CN109890408A - 新表位疫苗组合物及其使用方法 - Google Patents

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A·赖斯
P·孙雄
K·尼亚兹
S·拉比扎德
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Nant Holdings IP LLC
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Nantessel Co
Etpeterses Corp
Nant Holdings IP LLC
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Abstract

在某些实施方案中，提供用于生成针对肿瘤新抗原或新表位的免疫应答的方法和组合物。在特定的实施方案中，可提供构建和产生基于重组腺病毒的载体疫苗的方法，所述载体疫苗含有编码肿瘤新抗原和新表位的核酸序列，其允许在对腺病毒具有预先存在的免疫力的个体中进行疫苗接种。在附加实施方案中，提供使用基于基于重组腺病毒的载体与工程化天然杀伤细胞组合的免疫疗法来治疗癌症的方法和组合物。在一些实施方案中，该方法和组合物进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸。

Description

新表位疫苗组合物及其使用方法
交叉引用
本申请要求2016年5月27日提交的美国临时专利申请第62/342,752号的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
通过鉴定相关靶抗原限制针对癌症的疫苗接种。因此，尽管在血液中检测到疫苗诱导的T细胞应答，但靶向肿瘤相关自身抗原的临床疫苗接种试验通常不能引发治疗性免疫。
回顾起来，这些失败可通过发现许多这些自身抗原在胸腺中表达，导致高反应性T细胞库的缺失和抑制性T调节细胞的发展来解释。此外，发现通过输注靶向此类抗原的基因工程T细胞来规避胸腺耐受性与重要体细胞组织中的严重毒性相关，这说明免疫耐受性对许多肿瘤相关抗原的生理学重要性。
因此，仍然需要发现用于增强对复杂疾病诸如癌症的治疗性应答的新型组合物和方法。
发明内容
在各个方面，本公开提供包含复制缺陷型载体的组合物，其中复制缺陷型载体包含编码肿瘤新抗原的核酸序列；以及编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在各个方面，本公开提供包含复制缺陷型载体的组合物，其中复制缺陷型载体包含编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列；以及编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在一些方面，复制缺陷型载体为腺病毒载体。在一些方面，腺病毒载体为Ad5载体。在一些方面，复制缺陷型载体包含E2b区域、E1区域、E3区域和E4区域中的缺失，或其任何组合。在一些方面，复制缺陷型载体包含E2b区域中的缺失。在一些方面，复制缺陷型载体包含E2b区域中DNA聚合酶、前末端蛋白(pTP)或其组合的缺失。在其他方面，复制缺陷型载体不为空壳载体。在一些方面，复制缺陷型载体包含多种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码序列。在一些方面，复制缺陷型载体包含至少十种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码核酸序列。在一些方面，复制缺陷型载体包含至少五种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码核酸序列。
在其他方面，免疫融合配偶体包含分枝杆菌属物种、结核分枝杆菌衍生的Ra12片段、衍生自革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白的蛋白质D、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区域、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPS肽模拟物、志贺毒素、白喉毒素、IL-15超激动剂、ALT-803、CRM197或其任何组合。在一些方面，免疫融合配偶体为分枝杆菌属物种的片段或衍生物、结核分枝杆菌衍生的Ra12片段、衍生自革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白的蛋白质D、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区域、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPS肽模拟物、志贺毒素、白喉毒素、IL-15超激动剂、ALT-803、CRM197或其任何组合。在一些方面，免疫融合配偶体与SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：109至SEQ ID NO：112中任一个的序列为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少90％同一。
在其他方面，复制缺陷型载体进一步包含编码接头的核酸序列。在一些方面，接头长1个至约150个核酸，长约5个至约100个核酸，或长约10个至约50个核酸。在其他方面，核酸序列编码氨基酸残基。在一些方面，氨基酸残基形成氨基酸序列。在一些方面，氨基酸序列包含1个至约50个氨基酸残基，约5个至约25个氨基酸残基或少于10个氨基酸残基。在一些方面，接头为聚丙氨酸接头或聚甘氨酸接头。在一些方面，接头包含丙氨酸和甘氨酸的混合物。在一些方面，编码接头的核酸序列位于编码肿瘤新抗原的核酸序列和编码免疫融合配偶体的核酸序列之间。在一些方面，接头为SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105中的任一个。
在其他方面，复制缺陷型载体包含编码一种以上肿瘤新抗原的一种以上核酸序列。在一些方面，该组合物为疫苗。在一些方面，该组合物包含药学上可接受的载体。在一些方面，该组合物包含至少十种腺病毒载体。在另外的方面，该组合物包含至少十种腺病毒载体。
在一些方面，肿瘤新抗原包含肿瘤新表位、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TP1/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1或其任何组合。在其他方面，肿瘤新抗原包含肿瘤新表位。在一些方面，肿瘤新抗原包含CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7或其任何组合。在一些方面，肿瘤新抗原为肿瘤新表位，该肿瘤新表位具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：22中任一个的氨基酸序列、SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：30中任一个的核苷酸序列，或者具有以下突变中的一个：基因SLC4A11的Q678P突变、基因SIGLEC1的D1143N突变、基因SIGLEC14的A292T突变、PIEZO2的T2356M突变、基因FAT4的S1613L突变、基因FCRL1的R268C突变，或基因VIPR2的V73M突变，或基因FLRT2的R346W突变。
在一些方面，复制缺陷型载体进一步包含编码共刺激分子的核酸序列。在一些方面，共刺激分子包含B7、ICAM-1、LFA-3或其任何组合。在一些方面，该组合物另外包含工程化天然杀伤(NK)细胞。在一些方面，工程化NK细胞包含已被修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制受体)表达的NK细胞、已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞，以及已被修饰以表达CAR(嵌合抗原受体)的NK细胞或其任何组合。在一些方面，工程化NK细胞包含已被修饰为基本上缺乏表达KIR的NK细胞。在一些方面，工程化NK细胞包含已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞。在其他方面，工程化NK细胞包含已被修饰以表达CAR的NK细胞。在一些方面，CAR为针对以下的CAR：肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TP1/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、或TEL/AML1。
在一些方面，组合物另外包含免疫刺激剂。在其他方面，免疫刺激剂选自由以下构成的组：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23和IL-32。在一些方面，组合物另外包含治疗有效量的IL-15或包含编码IL-15的核酸序列的复制缺陷型载体。在一些方面，该组合物另外包含癌症疗法。
在一些方面，癌症疗法为化学治疗剂量、放射剂量、免疫疗法或其任何组合。在一些方面，免疫疗法包含治疗有效量的包含复制缺陷型载体的组合物，所述复制缺陷型载体包含编码肿瘤相关抗原或肿瘤新抗原的核酸序列。在一些方面，如果化学治疗剂量和放射剂量单独存在，则化学治疗剂量和放射剂量的组合以低于推荐剂量的剂量存在于组合物中。在一些方面，癌症疗法为抗PD-1抗体pembrolizumab。
在其他方面，组合物另外包含治疗有效量的免疫途径限制点抑制剂。在一些方面，免疫途径限制点抑制剂包含治疗有效的组合物，该组合物包含结合免疫途径限制点配体的抗体。在一些方面，免疫途径限制点抑制剂为结合PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3或IDO的抗体。
在一些方面，复制缺陷型载体进一步包含编码报告分子的核酸序列。在一些方面，复制缺陷型载体包含编码附着于编码报告分子的核酸序列的肿瘤新抗原的核酸序列。在其他方面，复制缺陷型载体以大于或等于1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012或更多病毒颗粒(VP)的剂量存在。在一些方面，复制缺陷型载体以小于或等于每次免疫1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012或更多病毒颗粒的剂量存在。
在一些方面，肿瘤抗原对受试者具有特异性。
在一些方面，肿瘤新抗原由包含肿瘤特异性单核苷酸变体(SNV)的核苷酸序列编码。在一些方面，肿瘤新抗原驱动细胞介导的免疫应答或被确定以驱动细胞介导的免疫应答。在一些方面，肿瘤新抗原为具有六个至十个氨基酸大小的肽。在一些方面，CEA包含与SEQ ID NO：106具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，MUC1-c包含与SEQ ID NO：107具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，Brachyury包含与SEQ ID NO：108具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。
在各个方面，包含细胞的组合物包含如本文所述的组合物。在一些方面，细胞为树突细胞(DC)。
在各个方面，治疗有需要的受试者中的癌症的方法包括向受试者施用如本文所述的组合物。
在各个方面，治疗有需要的受试者中的癌症的方法包括向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含复制缺陷型载体，其中复制缺陷型载体包含编码肿瘤新抗原的核酸序列；以及编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在各个方面，监测受试者状态的方法包括a)向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含复制缺陷型载体，其中复制缺陷型载体包含编码受试者的肿瘤新抗原的核酸序列和编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及b)监测受试者中的肿瘤新抗原的状态。
在各个方面，检测受试者中的肿瘤的方法包括：a)向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含复制缺陷型载体，其中复制缺陷型载体包含编码肿瘤新抗原的核酸序列和编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及b)在施用之后检测受试者中的肿瘤新抗原的存在或不存在。
在各个方面，治疗有需要的受试者中的癌症的方法包括：a)向受试者施用癌症疗法；b)检测受试者中的肿瘤新抗原的存在；c)向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含复制缺陷型载体，其中复制缺陷型载体包含编码肿瘤新抗原的核酸序列和编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及d)重复步骤b)至步骤c)。
在各个方面，治疗有需要的受试者中的癌症的方法包括向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含细胞群体，其中细胞群体中的细胞包含复制缺陷型载体，并且其中复制缺陷型载体包含编码肿瘤新抗原的核酸序列和编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在各个方面，治疗有需要的受试者中的癌症的方法包括向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含复制缺陷型载体，其中复制缺陷型载体包含编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列；以及编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在各个方面，监测受试者状态的方法包括：a)向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含复制缺陷型载体，其中复制缺陷型载体包含编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列，以及编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及b)监测受试者中CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的状态。
在各个方面，检测受试者中的肿瘤的方法包括：a)向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含复制缺陷型载体，其中复制缺陷型载体包含编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列，以及编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及b)在施用之后检测受试者中CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的存在或不存在。
在各个方面，治疗有需要的受试者的癌症的方法包括：a)向受试者施用癌症疗法；b)检测受试者中CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的存在；c)向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含复制缺陷型载体，其中复制缺陷型载体包含编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列，以及编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及d)重复步骤b)至步骤c)。
在各个方面，治疗有需要的受试者中的癌症的方法包括向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含细胞群体，其中细胞群体中的细胞包含复制缺陷型载体，并且其中复制缺陷型载体包含编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列，以及编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在一些方面，复制缺陷型载体为腺病毒载体。在一些方面，腺病毒载体为Ad5载体。在一些方面，复制缺陷型载体包含E2b区域、E1区域、E3区域和E4区域中的缺失，或其任何组合。在一些方面，复制缺陷型载体包含E2b区域中的缺失。在一些方面，复制缺陷型载体包含E2b区域中DNA聚合酶、前末端蛋白(pTP)或其组合的缺失。在一些方面，复制缺陷型载体不为空壳载体。
在其他方面，复制缺陷型载体包含多种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码序列。在一些方面，复制缺陷型载体包含至少十种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码序列。在一些方面，复制缺陷型载体包含至少五种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码序列。
在一些方面，免疫融合配偶体包含分枝杆菌属物种、结核分枝杆菌衍生的Ra12片段、衍生自革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白的蛋白质D、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区域、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPS肽模拟物、志贺毒素、白喉毒素、IL-15超激动剂、ALT-803、CRM197或其任何组合。在一些方面，免疫融合配偶体可为分枝杆菌属物种的片段或衍生物、结核分枝杆菌衍生的Ra12片段、衍生自革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白的蛋白质D、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区域、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPS肽模拟物、志贺毒素、白喉毒素、IL-15超激动剂、ALT-803、CRM197或其任何组合。在一些方面，免疫融合配偶体与SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：109至SEQ ID NO：112中任一个的序列为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少90％同一。
在一些方面，复制缺陷型载体进一步包含编码接头的核酸序列。在一些方面，接头长1个至约150个核酸，长约5个至约100个核酸，或长约10个至约50个核酸。
在一些方面，核酸序列编码氨基酸残基。在一些方面，氨基酸残基形成氨基酸序列。在一些方面，氨基酸序列包含1个至约50个氨基酸残基，约5个至约25个氨基酸残基或少于10个氨基酸残基。在一些方面，接头为聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头。在一些方面，接头包含丙氨酸和甘氨酸的混合物。在一些方面，编码接头的核酸序列位于编码肿瘤新抗原的核酸序列和编码免疫融合配偶体的核酸序列之间。在一些方面，接头为SEQ ID NO：91至SEQID NO：105中的任一个。
在一些方面，复制缺陷型载体包含一种以上编码肿瘤新抗原的核酸序列。
在一些方面，药物组合物为疫苗。在一些方面，药物组合物包含药学上可接受的载体。在一些方面，药物组合物包含至少十种腺病毒载体。
根据权利要求66至100中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含至少五种腺病毒载体。
在一些方面，肿瘤新抗原包含肿瘤新表位、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TP1/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1或其任何组合。
在一些方面，肿瘤抗原包含肿瘤新表位。在一些方面，肿瘤新抗原包括CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7或其任何组合。在一些方面，肿瘤新抗原为肿瘤新表位，该肿瘤新表位具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：22中任一个的氨基酸序列、SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：30中任一个的核苷酸序列，或者具有以下突变中的一个：基因SLC4A11的Q678P突变、基因SIGLEC1的D1143N突变、基因SIGLEC14的A292T突变、PIEZO2的T2356M突变、基因FAT4的S1613L突变、基因FCRL1的R268C突变，或基因VIPR2的V73M突变，或基因FLRT2的R346W突变。
在一些方面，复制缺陷型载体进一步包含编码共刺激分子的核酸序列。在一些方面，共刺激分子包含B7、ICAM-1、LFA-3或其任何组合。
在一些方面，该方法进一步包括向受试者施用包含工程化天然杀伤(NK)细胞的附加药物组合物。在一些方面，工程化NK细胞包含已被修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制受体)表达的NK细胞、已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞，以及已被修饰以表达CAR(嵌合抗原受体)的NK细胞或其任何组合。在一些方面，工程化NK细胞包含已被修饰为基本上缺乏表达KIR的NK细胞。在一些方面，工程化NK细胞包含已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞。在一些方面，工程化NK细胞包含已被修饰以表达CAR的NK细胞。在其他方面，CAR为针对以下的CAR：肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TP1/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、或TEL/AML1。
在其他方面，该方法进一步包括向受试者施用包含免疫刺激剂的附加药物组合物。在一些方面，免疫刺激剂选自由以下构成的组：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23和IL-32。
在一些方面，该方法进一步包括向受试者施用附加药物组合物，该附加药物组合物包含治疗有效量的IL-15或包含编码IL-15的核酸序列的复制缺陷型载体。
在一些方面，在确定受试者患有肿瘤新抗原之前，已对受试者施用癌症疗法。在一些方面，癌症疗法为化学疗法、放射治疗、免疫疗法或其任何组合。在一些方面，免疫疗法包含治疗有效量的包含复制缺陷型载体的组合物，所述复制缺陷型载体包含编码肿瘤相关抗原或肿瘤新抗原的核酸序列。在一些方面，如果化学疗法和放射单独施用，则以低于推荐剂量的剂量施用化学疗法和放射的组合。在一些方面，癌症疗法为抗PD-1抗体pembrolizumab。
在一些方面，该方法进一步包括向受试者施用附加药物组合物，该附加药物组合物包含治疗有效量的免疫途径限制点抑制剂。在一些方面，免疫途径限制点抑制剂包含治疗有效的组合物，所述组合物包含结合免疫途径限制点配体的抗体。在一些方面，免疫途径限制点抑制剂为结合PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3或IDO的抗体。
在一些方面，复制缺陷型载体包含编码报告分子的核酸序列。在一些方面，复制缺陷型载体包含编码附着于编码报告分子的核酸序列的肿瘤新抗原的核酸序列。在一些方面，复制缺陷型载体以大于或等于1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012或更多病毒颗粒(VP)的剂量存在。在一些方面，复制缺陷型载体以小于或等于每次免疫1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012或更多病毒颗粒的剂量存在。
在一些方面，肿瘤新抗原对受试者具有特异性。在一些方面，肿瘤新抗原由包含肿瘤特异性单核苷酸变体(SNV)的核苷酸序列编码。在一些方面，肿瘤新抗原驱动细胞介导的免疫应答或被确定以驱动细胞介导的免疫应答。在一些方面，肿瘤新抗原为具有六个至十个氨基酸大小的肽。在一些方面，受试者在施用之前具有肿瘤新抗原。
在一些方面，该方法进一步包括确定受试者在施用期间或之后是否发展新的新抗原。在一些方面，肿瘤新抗原已经鉴定为将受试者的肿瘤样品的基因组谱与参照物进行比较的结果。
在一些方面，该方法进一步包括获得受试者的肿瘤样品的基因组谱。
在一些方面，该方法进一步包括将受试者的肿瘤样品的基因组谱与参照物进行比较以鉴定肿瘤特异性突变。在一些方面，获得基因组谱包括下一代测序、全外来体测序、合成测序、连接测序、单分子测序、用于单分子测序的纳米技术、离子半导体测序或其组合。
在一些方面，该方法进一步包括从肿瘤特异性突变中鉴定肿瘤新抗原。在一些方面，鉴定肿瘤新抗原包括使用蛋白质组学。
在一些方面，该方法进一步包括鉴定肿瘤新表位。
在一些方面，该方法进一步包括访问数据库以获得先前存储的受试者的基因组谱或参照物。
在一些方面，该方法进一步包括在施用药物组合物之后鉴定受试者中的附加肿瘤新抗原。
在一些方面，该方法进一步包括在施用药物组合物之后鉴定受试者中的附加肿瘤新抗原，施用附加药物组合物，该附加药物组合物包含附加复制缺陷型载体，该复制缺陷型载体包含对受试者的附加肿瘤新抗原。
在一些方面，该方法进一步包括监测已施用药物组合物的受试者中的肿瘤新抗原的状态。
在一些方面，癌症为胰腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈鳞状细胞癌或其任何组合。
在一些方面，肿瘤新抗原为受试者中存在的一种以上肿瘤新抗原。
在一些方面，药物组合物和另外的药物组合物同时施用。
在一些方面，细胞为树突细胞(DC)。
在一些方面，CEA包含与SEQ ID NO：106具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，MUC1-c包含与SEQ ID NO：107具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。在一些方面，Brachyury包含与SEQ ID NO：108具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。
在各个方面，治疗有需要的受试者中的癌症的方法包括：向受试者施用第一药物组合物，该药物组合物包含第一复制缺陷型载体，其中第一复制缺陷型载体包含编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列；或本文所述的任何组合物；以及向受试者施用第二药物组合物，该第二药物组合物包含第二复制缺陷型载体，其中复制缺陷型载体包含编码本文所述任何组合物的核酸序列。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。
图1.示出肿瘤新表位的鉴定的非限制性示例性实施方案
图2.示出基于癌症外显子组的肿瘤新表位的鉴定的非限制性示例性实施方案。分析肿瘤材料的非同义体细胞突变。RNA测序数据用于关注表达基因的突变。含有鉴定的非同义突变的任一种的肽段在计算机中生成，并且通过使用预测算法过滤或者用于鉴定质谱数据中的MHC相关的新表位。将突变对所得肽-MHC复合物的影响建模用作附加过滤器。所得表位组用于通过基于MHC多聚体的筛选和CD8和CD4T细胞群体内的功能测定来鉴定生理学上出现的新表位特异性T细胞应答。
图3.设计用于将肿瘤新表位插入Ad5[E1-，E2b-]平台的四种示例性基因构建体。
图4.用Ad5[E1-，E2b-]-UCLA-基因1-hTRICOM转染的A549细胞：48小时转染并且置于末端的Tricom的表达作为报告基因以验证置于报告元件之前的基因1的表达。
具体实施方式
虽然下面详细论述本发明的各种实施方案的制作和使用，但是应理解，本发明提供许多可在各种具体环境中实施的可应用的发明概念。本文论述的具体实施方案仅说明制造和使用本发明的具体方式，并不限制本发明的范围。
为了便于理解某些方面，下面定义许多术语。本文定义的术语具有本领域普通技术人员在与本发明相关的领域中通常理解的含义。
诸如“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”的术语不旨在仅指单个实体，而是包括可用于说明的特定示例的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是除了权利要求中所概述的之外，它们的使用不限制本发明。
“个体”、“受试者”或“患者”是指需要疗法的任何单个受试者，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物、狗或猪。任何参与临床研究试验但未显示任何疾病临床体征的受试者，或参与流行病学研究的受试者，或用作对照的受试者也旨在作为受试者包括在内。
如本文所用，术语“基因”是指功能性蛋白质、多肽或肽编码单元。如本领域技术人员所理解的，该功能性术语包括基因组序列、cDNA序列或其片段或组合，以及基因产物，包括可能已被人工改变的基因产物。纯化的基因、核酸、蛋白质等用于指当从至少一种通常与之相关的污染核酸或蛋白质中鉴定和分离时的这些实体。术语“等位基因”或“等位基因形式”是指编码相同功能性蛋白质但相对于相同基因的另一个版本包含核苷酸序列差异的基因的替代版本。
如本文所用，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链反应(PCR)生成的片段以及通过连接、切断、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任何生成的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸的单体(诸如DNA和RNA)，或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的α-对映体形式)或两者的组合组成。修饰的核苷酸可具有糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分的改变。糖修饰包括例如用卤素、烷基、胺和叠氮基替换一个或多个羟基，或者糖可官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可用空间和电子相似的结构替换，诸如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰的示例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶，或其他熟知的杂环取代基。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含附着于聚酰胺主链的天然存在的或修饰的核酸碱基。核酸可为单链或双链的。
如本文所用，除非另有说明，否则冠词“一个”意指一个或多个，除非另有明确规定。
如本文所用，除非另有说明，诸如“包含(contain)”、“含有(containing)”、“包括(include)”、“包括(including)”等术语意指“包含”。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“或”可为连接的或分离的。
如本文所用，除非另有说明，否则任何实施方案可与任何其他实施方案组合。
如本文所用，除非另有说明，本文的一些发明实施方案考虑数值范围。可以范围格式呈现各种方面。应理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对本发明范围的不灵活限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的各个数值，如同明确写出一样。例如，应该认为对诸如1至6的范围的描述具有特别公开的子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。当存在范围时，范围包括范围端点。
术语“腺病毒”或“Ad”是指来自腺病毒科的一组无包膜DNA病毒。除人宿主外，这些病毒可在禽类、牛类、猪类和犬类物种中找到，但不限于此。某些方面可考虑使用来自腺病毒科的四个属中的任何一个的任何腺病毒(例如，禽腺病毒(Aviadenovirus)、哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)、Atadenovirus和Siadenovirus)作为E2b缺失的病毒载体的基础，或含有如本文所述的其他缺失的载体。此外，在每个物种中都发现几种血清型。Ad还涉及这些病毒血清型中的任何的遗传衍生物，包括但不限于同源或异源DNA序列的遗传突变、缺失或转位。
“辅助腺病毒”或“辅助病毒”是指可供应特定宿主细胞不能供应的病毒功能的Ad(宿主可提供Ad基因产物，诸如E1蛋白)。该病毒用于反式供应缺乏第二种病毒或辅助依赖型病毒(例如，空壳或无内容(gutless)病毒，或针对特定区域诸如E2b或本文所述的其他区域缺失的病毒)的功能(例如，蛋白质)；据说第一种无复制能力的病毒“帮助”第二种辅助依赖型病毒，从而允许在细胞中产生第二种病毒基因组。
如本文所用，术语“腺病毒5无效(Ad5null)”是指不含任何用于表达的异源核酸序列的非复制性Ad。
如本文所用，术语“第一代腺病毒”是指缺失早期区域1(E1)的Ad。在其他情况下，也可缺失不必要的早期区域3(E3)。
如本文所用，术语“空壳”或“无内容”是指已经缺失所有病毒编码区域的腺病毒载体。
如本文所用，术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞中。转染可通过本领域已知的多种方法完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪法。
术语“稳定转染”或“稳定转染的”是指将外源核酸、DNA或RNA引入和整合至转染细胞的基因组中。术语“稳定转染子”是指将外源DNA稳定整合至基因组DNA中的细胞。
术语“报告基因”表示编码报告分子(包括酶)的核苷酸序列。“报告分子”可在多种检测系统中的任何一种中检测，包括但不限于基于酶的检测测定(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。
在一个实施方案中，可提供大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(可从新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech,Pistacataway,N.J.)获得)、绿色荧光蛋白(GFP)(可从加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆技术公司(Clontech,Palo Alto,Calif.)商购获得)、人胎盘碱性磷酸酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因作为报告基因；其他报告基因为本领域已知的并且可采用。
如本文所用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定沿着多肽(蛋白质)链上氨基酸的顺序。因此核酸序列编码氨基酸序列。
如本文所用，术语“异源核酸序列”是指与核酸序列连接的核苷酸序列，或者被操纵成与核酸序列连接的核苷酸序列，该核酸序列本质上没有被连接，或者本质上在不同位置处被连接。异源核酸可包括天然存在于其所引入的细胞中的核苷酸序列，或者异源核酸可包含相对于天然存在的序列的一些修饰。
术语“转基因”是指引入测试受试者的细胞或基因组中的任何基因编码区域，无论是天然或异源核酸序列还是融合的同源或异源核酸序列。在某些方面，转基因携带在用于将转基因引入受试者细胞的任何病毒载体上。
如本文所用，术语“第二代腺病毒”是指从病毒中缺失(去除)E1、E2、E3和(在某些实施方案中)E4DNA基因序列的全部或部分的Ad。
如本文所用，术语“片段或段”，在应用于核酸序列、基因或多肽时，长度通常为至少约5个连续的核酸碱基(对于核酸序列或基因)或氨基酸(对于多肽)，通常为至少约10个连续的核酸碱基或氨基酸，更通常为至少约20个连续的核酸碱基或氨基酸，通常为至少约30个连续的核酸碱基或氨基酸，优选为至少约40个连续的核酸碱基或氨基酸，更优选为至少约50个连续的核酸碱基或氨基酸，甚至更优选为至少约60个至80个或更多个连续的核酸碱基或氨基酸。如本文所用，“重叠片段”是指起始于核酸或蛋白质的氨基末端并终止于核酸或蛋白质的羧基末端的连续的核酸或肽片段。每个核酸或肽片段具有与下一个核酸或肽片段共同的至少约一个连续的核酸或氨基酸位置，更优选共同的至少约三个连续的核酸碱基或氨基酸位置，最优选共同的至少约十个连续的核酸碱基氨基酸位置。
核酸上下文中的重要“片段”为至少约17个核苷酸、通常至少20个核苷酸、更通常至少23个核苷酸、通常至少26个核苷酸、更通常至少29个核苷酸、通常至少32个核苷酸、更通常至少35个核苷酸、通常至少38个核苷酸、更通常至少41个核苷酸、通常至少44个核苷酸、更通常至少47个核苷酸、优选至少50个核苷酸、更优选至少53个核苷酸并且在特别优选的实施方案中将至少56个或更多个核苷酸的连续片段。
“载体”为可转导、转染、转化或感染细胞的组合物，从而使细胞表达非细胞天然的核酸和/或蛋白质，或者以非细胞天然的方式表达。当核酸从细胞外环境转移至细胞中时，细胞被核酸“转导”。可使用将核酸转移至细胞中的任何方法；除非另有说明，该术语并不暗示将核酸递送至细胞中的任何特定方法。当核酸被转导至细胞中并稳定复制时，细胞被核酸“转化”。载体包括由细胞表达的核酸(通常为RNA或DNA)。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞中的材料，诸如病毒颗粒、脂质体、蛋白质包衣等。“细胞转导载体”为编码一旦核酸被转导至细胞中就能在细胞中稳定复制和表达的核酸的载体。
当在多核苷酸序列的上下文中使用时，术语“变体”可包括与野生型基因相关的多核苷酸序列。该定义还可包括例如“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多态”变体。剪接变体可与参考分子具有显著的同一性，但由于mRNA加工过程中外显子的交替剪接，通常具有更多或更少数量的多核苷酸。对应的多肽可具有附加功能结构域或不存在结构域。物种变体为从一个物种到另一个物种不同的多核苷酸序列。在本发明中特别有用的为野生型靶基因的变体。变体可由核酸序列中的至少一个突变产生，并且可引起mRNA改变或其结构或功能可改变或可不改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可没有、具有一个或多个等位基因形式。产生变体的常见突变通常归因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。这些类型的变化中的每一种可单独发生，在给定序列中与其他变化组合发生一次或多次。
如本文所用，多肽的“变体”是指被一个或多个氨基酸残基改变的氨基酸序列。变体可具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质(例如，用异亮氨酸替换亮氨酸)。更罕见的是，变体可能具有“非保守”变化(例如，用色氨酸替换甘氨酸)。类似的微小变异也可包括氨基酸缺失或插入，或两者。可使用本领域熟知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR)，找到确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指导。
所得多肽通常相对于彼此具有显著的氨基酸同一性。多态变体为给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变异。多态变体还可包括“单核苷酸多态性”(SNP)或单碱基突变，其中多核苷酸序列因一个碱基而变化。
“抗原”为与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应的任何物质。“抗原结合位点”为特异性结合抗原的免疫球蛋白分子的一部分。另外，抗原结合位点包括任何抗原结合分子上的任何此类位点，包括但不限于MHC分子或T细胞受体。“抗原加工”是指抗原降解成片段(例如，蛋白质降解成肽)以及这些片段中的一个或多个(例如，通过结合)与MHC分子的结合，用于通过“抗原呈递细胞”呈递给特定的T细胞。
“树突细胞”(DC)为有效的抗原呈递细胞，能够在体内引发强烈的适应性免疫应答。已经显示，活化的成熟DC提供T细胞活化和增殖所需的信号。这些信号可分为两种类型。赋予免疫应答特异性的第一种类型通过T细胞受体/CD3(“TCR/CD3”)复合物与APC表面由主要组织相容性复合物(上文定义的“MHC”)I类或II类蛋白质所呈递的抗原肽之间的相互作用介导。称为共刺激信号的第二种类型信号，既不是抗原特异性也不是MHC限制性的，并且可在第一种类型信号存在的情况下引起T细胞的完全增殖反应和T细胞效应子功能的诱导。因此，这种双重信号传导可引起强烈的免疫应答。如上所述，在大多数非禽类脊椎动物中，DC来自骨髓衍生的前体。在外周血和脐带血以及胸腺中发现未成熟的DC。其他未成熟群体可能存在于其他地方。在脾、淋巴结、扁桃体和人体肠道中也发现各种成熟阶段的DC。禽类DC也可在法氏囊中发现，法氏囊为禽类特有的主要免疫器官。在具体实施方案中，树突细胞为哺乳动物，优选人、小鼠或大鼠。
