CN109862939A - 用于治疗人乳头瘤病毒(hpv)相关疾病的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗人乳头瘤病毒(hpv)相关疾病的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

提供了用于构建和制造重组腺病毒类载体疫苗的方法和组合物。在特定方面，提供涉及腺病毒载体的组成物和方法，所述腺病毒载体包括靶抗原如HPV E6和/或HPV E7的新颖抗原的基因，所述腺病毒载体用于在对于腺病毒具有预存免疫的个体中产生高反应性抗HPV和抗肿瘤免疫反应的治疗方法中。

Description

用于治疗人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2016年6月3日提交的美国临时专利申请第62/345,592号的权益，其公开内容通过引用以其全部并入本文。
关于联邦赞助的研究的声明
本发明得到了由国家牙科和颅面研究所(National Institute of Dental andCraniofacial Research)(NIDCR)授予的SBIR基金号1R43DE021973-01、2R44DE021973-02和3R44DE021973-03S1的政府资助。政府在本发明中享有一定权利。
背景技术
疫苗通过训练免疫系统识别和破坏有害物质与病变细胞，来帮助身体对抗疾病。很大程度上，疫苗可分为两种类型，预防性疫苗和治疗性疫苗。向健康人群给予预防疫苗，以预防特定疾病的发展；而向已诊断患有疾病的个人给予治疗性疫苗(也被称作免疫疗法)，以帮助终止疾病生长和扩散，或作为预防措施。
目前正在开发病毒疫苗，以接种疫苗抵抗传染性疾病和通过免疫疗法治疗传染性疾病诱发的癌症。这些病毒疫苗通过诱导宿主细胞内与疾病相关联的小部分基因的表达——这又增强宿主的免疫系统以识别和破坏含有传染原的病变细胞——来起作用。因此，病毒疫苗的临床反应可取决于疫苗获得高水平免疫原性和具有持久的长期表达的能力。
因此，仍需要开发用于对复杂疾病(如癌症，如人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病或HPV诱发的癌症)的治疗性反应增强的新颖组合物和方法。
发明内容
在各种方面中，本公开提供一种组合物，所述组合物包括复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括含有以下中的一个或更多个的核酸序列：a)核酸序列，其编码与SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；b)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；c)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；d)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:5、SEQID NO:18、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；以及e)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
在一些方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。在其它方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。在另其它方面中，载体包括核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。
在其它方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。在其它方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:2至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。在另其它方面中，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:3至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
在另其它方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:4至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。在一些方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。在一些方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:18至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。在一些方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:6至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。在其它方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:19至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
在一些方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。在其它方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:20至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。在一些方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。在一些方面，载体包括核酸序列，所述核酸序列包括与SEQ ID NO:21至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
在一些方面，载体为腺病毒载体。在其它方面，载体包括E1区、E2b区、E3区、E4区或其组合中的缺失。在进一步方面，载体包括E2b区中的缺失。在另外进一步方面，载体包括E1区、E2b区和E3区中的缺失。
在一些方面，组合物或载体进一步包括编码共刺激分子的核酸序列。在一些方面，共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。在进一步方面，共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。在一些方面，组合物进一步包括位于相同复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。在一些方面，组合物进一步包括位于单独复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。在一些方面，组合物包括至少5×1011个复制缺陷型病毒载体。
在一些方面，组合物包括编码含有HPV E6和HPV E7的融合蛋白的核苷酸序列。在一些方面，组合物包括：第一复制缺陷型腺病毒载体，其包括：E2b区中的缺失，和编码HPVE6的核酸序列；以及第二复制缺陷型腺病毒载体，其包括：E2b区中的缺失，和编码HPV E7的核酸序列。在一些方面，复制缺陷型病毒载体进一步包括编码可选标记的核酸序列。在进一步方面，可选标记为lacZ蛋白、胸苷激酶、gpt、GUS、或牛痘K1L宿主范围蛋白或其组合。在一些方面，经修饰的HPV抗原为经修饰的HPV E6抗原与经修饰的HPV E7抗原的组合。
在进一步方面，经修饰的HPV抗原为非致癌HPV抗原。在另外进一步方面，经修饰的HPV抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合结合。在一些方面，核酸序列具有与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其组合的位置23-496和502-795至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。在一些方面，核酸序列与SEQID NO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在一些方面，核酸序列与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
在一些方面，复制缺陷型病毒进一步包括编码一种或更多种额外靶抗原或其免疫表位的核酸序列。在进一步方面，一种或更多种额外靶抗原为肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、丝裂原或其组合。在一些方面，一种或更多种额外靶抗原为CEA、叶酸受体α、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSCA、PSMA、PAP、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、Her2/neu、BRCA1、BRACHYURY、BRACHYURY(TIVS7-2，多态性)、BRACHYURY(IVS7T/C多态性)、T BRACHYURY、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、Her2/neu、Her3、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、或TEL/AML1、或其经修饰的变体、剪接变体、功能性表位、表位激动剂或组合。
在一些方面，一种或更多种额外靶抗原为CEA、Brachyury和MUC1。在进一步方面，CEA包括与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的位置1057-3165至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的序列。在一些方面，MUC1-c包括与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的序列。在一些方面，Brachyury包括与SEQ ID NO:28至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的序列。
在一些方面，组合物包括至少1×109个病毒颗粒到至少5×1012个病毒颗粒。在一些方面，组合物包括至少1×1011个病毒颗粒。在其它方面，组合物包括至少5×1011个病毒颗粒。在一些方面，复制缺陷型病毒载体进一步包括编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在各种方面中，本公开提供一种药物组合物，其包括上述组合物中的任一者和药学上可接受的载剂。
在各种方面中，本公开提供一种宿主细胞，其包括上述组合物中的任一者。
在各种方面中，本公开提供一种制备肿瘤疫苗的方法，其包括制备上述任何药物组合物或制备上述任何组合物。
在各种方面中，本公开提供一种增强有需要的个体中的HPV特异性免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的上述任何组合物或上述任何药物组合物。
在各种方面中，本公开提供一种预防或治疗有需要的个体的HPV诱发的癌症的方法，所述方法包括向个体施用治疗有效量的上述任何组合物或上述任何药物组合物。在一些方面，施用消除个体中的HPV E6表达细胞或HPV E7表达细胞。在一些方面，方法为预防在施用之前确定为HPV阳性的个体的HPV诱发的癌症的方法。在一些方面，个体对于16型HPV或18型HPV致癌基因的表达呈阳性。
在进一步方面，方法进一步包括施用佐剂，其中所述佐剂包括弗氏(Freund's)不完全佐剂、弗氏完全佐剂、默克(Merck)佐剂65、AS-2、氢氧化铝凝胶(矾)、磷酸铝、钙盐、铁盐或锌盐、酰化酪氨酸、酰化糖、阳离子或阴离子衍生的多糖、聚磷腈、生物可降解的微球体、单磷酰脂质A、quil A、GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23或IL-32。在一些方面，个体为HPV阳性的，或表达HPV E6或HPV E7。在一些方面，方法进一步包括向个体施用免疫检查点抑制剂。在一些方面，免疫检查点抑制剂靶向PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA或CD244。
在进一步方面，免疫检查点抑制剂靶向PD-1或PDL1。在一些方面，免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体或抗PDL1抗体。在一些方面，免疫检查点抑制剂为抗PDL1抗体。在进一步方面，免疫检查点抑制剂为阿维鲁单抗(avelumab)。在一些方面，方法进一步包括治疗有需要的个体的HPV感染、HPV诱发的癌症或HPV相关疾病。在一些方面，个体患有HPV感染、HPV诱发的癌症或HPV相关疾病。在一些方面，HPV诱发的癌症为HPV诱发的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、口咽和扁桃体癌、阴道癌、阴茎癌、外阴癌、肛门癌或宫颈癌。在一些方面，个体患有以下的HPV阳性鳞状细胞癌：宫颈、阴道、外阴、头/颈、肛门或阴茎。
在一些方面，个体对于Ad5具有预存免疫。在一些方面，每三周重复施用治疗有效量的组合物。在一些方面，药物组合物包括至少5×1011个腺病毒载体。在进一步方面，方法进一步包括向个体施用化疗、放疗或其组合。在一些方面，施用途径为静脉内、皮下、淋巴管内、肿瘤内、皮内、肌肉内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、口服、经膀胱滴注或经划痕。在一些方面，个体在施用之后具有增强的免疫反应，所述免疫反应为细胞介导的反应或体液反应。在一些方面，个体具有增强的免疫反应，所述增强的免疫反应为B细胞增殖、CD4+T细胞增殖、CD8+T细胞增殖或其组合的增强。
在一些方面，个体具有增强的免疫反应，所述增强的免疫反应为IL-2产生、IFN-γ产生或其组合的增强。在进一步它方面，个体具有增强的免疫反应，所述增强的免疫反应为抗原呈递细胞增殖、功能或其组合的增强。在一些方面，个体先前已施用腺病毒载体。在一些方面，确定个体对于腺病毒载体具有预存免疫。
在进一步方面，方法进一步包括向个体施用包括工程改造的自然杀伤(NK)细胞的群体的药物组合物。在一些方面，工程改造的NK细胞包括：已经修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制性受体)表达的一个或更多个NK细胞，已经修饰以表达高亲和力CD16变体的一个或更多个NK细胞，和已经修饰以表达一种或更多种CAR(嵌合抗原受体)的一个或更多个NK细胞，或其任何组合。在一些方面，工程改造的NK细胞包括已经修饰为基本上缺乏KIR表达的一个或更多个NK细胞。在其它方面，工程改造的NK细胞包括已经修饰以表达高亲和力CD16变体的一个或更多个NK细胞。在另其它方面，工程改造的NK细胞包括已经修饰以表达一种或更多种CAR的一个或更多个NK细胞。
在一些方面，CAR为针对以下的CAR：肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、HPV E6、HPVE7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1或其任何组合。
在一些方面，腺病毒载体为复制缺陷型的。在一些方面，复制缺陷型腺病毒载体包括于细胞中。在进一步方面，细胞为树突状细胞(DC)。在一些方面，方法进一步包括施用药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的IL-15或含有编码IL-15的核酸序列的复制缺陷型载体。在一些方面，方法进一步包括施用药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的IL-15超激动剂或含有编码IL-15超激动剂的核酸序列的复制缺陷型载体。在进一步方面，IL-15超激动剂为ALT-803。
