CN111867612A - 抗PDL1、IL-15和TGF-β受体组合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明特征在于多特异性蛋白复合物，其具有包含IL‑15或功能变体的一个结构域、细胞因子受体或细胞因子配体，和特异性针对疾病抗原、免疫检查点或信号传导分子的结合结构域。

Description

抗PDL1、IL-15和TGF-β受体组合分子
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年3月26日提交的美国临时申请号62/648,373和于2018年9月21日提交的美国临时申请号62/734,994的优先权权益。这些申请的全部内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及多聚体融合分子的领域。
背景技术
现在已经证明，癌症免疫疗法研究在患有黑色素瘤的患者中和患有其他实体瘤的患者的子集中的临床反应率是有前景的。那些研究已经涉及单克隆抗体(MAb)检查点抑制剂(例如抗CTLA4)、抗程序性细胞死亡-1(PD-1)，和抗程序性细胞死亡蛋白-1配体(PD-L1)、以及细胞因子(例如IL-2和IL-15)。1-5
大多数针对PD-1/PD-L1的抗体是IgG4同种型，或被工程化而具有Fc结构域突变从而损害抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性的IgG1同种型。多种抗癌MAb，例如抗CTLA4(伊匹单抗)，抗CD20(利妥昔单抗)，抗HER2(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)，和抗EGFR(西妥昔单抗)，然而，它们都是IgG1同种型，并且因此具有介导ADCC的潜力。ADCC机制已经牵涉到有助于临床功效，9-11尽管其他研究并不支持这种发现。阿特珠单抗(
Figure BDA0002655406700000012
基因泰克公司(Genentech))和阿维鲁单抗(
Figure BDA0002655406700000011
EMD Serono公司)是IgG1同种型的完整的人类抗PD-L1疗法，FDA已经批准这些疗法用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌、尿路上皮癌，和转移性梅克尔细胞癌。12-15
因为PD-L1在一些免疫细胞上表达，所以使用全外周血单核细胞(PBMC)作为靶标，进行研究来评估阿维鲁单抗介导的ADCC。使用来自健康供体和癌症患者的天然杀伤(NK)细胞，观察到一系列人类肿瘤细胞类型的实质性裂解，其中当将人类PBMC子集用作靶标时，很少发生裂解或没有裂解。在来自用九个剂量的阿维鲁单抗治疗的患者的PBMC的123个免疫细胞子集的分析中，也见到类似结果。13,16此外，尽管在一系列人类肿瘤中已经观察到使用阿维鲁单抗的临床益处，但是并未观察到超过使用其他抗PD1/PD-L1 MAb看到的不良事件的不良事件。3,14,17,18
尽管存在上述有前景的结果，但是当用抗PD-1/PD-L1单一疗法治疗时，甚至在仅招募预处理肿瘤样品表达PD-L1的那些患者的试验中，仅10％-30％的患有大多数恶性肿瘤的患者实现了客观应答。19
在本文描述的发明之前，对于开发用来将不同效应分子靶向到疾病部位从而提供治疗益处而没有与非特异性免疫活性相关的副作用的新策略存在迫切需要。
发明内容
本发明至少部分基于令人惊讶的发现，即基于IL-15的多特异性蛋白复合物增强免疫细胞的刺激并促进其针对疾病细胞的活性，从而导致减少或预防疾病。这些基于IL-15的蛋白复合物还显示对疾病和靶抗原的增加的结合。本文提供了多特异性蛋白复合物，其具有包含IL-15或功能变体的至少一个结构域，转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域，和特异性针对疾病抗原、免疫检查点或信号传导分子的结合结构域。特别地，这些复合物包含融合至抗体或抗体结合片段的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc支架，和结合转化生长因子-β(TGFβ)的TGFβRII结构域。具体地，本文描述了蛋白复合物，这些蛋白复合物包含：特异性结合程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、分化簇47(CD47)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(TIM-3、TIM3)或糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族相关基因(GITR)的结合结构域。通过提供免疫刺激细胞因子至免疫细胞，这些复合物增强免疫活性。此类细胞因子是本领域已知的，并且可以单独使用或与其他细胞因子或药剂组合使用。通过经由抗PD-L1、PD-1、CTLA-4、CD47、TIM3或GITR结合结构域的免疫检查点阻断，这些复合物进一步增强了免疫应答。最后，这些复合物可以结合TGFβ，并且阻断其进而促进肿瘤生长和转移以及其他疾病的免疫抑制活性。
在一些情况下，这些复合物还识别在疾病细胞上表达的抗原，例如PD-L1、单链脱氧核糖核酸(ssDNA)、CD20、人表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD19、CD38、CD52、双唾液神经节苷脂(GD2)、CD33、Notch1、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、组织因子或HIV包膜，并且经由Fc结合结构域刺激针对疾病细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
提供了分离的可溶性融合蛋白复合物，所述复合物包含至少两种可溶性蛋白。例如，第一蛋白包含白介素-15(IL-15)多肽，例如，包含N72D突变的变体IL-15多肽(IL-15N72D)。第二蛋白包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)(IL-15RαSu/Fc)。分离的可溶性融合蛋白复合物的第三组分包含识别疾病抗原、免疫检查点分子或信号传导分子(例如PD-L1、PD-1、CTLA-4、CD47、TIM3或GITR)的结合结构域，其中所述结合结构域融合至IL-15N72D或IL-15RαSu/Fc蛋白。可溶性融合免疫复合物的第四组分包含细胞因子受体，例如TGFβRII或细胞因子。在一些方面，结合结构域融合至IL-15N72D和IL-15RαSu/Fc蛋白二者。在其他方面，这些结构域之一融合至IL-15N72D或IL-15RαSu/Fc蛋白，并且第二结合结构域(即特异性针对免疫检查点或信号传导分子或疾病抗原)融合至相同的或其他的蛋白。在一些方面，细胞因子受体(例如TGFβRII)融合至IL-15N72D和/或IL-15RαSu/Fc蛋白。在一些方面，细胞因子受体(例如TGFβRII)经由接头分子，融合至或连接至IgG1 Fc。在另一方面，细胞因子受体(例如TGFβRII)是融合至IL-15N72D和IL-15RαSu/Fc蛋白的二聚体。在一个方面，疾病抗原与瘤形成、传染性疾病、或自身免疫病相关。在一些情况下，第一和/或第二可溶性蛋白进一步包含识别在疾病细胞上表达的疾病抗原(例如PD-L1、ssDNA、CD20、HER2、EGFR、CD19、CD38、CD52、GD2、CD33、Notch1、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、组织因子或HIV包膜)的结合结构域。可替代地，IL-15N72D或IL-15RαSu/Fc蛋白包含特异性针对疾病抗原、免疫检查点或信号传导分子的结合结构域，并且其他蛋白(分别是IL-15RαSu/Fc或IL-15N72D蛋白)并不包含另外的融合结合结构域。第一蛋白的IL-15N72D结构域结合第二蛋白的可溶性IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。示例性融合蛋白复合物包含共价连接至IL-15N72D和/或IL-15RαSu/Fc融合蛋白的抗PD-L1抗体。在其他方面，细胞因子受体(例如TGFβRII)和/或结合结构域共价连接至可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)，所述结合结构域融合至免疫球蛋白Fc结构域；而第二蛋白包含结合结构域，所述结合结构域识别共价连接的疾病抗原和包含N72D突变的变体白介素-15(IL-15)多肽(IL-15N72D)。在另一方面，所述第二蛋白包含细胞因子受体，例如TGFβRII。
在某些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含至少两种可溶性蛋白，其中第一可溶性蛋白包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，并且第二可溶性蛋白包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)，其中免疫球蛋白Fc(IgG Fc)结构域融合至或连接至糖基化的或未糖基化的转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域；第一和/或第二可溶性蛋白进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子的结合结构域，并且第一可溶性蛋白的IL-15结构域结合第二可溶性蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。未糖基化的TGFβRII氨基酸序列的实例如下：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMQNCPITSICEKPQEVCVAVWRKQDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYQTSNPD(SEQ IDNO:35)。
在这个和其他实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域经由接头分子，连接至转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域。在这些和其他实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是包含绞链区的IgG Fc变体，所述铰链区缺乏在残基位置70处的游离半胱氨酸。在某些实施方案中，在残基位置70处，半胱氨酸被丝氨酸取代(IgGFcC70S)。Δ游离半胱氨酸IL15RαSuFc氨基酸序列的实例如下：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:36)。
在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是缺乏铰链区的IgG-Fc变体。例如，IL15RαSuFc缺乏在位置66至70处的氨基酸残基EPKSC。Δ铰链IL15RαSuFc氨基酸序列的实例如下：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
Figure BDA0002655406700000041
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:37)
在这些和其他实施方案中，第一和第二可溶性蛋白之一进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子、或免疫信号传导分子的第二结合结构域。在这些和其他实施方案中，IL-15多肽是包含以下的IL-15变体：N72D突变(IL-15N72D)、IL-15K41Q突变、IL-15L45S突变、IL-15I67T突变、IL-15N79Y突变、IL-15E93A突变、或其组合。IL-15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A氨基酸序列的实例如下：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMQCFLSELQVISLESGDASIHDTVENLTILANDSLSSNGYVTESGCKECEELEAKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:38)。
在某些实施方案中，IL-15多肽是包含L45S突变的IL-15变体。IL15-L45S氨基酸序列的实例如下：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLSELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:39)。
在某些实施方案中，结合结构域包含通过多肽接头序列，共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。在这些和其他实施方案中，结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族相关基因(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、组织因子(TF)、δ样蛋白4(DLL4)、单链DNA或T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(Tim-3)。在某些实施方案中，结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)。在这些和其他实施方案中，TGFβRII结构域结合转化因子β(TGFβ)。在这些和其他实施方案中，第一融合蛋白复合物通过二硫键共价连接至第二融合蛋白复合物，所述二硫键将第一可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域连接至第二可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域。
在某些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含至少两种可溶性蛋白，其中第一可溶性蛋白包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，并且第二可溶性蛋白包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)，第一和/或第二可溶性蛋白进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子的结合结构域，并且第一可溶性蛋白的IL-15结构域结合第二可溶性蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性蛋白复合物。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc(IgG Fc)结构域进一步包含经由接头分子融合至或连接至IgG Fc结构域的糖基化的或未糖基化的转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc(IgG Fc)结构域缺乏TGFβRII结构域。在这些和其他实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是包含绞链区的IgG Fc变体，所述铰链区缺乏在残基位置70处的游离半胱氨酸。在这些和其他实施方案中，在残基位置70处，半胱氨酸被丝氨酸取代(IgG-FcC70S)。在这些和其他实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是缺乏铰链区的IgG-Fc变体。在这些和其他实施方案中，第一和第二可溶性蛋白之一进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子、或免疫信号传导分子的第二结合结构域。在这些和其他实施方案中，IL-15多肽是包含以下的IL-15变体：N72D突变(IL-15N72D)、IL-15K41Q突变、IL-15L45S突变、IL-15I67T突变、IL-15N79Y突变、IL-15E93A突变、或其组合。在这些和其他实施方案中，结合结构域包含通过多肽接头序列，共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。在这些和其他实施方案中，结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族相关基因(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、组织因子(TF)、δ样蛋白4(DLL4)、单链DNA或T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(Tim-3)。在某些实施方案中，结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)。在某些实施方案中，第一融合蛋白复合物通过二硫键共价连接至第二融合蛋白复合物，所述二硫键将第一可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域连接至第二可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域。
在某些实施方案中，结合结构域包含单链抗体(scAb或scFv)，其中通过多肽接头序列，免疫球蛋白轻链可变结构域共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域。可替代地，结合结构域包含能够充当免疫检查点抑制剂或免疫激动剂的可溶性的或细胞外的配体或受体结构域。
示例性多核苷酸分子包含：包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、16、17、18、19或其组合的核酸序列。在一方面，一个或多个核酸序列进一步包含启动子、翻译起始信号，和与编码融合蛋白的序列可操作地连接的前导序列。在某些实施方案中，表达载体包含：包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、16、17、18、19或其组合的核酸序列。
示例性多肽分子包含：包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或其组合的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:7具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:9具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:11具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:13具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:15具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:16具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:17具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:18具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物由与SEQ ID NO:19具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％序列同一性的核酸序列编码。
还提供了包含本文描述的核酸序列的一种或多种表达载体。例如，核酸序列在载体中用于复制、表达或二者。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:2具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:4具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:6具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:8具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:10具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:12具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:14具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:20具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:21具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:22具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:23具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:24具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:25具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:26具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:27具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:28具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:29具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:30具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:31具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:32具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:33具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含与SEQ ID NO:34具有至少约70％(例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更大)序列同一性的氨基酸序列。
还提供了可溶性融合蛋白复合物，所述复合物包含共价连接至第二可溶性融合蛋白复合物的第一可溶性融合蛋白复合物。例如，本发明的可溶性融合蛋白复合物是多聚化的，例如，二聚化的、三聚化的，或其他多聚化的(例如，4个的复合物、5个的复合物等)。例如，多聚体是同源多聚体或异源多聚体。可溶性融合蛋白复合物通过共价键(例如，二硫键、化学交联剂)连接。在一些情况下，将一个可溶性融合蛋白通过二硫键共价连接至另一个可溶性融合蛋白，所述二硫键连接第一可溶性蛋白的Fc结构域与第二可溶性蛋白的Fc结构域。
Fc结构域或其功能片段包含选自下组的Fc结构域，所述组由以下组成：IgG Fc结构域、人IgG1 Fc结构域、人IgG2 Fc结构域、人IgG3 Fc结构域、人IgG4 Fc结构域、IgA Fc结构域、IgD Fc结构域、IgE Fc结构域，和IgM Fc结构域；小鼠IgG2A结构域，或其任何组合。任选地，Fc结构域包括氨基酸改变，这些氨基酸改变形成具有改变的补体或Fc受体结合特性或者改变的二聚化或糖基化特征的Fc结构域。产生具有改变的补体或Fc受体结合特性或者改变的二聚化或糖基化特征的Fc结构域的氨基酸改变是本领域已知的。例如，IgG1 CH2位置234和235处(基于抗体共有序列编号)的亮氨酸残基(即，……P E L L G G……)被丙氨酸残基(即，……P E A A G G……)取代导致Fcγ受体结合丧失，而IgG1 CH2位置322(基于抗体共有序列编号)处的赖氨酸残基(即，……K C K S L……)被丙氨酸残基(即，……K CA S L……)取代导致补体活化的丧失。在一些实例中，将此类突变组合。
在一些方面，通过多肽接头序列，将结合结构域和/或细胞因子受体结构域共价连接至IL-15多肽(或其功能片段)。类似地，通过多肽接头序列，将结合结构域和/或细胞因子受体结构域共价连接至IL-15Rα多肽(或其功能片段)。任选地，通过多肽接头序列，将IL-15Rα多肽(或其功能片段)共价连接至Fc结构域(或其功能片段)。可以独立地选择每个多肽接头序列。任选地，这些多肽接头序列是相同的。可替代地，它们是不同的。
任选地，提供了本发明的可溶性融合蛋白复合物，其中这些可溶性融合蛋白中的至少一个包含可检测标记。可检测标记包括但不限于生物素，链霉亲和素，酶或其催化活性片段，放射性核素，纳米颗粒，顺磁性金属离子，或荧光、磷光，或化学发光分子，或其任何组合。
本发明提供了用于制备本发明的可溶性融合蛋白复合物的方法。所述方法包括以下步骤：a)向第一宿主细胞中引入编码第一蛋白的具有适合的控制序列的DNA载体；b)在足以在细胞或培养基中表达第一蛋白的条件下，在培养基中培养所述第一宿主细胞；c)从这些宿主细胞或培养基纯化第一蛋白；d)向第二宿主细胞中引入编码第二蛋白的具有适合的控制序列的DNA载体；e)在足以在细胞或培养基中表达第二蛋白的条件下，在培养基中培养所述第二宿主细胞；和f)从这些宿主细胞或培养基纯化第二蛋白；和g)在足以允许第一蛋白的IL-15结构域和第二蛋白的可溶性IL-15Rα结构域之间的结合以形成可溶性融合蛋白复合物的条件下，将第一和第二蛋白混合。
在一些情况下，所述方法进一步包括在足以允许由表达载体表达的多肽之间形成二硫键的条件下，将第一和第二蛋白混合。
可替代地，通过以下进行用于制备本发明的可溶性融合蛋白复合物的方法：a)向宿主细胞中引入编码第一蛋白的具有适合控制序列的DNA载体和编码第二蛋白的具有适合控制序列的DNA载体；b)在足以在细胞或培养基中表达这些蛋白并且允许第一蛋白的IL-15结构域和第二蛋白的可溶性IL-15Rα结构域之间缔合以形成可溶性融合蛋白复合物的条件下，在培养基中培养所述宿主细胞；和c)从这些宿主细胞或培养基纯化可溶性融合蛋白复合物。
在一方面，所述方法进一步包括在足以允许由表达载体表达的多肽之间形成二硫键的条件下，将第一和第二蛋白混合。
还提供了用于制备可溶性融合蛋白复合物的方法，这些方法包括：a)向宿主细胞中引入编码第一和第二蛋白的具有适合的控制序列的DNA载体；b)在足以在细胞或培养基中表达这些蛋白并且允许第一蛋白的IL-15结构域和第二蛋白的可溶性IL-15Rα结构域之间缔合以形成可溶性融合蛋白复合物，并且以允许这些多肽之间形成二硫键的条件下，在培养基中培养所述宿主细胞；和c)从这些宿主细胞或培养基纯化可溶性融合蛋白复合物。
任选地，所述方法进一步包括在足以允许由表达载体表达的多肽之间形成二硫键的条件下，将第一和第二蛋白混合。
通过向受试者施用有效量的包含本文描述的可溶性融合蛋白复合物(例如可溶性抗PD-L1 scAb/IL-15N72D:TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合物)的药物组合物，进行用于在有需要的受试者中治疗瘤形成、传染性疾病，或自身免疫病的方法，由此治疗瘤形成、传染性疾病，或自身免疫病。例如，通过向受试者施用有效量的包含可溶性TGFβRII二聚体/huIL-15N72D:抗人PD-L1 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc融合蛋白复合物的药物组合物，进行用于在有需要的受试者中治疗实体恶性肿瘤或血液恶性肿瘤的方法，由此治疗恶性肿瘤。
用本文描述的方法治疗的适合的瘤形成包括胶质母细胞瘤、前列腺癌、急性髓性白血病、B细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、实体瘤、尿路上皮/膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、胃癌和食道癌、头颈癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌，和鳞状细胞头颈癌。
按有效量施用包含融合蛋白复合物的药物组合物。例如，药物组合物的有效量在约1μg/kg和100μg/kg之间，例如，1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg，或100μg/kg。可替代地，TxM复合物以固定剂量或基于体表面积(即，每m2)的剂量施用。
将包含融合蛋白复合物的药物组合物每月施用至少一次，例如，每月两次、每周一次、每周两次、每天一次、每天两次、每8小时一次、每4小时一次、每2小时一次或每小时一次。针对药物组合物的适合的施用模式包括全身施用、静脉内施用、局部施用、皮下施用、肌内施用、瘤内施用、吸入，和腹膜内施用。
优选地，融合蛋白复合物增加干扰素γ(IFN-γ)的血清水平，和/或刺激CD4+和CD8+T细胞和NK细胞杀伤受试者中的疾病细胞或肿瘤细胞。
在某些实施方案中，提供了在有需要的受试者中诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文体现的可溶性融合蛋白复合物。
在某些实施方案中，在体外或体内抑制转化生长因子β(TGFβ)活性的方法，所述方法包括在体外使TGFβ应答细胞接触以下项，或向有需要的受试者施用以下项：有效量的本文体现的可溶性融合蛋白复合物。
在某些实施方案中，在体内减少转化生长因子β(TGFβ)的量的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文体现的可溶性融合蛋白复合物。
在某些实施方案中，在体内抑制转化生长因子β(TGFβ)介导的SMAD多肽的磷酸化和活化的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文体现的可溶性融合蛋白复合物。
在本发明的可溶性融合蛋白复合物的某些方面，IL-15多肽是具有与天然IL-15多肽不同的氨基酸序列的IL-15变体。人IL-15多肽在本文中被称为huIL-15、hIL-15、huIL15、hIL15、IL-15野生型(wt)，并且其变体是指使用天然氨基酸、其在成熟序列中的位置和变体氨基酸。例如，huIL15N72D是指包含在位置72处N至D的取代的人IL-15。在一个方面，IL-15变体起IL-15激动剂的作用，例如通过与天然IL-15多肽相比增加的IL-15/IL-2βγC受体(IL-15R)结合活性来证明。可替代地，例如，通过与天然IL-15多肽相比，IL-15R的降低的结合活性证明了作为IL-15拮抗剂的IL-15变体功能。
用于通过以下进行的杀伤靶细胞的方法：a)使多个细胞与本发明的可溶性融合蛋白复合物接触，其中所述多个细胞进一步包括带有由IL-15结构域识别的IL-15R链的免疫细胞，或带有由检查点抑制剂、TGFβ分子或免疫激动剂结合结构域调节的检查点和/或细胞因子受体或信号传导分子的免疫细胞，以及靶疾病细胞；b)经由IL-15R或信号传导分子、经由抑制TGFβ免疫抑制或经由检查点分子的阻断活化免疫细胞；和c)通过经活化的免疫细胞杀伤所述靶疾病细胞。例如，靶疾病细胞是肿瘤细胞、自身免疫细胞，或病毒感染的细胞。在一些情况下，结合结构域包含抗PD-L1抗体。