“共刺激分子”包括任何单个分子或分子组合，当与由T细胞表面上的T细胞受体结合的肽MHC复合物一起作用时，提供共同刺激作用，其实现结合肽的T细胞的活化。
“诊断的”或“诊断”意指识别病理状况的存在或性质。诊断方法的敏感性和特异性不同。诊断测定的“敏感性”为测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。未通过该测定检测到的患病个体为“假阴性”。未患病且在测定中测试为阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为没有疾病测试阳性者的比例。虽然特定的诊断方法可能无法提供病况的明确诊断，但如果该方法提供有助于诊断的积极指示就足够。
在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括装置的固有误差变化、用于确定该值的方法，或研究对象之间存在的变化。
如在本说明书和权利要求(一个或多个)中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、包括(including)“(以及任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的含有，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)为包容性或开放式，不排除其他未列举的元件或方法步骤。如本文所用，短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤以及不实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤。如本文所用，短语“由......组成”不包括权利要求中未指定的任何元件、步骤或成分，除了例如通常与该元件或限制相关的杂质。
本文使用的术语“或其组合”是指该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果顺序在特定上下文中为重要的，则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该示例，明确地包括包含一个或多个项目或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，除非从上下文中另外明显，否则通常对任何组合中的项目或术语的数量没有限制。
如本文所用，近似的词语，诸如但不限于，“约”、“基本”或“基本上”是指当被如此修饰时被理解为不一定为绝对的或完美的条件，而是被认为足够接近本领域普通技术人员以保证指定该条件为存在的条件。描述可变化的程度将取决于可设置多大的变化，并且仍然使本领域普通技术人员认识到修饰的特征仍然具有未修饰特征的所需特征和能力。一般而言，但是根据前面的论述，本文由诸如“约”的近似词修饰的数值可从所述值变化至少±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、10％、12％或15％。
I.肿瘤抗原
在某些方面，方法可包括向受试者施用包含编码一种或多种肿瘤新抗原的核酸序列的药物组合物。在某些实施方案中，可在施用之前确定受试者具有肿瘤新抗原。在其他实施方案中，方法可包括施用药物组合物，该药物组合物包含编码肿瘤新抗原的核酸序列和编码免疫融合配偶体的核酸序列。在具体实施方案中，复制缺陷型腺病毒载体和/或部分E2b缺失的腺病毒载体可用于向受试者施用肿瘤新抗原。
1.免疫系统
免疫系统基于T细胞识别抗原的基本机制识别肿瘤细胞。T细胞在胸腺中成熟，其中T细胞受体(TCR)基因座的体细胞重排为每个T细胞产生独特的TCR。同样在胸腺内，通过称为阴性选择或中心耐受的过程缺失自身反应性T细胞。结果为对自身具有有限的反应性但对外来抗原具有强烈的反应性的成熟的T细胞库。T细胞上的TCR将抗原识别为与靶细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)结合的短肽(称为表位)。来自每种蛋白质的仅少数肽具有有利的生物化学特性，以允许它们从母本蛋白质中蛋白水解裂解并与MHC结合。
有两种类型的MHC分子由人白细胞抗原(HLA)基因编码：MHC I类(MHCI)和MHC II类(MHCII)。几乎所有有核细胞都表达MHCI，该MHCI向“杀伤性”CD8+T细胞呈递表位，也称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CTL可直接裂解在MHCI上显示同源表位的细胞，这被认为为抗肿瘤免疫的最重要机制。
专职抗原呈递细胞(APC)表达MHCII，该MHCII向CD4+T辅助细胞(Th)呈递表位。Th细胞可具有多种抗肿瘤功能，诸如直接杀伤肿瘤细胞、增强CD8+T细胞应答，以及活化先天抗肿瘤免疫细胞。最常见的是，T细胞识别来自病原体的抗原；然而，如果T细胞与健康组织中发现的自身蛋白质充分不同，T细胞也可识别肿瘤抗原。
2.肿瘤抗原
肿瘤抗原可包括肿瘤相关抗原(TAA)、癌症-种系/癌症睾丸抗原(CTA)和肿瘤特异性抗原(TSA)。
TAA包括在正常基因组中编码的蛋白质，并且可为正常分化抗原或异常表达的正常蛋白质。具有生长/存活促进功能的过表达的正常蛋白质，诸如Wilms肿瘤1(WT1)或Her2/neu，代表直接参与致癌过程的TAA。蛋白质的翻译后修饰诸如磷酸化也可引起TAA的形成。附加示例包括乳腺癌和卵巢癌上的人表皮生长因子受体2，以及多种癌症中的小鼠双微体2同源物。此外，在肿瘤起源组织中差异表达的蛋白质可产生“分化”抗原。例如，黑素瘤通常表达分化抗原MART1、gp100和酪氨酸酶。
由于TAA诸如分化和过表达的抗原为正常蛋白质并且也存在于健康组织中，因此它们的抗原性取决于异常表达水平或环境以规避自然发生的免疫耐受机制。在这些方面，由于胸腺阴性选择，TAA通常具有与TSA或外来抗原相比较低的T细胞受体(TCR)亲和力。此外，用免疫疗法靶向这些抗原会带来自身免疫毒性的风险。
另一种类型的肿瘤抗原包括CTA，其在睾丸、胎儿卵巢和滋养层中正常表达，但也可在癌细胞中表达。因为它们在正常基因组中编码但显示出高度限制的组织表达，所以CTA作为免疫疗法的有吸引力的靶标已经受到相当大的关注。
TSA为不在正常宿主基因组中编码的抗原，包括致癌病毒蛋白和由于体细胞突变而产生的异常蛋白(包括新抗原)。病毒来源的癌症表达可被免疫系统识别的病毒衍生的蛋白质。例如，来自人乳头瘤病毒的E6蛋白质和E7蛋白质构成理想的免疫疗法靶标。除致癌病毒蛋白外，在癌症发生和发展过程中，肿瘤细胞获得蛋白质改变突变，这些要么突变负责转化(驱动突变)，要么为伴随细胞转化的基因组不稳定性的副产物(乘客突变)。这些改变中的一些可能引起突变蛋白的表达，该突变蛋白被免疫系统感知为外来蛋白。这类抗原可能不太容易受到免疫耐受机制的影响，因此可能代表免疫介导的肿瘤控制的更明显的靶标。
3.肿瘤新抗原
肿瘤在肿瘤发生过程中发展数十至数千个编码突变。一小部分突变影响细胞表面蛋白的细胞外结构域，诸如EGFRvIII突变，为基于抗体的免疫疗法提供独特的靶标。然而，为了被T细胞识别，突变被加工并呈递在MHCI或MHCII上，产生所谓的新抗原。
当突变影响对MHCI或II具有亲和力的肽表位中的TCR接触残基或锚定残基时，可产生新抗原。甚至单个氨基酸取代也可产生与自身充分不同的表位，以标记肿瘤细胞用于T细胞介导的破坏。
通过用肿瘤反应性T细胞克隆筛选肿瘤衍生的cDNA文库，几项早期研究提供免疫系统识别新抗原的轶事示例。这些研究表明，新抗原可衍生自驱动基因和乘客基因两者，并且存在于许多不同类型的肿瘤中，包括黑素瘤、肾细胞癌、口腔鳞状细胞癌、结肠直肠癌、肺癌和慢性髓细胞白血病。一些研究表明，新抗原可能为TIL识别的主要抗原类别。此外，新抗原特异性T细胞应答与无论自发地还是疗法后的完全或部分肿瘤消退相关。
作为治疗靶标，新抗原与其他类型的肿瘤抗原相比具有几个优点。首先，新抗原特异性T细胞不受胸腺或外周耐受的影响；因此，高亲和力T细胞克隆可用于免疫疗法。值得注意的是，携带对其同源抗原具有高亲和力的TCR的T细胞具有更高的细胞毒性，在肿瘤环境中具有更长的持久性，并且对免疫抑制的易感性降低。第二，虽然分化和过表达的抗原由非肿瘤组织表达，但新抗原仅由肿瘤细胞表达，降低脱靶毒性的可能性。第三，虽然病毒抗原和CT抗原可能仅在有限数量的肿瘤中表达，但NGS已经揭示大部分肿瘤表达多种可潜在地充当T细胞靶标的突变基因产物。
例如，引起具有患者肿瘤特有的改变的氨基酸序列的蛋白质(例如，新抗原)的有用突变可包括：(1)引起蛋白质中不同氨基酸的非同义突变；(2)其中终止密码子被修饰或缺失的通读突变，引起在C末端具有新的肿瘤特异性序列的较长蛋白质的翻译；(3)剪接位点突变，引起在成熟mRNA中包含内含子，因此产生独特的肿瘤特异性蛋白质序列；(4)染色体重排，在2种蛋白质的连接处产生具有肿瘤特异性序列的嵌合蛋白质(即基因融合)；(5)移码突变或缺失，引起具有新颖肿瘤特异性蛋白质序列的新的开放阅读框架；等。可通过对肿瘤细胞与正常细胞中的DNA、RNA或蛋白质进行测序来鉴定具有突变的肽或突变多肽，该具有突变的肽或突变多肽来自于例如肿瘤细胞中的剪接位点、移码、通读或基因融合突变。
本文还包括衍生自常见肿瘤驱动基因的个体新抗原肽，其可进一步包括先前鉴定的肿瘤特异性突变。例如，可在万维网(www)sanger.ac.uk/cosmic上找到已知的常见肿瘤驱动基因和常见肿瘤驱动基因中的肿瘤突变。
II.用于鉴定肿瘤突变的核酸测定
在某些方面，提供用于鉴定肿瘤突变和肿瘤新表位或新抗原的核酸测定方法和组合物。本文公开的可为将核酸测定诸如癌症DNA的下一代测序与反向免疫学组合，以鉴定来自参与人癌症控制的独特肿瘤抗原和肿瘤表位的T细胞表位。在某些方面，最初的步骤为对来自患者肿瘤和正常组织的DNA或RNA进行测序，以鉴定产生新抗原(错义和neoORF)的突变，特别是在肿瘤细胞中表达的基因中。
在某些方面，可通过测序诸如全外显子组测序或全基因组测序分析肿瘤材料的肿瘤特异性突变，诸如非同义体细胞突变(图1或图2)。在某些方面，RNA测序数据用于关注表达基因中的肿瘤突变。在某些方面，含有鉴定的非同义肿瘤突变中的任何的肽段在计算机中产生，并且通过使用预测算法进行过滤或者用于鉴定质谱数据中的MHC相关的新表位。在某些方面，将肿瘤突变对所得肽-MHC复合物的影响的建模用作附加过滤器。在某些方面，MHC结合新表位组用于通过基于MHC多聚体的筛选和CD8T细胞群体和CD4T细胞群体两者内的功能测定来鉴定生理上出现的新表位特异性T细胞应答。
在一个实施方案中，通过使用下一代测序技术对来自癌症患者的肿瘤组织和健康组织的基因组和/或外显子组进行测序来确定突变的表位。在另一个实施方案中，使用下一代测序技术对基于其突变频率和充当新抗原的能力选择的基因进行测序。
下一代测序适用于基因组测序、基因组重测序、转录组性能分析(RNA-Seq)，DNA-蛋白质相互作用(ChIP-测序)和表观基因组表征。
下一代测序现在可快速揭示离散突变的存在，诸如个体肿瘤中的编码突变，最常见的为单个氨基酸变化(例如，错义突变)，以及通过移码插入/缺失/基因融合生成的较少频率的新颖氨基酸段，终止密码子中的通读突变和不正确剪接的内含子(例如，neoORF)的翻译。
NeoORF作为免疫原为有价值的，因为它们的全部序列对免疫系统为完全新颖的，因此类似于病毒或细菌外来抗原。因此，neoORF：(1)对肿瘤具有高度特异性(即，在任何正常细胞中都没有表达)；(2)可绕过中枢耐受性，从而增加新抗原特异性CTL的前体频率。
测序技术已经揭示每个肿瘤都含有多个患者特异性突变，该患者特异性突变改变基因的蛋白质编码含量。此类突变产生改变的蛋白质，范围从单个氨基酸变化(由错义突变引起)到由于移码、终止密码子的通读或内含子区域的翻译而添加新颖氨基酸序列的长区域(新颖开放阅读框突变；neoORF)。这些突变蛋白质为宿主对肿瘤免疫应答的有价值的靶标，因为与天然蛋白质不同，它们不受自身耐受性的免疫抑制作用。因此，与患者的正常细胞相比，突变蛋白更可能具有免疫原性并且对肿瘤细胞也更具特异性。
通过将测序反应与在相同仪器运行中的数亿个基因组片段的核苷酸掺入事件的检测组合，测序技术的进步已经改变我们解码癌症特异性突变的能力。
特别地，可使用大规模平行测序(MPS)方法鉴定肿瘤特异性或“体细胞”突变，以比较从肿瘤中分离的DNA与正常来源的DNA。
类似于使用MPS的基于DNA的测定，可通过转换成cDNA并构建适于测序的文库来分析来自肿瘤的RNA。
由于基因组很大(30亿个碱基对)及其分析复合物，杂交捕获技术的出现使得研究人员仅关注包含已知基因的编码外显子(即，“外显子组”)的1％的基因组。在此，设计用于结合注释基因的外显子序列的探针被合成、生物素化，并且在溶液中与片段化的全基因组文库杂交。随后使用链霉亲和素蛋白包被的磁珠捕获并分离探针结合的文库片段。通过变性从珠释放后，对文库片段进行扩增、定量和测序。
外显子组捕获可用于临床环境，但挑战可包括(a)在临床相关时间范围内获得信息，(b)可从核心活组织检查程序获得的少量DNA/RNA，(c)福尔马林和石蜡(福尔马林固定石蜡包埋的[FFPE])中的组织保存，这通过骨架交联促进核酸的降解，以及(d)数据解释。最近的技术创新将这种方法的时间从大约一周缩短至大约两小时，用于混合捕获。现在可生成外显子组捕获数据并在大约三天内产生一系列体细胞突变。杂交捕获还增强从肿瘤RNA(cDNA)测序获得的测序数据质量，特别是对于低产量和/或FFPE衍生的样品。
通过将序列读数与参考基因组比对来实现从外显子组捕获测序数据调用的突变，所述参考基因组用作分析由MPS平台产生的短读数长度(～100bp)的关键。一旦读数与基因组比对，使用若干算法鉴定变体以解释不同类型的突变，包括点突变(或单核苷酸变体[SNV])和集中的插入或缺失变体(插入缺失)。然后将肿瘤变体调用与来自使用类似捕获试剂获得的匹配的正常组织DNA的数据进行比较，以便鉴定肿瘤特有的(“体细胞”)突变。随后的注释步骤将核酸序列的变异转换成氨基酸序列的变化，从而提供鉴定和排序肿瘤新抗原所需的初始数据。
该过程的一个方面为预测由更“极端”突变引起的新抗原的能力。原则上，添加或缺失氨基酸或截短或延伸开放阅读框或由易位或反转产生的融合基因的变体可为高抗原性新表位的来源；然而，在过去，即使采用专门调整以检测这种类型突变的算法，也很难以高确定性检测到插入缺失变体。然而，最近的进展现在允许以相当高的确定性鉴定一些插入缺失，尽管包含高度重复区域的插入缺失仍然为困难的。结构变异也很难鉴定，特别是从外显子组捕获数据，因此除非RNA测序(RNA-Seq)数据可针对融合转录本(具有相关的高假阳性率)进行评估，否则不太可能容易检测到。在所有情况下，使用来自cDNA捕获测序(cDNACap-Seq)或RNA-Seq的RNA数据来鉴定和/或确认此类变体为至关重要的。
在某些方面，“参考”可用于关联和比较来自肿瘤标本的核酸测定方法中获得的结果以鉴定肿瘤突变。通常，“参考”可基于一个或多个正常标本，特别是不受癌症疾病影响的标本，从患者或一个或多个不同个体，特别是健康个体，特别是相同物种的个体获得。在其他方面，“参考”可通过测试足够大量的正常标本来凭经验确定。
预期可采用许多测定来鉴定生物样品中的肿瘤特异性突变或肿瘤新抗原或表位。此类测定包括但不限于下一代测序、蛋白质组学、阵列杂交、溶液杂交、核酸扩增、聚合酶链反应、定量PCR、RT-PCR、原位杂交、Northern杂交、杂交保护测定(HPA)(GenProbe)、分支DNA(bDNA)测定(Chiron)、滚环扩增(RCA)、单分子杂交检测(美国基因组公司(US Genomics))、Invader测定(ThirdWave科技公司(ThirdWave Technologies))和/或寡核苷酸连接测定(OLA)、杂交和阵列分析。
在某些方面，可提供一种或多种测序方法以鉴定用于疫苗免疫疗法的新表位。可对源自患者的样品进行测序，以利用基于腺病毒载体的疫苗鉴定用于靶向的可能的新表位。测序分析可与基因组学、生物信息学和免疫学方法组合以鉴定突变体肿瘤相关抗原和表位。
可使用任何合适的测序方法。特别地，可使用下一代测序或“NGS”。下一代测序方法可包括所有新型高通量测序技术，与称为桑格化学(Sanger chemistry)的“常规”测序方法相比，通过将整个基因组分成小块，沿着整个基因组随机平行读取核酸模板。
此类NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间内，例如1周至2周内、1天至7天内、或小于24小时内递送整个基因组、外显子组、转录组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息，并且原则上允许单细胞测序方法。可使用商业上可获得的或文献中提到的多个NGS平台，如本文所述，例如在Zhang等人2011:《下一代测序对基因组学的影响》《遗传基因组学》(J.Genet Genomics)38(3),95-109；或者在Voelkerding等人2009中详细描述的那些。
在某些方面，本文使用的NGS方法可包括索莱萨公司(Solexa)(现在为加利福尼亚州圣地亚哥Illumina公司(Illumina Inc.,San Diego,California)的一部分)开发的合成测序方法，该合成测序方法基于可逆染料终止剂并且例如在Illumina/Solexa GenomeAnalyzerTM和Illumina HiSeq 2000基因组分析仪中实施。在该技术中，将所有四种核苷酸与DNA聚合酶一起同时加入流动池通道中的寡聚体引物簇片段中。桥扩增用所有四种荧光标记的核苷酸延伸簇链以进行测序。
在某些方面，本文使用的NGS方法可包括通过连接测序方法，例如，在应用生物系统公司(Applied Biosystems)(现在的加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司(LifeTechnologies Corporation,Carlsbad,California))的SOLidTM平台中实施。在该技术中，根据测序位置标记固定长度的所有可能寡核苷酸库。将寡核苷酸退火并连接；通过DNA连接酶对匹配序列的优先连接产生该位置核苷酸的信号信息。在测序之前，通过乳液PCR扩增DNA。将所得珠沉积在载玻片上，每个珠仅含有相同DNA分子的拷贝。作为第二示例，多佛系统公司(Dover Systems)(新罕布什尔州塞勒姆(Salem,New Hampshire))的PolonatorTMG.007平台也采用连接测序方法，通过使用随机排列的基于珠的乳液PCR来扩增DNA片段以用于平行测序。
在某些方面，本文使用的NGS方法可包括单分子测序技术，例如，在太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)(加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park,California))的PacBio RS系统或螺旋生物科学公司(Helicos Biosciences)的HeliScopeTM平台(马萨诸塞州剑桥(Cambridge,Massachusetts))中实施的技术。该技术的独特特性为其能够在不扩增的情况下对单个DNA或RNA分子进行测序，这定义为单分子实时(SMRT)DNA测序。例如，HeliScope使用高灵敏度的荧光检测系统在合成时直接检测每个核苷酸。基于荧光共振能量转移(FRET)的类似方法已经由Visigen生物技术公司(Visigen Biotechnology)(得克萨斯州休斯敦(Houston,Texas))开发。其他基于荧光的单分子技术来自美国基因组学(GeneEngineTM)和Genovoxx(AnyGeneTM)。
在某些方面，本文使用的NGS方法可包括用于单分子测序的纳米技术，其中使用各种纳米结构，例如排列在芯片上以监测复制期间聚合酶分子在单链上的移动。基于纳米技术的方法的非限制性示例为牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore Technologies)(英国牛津(Oxford,UK))的GridONTM平台、由Nabsys公司(Nabsys)(罗德岛普罗维登斯(Providence,Rhode Island))开发的杂交辅助纳米孔测序(HANSTM)平台、利用DNA纳米球(DNB)技术的专有的基于连接酶的DNA测序平台，称为组合探针-锚定连接(cPALTM)，以及基于电子显微镜的单分子测序技术。
在某些方面，本文使用的NGS方法可包括离子半导体测序，该离子半导体测序基于在DNA聚合期间释放的氢离子的检测。例如，离子激流系统(Ion Torrent Systems)(加利福尼亚州旧金山(San Francisco,California))使用高密度微机械加工孔阵列以大规模并行方式执行该生物化学过程。每个孔都有不同的DNA模板。孔下面为离子敏感层，并且下面为专有的离子传感器。
在某些方面，本文使用的NGS方法可包括用于外显子组测序的几种靶向NGS方法(参见例如Teer和Mullikin 2010:《人类分子遗传学》(Human Mol Genet 19)(2),Rl 45-51)。这些方法中的许多(例如，描述为基因组捕获、基因组分配、基因组富集等)使用杂交技术并且包括基于阵列的(例如，Hodges等人2007:Nat.Genet.39,1522-1527)和基于液体的(例如，Choi等人2009:Proc.Natl.Acad.Sci USA106,19096-19101)杂交方法。还提供用于DNA样品制备和随后的外显子组捕获的商业试剂盒：例如，Illumina公司(Illumina Inc.)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,California))提供TruSeqTM DNA样品制备试剂盒和外显子富集试剂盒TruSeqTM外显子组富集试剂盒。
本文公开涉及使用基于panomics的测试的方法，该测试可利用患者肿瘤的全基因组测序或RNA测序或其任何组合。可利用全基因组测序或RNA测序的基于panomics的测试可将患者的肿瘤与患者的正常样品或参照物进行比较，以识别患者肿瘤的DNA和RNA中的分子改变。在某些情况下，基于全基因组的DNA和RNA测序可提供癌症患者分子改变的临床信息，这些改变可能导致异常蛋白质。异常蛋白质可包含可靶向的肿瘤新表位。
基于panomics的测试可能需要基因组分析。在一些情况下，基因组分析通过将肿瘤基因组序列与来自每个患者的正常基因组序列直接对比并且通过鉴定所表达的患者突变基因，可选择相关突变，包括单核苷酸变异(SNV)、拷贝数差异、插入、缺失、重排或其任何组合。
合适的样品可为任何患者样品。合适的样品可进行DNA或RNA提取。在一些情况下，对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)或新鲜冷冻样品进行测序分析。在某些情况下，可使用全血。可在测试前处理患者样品。在某些情况下，患者可捐献肿瘤样品。肿瘤样品可为实体肿瘤样品。肿瘤样品也可为液体肿瘤样品。在某些情况下，可富集样品。富集可包括增加肿瘤细胞特有的蛋白质浓度。任何合适的方法都可用于富集。在某些情况下，激光显微切割可用于富集样品。激光显微切割可使用质谱分析测量靶向和化学疗法的相关蛋白质的绝对量。
靶向富集方法可大致分为两类：PCR-扩增子和杂交捕获方法。由于基于PCR的方法可很容易地在诊断实验室中常规使用，因此它们非常适合现有的诊断工作流程。PCR可为高度特异性的并且具有比对比杂交方法生成更均匀覆盖的优点，前提为在汇集和测序之前充分标准化单独的PCR产物的浓度。
已经使用不同的策略来生成PCR扩增的文库。一些使用PCR产物的串联来生成片段文库；剪切PCR串联体并将其加入鸟枪文库制备中。与长读测序仪器兼容的更直接的方案为将序列衔接子合并至PCR引物的5'或3'末端，从而实现扩增子的汇集和直接测序。本文中可使用本领域可用的任何靶向富集方法。
在一些情况下，本文可使用Fluidigm，一种使用多层软光刻(MSL)的基于微流体的方法。微流体电路可由软橡胶复合材料制成，其允许通过使用压力在用于PCR的电路和反应室中产生微小阀门来控制试剂的流动。富鲁达公司(Fluidigm)最初开发用于实时定量PCR和单核苷酸多态性(SNP)基因分型应用，但最近已发布Access Array，允许检索用于靶向重测序应用的PCR产物。目前的Access Array系统能够通过48次单重测定对48个样品进行平行PCR反应。该平台的一个有吸引力的方面可为需要相对少量的模板(～50ng/样品)。还可多路测定分析以提高通量。
本文公开的还可为RainStorm(Raindance科技公司(Raindance Technologies))的使用。RainStorm涉及在油乳液中生成微滴，然后作为PCR的小型化反应室。该方法可用于从FFPE组织提取的DNA。另选地，本文可使用分子反转探针(MIP)。MIP为由通用接头序列拴系的序列特异性引物末端组成的长寡核苷酸。靶特异性引物末端与位于目标区域侧翼的互补DNA杂交。聚合酶延伸然后连接引起MIP的环化。然后通过滚环扩增或通过PCR从接头区域内的通用PCR引发位点扩增捕获的区域
在一些情况下，可使用RNA测序(RNA-seq)。在一些情况下，RNA群体(总的或分级的，诸如poly(A)+)可转换为cDNA片段文库，其中衔接子附着于一端或两端。然后每个分子，无论是否扩增，都可以高通量方式进行测序，以从一端(单端测序)或两端(双端测序)获得短序列。根据使用的DNA测序技术，读数通常可为30bp至400bp。
任何高通量测序技术可用于RNA-Seq，包括例如Illumina IG、应用生物系统SOLiD(Applied Biosystems SOLiD)和Roche 454生命科学系统(Roche 454Life Sciencesystems)。在其他情况下，Helicos生物科学tSMS系统(Helicos Biosciences tSMSsystem)可用于RNA-Seq研究。测序后，所得读数可与参考基因组或参考转录物比对，或者在没有基因组序列的情况下从头组装，以产生由每个基因的转录结构和/或表达水平组成的基因组规模的转录图谱。
在一些情况下，可使用大规模平行测序(MPS)(Simpson AJ,等人Nat RevCancer.2005；5(8)：615–625.)方法鉴定肿瘤特异性或“体细胞”突变，以比较从肿瘤与正常来源分离的DNA。类似于使用MPS的基于DNA的测定，可通过转换为cDNA并构建适于测序的文库来分析来自肿瘤的RNA。可设计探针以结合注释基因的外显子序列，该外显子序列可合成、生物素化，并在溶液中与片段化的全基因组文库杂交。随后可使用链霉亲和素蛋白包被的磁珠捕获和分离探针结合的文库片段。通过变性从珠释放后，对文库片段进行扩增、定量和测序。
在某些方面，外显子组捕获可用于测序方法。通过将序列读数与参考基因组比对，可实现从外显子组捕获测序数据调用的突变，这充当分析由MPS平台产生的短读数长度(～100bp)的关键。一旦读数与基因组比对，就可使用几种算法鉴定变体以解释不同类型的突变，包括点突变(或单核苷酸变体(SNV))和集中的插入或缺失变体(插入缺失)。然后将肿瘤变体调用与来自使用类似捕获试剂获得的匹配的正常组织DNA的数据进行比较，以便鉴定肿瘤特有的(“体细胞”)突变。随后的注释步骤将核酸序列的变异转换成氨基酸序列的变化，从而提供鉴定和排序肿瘤新表位所需的初始数据。在一些情况下，可使用来自cDNA捕获测序(cDNA Cap-Seq)或RNA-Seq的RNA数据来鉴定和/或确认新表位变体。
已经证明通过单核全基因组和全外显子组测序对体细胞变体的全面表征，其中nuc-seq方案描述实现超过90％的平均覆盖宽度。还可使用针对预测变体的更具成本效益的单细胞测序方案获得相关的克隆结构。这些生物信息学密集型方法对于为鉴定新表位的任何和所有方法创建必要的基础非常重要。
III.肿瘤新表位的鉴定
在一个实施方案中，分析源自确定癌症患者中突变的存在的测序数据，以预测可结合个体的HLA分子的个体突变肽。在一个实施方案中，使用计算机分析数据。在另一个实施方案中，分析序列数据中新抗原的存在。在一个实施方案中，新抗原通过它们对MHC分子的亲和力来确定。
有效地选择利用哪种特定突变作为免疫原涉及鉴定患者HLA类型和预测哪种突变肽将有效结合患者的HLA等位基因的能力。具有验证的结合和非结合肽的基于神经网络的学习方法提高主要HLA-A和-B等位基因的预测算法的准确性。利用先进的算法预测哪些错义突变产生与患者的同源MHC分子的强结合肽，可鉴定和优先考虑代表每个患者的最佳突变表位(neoORF和错义两者)的一组肽。
在某些方面，新表位预测算法用于预测候选肽与MHC I类分子或MHC II类分子的结合。在人类中，MHC I类抗原呈递途径负责将源自内源性细胞-内在蛋白的肽呈递给CD8CTL。内源蛋白质由蛋白酶体加工，所得8个至11个氨基酸肽通过与抗原加工(TAP)相关的转运蛋白转运至ER中，在那里它们被加载至新合成的I类分子上，并且稳定的肽-MHCI(p-MHCI)复合物被转运至细胞表面。在一些情况下，新表位可由MHC I类呈递。例如，新表位可为6至10聚体的肽。
本文公开的还可为使用用于预测肽与MHC I类结合的工具鉴定肿瘤衍生的新表位的方案。本文公开的还可为使用用于预测肽与MHC II类结合的工具鉴定肿瘤衍生的新表位的方法。
存在多种工具来预测肽与MHCI或MHCII的结合。提供一份全面的预测工具列表(可通过http://cancerimmunity.org/resources/webtools获取)。在一些情况下，肽结合工具可从包括以下内容的列表中选择：PAProC、NetChop、MAPPP、TAPPred、RankPep、MHCBench、HLA肽结合预测、PREDEP、nHLAPred-I、ProPred-1、SVMHC、EPIPREDICT、ProPred、NetMHC、NetMHCII、NetMHCpan、SMM、POPI、OptiTope、嵌合疫苗工具套件、HLABinding、抗原决定因子预测、ANTIGENIC、BepiPred、DiscoTope、ElliPro、抗体表位预测、CTLPred、NetCTL、MHC-I加工预测、表位聚类分析、表位保存分析、VaxiJen或其组合。其他程序诸如SYFPEITHI(Rammensee H,等人《免疫遗传学》1999；50(3–4):213–219)、Rankpep(Reche PA,等人《人类免疫学》(Hum Immunol.)2002；63(9):701–709)或者BIMAS(Parker KC,等人《免疫学》(JImmunol.)1994；152(1):163–175.)也可使用。
在一些情况下，免疫表位数据库和分析资源(IEDB)(Vita R,等人《核酸研究》2015；43(数据库问题):D405-D412)可用于鉴定合适的肿瘤新抗原。在一些情况下，这些算法可基于人工神经网络(ANN)预测肽与不同MHC I类变体的结合，提供预测的IC50作为输出。在一些情况下，可使用NetMHC(Lundegaard C,等人《核酸研究》2008；36(Web服务器问题):W509-W512.)。基于神经网络的方法可取决于训练集的质量和大小，因此对于更常见的等位基因可能更准确。在一些情况下，可使用诸如SMM(Peters B,等人《BMC生物信息学》2005；6:132)和SMMPMBEC(Kim Y,等人《BMC生物信息学》2009；10:394)的程序。这些程序使用位置权重矩阵来描述来自p-MHCI结合数据的统计偏好。该方法可抑制由实验误差和训练集中存在的有限数量的数据点引起的噪声。
在某些方面，从候选新抗原或新表位中去除SNP。有关SNP的信息可从单核苷酸多态性数据库获得：(dbSNP)，这为一个由国家生物技术信息中心(NCBI)与国家人类基因组研究所(NHGRI)合作开发和托管的不同物种内部和跨不同物种的遗传变异的免费公共档案。虽然数据库的名称仅包含一类多态性的集合(即单核苷酸多态性(SNP))，但它实际上包含一系列分子变异：(1)SNP，(2)短缺失和插入多态性(indels/DIPs)，(3)微卫星标记或短串联重复(STR)，(4)多核苷酸多态性(MNP)，(5)杂合序列，以及(6)命名变体。dbSNP接受明显中性的多态性、对应于已知表型的多态性和无变异的区域。它于1998年9月创建，用于补充基因库(GenBank)，NCBI公开收集的核酸和蛋白质序列。
在某些方面，提供一种用于鉴定肿瘤特异性新抗原的基于蛋白质组的方法，诸如直接蛋白质测序。使用包括串联质谱(MS/MS)的多维MS技术对酶消化产物进行蛋白质测序也可用于鉴定新抗原。此类蛋白质组学方法允许快速、高度自动化的分析。进一步预期用于未知蛋白质的从头测序的高通量方法可用于分析患者肿瘤的蛋白质组以鉴定表达的新抗原。例如，meta-shotgun蛋白质测序可用于鉴定表达的新抗原。
还可使用MHC多聚体鉴定肿瘤特异性新抗原以鉴定新抗原特异性T细胞应答。例如，可使用基于MHC四聚体的筛选技术进行患者样品中新抗原特异性T细胞应答的高通量分析。此类基于四聚体的筛选技术可用于肿瘤特异性新抗原的初始鉴定，或者可选地作为二级筛选方案，用于评定患者可能已经接触哪些新抗原，从而促进候选新抗原的选择。
可应用附加过滤器以消除(1)预测由免疫蛋白酶体处理不良的表位和(2)具有比对应的野生型序列更低的结合亲和力的表位。在某些方面，合成候选突变肽并筛选以鉴定T细胞新抗原。这种方法可非常有效地鉴定新抗原。
在某些方面，通过用包含最小T细胞表位的相对长的合成肽脉冲抗原呈递细胞来提供鉴定肿瘤新表位的另一种方法。在最近的一份报告中，通过评估CD4+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)对用包含单个突变的31个氨基酸长肽脉冲的自体B细胞的反应，在三个黑素瘤病变中鉴定出非同义突变表位。使用该方法导致鉴定突变的CIRH1A、GART、ASAP1、RND3、TNIK、RPS12、ZC3H18和LEMD2T细胞表位。此外，在最近的一份报告中，基于两个肽文库的组合进行肽筛选：(1)15聚体重叠长肽(2)基于MHC结合预测的肽。该筛选使得鉴定从卵巢肿瘤分离的突变的HSDL1反应性T细胞。
在某些方面，串联小基因筛选方法可用于鉴定肿瘤新表位。串联小基因构建体包含6个至24个小基因，其编码含有在其N-末端和C-末端侧接12个氨基酸的突变氨基酸残基的多肽。在某些方面，合成串联小基因构建体并用于转染共表达自体HLA分子的自体APC或细胞系。使用该方法，在两名黑素瘤患者中鉴定出突变的KIF2C和POLA2表位。此外，在一名患有胆管癌的患者中鉴定出突变的ERBB2IP表位。最近使用这种方法的研究已经使得鉴定出在胃肠癌、乳腺癌和卵巢癌上表达的突变抗原。值得注意的是，新抗原反应性可从具有相对低数量的突变的胆管癌或胃肠癌患者中分离的TIL中鉴定。
在某些方面，使用组合全外显子组/转录组测序分析、MHC结合预测以及质谱技术的方法来鉴定肿瘤新表位，以检测从HLA分子洗脱的肽。有趣的是，只有一小部分预测的高结合肽通过质谱确认。通过质谱法鉴定的相对少量的突变肽可能为由于肽纯化和质谱的灵敏度，但是它也可能表明天然抗原过程和细胞中的呈递可能为非常低效的。在通过该方法鉴定的7个新表位中，突变的Adpgk、Reps1和Dpagt1表位被确认具有免疫原性。
IV.肿瘤新表位优先排序
在某些方面，可提供基于一种或多种标准，诸如MHC结合亲和力、表位丰度、抗原加工和/或呈递对肿瘤新表位或新抗原进行优先排序的方法。这种鉴定的肿瘤新表位或新抗原可用于使用本文公开的腺病毒载体的靶向疫苗或免疫疗法中。
在某些方面，为了鉴定肿瘤衍生的突变表位，可使用诸如预测的p-MHCI结合亲和力的标准来生成候选新表位的初始优先列表。在一些情况下，对肿瘤新表位的天然免疫应答选择性地针对预测具有最强MHCI结合亲和力的组内的表位。
肽/MHCI结合可受两个附加参数-表位丰度和抗原加工(即蛋白质降解和肽转运)的影响。
在一些方面，质谱法可潜在地提供关于表位丰度的信息。在其他方面，如果检测到体细胞突变在RNA测序中存在或丰富，则可将其优先化为靶标新抗原。在另外的方面，可通过定量RNA表达水平间接估计表位丰度。在一种方法中，将由肿瘤与正常DNA比较定义的突变进行生物信息学分析以预测其免疫原性，并且通过RNA-Seq估计候选免疫刺激肽的水平。RNA评估提供关于(a)变体是否在RNA中表达和(b)突变等位基因相对于其他基因的表达水平的信息。在第二种方法中，可从肿瘤RNA进行cDNA捕获并与正常DNA比较以提供突变肽的列表。
在一些情况下，由于逆转录酶的错误率和RNA与DNA中的变体调用中的假阳性来源，通过应用一系列过滤器来去除已知的假阳性变体来源(例如，肿瘤或正常情况下的低覆盖率，或低数量的含变体的读数)并且消除非表达的基因和/或等位基因可进一步细化预测的突变。过滤器可消除低表达的基因。然后可对该过滤的突变肽组进行免疫原性预测的下游步骤。
存在附加算法来细化表位预测，包括那些侧重于定义蛋白酶体切割的预测(即，NetChop)(Nielsen M,等人《免疫遗传学》2005；57(1–2):33–41)和/或TAP转运(即NetCTL和NetCTLpan)(Peters B，等人《免疫学》2003；171(4)：1741–1749)。
本文公开的还可为用于预测MHC II类新表位的方法或工具。尽管MHC I类结合槽在两端封闭，但MHC II类具有开放的肽结合槽，引起可结合MHC II类的肽的长度和结合核心的位置的相当大的变化。可使用多种MHC II类结合预测算法，诸如可在本文使用的TEPITOPE(Hammer J,等人《实验医学》1994；180(6):2353–2358)；netMHCII(Nielsen M,等人《BMC生物信息学》2009；10:296)；和SMM-align(Nielsen M,等人《BMC生物信息学》2007；8:238)。
软件可用于鉴定突变体新表位。在一些情况下，可计算潜在新表位的结合亲和力。例如，NetMHCpan软件程序可潜在地预测突变体新表位。可使用任何合适的程序或算法来鉴定新表位。
新表位可对MHC分子具有任何亲和力，诸如小于10nmol/L、20nmol/L、30nmol/L、40nmol/L、50nmol/L、60nmol/L、70nmol/L、80nmol/L、90nmol/L、100nmol/L、110nmol/L、120nmol/L、130nmol/L、140nmol/L、150nmol/L、160nmol/L、170nmol/L、180nmol/L、190nmol/L、200nmol/L、210nmol/L、220nmol/L、230nmol/L、240nmol/L、250nmol/L、260nmol/L、270nmol/L、280nmol/L、290nmol/L、300nmol/L、310nmol/L、320nmol/L、330nmol/L、340nmol/L、350nmol/L、400nmol/L、450nmol/L、500nmol/L或任何中间范围或值。在一些情况下，强亲和力可为二分之一最大抑制浓度(IC50)<50nmol/L。在一些情况下，中等亲和力可为50<IC50<150。在一些情况下，对于HLA，弱亲和力可为150<IC50<500。在某些情况下，IC50>500可为低或没有亲和力。
在其他方面，本文可提供方法以鉴定最可能生成强烈免疫应答的肽，例如，通过使用预测肽结合至患者特异性I类HLA分子的裂口(cleft)的算法(例如，NetMHC、IEDB)。例如，在患有白血病的人类患者中的两项研究使用该方法来鉴定靶向HLA结合肽的CTL，该HLA结合肽衍生自已知致癌基因的突变区域、急性髓细胞白血病中的核磷蛋白和慢性髓细胞白血病中的BCR-ABL。
另外，为了进行新抗原的无偏倚搜索，例如，在最近的一份报告中，可使用全外显子组测序鉴定慢性淋巴细胞白血病患者中的所有白血病特异性突变。在具有鉴定的HLA等位基因的患者的子集内，可提供使用NetMHC以预测哪种突变的肽与患者特异性HLA结合的方法，在生物化学上验证它们的结合，并且确认靶向这些新抗原衍生肽的子集的CTL的存在。
此外，改进的预测规则(基于抗原加工中的附加步骤)可进一步改善几率。在某些方面，在新表位中，可优先考虑neoORF，因为它们提供长段的完全新颖蛋白质序列(其绕过中心耐受性并且在任何正常细胞中没有对应物)。
此外，可提供方法以优先考虑包含肿瘤细胞存活所需基因的突变的靶标(例如，“致癌驱动因子；”)或在表达减少时降低适配性的靶标，以及存在于所有癌细胞(即克隆)而不仅仅为亚群(即亚克隆)中的靶标。
在某些方面，蛋白质组学方法诸如MHC洗脱的肽的质谱法用于鉴定实际呈递的新表位。通过MHC分子预测可呈递性也可使用生物信息学策略。
在某些方面，基于算法的方法或工具可用于定义新表位与“自身”抗原的不相似性，诸如DAI算法。
在某些方面，可提供用于测量T细胞应答的方法以进一步选择肿瘤新抗原。可通过测量体外测量的T细胞活性来测试肿瘤新抗原体内观察到的抗肿瘤活性。具体地，可通过引发可在体外测量的CD8应答来表示以CD8依赖性方式引发肿瘤排斥的新表位。改进的高通量测定以高灵敏度和多因素的方式测量T细胞对大量抗原的活化，可帮助新表位发现。基于T细胞受体测序的测定可为一个此类示例。
V.基于肿瘤新抗原的癌症疗法
本文公开的可为用于鉴定可为患者癌症特有的变化的方法和组合物。在一些情况下，方法可用于选择特异于患者癌症的治疗性干预。在一些情况下，用疫苗靶向患者的肿瘤新表位可能为合适的方法。例如，下一代DNA或RNA测序技术可用于鉴定肿瘤新表位以用于疗法。可使用如本文公开的疫苗接种方法以及附加疗法。附加疗法的非限制性示例可包括附加免疫疗法、化学疗法、放射、基因疗法、靶向疗法或其组合。本文公开的疫苗方法还可包括施用包含复制缺陷型载体的组合物，其中复制缺陷型载体包含编码肿瘤新抗原的核酸序列；以及编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在一些情况下，患者可接受疗法，然后对患者样品进行测序。患者样品可进行测序(图1)。测序可鉴定癌症特异性SNV。可对SNV进行进一步检查以确定SNV是否在表达的蛋白质中。蛋白质可驱动MHC免疫。MHC可为I类或II类。具有任何MHC类型或HLA类型的患者可进行测序分析。