在各种方面中，本公开提供一种降低有需要的个体中的HPV表达细胞的方法，所述方法包括施用有效量的组合物，所述组合物包括含有编码经修饰的HPV E6、经修饰的HPVE7抗原或其组合的核酸序列的复制缺陷型病毒载体。在一些方面，核酸序列编码经修饰的HPV E6和经修饰的HPV E7。在一些方面，复制缺陷型病毒载体包括：a)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；b)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；c)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；d)核酸序列，其具有与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；e)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；f)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:13至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；g)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:14至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；或h)核酸序列，其包括与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
在一些方面，施用消除个体中的HPV E6表达细胞或HPV E7表达细胞。在一些方面，方法进一步包括预防在施用之前确定为HPV阳性的个体的HPV诱发的癌症。在一些方面，载体为腺病毒载体。在进一步方面，载体包括E1区、E2b区、E3区、E4区或其组合中的缺失。在另外进一步方面，载体包括E2b区中的缺失。在另外进一步方面，载体包括E1区、E2b区和E3区中的缺失。
在一些方面，组合物或载体进一步包括编码共刺激分子的核酸序列。在一些方面，共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。在进一步方面，共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。在另外进一步方面，组合物进一步包括位于相同复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。在一些方面，组合物进一步包括位于单独复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。在一些方面，组合物包括至少5×1011个复制缺陷型病毒载体。
在一些方面，组合物包括编码含有HPV E6和HPV E7的融合蛋白的核苷酸序列。在一些方面，组合物包括：第一复制缺陷型腺病毒载体，其包括：E2b区中的缺失，和编码HPVE6的核酸序列；以及第二复制缺陷型腺病毒载体，其包括：E2b区中的缺失，和编码HPV E7的核酸序列。在一些方面，复制缺陷型病毒载体进一步包括编码可选标记的核酸序列。
在进一步方面，可选标记为lacZ蛋白、胸苷激酶、gpt、GUS、或牛痘K1L宿主范围蛋白或其组合。在一些方面，经修饰的HPV E6抗原或HPV E7抗原为非致癌HPV抗原。在一些方面，经修饰的HPV E6抗原或HPV E7抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合结合。在进一步方面，核酸序列包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其组合的位置23-496和502-795至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
在其它方面，核酸序列包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:20的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在其它方面，核酸序列包括与SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:21的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在一些方面，个体对于16型HPV或18型HPV致癌基因的表达呈阳性。在一些方面，确定个体为HPV阳性的，或表达HPV E6或HPV E7。在一些方面，个体患有HPV感染。
在一些方面，已通过漱口液或宫颈刮片确定个体患有HPV感染。在一些方面，个体对于Ad5具有预存免疫。在一些方面，每三周重复施用。在一些方面，组合物包括至少5×1011个腺病毒载体。在一些方面，施用途径为静脉内、皮下、淋巴管内、肿瘤内、皮内、肌肉内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、口服、经膀胱滴注或经划痕。
在一些方面，施用途径为皮下施用。在一些方面，个体先前已施用腺病毒载体。在一些方面，确定个体对于腺病毒载体具有预存免疫。在一些方面，施用治疗有效量的组合物包括1×109到5×1012个病毒颗粒/剂。在进一步方面，施用治疗有效量的组合物包括至少1×1011个病毒颗粒/剂。在另外进一步方面，施用治疗有效量的组合物包括至少5×1011个病毒颗粒/剂。
在一些方面，施用治疗有效量的组合物，随后施用包括相同组合物或药物组合物的一种或更多种加强免疫。在进一步方面，每一个月、两个月或三个月施用加强免疫。在一些方面，重复加强免疫三次或更多次。在一些方面，施用治疗有效量为初次免疫，每一周、两周或三周，重复三次；随后加强免疫，每一个月、两个月或三个月，重复三次或更多次。
附图说明
图1A例示C57BL/6小鼠(n＝5只/组)免疫疗法的肿瘤大小的变化，所述小鼠在第0天植入2×105个不可触知的HPV E6/E7TC-1肿瘤细胞，且在第1、8和15天施用1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-null病毒颗粒(VP)或1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP。测定肿瘤大小，且根据式V＝(肿瘤宽度2×肿瘤长度)/2来计算体积。使用未配对t检验，进行实验组与载体对照组之间的显著性分析，且显著性由*(p<0.05)和**(p<0.01)指示。
图1B例示如图1A中所描述的小鼠的存活率曲线，所述存活率曲线使用Mantel-Cox检验来绘制和比较。显著性由**(p<0.01)指示。
图2A例示C57BL/6小鼠(n＝4只/组)免疫疗法的肿瘤大小的变化，所述小鼠在第0天植入2×105个可触知的小HPV E6/E7TC-1肿瘤细胞，且在第6、13和20天施用1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP或1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP。测定肿瘤大小，且根据式V＝(肿瘤宽度2×肿瘤长度)/2来计算体积。使用未配对t检验进行实验组与载体对照组之间的显著性分析，且显著性由**(p<0.01)指示。
图2B例示如图2A中所描述的小鼠的存活率曲线，所述存活率曲线使用Mantel-Cox检验来绘制和比较。显著性由**(p<0.01)指示。
图3A例示C57BL/6小鼠(n＝4只/组)免疫疗法的肿瘤大小的变化，所述小鼠在第0天植入2×105个建立的大HPV E6/E7TC-1肿瘤细胞，且在第13、20和27天施用1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP或1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP。测定肿瘤大小，且根据式V＝(肿瘤宽度2×肿瘤长度)/2来计算体积。使用未配对t检验进行实验组与载体对照组之间的显著性分析，且显著性由**(p<0.01)指示。
图3B例示如图3A中所描述的小鼠的存活率曲线，所述存活率曲线使用Mantel-Cox检验来绘制和比较。显著性由**(p<0.01)指示。
图4A例示C57BL/6小鼠(n＝7只/组)的肿瘤大小的变化，所述小鼠在第0天接种2×105个TC-1肿瘤细胞，且在第10、17和24天施用1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP加100μg同型对照大鼠IgG抗体处理。测定肿瘤大小，且根据式V＝(肿瘤宽度2×长度)/2来计算体积。肿瘤生长动力学表示每组中的个别小鼠。
图4B例示C57BL/6小鼠(n＝7只/组)的肿瘤大小的变化，所述小鼠在第0天接种2×105个TC-1肿瘤细胞，且在第10、17和24天施用1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP加100μg抗PD-1抗体处理。
图4C例示C57BL/6小鼠(n＝7只/组)的肿瘤大小的变化，所述小鼠在第0天接种2×105个TC-1肿瘤细胞，且在第10、17和24天施用1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP加100μg同型对照大鼠IgG抗体处理。
图4D例示C57BL/6小鼠(n＝7只/组)的肿瘤大小的变化，所述小鼠在第0天接种2×105个TC-1肿瘤细胞，且在第10、17和24天施用1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP加100μg抗PD-1抗体处理。
图5例示如图4A到图4D中的那些处理的C57BL/6小鼠(n＝7只/组)的存活率曲线。在肿瘤植入后第52天，终止实验。相较于两个对照小鼠组(Ad5[E1-、E2b-]-null和对照抗体，或Ad5[E1-、E2b-]-null和抗PD-1抗体)，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和对照抗体处理的小鼠呈现显著(p<0.008)较长的存活。7只中的2只(29％)Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和对照抗体处理小鼠在第52天仍存活。相较于两个对照组，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加抗PD-1抗体处理的小鼠呈现显著(p<0.0006)较长的存活。7只中的4只(57％)Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加抗PD-1抗体处理小鼠在第52天仍存活。
图6A例示Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7促进CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)募集到TC-1肿瘤中。对C57BL/6小鼠(n＝5只/组)植入2×105个TC-1肿瘤细胞。在植入之后十二天，小鼠开始用Ad5[E1-、E2b-]-null空白载体加对照IgG、Ad5[E1-、E2b-]-null加抗PD-1抗体、Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加对照IgG、或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加抗PD-1抗体进行处理。每周皮下施用疫苗，且每3-4天通过顶内注射施用抗PD-1抗体，并且在第27天分析肿瘤。Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7处理显著降低Treg/CD8+TIL比率。使用未配对t检验进行显著性分析，且显著性由ns(p>0.05)、*(p<0.05)、**(p<0.01)、***(p<0.001)或****(p<0.0001)指示。
图6B例示图6A的Treg/CD8+TIL比率的降低不是通过Treg数量的降低驱动。
图6C例示图6A的Treg/CD8+TIL比率的降低是通过CD8+TIL数量的增加驱动。
图7A例示Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加抗PD-1抗体组合疗法促进促炎性肿瘤微环境。对C57BL/6小鼠(n＝5只/组)进行肿瘤植入、处理，且如图6A到图6C分析肿瘤。PD-1+CD4+TIL和PD-1+CD8+TIL的频率在用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7处理的小鼠的肿瘤中增加。用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和抗PD-1抗体的组合处理的小鼠的肿瘤具有显著较低的PD-1+CD4+TIL和PD-1+CD8+TIL(A)、LAG-3+CD8+TIL(B)和(C)频率。使用未配对t检验进行显著性分析，且显著性由ns(p>0.05)、*(p<0.05)、**(p<0.01)或***(p<0.001)指示。
图7B例示用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和抗PD-1抗体的组合如图7A中处理的小鼠的肿瘤具有显著较低的LAG-3+CD8+TIL频率，使这些水平更加与对照小鼠的肿瘤一致。
图7C例示用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和抗PD-1抗体的组合如图7A中处理的小鼠的肿瘤具有显著降低的PDL1表达水平。
图8例示细胞介导的免疫(CMI)剂量反应，如由C57BL/6小鼠(n＝5只/组)的脾细胞的ELISpot所测量的，所述小鼠以14天间隔用1×108、1×109或1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP的剂量免疫三次，且在最终免疫之后14天进行评定。用个1×1010个VP剂量实现最大CMI诱导。将阳性对照脾细胞暴露于Con A。
图9A例示在以两周间隔用1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP免疫三次的C57BL/6小鼠(n＝5只/组)免疫之后，CD8-α+/IFN-γ+脾细胞的活化。对照接受1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP。通过流式细胞术评定在最终免疫之后14天收集的脾细胞。对于阳性对照，将脾细胞暴露于PMA/伊屋诺霉素(ionomycin)。
图9B例示在如图9A中所描述的小鼠免疫之后，CD8-α+/IFN-γ+/TNF-α+脾细胞的活化。
图10例示HPV免疫疗法在C57BL/6小鼠(n＝7只/组)中的效果，所述小鼠植入HPV-E6/E7表达TC-1肿瘤细胞(第0天)，且在第10、17和24天通过免疫疗法用1×1010个Ad5-nullVP加100μg对照IgG抗体(腹膜内)、1×1010个Ad5-null VP加100μg抗PD-1抗体、1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP加100μg小鼠IgG抗体、或1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP加100μg抗PD-1抗体处理。用或不用抗PD-1的免疫疗法到第23天引起显著的肿瘤生长抑制(p<0.05)。由于肿瘤质量，所有对照小鼠到第23天终止。
图11例示CMI反应，如通过流式细胞术评定的。以两周间隔，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP或1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，对C57BL/6小鼠免疫三次。在最终免疫之后两周，分析CD8α+脾细胞在用抗原特异性肽库刺激6小时之后IFNγ的胞内表达。绘制平均值+/-标准差。
