활성화할 수 있으며, 이는 효능 있는 면역 자극 활성을 허용한다. 2 개의 IL-15 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질 융합 복합체는 다른 IL-15 융합 단백질에 비해 예상된 경우보다 더 양호한 IL-15 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 단백질 융합 복합체는 TCR-IgG1 융합 단백질보다 펩타이드/MHC 제공 표적 세포에 대한 항체 Fc 의존적인 세포 세포독성을 매개함에 있어서 더 유효하였다. 상기 개선된 활성은 상기 펩타이드/MHC 복합체에 대한 상기 단백질 융합 복합체의 증대된 결합의 결과일 수도 있고/있거나 Fc 수용체 또는 IL-15 수용체를 나타내는 효과기 세포에 대한 반응성을 증가시킬 수도 있다. 더욱이, 돌연변이 분석을 통해, 상기 융합 단백질 복합체의 TCR, IL-15 및 IgG Fc 도메인 각각을, 목적하는 생물 효과를 갖는 다중특이성 복합체를 제공하도록 그의 결합 및 작용 활성을 변경시키기 위해 쉽고 독립적으로 조작할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 복합체는 유리 IL-15보다 포유동물에서 현저하게 더 양호한 약동학 프로파일을 갖는 것으로 입증되었다. 또한, 상이한 분석 방법에 의해 관찰된 유사한 PK 프로파일을 근거로, 상기 융합 단백질 복합체는 폴리펩타이드 쇄 절단 또는 해리의 증거 없이 다중 쇄 분자로서 생체 내에서 완전하게 남아있는다. 또한, 본 발명의 융합 단백질 복합체는 동물에서 표적 함유 및 비-표적 함유 종양 모두에 대해 항종양 활성을 매개할 수 있고 동몰 용량으로 투여된 rhIL-15보다 더 효능 있는 항종양 효능을 나타내는 것으로 나타났다. 더욱이, 유효 용량의 상기 융합 단백질에 의한 치료는 이들 동물 모델에서 잘 허용되었다.
실시예 1 - c264scTCR / huIL15R α 스시 - huIgG1 및 c149scTCR / huIL15N72D 유전자 융합물을 함유하는 발현 벡터의 제작
T2 분자(T2M)로서 지칭되는 융합 단백질은 다중 쇄 폴리펩타이드로 이루어진다(도 1). 본 발명의 하나의 실시태양에서, 이들 폴리펩타이드 중 하나는 WO2008143794(본 발명에 참고로 인용됨)에 개시된 바와 같이 단백질-결합 도메인과 IL-15(또는 IL-15 변체) 간의 융합물을 포함한다. T2의 제 2 폴리펩타이드는 단백질 결합 도메인, IL-15Rα 도메인과 면역글로불린 도메인 간의 융합물을 포함한다. 한편으로, 상기 단백질 결합 도메인-IL-15 융합 단백질을 면역글로불린 도메인에 추가로 결합시킬 수 있다. 바람직한 면역글로불린 도메인은 다른 면역글로불린 도메인과 상호작용하여 다중 쇄 단백질을 형성할 수 있게 하는 영역들을 포함한다. 예를 들어, 상기 면역글로불린 중쇄 영역, 예를 들어 IgG1 CH2-CH3은 상호작용하여 Fc 영역을 생성시킬 수 있다. 바람직한 면역글로불린 도메인은 또한 효과기 작용, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체 단백질 결합 활성 및/또는 글리코실화 부위를 갖는 영역들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 T2 분자의 면역글로불린 도메인은 Fc 수용체 또는 보체 결합 활성 또는 글리코실화를 감소시키거나 증대시키는 돌연변이를 함유하며, 이에 의해 생성 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미친다. 예를 들어, Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 돌연변이를 함유하는 면역글로불린 도메인을 사용하여 Fc 수용체-함유 세포에 대해 더 낮은 결합 활성을 갖는 T2 분자를 생성시킬 수 있었으며, 이는 TCR-특이성 항원을 인식하거나 검출하도록 설계된 시약에 유리할 수 있다.
인간 IL-15Rα 스시 도메인(huIL15Rα스시) 및 인간 IgG1 불변 영역(huIgG1 CH1-CH2-CH3)에 융합된 p53(aa264-272) 단일-쇄 TCR(c264scTCR이라 지칭됨)을 함유하는 발현 벡터의 제작을 하기와 같이 수행하였다. 상기 c264scTCR/huIgG1 유전자 단편을 앞서 제작된 pNEF38-c264scTCR/huIgG1 벡터로부터 PacI 및 MluI에 의한 제한 절단에 의해 제거하였다. 상기 유전자 단편을 젤-정제하고 동일한 제한 효소로 절단된 pMSGV 벡터에 연결하여, pMSGV-c264scTCR/huIgG1이라 칭하는 구조물을 생성시켰다. 상기 CMV 프로모터를 함유하는 DNA 단편을 NruI 및 HindIII에 의한 절단에 따라 pcDNA3.1로부터 정제하였다. 상기 단편을, PacI로 절단하고 DNA 폴리머라제를 충전하여 불활성 단부를 생성시키고 이어서 HindIII로 절단한 pMSGV-c264TCR/huIgG1에 연결하였다. 생성 구조물을 pMC-c264scTCR/huIgG1이라 명명하였다. 앞서 제조된 pNEF38-c264scTCR/huIL-15Rα스시(WO2008143794 참조)로부터의 huIL15Rα스시 유전자 단편을 하기의 PCR 조건: 95C, 2분, 1 주기; 95C, 20초, 65C, 20초; 70C, 20초, 35 주기; 72C, 10 분, 1 주기 하에서 KOD 고온 출발 DNA 폴리머라제(EMD)에 의해 전면 프라이머: 5'-TGTTGGGAATTCATCACGTGCCCTC-3' 및 후면 프라이머: 5'-TGGTGTGAATTCTCTAATGCATTTGAGACTGG-3'로 증폭시켰다. 인간 IL15Rα스시 유전자의 PCR 산물을 젤 정제하고 EcoRI로 절단하였다. 상기 유전자를 EcoRI로 절단한 pMC-c264scTCR/huIgG1에 연결시켰다. 상기 인간 IL15Rα스시 도메인을 암호화하는 DNA 단편의 상기 pMC-c264scTCR/huIgG1 내로의 클로닝은 하기의 서열을 포함하는 c264scTCR/huIL15Rα스시-huIgG1 융합 유전자를 생성시켰다: 3' -면역글로불린 중쇄 리더 - 264 TCR V-α - 펩타이드 링커 - 264 TCR V-β - 인간 TCR C-β - 인간 IL15Rα스시 - 인간 IgG1 중쇄. 정확한 인간 IL15Rα스시 유전자 삽입물을 함유하는, 도 2에 도시된 상기 생성 벡터(pMC.c264scTCR-Su/IgG1.PUR)를 진단 PCR을 근거로 확인하고 DNA 서열화에 의해 재확인하였다. 상기 c264scTCR/huILIL15Rα스시/huIgG1 유전자 및 단백질의 서열을 각각 도 3 및 도 4에 나타낸다.
내부 EcoRI 부위(및 상응하는 암호화 서열)가 결여된, c264scTCR/huIL-15Rα스시-huIgG1 유전자 융합물을 함유하는 상이한 발현 벡터를 제작하였다. 상기 벡터에 대해서, 상기 c264scTCR 유전자 단편의 일부를 전면 프라이머: 5'GTACGACTTAATTAACTCGAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGG3' 및 후면 프라이머: 5'CTTCCCGTTAACCCACCAGCTCAGCTCCACGTG3'으로 c264scTCR/huIgG1 벡터로부터 증폭시켰다.
상기 c264scTCR 유전자 단편의 TCR β 불변 영역의 나머지를 전면 프라이머: 5'CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3' 및 후면 프라이머: 5'GAGGGCACGTGATGTCTGCTCTACCCCAGGCCTC3'으로 c264scTCR/huIgG1 벡터로부터 증폭시켰다.
상기 huIL15Rα스시 유전자 단편을 전면 프라이머: 5'GTAGAGCAGACATCACGTGCCCTCCCCCCATG3' 및 후면 프라이머: 5'CCTTGGTGCTAGCTCTAATACATTTGAGACTGGGGGTTGTCC3'으로 c264scTCR/huIL15Rα스시 벡터로부터 증폭시켰다.
상기 huIgG1 중쇄 불변 영역 유전자 단편을 전면 프라이머: 5'CCAGTCTCAAATGTATTAGAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTC3' 및 후면 프라이머: 5'GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC3'으로 c264scTCR/huIgG1 벡터로부터 증폭시켰다.
상기 TCR β 불변 영역 서열 및 huIL15Rα스시 유전자를 함유하는 생성물을 주형으로서 사용하여 전면 프라이머: 5'CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3' 및 후면 프라이머: 5'CCTTGGTGCTAGCTCTAATACATTTGAGACTGGGGGTTGTCC3'을 함께 사용하여 PCR에 의해 유전자 단편을 생성시켰다.
상기 생성되는 PCR 산물 및 상기 huIgG1 유전자 단편은 주형으로서 사용되어 전면 프라이머: 5'CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3' 및 후면 프라이머: 5'GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC3'과 함께 PCR에 의해 TCRβc/huIL15Rα스시/huIgG1 융합 유전자를 생성시켰다.
상기 c264scTCR PCR 산물을 PacI 및 HpaI로 절단하고 TCRβc/huIL15Rα스시/huIgG1 융합 유전자를 HpaI 및 NsiI로 절단하였다. 상기 절단된 유전자 단편을 CMV 프로모터-함유 pMSGV 레트로바이러스 벡터에 연결하였다. 상기 생성 벡터를 c264scTCR/스시/hIgG1-pMSGVc 또는 pMSGVc264SuIg로서 표시하였다(도 5). 상기 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 유전자 및 단백질의 서열을 각각 도 6 및 도 7에 나타낸다.
단일-쇄 TCR 결합 도메인(즉 c264scTCR)과 IL-15(또는 IL-15 변체) 간의 융합물을 생성시키는 발현 벡터의 생성이 WO2008143794에 개시되어 있다. 특히 유용한 IL-15 변체는 IL-15 생물 활성을 감소시키거나 제거하는 것 또는 IL-15 생물 활성을 증가시키는 것이다. 예를 들어, 72 번 위치에 치환(즉 N72D 치환)을 갖는 인간 IL-15 변체는 상기 IL-15 생물 활성을 5 내지 10배 증가시킬 수 있다. IL-15 변체를 하기 표 1에 제공한다:
돌연변이체 위치 8 61 65 72 108 IL15Rbgc 수용체 결합 IL15Ra
결합		 증식활성
WT aa D D N N Q + + +
1 8 N - + -
2 8 A - + -
3 61 A - + -
4 65 D - + -
5 65 A - + -
6 72 D 3+ + 3+
8 72 R - + -
9 108 A - + -
10 8 + 65 N A - + -
11 8 + 108 A A - + -
12 8 + 65 S R - + -
바로 위의 표에 개시된 바와 같은 IL-15 변체를 포함하는 융합 단백질 복합체는 TCR-특이성 항원, p53(aa264-272)/HLA-A2.1에 결합하는 그의 능력에 대해 특성화되었다. p53(aa264-272)/HLA-A2.1을 제공하는 세포를 생성시키기 위해서, HLA-A2.1-양성 T2 세포(2 x 106/㎖)에 2 내지 3 시간 동안 1 x PLE(Altor Bioscience)의 존재 하에 37 ℃에서 20 μM p53(aa264-272) 펩타이드를 로딩하였다. 펩타이드 및 IL-2/15Rβγc를 발현하는 32Dβ 세포와 함께 배양되지 않은 T2 세포를 대조군으로서 제공한다. 이어서 상기 p53 펩타이드-로딩된 T2 세포, 대조용 T2 세포, 또는 32Dβ 세포(2 x 105/100 ㎕)를 4 ℃에서 30 분간 320 nM의 하기의 이량체성 융합 단백질 복합체와 함께 배양하였다:
1) c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15Rα스시,
2) c264scTCR/huIL15D8A+c264scTCR/huIL15Rα스시, 및
3) c264scTCR/huIL15D8N+c264scTCR/huIL15Rα스시.
이들 복합체를, 160 nM의 정제된 c264scTCRhuIL15 융합 단백질 및 160 nM의 정제된 c264scTCRhuIL15Rα스시 융합 단백질을 4 ℃에서 3 시간 동안 배양함으로써 생성시켰다. 염색에 이어서, 세포를 세척 완충제(0.5% BSA 및 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS)로 1 회 세척하고 4 ℃에서 30 분간 100 ㎕의 세척 완충제 중의 0.5 ㎍의 비오틴화된 마우스 단클론 항-인간 TCR Cβ 항체(BF1)로 염색하였다. 세포를 1 회 세척하고 4 ℃에서 30 분간 100 ㎕의 세척 완충제 중의 0.5 ㎍의 R-피코에리쓰린 접합된 스트렙트아비딘으로 염색하였다. 세포를 세척하고 유식 세포측정에 의한 분석을 위해 재현탁하였다.
상기 c264scTCR/huIL15D8A+c264scTCR/huIL15Rα스시 복합체 및 c264scTCR/huIL15D8N+c264scTCR/huIL15Rα스시 복합체는 p53 펩타이드-로딩된 T2 세포의 특이적인 염색에 대해 c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15Rα스시 복합체와 동등한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 상기 다가 scTCR 도메인이 이들 각각의 융합 복합체 중에서 완전히 작용성임을 가리킨다. IL-15 변체(D8A 및 D8N)를 포함하는 융합 단백질 복합체는 상기 32Dβ 세포 상에 존재하는 IL-15Rβγc 수용체에 대해 결합 활성을 나타내지 않는다. IL-15Rβγc 수용체 결합의 유사한 연구를 IL-15 변체를 포함하는 다른 융합 단백질로 수행하고 표 1에 요약한다. 결과는 IL-15 변체를 포함하는 본 발명의 융합 단백질 및 융합 단백질 복합체가 펩타이드/MHC 복합체를 인식하는 활성을 유지하며 IL-15Rβγc 수용체에 대해 감소되거나 증가된 결합 활성을 나타냄을 가리킨다.
몇몇 T2 분자에 대해서, 상기 IL-15 및 IL-15Rα 성분에 융합된 다수의 상이한 결합 도메인을 갖는 것이 유용하다. 상기와 같은 분자의 활성을 예시하기 위한 일례에서, HLA-A2와 관련하여 제공된 p53(aa149-157) 펩타이드에 특이적인 단일-쇄 TCR 도메인(c149scTCR이라 칭한다)을 IL-15N72D 도메인에 결합시키고 생성되는 융합 단백질을 상기 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 융합 단백질과 함께 발현시켜 c264scTCR 및 c149scTCR 결합 도메인을 갖는 다중 쇄 T2 단백질을 생성시켰다.
상기 149scTCR/IL15N72D 유전자 융합물을 생성시키기 위해서, c149scTCR 유전자 단편(TCR-α, 링커, TCR-β 및 TCR-β 불변 단편)을 전면 프라이머: 5'GACTTCAAGCTTAATTAAGCCACCATGGACAGACTTACTTCTTC3' 및 후면 프라이머: 5'CTTCCCGTTAACCCACCAGCTCAGCTCCACGTG3'으로 c149scTCR/huIgG1 발현 벡터로부터 증폭시켰다.
상기 c149scTCR/huIgG1 벡터의 TCR β 불변 영역의 나머지를 전면 프라이머: 5'CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3' 및 후면 프라이머: 5'CACCCAGTTGTCTGCTCTACCCCAGGCCTC3'으로 증폭시켰다.
상기 huIL15N72D 유전자를 전면 프라이머: 5'CTGGGGTAGAGCAGACAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTG3' 및 후면 프라이머: 5'CCTCATGCATTCGAATCCGGATCATTAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG3'으로 c264scTCR/huIL15N72D 발현 벡터로부터 증폭시켰다.
상기 TCR β 불변 영역 서열 및 huIL15N72D 유전자를 함유하는 생성물을 주형으로서 사용하여 전면 프라이머: 5'CTGGTGGGTTAACGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTC3' 및 후면 프라이머: 5'CCTCATGCATTCGAATCCGGATCATTAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG3'를 함께 사용하여 PCR에 의해 유전자 단편을 생성시켰다.
상기 c149scTCR PCR 산물을 PacI 및 HpaI로 절단하고 TCRβc/huIL15N72D PCR 산물을 HpaI 및 BstB I로 절단하였다. 상기 절단된 유전자 단편을 CMV 프로모터-함유 pMSGV 레트로바이러스 벡터에 연결하였다. 상기 생성 벡터를 c149scTCR/IL15N72D-pMSGVn 또는 pMSGV-c149IL15N72D로서 표시하였다(도 8). 상기 c149scTCR/huIL15N72D 유전자 및 단백질의 서열을 각각 도 9 및 도 10에 나타낸다.
실시예 2 - 융합 단백질을 생산하는 형질감염된 숙주 세포주의 생성
상기 발현 벡터를 여러 가지 상이한 형질전환, 형질감염 또는 형질도입 방법에 의해 다양한 숙주 세포주 내로 도입시킬 수 있다. 하나의 상기와 같은 방법에서, CHO-K1 세포(5 x 105)를 6-웰 플레이트에 시딩하고 CO2 배양기에서 밤새 배양하였다. 상기 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 10 ㎕의 미루스 트랜스IT-LT1 시약(Mirus)을 사용하여 c264scTCR/huIL15N72D 융합 유전자를 함유하는 발현 벡터 5 ㎍으로 형질감염시켰다. 상기 세포를 상기 형질감염 후 1일째에 4 ㎎/㎖의 G418(Invitrogen)로 선택하였다. 상기 G418 내성 세포를 확대시키고 TCR/IL15 융합 단백질 발현 세포를 제한 희석에 의해 3 회 서브클로닝하고 생산 세포주를 앞서 개시된(WO2008143794 참조) 포획 항체, 항-인간 TCR Cβ 항체(BF1), 및 검출 항체, 비오틴화된 항-인간 IL-15 항체(BAM 247, R&D Systems)와 함께 TCR 및 huIL15-특이성 ELISA에 의해 배양 배지 내로 분비되는 용해성 융합 단백질의 수준을 근거로 선별하였다. 이어서 상기 c264scTCR/IL15N72D 생산 세포주를 하기와 같이 c264scTCR/huIL15Rα스시-huIgG1 융합 유전자를 함유하는 위형 레트로바이러스 벡터로 형질도입시켰다.
상기 위형 레트로바이러스 벡터를 생성시키기 위해서, 폴리-리신 코팅된 10 ㎝ 디쉬(BD Bioscience) 중의 2 x 106의 293GP 패키징 세포를 CO2 배양기에서 37 ℃에서 2일간 배양하였다. 이어서 상기 세포를 9 ㎍의 플라스미드 pMC-c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 및 4 ㎍의 플라스미드 pMD-G 암호화 VSV-G 외피 단백질과 함께 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 동시 형질감염시켰다. 바이러스를 함유하는 상등액을 형질감염 후 48 시간째에 수거하고 세포 찌꺼기를 0.45 μM 폴리비닐리덴 플루오라이드 필터에 통과시킴으로써 제거하였다. 바이러스를 10 ㎍/㎖의 폴리브렌(Sigma-Aldrich)의 존재 하에서 상기 c264scTCR/IL15N72D 생산 세포에 적용하였다(6-웰 플레이트에서 1 x 105 세포/웰). 세포를 형질도입 후 2일째에 10 ㎍/㎖의 퓨로마이신 및 2 ㎎/㎖의 G418로 선택하였다. 상기 퓨로마이신 및 G418 내성 세포를 확대시키고 상기 T2 융합 단백질 복합체 발현 세포를 제한 희석에 의해 3 회 서브클로닝하고 생산 세포주를 포획 항체, 항-인간 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch), 및 검출 항체, 비오틴화된 항-인간 IL-15 항체(BAM 247, R&D Systems)와 함께 huIgG1/huIL15-특이성 ELISA를 사용하여 배양 배지 내로 분비되는 용해성 융합 단백질의 수준을 근거로 선별하였다.