本文公开一种用于将癌症作为慢性疾病治疗的策略。在某些情况下，患者可对癌症样品进行测序。测序可鉴定肿瘤新表位。可将靶标新表位克隆至腺病毒载体中并用作疫苗接种。在一些情况下，患者的癌症可能发生突变，并且新的新表位可用于第二种疫苗接种方案。本文公开一种鉴定和利用肿瘤新表位以随着患者癌症进化而治疗患者癌症的方法。在某些情况下，癌症可能会发生变异以克服治疗。突变可生成新的肿瘤新表位，其可用本文公开的腺病毒载体靶向。
随着肿瘤的发展，它们可进化出许多亚克隆，并且这些亚克隆之间的基因表达可变化。此外，尽管大多数亚克隆共享负责支持肿瘤生长和存活的驱动突变；他们可能有更多变异的乘客突变(对于肿瘤存活不是必需的基因突变)。驱动突变与乘客突变的不均匀比率可能造成问题，因为它可能会迫使疫苗靶向可能不会在亚克隆中均匀表达并且可能对于存活不是必需的新表位。当考虑转移瘤之间的变异时，肿瘤变异变得更加复杂，该转移瘤仅源自原发性肿瘤的亚克隆子集。
本文公开一种用于随着癌症进化而治疗癌症的方法。在一些情况下，施用靶向新表位的疫苗。已经用新表位靶向疫苗治疗的患者可对样品进行二次测序以鉴定可能由肿瘤进化产生的新的新表位。肿瘤可进化为绕过治疗并继续持续存在。
某些方面涉及一种针对正在进化的癌症进行疫苗接种并将癌症作为慢性疾病进行治疗的治疗方法。患者可对样品进行测序，并且可在不同的时间点对样品进行附加测序。样品的测序可随时进行。测序可在预定义的时间点发生。在一些情况下，根据对治疗的响应确定时间点。在其他情况下，时间点为预先确定的。时间点可随时发生。时间点可为每周一次。时间点可为每月一次。时间点可为每年一次。在某些情况下，时间点也可能为每小时一次。可执行样品的测序以便鉴定随癌症进化的突变或新表位。新的新表位可用于疫苗接种或合适的靶向疗法。
某些方面涉及使用腺病毒载体生成针对各种新表位产生免疫应答的疫苗的方法，该腺病毒载体允许多次接种以生成针对肿瘤新表位的广泛反应性免疫应答。
一方面提供在受试者中生成针对几种肿瘤新表位的免疫应答的方法，包括向受试者施用腺病毒载体，该腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中该腺病毒载体在E2b区域具有缺失，和b)编码一个或多个肿瘤新表位的核酸；并且向受试者重新施用腺病毒载体至少一次；从而生成针对肿瘤新表位的免疫应答。在一些方面，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
另一方面提供用于在受试者中生成针对几种新表位的免疫应答的方法，其中该受试者具有对腺病毒的预先存在的免疫力，该方法包括：向受试者施用腺病毒载体，该腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区域具有缺失，和b)编码多个肿瘤新表位的核酸；并且向受试者重新施用腺病毒载体至少一次；从而生成针对肿瘤新表位的免疫应答。在一些方面，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
免疫系统可通过称为免疫编辑的过程来塑造肿瘤的克隆组成。免疫测定证明免疫系统发挥抗肿瘤反应的潜力；它可能对肿瘤多体靶向疫苗造成问题，因为免疫编辑可根除表达最具免疫原性的新表位的肿瘤细胞，因此为最好的疫苗靶标，只留下较低免疫原性和较不理想的靶标以通过测序获得。此外，免疫编辑肿瘤的生长证明靶向覆盖整个肿瘤亚克隆库的表位的重要性，并且不一定仅为显性新表位。本文公开一种靶向已进化的肿瘤的方法。
本文公开的可为一种治疗癌症的方法。例如，患者可用癌症疫苗治疗。在一些方面，癌症疫苗可包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。癌症疫苗治疗可与任何合适的二级疗法组合。二级疗法可包括免疫疗法、放射、化学疗法、放射疗法或其任何组合。
具有被选择用于计算机预测的良好MHC II类结合和丰富表达的突变的疫苗赋予有效的抗肿瘤控制。在一些情况下，免疫原性和非免疫原性突变的新表位靶标的MHC II结合评分的比较可鉴定合适的靶标。在一些情况下，与MHC I类表位相比，CD4T细胞对突变的识别对于结合MHC II类分子的肽可具有不太严格的长度和序列要求，从而增加在呈递的肽内发现给定突变的可能性。在一些情况下，可使用MHC II类新表位。在其他情况下，施用由靶向MHC I类和MHC II类的新表位的载体组成的文库。
如本文其他地方所述，表达构建体，特别是腺病毒载体，可包含编码一种或多种目标靶抗原的核酸序列，诸如将生成免疫应答的肿瘤新抗原或肿瘤新表位中的任何一种或多种。例如，靶抗原可包括但不限于在固体或液体肿瘤上鉴定的肿瘤新表位或新抗原。在一些方面，表达构建体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
表达构建体可用于许多疫苗设定中，用于生成针对如本文所述的一种或多种靶抗原的免疫应答。腺病毒载体具有特别重要的意义，因为它们可用于在对Ad具有预先存在的免疫力的受试者中生成免疫应答，并且可以用于包括使用腺病毒载体的多轮免疫的疫苗接种方案、使用前几代腺病毒载体不可能的方案。
通常，生成免疫应答包括诱导体液应答和/或细胞介导的应答。在某些实施方案中，期望增加针对目标靶抗原的免疫应答。由此，“生成免疫应答”或“诱导免疫应答”包括任何统计学上显著的变化，例如，一种或多种免疫细胞(T细胞、B细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、中性粒细胞等)的数量增加，或者这些免疫细胞中的一种或多种的活性(CTL活性、HTL活性、细胞因子分泌、细胞因子分泌曲线的变化等)的活性增加。
技术人员将容易理解，可获得许多用于确定是否发生免疫应答改变的方法。用于检测免疫应答改变(例如，细胞数量、细胞因子表达、细胞活性)的多种方法为本领域已知的，并且在某些方面为有用的。说明性方法在《免疫学的现行协议》(Current Protocols inImmunology)中有所描述，编辑者：John E.Coligan、Ada M.Kruisbeek、DavidH.Margulies、Ethan M.Shevach、Warren Strober(2001年约翰·威利父子公司，纽约州纽约市(2001John Wiley&Sons，NY，NY))Ausubel等人(纽约州纽约市格林·普伯尔公司和约翰·威利父子公司的2001年《分子生物学的现行协议》(2001Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY))；Sambrook等人(纽约州普莱恩维尤冷泉港实验室1989年《分子克隆》，第二版(1989Molecular Cloning,Second Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY))；Maniatis等人(纽约普莱恩维尤冷泉港实验室1982年《分子克隆》(1982MolecularCloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY))和其他地方。在该上下文中有用的说明性方法包括细胞内细胞因子染色(ICS)、ELISpot、增殖测定、细胞毒性T细胞测定，包括铬释放或等效测定，以及使用任何数量的聚合酶链式反应(PCR)或基于RT-PCR的测定的基因表达分析。
在某些实施方案中，与对照相比，生成免疫应答包括在施用腺病毒载体的受试者中靶抗原特异性CTL活性增加约1.5倍至20倍或更多倍。在另一个实施方案中，与对照相比，生成免疫应答包括在施用腺病毒载体的受试者中靶特异性CTL活性增加约1.5倍至20倍或更多倍。在另一个实施方案中，与对照相比，生成免疫应答包括通过ELISpot测定法测量的靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加约1.5倍至20倍或更多倍，该ELISpot测定法测量细胞因子分泌，诸如干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其他细胞因子。
在其他实施方案中，与适当的对照相比，生成免疫应答包括在施用如本文所述的腺病毒载体的受试者中靶特异性抗体产生增加1.5倍至5倍。在另一个实施方案中，与对照相比，生成免疫应答包括施用腺病毒载体的受试者中靶特异性抗体产生增加约1.5倍至20倍或更多倍。
因此，可提供生成针对肿瘤抗原的免疫应答的方法，包括向有需要的个体施用腺病毒载体，该腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区域中具有缺失，和b)编码一种或多种肿瘤抗原诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的核酸；并且向受试者重新施用腺病毒载体至少一次；从而生成针对肿瘤抗原的免疫应答。在一些方面，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。在某些实施方案中，可提供方法，其中施用的腺病毒载体不为空壳载体。
在其他实施方案中，可提供用于在受试者中生成针对肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的免疫应答的方法，其中通过向受试者施用腺病毒载体，该受试者对Ad具有预先存在的免疫力，该腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区域具有缺失，和b)编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的核酸；并且向受试者重新施用腺病毒载体至少一次；从而生成针对肿瘤抗原的免疫应答。在一些方面，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
关于对Ad的预先存在的免疫力，这可使用本领域已知的方法来确定，诸如基于抗体的测定以测试Ad抗体的存在。此外，在某些实施方案中，该方法可包括首先确定受试者对Ad具有预先存在的免疫力，然后施用如本文所述的E2b缺失的腺病毒载体。
一个实施方案提供在个体中生成针对一种或多种靶抗原的免疫应答的方法，包括向个体施用包含复制缺陷型腺病毒载体的第一种腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，以及编码至少一种靶抗原的核酸；向个体施用包含复制缺陷型腺病毒载体的第二种腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区域具有缺失，以及编码至少一种靶抗原的核酸，其中第二种腺病毒载体的至少一种靶抗原与第一种腺病毒载体的至少一种靶抗原相同或不同。在特定实施方案中，靶抗原可为野生型蛋白质、其片段、变体或变体片段。在一些实施方案中，靶抗原包含肿瘤抗原、肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤相关抗原、其片段、变体或变体片段。在一些方面，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。在一些方面，第二种腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
因此，某些实施方案考虑用相同的E2b缺失的腺病毒载体进行多次免疫或用不同的E2b缺失的腺病毒载体进行多次免疫。在每种情况下，腺病毒载体可包含编码一种或多种靶抗原的核酸序列，如本文其他地方所述。在每种情况下，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。在某些实施方案中，该方法包括用编码一种靶抗原的E2b缺失的腺病毒进行多次免疫，并且多次重新施用相同的腺病毒载体，从而诱导针对靶抗原的免疫应答。在一些实施方案中，靶抗原包含肿瘤抗原、肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤相关抗原、其片段、变体或变体片段。
在另一个实施方案中，该方法包括用编码一种或多种靶抗原的第一种腺病毒载体免疫，然后用编码一种或多种靶抗原的第二种腺病毒载体施用，所述靶抗原可与由第一种腺病毒载体编码的那些抗原相同或不同。在这方面，编码的靶抗原中的一个可为不同的，或者编码的抗原中的所有可为不同的，或者一些可为相同的且一些可为不同的。此外，在某些实施方案中，该方法包括多次施用第一种腺病毒载体并多次施用第二种腺病毒。在这方面，该方法包括施用第一种腺病毒载体1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次或更多次，并且施用第二种腺病毒载体1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次或更多次。施用顺序可包括连续一次或多次施用第一种腺病毒，随后连续一次或多次施用第二种腺病毒载体。在某些实施方案中，该方法包括交替施用第一种腺病毒载体和第二种腺病毒载体，如每种施用一次，每种施用两次，每种施用三次等。在某些实施方案中，第一种腺病毒载体和第二种腺病毒载体同时施用。在其他实施方案中，第一种腺病毒载体和第二种腺病毒载体顺序施用。在一些实施方案中，靶抗原包含肿瘤抗原、肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤相关抗原、其片段、变体或变体片段。在一些方面，第一种腺病毒载体和/或第二种腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
如本领域技术人员容易理解的，可在本文所述的方法中使用两种以上的腺病毒载体。三种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的腺病毒载体可用于本文所述的方法中。在某些实施方案中，该方法包括一次施用一种以上E2b缺失的腺病毒载体。在这方面，可通过同时施用多种不同的腺病毒载体来生成针对多种目标靶抗原的免疫应答，每种腺病毒载体包含编码一种或多种靶抗原的核酸序列。
腺病毒载体可用于生成针对癌症，诸如癌或肉瘤(例如，实体瘤、淋巴瘤和白血病)的免疫应答。腺病毒载体可用于生成针对癌症的免疫应答，所述癌症诸如神经系统癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、浆细胞瘤、腺瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、子宫癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肝癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或其他癌症。
还提供用于治疗或改善如本文所述的任何传染病或癌症的症状的方法。治疗方法包括向患有或有风险患有本文所述传染病或癌症的个体施用腺病毒载体一次或多次。在一些方面，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。由此，某些实施方案提供用于对有发展传染病或癌症风险的个体中的此类疾病进行疫苗接种的方法。处于风险中的个体可为可能在某个时间接触过感染因子或之前已经接触过但尚未具有感染症状的个体，或者具有发展癌症或对感染因子特别敏感的遗传易感性的个体。可确定患有本文所述的传染病或癌症的个体表达和/或呈递靶抗原，该靶抗原可用于指导本文的疗法。例如，可发现个体表达和/或呈递靶抗原，并且可随后施用编码靶抗原、其变体、片段或变体片段的腺病毒载体。在一些方面，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
某些实施方案考虑使用腺病毒载体用于体内递送编码靶抗原或其片段、变体或变体片段的核酸。在一些方面，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。一旦注射至受试者体内，就会表达核酸序列，引起针对由序列编码的抗原的免疫应答。腺病毒载体疫苗可以“有效量”施用，也就是说，在选定的一种或多种施用途径中有效的腺病毒载体的量，以引发免疫应答，如本文其他地方所述。有效量可诱导有效促进宿主针对靶感染因子或癌症的保护或治疗的免疫应答。每种疫苗剂量中的载体量被选择作为诱导免疫、免疫保护或其他免疫疗法反应而没有通常与典型疫苗相关的显著副作用的量。一旦接种疫苗，可监测受试者以确定疫苗治疗的功效。监测疫苗接种的功效可通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。在一些实施方案中，可测定血液或液体样品以检测抗体水平。在其他实施方案中，可进行ELISpot测定以检测来自循环血细胞或淋巴组织细胞的细胞介导的免疫应答。
在某些实施方案中，可在52周时间内施用1个至10个剂量。在某些实施方案中，以1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、11个月、12个月的间隔或可由其衍生的任何范围或值施用6个剂量，并且此后可以1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、11个月、12个月的间隔或可由其衍生的任何范围或值定期施用进一步的加强免疫。替代方案可能适合个别患者。由此，可在一年时间内或更短或更长时间内，诸如35周、40周、45周、50周、55周、60周、65周、70周、75周、80周、85周、90周、95周或100周时间内施用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个剂量。剂量可以1周、2周、3周、4周、5周或6周间隔或更长间隔施用。
疫苗可在少于约4小时的时间内输注，更优选地，在少于约3小时的时间内输注。例如，前25mg至50mg可在30分钟内输注，优选甚至在15min内输注，其余的在接下来的2小时至3小时内输注。更一般地，施用的疫苗构建体的剂量可每2周或3周以一个剂量施用，重复总共至少3个剂量。或者，构建体可每周施用两次，持续4周至6周。施用方案可任选地以其他间隔重复，并且剂量可通过各种肠胃外途径给予，其中适当调整剂量和方案。本文所述的组合物可在与任何数量的相关治疗方式(例如，之前、同时或之后)联合施用给患者。
合适的剂量为腺病毒载体的量，当如上所述施用时，其能够促进如本文其他地方所述的靶抗原免疫应答。在某些实施方案中，免疫应答比基础(即未治疗)水平高至少10％至50％。在某些实施方案中，免疫应答是基础水平的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、125、150、200、250、300、400、500或更高倍。可通过测量患者中的靶抗原抗体或通过疫苗依赖性生成能够在体外杀伤患者肿瘤或感染细胞的细胞溶解效应细胞或本领域已知的用于监测免疫应答的其他方法来监测此类应答。与未接种疫苗的患者相比，此类疫苗还应能够引起免疫应答，其引起接种疫苗的患者中所述疾病的临床结果得到改善。在一些实施方案中，改善的临床结果包括治疗疾病、减轻疾病症状、改变疾病的进展或延长寿命。
本文提供的任何组合物可施用于个体。“个体”可与“受试者”或“患者”互换使用。个体可为哺乳动物，例如人或动物，诸如非人灵长类动物、啮齿动物、兔子、大鼠、小鼠、马、驴、山羊、猫、狗、牛、猪或绵羊。在实施方案中，个体为人。在实施方案中，个体为胎儿、胚胎或儿童。在一些情况下，将本文提供的组合物离体施用于细胞。在一些情况下，将本文提供的组合物作为治疗疾病或病症的方法施用于个体。在一些实施方案中，个体患有遗传疾病。在一些情况下，个体处于患有该疾病的风险中，诸如本文所述的任何疾病。在一些实施方案中，个体患蛋白质量不足或蛋白质活性不足引起的疾病或病症的风险增加。如果个体患有疾病或病症的“风险增加”，则该方法涉及预防性或预防性治疗。例如，由于疾病的家族史，个体患有此类疾病或病症的风险可增加。通常，患有这种疾病或病症的风险增加的个体受益于预防性治疗(例如，通过预防或延迟疾病或病症的发作或进展)。
在一些情况下，受试者没有疾病。在一些情况下，如本文所述的治疗在疾病发作之前施用。受试者可能未检测到疾病。受试者可具有低疾病负担。受试者也可具有高疾病负担。在某些情况下，可根据分级量表向受试者施用如本文所述的治疗。分级量表可为格里森分类。格里森分类反映不同肿瘤组织与正常前列腺组织的不同。它使用1至5的范围。医生根据癌细胞的形态和生长给出癌症数量。数量越低，癌细胞看起来越正常，等级越低。数量越高，癌细胞看起来越不正常，等级越高。在某些情况下，可对具有低格里森评分的患者施用治疗。优选地，格里森评分为3或更低的患者可施用如本文所述的治疗。
各种实施方案涉及用于在所选患者群体中提升针对一种或多种特定靶抗原的免疫应答的组合物和方法。因此，如本文所述方法和组合物可靶向患有癌症的患者，所述癌症包括但不限于癌或肉瘤诸如神经系统癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、浆细胞瘤、腺瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、子宫癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肝癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、和慢性淋巴细胞白血病(CLL)，或者其他癌症可作为用于疗法的靶标。在一些情况下，靶向患者群体可能限于患有结肠直肠腺癌，转移性结肠直肠癌，表达晚期MUC1、MUC1c、MUC1n、T或CEA的结肠直肠癌，头颈癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，膀胱癌，或胰腺癌的个体。可使用组织学确认的选定癌症的诊断，例如结肠直肠腺癌。可选择特定的疾病阶段或进展，例如，可选择患有转移性癌症、复发性癌症、III期癌症或IV期癌症中的一种或多种的患者以用本文所述的方法和组合物进行疗法。在一些实施方案中，可能要求患者接受并任选地通过其他疗法进展，包括但不限于含有氟嘧啶(fluoropyrimidine)、伊立替康(irinotecan)、奥沙利铂(oxaliplatin)、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)的疗法。在一些情况下，个体拒绝接受此类疗法可允许患者被包括在具有如本文所述的方法和组合物的疗法合格库中。在一些实施方案中，使用本文所述的方法和组合物接受疗法的个体可需要具有至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、15个月、18个月、21个月或24个月的估计预期寿命。使用如本文所述的方法和组合物接受疗法的患者库可能受年龄限制。例如，年龄超过2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁、19岁、20岁、21岁、25岁、30岁、35岁、40岁、50岁、60岁或更大年龄的个体可有资格用本文所述的方法和组合物进行疗法。另一个示例，年龄小于75岁、70岁、65岁、60岁、55岁、50岁、40岁、35岁、30岁、25岁、20岁或更小年龄的个体可有资格用本文所述的方法和组合物进行疗法。
在一些实施方案中，使用如本文所述的方法和组合物接受疗法的患者限于具有足够血液功能的个体，例如具有以下中的一种或多种：WBC计数至少为每微升1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更高，血红蛋白水平至少为5g/dL、6g/dL、7g/dL、8g/dL、9g/dL、10g/dL、11g/dL、12g/dL、13g/dL、14g/dL或更高，血小板计数至少为每微升50,000；60,000；70,000；75,000；90,000；100,000；110,000；120,000；130,000；140,000；150,000或更高；具有PT-INR值小于或等于0.8、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0或更高，PTT值小于或等于1.2X ULN、1.4X ULN、1.5X ULN、1.6X ULN、1.8X ULN、2.0XULN或更高。在各种实施方案中，对于不同性别和年龄组的个体，例如0岁至5岁、5岁至10岁、10岁至15岁、15岁至18岁、18岁至21岁、21岁至30岁、30岁至40岁、40岁至50岁、50岁至60岁、60岁至70岁、70岁至80岁或80岁以上的个体，不同地选择血液学功能指标限制值。
在一些实施方案中，使用如本文所述的方法和组合物接受疗法的患者限于具有足够肾和/或肝功能的个体，例如具有以下中的一种或多种：血清肌酸酐水平小于或等于0.8mg/dL、0.9mg/dL、1.0mg/dL、1.1mg/dL、1.2mg/dL、1.3mg/dL、1.4mg/dL、1.5mg/dL、1.6mg/dL、1.7mg/dL、1.8mg/dL、1.9mg/dL、2.0mg/dL、2.1mg/dL、2.2mg/dL或更高，胆红素水平为0.8mg/dL、0.9mg/dL、1.0mg/dL、1.1mg/dL、1.2mg/dL、1.3mg/dL、1.4mg/dL、1.5mg/dL、1.6mg/dL、1.7mg/dL、1.8mg/dL、1.9mg/dL、2.0mg/dL、2.1mg/dL、2.2mg/dL或更高，同时允许吉尔伯特综合征的更高限制值，例如，小于或等于1.5mg/dL、1.6mg/dL、1.8mg/dL、1.9mg/dL、2.0mg/dL、2.1mg/dL、2.2mg/dL、2.3mg/dL或2.4mg/dL，ALT和AST值小于或等于小于或等于正常上限值(ULN)的1.5x、2.0x、2.5x、3.0x或更大。在各种实施方案中，对于不同性别和年龄组的个体，例如0岁至5岁、5岁至10岁、10岁至15岁、15岁至18岁、18岁至21岁、21岁至30岁、30岁至40岁、40岁至50岁、50岁至60岁、60岁至70岁、70岁至80岁或80岁以上的个体，选择不同的肾或肝功能指标限制值。
在一些实施方案中，可确定作为候选者的个体的K-ras突变状态，用于使用如本文所述的方法和组合物进行疗法。具有预选K-ras突变状态的个体可包括在合格患者库中，用于使用本文所述的方法和组合物进行疗法。
在各种实施方案中，使用如本文所述的方法和组合物接受疗法的患者限于以下个体：没有并发细胞毒性化学疗法或放射疗法，脑转移史或当前脑转移，自身免疫疾病史诸如但不限于炎性肠病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化症、甲状腺疾病和白癜风，严重的并发慢性或急性疾病诸如心脏病(NYHA III或IV级)或肝病，可能符合该方案的医学或心理障碍，除非黑色素瘤皮肤癌、原位宫颈癌、受控浅表性膀胱癌或其他已经治疗的原位癌以外的并发(或在过去5年内)第二次恶性肿瘤，活动性急性或慢性感染，包括：尿路感染、HIV(例如，通过ELISA测定并由Western Blot确认)和慢性肝炎，或并发类固醇疗法(或其他免疫抑制药物，诸如硫唑嘌呤或环孢菌素A)。在某些情况下，停用任何类固醇疗法至少3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周的患者(除了用作化学疗法或对比增强研究的预先用药之外)可包括在合格个体库中，用于使用本文所述的方法和组合物进行疗法。在一些实施方案中，使用如本文所述的方法和组合物接受疗法的患者包括患有甲状腺疾病和白癜风的个体。
在各种实施方案中，可收集来自个体或候选个体的样品，例如血清或尿液样品，用于使用本文所述的方法和组合物进行疗法。可在疗法之前、期间和/或之后收集样品，例如，在疗法开始前的2周、4周、6周、8周、10周内，在疗法开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周或12周内，在疗法开始前的2周、4周、6周、8周、10周内，在疗法开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周内或12周内，在疗法期间的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周间隔中，在疗法后1个月、3个月、6个月、1年、2年间隔中，在疗法后1个月、3个月、6个月、1年、2年或更长时间内，持续6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。可测试样品中本文所述的任何血液学、肾脏或肝功能指标以及本领域已知的合适的其他指标，例如具有生育潜力的女性的β-HCG。在这方面，血液学和生物化学测试，包括具有差异的血细胞计数、PT、INR和PTT，测量Na、K、Cl、CO2、BUN、肌酐、Ca、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT和葡萄糖的测试在某些方面为可考虑的。在一些实施方案中，在来自个体或候选个体的样品中测定HIV抗体、肝炎BsAg或丙型肝炎抗体的存在或量，用于使用本文所述的方法和组合物进行疗法。
可在来自个体或候选个体的样品诸如血清中测试生物学标记物，诸如靶抗原的抗体或针对Ad5载体的中和抗体，用于使用本文所述的方法和组合物进行疗法。在一些情况下，可从个体或候选个体收集并归档一个或多个样品，诸如血液样品，用于使用本文所述的方法和组合物进行疗法。收集的样品可被测定进行免疫学评估。使用本文所述的方法和组合物进行疗法的个体或候选个体可在成像研究中进行评估，例如使用胸部、腹部或骨盆的CT扫描或MRI。可在疗法之前、期间或之后使用本文所述的方法和组合物，在疗法期间和/或之后进行成像研究，例如，在疗法开始前的2周、4周、6周、8周、10周内，在疗法开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周或12周内，在疗法开始前的2周、4周、6周、8周、10周内，在疗法开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周内或12周内，在疗法期间的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周间隔中，在疗法后1个月、3个月、6个月、1年、2年间隔中，在疗法后1个月、3个月、6个月、1年、2年或更长时间内，持续6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。
本文所述的组合物和方法考虑疗法期间的各种剂量和施用方案。患者可接受一种或多种复制缺陷型腺病毒或腺病毒载体，例如Ad5[E1-，E2B-]-载体，其包含能够提升个体针对本文所述靶抗原的免疫应答的的靶抗原。在一些方面，Ad5[E1-，E2B-]-载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在某些实施方案中，复制缺陷型腺病毒以适于影响或增强此类免疫应答的剂量施用。在某些情况下，复制缺陷型腺病毒的施用剂量大于或等于每次免疫1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012或更多病毒颗粒(VP)。在某些情况下，复制缺陷型腺病毒的施用剂量小于或等于每次免疫1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012或更多病毒颗粒。在各种实施方案中，本文所述的所需剂量在合适体积的制剂缓冲液中施用，例如体积为约0.1mL至10mL、0.2mL至8mL、0.3mL至7mL、0.4mL至6mL、0.5mL至5mL、0.6mL至4mL、0.7mL至3mL、0.8mL至2mL、0.9mL至1.5mL、0.95mL至1.2mL或1.0mL至1.1mL。本领域技术人员理解，体积可落入由这些值中的任何值界定的任何范围内(例如，约0.5mL至约1.1mL)。病毒颗粒的施用可通过各种合适的途径进行递送，例如它可通过注射(例如，皮内、肌肉内、静脉内或皮下)、鼻内(例如，通过抽吸)、以丸剂形式(例如，吞咽、用于阴道或直肠递送的栓剂。在一些实施方案中，皮下递送可为优选的并且可提供更大的树突细胞通路。
可重复向个体施用病毒颗粒。病毒颗粒的重复递送可遵循时间表，或者可根据需要进行。例如，可测试个体针对靶抗原的免疫力，例如肿瘤抗原、肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤相关抗原、其片段、变体或变体片段，并且在必要时补充附加递送。在一些实施方案中，递送的时间表包括以规则的间隔施用病毒颗粒。可设计联合递送方案，其包括在施用之前评定的具有时间表的时段和/或基于需要的施用时段中的一个或多个。例如，疗法方案可包括施用，诸如每三周皮下施用一次，然后每三个月进行另一次免疫疗法治疗，直到因包括死亡的任何原因退出疗法。另一个示例方案包括每三周施用三次，然后每三个月施用另一组三次免疫疗法治疗。
另一个示例方案包括第一时段，其中以第一频率施用第一次数，第二时段，其中以第二频率施用第二次数，第三时段，其中以第三频率施用第三次数等，并且任选地，一个或多个时段，其中在必要的基础上施用未确定的次数。每个时段的施用次数可独立选择，例如可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。每个时段的施用频率也可独立选择，例如可为约每天、每隔一天、每三天、一周两次、一周一次、每隔一周一次、每三周、每个月、每六周、每隔一个月、每三个月、每四个月、每五个月、每六个月、每年一次等。该疗法可耗总时段达1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、30个月、36个月或更长。
可修改免疫之间的预定间隔，使得免疫之间的间隔被修改多达间隔的五分之一、四分之一、三分之一或一半。例如，对于3周的间隔时间表，可在20天至28天(3周-1天至3周+7天)之间重复免疫。对于前3次免疫，如果第二次和/或第三次免疫被延迟，则随后的免疫可移位，允许免疫之间的最小量的缓冲。例如，对于三周的间隔时间表，如果免疫延迟，则可安排随后的免疫在不早于先前免疫后的17天、18天、19天或20天进行。
本文所述的组合物可以各种状态，例如以室温、冰上或冷冻提供。组合物可在合适大小的容器中提供，例如2mL小瓶的小瓶。在一个实施方案中，含有1.0mL可提取疫苗的12ml小瓶含有5×1011个总病毒颗粒/mL。包括温度和湿度的储存条件可不同。例如，用于在疗法中使用的组合物可在室温、4℃、-20℃或更低温度下储存。
在各种实施方案中，对根据本文所述的方法和组合物接受治疗的个体进行一般评估。任何测试中的一项或多项可根据需要或按预定基础，诸如在第0周、第3周、第6周等进行。相比于没有免疫的时间点，可在免疫的同时进行不同组的测试。
一般评估可包括主治医师掌握的病史、ECOG表现评分、Karnofsky表现状态和具有体重的完整体检中的一项或多项。可记录患者自上次就诊后接受或已接受的任何其他治疗、药物、生物制剂或血液制品。在接受疫苗后，患者可在诊所被跟踪一段合适的时间，例如大约30分钟，以监测任何不良反应。
在某些实施方案中，每次剂量疫苗后的局部和全身反应原性可每天评定选定的时间，例如3天(免疫当天和之后的2天)。日记卡可用于报告症状，并且标尺可用于测量局部反应原性。可评定免疫注射部位。可对胸部、腹部和骨盆进行CT扫描或MRI。
在各种实施方案中，对根据本文所述的方法和组合物接受治疗的个体进行血液学和生物化学评估。任何测试中的一项或多项可根据需要或按预定基础，诸如在第0周、第3周、第6周等进行。相比于没有免疫的时间点，可在免疫的同时进行不同组的测试。血液学和生物化学评估可包括用于化学和血液学的血液测试，具有差异的CBC、Na、K、Cl、CO2、BUN、肌酐、Ca、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT、葡萄糖和ANA中的一种或多种。
在各种实施方案中，根据本文所述的方法和组合物对接受治疗的个体评估生物学标记。任何测试中的一项或多项可根据需要或按预定基础，诸如在第0周、第3周、第6周等进行。相比于没有免疫的时间点，可在免疫的同时进行不同组的测试。
生物标记评估可包括从足够体积的血清样品测量用于靶向本文所述的抗原或病毒载体的抗体中的一种或多种，例如约5ml生物标记如果确定且可用，则可对其进行审查。
在各种实施方案中，对根据本文所述的方法和组合物接受治疗的个体进行免疫学评定。任何测试中的一项或多项可根据需要或按预定基础，诸如在第0周、第3周、第6周等进行。相比于没有免疫的时间点，可在免疫的同时进行不同组的测试。
可在每次免疫之前和在至少一些免疫之后的时间抽取外周血，例如约90mL，以确定在研究期间和/或特定次数的免疫之后的特定时间点是否对免疫应答有影响。免疫学评定可包括使用ELISpot、增殖测定、多参数流式细胞术分析和细胞毒性测定来测定外周血单核细胞(PBMC)对靶抗原的T细胞应答中的一种或多种。每次抽血的血清可存档并发送和确定。
在各种实施方案中，对根据本文所述的方法和组合物接受治疗的个体进行肿瘤评定。任何测试中的一项或多项可根据需要或或按预定基础，诸如在治疗前、第0周、第3周、第6周等进行。相比于没有免疫的时间点，可在免疫的同时进行不同组的测试。肿瘤评定可包括在治疗之前、在至少一些免疫之后的时间，以及在完成选定次数，例如2次、3次或4次的第一次治疗之后并且例如直到从治疗中去除的大约每三个月进行的胸部、腹部或骨盆的CT或MRI扫描中的一个或多个。
可使用一种或多种合适的免疫应答测试，诸如ELISpot、细胞因子流式细胞术或抗体反应从样品，诸如个体的外周血样品评估针对本文所述的靶抗原，诸如肿瘤新表位或新抗原的免疫应答。可通过测量T细胞应答来确定阳性免疫应答。如果针对具有抗原的六个孔中背景调整的平均斑点数超过六个对照孔中的斑点数10，并且使用学生t检验(Student’st-test)的六个含有抗原的孔和六个对照孔的单个值之间的差异在p≤0.05的水平上具有统计学意义，则T细胞应答可被认为是阳性的。免疫原性测定可在每次免疫之前和治疗期间的预定时间点进行。例如，可预定在第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第9周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周、第15周、第18周、第20周、第24周、第30周、第36周或第48周左右的免疫原性测定的时间点，即使此时没有预定免疫。在一些情况下，如果个体接受至少最小数量的免疫，例如1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或更多次免疫，则可认为该个体可评估免疫应答。
在一些实施方案中，根据RECIST 1.1标准在患有可测量/可评估疾病的患者中进行疾病进展或临床反应确定。在一些实施方案中，使用如本文所述的方法和组合物的疗法影响接受疗法的个体中的完全反应(CR；靶病变的所有靶病变的消失或所有非靶病变的消失以及非靶病变的肿瘤标记水平的正常化)。在一些实施方案中，使用如本文所述的方法和组合物的疗法影响接受疗法的个体中的部分反应(PR；靶病变的LD总和至少减少30％，以靶病变的基线总和LD作为参考)。
在一些实施方案中，使用如本文所述的方法和组合物的疗法影响接受疗法的个体中的稳定疾病(SD；既没有足够的收缩以符合PR标准，也没有足够的增加以符合PD标准，以自靶病变治疗开始以来的最小总和LD作为参考)。在一些实施方案中，使用本文所述的方法和组合物的疗法影响接受疗法的个体中的不完全反应/稳定疾病(SD；持续存在一种或多种非靶病变或/和维持肿瘤标记水平高于非靶病变的正常限度)。在一些实施方案中，使用如本文所述的方法和组合物的疗法影响接受疗法的个体中的进行性疾病(PD；靶病变的LD总和增加至少20％，以自治疗开始以来记录的最小总和LD作为参考，或者出现靶病变的一个或多个新病变，或者持续存在一个或多个非靶病变或/和维持肿瘤标记水平高于非靶病变的正常限度)。
VI.载体
某些方面包括将包含编码一种或多种肿瘤新表位或新抗原的一种或多种核酸序列的表达构建体转移至细胞中。在一些方面，表达构建体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。在某些实施方案中，可使用病毒载体完成表达构建体向细胞中的转移。病毒载体可用于包括含有足以表达已克隆在其中的重组基因构建体的病毒序列的那些构建体。
本文公开的组合物可为包含靶向多种肿瘤新抗原或新表位的载体文库的组合物。载体文库可靶向癌症的所有鉴定的新表位。在一些情况下，载体文库可用于治疗患者。载体文库可更积极地靶向表达多个新表位的异质肿瘤。在某些情况下，载体文库至少为两个载体。载体文库可为两个以上的载体。载体文库可包含或可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多靶向不同新表位的载体。载体文库可同时靶向驱动突变和乘客突变。在某些情况下，根据患者的肿瘤情况设计载体文库。在一些情况下，载体文库中的载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在特定实施方案中，病毒载体为腺病毒载体。腺病毒为DNA病毒家族，其特征在于含有线性双链基因组的二十面体无包膜衣壳。在人类腺病毒中，没有一种与任何肿瘤性疾病相关，并且仅在免疫活性个体中引起相对温和的自限性疾病。
腺病毒载体可能具有低的整合至基因组DNA中的能力。腺病毒载体可引起高效的基因转移。腺病毒载体的附加优点包括它们在向非分裂细胞和分裂细胞的基因递送方面为有效的，并且可大量生产。
与整合病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染可能不会引起染色体整合，因为腺病毒DNA可以游离方式复制而没有潜在的遗传毒性。而且，腺病毒载体可为结构稳定的，并且在广泛扩增后未检测到基因组重排。腺病毒特别适合用作基因转移载体，因为它具有中等大小的基因组、易于操作、高滴度、广泛的靶细胞范围和高感染性。
由病毒表达的第一基因为E1基因，该E1基因起到从野生型基因组中存在的其他Ad5基因启动子启动高水平基因表达的作用。病毒DNA复制和子代病毒粒子的组装发生在受感染细胞的细胞核内，整个生命周期约需要36hr，其中每个细胞的输出大约为104个病毒粒子。
野生型Ad5基因组约为36kb，并且编码分为早期和晚期病毒功能的基因，这取决于它们是在DNA复制之前还是之后表达。早期/晚期描述几乎为绝对的，因为已经证明先前用Ad5感染的细胞的超感染导致超感染病毒的晚期基因表达缺乏，直到它复制其自身的基因组。不受理论束缚，这可能是由于Ad5主要晚期启动子(MLP)的复制依赖性顺式活化，阻止晚期基因表达(主要为Ad5衣壳蛋白)直至存在复制的基因组被包封。该组合物和方法可在开发先进的一代Ad载体/疫苗中利用这些特征。