图12例示建立的小HPV E6/E7表达肿瘤用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫疗法的结果。在第0天对C57BL/6小鼠植入2×105个TC-1肿瘤细胞，且在第6、13和20天，如由箭头指示，施用1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP(载体对照)或1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP。(A)测定肿瘤大小，且根据式V＝(肿瘤宽度2×肿瘤长度)/2来计算体积。在第23天，将载体对照组的小鼠进行安乐死。在这个第23天时间点之后，不能进行显著性分析，且这通过虚线指示。使用未配对t检验，进行实验组与载体对照组之间的显著性分析，且显著性由**(p<0.01)指示。误差棒表示平均值的标准误差。
图13图示所建立的HPV16-E6Δ/E7Δ表达肿瘤的与化疗/放疗治疗(CRT)组合的免疫疗法。所建立的HPV16-E6Δ/E7Δ表达肿瘤在第7、14和21天用Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ处理，结合在第13、20和27天用顺铂/放疗处理。通过注射，用Ad-null与顺铂/放疗处理组合处理对照肿瘤携带小鼠。
图14图示CRT对于CMI反应的效果。非肿瘤携带小鼠如上文图4中所描述进行处理。在最后处理之后两周，评定小鼠的CMI活性，如通过IFN-γ分泌脾细胞的ELISpot分析所测定。注意，在用组合疗法(Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ加CRT)处理的小鼠中，CMI反应增加。
图15通过漱口液或宫颈刮片样本例示呈HPV-16阳性的健康个体的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的I/Ib期试验的处理方案。
图16例示患有HPV-16阳性鳞状细胞癌的个体的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的I期试验的研究设计和处理方案。
图17例示患有HPV 16阳性鳞状细胞癌的个体的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的I期试验的处理和相关生物标记方案。
具体实施方式
以下段落更详细地描述某些实施例的不同方面。除非相反地清楚指示，否则每个方面都可以与任何其它一个或更多个方面组合。确切地说，任何指示为优选或有利的特征都可以与任何其它指示为优选或有利的特征组合。
除非另外指示，否则任何实施例可与任何其它实施例组合。各种方面可以以一个范围形式出现。应理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，并且不应该被解释为是对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应视为，已具体地公开所有可能子范围以及在所述范围内的个别数值，如同明确地写出一般。举例来说，对如从1到6的范围的描述应视为已经具体地公开子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及所述范围内的个别数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都适用。当存在多个范围时，范围包含范围端点。
如本文所用，除非另外指示，否则冠词“一(a)”意味着一个或更多个，除非另外明确地指出。如本文所用，除非另外指示，否则如“含有(contain/containing)”、“包含(include/including)”以及其类似者的术语意味着“包括(comprising)”。如本文所用，除非另外指示，否则术语“或(or)”可为连词或转折词。如本文所用，除非另外指示，否则任何实施例可与任何其它实施例组合。
I.腺病毒载体构建体
“腺病毒”(Ad)是指来自腺病毒科的未包膜的DNA病毒。这些病毒可在(但不限于)人、鸟、牛、猪和犬物种中找到。一些实施例涵盖来自腺病毒科的四个属(例如禽腺病毒属、哺乳动物腺病毒属、富AT腺病毒属(Atadenovirus)和唾液酸酶病毒属(Siadenovirus))中的任一种的任何Ad的用途——其作为E2b缺失病毒载体或含有如本文所描述的其它缺失的载体的基础。另外，在每种物种中找到若干种血清型。Ad也涉及这些病毒血清型中的任一种的基因衍生物，包含但不限于基因突变、缺失或转座。
“第一代腺病毒”是指缺失早期区1(E1)的Ad。在额外情况中，也可缺失早期区3(E3)。
“第二代腺病毒”是指从病毒缺失(去除)E1、E2、E3和(在某些实施例中)E4DNA基因序列的全部或部分的Ad。
“E2b缺失的”是指使DNA序列突变，以此方式以便防止至少一个E2b基因产物的表达和/或功能。因此，在某些实施例中，“E2b缺失的”是关于从Ad基因组缺失(去除)的特定DNA序列使用。E2b缺失的或“在E2b区内含有缺失”是指在Ad基因组的E2b区内缺失至少一个碱基对。因此，在某些实施例中，缺失多于一个碱基对，且在进一步实施例中，缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一实施例中，缺失具有在Ad基因组的E2b区内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。E2b缺失可以是防止至少一个E2b基因产物的表达和/或功能的缺失，且因此涵盖在E2b特定蛋白质的编码部分的外显子内的缺失以及在启动子和前导序列内的缺失。在某些实施例中，E2b缺失为防止E2b区的DNA聚合酶和前末端蛋白中的一个或两个的表达和/或功能的缺失。在进一步实施例中，“E2b缺失的”是指Ad基因组的此区的DNA序列中使得一个或更多个所编码蛋白质呈非功能性的一个或更多个点突变。这类突变包含残基被不同残基置换，导致产生非功能性蛋白质的氨基酸序列改变。
“E1缺失的”是指使DNA序列突变，以此方式以便防止至少一个E1基因产物的表达和/或功能。因此，在某些实施例中，“E1缺失的”是关于从Ad基因组缺失(去除)的特定DNA序列使用。E1缺失的或“在E1区内含有缺失”是指在Ad基因组的E1区内缺失至少一个碱基对。因此，在某些实施例中，缺失多于一个碱基对，且在进一步实施例中，缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一实施例中，缺失具有在Ad基因组的E1区内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。E1缺失可以是防止至少一个E1基因产物的表达和/或功能的缺失，且因此涵盖在E1特定蛋白质的编码部分的外显子内的缺失以及在启动子和前导序列内的缺失。在某些实施例中，E1缺失为防止E1区的反式作用转录调节因子中的一个或两个的表达和/或功能的缺失。在进一步实施例中，“E1缺失的”是指Ad基因组的此区的DNA序列中使得一个或更多个所编码蛋白质呈非功能性的一个或更多个点突变。这类突变包含残基被不同残基置换，导致产生非功能性蛋白质的氨基酸序列改变。
相较于第一代腺病毒载体，某些实施例提供第二代E2b缺失的腺病毒载体，其含有DNA聚合酶基因(pol)中的缺失和前末端蛋白(pTP)的缺失。相较于第一代腺病毒载体的5到6kb能力，E2b缺失的载体具有上至13kb基因携载力，从而容易地为编码各种靶抗原中的任一种的核酸序列提供空间。相较于第一代腺病毒载体，E2b缺失的腺病毒载体还具有降低的不良反应。
“靶抗原”或“靶蛋白”是指免疫反应所针对的分子，如蛋白质。
对于野生型Ad的先天性免疫反应可能是复杂的，且似乎由腺病毒载体表达的Ad蛋白起重要作用。具体来说，E2b缺失的载体中的前末端蛋白和DNA聚合酶的缺失似乎能够在注射后第一个24到72h期间降低炎症，而第一代腺病毒载体在此时间期间刺激炎症。另外，据报道，由E2b缺失产生的额外复制块还引起Ad晚期基因表达降低10,000倍，远远超过单独E1、E3缺失得到的降低。通过E2b缺失的腺病毒载体产生的Ad蛋白水平降低，有效地降低针对Ad抗原的竞争性非所需免疫反应的可能，这防止在Ad或暴露的个体中重复使用平台。通过第二代E2b缺失的载体降低炎性反应的诱导使得载体在抗原呈递细胞(即，树突状细胞)感染期间表达所需疫苗抗原的可能增加，降低抗原竞争的可能，从而使得疫苗对于所需抗原相对于利用第一代腺病毒载体的相同尝试具有更高的免疫。E2b缺失的腺病毒载体提供一种改进的Ad类候选疫苗，其比先前描述使用第一代腺病毒载体的候选疫苗更安全、更有效且更通用。
因此，第一代E1缺失的腺病毒亚型5(Ad5)类载体(尽管为用作癌症疫苗有前景的平台)的活性会被天然存在或诱发的Ad特异性中和抗体所阻碍。在不受理论束缚的情况下，具有E1和E2b区缺失的Ad5类载体(Ad5[E1-、E2b-])——所述E2b区编码DNA聚合酶和前末端蛋白，例如凭借减弱的晚期病毒蛋白质表达，可避免免疫清除，且诱导针对Ad免疫宿主中所编码的肿瘤抗原转基因更强效的免疫反应。
一些实施例涉及用于产生针对靶抗原——确切地说与传染性疾病或增殖性细胞疾病(如癌症)相关联或相关的那些靶抗原——的免疫反应的方法和组合物(例如病毒载体)。一些实施例涉及用于在个体中产生针对靶抗原——确切地说与细胞增殖疾病(如癌症)相关的那些靶抗原——的免疫反应的方法和组合物。在一些实施例中，本文所描述的组合物和方法涉及在个体中产生针对表达和/或呈递靶抗原或包括至少一个靶抗原的靶抗原标志(signature)的细胞的免疫反应。一些实施例提供用于结合PD-1检查点阻断，使用免疫HPV基因E6、HPV基因E7或其组合的病毒基因递送平台，针对人乳头瘤病毒(HPV)的免疫疗法的组合物和方法。在某些实施例中，这些组合物和方法结合免疫途径检查点调节剂，使用Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-E6可以指Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6，或反之亦然。Ad5[E1-、E2b-]-E7可以指Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7，或反之亦然。Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7可以指Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7，或反之亦然。
一般来说，腺病毒对于临床用途是有吸引力的，这是因为其可具有宽广的向性，其可感染各种分裂和非分裂细胞类型，且其可在哺乳动物身体中全身性使用以及通过更多选择性粘膜表面。另外，其相对热稳定性进一步有助于其临床用途。腺病毒为DNA病毒家族，特征为含有线性双链基因组的二十面体未包膜衣壳。一般来说，发现腺病毒为包括大小接近～30-35千碱基的双链DNA基因组的未包膜病毒。在人Ad中，没有一种是与任何肿瘤性疾病相关联，且在具有免疫能力的个体中仅引起相对轻微的自我限制病痛。在一些实施例中，在感染后，Ad基因组或本文所描述的腺病毒载体中的基因并不并入宿主基因中，且是在染色体外加工。
病毒最先表达的基因为E1基因，其用以从野生型基因组中存在的其它Ad5基因启动子起始高水平基因表达。病毒DNA复制和子代病毒粒子的组装发生在受感染细胞的细胞核内，且整个生命周期花费约36小时，其中每个细胞大致输出104个病毒粒子。野生型Ad5基因组大致为36kb，且编码分成早期和晚期病毒功能的基因，所述早期和晚期病毒功能取决于是在DNA复制之前还是之后表达。早期/晚期定界几乎为绝对的，这是由于已证实先前用Ad5感染的细胞的重叠感染引起缺乏重叠感染病毒的晚期基因表达，直到其已复制其自身基因组之后。在不受理论束缚的情况下，这可能是由于Ad5主要晚期启动子(MLP)的复制依赖型顺式活化，阻止晚期基因表达(主要为Ad5衣壳蛋白)，直到复制的基因组呈递为被囊封为止。在一些实施例中，如本文所描述的组合物和方法利用发展先进一代的Ad载体/疫苗的特征。腺病毒的线性基因组一般侧接两个DNA复制起点(ITR)，且具有用于RNA聚合酶II介导的转录的八个单元。该基因组携带五个早期单元E1A、E1B、E2、E3、E4和E5，在病毒复制起始之后延迟表达的两个单元(IX和IVa2)，和细分为L1到L5的一个晚期单元(L)。一些腺病毒可进一步编码一或两个称为病毒相关(VA)RNA的RNA种类。
提供在人类个体中诱导先天性和适应性免疫反应的腺病毒。通过缺失或插入病毒基因组的关键区，提供已经工程改造来增加其可预测性且降低非所需副作用的重组载体。在一些方面，提供一种腺病毒载体，其包括选自以下的基因组缺失或插入：E1A、E1B、E2、E3、E4、E5、IX、IVa2、L1、L2、L3、L4和L5，以及其任何组合。
某些实施例提供重组腺病毒载体，其包括经改变的衣壳。一般来说，腺病毒的衣壳主要包括二十面体的20个三角形小面，每个二十面体含有12个六邻体三聚物拷贝。另外，还存在其它若干额外微量衣壳蛋白：IIIa、VI、VIII和IX。
某些实施例提供重组腺病毒载体，其包括一种或更多种经改变的纤维蛋白。一般而言，纤维蛋白(其也形成三聚物)在12个顶点处插入到五聚化五邻体碱基中。纤维可包括薄的N端尾(tail)、轴(shaft)和结(knob)结构域。轴可包括可变数量的β链重复序列。结可包括一个或更多个环：A、B、C、D、E、F、G、H、I或J。纤维结环可与细胞受体结合。某些实施例提供腺病毒载体，其用于治疗癌症和传染性疾病的疫苗系统中。
可以与本发明方法和本公开的组合物一起使用的合适腺病毒包含但不限于：物种特异性腺病毒，其包含人类子组A、B1、B2、C、D、E和F；或如本文所提供的其关键基因组区，所述子组可进一步分类成免疫学上不同血清型。此外，可以与本发明方法和本公开的组合物一起使用的合适腺病毒包含但不限于从灵长类动物、牛科动物、家禽、爬行动物或青蛙鉴定的物种特异性腺病毒或其关键基因组区。
一些腺病毒血清型优先靶向不同器官。血清型，如AdHu1、AdHu2和AdHu5(亚属C)，一般影响和感染上部呼吸道，而亚属A和F影响肠胃器官。某些实施例提供用于优先靶向不同器官以治疗器官特异性癌症或器官特异性传染性疾病的重组腺病毒载体。在一些应用中，改变重组腺病毒载体以降低对于哺乳动物中的特定器官的向性。在一些应用中，改变重组腺病毒载体以增加对于哺乳动物中的特定器官的向性。
腺病毒的向性可通过其附着于宿主细胞受体的能力来确定。在一些情况下，宿主细胞附着的过程可涉及纤维的远端结结构域与宿主细胞表面分子的初始结合，随后五邻体碱基内的RGD基序与αV整合素的结合。某些实施例提供向性改变的重组腺病毒载体，使得其可经基因工程改造以感染宿主的特定细胞类型。某些实施例提供向性改变的重组腺病毒载体，以治疗细胞特异性癌症或细胞特异性传染性疾病。某些实施例提供纤维结改变或插入RGD序列的重组腺病毒载体，所述纤维结来自子组A、B、C、D或F或其组合的一种或更多种腺病毒。在一些应用中，包括经改变纤维结的重组腺病毒载体产生对于一个或更多个特定细胞类型的向性降低的载体。在一些应用中，包括经改变纤维结的重组腺病毒载体产生对于一个或更多个特定细胞类型的向性增强的载体。在一些应用中，包括经改变纤维结的重组腺病毒载体产生产物特异性B或T细胞反应降低的载体。在一些应用中，包括经改变纤维结的重组腺病毒载体产生产物特异性B或T细胞反应增强的载体。
某些实施例提供重组腺病毒载体，其包被有其它分子以规避病毒中和抗体的影响或改进向宿主细胞中的转导。某些实施例提供重组腺病毒载体，其包被有有助于使载体附着于宿主细胞受体的衔接分子。通过举例，腺病毒载体可包被有将柯萨奇病毒(coxsackie)Ad受体与CD40L连接的衔接分子，使得树突状细胞的转导增加，从而增强个体中的免疫反应。还涵盖进行类似地工程改造以增强对于其它靶细胞类型附着的其它腺病毒载体。
构建第一代或E1缺失的腺病毒载体Ad5[E1-]，使得转基因仅替代基因的E1区。通常地，约90％的野生型Ad5基因组保留于载体中。Ad5[E1-]载体的复制能力降低，且在感染不表达Ad5E1基因的细胞之后不会产生感染性病毒。重组Ad5[E1-]载体在允许Ad5[E1-]载体复制和包装的人细胞(例如HEK 293细胞)中繁殖。Ad5[E1-]载体具有多种正面属性；最重要的一个是其相对易于规模扩大和cGMP生产。目前，远超过220例人类临床试验使用Ad5[E1-]载体，其中超过两千名个体sc、im或iv给予病毒。此外，Ad5载体不会整合；其基因组保持游离型。一般来说，对于不会整合到宿主基因组中的载体，就算是有的话，插入诱变和/或种系转移的风险极低。常规Ad5[E1-]载体具有接近7kb的携载力。