실시예 3 - T2 융합 단백질의 생성 및 정제
c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1를 발현하는 세포주를 생육 조건(즉 소규모 배양 플라스크, 스피너 또는 진탕기 플라스크 또는 대규모 중공-섬유, 파동 주머니 또는 교반 탱크 생물반응기 또는 동등한 배양 용기 및 반응기에서 5 내지 28일 동안 25 내지 37 ℃) 하에서 배양하여 상기 배양 배지 중에 용해성 단백질로서 T2 분자를 생성시켰다. 상기 T2 분자를 정제하기 위해서, 상기 배양 배지를 pH-조절하고 세파로스에 공유 결합된 항-TCR 항체(BF1)를 함유하는 면역친화성 컬럼 상에 로딩하였다. 상기 컬럼을 세척하고 T2 분자를 0.5M Na-시트레이트 pH 4.0으로 용출시켰다. 상기 용출된 단백질을 농축시키고 완충제를 포스페이트 완충된 염수(PBS)로 교환하고 이어서 r단백질 A-세파로스 컬럼 상에 로딩하였다. 세척 단계에 이어서, 상기 단백질을 0.5M Na-시트레이트 pH 4.0으로 용출시키고 이어서 완충제를 PBS로 교환하였다. 생성 단백질을 쿠마씨-염색된 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 특성화하였다.
환원 SDS-PAGE 조건 하에서, 상기 정제된 T2 단백질은 동종이량체 분자로 예상된 단일 밴드로 이동하는 정제된 c264scTCR/huIgG1 및 c264scTCR/huIgG1ΔCH1 융합 단백질에 비해 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 성분으로 예상되는 분자량에 상응하는 2 개의 폴리펩타이드 밴드로서 이동하였다(도 11). 비-환원 변성 조건 하에서, 상기 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 밴드는 이량체성 폴리펩타이드와 일치하는 분자량에서 이동하는 반면 상기 c264scTCR/huIL15N72D 밴드는 그의 단량체 형태와 일치한다(도 11). 크기 배제 젤 여과 크로마토그래피에 의해, 상기 고유 T2 단백질은 4-쇄(2 x c264scTCR/huIL15N72D, 2 x c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1) 분자의 예상 분자량에서 용출되었다(도 12). 이러한 결과는 도 1에 나타낸 바와 같이 상기 T2 분자가 상기 huIL15N72D와 huIL15Rα스시 도메인 간의 상호작용 및 huIgG1 간의 공유 상호작용과 일치하는 다중 쇄 형태를 나타냄을 입증한다.
유사한 포유동물 세포 발현 및 친화성 크로마토그래피 정제 방법을 사용하여 본 발명에 개시된 다른 T2 단백질 복합체들을 생성시켰다.
실시예 4 - T2 분자의 결합 활성의 시험관 내 특성화
시험관 내 분석을 수행하여 상기 T2 분자의 도메인들의 결합 활성을 특성화하고 다른 융합 분자들의 경우와 상기 활성을 비교하였다. 상기 IgG1 도메인을 특성화하기 위해서, 미세적정 웰을 항-인간 IgG1 항체로 코팅하고 동몰량의, c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성된 정제된 T2 단백질, 또는 정제된 c264scTCR/huIgG1 융합 단백질을 상기 웰에 적용하였다. 결합 및 세척 단계에 이어서, 상기 결합된 단백질들을 표준 ELISA 조건 하에서 항-인간 IgG1 항체로 검출하였다.
도 13에 나타낸 분석의 결과는 상기 T2 분자의 IgG1 도메인이 상기 TCR/IgG1의 필적할만한 도메인과 동등한 항체 결합 활성을 나타냄을 입증하며, 이는 상기 T2 IgG1 도메인이 고유 형태를 유지함을 가리킨다. 상기 T2 분자의 TCR 도메인을 유사한 분석으로 평가하였다. 동몰량의 T2 또는 c264scTCR/huIgG1 단백질을 항-인간 IgG1 Ab 코팅된 웰 상에 포획하고 항-인간 TCR Cβ 항체(W4F)로 검출하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, 상기 T2 단백질은 상기 항-TCR 항체에 대해 c264scTCR/huIgG1 단백질보다 2 배 더 높은 반응성을 나타내었다. 이는 상기 c264scTCR/huIgG1 융합물의 동종이량체 조성물에 비해 상기 T2 분자의 4-쇄 TCR 융합 단백질 조성물이 제공됨이 예상된다. 상기 T2 분자의 TCR 도메인의 펩타이드/MHC 결합 활성을 평가하였다. 동몰량의 T2(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨) 또는 c264scTCR/huIgG1 단백질을 항-인간 IgG1 Ab 코팅된 웰 상에 포획하고 p53(aa264-272)펩타이드/HLA-A2 스트렙트아비딘-HRP 사량체로 검출하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 상기 T2 단백질은 상기 펩타이드/MHC 시약에 대해 c264TCR/huIgG1 단백질보다 3 배 더 높은 결합 활성을 나타내었다. 이는 상기 T2 단백질이 그의 구조 및 항-TCR Ab 반응성을 근거로(도 14 참조) c264scTCR/huIgG1보다 단지 2 배 더 높은 TCR 결합 활성을 나타낼 것으로 예상되었기 때문에 뜻밖이었다. 따라서, 상기 T2 분자 구조는 개별적인 성분들을 근거로 예상된 것보다 양호한 항원-특이성 결합 활성을 제공한다. 이러한 증대된 결합 활성은 상기 TCR 도메인과 펩타이드/MHC 항원 간의 적은 입체 장애, 양호한 결합능 효과, 협력적인 상호작용 및/또는 양호한 형태적 일치의 결과일 수 있다.
실시예 5 - T2 IL -15 도메인의 생물 활성의 특성화
상기 T2 분자의 IL-15 도메인의 활성을 또한 평가하였다. 미세적정 웰을 항-인간 IL-15 항체로 코팅하고 동몰량의, c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성된 정제된 T2 단백질, 또는 정제된 c264scTCR/huIL15N72D 융합 단백질을 상기 웰에 적용하였다. 결합 및 세척 단계에 이어서, 상기 결합된 단백질들을 표준 ELISA 조건 하에서 항-인간 IL-15 항체로 검출하였다.
도 16에 도시된 바와 같이, 상기 T2 단백질은, 각각의 T2 분자가 2 개의 IL-15 도메인을 함유한다는 가설을 근거로 예상되는 바와 같이, 항-IL15 Ab에 대해 c264scTCR/huIL15N72D 융합에 비해 증가된 반응성(1.6 배 더 높은)을 나타내었다. 상기 T2 분자의 IL-15 도메인의 생물 활성을 사이토킨-의존성 32Dβ 세포주를 사용하는 증식 분석에서 추가로 특성화하였다. 세포 증식을 측정하기 위해서, 32Dβ세포(2 x 104 세포/웰)를 증가하는 농도의 T2 단백질(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨) 또는 c264scTCR/huIL15N72D 융합 단백질과 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 세포 증식 시약 WST-1(Roche Applied Science)을 제조사의 과정에 따라 최종 4 시간의 세포 생육 기간 동안 가하였다. 대사 활성 세포에 의한 WST-1의 착색된 포르마잔 염료로의 전환을 440 ㎚에서 흡광도 측정을 통해 측정하였다.
도 17에 도시된 바와 같이, 상기 T2 단백질은 상기 c264scTCR/huIL15N72D 융합 단백질보다 3 배 더 양호한 생물 활성을 나타낸다. 이는 상기 T2 단백질이 그의 구조 및 항-IL-15 Ab 반응성을 근거로(도 16 참조) c264scTCR/hu15N72D보다 단지 2 배 더 높은 IL-15 활성을 나타낼 것이 예상되었기 때문에 뜻밖이었다. 이러한 결과와 함께, 증가된 TCR 결합 활성 및 IL-15 생물 활성을 제공함에 있어서 상기 성분들 단독으로 또는 다른 융합 단백질 포맷과 관련하여 관찰되지 않는 상기 T2 분자 포맷에 대한 다수의 이점들을 예시한다.
IL-15-반응성 면역 세포의 증식을 촉진하는 상기 T2 단백질의 능력을 영장류 모델에서 검사하였다. 키노몰구스 원숭이(n=2, 1m, 1f)에게 정제된 T2 단백질(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨)을 0.5 ㎎/㎏으로 정맥 내 주사하였다. 5일 후에 채혈된 혈액을 CD8 기억 T 세포 마커(CD8 및 CD95) 및 NK 세포 마커(CD56 및 CD16)에 대해 염색하고 처리 전에 취한 혈액과 비교하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, T2 처리는 CD8+ CD95+ 기억 T 세포(A) 및 CD56dim CD16+ 효과기 NK 세포(B)를 확대시켰다. 상기 결과는 생체 내에서 효능 있는 IL-15 활성을 나타내는 T2 분자와 일치한다.
실시예 6 - T2 Fc 도메인의 결합 및 생물 활성의 특성화
상기 T2 분자의 IgG1 Fc 도메인의 결합 활성을 세포 결합 분석에서 특성화하였다. Fc-감마 수용체 함유 U937 세포를 20 분 동안 33 nM의 T2 단백질(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨), c264scTCR/huIgG1 또는 A2AL9scTCR/IgG1(음성 대조군)와 함께 배양하였다. 세포를 1 회 세척하고 20 분 동안 PE-접합된 p53(aa264-272) 펩타이드/HLA-A2 사량체와 함께 배양하였다. U937 세포 표면상의 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 도 19A에 도시된 바와 같이 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 일련의 단백질 농도를 사용하여 유사한 U937 결합 연구를 또한 수행하였으며 상기 염색된 세포에 대한 평균 형광 강도를 도 19B에 플롯팅하였다.
상기 연구의 결과는 상기 U937 세포가 상응하는 c264scTCR/huIgG1 융합 단백질보다 상기 T2 분자에 의해 더 유효하게 염색됨을 가리키며, 이는 상기 T2 분자의 Fc 수용체 결합 활성을 입증한다. 상기 Fc 도메인의 생물 활성을 평가하기 위해서, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 활성을 매개하는 상기 T2 분자의 능력을 평가하였다. 이 연구에서, T2 단백질, c264scTCR/huIgG1 또는 A2AL9scTCR/IgG1(음성 대조군)을 96-웰 플레이트에 0.137 내지 100 nM로 가하였다. HLA-A2-양성 T2 표적 세포를 10 μM의 p53 aa264-272 펩타이드로 펄스화하고 50 ng/㎖의 칼세인-AM으로 표지하였다. 상기 융합 단백질을 1 x 104의 표적 세포/웰과 혼합하고 1 x 106/웰의 새로운 인간 PBMC를 가하였다. 상기 플레이트를 CO2 배양기에서 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고 100 ㎕의 상기 조건 배지를 수거하고 용해된 세포로부터 방출된 칼세인에 대해 분석하였다. 칼세인을 Ex-485 ㎚, Em-538 ㎚, 및 컷오프-530 ㎚에서 형광 판독기로 정량분석하였다. 상기 특이적인 세포 용해를 하기식으로 계산한다: 비 용해 = [exp - (배경 - 자동 방출)]/[완전 방출 - (배경 - 자동 방출)] x 100%. Exp = 융합 단백질+T2 세포+PBMC; 배경 = 배지만; 자동 방출 = T2 세포만; 완전 방출 = T2 세포+0.5% 트리톤 X-100.
데이터 점당 3 회 중복 측정의 결과를 도 20에 도시하며 여기에서 상기 T2 단백질의 2 개의 상이한 로트가 특성화되었다. 상기 결과는 상기 T2 단백질이 상기 TCR-IgG1 융합 단백질보다 펩타이드/MHC 제공 표적 세포에 대해 ADCC-유사 활성을 매개함에 있어서 더 유효함을 가리킨다. 개선된 활성은 상기 펩타이드/MHC 복합체에 대한 상기 T2 분자의 증대된 결합 및/또는 Fc 수용체 또는 IL-15 수용체를 드러내는 효과기 세포에 대한 증가된 반응성의 결과일 수 있다.
실시예 7 - 세포 상에 드러난 펩타이드 / MHC 복합체에 대한 T2 분자 결합의 특성화
세포 상의 펩타이드/MHC 표적에 대한 T2 단백질의 결합 활성을 평가하기 위해서, HLA-A2-양성 T2 세포를 다양한 양의 p53 aa264-272 펩타이드로 펄스화하였다. 이어서 상기 세포를 T2 단백질(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨), c264scTCR/huIgG1 또는 A2AL9scTCR/IgG1(음성 대조군)과 함께 각각 83 nM로 배양하였다. 상기 세포를 비오틴화된 항-TCR Ab(BF1) 및 스트렙트아비딘-PE와 함께 배양하였다. 이어서 상기 세포를 도 21A에 도시된 바와 같이 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 상기 염색된 세포에 대한 평균 형광 강도를 도 21B에 플롯팅하였다.
상기 결과는 상기 T2 분자가 상기 c264scTCR/huIgG1 융합 단백질에 비해 세포 상에서 p53 펩타이드/HLA-A2 복합체의 증대된 검출 능력을 나타냄을 보인다. 이러한 결과는 상기 T2 단백질이 표적 세포 상의 종양-관련된 펩타이드 항원에 대해 c264scTCR/huIgG1 융합물보다 더 유효하게 결합할 수 있음을 가리킨다.
다른 펩타이드/MHC 표적에 특이적인 TCR 도메인을 포함하는 T2 분자를 사용하는 경우 유사한 결과가 예상된다. 예를 들어, 상기 인간 종양 관련된 단백질로부터 유도된 다양한 펩타이드, 즉 p53, gp100, MART1, MAGE-A3, PSMA, PSA, Her2/neu, hTERT, 티로시나제, 서비빈, WT1, PR1, NY-ESO1, EGFR, BRAF 등은 HLA 분자에 결합하고 TCR 상호작용을 통한 인간 T 세포 반응에 대한 표적인 것으로 공지되어 있다. 또한, HIV, HCV, HBC, CMV, HTLV, HPV, EBV 및 다른 바이러스로부터의 바이러스 펩타이드 항원을 드러내는 HLA 복합체에 특이적인 TCR들이 동정되었다. 상기 TCR은 상기 IL-15 또는 huIL15RαSu스시 단백질에 융합될 수 있으며 상술한 바와 같이 적합한 펩타이드 로딩된 항원 제공 세포 상에서 펩타이드/MHC 반응성에 대해 특성화될 수 있다.
실시예 8 - 2 개의 상이한 TCR 도메인을 갖는 T2 분자의 특성화
상기 가리킨 바와 같이, 상기 T2 분자의 IL-15, IL-15Rα 및 IgG 성분에 융합된 다수의 상이한 TCR 도메인을 갖는 것이 유용하다. 이는 단일의 다중 쇄 단백질 중에 하나보다 많은 항원 표적화 활성이 존재하게 한다. 이러한 접근법의 실행성을 입증하기 위해서, c264scTCR-스시-hIgG1-pMSGVc 및 c149scTCR-hIL15N72D-pMSGVn 발현 벡터를 IMDM-10 배지 중에서 배양한 CHO 세포 내로 형질감염시켰다. 상기 배양 상등액을 실온에서 상기 형질감염체의 배양 6일 후에 수확하였다. c149scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1의 T2 분자를 ELISA로 특성화하였다. 상기 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1의 정제된 T2 분자를 대조군으로서 사용하였다. 상기 TCR 도메인을 평가하기 위한 하나의 분석에서, 웰들을 항-인간 TCR Ab(BF1)로 코팅하고, 융합 단백질을 가하고 결합된 단백질을 비오틴화된 항-인간 TCR Ab(W4F-BN)로 검출하였다.
도 22에 나타낸 결과는 c149scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1로 구성된 T2 분자의 TCR 도메인이 항-TCR 항체에 의해 검출될 수 있었음을 가리킨다. 상기 T2 단백질의 IgG1 및 IL-15 도메인을 평가하기 위해서, 상술한 염소 항-인간 IgG Ab 포획 및 항-인간 IL-15 Ab 검출로 구성된 ELISA를 사용하였다.
도 23에 도시된 바와 같이, c149scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1으로 구성된 상기 T2 분자를 상기 포맷으로 검출할 수 있었으며, 이는 상기 IgG 및 IL-15N72D 도메인을 함유하는 단백질 쇄들 간의 상호작용을 가리킨다. 상기 c149scTCR 도메인의 활성을 또한 p53(aa 249-157) 펩타이드/HLA-A2 스트렙트아비딘-HRP 사량체에 의한 항-인간 IgG Ab 포획 및 검출을 사용하여 ELISA에서 검사하였다.
도 24에 도시된 바와 같이, c149scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1로 구성된 상기 T2 분자를 이 포맷으로 검출할 수 있었으며, 이는 IgG1 도메인을 갖는 분자들이 상기 c149scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄들 간의 상호작용을 통해 상기 p53(aa 149-157) 펩타이드/HLA-A2 복합체에 대한 결합 활성을 또한 가짐을 가리킨다. p53(aa 149-157) 펩타이드/HLA-A2 또는 p53(aa 264-272) 펩타이드/HLA-A2 사량체에 의한 항-인간 IgG Ab 포획 및 검출, 또는 항-TCR Ab(BF1) 포획 및 항-TCR Ab 또는 항 IL15 Ab 검출로 이루어지는 추가적인 분석들은 상기 도메인들이 각각 상기 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성된 상기 T2 단백질에 작용적으로 결합됨을 입증하였다(도 24).
이들 2 개의 TCR 도메인이 다른 단백질 쇄 상에서 발현된 T2 분자, 즉 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄가 또한 생성되었다. 상기 분자의 Fc 및 TCR 활성을 U937 세포에 대한 결합 및 p53(aa 264-272) 펩타이드/HLA-2A 사량체에 의한 검출에 이어서 유식 세포측정에 따라 평가하였다.
도 25에 도시된 바와 같이, c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성된 T2 분자는 Fc 도메인을 통해 U937 세포 상의 Fc 감마 수용체와 결합하고 c264scTCR 도메인을 통해 p53(aa 264-272) 펩타이드/HLA-A2 복합체를 인식할 수 있었다. 이들 연구는 다수의 작용성 TCR 도메인 및 IL-15 및 IL15Rα 및 IgG1 도메인을 갖는 T2 분자가 도 1에 도시된 바와 같은 구조를 형성할 수 있음을 입증한다.
실시예 9 - 마우스 및 키노몰구스 원숭이에서 T2 단백질 약동학의 특성화
IL-15에 의한 잠재적인 요법에 대한 주요 한계는 생체 내 사이토킨의 매우 짧은 생물학적 반감기이다. 동물 모델에서 T2 분자의 생물 약동학적 성질을 평가하기 위해서, HLA-A2/Kb-트랜스제닉 마우스(5 마우스/시점)에게 정제된 T2 단백질(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨) 135 ㎍/마우스를 정맥 내 주사하였다. 상기 HLA-A2/Kb-트랜스제닉 마우스 모델을 선택하였는데, 그 이유는 상기 c264scTCR을 제한하는 HLA-A2.1 도메인의 존재가 상기 단백질의 약동학에 영향을 미칠 수도 있고 다른 비-인간 모델보다 더 타당한 약동학의 "인간화된" 면을 제공할 것이기 때문이다. 이 연구에서, 혈액을 주사 후 0, 1, 4, 8, 24, 48 및 72, 96 시간째에 채혈하고 혈청 중 T2 단백질의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 2 개의 상이한 ELISA 포맷을 사용하였다: 1) 염소 항-인간 IgG Ab 포획 및 항-인간 TCR Ab(W4F-BN) 검출 또는 2) 염소 항-인간 IgG Ab 포획 및 항-인간 IL-15 Ab 검출. 상기 분석은 완전한 단백질 및 다중 쇄 단백질 복합체의 안정성 평가를 허용한다.
도 26A에 도시된 바와 같이, 상기 T2 분자는 정맥 내 주사 후 약 9 내지 11 시간의 생물학적 반감기를 가졌다. 이는 IP 주사 후 마우스에서 관찰된 인간 IL-15의 약 1 시간의 반감기보다 상당히 더 길다(문헌[Stoklasek TA et al. 2006. J. Immunol. 177: 6072]). 또한 상기 T2 분자는 전달된 용량과 일치하는 혈청 농도에 도달한 반면, IL-15의 투여된 용량은 앞서 보고된 연구에서 혈청 중에서 매우 적게 회수되었다(문헌[Stoklasek TA et al. 2006. J. Immunol. 177: 6072]). 따라서, 상기 T2 분자는 유리 인간 IL-15보다 현저하게 더 양호한 약동학 프로파일을 갖는다. 또한, 상기 두 ELISA에 의해 관찰된 유사한 PK 프로파일을 근거로, 상기 T2 단백질은 절단의 증거 없이 다중 쇄 분자로서 완전하게 남아있었다.