腺病毒载体可为复制缺陷的，或至少为条件缺陷的。腺病毒可具有42种不同的已知血清型或亚组A至亚组F中的任何一种，并且可设想其他血清型或亚组。在特定实施方案中可使用亚组C的5型腺病毒，以便获得复制缺陷型腺病毒载体。这是因为5型腺病毒为人类腺病毒，关于其的大量的生物化学和遗传信息为已知的，并且它历来用于采用腺病毒作为载体的大多数构建体。
腺病毒生长和操作为本领域技术人员已知的，并且在体外和体内表现出广泛的宿主范围。还可使用经修饰的病毒，诸如具有CAR结构域改变的腺病毒。还设想用于增强递送或规避免疫应答的方法，诸如病毒的脂质体包封。
载体可包含基因工程形式的腺病毒，诸如E2缺失的腺病毒载体，或更具体地，E2b缺失的腺病毒载体。如本文所用，术语“E2b缺失”是指以此类方式突变的特定DNA序列，以便防止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能。因此，在某些实施方案中，“E2b缺失”是指从Ad基因组缺失(去除)的特定DNA序列。E2b缺失或“在E2b区域内含有缺失”是指Ad基因组的E2b区域内至少一个碱基对的缺失。在某些实施方案中，缺失一个以上的碱基对，并且在其他实施方案中，缺失至少20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个或150个碱基对。在另一个实施方案中，在Ad基因组的E2b区域内缺失超过150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个或300个碱基对。E2b缺失可为阻止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能的缺失，因此包括编码E2b特异性蛋白质部分的外显子内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。在某些实施方案中，E2b缺失为阻止E2区域的DNA聚合酶和前末端蛋白中的一种或两种的表达和/或功能的缺失。在另一个实施方案中，“E2b缺失”是指Ad基因组的该区域的DNA序列中的一个或多个点突变，使得一种或多种编码的蛋白质为无功能的。此类突变包括被不同残基替换的残基，引起氨基酸序列的变化，从而产生无功能蛋白质。
如本领域技术人员在阅读本公开内容时将理解的，可缺失Ad基因组的其他区域。因此，如本文所用，在Ad基因组的特定区域中“缺失”是指以此类方式突变的特定DNA序列，以便防止由该区域编码的至少一种基因产物的表达和/或功能。在某些实施方案中，在特定区域中“缺失”是指以此类方式从Ad基因组中缺失(去除)的特定DNA序列，以便防止由该区域编码的表达和/或功能(例如，DNA聚合酶的E2b功能或前末端蛋白功能)。特定区域内的“缺失”或“含有缺失”是指在Ad基因组的该区域内缺失至少一个碱基对。
因此，在某些实施方案中，缺失一个以上的碱基对，并且在其他实施方案中，从特定区域缺失至少20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个或150个碱基对。在另一个实施方案中，在Ad基因组的特定区域内缺失超过150个、160个、170个、180个、190个、200个、250个或300个碱基对。这些缺失使得可防止由该区域编码的基因产物的表达和/或功能。因此，缺失包括编码蛋白质部分的外显子内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。在另一个实施方案中，Ad基因组的特定区域中的“缺失”是指Ad基因组的该区域的DNA序列中的一个或多个点突变，使得一种或多种编码的蛋白质为无功能的。此类突变包括被不同残基替换的残基，引起氨基酸序列的变化，从而产生无功能蛋白质。
在某些实施方案中，预期使用的腺病毒载体包括E2b缺失的腺病毒载体，其在Ad基因组的E2b区域和任选的E1区域具有缺失。在某些情况下，此类载体没有缺失Ad基因组的任何其他区域。
在另一个实施方案中，预期使用的腺病毒载体包括E2b缺失的腺病毒载体，其在Ad基因组的E2b区域中具有缺失，并且任选地在E1区域和E3区域中具有缺失。在某些情况下，此类载体没有缺失其他区域。
在另一个实施方案中，预期使用的腺病毒载体包括腺病毒载体，其在Ad基因组的E2b区域具有缺失，并且任选地在E1区域、E3区域中具有缺失，并且还任选地，部分或完全去除E4区域。在某些情况下，此类载体没有其他缺失。
在另一个实施方案中，预期使用的腺病毒载体包括腺病毒载体，其在Ad基因组的E2b区域中具有缺失，并且任选地在E1区域和/或E4区域中具有缺失。在某些情况下，此类载体不包含其他缺失。
在另一个实施方案中，预期使用的腺病毒载体包括在Ad基因组的E2a、E2b和/或E4区域具有缺失的腺病毒载体。在某些情况下，此类载体没有其他缺失。
在一个实施方案中，用于本文的腺病毒载体包含缺失E2b区域的E1和/或DNA聚合酶功能的载体。在某些情况下，此类载体没有其他缺失。
在另一个实施方案中，用于本文的腺病毒载体缺失E2b区域的E1和/或前末端蛋白功能。在某些情况下，此类载体没有其他缺失。
在另一个实施方案中，用于本文的腺病毒载体缺失E1、DNA聚合酶和/或前末端蛋白功能。在某些情况下，此类载体没有其他缺失。在一个特定的实施方案中，本文预期使用的腺病毒载体缺失E2b区域和/或E1区域的至少一部分。
在一些情况下，此类载体不为“空壳”腺病毒载体。在这方面，对于DNA聚合酶和E2b区域的前末端蛋白功能，可缺失载体。在另外的实施方案中，使用的腺病毒载体包括在腺病毒基因组的E1区域、E2b区域和/或100K区域具有缺失的腺病毒载体。在某些实施方案中，腺病毒载体可为“空壳”腺病毒载体。
在一个实施方案中，用于本文的腺病毒载体包含缺失E1、E2b和/或蛋白酶功能的载体。在某些情况下，此类载体没有其他缺失。
在另一个实施方案中，用于本文的腺病毒载体缺失E1区域和/或E2b区域，而纤维基因已通过突变或其他改变(例如，改变Ad趋向性)进行修饰。可将从E3区域或E4区域去除基因添加至任何提到的腺病毒载体中。
可使用本领域已知的重组技术生成缺失的腺病毒载体(参见例如，Amalfitano等人《病毒学》(J.Virol.)1998；72:926-33；Hodges等人《基因医学》(J Gene Med)2000；2:250-59)。如本领域技术人员所认识到的，用于某些方面的腺病毒载体可使用合适的包装细胞系成功地生长至高滴度，该包装细胞系组成型地表达E2b基因产物和可能已经缺失的任何必需基因的产物。在某些实施方案中，可使用HEK-293衍生的细胞，其不仅组成型地表达E1和DNA聚合酶蛋白，而且组成型地表达Ad-前末端蛋白。在一个实施方案中，E.C7细胞用于成功培养腺病毒载体的高滴度原种(参见例如，Amalfitano等人1998；72:926-33；Hodges等人2000；2:250-59)
为了从自繁殖的腺病毒载体中缺失关键基因，由靶向基因编码的蛋白质可与E1蛋白一起在HEK-293细胞或类似细胞中共表达。因此，只能使用那些在组成型地共表达时无毒的蛋白质(或可诱导表达的有毒蛋白质)。已证实E1基因和E4基因的HEK-293细胞中的共表达(利用诱导型而非组成型启动子)(Yeh,等人《病毒学》1996；70:559；Wang等人《基因疗法》(Gene Therapy)1995；2:775；和Gorziglia,等人《病毒学》1996；70:4173)。E1和蛋白质IX基因(病毒体结构蛋白)已共表达(Caravokyri,等人《病毒学》1995；69:6627)，并且还描述E1、E4和蛋白质IX基因的共表达(Krougliak,等人《人类基因疗法》(Hum.Gene Ther.)1995；6:1575)。E1和100k基因已经在反式互补细胞系中成功表达，E1和蛋白酶基因也是如此(Oualikene,等人《人类基因疗法》2000；11:1341-53；Hodges,等人《病毒学》2001；75:5913-20)。
美国专利第6,063,622号中描述共表达E1基因产物和E2b基因产物的细胞系用于在培养高滴度的E2b缺失的Ad颗粒中使用。E2b区编码为Ad基因组复制所必需的病毒复制蛋白(Doerfler,等人《染色体》(Chromosoma)1992；102:S39-S45)。有用的细胞系组成型地表达大约140kDa的Ad-DNA聚合酶和/或大约90kDa的前末端蛋白。特别地，具有E1、DNA聚合酶和前末端蛋白的高水平、组成型共表达而没有毒性的细胞系(例如，E.C7)希望用于繁殖Ad以用于多次疫苗接种。这些细胞系允许缺失E1、DNA聚合酶和前末端蛋白的腺病毒载体的繁殖。
可使用本领域已知的技术繁殖重组Ad。例如，在某些实施方案中，含有E.C7细胞的组织培养板以适当的MOI(例如5)用腺病毒载体病毒原种感染，并且在37.0℃温育40h至96h。收获感染的细胞，重悬于10mM Tris-Cl(pH8.0)中，并且超声处理，通过两轮氯化铯密度离心纯化病毒。在某些技术中，含有病毒的条带在Sephadex CL-6B柱(新泽西州皮斯卡塔韦的玛法西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ.))上脱盐，加入蔗糖或甘油，并且在-80℃下储存等分试样。在一些实施方案中，将病毒置于旨在增强其稳定性的溶液中，诸如A195(Evans,等人《医药科学》(J Pharm Sci)2004；93:2458-75)。测量原种的滴度(例如，通过在SDS裂解后测量260nm处的病毒等分试样的光密度)。在另一个实施方案中，包含整个重组E2b缺失的腺病毒载体的线性或环状质粒DNA可转染至E.C7或类似细胞中，并且在37.0℃下温育直至存在病毒产生的证据(例如，细胞病变效应)。然后来自这些细胞的条件培养基可用于感染更多的E.C7或类似细胞，以在纯化前扩增产生的病毒量。可通过两轮氯化铯密度离心或选择性过滤来完成纯化。在某些实施方案中，病毒可通过柱色谱法纯化，可使用市售产品(例如，宾夕法尼亚州马尔维市Puresyn公司(Puresyn,Inc.,Malvem,PA)的Adenopure)或定制的色谱柱。
在某些实施方案中，重组腺病毒载体可包含足够的病毒以确保待感染的细胞面临一定数量的病毒。因此，可提供重组Ad的原种，例如在重组Ad的无RCA的原种中。Ad原种的制备和分析可使用本领域可用的任何方法。病毒原种的滴度差异很大，这在很大程度上取决于病毒基因型以及用于制备它们的方案和细胞系。病毒原种可具有至少约106pfu/ml、107pfu/ml或108pfu/ml的滴度，并且许多此类原种可具有更高的滴度，诸如至少约109pfu/ml、1010pfu/ml、1011pfu/ml或1012pfu/ml。
某些方面考虑使用E2b缺失的腺病毒载体，诸如美国专利第6,063,622号；第6,451,596号；第6,057,158号；第6,083,750号；和第8,298,549号中所述的那些。在许多情况下，E2b区域中具有缺失的载体削弱病毒蛋白质表达和/或降低生成复制能力Ad(RCA)的频率。
可利用表达缺失的E2b基因产物的细胞系完成这些E2b缺失的腺病毒载体的繁殖。某些方面还提供此类包装细胞系；例如E.C7(正式称为C-7)，衍生自HEK-293细胞系。
在其他方面，E2b基因产物、DNA聚合酶和前末端蛋白可在E.C7或类似细胞中与E1基因产物一起组成型地表达。将基因片段从Ad基因组转移至生产细胞系具有直接的益处：(1)携带能力增加；以及(2)RCA生成的潜力降低，通常需要两个或更多个独立的重组事件来生成RCA。本文使用的E1、Ad DNA聚合酶和/或前末端蛋白表达细胞系能够繁殖具有接近13kb的携带能力的腺病毒载体，而不需要污染的辅助病毒。此外，当缺失对病毒生命周期关键的基因(例如，E2b基因)时，进一步削弱Ad复制或表达其他病毒基因蛋白。这可降低病毒感染细胞的免疫识别，并且允许延长外源转基因表达的持续时间。
E1、DNA聚合酶和前末端蛋白缺失的载体通常不能从E1区域和E2b区域表达相应的蛋白质。此外，它们可能显示大多数病毒结构蛋白缺乏表达。例如，Ad的主要晚期启动子(MLP)负责晚期结构蛋白L1至L5的转录。尽管MLP在Ad基因组复制之前活性最低，但是仅在病毒基因组复制发生后，高毒性Ad晚期基因主要由MLP转录和翻译。晚期基因转录的这种顺式依赖性活化通常，诸如在多瘤和SV-40的生长中为DNA病毒的特征。DNA聚合酶和前末端蛋白对Ad复制很重要(与E4或蛋白IX蛋白不同)。它们的缺失可对腺病毒载体晚期基因表达，以及该表达在诸如APCs.E1缺失的腺病毒载体等细胞中的毒性作用极为不利
某些方面考虑使用E1缺失的腺病毒载体。构建第一代或E1缺失的腺病毒载体Ad5[E1-]，使得转基因仅取代基因的E1区域。通常，约90％的野生型Ad5基因组保留在载体中。Ad5[E1-]载体在感染不表达Ad5E1基因的细胞后具有降低的复制能力并且不能产生感染性病毒。重组Ad5[E1-]载体在人细胞(通常293个细胞)中繁殖，允许Ad5[E1-]载体复制和包装。Ad5[E1-]载体具有许多阳性属性；其中最重要的一种为它们相对容易扩大规模和cGMP生产。目前，超过220项人临床试验使用Ad5[E1-]载体，超过两千名受试者皮下、肌肉内或静脉内接种该病毒。
另外，Ad5载体不整合；他们的基因组仍然为游离的。通常，对于不整合至宿主基因组中的载体，插入诱变和/或种系传递的风险极低(如果有的话)。常规Ad5[E1-]载体具有接近7kb的携带能力。
对人和动物的研究已经证明，预先存在的针对Ad5的免疫力可为基于Ad的疫苗的商业用途的抑制因子。人类的优势为针对Ad5的抗体，Ad5为人类疫苗中使用最广泛的亚型，其中三分之二的人研究过针对Ad5的淋巴增殖反应。这种预先存在的免疫力可使用典型的Ad5疫苗抑制免疫或再免疫，并且可在以后使用Ad5载体排除针对第二抗原的疫苗的免疫。克服预先存在的抗载体免疫的问题一直为一个深入调查的主题。已经检查使用替代的人(非基于Ad5的)Ad5亚型或甚至非人形式的Ad5的调查。即使这些方法在初次免疫中成功，随后的疫苗接种也可能由于对新型Ad5亚型的免疫应答而有问题。
为了避免Ad5免疫屏障，并且改善第一代Ad5[E1-]载体诱导最佳免疫应答的有限功效，提供与基于下一代Ad5载体的疫苗平台相关的某些实施方案。下一代Ad5平台在E2b区域具有附加缺失，去除DNA聚合酶和前末端蛋白基因。Ad5[E1-，E2b-]平台具有扩展的克隆能力，足以允许包含许多可能的基因。与Ad5[E1-]载体的7kb容量相比，Ad5[E1-，E2b-]载体具有高达约12kb的基因携带能力，如果需要，为多个基因提供空间。在一些实施方案中，将超过1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb或11kb的插入物引入Ad5载体，诸如Ad5[E1-，E2b-]载体。
E2b区域的缺失可赋予Ad5载体有利的免疫特性，通常引发对靶转基因抗原诸如肿瘤新表位的有效免疫应答，同时使对Ad病毒蛋白的免疫应答最小化。
在各种实施方案中，Ad5[E1-，E2b-]载体可诱导有效的CMI，以及针对载体表达的靶抗原的抗体，诸如肿瘤新表位或新表位，甚至在存在Ad免疫的情况下。
与Ad5[E1-]载体相比，Ad5[E1-，E2b-]载体也具有减少的不良反应，特别为肝毒性和组织损伤的出现。
这些Ad5载体的某些方面为Ad晚期基因的表达大大降低。例如，可在体内检测衣壳纤维蛋白的产生以用于Ad5[E1-]载体，而从Ad5[E1-，E2b-]载体疫苗中消除纤维表达。对野生型Ad的先天免疫应答为复杂的。从Ad5[E1-，E2b-]载体中缺失的蛋白质通常起重要作用。具体地，与Ad5[E1-]载体相比，具有前末端蛋白或DNA聚合酶缺失的Ad5[E1-，E2b-]载体在注射后的最初24小时至72小时期间显示减少的炎症。在各种实施方案中，缺乏Ad5基因表达使得感染细胞对抗-Ad活性不可见，并且允许感染细胞长时间表达转基因，从而开发对靶标的免疫力。
各种实施方案考虑通过利用针对Ad5[E1-，E2b-]载体病毒蛋白的减少的炎症反应以及由此引起的对预先存在的Ad免疫力的逃避，增加Ad5[E1-，E2b-]载体转导树突细胞的能力，改善疫苗中的抗原特异性免疫应答。
在一些情况下，这种免疫诱导可能需要数月。Ad5[E1-，E2b-]载体不仅比Ad5[E1-]载体更安全，而且在抗原特异性免疫应答的诱导方面似乎优于Ad5[E1-]载体，这使它们更适合作为递送肿瘤疫苗的平台，从而可引起临床反应。
在某些实施方案中，通过利用Ad5[E1-，E2b-]载体系统开发治疗性肿瘤疫苗来提供方法和组合物，该治疗性肿瘤疫苗克服其他Ad5系统发现的障碍并且允许先前已经接触过Ad5的人进行免疫。
与第一代腺病毒载体的5kb至6kb容量相比，E2b缺失的载体可具有高达13kb的基因携带能力，从而容易地为编码任何多种靶抗原，诸如肿瘤新表位或新抗原的核酸序列提供空间。在一些方面，E2b缺失的载体可进一步为编码免疫融合配偶体的核酸序列提供空间。
与第一代腺病毒载体相比，E2b缺失的腺病毒载体也具有降低的不良反应。E2b缺失的载体具有降低的病毒基因表达，并且该特性引起体内转基因表达延长。
与第一代腺病毒载体相比，第二代E2b缺失的腺病毒载体的某些实施方案在DNA聚合酶基因(pol)和前末端蛋白(pTP)的缺失中含有附加缺失。
似乎从腺病毒载体表达的Ad蛋白起重要作用。具体地，E2b缺失载体中前末端蛋白和DNA聚合酶的缺失似乎在注射后的前24小时至72小时期间减少炎症，而第一代腺病毒载体在此期间刺激炎症。
此外，据报告，由E2b缺失产生的附加复制块也引起Ad晚期基因表达减少10,000倍，远远超过单独的E1、E3缺失所提供的表达。E2b缺失的腺病毒载体产生的Ad蛋白水平的降低有效地降低对Ad抗原的竞争性、不期望的免疫应答的可能性，这些应答阻止在Ad免疫或暴露的个体中重复使用该平台。
第二代E2b缺失载体对炎症反应的诱导减少引起载体在抗原呈递细胞(即树突细胞)感染期间表达所需疫苗抗原诸如肿瘤新表位的可能性增加，相对于第一代腺病毒载体的相同尝试，降低用于抗原竞争的可能性，引起疫苗对所需抗原的更大免疫。
E2b缺失的腺病毒载体提供改善的基于Ad的候选疫苗，该候选疫苗比使用第一代腺病毒载体的先前描述的候选疫苗更安全、更有效和更通用。
因此，第一代E1缺失的基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体，尽管用作疫苗的有希望的平台，但是可通过天然存在的或诱导的Ad特异性中和抗体阻碍其活性。
不受理论束缚，基于Ad5的载体具有E1区域和E2b区域的缺失(Ad5[E1-，E2b-])，后者编码DNA聚合酶和前末端蛋白，例如由于晚期病毒蛋白表达减少，可避免免疫清除，并且在Ad-免疫宿主中诱导针对编码的抗原转基因诸如肿瘤新抗原或新表位的更强的免疫应答。
VII.靶抗原
在某些方面，可提供表达构建体或载体，其包含编码一种或多种目标靶蛋白或靶抗原的核酸序列，诸如肿瘤表位或肿瘤新表位。在这方面，可提供表达构建体或载体，其可含有编码至少、至多或约一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种或500种不同的目标靶抗原或由其衍生的任何数量或范围。表达构建体或载体可含有编码来自一种目标靶蛋白的多个片段或表位的核酸序列，或者可含有来自许多不同的目标靶新表位抗原蛋白的一种或多种片段或表位。在一些方面，腺病毒载体可进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在特定实施方案中，靶抗原可为肿瘤新抗原或肿瘤新表位。癌症在其发展过程中可获得数十至数百种体细胞突变(称为“肿瘤mutome”)。这些突变中的每一种都有可能生成一种或多种新的T细胞新抗原和对每个患者肿瘤唯一特异的“新表位”。因为这些新表位不存在于种系中，并且直到肿瘤发生后才遇到，所以高亲和力T细胞的所有库能够识别它们并且可避免胸腺的中枢耐受性和逃避缺失。在某些方面，肿瘤特异性突变可用作开发患者特异性肿瘤疫苗的抗原靶标的有吸引力的来源。
在一些情况下，肿瘤新表位可为8个至10个氨基酸长。在一些情况下，新表位为4个至10个氨基酸长或超过10个氨基酸长。新表位可包含长度或者可包含至少、约或至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个氨基酸的长度，或由其衍生的任何数量或范围。新表位可为任何长度的氨基酸。
靶新抗原或新表位可源自癌症突变。癌症突变可产生多个靶新表位。例如，癌症突变可生成38种不同的肽，这些肽可潜在地结合至HLAI类分子以产生可靶向的新表位。在一些情况下，肽可被蛋白水解暴露，但不被破坏，被一同带入至内质网中，并且如果能够结合至MHC I类，则被递送至细胞表面用于T细胞识别。在某些情况下，表位较长且可以不同方式处理，但也必须暴露并且不被破坏，并且可对HLA II类分子而不是HLAI类具有亲和力。
在另外的方面，可响应肿瘤疗法在肿瘤细胞中产生靶新抗原或新表位。本文公开的可为生成与改善的临床反应相关的由患者CD8T细胞识别的先前鉴定的突变肿瘤新表位的库。新表位可由代表不同人类癌症类型的错义突变和移码突变组成，包括实体和血液肿瘤。在某些情况下，新表位可为任何突变。在某些情况下，突变可为错义突变。另外，在其他情况下，突变可为移码突变。
在一些情况下，进行由抗原呈递细胞加工和呈递并由肿瘤呈递在HLA上的疫苗靶标的富集。在某些情况下，可能的靶标通过对HLA的亲和力进行筛选。在一个实施方案中，可结合至HLAI类或II类的肽提供合格的疫苗靶标。HLA可属于任何类别。在某些情况下，使用HLAI类。在其他情况下，使用HLAII类。
选择疫苗靶标的一种可能方法为基于候选新表位对患者表达的HLA分子的预测亲和力来选择候选新表位。患者可具有任何HLA类型。在一些情况下，HLA结合亲和力预测算法(Parker KC等人《免疫学》1994；152:163–75)可用于鉴定合适的肿瘤新表位。
在某些实施方案中，靶抗原诸如新表位可结合MHC I类或II类分子。如本文所用，如果使用本领域已知的任何测定法检测到此类结合，则称靶抗原“结合”MHC I类或II类分子。例如，可通过监测促进125I标记的β2-微球蛋白(β2m)掺入MHC I类/β2m/肽异源三聚体复合物的能力来间接评估多肽结合MHC I类的能力(参见Parker等人《免疫学》752:163,1994)。另选地，可使用功能性肽竞争测定。
靶抗原可为全长蛋白质或可为其免疫原性片段(例如表位)。免疫原性片段可使用现有技术鉴定，诸如在Paul《基础免疫学》(Fundamental Immunology),3rd ed.,243-247(出版社，1993)和其中引用的参考文献中总结的那些技术。用于鉴定免疫原性片段的代表性技术包括筛选多肽与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。特定靶多肽的免疫原性片段可为与此类抗血清和/或T细胞反应的片段，其水平基本上不低于全长靶多肽的反应性(例如，在ELISA和/或T细胞反应性测定中)。换句话说，免疫原性片段可在此类测定中以类似于或大于全长多肽的反应性的水平反应。此类筛选通常可使用本领域普通技术人员可用的方法进行，诸如Harlow和Lane,抗体：《实验室手册》(A Laboratory Manual),冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),1988中描述的方法。
靶抗原可包括但不限于任何癌症的抗原。在特定的实施方案中，可靶向新表位。可用疫苗靶向新表位。在某些情况下，可使用基于腺病毒的疫苗。在某些情况下，靶向新抗原。新表位可包含在新抗原中。新抗原可包含多个新表位。
在某些方面，靶抗原可为肿瘤细胞表位、新抗原或新表位、肿瘤相关抗原或表位或其组合。抗原可为肿瘤细胞抗原。表位可为肿瘤细胞表位。肿瘤细胞表位可衍生自多种肿瘤抗原，诸如来自突变的肿瘤的抗原、共有的肿瘤特异性抗原、分化抗原和肿瘤中过表达的抗原。
本文所用的肿瘤新表位为肿瘤特异性表位，诸如EQVWGMAVR或CQGPEQVWGMAVREL(FLRT2的R346W突变)、GETVTMPCP或NVGETVTMPCPKVFS(VIPR2的V73M突变)、GLGAQCSEA或NNGLGAQCSEAVTLN(FCRL1的R286C突变)、RKLTTELTI、LGPERRKLTTELTII或PERRKLTTE(FAT4的S1613L突变)、MDWVWMDTT、AVMDWVWMDTTLSLS或VWMDTTLSL(PIEZO2的T2356M突变)、GKTLNPSQT、SWFREGKTLNPSQTS或REGKTLNPS(SIGLEC14的A292T突变)、VRNATSYRC、LPNVTVRNATSYRCG或NVTVRNATS(SIGLEC1的D1143N突变)、FAMAQIPSL、PFAMAQIPSLSLRAV或AQIPSLSLR(SLC4A11的Q678P突变)。编码肿瘤新表位的核苷酸序列的非限制性示例显示在实施例9的表3中。
肿瘤相关抗原可为由宿主不正常表达的抗原；它们可为突变的、截短的、错误折叠的，或者为由宿主正常表达的分子的异常表现；它们可与正常表达但在异常高水平表达的分子相同；或者它们可在异常的背景或环境中表达。肿瘤相关抗原可为例如蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、其他生物分子或其任何组合。
靶抗原的附加非限制性示例包括癌胚抗原(CEA)、叶酸受体α、WT1、brachyury(TIVS7-2，多态性)、brachyury(IVS7T/C多态性)、T brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、HPVE6、HPV E7、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSMA、PSCA、STEAP、PAP、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、EGFR、Her2/neu、Her3、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1-c、MUC1-n、MUC1、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人乳头瘤病毒(HPV)、前列腺特异性抗原(PSA)、α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、CAR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、伸长因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖基转移酶融合蛋白、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、neo-PAP、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1-或-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、磷酸丙糖异构酶、BAGE-1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、Gage 3、Gage4、Gage 5、Gage 6、Gage 7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-Al2、MAGE-C2、粘蛋白、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、gp100/Pmel17、激肽释放酶4、乳房珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、adipophilin、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IL13Rα2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、MUC1、p53、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、生存素、端粒酶、VEGF或其任何组合。在一些实施方案中，CEA可包含与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列：
ATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTCCCCACAGATGGTGCATCCCCTGGCAGAGGCTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCGCCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTGCTTCTACTTGTCCACAATCTGCCCCAGCATCTTTTTGGCTACAGCTGGTACAAAGGTGAAAGAGTGGATGGCAACCGTCAAATTATAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGATAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACATCATCCAGAATGACACAGGATTCTACACCCTACACGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACTGGCCAGTTCCGGGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACGCAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACACAGCAAGCTACAAATGTGAAACCCAGAACCCAGTGAGTGCCAGGCGCAGTGATTCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCGGATGCCCCCACCATTTCCCCTCTAAACACATCTTACAGATCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCACGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTACTCTTGGTTTGTCAATGGGACTTTCCAGCAATCCACCCAAGAGCTCTTTATCCCCAACATCACTGTGAATAATAGTGGATCCTATACGTGCCAAGCCCATAACTCAGACACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGACGATCACAGTCTATGCAGAGCCACCCAAACCCTTCATCACCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGATGAGGATGCTGTAGCCTTAACCTGTGAACCTGAGATTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGACAACAGGACCCTCACTCTACTCAGTGTCACAAGGAATGATGTAGGACCCTATGAGTGTGGAATCCAGAACGAATTAAGTGTTGACCACAGCGACCCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGACGACCCCACCATTTCCCCCTCATACACCTATTACCGTCCAGGGGTGAACCTCAGCCTCTCCTGCCATGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTATTCTTGGCTGATTGATGGGAACATCCAGCAACACACACAAGAGCTCTTTATCTCCAACATCACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATACCTGCCAGGCCAATAACTCAGCCAGTGGCCACAGCAGGACTACAGTCAAGACAATCACAGTCTCTGCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGCTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCAGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACGCAAGAGCCTATGTATGTGGAATCCAGAACTCAGTGAGTGCAAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGGATGTCCTCTATGGGCCGGACACCCCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGGACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGGGGCCACTGTCGGCATCATGATTGGAGTGCTGGTTGGGGTTGCTCTGATATAG(SEQ ID NO：106)或其片段或变体。在一些实施方案中，MUC1-C可包含与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列：
ATGACACCGGGCACCCAGTCTCCTTTCTTCCTGCTGCTGCTCCTCACAGTGCTTACAGTTGTTACGGGTTCTGGTCATGCAAGCTCTACCCCAGGTGGAGAAAAGGAGACTTCGGCTACCCAGAGAAGTTCAGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGCTGTGAGTATGACCAGCAGCGTACTCTCCAGCCACAGCCCCGGTTCAGGCTCCTCCACCACTCAGGGACAGGATGTCACTCTGGCCCCGGCCACGGAACCAGCTTCAGGTTCAGCTGCCCTTTGGGGACAGGATGTCACCTCGGTCCCAGTCACCAGGCCAGCCCTGGGCTCCACCACCCCGCCAGCCCACGATGTCACCTCAGCCCCGGACAACAAGCCAGCCCCGGGCTCCACCGCCCCCCCAGCCCACGGTGTCACCTCGTATCTTGACACCAGGCCGGCCCCGGTTTATCTTGCCCCCCCAGCCCATGGTGTCACCTCGGCCCCGGACAACAGGCCCGCCTTGGGCTCCACCGCCCCTCCAGTCCACAATGTCACCTCGGCCTCAGGCTCTGCATCAGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGCACCTCTGCCAGGGCTACCACAACCCCAGCCAGCAAGAGCACTCCATTCTCAATTCCCAGCCACCACTCTGATACTCCTACCACCCTTGCCAGCCATAGCACCAAGACTGATGCCAGTAGCACTCACCATAGCACGGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAATCACAGCACTTCTCCCCAGTTGTCTACTGGGGTCTCTTTCTTTTTCCTGTCTTTTCACATTTCAAACCTCCAGTTTAATTCCTCTCTGGAAGATCCCAGCACCGACTACTACCAAGAGCTGCAGAGAGACATTTCTGAAATGTTTTTGCAGATTTATAAACAAGGGGGTTTTCTGGGCCTCTCCAATATTAAGTTCAGGCCAGGATCTGTGGTGGTACAATTGACTCTGGCCTTCCGAGAAGGTACCATCAATGTCCACGACGTGGAGACACAGTTCAATCAGTATAAAACGGAAGCAGCCTCTCGATATAACCTGACGATCTCAGACGTCAGCGTGAGTGATGTGCCATTTCCTTTCTCTGCCCAGTCTGGGGCTGGGGTGCCAGGCTGGGGCATCGCGCTGCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTTATCTGGCCATTGTCTATCTCATTGCCTTGGCTGTCGCTCAGGTTCGCCGAAAGAACTACGGGCAGCTGGACATCTTTCCAGCCCGGGATAAATACCATCCTATGAGCGAGTACGCTCTTTACCACACCCATGGGCGCTATGTGCCCCCTAGCAGTCTTTTCCGTAGCCCCTATGAGAAGGTTTCTGCAGGTAATGGTGGCAGCTATCTCTCTTACACAAACCCAGCAGTGGCAGCCGCTTCTGCCAACTTGTAG(SEQ IDNO：107)或其片段或变体。在一些实施方案中，Brachyury可包含与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列：
ATGAGCTCCCCTGGCACCGAGAGCGCGGGAAAGAGCCTGCAGTACCGAGTGGACCACCTGCTGAGCGCCGTGGAGAATGAGCTGCAGGCGGGCAGCGAGAAGGGCGACCCCACAGAGCGCGAACTGCGCGTGGGCCTGGAGGAGAGCGAGCTGTGGCTGCGCTTCAAGGAGCTCACCAATGAGATGATCGTGACCAAGAACGGCAGGAGGATGTTTCCGGTGCTGAAGGTGAACGTGTCTGGCCTGGACCCCAACGCCATGTACTCCTTCCTGCTGGACTTCGTGGCGGCGGACAACCACCGCTGGAAGTACGTGAACGGGGAATGGGTGCCGGGGGGCAAGCCGGAGCCGCAGGCGCCCAGCTGCGTCTACATCCACCCCGACTCGCCCAACTTCGGGGCCCACTGGATGAAGGCTCCCGTCTCCTTCAGCAAAGTCAAGCTCACCAACAAGCTCAACGGAGGGGGCCAGATCATGCTGAACTCCTTGCATAAGTATGAGCCTCGAATCCACATAGTGAGAGTTGGGGGTCCACAGCGCATGATCACCAGCCACTGCTTCCCTGAGACCCAGTTCATAGCGGTGACTGCTAGAAGTGATCACAAAGAGATGATGGAGGAACCCGGAGACAGCCAGCAACCTGGGTACTCCCAATGGGGGTGGCTTCTTCCTGGAACCAGCACCGTGTGTCCACCTGCAAATCCTCATCCTCAGTTTGGAGGTGCCCTCTCCCTCCCCTCCACGCACAGCTGTGACAGGTACCCAACCCTGAGGAGCCACCGGTCCTCACCCTACCCCAGCCCCTATGCTCATCGGAACAATTCTCCAACCTATTCTGACAACTCACCTGCATGTTTATCCATGCTGCAATCCCATGACAATTGGTCCAGCCTTGGAATGCCTGCCCATCCCAGCATGCTCCCCGTGAGCCACAATGCCAGCCCACCTACCAGCTCCAGTCAGTACCCCAGCCTGTGGTCTGTGAGCAACGGCGCCGTCACCCCGGGCTCCCAGGCAGCAGCCGTGTCCAACGGGCTGGGGGCCCAGTTCTTCCGGGGCTCCCCCGCGCACTACACACCCCTCACCCATCCGGTCTCGGCGCCCTCTTCCTCGGGATCCCCACTGTACGAAGGGGCGGCCGCGGCCACAGACATCGTGGACAGCCAGTACGACGCCGCAGCCCAAGGCCGCCTCATAGCCTCATGGACACCTGTGTCGCCACCTTCCATGTGA(SEQ ID NO：108)或其片段或变体。
VIII.异源核酸
在一些实施方案中，诸如腺病毒载体的载体可包含编码一种或多种肿瘤抗原的异源核酸序列，所述肿瘤抗原诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原、其融合物或其片段，其可调节免疫应答。在某些方面，可提供第二代E2b缺失的腺病毒载体，其包含编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的异源核酸序列。在一些实施方案中，诸如腺病毒载体的载体可进一步包含编码一种或多种免疫融合配偶体的异源核酸序列，其可调节免疫应答。在某些方面，可提供第二代E2b缺失的腺病毒载体，其进一步包含编码一种或多种免疫融合配偶体的异源核酸序列。
由此，可提供编码来自如本文进一步描述的任何来源的肿瘤抗原的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体或构建体以及用此类载体或表达构建体转化或转染的宿主细胞。此外，可提供编码来自本文进一步描述的任何来源的免疫融合配偶体的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体或构建体以及用此类载体或表达构建体转化或转染的宿主细胞。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中基本上可互换使用。如本领域技术人员还将认识到的，本文所用的多核苷酸可为单链(编码或反义)或双链的，并且可为DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可包括含有内含子并且以一对一的方式对应于DNA分子的HnRNA分子，以及不含有内含子的mRNA分子。附加的编码或非编码序列可但不必存在于如本文公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可但不必与其他分子和/或支持材料连接。如本文所用，分离的多核苷酸意指多核苷酸基本上远离其他编码序列。例如，如本文所用的分离的DNA分子不含有大部分无关编码DNA，诸如大染色体片段或其他功能基因或多肽编码区域。当然，这是指最初分离的DNA分子，并且不排除随后通过实验室中的重组添加至段中的基因或编码区域。