用于杀伤靶细胞的方法进一步包括：a)使多个细胞与本发明的可溶性融合蛋白复合物接触，其中所述多个细胞进一步包括带有由Fc结构域识别的Fc受体链的免疫细胞，和带有由结合结构域(例如抗原特异性scAb)和/或免疫刺激细胞因子或其受体识别的抗原的靶疾病细胞；b)在靶疾病细胞上的抗原和免疫细胞上的Fc受体链以及足以结合并且活化所述免疫细胞的免疫刺激细胞因子或其受体之间形成特异性结合复合物(桥)；和c)通过结合的经活化的免疫细胞杀伤所述靶疾病细胞。例如，靶疾病细胞是肿瘤细胞、自身免疫细胞，或病毒感染的细胞。在一些情况下，结合结构域包含抗PD-L1抗体。
还提供了用于预防或治疗患者的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：a)向所述患者施用本发明的可溶性融合蛋白复合物；b)活化所述患者体内的免疫细胞；和c)经由足以预防或治疗所述患者的疾病的经活化的免疫细胞破坏或杀伤疾病细胞。
本发明还提供了用于预防或治疗患者的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：a)将带有IL-15R链、细胞因子受体和/或检查点或信号传导分子的免疫细胞与本发明的可溶性融合蛋白复合物混合；b)活化所述免疫细胞；c)向所述患者施用经活化的免疫细胞；和d)经由足以预防或治疗所述患者的疾病的经活化的免疫细胞破坏或杀伤疾病细胞。免疫细胞还可以与特异性抗原接触从而扩大经活化的免疫细胞的数量。
施用本发明的融合蛋白复合物诱导受试者的免疫应答。例如，施用本发明的融合蛋白复合物诱导针对与瘤形成、传染性疾病，或自身免疫病相关的细胞的免疫应答。在一个方面，本发明的融合蛋白复合物增加免疫细胞增殖。
本发明提供了通过向哺乳动物施用有效量的本发明的可溶性融合蛋白复合物，刺激哺乳动物免疫应答的方法。本发明还提供了通过向哺乳动物施用有效量的本发明中任一项的可溶性融合蛋白复合物，抑制哺乳动物免疫应答的方法。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有由本发明所属领域技术人员通常所理解的意义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典](第2版.1994)；The Cambridge Dictionary of Science andTechnology[剑桥科学技术词典](Walker编辑,1988)；The Glossary of Genetics[遗传学术语],第5版,R.Rieger等人(编辑),Springer Verlag[施普林格出版社](1991)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology[哈珀柯林斯生物学词典](1991)。如本文所使用的，除非另有说明，否则以下术语具有下文所赋予的含义。
“药剂”是指肽、核酸分子，或小化合物。
“TxM”是指复合物，所述复合物包含连接至结合结构域的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc支架。示例性TxM是IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物，所述复合物包含与特异性识别PD-L1的结合结构域的融合(PD-L1 TxM)。
“改善”意指减少、压制、减弱、减轻、阻止或稳定疾病的发展或进展。
所谓“类似物”意指不是相同的但是具有类似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留了对应的天然存在的多肽的生物活性，同时相对于天然存在的多肽具有某些增强所述类似物的功能的生物化学修饰。此类生物化学修饰可以增加所述类似物的蛋白酶抗性、膜通透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可以包括非天然氨基酸。
术语“结合结构域”旨在涵盖抗体、单链抗体、Fab、Fv、T细胞受体结合结构域、配体结合结构域、受体结合结构域，或其他本领域已知的抗原特异性多肽。
本发明包括抗体或此类抗体的片段，只要它们显示出所希望的生物活性。还包括在本发明中的是嵌合抗体，例如人源化抗体。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。例如，可以使用本领域所述的方法，通过用啮齿动物互补决定区的至少一部分取代人抗体的相应区域进行人源化。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”旨在涵盖多克隆和单克隆抗体。优选的抗体是与抗原反应的单克隆抗体。术语“抗体”还旨在涵盖与抗原反应的一种以上抗体的混合物(例如，与抗原反应的不同类型的单克隆抗体的混合物)。术语“抗体”进一步旨在涵盖完整抗体、其生物学功能性片段、单链抗体，和遗传改变的抗体(例如包含来自一个以上物种的部分的嵌合抗体)、双功能抗体、抗体缀合物、人源化抗体和人抗体。还可以使用的生物学功能性抗体片段是衍生自足以与抗原结合的抗体的那些肽片段。如本文所使用的“抗体”意指包括完整抗体以及能够与表位、抗原或目的抗原片段结合的任何抗体片段(例如，F(ab')2、Fab'、Fab、Fv)。
“与分子结合”意指对于所述分子具有物理化学亲和力。
“检测”是指识别待检测的分析物的存在、不存在或量。
所谓“疾病”意指损害或妨碍细胞、组织或器官的正常功能的任何病症或障碍。疾病的实例包括瘤形成、自身免疫病和病毒感染。
术语配制剂或配制剂组分的“有效量”和“治疗有效量”是指单独地或呈组合形式的配制剂或组分的以提供所希望的效果的足够的量。例如，“有效量”是指相对于未经治疗的患者，改善疾病症状所需的单独地或呈组合形式的化合物的量。用于实施本发明以治疗性地处理疾病的一种或多种活性化合物的有效量随施用方式，受试者的年龄、体重以及总体健康状况而变化。最终地，主治医生或兽医会决定适当的量以及给药方案。这样的量被称为“有效”量。
所谓“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。此部分优选地包含参考核酸分子或多肽的整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，或90％。例如，片段可以包含10、20、30、40、50、60、70、80、90，或100、200、300、400、500、600、700、800、900，或1000个核苷酸或氨基酸。然而，本发明还包含多肽和核酸片段，只要它们分别显示出全长多肽和核酸的所希望的生物活性。使用几乎任何长度的核酸片段。例如，具有总长度为约10,000、约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对长度(包括所有中间长度)的说明性的多核苷酸区段包括在本发明的许多实施方式中。类似地，使用几乎任何长度的多肽片段。例如，具有总长度为约10,000、约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约5,000、约1,000、约500、约200、约100，或约50个氨基酸长度(包括所有中间长度)的说明性的多肽区段包括在本发明的许多实施方式中。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指不同程度上不含在天然状态下发现的通常伴随其的组分的物质。“分离”表示与原始来源或周围环境的分离程度。“纯化”表示高于分离的分离度。
“纯化的”或“生物学纯的”蛋白充分地不含其他物质，使得任何杂质不会实质上影响蛋白的生物学特性或引起其他不利后果。换言之，当通过重组DNA技术产生时，如果本发明的核酸或肽基本上不含细胞物质、病毒物质，或培养基时，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品时，则本发明的核酸或肽是纯化的。纯度和均质性典型地是使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定的。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以进行修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白，这些蛋白可以被单独纯化。
类似地，“基本上纯的”意指已经从天然伴随其的组分分离的核苷酸或多肽。典型地，当核苷酸和多肽按重量计至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％不含与它们天然关联的蛋白和天然存在的有机分子时，它们是基本上纯的。
“分离的核酸”是指核酸，其不含在衍生其的生物的天然存在的基因组中与其侧翼的基因。所述术语涵盖例如：(a)DNA，所述DNA是天然存在的基因组DNA分子的一部分，但侧翼不是如下两个核酸序列，所述两个核酸序列在天然存在所述分子的所述部分的生物的基因组中侧翼于所述分子的所述部分；(b)核酸，其以某种方式掺入载体或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中，使得所得分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不同；(c)单独的分子，例如cDNA，基因组片段，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，或限制性片段；和(d)重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列是杂交基因(即，编码融合蛋白的基因)的一部分。根据本发明分离的核酸分子进一步包括合成产生的分子，以及已经被化学改变和/或具有经修饰的骨架的任何核酸。例如，分离的核酸是经纯化的cDNA或RNA多核苷酸。分离的核酸分子还包括信使核糖核酸(mRNA)分子。
所谓“分离的多肽”意指从天然伴随它的组分中分离的本发明的多肽。典型地，当所述多肽以重量计为至少60％时，将它与它天然关联的蛋白和天然存在的有机分子分离。优选地，所述制剂是以重量计至少75％，更优选是至少90％，并且最优选是至少99％的本发明的多肽。本发明的分离的多肽可以例如通过从天然源提取、通过表达编码这样一种多肽的重组核酸或通过化学合成所述蛋白而获得。可以通过任何适当的方法测量纯度，例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过HPLC分析。
“标志物”是指具有在与疾病或障碍相关的表达水平或活性方面改变的任何蛋白或多核苷酸。
“瘤形成”是指特征在于过度增殖或凋亡减少的疾病或障碍。可以使用本发明的示例性肿瘤包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、华氏巨球蛋白血症、重链病和实体瘤例如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、成肾细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤及成视网膜细胞瘤)。在特别的实施方案中，瘤形成是多发性骨髓瘤、β细胞淋巴瘤、尿路上皮/膀胱癌，或黑色素瘤。如本文所使用的，如在“获得药剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方式获得药剂。
“减少”是指至少5％、10％、25％、50％、75％，或100％的负的改变。
所谓“参考”意指标准或对照状况。
“参考序列”是定义的用作序列比较的基础的序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体；例如，全长cDNA或基因序列的区段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽而言，参考多肽序列的长度将通常是至少约16个氨基酸、优选至少约20个氨基酸、更优选至少约25个氨基酸，并且甚至更优选约35个氨基酸、约50个氨基酸，或约100个氨基酸。对于核酸而言，参考核酸序列的长度通常是至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，并且甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或它们附近的或者它们之间的任一整数。
“特异性结合”意指一种化合物或抗体识别并且结合本发明的多肽，但是基本上并不识别并且结合样品(例如，天然包含本发明的多肽的生物样品)中的其他分子。
在本发明的方法中有用的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％同一，但是将典型地显示出基本同一性。与内源序列具有“基本同一性”的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。在本发明的方法中有用的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％同一，但是将典型地显示出基本同一性。与内源序列具有“基本同一性”的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。所谓“杂交”意指在不同的严格条件下进行配对以在互补的多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之间形成双链分子。(参见，例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]152:507)。
例如，严格的盐浓度通常将是小于约750mM的NaCl和75mM的柠檬酸三钠，优选小于约500mM的NaCl和50mM的柠檬酸三钠，并且更优选小于约250mM的NaCl和25mM的柠檬酸三钠。在缺少有机溶剂(例如，甲酰胺)下可以获得低严格杂交，而在至少约35％甲酰胺，并且更优选至少约50％甲酰胺存在下可以获得高严格杂交。严格的温度条件将通常包括至少约30℃、更优选地是至少约37℃、并且最优选地是至少约42℃的温度。不同的另外的参数，如杂交时间、清洁剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度以及载体DNA的包含或排除，对本领域的普通技术人员是熟知的。根据需要通过组合这些不同的条件实现不同的严格水平。在一个优选的实施方案中，杂交将在30℃、在750mM的NaCl、75mM的柠檬酸三钠、以及1％的SDS中发生。在一个更优选的实施方案中，杂交将在37℃，在500mM的NaCl、50mM的柠檬酸三钠、1％的SDS、35％的甲酰胺以及100mu.g/ml的变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中发生。在一个最优选的实施方案中，杂交将在42℃、在250mM的NaCl、25mM的柠檬酸三钠、1％的SDS、50％的甲酰胺、以及200μg/ml的ssDNA中发生。这些条件的有用变化对于本领域的普通技术人员应是容易地显而易见的。
对于大多数应用，杂交之后的洗涤步骤也将会在严格度方面不同。可以通过盐浓度和温度限定洗涤严格条件。如上所述，通过降低盐浓度或通过增加温度可以增加洗涤严格度。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度将为优选地小于约30mM的NaCl和3mM的柠檬酸三钠，并且最优选地小于约15mM的NaCl和1.5mM的柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件将通常包括至少约25℃、更优选地是至少约42℃、并且甚至更优选地是至少约68℃的温度。在一个优选的实施方案中，洗涤步骤将在25℃、在30mM的NaCl、3mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。在一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃、在15mM的NaCl、1.5mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。在一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃、在15mM的NaCl、1.5mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。这些条件的另外的变化对于本领域的普通技术人员应是容易地显而易见的。杂交技术是本领域的技术人员熟知的并且描述于例如Benton和Davis(Science[科学]196:180,1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA[美国国家科学院院刊]72:3961,1975)；Ausubel等人(CurrentProtocols in Molecular Biology[分子生物学实验手册]，Wiley Interscience[威利国际科学]，纽约,2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques[分子克隆技术指南],1987,Academic Press[学术出版社],纽约)；以及Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验指南],Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约中。
所谓“基本上同一”意指相对于参考氨基酸序列(例如，本文描述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文描述的任一核酸序列)，一种多肽或核酸分子显示出至少50％同一性。优选地，这样的一个序列与用于比较的序列在氨基酸水平或核酸上至少60％，更优选80％或85％，并且更优选90％、95％或甚至99％同一。
通常使用序列分析软件(例如，Sequencher，基因密码公司(Gene CodesCorporation)，775技术驱动，安阿伯，密歇根州；载体NTI，生命技术公司(LifeTechnologies)，3175斯坦利街(Staley Rd)，格兰德岛，纽约州)测量序列同一性。这种软件可以通过对不同取代、缺失和/或其他修饰的同源性程度进行赋值而将相同或相似的序列进行匹配。保守取代典型地包括在以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。在一种确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中在e-3与e-100之间的概率得分指示紧密相关的序列。
“受试者”是指哺乳动物，包括但不局限于，人或非人类哺乳动物，如牛、马、犬、绵羊，或猫。受试者优选是需要这种治疗的哺乳动物，例如，已被诊断为患有B细胞淋巴瘤或其易感性的受试者。所述哺乳动物是任何哺乳动物，例如人、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马，以及生长为食品消费的牲畜或动物，例如牛、羊、猪、鸡，和山羊。在优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。
在此提供的范围被理解为对所述范围内的所有值的简写。例如，1到50的范围应当被理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，所述组由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49，或50。
如本文所使用的术语“治疗(“treating”和“treatment”)”是指将药剂或配制剂施用至患有不良病症、障碍或疾病的临床症状性个体，以便实现症状严重性和/或频次的降低、消除症状和/或其潜在原因，和/或促进损害的改善或补救。应理解的是，尽管不能排除，治疗障碍或病症并不要求完全地消除所述障碍、病症或与其相关的症状。
术语“预防(“preventing”和“prevention”)”是指将药剂或组合物施用至易感或易患特定不良病症、障碍或疾病的临床无症状的个体，并因此涉及预防症状的发生和/或其潜在原因。
除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“或”被理解为包括在内。除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“一个、一种(a、an)”和“所述(the)”被理解为单数的或复数的。
除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。约可以被理解为在规定的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％，或0.01％之内。除非另外从上下文清楚可见，否则在此提供的所有数值均被术语约修饰。
在此的变量的任何定义中，化学基团列表的陈述包括所述变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。针对在此的变量或方面的实施方案的陈述包括所述实施方案作为任何单一实施方案或与任何其他实施方案或其部分的组合。
在此提供的任何组合物或方法可以与在此提供的一个或多个任何其他组合物和方法进行组合。
过渡性术语“包括”(comprising)与“包括”(including)、“含有”(containing)或“由……表征”(characterized by)同义，是包含性的或开放性的，并且不排除另外的未列举的元件或方法步骤。相比之下，过渡性短语“由……组成”排除在权利要求书中未指定的任何元件、步骤或成分。过渡性短语“基本上由……组成”将一项权利要求的范围限制到指定的材料或步骤、“以及本质上不影响所要求保护的本发明的一个或多个基本和新颖特征的那些”。
本发明的其他特征和优点将从下面对其优选实施方案的描述以及从权利要求书中显而易见。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似或等同于本文描述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下面描述了适合的方法和材料。本文引用的所有公开的外文专利和专利申请都通过引用并入本文。
由本文引用的登录号指示的Genbank和NCBI提交内容通过引用并入本文。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献都通过引用并入本文。在发生冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。此外，这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。
附图说明
专利或申请文件包含至少一张彩色附图。本专利或专利申请公开的带有一个或多个彩色附图的副本将根据要求并且并支付必要的费用后由官方提供。
图1是说明了构建体αPDL1/TGFβRII/TXM的结构的实施方案的示意图。
图2是在蛋白A纯化后，αPDL1/TGFβRII/TXM的分析性尺寸排阻色谱(SEC)。
图3是显示αPDL1/TGFβRII/TXM的减少的SDS PAGE结果的照片的扫描。
图4是说明了构建体TGFβRII/αPDL1/TXM的结构的实施方案的示意图。
图5是蛋白纯化后，TGFβRII/αPDL1/TXM的分析性SEC。
图6是显示TGFβRII/αPDL1/TXM的减少的SDS PAGE结果的照片的扫描。
图7是说明了构建体αPDL1/TxM/TGFβRII的结构的实施方案的示意图。
图8显示了TGFβRII/αPDL1/TxM和αPDL1/TGFβRII/TxM的减少的SDS PAGE结果。
图9是早期蛋白表征的表和示意图。
图10是描绘了使用比较αPDL1/TxM/TGFβRII、αPDL1/TGFβRII/TxM、TGFβRII/αPDL1/TxM和ALT-803的IL-15活性测定获得的结果的图和表。
图11是描绘了使用比较αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TxM和αPDL1/TGFβRII/TxM的TGFβ活性阻断测定获得的结果的图和表。
图12是描绘了使用比较αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TxM，和αPDL1/TGFβRII/TxM的PDL1结合测定获得的结果的图和表。
图13是显示了TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM之间的总体比较的表。
图14A显示了用hTGFβRII/αPDL1/TxM或ALT-803刺激后细胞增殖的图。用hTGFβRII/αPDL1/TxM或ALT-803刺激IL-15依赖性32Dβ细胞3天，并且使用PrestoBlue评估细胞增殖。通过使用ALT-803作为阳性对照，进行IL-15的EC50。结果是hαPDL1/TGFβRII/TxM具有IL-15活性，具有大约188pM的EC50。
图14B是显示了用hαPDL1/TGFβRII/TxM或ALT-803刺激后细胞增殖的图。用hαPDL1/TGFβRII/TxM或ALT-803刺激IL-15依赖性32Dβ细胞3天，并且使用PrestoBlue评估细胞增殖。通过使用ALT-803作为阳性对照，进行IL-15的EC50。结果是hαPDL1/TGFβRII/TxM具有IL-15活性，具有大约376.5pM的EC50。
图15A是显示了从TGFβRII/αPDL1/TxM与人肺乳头状腺癌细胞结合获得的结果的图。使用特异性针对hIgG的Fc部分的APC标记的抗体，通过流式细胞术分析TGFβRII/αPDL1/TxM与PDL1+H441人肺乳头状腺癌细胞的结合。结果显示TGFβRII/αPDL1/TxM具有针对PDL1的结合活性。
图15B是显示了从hαPDL1/TGFβRII/TxM与人肺乳头状腺癌细胞结合获得的结果的图。使用特异性针对hIgG的Fc部分的APC标记的抗体，通过流式细胞术分析hαPDL1/TGFβRII/TxM与PDL1+H441人肺乳头状腺癌细胞的结合。结果显示hαPDL1/TGFβRII/TxM具有针对PDL1的结合活性。
图16A是显示了通过hTGFβRII/αPDL1/TxM阻断TGFβ1介导的Smad2/3磷酸化获得的结果的图。用含有TGF/SMAD信号传导途径SBE报告分子的HEK293细胞(BPS Bioscience公司)，对使用hTGFβRII/αPDL1/TxM阻断由TGFβ1(100ng/mL)诱导的Smad2/3磷酸化进行评估。将融合至IgG Fc的TGFβRII用作对照。结果显示hTGFβRII/αPDL1/TxM可以有效阻断由TGFβ1介导的Smad磷酸化，具有大约2.35nM的IC50。
图16B是显示了通过hαPDL1/TGFβRII/TxM阻断TGFβ1介导的Smad2/3磷酸化获得的结果的图。用含有TGF/SMAD信号传导途径SBE报告分子的HEK293细胞(BPS Bioscience公司)，对使用hαPDL1/TGFβRII/TxM阻断由TGFβ1(100ng/mL)诱导的Smad2/3磷酸化进行评估。将融合至IgG Fc的TGFβRII用作对照。结果显示hαPDL1/TGFβRII/TxM可以有效阻断由TGFβ1介导的Smad磷酸化，具有大约0.38nM的IC50。
图17A是显示了通过hTGFβRII/αPDL1/TxM阻断TGFβ3介导的Smad2/3磷酸化获得的结果的图。用含有TGF/SMAD信号传导途径SBE报告分子的HEK293细胞(BPS Bioscience公司)，对使用hTGFβRII/αPDL1/TxM阻断由TGFβ3(100ng/mL)诱导的Smad2/3磷酸化进行评估。将融合至IgG Fc的TGFβRII用作对照。结果显示hTGFβRII/αPDL1/TxM可以有效阻断由TGFβ3介导的Smad磷酸化，具有大约0.355nM的IC50。
图17B是显示了通过hαPDL1/TGFβRII/TxM阻断TGFβ3介导的Smad2/3磷酸化获得的结果的图。用含有TGF/SMAD信号传导途径SBE报告分子的HEK293细胞(BPS Bioscience公司)，对使用hαPDL1/TGFβRII/TxM阻断由TGFβ3(100ng/mL)诱导的Smad2/3磷酸化进行评估。将融合至IgG Fc的TGFβRII用作对照。结果显示hαPDL1/TGFβRII/TxM可以有效阻断由TGFβ3介导的Smad磷酸化，具有大约0.029nM的IC50。
图18A是显示了从hTGFβRII/αPDL1/TXM与TGF-β1的结合获得的结果的图。进行ELISA来评估hTGFβRII/αPDL1/TXM与TGF-β1的结合。首先用TGFβ1(0.5μg/ml)涂覆孔过夜，并且然后以连续稀释，与hTGFβRII/αPDL1/TXM一起温育。使用抗hIgG辣根过氧化物酶(HRP)检测蛋白结合。结果显示hTGFβRII/αPDL1/TXM可以与板结合的TGF-β1结合，具有1.28nM的EC50。
图18B是显示了从hαPDL1/TGFβRII/TXM与TGF-β1的结合获得的结果的图。进行ELISA来评估hαPDL1/TGFβRII/TXM与TGF-β1的结合。首先用TGFβ1(0.5ug/ml)涂覆孔过夜，并且然后以连续稀释，与hαPDL1/TGFβRII/TXM一起温育。使用抗hIgG辣根过氧化物酶(HRP)检测蛋白结合。结果显示hαPDL1/TGFβRII/TXM可以与板结合的TGF-β1结合，具有0.49nM的EC50。
图19A是显示了从hTGFβRII/αPDL1/TXM与TGF-β3的结合获得的结果的图。进行ELISA来评估hTGFβRII/αPDL1/TXM与TGF-β1的结合。首先用TGFβ3(0.5μg/ml)涂覆孔过夜，并且然后以连续稀释，与hTGFβRII/αPDL1/TXM一起温育。使用抗hIgG辣根过氧化物酶(HRP)检测蛋白结合。结果显示hTGFβRII/αPDL1/TXM可以与板结合的TGFβ3结合，具有3.617nM的EC50。
图19B是显示了从hαPDL1/TGFβRII/TXM与TGF-β3的结合获得的结果的图。进行ELISA来评估hαPDL1/TGFβRII/TXM与TGF-β3的结合。首先用TGFβ3(0.5μg/ml)涂覆孔过夜，并且然后以连续稀释，与hαPDL1/TGFβRII/TXM一起温育。使用抗hIgG辣根过氧化物酶(HRP)检测蛋白结合。结果显示hαPDL1/TGFβRII/TXM可以与板结合的TGFβ3结合，具有2.447nM的EC50。
图20是从评估hTGFβRII/αPDL1/TXM的抗肿瘤活性的实验获得的结果的图。为了评估hTGFβRII/αPDL1/TXM蛋白的抗肿瘤活性，在如所示的不同蛋白存在下，在37℃下，按10:1的E:T比率，将CellTrace标记的PD-L1+H441肺肿瘤细胞与人NK细胞一起温育20小时。然后洗涤细胞，并且在2μg/ml PI溶液中重悬。通过流式细胞术确定死亡的PI+CellTrace+H441肿瘤细胞的百分比，并且代表不同蛋白介导的肿瘤细胞的NK细胞依赖性杀伤。结果显示hTGFβRII/αPDL1/TXM蛋白可以诱导针对肿瘤细胞的ADCC。
图21是从hαPDL1/TGFβRII/TXM的抗肿瘤活性的实验获得的结果的图。为了评估hαPDL1/TGFβRII/TXM蛋白的抗肿瘤活性，在如所示的不同蛋白存在下，在37℃下，按10:1的E:T比率，将CellTrace标记的PD-L1+H441肺肿瘤细胞与人NK细胞一起温育20小时。然后洗涤细胞，并且在2μg/ml PI溶液中重悬。通过流式细胞术确定死亡的PI+CellTrace+H441肿瘤细胞的百分比，并且代表不同蛋白介导的肿瘤细胞的NK细胞依赖性杀伤。结果显示hαPDL1/TGFβRII/TXM蛋白可以诱导针对肿瘤细胞的ADCC。