영장류 모델에서 상기 T2 분자의 생물 약동학적 성질을 평가하기 위해서, 키노몰구스 원숭이(n=2, 1m, 1f)에게 정제된 T2 분자(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨) 0.5 ㎎/㎏을 정맥 내 주사하였다. 상기 연구에서, 주사 후 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96 및 120 시간째에 혈액을 채혈하고 혈청 중 T2 단백질의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 3 개의 상이한 ELISA 포맷을 사용하였다: 1) 항-인간 TCR Ab(βF-1) 포획 및 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG Ab 검출 또는 2) 항-인간 IL-15 Ab 포획 및 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG Ab 검출 또는 3) 항-인간 IL-15 Ab 포획 및 항-인간 TCR Ab(W4F-BN) 검출. 상기 분석은 완전한 단백질 및 다중 쇄 단백질 복합체의 안정성의 평가를 허용한다.
도 26B에 도시된 바와 같이, 상기 T2 분자는 정맥 내 주사 후 약 4 내지 6 시간의 생물학적 반감기를 가졌다. 이는 피하 주사에 이어서 원숭이에게서 관찰된 IL-15의 보고된 약 1 시간 반감기보다 상당히 더 길다(문헌[Villinger, F. et al. 2004. Vaccine 22: 3510]). 따라서, 상기 T2 분자는 유리 IL-15보다 현저하게 더 양호한 약동학 프로파일을 갖는 것처럼 보인다. 또한, 상기 3 개의 ELISA에 의해 관찰된 유사한 PK 프로파일을 근거로, 이들 데이터는 상기 T2 단백질이 절단의 증거 없이 다중 쇄 분자로서 완전하게 남아있음을 암시하는 쥐 PK 데이터를 지지한다.
실시예 10 - 이종이식편 종양 마우스 모델에서 고형 인간 종양에 대한 T2 분자의 항-종양 활성
상기 T2 단백질의 치료 효과를 측정하기 위해서, 우리는 누드 마우스에서 인간 p53+HLA-A2+A375 흑색종 세포주를 갖는 원발성 종양 성장 모델에서의 항종양 활성을 조사하였다. 종양 세포를 누드 마우스 내로 피하 주사하고 종양을 처리 시작 전에 100 ㎣까지 성장시켰다. 종양 함유 마우스에게 32 ㎍/용량(1.6 ㎎/㎏)의, c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1로 구성된 T2 단백질, 32 ㎍/용량(1.6 ㎎/㎏)의 c264scTCR/huIL2, 또는 60 ㎍/용량(3 ㎎/㎏)의 264scTCR/huIgG1을 정맥 내 주사하였다. 상기 마우스를 1 주일 동안 이틀마다 처리한 다음(3 회 주사), 9일의 휴지기를 갖고 이어서 추가로 한 주 동안 이틀마다 처리하였다(3 회 주사). 상기 연구기간 동안, 종양 성장을 측정하고 종양 부피를 플롯팅하였다(도 27). 결과를 오직 PBS만으로 처리한 마우스에서의 A375 종양 성장에 비교하였다.
도 27에 도시된 바와 같이, A375 종양 성장이 T2 분자 또는 TCR-IL2 또는 TCR-IgG 융합 단백질로 처리된 누드 마우스에서 억제되었다. 선행의 연구들은 상기 모델에서 상기 p53 특이적인 TCR-IL2 또는 TCR-IgG 융합 단백질의 항종양 효과가 상기 TCR 도메인을 통해 종양 부위에 대해 효과기 도메인 활성을 표적화한 결과임을 나타내었다(문헌[Belmont et al. 2006 Clin. Immunol. 121:29, Mosquera et al. 2005 J. Immunol. 174:4781]). 상기 가능성을 평가하기 위해서, 표적화되지 않은 TCR 도메인을 갖는 T2 단백질을 A375 종양 이종이식편 마우스 모델에서 시험할 것이다. 상기 A375 종양에 대한 상기 p53-특이적인 T2 단백질과 비교된 표적화되지 않은 T2 분자의 효능 감소는, 종양 항원 표적화가 상기 T2 분자의 항종양 활성에서 한 역할을 한다는 증거를 제공할 것이다.
실시예 11 - IL -15 및 Fc 도메인에서 돌연변이를 갖는 T2 분자의 특성화
WO2008143794에 개시된 바와 같이, IL-15Rβγ 쇄와 상호작용하고 그의 생물 활성에 영향을 미치는 그의 능력을 증가 또는 감소시키는 돌연변이를 상기 IL-15 도메인 내에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 가리킨 바와 같이, N72D 치환은 IL-15 생물 활성을 5 내지 10 배 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 길항물질 작용을 제공하기 위해 IL-15 활성을 감소시키는 것이 유용하다. 상기 T2 분자 포맷과 관련하여 상기와 같은 돌연변이의 영향을 조사하기 위해서, 상기 IL-15 도메인의 8 번 위치(즉 D8N) 및 65 번 위치(즉 N65D)에 치환을 함유하는 c264scTCR/huIL15 구조물을 생성시키고 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 단백질과 함께 발현시켰다. 상기 생성되는 c264scTCR/huIL15 변체 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄의 복합체를 실시예 5에 개시된 바와 같이 32Dβ 세포를 사용하여 IL-15 생물 활성에 대해 시험하였따. 도 28에 도시된 바와 같이, IL-15 D8N 및 N65D 변체를 포함하는 T2 분자는 IL-15N72D 도메인 또는 c264scTCR/huIL15 융합물을 포함하는 T2 분자에 비해 32Dβ 세포 증식을 지지하는 그의 능력의 현저한 감소를 나타내었다. 실시예 5의 결과와 일치하게, IL-15 N72D 도메인을 포함하는 T2 분자는 상기 c264scTCR/huIL15 또는 c264scTCR/huIL15N72D 융합물보다 더 큰 IL-15 활성을 나타내었다.
앞서 Fc 감마 수용체 또는 보체와 상호작용하는 능력을 감소시키는 것으로 입증된 돌연변이를 또한 IgG1 Fc 도메인 내로 도입시켰다(문헌[Hessell, A. J., et al. 2007. Nature 449: 101-1040], 본 발명에 참고로 인용됨). 예를 들어, IgG1 CH2(항체 공통 서열에 근거한 넘버링)의 234 및 235 번 위치의 류신 잔기(즉 ...PE LL GG...)의 알라닌 잔기(즉 ...PE AA GG...)에 의한 치환은 Fc 감마 수용체의 상실을 생성시키는 반면 IgG1 CH2(항체 공통 서열에 근거한 넘버링)의 322 번 위치의 리신 잔기(즉 ...KC K SL...)의 알라닌 잔기(즉 ...KC A SL...)에 의한 치환은 보체 활성화의 상실을 발생시킨다(문헌[Hessell, A. J., et al. 2007. Nature 449: 101-1040], 본 발명에 참고로 인용됨). 이러한 치환을 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 구조물 내에 도입시키고 상기 생성 단백질을 상술한 c264scTCR/huIL15N72D 또는 다른 TCR-IL-15 변체와 함께 발현시켰다. p53 aa264-272 펩타이드-로딩된 HLA-A2-양성 T2 표적 세포에 대한 인간 PBMC의 ADCC 활성을 매개하는 상기 복합체의 능력을 실시예 6에 개시된 바와 같이 평가하였다. Fc 작용을 변경하는 것으로 공지된 다른 돌연변이들은 예를 들어 문헌[Lazar et al., PNAS, 103:4005-4010, 2006](본 발명에 참고로 인용됨)에 제공되어 있다.
도 29에 도시된 바와 같이, 상기 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1-LALA 쇄를 포함하는 T2 복합체는 Fc-LALA 변체에 의해 나타나는 Fc 감마 수용체 결합의 상실과 일치하는 높은 수준의 ADCC 활성을 매개할 수 없었다. 대조적으로, 상기에 개시된 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1-KA 쇄 또는 IL-15 변체(N65D 또는 D8N)는 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1-c264TCR/huIL15N72D 복합체와 동일한 수준의 ADCC 활성을 나타내었다. 기전에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 데이터는 또한 상기 IL-15 도메인 및 Fc 보체-결합 도메인이 ADCC 활성을 매개하는데 관련되지 않는다는 가능성을 근거로 예상된다.
인간 NK 및 T 세포 반응을 자극하는 상기 T2 분자의 능력에 대한 IL-15 및 Fc 도메인의 영향을 또한 조사하였다. 1.8 내지 5 x 105 세포/㎖의 인간 PBMC를 상술한 돌연변이를 포함하는 1 nM T2 분자를 함유하거나 또는 대조용으로서 10 ng/㎖의 재조합 인간 IL-2 또는 IL-15를 갖는 배지에서 37 ℃에서 4일 동안 배양하였다.
이어서 NK 세포 세포독성을 50 ug/㎖의 칼세인-AM으로 표지한 다음 표적 세포로서 NK-민감성 K-562 세포를 사용하여 평가하였다. 다양한 비의 PBMC 및 K-562 세포를 혼합하고 CO2 배양기에서 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고 100 ㎕의 상기 조건 배지를 수거하고 용해된 세포로부터 방출된 칼세인에 대해 분석하였다. 칼세인을 Ex-485 ㎚, Em-538 ㎚, 및 컷오프-530 ㎚에서 형광 판독기로 정량분석하였다. 상기 특이적인 세포 용해를 하기식으로 계산한다: 비 용해 = [exp - (배경 - 자동 방출)]/[완전 방출 - (배경 - 자동 방출)] x 100%. Exp = K-562 세포+PBMC; 배경 = 배지만; 자동 방출 = K-562 세포만; 완전 방출 = K-562 세포+0.5% 트리톤 X-100.
도 30에 도시된 바와 같이, c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄를 포함하는 T2 분자와의 배양은 배지만으로 배양한 후에 관찰된 경우에 비해 인간 PBMC의 NK 세포 세포용해 활성을 자극할 수 있었다. 또한 상기 Fc 도메인 LALA 및 KA 변체를 포함하는 T2 분자는 또한 NK 세포 활성을 자극할 수 있었던 반면 상기 IL-15 도메인 중의 N65D 또는 D8N 치환을 포함하는 것은 NK 세포 세포독성을 자극하는 능력이 전혀 또는 거의 없을 것이다. 이러한 결과와 일치하게, 상기 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄를 포함하는 T2 분자 또는 Fc 도메인 LALA 및 KA 변체를 갖는 것들과 인간 PBMC와의 배양은 CD56+ NK 세포의 증식을 증가시킨 반면 IL-15 N65D 또는 D8N 치환을 포함하는 T2 분자는 그만큼 NK 세포 증식 활성을 제공하지 못했다(도 31). 이러한 결과는 상기 각각의 IL-15 도메인의 작용성을 근거로 예상된다.
일부 용도의 경우, 상기 T2 분자와 IL-15 또는 Fc 수용체 간의 감소된 상호작용이 상기 수용체를 갖는 세포에 대한 비-특이적 결합을 감소시키기에 바람직할 수도 있다. 이를 평가하기 위해서, IL-15 및 Fc 돌연변이를 함유하는 T2 분자를 펩타이드가 로딩된 T2 세포를 사용하여 TCR-특이성 표적 세포 인식에 대해 평가하였다. 상기 T2 분자 또는 c264scTCR-스트렙트아비딘 사량체 양성 대조군에 의한 세포 염색을 실시예 7에 개시된 방법을 사용하여 로딩된 p53 펩타이드와 함께(T2.265) 및 상기 없이(T2) T2 세포 상에서 수행하였다. 로딩되지 않은 세포의 염색을 근거로, 상기 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄를 포함하는 T2 분자는 상기 c264scTCR-스트렙트아비딘 사량체 또는 BF1 항체 대조군에 비해 현저한 세포 결합을 나타냄이 분명하다. 상기 Fc LALA 또는 IL-15 N65D 또는 D8N 돌연변이의 도입은 상기 세포 결합을 감소시켰으며 이는 Fc 및 IL-15 수용체 모두와의 상호작용이 T2 복합체 결합에 한 역할을 함을 가리킨다. 상기 Fc LALA 및 IL-15 N65D 또는 D8N 돌연변이의 조합은, 상기 c264scTCR/huIL15 D8N 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1-LALA를 포함하는 분자가 상기 BF1 항체 음성 대조군인 상기 로딩되지 않은 T2 세포에 대해 결합을 나타내지 않도록 T2 복합체 결합을 추가로 감소시켰다. p53 펩타이드 로딩된 세포의 염색이 또한 상기 Fc 또는 IL-15 돌연변이의 도입에 의해 영향을 받았다. 그러나, 펩타이드 로딩된 대 로딩되지 않은 세포를 염색하는 T2 분자의 평균 형광 강도를 비교한 경우(특이적 대 비특이적 비), c264scTCR/huIL15 D8N 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1-LALA 쇄를 포함하는 T2 분자가 상기 p53 펩타이드 항원에 대해 최고의 염색 특이성을 제공하였음은 분명하다(도 32B). 이러한 결과는 상기 T2 분자의 TCR, IL-15 및 IgG Fc 도메인들 각각의 결합 활성을, 목적하는 생물 활성을 갖는 다중 특이성 복합체를 제공하도록 쉽고 독립적으로 조작할 수 있음을 가리킨다.
다른 경우에, 상기 T2 복합체의 치료 지수를 최적화하고 그의 독성을 최소화하도록 상기 IL-15 도메인 및 IgG Fc 도메인의 활성을 변경시키는 것이 유용하다. 예를 들어, 치료 효과에 대해 부분적으로 ADCC 활성에 의존하는 표적화된 복합체는 상기 IL-15 성분의 허용 가능한 용량 수준을 초과하는 높은 수준(즉 1 내지 20 ㎎/㎏)의 투여를 필요로 할 수도 있다. 상기와 같은 경우에, 활성을 감소시키는 IL-15 도메인 중의 돌연변이를 함유하는 복합체는 더 양호한 치료 활성 및 더 낮은 독성을 제공하는 것으로 예상된다. 상술한 IL-15 도메인에 N65D 또는 D8N 치환 또는 I6S, D8A, D61A, N65A, N72R, V104P 또는 Q108A를 포함하는 다른 치환(IL-15 활성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다)을 함유하는 T2 분자가 특히 중요하다.
실시예 12 - 표적화되지 않은 T2 분자의 특성화
일부 용도에서, 특이 항원을 T2 복합체로 표적화하는 것이 필요하지 않다. 상기와 같은 분자에서 상기 항원-특이성 도메인, 예를 들어 TCR 결합 도메인을 돌연변이에 의해 불활성화시키거나 완전히 결실시킬 수 있다. 본 발명에 개시된 방법을 사용하여, huIL15 D8N 및 huIL15Rα스시/huIgG1 쇄를 포함하는 상기와 같은 분자(T2MΔTCR이라 지칭된다)의 활성을 c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄를 포함하는 T2 분자(T2M이라 지칭된다) 및 huIgG1 쇄가 결여된 T2 분자(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시, T2MΔIg 또는 c264scTCR 이량체로서 지칭됨)와 비교하였다. 실시예 5에 개시된 바와 같이 32Dβ 세포 생육을 지지하는 능력에 대해 시험할 때, 상기 T2MΔTCR은 재조합 인간 IL-15에 대해 관찰된 경우의 >24 배인 매우 효능 있는 IL-15 활성(도 33A)을 나타내었다.
인간 면역 세포 생육을 지지하는 상기 T2MΔTCR의 능력을 또한 평가하였다. 1 x 106 세포/㎖의 인간 PBMC를 7일 동안 T2M(0.5 nM), T2MΔTCR(0.5 nM) 또는 T2MΔIg(1 nM)의 존재 또는 부재 하에서 배지와 함께 배양하였다. 세포를 항-CD45RO 및 항-CD8, 또는 항-CD8, 항-CD95, 및 항-CCR7, 또는 항-CD56 및 항-CD16으로 염색하고, FACScan으로 분석하였다. 도 33B에 도시된 8 명의 상이한 공여자로부터 평균한 결과는 상기 T2MΔTCR 및 다른 T2 분자가 효과기 기억 T 세포를 포함하여 다양한 CD8+ 기억 T 세포 및 NK 세포 부분집합들의 확대를 유효하게 자극할 수 있었음을 가리킨다. 이들 세포의 NK 세포 활성을 실시예 11에 개시된 방법을 사용하여 조사하였다. 도 33C에 도시된 2 명의 공여자 PBMC 제제로부터의 전형적인 결과는 상기 T2MΔTCR 및 다른 T2 분자가 NK 세포 세포독성 활성을 유효하게 자극할 수 있었음을 가리킨다. 전체적으로 상기 결과는 상기 T2MΔTCR 단백질이 효능 있는 면역자극 분자임을 가리킨다.
실시예 13 - T2 분자의 생체 내 활성
상기 T2 분자의 면역자극 활성을 추가로 특성화하기 위해서, T2M, T2MΔTCR, IgG1 CH1 도메인이 결여된 T2MΔTCR(T2MΔTCRΔCH1), Fc LALA 돌연변이를 갖는 T2M(T2MLALA) 및 IL-15 D8N 돌연변이를 갖는 T2(T2MD8N)를 C57BL/6 마우스에서 NK 및 CD8 T-세포의 확대를 유도하는 그들이 능력에 대해 시험하였다. 또한, c264scTCR/huIL15N72D, c264scTCR/huIL15Rα스시 및 c264scTCR/huIL15N72D + c264scTCR/huIL15Rα스시 복합체를 평가하였다.
마우스에게 1일 및 4일째에 2.5 ㎍ 용량의 IL-15와 동등한 양의 융합 단백질질들을 i.v. 주사하였다. 8일째에, 혈액 세포 및 비장 세포를 수거하고, CD8 T-세포 및 NK 세포를 염색하고, 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 도 34에 도시된 결과는 T2 분자가 생체 내에서 혈액 및 비장 NK 세포 및 CD8 T 세포 모두를 확대하는데 유효함을 가리킨다. T2MLALA는 T2M과 유사한 활성을 나타내었는데, 이는 FcR 결합 및 신호전달이 NK 및 CD8 T 세포 확대에서 중요한 역할을 하지 않을 수도 있음을 암시한다. T2MD8N 처리는 T2M에 비해 감소된 활성을 생성시켰으며, 이는 D8N 돌연변이가 인간 PBMC를 사용하는 시험관 내 분자의 면역자극 활성을 감소시킨다는 발견을 입증한다. TCR의 결실(T2MΔTCR) 및 TCR 및 CH1의 결실(T2MΔTCRΔCH1)은 감소된 활성을 나타내었다. 이러한 효과는 상기 보다 작은 분자의 보다 짧은 반감기에 기인하였다. 상기 c264scTCR/huIL15N72D, c264scTCR/huIL15Rα스시 및 c264scTCR/huIL15N72D + c264scTCR/huIL15Rα스시 복합체는 또한 상기 T2M에 비해 감소된 생체 내 활성을 나타내었으며, 이는 상기 T2 분자가 보다 효능 있는 면역자극 화합물임을 가리키는 시험관 내 결과를 입증한다.
실시예 14 - 다중 특이성 T2 분자
다중 결합 도메인에 대한 스캐폴드로서 작용하는 상기 IL-15 및 IL-15Rα/IgG Fc 융합 도메인의 능력을 추가로 특성화하기 위해서, huIL15N72D에 결합된 H-2Kb-제한된 OVA aa257-264 펩타이드(SINFEKL)에 특이적인 단일-쇄 TCR 도메인(OT1scTCR) 및 huIL15Rα스시/huIgG1 융합물에 결합된 단일 쇄 CD8α/β 도메인을 포함하는 융합 단백질 복합체(OT1-CD8-T2M)를 생성시켰다. 상기 단일 쇄 CD8α/β 도메인은 (G4S)4 펩타이드 링커를 통해 쥐 CD8β의 세포외 도메인에 결합된 쥐 CD8α의 세포외 도메인을 포함한다. CD8이 MHC 분자에서 상기 TCR-특이성 펩타이드/MHC 계면에 원위인 부위에 결합함은 잘 특성화되어 있다. 따라서 상기 OT1-CD8-T2M 복합체의 OTscTCR 및 scCD8α/β 도메인이 모두 상기 OVA aa257-264/H-2Kb-분자 상의 상이한 부위들에서 상호작용할 것으로 예상된다.
이를 시험하기 위해서, OT1-CD8-T2M의 결합 활성을 ELISA에 의해 상기 OT1scTCR/huIL15N72D 융합물의 경우와 비교하였다. 동몰량의 각각의 단백질을 항-TCR Cβ mAb(H57)로 코팅된 웰 상에 포획하고 OVA aa257-264/H-2Kb 사량체 또는 IL15, CD8α, CD8β 또는 TCR Vα2에 대한 mAb로 탐침처리하였다. 분석을 또한 항-인간 Ig로 코팅되고 항-TCR Vα로 탐침처리된 웰을 사용하여 수행하였다.