缺失E1和E2b区的Ad5类载体(Ad5[E1-、E2b-])——所述E2b区编码DNA聚合酶和前末端蛋白，凭借减弱的晚期病毒蛋白质表达，提供避免免疫清除且诱导针对Ad免疫宿主中所编码的肿瘤抗原转基因更强效的免疫反应的机会。新的Ad5平台具有额外的E2b区中的缺失——去除了DNA聚合酶和前末端蛋白基因。Ad5[E1-、E2b-]平台具有足以允许包含许多可能基因的扩大的克隆能力。相较于Ad5[E1-]载体7kb能力，Ad5[E1-、E2b-]载体具有高达约12kb基因携载力，提供多个基因的空间(如果需要)。在一些实施例中，将超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11kb的插入物引入到Ad5载体中，所述载体如Ad5[E1-、E2b-]载体。E2b区的缺失赋予Ad5载体有利的免疫特性，通常引起对于靶标转基因抗原的强效免疫反应，同时最小化对于Ad病毒蛋白的免疫反应。
在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括经修饰的序列，所述序列编码与野生型免疫原性多肽或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性的多肽。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括经修饰的序列，所述序列编码野生型多肽的亚基。在一些实施例中，组合物和方法涉及包括与SEQ ID NO:17具有至少60％序列同一性的腺病毒来源载体。
在一些实施例中，腺病毒来源载体——任选地涉及复制缺陷型腺病毒，包括与SEQID NO:17具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％或99.9％同一性的序列或通过替代密码子置换由SEQ ID NO:17产生的序列。在不同实施例中，本文所描述的腺病毒来源载体具有E2b区和任选地E1区中的缺失，所述缺失赋予在如本文所描述的免疫疗法中使用所述载体的各种优势。
腺病毒基因组内的某些区提供基本功能，且当构建复制缺陷型腺病毒载体时可能需要基本上为保守的。这些区进一步描述于Lauer等人,J.Gen.Virol.,85,2615-25(2004)、Leza等人,J.Virol.,第3003-13页(1988)以及Miralles等人,J.Bio Chem.,第264卷,第18期,第10763-72页(1983)中，所述文献以全文通过引用并入。在一些实施例中，使用重组核酸载体，其包括与SEQ ID NO:17的一部分(如包括SEQ ID NO:17的至少约100、250、500、1000或更多个碱基的部分)具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％同一性值的序列。
某些实施例涵盖使用E2b缺失的腺病毒载体，其如描述于美国专利第6,063,622号、第6,451,596号、第6,057,158号、第6,083,750号以及第8,298,549号中的那些，所述专利各自以全文通过引用并入本文中。在许多情况下，具有E2b区中的缺失的载体削弱病毒蛋白质表达，和/或降低产生有复制能力的Ad(RCA)的频率。这些E2b缺失的腺病毒载体的繁殖可使用表达缺失E2b基因产物的细胞系来进行。本文提供这类包装细胞系，例如E.C7(正式地称为C-7)，来源于HEK-2p3细胞系。
此外，E2b基因产物、DNA聚合酶和前末端蛋白，可连同E1基因产物一起在E.C7或类似细胞中组成性表达。基因片段从Ad基因组转移到生产细胞系具有直接的益处：(1)增加携载力；以及(2)降低RCA产生的可能，通常需要两个或大于两个独立重组事件来产生RCA。在一些实施例中，所使用的E1、Ad DNA聚合酶和/或前末端蛋白表达细胞系可使得具有接近13kb携载力的腺病毒载体能够繁殖，而不需要污染性辅助病毒。另外，当缺失病毒生命周期关键的基因(例如E2b基因)时，发生Ad复制或表达其它病毒基因蛋白的进一步削弱。这可降低受感染细胞的免疫识别，且延长外源转基因表达的持续时间。
E1、DNA聚合酶和前末端蛋白缺失的载体通常不能够表达E1和E2b区的各自蛋白质。此外，其可显示缺乏大部分病毒结构蛋白的表达。举例来说，Ad的主要晚期启动子(MLP)负责转录晚期结构蛋白L1到L5。尽管MLP在Ad基因组复制之前具有极小活性，但仅在已发生病毒基因组复制之后，从MLP主要转录和翻译高毒性Ad晚期基因。这种顺式依赖型的晚期基因转录活化为DNA病毒(一般来说，如在多瘤病毒和SV-40的生长中)的一种特征。DNA聚合酶和前末端蛋白对于Ad复制为重要的(不同于E4或蛋白质IX蛋白)。其缺失对于腺病毒载体晚期基因表达和所述表达在如APC的细胞中的毒性效果可为极其不利的。
腺病毒载体可包含Ad基因组的E2b区和任选地E1区中的缺失。在一些情况下，这类载体并不缺失Ad基因组的任何其它区。腺病毒载体可包含Ad基因组的E2b区中的缺失和E1与E3区中的缺失。在一些情况下，这类载体未缺失其它区。腺病毒载体可包含Ad基因组的E2b区中的缺失和E1、E3中的缺失与部分或完成去除E4区。在一些情况下，这类载体无其它缺失。腺病毒载体可包含Ad基因组的E2b区中的缺失和E1和/或E4区中的缺失。在一些情况下，这类载体不含有其它缺失。腺病毒载体可包含Ad基因组的E2a、E2b和/或E4区中的缺失。在一些情况下，这类载体无其它缺失。腺病毒载体可缺失E1和/或E2b区的DNA聚合酶功能。在一些情况下，这类载体无其它缺失。腺病毒载体可缺失E1和/或E2b区的前末端蛋白功能。在一些情况下，这类载体无其它缺失。腺病毒载体可缺失E1、DNA聚合酶和/或前末端蛋白功能。在一些情况下，这类载体无其它缺失。腺病毒载体可具有E2b区和/或E1区的至少一部分。在一些情况下，这类载体不是空壳(gutted)腺病毒载体。在这点上，载体可同时缺失E2b区的DNA聚合酶和前末端蛋白功能二者。腺病毒载体可具有腺病毒基因组的E1、E2b和/或100K区中的缺失。腺病毒载体可包括缺失E1、E2b和/或蛋白酶功能的载体。在一些情况下，这类载体无其它缺失。腺病毒载体可缺失E1和/或E2b区，而纤维基因已通过突变或其它改变(例如以改变Ad向性)进行修饰。可向所提到的任一种腺病毒载体添加去除E3或E4区的基因。在某些实施例中，腺病毒载体可以是空壳腺病毒载体。
“空壳”或“无内容”是指已缺失所有病毒编码区的Ad载体。
“辅助腺病毒”或“辅助病毒”是指可提供特定宿主细胞不能(宿主可提供Ad基因产物，如E1蛋白)提供的病毒功能的Ad。这种病毒用于反式提供第二病毒或辅助依赖型病毒(例如空壳或无内容病毒，或缺失如本文所描述的特定区(如E2b或其它区)的病毒)中缺乏的功能(例如蛋白质)；第一复制不胜任无复制能力的病毒称为“辅助”第二辅助依赖型病毒，从而允许在细胞中产生第二病毒基因组。
可缺失Ad基因组的其它区。Ad基因组的特定区中的“缺失”是指特定DNA序列用阻止由所述区编码的至少一种基因产物的表达和/或功能(例如DNA聚合酶的E2b功能或前末端蛋白功能)这样一种方法进行突变或去除。缺失涵盖蛋白质的外显子编码部分内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。特定区内的缺失是指Ad基因组的所述区内的至少一个碱基对的缺失。可缺失多于一个碱基对。举例来说，可从特定区缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。缺失可为在Ad基因组的特定区内的多于150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。这些缺失可阻止由所述区编码的基因产物的表达和/或功能。举例来说，Ad基因组的特定区可包含一个或更多个点突变，使得一个或更多个所编码的蛋白质为非功能性的。这类突变包含残基被不同残基置换，导致产生非功能性蛋白质的氨基酸序列改变。Ad基因组中的例示性缺失或突变包含以下区中的一个或更多个：E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、L1、L2、L3、L4、L5、TP、POL、IV和VA区。可例如使用重组技术来制备缺失的腺病毒载体。
在某些实施例中，Ad载体可使用适当的包装细胞系成功地生长到高滴度，所述细胞系组成性表达E2b基因产物和可能已缺失的任一种必需基因的产物。可使用不仅组成性表达E1和DNA聚合酶蛋白且还表达Ad前末端蛋白的HEK 293来源细胞。可使用E.C7细胞例如以生长高滴度的腺病毒载体储液。
为了从自我繁殖的腺病毒载体缺失关键基因，可在HEK-293细胞中首先共表达或类似连同E1蛋白一起共表达由靶基因编码的蛋白质。举例来说，可选择性地使用当组成性共表达时无毒的那些蛋白质(或诱导性表达的有毒蛋白质)。在HEK-293细胞中共表达E1和E4基因是可能的(例如使用诱导性而非组成性启动子)。可共表达E1和蛋白质IX基因(一种病毒粒子结构蛋白)。还可能进一步共表达E1、E4和蛋白质IX基因。E1和100K基因可在反式互补细胞系中表达，E1和蛋白酶基因也可。
可使用共表达E1和E2b基因产物以用于生长高滴度的缺失E2b的Ad颗粒的细胞系。适用细胞系组成性表达大致140kDa Ad-DNA聚合酶和/或大致90kDa前末端蛋白。拥有高水平组成性共表达E1、DNA聚合酶和前末端蛋白而无毒性的细胞系(例如E.C7)是用于繁殖复制缺陷型腺病毒载体所需的。这些细胞系准许缺失E1、DNA聚合酶和前末端蛋白的腺病毒载体繁殖。
可使用例如含有E.C7细胞的组织培养平板来繁殖重组Ad，所述E.C7细胞经Ad载体病毒储液以适当MOI(例如5)感染且在37℃下温育40-96h。可收集受感染细胞，再悬浮于10mM Tris-Cl(pH 8.0)中且超声处理，并且病毒可通过两轮氯化铯密度离心来纯化。含有病毒的条带可在柱上脱盐，可添加蔗糖或甘油，且可将等分试样存储在-80℃下。可将病毒放置于设计为增强其稳定性的溶液(如A195)中。可测量储液的滴度(例如通过测量在裂解之后病毒等分试样在260nm下的光密度)。可将涵盖整个重组E2b缺失的腺病毒载体的质粒DNA(线性或环状)转染到E.C7或类似细胞中，且在37℃下温育，直到出现病毒产生的迹象(例如细胞病变效应)为止。来自细胞的条件培养基可用于感染更多细胞以扩增在纯化之前所产生病毒的量。可例如通过两轮氯化铯密度离心或选择性过滤来实现纯化。病毒可通过色谱法使用可商购的产品或常规色谱柱来纯化。
如本文所描述的组合物可包括足够的病毒以确保待感染的细胞面对某一数量的病毒。因此，一些实施例提供一种重组Ad储液，如无RCA的重组Ad储液。病毒储液的滴度可相当大地变化，这很大程度上取决于病毒基因型和用于制备其的方案与细胞系。病毒储液可具有至少约106、107或108个病毒颗粒(VP)/mL，或更高，如至少约109、1010、1011或1012个VP/mL的滴度。
“腺病毒5-无效(Ad5-null)”是指不含有用于表达的任何异源核酸序列的非复制Ad。
“转染”是指将外源核酸引入到真核细胞中。转染的例示性手段包含：磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、反转录病毒感染和基因枪法。
“稳定转染(Stable transfection/stably transfected)”是指将外源核酸、DNA或RNA引入且整合到转染细胞的基因组中。术语“稳定转染子”是指已将外源DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。
“报告基因”指示编码报告分子(例如酶)的核苷酸序列。“报告分子”在各种检测系统中的任一种中为可检测的，所述检测系统包含但不限于酶类检测分析(例如ELISA、组织化学分析)、荧光、放射性和发光系统。可采用大肠杆菌(E.coli)β半乳糖苷酶基因、绿色荧光蛋白(GFP)、人类胎盘碱性磷酸酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因以及其它报告基因。
“异源序列”是指接合到或被操纵以接合到核酸序列的核苷酸序列，在自然界中，所述核苷酸序列不与所述核酸序列接合，或在自然界中它们于不同位置处接合。异源核酸可包含天然存在的核苷酸序列或相对于天然存在序列的一些修饰。
“转基因”是指引入到个体的细胞或基因组中的任何基因编码区、天然或异源核酸序列，或融合的同源或异源核酸序列。转基因可携载于用于将转基因引入到个体细胞中的任何病毒载体上。
“产生免疫反应”或“诱导免疫反应”是指一种或更多种免疫细胞(T细胞、B细胞、抗原呈递细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞以及其类似细胞)的数量，或这些免疫细胞中的一种或更多种的活性(CTL活性、HTL活性、细胞因子分泌、细胞因子分泌轮廓变化等)统计学上显著变化(例如增加或减少)。
II.用于免疫疗法和疫苗的病毒载体
重组病毒载体可用于表达蛋白质编码基因或抗原(例如TAA(肿瘤相关抗原)和/或IDAA(传染性疾病相关抗原))。重组病毒载体类疫苗和免疫疗法的优势包含：高效率基因转导、高度特异性地递送基因到靶细胞、诱导稳健免疫反应和增加细胞免疫。某些实施例提供重组腺病毒载体，其包括病毒基因组的关键区的缺失或插入。本文提供的病毒载体可包括编码所关注的一种或更多种靶抗原(期望产生针对其的免疫反应)的异源核酸序列，或其变体、片段或融合物。
人乳头瘤病毒(HPV)载体可用于表达抗原。举例来说，通过修饰基因组中的致癌基因，如通过缺失或插入HPV病毒基因组的关键区，重组载体可进行工程改造以增加感染的可预测性和降低非所需副作用。例示性HPV载体为与腺病毒载体的融合载体。例示性HPV载体为Ad5[E1-、E2b-]-HPV抗原病毒载体，其包括经修饰的非致癌HPV E6和/或HPV E7。
人和动物中的研究已表明，针对Ad5的预存免疫可为商用Ad类疫苗的抑制因子。多数人具有针对Ad5的抗体，其为人类疫苗最广泛使用的亚型，其中所研究人类的三分之二具有针对Ad5的淋巴增殖性反应。预存免疫可抑制使用典型Ad5疫苗的免疫或再免疫，且可以阻止在稍后时间使用Ad5载体针对第二抗原的疫苗免疫。克服预存抗载体免疫的问题已成为重点研究的主题。已检查使用替代性人类(非Ad5类)Ad5亚型或甚至非人类Ad5形式的研究。即使这些方法初始免疫成功，但随后疫苗接种可能是有问题的，这是由于对于新颖Ad5亚型的免疫反应。为了避免Ad5免疫屏障，且改进第一代Ad5[E1-]载体的有限功效以诱导最优免疫反应，一些实施例涉及下一代Ad5载体类疫苗平台。
在不同实施例中，Ad5[E1-、E2b-]载体诱导强效的细胞介导免疫(CMI)，以及针对载体表达的疫苗抗原的抗体，即使在存在Ad免疫的情况下。相较于Ad5[E1-]载体，Ad5[E1-、E2b-]载体还具有降低的不良反应，尤其是肝毒性和组织损伤的出现。这些Ad5载体的关键方面为极大地降低Ad晚期基因的表达。举例来说，可在体内检测Ad5[E1-]载体的衣壳纤维蛋白的产生，而从Ad5[E1-、E2b-]载体疫苗去除纤维表达。对于野生型Ad的先天性免疫反应是复杂的。从Ad5[E1-、E2b-]载体缺失的蛋白质一般起重要作用。具体来说，相较于Ad5[E1-]载体，具有前末端蛋白或DNA聚合酶缺失的Ad5[E1-、E2b-]载体在注射后第一个24到72h期间显示炎症降低。在不同实施例中，Ad5基因表达的缺乏使得受感染细胞对抗Ad活性不可见，且准许受感染细胞表达转基因持续延长的一段时间，这发展对于靶标的免疫。
已发现，Ad5[E1-、E2b-]载体不仅比Ad5[E1-]载体更安全，且关于诱导抗原特异性免疫反应来说看起来更优异，使得其更适用作递送可引起临床反应的HPV E6和/或HPV E7疫苗的平台。在其它情况下，免疫诱导可耗费数月。
一些实施例涵盖增加Ad5[E1-、E2b-]载体转导树突状细胞的能力，通过利用针对Ad5[E1-、E2b-]载体病毒蛋白质的炎性反应降低以及由此产生的预存Ad免疫避开而改进疫苗中的抗原特异性免疫反应。
克服抗Ad免疫的尝试已包含在Ad5病毒衣壳蛋白质中使用替代性Ad血清型和/或替代物，各自具有有限的成效，且有可能显著地改变所得疫苗的生物分布。因此，通过进一步降低从E1缺失的Ad5载体表达病毒蛋白质(已知为预存Ad免疫的靶标的蛋白质)，尝试全新的方法。具体来说，新颖重组Ad5平台已描述早期1(E1)基因区中的缺失和早期2b(E2b)基因区中的额外缺失(Ad5[E1-、E2b-])。E2b区(其编码DNA聚合酶和前末端蛋白)的缺失使得病毒DNA复制和晚期病毒蛋白质表达减少。这种载体平台可用于诱导癌症和传染性疾病动物模型中的CMI反应，且更重要地，这种重组Ad5基因递送平台克服Ad5免疫屏障，且可用于预存免疫和/或载体诱发的Ad免疫的情况，因此能够多次同源施用疫苗。在特定实施例中，一些实施例涉及血清型5的复制缺陷型腺病毒载体，其包括编码免疫原性多肽的序列。免疫原性多肽可以是突变体、天然变体或其片段。
III.编码抗原靶标的多核苷酸和变体