如本领域技术人员所理解的，多核苷酸可包括基因组序列、基因组外和质粒编码的序列以及表达或可适于表达如本文所述的靶抗原、抗原片段、肽等的较小工程化基因段。此类段可为天然分离的，或通过人工合成修饰。
多核苷酸可包含天然序列(即，编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原或其一部分的内源序列)，或者可包含编码此类序列的变体或衍生物的序列。在某些实施方案中，本文所述的多核苷酸序列编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原。在一些实施方案中，多核苷酸代表已经优化用于在特定细胞类型(即人细胞系)中表达的新颖基因序列，该基因序列可基本上不同于天然核苷酸序列或变体但编码相似的蛋白质抗原。多核苷酸可进一步包含天然序列(即，编码一种或多种免疫融合配偶体或其部分的内源序列)，或者可包含编码此类序列的变体或衍生物的序列。在某些实施方案中，本文所述的多核苷酸序列编码一种或多种免疫融合配偶体，诸如本文中所述的那些。在一些实施方案中，多核苷酸代表已经优化用于在特定细胞类型(即人细胞系)中表达的新基因序列，该基因序列可基本上不同于天然核苷酸序列或变体但编码相似的蛋白质抗原。
在其他相关的实施方案中，可提供与编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的天然序列具有实质同一性的多核苷酸变体，例如相比于使用本文所述方法编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的天然多核苷酸序列(例如，使用标准参数进行BLAST分析，如下所述)，包含至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或其任何可衍生范围或值，特别为至少75％至99％或更高的序列同一性的那些。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可适当调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应同一性。
通常，多核苷酸变体将包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，特别为使得由变体多核苷酸编码的多肽表位的免疫原性或使得异源靶蛋白的免疫原性相对于由天然多核苷酸序列编码的多肽基本上不降低。如本文其他地方所述，在某些方面，多核苷酸变体编码一种或多种肿瘤抗原的变体，所述肿瘤抗原诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原，或其片段(例如，表位)，其中变体多肽或其片段(例如表位)与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向相对于天然多肽基本上不降低。术语“变体”还应理解为包括异种来源的同源基因。
在某些方面，可提供包含至少约5个至多1000个或更多个编码多肽的连续核苷酸或由其组成的多核苷酸，包括如本文所述的靶蛋白抗原，以及其间的所有中间长度。容易理解的是，在这种情况下，“中间长度”是指引用值之间的任何长度，诸如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200至500；500至1,000之间的所有整数，等等。如本文所述的多核苷酸序列可在一端或两端通过编码本文所述多肽的天然序列中未发现的附加核苷酸延长，诸如表位或异源靶蛋白。该附加序列可在所公开序列的任一端或在所公开序列的两端由1个至20个核苷酸或更多个核苷酸组成。
无论编码序列本身的长度如何，多核苷酸或其片段可与其他DNA序列组合，诸如启动子、表达控制序列、多腺苷酸化信号、附加限制酶位点、多克隆位点、其他编码段，等等，使得它们的总长度可显著变化。因此，在一些方面，考虑可使用几乎任何长度的核酸片段，其总长度受在预期的重组DNA方案中制备和使用的容易性的限制。例如，总长度为约1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10,000个、约500个、约200个、约100个、约50个碱基对长度等等(包括所有中间长度)的示例性多核苷酸段预期在某些方面为有用的。
当比较多核苷酸序列时，如果两个序列中的核苷酸序列在比对以获得最大对应性时相同时，则称两个序列为“相同的”，如下所述。通常通过在比较窗口上比较序列来鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行两个序列之间的比较。如本文所用的“比较窗口”是指至少约20个连续位置的段，通常为30至约75、40至约50，其中在两个序列最佳比对后，可将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可使用生物信息学软件的Lasergene套件(威斯康辛州麦迪逊的DNASTAR公司(DNASTAR,Inc.,Madison,Wl))中的Megalign程序，使用默认参数进行。该程序体现以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff MO(1978)蛋白质进化变化模型-用于检测远距离关系的矩阵。在华盛顿州哥伦比亚特区,国家生物医学研究基金会的达霍夫莫(编辑)阿特拉斯的《蛋白质序列和结构图谱》,第5卷,补编3,第345页至358页(Dayhoff MO(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National BiomedicalResearch Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358)中；Hein J《比对和系统发育的统一方法》，第626页至645页(1990年)(Unified Approach to Alignment andPhylogenes,pp.626-645(1990))；加利福尼亚州圣地亚哥,学术出版社,《酶学方法》第183卷(Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA)；希金斯,等人PM CABIOS1989；5:151-53；Myers EW,等人CABIOS1988；4:11-17；罗宾逊·埃德·康布1971年理论；11A05；Saitou N,等人《摩尔生物学》(Mol.Biol.Evol.)1987；4:406-25；加利福尼亚州,旧金山,弗里曼出版社(1973年)《Sneath PHA和Sokal RR数值分类法》-数值分类学的原理和实践(Sneath PHAand Sokal RR Numerical Taxonomy-the Principles andPractice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA(1973))；WilburWJ,等人Proc.Natl.Acad.,Sci.USA1983 80:726-30)。
可选地，可通过以下进行用于比较的序列的最佳比对，通过Smith等人Add.APL.Math 1981；2:482的局部同一性算法，通过Needleman等人Mol.Biol.1970 48:443的同一性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988；85:2444的用于相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机化实施方式(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(GCG)，威斯康辛州麦迪逊的575科学博士(GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wl))，或者通过检查。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个示例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人,Nucl.Acids Res.197725:3389-3402，和Altschul等人,J.MoI.Biol.1990 215:403-10。可使用BLAST和BLAST 2.0，例如使用本文所述的参数，以确定多核苷酸的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。在一个说明性示例中，对于核苷酸序列，可使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的惩罚评分；总是<0)来计算累积评分。在以下情况下，停止每个方向上的字符命中的扩展：累积比对评分从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分为零或低于零；或者达到任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11，期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989；89:10915)比对，(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为默认值。
在一些方面，“序列同一性百分比”通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定，其中与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包含20％或更少，通常5％至15％，或10％至12％的添加或缺失(即，间隙)。通过确定两个序列中相同核酸碱基出现的位置数以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以参考序列中的位置总数(即，窗口大小)并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比，来计算百分比。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的特定靶抗原或其片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，特别考虑由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。
此外，还可考虑包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因为内源基因，其由于一个或多个突变，诸如核苷酸的缺失、添加和/或取代而改变。所得mRNA和蛋白质可但不必具有改变的结构或功能。可使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。
因此，在另一个实施方案中，采用诱变方法，诸如位点特异性诱变，用于制备编码一种或多种肿瘤抗原，诸如如本文所述的肿瘤新表位或肿瘤新抗原或其片段的核酸序列的变体和/或衍生物。通过这种方法，可通过诱变编码它们的潜在多核苷酸来进行多肽序列的特定修饰。这些技术通过将一个或多个核苷酸序列变化引入多核苷酸中，提供制备和测试序列变体的直接方法，例如，结合前述考虑因素中的一个或多个。
位点特异性诱变允许通过使用编码所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸来产生突变体，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，从而在横越的缺失连接的两侧形成稳定的双链体。突变可用于选定的多核苷酸序列中以改善、改变、降低、修饰或以其他方式改变多核苷酸本身的性质，和/或改变编码的多肽的性质、活性、组成、稳定性或初级序列。
编码多肽的多核苷酸段或片段可通过例如通过化学手段直接合成片段而容易地制备，正如通常使用自动寡核苷酸合成仪实施的那样。此外，可通过应用核酸复制技术，诸如美国专利4,683,202的PCRTM技术，通过将选择的序列引入重组载体用于重组生产，以及通常通过分子生物学领域技术人员公知的其他重组DNA技术获得(参见例如《分子生物学》中的现行方案(Current Protocols in Molecular Biology)，纽约州纽约市的约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons,NY,NY))。
为了表达所需的肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原、多肽或其片段，或包含上述任何一种的融合蛋白，如本文所述，使用本领域已知的重组技术将编码多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的载体中，诸如本文所述的复制缺陷型腺病毒载体。合适的载体含有用于插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件和任何所需的接头。为了表达免疫融合配偶体，诸如本文所述的那些，使用本领域已知的重组技术将编码多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的载体中，诸如本文所述的复制缺陷型腺病毒载体。合适的载体含有用于插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件和任何所需的接头。
可使用本领域技术人员可用的方法可用于构建这些载体，其含有编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的序列以及适当的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。例如，此类技术描述于Amalfitano,等人J.Virol.1998；72:926-33；霍奇斯,等人《基因医学》(J Gene Med)2000；2:250-259；Sambrook J,等人纽约普莱恩维尤(1989年)《分子克隆》，《实验室手册》，冷泉港出版社((1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.)，和Ausubel FM,等人,纽约州纽约市约翰·威利父子公司(1989年)《分子生物学的现行协议》((1989)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y))。在一些方面，这些方法也可用于构建载体，该载体进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
可利用多种载体/宿主系统以包含和产生多核苷酸序列。这些包括但不限于微生物，诸如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA载体转化的细菌；用酵母转化的酵母；用病毒载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒载体(例如花椰菜花叶病毒、CaMV；烟草花叶病毒、TMV)或细菌载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
诸如腺病毒载体的载体中存在的“控制元件”或“调节序列”为载体的非翻译区域-增强子、启动子、5'和3'非翻译区域-其与宿主细胞蛋白质相互作用以进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可能不同。取决于所用的载体系统和宿主，可使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的序列可连接至由晚期启动子和三联前导序列组成的Ad转录/翻译复合物中。作为另一个示例，编码一种或多种免疫融合配偶体的序列可连接至由晚期启动子和三联前导序列组成的Ad转录/翻译复合物中。插入病毒基因组的非必需E1区域或E3区域可用于获得能够在感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan J,等人Proc.Natl.Acad.Sci 1984；87:3655-59)。另外，转录增强子，诸如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子，可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
特异性起始信号也可用于实现编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的序列，和/或编码一种或多种免疫融合配偶体的序列的更有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列被插入合适的表达载体的情况下，可能不需要附加转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其部分的情况下，应提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应在正确的阅读框内，以确保整个插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可具有天然的和合成的各种来源。表达效率可通过包含适合于所用特定细胞系统的增强子来增强，诸如以下文献中描述的那些(Scharf D.,等人Results Probl.Cell Differ.1994；20:125-62)。也可掺入用于转录或翻译的特定终止序列，以实现编码所选多肽的序列的有效翻译。
用于使用对产物特异的多克隆或单克隆抗体检测和测量多核苷酸编码产物(例如，一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原)的表达的多种方案为本领域已知的。示例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。在一些应用中，可使用基于单克隆抗体的双位点免疫测定法，该免疫测定法利用对给定多肽上的两个非干扰表位有反应的单克隆抗体，但是也可采用竞争性结合测定法。这些和其他测定描述于Hampton R等人(1990年；明尼苏达州圣保罗血清学方法，实验室手册，APS出版社(1990年；明尼苏达州,圣保罗,APS出版社《血清学方法》,《实验室手册》(SerologicalMethods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul.Minn.))和Maddox DE,等人J.Exp.Med.1983；758:1211-16)，等。
在某些实施方案中，可将增加所需肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的表达和/或增加所需免疫融合配偶体表达的元件掺入到表达构建体或载体，诸如本文所述的腺病毒载体的核酸序列中。这些元件包括内部核糖体结合位点(IRES；Wang,等人《当前顶级微生物免疫学》1995；203:99(Curr.Top.Microbiol.Immunol 1995；203:99)；Ehrenfeld,等人《当前顶级微生物免疫学》1995；203:65(Curr.Top.Microbiol.Immunol.1995；203:65)；Rees,等人《生物技术》1996；20:102(Biotechniques 1996；20:102)；Sugimoto,等人《生物技术》1994；2:694(v))。IRES提高翻译效率。同样，其他序列可增强表达。对于一些基因，特别是在5'末端的序列抑制转录和/或翻译。这些序列通常为可形成发夹结构的回文序列。通常缺失待递送的核酸中的任何此类序列。测定转录物或翻译产物的表达水平以确认或确定哪些序列影响表达。转录水平可通过任何已知方法测定，包括Northern印迹杂交、RNase探针保护等。蛋白质水平可通过任何已知方法测定，包括ELISA。
如本领域技术人员将认识到的，可使用本领域已知的重组技术生成包含异源核酸序列的载体，诸如本文所述的腺病毒载体，诸如描述于以下的那些：Maione,等人《美国科学院学报》2001；98:5986-91(Proc Natl Acad Sci USA 2001；98:5986-91)；Maione,等人《人类基因疗法》2000 1:859-68(Hum Gene Ther 20001:859-68)；Sandig,等人《美国科学院学报》,2000；97:1002-07(Proc Natl Acad Sci USA,2000；97:1002-07)；Harui,等人《基因疗法》2004；11:1617-26(Gene Therapy 2004；11:1617-26)；帕克斯,等人《美国科学院学报》1996；93:13565-570(Proc Natl Acad Sci USA 1996；93:13565-570)；DelloRusso,等人《美国科学院学报》2002；99:12979-984(Proc Natl Acad Sci USA 2002；99:12979-984)；纽约州纽约市约翰·威利父子公司《分子生物学的现行协议》(Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,NY,NY))。
IX.药物组合物
在某些方面，可提供包含编码一种或多种肿瘤抗原的核酸序列的药物组合物，所述肿瘤抗原诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原，针对所述肿瘤抗原将生成免疫应答。例如，肿瘤抗原可包括但不限于在固体或液体肿瘤上鉴定的肿瘤新抗原。可通过任何合适的方法鉴定肿瘤新抗原。在一些方面，这些药物组合物进一步包含编码免疫融合配偶体的核酸序列。
例如，本文所述的腺病毒载体原种可与合适的缓冲液、生理学上可接受的载体、赋形剂等组合。在某些实施方案中，在合适的缓冲液，诸如无菌PBS中施用适当数量的腺病毒载体颗粒。在某些情况下，期望通过肠胃外、肿瘤内、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内递送本文公开的腺病毒载体组合物。
在某些实施方案中，药物组合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可在适当地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合的水中制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在其他实施方案中，E2b缺失的腺病毒载体可以丸剂形式递送，通过吞咽或通过栓剂递送。
适于注射使用的示例性药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(例如，参见美国专利5,466,468)。在所有情况下，这种形式必须为无菌的并且必须为流体，以便存在易于注射的程度。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物诸如细菌、霉菌和真菌的污染作用。
载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、脂质、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。例如，通过利用包衣诸如卵磷脂，通过在分散的情况下维持所需的粒度和/或通过利用表面活性剂，可保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸(sorbic acid)、硫柳汞(thimerosal)等可促进微生物作用的预防。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中利用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现可注射组合物的延长吸收。
在一个实施方案中，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，可适当地缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开内容，可使用的无菌水性介质对于本领域技术人员而言为已知的。例如，可将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且将其加入到1000ml的皮下注射液中或者在提议的输注部位注射(参见例如，《雷明顿制药科学》(“Remington’s Pharmaceutical Sciences”)第15版、第1035页至第1038页和第1570页至第1580页)。取决于所治疗的受试者的状况，剂量的一些变化必然发生。此外，对于人类施用，制剂当然优选满足FDA生物学标准办公室要求的无菌性、致热原性和一般安全性和纯度标准。
载体可进一步包含任何和所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途为本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可掺入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。
本文所述的治疗组合物的施用途径和频率以及剂量将因个体和疾病而异，并且可使用标准技术容易地确定。通常，药物组合物和疫苗可通过注射(例如，皮内、肌肉内、静脉内或皮下)、鼻内(例如通过抽吸)、以丸剂形式(例如，吞咽、用于阴道或直肠递送的栓剂)施用。在某些实施方案中，可在6周的时间内施用1个至3个剂量，并且此后可定期进行进一步的加强疫苗接种。
例如，合适的剂量为腺病毒载体的量，当如上所述施用时，其能够促进如本文其他地方所述的靶抗原免疫应答。在某些实施方案中，免疫应答比基础(即未治疗)水平高至少10％至50％。可通过测量患者中的靶抗原抗体或通过疫苗依赖性生成能够在体外杀伤肿瘤新表位表达细胞的细胞溶解效应细胞，或者本领域已知的用于监测免疫应答的其他方法来监测此类应答。
通常，合适的剂量和治疗方案提供足以提供预防益处的量的腺病毒载体。通常可使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定来评估保护性免疫应答，这可使用在免疫(疫苗接种)之前和之后从患者获得的样品进行。
在某些方面，施用于患者或受试者的组合物的实际剂量可通过物理和生理因素确定，诸如体重、病况的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时的治疗性干预、患者的特发性疾病和施用途径。在任何情况下，负责施用的从业者将确定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。
虽然本文描述的组合物和方法的一个优点为能够用相同的腺病毒载体进行多次疫苗接种，特别是在对Ad具有预先存在的免疫力的个体中，但本文所述的腺病毒疫苗也可作为致敏(prime)和加强方案的一部分施用。混合模式致敏和加强接种方案可引起增强的免疫应答。因此，一个方面为一种用质粒疫苗，诸如包含编码一种或多种肿瘤抗原，诸如肿瘤新表位或肿瘤新抗原的核酸序列的质粒载体致敏受试者的方法，该方法通过施用质粒疫苗至少一次，允许经过预定的时间长度，并且然后通过施用本文所述的腺病毒载体进行加强。另一方面为用质粒疫苗，诸如进一步包含编码一种或多种免疫融合配偶体的核酸序列的质粒载体致敏受试者的方法，该方法通过施用质粒疫苗至少一次，允许经过预定的时间长度，并且然后通过施用本文所述的腺病毒载体进行加强。
可采用多次致敏，例如1至3次，但可使用更多次。致敏和加强之间的时间长度通常可从大约六个月至一年不等，但是可使用其他时间范围。
在某些实施方案中，药物组合物可包含，例如，至少约0.1％的治疗剂，诸如本文中用作疫苗的表达构建体或载体、相关的脂质纳米囊泡，或载有治疗剂的外来体或纳米囊泡。在其他实施方案中，治疗剂可占该单位重量的例如约2％至约75％，或约25％至约60％，和其中可衍生的任何范围。在其他非限制性示例中，剂量还可包含每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000毫克/kg/体重或更多，以及其中可衍生的任何范围。在从本文所列数字可衍生的范围的非限制性示例中，可施用范围为约5微克/kg/体重至约100毫克/kg/体重，约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等。
基于预期目标确定有效量的药物组合物。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的药物组合物，该药物组合物经计算可产生与其施用相关的上述所需反应，即适当的途径和治疗方案。根据治疗次数和单位剂量，施用量取决于所需的保护作用或效果。
精确量的药物组合物还取决于从业者的判断并且为每个个体特有的。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状态、施用途径、治疗的预期目标(例如，缓解症状与治愈)以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。
在某些方面，包含疫苗接种方案的组合物可通过任何途径单独施用或与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用，并且此类施用可单剂量和多剂量进行。更特别地，药物组合物可与片剂、胶囊、锭剂、含片、手工糖果、粉末、喷雾剂、水悬浮液、可注射溶液、酏剂、糖浆等形式的各种药学上可接受的惰性载体组合。此类载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂等。此外，此类口服药物制剂可通过常用于此目的的各种试剂适当地增甜和/或调味。全文所述的组合物可配制成药物，并且用于治疗有需要的被诊断患有疾病，例如癌症的人或哺乳动物，或用于增强免疫应答。
在某些实施方案中，本文所述的病毒载体或组合物可与一种或多种免疫刺激剂诸如佐剂联合施用。免疫刺激剂基本上是指增强或加强抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。一种类型的免疫刺激剂包含佐剂。许多佐剂含有设计用于保护抗原免于快速分解代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答的刺激剂，诸如脂质A、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌衍生的蛋白质。某些佐剂可商购获得，例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco实验室(Difco Laboratories))；默克佐剂65(默克公司(Merck and Company,Inc.))AS-2(史克必成(SmithKline Beecham))；铝盐诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；单磷酰脂质A和奎尔A(Quil A)。细胞因子，诸如GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和/或MIF，以及其他细胞因子，比如生长因子也可用作佐剂。
在某些实施方案中，佐剂组合物可为诱导主要为Th1型的免疫应答的佐剂组合物。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于有利于诱导对施用的抗原的细胞介导的免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于有利于诱导体液免疫应答。在应用如本文提供的疫苗后，患者可支持包括Th1和/或Th2型应答的免疫应答。在某些实施方案中，其中应答主要为Th1型，Th1型细胞因子的水平将比Th2型细胞因子的水平增加至更大程度。使用标准测定可容易地评定这些细胞因子的水平。因此，各种实施方案涉及使用细胞因子提高针对靶抗原，例如肿瘤新抗原或新表位的免疫应答的疗法，所述细胞因子例如IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和/或MIF与复制缺陷型病毒载体治疗同时供应。在一些实施方案中，细胞因子或编码细胞因子的核酸与本文所述的复制缺陷型病毒载体一起施用。在一些实施方案中，细胞因子施用在病毒载体施用之前或之后进行。在一些实施方案中，能够产生针对靶抗原，诸如肿瘤新抗原或新表位的免疫应答的复制缺陷型病毒载体进一步包含编码细胞因子的序列。
用于引发主要为Th1型应答的某些示例性佐剂包括，例如，单磷酰脂质A，例如3-去氧酰化单磷酰脂质A，以及铝盐的组合。佐剂为可商购获得的(参见，例如，美国专利第4,436,727号；第4,877,611号；第4,866,034号和第4,912,094号)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也主要诱导Th1应答。(参见，例如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利第6,008,200号和第5,856,462号)。也可使用免疫刺激DNA序列。
在一些实施方案中使用的另一种佐剂包括皂苷，诸如奎尔A或其衍生物，包括QS21和QS7(阿奎拉生物制药公司(Aquila Biopharmaceuticals Inc.))，Escin；洋地黄皂苷(Digitonin)；或满天星(Gypsophila)或藜麦皂苷(Chenopodium quinoa saponins)。其他制剂可在佐剂组合中包含一种以上的皂苷，例如包含QS21、QS7、奎尔A、β-七叶皂苷或洋地黄皂苷的组中的至少两种的组合。
在一些实施方案中，组合物可通过鼻内喷雾、吸入和/或其他气溶胶递送载体递送。可采用使用鼻内微粒树脂和溶血磷脂酰甘油化合物的药物递送(参见，例如，美国专利第5,725,871号)。同样，可采用聚四氟乙烯支持基质形式的示例性透粘膜药物递送(参见，例如，美国专利第5,780,045号)。
脂质体、纳米胶囊、微粒、脂质颗粒、囊泡等可用于将如本文所述的组合物引入合适的热细胞/生物体中。如本文所述的组合物可配制用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中的递送。另选地，如本文所述的组合物可共价或非共价结合至此类载体媒介的表面。脂质体可有效地用于将基因、各种药物、放射治疗剂、酶、病毒、转录因子、变构效应子等引入各种培养的细胞系和动物中。此外，脂质体的使用似乎与全身递送后的自身免疫应答或不可接受的毒性无关。在一些实施方案中，脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成，并且自发形成多层同心双层囊泡(即多层囊泡(MLV))。
在一些实施方案中，提供如本文所述的组合物或载体的药学上可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以稳定且可重复的方式包封药物组合物。为了避免由细胞内聚合物过载引起的副作用，可使用能够在体内降解的聚合物设计此类超细颗粒(大小约0.1μm)。
在某些方面，包含治疗有效量的IL-15的药物组合物或包含编码IL-15的核苷酸序列的复制缺陷型载体可与本文提供的一种或多种疗法组合施用于有需要的个体，特别为包含编码一种或多种肿瘤新抗原或肿瘤新表位的核酸序列的一种或多种腺病毒载体。
白细胞介素15(IL-15)为与IL-2具有结构相似性的细胞因子。与IL-2一样，IL-15通过由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同γ链(γ-C，CD132)组成的复合物结合并发出信号。在被病毒感染后，IL-15由单核吞噬细胞(和一些其他细胞)分泌。这种细胞因子诱导自然杀伤细胞的细胞增殖；先天免疫系统的细胞，其主要作用为杀伤病毒感染的细胞。
IL-15可在临床前模型中增强CD8+T细胞的抗肿瘤免疫力。用于评估IL-15在转移性黑素瘤和肾细胞癌(肾癌)患者中的安全性、剂量和抗肿瘤功效的I期临床试验已开始在美国国立卫生研究院招募患者。
本文公开的IL-15还可包括IL-15的突变体，其经修饰以维持其天然形式的功能。
IL-15为小鼠中由染色体4的34kb区域4q31和由染色体8的中心区域编码的14-15kDa糖蛋白。人IL-15基因包含9个外显子(1至8和4A)和8个内含子，其中4个(外显子5至8)编码成熟蛋白。已经报告编码相同蛋白质的该基因的两个替代剪接的转录物变体。最初鉴定的同种型具有48个氨基酸的长信号肽(IL-15LSP)，由316bp的5'-非翻译区域(UTR)、486bp的编码序列和C-末端400bp的3'-UTR区域组成。另一种同种型(IL-15SSP)具有由外显子4A和5编码的21个氨基酸的短信号肽。两种同种型在N-末端的信号序列之间共享11个氨基酸。尽管两种同种型都产生相同的成熟蛋白质，但它们的细胞运输方式不同。在高尔基体[GC]、早期内体和内质网(ER)中鉴定出IL-15LSP同种型。它以两种形式存在，特别为在树突细胞上分泌和膜结合。另一方面，IL-15SSP同种型并不分泌，并且它似乎局限于细胞质和细胞核，其在细胞周期的调节中起重要作用。
已经证明，通过在小鼠中交替剪接生成两种IL-15mRNA同种型。具有含有另外3'剪接位点的替代外显子5的同种型表现出高的翻译效率，并且该产物在N-末端的信号序列中缺乏疏水结构域。这表明源自该同种型的蛋白质位于细胞内。具有正常外显子5的另一种同种型，其通过替代外显子5的整体剪接生成，可在细胞外释放。
尽管IL-15mRNA可在许多细胞和组织中发现，包括肥大细胞、癌细胞或成纤维细胞，但这种细胞因子主要由树突细胞、单核细胞和巨噬细胞作为成熟蛋白产生。IL-15mRNA的广泛出现与蛋白质的产量有限之间的这种差异可通过在人类中存在十二个和在小鼠上游起始密码子中存在五个来解释，其可抑制IL-15mRNA的翻译。翻译无活性mRNA存储在细胞内并且可在特定信号上诱导。由细胞因子诸如GM-CSF、双链mRNA、未甲基化的CpG寡核苷酸、脂多糖(LPS)通过Toll样受体(TLR)、干扰素γ(IFN-γ)或在单核细胞疱疹病毒、结核分枝杆菌和白色念珠菌感染后可刺激IL-15的表达。
X.自然杀伤(NK)细胞
在某些实施方案中，可提供天然或工程化NK细胞以与本文所述的基于腺病毒载体的组合物或免疫疗法组合施用于有需要的受试者。
免疫系统为不同免疫细胞家族的集合(tapestry)，每个免疫细胞家族在保护免受感染和疾病方面具有其自身独特的作用。在这些免疫细胞中，自然杀伤细胞或NK细胞为身体的第一道防线。NK细胞具有快速寻找和破坏异常细胞，诸如癌症或病毒感染的细胞的先天能力，而无需事先暴露或被其他支持分子活化。与诸如T细胞的适应性免疫细胞相反，NK细胞已经在第1阶段临床试验中用作基于细胞的“现成”治疗，并且已经证明对癌症的肿瘤杀伤能力。
1.aNK细胞
除了天然NK细胞之外，可提供NK细胞用于向不表达杀伤抑制受体(KIR)的患者进行施用，其患病细胞经常用来规避NK细胞的杀伤功能。这种独特的活化的NK或aNK细胞缺乏这些抑制性受体，同时保留广泛的活化受体，这些活化受体能够选择性靶向和杀伤患病细胞。aNK细胞还携带更大负载量的颗粒酶和含有穿孔素的颗粒，从而使它们能够向多个靶标递送更大负载量的致死酶。
2.taNK细胞
嵌合抗原受体(CAR)技术为目前正在开发的最新颖的癌症治疗方法之一。CAR为允许免疫效应细胞靶向显示特异性表面抗原(靶标活化的自然杀伤剂)的癌细胞的蛋白质为一个平台，在该平台上aNK细胞用一种或多种CAR改造以靶向癌症上发现的蛋白质，并且然后与广谱的CAR整合。与使用患者或供体来源的效应细胞(例如自体T细胞)的其他CAR方法相比，该策略具有多个优点，尤其为在可扩展性、质量控制和一致性方面。
大多数癌细胞杀伤依赖于ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)，因此效应免疫细胞附着于抗体，而抗体又结合靶癌细胞，从而促进效应细胞对癌症的杀伤。NK细胞为ADCC体内的关键效应细胞，并且利用特异性受体(CD16)结合抗体。
3.HaNK细胞
研究表明，可能只有20％的人群一致地表达CD16的“高亲和力”变体，与具有“低亲和力”CD16的患者相比，这与更有利的疗法结果密切相关。另外，许多癌症患者由于化学疗法、疾病本身或其他因素而具有严重削弱的免疫系统。
在某些方面，修饰haNK细胞以表达高亲和力CD16。因此，haNK细胞可增强针对癌细胞的广谱抗体的疗法功效。
XI.组合疗法
可将全文所述的组合物配制成药物药剂并且用于治疗有需要或诊断患有疾病，例如癌症的人或哺乳动物。这些药剂可与一种或多种附加疫苗共同施用于人或哺乳动物，或者与一种或多种常规癌症疗法或替代癌症疗法、细胞因子诸如IL-15或编码此类细胞因子的核酸序列、工程化自然杀伤细胞或免疫途径限制点调制剂一起施用，如本文所述。
常规癌症疗法包括一种或多种选自基于化学或放射的治疗和手术的疗法。化学疗法包括，例如，顺铂(cisplatin)(CDDP)、卡铂(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、喜树碱(camptothecin)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安(busulfan)、亚硝基脲(nitrosurea)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普利霉素(plicomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)(VP16)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、雌激素受体结合剂、紫杉醇(taxol)、吉西他滨(gemcitabien)、诺维本(navelbine)、法呢基蛋白质转移酶抑制剂(farnesyl-protein tansferase inhibitors)、移植丁(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱(vincristin)、长春碱(vinblastin)和甲氨蝶呤(methotrexate)或前述的任何类似物或衍生物变体。