도 35A에 도시된 바와 같이, 상기 OT1-CD8-T2M 단백질은 항-IL15, CD8α, CD8β, TCR Vα2 및 인간 Ig 항체에 대해 반응성을 나타내었다. 상기 T2M 융합 복합체의 다가 포맷을 근거로 예상되는 바와 같이, OT1scTCR/huIL15N72D보다 3 배 더 큰 항-TCR Vα2 mAb에 대한 반응성이 존재하였다. 그러나, 상기 OT1scTCR/huIL15N72D 융합물은 OVA aa257-264/H-2Kb 사량체에 대해 결합을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 반면, 상기 OT1-CD8-T2M 단백질과의 결합은 확실히 명백하였다. 이러한 결과는 상기 OT1-CD8-T2M 복합체의 OtscTCR 및 scCD8α/β 도메인이 모두 상기 OVA aa257-264/H-2Kb 분자에 결합하여 높은 친화성의 안정한 상호작용을 제공함을 가리킨다.
실시예 15 - 작용성 스캐폴드로서 IL -15: IL -15Rα 도메인
펩타이드/MHC 부류 1(pMHC1) 사량체의 제조 - 쥐 H-2Kb 유전자를 상술한 바와 같이 C57BL/6 마우스 림프구로부터 추출된 전체 RNA로부터 클로닝하였다. 상기 세포외 영역을 HLA-A*0201 암호화 서열(31)을 대체하는 HLA-A*0201 중쇄 발현 벡터(31)에 연결하였다. β2m, HLA-A*0201 및 H-2Kb 박현 벡터를 이 콜라이 내로 개별적으로 형질전환시키고 상기 재조합 단백질의 발현을 개시된 바와 같이 유도하며(31), 불용성 봉입체로서 발현시켰다. 상기 펩타이드를 갖는 복합체 중의 활성 및 용해성 단백질을 http://www.microbiology.emory.edu/altman/ jdaWebSite_v3/ptetPrepOverview.shtml에 개시된 리폴딩 방법에 의해 수득하였다. 상기 p53(aa264-272) 및 (aa149-157) 펩타이드/HLA-A*0201 시약을 각각 A2/p53.264-272 및 A2/p53.149-157이라 칭하고, 상기 OVA (aa257-264) 펩타이드/H-2Kb는 Kb/OVA.257-264라 칭한다.
ELISA - 면역플레이트(Maxisorb, Nunc, Rochester, NY)를 c264scTCR 융합 단백질의 포획을 위해 (BF1) 8A3.31 mAb로, 또는 OT1scTCR 융합 단백질의 포획을 위해 H57-597 mAb로 코팅하였다. 세척 후에, 상기 단백질들을 상기 결과 부분에서 상세히 나타낸 바와 같은 다양한 탐침들을 사용하여 검출하였다. 이어서 ABTS(2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산] - 다이암모늄 염) 기질을 가하고 흡광도를 96-웰 플레이트 판독기(Versamax, Sunnyvale, CA)를 사용하여 405 ㎚에서 측정하였다.
유식 세포측정 - 상기 c264scTCR 융합 단백질 복합체의 특성화를 위해서, T2 세포를 펩타이드 로딩 인헨서(PLE, Altor BioScience Corp., Miramar, FL)의 존재 하에서 2 시간 동안 37 ℃에서 p53(aa264-272) 펩타이드로 펄스화하였다. 상기 OT1scTCR 융합 단백질 복합체의 경우, 쥐 림프종 EL4 세포를 37 ℃에서 6 시간 동안 100 ㎍/㎖의 OVA 펩타이드 및 PLE로 펄스화하였다. 다양한 birA 융합 단백질들(SA-PE와 착화됨)을 가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 샘플을 2 회 세척하고 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 FACScan 유식 세포계 상에서 분석하였다.
IL-15 도메인 결합 활성을 평가하기 위해서, 32Dβ 세포를 4 ℃에서 30 분 동안 320 nM의 상기 c264scTCR 융합 단백질 복합체와 함께 배양하였다. 차례로 상기 단백질의 결합을 비오틴화된(BF1) 8A3.31 mAb로 15 분간 및 SA-PE로 15 분간(각각 5 ㎍/㎖) 검출하였다. 염색된 세포를 상술한 바와 같이 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
세포 증식 분석 - 세포 증식을 앞서 개시된 바와 같이 측정하였다(25). 간단히, 32Dβ 세포(1 x 105 세포/웰)를 37 ℃에서 48 시간 동안 동몰 농도의 scTCR/hIL-15RαSu의 존재 또는 부재 하에서 증가하는 농도의 scTCR/hIL-15 또는 scTCR/hIL-15 뮤테인과 함께 배양하였다. 세포 증식 시약 WST-1(롯슈 어플라이드 사이언스, Indianapolis, IN)을 제조사의 과정에 따라 세포 생육의 최종 4 시간 동안 첨가하였다. 대사 활성 세포에 의한 WST-1의 착색된 포르마잔 염료로의 전환을 440 ㎚에서의 흡광도 측정을 통해 측정하였다. EC50을 프리즘4 소프트웨어(GraphPad Software, La Jolla, CA)로 비선형 회귀 가변 기울기 곡선-정합에 의해 상기 실험 데이터로부터 생성된 용량-반응 곡선으로 측정하였다.
표면 플라스몬 공명 - 동족 pMHCI에 대한 상기 OT1scTCR 융합 단백질의 친화성 상수를 BIAcore 2000 장비(GE Healthcare, Piscataway, NJ) 상에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 방법을 사용하여 측정하였다. 비오틴화된 pMHCI 복합체를, HBS 완충제(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% P20 계면활성제, pH 7.4) 중의 단백질 2 ㎍/㎖을 10 ㎕/분의 유속으로 주입함으로써 SA5 센서 칩(GE Healthcare, Piscataway, NJ)의 스트렙트아비딘-코팅된 표면상에 고정화시켰다. 이는 1000 내지 1200 RU의 고정화된 pMHCI 복합체를 생성시켰다.
상기 정제된 OT1scTCR 융합 단백질을 HBS 중에서 1 μM, 0.5 μM 및 0.25 μM로 희석하였다. 각각의 농도를 새로 고정화된 pMHCI 표면뿐만 아니라 비오틴으로 차단된 대조용 스트렙트아비딘 표면(기준선) 상에 10 ㎕/분의 유속으로 1 회 주입하고(50 ㎕) 상기 결합 곡선을 기록하였다. 해리 상수(KD) 및 결합(kon) 및 해리(koff)율을 BIA평가 4.1.1 소프트웨어(GE Healthcare Sciences, Piscataway, NJ)를 사용하여 상기 보정된 결합 곡선(공제된 기준선)으로부터 계산하였다.
hIL-15:hIL-15Rα 스캐폴드를 사용하는 scTCR 이량체의 생성 - 우리는 앞서 c264scTCR/hIL-15로서 나타낸, 생물 활성의 이작용성 융합 단백질을, hIL-15의 N-말단을 3 개-영역, 상기 p53(aa264-272) 펩타이드 항원(c264scTCR)(25)에 특이적인 HLA-A*0201-제한된 키메릭 TCR에 융합시킴으로써 생성시킬 수 있음을 입증하였다(도 36A). 우리는 c264scTCR 및 인간 IL-15Rα의 스시-결합 도메인(aa1-66)(hIL-15RαSu)(hIL-15 결합을 맡고 있는 구조 요소를 함유하는 것으로 입증되었다)과의 유사한 융합 단백질을 제작하였다. 상기 융합 단백질을 birA 펩타이드 태그에 유전자 결합시켜 스트렙트아비딘의 존재 하에서 비오틴화 및 후속 다량체화를 허용하였다(32). 상기 융합 단백질을 c264scTCR/hIL-15RαSu/birA라 표시하며 CHO 세포로부터의 그의 발현 및 정제는 c264scTCR/hIL-15의 경우와 유사하였다(25). 상기 융합 단백질을 세포-배양 상등액의 리터당 ㎎의 수준으로 쉽게 생성시킨다(데이터 도시 안 됨).
상기 hIL-15와 hIL-15RαSu 도메인 간의 높은 비 결합 활성을 근거로, 우리는 상기 융합 단백질이 이종이량체성 복합체를 형성할 수 있음을 예상하였다. 또한, 상기 인간 IL-15:IL-15Rα 복합체의 결정 구조에 대한 조사는 상기 두 단백질의 N-말단들이 상기 복합체의 대향 단부에서 대략 50 Å 떨어져 있음을 지적하였다(33). 따라서, 이들 영역에 대한 상기 scTCR 도메인의 융합은 복합체 형성을 차단하지 않을 것으로 예상된다.
상기 c264scTCR/hIL-15 및 c264scTCR/hIL-15RαSu/birA 융합 단백질 간의 결합의 초기 증거는 hIL-15 및 c264scTCR/hIL-15 단백질을 포획하는 플레이트-결합된 c264scTCR/hIL-15RαSu/birA를 사용하는 ELISA에서 관찰되었다(25). 상기 이량체성 c264scTCR 융합 단백질 복합체(c264scTCR 이량체라 칭함)를 더욱 특성화하기 위해서, 동몰량의 정제된 c264scTCR/hIL-15 및 c264scTCR/hIL-15RαSu/birA 융합 단백질을 혼합하고 실온에서 10 분 넘게 결합되게 하였다. 상기 복합체 및 개별적인 단백질 융합물을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가하였다.
도 36B에 도시된 바와 같이, 상기 정제된 c264scTCR/hIL-15 및 c264scTCR/hIL-15RαSu/birA 융합 단백질 제제의 주요 종들은 단량체성 단백질(각각 분자량(MW) = 115 및 113 kDa)과 일치하는 SEC 프로파일을 나타낸 반면, 상기 두 단백질의 혼합물은 이량체성 복합체에 상응하는 분자량(MW > 192 kDa)을 갖는 주요 피크를 생성시켰다. 따라서, 상기 c264scTCR 이량체 제제 중의 보다 큰 분자량 종들의 출현은 상기 이종이량체성 복합체가 생성되었다는 증거이다.
상기 c264scTCR 이량체를 상기 TCR-특이성 항원, p53(aa264-272)/HLA-A*0201에 결합하는 능력에 대해 단량체성 c264scTCR/BirA 단백질과 비교하였다. 각각의 경우에, 상기 단백질들을 비오틴 리가제로 비오틴화한 다음 SA-PE(32)와 착화시켜 앞서 개시된 바와 같은 다량체성 유식 세포측정 염색 시약(32)을 생성시켰다. 변화하는 농도의 p53(aa264-272) 펩타이드로 펄스화된 HLA-A*0201-양성 T2 세포를 염색하기 위해 사용되는 경우, 상기 두 시약은 모두 펩타이드-농도 의존적인 방식으로 증가되는 항원-특이성 결합을 나타내었다(도 37A). 그러나, 상기 c264scTCR 이량체를 포함하는 상기 염색 시약은 상기 단량체-유도된 c264scTCR/birA 상대보다 3 배까지 더 양호하게 염색하였다(도 37B). 기전에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 데이터는 IL-15:IL-15Rα 상호작용을 통한 이량체화가 상기 scTCR의 작용 활성을 보존하고 증가된 결합능을 통해 scTCR 융합 복합체의 그의 동족 HLA/펩타이드에 대한 유효 친화성을 증가시킴을 암시한다. 상기 birA 태그를 통한 비오틴화가 상기 복합체의 scTCR/hIL-15의 C-말단을 향하는 경우 유사한 결과가 관찰되었다(데이터 도시 안 됨). 이는 상기 복합체의 C-말단을, 상기 융합 단백질 복합체의 이량체화 또는 항원 결합 도메인을 방해하지 않고 현저한 크기(스트렙트아비딘의 MW는 대략 60 kDa이다)의 분자 탐침에 대한 접합에 이용할 수 있음을 입증한다.
이러한 연구를 이중특이성 분자의 생성 가능성의 조사로 연장시켰다. 149 내지 157의 아미노산 잔기에 걸쳐있는 인간 p53 단백질의 HLA-A*0201 제한된 에피토프를 인식하는 제 2의 scTCR(c149scTCR)을 생성시켰다(24). 상기 scTCR을 hIL-15에 융합시키고, c149scTCR/hIL-15로 표시되는 상기 생성 단백질을 CHO 세포에서 상기 c264scTCR/hIL-15RαSu/birA 융합물과 함께 발현시켰다. 상기 재조합 CHO 세포 배양물의 상등액 중에서 관찰된 융합 복합체를 항-IL-15 항체를 사용하여 고정화시키고 HRP-표지된 p53(aa264-272) 또는 p53(aa149-157) 펩타이드/HLA-A*0201 사량체에 의해 탐침처리하였다. 도 37C에 도시된 바와 같이, 상기 항-IL-15 항체 포획된 융합 단백질 복합체는 상기 펩타이드-로딩된 HLA 사량체 모두와 결합할 수 있었다. 상기 결과는 상기 개별적인 scTCR 분자가 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 스캐폴드에 융합 시 작용 활성을 유지하며 hIL-15:hIL-15RαSu 복합체의 공간 배열이 대략 40 kDa의 개별 분자량을 갖는 scTCR 도메인의 충전을 현저하게 방해하지 않음을 입증한다.
단백질 이량체화를 위한 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 스캐폴드의 광범위한 유용성을 입증하기 위해서, 우리는 2 개의 단일 쇄 OT1 TCR, 즉 hIL-15의 N-말단에 융합된 하나 및 hIL-15RαSu/birA 단백질의 N-말단에 융합된 또 다른 하나를 짝지음으로써 제 2의 이량체성 scTCR 융합 복합체를 생성시켰다. OT1은 쥐 H-2Kb와 관련하여 아미노산 잔기 257 내지 264에 걸쳐 있는 OVA 단백질의 에피토프를 인식하는 잘-특성화된 TCR이다(34). OT1 단일 쇄 TCR(OT1scTCR) 유전자를 생성시키고 재조합 CHO 세포 발현을 위해 상기 hIL-15 및 OT1scTCR/hIL-15RαSu/birA 구조물에 융합시켰다. 상기 친화성 정제된 OT1scTCR 융합 단백질은, 포획 시약으로서 항-마우스 TCR Cβ H57 항체 및 HRP-표지된, OVA(aa257-264) 펩타이드-로딩된 H-2Kb 사량체를 사용하는 ELISA에서 pMHCI 결합 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 42). 상기 OT1scTCR 이량체 및 OT1scTCR/birA 단량체 간의 결합 활성의 차이를 식별하기 위해서, 우리는 상기 c264scTCR 이량체에 대해 상술한 바와 유사하지만 OVA(aa257-264)펩타이드가 로딩된 H-2Kb-양성 EL4 세포를 사용하는 유식 세포측정 분석을 수행하였다.
도 38에 도시된 바와 같이, 상기 OT1scTCR 이량체를 포함하는 SA-PE 사량체는 실제로 단량체성 OT1scTCR/birA 융합물을 포함하는 것들보다 현저하게 더 양호하게 염색하였다. 우리는 또한 스트렙트아비딘 센서 칩상에 고정화된 상기 비오틴화된 OVA(aa257-264)펩타이드-로딩된 H2-Kb/birA 복합체에 대한 상기 OT1scTCR 단량체 및 이량체의 결합 친화성을 평가하기 위해 표면 플라스몬 공명 분석을 수행하였다. OVA 펩타이드/II-2Kb 복합체에 대한 상기 OT1scTCR 이량체의 겉보기 결합 친화성(KD)은 약 30 μM인 것으로 추정된 반면, 상기 단량체성 OT1scTCR/birA 융합 단백질의 경우 결합이 관찰되지 않았다(표 1). 이러한 데이터는 hIL-15:hIL-15Rα 상호작용을 통한 이량체화가 상기 scTCR의 생물 활성을 보존하고 상기 scTCR 분자의 증가된 결합능을 통해 그의 동족 pMHCI 복합체에 대한 유효 친화성을 증가시킴을 입증한다.
OT1scTCR/scCD8 이종이량체의 생성 - 상기 CD8 분자는 앞서 OT1 TCR과 그의 동족 OVA 펩타이드/H2-Kb 복합체 간의 상호작용에 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었기 때문에(35-37), 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 스캐폴드는, CD8 분자가 세포 표면 상에서 무세포 및 부착 분자 부재 조건 하에 발현된 OVA 펩타이드/H-2Kb에 대한 OT1 TCR 결합 친화성을 증대시키는지를 평가할 기회를 제공한다. 이를 성취하기 위해서, 우리는 먼저 가요성 링커를 사용하여 상기 쥐 CD8의 α 및 β 쇄의 세포외 도메인들을 융합시킴으로써 단일 쇄 포맷의 쥐 CD8 분자(scCD8)를 생성시켰다. 상기 융합 유전자를 레트로바이러스 발현 벡터 중의 상기 hIL-15RαSu/birA 구조물에 융합시켰다. 이어서 재조합 레트로바이러스를 사용하여 상기 OT1scTCR/hIL-15 융합 단백질을 발현하는 CHO 세포주를 감염시켰다. 상기 이종이량체성 융합 단백질 복합체를 상술한 바와 같이 항-TCR 항체-기재 친화성 크로마토그래피를 사용하여 상기 배양된 재조합 CHO 세포의 상등액으로부터 정제하였다. 상기 정제된 단백질에 대해 포획 시약으로서 항-TCR 항체 또는 탐침으로서 비오틴화된 항-mCD8α 또는 항-mCD8β mAb를 사용하여 ELISA를 수행하였다.
도 39A에 도시된 바와 같이, 상기 항-TCR Ab-고정화된 융합 복합체는 CD8α 및 CD8β 모두를 함유하며 따라서 OT1scTCR/scCD8 이종이량체의 형성을 가리킨다. 우리는 상기 OT1scTCR 이량체를 갖는 OT1scTCR/scCD8 이종이량체의 상기 세포 표면상에 나타나는 변화하는 양의 OVA 펩타이드/H-2Kb 복합체에 대한 결합 활성을 비교하기 위해서 유식 세포측정 분석을 사용하였다. 도 39B에 도시된 바와 같이, 상기 OT1scTCR/scCD8 이종이량체를 포함하는 SA-PE 염색 시약은 10 ng/㎖ 정도로 적은 OVA 펩타이드가 로딩된 EL4 세포 상의 OVA 펩타이드/H-2Kb 복합체를 쉽게 검출할 수 있는 반면, 상기 OT1scTCR 이량체를 포함하는 필적하는 시약을 사용하는 경우 상기 펩타이드 농도에서 염색은 전혀 또는 거의 관찰되지 않았다. 보다 높은 배경 OT1scTCR/scCD8 이종이량체 염색이 펩타이드로 펄스화되지 않은 EL4 세포 상에서 관찰되었으며, 이는 펩타이드-독립적인 상호작용이 상기 세포 표면상에서 상기 CD8 도메인과 MHC 분자 사이에서 발생함을 암시한다. 유사한 효과가 T 세포 상에서 발현된 CD8 분자에 대한 pMHCI 사량체 결합에 대해 보고되었다(38).
상기 OT1scTCR/scCD8 이종이량체의 펩타이드-특이성 상호작용에 대한 결과는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 추가로 확인되었다. OVA 펩타이드/H-2Kb 복합체에 대한 상기 OT1scTCR/scCD8 이종이량체의 결합 친화성(KD)은 2.6 μM인 것으로 추정되었으며, 이는 상기 OT1scTCR 이량체에 대해 관찰된 약 30 μM보다 현저하게 더 높다(표 1, 도 43). 어느 융합 단백질도 대조용 VSV 펩타이드/H-2Kb 복합체에 대해 어떠한 결합도 나타내지 않았다.