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文基本上互换使用。多核苷酸可为单链(编码或反义链)或双链，且可为DNA(例如基因组的、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可包含hnRNA分子，其含有内含子且以一对一方式对应于DNA分子；和mRNA分子，其不含有内含子。额外编码或非编码序列可以但不必须存在于如本文所描述的多核苷酸内，且多核苷酸可以但不必须与其它分子和/或支持(support)材料连接。如本文所用，经分离多核苷酸意指多核苷酸基本上与其它编码序列分开。举例来说，如本文所用，经分离DNA分子不含有大部分的无关编码DNA，如大的染色体片段或其它功能性基因或多肽编码区。这是指如初始经分离的DNA分子，且并不排除稍后在实验室中以重组方式添加到区段中的基因或编码区。
如所属领域的技术人员将理解，多核苷酸可包含基因组序列、基因组外和质粒编码的序列，和较小的工程改造基因区段，所述基因区段表达或可适于表达如本文所描述的靶抗原、抗原片段、肽以及其类似物。这类区段可为天然经分离的，或通过人力以合成方式经修饰的。
通常，多核苷酸变体将含有一个或更多个取代、添加、缺失和/或插入，优选地使得由变体多核苷酸编码的多肽的表位的免疫原性或异源靶蛋白的免疫原性相对于由天然多核苷酸序列编码的多肽基本上不减弱。在一些情况下，一个或更多个取代、添加、缺失和/或插入可引起由变体多核苷酸编码的多肽的表位的免疫原性增加。如本文其它地方所描述，多核苷酸变体可编码靶抗原的变体或其片段(例如表位)，其中变体多肽或其片段(例如表位)与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向相对于天然多肽基本上不减弱。多核苷酸变体可编码靶抗原的变体或其片段，其中变体多肽或其片段与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向相对于天然多肽基本上增加。
术语“变体”还应理解为涵盖异种来源的同源基因。在特定实施例中，靶抗原的变体或片段经修饰，使得其具有一个或更多个降低的生物活性。举例来说，致癌蛋白质靶抗原可经修饰以降低或消除蛋白质的致癌活性，或病毒蛋白质可经修饰以降低或消除一个或更多个活性或病毒蛋白质。经修饰的HPV E6蛋白的实例为具有L26V突变，使得变体蛋白质的免疫原性增加的HPV E6。
当比较多核苷酸序列时，如下文所描述，如果两个序列中的核苷酸的序列当进行最大对应性比对时是相同的，那么两个序列被称为“同一的”。两个序列之间的比较典型地通过在比较窗口比较序列以鉴定和比较局部区的序列相似性来进行。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个、通常30到约75个、40到约50个邻接位置的区段，其中在两个序列经最优比对之后，序列可以与具有相同数目的邻接位置的参考序列相比较。用于比较的序列的最优比对可使用生物信息学软件的Lasergene程序组中的Megalign程序，使用默认参数来进行。可选地，用于比较的序列的最优比对可通过以下来进行：Smith和Waterman,Add.APL.Math 2:482(1981)的局部同一性算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性比对算法；搜索Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性方法；这些算法(GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)的计算机化实施方式；或检测(inspection)。适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法。BLAST和BLAST 2.0可以例如以本文所述的参数使用，以确定多核苷酸的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开可用。在一个说明性实例中，对于核苷酸序列，累积得分可以使用参数M(匹配残基对的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的惩罚得分；始终<0)计算。当累积比对得分从其达到的最大值降低量X；由于一次或更多次负分残基比对的累积，累积得分变成零或低于零；或到达任一序列的末端时，中断字命中在各方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序使用默认值：字长(W)为11和期望值(E)为10、且BLOSUM62计分矩阵比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4，且进行两条链的比较。
“序列同一性百分比”可通过在至少20个位置的比较窗口比较两个最优比对序列来确定，其中相较于用于两个序列的最优比对的参考序列(其不包括添加或缺失)，比较窗口中的多核苷酸序列部分可包括20％或更少、通常5到15％或10到12％的添加或缺失(即，间隙)。百分比通过以下方式计算：确定两个序列中存在的同一核酸碱基的位置数，得到匹配位置数，将匹配位置数除以参考序列中的总位置数，并且将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
所属领域的一般技术人员应了解，如本文所描述，由于遗传密码的简并，存在多种编码所关注的特定抗原或其片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列携有最小同源性。但是，特异性地涵盖由于密码子使用差异而变化的多核苷酸。此外，包括本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在一些实施例的范围内。等位基因是由于核苷酸的一个或更多个突变(如缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。所得mRNA和蛋白质可以但不必须具有改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定。
某些实施例提供核酸序列，在本文中也被称作编码一个或更多个所关注的靶抗原或其片段或变体的多核苷酸。因此，一些实施例提供编码如在本文中进一步描述的来自任何来源的靶抗原的多核苷酸、包括这类多核苷酸的载体和用这类表达载体转化或转染的宿主细胞。为了表达所需靶抗原多肽，可将编码多肽的核苷酸序列或功能性等效物插入到适当Ad载体中(例如使用重组技术)。适当腺病毒载体可含有用于转录与翻译所插入编码序列的必需元件以及任何所需连接子。所属领域的技术人员熟知的方法可用于构建这些含有编码所关注的多肽的序列和适当的转录与翻译控制元件的腺病毒载体。这些方法包含体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。
多核苷酸可包括天然序列(即，编码靶抗原多肽/蛋白质/表位或其部分的内源性序列)，或可包括编码这种序列的变体、片段或衍生物的序列。多核苷酸序列可编码靶抗原蛋白质。在一些实施例中，多核苷酸表示经优化以在特定细胞类型中表达的新颖基因序列，所述基因序列可基本上与天然核苷酸序列或变体不同但编码类似蛋白质抗原。
在其它相关实施例中，多核苷酸变体与编码蛋白质(例如所关注的靶抗原)的天然序列具有基本上同一性，例如相较于编码多肽的天然多核苷酸序列具有至少70％序列同一性，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性(例如使用标准参数的BLAST分析)的那些多核苷酸变体。考虑密码简并、氨基酸相似性、阅读框定位等，这些值可进行适当地调整，以测定由两条核苷酸序列编码的蛋白质的对应同一性。多核苷酸可编码相较于由天然多核苷酸序列编码的蛋白质序列具有例如至少70％序列同一性的蛋白质，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性。
多核苷酸可包括编码多肽(例如靶蛋白抗原)的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、11、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000或更多个连续核苷酸，和其间的所有中间长度。在此环境中，“中间长度”是指给出值之间的任何长度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包含200到500之间的所有整数；500-1,000等。多核苷酸序列可在一端或两端处通过编码多肽(如表位或异源靶蛋白)的天然序列中不存在的额外核苷酸延长。这种额外序列可由在所公开序列的任一端处或在所公开序列的两端处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸组成。
多核苷酸——不管编码序列自身的长度如何，可与如以下的其它DNA序列组合：启动子、表达控制序列、聚腺苷酸化信号、额外限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段以及其类似序列，使得其总长度可相当大地变化。因此预期，可采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地受预期重组DNA方案中的制备和使用的容易性限制。预期总长度为以下的说明性多核苷酸区段可用于许多实施例：约1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、约500、约200、约100、约50个碱基对长度以及其类似长度(包含所有中间长度)。
可采用诱变方法如位点特异性诱变来制备靶抗原序列。多肽序列中的特异性修饰可通过编码其的潜在(underlying)多核苷酸的诱变来制备。通过使用编码具有所需突变的DNA序列的寡核苷酸序列，以及足够数量的相邻核苷酸以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，在横穿的缺失接合两侧形成稳定的双螺旋，位点特异性诱变可用于制备突变体。举例来说，可采用包括长度在约14至约25个核苷酸左右的引物，其中在序列接合的两侧上约5至约10个残基被改变。可在所选择多核苷酸序列中进行突变，以改进、更改、降低、调节或以其它方式改变多核苷酸的特性，和/或更改所编码多肽的以下特性：活性、组成、稳定性或一级序列。
多核苷酸序列的诱变可用于更改所编码多肽的一个或更多个特性，如包括于多肽中的表位的免疫原性或靶抗原的致癌性。检验多肽的免疫原性的分析包含但不限于：T细胞细胞毒性分析(CTL/铬释放分析)、T细胞增殖分析、胞内细胞因子染色、ELISA、ELISpot等。可采用获得肽和编码其的DNA序列的序列变体的其它方式。举例来说，编码所需肽序列的重组载体可用诱变剂(如羟胺)处理，以获得序列变体。
编码如本文所描述的多肽的多核苷酸区段或片段可容易地通过例如利用化学手段直接合成片段来制备。可通过应用核酸复制技术(如PCR)，通过将所选择序列引入到用于重组生产的重组载体中来获得片段。
可使用各种载体/宿主系统来容纳和产生多核苷酸序列。例示性系统包含：微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA载体转化的细菌，用酵母载体转化的酵母；昆虫细胞系统，其用病毒载体(例如杆状病毒)感染；植物细胞系统，其用病毒载体(例如花椰菜嵌纹病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或细菌载体(例如Ti或pBR322质粒)转化；或动物细胞系统。
Ad载体中存在的控制元件或调节序列可包含载体的那些非翻译区：增强子、启动子和5'与3'非翻译区。这类元件可在其强度和特异性方面变化。取决于所使用的载体系统和宿主，可使用任何数量的合适转录与翻译元件，其包含组成性和诱导性启动子。举例来说，可将编码所关注的多肽的序列接合到由晚期启动子和三联前导序列组成的Ad转录/翻译复合物中。病毒基因组的非必需E1或E3区中的插入可用于获得能够在受感染宿主细胞中表达多肽的活病毒。另外，转录增强子，如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)增强子，可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
特异性起始信号还可用以实现编码所关注的多肽的序列(例如ATG起始密码子和相邻序列)的更高效翻译。外源性翻译元件和起始密码子可具有多种天然和合成的来源。表达效率可通过包含适合于所使用的特定细胞系统的增强子来增强。也可并入特异性终止序列(转录或翻译终止序列)，以便实现编码所选多肽的序列的有效翻译。
可使用各种方案来检测和测量多核苷酸编码产物(例如靶抗原)的表达(例如使用对产物具有特异性的多克隆或单克隆抗体)。实例包含酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。对于一些应用，使用单克隆抗体与既定多肽上的两个非干扰表位反应的基于两位点单克隆的免疫分析可为优选的，但也可采用竞争性结合分析。
Ad载体可包括可被检测到或选择的产物，如其产物可如通过显色或荧光底物上的荧光、酶活性以及其类似方法被检测到或通过生长条件选择的报告基因。例示性报告基因包含：绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、新霉素磷酸转移酶、分泌性碱性磷酸酶(SEAP)和人生长激素(HGH)。例示性可选标记包含药物抗性，如新霉素(G418)、潮霉素以及其类似药物。
Ad载体还可包括启动子或表达控制序列。启动子的选择将部分地取决于靶向细胞类型和所需控制的程度或类型。合适的启动子非限制性地包含组成性启动子、诱导性启动子、组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子、时序特异性启动子或事件特异性启动子。组成性或非特异性启动子的实例包含SV40早期启动子、SV40晚期启动子、CMV早期基因启动子、牛乳头状瘤病毒启动子和腺病毒启动子。除病毒启动子以外，细胞启动子也适合和适用于可用于一些实施例。确切地说，所谓管家基因的细胞启动子为适用可用的(例如β-肌动蛋白)。病毒启动子为一般比细胞启动子更强的启动子。还可使用诱导性启动子。这些启动子包含：MMTV LTR，其可通过地塞米松(dexamethasone)诱导、；金属硫蛋白诱导，其可通过重金属诱导；和具有cAMP反应元件的启动子，其可通过cAMP诱导；热休克启动子。通过使用诱导性启动子，可将核酸递送到细胞，且将保留静止直到添加诱导剂为止。这允许对所关注蛋白质的产生时机进行进一步控制。可使用事件型特异性启动子(例如HIV LTR)，其仅在发生某一事件(如致肿瘤性或病毒感染)后具活性或上调。除非tat基因产物存在——其发生在病毒感染后，否则HIV LTR启动子无活性。一些事件型启动子也为组织特异性的。优选的事件型特异性启动子包含在病毒感染后活化的启动子。
启动子的实例包含针对以下的启动子：α-胎蛋白、α-肌动蛋白、myo D、癌胚抗原、VEGF受体；FGF受体；TEK或tie 2；tie；尿激酶受体；E-选择素和P-选择素；VCAM-1；内皮糖蛋白；内皮唾液酸蛋白；αV-β3整合素；内皮素-1；ICAM-3；E9抗原；血管性血友病因子；CD44；CD40；血管内皮钙粘素；notch 4、高分子量黑素瘤相关抗原；前列腺特异性抗原-1、probasin、FGF受体、VEGF受体、erb B2；erb B3；erb B4；MUC-1；HSP-27；int-1；int-2、CEA、HBEGF受体；EGF受体；酪氨酸酶、MAGE、IL-2受体；前列腺酸性磷酸酶、probasin、前列腺特异性膜抗原、α-晶状体球蛋白、PDGF受体、整合素受体、α-肌动蛋白、SM1和SM2肌球蛋白重链、钙调蛋白-h1、SM22α-血管紧张素受体、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链和CD4。
可插入抑制子序列、阴性调节子或组织特异性沉默子，以减少多核苷酸的非特异性表达。可在启动子区中插入多个抑制子元件。转录抑制与抑制子元件的取向或距启动子的距离无关。抑制子序列的一种类型为隔离子序列。这类序列抑制转录，且可使背景转录沉默。阴性调节元件可位于多个不同基因的启动子区中。抑制子元件可在不存在因子如类固醇的情况下用作转录的抑制子，如卵白蛋白基因的启动子区中的NSE一样。这些阴性调节元件可结合来自输卵管的特异性蛋白质复合物，所述蛋白质复合物无一对类固醇敏感。三个不同元件位于卵白蛋白基因的启动子中。对应于这些元件部分的寡核苷酸可抑制TK报告基因的病毒转录。沉默子元件中的一个与其它基因中的沉默子具有序列同一性(TCTCTCCNA(SEQ ID NO:1))。