图22A是αPDL1/TxM/TGFβRII构建体的示意性图示。图22B：在还原(左)和非还原(右)条件下，在SDS-PAGE上运行αPD-L1/TxM、αPDL1/TxM/TGFβRII，和对照抗体。图22C是αPDL1/TxM/TGFβRII和Rsbc6(αPDL1 Ab)的SPR分析。通过Fc捕获，将αPDL1/TxM/TGFβRII和Rsbc6固定到SPR传感器上。通过Pioneer FE(Fortebio公司)上的OneStep动力学分析确定与PD-L1的结合亲和力。图22D是来自显示93％纯度的αPDL1/TxM/TGFβRII的SEC-HPLC的结果。图22E证明了针对PD-L1阳性肿瘤细胞(MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞)的αPD-L1/TxM、阿维鲁单抗、Rsbc6(Anti-PD-L1)、αPDL1/TxM/TGFβRIIR的ADCC活性。αPD-L1/TxM显示了约85％的最大杀伤，而αPDL1/TxM/TGFβRII显示了约30％的最大杀伤。
图23是显示αPDL1/TxM/TGFβRII上的TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3结合的表面等离子体共振(SPR)分析的一系列图。通过Fc捕获，将αPDL1/TxM/TGFβRII固定到SPR传感器上。通过Pioneer FE(Fortebio公司)上的OneStep动力学分析确定与TGFβ1(左图)、TGFβ2(中图)和TGFβ3(右图)的结合亲和力。
图24是用来评估蛋白的免疫检查点活性的标准化PD-L1阻断测定的示意图。
图25A是显示与αPDL1 Ab相比，从通过hαPDL1/TGFβRII/TxM和hTGFβRII/αPDL1/TxM阻断PD-L1介导的免疫细胞抑制获得的结果的图。图25B是显示与αPDL1 Ab相比，从通过hαPDL1/TxM/TGFβRII和hTGFβRII/αPDL1/TxM阻断PD-L1介导的免疫细胞抑制获得的结果的图。将增加浓度的hαPDL1/TGFβRII/TxM、hTGFβRII/αPDL1/TxM和hαPDL1/TxM/TGFβRII添加到标准化的基于细胞的PD-L1阻断测定中(图24)。通过导致NFAT-RE介导的冷光的T细胞活化，测量复合物阻断免疫抑制的能力。将抗PD-L1抗体和PD-L1/TxM蛋白复合物(类似于TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM复合物，但是缺乏TGFβRII结构域)用作阳性对照。
图26A和26B是证明与针对亲本对照分子(αPDL1/TxM，图26B)的活性相比，针对每种分子(N-810，图26A)，人TGFβ特异性阻断活性的图。使用稳定的基于细胞萤光素酶报告分子系统(HEK-293T-luc2P/SBE)，从而评估特异性TGFβ阻断活性。在阻断剂存在或不存在下，用0.0175nM的重组人TGFβ1刺激培养的细胞20小时。用相对冷光单位(RLU)±SD表示对hTGFβ1的应答。
图27A和27B是证明与针对亲本对照分子(αPDL1/TxM，图27B)的活性相比，针对每种分子(N-810Sorrento-Fc，图27A)，特异性hTGFβ1阻断活性的图。使用稳定的基于细胞萤光素酶报告分子系统(HEK-293T-luc2P/SBE)，从而评估特异性TGFβ阻断活性。在阻断剂存在或不存在下，用0.0175nM的重组人TGFβ1刺激培养的细胞20小时。用相对冷光单位(RLU)±SD表示对hTGFβ1的应答。
图28A和28B是证明与针对亲本对照分子(αPDL1/TxM，图28B)的活性相比，针对每种分子(N-810ΔC，图28A)，特异性hTGFβ1阻断活性的图。使用稳定的基于细胞萤光素酶报告分子系统(HEK-293T-luc2P/SBE)，从而评估特异性TGFβ阻断活性。在阻断剂存在或不存在下，用0.0175nM的重组人TGFβ1刺激培养的细胞20小时。用相对冷光单位(RLU)±SD表示对hTGFβ1的应答。
图29A和29B是证明与针对亲本对照分子(αPDL1/TxM，图29B)的活性相比，针对每种分子(N-810D，图29A)，特异性hTGFβ1阻断活性的图。使用稳定的基于细胞萤光素酶报告分子系统(HEK-293T-luc2P/SBE)，从而评估特异性TGFβ阻断活性。在阻断剂存在或不存在下，用0.0175nM的重组人TGFβ1刺激培养的细胞20小时。用相对冷光单位(RLU)±SD表示对hTGFβ1的应答。
图30是证明在乳腺腺癌细胞(MDA-MB-231)中，TxM构建体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。使用抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，从而确定特异性αPD-L1活性。效应子细胞：haNK(NK-92衍生物)。
图31A-31H是显示不同构建体的示意性图示。图31A：N-810A。图31B：未糖基化的N-810A。图31C：未糖基化的N-810A，Δ游离半胱氨酸。图31D：N-810A Δ铰链。图31E：N-810A(IL15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A)。IL15中的突变增强分子的溶解度和表达。图31F：N-810A(IL15-L45S)。IL15中的突变增强分子的溶解度和表达。图31G：N-810D。图31H：N-810E。
图32是证明IL15突变增加蛋白产量并且减少聚集的表。N-810D变异也增加产量并且减少聚集。
具体实施方式
本发明至少部分基于令人惊讶的发现，即基于IL-15的多特异性蛋白复合物增强免疫细胞的活性并促进其针对疾病细胞的活性，从而导致减少或预防疾病。这些蛋白复合物还显示对疾病和靶抗原的增加的结合。本文提供了多特异性蛋白复合物，其具有包含IL-15或功能变体的一个结构域、细胞因子受体或细胞因子配体，和包含疾病特异性结合结构域、免疫检查点抑制剂或免疫激动剂的结合结构域。在用于治疗受试者中的瘤形成、传染性疾病，或自身免疫病的方法中，此类蛋白复合物具有功用。因此，本文提供了特征在于PD-L1/TGFβRII/TxM的组合物，和使用此类组合物来增强针对瘤形成(实体瘤和血液肿瘤)的免疫应答的方法。
如本文描述，具有靶向疾病细胞的能力的蛋白用于宿主免疫识别和应答的用途，是用于治疗癌症、传染性疾病，和自身免疫病的有效策略。如在美国专利号8,507,222(通过引用并入本文)中描述，包含IL-15和IL-15受体α结构域的蛋白支架已经用于产生能够识别疾病细胞上的抗原和免疫细胞上的受体的多特异性蛋白。参见在实施例15的美国专利号8,507,222。本文描述了包含与一个或多个识别免疫检查点或信号传导分子的结合结构域连接的IL-15和IL-15受体α可溶性多特异性蛋白复合物的产生。在一些情况下，这些复合物还包含识别在疾病细胞上表达的抗原(例如PD-L1、ssDNA、CD20、HER2、EGFR、CD19、CD38、CD52、GD2、CD33、Notch1、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、组织因子、HIV包膜或其他肿瘤抗原)的结合结构域。
在一些情况下，结合结构域包含单链抗体，其中通过多肽接头序列，免疫球蛋白轻链可变结构域共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域。可以按VH-接头-VL或VL-接头-VH格式布置单链抗体结构域。可替代地，结合结构域包含能够充当免疫检查点抑制剂或免疫激动剂的可溶性的或细胞外的配体或受体结构域。只要维持结合活性，用或不用另外的接头序列，将识别免疫检查点或信号传导分子的结合结构域连接至IL-15或IL-15受体α蛋白的N或C末端。优选地，将结合结构域连接至人IL-15N72D超激动剂蛋白的N末端(huIL-15N72D)。可替代地，将结合结构域连接至人IL-15N72D蛋白的C末端。优选地，将结合结构域连接至人IL-15受体αsushi结构域的N末端(huIL-15RαSu)。可替代地，将结合结构域连接至huIL-15RαSuFc蛋白的C末端。在一些情况下，本发明的多特异性蛋白复合物进一步包含用于蛋白二聚化和免疫细胞上CD16受体的识别的IgG Fc结构域。这样一个结构域介导针对靶细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的刺激。在一些实例中，有用的是采用具有增强的或减少的CD16结合活性的Fc结构域。在一个方面，Fc结构域含有减小ADCC活性、但是保留了形成二硫键二聚体的能力的氨基酸取代L234A和L235A(LALA)(基于Fc共有序列的编号)。
因此，在某些实施方案中，分离的可溶性融合蛋白复合物包含至少两种可溶性蛋白复合物，第一可溶性蛋白复合物包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，并且第二可溶性蛋白包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)，其中免疫球蛋白Fc结构域融合至或连接至转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域；第一和/或第二可溶性蛋白进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子的结合结构域，并且第一可溶性蛋白的IL-15结构域结合第二可溶性蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。在某些方面，免疫球蛋白Fc结构域经由接头分子，连接至转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域。
在某些实施方案中，可溶性融合复合物包含至少两种可溶性蛋白，第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中第一融合蛋白包含转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)二聚体，所述TGFβRII二聚体包含连接至第二TGFβRII结构域的第一TGFβRII结构域，其中所述TGFβRII二聚体融合至或连接至白介素-15(IL-15)多肽结构域；第二融合蛋白包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)；其中第二融合蛋白进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子的结合结构域，并且其中第一融合蛋白的IL-15结构域结合第二融合蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。
在某些实施方案中，可溶性融合复合物包含至少两种可溶性蛋白，第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中第一融合蛋白包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，所述IL-15多肽结构域融合至特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子的结合结构域；第二融合蛋白包含转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)二聚体，所述TGFβRII二聚体包含连接至第二TGFβRII结构域的第一TGFβRII结构域，其中TGFβRII二聚体和可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)融合至免疫球蛋白Fc结构域；其中第一或第二TGFβRII结构域融合至IL-15RαSu结构域，其中第一融合蛋白的IL-15多肽结构域结合第二融合蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。
在某些实施方案中，第一和第二可溶性蛋白之一进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子，或免疫信号传导分子的第二结合结构域。
在某些实施方案中，IL-15多肽是包含N72D突变的IL-15变体(IL-15N72D)。
在某些实施方案中，结合结构域包含通过多肽接头序列，共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。
在某些实施方案中，结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族相关基因(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、组织因子(TF)、δ样蛋白4(DLL4)、单链DNA或T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(Tim-3)。
在某些实施方案中，结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)。在某些实施方案中，TGFβRII结构域结合转化因子β(TGFβ)。
在某些实施方案中，第一融合蛋白复合物通过二硫键共价连接至第二融合蛋白复合物，所述二硫键将第一可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域连接至第二可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域。
白介素-15
白介素-15(IL-15)是用于效应子NK细胞和CD8+记忆T细胞的发育、增殖和活化的重要细胞因子。IL-15与IL-15受体a(IL-15Rα)结合并反式呈递给效应子细胞上的IL-2/IL-15受体β-共γ链(IL-15Rβγc)复合物。IL-15和IL-2共享与IL-15Rβγc的结合，并通过STAT3和STAT5途径发信号。然而，与IL-2不同，IL-15不支持CD4+CD25+FoxP3+调节性T(Treg)细胞的维持或诱导活化的CD8+T细胞的细胞死亡，这种影响可能限制IL-2对多发性骨髓瘤的治疗活性。另外，IL-15是已知为效应子CD8+T细胞以提供抗调亡信号传导的唯一细胞因子。IL-15，无论单独施用还是作为与IL-15Rα的复合物施用，在实验动物模型中显示出针对已确认的实体瘤的有效抗肿瘤活性，并因此，已被鉴定为可以潜在治愈癌症的最有希望的免疫治疗药物之一。首次人体临床试验发现施用重组人(rh)IL-15的患者显示γδT细胞、CD8+T细胞，和NK细胞的显著增加，但是高剂量导致毒性和有限的肿瘤应答。2还观察到原核生物rhIL-15的较短半衰期。23
为促进基于IL-15的癌症治疗剂的临床开发，鉴定了与IL-15相比具有增加的生物活性的IL-15突变体(IL-15N72D)(Zhu等人,J Immunol[免疫学杂志],183:3598-3607,2009)。通过产生IL-15N72D:IL-15Rα/Fc融合复合物(ALT-803)进一步改善所述IL-15超激动剂(IL-15N72D)的药代动力学和生物活性，使得所述超激动剂复合物具有体内天然细胞因子活性的至少25倍(Han等人,Cytokine[细胞因子],56:804-810,2011)。
免疫检查点抑制剂和免疫激动剂结构域
在其他实施方案中，结合结构域对免疫检查点或信号传导分子或其配体是特异性的，并且充当免疫检查点抑制活性的抑制剂或充当免疫刺激活性的激动剂。此类免疫检查点和信号传导分子以及配体包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、CD28、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、B7-H5、ICOS-L、ICOS、BTLA、CD137L、CD137、HVEM、KIR、4-1BB、OX40L、CD70、CD27、CD47、CIS、OX40、GITR、IDO、TIM3、GAL9、VISTA、CD155、TIGIT、LIGHT、LAIR-1、Siglecs以及A2aR(Pardoll DM.2012.Nature Rev Cancer[癌症自然评论]12:252-264,Thaventhiran T,等人2012.J Clin Cell Immunol[临床与细胞免疫学杂志]S12:004)。另外，本发明的优选的抗体结构域可以包括伊匹单抗和/或曲美木单抗(tremelimumab)(抗CTLA4)、纳武单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、皮力珠单抗(pidilizumab)、TSR-042、ANB011、AMP-514和AMP-224(配体-Fc融合物)(抗PD1)、阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、阿维鲁单抗(avelumab)(MSB0010718C)、度伐单抗(durvalumab)(MEDI4736)、MEDI0680，和BMS-9365569(抗PDL1)、MEDI6469(抗OX40激动剂)、BMS-986016、IMP701、IMP731、IMP321(抗LAG3)和GITR配体。
细胞因子受体和细胞因子
融合至或连接至本文体现的IL-15的细胞因子受体结合导致免疫活性的增强的免疫刺激细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于IL-2家族、干扰素(IFN)、IL-10、IL-1、IL-17、TGF和TNF细胞因子家族，并且不限于IL-1到IL-35、IFN-α、IFN-β、IFNγ、TGF-β、TNF-α，和TNFβ。示例性受体是结合TGFβ的转化生长因子β受体类型II(TGFβRII)。由此基因编码的蛋白是具有蛋白激酶结构域的跨膜蛋白，与TGF-β受体类型1形成异二聚体复合物，并且结合TGF-β。此受体/配体复合物将蛋白磷酸化，然后蛋白进入细胞核并且调节与以下相关的基因的转录：细胞增殖、细胞周期阻滞、伤口愈合、免疫抑制，和肿瘤发生。在此基因中的突变已经与以下相关：马方综合征、洛伊斯-德茨主动脉瘤综合征，和不同类型的肿瘤的发展。TGFβRII的细胞外结构域可以结合TGF-β并且阻断其活性。在肿瘤微环境内，TGF-β发挥作用，来经由基质改性、血管发生，和上皮-间质转化(EMT)的诱导，促进肿瘤进展。TGF-β1可以直接抑制T细胞增殖和应答以及天然杀伤(NK)细胞活性。此外，在髓样细胞中的TGF-β信号传导在驱动转移中是至关重要的。
抗原特异性结合结构域
抗原特异性结合结构域由与疾病细胞上的靶标特异性结合的多肽组成。可替代地，这些结构域可以与支持疾病状态的其他细胞上的靶标结合，例如支持肿瘤生长的基质细胞上的靶标或支持疾病介导的免疫抑制的免疫细胞上的靶标。抗原特异性结合结构域包括本领域已知的抗体、单链抗体、Fab、Fv、T细胞受体结合结构域、配体结合结构域、受体结合结构域、结构域抗体、单结构域抗体、迷你抗体、纳米抗体、肽体(peptibodies)，或各种其他抗体模拟物(例如affimers、affitins、α体、三聚体(atrimers)、基于CTLA4的分子、纤维连接蛋白(adnectins)、抗运载蛋白(anticalins)、基于库尼茨(Kunitz)结构域的蛋白、亲和多聚体(avimers)、打结素(knottins)、fynomers、设计的锚蛋白重复蛋白(darpins)、亲合体(affibodies)、亲合素(affilins)、单体和基于犰狳重复序列蛋白的蛋白(Weidle,UH,等人2013.Cancer Genomics&Proteomics[癌症基因组学与蛋白组学]10:155-168))。
在某些实施方案中，针对抗原特异性结合结构域的抗原包含细胞表面受体或配体。在另外的实施方案中，抗原包含CD抗原、细胞因子或趋化因子受体或配体、生长因子受体或配体、组织因子、细胞黏附分子、MHC/MHC样分子、Fc受体、Toll样受体、NK受体、TCR、BCR、阳性/阴性共刺激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤相关抗原，或病毒编码的抗原。优选地，抗原特异性结合结构域能够与肿瘤细胞上的抗原结合。肿瘤特异性结合结构域可以来源于批准用于治疗癌症患者的抗体，这些抗体包括利妥昔单抗、奥法木单抗，和奥比珠单抗(obinutuzumab)(抗CD20抗体)；曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(抗HER2抗体)；西妥昔单抗和帕尼单抗(抗EGFR Ab)；和阿仑珠单抗(抗CD52 Ab)。类似地，可以使用来自对以下各项具有特异性的批准的抗体-效应子分子缀合物的结合结构域：CD20(90Y标记的替伊莫单抗、131I标记的托西莫单抗)、HER2(阿多-恩星曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine))、CD30(维汀-布仑妥昔单抗(brentuximab vedotin))和CD33(奥-吉妥珠单抗(gemtuzumabozogamicin))(Sliwkowski MX,Mellman I.2013Science[科学]341:1192)。
另外地，本发明的优选的结合结构域可以包括本领域已知的各种其他肿瘤特异性抗体结构域。用于治疗癌症的抗体和其各自的靶标包括但不限于纳武单抗(抗PD-1Ab)、TA99(抗gp75)、3F8(抗GD2)、8H9(抗B7-H3)、阿巴伏单抗(抗CA-125(仿制品))、阿德木单抗(抗EpCAM)、阿夫珠单抗(afutuzumab)(抗CD20)、培戈-阿拉赛珠单抗(alacizumab pegol)(抗VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)(抗CEA)、阿马妥昔单抗(amatuximab)(抗间皮素)、AME-133(抗CD20)、马安那莫单抗(anatumomab mafenatox)(抗TAG-72)、阿泊珠单抗(apolizumab)(抗HLA-DR)、阿西莫单抗(arcitumomab)(抗CEA)、巴维昔单抗(bavituximab)(抗磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(bectumomab)(抗CD22)、贝利木单抗(belimumab)(抗BAFF)、贝索单抗(besilesomab)(抗CEA-相关抗原)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(抗VEGF-A)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)(抗CD44 v6)、博纳吐单抗(blinatumomab)(抗CD19)、BMS-663513(抗CD137)、本妥昔单抗(抗CD30(TNFRSF8))、莫星-坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)(抗粘蛋白CanAg)、雷星-坎妥珠单抗(cantuzumab ravtansine)(抗MUC1)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)(抗-前列腺癌细胞)、卡鲁单抗(carlumab)(抗MCP-1)、卡妥索单抗(catumaxomab)(抗EpCAM、CD3)、cBR96-阿霉素免疫缀合物(抗路易斯(Lewis)Y抗原)、CC49(抗TAG-72)、西地珠单抗(cedelizumab)(抗CD4)、Ch.14.18(抗GD2)、ch-TNT(抗DNA相关的抗原)、柏托-西他妥珠单抗(citatuzumab bogatox)(抗EpCAM)、西妥木单抗(cixutumumab)(抗IGF-1受体)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)(抗MUC1)、坎妥木单抗(conatumumab)(抗TRAIL-R2)、CP-870893(抗CD40)、达西珠单抗(dacetuzumab)(抗CD40)、达利珠单抗(daclizumab)(抗CD25)、达图珠单抗(dalotuzumab)(抗胰岛素样长因子I受体)、达雷木单抗(daratumumab)(抗CD38(环状ADP核糖水解酶))、登西珠单抗(demcizumab)(抗DLL4)、地莫单抗(detumomab)(抗B-淋巴瘤细胞)、德珠单抗(drozitumab)(抗DR5)、度利格单抗(duligotumab)(抗HER3)、度西图单抗(dusigitumab)(抗ILGF2)、依美昔单抗(ecromeximab)(抗GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(edrecolomab)(抗EpCAM)、埃洛妥珠单抗(elotuzumab)(抗SLAMF7)、艾西莫单抗(elsilimomab)(抗IL-6)、埃诺瓦珠单抗(enavatuzumab)(抗TWEAK受体)、埃诺库单抗(enoticumab)(抗DLL4)、恩司昔单抗(ensituximab)(抗5AC)、西坦-依匹妥莫单抗(epitumomab cituxetan)(抗上皮唾液蛋白)、依帕珠单抗(epratuzumab)(抗CD22)、厄马索单抗(ertumaxomab)(抗HER2/neu、CD3)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)(抗整合素αvβ3)、法拉莫单抗(faralimomab)(抗干扰素受体)、法勒珠单抗(farletuzumab)(抗叶酸受体1)、FBTA05(抗CD20)、拉妥珠单抗(ficlatuzumab)(抗HGF)、芬妥木单抗(figitumumab)(抗IGF-1受体)、法伏托单抗(flanvotumab)(抗TYRP1(糖蛋白75))、夫苏木单抗(fresolimumab)(抗TGFβ)、弗妥昔单抗(futuximab)(抗EGFR)、加利昔单抗(抗CD80)、加尼妥单抗(ganitumab)(抗IGF-I)、奥-吉妥珠单抗(抗CD33)、吉瑞昔单抗(girentuximab)(抗碳酸酐酶9(CA-IX))、维汀-布仑妥昔单抗(抗GPNMB)、格赛库单抗(guselkumab)(抗IL13)、伊布丽珠单抗(ibalizumab)(抗CD4)、替伊莫单抗(抗CD20)、伊鲁库单抗(icrucumab)(抗VEGFR-1)、伊戈伏单抗(igovomab)(抗CA-125)、IMAB362(抗CLDN18.2)、IMC-CS4(抗CSF1R)、IMC-TR1(TGFβRII)、英加妥珠单抗(imgatuzumab)(抗EGFR)、英拉珠单抗(inclacumab)(抗选择素P)、雷星-英达妥昔单抗(indatuximabravtansine)(抗SDC1)、奥星-艾诺妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)(抗CD22)、英妥木单抗(intetumumab)(抗CD51)、伊匹单抗(抗CD152)、伊妥木单抗(iratumumab)(抗CD30(TNFRSF8))、KM3065(抗CD20)、KW-0761(抗CD194)、LY2875358(抗MET)、拉贝珠单抗(抗CEA)、兰布罗利珠单(lambrolizumab)(抗PDCD1)、来沙木单抗(lexatumumab)(抗TRAIL-R2)、林妥珠单抗(lintuzumab)(抗CD33)、立鲁单抗(lirilumab)(抗KIR2D)、莫星-洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab mertansine)(抗CD56)、鲁图莫单抗(lucatumumab)(抗CD40)、鲁昔单抗(lumiliximab)(抗CD23(IgE受体))、马帕木单抗(mapatumumab)(抗TRAIL-R1)、马格妥昔单抗(margetuximab)(抗ch4D5)、马妥珠单抗(matuzumab)(抗EGFR)、马瑞林单抗(mavrilimumab)(抗GMCSF受体α-链)、米拉珠单抗(milatuzumab)(抗CD74)、明瑞莫单抗(minretumomab)(抗TAG-72)、米妥莫单抗(mitumomab)(抗GD3神经节苷脂)、莫加利珠单抗(mogamulizumab)(抗CCR4)、帕舒托-莫塞妥莫单抗(moxetumomab pasudotox)(抗CD22)、他托-那考罗单抗(nacolomab tafenatox)(抗C242抗原)、埃托-那普妥莫单抗(naptumomabestafenatox)(抗5T4)、那图单抗(narnatumab)(抗RON)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)(抗EGFR)、尼瓦库单抗(nesvacumab)(抗血管生成素2)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(抗EGFR)、纳武单抗(nivolumab)(抗IgG4)、莫诺非单抗(nofetumomab merpentan)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(抗CD20)、奥卡珠单抗(ocaratuzumab)(抗CD20)、奥拉单抗(olaratumab)(抗PDGF-Rα)、奥纳珠单抗(onartuzumab)(抗c-MET)、欧土希珠单抗(ontuxizumab)(抗TEM1)、蒙托-奥珀妥珠单抗(oportuzumab monatox)(抗EpCAM)、奥戈伏单抗(oregovomab)(抗CA-125)、奥勒珠单抗(otlertuzumab)(抗CD37)、盘卡单抗(pankomab)(MUC1的抗肿瘤特异性糖基化)、帕图珠单抗(parsatuzumab)(抗EGFL7)、帕斯利珠单抗(pascolizumab)(抗IL-4)、帕托单抗(patritumab)(抗HER3)、盘图莫单抗(pemtumomab)(抗MUC1)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(抗HER2/neu)、皮力珠单抗(pidilizumab)(抗PD-1)、维汀-匹那妥珠单抗(pinatuzumab vedotin)(抗CD22)、平妥木单抗(pintumomab)(抗腺癌抗原)、维汀-珀拉妥珠单抗(polatuzumab vedotin)(抗CD79B)、普立木单抗(pritumumab)(抗波形蛋白)、PRO131921(抗CD20)、奎利珠单抗(quilizumab)(抗IGHE)、拉妥木单抗(racotumomab)(抗N-羟乙酰神经氨酸)、拉图单抗(radretumab)(抗纤连蛋白外结构域-B)、雷莫芦单抗(ramucirumab)(抗VEGFR2)、利妥木单抗(rilotumumab)(抗HGF)、罗妥木单抗(robatumumab)(抗IGF-1受体)、罗利度单抗(roledumab)(抗RHD)、罗维珠单抗(rovelizumab)(抗CD11&CD18)、沙穆珠单抗(samalizumab)(抗CD200)、喷地肽沙妥莫单抗(satumomab pendetide)(抗TAG-72)、赛瑞班图单抗(seribantumab)(抗ERBB3)、SGN-CD19A(抗CD19)、SGN-CD33A(抗CD33)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)(抗FAP)、司妥昔单抗(siltuximab)(抗IL-6)、索利图单抗(solitomab)(抗EpCAM)、松妥珠单抗(sontuzumab)(抗上皮唾液蛋白)、他巴鲁单抗(tabalumab)(抗BAFF)、台托坦他图珠单抗(tacatuzumabtetraxetan)(抗α-胎蛋白)、帕他普莫单抗(taplitumomab paptox)(抗CD19)、阿利拓提莫单抗(telimomab aritox)、台那木单抗(tenatumomab)(抗腱生蛋白C)、替奈昔单抗(teneliximab)(抗CD40)、台普木单抗(teprotumumab)(抗CD221)、TGN1412(抗CD28)、提利木单抗(ticilimumab)(抗CTLA-4)、提格珠单抗(tigatuzumab)(抗TRAIL-R2)、TNX-650(抗IL-13)、托西莫单抗(抗CS20)、托维图单抗(tovetumab)(抗CD140a)、TRBS07(抗GD2)、托格利珠单抗(tregalizumab)(抗CD4)、曲美木单抗(tremelimumab)(抗CTLA-4)、TRU-016(抗CD37)、塞莫白介素-2-妥考妥珠单抗(tucotuzumab celmoleukin)(抗EpCAM)、乌妥昔单抗(ublituximab)(抗CD20)、优鲁单抗(urelumab)(抗4-1BB)、万提图单抗(vantictumab)(抗卷曲受体)、伐利昔单抗(vapaliximab)(抗AOC3(VAP-1))、伐利珠单抗(vatelizumab)(抗ITGA2)、维妥珠单抗(veltuzumab)(抗CD20)、维森库单抗(vesencumab)(抗NRP1)、维斯利珠单抗(visilizumab)(抗CD3)、伏洛昔单抗(volociximab)(抗整合素α5β1)、玛汀-沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab mafodotin)(抗CD70)、伏妥莫单抗(votumumab)(抗肿瘤抗原CTAA16.88)、扎芦木单抗(zalutumumab)(抗EGFR)、扎诺木单抗(zanolimumab)(抗CD4)、扎图西单抗(zatuximab)(抗HER1)、扎利木单抗(ziralimumab)(抗CD147(基础免疫球蛋白))、RG7636(抗ETBR)、RG7458(抗MUC16)、RG7599(抗NaPi2b)、MPDL3280A(抗PD-L1)、RG7450(抗STEAP1)，和GDC-0199(抗Bcl-2)。