특이적인 pMHCI 결합 활성의 차이는, 상기 OT1scTCR 이량체의 2가 성질이 이 분석 포맷에서 증가된 작용 친화성을 제공할 것으로 예상되는 것을 고려하면 놀라운 것이다. 또한, 독립적인 성분들로서 용해성 TCR, CD8α/β 및 pMHCI 단백질을 사용하여 수행된 유사한 SPR 결합 연구는, CD8 단백질과 펩타이드/H-2Kb 복합체 간의 단지 약한 상호작용(KD 30 내지 100 μM) 및 TCR:펩타이드/H-2Kb 상호작용에 대한 CD8의 뚜렷한 협력적인 효과가 없음을 보였다(39-41). 합쳐서 생각하면, 이들 데이터는 상기 OT1scTCR 융합물에 대한 상기 CD8α/β 도메인의 첨가가 상기 2가 OT1scTCR 분자의 생성보다 pMHCI 결합에 더 큰 영향을 미침을 가리킨다. 우리의 결과는 또한 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 스캐폴드를 사용하여 복합체 단백질-단백질 상호작용을 수용하는 융통성으로 이중-특이성 작용 분자를 생성시킬 수 있음을 입증한다. 또한, 우리는 최초로 작용성 CD8 분자를 용해성 단일 쇄 분자로서 제작할 수 있음을 입증하며 상기 scCD8 도메인이 이종이량체성 분자 중에서 OT1scTCR과 착화될 때 다른 부착 분자들의 존재 없이 무 세포 조건에서 TCR:pMHCI 상호작용을 증대시킴을 입증한다.
작용성 TCR α/β 이종이량체의 생성 - 상기 나타낸 바와 같이, 상기 hIL-15 및 hIL-15Rα 도메인의 N-말단은 상기 복합체의 원위 단부에 있으며, 이는 상기 스캐폴드가 다중 쇄 단백질의 폴리펩타이드에 대한 융합에 적합한지의 여부에 관하여 의문을 제기시킨다. 용해성의 생물 활성 이종이량체성 TCR α/β가 상기 hIL-15 및 hIL-15RαSu 스캐폴드를 사용하여 제작될 수 있는지를 결정하기 위해서, 상기 세포외 OT1 TCR Vα-Cα 및 Vβ-Cβ 도메인의 C-말단 단부들을 각각 hIL-15 및 hIL-15RαSu/birA 쇄에 결합시켰다. 상기 공개된 α/β TCR 결정 구조를 근거로, 적합하게 폴딩된 OT1 TCRα/β 분자의 TCR Cα 및 Cβ C-말단 아미노산은 약 18 Å 떨어져 있는 것으로 예상된다(42). 상기 OT1 TCRα/hIL-15 및 OT1 TCRβ/hIL-15RαSu/birA 융합 유전자를 2 개의 별도의 발현 벡터 내에 클로닝하고 CHO 세포 내로 동시 형질감염시켰다. 상기 분비된 융합 단백질 복합체를 상술한 바와 같이 항-TCR Cβ mAb 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 환원 조건 하에서 쿠마씨-염색된 SDS-PAGE에 의해 분석 시, 상기 정제된 단백질 밴드는 50 kDa에서 이동하며, 이는 상기 2 개의 융합 단백질 각각의 계산된 단량체 MW(40 kDa)와 일치한다(데이터 도시 안됨).
상기 정제된 단백질을 작용성 ELISA(항-TCR Cβ mAb 포획: OVA 펩타이드/H2-Kb 사량체 탐침)에서 추가로 특성화하였다. 도 40A에 도시된 바와 같이, 상기 정제된 단백질은 단일 쇄 포맷으로 OT1 TCR과 동등한 pMHCI 결합 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 유사한 결과가 상기 p53-특이성 264 TCR의 Vα-Cα 및 Vβ-Cβ 쇄에 대한 hIL-15:hIL-15RαSu/birA 융합에 대해 관찰되었다(도 40B). 포유동물 세포에서 용해성 α/β TCR 이종이량체를 생성시키고자한 선행 시도들은 충분히 성공적이었다(43,44). 따라서, 우리의 결과는 상기 TCR α 및 β 쇄가 상기 형질감염된 세포 내에서 상기 hIL-15 및 hIL-15RαSu/birA 도메인의 결합을 통해 적합하게 폴딩됨을 암시한다. 흥미롭게도, 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 스캐폴드의 N-말단에 대한 융합은 OT1 TCR 및 264 TCR의 α 및 β 쇄와 같이 가깝게 짝을 이룬 쇄들의 폴딩을 허용하는 가요성을 유지하면서 상기 c264scTCR/c149scTCR 이종이량체 복합체에 대해 관찰된 바와 같이 작용상 독립적인 결합 도메인들에 충분한 공간 배열을 제공할 수 있다.
hIL-15:hIL-15RαSu 융합 복합체에 대한 hIL-15 도메인의 생물 활성 - 상기 c264scTCR 이량체의 hIL-15:hIL-15Rα 도메인의 IL-15 수용체(IL-15RβγC) 결합 능력을, hIL-15Rβ 및 쥐 γC(mγC) 쇄를 갖는 32Dβ 세포를 사용하여 유식 세포측정에 의해 평가하였다. 이 연구를 야생형 hIL-15 도메인을 함유하는 c264scTCR 이량체뿐만 아니라 상기 hIL-15Rβ 쇄(25)에 대한 결합을 증대(N72D) 또는 감소(D8N)시키는 것으로 앞서 입증된 hIL-15 뮤테인 도메인을 갖는 이량체를 사용하여 수행하였다. 또한 우리는 이러한 돌연변이가 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 복합체의 형성에 영향을 미치지 않음을 입증하였다(25). 상기 c264scTCR 이량체와의 배양에 이어서, 상기 32Dβ 세포를 항-TCR mAb로 염색하여 세포-결합된 융합 단백질 이량체를 검출하였다. 도 41A에 도시된 바와 같이, 상기 32Dβ 세포는 hIL-15 야생형 또는 hIL-15N72D 도메인을 함유하는 c264scTCR 이량체에 의해 양으로 염색되지만 상기 hIL-15D8N 도메인을 함유하는 것에 의해서는 염색되지 않으며, 이는 상기 복합체의 IL-15:hIL-15RαSu 부분이 상기 예상된 IL-15RβγC 결합 활성을 유지함을 가리킨다.
상기 융합 단백질 이량체의 hIL-15 생물 활성을 또한 32Dβ 세포를 사용하여 세포 증식 분석에서 또한 조사하였다. 도 42B에 도시된 바와 같이, 상기 단량체성(scTCR/hIL-15 융합물) 또는 이량체성(scTCR/hIL-15:scTCR/hIL-15RαSu) 융합 포맷의 상기 hIL-15 야생형 도메인은 농도-의존적인 방식으로 32Dβ 세포의 생육을 지지할 수 있었으며, 이는 약 300 pM에서 최대 절반의 자극(EC50)을 나타내었다. 상기 hIL-15N72D 또는 D8N 도메인은, 이들이 단량체 융합물로 존재하든 이량체 융합물로 존재하든지 간에, 상기 융합 단백질의 생물 활성을 각각 증가시키거나 감소시켰다. 이러한 결과는 상기 N72D 또는 D8N 돌연변이를 수반하는 비-융합 IL-15 사이토킨에 대해 관찰된 작용 활성과 일치한다(25). 따라서, 2 개의 독립적인 TCR 도메인을 함유하는 융합 단백질 복합체의 형성은 상기 IL-15 도메인의 생물 활성을 현저하게 변화시키지 않는다. 대조적으로, 상기 OT1 TCRα/β 이종이량체 복합체에 대한 IL-15 활성의 3 배 이상의 상실이 존재하였으며(데이터 도시 안 됨), 이는 상기 이종이량체성 TCR 구조물의 형성이 hIL-15RβmγC와 상호작용하는 상기 hIL-15 도메인의 능력을 어느 정도 억제함을 암시한다. 또한, 이러한 결과는 상기 hIL-15 도메인이 수용체 결합 및 작용 활성을 증대 또는 감소시키도록 쉽게 조작될 수 있고, 따라서 상이한 용도에서 상기 hIL-15:hIL-15RαSu 스캐폴드의 추가적인 사용 융통성을 제공함을 가리킨다.
실시예 16 - 면역능력 마우스에서 T2 분자의 독성 프로파일 및 항-종양 활성
상기 T2 분자, IgG1 CH1 도메인이 결여된 T2M(T2MΔCH1) 및 표적화되지 않은 T2MΔTCRΔCH1 단백질 복합체의 추가적인 생체 내 효과를 측정하기 위해서, 우리는 종양-함유 면역능력 C57BL 마우스에서 독성 및 항종양 활성을 조사하였다. B16(5 x 105/마우스) 또는 EG7(1 x 106/마우스) 쥐 종양 세포를 연구 0일째에 C57BL/6NHsd 마우스에게 피하 주사하였다. 종양 함유 마우스에게 연구 1, 4, 8 및 11일째에 51 또는 25.5 ㎍/용량의 T2 단백질(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 쇄로 구성됨), 47.7 ㎍/용량의 T2MΔCH1(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 CH2-CH3 쇄로 구성됨)(51 ㎍/용량의 T2 단백질에 몰 당량), 16.6 또는 8.3 ㎍/용량의 T2MΔTCRΔCH1(huIL15N72D 및 huIL15Rα스시/huIgG1 CH2-CH3 쇄로 구성됨)(각각 51 및 25.5 ㎍/용량의 T2 단백질에 몰 당량), 또는 1.2 ㎍/용량의 rhIL-15(25.5 ㎍/용량의 T2 단백질에 몰 당량)를 정맥 내 주사하였다. 상기 연구 동안, 동물 중량 및 종양 부피를 측정하고 결과를 플롯팅하였다(도 44A-B 및 45A-B).
상기 T2M, T2MΔCH1 및 T2MΔTCRΔCH1 단백질에 의한 처리는 PBS 처리에 이어서 관찰된 경우에 비해 B16(도 44A) 및 EG7(도 45A) 종양 성장을 현저하게 억제하였으며, 상기 융합 단백질 복합체들은 각각 동몰 수준으로 투여된 rhIL-15보다 더 효능이 있었다. 또한, 상기 종양-함유 마우스의 체중 변화에 의해 측정된 바와 같이 T2M, T2MΔCH1 및 T2MΔTCRΔCH1 처리의 독물학적 영향은 거의 또는 전혀 없었다(도 44B 및 45B). 기전에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 데이터는 면역능력 동물에서 상기 분자의 생체 내 면역자극 활성과 일치한다(실시예 13).
실시예 17 - T2M 및 그의 유도체의 면역자극 및 항-종양 활성의 추가적인 특성화
유사한 표적화된 IL-15:IL-15Rα-Fc 복합체를 더욱 특성화하기 위해서, c264scTCR/huIL-15 및 c264scTCR/huIL15Rα/huIgG1 Fc 융합 단백질을 동시 발현하는 재조합 CHO 세포주를 생성시켰다. 하나의 경우에 상기 인간 IgG1 도메인은 전체 중쇄 불변(CH1-CH2-CH3)을 함유하였으며 두 번째 경우에 상기 CH2-CH3 도메인(즉 ΔCH1) 또는 Fc 도메인은 상기 나타낸 바와 같이 사용되었다. 인간 IgG1 CH2-CH3 도메인 또는 Fc 도메인의 단백질 서열을 도 46에 나타낸다. 간략성을 위해서, 이 예에서, 상기 생성되는 c264scTCR/huIL15N72D 초작용물질:c264scTCR/huIL15Rα/huIgG1 CH1-CH2-CH3 복합체를 T2 분자(T2M)라 칭하고 상기 c264scTCR/huIL15N72D 초작용물질:c264scTCR/huIL15Rα/IgG1 CH2-CH3 복합체를 T2M2(또한 상기에 T2MΔCH1으로서)이라 칭한다. 이러한 복합체들의 이점은 상기 Fc 도메인을 통한 이량체화 및 IL-15와 IL-15Rα 도메인 간의 상호작용이 IL-15Rβγ-양성 세포 및 Fc 수용체(FcR)-양성 세포에 결합할 수 있는 사량체성 표적화 분자를 제공한다는 것이다. 또한 이들 도메인 각각의 활성을 상기 동족 수용체와의 상호작용을 감소시키는 돌연변이체에 의해 분석할 수 있다. 재조합 CHO 세포에 의한 용해성 발현에 이어서, 상기 복합체를 항-TCR Cβ mAb-세파로스 및 단백질 A 세파로스를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 동종성으로 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피는 상기 분자가 완전한 복합체에 대해 예상되는 크기에서 이동함을 지적하였다.
상술한 분석과 유사하게, ELISA-기재 방법은 상기 T2M 및 T2M2의 scTCR 및 IL-15 도메인이 이들 각각의 결합 활성을 유지함을 입증하였다. 또한, 상기 T2M 및 T2M2의 IgG1 도메인은 Fc 수용체(FcR) 함유 세포에 결합하는 능력을 유지하며, 이는 scTCR-IgG1 융합물의 경우에 필적하는 활성을 갖는 펩타이드/HLA 사량체에 의한 특이적인 검출을 허용한다. T2M 및 T2M2는 상기 p53(aa264-272)/HLA-A2 복합체를 나타내는 표적 세포에 대한 인간 림프구의 ADCC 활성을 매개할 수 있었다(도 47). 상기 결과는 T2M 및 T2M2가 상기 scTCR-IgG 융합물에 대해 앞서 개시한 항체-유사 효과기 작용을 유지함을 입증한다. FcR 결합 활성을 감소시키는 Fc 돌연변이(LALA)를 함유하는 복합체에 대한 연구는 작용성 Fc 도메인이 ADCC 활성에 필요함을 입증하였다. T2M 및 T2M2는 또한 상기 IL-15 의존성 32Dβ 세포주의 생육을 지지하였지만, T2M보다 약 3 배 더 적은 시험관 내 IL-15 활성을 나타내었다. 마우스에서 면역 반응을 자극하는 상기 분자의 능력을 또한 평가하였다. IL-15(1 ㎎/㎏)에 의한 C57BL/6 마우스의 처리는 혈액 중 백혈구(WBC) 수, 비장 중량 또는 NK 및 CD8+ T 세포 집단에 대해 영향이 거의 또는 전혀 없는 반면 상기 IL-15N72D:IL-15Rα-IgG CH2-CH3 복합체(몰 당량의 IL-15 용량에서)에 의한 처리는 비종 및 상승된 혈액 CD8+ T 세포 수준을 생성시켰으며(도 48A & B), 이는 유사한 IL-15:IL-15Rα-Fc 복합체에 대해 앞서 관찰된 결과와 일치한다. 상기 T2M 및 T2M2 복합체는 모두 WBC 수준, 비장 중량 및 혈액 NK 및 CD8+ T 세포 집단의 증가를 자극하였으며, 이때 상기 T2M2 복합체는 동 몰 용량에서 더 효능 있는 면역자극 효과를 보였다(32Dβ 세포에 대해 더 낮은 IL-15 활성을 나타냄에도 불구하고). NK 및 CD8+ T 세포 집단에 대한 유사한 처리 의존성 효과가 비장에서 관찰되었다. T2M2 및 IL-15N72D/IL-15Rα-IgG 복합체 처리된 마우스로부터 단리된 비장세포는 NK-민감성 YAC 세포에 대해 세포용해 활성을 보였다(도 48C). 용량 반응 연구는 상기 효과가 0.4 ㎎/㎏ 정도로 낮은 단일 용량 수준으로 관찰됨을 지적한다(도 49A). T2M2 및 IL-15N72D/IL-15Rα-IgG에 의한 누드 마우스의 처리는 처리 후 4일째에 혈액 및 비장 중 NK 세포의 백분율의 증가를 보이며, 이는 처리 후 7일째에 거의 기준선 수준까지 감소한다(도 49B). 합쳐서 생각하면, 이들 결과는, 상기 T2M2 복합체가 IL-15의 경우보다 및 상기 IL-15N72D/IL-15Rα-IgG 복합체의 경우보다 NK 세포에 대해 현저하게 더 높은 활성으로 마우스에서 CD8+ T 세포 및 NK 세포 반응을 자극할 수 있음을 가리킨다.
이들 복합체의 항종양 활성을 누드 마우스에서 피하 A375 이종이식편 모델에서 추가로 조사하였다. 초기 연구에서, 재조합 인간 IL-15, c264scTCR-IL15 및 c264scTCR-IL15N72D 융합 단백질 또는 c264scTCR-IL15N72D/c264scTCR-IL15Rα 복합체의 투여는 PBS 또는 c264scTCR-IL15Rα 융합 단백질 처리에 비해 s.c. A375 종양 이종이식편에 대해 효과가 없음을 보였다(도 50A). 상기 모델에서 상기 TCR-IL15 융합물의 효과의 결여는 상기 c264scTCR-IL2 융합물에 대해 보고된 결과와 대조적으로 NK 세포 반응을 자극하는 상기 단백질의 능력이 없음에 기인하는 듯하다. 상기에 나타내는 바와 같이, T2M 복합체를 상기 모델에서 시험한 경우, 상기 복합체는 보통이지만 통계학적으로 유의수준인 항-종양 활성을 나타내었으며 이는 NK 세포 증식을 자극하는 그의 능력과 일치한다(도 50B). 그러나, 동 몰량의 c264scTCR-IL15 융합물에 의한 처리와 대조적으로, 상기 T2M 투여 스케줄(3주간 이틀마다 4 ㎎/㎏)은 최종 투여 후 현저한 체중 손실을 생성시켰으며 6 마리 마우스 중 2 마리가 죽었다. 임상적인 관찰은 마우스 무기력, 구부정한 자세, 및 불그스레한 피부를 포함하였다. 다른 모델에서 IL-15 단백질 복합체의 동반 연구는 반복된 이틀에 한 번의 투여가 잘 허용되지 않으며 주 1회 투여는 과도한 독성 없이 면역 자극을 제공함을 입증하였다. NK 세포 증식 유도에 유효한 것으로 입증된 용량 수준의 T2M2 복합체의 이틀에 한 번에서 주 1 회 스케줄로의 투여 섭생의 변화는 IL-15 또는 PBS 처리에 비해 현저하게 더 효능 있는 항-종양 활성을 나타내었다(도 50C). 보다 중요하게, 상기 주 1 회 투여 섭생은 상기 종양-함유 누드 마우스 및 면역능력 마우스에 의해 또한 잘 허용되었다.
상기 scTCR-IL15 융합물 및 T2M 복합체의 독성 프로파일을 상술한 생체 내 활성 연구와 동반하여 평가하였다. 상기 가리킨 바와 같이, scTCR-IL15 융합물에 의한 3 주의 이틀에 한 번 처리는 종양 함유 누드 마우스에 의해 잘 허용되었지만 T2M(4 ㎎/㎏) 처리는 상기 동물의 >30%에서 사망률을 발생시켰다. 이를 1 주일 동안 이틀에 한 번, 9, 18 또는 36 ㎎/㎏의 T2M 또는 몰 당량의 T2M2 복합체를 투여한 HLA-A*0201/Kb-트랜스제닉 마우스에서 추가로 평가하였다. 처리 개시 후 1 주일째에 체중 및 임상 관찰에 대한 처리, 용량 및 시간 의존성 영향이 나타났다. 36 ㎎/㎏ T2M을 제공받은 마우스는 동량의 T2M2로 처리된 마우스에서 관찰된 12% 감소에 비해 20%의 체중 감소를 나타내었다. 1 주일의 기간에 걸쳐 약 9 ㎎/㎏의 T2M 또는 T2M2로 처리한 마우스에서 체중 변화는 관찰되지 않았다. 흥미롭게도 T2M에 의해 관찰된 보다 높은 독성은, T2M2로 처리된 마우스가 T2M-처리된 마우스보다 더 높은 수준의 WBC 수 및 NK 세포 수준을 나타내었기 때문에 증가된 면역 세포 활성화와 상관되지는 않았다. 마우스 체중, 비장 중량 및 면역 세포에 대한 최소 영향이 0.4 ㎎/㎏ T2M2의 단일 용량의 i.v. 투여에 이어서 관찰되었다. 또한 키노몰구스 원숭이에서의 예비 연구는 단일의 0.5 ㎎/㎏ i.v. 용량의 T2M이 어떠한 관찰된 독성 효과도 일으키지 않았으나 CD8+ 기억 T 세포 및 효과기 NK 세포 확대를 유도할 수 있음을 지적하였다. 이러한 연구의 결과는 효능 있는 면역자극 및 항암 활성 및 유리한 독성 및 약동학 프로파일을 갖는 표적화된 IL-15 융합 복합체가 생성될 수 있음을 가리킨다. 이러한 연구를 통해 최적화된 TCR-표적화된 T2M2(c264scTCR/huIL15N72D 및 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 CH2-CH3 쇄로 구성된 T2MΔCH1이라 또한 지칭됨)가 정의되고 특성화되었다. 상기 c264scTCR/huIL15Rα스시/huIgG1 CH2-CH3 구조물의 핵산 및 단백질 서열을 각각 도 51 및 52에 도시한다.