可将增加所需靶抗原表达的元件并入到本文所描述的Ad载体的核酸序列中。例示性元件包含内部核糖体结合位点(IRES)。IRES可增加翻译效率。同样，其它序列可增强表达。对于一些基因，尤其在5'端处的序列可抑制转录和/或翻译。这些序列通常为可形式发夹结构的回文结构。在一些情况下，缺失待递送核酸中的这类序列。可分析转录物或翻译产物的表达水平，以确认或确定哪些序列影响表达。转录水平可通过任何已知方法来分析，所述方法包含RNA印迹杂交、RNA酶探针保护以及类似方法。蛋白质水平可通过包含ELISA在内的任何已知方法来分析。
IV.抗原特异性免疫疗法和疫苗
某些实施例提供使用这类载体和如本文所提供的其它载体，针对HPV E6、HPV E7或其组合的单一抗原或组合抗原免疫。某些实施例提供针对患有HPV诱发或HPV相关癌症的个体中的HPV E6和/或HPV E7的治疗性疫苗。其它实施例提供针对HPV阳性而无癌症但处于发展HPV诱发癌症高风险下的个体中的HPV E6和/或HPV E7的疫苗。此外，在不同实施例中，本文所提供的组合物和方法可引起临床反应，如改变的疾病进展或预期寿命。
Ad5载体衣壳与树突状细胞(DC)的相互作用可触发若干有益反应，这可增强DC呈递由Ad5载体编码的抗原的倾向。举例来说，未成熟的DC——尽管在抗原摄取方面特化——为T细胞活化的相对低效的效应子。DC成熟与DC驱动T细胞免疫的能力增强相符。在一些例子中，所述组合物和方法利用Ad5感染，引起直接诱导DC成熟。在一些例子中，Ad载体感染来自小鼠的未成熟骨髓来源的DC可上调通常与DC成熟相关联的细胞表面标记(MHC I和II、CD40、CD80、CD86和ICAM-1)，以及下调CD11c——在骨髓DC成熟后下调的整合素。在一些例子中，Ad载体感染触发DC产生IL-12，所述IL-12为DC成熟的标记。在不受理论束缚的情况下，这些事件可以是可能由于Ad5触发的NF-κB途径的活化。成熟DC可有效地由Ad载体转导，且并不失去其在较低感染复数(MOI)下刺激初始T细胞增殖的功能性潜能，如通过成熟CD83+人类DC(来源于外周血液单核细胞)所展现的。然而，成熟DC与比未成熟的DC相比可能较不受感染。衣壳蛋白的修饰可用作优化通过Ad载体感染DC以及增强功能性成熟的策略，例如使用CD40L受体作为病毒载体受体，而不是使用正常CAR受体感染机制。
在一些实施例中，包括Ad5[E1-、E2b-]载体(一种或多种)HPV E6和/或HPV E7抗原疫苗的组合物和方法具有在技术安全性范围内总存活率(OS)增加的效果。
在一些实施例中，抗原靶标与良性肿瘤相关联。在一些实施例中，所靶向的抗原与癌前肿瘤相关联。
如上文所指出，腺病毒载体包括核酸序列，所述核酸序列编码所关注的一个或更多个靶蛋白或抗原。在这点上，载体可含有核酸，所述核酸编码所关注的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种不同靶抗原。靶抗原可以是全长蛋白质，或可以是其片段(例如表位)。腺病毒载体可含有编码来自一种所关注的靶蛋白的多个片段或表位的核酸序列，或可含有来自所关注的众多不同靶蛋白的一个或更多个片段或表位。靶抗原可包括期望针对其产生免疫反应的任何物质，但一般来说，靶抗原为蛋白质。靶抗原可包括全长蛋白质、蛋白质亚基、蛋白质同种型或其诱导免疫反应的片段(即，免疫原性片段)。靶抗原或其片段可经修饰，例如以降低靶抗原的一种或更多种生物活性，或以增强其免疫原性。靶抗原或靶蛋白可为HPV E6、HPV E7或两者。
“免疫原性片段”是指多肽的如此片段，其由B细胞和/或T细胞表面抗原受体特异性识别(即，特异性结合)，从而使得产生特异性针对片段的免疫反应。
在某些实施例中，免疫原性片段与MHC I类或II类分子结合。如果这类结合为可使用所属领域中已知的任何分析检测到的，那么免疫原性片段可“与”MHC I类或II类分子“结合”。举例来说，多肽与MHC I类结合的能力可间接通过监测促进将125I标记的β-2-微球蛋白(β-2m)并入到MHC I类/β2m/肽异源三聚复合物中的能力来评价。可选地，可采用所属领域中已知的功能性肽竞争分析。多肽的免疫原性片段一般可使用熟知技术来鉴定。用于鉴定免疫原性片段的代表性技术包含筛选能够与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的多肽。特定靶多肽的免疫原性片段为以基本上不小于全长靶多肽的反应性的水平(例如在ELISA和/或T细胞反应性分析中)，与这类抗血清和/或T细胞反应的片段。换句话说，免疫原性片段可在这类分析中以类似于或大于全长多肽的反应性的水平反应。这类筛选可以使用所属领域中已知的方法进行。
在一些实施例中，病毒载体包括异源核酸序列，所述异源核酸序列编码可调节免疫反应的一个或更多个蛋白质、其变体、其融合物或其片段。在一些实施例中，第二代E2b缺失的腺病毒载体包括异源核酸序列。在一些实施例中，异源核酸序列为HPV E6和HPV E7、其变体、部分或任何组合。
V.HPV抗原靶标
靶抗原还可包含与人乳头瘤病毒(HPV)相关联的蛋白质或其变体或片段，如癌蛋白E6和/或E7。在某些实施例中，癌蛋白经修饰，以产生非致癌变体或致癌性相对于野生型蛋白质降低的变体。举例来说，肽负责结合肿瘤抑制蛋白(例如p53和pRb)的部分可缺失或经修饰，以使得其不再与肿瘤抑制蛋白相互作用。在某些实施例中，HPV E6和HPV E7可经进一步修饰，以包含与所选择MHC分子结合的激动剂表位，例如HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24。举例来说，HPV E6和/或HPV E7可经修饰以含有一种或更多种激动剂表位。在一些例子中，可在免疫期间使用两种或更多种靶抗原。举例来说，E6和/或E7抗原可由相同载体、或组合使用的含有编码E6和E7靶抗原的异源核苷酸的单独载体表达。举例来说，可与Ad5-E7载体一起施用Ad5-E6载体。在此实例中，Ad5-E6载体和Ad5-E7载体可同时施用或其可顺序施用。
高风险人乳头瘤病毒(HPV)如16型HPV(HPV-16)与宫颈癌和超过90％的HPV相关头颈部鳞状细胞癌的病因学相关联。预防性疫苗，如HPV二价[16型和18型]疫苗和重组体与HPV四价[6型、11型、16型和18型]疫苗可以通过预防病毒感染，而主要防御HPV相关癌症，但报告指示其对于所建立疾病的活性免疫疗法无效。HPV早期6(E6)和早期7(E7)基因，以高水平在HPV诱发癌症中表达，且涉及初级人表皮细胞的永生化。因此，这些是肿瘤特异性免疫疗法的理想靶标，这是因为，不同于许多其它肿瘤相关抗原，这些病毒抗原为“非自身的”，且因此并不具有诱导自身免疫性的潜能。
在某些实施例中，本文公开了针对人乳头瘤病毒(HPV)的疫苗，其可用于降低、破坏或消除HPV阳性而未患癌症但具有较高风险发展HPV诱发或HPV相关癌症的个体中的HPVE6/E7表达细胞。
在某些实施例中，公开在HPV阳性个体中治疗HPV诱发或HPV相关疾病(如癌症)的疫苗或免疫疗法。
本公开的HPV疫苗使用病毒基因递送平台，来免疫HPV-16基因E6和E7(Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7)。在一些实施例中，可将Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗与程序性死亡配体1(PD-1)阻断组合。本文还公开如此疫苗，其由携载经修饰的HPV-16E6和/或E7基因的基因递送媒介物(Ad5[E1-、E2b-])构成。HPV E6和/或E7基因可经修饰，以使其为非致癌的同时保持产生针对HPV和HPV诱发肿瘤的免疫反应所必需的抗原性。本文还公开，HPV E6和HPV E7可经进一步修饰，以包含与所选择MHC分子结合的激动剂表位，例如HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24。举例来说，HPV E6和/或HPV E7可经修饰，以含有一种或更多种激动剂表位。可将经修饰的基因并入到疫苗(Ad5[E1-、E2b-]-E6；Ad5[E1-、E2b-]-E7；或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7)中。Ad5[E1-、E2b-]-E6疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-E7疫苗或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗可保留诱导HPV特异性细胞介导的免疫(CMI)反应的能力。在一些实施例中，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗可与标准临床疗法协同作用，增强对HPV E6/E7表达肿瘤的免疫介导的清除。在一些实施例中，Ad5[E1-、E2b-]-E6疫苗可与标准临床疗法协同作用，增强对HPV E6表达肿瘤的免疫介导的清除。在一些实施例中，Ad5[E1-、E2b-]-E7疫苗可与标准临床疗法协同作用，增强对HPV E7表达肿瘤的免疫介导的清除。
某些实施例使用新的Ad5[E1-、E2b-]载体系统，来递送长久以来对发展针对HPVE6和/或HPV E7的治疗性疫苗的需要，克服在使用其它Ad5系统的情况下存在的屏障，以及准许先前已暴露于Ad5的人群进行免疫。
为了解决自身肿瘤抗原的低免疫原性，提供多种先进的多组分疫苗接种策略，其包含共施用佐剂和免疫刺激细胞因子。一些实施例涉及重组病毒载体，其提供先天性促炎性信号，而同时经工程改造以表达所关注的抗原。备受关注的是腺病毒血清型5(Ad5)类免疫治疗剂，其已反复地在人中使用来诱导稳健的T细胞介导的免疫反应，同时所有均维持广泛的安全分布。
活化与抑制信号之间的平衡调节T淋巴细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，其中T细胞反应通过由T细胞受体(TCR)抗原识别来起始。在一些情况下，当在携带HPV E6/E7表达肿瘤的小鼠中与化疗/放疗组合时，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法治疗，可相较于单独接受化疗/放疗的个体，引起显著的总存活率提高。
在特定实施例中，HPV抗原经修饰为非致癌性HPV抗原或相比于野生型HPV致癌性降低的经修饰HPV抗原。在某些实施例中，经修饰的HPV抗原经进一步修饰，以含有一种或更多种激动剂表位。举例来说，本文所用的抗原为：经修饰的HPV E6抗原，其具有SEQ ID NO:8(具有E6A1表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:9(具有E6A3表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:10(具有E6A1+E6A3表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:13中所阐述的氨基酸序列，或与其至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一的氨基酸序列；经修饰的HPV E7抗原，其具有SEQ ID NO:12(具有E7A3表位的HPV16E7)、SEQ ID NO:14中所阐述的氨基酸序列，或与其至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一的氨基酸序列；或其组合。在特定实施例中，抗原的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:2(具有E6A1表位的HPV16E6和具有E7A3表位的HPV16E7)、SEQ ID NO:3(具有E6A3表位的HPV16E6和具有E7A3表位的HPV16E7)或SEQ IDNO:4(具有E6A1和E6A3表位的HPV16E6，和具有E7A3表位的HPV16E7)或其组合的位置23-496和502-795至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一的区。举例来说，核酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4(编码HPV E6和E7蛋白质两者的核苷酸序列)具有至少80％同一性。在其它实施例中，核酸序列与SEQ ID NO:16(表达HPV E6和E7的腺病毒载体的预测序列)的任何部分或全长(如SEQ ID NO:16的位置1033到1845)具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性。在某些实施例中，核酸序列编码包括经修饰的HPV E6和经修饰的E7抗原的融合蛋白，如与SEQ ID NO:15至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一的核酸序列。
在一些实施例中，HPV抗原包括修饰，所述修饰包括在HPV E6的位置26、98、106(例如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10)或其组合处的氨基酸的取代。在一些实施例中，HPV抗原包括修饰，所述修饰包括在HPV E7的位置86(例如SEQ ID NO:12)处的氨基酸的取代。
在一个方面，提供一种组合物，其包括含有编码HPV E6抗原的序列的重组复制缺陷型病毒载体，其中编码HPV E6抗原的序列与SEQ ID NO:5(具有E6A1表位的HPV16E6)、SEQID NO:18(具有E6A1表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:6(具有E6A3表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:19(具有E6A3表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:7(具有E6A1和E6A3表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:20(具有E6A1和E6A3表位的HPV16E6)具有至少80％序列同一性；或与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4的位置23-496具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，HPV E6抗原包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性的序列。
在一个方面，提供一种组合物，其包括含有编码HPV E7抗原的序列的重组复制缺陷型病毒载体，其中编码HPV E7抗原的序列与SEQ ID NO:11(具有E7A3表位的HPV16E7)或SEQ ID NO:21(具有E7A3表位的HPV16E7)具有至少80％序列同一性；或与SEQ ID NO:2的位置502-795具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，HPV E7抗原包括与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性的序列。
在一个方面，提供一种组合物，其包括含有编码HPV E6/E7的序列的重组复制缺陷型病毒载体，其中编码HPV E6和HPV E7抗原的序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，HPV E6和HPV E7抗原包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性的序列。