引起DNA损伤并且已广泛使用的放射疗法包括通常所知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑其他形式的DNA损伤因子，诸如微波和紫外线放射。很可能这些因素中的所有都会对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。X射线的剂量范围从50伦琴至200伦琴的日剂量持续延长的时间段(3周至4周)，至2000伦琴至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、发射的放射强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。
当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将疗法构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并置的过程。为了实现细胞杀伤或停滞，将两种药剂以有效杀伤细胞或防止细胞分裂的组合量递送至细胞中。
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术为可与其他疗法联合使用的癌症治疗，诸如本文所述的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。
治愈性手术包括切除，其中癌组织中的全部或部分被物理去除、切除和/或破坏。肿瘤切除是指至少部分肿瘤的物理去除。除肿瘤切除外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科和显微手术(莫氏手术)。进一步预期本文所述的治疗方法可与去除浅表癌症、癌前病变或附带量的正常组织联合使用。
在切除癌细胞、组织或肿瘤中的所有的一部分后，可在体内形成腔。可通过灌注、直接注射或利用附加抗癌疗法局部应用该区域来完成治疗。此类治疗可重复，例如，每1天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天或每7天，或者每1周、每2周、每3周、每4周和每5周，或者每1个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每12个月。这些治疗也可为不同的剂量。
替代性癌症疗法包括除手术、化学疗法和放射疗法之外的任何癌症疗法，诸如免疫疗法、基因疗法、激素疗法或其组合。使用本发明方法鉴定具有不良预后的受试者可能对单独的常规治疗不具有有利反应，并且可开处方或施用一种或多种替代性癌症疗法本身或者与一种或多种常规治疗组合。
免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应子可为，例如，对肿瘤细胞表面上的某些标记物具有特异性的抗体。抗体单独地可充当疗法的效应子，或者它可募集其他细胞以实际影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并且仅充当靶向剂。另选地，效应子可为携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
基因疗法为将包括DNA或RNA的多核苷酸插入受试者的细胞和组织中以治疗疾病。反义疗法也为基因疗法的一种形式。治疗性多核苷酸可在第一次癌症治疗之前、之后或同时施用。在某些方面考虑递送编码多种蛋白质的载体。例如，外源性肿瘤抑制癌基因的细胞表达将发挥其抑制过度细胞增殖的功能，诸如p53、p16和C-CAM。
用于改善治疗性疗效的附加药剂包括免疫调制剂、影响细胞表面受体和GAP连接上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂或增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的药剂。免疫调制剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、干扰素β和干扰素γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。进一步预期细胞表面受体或其配体诸如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调将通过对过度增殖细胞建立自分泌或旁分泌作用来增强细胞凋亡诱导能力。通过提高GAP连接的数量来增加细胞间信号传导将增加对邻近的过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可与本文所述的药物组合物组合使用，以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附的抑制剂可改善本文所述药物组合物的功效。细胞粘附抑制剂的示例为粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步预期增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂，诸如抗体c225，可与本文所述的药物组合物组合使用以改善治疗功效。
激素疗法还可与先前描述的任何其他癌症疗法组合使用。激素的使用可用于治疗某些癌症，诸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌，以降低水平或阻断某些激素诸如睾酮或雌激素的作用。该治疗通常与至少一种其他癌症疗法组合用作治疗选项或降低转移风险。
如本文所用的“化学治疗剂”或“化学治疗化合物”及其语法等同物可为用于治疗癌症的化学化合物。可与所公开的T细胞组合使用的化学治疗性癌症药剂包括但不限于有丝分裂抑制剂(长春花生物碱(vinca alkaloids))。这些包括长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)和NavelbineTM(长春瑞滨，5'-去甲肾上腺素)。在其他实施方案中，化学治疗性癌症药剂包括拓扑异构酶I抑制剂，诸如喜树碱(camptothecin)化合物。如本文所用，“喜树碱化合物”包括CamptosarTM(伊立替康(irinotecan)HCL)、HycamtinTM(拓扑替康(topotecan)HCL)和衍生自喜树碱及其类似物的其他化合物。可用于本文公开的方法和组合物中的另一类化学治疗性癌症药剂为鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物，诸如依托泊苷、替尼泊苷(teniposide)和米托泊甙(mitopodozide)。
在某些方面，本文所述的方法或组合物进一步包括使用称为烷化剂的其他化学治疗性癌症药剂，其使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化。这些包括但不限于顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、尿嘧啶氮芥、氯霉素和达卡巴嗪(dacarbazine)。本公开包括作为化学治疗剂的抗代谢物。这些类型的药剂的示例包括胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。可用于本文公开的方法和组合物中的另一类化学治疗性癌症药剂包括抗生素。示例包括但不限于多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(dactinomycin)、柔红霉素、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、丝裂霉素C和道诺霉素(daunomycin)。对于这些化合物，存在许多可市售获得的脂质体制剂。在某些方面，本文所述的方法或组合物进一步包括使用其他化学治疗性癌症药剂，包括但不限于抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷(azacytidine)、安吖啶(amsacrine)、美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌(mitoxantrone)。
本文公开的腺病毒疫苗可与其他抗肿瘤剂组合施用，包括细胞毒性/抗肿瘤剂和抗血管生成剂。细胞毒性/抗肿瘤剂可定义为攻击和杀伤癌细胞的药剂。一些细胞毒性/抗肿瘤剂可为烷化剂，其使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，例如顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、尿嘧啶氮芥、氯霉素和达卡巴嗪。其他细胞毒性/抗肿瘤剂可为肿瘤细胞的抗代谢物，例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其他细胞毒性/抗肿瘤剂可为抗生素，例如多柔比星、博来霉素、放线菌素、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。对于这些化合物，存在许多可市售获得的脂质体制剂。还有其他细胞毒性/抗肿瘤剂可为有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春碱和依托泊苷。其他细胞毒性/抗肿瘤剂包括紫杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。
包含CAR T细胞群体、T细胞受体工程化T细胞、B细胞受体工程细胞的其他制剂可在施用本文所述的药物组合物之前或之后联合施用于受试者。当实施本文所述的方法时，可向受试者施用治疗性有效的过继转移细胞群体。通常，施用包含约1×104个至约1×1010个CAR T细胞、T细胞受体工程细胞或B细胞受体工程细胞的制剂。在一些情况下，制剂包含约1×105个至约1×109个工程细胞、约5×105个至约5×108个工程细胞或约1×106个至约1×107个工程细胞。然而，施用于受试者的工程细胞的数量将在宽范围内变化，这取决于癌症的位置、来源、身份、程度和严重程度、待治疗受试者的年龄和病况等。医生将最终确定适当的剂量。
也可使用抗血管生成剂。用于所公开的方法和组合物的合适的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体，包括人源化和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他血管生成抑制剂包括血管抑制素、内皮抑素、干扰素、白细胞介素1(包括α和β)白细胞介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1和金属蛋白酶-2(TIMP-1和TIMP-2)的组织抑制剂。还可使用小分子，包括拓扑异构酶诸如雷佐生(razoxane)，具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
在一些情况下，例如，在治疗癌症的组合物、制剂和方法中，所施用的组合物或制剂的单位剂量可为5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg。在一些情况下，所施用的组合物或制剂的总量可为0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g、10g、11g、12g、13g、14g、15g、16g、17g、18g、19g、20g、25g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g或100g。
XII.免疫融合配偶体抗原靶标
本文所述的病毒载体或组合物可进一步包含编码蛋白质的核酸序列，或“免疫融合配偶体”，其可增加靶抗原，诸如靶抗原、靶表位、肿瘤新抗原或新表位的免疫原性。在这方面，用含有此类蛋白质的病毒载体免疫后产生的蛋白质可为融合蛋白质，该融合蛋白质包含与增加目标靶抗原的免疫原性的蛋白质融合的目标靶抗原。此外，与编码新表位或靶表位和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体的组合疗法可引起增强免疫应答，使得两种疗法部分的组合与单独编码新表位或靶表位或单独的免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体相比起到协同加强免疫应答的作用。例如，与编码新表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体的组合疗法可引起协同增强刺激抗原特异性效应子CD4+T细胞和CD8+T细胞，刺激针对杀伤受感染细胞的NK细胞应答，刺激经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制或其任何组合针对杀伤受感染细胞的中性粒细胞或单核细胞应答。这种协同加强可在施用至有需要的受试者后极大地改善存活结果。在某些实施方案中，与编码新表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体的组合疗法可引起生成免疫应答，所述免疫应答包括施用腺病毒载体的受试者中靶抗原特异性CTL活性相比于对照增加约1.5倍至20倍或更多倍。在另一个实施方案中，生成免疫应答包括施用编码新表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体的受试者中靶特异性CTL活性相比于对照增加约1.5倍至20倍或更多倍。在另一个实施方案中，生成免疫应答，该免疫应答包括通过测量细胞因子分泌的ELISpot测定法测量的靶抗原特异性细胞介导的免疫活性相比于对照增加约1.5倍至20倍或更多倍，所述细胞因子诸如干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其他细胞因子。在另一个实施方案中，生成免疫应答包括在施用编码新表位抗原和如本文所述的免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体的受试者中靶特异性抗体产量相比于合适对照增加1.5倍至5倍。在另一个实施方案中，生成免疫应答包括施用腺病毒载体的受试者中靶特异性抗体产量相比于对照增加约1.5倍至20倍或更多倍。
作为附加实例，与编码靶表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体的组合疗法可引起协同增强刺激抗原特异性效应子CD4+T细胞和CD8+T细胞，刺激针对杀伤受感染细胞的NK细胞应答，刺激经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制或其任何组合针对杀伤受感染细胞的中性粒细胞或单核细胞应答。这种协同加强可在施用至有需要的受试者后极大地改善存活结果。在某些实施方案中，与编码靶表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体的组合疗法可引起生成免疫应答，所述免疫应答包括施用腺病毒载体的受试者中靶抗原特异性CTL活性相比于对照增加约1.5倍至20倍或更多倍。在另一个实施方案中，生成免疫应答包括施用编码靶表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体的受试者中靶特异性CTL活性相比于对照增加约1.5倍至20倍或更多倍。在另一个实施方案中，生成免疫应答，该免疫应答包括通过测量细胞因子分泌的ELISpot测定法测量的靶抗原特异性细胞介导的免疫活性相比于对照增加约1.5倍至20倍或更多倍，所述细胞因子诸如干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其他细胞因子。在另一个实施方案中，生成免疫应答包括施用如本文所述的腺病毒载体的受试者中靶特异性抗体产量相比于合适对照增加1.5倍至5倍。在另一个实施方案中，生成免疫应答包括施用腺病毒载体的受试者中靶特异性抗体产量相比于对照增加约1.5倍至20倍或更多倍。
在一个实施方案中，此类免疫融合配偶体衍生自分枝杆菌属物种，诸如结核分枝杆菌衍生的Ra12片段。衍生自分枝杆菌属物种的免疫融合配偶体可为SEQ ID NO：39至SEQID NO：47中列出的任何一种序列。Ra12组合物及其用于增强异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的方法描述于美国专利第7,009,042号，该专利通过引用整体并入本文。简而言之，Ra12是指多核苷酸区域，其为结核分枝杆菌MTB32A核酸的子序列。MTB32A为一种32kDa的丝氨酸蛋白酶，由结核分枝杆菌的有毒和无毒菌株中的基因编码。已经描述MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列(参见，例如，美国专利第7,009,042号；Skeiky等人,《感染和免疫》(Infection and Immun.)67:3998-4007(1999)，该专利通过引用整体并入本文)。MTB32A编码序列的C末端片段可高水平表达，并且在整个纯化过程中保持为可溶性多肽。此外，Ra12可增强与其融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。Ra12融合多肽可包含对应于MTB32A的氨基酸残基192至氨基酸残基323的14kDa C末端片段。其他Ra12多核苷酸通常可包含编码Ra12多肽的一部分的至少约15个、30个、60个、100个、200个、300个或更多个核苷酸。Ra12多核苷酸可包含天然序列(即，编码Ra12多肽或其一部分的内源序列)或可包含此类序列的变体。Ra12多核苷酸变体可含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得编码的融合多肽的生物学活性相对于包含天然Ra12多肽的融合多肽基本上不降低。变体可与编码天然Ra12多肽或其一部分的多核苷酸序列具有至少约70％、80％或90％或更高的同一性。
在某些方面，免疫融合配偶体可衍生自蛋白D，即革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白。衍生自蛋白D的免疫融合配偶体可为SEQ ID NO：48中列出的序列。在一些情况下，蛋白质D衍生物包含大约蛋白质的前三分之一(例如，第一个N末端100个至110个氨基酸)。蛋白质D衍生物可被脂质化。在某些实施方案中，脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包含在N末端以为多肽提供附加外源T细胞表位，这可增加大肠杆菌中的表达水平并且可起到表达增强子的作用。脂质尾部可确保抗原向抗原呈递细胞的最佳呈递。其他融合配偶体可包括来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。通常，使用N-末端81个氨基酸，但是可使用包括T辅助表位的不同片段。
在某些方面，免疫融合配偶体可为称为LYTA的蛋白质，或其一部分(特别为C-末端部分)。衍生自LYTA的免疫融合配偶体可为SEQ ID NO：49中列出的序列。LYTA衍生自肺炎链球菌，其合成称为酰胺酶LYTA(由LytA基因编码)的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶。LYTA为一种自溶素，其可特异性降解肽聚糖骨架中的某些键。LYTA蛋白的C末端结构域负责对胆碱或一些胆碱类似物诸如DEAE的亲和力。该性质已被用于开发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。可采用在氨基末端含有C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化。在另一个实施方案中，LYTA的重复部分可掺入融合多肽中。例如，重复部分可在残基178开始的C-末端区域中找到。一个特定的重复部分包含残基188至残基305。
在一些实施方案中，靶抗原与免疫融合配偶体融合，所述免疫融合配偶体在本文中也称为“免疫原性组分”，包含选自以下构成的组的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。靶抗原融合物可产生与以下中的一种或多种具有基本同一性的蛋白质：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。靶抗原融合体可编码核酸，所述核酸编码与以下中的一种或多种具有基本同一性的蛋白质：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。在一些实施方案中，靶抗原融合物进一步包含一种或多种免疫融合配偶体，所述免疫融合配偶体在本文中也称为“免疫原性组分”，包含选自以下构成的组的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。IFN-γ的序列可为但不限于如SEQ ID NO：50中列出的序列。TNFα的序列可为但不限于如SEQ ID NO：51中列出的序列。IL-2的序列可为但不限于如SEQ IDNO：52中列出的序列。IL-8的序列可为但不限于如SEQ ID NO：53中列出的序列。IL-12的序列可为但不限于如SEQ ID NO：54中列出的序列。IL-18的序列可为但不限于如SEQ ID NO：55中列出的序列。IL-7的序列可为但不限于如SEQ ID NO：56中列出的序列。IL-3的序列可为但不限于如SEQ ID NO：57中列出的序列。IL-4的序列可为但不限于如SEQ ID NO：58中列出的序列。IL-5的序列可为但不限于如SEQ ID NO：59中列出的序列。IL-6的序列可为但不限于如SEQ ID NO：60中列出的序列。IL-9的序列可为但不限于如SEQ ID NO：61中列出的序列。IL-10的序列可为但不限于如SEQ ID NO：62中列出的序列。IL-13的序列可为但不限于如SEQ ID NO：63中列出的序列。IL-15的序列可为但不限于如SEQ ID NO：64中列出的序列。IL-16的序列可为但不限于如SEQ ID NO：109中列出的序列。IL-17的序列可为但不限于如SEQ ID NO：110中列出的序列。IL-23的序列可为但不限于如SEQ ID NO：111中列出的序列。IL-32的序列可为但不限于如SEQ ID NO：112中列出的序列。
在一些实施方案中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体在本文中也称为“免疫原性组分”，包含选自以下构成的组的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。在一些实施方案中，靶抗原在细胞中与免疫融合配偶体共表达，所述免疫融合配偶体在本文中也称为“免疫原性组分”，包含选自以下构成的组的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。
在一些实施方案中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体包括CpG ODN(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：65)、霍乱毒素(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：66)、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区域(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：67)、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区域(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：68)、Hp91(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：69)、CCL20(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：70)、CCL3(非限制性示例序列显示于SEQID NO：71)、GM-CSF(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：72)、G-CSF(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：73)、LPS肽模拟物(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：74至SEQ ID NO：85)，志贺毒素(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：86)、白喉毒素(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：87)或CRM197(非限制性示例序列显示于SEQ ID NO：90)。
在一些实施方案中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体包含IL-15超激动剂。白细胞介素15(IL-15)为病毒感染后分泌的一种天然存在的炎性细胞因子。分泌的IL-15可通过其效应免疫细胞上的同源受体发出信号来发挥其功能，因此可引起效应免疫细胞活性的整体增强。
基于IL-15刺激和维持细胞免疫应答的广泛能力，据信它为一种有希望的免疫疗法药物，其可能潜在地治愈某些癌症。然而，IL-15临床开发的主要限制可能包括标准哺乳动物细胞表达系统的低产量和短的血清半衰期。此外，包含由相同细胞共表达的蛋白质而不为游离IL-15细胞因子的IL-15：IL-15Rα复合物可负责刺激携带IL-15βγc受体的免疫效应细胞。
为了应对这些缺点，鉴定新颖的IL-15超激动剂突变体(IL-15N72D)，其具有增加的结合IL-15Rβγc的能力和增强的生物活性。将小鼠或人IL-15Rα和Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区域)添加至等摩尔浓度的IL-15N72D可进一步提高IL-15的生物学活性，使得IL-15N72D：IL-15Rα/Fc超-激动剂复合物表现出支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，其比游离IL-15细胞因子低10倍以上。
在一些实施方案中，IL-15超激动剂可为新型IL-15超激动剂突变体(IL-15N72D)。在某些实施方案中，将小鼠或人IL-15Rα和Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区)添加至等摩尔浓度的IL-15N72D可提供IL-15生物活性的进一步增加，使得IL-15N72D：IL-15Rα/Fc超激动剂复合物显示出支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，该中值有效浓度可比游离IL-15细胞因子低10倍以上。
因此，在一些实施方案中，本公开提供一种IL-15N72D：IL-15Rα/Fc超激动剂复合物，其具有用于支持IL-15依赖性细胞生长的EC50，其比游离IL-15细胞因子的EC50低2倍以上、低3倍以上、低4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上，低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。
在一些实施方案中，IL-15超激动剂为两种IL-15N72D分子和可溶性IL-15Rα/Fc融合蛋白的二聚体的生物活性蛋白质复合物，也称为ALT-803。ALT-803的组合物以及制备和使用ALT-803的方法描述于美国专利申请公开2015/0374790中，该美国专利申请通过引用并入本文。已知在N末端(Su)含有所谓的“sushi”结构域的可溶性IL-15Rα片段可承载负责高亲和力细胞因子结合的大多数结构元件。通过将人IL-15RαSu结构域(成熟人IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65)与含有Fc结构域的人IgG1CH2-CH3区域(232个氨基酸)连接，可生成可溶性融合蛋白。该IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白可具有经由IgG1结构域通过二硫键结合形成二聚体的优点，并且易于使用标准蛋白A亲和层析方法纯化。
在一些实施方案中，ALT-803可具有由与对二聚体IL-15Rαsushi结构域/人IgG1Fc融合蛋白的高亲和力相关的人IL-15变体的2个蛋白质亚基组成的可溶性复合物。IL-15变体为114个氨基酸多肽，包含成熟的人IL-15细胞因子序列，在螺旋C N72D的72位具有Asn至Asp取代。人IL-15R sushi结构域/人IgG1Fc融合蛋白包含与含有Fc结构域(232个氨基酸)的人IgG1CH2-CH3区域连接的IL-15R亚基的sushi结构域(成熟人IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65)。除了N72D取代之外，所有蛋白质序列都为人类的。基于亚基的氨基酸序列，包含两个IL-15N72D多肽(示例IL-15N72D序列显示于SEQ ID NO：88)和二硫键连接的同源二聚体IL-15RαSu/IgG1Fc蛋白质(示例IL-15RαSu/Fc结构域显示于SEQ ID NO：89)的复合物的计算分子量为92.4kDa。在一些实施方案中，编码靶抗原和ALT-803的重组载体可具有本文所述的任何编码靶抗原的序列，并且可以任何顺序具有SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：88和SEQ IDNO：89以编码ALT-803。
每种IL-15N720多肽的计算分子量约为12.8kDa，并且IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白的计算分子量约为33.4kDa。IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG1Fc蛋白均可被糖基化，通过尺寸排阻色谱法得到ALT-803的表观分子量约为114kDa。对ALT-803测定的等电点(pI)可为约5.6至6.5的范围内。因此，融合蛋白可在pH 7下带负电荷。
与编码新表位和ALT-803的Ad5[E1-，E2b-]载体的组合疗法可引起增强免疫应答，使得两种疗法部分的组合与任一单独疗法相比起到协同加强免疫应答的作用。例如，与编码新表位抗原和ALT-803的Ad5[E1-，E2b-]载体的组合疗法可引起协同增强刺激抗原特异性效应子CD4+T细胞和CD8+T细胞，刺激针对杀伤受感染细胞的NK细胞应答，刺激经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制针对杀伤受感染细胞的中性粒细胞或单核细胞应答。与编码新表位抗原和ALT-803的Ad5[E1-，E2b-]载体的组合疗法可协同地加强上述应答中的任何一种或上述应答的组合，以极大地改善施用至有需要的受试者后的存活结果。
通过使用本文所述的重组载体中的任何在相同的重组载体中表达免疫原性增强剂和靶抗原，可将本文所述的任何免疫原性增强剂与靶抗原融合或连接。
编码这种免疫原性增强剂的核酸序列可为SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：90中的任一个，并总结于表1中。
表1：免疫原性增强剂的序列
在一些实施方案中，靶抗原和免疫融合配偶体的核酸序列不被任何核酸分开。在其他实施方案中，编码接头的核酸序列可插入编码本文所述任何靶抗原的核酸序列和编码本文所述任何免疫融合配偶体的核酸序列之间。因此，在某些实施方案中，用含有靶抗原、接头和免疫融合配偶体的病毒载体免疫后产生的蛋白质可为融合蛋白，该融合蛋白包含目标靶抗原，随后为接头并且最后为免疫融合配偶体，从而经由接头将靶抗原连接至增强目标靶抗原免疫原性的免疫融合配偶体。在一些实施方案中，接头核酸的序列可为约1个至约150个核酸长，约5个至约100个核酸，或长度约10个至约50个核酸。在一些实施方案中，核酸序列可编码一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头的氨基酸序列长度可为约1个至约50个，或约5个至约25个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头的序列包含少于10个氨基酸。在一些实施方案中，接头可为聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头或具有丙氨酸和甘氨酸两者的接头。
编码此类接头的核酸序列可为SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105中的任何一个，并总结于表2中。
表2：接头序列
SEQ ID NO 序列
SEQ ID NO:91 MAVPMQLSCSR
SEQ ID NO:92 RSTG
SEQ ID NO:93 TR
SEQ ID NO:94 RSQ
SEQ ID NO:95 RSAGE
SEQ ID NO:96 RS
SEQ ID NO:97 GG
SEQ ID NO:98 GSGGSGGSG
SEQ ID NO:99 GGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:100 GGSGGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:101 GGSGGSGGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:102 GGSGGSGGSGGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:103 GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:104 GGSGGSGGSGGSGGSG
SEQ ID NO:105 GSGGSGGSGGSGGSGG
XIII.共刺激分子
除了使用含有肿瘤新表位或新抗原的基于重组腺病毒的载体疫苗之外，还可将共刺激分子掺入所述疫苗中，这将增加免疫原性。
免疫应答的启动需要至少两个信号用于通过APC活化幼稚T细胞(Damle,等人《免疫学》148:1985-92(1992)(J Immunol 148:1985-92(1992))；Guinan,等人《血液学》84:3261-82(1994)(Blood 84:3261-82(1994))；Hellstrom,等人《癌症化学药物》38:S40-44(1996)(Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44(1996))；Hodge,等人《癌症》39:5800-07(1999)(Cancer Res 39:5800-07(1999)))。通过肽/主要组织相容性复合物(MHC)通过T细胞受体(TCR)递送抗原特异性第一信号，并且使T细胞进入细胞周期。可递送第二种或共刺激信号用于细胞因子产生和增殖。
已报告通常在专职抗原呈递细胞(APC)的表面上发现的至少三种不同分子能够提供对T细胞活化至关重要的第二信号：B7-1(CD80)、ICAM-1(CD54)和LFA-3(人CD58)(Damle,等人《免疫学》148:1985-92(1992)(J Immunol148:1985-92(1992))；Guinan,等人《血液学》84:3261-82(1994)(Blood84:3261-82(1994))；Wingren,等人《免疫临界转速》15:235–53(1995)(Crit Rev Immunol 15:235–53(1995))；Parra,等人《斯坎德免疫学》38:508–14(1993)(Scand.J Immunol 38:508–14(1993))；Hellstrom等，《安·纽约科学院》690:225–30(1993)(Ann NY Acad Sci 690:225–30(1993))；Parra,等人《免疫学》158:637–42(1997)(J Immunol 158:637–42(1997))；Sperling,等人《免疫学》157:3909–17(1996)(J Immunol157:3909–17(1996))；Dubey,等人《免疫学》155:45–57(1995)(J Immunol 155:45–57(1995))；Cavallo,等人《欧洲免疫学》25:1154–62(1995)(Eur J Immunol 25:1154–62(1995)))。
这些共刺激分子具有不同的T细胞配体。B7-1与CD28和CTLA-4分子相互作用，ICAM-1与CD11a/CD18(LFA-1β2整联蛋白)复合物相互作用，LFA-3与CD2(LFA-2)分子相互作用。因此，在某些实施方案中，期望具有分别含有B7-1、ICAM-1和LFA-3的重组腺病毒载体，当与含有一个或多个编码靶抗原，诸如肿瘤新抗原的核酸的基于重组腺病毒的载体疫苗组合时将进一步增加/增强针对特定靶抗原的抗肿瘤免疫应答。
XIV.免疫途径限制点调制剂
在某些实施方案中，免疫途径限制点抑制剂与包含本文公开的腺病毒载体的组合物组合。在一些情况下，限制点抑制剂释放的T细胞识别源自非同义突变的患者和癌症特异性新表位，而不是保守的自身抗原。治疗前和治疗后肿瘤组织的全外显子组测序揭示，对于限制点抑制的临床反应与人类黑色素瘤和非小细胞肺癌的治疗前非同义突变的频率的强烈关联，其中两种类型的癌症具有特别高的突变负荷。
本文公开的治疗方法包括用基于腺病毒的组合物和/或免疫途径限制点抑制剂治疗有需要的个体，然后对癌症样品进行测序。测序可鉴定新的靶标新表位。测序可鉴定新的新表位，该新表位包括在第二种基于腺病毒的组合物中，诸如二级疫苗。在一些实施方案中，患者接种针对可通过测序鉴定的新表位的疫苗。在一些实施方案中，患者接受免疫途径限制点抑制剂以及本文所述的疫苗或药物组合物。
在其他实施方案中，组合物与一种或多种免疫途径限制点调制剂一起施用。活化和抑制信号之间的平衡调制T淋巴细胞和疾病细胞之间的相互作用，其中通过T细胞受体(TCR)的抗原识别引发T细胞应答。抑制途径和信号称为免疫途径限制点。在正常情况下，免疫途径限制点在控制和预防自身免疫方面起着关键作用，并且还可保护组织免受响应于病原体感染的损伤。
某些实施方案提供组合免疫疗法，其包含用于调节免疫途径限制点抑制途径的基于病毒载体的疫苗和组合物，用于预防和/或治疗癌症和传染病。在一些实施方案中，调节为增加基因或蛋白质的表达或活性。在一些实施方案中，调节为降低基因或蛋白质的表达或活性。在一些实施方案中，调节影响基因或蛋白质家族。
通常，免疫抑制途径由配体-受体相互作用引发。现在很明显，在疾病中，疾病可指派免疫限制点途径作为用于诱导受试者中免疫抗性的机制。
通过给定疾病诱导受试者中的免疫抗性或免疫抑制途径可由已知调节免疫抑制途径中的一种或多种的分子组合物阻断，所述分子组合物诸如siRNA、反义、小分子、模拟物、重组形式的配体、受体或蛋白质或抗体(可为Ig融合蛋白)。例如，免疫限制点蛋白阻断剂的初步临床发现，诸如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)已显示出增强抗肿瘤免疫力的前景。
因为患病细胞可表达多种抑制性配体，并且疾病浸润淋巴细胞表达多种抑制性受体，双重或三重阻断的免疫途径限制点蛋白质可增强抗疾病免疫力。本文提供的组合免疫疗法可包含一种或多种组合物，该组合物包含靶向以下免疫限制点蛋白中的一种或多种的免疫途径限制点调制剂：PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3(也称为CD276)、B7-H4(也称为B7-S1、B7x和VCTN1)、BTLA(也称为CD272)、HVEM、KIR、TCR、LAG3(也称为CD223)、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3(也称为HAVcr2)、GAL9、A2aR和腺苷。
在一些实施方案中，分子组合物包含siRNA。在一些实施方案中，分子组合物包含小分子。在一些实施方案中，分子组合物包含重组形式的配体。在一些实施方案中，分子组合物包含重组形式的受体。在一些实施方案中，分子组合物包含抗体。在一些实施方案中，组合疗法包含一种以上分子组合物和/或一种以上类型的分子组合物。如本领域技术人员将理解的，未来发现的免疫限制点抑制途径的蛋白质也被设想为包含在本公开内容中。
在一些实施方案中，组合免疫疗法包含用于调制CTLA4的分子组合物。在一些实施方案中，组合免疫疗法包含用于调制PD1的分子组合物。在一些实施方案中，组合免疫疗法包含用于调制PDL1的分子组合物。在一些实施方案中，组合免疫疗法包含用于调制LAG3的分子组合物。在一些实施方案中，组合免疫疗法包含用于调制B7-H3的分子组合物。在一些实施方案中，组合免疫疗法包含用于调制B7-H4的分子组合物。在一些实施方案中，组合免疫疗法包含用于调制TIM3的分子组合物。在一些实施方案中，调制为表达的增加或增强。在其他实施方案中，调制为表达缺失的减少。
两种非限制性示例性免疫途径限制点抑制剂包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白-1(PD1)。CTLA-4可仅在调制T细胞活化的早期阶段的T细胞上表达。CTLA-4与共刺激性T细胞受体CD28相互作用，这可引起抑制T细胞活性的信号传导。一旦发生TCR抗原识别，则CD28信号传导可增强TCR信号传导，在一些情况下引起活化的T细胞并且CTLA-4抑制CD28的信号传导活性。本公开内容提供本文提供的免疫疗法与抗-CTLA-4单克隆抗体的组合，用于预防和/或治疗癌症和传染病。本公开内容提供如本文提供的疫苗或免疫疗法与CTLA-4分子组合物的组合，用于预防和/或治疗癌症和传染病。