실시예 18 - 항체 표적화 도메인을 포함하는 T2 분자의 특성화
추가적인 질병 표적화된 분자를 생성시키기 위한 상기 huIL-15:huIL-15RαSu 스캐폴드의 유용성을 입증하기 위해서, huIL-15N72D 및 huIL-15RαSu/huIgG1 CH2-CH3(Fc) 쇄의 N-말단에 항-인간 CD20 단일 쇄 항체의 C-말단 단부를 결합시킨 구조물을 제조하였다. 상기 항-인간 CD20 단일 쇄 항체(항-CD20 scAb) 서열은 가요성 링커 서열을 통해 결합된 리툭시맵 항체의 중쇄 및 경쇄 V 도메인의 암호화 영역들을 포함한다. 상기 항-CD20 scAb/hIL-15N72D 구조물의 핵산 및 단백질 서열을 각각 도 53 및 54에 도시한다. 상기 항-CD20 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc 구조물의 핵산 및 단백질 서열을 각각 도 55 및 56에 도시한다. 이들 서열을 상술한 바와 같이 발현 벡터 내에 클로닝하고 상기 발현 벡터를 CHO 세포 내로 형질감염시켰다. 상기 두 구조물의 동시 발현은 용해성 항-CD20 scAb/huIL-15N72D:항-CD20 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc 복합체(항-CD20 scAb T2M이라 지칭됨)의 형성 및 분비를 허용하였으며 상기 복합체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 CHO 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다.
상술한 분석과 유사하게, ELISA-기재 방법은 상기 항-CD20 scAb/huIL-15N72D:항-CD20 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc 복합체의 형성을 입증하였다. 또한, 상술한 바와 같이 32Dβ 세포를 사용하는 IL-15 수용체 결합 및 세포 증식 분석은 상기 복합체가 IL-15 결합 및 생물 활성을 나타냄을 가리켰다. 이어서 상기 항-CD20 scAb T2M 복합체를 인간 CD20+ 버킷(Burkitt) 림프종 다우디(Daudi) 세포주에 대한 항원 특이성 결합 활성에 대해 시험하였다. 다우디 세포를 항-CD20 scAb T2M, c264scTCR T2M 또는 PBS와 함께 배양하였다. 세척 단계에 이어서, 세포 결합된 융합 단백질 복합체를 유식 세포측정에 의해 PE-접합된 염소 항-인간 Ig 항체(GAH-Ig-PE)로 검출하였다(도 57). 상기 항-CD20 scAb T2M 복합체는 다우디 세포에 대한 현저한 결합을 보였으며 이는 c264scTCR T2M 또는 GAH-Ig-PE에 대해서 관찰되지 않았고, 이는 상기 세포에 대한 특이적인 반응성을 가리킨다.
상기 항-CD20 scAb T2M 복합체가 ADCC-기본 기전을 통해 CD20+ 종양 세포를 살해할 수 있는지를 측정하기 위한 연구들을 또한 수행하였다. 칼세인-AM 표지된 다우디 표적 세포를 인간 PMBC(E:T - 100:1) 및 다양한 농도의 항-CD20 scAb T2M, c264scTCR T2M(음성 대조군) 또는 키메릭 항-CD20 mAb(양성 대조군)와 혼합하였다. 배양 기간 후에, 표적 세포 용해를 상술한 바와 같이 평가하였다. 도 58에 도시된 바와 같이, 상기 항-CD20 scAb T2M 복합체는 CD20+ 인간 림프종 세포에 대한 ADCC 활성을 매개함에 있어서 매우 유효하였다. 이는 상이한 효과기 대 표적 세포 비를 조사하는 유사한 연구들에 의해 입증되었으며, 이때 상기 항-CD20 scAb T2M 복합체(2 nM에서)는 상기 키메릭 항-CD20 mAb로서 필적할만한 활성을 보였다(도 59).
이러한 결과를 근거로, 상기 항-CD20 scAb T2M 분자는 표준 이종이식편 종양 모델에서 인간 림프종 세포에 대해 항종양 활성을 나타낼 것이 예상된다(예를 들어 문헌[Rossi et al . Blood 2009;114:3864]; [Gillis et al . Blood. 2005;105:3972; 및 Xuan et al . Blood 2010;115:2864-2871]을 참조하시오).
또한 상기 huIL-15N72D 및 huIL-15RαSu/huIgG1 CH2-CH3(Fc) 쇄에 각각 개별적으로 융합된 항-CD20 경쇄 및 중쇄 도메인을 포함하는 T2M 구조물을 본 발명에 개시된 바와 같이 생성시키고 발현시킬 수 있었다. 상기와 같은 2 개의 융합 구조물의 핵산 및 단백질 서열을 도 60 내지 63에 도시한다. 이들 융합 단백질을 포함하는 정제된 복합체는 상술한 바와 같이 Fc 도메인 및 IL-15 생물 활성 및 CD20-특이성 결합 활성을 나타내는 것으로 예상된다. 이들 복합체는 생체 내에서 CD20+ 종양 세포에 대한 ADCC 활성 및 CD20+ 종양 세포에 대한 항종양 활성을 매개할 것으로 예상된다.
scAb 또는 항체 인식 도메인을 포함하는 유사한 T2M 구조물을 다른 CD 항원, 사이토킨 또는 케모킨 수용체 또는 리간드, 성장 인자 수용체 또는 리간드, 세포 부착 분자, MHC/MHC-유사 분자, Fc 수용체, 톨형 수용체, NK 수용체, TCR, BCR, 양성/음성 동시-자극 수용체 또는 리간드, 치사 수용체 또는 리간드, 종양 관련된 항원, 바이러스-암호화된 및 세균-암호화된 항원 및 세균-특이성에 특이적인 항체 서열로 쉽게 생성시킬 수 있었다. 특히 중요한 것은 CD3, CD4, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD51, CD52, CD70, CD74, CD80, CD152, CD147, CD221, EGFR, HER-2/neu, HER-1, HER-3, HER-4, CEA, OX40 리간드, cMet, 조직 인자, 넥틴-4, PSA, PSMA, EGFL7, FGFR, IL-6 수용체, IGF-1 수용체, GD2, CA-125, EpCam, 치사 수용체 5 MUC1, VEGFR1, VEGFR2, PDGFR, 트레일(Trail) R2, 폴레이트 수용체, 안지오포이에틴-2, 알파v베타3 인테그린 수용체 및 HLA-DR 항원의 에피토프에 특이적인 항체 도메인을 갖는 T2M이다. HIV, HCV, HBC, CMV, HTLV, HPV, EBV, RSV 및 다른 바이러스로부터의 바이러스 항원에 대한 항체 도메인, 특히 HIV 외피 스파이크 및/또는 gp120 및 gp41 에피토프를 인식하는 것들이 또한 중요하다. 상기와 같은 항체 도메인을 당해 분야에 공지된 서열로부터 생성시키거나 또는 당해 분야에 공지된 다양한 공급원(즉 척추동물 숙주 또는 세포, 조합 라이브러리, 랜덤 합성 라이브러리, 컴퓨터에 의한 설계 등)으로부터 드노보 단리할 수 있다.
또한, 상기 가리킨 바와 같이, 상기 항체-표적화된 T2 복합체의 치료 지수를 최적화하고 독성을 최소화하기 위해서 상기 IL-15 도메인 및 IgG Fc 도메인의 활성을 증가시키거나 감소시키는 것이 유용하다. Fc 도메인의 활성을 변형시키는 방법은 상기에 개시되어 있으며 당해 분야에 널리 특성화되어 있다. 상기와 같은 경우에, 상기 IL-15 도메인 중에 그의 활성을 감소시키는 돌연변이를 함유하는 복합체가 보다 양호한 치료 활성 및 보다 낮은 독성을 제공하는 것으로 예상된다. 상술한 IL-15 도메인 중의 N65D 또는 D8N 치환, 또는 IL-15 활성을 감소시키는 것으로 밝혀진 I6S, D8A, D61A, N65A, N72R, V104P 또는 Q108A를 포함하는 다른 치환들을 함유하는 항체-표적화된 T2 분자가 특히 중요하다.
실시예 19: CHO 세포에서 IL -15 N72D 및 IL -15Rα Su / Fc 융합 유전자의 동시-발현
선행 연구들은 재조합 IL-15가 포유동물 세포에 의해 불충분하게 발현됨을 입증하였다(문헌[A. Ward et al., Protein Expr Purif 68 (2009) 42-48]). 그러나, IL-15Rα와의 세포 내 복합체 형성은 ER에서 IL-15 분해를 방지함이 보고되었다(문헌[C. Bergamaschi et al., J Biol Chem 283 (2008) 4189-4199]). 따라서, IL-15는 IL-15Rα와 함께 발현되는 경우 더 높은 수준으로 생성될 수 있는 것으로 가정되었다. N 말단에 소위 "스시" 도메인(Su)을 함유하는 용해성 IL-15Rα 단편은 사이토킨 결합을 맡고 있는 구조 요소의 대부분을 가짐이 공지되어 있다. 용해성 IL-15RαSu(그의 막관통 도메인 부재) 및 IL-15는 용액 중에 매우 안정한 이종이량체성 복합체(복합체의 Kd = 100 pM(문헌[G. Bouchaud et al., J Mol Biol 382 (2008) 1-12]))를 형성할 수 있으며 이들 복합체는 IL-15Rβγc 복합체를 통해 면역 반응을 조절(즉 자극하거나 차단하거나)할 수 있다(문헌[E. Mortier et al., J Biol Chem 281 (2006) 1612-1619]; [M.P. Rubinstein et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103 (2006) 9166-9171]; [T.A. Stoklasek et al., J Immunol 177 (2006) 6072-6080]; [G. Bouchaud et al., J Mol Biol 382 (2008) 1-12]). 따라서, IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질로 이루어지는 복합체를 생산을 위해 선택하였다(도 64 참조). 상기 IL-15RαSu 도메인을 상기 인간 IgG1-Fc 영역에 유전자 융합시켜 그의 이량체화 및 쇄 간 다이설파이드 결합을 통한 이량체화를 촉진하였다. IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc를 동시 발현시키기 위해서, 2 개의 개별적인 레트로바이러스-기재 발현 벡터, pMSGV-IL-15RαSu/Fc 및 pMGSV-IL-15N72D를 제작하고 CHO 세포 내로 동시 형질감염시켰다. 상기 재조합 CHO 세포를 상기 2 개의 발현 벡터에 의해 제공된 네오마이신 및 퓨로마이신 내성 요소들을 근거로 선택하고 이어서 개별적인 생산 세포주를 제한된 희석 클로닝을 사용하여 생성시켰다. 무혈청의 한정된 배지 중에서 ELISA를 근거로, 대략 100 ㎎/ℓ의 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체를 생산할 수 있는 클론이 동정되었다. 이 결과는 IL-15가 IL-15RαSu 도메인과 함께 발현되는 경우 포유동물 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있음을 입증한다.
실시예 20: IL -15 N72D : IL -15Rα Su / Fc 복합체의 정제 및 특성화
IL-15RαSu/Fc 및 IL-15N72D를 동시 발현시키고 재조합 CHO 세포에서 세포 내 조립한 경우, 4 개의 상이한 형태의 단백질이 세포 배양 상등액 중에서 예상되었다: 1) 2 개의 IL-15N72D 서브유닛으로 완전히 점유된 이량체성 IL-15RαSu/Fc 분자, 2) 하나의 IL-15N72D 서브유닛으로 부분적으로 점유된 이량체성 IL-15RαSu/Fc 분자, 3) 결합된 IL-15가 없는 소량의 유리 동종이량체성 IL-15RαSu/Fc 분자, 및 4) 유리 IL-15N72D. IL-15N72D는 Fc 영역이 없기 때문에, r단백질 A-기본 친화성 정제 단계를 사용하여 상기 배양 상등액 중의 모든 Fc-함유 융합 단백질로부터 유리 IL-15N72D를 분리시켰다.
이어서 다양한 형태의 IL-15RαSu/Fc 복합체를 분리시키기 위해 이온 교환 크로마토그래피 방법이 개발되었다. 상기 IL-15RαSu/Fc 이량체성 분자의 계산된 등전점(pI)은 8.5이다. 예상된 바와 같이, 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0 용액 중의 상기 단백질은 QSFF 수지에 결합하지 않음이 후속으로 발견되었다. 또한, IL-15N72D의 계산된 pI는 4.5이다. 따라서, 상기 부분적으로 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc(즉 이량체성 IL-15RαSu/Fc + 하나의 IL-15N72D 분자) 및 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc(이량체성 IL-15RαSu/Fc + 2 개의 IL-15N72D 분자)의 전체 전하가 상이한 것으로 예견되었다. 이는 상기 완전히 점유된 및 부분적으로 점유된 복합체들 각각의 예상된 pI에 상응하는 5.6 내지 6.5 및 6.8 내지 7.5의 pI를 갖는 복합체의 2 개의 주요 그룹을 나타낸, 상기 단백질-A-정제된 제제의 IEF 젤 분석과 일치한다(도 65A). 각각의 단백질 그룹의 pI 밴드들 가운데 이질성은 추정상 상기 IgG1 쇄 중의 글리코실화 정도 및 C-말단 리신 변체에 기인한다. 따라서, 상이한 이온 강도를 갖는 완충제를 사용하여 상기 QSFF로부터 상기 부분적으로 점유된 및 완전히 점유된 복합체들을 별도로 용출시켰다. 130 mM NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0을 사용하여, 단일 단백질 분획(Q 단계 1)을 QSSF로부터 용출시켰으며 이는 상기 IL-15RαSu/Fc 분자의 부분 점유율을 측정하는 ELISA를 근거로 주로 상기 부분적으로 점유된 복합체를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 300 mM NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0을 사용하는 후속 단계에서, Q1c 및 Q2c로서 표시된 2 개의 단백질 분획들이 상기 QSFF로부터 추가로 용출되었다. ELISA 분석을 이들 제제 상에서 수행하였으며, 상기 분석은 Q1c 분획이 부분적으로 점유된(전체의 10%) 및 완전히 점유된(90%) 복합체들의 혼합물을 함유하는 반면 Q2c는 오직 완전히 점유된 복합체만을 함유함을 가리켰다(데이터 도시 안 됨). 이러한 발견은 정제된 단백질 제제의 IEF 젤 분석과 일치한다(도 65B). Q 단계 1로부터 용출된 단백질은 5.6 내지 7.5 범위의 넓은 pI를 갖고; pI 6.8 내지 7.5의 단백질은 부분적으로 점유된 복합체를 나타낸다. Q 단계 2 용출의 분획 Q1c는 주로 5.6 내지 6.5 범위의 pI를 갖는 단백질(즉 완전히 점유된 복합체)을 함유하지만 5.6 내지 7.5의 pI를 갖는 소량의 오염물질 단백질을 함유하였다. 상기 Q2c 분획은 오직 5.6 내지 6.5 범위의 pI를 갖는 단백질만을 함유하였다.
SEC 분석에서, 상기 정제된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc Q2c 제제는 고 순도로 단일 분자로서 용출되는 것으로 밝혀졌다(도 66). 상기 동종이량체의 추정된 분자량은 대략 114 kDa이었으며, 이는 IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질의 추론된 아미노산 서열을 근거로 계산된 92 kDa 분자량보다 더 컸다. 이는 포유동물 세포에 의해 생산된 단백질의 글리코실화에 기인하는 듯하다.
환원 SDS-PAGE(도 65C)에서, 상기 정제된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 제제는 40 kDa, 16 kDa 및 13 kDa의 분자량을 갖는 3 개의 단백질을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, N-글리코시다제 F에 의해 절단 후, 약 37 kDa 및 13 kDa의 분자량을 갖는 2 개의 단백질만이 검출되었다(도 65D). 이들 분자량은 IL-15RαSu/Fc 및 IL-15 또는 IL-15N72D의 계산된 분자량과 근접하게 합치된다. 이는 이들 2 개의 단백질이 포유동물 세포 생산 도중 글리코실화되었고 상기 IL-15N72D가 13 kDa 및 16 kDa의 분자량을 갖는 2 개의 주요 글리코실화 형태로 생성되었음을 암시한다. 도 65C에 도시된 상이한 정제 분획들 중의 상기 IL-15N72D 종의 상대적인 풍부성은 ELISA 및 IEF 젤 분석에 의해 측정된 복합체 점유 수준과 일치한다.
상기 IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc는 환원 SDS-PAGE에서 분리되었으며 이들 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 에드만 분해 방법을 사용하여 측정하였다. 대략 15 개의 N-말단 아미노산 서열이 IL-15RαSu/Fc 및 IL15N72D 각각에 대해 획득되었다. 이들 단백질의 상기 측정된 N-말단 아미노산 서열은 상기 2 개 유전자의 암호화 영역으로부터 추론된 아미노산 서열과 합치되었다. 환원된 SDS-PAGE 상에서 13 및 16 kDa에서 나타난 2 개의 주요 밴드의 아미노산 서열은 IL-15N72D인 것으로 확인되었다. 상기 서열 확인은 다시 포유동물 세포에서 IL-15N72D의 글리코실화의 증거를 제공하였다.
실시예 21: IL -15 N72D : IL -15Rα Su / Fc 복합체의 약동학 성질
IL-15 및 시험관 내 조립된 IL15:IL-15Rα/Fc 복합체가, 이들 단백질을 복강 내 주사한 경우 마우스에서 각각 1 시간 및 20 시간 혈청 반감기를 가짐이 앞서 보고되었다(문헌[T.A. Stoklasek et al., J Immunol 177 (2006) 6072-6080]). IL-15 및 동시 발현된, 정제된 IL-15:IL-15RαSu/Fc 복합체가 정맥 내 투여될 때 유사하게 반응하는지를 평가하기 위해서, 이들의 약동학 매개변수를 CD-1 마우스에서 측정하였다. 정맥 내 투여는, 상기 투여가 인간에서 상기 IL-15:IL-15RαSu-Fc 복합체에 사용되는 약물 전달 경로일 듯하기 때문에 선택되었다. 암컷 마우스에게 1.0 ㎎/㎏의 IL-15:IL-15RαSu/Fc 또는 0.28 ㎎/㎏의 IL-15(몰 당량 용량)를 정맥 내 주사하고 혈액을 IL-15의 경우 주사 후 15 분에서 8시간까지 및 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc의 경우 30 분에서 72 시간까지 다양한 시점들에서 채혈하였다. IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc의 혈청 농도를 2 개의 ELISA 포맷, 즉 완전한 복합체를 검출하는 하나(항-IL-15 Ab 검출) 및 오직 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질만을 검출하는 다른 하나(항-인간 IgG Fc Ab 검출)를 사용하여 평가하였다. IL-15의 농도를 표준 IL-15-특이성 ELISA를 사용하여 평가하였다.
단일 정맥 내 일시 주사 후 IL-15:IL-15RαSu/Fc 및 IL-15에 대해 예견된 정합성 및 실제 데이터를 도 67에 도시한다. 항-IL-15 Ab-기본 또는 항-인간 IgG Fc Ab-기본 ELISA를 사용하여 추정된 IL-15:IL-15RαSu/Fc의 반감기는 각각 약 25 또는 18 시간이었다. 이러한 결과는 상기 융합 단백질이 절단되지 않았고 상기 IL-15가 생체 내에서 상기 IL-15RαSu/Fc 분자로부터 현저하게 해리되지 않았음을 가리킨다. IL-15:IL-15RαSu/Fc의 제거(Cl) 범위는 0.059 내지 0.051 ㎖/h이고 정상 상태의 분배 부피(Vss)는 상기 분석 포맷에 따라 2.1 내지 1.3 ㎖의 범위이었다. 비교에서, IL-15는 0.24 시간의 흡수 반감기 및 0.64 시간의 종말 반감기를 가졌다. IL-15의 Cl은 49 ㎖/h이고, Vss는 18.4 ㎖이었다. 이러한 결과는 IL-15:IL-15RαSu/Fc가 IL-15보다 >24 배 더 긴 종말 반감기를 나타내고 >800 배 더 느리게 제거됨을 가리킨다.
실시예 22: IL -15 N72D : IL -15Rα Su / Fc 복합체의 시험관 내 및 생체 내 생물 활성
동시 발현되고 정제된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체의 생물 활성을 IL-15 의존적인 32Dβ 세포 증식 분석을 사용하여 평가하였다. 상기 분석을 위해서, 시험관 내 조립된 (IVA) IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc IVA)를 또한 4 ℃에서 30 분간 IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc를 1:1 비로 혼합함으로써 생성시켰다. 도 68에 도시된 바와 같이, 상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체는 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc IVA와 동등한 32Dβ 세포의 생육을 지지하는 생물 활성을 가졌다. 상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체는 15.61 pM의 EC50을 나타내었고 상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc IVA는 15.83 pM의 EC50을 나타내었다. 이는 상기 동시 발현된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체가 적합하게 세포 내 처리되고 정제 후 완전한 IL-15 활성을 유지함을 입증한다. 따라서, 본 발명에 제공된 방법은 개별적으로 생산된 시험관 내 조립체 및 일부의 경우 리폴딩된 단백질을 사용하는 현행 전략보다 더 양호한 cGMP-등급 임상 물질의 생성을 위한 접근법을 나타낸다.