可用于本发明的其他抗体结构域或肿瘤靶结合蛋白(例如TCR结构域)包括但不限于结合以下抗原的那些(注意，所示的癌症适应症代表非限制性实例)：氨肽酶N(CD13)、膜联蛋白Al、B7-H3(CD276、各种癌症)、CA125(卵巢癌)、CA15-3(癌)、CA19-9(癌)、L6(癌)、Lewis Y(癌)、Lewis X(癌)、α胎蛋白(癌)、CA242(结肠直肠癌)、胎盘碱性磷酸酶(癌)、前列腺特异性抗原(前列腺)、前列腺酸性磷酸酶(前列腺)、表皮生长因子(癌)、CD2(霍奇金氏病、NHL淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、CD3ε(T细胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、自身免疫病、恶性腹水)、CD19(B细胞恶性肿瘤)、CD20(非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞肿瘤、自身免疫病)、CD21(B细胞淋巴瘤)、CD22(白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、SLE)、CD30(霍奇金氏淋巴瘤)、CD33(白血病、自身免疫病)、CD38(多发性骨髓瘤)、CD40(淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(CLL))、CD51(转移性黑色素瘤、肉瘤)、CD52(白血病)、CD56(小细胞肺癌、卵巢癌、梅克尔细胞癌，和液体瘤、多发性骨髓瘤)、CD66e(癌)、CD70(转移性肾细胞癌和非霍奇金氏淋巴瘤)、CD74(多发性骨髓瘤)、CD80(淋巴瘤)、CD98(癌)、CD123(白血病)、粘蛋白(癌)、CD221(实体瘤)、CD227(乳腺癌、卵巢癌)、CD262(NSCLC和其他癌)、CD309(卵巢癌)、CD326(实体瘤)、CEACAM3(结肠直肠癌、胃癌)、CEACAM5(CEA、CD66e)(乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌)、DLL4(A样-4)、EGFR(各种癌)、CTLA4(黑色素瘤)、CXCR4(CD 184、血红素肿瘤、实体瘤)、内皮素(CD105、实体瘤)、EPCAM(上皮细胞粘附分子、膀胱癌、头癌、颈癌、结肠癌、NHL前列腺癌，和卵巢癌)、ERBB2(肺癌、乳腺癌、前列腺癌)、FCGR1(自身免疫病)、FOLR(叶酸受体、卵巢癌)、FGFR(癌)、GD2神经节苷脂(癌)、G-28(细胞表面抗原糖脂、黑色素瘤)、GD3独特型(癌)、热激蛋白(癌)、HER1(肺癌，胃癌)、HER2(乳腺癌、肺癌和卵巢癌)、HLA-DR10(NHL)、HLA-DRB(NHL、B细胞白血病)、人绒毛膜促性腺激素(癌)、IGF1R(实体瘤、血癌)、IL-2受体(T细胞白血病和淋巴瘤)、IL-6R(多发性骨髓瘤、RA、卡斯特莱曼病(Castleman's disease)、IL6依赖性肿瘤)、整合素(针对各种癌症的ανβ3、α5β1、α6β4、α11β3、α5β5、ανβ5)、MAGE-1(癌)、MAGE-2(癌)、MAGE-3(癌)、MAGE 4(癌)、抗转铁蛋白受体(癌)、p97(黑色素瘤)、MS4A1(跨膜4-结构域亚家族A成员1、非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、白血病)、MUC1(乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、支气管癌和胃肠癌)、MUC16(CA125)(卵巢癌)、CEA(结肠直肠癌)、gp100(黑色素瘤)、MARTI(黑色素瘤)、MPG(黑色素瘤)、MS4A1(跨膜4-结构域亚家族A、小细胞肺癌、NHL)、核仁素、Neu癌基因产物(癌)、P21(癌)、连接素-4(癌)、抗-(N-羟乙酰神经氨酸、乳腺癌、黑色素瘤癌)的互补位、PLAP样睾丸碱性磷酸酶(卵巢癌，睾丸癌)、PSMA(前列腺瘤)、PSA(前列腺)、ROB04、TAG 72(肿瘤相关糖蛋白72、AML、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌)、T细胞跨膜蛋白(癌症)、Tie(CD202b)、组织因子、TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B，癌)、TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B、多发性骨髓瘤、NHL、其他癌症、RA和SLE)、TPBG(滋养层糖蛋白、肾细胞癌)、TRAIL-R1(肿瘤坏死凋亡诱导配体受体1、淋巴瘤、NHL、结肠直肠癌、肺癌)、VCAM-1(CD106、黑色素瘤)、VEGF、VEGF-A、VEGF-2(CD309)(各种癌症)。已经综述了一些其他肿瘤相关的抗原靶标(Gerber,等人,mAbs 2009 1:247-253；Novellino等人,CancerImmunol Immunother[癌症免疫学，免疫疗法].200554:187-207；Franke,等人,CancerBiother Radiopharm[癌症生物治疗和放射药物].2000,15:459-76；Guo,等人,Adv CancerRes.[癌症研究进展]2013；119:421-475；Parmiani等人J Immunol.[免疫学杂志]2007178:1975-9)。这些抗原的实例包括分化簇(CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CDl la、CDllb、CDl lc、CD12w、CD14、CD15、CD16、CDwl7、CD18、CD21、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD31、CD32、CD34、CD35、CD36、CD37、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD53、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD79、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD106、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD147、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD166、.CD168、CD184、CDwl86、CD195、CD202(a、b)、CD209、CD235a、CD271、CD303、CD304)、膜联蛋白Al、核仁素、内皮素(CD105)、ROB04、氨基-肽酶N,-样-4(DLL4)、VEGFR-2(CD309)、CXCR4(CD184)、Tie2、B7-H3、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、独特型、MAGE A3、p53非突变体、NY-ESO-1、GD2、CEA、MelanA/MARTl、Ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、hTERT、肉瘤易位断点、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、周期素B l、多唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、岩藻糖基GMl、间皮素、PSCA、MAGE Al、sLe(a)、CYPIB I、PLACl、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、Notch1、ICAM1以及Fos相关抗原1。
另外，本发明的优选的结合结构域包括对本领域已知的与感染的细胞相关的抗原和表位靶标特异的结合结构域。此类靶标包括但不限于源自以下目的感染剂的那些：HIV病毒(特别是来自HIV包膜突起和/或gp120和gp41表位的抗原)、人乳头瘤病毒(HPV)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、耐甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、乙型流感杆菌(influenzae B)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布氏杆菌(Brucella abortus)、狂犬病病毒(rabies virus)、流感病毒(influenza virus)、巨细胞病毒、单纯性疱疹病毒I、单纯性疱疹病毒II、人血清细小样病毒、呼吸道合胞体病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃巴(Epstein-Barr)病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、疱疹性口炎病毒、辛德毕斯(sindbis)病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼吸道肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺肿瘤病毒、登革热病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、阮格利锥虫(Trypanosoma rangeli)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiensei)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、曼氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、牛巴贝虫(Babesia bovis)、柔嫩艾美尔球虫(Elmeria tenella)、旋盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、旋毛线虫(Trichinella spiralis)、小泰勒虫(Theileria parva)、水泡绦虫(Taenia hydatigena)、羊绦虫(Taenia ovis)、牛肉绦虫(Taenia saginata)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、科氏中殖孔绦虫(Mesocestoides corti)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M arginini)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、唾液支原体(M.salivarium)和肺炎支原体(M.pneumoniae)。
T细胞受体(TCR)
T细胞是细胞亚群，所述细胞与其他免疫细胞类型(多形核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、B细胞、NK细胞)一起构成免疫系统的细胞组分。在生理条件下，T细胞在免疫监视和消除外来抗原中起作用。然而，在病理条件下，存在表明T细胞在疾病的出现和传播中起主要作用的令人信服的证据。在这些障碍中，中枢或外周的T细胞免疫耐受性的破坏是自身免疫病原因中的基本过程。
TCR复合物由至少七种跨膜蛋白组成。二硫键连接的(αβ或γδ)异二聚体形成单型抗原识别单元，而由ε、γ、δ、ζ，和η链组成的CD3的不变链负责将配体结合与信号传导途径(其导致T细胞活化和细胞免疫应答的展开)偶联。尽管TCR链具有基因多样性，但两种结构特征对于所有已知的亚基是共同的。首先，它们是具有单个跨膜结构域(可能是α螺旋)的跨膜蛋白。其次，所有TCR链具有在预测的跨膜结构域内具有带电氨基酸的不寻常特征。不变链具有单个负电荷，在小鼠和人之间保守，并且变体链具有一个(TCR-β)或两个(TCR-α)正电荷。TCR-α的跨膜序列在许多物种中高度保守，因此在系统发育上可能起重要的功能作用。含有亲水性氨基酸精氨酸和赖氨酸的八肽序列在物种之间是相同的。
通过抗原与TCR结合来调节T细胞应答。TCR的一种类型是膜结合异二聚体，由类似于免疫球蛋白可变(V)和恒定(C)区的α链和β链组成。TCRα链包括共价连接的V-α和C-α链，而β链包括连接至C-β链共价的V-β链。V-α和V-β链形成口袋或裂口，所述口袋或裂口可以在主要组织相容性复合物(MHC)(在人中被称为HLA复合物)的背景下结合超抗原或抗原。参见，Davis Ann.Rev.of Immunology[免疫学年评]3:537(1985)；Fundamental Immunology[基础免疫学]第3版,W.Paul编辑Rsen Press LTD.New York[如森出版社有限公司，纽约](1993)。
TCR链的细胞外结构域(αβ或γδ)还可以被工程化为与异源跨膜结构域融合以在细胞表面上表达。此类TCR可以包括与CD3、CD28、CD8、4-1BB和/或嵌合活化受体(CAR)跨膜或活化结构域的融合。TCR也可以是包含αβ或γδ链的抗原结合结构域中的一个或多个的可溶性蛋白。此类TCR可包括TCR可变结构域或其功能片段(具有或不具有TCR恒定结构域)。可溶性TCR可以是异二聚体分子或单链分子。
Fc结构域
本发明的蛋白复合物可以包含Fc结构域。例如，PD-L1 TxM包含抗PD-L1scAb/huIL-15N72D:抗PD-L1 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc融合复合物。已经报道了将IgG的Fc区与另一种蛋白(例如各种细胞因子和可溶性受体)的结构域组合的融合蛋白(参见，例如，Capon等人,Nature[自然],337:525-531,1989；Chamow等人,Trends Biotechnol.[生物技术趋势],14:52-60,1996)；美国专利号5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是通过IgGFc铰链区中的半胱氨酸残基连接的同源二聚体蛋白，产生类似于没有重链可变和CHl结构域和轻链的IgG分子的分子。包含Fc结构域的融合蛋白的二聚体性质可在提供与其他分子的更高级相互作用(即二价或双特异性结合)中是有利。由于结构同源性，Fc融合蛋白显示出与具有相似同种型的人IgG相当的体内药代动力学特征。IgG类免疫球蛋白是人体血液中含量最丰富的蛋白，其循环半衰期可长达21天。为了延长IL-15或IL-15融合蛋白的循环半衰期和/或增加其生物活性，本文描述了含有与IL-15Rα非共价结合的IL-15结构域的融合蛋白复合物，所述IL-15Rα共价连接至人重链IgG蛋白的Fc部分。
术语“Fc”是指片段可结晶区域，是抗体的恒定区，所述区与细胞表面受体(被称为Fc受体)和补体系统的一些蛋白相互作用。这样的“Fc”处于二聚体形式。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选是人来源的，并且可以是任何免疫球蛋白，尽管IgG1和IgG2是优选的。天然Fc由单体多肽组成，这些单体多肽可通过共价(即二硫键)和非共价缔合而连接成二聚体或多聚体形式。取决于类(例如，IgG、IgA、IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)，天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目在从1至4的范围内。天然Fc的一个实例是由IgG的木瓜蛋白酶消化产生的二硫键连接的二聚体(参见Ellison等人(1982),NucleicAcids Res.[核酸研究]10:4071-9)。如本文所使用的术语“天然Fc”对于单体、二聚体和多聚体形式是通用的。Fc结构域含有蛋白A、蛋白G、各种Fc受体和补体蛋白的结合位点。在一些实施方案中，复合物的Fc结构域能够与Fc受体相互作用以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在其他应用中，复合物包含不能有效介导ADCC或ADCP的Fc结构域(例如，IgG4 Fc)。
在一些实施方案中，术语“Fc变体”是指从天然Fc修饰的分子或序列，但仍包含针对补救受体FcRn的结合位点。国际申请WO 97/34631和WO 96/32478描述了示例性Fc变体，以及与补救受体的相互作用，并且特此通告引用并入。因此，术语“Fc变体”包含从非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被去除的位点，因为它们提供了对于本发明的融合分子不需要的结构特征或生物活性。因此，在某些实施方案中，术语“Fc变体”包含改变一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列，这些分子或序列影响或参与：(1)二硫键形成；(2)与所选的宿主细胞的不相容性；(3)在所选的宿主细胞中表达后的N末端异质性；(4)糖基化；(5)与补体的相互作用；(6)与补救受体以外的Fc受体的结合；(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；或(8)抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。这些改变可以增加或减少这些Fc特性中的任何一个或多个。在某些实施方案中，Fc区是人IgG Fc并且包含在Fc区内任何位置处引入的一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或修饰(碳氢化合物化学修饰)。在某些实施方案中，与不包含一个或多个氨基酸残基突变体的野生型Fc区相比，人IgG Fc变体包含一个或多个氨基酸残基突变体并且具有针对FcRn的增加的结合亲和力。对于铰链连接新生儿受体，Fc结合相互作用是必须的，但不限于增加IgG的血清半衰期。因此，在某些实施方案中，相对于具有相同氨基酸序列但是不包含一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或修饰(本文称为“相当的分子”)，例如像在Fc区中的相应位置处含有天然存在的氨基酸残基的未修饰的Fc区，人IgG Fc变体显示出针对至少一种或多种Fc配体(例如FcRns)的改变的结合亲和力。Fc变体在下文中被进一步详细描述。
术语“Fc结构域”涵盖如上定义的天然Fc和Fc变体分子以及序列。与Fc变体和天然Fc的变体一样，术语“Fc结构域”包括呈单体或多聚体形式的分子，无论从完整抗体消化的还是通过重组基因表达或通过其他方式产生的。
融合蛋白复合物
本发明提供了融合蛋白复合物。在一些情况下，第一蛋白包含与白介素-15(IL-15)或其功能片段共价连接的第一生物活性多肽；并且第二蛋白包含共价连接至可溶性白介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其功能片段的第二生物活性多肽，其中第一蛋白的IL-15结构域结合第二蛋白的可溶性IL-15Rα结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。本发明的融合蛋白复合物还包含连接至第一和第二蛋白中的一者或两者的免疫球蛋白Fc结构域或其功能片段。优选地，连接至融合蛋白的Fc结构域相互作用，从而形成融合蛋白复合物。可以通过免疫球蛋白Fc结构域之间的二硫键形成来稳定此类复合物。在一个方面，本发明的可溶性融合蛋白复合物包括IL-15多肽、IL-15变体或其功能片段和可溶性IL-15Rα多肽或其功能片段，其中IL-15和IL-15Rα多肽中的一者或两者进一步包括免疫球蛋白Fc结构域或其功能片段。
在某些实施例中，第一和第二蛋白中的一者或两者包含抗体或其功能片段。例如，结合结构域之一包含可溶性抗PD-L1单链抗体或其功能片段。在另一个实施例中，其他或第二结合结构域包含抗CTLA4单链抗体或疾病抗原特异性抗体或其功能片段。在一个实施方案中，本发明提供了PD-L1 TxM，其包含可溶性抗PD-L1 scAb/huIL-15N72D:抗PD-L1 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc融合蛋白复合物。在此实施例中，两个抗PD-L1 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc融合蛋白上的huIL-15N72D和huIL-15RαSu结构域与huIgG1结构域相互作用，从而形成多链融合蛋白复合物。
如本文所使用的，术语“生物活性多肽”或“效应子分子”意指氨基酸序列，例如蛋白、多肽或肽；糖或多糖；脂质或糖脂、糖蛋白，或脂蛋白，它们可以产生如本文所讨论的所希望的作用。效应子分子还包括化学药剂。还考虑了编码生物活性或效应子蛋白、多肽，或肽的效应子分子核酸。因此，适合的分子包括调节因子、酶、抗体，或药物以及DNA、RNA，和寡核苷酸。生物活性多肽或效应子分子可以是天然存在的或可以从已知的组分合成，例如，通过重组或化学合成，并且可以包括异源组分。如通过标准分子定量技术(例如，离心或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)的判断，生物活性多肽或效应子分子通常在约0.1KD至100KD之间或更高至约1000KD，优选地在约0.1KD、0.2KD、0.5KD、1KD、2KD、5KD、10KD、20KD、30KD和50KD之间。本发明的所希望的效果包括但不限于例如，形成具有增加的结合活性的本发明的融合蛋白复合物，杀伤靶细胞，例如诱导细胞增殖或细胞死亡，引发免疫应答，预防或治疗疾病，或作为用于诊断目的的检测分子。对于这种检测，可以使用以下测定，例如包括以下连续步骤的测定：培养细胞以使其增殖，并且使这些细胞与本发明的融合复合物接触，并然后评估所述融合复合物是否抑制这些细胞的进一步发育。
根据本发明，将效应子分子与本发明的融合蛋白复合物共价连接提供了许多显著的优点。可以产生包含单个效应子分子(包括已知结构的肽)的本发明的融合蛋白复合物。另外，在类似的DNA载体中可以产生多种效应子分子。换言之，不同效应子分子文库可以连接至融合蛋白复合物，用于识别感染的细胞或疾病细胞。此外，对于治疗应用，不是向受试者施用本发明的融合蛋白复合物，而是可以施用编码融合蛋白复合物的DNA表达载体用于融合蛋白复合物的体内表达。这种方法避免了通常与重组蛋白的制备相关的昂贵纯化步骤，并避免了与常规方法相关的抗原摄取和加工的复杂性。
正如所指，本文披露的融合蛋白的组分(例如，效应子分子，如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白毒素、免疫球蛋白结构域或其他生物活性分子和任何肽接头)可以按几乎任何方式组织(条件是所述融合蛋白具有预期的功能)。特别地，如果需要，融合蛋白的每个组分可以通过至少一个适合的肽接头序列与另一个组分隔开。另外，融合蛋白可以包括标签，例如，以促进修饰、鉴定和/或纯化融合蛋白。更具体的融合蛋白在以下所述的实施例中。
接头
在某些实施方案中，本发明的融合蛋白复合物还包括插入IL-15或IL-15Rα结构域和生物活性多肽之间的柔性接头序列。接头序列应允许生物活性多肽关于IL-15或IL-15Rα结构域的有效定位，以允许两个结构域的功能活性。
在某些情况下，可溶性融合蛋白复合物具有接头，其中第一生物活性多肽通过多肽接头序列共价连接至IL-15(或其功能片段)。在其他方面，如本文描述的可溶性融合蛋白复合物具有接头，其中第二生物活性多肽通过多肽接头序列共价连接至IL-15Rα多肽(或其功能片段)。
接头序列优选由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列产生可以有效定位用于识别呈递抗原的TCR分子的或用于识别抗原的抗体分子的结合结构域的结合槽的肽。如本文所使用的，短语“生物活性多肽关于IL-15或IL-15Rα结构域的有效定位”或其他类似短语旨在表示连接至IL-15或IL-15Rα结构域的生物活性多肽被定位，使得IL-15或IL-15Rα结构域能够彼此相互作用，从而形成蛋白复合物。例如，IL-15或IL-15Rα结构域被有效定位以允许与免疫细胞相互作用以启动或抑制免疫反应，或抑制或刺激细胞发育。
本发明的融合复合物优选地还包括插入IL-15或IL-15Rα结构域和免疫球蛋白Fc结构域之间的柔性接头序列。接头序列应允许Fc结构域、生物活性多肽和IL-15或IL-15Rα结构域的有效定位以允许每个结构域的功能性活性。例如，Fc结构域被有效定位以允许适当的融合蛋白复合物形成和/或与在补体系统的免疫细胞或蛋白上的Fc受体相互作用以刺激Fc介导的作用，包括调理素作用，细胞裂解，肥大细胞、嗜碱性粒细胞，和嗜酸性粒细胞的脱粒，以及其他的Fc受体依赖性过程；补体途径的活化；以及融合蛋白复合物的增强的体内半衰期。
还可以将接头序列用于连接生物活性多肽的两个或更多个多肽，以产生具有所需功能活性的单链分子。
优选地，接头序列包含从约7至20个氨基酸，更优选从约10至20个氨基酸。接头序列优选是柔性的，以便不将生物活性多肽或效应子分子以单一的不希望的构象保持。可以使用接头序列，例如使识别位点与经融合的分子间隔开。具体地，可以将肽接头序列在生物活性多肽和效应子分子之间定位，例如，以将其化学交联并提供分子柔性。接头优选主要包含具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供柔性。优选地，约80％或90％或更多的接头序列包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基(特别是甘氨酸和丝氨酸残基)。
可以使用不同的接头序列，包括已成功用于将抗体可变区连接在一起的许多柔性接头设计中的任何一种(参见，Whitlow,M.等人,(1991)Methods:A Companion to Methodsin Enzymology[方法：与酶学方法的比较],2:97-105)。
药物治疗剂
本发明提供了包含融合蛋白复合物的药物组合物，所述组合物用作治疗剂。在一方面，本发明的融合蛋白复合物被全身施用，例如，配制在药学上可接受的缓冲液(如生理盐水)中。优选的施用途径包括，例如，滴注到膀胱中，皮下、静脉内、腹膜内、肌内、瘤内或皮内注射，其在患者体内提供连续、持续或有效水平的组合物。使用在生理学上可接受的运载体中的治疗有效量的本文鉴定的治疗剂进行人患者或其他动物的治疗。适合的运载体和其配制剂描述于例如，由E.W.Martin编辑的Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]中。待施用的治疗剂的量根据施用方式，患者的年龄和体重以及瘤形成的临床症状而变化。通常，量将在其他药剂的使用的量的范围内，这些其他药剂在治疗与瘤形成、自身免疫病或传染性疾病相关的其他疾病中使用，尽管在某些情况下由于化合物的特异性增加将需要较低的量。如通过本领域技术人员已知的方法测定，按以下剂量施用化合物，所述量增强受试者的免疫应答，或降低瘤形成细胞、感染的细胞，或自身免疫细胞的增殖、存活或侵袭性。
药物组合物的配制剂
通过任何适合的方式施用用于治疗瘤形成、传染性疾病或自身免疫病的本发明的融合蛋白复合物，所述方式导致与其他组分组合的治疗剂的浓度在改善、减少或稳定所述瘤形成、传染性疾病或自身免疫病中是有效的。本发明的融合蛋白复合物可以按任何适合的量包含在任何适合的运载体物质中，并且通常按组合物总重量的重量计以1％-95％的量存在。可以按适合于肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌内、囊内、瘤内或腹膜内)施用途径的剂型提供组合物。例如，根据常规的药物实践配制药物组合物(参见，例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践](第20版),编辑A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000以及Encyclopedia ofPharmaceutical Technology[药物技术百科全书],编辑.J.Swarbrick和J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York[马塞尔·德克尔出版社，纽约])。
人体剂量最初通过从小鼠或非人灵长类动物中使用的化合物的量外推来确定，因为技术人员认识到与动物模型相比，修饰人的剂量在本领域中是常规的。例如，剂量可以在从约1μg化合物/kg体重至约5000mg化合物/kg体重；或从约5mg/kg体重至约4,000mg/kg体重；或从约10mg/kg体重至约3,000mg/kg体重；或从约50mg/kg体重至约2000mg/kg体重；或从约100mg/kg体重至约1000mg/kg体重；或从约150mg/kg体重至约500mg/kg体重的范围内变化。例如，剂量是约1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500，或5,000mg/kg体重。可替代地，剂量在约5mg化合物/Kg体重至约20mg化合物/kg体重的范围内。在另一个实例中，剂量为约8、10、12、14、16或18mg/kg体重。优选地，按0.5mg/kg-约10mg/kg(例如，0.5、1、3、5、10mg/kg)施用融合蛋白复合物。当然，取决于初始临床试验的结果和特定患者的需要，如在这样的治疗方案中常规进行的那样，所述剂量可以向上或向下调整。