程序性死亡细胞蛋白配体-1(PDL1)为B7家族的成员，并且分布在各种组织和细胞类型中。PDL1可与抑制T细胞活化和CTL介导的裂解的PD1相互作用。已经在各种人肿瘤上证明PDL1的显著表达，并且PDL1表达为肿瘤规避宿主抗肿瘤免疫应答的关键机制中的一个。程序性死亡配体1(PDL1)和程序性细胞死亡蛋白-1(PD1)作为免疫途径限制点相互作用。这种相互作用可为引起抗肿瘤免疫应答的钝化和随后的肿瘤进展的主要耐受机制。PD1存在于活化的T细胞上，并且PD1的主要配体PDL1通常在肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APC)以及包括B细胞的其他细胞上表达。已经在包括HPV相关的头颈癌在内的各种人类肿瘤中证明PDL1的显著表达。PDL1与抑制T细胞活化和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的裂解的T细胞上的PD1相互作用。本公开内容提供本文提供的免疫疗法与抗PD1或抗PDL1单克隆抗体的组合，用于预防和/或治疗癌症和传染病。
某些实施方案可提供如本文提供的免疫疗法与PD1或抗PDL1分子组合物的组合，用于预防和/或治疗癌症和传染病。某些实施方案可提供如本文提供的免疫疗法与抗-CTLA-4和抗-PD1单克隆抗体的组合，用于预防和/或治疗癌症和传染病。某些实施方案可提供如本文提供的免疫疗法与抗-CTLA-4和PDL1单克隆抗体的组合。某些实施方案可提供如本文提供的疫苗或免疫疗法与抗-CTLA-4、抗-PD1、抗-PDL1单克隆抗体或其组合的组合，用于治疗癌症和传染病。
免疫途径限制点分子可由T细胞表达。免疫途径限制点分子可有效地充当“制动器”以下调或抑制免疫应答。免疫途径限制点分子包括但不限于直接抑制免疫细胞的程序性死亡1(PD1或PD-1，也称为PDCD1或CD279，检索号：NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，基因库检索号AF414120.1)、LAG3(也称为CD223，检索号：NM_002286.5)、Tim3(又称甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)，基因库检索号：JX049979.1)、B淋巴细胞和T淋巴细胞相关(BTLA)(也称为CD272，检索号：NM_181780.3)、BY55(也称为CD160，基因库检索号：CR541888.1)、TIGIT(也称为IVSTM3，检索号：NM_173799)、LAIR1(也称为CD305，基因库检索号：CR542051.1)、SIGLECIO(基因库检索号：AY358337.1)、自然杀伤细胞受体2B4(也称为CD244，检索号：NM_001166664.1)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、ILIORA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3。例如，PD1可与基于腺病毒载体的组合物组合以治疗有需要的患者。
可靶向的其他免疫途径限制点可为腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含有T细胞活化抑制剂1的V集结构域(VTCN1)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个结构域、长细胞质尾,1(KIR3DL1)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、细胞因子诱导的含SH2蛋白(CISH)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺病毒相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)或其任何组合。
表3并非穷举，显示可灭活以提高如本文所述的基于腺病毒载体的组合物的效率的示例性免疫途径限制点基因。免疫途径限制点基因可选自表1中列出的此类基因和其他涉及以下的基因：共抑制受体功能、细胞死亡、细胞因子信号传导、精氨酸色氨酸饥饿、TCR信号传导、诱导T-reg抑制、控制衰竭或无能的转录因子以及缺氧介导的耐受性。
表3：示例性免疫途径限制点基因
与单独的任一种药剂相比，基于腺病毒的组合物和免疫途径限制点调制剂的组合可引起治疗患者中感染、进展或疾病症状的减少。在另一个实施方案中，与单独的任一种药剂相比，基于腺病毒的组合物和免疫途径限制点调制剂的组合可引起治疗患者的总体存活率提高。在一些情况下，与单独的任一种药剂相比，基于腺病毒的组合物和免疫途径限制点调制剂的组合可增加治疗患者中疾病特异性T细胞应答的频率或强度。
某些实施方案还可提供免疫途径限制点抑制的用途，以改善基于腺病毒载体的组合物的性能。某些免疫途径限制点抑制剂可在基于腺病毒载体的组合物时施用。某些免疫途径限制点抑制剂也可在施用基于腺病毒载体的组合物后施用。免疫途径限制点抑制可与腺病毒疫苗施用同时发生。免疫途径限制点抑制可在疫苗接种后1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟发生。免疫途径限制点抑制也可在施用基于腺病毒载体的组合物后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时发生。在一些情况下，免疫抑制可在疫苗接种后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天发生。免疫途径限制点抑制可在施用基于腺病毒载体的组合物之前或之后的任何时间发生。
在另一个方面，提供涉及疫苗的方法，所述疫苗包含编码抗原的一种或多种核酸和免疫途径限制点调制剂。例如，提供治疗受试者的方法，所述受试者具有将受益于下调免疫途径限制点蛋白例如PD1以及其在受试者细胞上的天然结合配偶体(一个或多个)的条件。
免疫途径限制点调制剂可与基于腺病毒载体的组合物组合，所述组合物包含编码任何抗原的一种或多种核酸。例如，抗原可为肿瘤抗原，诸如肿瘤新抗原或肿瘤新表位，或本文所述的任何抗原。
免疫途径限制点调制剂当与基于腺病毒载体的组合物，诸如疫苗组合时可产生协同效应。免疫途径限制点调制剂当与基于腺病毒载体的组合物组合时也可产生有益效果。
XV.癌症治疗
特别考虑的是，包含本文所述的腺病毒载体的组合物可用于评估或治疗疾病的各阶段，诸如在增生、发育不良、瘤形成、癌症前期和癌症之间，或者在原发性肿瘤和转移性肿瘤之间。
如本文所用，术语“肿瘤细胞”和“瘤形成”可互换使用，并且是指表现出相对自主生长的细胞，因此它们表现出异常生长表型，其特征在于显著丧失对细胞增殖的控制。肿瘤细胞可为恶性的或良性的。在特定方面，瘤形成包括发育异常和癌症两者。肿瘤可为良性的、恶变前(原位癌或发育异常)或恶性的(癌症)。肿瘤细胞可形成肿块(即肿瘤)或不形成肿块。
当细胞异常局限于起源组织时，可使用术语“发育异常”，如在早期原位肿瘤的情况下。发育异常可能为早期肿瘤过程的指征。术语“癌症”可指恶性肿瘤，包括涉及不受调节的细胞生长的广泛的各种疾病。
转移或转移性疾病可指癌症从一个器官或部分扩散至另一个非相邻器官或部分。由此生成的新发生的疾病可称为转移性肿瘤。
可通过所公开的方法和组合物评估或治疗的癌症包括来自胰腺的癌细胞，包括胰腺导管腺癌(PDAC)、来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌细胞。
此外，癌症可具体地具有以下组织学类型，但不限于这些类型：恶性肿瘤；癌；未分化癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛细胞癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌；恶性类癌；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性粒细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病(paget’s disease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性肉瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；支持细胞癌；恶性睾丸间质细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无黑色素瘤；浅表性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合肿瘤；缪氏混合肿瘤(mullerian mixedtumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性布伦纳肿瘤(brenner tumor)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢肿瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(ewing’s sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞齿瘤(ameloblastic odontosarcoma)；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；原纤维星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤(oligodendroblastoma)；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(Hodgkin’s disease)；霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)；巴拉圭瘤(paragranuloma)；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphomas)；恶性组织细胞病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。此外，可在癌前病变，诸如化生、发育异常和增生中评估肿瘤新抗原或新表位。
XVI.试剂盒
本文所述的组合物、免疫疗法或疫苗可以试剂盒的形式提供。本公开的试剂盒可进一步包括关于剂量和/或施用的说明，包括治疗方案信息。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于提供所述免疫疗法或疫苗的组合物和方法。在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含用于施用试剂盒组分的组分和关于如何制备组分的说明。在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括用于在治疗之前和之后用适当的实验室测试对患者进行监测，或者与医务人员交流结果和患者数据的软件。
包含试剂盒的组分可为干燥或液体形式。如果它们为干燥形式，则试剂盒可包括溶解干燥材料的溶液。试剂盒还可包括液体或干燥形式的转移因子。如果转移因子为干燥形式，则试剂盒将包括溶解转移因子的溶液。试剂盒还可包括用于混合和制备组分的容器。该试剂盒还可包括用于辅助施用的仪器，诸如针、管、涂药器、吸入器、注射器、移液管、镊子、测量勺、滴管或任何此类医学上批准的递送载体。如本文所述的试剂盒或药物递送系统通常还包括用于将本公开的组合物封闭起来用于商业销售和分销的装置。
XVII.有形计算机可读介质
可提供具有计算机可用程序代码的有形计算机可读介质，所述计算机可用程序代码可执行以执行与肿瘤新表位或肿瘤新抗原的鉴定、分类和选择相关的操作。
一个或多个处理器可用于执行由本文公开的示例有形计算机可读介质驱动的操作。另选地，一个或多个处理器可在硬件控制下或在硬件和软件控制的组合下执行那些操作。例如，处理器可为专门配置成执行一个或多个那些操作的处理器，诸如专用集成电路(ASIC)或现场可编程门阵列(FPGA)。一个或多个处理器的使用允许处理在没有一个或多个处理器的帮助下不可能的信息(例如，数据)，或者至少不以一个或多个处理器可实现的速度处理。
可在一定量的时间内实现此类操作的执行的一些实施方案，例如小于在不使用计算机系统、一个或多个处理器的情况下执行操作所花费的时间量，包括不超过一小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟、不超过一分钟、不超过一秒钟、并且不超过一秒钟和一小时之间以秒为单位的每个时间间隔。
本有形计算机可读介质的一些实施方案可为例如CD-ROM、DVD-ROM、闪存驱动器、硬盘驱动器或任何其他物理存储设备。本方法的一些实施方案可包括记录具有计算机可读代码的有形计算机可读介质，当由计算机执行该计算机可读代码时，使得计算机执行本文所论述的任何操作，包括与本有形计算机可读介质相关的操作。记录有形计算机可读介质可包括，例如，将数据刻录至CD-ROM或DVD-ROM上，或者用数据填充物理存储设备。
可组合上述各种实施方案以提供进一步的实施方案。本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用整体并入本文，其程度正如每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入的程度。
如果需要，可修改实施方案的各方面以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供更进一步的实施方案。
根据以上详细描述，可对实施方案进行这些和其他改变。通常，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中公开的特定实施方案，而是应该被解释为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求所授权的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相同或相似的结果。
实施例1
用于插入Ad5[E1-，E2b-]的多个新表位
载体(Alkbh6.2、Slit3和Atxn10.1)的构建
Ad5[E1-，E2b-]载体的构建：将pBHG11的约20kb Xba-BamHI亚片段(Bett等人，1994年，加拿大安大略省多伦多市微生物研究所(1994,Microbix,Toronto,Ontario,Canada))亚克隆至pBluescriptKSII+(加利福尼亚州拉霍亚的斯Stratagene(Stratagene,La Jolla,Calif.))，产生pAXB。用BspEI消化质粒pAXB，T4DNA聚合酶末端填充，以及BamHI消化，分离出大约9.0kb的片段。质粒pAXB也用BspHI消化，T4DNA聚合酶末端填充，以及BamHI消化，大约13.7kb片段连接至先前分离的9.0kb片段，生成pAXB-Δpol。
该亚克隆策略在聚合酶基因的氨基末端缺失608bp(Δpol；Ad5核苷酸7274至核苷酸7881)。该缺失还有效地去除在Ad基因组的该区域中右侧读取链上存在的开放阅读框9.4。将pAXB-Δpol的Xba-BamHI亚片段重新引入Xba-BamHI消化的pBHG11中，以生成pBHG11-Δpol。
Ad5[E1-，E2b-]-HER2/neu疫苗的构建：将侧翼为最小巨细胞病毒启动子/增强子元件的新表位转基因和SV40衍生的多腺苷酸化信号亚克隆至穿梭pShuttleCMV中，生成穿梭质粒pShuttle CMV/新表位。穿梭质粒用PmeI线性化并与质粒pAdΔpp同源重组(在大肠杆菌中)以生成pAdCMV/新表位/Δpp。用PacI线性化的10微克pAdCMV/新表位/Δpp为CaPO4共转染至Ad E1、聚合酶(E2b)和表达pTP(E.C7细胞)中。转染后十六小时，收获细胞，将细胞混合物分配至9个24孔组织培养簇板中，并且在37℃下温育5天至9天。收获证明病毒致细胞病变效应的各个孔，并且通过反复感染更多数量的E.C7细胞来扩增分离的病毒。随后通过(1)载体基因组的DNA限制性图谱、(2)新表位表达的确认和(3)多功能研究证实Ad5[E1-，E2b-]-新表位重组载体的分离。
在新表位转基因中，多个单独的新表位基因序列分别通过源自猪捷申病毒-1和Thosea asigna病毒的“自切割”2A肽分离(de Felipe P,等人《交通》2004；5(8),616–26(Traffic 2004；5(8),616–26)；Holst J,等人《自然免疫学》2008；9:658–66(NatureImmunol.2008；9:658–66)；Kim JH,等人公共科学图书馆一号,2011；6(4),e18556.doi:10.1371/journal.pone.0018556(PloS One,2011；6(4),e18556.doi:10.1371/journal.pone.0018556))。当2A肽在核糖体上翻译时，2A肽的最后两个残基之间的肽键从未形成，产生在一个核糖体传递中明显表达的蛋白质。使用分离三种基因的两个2A肽序列引起该三种蛋白质的近化学计量表达。
实施例2
多次注射含有Alkbh6.2、Slit3和Atxn10.1的Ad5[E1-，E2b-]-载体生成针对这些新表位的细胞介导的免疫应答
用突变肽Alkbh6.2、Slit3和Atxn10.1或空载体对照免疫小鼠两次，间隔两周。免疫终止后7天收获引流淋巴结。在体外培养淋巴结，随后用同源肽刺激或未刺激20小时，并且然后通过ELISpot分析。在最后一次免疫(疫苗接种)后两(2)周从单只小鼠获得脾脏，并且采用ELISpot测定法评定分泌IFN的脾细胞的CMI(Gabitzsch ES,等人《癌免疫抗原》2010；59:1131-35(Cancer Immunol Immunother.2010；59:1131-35)；Gabitzsch ES,等人《癌症基因疗法》2011；18:326-35(Cancer Gene Ther.2011；18:326-35)；Jones FR,等人《疫苗学》2011；29:7020-26(Vaccine 2011；29:7020-26))。
实施例3
用含有Alkbh6.2、Slit3和Atxn10.1的Ad5[E1-，E2b-]-载体疫苗接种在
体内生成针对这些新表位的细胞介导的免疫应答
每组五(5)只小鼠以两(2)周间隔皮下注射免疫剂量为1×108、1×109或1×1010的VP Ad5[E1-，E2b-]-Alkbh6.2、Slit3和Atxn10.1或空白对照载体。一周后，用300,000个活CMS5-FFLuc肿瘤细胞皮内攻击小鼠。使用活生物发光成像(铂金埃尔默公司(PerkinElmer))监测肿瘤生长。收集小鼠血液，分离T细胞，并且在体外用同源肽刺激，用无关肽刺激或未刺激。分析培养基的IFN-γ和IL-2产生。对小鼠T细胞进行流式细胞术以用于产生细胞内IFN-γ。
实施例4
评定基于新表位的个性化疫苗方法在胰腺癌患者中的安全性、可行性和初步功效的初步研究
使用Ad5[E1-，E2b-]-CEA(癌胚抗原)平台疫苗在表达CEA的胰腺癌患者中进行免疫疗法的临床试验之后，随后用Ad5[E1-，E2b-]-新表位靶向载体接种疫苗。这为一项I/II期研究，其主要目的为确定晚期或转移性CEA表达恶性肿瘤患者中用Ad5[E1-，E2B-]-CEA(6D)免疫的安全性。次要目标为评估对免疫的新表位免疫应答，并且获得关于为先前用疫苗接种治疗的胰腺癌患者生成新表位靶向疫苗的临床可行性的初步数据。
研究群体由经组织学证实诊断为CEA阳性的转移性恶性肿瘤患者组成，这些患者先前用已知具有可能的存活益处的标准疗法治疗或拒绝此类疗法。该研究确定三种剂量水平的Ad5[E1-，E2B-]-CEA(6D)疫苗(I期成分)的安全性，以及生成Ad5[E1-，E2B-]-新表位疫苗的安全性和可行性。
研究药物为Ad5[E1-，E2B-]-CEA(6D)，每3周通过皮下(SQ)注射进行3次免疫。在前一队列中的最后一名患者接受第一次注射后至少3周，在每个队列中评估安全性。如果在剂量水平下接受治疗的患者中有<33％经历DLT(例如，3名患者中的0名，≤6名患者中的1名，≤12名患者中的3名或≤18名患者中的5名)，则认为施用方案为安全的。
免疫第三周后，获取患者肿瘤样品并进行处理以用于测序(参见图1)。患者匹配的肿瘤样品和正常样品的全基因组测序在DNA水平上精确定位肿瘤特异性改变，RNA测序证实并给出与DNA中突变或SNV相关的信息。还执行定量蛋白质组学以测量鉴定的SNV的临床重要蛋白质的水平。推定的SNV将进行MHC I类结合预测，其中截止值为(IC≤500)。用Ad5[E1-，E2B-]载体框内克隆最终的一组SNV以产生新表位特异性Ad5[E1-，E2B-]疫苗。随后使用Ad5[E1-，E2B-]-新表位载体每3周通过皮下(SQ)注射对患者进行3次免疫。
实施例5
患有胰腺癌的患者基于新表位的个性化疫苗方法
从患有胰腺肿瘤的患者中分离肿瘤新表位，所述胰腺肿瘤已经用Ad5[E1-，E2b-]-CEA(癌胚抗原)处理，随后用限制点抑制剂(抗PDL-1)处理。通过比较正常皮肤组织患者的肿瘤活组织检查中的基因组序列，来鉴定肿瘤特异性突变诸如SNV。SNV被确定是否表达，并且SNV被确定是否驱动细胞介导的免疫。在基因组中的70种肿瘤新抗原中，只有10种驱动细胞介导的免疫。将鉴定的新抗原插入Ad5[E1-，E2b-]载体文库中，用于递送至人胰腺癌患者。新的新抗原的鉴定和新鉴定的新抗原的处理在循环中重复进行。
实施例6
肿瘤新抗原的鉴定
基于图1或图2中所示的方法鉴定候选肿瘤新表位。
使用DNA测序，诸如全外显子组测序(WES)或全基因组测序(WGS)检测癌症样品中的肿瘤特异性突变，并且通过应用突变调用算法(诸如Mutect)进行鉴定。
通过RNA测序或间接RNA分析鉴定表达的突变，以提供候选新抗原或新表位。
接下来，可基于HLA分型或预测的对MHC I或MHC II的结合亲和力，例如，使用经过充分验证的算法(NetMHCpan)从这些表达的突变中鉴定候选新抗原或新表位，并且它们的鉴定可通过肽-HLA结合的实验验证和通过确认RNA水平的基因表达来细化。
随后可合成这些候选新抗原或新表位并且测试其刺激肿瘤特异性T细胞应答的能力，以证明它们是否为免疫原性新抗原或新表位。
实施例7
液体肿瘤样品中肿瘤新抗原的鉴定
患者样品
肝素化血液获自临床研究方案中登记的患者。通过Ficoll/Hypaque密度梯度离心分离患者外周血单核细胞(PBMC)，用10％二甲基亚砜冷冻保存，并且储存在气相液氮中直至分析时间。进行HLA分型。
CLL和其他癌症的全外显子组捕获测序数据
通过全外显子组捕获测序或全基因组测序(WGS)以及种系DNA的匹配测序或经由与正常参照的比较在CLL中检测体细胞突变。
预测源自基因突变的肽与个体HLA等位基因的结合
使用NetMHCpan(v2.4)预测从每种体细胞突变成的所有可能的9聚体和10聚体肽以及对应的野生型肽的主要组织相容性复合物(MHC)结合亲和力。分析这些平铺肽对患者HLA谱中每个I类等位基因的结合亲和力(IC50nM)。IC50值<150nM被认为是预测的强结合；IC50值在150nM至500nM之间，被认为是中等至弱结合；以及IC50值>500nM，被认为是非结合。经验证实通过竞争性MHC I类等位基因结合实验预测的肽与HLA分子的结合(IC50<500nM)。
生成和检测患者抗原特异性T细胞
生成自体树突细胞(DC)。对于一些实验，CD40L-Tri活化和扩增的CD19+B细胞用作抗原呈递细胞(APC)。
为了从CLL患者生成肽反应性T细胞，将从移植前和移植后PBMC(CD8+微珠；加利福尼亚州奥本的细胞分选(Miltenyi,Auburn,CA))中免疫磁性选择的CD8+T细胞(1000万)用自体肽库脉冲的DC(以40：1比例)培养。随后，每周(从第7天开始)用肽脉冲的CD40L-Tri活化放射B细胞(以4：1的比例)再次刺激T细胞，以检测记忆T细胞应答，或者三次以上以检测幼稚T细胞应答。所有刺激均在补充有10％胎牛血清和5ng/mL至10ng/mL白细胞介素(IL)-7、IL-12和IL-15(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D Systems(R&D Systems,Minneapolis,MN))的完全培养基中进行。用肽库(10μM/肽/库3小时)脉冲APC。在最后一次刺激后10天，通过干扰素(IFN)-γELISPOT或CD107a脱粒测定法测试针对肽库或自体肿瘤的T细胞特异性。
统计考虑
构建用于细胞因子分泌测量的方差模型的双向分析，并且包括作为固定效应的浓度和突变状态以及适当的相互作用项。调整这些模型的P值以进行事后多重比较(Tukey方法)。对于组间连续测量的其他比较，使用Welch t检验。报告的所有其他P值均为双侧且在对多次比较进行适当调整的情况下的.05水平上被认为为显著的。分析在SAS 9.2版中执行。
实施例8
鉴定实体肿瘤样品中的肿瘤新抗原
首先在源自CRC患者的原发手术标本的细胞系中鉴定出独特的抗原。来自癌症样品的单细胞悬浮液在标准条件下培养以获得“分化的”癌细胞，并且在可能的情况下，也在无血清条件下培养以支持显示CSC特性的结肠球的生成。
编码CRC中20个最频繁突变的候选癌基因的cDNA从8个分化的CRC细胞系和2个平行的CSC培养物中进行PCR扩增，并且进行大规模平行测序。在所有CRC细胞中的20种表达基因中的几种中发现体细胞突变。
将在CRC cDNA中发现的突变与从相同患者的健康细胞(PBMC或LCL)获得的DNA进行比较，并且CRC中20个最频繁突变的基因的测序提供每个肿瘤的几个体细胞突变，这为独特T细胞新表位的潜在来源。
提供PBMC以研究T细胞对源自突变基因产物的表位的识别。来自患者的PBMC在体外用合成肽库刺激至少两次，对于每种突变蛋白质，该合成肽库由跨越突变残基并由11个残基重叠的三个15aa长肽组成。该方法基于以下证据：15aa长肽由APC天然加工成由MHC I类和II类分子呈递给自体T细胞的表位，而不事先知道确切的HLA等位基因特异性表位结构。
测试从刺激的PBMC分离的CD8+T细胞对自体癌细胞的识别，所述自体癌细胞在IFNγ处理后表达HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DR。这些结果证明诱导的CD8+T细胞对由患者特异性HLA呈递的天然加工的新表位具有特异性。
实施例9
肿瘤新表位的Ad5[E1-，E2b-]载体构建体
在表4中鉴定选定的候选肿瘤新表位库。
表4：候选肿瘤新表位
在表4中的候选新表位中，去除数据库SNP变体LILRB3(VGPVNPSHR中的T187N突变，对应于Rs71257443，发生在28％的群体中)。
接下来，进行RNA测序(RNA-seq)，并且RNA-seq数据用于优先拍排序候选新表位。因为在RNA测序中检测到一个基因FLRT2，所以它可能在肿瘤样品中良好地表达，并且应该优先作为靶标。
表5中总结这些鉴定的候选肿瘤新表位的扩展的15聚体新表位。
表5：扩展的新表位
如图3所示，设计四种基因构建体用于将鉴定的肿瘤新表位插入Ad5[E1-，E2b-]载体构建体中：
(I)15-aa小基因为在任一侧用7-aa天然序列选择的肿瘤突变(靶向的MHC I类抗原)
(II)25-aa小基因为在任一侧用12-aa天然序列选择的肿瘤突变。(MHC I类靶向抗原和MHC II类抗原可用，如果存在)
(III)如上文(I)中的15-aa小基因，其中每个小基因之间具有9-aa接头，使得在相邻的小基因之间不会形成“非天然的”MHC I类表位。
(IV)如上文(II)中的25-aa小基因，其中每个小基因之间具有9-aa接头，使得在相邻的小基因之间不会形成“非天然的”MHC I类表位。
这四种基因构建体的核苷酸序列和蛋白质序列如下所示：
基因构建体1(SEQ ID NO：31)：
CTCGAGGAAGCTTGCCGCCACCATGCCATTTGCCATGGCCCAGATCCCCAGCCTGAGCCTGAGAGCTGTGCTGCCTAATGTGACCGTGCGGAACGCCACCAGCTACAGATGTGGCAGCTGGTTCAGAGAGGGCAAGACCCTGAACCCCAGCCAGACCAGCGCCGTGATGGACTGGGTGTGGATGGACACCACCCTGTCCCTGAGCCTGGGCCCCGAGAGAAGAAAGCTGACCACCGAGCTGACAATCATCAACAATGGCCTGGGCGCTCAGTGTAGCGAGGCCGTGACCCTGAATAATGTGGGCGAGACAGTGACCATGCCCTGCCCCAAGGTGTTCAGCTGCCAGGGCCCCGAACAAGTGTGGGGAATGGCTGTGCGCGAGCTGTGAGATATCGCGGCCGC
基因构建体2(SEQ ID NO：32)：
CTCGAGGAAGCTTGCCGCCACCATGCCATTTGCCATGGCCCAGATCCCCAGCCTGAGCCTGAGAGCTGTGGGAAGCGGGAGTGGCTCAGGTTCAGGACTGCCTAATGTGACCGTGCGGAACGCCACCAGCTACAGATGTGGCGGAAGTGGGTCAGGCTCCGGTTCTGGAAGCTGGTTCAGAGAGGGCAAGACCCTGAACCCCAGCCAGACCAGCGGGTCAGGAAGTGGTAGCGGCTCCGGGGCCGTGATGGACTGGGTGTGGATGGACACCACCCTGTCCCTGAGCGGAAGTGGATCAGGTTCCGGCTCTGGGCTGGGCCCCGAGAGAAGAAAGCTGACCACCGAGCTGACAATCATCGGATCCGGGTCTGGCAGTGGTTCAGGCAACAATGGCCTGGGCGCTCAGTGTAGCGAGGCCGTGACCCTGAATGGATCAGGGTCCGGCAGCGGTAGTGGCAATGTGGGCGAGACAGTGACCATGCCCTGCCCCAAGGTGTTCAGCGGGTCCGGATCTGGTAGTGGCTCAGGTTGCCAGGGCCCCGAACAAGTGTGGGGAATGGCTGTGCGCGAGCTGTGAGATATCGCGGCCGC
基因构建体3(SEQ ID NO：33)：
CTCGAGGAAGCTTGCCGCCACCATGCCTAGCGAGAGCCCTCCATTTGCCATGGCCCAGATCCCCAGCCTGAGCCTGAGAGCTGTGTCTGGCGCTATGGGAGCCCACAGCATCCCCCTGCCTAATGTGACCGTGCGGAACGCCACCAGCTACAGATGTGGCGTGGGACCTCCTGGCCCTCCTGCTTCCCTGAGCTGGTTCAGAGAGGGCAAGACCCTGAACCCCAGCCAGACCAGCATGAGCGGCACCCTGCTGACAGAGCTGAGAGCCGTGATGGACTGGGTGTGGATGGACACCACCCTGTCCCTGAGCAGCTGGATCTGTGTGGTGTCCGCCACAGACCTGGGCCCCGAGAGAAGAAAGCTGACCACCGAGCTGACAATCATCCTGCAGGGCCTGGACTACAGCTGCGAGGCCAACAATGGCCTGGGCGCTCAGTGTAGCGAGGCCGTGACCCTGAATTTCACCGTGCCCACCTGTTGGAGGCCCGCCAATGTGGGCGAGACAGTGACCATGCCCTGCCCCAAGGTGTTCAGCAACTTCTACAGCAAAGTGCGGGGCTTCATGTGCCAGGGCCCCGAACAAGTGTGGGGAATGGCTGTGCGCGAGCTGAACATGAACCTGCTGTGAGATATCGCGGCCGC
基因构建体4(SEQ ID NO：34)：
CTCGAGGAAGCTTGCCGCCACCATGCCTAGCGAGAGCCCTCCATTTGCCATGGCCCAGATCCCCAGCCTGAGCCTGAGAGCTGTGTCTGGCGCTATGGGAGGAAGCGGGAGTGGCTCAGGTTCAGGAGCCCACAGCATCCCCCTGCCTAATGTGACCGTGCGGAACGCCACCAGCTACAGATGTGGCGTGGGACCTCCTGGCGGAAGTGGGTCAGGCTCCGGTTCTGGACCTCCTGCTTCCCTGAGCTGGTTCAGAGAGGGCAAGACCCTGAACCCCAGCCAGACCAGCATGAGCGGCACCCTGGGGTCAGGAAGTGGTAGCGGCTCCGGGCTGACAGAGCTGAGAGCCGTGATGGACTGGGTGTGGATGGACACCACCCTGTCCCTGAGCAGCTGGATCTGTGTGGGAAGTGGATCAGGTTCCGGCTCTGGGGTGTCCGCCACAGACCTGGGCCCCGAGAGAAGAAAGCTGACCACCGAGCTGACAATCATCCTGCAGGGCCTGGACGGATCCGGGTCTGGCAGTGGTTCAGGCTACAGCTGCGAGGCCAACAATGGCCTGGGCGCTCAGTGTAGCGAGGCCGTGACCCTGAATTTCACCGTGCCCACCGGATCAGGGTCCGGCAGCGGTAGTGGCTGTTGGAGGCCCGCCAATGTGGGCGAGACAGTGACCATGCCCTGCCCCAAGGTGTTCAGCAACTTCTACAGCAAAGGGTCCGGATCTGGTAGTGGCTCAGGTGTGCGGGGCTTCATGTGCCAGGGCCCCGAACAAGTGTGGGGAATGGCTGTGCGCGAGCTGAACATGAACCTGCTGTGAGATATCGCGGCCGC
构建体1蛋白质序列(SEQ ID NO：35)：
MPFAMAQIPSLSLRAVLPNVTVRNATSYRCGSWFREGKTLNPSQTSAVMDWVWMDTTLSLSLGPERRKLTTELTIINNGLGAQCSEAVTLNNVGETVTMPCPKVFSCQGPEQVWGMAVREL
构建体2蛋白质序列(SEQ ID NO：36)：
MPFAMAQIPSLSLRAVGSGSGSGSGLPNVTVRNATSYRCGGSGSGSGSGSWFREGKTLNPSQTSGSGSGSGSGAVMDWVWMDTTLSLSGSGSGSGSGLGPERRKLTTELTIIGSGSGSGSGNNGLGAQCSEAVTLNGSGSGSGSGNVGETVTMPCPKVFSGSGSGSGSGCQGPEQVWGMAVREL
构建体3蛋白质序列(SEQ ID NO：37)：
MPSESPPFAMAQIPSLSLRAVSGAMGAHSIPLPNVTVRNATSYRCGVGPPGPPASLSWFREGKTLNPSQTSMSGTLLTELRAVMDWVWMDTTLSLSSWICVVSATDLGPERRKLTTELTIILQGLDYSCEANNGLGAQCSEAVTLNFTVPTCWRPANVGETVTMPCPKVFSNFYSKVRGFMCQGPEQVWGMAVRELNMNLL
构建体4蛋白质序列(SEQ ID NO：38)：
MPSESPPFAMAQIPSLSLRAVSGAMGGSGSGSGSGAHSIPLPNVTVRNATSYRCGVGPPGGSGSGSGSGPPASLSWFREGKTLNPSQTSMSGTLGSGSGSGSGLTELRAVMDWVWMDTTLSLSSWICVGSGSGSGSGVSATDLGPERRKLTTELTIILQGLDGSGSGSGSGYSCEANNGLGAQCSEAVTLNFTVPTGSGSGSGSGCWRPANVGETVTMPCPKVFSNFYSKGSGSGSGSGVRGFMCQGPEQVWGMAVRELNMNLL
图4显示用含有新抗原基因1序列的Ad5[E1-，E2b-]载体转染人A549肿瘤细胞，其中Tricom报告元件位于基因序列的末端，可检测其在转染细胞中的表达。这里的基本原理为如果检测到报告元件，则也必须表达之前的一个或多个基因。
实施例10
用编码肿瘤新表位和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症该实施例描述用编码肿瘤新表位和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症。编码SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：30的肿瘤新表位中的任一个、SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：90的免疫融合配偶体中的任一个或本文所述的任何其他免疫融合配偶体，诸如IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF，以及任选地，SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105的接头中的任何一个的Ad5[E1-，E2b-]载体使用实施例1中所列的方法制造。编码新表位和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体作为治疗疫苗施用至有需要的受试者。受试者为哺乳动物，诸如人或非人灵长类动物。受试者患有此类任何癌症。在施用疫苗后诱导细胞和体液免疫的建立，驱动抗体和细胞介导的针对癌症的应答。施用疫苗后癌症病况得到缓解。
实施例11
用编码肿瘤新表位和ALT-803(免疫融合配偶体)的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症
该实施例描述用编码肿瘤新表位和ALT-803(免疫融合配偶体)的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症。编码SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：30的肿瘤新表位中的任一个、ALT-803，以及任选地，SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105的接头中的任一个的Ad5[E1-，E2b-]载体使用实施例1中所列的方法制备。编码新表位和ALT-803的Ad5[E1-，E2b-]载体作为治疗性疫苗施用至有需要的受试者。受试者为哺乳动物，诸如人或非人灵长类动物。受试者患有癌症等病症。在施用疫苗后诱导细胞和体液免疫的建立，驱动抗体和细胞介导的针对癌症的应答。施用疫苗后癌症病况得到缓解。
实施例12
用编码肿瘤新表位和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体个性化治疗癌症
从患有用Ad5[E1-，E2b-]-CEA(癌胚抗原)治疗的任何肿瘤的患者分离肿瘤新表位。通过比较正常皮肤组织患者的肿瘤活组织检查中的基因组序列，来鉴定肿瘤特异性突变如SNV。确定SNV的表达，并且然后评定这些SNV是否它们驱动细胞介导的免疫。如果表达的新抗原驱动细胞介导的免疫，则将它们与免疫融合配偶体一起插入Ad5[E1-，E2b-]载体文库中以递送给人癌症患者。免疫融合配偶体选自SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：90、SEQ IDNO：109至SEQ ID NO：112的免疫融合配偶体，或本文所述的任何其他免疫融合配偶体，诸如IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。新的新抗原的鉴定和新鉴定的新抗原的处理在循环中重复进行。
实施例13
用编码肿瘤新表位和免疫融合配偶体的Ad5[E1-，E2b-]载体个性化治疗癌症
从患有用Ad5[E1-，E2b-]-CEA(癌胚抗原)-免疫融合配偶体治疗的任何肿瘤的患者分离肿瘤新表位。免疫融合配偶体选自SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：109至SEQ ID NO：112的免疫融合配偶体，或本文所述的任何其他免疫融合配偶体，诸如IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。通过比较正常皮肤组织患者的肿瘤活组织检查中的基因组序列，来鉴定肿瘤特异性突变如SNV。确定SNV的表达，并且然后评定这些SNV是否它们驱动细胞介导的免疫。如果表达的新抗原驱动细胞介导的免疫，则将它们与免疫融合配偶体一起插入Ad5[E1-，E2b-]载体文库中以递送给人癌症患者。免疫融合配偶体选自SEQ IDNO：39至SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：109至SEQ ID NO：112的免疫融合配偶体，或本文所述的任何其他免疫融合配偶体，诸如IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。新的新抗原的鉴定和新鉴定的新抗原的处理在循环中重复进行。
实施例14
用编码肿瘤新表位和IL-16的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症
该实施例描述用编码肿瘤新表位和IL-16的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症。编码SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：30的肿瘤新表位中的任一个；SEQ ID NO：109的免疫融合配偶体；以及任选地，SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105的接头中的任一个的Ad5[E1-，E2b-]载体使用实施例1中所列的方法制备。编码新表位和SEQ ID NO：109的Ad5[E1-，E2b-]载体作为治疗性疫苗施用至有需要的受试者。受试者为哺乳动物，诸如人或非人灵长类动物。受试者患有癌症等病症。在施用疫苗后诱导细胞和体液免疫的建立，其驱动抗体和细胞介导的针对癌症的反应。施用疫苗后癌症状况得到缓解。
实施例15
用编码肿瘤新表位和IL-17的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症