상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체 및 IL-15wt를 또한 C57BL/6 마우스에서 NK 세포 및 CD8+ T 세포의 확대를 유도하는 이들의 능력에 대해 비교하였다. 도 69에 도시된 바와 같이, IL-15wt는 0.28 ㎎/㎏의 단일 정맥 내 투여 후 4일째에 NK 및 CD+ 8 세포의 확대에 현저한 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체는 혈액 및 비장 중 NK 및 CD8+ T 세포 증식을 현저하게 촉진하였으며, 이는 혈중 림프구증가증 및 비종을 유도하였다(도 69 및 70). 이러한 발견은 IL-15:IL-15Rα 복합체가 생체 내에서 IL-15의 생물 활성을 현저하게 증가시켰다는 선행 보고서와 일치한다(문헌[M.P. Rubinstein et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103 (2006) 9166-9171]; [T.A. Stoklasek et al., J Immunol 177 (2006) 6072-6080]; [S. Dubois et al., J Immunol 180 (2008) 2099-2106]; [M. Epardaud et al., Cancer Res 68 (2008) 2972-2983]; [A. Bessard et al., Mol Cancer Ther 8 (2009) 2736-2745]). 상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체의 이러한 증대된 활성은 IL-15Rβγc 복합체에 대한 N72D 뮤테인의 증가된 결합 활성(문헌[X. Zhu et al., J Immunol 183 (2009) 3598-3607]), 생체 내에서 IL-15Rα 쇄에 의해 최적화된 사이토킨 트랜스-제공(수지상 세포 및 대식세포 상의 FcR 수용체를 통해), 사이토킨 도메인의 이량체성 성질(IL-15Rβγc에 대한 결합의 증가된 결합능) 및 IL-15에 비해 증가된 그의 생체 내 반감기(25 시간 대 <40 분)의 조합의 결과인 듯하다.
요컨대, 본 발명에 개시된 결과는 상기 IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc 유전자가 재조합 CHO 세포에서 동시 발현될 수 있고 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체는 단순한 규모조절 가능한 정제 방법을 사용하여 세포 배양 상등액으로부터 고도로 정제될 수 있음을 입증한다.
상기 실시예들을 하기의 물질 및 방법을 사용하여 수행하였다.
단백질 복합체 발현용 벡터의 제작
상기 IL-15RαSu/Fc 융합 유전자를 인간 IL-15Rα의 스시 도메인(인간 IL-15Rα의 aa1-66) 및 인간 IgG1 Fc 단편을 암호화하는 DNA 주형의 오버랩 PCR 증폭에 의해 제작하였다. 상기 신호 펩타이드-IL-15RαSu 암호화 영역(문헌[R.L. Wong et al., Protein Eng Des Sel 24 (2011) 373-383]) 및 인간 IgG1-Fc 유전자 단편(문헌[L.A. Mosquera et al., J Immunol 174 (2005) 4381-4388])을 각각 하기 프라이머 쌍들을 사용하여 증폭시켰다:
BA494: 5'-GACTTCAAGCTTAATTAAGCCACCATGGACAGACTTACTTCTTC-3';
BA550R: 5'-GTGAGTTTTGTCACAAGATTTCGGCTCTCTAATGCATTTGAGACTGGGGGTTG-3', 및
BA550F: 5'GAGCCGAAATCTTGTGACAAAACTCAC-3';
BA393R: 5'-GTAATATTCTAGACGCGTTCATTATTTACCAGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC-3'
상기 생성되는 IL-15RαSu/Fc 융합 유전자를 퓨로마이신-내성 발현 벡터 pMSGV-1(문헌[M.S. Hughes et al., Hum Gene Ther 16 (2005) 457-472]) 내로 연결시켜 발현 벡터 pMSGV-IL-15RαSu/Fc를 제작하였다.
IL-15N72D의 암호화 서열(문헌[X. Zhu et al., J Immunol 183 (2009) 3598-3607])을 IRES 영역 뒤에 네오마이신 내성 유전자를 지니는 변형된 레트로바이러스 발현 벡터 pMSGV-1(문헌[M.S. Hughes et al., Hum Gene Ther 16 (2005) 457-472]) 내로 클로닝하여 발현 벡터 pMSGV-IL-15N72D를 제작하였다.
CHO 세포에서 IL-15N72D:pMSGV-IL-15RαSu/Fc 융합 복합체의 동시 발현
IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질(도 64 참조)을 동시 발현하기 위해서, pMSGV-IL-15RαSu/Fc 및 pMSGV-IL-15N72D를 CHO 세포에 동시-형질감염시킨 다음 2 ㎎/㎖의 G418(Hyclone, Logan, UT) 및 10 ㎍/㎖의 퓨로마이신(Hyclone, Logan, UT)을 함유하는 배지에서 선택하였다. 상기 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질을 또한 대조용으로서 재조합 인간 야생형 IL-15(IL-15wt)의 로딩에 사용하기 위해 CHO 세포에서 개별적으로 발현시켰다. 상기 융합 단백질들의 생산을 위해서, 상기 재조합 CHO 세포를 무혈청 한정된 배지(SFM4CHO, Hyclone, Logan, UT)에서 37 ℃에서 생육시켰다. 상기 배양물의 생육 가능한 세포 밀도가 최대에 도달했을 때, 배양 온도를 상기 용해성 복합체의 축적을 위해 30 ℃로 하향 이동시켰다. 이어서 상기 배양물의 생육 가능한 세포 밀도가 대략 10% 생육 가능한 세포에 도달하면 배양 상등액을 수확하였다.
정제 과정
재조합 CHO 세포 배양 배지를 원심분리하고 여과하여 세포 및 찌꺼기를 제거한 후에 상등액을 1M 트리스-HCl, pH 8.0으로 pH 8.0으로 조절하였다. 용해성 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체를 2 단계 친화성 및 이온 교환 크로마토그래피-기본 공정을 사용하여 정제하였다.
상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체가 IgG1-Fc 도메인을 함유하므로, r단백질 A 세파로스 고속 흐름 (GE Healthcare) 컬럼을 상기 정제 공정에서 제 1 단계로서 사용하였다. 샘플 로딩 전에, 상기 컬럼을 5 컬럼 부피(CV)의 20 mM 트리스-HC, pH 8.0으로 세척하고, 5 CV의 0.1N NaOH로 1 시간 동안 살균하고, 이어서 7 CV의 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0으로 평형화시켰다. 상등액을 상기 11 ㎖ 컬럼에 2 ㎖/분으로 로딩하고, 이어서 상기 컬럼을 8 CV의 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0으로 세척한 다음 7 CV의 세척 완충제(0.1M Na-시트레이트, pH 5.0)로 세척하여 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거하였다. 이어서 상기 단백질을 0.2M Na-시트레이트, pH 4.0으로 용출시키고 수거된 피크 분획들의 pH를 0.2M 시트르산을 사용하여 pH 3.5로 바로 조절하고; 용출된 단백질을 상기 저 pH에서 30 분간 표준 바이러스 제거 단계로서 유지시켰다. 상기 저 pH 유지 단계 후에, 상기 용출된 제제의 pH를 2M 트리스-HCl, pH 8.0을 사용하여 pH 7.7로 조절하였다. 상기 제제를 농축시키고 아미콘 울트라-15 원심분리 농축기(30 kDa 컷-오프, Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0 내로 완충제 교환한 후에 0.22 ㎛ 필터(Corning Life Sciences, Lowell, MA)를 사용하여 멸균 여과하였다.
이어서 상기 단백질 제제를 Q 세파로스 고속 흐름(QSFF; GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) 이온 교환 컬럼에 적용하였다. 5 ㎖ 컬럼을 완충제 A(20 mM 트리스-HCl, pH 8.0)로 세척하고, 5 CV의 0.1N NaOH로 1 시간 동안 살균하고, 이어서 완충제 A로 평형화시켰다. 상기 제제 중 단백질 농도를 먼저 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0으로 <1 ㎎/㎖로 조절하고, 이어서 1 ㎖/분의 속도로 상기 QSFF 컬럼 상에 로딩하였다. 이어서 상기 단백질을 하기와 같은 3-단계-구배 공정을 사용하여 상기 컬럼으로부터 용출시켰다: 제 1 단계로서 4 CV에 대해 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 130 mM NaCl, 제 2 단계의 경우 4 CV에 대해 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 및 마지막 단계로서 2 CV에 대해 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl. 단백질 피크 분획들을 수거하고, 완충제를 PBS(Hyclone, Logan, UT)로 교환하고 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. 단백질 농도를 1 A280㎚ = 0.79 ㎎/㎖의 소광 계수를 사용하여 280 nM에서 UV 분광광도계에 의해 측정하였다. 상기 소광 계수를 상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체의 추론된 아미노산 서열을 근거로 계산하였다.
개별적으로 발현된 IL-15RαSu/Fc를, 이 콜라이에서 생산되고 리폴딩된(Zhu, 2009#3315) IL-15N72D 또는 IL-15wt와의 용액 중 복합체의 조립을 위해 상술한 바와 같이 r단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제시켰다. 이러한 시험관 내 조립된 복합체를 생물 활성 평가 및 동시 발현된 복합체 중의 IL-15 부위의 점유 정도의 추정을 위한 표준으로서 사용하였다.
젤 전기영동 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석
정제된 단백질을 상이한 유형의 젤 전기영동 방법들에 의해 분석하였으며, 이들 방법은 NuPAGE 12% 비스-트리스 젤(환원 및 비 환원 조건 하에서), 4-20% 트리스-글리신 젤(본래 조건), 및 IEF pH 3-10 젤(pI 측정용)을 포함하였다. 모든 공급은 인비트로젠(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로부터였다. 실험 방법을 제조사에 의해 개시된 바와 같이 수행하였다. 실행 완충제로서 PBS(Hyclone, Logan, UT)를 사용하는 수퍼덱스(Superdex) 200 HR 10/30(GE Healthcare Bio-Sciences) 크로마토그래피를 사용하여 순도를 조사하고 상기 단백질의 분자 질량을 추정하였다.
N-말단 아미노산 서열 및 글리코실화 분석
관심 단백질 밴드를 SDS-PAGE 젤 상에서 분리시키고, PVDF 멤브레인 상에 블럿팅하고 폰소 S 용액에 의해 염색하였다. N-말단 아미노산 서열화를 에드만 분해 방법(Molecular Structure Facility, UC Davis, Davis, CA)을 사용하여 수행하였다.
상기 융합 복합체가 글리코실화되었는지를 조사하기 위해서, 이온 교환 크로마토그래피 후 50 ㎍의 고도로 정제된 단백질을 실온에서 PBS 중의 50 ㎕의 총 부피로 2 ㎕의 N-글리코시다제 F(Calbiochem, La Jolla, CA)로 절단하고 이어서 환원 조건 하에서 NuPAGE 12% 비스-트리스 젤에서 전기영동을 수행하였다.
정제된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체의 IL-15N72D 점유의 측정
정제된 IL-15RαSu/Fc를 4 ℃에서 15 시간 동안 다양한 비로 IL-15wt(이 콜라이에서 생산되고 리폴딩됨, J. Yovandich, NCI, Fredrick, MD에 의해 제공됨)와 함께 로딩하였다. 배양 후에, 상기 IL-15wt:IL-15RαSu/Fc 복합체를 상술한 바와 같이 r단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제시켰다. 상기 정제된 복합체를 2 개의 ELISA 포맷, 즉 완전한 복합체를 검출하는 하나(항-인간 IgG Fc 포획 및 항-IL-15 검출) 및 오직 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질만을 검출하는 다른 하나(항-인간 IgG Fc 포획 및 항-인간 IgG Fc 검출)를 사용하여 평가하였다. 상기 완전한 IL-15wt:IL-15αSu/Fc 복합체와 IL-15RαSu/Fc 단백질 수준 간의 비는 상기 복합체의 IL-15 결합 부위의 점유율을 반영한다. [점유율(%) = 완전한 복합체(ng/㎖)/IL-15RαSu/Fc(ng/㎖) x 100%]. 이어서 완전히 점유된 복합체(1:3의 비로 IL-15RαSu/Fc 및 IL-15wt의 예비 결합된)를 표준으로서 사용하여 정제 후 상기 정제된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체의 점유율을 정량화하였다.
IL-15 생물 활성의 측정
상기 IL-15-의존된 32Dβ 세포 주를 사용하는 시험관 내 세포 증식 분석을 사용하여 앞서 개시된 바와 같이 상기 정제된 복합체 및 IL-15wt 단백질의 IL-15 생물활성을 평가하였다(문헌[X. Zhu et al., J Immunol 183 (2009) 3598-3607]).
약동학 평가
IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체 및 IL-15wt의 약동학 프로파일을 앞서 IL-2에 대해 개시된 바와 같이(문헌[H. J. Belmont et al., Clin Immunol 121 (2006) 29-39]) 암컷 CD-1 마우스(4 마우스/시점, Harlan, Indianapolis, IN)에서 평가하였다. IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체의 혈청 수준을 상술한 2 개의 ELISA 포맷으로 평가하였다. IL-15wt 수준을 항-IL-15 포획(MAB647; R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 항-IL-15 검출(BAM247; R&D Systems, Minneapolis, MN)을 사용하여 ELISA에 의해 평가하였다. 각각의 ELISA 포맷으로부터의 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 수준을 PK 솔루션 2.0(Summit Research Services, Montrose, CO)을 사용하여 1-구획 모델과 정합시켰다. IL-15wt로 처리된 마우스로부터의 데이터가 2-구획 모델로서 가장 잘 설계되었다.
림프구 자극
C57BL/6 마우스(수컷, 6 주령, Harlan, Indianapolis, IN)를 각각 1 ㎎/㎏의 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 복합체 또는 0.28 ㎎/㎏의 인간 IL-15wt(몰 당량 용량), 또는 음성 대조용으로서 PBS를 단일 용량으로 정맥 내 주사하였다. 처리 후 4일째에, 혈액을 모으고(그룹당 5 마리 마우스) 비장세포를 수거하였다. PBMC를 히스토파크(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 혈액으로부터 단리하였다. 이어서 상기 PBMC 및 비장세포를 PE-표지된 항-CD19, PE-표지된 항-CD335(NKp46), FITC-표지된 항-CD4 및 FITC-표지된 항-CD8 항체(BioLegend, San Diego, CA)로 염색하였다. 상기 염색된 세포를 FACScan 유식 세포측정계(BD Bioscience, San Jose, CA) 상에서 분석하였다. 모든 동물 연구를 알토(Altor)의 IACUC 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.
하기의 펩타이드들을 상기 실시예에 제공된 연구에서 사용하였다.
단백질 아미노산 서열 (SEQ ID NO)
p53 149-157 STPPPGTRV
p53 264-272 LLGRNSFEV
OVA 257-264 SIINFEKL
VSV 52-59 RGYVYQGL
실시예에 사용된 융합 단백질들의 단백질 도메인 링커 서열을 하기에 제공하였다.
링커 링커 서열 융합 단백질
단일-쇄 TCR 링커 TCR V - DTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSS - TCR V c264scTCR/hIL-15, c264scTCR/hIL-15R Su/birA
TCR V - TSGGGGSGGGGSPGGGGSGGGGSSS - TCR V c149scTCR/hIL15N72D
TCR V - DTSGGGGSGGGASGGGGSGGGGSSS - TCR V OT1scTCR/birA
TCR V - SGGGGSGGGASGGGGSGGGGS - TCR V OT1scTCR/hIL-15D8N, OT1scTCR/hIL-15R Su/birA
돌연변이된 인간 IgG1 힌지 TCR domain - VNEPKSSDKTHTSPPSPTR - hIL-15R Su c264scTCR/hIL-15R Su/birA, OT1scTCR/hIL-15R Su/birA, OT1TCR /hIL-15R Su/birA, 264TCR /hIL-15R Su/birA
TCR domain - VNEPKSSDKTHTSPPSPTR - hIL-15 264TCR /hIL-15D8N, OT1TCR /hIL-15, OT1scTCR/hIL-15D8N
BirA 링커 hIL-15R Su - SGGGSGGGGSID - birA tag c264scTCR/hIL-15R Su/birA, OT1TCR /hIL-15R Su/birA
단일-쇄 CD8 링커 CD8 - SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS - CD8 scCD8 /hIL-15R Su/birA
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Claims (110)

  1. 2 개 이상의 용해성 융합 단백질을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체로,
    제 1 융합 단백질이 (b) 인터류킨-15(IL-15) 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 (a) 제 1 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하고;
    제 2 융합 단백질이 (d) 용해성 인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편에 공유 결합된 (c) 제 2 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하며,
    상기 제 1 및 제 2 융합 단백질 중 어느 하나 또는 둘 다가 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 작용 단편을 또한 포함하고,
    상기 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인이 상기 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인에 결합하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성하는
    용해성 융합 단백질 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 생물 활성 폴리펩타이드들 중 하나가 제 1 용해성 T-세포 수용체(TCR) 또는 그의 작용 단편을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    생물 활성 폴리펩타이드들 중 다른 것이 제 2 항의 제 1 용해성 TCR 또는 그의 작용 단편을 포함하고, 이에 의해 증가된 결합 활성을 갖는 다가 TCR 융합 단백질 복합체를 생성시키는 용해성 융합 단백질 복합체.
  4. 제 2 항에 있어서,
    다른 생물 활성 폴리펩타이드가 제 1 용해성 TCR과 상이한 제 2 용해성 TCR 또는 그의 작용 단편을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCR이 특정 항원의 인식에 특이적인 용해성 융합 단백질 복합체.
  6. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCR이 α 및 β 쇄 TCR을 포함하는 이종이량체인 용해성 융합 단백질 복합체.
  7. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCR이 단일 쇄 TCR 폴리펩타이드를 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    단일 쇄 TCR이 펩타이드 링커 서열에 의해 TCR V-β 쇄에 공유 결합된 TCR V-α 쇄를 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    단일 쇄 TCR이 TCR V-β 쇄에 공유 결합된 용해성 TCR Cβ 쇄 단편을 또한 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    단일 쇄 TCR이 TCR V-α 쇄에 공유 결합된 용해성 TCR Cα 쇄 단편을 또한 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  11. 제 1 항에 있어서,
    제 1 생물 활성 폴리펩타이드가 TCRα 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함하고 제 2 생물 활성 폴리펩타이드가 TCRβ 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  12. 제 1 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 생물 활성 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두가 항체 또는 그의 작용 단편을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  13. 제 12 항에 있어서,
    항체가 특정 항원의 인식에 특이적인 용해성 융합 단백질 복합체.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    항체가 단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv인 용해성 융합 단백질 복합체.
  15. 제 14 항에 있어서,
    단일 쇄 항체가 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 면역글로불린 중쇄 가변 도메인에 공유 결합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  16. 제 1 항에 있어서,
    제 1 생물 활성 폴리펩타이드가 항체 중쇄 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함하고 제 2 생물 활성 폴리펩타이드는 항체 경쇄 폴리펩타이드 또는 그의 작용 단편을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  17. 제 1 항에 있어서,
    IL-15 폴리펩타이드가 고유 IL-15 폴리펩타이드와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 변체인 용해성 융합 단백질 복합체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    IL-15 변체가 IL-15 작용물질 또는 길항물질로서 작용하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  19. 제 17 항에 있어서,
    IL-15 변체가 고유 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15RβγC 수용체에 대해 증가되거나 감소된 결합 활성을 갖는 용해성 융합 단백질 복합체.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15 변체의 서열이 고유 IL-15 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 용해성 융합 단백질 복합체.
  21. 제 20 항에 있어서,
    아미노산 변화가 IL-15Rβ 및/또는 IL-15RγC와 상호작용하는 IL15의 도메인 중 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실인 용해성 융합 단백질 복합체.
  22. 제 20 항에 있어서,
    아미노산 변화가 성숙한 인간 IL-15 서열(서열번호 1)의 6, 8, 10, 61, 65, 72, 92, 101, 104, 105, 108, 109, 111 또는 112 번 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실인 용해성 융합 단백질 복합체.