将药物组合物与适合的赋形剂一起配制成药物组合物，所述药物组合物在施用后以受控方式释放治疗剂。实例包括单或多单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。优选地，将融合蛋白复合物配制在适于肠胃外施用的赋形剂中。
肠胃外组合物
将包含本发明的融合蛋白复合物的药物组合物通过注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌内、瘤内、囊内、腹膜内)，以剂型、配制剂或经由适合的递送装置或包含常规无毒性药学上可接受的运载体和佐剂的植入物肠胃外施用。此类组合物的配制剂和制剂对于药物配制剂领域的技术人员是熟知的。可以在Remington:The Science and Practice ofPharmacy[雷明顿：药学科学与实践],同上中发现配制剂。
以单位剂型(例如，以单剂量安瓿)提供包含用于肠胃外使用的本发明的融合蛋白复合物的组合物。可替代地，将组合物提供在含有若干个剂量的小瓶中，并且其中可以添加适合的防腐剂(参见下文)。组合物呈溶液、悬浮液、乳液、输注装置或用于植入的递送装置的形式，或呈现为在使用前用水或另一种适合的媒介物重构的干粉末。除了减少或改善瘤形成、传染性疾病或自身免疫病的活性剂外，所述组合物还包括适合的肠胃外可接受的运载体和/或赋形剂。可以将一种或多种活性治疗剂掺入微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体中用于控制释放。此外，所述组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂和/或分散剂。
如上所述，包含本发明的融合蛋白复合物的药物组合物可以呈适合于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将一种或多种适合的活性治疗剂溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体媒介物中。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水，通过添加适量的盐酸、氢氧化钠或适合的缓冲液调节至适合的pH的水，1,3-丁二醇，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液和右旋糖溶液。水性配制剂还可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在其中一种化合物仅微量或微溶于水的情况下，可以添加溶解增强剂或增溶剂，或溶剂可以包括10％w/w-60％w/w的丙二醇。
本发明提供治疗瘤形成、传染性疾病或自身免疫病或其症状的方法，所述方法包括向受试者(例如哺乳动物，如人)施用治疗有效量的包含本文通式化合物的药物组合物。因此，一个实施方案是治疗患有或易患瘤形成、传染性疾病或自身免疫病或其症状的受试者的方法。所述方法包括以下步骤：在治疗疾病或障碍的条件下，向哺乳动物施用治疗量的足以治疗疾病或障碍或其症状的量的化合物。
本文的方法包括向受试者(包括鉴定为需要这种治疗的受试者)施用有效量的本文描述的化合物或本文描述的组合物以产生这种效果。鉴定需要这种治疗的受试者可以是受试者或健康护理专业人员的判断，并且可以是主观的(例如意见)或客观的(例如通过测试或诊断方法可测量)。
本发明的治疗方法(包括预防性治疗)通常包括向有需要的受试者(例如，动物，人，包括哺乳动物，特别是人)施用治疗有效量的本文的化合物(例如本文通式的化合物)。这种治疗将被适当地施用至患有、具有、易患肿瘤形成、传染性疾病、自身免疫病、障碍或其症状或处于患肿瘤形成、感染性疾病、障碍或其症状的风险中的受试者(特别是人)。可通过诊断测试或受试者或健康护理提供者的意见(例如，基因测试、酶或蛋白标志物、标志物(如本文所定义的)、家族史等)进行任何客观或主观确定可以做出对“处于风险中”的受试者的确定。本发明的融合蛋白复合物可用于治疗任何其他的障碍(其中需要增加免疫应答)。
本发明还提供了一种监测治疗进展的方法。所述方法包括以下步骤：在患有或易患与瘤形成相关的障碍或其症状的受试者中，测定诊断标志物(标志物)(例如，由本文化合物调节的本文描绘的任何靶标、蛋白或其指示物等)或诊断测量(例如，筛选，测定)的水平，其中所述受试者已经被施用足以治疗疾病或其症状的治疗量的本文的化合物。可以将所述方法中确定的标志物的水平与健康正常对照或其他患病患者中的标志物的已知水平进行比较，以确定受试者的疾病状态。在一些情况下，在比第一水平的确定更晚的时间点处确定受试者中的标志物的第二水平，并且比较这两个水平以监测疾病的进程或治疗的功效。在某些方面，根据本发明在开始治疗之前确定受试者中的标志物的治疗前水平；然后可以将标志物的治疗前水平与治疗开始后受试者中标志物的水平进行比较，以确定治疗的功效。
组合疗法
任选地，将本发明的融合蛋白复合物与任何其他标准疗法组合施用；这些方法对于本领域技术人员是已知的并且在Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]中由E.W.Martin.进行了描述。如果需要，将本发明的融合蛋白复合物与任何常规的抗肿瘤疗法组合施用，这些常规的抗肿瘤疗法包括但不限于免疫疗法、治疗性抗体、靶向治疗、手术、放射治疗，或化疗。
试剂盒或药物系统
可以将包含本发明的融合蛋白复合物的药物组合物组装成试剂盒或药物系统，用于在改善瘤形成、传染性疾病或自身免疫病中使用。根据本发明所述方面的试剂盒或药物系统包括在其中的限定空间中具有一个或多个容器装置(例如小药瓶、管、安瓿、瓶等)的载体手段(例如盒子、纸箱、管)。本发明的试剂盒或药物系统还可包含用于使用本发明的融合蛋白复合物的相关说明书。
重组蛋白表达
通常，本发明的融合蛋白复合物(例如，TxM复合物的组分)的制备可以通过本文披露的方法和通过公认的重组DNA技术完成。
通常，通过在适合的表达载体中的全部或部分的编码多肽的核酸分子或其片段转化适合的宿主细胞来产生重组多肽。分子生物学领域的技术人员将理解，可以使用多种表达系统中的任何一种来提供重组蛋白。使用的明确宿主细胞对本发明并不重要。可以在几乎任何真核宿主(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；昆虫细胞(例如，Sf21细胞)；或哺乳动物细胞(例如，NIH 3T3、HeLa，或优选地COS细胞))中产生重组多肽。此类细胞可从多种来源获得(例如，American Type Culture Collection[美国种质保存中心],罗克兰,马里兰州；还参见，例如，Ausubel等人,Current Protocol in Molecular Biology[分子生物学现代方法],New York:John Wiley and Sons[纽约:约翰威利父子出版公司],1997)。转染方法和表达载体的选择取决于所选择的宿主系统。转化方法描述于例如，Ausubel等人(同上)；表达载体可选自在例如，Cloning Vectors:A Laboratory Manual[克隆载体：实验室手册](P.H.Pouwels等人,1985,增刊1987)中提供的那些。
存在多种用于产生重组多肽的表达系统。可用于产生此类多肽的表达载体包括但不限于染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、衍生自噬菌体、衍生自转座子、衍生自酵母附加体、衍生自插入元件、衍生自酵母染色体元件的载体；衍生自病毒(如杆状病毒、乳多孔病毒(papova病毒)(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒)的载体，以及衍生自其组合的载体。
一旦表达重组多肽后，例如使用亲和色谱法分离。在一个实例中，针对多肽产生的(例如，如本文描述产生的)抗体可以附接到柱上并用于分离重组多肽。在亲和色谱之前，可以通过标准方法进行携带多肽的细胞的裂解和分级(参见，例如，Ausubel等人，同上)。一旦分离，如果需要，可以例如通过高效液相色谱法进一步纯化重组蛋白(参见，例如，Fisher,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology[生物化学和分子生物学实验室技术],编辑,Work和Burdon,爱思唯尔出版公司(Elsevier),1980)。
如本文所使用的，本发明的生物活性多肽或效应子分子可以包括以下因子，例如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白毒素、免疫球蛋白结构域，或其他生物活性蛋白(如酶)。同样，生物活性多肽可包括与其他化合物(例如非蛋白毒素、细胞毒性剂、化学治疗剂、可检测标记、放射性物质等)的缀合物。
本发明的细胞因子由细胞(其影响其他细胞的并且负责细胞免疫的许多多重作用中的任何一种)产生的任何因子定义。细胞因子的实例包括但不限于IL-2家族、干扰素(IFN)、IL-10、IL-1、IL-17、TGF和TNF细胞因子家族，并且不限于IL-1到IL-35、IFN-α、IFN-β、IFNγ、TGF-β、TNF-α，和TNFβ。
在本发明的一方面，第一蛋白包含共价连接至白介素-15(IL-15)结构域或其功能片段的第一生物活性多肽。IL-15是影响T细胞活化和增殖的细胞因子。影响免疫细胞活化和增殖的IL-15活性在一些方面与IL-2类似，尽管已经很好地表征了基本差异(Waldmann,TA,2006,Nature Rev.Immunol.[自然综述免疫学]6:595-601)。
在本发明的另一方面，第一蛋白包含白介素-15(IL-15)结构域，所述结构域是IL-15变体(本文中还被称为IL-15突变体)。所述IL-15变体优选地包含与天然(或野生型)IL-15蛋白不同的氨基酸序列。所述IL-15变体优选地结合IL-15Rα多肽，并且作为IL-15激动剂或拮抗剂起作用。优选地，具有激动剂活性的IL-15变体具有超激动剂活性。IL-15变体可以不依赖于其与IL-15Rα的缔合，作为IL-15激动剂或拮抗剂起作用。与野生型IL-15相比，通过相当或增加的生物活性例证IL-15激动剂。通过与野生型IL-15相比降低的生物活性或通过抑制IL-15介导的应答的能力例证IL-15拮抗剂。在一些实例中，IL-15变体以增加或降低的活性与IL-15RβγC受体结合。在一些情况下，与天然IL-2序列相比，IL-15变体的序列具有至少一个氨基酸变化(例如取代或缺失)，此类变化导致IL-15激动剂或拮抗剂活性。优选地，氨基酸取代/缺失在与IL-15Rβ和/或γC相互作用的IL-15的结构域中。更优选地，氨基酸取代/缺失不影响与IL-15Rα多肽的结合或产生IL-15变体的能力。可以基于推定的或已知的IL-15结构鉴定，通过如本文提供的合理或随机诱变和功能测定或其他经验方法将IL-15与具有已知结构的同源分子(例如IL-2)进行比较来鉴定产生IL-15变体的适合的氨基酸取代/缺失。另外，适合的氨基酸取代可以是保守的或非保守的变化和另外的氨基酸的插入。优选地，本发明的IL-15变体在成熟人IL-15序列的位置6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111，或112处包含一个或多于一个氨基酸取代/缺失；特别地，D8N(“D8”是指天然成熟人IL-15序列中的氨基酸和残基位置，并且“N”是指在IL-15变体中位置处的取代的氨基酸残基)、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P或Q108A取代形成具有拮抗剂活性的IL-15变体，并且N72D取代形成具有激动剂活性的IL-15变体。
类似于细胞因子的趋化因子被定义为任何化学因子或分子，当其暴露于其他细胞时负责细胞免疫的许多多重作用中的任何一种。适合的趋化因子可以包括但不限于CXC、CC、C，和CX3C趋化因子家族，并且不限于CCL-1到CCL-28、CXC-1到CXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-1b、IL-8、MCP-1和Rantes。
生长因子包括当暴露于特定细胞时诱导受影响的细胞的增殖和/或分化的任何分子。生长因子包括蛋白和化学分子，其中一些包括：GM-CSF、G-CSF、人生长因子和干细胞生长因子。另外的生长因子也可适用于本文描述的用途。
毒素或细胞毒性剂包括任何物质，当其暴露于细胞时对生长具有致死作用或抑制作用。更具体地，效应子分子可以是例如植物或细菌来源的细胞毒素，例如白喉毒素(DT)、志贺毒素、相思豆毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、皂草素、假单胞菌外毒素(PE)、美洲商陆抗病毒蛋白，或白树毒素。此类毒素的生物活性片段是本领域熟知的，并且包括例如，DT A链和蓖麻毒素A链。另外，毒素可以是在细胞表面有活性的药剂，例如像磷脂酶(例如，磷脂酶C)。
此外，效应子分子可以是化学治疗药物，例如像长春地辛、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、阿霉素、博来霉素或顺铂。
另外，效应子分子可以是适于诊断或成像研究的可检测地标记的分子。此类标记包括生物素或链霉亲和素/抗生物素蛋白、可检测的纳米颗粒或晶体、酶或其催化活性片段、荧光标记(例如绿色荧光蛋白)、FITC、藻红蛋白、cychome、德克萨斯红或量子点；放射性核素(例如，碘-131、钇-90、铼-188或铋-212)；磷光或化学发光分子或通过PET、超声或MRI可检测的标记(例如基于Gd或顺磁性金属离子的造影剂)。针对关于制备和使用包含效应子或标签的蛋白的披露内容，参见，例如，Moskaug,等人J.Biol.Chem[生物化学杂志]264,15709(1989)；Pastan,I.等人.Cell[细胞]47,641,1986；Pastan等人,Recombinant Toxinsas Novel Therapeutic Agents[作为新颖治疗性药剂的重组毒素],Ann.Rev.Biochem[生物化学年鉴].61,331,(1992)；“Chimeric Toxins[嵌合毒素]”Olsnes和Phil,Pharmac.Ther.[药理学与治疗学],25,355(1982)；公开的PCT申请号WO 94/29350；公开的PCT申请号WO 94/04689；公开的PCT申请号WO 2005046449和美国专利号5,620,939。
包括共价连接的IL-15和IL-15Rα结构域的蛋白融合或缀合复合物具有几个重要用途。例如，包含抗PD-L1 scAb的蛋白融合或缀合复合物可以用于将IL-15:IL-15Rα复合物递送至某些细胞，例如表达PD-L1的肿瘤细胞。因此，蛋白融合或缀合复合物提供了选择性破坏或杀伤包含配体的细胞的方式。能够由蛋白融合或缀合复合物破坏或杀伤的细胞或组织的实例包括表达一种或多种配体的肿瘤和病毒或细菌感染的细胞。易被损伤或杀伤的细胞或组织可通过本文公开的方法容易地测定。
本发明的IL-15和IL-15Rα多肽在氨基酸序列方面适当地对应于天然存在的IL-15和IL-15Rα分子，例如人、小鼠或其他啮齿动物，或其他哺乳动物的IL-15和IL-15Rα分子。这些多肽和编码核酸的序列在文献中是已知的，包括人白介素15(IL15)mRNA-GenBank:U14407.1(通过引用并入本文)、小家鼠白介素15(IL15)mRNA-GenBank:U14332.1(通过引用并入本文)、人白介素-15受体α链前体(IL15RA)mRNA-GenBank:U31628.1(通过引用并入本文)、小家鼠白介素15受体α链-GenBank:BC095982.1(通过引用并入本文)。
在一些情况下，使本发明的蛋白融合或缀合物复合物多价化是有用的，例如，以增加sc-抗体的化合价。特别地，融合蛋白复合物的IL-15和IL-15Rα结构域之间的相互作用提供了产生多价复合物的方式。此外，可以通过使用例如标准生物素-链霉亲和素标记技术，或通过与适合的固体支持物(例如乳胶珠)缀合，通过在一个和四个蛋白(相同或不同)之间共价或非共价连接而制备多价融合蛋白。化学交联的蛋白(例如与树状聚合物交联)也是适合的多价物质。例如，可以通过包括编码可以被修饰的标签序列(例如生物素化BirA标签)的序列或具有化学反应性侧链的氨基酸残基(如Cys或His)来修饰蛋白。此类氨基酸标签或化学反应性氨基酸可位于融合蛋白的多个位置中，优选位于生物活性多肽或效应子分子的活性位点的远端。例如，可溶性融合蛋白的C末端可以共价连接至标签或包含一个或多个这种反应性氨基酸的其他融合蛋白。可以包括适合的侧链以将两个或更多个融合蛋白化学与适合的树状聚合物或其他纳米颗粒连接，以产生多价分子。树状聚合物是合成化学聚合物，可以具有其表面的许多不同官能团中的任何一种(D.Tomalia,Aldrichimica Acta[奥尔德里奇化学公司杂志],26:91:101(1993))。根据本发明使用的示例性树状聚合物包括，例如E9星状亮光(starburst)聚胺树状聚合物和E9燃烧聚胺树状聚合物，这些聚合物可以连接胱氨酸残基。示例性纳米颗粒包括脂质体、核-壳颗粒或基于PLGA的颗粒。
在另一方面，融合蛋白复合物的一个或两个多肽包含免疫球蛋白结构域。可替代地，蛋白结合结构域-IL-15融合蛋白可以进一步连接至免疫球蛋白结构域。优选的免疫球蛋白结构域包含允许与其他免疫球蛋白结构域相互作用的区域，从而形成如上所提供的多链蛋白。例如，免疫球蛋白重链区(例如IgG1 CH2-CH3)能够稳定地相互作用以产生Fc区。包括Fc结构域的优选的免疫球蛋白结构域还包含具有效应子功能(包括Fc受体或补体蛋白结合活性)和/或具有糖基化位点的区域。在一些方面，融合蛋白复合物的免疫球蛋白结构域包含降低或增强Fc受体或补体结合活性或糖基化或二聚化的突变，从而影响所得蛋白的生物活性。例如，可以将含有降低与Fc受体结合的突变的免疫球蛋白结构域用于产生本发明的融合蛋白复合物，所述复合物对携带Fc受体的细胞具有较低的结合活性，这对于被设计为用于识别或检测特定抗原的试剂可能是有利的。
核酸和载体
本发明进一步提供了核酸序列，并且特别是编码本发明融合蛋白(例如TxM的组分)的DNA序列。优选地，DNA序列由适合于染色体外复制的载体(例如噬菌体、病毒、质粒、噬菌粒、粘粒、YAC或附加体)携带。特别地，可以将编码所希望的融合蛋白的DNA载体用于促进本文描述的制备方法并获得显著量的融合蛋白。可以将DNA序列插入适合的表达载体中，即含有针对所插入的编码蛋白的序列的转录和翻译所必需的元件的载体。可利用多种宿主-载体系统来表达编码蛋白的序列。这些包括感染病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物(如含有酵母载体的酵母，或用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌)。取决于所利用的宿主-载体系统，可以使用许多适合的转录和翻译元件中的任何一种。参见，Sambrook等人，同上和Ausubel等人，同上。
本发明包括用于制备可溶性融合蛋白复合物的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入编码第一和第二蛋白的如本文描述的DNA载体；在足以在细胞或培养基中表达融合蛋白并允许第一蛋白的IL-15结构域和第二蛋白的可溶性IL-15Rα结构域之间缔合以形成可溶性融合蛋白复合物的条件下，在培养基中培养所述宿主细胞；从这些宿主细胞或培养基纯化可溶性融合蛋白复合物。
通常，根据本发明的优选DNA载体包含通过以5'至3'方向的磷酸二酯键连接的核苷酸序列，其中用于引入编码生物活性多肽的第一核苷酸序列的第一克隆位点可操作地连接至编码效应子分子的序列。
由DNA载体编码的融合蛋白组分可以按盒式形式提供。术语“盒”是指每种组分可通过标准重组方法容易地取代另一种组分。特别地，当编码的融合复合物有待被用于对抗可能具有血清型或具有发展为血清型的能力的病原体时，特别需要以盒式形式配置的DNA载体。
为了使载体编码融合蛋白复合物，通过使用适合的连接酶将编码生物活性多肽的序列连接至编码效应子肽的序列。可以通过从天然来源(例如从适合的细胞系)中分离DNA或通过已知的合成方法(例如磷酸三酯法)来获得编码呈递肽的DNA。参见，例如，Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成],IRL出版社(M.J.Gait,编辑,1984)。还可以使用可商购的自动寡核苷酸合成仪制备合成的寡核苷酸。一旦分离，编码生物活性多肽的基因可通过聚合酶链式反应(PCR)或本领域已知的其他方式扩增。用于扩增生物活性多肽基因的适合的PCR引物可以向PCR产物中加入限制性位点。PCR产物优选包括用于效应子肽和适当表达和分泌生物活性多肽-效应子融合复合物所必需的前导序列的剪接位点。PCR产物还优选地包括编码接头序列的序列，或用于连接这种序列的限制酶位点。
本文描述的融合蛋白优选地通过标准重组DNA技术产生。例如，一旦分离出编码生物活性多肽的DNA分子，就可以将序列连接到编码效应多肽的另一DNA分子上。可以将编码生物活性多肽的核苷酸序列与编码效应子肽的DNA序列直接连接，或更典型地，如本文所述编码接头序列的DNA序列可以在编码生物活性多肽的序列和编码效应子肽的序列之间插入，并使用适合连接酶连接。所得杂交DNA分子可以在适合的宿主细胞中表达以产生融合蛋白复合物。DNA分子以5'至3'方向彼此连接，使得在连接后，编码的多肽的翻译框架不被改变(即，DNA分子在框内彼此连接)。所得DNA分子编码框内融合蛋白。
其他核苷酸序列也可以包括在基因构建体中。例如，控制与效应子肽融合的编码生物活性多肽的序列表达的启动子序列，将融合蛋白导向细胞表面或培养基的前导序列，可以包括在构建体中，或存在于插入构建体的表达载体中。免疫球蛋白或CMV启动子是特别优选的。
在获得变体生物活性多肽、IL-15、IL-15Rα或Fc结构域编码序列时，本领域普通技术人员将认识到可以在不损失或减少生物活性情况下通过某些氨基酸取代、添加、缺失和翻译后修饰来修饰多肽。特别地，众所周知，保守氨基酸取代，即用一个氨基酸取代具有相似大小、电荷、极性和构象的另一个氨基酸不可能显著改变蛋白功能。作为蛋白成分的20种标准氨基酸可被大致分类为如下的四组保守氨基酸：非极性(疏水)组包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸；极性(不带电荷的，中性的)组包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；带正电荷的(碱性)组包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸；和带负电荷的(酸性)组包括天冬氨酸和谷氨酸。将蛋白中的一种氨基酸替换为在同一组中的另一种氨基酸不太可能对蛋白的生物活性产生不利影响。在其他情况下，可以对氨基酸位置进行修饰以降低或增强蛋白的生物活性。此类变化可以基于一个或多个靶残基的已知或假定的结构或功能特性被随机引入或经由位点特异性突变被引入。在表达变体蛋白后，可以使用结合或功能测定容易地评估由于修饰引起的生物活性的变化。
可以通过DNA杂交分析来确定核苷酸序列之间的同源性，其中双链DNA杂交体的稳定性取决于发生的碱基配对的程度。高温和/或低盐含量的条件降低了杂交体的稳定性，并且可以改变以防止具有低于所选同源性程度的序列的退火。例如，对于具有约55％G-C含量的序列，40-50C、6x SSC(氯化钠/柠檬酸缓冲液)和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的杂交和洗涤条件表明约60％-70％同源性；50-65C、1x SSC和0.1％SDS的杂交和洗涤条件表明约82％-97％同源性；并且52C、0.1x SSC和0.1％SDS的杂交和洗涤条件表明约99％-100％同源性。还可获得用于比较核苷酸和氨基酸序列(并且测量同源性程度)的各种计算机程序，并且在Ausubel等人(1999)的文献中发现了提供可商购和免费软件来源的列表。易于获得的序列比较和多序列比对算法分别是基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,1997)和ClustalW程序。BLAST可在万维网ncbi.nlm.nih.gov上的获得，并且ClustalW的版本可在2.ebi.ac.uk上获得。
融合蛋白的组分可以按几乎任何顺序组织，只要每个组分能够进行其预期的功能。例如，在一个实施方案中，生物活性多肽位于效应子分子的C或N末端。
本发明的优选效应分子将具有有助于这些结构域所预期的功能的大小。可以通过多种方法(包括众所周知的化学交联方法)制备本发明的效应分子并且融合至生物活性多肽。参见，例如，Means,G.E.和Feeney,R.E.(1974)在Chemical Modification of Proteins[蛋白的化学修饰],Holden-Day。还参见，S.S.Wong(1991)in Chemistry of ProteinConjugation and Cross-Linking[蛋白缀合物和交联化学],CRC出版社。然而通常优选使用重组操作来制备框内融合蛋白。
如上所述，根据本发明的融合分子或缀合物分子可以按若干种方式组织。在示例性构型中，生物活性多肽的C末端可操作地连接至效应子分子的N末端。如果需要，可以通过重组方法实现所述连接。然而，在另一种构型中，生物活性多肽的N末端连接至效应子分子的C末端。
可替代地或另外地，可根据需要将一种或多种另外的效应子分子插入生物活性多肽或缀合物复合物中。
载体和表达
可以采用许多策略来表达本发明的融合蛋白复合物(例如，TxM)的组分。例如，可以使用限制酶以在载体中形成用于插入构建体的切口然后连接来将编码本发明的融合蛋白复合物的一个或多个组分的构建体掺入适合的载体中。然后将包含基因构建体的载体引入适合宿主中用于表达融合蛋白。通常参见，Sambrook等人，同上。可以基于与克隆方案有关的因素凭经验做出对适合的载体的选择。例如，载体应与正在使用的宿主兼容，并具有针对所述宿主的适当的复制子。载体必须能够容纳编码待表达的融合蛋白复合物的DNA序列。适合的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞，优选那些易于转化并在培养基中显示出快速生长的细胞。具体地，优选的宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillus)等)，以及真核生物(如动物细胞和酵母菌株，如酿酒酵母)。哺乳动物细胞通常是优选的，特别是J558、NSO、SP2-O或CHO。其他适合宿主包括例如，昆虫细胞，如Sf9。采用常规培养条件。参见，Sambrook，同上。然后可以选择稳定转化或转染的细胞系。可以通过已知的方法测定表达本发明的融合蛋白复合物的细胞。例如，可以通过对连接的免疫球蛋白特异的ELISA和/或通过免疫印迹来确定连接至免疫球蛋白的融合蛋白复合物的表达。在以下实例部分中披露了用于检测融合蛋白表达的其他方法，这些融合蛋白包含与IL-15或IL-15Rα结构域连接的生物活性多肽。
通常如上所述，可以将宿主细胞用于制备目的以繁殖编码所希望的融合蛋白的核酸。因此，宿主细胞可包括其中特别预期产生融合蛋白的原核或真核细胞。因此，宿主细胞特别包括酵母、苍蝇、蠕虫、植物、蛙、哺乳动物细胞以及能够使编码融合物的核酸增殖的器官。可以使用的哺乳动物细胞系的非限制性实例包括CHO dhfr细胞(Urlaub和Chasm,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],77:4216(1980)),293cells[细胞](Graham等人,J Gen.Virol.[普通病毒学杂志],36:59(1977))或骨髓瘤细胞(如SP2或NSO(Galfre和Milstein,Meth.Enzymol.[酶学方法],73(B):3(1981))。
能够使编码所希望的融合蛋白复合物的核酸增殖的宿主细胞涵盖非哺乳动物真核细胞，也包括昆虫(例如，草地贪夜蛾(Sp.frugiperda))、酵母(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(P.pastoris)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)；如由Fleer,R.,Current Opinion inBiotechnology[当代生物技术观点],3(5):486496(1992)一般综述)、真菌和植物细胞。还考虑了某些原核生物(例如大肠杆菌和芽孢杆菌)。
可以通过用于转染细胞的标准技术将编码所希望的融合蛋白的核酸引入宿主细胞中。术语“转染(“transfecting”或“transfection”)”旨在涵盖用于将核酸引入宿主细胞的所有常规技术，包括磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、显微注射、病毒转导和/或整合。用于转染宿主细胞的适合的方法可以在Sambrook等人，同上，和其他实验室教材中发现。
根据本发明可以使用各种启动子(转录起始调节区)。适合的启动子的选择取决于所提出的表达宿主。可以使用来自异源的启动子，只要它们在所选的宿主中起作用即可。
启动子的选择还取决于所希望的效率和肽或蛋白产生的水平。通常使用诱导型启动子(如tac)，以显著增加大肠杆菌中蛋白表达的水平。蛋白的过量表达可能对宿主细胞有害。因此，宿主细胞生长可能是受限的。诱导型启动子系统的使用允许在诱导基因表达之前将宿主细胞培养至可接受的密度，从而促进更高的产物产量。
根据本发明可以使用各种信号序列。可以使用与生物活性多肽编码序列同源的信号序列。可替代地，还可以使用已经被选择或被设计为用于在表达宿主中有效分泌和加工的信号序列。例如，适合的信号序列/宿主细胞对包括用于在枯草芽孢杆菌中分泌的枯草芽孢杆菌sacB信号序列，和酿酒酵母α配对因子或用于毕赤酵母分泌的毕赤酵母酸性磷酸酶phoI信号序列。可以通过编码信号肽酶切割位点的序列将信号序列与蛋白编码序列直接连接，或通过由通常少于10个密码子组成的短核苷酸桥直接连接，其中所述桥确保下游TCR序列的正确阅读框。
已经鉴定了针对真核蛋白表达系统的用于增强转录和翻译的元件。例如，将花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子定位在异源启动子任一侧的1,000bp可以在植物细胞中将转录水平提高10至400倍。表达构建体还应包括适合的翻译起始序列。修饰表达构建体以包括用于适当翻译起始的科扎克(Kozak)共有序列可以将翻译水平提高10倍。
通常使用选择性标志物，所述标志物可以是表达构建体的一部分或与其分开(例如，由表达载体携带)，使得所述标志物可以在与目的基因不同的位点处整合。实例包括赋予抗生素抗性(例如，对于大肠杆菌宿主细胞，bla赋予氨苄青霉素抗性；对于多种原核和真核细胞，nptII赋予卡那霉素抗性)或允许宿主在基本培养基上生长(例如，HIS4使毕赤酵母或His-酿酒酵母在缺乏组氨酸的情况下生长)的标志物。选择性标志物具有其自身的转录和翻译起始和终止调节区，以允许标志物的独立表达。如果使用抗生素抗性作为标志物，则用于选择的抗生素的浓度将根据抗生素而变化，范围通常为从10至600μg抗生素/mL培养基。
通过使用已知的重组DNA技术组装表达构建体(Sambrook等人,1989；Ausubel等人,1999)。限制酶消化和连接是用于连接DNA的两个片段的基本步骤。DNA片段的末端可能需要在连接之前进行修饰，并且这可以通过以下各项来实现：填充突出端、用核酸酶(例如，ExoIII)使一个或多个片段的末端部分缺失、定点诱变或通过PCR添加新的碱基对。可以使用多聚接头和衔接子来促进所选片段的连接。表达构建体通常在使用多轮限制、连接和大肠杆菌转化的阶段中组装。适用于构建表达构建体的许多克隆载体是本领域已知的(λZAP和pBLUESCRIPT SK-1,Stratagene,La Jolla,CA,pET,诺瓦根公司(Novagen Inc.),麦迪逊，威斯康辛州，在Ausubel等人,1999中引用)并且特定的选择对于本发明并不重要。克隆载体的选择将受所选择的用于将表达构建体引入宿主细胞的基因转移系统的影响。在每个阶段结束时，可以通过限制、DNA序列、杂交和PCR分析来分析所得构建体。