该实施例描述用编码肿瘤新表位和IL-17的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症。编码SEQ ID NO：23-SEQ ID NO：30的肿瘤新表位中的任一个；SEQ ID NO：110的免疫融合配偶体；以及任选地，SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105的接头中的任一个的Ad5[E1-，E2b-]载体使用实施例1中所述的方法制备。编码新表位和SEQ ID NO：110的Ad5[E1-，E2b-]载体作为治疗性疫苗给予有需要的受试者。受试者为哺乳动物，例如人或非人灵长类动物。受试者患有癌症等病症。在施用疫苗后诱导细胞和体液免疫的建立，其驱动抗体和细胞介导的针对癌症的应答。施用疫苗后癌症病况得到缓解。
实施例16
用编码肿瘤新表位和IL-23的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症
该实施例描述用编码肿瘤新表位和IL-23的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症。编码SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：30的肿瘤新表位中的任一个；SEQ ID NO：111的免疫融合配偶体；以及任选地，SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105的接头中的任一个的Ad5[E1-，E2b-]载体使用实施例1中所列的方法制备。编码新表位和SEQ ID NO：111的Ad5[E1-，E2b-]载体作为治疗性疫苗施用至有需要的受试者。受试者为哺乳动物，诸如人或非人灵长类动物。受试者患有癌症等病症。在施用疫苗后诱导细胞和体液免疫的建立，其驱动抗体和细胞介导的针对癌症的应答。施用疫苗后癌症病况得到缓解。
实施例17
用编码肿瘤新表位和IL-32的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症
该实施例描述用编码肿瘤新表位和IL-32的Ad5[E1-，E2b-]载体治疗癌症。编码SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：30的肿瘤新表位中的任一个；SEQ ID NO：112的免疫融合配偶体；以及任选地，SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105的接头中的任何一个的Ad5[E1-，E2b-]载体使用实施例1中所列的方法制备。编码新表位和SEQ ID NO：112的Ad5[E1-，E2b-]载体作为治疗性疫苗施用至有需要的受试者。受试者为哺乳动物，诸如人或非人灵长类动物。受试者患有癌症等病症。在施用疫苗后诱导细胞和体液免疫的建立，其驱动抗体和细胞介导的针对癌症的应答。施用疫苗后癌症病况得到缓解。
根据本公开内容，文公开和要求保护的方法中的所有都可在无需过度实验的情况下进行和执行。虽然已经根据优选实施方案描述本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，这些变化可应用于本文所述的方法和方法的步骤或步骤序列中。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时可获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (153)

1.一种包含复制缺陷型载体的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含：
编码肿瘤新抗原的核酸序列；以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列。
2.一种包含复制缺陷型载体的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含：
编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列；以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体为腺病毒载体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒载体为Ad5载体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含E2b区域、E1区域、E3区域和E4区域中的缺失，或其任何组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含E2b区域中的缺失。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含E2b区域中DNA聚合酶、前末端蛋白(pTP)或其组合的缺失。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体不为空壳载体。
9.根据权利要求1或3至8中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含多种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码序列。
10.根据权利要求1或3至9中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含至少十种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码核酸序列。
11.根据权利要求1或3至10中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含至少五种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码核酸序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述免疫融合配偶体包含分枝杆菌属物种、结核分枝杆菌衍生的Ra12片段、衍生自革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白的蛋白质D、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区域、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPS肽模拟物、志贺毒素、白喉毒素、IL-15超激动剂、ALT-803、CRM197或其任何组合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述免疫融合配偶体可为分枝杆菌属物种的片段或衍生物、结核分枝杆菌衍生的Ra12片段、衍生自革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白的蛋白质D、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区域、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPS肽模拟物、志贺毒素、白喉毒素、IL-15超激动剂、ALT-803、CRM197或其任何组合。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述免疫融合配偶体与SEQ IDNO：39至SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：109至SEQ ID NO：112中任一个的序列为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少90％同一。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体进一步包含编码接头的核酸序列。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述接头长1个至约150个核酸，长约5个至约100个核酸，或长约10个至约50个核酸。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的组合物，其中所述核酸序列编码氨基酸残基。
18.根据权利要求17的组合物，其中所述氨基酸残基形成氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述氨基酸序列包含1个至约50个氨基酸残基，约5个至约25个氨基酸残基或少于10个氨基酸残基。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的组合物，其中所述接头为聚丙氨酸接头或聚甘氨酸接头。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的组合物，其中所述接头包含丙氨酸和甘氨酸的混合物。
22.根据权利要求15至22中任一项所述的组合物，其中编码所述接头的所述核酸序列位于编码所述肿瘤新抗原的所述核酸序列和编码所述免疫融合配偶体的所述核酸序列之间。
23.根据权利要求15、18至19或21中任一项所述的组合物，其中所述接头为SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105中的任一项。
24.根据权利要求1或3至23中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含编码一种以上肿瘤新抗原的一种以上核酸序列。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述组合物为疫苗。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的载体。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少十种腺病毒载体。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少十种腺病毒载体。
29.根据权利要求1或3至28中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤新抗原包含肿瘤新表位、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TP1/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1或其任何组合。
30.根据权利要求1或3至29中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤新抗原包含肿瘤新表位。
31.根据权利要求1或3至30中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤新抗原包含CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7或其任何组合。
32.根据权利要求1或3至31中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤新抗原为肿瘤新表位，所述肿瘤新表位具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：22中任一个的氨基酸序列、SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：30中任一个的核苷酸序列，或者具有以下突变中的一个：基因SLC4A11的Q678P突变、基因SIGLEC1的D1143N突变、基因SIGLEC14的A292T突变、PIEZO2的T2356M突变、基因FAT4的S1613L突变、基因FCRL1的R268C突变，或基因VIPR2的V73M突变，或基因FLRT2的R346W突变。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体进一步包含编码共刺激分子的核酸序列。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述共刺激分子包含B7、ICAM-1、LFA-3或其任何组合。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的组合物，其中所述组合物另外包含工程化天然杀伤(NK)细胞。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述工程化NK细胞包含已被修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制受体)的表达的NK细胞、已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞以及已被修饰以表达CAR(嵌合抗原受体)的NK细胞，或其任何组合。
37.根据权利要求35至36中任一项所述的组合物，其中所述工程化NK细胞包含已被修饰为基本上缺乏表达KIR的NK细胞。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的组合物，其中所述工程化NK细胞包含已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的组合物，其中所述工程化NK细胞包含已被修饰以表达CAR的NK细胞。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述CAR为针对以下的CAR：肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TP1/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、或TEL/AML1。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的组合物，其中所述组合物另外包含免疫刺激剂。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述免疫刺激剂选自：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23和IL-32。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的组合物，其中所述组合物另外包含治疗有效量的IL-15或包含编码IL-15的核酸序列的复制缺陷型载体。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的组合物，其中所述组合物另外包含癌症疗法。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述癌症疗法为化学治疗剂量、放射剂量、免疫疗法或其任何组合。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中免疫疗法包含治疗有效量的包含复制缺陷型载体的组合物，所述复制缺陷型载体包含编码肿瘤相关抗原或肿瘤新抗原的核酸序列。
47.根据权利要求45至46中任一项所述的组合物，其中如果单独存在所述化学治疗剂量和所述放射剂量，则所述化学治疗剂量和所述放射剂量的组合以低于推荐剂量的剂量存在于所述组合物中。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的组合物，其中所述癌症疗法为抗PD-1抗体pembrolizumab。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的组合物，其中所述组合物另外包含治疗有效量的免疫途径限制点抑制剂。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述免疫途径限制点抑制剂包含治疗有效的组合物，所述组合物包含结合免疫途径限制点配体的抗体。
51.根据权利要求49至50中任一项所述的组合物，其中所述免疫途径限制点抑制剂为结合PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3或IDO的抗体。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体进一步包含编码报告分子的核酸序列。
53.根据权利要求1或3至52中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体包含编码附着于编码报告分子的核酸序列的肿瘤新抗原的核酸序列。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体以大于或等于1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012或更多病毒颗粒(VP)的剂量存在。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型载体以小于或等于每次免疫1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012或更多病毒颗粒的剂量存在。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤抗原对受试者具有特异性。
57.根据权利要求1或3至56中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤新抗原由包含肿瘤特异性单核苷酸变体(SNV)的核苷酸序列编码。
58.根据权利要求1或3至57中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤新抗原驱动细胞介导的免疫应答或被确定以驱动细胞介导的免疫应答。
59.根据权利要求1或3至58中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤新抗原为具有六个至十个氨基酸大小的肽。
60.根据权利要求2至59中任一项所述的组合物，其中CEA包含与SEQ ID NO：106具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。
61.根据权利要求2至60中任一项所述的组合物，其中MUC1-c包含与SEQ ID NO：107具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。
62.根据权利要求2至61中任一项所述的组合物，其中Brachyury包含与SEQ ID NO：108具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。
63.一种包含细胞的组合物，所述细胞包含权利要求1至62中任一项所述的组合物。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述细胞为树突细胞(DC)。
65.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至64中任一项所述的组合物。
66.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含复制缺陷型载体，其中所述复制缺陷型载体包含
编码肿瘤新抗原的核酸序列；以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列。
67.一种监测受试者的状态的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含复制缺陷型载体，其中所述复制缺陷型载体包含：
编码所述受试者的肿瘤新抗原的核酸序列，以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及
b)监测所述受试者中的所述肿瘤新抗原的状态。
68.一种检测受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含复制缺陷型载体，其中所述复制缺陷型载体包含：
编码肿瘤新抗原的核酸序列，以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及
b)在所述施用后检测所述受试者中的所述肿瘤新抗原的存在或不存在。
69.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者施用癌症疗法；
b)检测所述受试者中的肿瘤新抗原的存在；
c)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含复制缺陷型载体，其中所述复制缺陷型载体包含
编码肿瘤新抗原的核酸序列以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及
d)重复步骤b)至步骤c)。
70.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物包含细胞群体，其中所述细胞群体中的细胞包含复制缺陷型载体，并且其中所述复制缺陷型载体包含：
编码肿瘤新抗原的核酸序列，以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列。
71.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含复制缺陷型载体，其中所述复制缺陷型载体包含：
编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列；以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列。
72.一种监测受试者的状态的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含复制缺陷型载体，其中所述复制缺陷型载体包含：
编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列，以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及
b)监测所述受试者中的CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的状态。
73.一种检测受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含复制缺陷型载体，其中所述复制缺陷型载体包含：
编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列，以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及
b)在所述施用后检测所述受试者中的CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的存在或不存在。
74.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括：
a)向所述受试者施用癌症疗法；
b)检测所述受试者中的CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的存在；
c)向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含复制缺陷型载体，其中所述复制缺陷型载体包含：
编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列，以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列；以及
d)重复步骤b)至步骤c)。
75.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物包含细胞群体，其中所述细胞群体中的细胞包含复制缺陷型载体，并且其中所述复制缺陷型载体包含：
编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列，以及
编码免疫融合配偶体的核酸序列。
76.根据权利要求66至75中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体为腺病毒载体。
77.根据权利要求66至76中任一项所述的方法，其中所述腺病毒载体为Ad5载体。
78.根据权利要求66至77中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体包含E2b区域、E1区域、E3区域和E4区域中的缺失，或其任何组合。
79.根据权利要求66至78中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体包含E2b区域中的缺失。
80.根据权利要求66至79中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体包含E2b区域中DNA聚合酶、前末端蛋白(pTP)或其组合的缺失。
81.根据权利要求66至80中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体不为空壳载体。
82.根据权利要求66至70或76至81中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体包含多种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码序列。
83.根据权利要求66至70或76至82中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体包含至少十种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码序列。
84.根据权利要求66至70或76至83中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体包含至少五种复制缺陷型载体，其中每种复制缺陷型载体包含不同的肿瘤新抗原编码序列。
85.根据权利要求66至84中任一项所述的方法，其中所述免疫融合配偶体包含分枝杆菌属物种、结核分枝杆菌衍生的Ra12片段、衍生自革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白的蛋白质D、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区域、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPS肽模拟物、志贺毒素、白喉毒素、IL-15超激动剂、ALT-803、CRM197或其任何组合。
86.根据权利要求66至85中任一项所述的方法，其中所述免疫融合配偶体可为分枝杆菌属物种的片段或衍生物、结核分枝杆菌衍生的Ra12片段、衍生自革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白的蛋白质D、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区域、衍生自细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPS肽模拟物、志贺毒素、白喉毒素、IL-15超激动剂、ALT-803、CRM197或其任何组合。
87.根据权利要求66至86中任一项所述的方法，其中所述免疫融合配偶体与SEQ IDNO：39至SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：109至SEQ ID NO：112中任一个的序列为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少90％同一。
88.根据权利要求66至87中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体进一步包含编码接头的核酸序列。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述接头长1个至约150个核酸，长约5个至约100个核酸，或长约10个至约50个核酸。
90.根据权利要求88至89中任一项所述的方法，其中所述核酸序列编码氨基酸残基。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述氨基酸残基形成氨基酸序列。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述氨基酸序列包含1个至约50个氨基酸残基，约5个至约25个氨基酸残基或少于10个氨基酸残基。
93.根据权利要求88至92中任一项所述的方法，其中所述接头为聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头。
94.根据权利要求88至92中任一项所述的方法，其中所述接头包含丙氨酸和甘氨酸的混合物。
95.根据权利要求88至94中任一项所述的方法，其中编码所述接头的所述核酸序列位于编码所述肿瘤新抗原的所述核酸序列和编码所述免疫融合配偶体的所述核酸序列之间。
96.根据权利要求88、91至92或95中任一项所述的方法，其中所述接头为SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：105中的任一项。
97.根据权利要求66至70或76至96中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体包含编码肿瘤新抗原的一种以上核酸序列。
98.根据权利要求66至97中任一项所述的方法，其中所述药物组合物为疫苗。
99.根据权利要求66至98中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
100.根据权利要求66至99中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含至少十种腺病毒载体。
101.根据权利要求66至100中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含至少五种腺病毒载体。
102.根据权利要求66至101中任一项所述的方法，其中所述肿瘤新抗原包含肿瘤新表位、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TP1/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1或其任何组合。
103.根据权利要求66至102中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原包含肿瘤新表位。
104.根据权利要求66至103中任一项所述的方法，其中所述肿瘤新抗原包括CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7或其任何组合。
105.根据权利要求66至104中任一项所述的方法，其中所述肿瘤新抗原为肿瘤新表位，所述肿瘤新表位具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：22中任一个的氨基酸序列、SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：30中任一个的核苷酸序列，或者具有以下突变中的一个：基因SLC4A11的Q678P突变、基因SIGLEC1的D1143N突变、基因SIGLEC14的A292T突变、PIEZO2的T2356M突变、基因FAT4的S1613L突变、基因FCRL1的R268C突变，或基因VIPR2的V73M突变，或基因FLRT2的R346W突变。
106.根据权利要求66至105中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体进一步包含编码共刺激分子的核酸序列。
107.根据权利要求66至106中任一项所述的方法，其中所述共刺激分子包含B7、ICAM-1、LFA-3或其任何组合。
108.根据权利要求66至107中任一项所述的方法，进一步包含向所述受试者施用包含工程化天然杀伤(NK)细胞的附加药物组合物。
109.根据权利要求108的方法，其中所述工程化NK细胞包含已被修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制受体)的表达的NK细胞、已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞以及已被修饰以表达CAR(嵌合抗原受体)的NK细胞，或其任何组合。
110.根据权利要求108至109中任一项所述的方法，其中所述工程化NK细胞包含已被修饰为基本上缺乏表达KIR的NK细胞。
111.根据权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述工程化NK细胞包含已被修饰以表达高亲和力CD16变体的NK细胞。
112.根据权利要求108至111中任一项所述的方法，其中所述工程化NK细胞包含已被修饰以表达CAR的NK细胞。
113.根据权利要求112的方法，其中所述CAR为针对以下的CAR：肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TP1/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、或TEL/AML1。
114.根据权利要求1至113中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用包含免疫刺激剂的附加药物组合物。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述免疫刺激剂选自：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23和IL-32。
116.根据权利要求66至115中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用附加药物组合物，所述附加药物组合物包含治疗有效量的IL-15或包含编码IL-15的核酸序列的复制缺陷型载体。
117.根据权利要求66至70或75至116中任一项所述的方法，其中在确定受试者具有所述肿瘤新抗原之前，对所述受试者施用癌症疗法。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述癌症疗法为化学疗法、放射治疗、免疫疗法或其任何组合。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述免疫疗法包括治疗有效量的包含复制缺陷型载体的组合物，所述复制缺陷型载体包含编码肿瘤相关抗原或肿瘤新抗原的核酸序列。
120.根据权利要求118至119中任一项所述的方法，其中如果单独施用所述化学疗法和所述放射，则以低于推荐剂量的剂量施用化学疗法和放射的组合。
121.根据权利要求117至120中任一项所述的方法，其中所述癌症疗法为抗PD-1抗体pembrolizumab。
122.根据权利要求66至121中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用附加药物组合物，所述附加药物组合物包含治疗有效量的免疫途径限制点抑制剂。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述免疫途径限制点抑制剂包含治疗有效的组合物，所述组合物包含结合免疫途径限制点配体的抗体。
124.根据权利要求122至123中任一项所述的方法，其中所述免疫途径限制点抑制剂为结合PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3或IDO的抗体。
125.根据权利要求66至124中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体包含编码报告分子的核酸序列。
126.根据权利要求66至70或权利要求76至125中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体包含编码附着于编码报告分子的核酸序列的肿瘤新抗原的核酸序列。
127.根据权利要求66至126中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体以大于或等于1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012或更多病毒颗粒(VP)的剂量存在。
128.根据权利要求66至127中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型载体以小于或等于每次免疫1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012或更多病毒颗粒的剂量存在。
129.根据权利要求66至70或77至128中任一项所述的方法，其中所述肿瘤新抗原对受试者具有特异性。
130.根据权利要求66至70或76至129中任一项所述的方法，其中所述肿瘤新抗原由包含肿瘤特异性单核苷酸变体(SNV)的核苷酸序列编码。
131.根据权利要求66至70或76至130中任一项所述的方法，其中所述肿瘤新抗原驱动细胞介导的免疫应答或被确定以驱动细胞介导的免疫应答。
132.根据权利要求66至70或76至131中任一项所述的方法，其中所述肿瘤新抗原为具有六个至十个氨基酸大小的肽。
133.根据权利要求66至70或76至132中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述施用之前具有所述肿瘤新抗原。
134.根据权利要求66至70或76至133中任一项所述的方法，进一步包括确定所述受试者在施用期间或之后是否开发新的新抗原。
135.根据权利要求66至70或76至134中任一项所述的方法，其中所述肿瘤新抗原已经鉴定为将所述受试者的肿瘤样品的基因组谱与参照物进行比较的结果。
136.根据权利要求66至135中任一项所述的方法，进一步包括获得所述受试者的肿瘤样品的基因组谱。
137.根据权利要求66至136中任一项所述的方法，进一步包括将所述受试者的肿瘤样品的基因组谱与参照物进行比较以鉴定肿瘤特异性突变。
138.根据权利要求136所述的方法，其中获得基因组谱包括下一代测序、全外来体测序、合成测序、连接测序、单分子测序、用于单分子测序的纳米技术、离子半导体测序或其组合。
139.根据权利要求66至138所述的方法，进一步包括从肿瘤特异性突变中鉴定肿瘤新抗原。
140.根据权利要求139所述的方法，其中鉴定肿瘤新抗原包括蛋白质组学的使用。
141.根据权利要求66至140中任一项所述的方法，进一步包括鉴定肿瘤新表位。
142.根据权利要求66至141中任一项所述的方法，进一步包括访问数据库以获得先前存储的所述受试者的基因组谱或参照物。
143.根据权利要求66至142中任一项所述的方法，进一步包括在施用所述药物组合物之后鉴定所述受试者中的附加肿瘤新抗原。
144.根据权利要求66至143中任一项所述的方法，进一步包括在施用所述药物组合物之后鉴定所述受试者中的附加肿瘤新抗原，施用附加药物组合物，所述附加药物组合物包含附加复制缺陷型载体，所述附加复制缺陷型载体包含对所述受试者的附加肿瘤新抗原。
145.根据权利要求66至70或75至144中任一项所述的方法，进一步包括监测已施用所述药物组合物的所述受试者中的肿瘤新抗原的状态。
146.根据权利要求66至145中任一项所述的方法，其中所述癌症为胰腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈鳞状细胞癌或其任何组合。
147.根据权利要求66至146中任一项所述的方法，其中所述肿瘤新抗原为所述受试者中存在的一种以上肿瘤新抗原。
148.根据权利要求108至113、114至115、116至121或122至124中任一项所述的方法，其中所述药物组合物和所述附加药物组合物同时施用。
149.根据权利要求70至148中任一项所述的方法，其中所述细胞为树突细胞(DC)。
150.根据权利要求71至149中任一项所述的方法，其中CEA包含与SEQ ID NO：106具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。
151.根据权利要求71至150中任一项所述的组合物，其中MUC1-c包含与SEQ ID NO：107具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。
152.根据权利要求71至151中任一项所述的组合物，其中Brachyury包含与SEQ ID NO：108具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。
153.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括，
向所述受试者施用第一药物组合物，所述药物组合物包含第一复制缺陷型载体，其中所述第一复制缺陷型载体包含：
编码CEA、MUC1-c、Brachyury或其任何组合的核酸序列；或者
权利要求2至8、12至23、25至28、33至56或60至62中任一项所述的组合物；以及
向所述受试者施用第二药物组合物，所述第二药物组合物包含第二复制缺陷型载体，其中所述复制缺陷型载体包含编码权利要求1或3至59中任一项所述的组合物的核酸序列。
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