靶抗原的额外非限制性实例包含：人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、肿瘤新抗原或肿瘤新表位、叶酸受体α、WT1、brachyury(TIVS7-2，多态性)、brachyury(IVS7T/C多态性)、T brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、EGFR、HER2/neu、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1-c、MUC1-n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、人表皮生长因子受体3(HER3)、α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、CAR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延伸因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖苷转移酶融合蛋白、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1融合蛋白或SYT-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、磷酸丙糖异构酶、BAGE-1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、Gage 3、Gage 4、Gage 5、Gage 6、Gage 7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-Al2、MAGE-C2、粘蛋白、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、gp100/Pmel17、乳腺珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、亲脂素、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、细胞周期素D1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α胎蛋白、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、p53、PBF、PRAME、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、存活素、端粒酶、VEGF或其任何组合。
在一些方面，如本文所用的肿瘤新表位为肿瘤特异性表位，如EQVWGMAVR(SEQ IDNO:100)或CQGPEQVWGMAVREL(SEQ ID NO:101)(FLRT2的R346W突变)、GETVTMPCP(SEQ IDNO:102)或NVGETVTMPCPKVFS(SEQ ID NO:103)(VIPR2的V73M突变)、GLGAQCSEA(SEQ ID NO:104)或NNGLGAQCSEAVTLN(SEQ ID NO:105)(FCRL1的R286C突变)、RKLTTELTI(SEQ ID NO:106)、LGPERRKLTTELTII(SEQ ID NO:107)、或PERRKLTTE(SEQ ID NO:108)(FAT4的S1613L突变)、MDWVWMDTT(SEQ ID NO:109)、AVMDWVWMDTTLSLS(SEQ ID NO:110)、或VWMDTTLSL(SEQID NO:111)(PIEZO2的T2356M突变)、GKTLNPSQT(SEQ ID NO:112)、SWFREGKTLNPSQTS(SEQID NO:113)、或REGKTLNPS(SEQ ID NO:114)(SIGLEC14的A292T突变)、VRNATSYRC(SEQ IDNO:115)、LPNVTVRNATSYRCG(SEQ ID NO:116)、或NVTVRNATS(SEQ ID NO:117)(SIGLEC1的D1143N突变)、FAMAQIPSL(SEQ ID NO:118)、PFAMAQIPSLSLRAV(SEQ ID NO:119)或AQIPSLSLR(SEQ ID NO:120)(SLC4A11的Q678P突变)。
肿瘤相关抗原可为由宿主不正常表达的抗原；其可为由宿主正常表达的分子进行突变、截短、错误折叠或以其它方式异常表现的；其可与正常表达的分子同一但以异常高的水平表达；或其可在异常情况或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是例如蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、其它生物分子或其任何组合。
VI.CEA抗原靶标
本文中所公开的包含组合物，所述组合物包括含有以下的复制缺陷型载体：一个或更多个核酸序列，其编码HPV E6和/或E7抗原；和/或一个或更多个核酸序列，其编码粘蛋白家族抗原，如CEA；和/或一个或更多个核酸序列，其编码Brachyury；和/或一个或更多个核酸序列，其编码MUC1-c，所述核酸序列是在相同或单独复制缺陷型载体中。
CEA表示一种有吸引力的免疫疗法靶抗原，这是由于其几乎在所有结肠直肠癌和胰腺癌中过表达，且也由一些肺癌和乳腺癌以及不常见肿瘤(如甲状腺髓样癌)表达，但除在肠胃上皮中低水平表达以外，不在身体其它细胞中表达。CEA含有可以以MHC限制性方式由T细胞识别的表位。
发现，尽管存在预存或诱发的Ad5中和抗体，但用编码肿瘤抗原CEA的Ad5[E1-、E2b-]-CEA(6D)的多次同源免疫在小鼠中诱发具有抗肿瘤活性的CEA特异性细胞介导的免疫(CMI)反应。在本发明I/II期研究中，患有晚期结肠直肠癌的患者组用递增剂量的Ad5[E1-、E2b-]-CEA(6D)免疫。观测到CEA特异性CMI反应，尽管在大部分(61.3％)患者中存在预存Ad5免疫。重要的是，毒性极小，且不管预存Ad5中和抗体滴度如何，总体患者存活率(在12个月，48％)类似。结果表明，在癌症患者中，新颖Ad5[E1-、E2b-]基因递送平台，在天然获得和免疫诱发的Ad5特异性免疫的情况下，对于肿瘤抗原CEA产生显著CMI反应。
CEA抗原特异性CMI可为例如大于10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000或更多个IFN-γ斑点形成细胞(SFC)/106个外周血液单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，在预先存在的反向(inverse)Ad5中和抗体滴度高于50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、1000、12000、15000或更高的人类个体中，免疫反应升高。免疫反应可包括如本文所描述的细胞介导的免疫和/或体液免疫。免疫反应可通过以下中的一个或更多个来测量：胞内细胞因子染色(ICS)；ELISpot；增殖分析；细胞毒性T细胞分析，包含铬释放或等价分析；和使用任何数量的聚合酶链式反应(PCR)的基因表达分析或基于RT-PCR的分析，如本文所描述的，且在某种程度上，其对于所属领域的技术人员为可用的；以及所属领域中已知用于测量免疫反应的任何其它合适分析。
在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码亚基的经修饰序列，所述亚基与多肽的野生型亚基具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。
免疫原性多肽可以是突变CEA或其片段。在一些实施例中，免疫原性多肽包括在位置610处具有Asn->Asp取代的突变CEA。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码多肽的序列，所述多肽与免疫原性多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。在一些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括SEQ ID NO:22(CEA-CAP1(6D)的核酸序列)或SEQ ID NO:24(突变CAP1(6D)表位的氨基酸序列)的序列。
在一些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的序列；或由SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24通过替代性密码子置换产生的序列。在一些实施例中，相较于野生型人CEA序列，由腺病毒载体编码的免疫原性多肽包括上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个点突变，如单个氨基酸取代或缺失。
在一些实施例中，免疫原性多肽包括来自SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的序列或经修饰的形式，其例如包括SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个点突变，如单个氨基酸取代或缺失。
基于序列相似性、发育表达谱和其生物功能，CEA基因家族的成员细分为三个子组：CEA相关细胞粘附分子(CEACAM)子组，其含有十二个基因(CEACAM1、CEACAM3-CEACAM8、CEACAM16和CEACAM18-CEACAM21)；妊娠特异性糖蛋白(PSG)子组，其含有十一个紧密相关的基因(PSG1-PSG11)；和十一个假基因(CEACAMP1-CEACAMP11)的子组。大部分CEACAM子组成员具有类似结构，其由胞外Ig样结构域(其由单个N端V-set结构域构成，与免疫球蛋白可变结构域具有结构同源性)、随后不同数量的A或B亚型的C2-set结构域、跨膜结构域和细胞质结构域组成。CEACAM子组的两个成员(CEACAM16和CEACAM20)在其结构组织中显示少数例外。CEACAM16在其N端和C端处含有两个Ig样V型结构域，且CEACAM20含有截短的Ig样V型1结构域。CEACAM分子可通过其跨膜结构域(CEACAM5到CEACAM8)锚定于细胞表面，或直接与糖磷脂酰肌醇(GPI)脂质部分(CEACAM5、CEACAM18到CEACAM21)连接。
CEA家族成员在不同细胞类型中表达，且具有广泛范围的生物功能。CEACAM主要发现于大部分上皮细胞上，且存在于不同白细胞上。在人内，CEA家族的祖先成员CEACAM1在上皮和内皮细胞的顶侧上以及在淋巴细胞和骨髓细胞上表达。CEACAM1通过血友病性(CEACAM1到CEACAM1)以及异宗性(例如CEACAM1到CEACAM5)相互作用介导细胞-细胞粘附。另外，CEACAM1参与许多其它生物过程，如血管生成、细胞迁移和免疫功能。CEACAM3和CEACAM4表达很大程度上限于粒细胞，且其能够传递数种细菌病原体(包含奈瑟菌属(Neisseria)、莫拉菌属(Moraxella)和嗜血杆菌属(Haemophilus)物种)的摄取和破坏。
因此，在不同实施例中，组合物和方法涉及升高针对CEA的免疫反应，所述CEA选自CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM16、CEACAM18、CEACAM19、CEACAM20、CEACAM21、PSG1、PSG2、PSG3、PSG4、PSG5、PSG6、PSG7、PSG8、PSG9和PSG11。使用方法和组合物，可升高针对表达或过表达CEA中的一种或更多种的细胞例如癌细胞的免疫反应。在一些实施例中，相较于非癌细胞，这类癌细胞中的一种或更多种CEA的过表达超过5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更多。
在某些实施例中，本文所用的CEA抗原为野生型CEA抗原、或在YLSGANLNL(SEQ IDNO:23)(CEA的CAP1表位)中具有至少一个突变的经修饰的CEA抗原。突变可为保守或非-保守的取代、添加或缺失。在某些实施例中，本文所用的CEA抗原具有YLSGADLNL(SEQ ID NO:24)(突变的CAP1表位)中所阐述的氨基酸序列。在进一步实施例中，第一复制缺陷型载体或表达CEA的复制缺陷型载体具有与SEQ ID NO:25(表达经修饰的CEA抗原的腺病毒载体的预测序列)的任何部分，如SEQ ID NO:25的位置1057到3165或全长SEQ ID NO:25，至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一的核苷酸序列。
VII.粘蛋白家族抗原靶标
本文中所公开的包含组合物，所述组合物包括含有以下的复制缺陷型载体：一个或更多个核酸序列，其编码HPV E6和/或E7抗原；和/或一个或更多个核酸序列，其编码粘蛋白家族抗原，如MUC1；和/或一个或更多个核酸序列，其编码Brachyury；和/或一个或更多个核酸序列，其编码CEA，所述核酸序列是在相同或单独复制缺陷型载体中。
人粘蛋白家族(MUC1到MUC21)包含在身体上皮细胞表面上形成保护性粘液屏障中起作用的分泌性和跨膜粘蛋白。这些蛋白质的作用是保护呼吸道、肠胃道内层的上皮细胞和重要器官(例如乳腺、肝、胃、胰脏和肾)中的衬管(lining duct)。
MUC1(CD227)为在大部分人类癌瘤和数种血液科恶性疾病上过表达的TAA。MUC1(基因库：X80761.1，NCBI：NM_001204285.1)激活已知参与人类疾病的许多重要细胞途径。MUC1为通过两个亚基形成，通常在数种人类癌症中过表达的杂二聚体蛋白质。MUC1进行自体蛋白质溶解，产生两个亚基MUC1n和MUC1c，所述两个亚基又形成稳定的非共价杂二聚体。
MUC1C端亚基(MUC1c)可包括58氨基酸胞外结构域(ED)、28氨基酸跨膜结构域(TM)和72氨基酸细胞质结构域(CD)。MUC1c还可含有可允许MUC1二聚化的“CQC”基序，且其还可赋予细胞致癌功能。在一些情况下，MUC1可部分地通过经由MUC1c诱导细胞信号传导而起致癌作用。MUC1c可与EGFR、ErbB2和其它受体酪氨酸激酶相互作用，且促进PI3K→AKT和MEK→ERK细胞途径的活化。在细胞核中，MUC1c激活Wnt/β-连环蛋白、STAT和NF-κB RelA细胞途径。在一些情况下，MUC1可通过经由MUC1n诱导细胞信号传导赋予致癌功能。MUC1N端亚基(MUC1n)可包括不同数量的可糖基化的20氨基酸串联重复序列。MUC1通常在腺上皮细胞的表面表达，且在癌瘤中过表达和异常糖基化。MUC1为可用作肿瘤免疫疗法的靶标的TAA。数个临床试验已进行和正进行评价MUC1在免疫治疗性疫苗中的用途。重要的是，这些试验指示，用MUC1靶向的免疫疗法是安全的，且可提供存活益处。
然而，临床试验也已显示，MUC1为相对较差的免疫原。为了克服这个问题，本发明人已鉴定MUC1癌蛋白(MUC1-C或MUC1c)的C端区中的T淋巴细胞免疫增强子肽序列。相较于天然肽序列，其经修饰的MUC1-C中的激动剂：(a)在更低肽浓度下结合HLA-A2；(b)表明针对HLA-A2更高的亲合力；(c)当与抗原呈递细胞一起使用时，诱导T细胞产生比利用天然肽更多的IFN-γ；和(d)能够更高效地从癌症患者产生MUC1特异性人类T细胞系。重要的是，对于用天然表位脉冲的靶标的裂解和在表达MUC1的HLA-A2人类肿瘤细胞的裂解中，使用激动剂表位产生的T细胞系比那些使用天然表位产生的T细胞系更高效。此外，本发明人已鉴定MUC1-C的额外CD8+细胞毒性T淋巴细胞免疫增强子激动剂序列表位。
在某些方面，提供了针对免疫增强子能力进行修饰的强效MUC1-C(mMUC1-C或MUC1-C或MUC1c)。本公开提供了针对免疫增强子能力进行修饰的强效MUC1-C，将其并入到重组Ad5[E1-、E2b-]平台中，产生新的和更强效的免疫治疗性疫苗。举例来说，免疫治疗性疫苗可为用于治疗MUC1表达癌症或传染性疾病的Ad5[E1-、E2b-]-mMUC1-C。
翻译后修饰在控制身体和人类疾病中的蛋白质功能中起重要作用。举例来说，除上文所论述的蛋白质裂解以外，MUC1还可在特定氨基酸残基处具有数种翻译后修饰，如糖基化、唾液酸化、棕榈酰化或其组合。本文提供靶向MUC1的糖基化、唾液酸化、磷酸化或棕榈酰化修饰的免疫疗法。
MUC1可高度糖基化(在每个串联重复序列内，丝氨酸和苏氨酸残基上不同程度的N-连接和O-连接碳水化合物和唾液酸，范围为单糖基化到五糖基化)。在乳腺癌中，3,4-连接的GlcNAc进行不同的O-糖基化。N-糖基化由高甘露糖、酸性复合物型和呈分泌性形式MUC1/SEC的杂合聚糖，以及呈跨膜形式MUC1/TM.4的中性复合物型组成。本公开提供靶向MUC1的不同O-糖基化形式的免疫疗法。