可以将表达构建体作为克隆载体构建体(可以是线性的或环状的)转化到宿主中，或者可以从克隆载体中去除并按原样使用或引入到递送载体上。递送载体有助于在所选的宿主细胞类型中引入和维持表达构建体。通过许多已知的基因转移系统(例如，天然感受态、化学介导的转化、原生质体转化、电穿孔、生物射弹转化、转染或缀合)中的任何一种将表达构建体引入宿主细胞中(Ausubel等人,1999；Sambrook等人,1989)。取决于所用的宿主细胞和载体系统选择基因转移系统。
例如，通过原生质体转化或电穿孔可以将表达构建体引入酿酒酵母细胞中。酿酒酵母的电穿孔很容易完成，并产生与原生质球转化相当的转化效率。
本发明进一步提供了用于分离目的融合蛋白的生产方法。在所述过程中，其中已经引入与调节序列可操作地连接的编码目的蛋白的核酸的宿主细胞(例如，酵母、真菌、昆虫、细菌或动物细胞)在培养基中以生产规模生长，以刺激编码目的融合蛋白的核苷酸序列的转录。随后，从收获的宿主细胞或从培养基中分离目的融合蛋白。可以将标准蛋白纯化技术用于从培养基或从收获的细胞中分离目的蛋白。特别地，可以将纯化技术用于从各种实施装置(包括转瓶、旋式烧瓶、组织培养平板、生物反应器，或发酵罐)大规模地表达和纯化所希望的融合蛋白(即，以至少毫克的量)。
可以通过已知方法分离和纯化表达的蛋白融合复合物。通常将培养基离心或过滤，并然后通过亲和色谱法或免疫亲和色谱法(例如蛋白-A或蛋白-G亲和力色谱法或包括使用结合表达的融合复合物的单克隆抗体的免疫亲和方案)纯化上清液。可以通过已知技术的适当组合分离和纯化本发明的融合蛋白。这些方法包括，例如，利用溶解度的方法(例如盐沉淀和溶剂沉淀)；利用分子量差异的方法(例如透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)；利用电荷差异的方法(例如离子交换柱色谱法)；利用特异性亲和力的方法(例如亲和色谱法)；利用疏水性差异的方法(例如反相高效液相色谱法)；和利用等电点差异的方法(例如等电点聚焦电泳)，金属亲和柱(例如Ni-NTA)。对于涉及这些方法的披露内容一般参见Sambrook等人和Ausubel等人，同上。
优选本发明的融合蛋白基本上是纯的。换言之，融合蛋白已经与天然伴随其的细胞取代物分离，使得这些融合蛋白优选以至少80％或90％至95％均质性(w/w)存在。具有至少98％至99％均质性(w/w)的融合蛋白对于许多药物、临床和研究应用是最优选的。一旦基本上纯化，融合蛋白应基本上不含对于治疗应用的污染物。一旦部分纯化或达到基本纯度，可以将可溶性融合蛋白用于治疗，或用于进行本文披露的体外或体内测定。可通过多种标准技术(如色谱法和凝胶电泳)确定基本纯度。
本发明的融合蛋白复合物适用于体外或体内与多种细胞使用，这些细胞是癌细胞或被感染或可能被一种或多种疾病感染。
通过在抗原呈递细胞上表达的人IL-15受体α链(huIL-15Rα)，将人白介素-15(huIL-15)反式呈递至免疫效应子细胞。IL-15Rα主要通过细胞外sushi结构域(huIL-15RαSu)以高亲和力(38pM)结合huIL-15。如本文描述，可以将huIL-15和huIL-15RαSu结构域用作构建多结构域融合复合物的支架。
IgG结构域(特别是Fc片段)已经被成功用作针对许多治疗分子(包括批准的生物药物)的二聚体支架。例如，依那西普是与人IgG1的Fc结构域连接的可溶性人p75肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体(sTNFR)的二聚体。这种二聚化使依那西普在抑制TNF-α活性方面的效力比单体sTNFR高1,000倍，并提供具有比单体形式长五倍的血清半衰期的融合物。因此，依那西普在体内中和TNF-α的促炎活性方面和改善许多不同自身免疫适应症的患者结果方面是有效的。
除了其二聚化活性，通过补体活化和与在天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、吞噬细胞和树突细胞上展示的Fcγ受体相互作用，Fc片段还提供了细胞毒性效应子功能。在抗癌治疗性抗体和其他抗体结构域-Fc融合蛋白的背景下，这些活性可能在动物肿瘤模型和癌症患者中观察到的功效中起重要作用。然而，这些细胞毒性效应子应答在许多治疗应用中可能不足。因此，对改善和扩增Fc结构域的效应子活性以及对开发经由靶向治疗分子向疾病部位募集细胞溶解性免疫应答(包括T细胞活性)的其他方式产生了相当大的兴趣。IgG结构域已被用作支架以形成双特异性抗体，以改善由传统杂交瘤融合技术产生的产物的质量和数量。尽管这些方法绕过了其他支架的缺点，但是在哺乳动物细胞中难以按足以支持临床开发和使用的水平产生双特异性抗体。
为试图开发人衍生的免疫刺激多聚体支架，使用人IL-15(huIL-15)和IL-15受体结构域。huIL-15是细胞因子的小四α-螺旋束家族的成员，其以高结合亲和力(平衡解离常数(KD)约10-11M)与huIL-15受体α-链(huIL-15Rα)相缔合。然后将所得复合物反式呈递至在T细胞和NK细胞的表面上展示的人IL-2/15受体β/共γ链(huIL-15RβγC)复合物。这种细胞因子/受体相互作用导致效应子T细胞和NK细胞的扩增和活化，这些细胞在根除病毒感染和恶性细胞中起重要作用。通常，huIL-15和huIL-15Rα在树突细胞中共同产生以在细胞内形成复合物，这些复合物随后被分泌并在细胞表面上显示为异二聚体分子。因此，huIL-15和huIL-15Rα相互作用的特征表明这些链间结合结构域可以用作人衍生的免疫刺激支架，以制备能够靶特异性结合的可溶性二聚体分子。
如下文详细描述的，使用基于huIL-15:huIL-15RαSu-的支架来产生PD-L1/TGFβRII/TxM。二聚体融合蛋白复合物保留了它们的huIL-15结构域和结合结构域的免疫刺激和靶特异性生物活性指示添加huIL-15和huIL-15Rα并不显著改变融合结构域的空间排布，并且提供了足够程度的构象柔性而不影响细胞因子活性。因此，此支架可以用于形成多价融合复合物，例如PD-L1 TxM，从而增加分子的总体结合亲和力。在重组CHO细胞培养物中按较高水平产生可溶性融合蛋白(mg/升，在没有广泛细胞系筛选或优化的细胞培养物上清液中)，并且可以容易地从细胞培养物上清液中纯化。
除非另外指明，本发明的实施采用完全处于本领域技术人员的见识范围之内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在以下文献中加以充分解释，例如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验手册]”，第二版(Sambrook，1989)；“Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]”(Gait，1984)；“Animal Cell Culture[动物细胞培养]”(Freshney，1987)；“Methods inEnzymology[酶学方法]”“Handbook of Experimental Immunology[实验免疫学手册]”(Weir，1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[哺乳动物细胞用基因转移载体]”(Miller和Calos，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南]”(Ausubel，1987)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应])”，(Mullis，1994)；“Current Protocols in Immunology[免疫学实验指南]”(Coligan，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的产生，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施方案特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。
淋巴瘤
淋巴瘤是当B或T淋巴细胞比正常细胞分裂更快或比预期更长寿时，发生的一个类型的血癌。例如，B细胞淋巴瘤包括两种霍奇金氏淋巴瘤和大部分非霍奇金氏淋巴瘤。B细胞淋巴瘤表达CD20。
淋巴瘤可以在淋巴结、脾、骨髓、血液，或其他器官中发展。这些恶性细胞通常起源于淋巴结，呈现为淋巴结的增大，即淋巴样细胞的实体瘤。通过在显微镜下检查的淋巴结活检，即淋巴结的部分或全部切除。此检查可以揭示，指示淋巴瘤的组织病理学特征。治疗会涉及化疗、放射疗法，和/或骨髓移植。
给出以下实施例是为了给本领域普通技术人员提供如何进行和使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完整披露和描述，而不是旨在限制诸位发明人认为是自己的发明的范围。
实施例
实施例1：包含IL-15、抗PDL1，和TGFβRII结构域的融合蛋白复合物的产生和表征
用于治疗癌症或传染性疾病的重要治疗方法依赖于增强针对疾病细胞的免疫细胞活性。所述策略包括离体刺激免疫细胞，然后过继转移和/或直接增加患者体内的免疫细胞水平或活性。参与这些方法的免疫细胞可以是先天(即，NK细胞)或适应性(即，T细胞)免疫系统的免疫细胞。
用于增强免疫活性的一种方法是向免疫细胞提供免疫刺激细胞因子。此类细胞因子是本领域已知的，并且可以单独使用或与其他细胞因子或药剂组合使用。如下文详细描述的，我们产生了融合蛋白复合物，所述融合蛋白复合物包含：融合至可以与免疫检查点蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体(Ab)或抗体结合片段的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc支架，和能够结合TGFβ的TGFβRII结构域。这些融合蛋白复合物在与NK细胞的结合和经由细胞因子受体的信号传导细胞应答方面具有优势。Ig分子的Fc区形成二聚体以提供可溶性多种多肽复合物，出于纯化目的可以结合蛋白A并可以与能够介导ADCC和ADCP的NK细胞和巨噬细胞上的Fcγ受体相互作用。另外，IL-15N72D和IL-15RαSu结构域之间的相互作用提供了将IL-15N72D、TGFβRII和抗PDL1抗体(Ab)结构域(以及可能的其他蛋白结构域或药剂)连接成单一免疫刺激融合蛋白复合物的方式。
具体地，将TGFβRII单体或二聚体或单链的抗PDL1 Ab连接至IL-15N72D和IL-15RαSu/Fc链，制备构建体。在TGFβRII二聚体的情况下，多肽由两个TGFβRII组成，所述TGFβRII可以经由柔性接头序列连接以产生活性单链形式。在一些情况下，通过基因工程化的融合，将TGFβRII二聚体和/或抗PDL1 Ab连接至IL-15N72D和/或IL-15RαSu/Fc链的N末端。在其他情况下，用或不用接头，将TGFβRII多肽连接至IL-15RαSu/Fc链的C末端。下文描述了特定融合蛋白复合物，所述融合蛋白复合物包含：融合至TGFβRII和抗PDL1结合结构域的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc支架。
A：αPDL1/TGFβRII/TXM(N-810C)：产生了融合蛋白复合物，所述融合蛋白复合物包含TGFβRII二聚体/IL-15RαSu/Fc和抗PDL1-IL15N72D融合蛋白。
A1：TGFβRII/IL-15RαSu/Fc：人TGFβRII编码序列获得自UniProt网站，并且将其优化用于CHO细胞系转染。具体地，用接头将TGFβRII的编码序列连接至另一个TGFβRII，从而产生编码TGFβRII二聚体的序列，并且然后将此序列直接连接至编码IL-15RαSu/Fc链的N末端的一个序列，制备基因构建体。由金唯智公司(Genewiz Inc)合成构建体的DNA序列，并且将其用于分子克隆到表达载体中。
TGFβRII/IL-15RαSu/Fc构建体的核酸序列(包括信号肽序列)如下(SEQ ID NO:1)：
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(人TGFβRII)
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgat
(接头)
ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(人TGFβRII)
attcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
(人IL-15Rαsushi结构域)
atcacgtgtcctcctcctatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgcattaga
(人IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
gagccgaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcctggtaaa
be TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白的氨基酸序列(包括信号肽序列)(SEQ IDNO:2)如下：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人IL-15Rαsushi结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一些情况下，将前导肽从完整多肽上切割下来以产生可溶性或分泌的成熟形式。
A2：抗PDL1-15N72D：还经由重叠PCR，通过将合成的单链抗PDL1抗体核苷酸序列连接至IL-15N72D的N末端编码区，从而产生抗PDL1-15N72D，制备构建体。具体地，用编码柔性接头的序列连接抗PDL1 Ab的轻链和重链可变结构域序列，从而形成单链抗PDL1抗体构建体，然后将单链抗PD-L1序列连接至编码IL-15N72D的N末端的序列。由金唯智公司(GenewizInc)合成单链抗PDL1 Ab的序列，并且然后经由重叠PCR，将其连接至IL-15N72D的N末端编码区。构建体的核酸和蛋白序列如下所示，所述构建体包含连接至IL15N72D的N末端的单链抗PDL1 Ab。
抗PDL1/IL-15N72D构建体的核酸序列(包括前导序列)如下(SEQ ID NO:3)：
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(抗PDL1单链)
(抗PDL1轻链可变结构域)
aacatccagatgacccagtcccctagctccgtgtccgcctccgtgggagatcgggtgaccatcacctgtagggcctcccaggacatctccaggtggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgcctcctccctgcagtccggagtgcctagcaggttctccggctccggatccggcacagacttcgccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcaggccgactccaggttctccatcaccttcggccagggcaccaggctggagatcaagaggg
(接头)
ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(抗PDL1重链可变结构域)
gaggtgcagctggtgcagtccggaggaggactggtgcagcctggcggatccctgaggctgtcctgtgccgcttccggcttcaccttcagctcctactccatgaactgggtgaggcaggcccctggaaagggcctggagtgggtgtcctacatctccagctcctcctccaccatccagtacgccgactccgtgaagggcaggttcaccatctccagggacaacgccaagaactccctgtacctgcagatgaacagcctgagggacgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggggcgactattactacggcatggacgtgtggggccagggaaccaccgtgaccgtgtcctcc
(人IL-15N72D)
aactgggttaacgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacgacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttct
抗PDL1/IL-15N72D融合蛋白的氨基酸序列(包括前导序列)如下(SEQ ID NO:4)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗PDL1单链)
(抗PDL1轻链可变结构域)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(抗PDL1重链可变结构域)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(人IL-15N72D)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
在一些情况下，将前导肽从完整多肽上切割下来以产生可溶性或分泌的成熟形式。
共转染和蛋白纯化。将TGFβRII/IL-15RαSu/Fc和抗PDL1-IL15N72D构建体克隆到如先前所述的表达载体中(美国专利号8,507,222，实施例1，通过引用并入本文)，并将表达载体转染到CHO细胞中。在CHO细胞中两种构建体的共表达允许可溶性抗PDL1-IL15N72D:TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合物(被称为抗PDL1/TGFβRII/TxM)的形成和分泌。通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法从CHO细胞培养物上清液中纯化anti-PDL1/TGFβRII/TxM蛋白，产生由TGFβRII/IL-15RαSu/Fc二聚体和抗PDL1-IL15N72D融合蛋白组成的可溶性(非聚集的)融合蛋白复合物(图2)。
蛋白A纯化的抗PDL1-IL15N72D:TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合物的还原SDS-PAGE分析显示在图3中。观察到对应于可溶性抗PDL1-IL15N72D:TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白的条带分别位于约40kDa和约70kDa(图3和8)。
B：TGFβRII/αPDL1/TXM(N-810B)
对于第二种方法，产生的类似融合蛋白复合物包含TGFβRII-IL15N72D:抗PDL1-15RαSu/Fc融合蛋白。
B1：抗PDL1-15RαSu/Fc：经由重叠PCR，通过将合成的单链抗PDL1 Ab核苷酸序列连接至IL-15RαSu/Fc的N末端编码区，产生抗PDL1-15RαSu/Fc基因构建体。构建体的核酸和蛋白序列如下所示，所述构建体包含连接至IL-15RαSu/Fc的N末端的抗PDL1 Ab。
抗PDL1/IL-15RαSu/Fc构建体的核酸序列(包括信号肽序列)如下(SEQ ID NO:5)：
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(抗PDL1单链)
(抗PDL1轻链可变结构域)
aacatccagatgacccagtcccctagctccgtgtccgcctccgtgggagatcgggtgaccatcacctgtagggcctcccaggacatctccaggtggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgcctcctccctgcagtccggagtgcctagcaggttctccggctccggatccggcacagacttcgccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcaggccgactccaggttctccatcaccttcggccagggcaccaggctggagatcaagagg
(接头)
ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(抗PDL1重链可变结构域)
gaggtgcagctggtgcagtccggaggaggactggtgcagcctggcggatccctgaggctgtcctgtgccgcttccggcttcaccttcagctcctactccatgaactgggtgaggcaggcccctggaaagggcctggagtgggtgtcctacatctccagctcctcctccaccatccagtacgccgactccgtgaagggcaggttcaccatctccagggacaacgccaagaactccctgtacctgcagatgaacagcctgagggacgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggggcgactattactacggcatggacgtgtggggccagggaaccaccgtgaccgtgtcctcc
(人IL-15Rαsushi结构域)
atcacgtgtcctcctcctatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgcattaga
(人IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
gagccgaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcctggtaaa
抗PDL1/IL-15RαSu/Fc融合蛋白的氨基酸序列(包括信号肽序列)(SEQ ID NO:6)如下：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗PDL1单链)
(抗PDL1轻链可变结构域)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(抗PDL1重链可变结构域)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(人IL-15Rαsushi结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一些情况下，将前导肽从完整多肽上切割下来以产生可溶性或分泌的成熟形式。
B2：TGFβRII-IL15N72D：具体地，用接头将TGFβRII的连接至另一个TGFβRII，从而产生TGFβRII二聚体，并且然后将TGFβRII二聚体序列直接连接至IL15N72D的N末端的一个序列，制备构建体。由金唯智公司(GENEWIZ)合成编码TGFβRII-IL15N72D的DNA片段。
TGFβRII-IL15N72D构建体的核酸序列(包括信号肽序列)如下(SEQ ID NO:7)：
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(人TGFβRII)
atccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgat
(接头)
ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(人TGFβRII)
attcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgac
(人IL-15N72D)
aactgggttaacgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacgacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttct
TGFβRII-IL15N72D融合蛋白的氨基酸序列(包括前导序列)如下(SEQ ID NO:8)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人IL-15N72D)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
在一些情况下，将前导肽从完整多肽上切割下来以产生可溶性或分泌的成熟形式。
共转染和蛋白纯化：将TGFβRII二聚体/IL-15N72D和αPDL1/IL-15RαSu/Fc构建体克隆到如先前所述的表达载体中(美国专利号8,507,222，实施例1，通过引用并入本文)，并将表达载体转染到CHO细胞中。在CHO细胞中两种构建体的共表达允许可溶性TGFβRII/IL-15N72D:αPDL1/IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合物(被称为TGFβRII/αPDL1/TxM)的形成和分泌。
通过蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法从CHO细胞培养物上清液中纯化TGFβRII/anti-PDL1/TxM蛋白，产生可溶性(非聚集的)融合蛋白复合物(图5)。
蛋白A纯化的TGFβRII/抗PDL1/TxM融合蛋白复合物的还原SDS-PAGE分析显示在图6中。观察到对应于可溶性抗PDL1-IL15N72D:TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白的条带分别位于约50kDa和约60kDa(图6和8)。
C：αPDL1/TXM/TGFβRII(N-810A)
还产生的类似融合蛋白复合物包含IL15N72D和抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII。在这些构建体中，用或不用接头，将TGFβRII融合至抗PDL1-IL-15RαSu/Fc的C末端(图7)。
C1：IL15N72D：如先前描述制备IL15N72D构建体(美国专利号8,507,222，在实施例1中，通过引用并入本文)。
IL15N72D构建体的核酸序列(包括信号肽序列)如下(SEQ ID NO:9)：
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(人IL-15N72D)
aactgggttaacgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacgacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttct
IL15N72D蛋白的氨基酸序列(包括前导序列)如下(SEQ ID NO:10)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-15N72D)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
在一些情况下，将前导肽从完整多肽上切割下来以产生可溶性或分泌的成熟形式。
C2：抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII：制备两种构建体，用于此融合蛋白(图7)。在第一构建体中，将TGFβRII直接融合至抗PDL1/IL-15RαSu/Fc的C末端。在第二构建体中，将接头添加到TGFβRII和抗PDL1/IL-15RαSu/Fc之间，从而增加柔性。由金唯智公司(Genewiz)合成两个构建体，编码抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII的核酸序列。在TGFβRII序列的位置27处进行核酸突变(G至T)，从而在所述位置处产生Hap1限制性内切酶酶切位点，然而，不存在氨基酸序列改变。
C2A：抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII-没有接头：没有接头的抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII构建体的核酸序列(包括信号肽序列)如下(SEQ ID NO:11)：
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(抗PDL1单链)
(抗PDL1轻链可变结构域)
aacatccagatgacccagtcccctagctccgtgtccgcctccgtgggagatcgggtgaccatcacctgtagggcctcccaggacatctccaggtggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgcctcctccctgcagtccggagtgcctagcaggttctccggctccggatccggcacagacttcgccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcaggccgactccaggttctccatcaccttcggccagggcaccaggctggagatcaagagg
(接头)
ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(抗PDL1重链可变结构域)
gaggtgcagctggtgcagtccggaggaggactggtgcagcctggcggatccctgaggctgtcctgtgccgcttccggcttcaccttcagctcctactccatgaactgggtgaggcaggcccctggaaagggcctggagtgggtgtcctacatctccagctcctcctccaccatccagtacgccgactccgtgaagggcaggttcaccatctccagggacaacgccaagaactccctgtacctgcagatgaacagcctgagggacgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggggcgactattactacggcatggacgtgtggggccagggaaccaccgtgaccgtgtcctcc
(人IL-15Rαsushi结构域)
atcacgtgtcctcctcctatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgcattaga
(人IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
gagccgaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcctggtaaa
(人TGFβRII)
atccccccccacgtgcagaagtccgttaacaacgacatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagttcccccagctgtgcaagttctgcgacgtgaggttctccacctgcgacaaccagaagtcctgcatgtccaactgctccatcacctccatctgcgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtgtggcggaagaacgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgccacgaccccaagctgccctaccacgacttcatcctggaggacgccgcctcccccaagtgcatcatgaaggagaagaagaagcccggcgagaccttctttatgtgctcctgctccagcgacgagtgcaacgacaacatcatcttctccgaggagtacaacacctccaaccccgac
抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列(包括信号肽序列)(SEQID NO:12)如下：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗PDL1单链)
(抗PDL1轻链可变结构域)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(抗PDL1重链可变结构域)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(人IL-15Rαsushi结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(人TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
C2B：具有接头的抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII：具有接头的抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII构建体的核酸序列(包括信号肽序列)如下(SEQ ID NO:13)：
(信号肽)
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
抗PDL1单链
(抗PDL1轻链可变结构域)
aacatccagatgacccagtcccctagctccgtgtccgcctccgtgggagatcgggtgaccatcacctgtagggcctcccaggacatctccaggtggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgcctcctccctgcagtccggagtgcctagcaggttctccggctccggatccggcacagacttcgccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcaggccgactccaggttctccatcaccttcggccagggcaccaggctggagatcaagagg
接头)
ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(抗PDL1重链可变结构域)
gaggtgcagctggtgcagtccggaggaggactggtgcagcctggcggatccctgaggctgtcctgtgccgcttccggcttcaccttcagctcctactccatgaactgggtgaggcaggcccctggaaagggcctggagtgggtgtcctacatctccagctcctcctccaccatccagtacgccgactccgtgaagggcaggttcaccatctccagggacaacgccaagaactccctgtacctgcagatgaacagcctgagggacgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggggcgactattactacggcatggacgtgtggggccagggaaccaccgtgaccgtgtcctcc
(人IL-15Rαsushi结构域)
atcacgtgtcctcctcctatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgcattaga
(人IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
gagccgaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcctggtaaa
(接头)
ggaggaggtggctccggaggcggtggctccggtggaggtggctccggaggtggcggttccggt
(人TGFβRII)
atccccccccacgtgcagaagtccgttaacaacgacatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagttcccccagctgtgcaagttctgcgacgtgaggttctccacctgcgacaaccagaagtcctgcatgtccaactgctccatcacctccatctgcgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtgtggcggaagaacgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgccacgaccccaagctgccctaccacgacttcatcctggaggacgccgcctcccccaagtgcatcatgaaggagaagaagaagcccggcgagaccttctttatgtgctcctgctccagcgacgagtgcaacgacaacatcatcttctccgaggagtacaacacctccaaccccgac
具有接头融合蛋白的抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII的氨基酸序列(包括信号肽序列)(SEQ ID NO:14)如下：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗PDL1单链)
(抗PDL1轻链可变结构域)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(抗PDL1重链可变结构域)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(人IL-15Rαsushi结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人IgG1 CH2-CH3(Fc)结构域)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(人TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
共转染和蛋白纯化：将IL-15N72D和αPDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII构建体克隆到如先前所述的表达载体中(美国专利号8,507,222，实施例1，通过引用并入本文)，并将表达载体转染到CHO细胞中。在CHO细胞中两种构建体的共表达允许可溶性IL-15N72D:αPDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII融合蛋白复合物(被称为αPDL1/TxM/TGFβRII)的形成和分泌，可以通过蛋白A亲和及色谱方法纯化所述融合蛋白复合物，并且通过SDS-PAGE和SEC对其进行分析，从而证实纯度和适当的带型(图22)。
在一些情况下，将前导肽从完整多肽上切割下来以产生可溶性或分泌的成熟形式。
本发明的其他序列包括：
2x-TGFβRII-IL15(N72D)(SEQ ID NO:15)：
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactccatccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcagcatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgctccatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgacaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacgacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttcttaa
TGFβRII-IgG1-Fc(SEQ ID NO:16)：
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactccatccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcacgatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataa
TGFβRII-二聚体-IL15RaSu-IgG1-Fc(SEQ ID NO:17)：
atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactccatccccccccatgtgcaaaagagcgtgaacaacgatatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagtttccccagctctgcaagttctgcgatgtcaggttcagcacctgcgataatcagaagtcctgcatgtccaactgcacgatcacctccatctgcgagaagccccaagaagtgtgcgtggccgtgtggcggaaaaatgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgtcacgaccccaagctcccttatcacgacttcattctggaggacgctgcctcccccaaatgcatcatgaaggagaagaagaagcccggagagaccttctttatgtgttcctgtagcagcgacgagtgtaacgacaacatcatcttcagcgaagagtacaacaccagcaaccctgatggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtattcctccccacgtgcagaagagcgtgaataatgacatgatcgtgaccgataacaatggcgccgtgaaatttccccagctgtgcaaattctgcgatgtgaggttttccacctgcgacaaccagaagtcctgtatgagcaactgcacaatcacctccatctgtgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtctggcggaagaatgacgagaatatcaccctggaaaccgtctgccacgatcccaagctgccctaccacgatttcatcctggaagacgccgccagccctaagtgcatcatgaaagagaaaaagaagcctggcgagacctttttcatgtgctcctgcagcagcgacgaatgcaacgacaatatcatctttagcgaggaatacaataccagcaaccccgacatcacgtgtcctcctcctatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgtattagagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataa
IL15(N72D)(SEQ ID NO:18)：
Aactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttatccagtccatgcacatcgacgccaccctgtacaccgagagcgacgtgcacccctcctgcaaggtgaccgccatgaagtgcttcctgctggagctgcaggtgatctccctggagtccggcgacgcctccatccacgacaccgtggagaacctgatcatcctggccaacgactccctgtcctccaacggcaacgtgaccgagtccggctgcaaggagtgcgaggagctggaggagaagaacatcaaggagttcctgcagtccttcgtgcacatcgtccaaatgttcatcaacacttct
αPD-L1/SuFc/TGF-β(SEQ ID NO:19)：
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaaccaccggtgtccactccaacatccagatgacccagtctccatcttctgtgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcaggatattagccgctggttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaaactcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcgaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcgctctcactatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttactattgtcaacaggctgacagtcgtttctcgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaacgaggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagtgaggtgcagctggtgcagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatagcatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtttcatacattagtagtagtagtagtaccatacagtacgcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagacgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggggactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtgagctcaatcacgtgtcctcctcctatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgcattagagagccgaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcctggtaaaggaggaggtggctccggaggcggtggctccggtggaggtggctccggaggtggcggttccggtatccccccccacgtgcagaagtccgttaacaacgacatgatcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagttcccccagctgtgcaagttctgcgacgtgaggttctccacctgcgacaaccagaagtcctgcatgtccaactgcccaatcacctccatctgcgagaagcctcaggaggtgtgcgtggctgtgtggcggaagaacgacgagaacatcaccctggagaccgtgtgccacgaccccaagctgccctaccacgacttcatcctggaggacgccgcctcccccaagtgcatcatgaaggagaagaagaagcccggcgagaccttctttatgtgctcctgctccagcgacgagtgcaacgacaacatcatcttctccgaggagtacaacacctccaaccccgactga
此外，上述融合蛋白还可包含野生型IL-15而不是IL-15N72D变体的序列。例如，可以用编码野生型IL-15的核酸序列取代以上编码IL-15N72D结构域的核酸序列。本发明的序列可以是天然序列，或优化用于在宿主细胞中表达的那些序列，即密码子优化的序列。
野生型IL15蛋白结构域的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:20)：
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
N-810A
N-810A(αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/接头/IL15RαSuFc/接头/TGFβRII)蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:21)：
(IL-15(N72D))
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMQNCPITSICEKPQEVCVAVWRKQDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYQTSNPD。
N-810A未糖基化的TGFβRII*(αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/接头/IL15RαSuFc/接头/TGFβRII)(SEQ ID NO:22)的氨基酸如下：
(IL-15(N72D))
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMQNCPITSICEKPQEVCVAVWRKQDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYQTSNPD。
N-810A未糖基化的TGFβRII+Δ游离半胱氨酸*(αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/接头/IL15RαSuFc/接头/TGFβRII)(SEQ ID NO:23)的氨基酸如下：
((IL-15(N72D))
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMQNCPITSICEKPQEVCVAVWRKQDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYQTSNPD。
N-810A Δ绞链**(αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/接头/IL15RαSuFc/接头/TGFβRII)(SEQ ID NO:24)的氨基酸如下：
((IL-15(N72D))
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMNNCPITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD。
N-810A+(IL15-K41Q,L45S,I67T,N79Y,E93A)*(αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/接头/IL15RαSuFc/接头/TGFβRII)(SEQ ID NO:25)的氨基酸如下：
(IL-15-K41Q,L45S,I67T,N79Y,E93A)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMQCFLSELQVISLESGDASIHDTVENLTILANDSLSSNGYVTESGCKECEELEAKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCPITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD。
N-810A+(IL15-L45S)*(αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/接头/IL15RαSuFc/接头/TGFβRII)(SEQ ID NO:26)的氨基酸如下：
(IL15-L45S)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLSELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCPITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
N-810D
αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/IL-15(N72D)(SEQ ID NO:27)：
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
((IL-15(N72D))
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL15RαSuFc/接头/TGFβRII(SEQ ID NO:28)：
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCPITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
N-810D未糖基化的TGFβRII*
αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/IL-15(N72D)(SEQ ID NO:29)如下：
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
((IL-15(N72D))
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL15RαSuFc/接头/TGFβRII(SEQ ID NO:30)：
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMQNCPITSICEKPQEVCVAVWRKQDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYQTSNPD
N-810E
αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/IL-15(N72D)(SEQ ID NO:31)：
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
((IL-15(N72D))
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
TGFβRII/IL15RαSuFc(SEQ ID NO:32)：
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
N-810E未糖基化的TGFβRII*
αPD-L1轻链Fv/接头/αPD-L1重链Fv/IL-15(N72D)(SEQ ID NO 33)
(αPD-L1轻链Fv)
NIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYCQQADSRFSITFGQGTRLEIKR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重链Fv)
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(IL-15(N72D))
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
TGFβRII/IL15RαSuFc(SEQ ID NO:34)：
(TGFβRII)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMQNCPITSICEKPQEVCVAVWRKQDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYQTSNPD
(IL15RαSuFc)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
*在具有加下划线的残基内，注释了新点突变。
**用加删除线表示缺失。最终序列并不包括这些残基。
注意事项：所有未糖基化的版本、突变的游离半胱氨酸和/或铰链缺失版本也可以与IL15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A组合。
实施例2.包含IL-15、抗PDL1，和TGFβRII结构域的融合蛋白复合物的生物活性。将多种方法用于表征本发明的复合物的生物活性(图9)
IL-15免疫刺激活性：基于IL-15依赖性32Dβ细胞(小鼠造血细胞系)的增殖，评估αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物的IL-15免疫刺激活性。将增加水平的αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM或αPDL1/TGFβRII/TXM添加至在200μL RPMI:10％FBS培养基中的32Dβ细胞(104个细胞/孔)里，并将这些细胞在37℃下温育3天。然后添加PrestoBlue细胞活力试剂(20μL/孔)。4小时后，在570nm处测量吸光度(具有用于标准化的600nm参考波长)以通过代谢活性细胞，基于PrestoBlue(一种基于刃天青的溶液)的还原来确定细胞增殖。然后基于吸光度和蛋白浓度之间的关系确定针对αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM的IL-15生物活性的半最大有效浓度(EC50)。评估ALT-803的生物活性作为阳性对照。
如图10、13、14A和14B所示，αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物能够刺激32Dβ细胞的生长，证明这些蛋白保留了IL-15免疫刺激活性。
结合PD-L1：将基于流式细胞术的测定用于评估体外αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM与PD-L1的结合。具体地，在冰上，在黑暗中，将连续稀释的αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM、αPDL1/TGFβRII/TXM和抗PD-L1抗体对照与表达PD-L1的人H441肿瘤细胞(2.5×105个细胞)一起温育2小时。然后洗涤细胞，重悬，并且在4℃下，在黑暗中，用APC抗人IgG Fc抗体(克隆HP6017)染色30分钟。在洗涤两次后，将细胞重悬在250μl FACS缓冲液(磷酸盐缓冲液中的1％BSA和0.05％NaN3)中，并且保持在冰上，直至在具有BD FD FCS套件V1.0.6的BD FCSVerse流式细胞仪上进行分析。针对每一蛋白浓度，将平均荧光强度(MFI)量化。
如图12、13、15A和15B所示，αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物能够结合在人肿瘤细胞上表达的PDL1。类似地，图22显示通过表面等离子体共振(SPR)测定，αPDL1/TxM/TGFβRII复合物与PD-L1的结合。
TGFβ活性的抑制：TGFβ蛋白结合细胞表面上的受体，启动导致SMAD2和SMAD3(这二者然后与SMAD4形成复合物)的磷酸化和活化的信号传导级联。SMAD复合物转运到细胞核中并且结合细胞核中的SMAD结合元件(SBE)，导致TGF-β/SMAD应答基因的转录和表达。评估了αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物抑制TGF-β诱导的Smad2/3信号传导的能力。
按100μl的MEM培养基中5×104个细胞/孔的密度，将携带TGFβ/SMAD信号传导途径SEB报告分子(BPS Bioscience公司，#60653)的HEK293铺板在白色透明底96孔微板(康宁公司(Corning)3610)中，并且在37℃和5％CO2下温育过夜。24小时后，将孔改变为80μl新鲜的测定培养基中，并且在37℃和5％CO2下温育4小时。然后将10μl的连续稀释的αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM、αPDL1/TGFβRII/TXM或TGFβRII-Fc对照添加至每个孔并且温育1小时，随后添加10μl重组TGF-β1或TGF-β3(R&D系统公司(R&D Systems)，100ng/mL)至每个孔，从而达到100μl的总体积。在过夜温育后，添加100μl的ONE-StepTM萤光素酶试剂(BPSBioscience公司，#60690)，并且将板在室温下温育至少5分钟。使用GloMax Explorer酶标仪(普洛麦格公司(Promega))测量基于TGF-β诱导的Smad2/3信号传导的冷光。然后使用Graphpad Prism7软件，基于吸光度和蛋白浓度之间的关系确定αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM的TGF-β诱导的Smad2/3信号传导的半最大抑制浓度(EC50)。
如图11、13、16A、16B、17A和17B所示，αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物能够抑制TGF-β1诱导的Smad2/3信号传导。类似地，TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物还能够抑制TGF-β3诱导的Smad2/3信号传导(图17A，17B)。因此，这些复合物充当TGF-β陷阱分子并且预期阻断TGF-β蛋白的活性。值得注意地，与阳性对照TGFβRII-Fc蛋白相比，TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物两者显示了针对的TGF-β1和TGF-β3的更大抑制活性。
先前，已经显示在肿瘤细胞中，含有TGF-β陷阱结构域的蛋白具有对抗TGF-β1诱导的间质化(David等人，2017，OncoImmunology[肿瘤免疫学]6:10，e1349589)。预期αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物保留了此生物活性。如David等人提供，可以基于体外或体内肿瘤细胞间质标志物表达(即波形蛋白、纤连蛋白)、增殖抑制，和化疗抗性方面的TGF-β1介导的改变的抑制，评估这一点。
与TGFβ蛋白结合的蛋白的评估：将ELISA方法用于评估TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物与TGFβ1和TGFβ3的结合。具体地，用具有10％CSF的PBS中的TGFβ1和TGFβ3涂覆96孔ELISA板，在4℃下过夜。第二天，用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)洗涤板三次，并且在室温下，用PBS中的1％牛血清白蛋白封闭1小时。然后在室温下，将板与连续稀释的TGFβRII/αPDL1/TXM、αPDL1/TGFβRII/TXM或TGFβRII-Fc一起温育1小时。洗涤步骤后，在室温下，使用抗hIgG辣根过氧化物酶(HRP)(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immuno Research)，1:4,000稀释)检测蛋白结合30分钟。然后在底物显色后，使用BioTek酶标仪，在405nm下读取吸光度。