  23. 제 22 항에 있어서,
    아미노산 변화가 성숙한 인간 IL-15 서열의 6 번 위치에서 I에서 S, 8 번 위치에서 D에서 N 또는 A, 61 번 위치에서 D에서 A, 65 번 위치에서 N에서 A, 72 번 위치에서 N에서 R, 104 번 위치에서 V에서 P, 또는 108 번 위치에서 Q에서 A로의 치환 또는 이들 치환의 임의의 조합인 용해성 융합 단백질 복합체.
  24. 제 23 항에 있어서,
    아미노산 변화가, IL-15 길항물질 활성 또는 고유 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15RβγC 수용체에 대해 감소된 결합 활성을 갖는 IL-15 변체를 생성시키는 용해성 융합 단백질 복합체.
  25. 제 20 항에 있어서,
    아미노산 변화가 성숙한 인간 IL-15 서열의 72 번 위치에서 N에서 D로의 치환인 용해성 융합 단백질 복합체.
  26. 제 25 항에 있어서,
    아미노산 변화가, IL-15 작용물질 활성 또는 고유 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15RβγC 수용체에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 IL-15 변체를 생성시키는 용해성 융합 단백질 복합체.
  27. 제 1 항에 있어서,
    Fc 도메인 또는 그의 작용 단편이 IgG Fc 도메인, 인간 IgG1 Fc 도메인, 인간 IgG2 Fc 도메인, 인간 IgG3 Fc 도메인, 인간 IgG4 Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgG Fc 도메인, IgE Fc 도메인 및 IgM Fc 도메인으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 Fc 도메인을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  28. 제 27 항에 있어서,
    Fc 도메인이 변경된 보체 또는 Fc 수용체 결합 성질을 갖는 Fc 도메인을 생성시키는 아미노산 변화를 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  29. 제 28 항에 있어서,
    아미노산 변화가 IgG1 CH2(항체 공통 서열에 근거한 넘버링)의 234 및 235 번 위치의 류신 잔기(즉 ...PE LL GG...)의 알라닌 잔기(즉 ...PE AA GG...)에 의한 치환, IgG1 CH2(항체 공통 서열에 근거한 넘버링)의 322 번 위치의 리신 잔기(즉 ...KC K SL...)의 알라닌 잔기(즉 ...KC A SL...)에 의한 치환; 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용해성 융합 단백질 복합체.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 생물 활성 폴리펩타이드가 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 IL-15 폴리펩타이드(또는 그의 작용 단편)에 공유 결합되는 용해성 융합 단백질 복합체.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 생물 활성 폴리펩타이드가 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 IL-15Rα 폴리펩타이드(또는 그의 작용 단편)에 공유 결합되는 용해성 융합 단백질 복합체.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15Rα 폴리펩타이드(또는 그의 작용 단편)가 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 Fc 도메인(또는 그의 작용 단편)에 공유 결합되는 용해성 융합 단백질 복합체.
  33. 제 5 항에 있어서,
    TCR 도메인에 대한 항원이 MHC 또는 HLA 분자 중에 존재하는 펩타이드 항원을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  34. 제 33 항에 있어서,
    펩타이드 항원이 종양 관련된 폴리펩타이드 또는 바이러스 암호화된 폴리펩타이드로부터 유래하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  35. 제 13 항에 있어서,
    항체 도메인에 대한 항원이 세포 표면 수용체 또는 리간드를 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15Rα 폴리펩타이드가 IL-15Rα 스시 도메인 또는 IL-15RαΔE3 도메인을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 제 2 용해성 융합 단백질 복합체에 공유 결합된 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 제 1 용해성 융합 단백질 복합체를 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  38. 제 37 항에 있어서,
    제 1 용해성 융합 단백질 복합체가 제 2 용해성 융합 단백질 복합체와 동일한 용해성 융합 단백질 복합체.
  39. 제 37 항에 있어서,
    제 1 용해성 융합 단백질 복합체가 제 2 용해성 융합 단백질 복합체와 상이한 용해성 융합 단백질 복합체.
  40. 제 37 항에 있어서,
    제 1 용해성 융합 단백질 복합체가 다이설파이드 결합에 의해 제 2 용해성 융합 단백질 복합체에 공유 결합되는 용해성 융합 단백질 복합체.
  41. 제 40 항에 있어서,
    다이설파이드 결합이 제 1 용해성 융합 단백질 복합체의 제 2 폴리펩타이드의 Fc 도메인을 제 2 용해성 융합 단백질 복합체의 제 2 폴리펩타이드의 Fc 도메인에 공유 결합시키는 용해성 융합 단백질 복합체.
  42. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 제 1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열.
  43. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 제 2 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열.
  44. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서,
    융합 단백질을 암호화하는 서열에 작동적으로 결합된 프로모터, 번역 개시 신호, 및 리더 서열을 또한 포함하는 핵산.
  45. 제 42 항의 핵산 서열을 포함하는 DNA 벡터.
  46. 제 43 항의 핵산 서열을 포함하는 DNA 벡터.
  47. 제 42 항 및 제 43 항의 핵산 서열을 포함하는 DNA 벡터.
  48. 제 42 항의 서열, 제 43 항의 서열, 및 제 42 항 및 제 43 항의 서열의 그룹 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 세포.
  49. 제 1 항의 용해성 융합 단백질 복합체의 제조 방법으로,
    a) 제 1 숙주 세포에 제 1 융합 단백질을 암호화하는 제 45 항의 DNA 벡터를 도입시키고;
    b) 상기 제 1 숙주 세포를 상기 세포 또는 배지에서 상기 제 1 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에 배양하고;
    c) 상기 제 1 융합 단백질을 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 정제하고,
    d) 제 2 숙주 세포에 제 2 융합 단백질을 암호화하는 제 46 항의 DNA 벡터를 도입시키고;
    e) 상기 제 2 숙주 세포를 상기 세포 또는 배지에서 상기 제 2 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에 배양하고;
    f) 상기 제 2 융합 단백질을 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 정제하고,
    g) 상기 제 1 및 제 2 융합 단백질을 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인과 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인 간의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 혼합하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성시킴
    을 포함하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 융합 단백질을 제 46 항의 핵산으로부터 발현된 폴리펩타이드들 간의 다이설파이드 결합의 형성을 허용하기에 충분한 조건 하에서 혼합함을 또한 포함하고, 제 37 항의 용해성 융합 단백질 복합체가 제조되는 방법.
  51. 제 1 항의 용해성 융합 단백질 복합체의 제조 방법으로,
    a) 숙주 세포에 제 1 융합 단백질을 암호화하는 제 45 항의 DNA 벡터 및 제 2 융합 단백질을 암호화하는 제 46 항의 DNA 벡터를 도입시키고;
    b) 상기 숙주 세포를 상기 세포 또는 배지에서 상기 융합 단백질을 발현하고 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인과 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인 간의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에 배지에서 배양하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성시키고;
    c) 상기 용해성 융합 단백질 복합체를 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 정제함
    을 포함하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 융합 단백질을 제 46 항의 핵산으로부터 발현된 폴리펩타이드들 간의 다이설파이드 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 혼합함을 또한 포함하고, 제 37 항의 용해성 융합 단백질이 제조되는 방법.
  53. 제 1 항의 용해성 융합 단백질 복합체의 제조 방법으로,
    a) 숙주 세포에 제 1 및 제 2 융합 단백질을 암호화하는 제 47 항의 DNA 벡터를 도입시키고;
    b) 상기 숙주 세포를 상기 세포 또는 배지에서 상기 융합 단백질을 발현하고 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인과 제 2 융합 단백질의 용해성 IL-15Rα 도메인 간의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에 배지에서 배양하여 용해성 융합 단백질 복합체를 형성시키고, 제 46 항의 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드들 간의 다이설파이드 결합의 형성을 허용하고;
    c) 상기 용해성 융합 단백질 복합체를 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 정제함
    을 포함하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 융합 단백질을, 제 46 항의 핵산으로부터 발현된 폴리펩타이드들 간의 다이설파이드 결합의 형성을 허용하기에 충분한 조건 하에서 혼합함을 또한 포함하고, 제 37 항의 용해성 융합 단백질 복합체가 제조되는 방법.
  55. 표적 세포의 살해 방법으로,
    a) 다수의 세포를 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항의 용해성 융합 단백질 복합체와 접촉시키고, 여기에서 상기 다수의 세포가 제 1 항의 IL-15 도메인에 의해 인식되는 IL-15R 쇄를 갖는 면역 세포, 또는 제 1 항의 Fc 도메인에 의해 인식되는 Fc 수용체 쇄를 갖는 면역 세포, 및 제 1 항의 생물 활성 폴리펩타이드들 중 하나 이상에 의해 인식되는 항원을 갖는 표적 세포를 또한 포함하고,
    b) 상기 면역 세포와 결합하여 이를 활성화하기에 충분한, 상기 표적 세포 상의 항원과 상기 면역 세포 상의 IL-15R 또는 Fc 수용체 쇄간의 특이적인 결합 복합체(가교)를 형성시키고;
    c) 상기 표적 세포를 상기 결합된 활성화된 면역 세포에 의해 살해함
    을 포함하는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서,
    표적 세포가 종양 세포 또는 바이러스 감염된 세포인 방법.
  57. 제 55 항 또는 제 56 항에 있어서,
    생물 활성 폴리펩타이드가 TCR을 포함하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    표적 세포 상의 항원이, MHC 또는 HLA 분자 중에 존재하고 TCR에 의해 인식되는 종양 또는 바이러스 암호화된 펩타이드 항원을 포함하는 방법.
  59. 제 55 항에 있어서,
    면역 세포가 T-세포, LAK 세포, NK 세포, 대식세포, 단핵구 또는 과립구인 방법.
  60. 병든 세포가 질병 관련된 항원을 발현하는 환자에게서 질병을 예방 또는 치료하는 방법으로,
    a) 상기 환자에게 질병-관련된 항원을 인식하는 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하는 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항의 용해성 융합 단백질 복합체를 투여하고;
    b) 면역 세포를 국소화하기에 충분한, 항원-발현 병든 세포와 IL-15R 또는 Fc 수용체 발현 면역 세포 간의 특이적인 결합 복합체(가교)를 형성시키고;
    c) 상기 환자에게서 상기 질병을 예방하거나 치료하기에 충분히 상기 병든 세포를 손상시키거나 살해함
    을 포함하는 방법.
  61. 병든 세포가 질병 관련된 항원을 발현하는 환자에게서 질병을 예방 또는 치료하는 방법으로,
    a) IL-15R 쇄 또는 Fc 수용체 쇄를 갖는 면역 세포를 질병-관련된 항원을 인식하는 생물 활성 폴리펩타이드를 포함하는 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항의 용해성 융합 단백질 복합체와 혼합하고;
    b) 상기 환자에게 상기 면역 세포-융합 단백질 복합체 혼합물을 투여하고;
    c) 면역 세포를 국소화하기에 충분한, 항원-발현 병든 세포와 IL-15R 또는 Fc 수용체 발현 면역 세포 간의 특이적인 결합 복합체(가교)를 형성시키고;
    d) 상기 환자에게서 상기 질병을 예방하거나 치료하기에 충분히 상기 병든 세포를 손상시키거나 살해함
    을 포함하는 방법.
  62. 제 60 항 또는 제 61 항에 있어서,
    질병이 암 또는 바이러스 감염인 방법.
  63. 제 60 항 또는 제 61 항에 있어서,
    질병 관련된 항원이 펩타이드/MHC 복합체인 방법.
  64. 포유동물에게 유효량의 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항의 용해성 융합 단백질 복합체를 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에게서 면역 반응을 자극하는 방법.
  65. 포유동물에게 유효량의 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항의 용해성 융합 단백질 복합체를 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에게서 면역 반응을 억제하는 방법.
  66. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용해성 융합 단백질 중 하나 이상이 검출 가능한 표지를 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  67. 제 66 항에 있어서,
    검출 가능한 표지가 비오틴, 스트렙트아비딘, 그의 효소 또는 촉매 활성 단편, 방사성핵종, 나노입자, 상자성 금속 이온, 또는 형광, 인광, 또는 화학발광 분자인 용해성 융합 단백질 복합체.
  68. 세포 또는 조직상에 존재하는 항원을 포함하는 상기 세포 또는 조직의 검출 방법으로,
    a) 상기 세포 또는 조직을, 상기 항원과 제 66 항의 하나 이상의 용해성 융합 단백질 복합체의 생물 활성 폴리펩타이드 간의 특이적인 결합 복합체를 형성하는 조건 하에서 상기 용해성 융합 단백질 복합체와 접촉시키고,
    b) 상기 세포 또는 조직을 상기 항원에 결합하지 않은 임의의 용해성 융합 단백질 복합체를 제거하기에 적합한 조건 하에서 세척하고;
    c) 상기 특이적인 결합 복합체를 상기 항원을 포함하는 세포 또는 조직을 가리키는 것으로서 검출함
    을 포함하는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서,
    생물 활성 폴리펩타이드가 TCR을 포함하고 항원이 상기 TCR에 의해 인식되는 MHC 또는 HLA 분자 중에 존재하는 펩타이드 항원을 포함하는 방법.
  70. 제 68 항 또는 제 69 항에 있어서,
    존재하는 항원의 사본수가 세포당 1000 개 이하의 사본수인 방법.
  71. 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 실행하는 방법.
  72. 제 1 용해성 융합 단백질 복합체 및 제 2 용해성 융합 단백질 복합체의 이량체를 형성시킴을 포함하는 제 2 항 또는 제 12 항의 용해성 융합 단백질 복합체의 분자당 결합 활성을 증가시키는 방법으로, 상기 각각의 융합 단백질 복합체의 제 1 생물 활성 폴리펩타이드와 제 2 생물 활성 펩타이드의 결합 부위가 동일하거나 상이한 방법.
  73. 제 72 항에 있어서,
    분자당 결합 활성을 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 또는 70% 이상까지 증가시키는 방법.
  74. 제 1 용해성 융합 단백질 복합체와 제 2 용해성 융합 단백질 복합체의 이량체를 형성시킴을 포함하는 제 2 항 또는 제 12 항의 용해성 융합 단백질 복합체의 분자당 IL-15 활성을 증가시키는 방법.
  75. 인터류킨-15(IL-15):인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Rα) 융합 단백질 복합체의 제조 방법으로,
    a) 숙주 세포에 IL-15를 암호화하는 제 1 DNA 벡터 및 IL-15Rα 융합 단백질을 암호화하는 제 2 DNA 벡터를 도입시키고;
    b) 상기 숙주 세포를 상기 IL-15 및 IL-15Rα 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에서 배지에서 배양하고;
    c) 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15:IL-15Rα 융합 단백질 복합체를 정제함
    을 포함하는 방법.
  76. 제 75 항에 있어서,
    IL-15Rα 융합 단백질이 생물 활성 폴리펩타이드에 공유 결합된 용해성 IL-15Rα를 포함하는 방법.
  77. 제 76 항에 있어서,
    생물 활성 폴리펩타이드가 IgG의 중쇄 불변 도메인인 방법.
  78. 제 76 항에 있어서,
    생물 활성 폴리펩타이드가 IgG의 중쇄 불변 도메인의 Fc 도메인인 방법.
  79. 제 75 항에 있어서,
    IL-15가 제 2 생물 활성 폴리펩타이드에 공유 결합된 IL-15를 포함하는 방법.
  80. IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 포함하는 IL-15:IL-15Rα 복합체의 제조 방법으로,
    a) 숙주 세포에 IL-15를 암호화하는 제 1 DNA 및 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 암호화하는 제 2 DNA를 도입시키고;
    b) 상기 숙주 세포를 상기 IL-15 및 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에서 배지에서 배양하고;
    c) 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15:IL-15Rα/Fc 복합체를 정제함
    을 포함하는 방법.
  81. IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 포함하는 IL-15:IL-15Rα 융합 단백질 복합체의 제조 방법으로,
    a) 숙주 세포에서 IL-15 및 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 동시-발현시키고;
    b) 상기 숙주 세포를 상기 IL-15 및 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에서 배지에서 배양하고;
    c) 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15:IL-15Rα/Fc 융합 단백질 복합체를 정제함
    을 포함하는 방법.
  82. 제 75 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포 또는 배지로부터 IL-15:IL-15Rα 복합체를 정제함이, 상기 IL-15:IL-15Rα 융합 단백질 복합체에 특이적으로 결합하는 친화성 시약 상에서 상기 IL-15:IL-15Rα 복합체를 포획함을 포함하는 방법.
  83. 제 82 항에 있어서,
    IL-15Rα 융합 단백질이 IL-15Rα/Fc 융합 단백질을 포함하고, 친화성 시약이 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 방법.
  84. 제 83 항에 있어서,
    친화성 시약이 단백질 A 또는 단백질 G인 방법.
  85. 제 82 항 또는 제 83 항에 있어서,
    친화성 시약이 항체인 방법.
  86. 제 75 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포 또는 배지로부터 IL-15:IL-15Rα 복합체를 정제함이 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 방법.
  87. 제 75 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포 또는 배지로부터 IL-15:IL-15Rα 복합체를 정제함이 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 방법.
  88. 제 75 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15Rα가 IL-15Rα스시(IL-15RαSu)를 포함하는 방법.
  89. 제 75 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15가 변형 IL-15인 방법.
  90. 제 89 항에 있어서,
    변형 IL-15가 IL-15N72D를 포함하는 방법.
  91. 제 75 항 내지 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
  92. 제 75 항 내지 제 91 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15:IL-15Rα 복합체의 IL-15 결합 부위가 완전히 점유된 방법.
  93. 제 88 항에 있어서,
    IL-15:IL-15RαSu/Fc 복합체의 IL-15 결합 부위가 모두 완전히 점유된 방법.
  94. 제 75 항 내지 제 93 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15:IL-15Rα 복합체를 상기 복합체 전하 또는 크기 성질을 근거로 정제하는 방법.
  95. IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체의 제조 방법으로,
    a) 숙주 세포에서 IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질을 동시-발현시키고;
    b) 상기 숙주 세포를 상기 IL-15N72D 및 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에서 배지에서 배양하고;
    c) 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 상기 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체를 정제함
    을 포함하며, 여기에서 IL-15N72D:IL15RαSu/Fc 복합체의 IL-15 결합 부위가 모두 완전히 점유되는 방법.
  96. 제 95 항에 있어서,
    완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체를 상기 복합체 전하 성질을 근거로 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하는 방법.
  97. 제 95 항에 있어서,
    완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체를 저 이온 강도 중성 pH 완충제를 사용하는 결합 조건 및 증가하는 이온 강도의 완충제를 사용하는 용출 조건과 함께 4급 아민 기재 수지를 사용하여 정제하는 방법.
  98. IL-15 또는 IL-15 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오타이드 및 IL-15 수용체 융합 단백질을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
  99. 제 98 항에 있어서,
    IL-15N72D를 암호화하는 제 1 발현 벡터 및 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질을 암호화하는 제 2 발현 벡터를 포함하는 세포.
  100. 이량체성 IL-15RαSu/Fc 및 2 개의 IL-15N72D 분자를 포함하는 단리된 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체.
  101. 제 100 항에 있어서,
    90 내지 95% 이상의 정제된 완전히 점유된 복합체인 복합체.
  102. 제 100 항에 있어서,
    5.6 내지 6.5의 등전점을 갖는 복합체.
  103. 제 100 항에 있어서,
    약 114 kDa의 분자량을 갖는 복합체.
  104. 제 100 항에 있어서,
    IL-15N72D 및/또는 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질이 글리코실화된 복합체.
  105. 제 75 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 단리된 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체.
  106. 제 100 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항의 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체를 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 면역 반응을 조절하는 방법.
  107. 제 106 항에 있어서,
    면역 반응을 증가시키거나 감소시키는 방법.
  108. 제 100 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항의 완전히 점유된 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체를 종양이 있는 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 면역 반응을 증대시키는 방법.
  109. 제 13 항 또는 제 35 항에 있어서,
    항체 도메인에 대한 항원이 CD 항원, 사이토킨 또는 케모킨 수용체 또는 리간드, 성장 인자 수용체 또는 리간드, 세포 부착 분자, MHC/MHC-유사 분자, Fc 수용체, 톨형 수용체, NK 수용체, TCR, BCR, 양성/음성 동시-자극 수용체 또는 리간드, 치사 수용체 또는 리간드, 종양 관련된 항원 또는 바이러스 암호화된 항원을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
  110. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-15Rα 폴리펩타이드가 IL-15 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 IL-15 수용체 알파의 세포 외 도메인을 포함하는 용해성 융합 단백질 복합체.
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