如图18A、18B、19A，和19B所示，TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物两者能够结合TGFβ1和TGFβ3，符合TXM蛋白阻断TGFβ1和TGFβ3介导的生物活性的能力。
类似地，图23显示通过表面等离子体共振(SPR)测定，αPDL1/TxM/TGFβRII复合物与TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的结合。
针对PD-L1阳性肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性：通过诱导天然杀伤细胞和CD8 T细胞效应子应答、阻断TFG-β蛋白或PD-1检查点抑制剂的免疫抑制作用，和/或靶向针对表达PD-L1的肿瘤细胞的免疫应答，TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM可以有效针对肿瘤。为了评估这些蛋白介导针对PD-L1阳性肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性，在37℃下，在不同浓度的TGFβRII/αPDL1/TXM、αPDL1/TGFβRII/TXM、抗PD-L1抗体、非靶向TXM(101074/TXM)或其他对照存在下，按1:10比率，一式两份培养Celltrace标记的PD-L1阳性人H441肺肿瘤细胞(2x105个细胞)与NK效应子细胞。20小时温育后，收获细胞并且重悬在PI溶液(2μg/ml)中，从而标记死细胞。然后通过流式细胞术测量死亡的Celltrace阳性PI阳性H441肿瘤细胞的百分比。
如图20和21所示，TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白复合物两者能够介导针对表达PD-L1的肿瘤细胞的ADCC。事实上，TGFβRII/αPDL1/TXM显示出比抗PD-L1IgG1抗体的等同摩尔浓度更大的ADCC。使用PD-L1阳性人HCC4006肺癌细胞、CaSki宫颈癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞观察到类似结果。另外，αPDL1/TXM/TGFβRII复合物显示出针对PD-L1阳性人癌细胞的ADCC活性(图22)。
PD-L1活性的抑制：除了评估针对PD-L1阳性肿瘤细胞的PD-L1结合活性和ADCC活性，我们评估了TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM复合物抑制PD-1阳性效应子细胞上的PD-L1的免疫抑制(检查点)活性的能力。在标准化的测定中，将表达人PD-L1和设计用来以抗原非依赖性方式活化同源TCR的工程化细胞表面蛋白的人工抗原呈递细胞(aAPC)与表达人PD-1和由NFAT应答元件驱动的萤光素酶报告分子的JurkatT细胞混合。当两种细胞类型共培养时，PD-1/PD-L1相互作用抑制TCR信号传导和NFAT-RE介导的冷光。添加阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗PD-1或抗PD-L1抗体结构域释放抑制信号并且导致TCR活化和NFAT-RE介导的冷光(图23)。在此测定中，使用标准程序评估TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM复合物的活性(图24)。将抗PD-L1抗体和PD-L1/TxM蛋白复合物(类似于TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM复合物，但是缺乏TGFβRII结构域)用作阳性对照。
如图25A和25B所示，αPDL1/TGFβRII/TXM、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TXM/TGFβRII复合物能够以剂量依赖方式，按与抗PD-L1 Ab对照类似的活性诱导NFAT-RE介导的冷光。这些结果证实了αPDL1/TGFβRII/TXM、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TXM/TGFβRII复合物保留了免疫检查点阻断活性。
N-810：图26A和26B证明与针对亲本对照分子(αPDL1/TxM，图26B)的活性相比，针对N-810(图26A)，人TGFβ特异性阻断活性。使用稳定的基于细胞萤光素酶报告分子系统(HEK-293T-luc2P/SBE)，从而评估特异性TGFβ阻断活性。在阻断剂存在或不存在下，用0.0175nM的重组人TGFβ1刺激培养的细胞20小时。用相对冷光单位(RLU)±SD表示对hTGFβ1的应答。
N-810Sorrento-Fc：图27A和27B证明与针对亲本对照分子αPDL1/TxM(图27B)的活性相比，针对N-810Sorrento-Fc(图27A)，特异性hTGFβ1阻断活性。使用稳定的基于细胞萤光素酶报告分子系统(HEK-293T-luc2P/SBE)，从而评估特异性TGFβ阻断活性。在阻断剂存在或不存在下，用0.0175nM的重组人TGFβ1刺激培养的细胞20小时。用相对冷光单位(RLU)±SD表示对hTGFβ1的应答。
N-810ΔC：图28A和28B证明与针对亲本对照分子αPDL1/TxM(图28B)的活性相比，针对N-810ΔC(图28A)，特异性hTGFβ1阻断活性。使用稳定的基于细胞萤光素酶报告分子系统(HEK-293T-luc2P/SBE)，从而评估特异性TGFβ阻断活性。在阻断剂存在或不存在下，用0.0175nM的重组人TGFβ1刺激培养的细胞20小时。用相对冷光单位(RLU)±SD表示对hTGFβ1的应答。
N-810D：图29A和29B是证明与针对亲本对照分子(αPDL1/TxM，图29B)的活性相比，针对N-810D(图29A)，特异性hTGFβ1阻断活性的图。使用稳定的基于细胞萤光素酶报告分子系统(HEK-293T-luc2P/SBE)，从而评估特异性TGFβ阻断活性。在阻断剂存在或不存在下，用0.0175nM的重组人TGFβ1刺激培养的细胞20小时。用相对冷光单位(RLU)±SD表示对hTGFβ1的应答。
TxM构建体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)：图30是证明在乳腺腺癌细胞(MDA-MB-231)中，TxM构建体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。使用抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，从而确定特异性αPD-L1活性。效应子细胞：haNK(NK-92衍生物)。
TxM构建体：图31A-31H是显示不同构建体的示意性图示。图31A：N-810A。图31B：未糖基化的N-810A。图31C：未糖基化的N-810A，Δ游离半胱氨酸。图31D：N-810A Δ铰链。图31E：N-810A(IL15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A)。IL15中的突变增强分子的溶解度和表达。图31F：N-810A(IL15-L45S)。IL15中的突变增强分子的溶解度和表达。图31G：N-810D。图31H：N-810E。
图32和表1证明IL15突变增加蛋白产量并且减少聚集。N-810D变异也增加产量并且减少聚集。
Figure BDA0002655406700000801
其他实施方案
虽然本发明已经结合其详细的描述进行了描述，但是前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及修饰都在以下权利要求书的范围之内。
本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可用的知识。本文引用的所有美国专利和公开的或未公开的美国专利申请都通过引用而并入。本文引用的所有公开的外文专利合专利申请都通过引用特此并入。本文引用的登录号指示的Genbank和NCBI提交内容通过引用特此并入。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献都通过引用特此并入。
虽然本发明参考其优选实施方案已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。

Claims (64)

1.一种分离的可溶性融合蛋白复合物，所述分离的可溶性融合蛋白复合物包含至少两种可溶性蛋白，其中
第一可溶性蛋白包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，并且第二可溶性蛋白包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)，其中所述免疫球蛋白Fc结构域融合至或连接至转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域；
所述第一和/或第二可溶性蛋白进一步包含结合结构域，所述结合结构域特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子，并且
所述第一可溶性蛋白的IL-15结构域结合所述第二可溶性蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。
2.如权利要求1所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述免疫球蛋白Fc结构域经由接头分子，连接至转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域。
3.如权利要求1所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一和第二可溶性蛋白之一进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子、或免疫信号传导分子的第二结合结构域。
4.如权利要求1、2或3所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15多肽是包含N72D突变的IL-15变体(IL-15N72D)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域包含通过多肽接头序列，共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。
6.如权利要求1-5中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族相关基因(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、组织因子(TF)、δ样蛋白4(DLL4)、单链DNA或T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(Tim-3)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述TGFβRII结构域结合转化因子β(TGFβ)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一融合蛋白复合物通过二硫键共价连接至第二融合蛋白复合物，所述二硫键将第一可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域连接至第二可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域。
10.一种可溶性融合复合物，所述可溶性融合复合物包含至少两种可溶性蛋白，第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中：
所述第一融合蛋白包含转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)二聚体，所述TGFβRII二聚体包含连接至第二TGFβRII结构域的第一TGFβRII结构域，其中所述TGFβRII二聚体融合至白介素-15(IL-15)多肽结构域；
第二融合蛋白包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)；
其中所述第二融合蛋白进一步包含结合结构域，所述结合结构域特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子，并且
其中所述第一融合蛋白的IL-15结构域结合所述第二融合蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。
11.如权利要求10所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15多肽是包含N72D突变的IL-15变体(IL-15N72D)。
12.如权利要求10或11中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域包含通过多肽接头序列，共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。
13.如权利要求10-12中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族相关基因(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、组织因子(TF)、δ样蛋白4(DLL4)、单链DNA或T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(Tim-3)。
14.如权利要求10-13中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)。
15.如权利要求10-14中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述TGFβRII特异性结合转化因子β(TGFβ)。
16.如权利要求10-15中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一融合蛋白复合物通过二硫键共价连接至第二融合蛋白复合物，所述二硫键将第一可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域连接至第二可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域。
17.一种可溶性融合复合物，所述可溶性融合复合物包含至少两种可溶性蛋白，第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中：
所述第一融合蛋白包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，所述多肽结构域融合至结合结构域，所述结合结构域特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子；
第二融合蛋白包含转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)二聚体，所述TGFβRII二聚体包含连接至第二TGFβRII结构域的第一TGFβRII结构域，其中TGFβRII二聚体和可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)融合至免疫球蛋白Fc结构域；其中所述第一或第二TGFβRII结构域融合至所述IL-15RαSu结构域，
其中所述第一融合蛋白的IL-15多肽结构域结合所述第二融合蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。
18.如权利要求17所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15多肽是包含N72D突变的IL-15变体(IL-15N72D)。
19.如权利要求17或18中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域包含通过多肽接头序列，共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。
20.如权利要求17-19中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族相关基因(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、组织因子(TF)、δ样蛋白4(DLL4)、单链DNA或T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(Tim-3)。
21.如权利要求17-20中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)。
22.如权利要求17-21中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述TGFβRII特异性结合转化因子β(TGFβ)。
23.如权利要求17-22中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一融合蛋白复合物通过二硫键共价连接至第二融合蛋白复合物，所述二硫键将第一可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域连接至第二可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域。
24.如权利要求1-23中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述疾病抗原与瘤形成、传染性疾病或自身免疫病相关。
25.一种核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、16、17、18、19或其组合。
26.如权利要求25所述的核酸序列，其中所述核酸序列进一步包含启动子、翻译起始信号，和与编码所述可溶性蛋白的序列可操作地连接的前导序列。
27.一种氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或其组合。
28.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求25所述的核酸序列或编码如权利要求27所述的氨基酸序列的核酸序列。
29.一种分离的可溶性融合蛋白复合物，所述分离的可溶性融合蛋白复合物包含至少两种可溶性蛋白，其中
第一可溶性蛋白包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，并且第二可溶性蛋白包含融合至免疫球蛋白Fc结构域的可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)，其中所述免疫球蛋白Fc(IgG Fc)结构域融合至或连接至糖基化的或未糖基化的转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域；
所述第一和/或第二可溶性蛋白进一步包含结合结构域，所述结合结构域特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子，并且
所述第一可溶性蛋白的IL-15结构域结合所述第二可溶性蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。
30.如权利要求29所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述免疫球蛋白Fc结构域经由接头分子，连接至转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域。
31.如权利要求29所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述免疫球蛋白Fc结构域是包含绞链区的IgG Fc变体，所述铰链区缺乏在残基位置70处的游离半胱氨酸。
32.如权利要求31所述的可溶性融合蛋白复合物，其中在残基位置70处，半胱氨酸被丝氨酸取代(IgG-FcC70S)。
33.如权利要求29所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述免疫球蛋白Fc结构域是缺乏铰链区的IgG-Fc变体。
34.如权利要求29所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一和第二可溶性蛋白之一进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子的第二结合结构域。
35.如权利要求29、30、31、32或33所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15多肽是包含以下的IL-15变体：N72D突变(IL-15N72D)、IL-15K41Q突变、IL-15L45S突变、IL-15I67T突变、IL-15N79Y突变、IL-15E93A突变，或其组合。
36.如权利要求35所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15多肽是包含L45S突变的IL-15变体。
37.如权利要求29-35中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域包含通过多肽接头序列，共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。
38.如权利要求29-37中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族相关基因(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、组织因子(TF)、δ样蛋白4(DLL4)、单链DNA或T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(Tim-3)。
39.如权利要求29-38中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)。
40.如权利要求29-39中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述TGFβRII结构域结合转化因子β(TGFβ)。
41.如权利要求29-40中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一融合蛋白复合物通过二硫键共价连接至第二融合蛋白复合物，所述二硫键将第一可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域连接至第二可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域。
42.一种分离的可溶性融合蛋白复合物，所述分离的可溶性融合蛋白复合物包含至少两种可溶性蛋白，其中
第一可溶性蛋白包含白介素-15(IL-15)多肽结构域，并且第二可溶性蛋白包含与免疫球蛋白Fc结构域融合的可溶性IL-15受体αsushi-结合结构域(IL-15RαSu)，
所述第一和/或第二可溶性蛋白进一步包含结合结构域，所述结合结构域特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子，并且
所述第一可溶性蛋白的IL-15结构域结合所述第二可溶性蛋白的IL-15RαSu结构域，从而形成可溶性融合蛋白复合物。
43.如权利要求42所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述免疫球蛋白Fc(IgG Fc)结构域进一步包含经由接头分子融合至或连接至IgG Fc结构域的糖基化的或未糖基化的转化生长因子-β受体类型2(TGFβRII)结构域。
44.如权利要求43所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述免疫球蛋白Fc(IgG Fc)结构域缺乏TGFβRII结构域。
45.如权利要求43-44中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述免疫球蛋白Fc结构域是包含绞链区的IgG Fc变体，所述铰链区缺乏在残基位置70处的游离半胱氨酸。
46.如权利要求45所述的可溶性融合蛋白复合物，其中在残基位置70处，半胱氨酸被丝氨酸取代(IgG-FcC70S)。
47.如权利要求42-46中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述免疫球蛋白Fc结构域是缺乏铰链区的IgG-Fc变体。
48.如权利要求42-47中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一和第二可溶性蛋白之一进一步包含特异性结合疾病抗原、免疫检查点分子或免疫信号传导分子的第二结合结构域。
49.如权利要求42-48中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述IL-15多肽是包含以下的IL-15变体：N72D突变(IL-15N72D)、IL-15K41Q突变、IL-15L45S突变、IL-15I67T突变、IL-15N79Y突变、IL-15E93A突变，或其组合。
50.如权利要求42-49中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域包含通过多肽接头序列，共价连接至免疫球蛋白重链可变结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域。
51.如权利要求42-50中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族相关基因(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、组织因子(TF)、δ样蛋白4(DLL4)、单链DNA或T细胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(Tim-3)。
52.如权利要求42-51中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述结合结构域特异性结合包含以下的一个或多个分子：程序性死亡配体1(PD-L1)。
53.如权利要求42-52中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物，其中所述第一融合蛋白复合物通过二硫键共价连接至第二融合蛋白复合物，所述二硫键将第一可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域连接至第二可溶性融合蛋白复合物的Fc结构域。
54.一种刺激受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1、10、17、29或42中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物。
55.一种刺激受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括：
从生物样品分离或分开免疫细胞；
使所述免疫细胞与如权利要求1、10、17、29或42中任一项所述的可溶性融合蛋白复合物接触，其中
将所述免疫细胞重新注入所述受试者体内；由此，
刺激所述受试者体内的免疫应答。
56.一种在有需要的受试者中治疗瘤形成和/或传染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含如权利要求1、10、17、29或42所述的可溶性融合蛋白复合物的药物组合物，从而治疗所述瘤形成或传染性疾病。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述瘤形成包括：胶质母细胞瘤、前列腺癌、血液癌、B细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、实体瘤、尿路上皮/膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、胃癌和食道癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌，或鳞状细胞头颈癌。
58.如权利要求56所述的方法，所述方法任选地包括向所述受试者施用一种或多种化学治疗剂。
59.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1、10、17、29或42所述的可溶性融合蛋白复合物、如权利要求25所述的核酸序列、如权利要求27所述的氨基酸序列或如权利要求28所述的表达载体。
60.一种在体外或体内抑制转化生长因子β(TGFβ)活性的方法，所述方法包括在体外使细胞与以下项接触或向有需要的受试者施用以下项：有效量的如权利要求1、10、17、29或42所述的可溶性融合蛋白复合物、如权利要求25所述的核酸序列、如权利要求27所述的氨基酸序列、如权利要求28所述的表达载体或如权利要求59所述的药物组合物，由此在体外或体内抑制转化生长因子β(TGFβ)活性。
61.一种在体内减少转化生长因子β(TGFβ)的量的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用以下项：治疗有效量的如权利要求1、10、17、29或42所述的可溶性融合蛋白复合物、如权利要求25所述的核酸序列、如权利要求27所述的氨基酸序列、如权利要求28所述的表达载体或如权利要求59所述的药物组合物，由此在体内减少转化生长因子β(TGFβ)的量。
62.一种在有需要的受试者中诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用以下项：有效量的如权利要求1、10、17、29或42所述的可溶性融合蛋白复合物、如权利要求25所述的核酸序列、如权利要求27所述的氨基酸序列、如权利要求28所述的表达载体或如权利要求59所述的药物组合物，由此在所述受试者中诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
63.一种在体内抑制转化生长因子β(TGFβ)介导的SMAD多肽的磷酸化和活化的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用以下项：治疗有效量的如权利要求1、10、17、29或42所述的可溶性融合蛋白复合物、如权利要求25所述的核酸序列、如权利要求27所述的氨基酸序列、如权利要求28所述的表达载体或如权利要求59所述的药物组合物，由此在体内抑制转化生长因子β(TGFβ)介导的SMAD多肽的磷酸化和活化。
64.一种表达载体，所述表达载体包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、16、17、18、19或其组合的核酸序列。
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