此外，MUC1可唾液酸化。来自肾脏和乳腺癌细胞的膜脱落糖蛋白优选地具有唾液酸化的核心1结构，而来自相同组织的分泌性形式主要显示核心2结构。在这两种组织中，O-糖基化内含物是重叠的，其中以末端岩藻糖和半乳糖、2-连接和3-连接的半乳糖、3-连接的和3,6-连接的GalNAc和4-连接的GlcNAc为主。本公开提供靶向MUC1的不同唾液酸化形式的免疫疗法。CQC基序中的半胱氨酸残基上的双棕榈酰化，是从内体再循环回到质膜所需要的。本公开提供靶向MUC1的不同棕榈酰化形式的免疫疗法。
磷酸化可影响MUC1诱导对于人体健康重要的特定细胞信号传导反应的能力。本公开提供靶向MUC1的不同磷酸化形式的免疫疗法。举例来说，MUC1可在C端结构域中的酪氨酸和丝氨酸残基上进行磷酸化。C端结构域中的酪氨酸上的磷酸化可增加MUC1和β-连环蛋白的细胞核定位。通过PKCδ的磷酸化可诱导MUC1与β-连环蛋白/CTNNB1的结合，且降低β-连环蛋白/E-钙粘素复合物的形成。Src介导的MUC1磷酸化可抑制与GSK3B的相互作用。Tyr-1229上Src和EGFR介导的MUC1磷酸化可增加与β-连环蛋白/CTNNB1的结合。Ser-1227上GSK3B介导的MUC1磷酸化可降低这种相互作用，但恢复β-钙粘素/E-钙粘素复合物的形成。PDGFR介导的MUC1磷酸化可增加MUC1CT和CTNNB1的细胞核共定位。本公开提供靶向MUC1、MUC1c和MUC1n的已知调节其细胞信号传导能力的不同磷酸化形式的免疫疗法。
本公开提供调节MUC1c细胞质结构域和其在细胞中的功能的免疫疗法。本公开提供包括调节MUC1c中的CQC基序的免疫疗法。本公开提供包括调节MUC1c的胞外结构域(ED)、跨膜结构域(TM)、细胞质结构域(CD)或其组合的免疫疗法。本公开提供包括调节MUC1c通过EGFR、ErbB2或其它受体酪氨酸激酶诱导细胞信号传导的能力的免疫疗法。本公开提供包括调节MUC1c诱导PI3K→AKT、MEK→ERK、Wnt/β-连环蛋白、STAT、NF-κB RelA细胞途径或其组合的能力的免疫疗法。
在一些实施例中，MUC1c免疫疗法可进一步包括在相同复制缺陷型病毒载体或单独复制缺陷型病毒载体中的HPV E6和/或E7、CEA或Brachyury免疫疗法。
本公开还提供调节MUC1n和其细胞功能的免疫疗法。本公开还提供包括MUC1n的串联重复序列、MUC1n的串联重复序列上的糖基化位点或其组合的免疫疗法。在一些实施例中，MUC1n免疫疗法进一步包括在相同复制缺陷型病毒载体或单独复制缺陷型病毒载体中的HPV E6和/或E7、CEA或Brachyury免疫疗法。
本公开还提供包括MUC1n、MUC1c、HPV E6和/或E7、brachyury、CEA或其组合的疫苗。本公开提供包括MUC1c和HPV E6和/或E7、brachyury、CEA或其组合的疫苗。本公开还提供靶向MUC1n和HPV E6和/或E7、Brachyury、CEA或其组合的疫苗。在一些实施例中，抗原组合含于如本文所提供的一个载体中。在一些实施例中，抗原组合含于如本文所提供的单独载体中。
本发明涉及血清型5的复制缺陷型腺病毒载体，其包括编码免疫原性多肽的序列。免疫原性多肽可为MUC1同种型或其亚基或片段。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码多肽的序列，所述多肽与免疫原性多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。在一些实施例中，相较于野生型人MUC1序列，由本文所描述的腺病毒载体编码的免疫原性多肽包括上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个点突变，如单个氨基酸取代或缺失。
在一些实施例中，本公开的MUC1-c抗原可以是经修饰的MUC1，且可具有与SEQ IDNO:26至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的核苷酸序列。在某些实施例中，本公开的MUC1-c抗原可具有如SEQ ID NO:26中所阐述的核苷酸序列。
在一些实施例中，本公开的MUC1-c抗原可以是经修饰的MUC1，且可具有与SEQ IDNO:27至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开的MUC1-c抗原可具有如SEQ ID NO:27中所阐述的氨基酸序列。
VIII.Brachyury抗原靶标
本文中所公开的包含组合物，所述组合物包括含有以下的复制缺陷型载体：一个或更多个核酸序列，其编码HPV E6和/或E7抗原；和/或一个或更多个核酸序列，其编码粘蛋白家族抗原，如MUC1；和/或一个或更多个核酸序列，其编码Brachyury；和/或一个或更多个核酸序列，其编码CEA，所述核酸序列是在相同或单独复制缺陷型载体中。
本公开提供包括针对Brachyury的一个或更多个抗原的免疫疗法。Brachyury(也称为人中的“T”蛋白)为转录因子T-盒家族的成员，其在早期发育期间，主要在正常中胚层的形成和分化中起关键作用，且表征为高度保守的DNA结合结构域，称为T-结构域。上皮到间充质转换(EMT)为在原发性肿瘤进展为转移性状态期间的关键步骤，其中Brachyury起关键作用。Brachyury在人类癌瘤细胞中的表达诱导EMT的特征变化，包含间充质标记上调、上皮标记下调和细胞迁移与侵袭增加。相反，Brachyury的抑制引起间充质标记下调、和细胞迁移与侵袭减少(loss)，以及人类肿瘤细胞形成癌转移的能力减弱。Brachyury可用以介导上皮细胞-间充质转换，且促进侵袭。
本公开还提供调节Brachyury对于细胞增殖疾病(如癌症)中的上皮-间充质转换功能的影响的免疫疗法。本公开还提供调节Brachyury促进细胞增殖疾病(如癌症)中的侵袭的能力的免疫疗法。本公开还提供调节Brachyury的T-盒结构域的DNA结合功能的免疫疗法。在一些实施例中，Brachyury免疫疗法可进一步包括针对HPV E6和/或E7、CEA、或MUC1、MUC1c或MUC1n的一种或更多种抗原。
Brachyury表达在大部分正常人类组织中几乎是不可检测的，且高度限于人类肿瘤并通常过表达，使得其为有吸引力的免疫疗法的靶抗原。在人中，Brachyury由T基因(基因库：AJ001699.1，NCBI：NM_003181.3)编码。在人中，发现至少有两种通过可变剪接产生的不同同种型。每种同种型具有多种天然变体。
Brachyury为免疫原性的，且体外扩增的Brachyury特异性CD8+T细胞可将Brachyury表达肿瘤细胞裂解。这些Brachyury特征使得其为有吸引力的用于免疫疗法的肿瘤相关抗原(TAA)。Brachyury蛋白为T-盒转录因子。其可通过其N端中称为T-盒的区，与特定DNA元件(近回文序列“TCACACCT”)结合，以当与这种位点结合时激活基因转录。
本公开还提供包括Brachyury、HPV E6和/或E7、MUC1、CEA或其组合的疫苗。在一些实施例中，抗原组合含于如本文所提供的一个载体中。在一些实施例中，抗原组合含于如本文所提供的单独载体中。
在特定实施例中，本发明涉及血清型5的复制缺陷型腺病毒载体，其包括编码免疫原性多肽的序列。免疫原性多肽可为Brachyury同种型或其亚基或片段。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码多肽的序列，所述多肽与免疫原性多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。在一些实施例中，相较于野生型人类Brachyury序列，由本文所描述的腺病毒载体编码的免疫原性多肽包括上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40个或更多点突变，如单个氨基酸取代或缺失。
在一些实施例中，本公开的Brachyury抗原可具有与SEQ ID NO:28至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开的Brachyury抗原可具有如SEQ ID NO:28中所阐述的氨基酸序列。
IX.组合疗法
某些实施例提供用于治疗和预防癌症和传染性疾病的组合免疫疗法和疫苗组合物。一些实施例提供用于增强针对复杂疾病(如传染性疾病和癌症)的治疗性反应的组合多靶向疫苗、免疫疗法和方法。组合疗法的各种组分可独立地包含于用于预防HPV感染或HPV相关疾病的免疫疗法的疫苗组合物中。
“治疗”可以指向个体施用治疗有效剂量的本公开疫苗。可以以药物组合物形式向个体施用治疗。个体在治疗时可罹患疾病病状，且在此情况下，治疗可称为治疗性疫苗接种。个体在治疗时还可为健康和无疾病的，且在此情况下，治疗可称为预防性疫苗接种。
“个体”是指任何动物，包含但不限于人、非人灵长类动物(例如恒河猴或其它类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和家禽。“个体”在本文中可与“对象”或“患者”互换使用。
在一些实施例中，本文所描述的任何疫苗(例如Ad5[E1-、E2b-]-E6；Ad5[E1-、E2b-]-E7；或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7)可与低剂量化疗或低剂量放疗组合。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的任何疫苗(例如Ad5[E1-、E2b-]-E6；Ad5[E1-、E2b-]-E7；或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7)可与化疗组合，使得所施用的化疗剂量低于临床护理标准。在一些实施例中，化疗可为环磷酰胺。环磷酰胺可以以低于临床护理给药标准的剂量施用。举例来说，化疗可在每2周的第1-5天和第8-12天，以50mg，一日两次(BID)施用，总共8周。在一些实施例中，本文所描述的任何疫苗(例如Ad5[E1-、E2b-]-E6；Ad5[E1-、E2b-]-E7；或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7)可与放疗组合，使得所施用的放疗剂量低于临床护理标准。举例来说，在一些实施例中，在8Gy下的并行立体定向身体放疗(SBRT)可在第8、22、36、50天给予(每2周，4次剂量)。可使用SBRT向所有可行的肿瘤位点施用放疗。
在一些方面，本文提供的组合免疫疗法和疫苗可包括多靶向免疫治疗性方法，所述方法针对与发展癌症相关联的抗原(如肿瘤相关抗原(TAA))或已知参与特定传染性疾病的抗原(如传染性疾病相关抗原(IDAA))。在一些方面，本文提供的组合免疫疗法和疫苗可包括多靶向抗原标志免疫治疗性方法，所述方法针对与发展癌症或传染性疾病相关联的抗原。在不同实施例中，所述组合物和方法提供用于免疫疾病的基于病毒的载体，所述载体表达HPV E6和/或HPV E7的变体，如本文所提供的。这些载体可升高针对HPV E6和/或HPV E7的免疫反应。
在一些方面，载体包括至少一种抗原。在一些方面，载体包括至少两种抗原。在一些方面，疫苗制剂包括1:1比率的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:2比率的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:3比率的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:4比率的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:5比率的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:6比率的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:7比率的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:8比率的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:9比率的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:10比率的载体与抗原。
在一些方面，疫苗为组合疫苗，其中疫苗包括至少两种载体，各自含有至少单种抗原。
当不同抗原的混合物同时施用或在个体中从相同或不同载体表达时，其可彼此竞争。因此，对在组合免疫疗法或疫苗中包括不同浓度和比率的所表达抗原的制剂必须进行评价且对于个体或个体组进行调适，以确保在施用之后发生有效和持久的免疫反应。
包括多种抗原的组合物可以以各种比率存在。举例来说，具有多于一种载体的制剂可具有各种比率。举例来说，免疫疗法或疫苗可具有呈以下化学计量的两种不同载体：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、2:1、2:3、2:4、2:5、2:6、2:7、2:8、3:1、3:3、3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、3:1、3:3、3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、4:1、4:3、4:5、4:6、4:7、4:8、5:1、5:3、5:4、5:6、5:7、5:8、6:1、6:3、6:4、6:5、6:7、6:8、7:1、7:3、7:4、7:5、7:6、7:8、8:1、8:3、8:4、8:5、8:6或8:7。
某些实施例提供组合免疫疗法，其包括针对TAA的多靶向免疫治疗剂。某些实施例提供组合免疫疗法，其包括针对于IDAA的多靶向免疫治疗剂。
在一些实施例中，重组核酸载体中的至少一种为复制缺陷型腺病毒载体，其包括含有第一同一性值的复制缺陷型腺病毒5载体。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括E2b区中的缺失。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体进一步包括E1区中的缺失。在一些实施例中，第一同一性值为至少90％。在一些实施例中，第一同一性值为至少95％。在一些实施例中，第一同一性值为至少99％。在一些实施例中，第一同一性值为100％。在一些实施例中，第一同一性值为至少90％。在一些实施例中，第一同一性值为至少95％。在一些实施例中，第一同一性值为至少99％。在一些实施例中，第一同一性值为100％。在一些实施例中，第一同一性值为至少90％。在一些实施例中，第一同一性值为至少95％。在一些实施例中，第一同一性值为至少99％。在一些实施例中，第一同一性值为100％。
在某些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的HPV表达癌症的方法，所述方法包括：向个体施用药物组合物，所述药物组合物包括含有编码HPV抗原或任何合适抗原的核酸序列的复制缺陷型载体；以及向个体施用免疫检查点抑制剂。方法可进一步包括向个体施用放疗、化疗或其组合。
A.免疫途径检查点调节剂
在一些实施例中，组合疗法包含与一种或更多种免疫检查点调节剂(如免疫检查点抑制剂)一起施用的组合物。在一些实施例中，组合物包括复制缺陷型载体，所述载体包括编码靶抗原(如HPV E6、HPV E7或其组合)的核苷酸序列。
活化与抑制信号之间的平衡调节T淋巴细胞与疾病细胞之间的相互作用，其中T细胞反应通过由T细胞受体(TCR)抗原识别来起始。抑制性途径和信号被称作免疫检查点。在正常情况下，免疫检查点在控制和预防自身免疫性中起关键作用，并且也响应于病原性感染保护免于组织损伤。
在某一方面，提供组合免疫疗法，其包括基于病毒载体的疫苗和组合物，其用于调节免疫检查点抑制途径以治疗癌症和传染性疾病。在一些实施例中，调节是增加基因或蛋白质的表达或活性。在一些实施例中，调节是降低基因或蛋白质的表达或活性。在一些实施例中，调节影响一个基因或蛋白质家族。
一般来说，免疫抑制途径通过配体-受体相互作用来起始。现在清楚，在疾病中，疾病可选择(co-opt)免疫检查点途径为诱导个体中的免疫抗性的机制。
通过既定疾病诱导个体中的免疫抗性或免疫抑制途径可通过如以下的分子组合物来阻断：siRNA；反义物；小分子；模拟物；配体、受体或蛋白质的重组形式；或已知调节免疫抑制途径中的一个或更多个的抗体(其可为Ig融合蛋白)；或其组合。举例来说，用免疫检查点蛋白，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的阻断剂的初始临床发现已显示增强抗肿瘤免疫的前景。
因为病变细胞可表达多种抑制性配体，且疾病浸润淋巴细胞表达多种抑制性受体，所以免疫检查点蛋白的双重或三重阻断可增强抗疾病免疫。如本文所提供的组合免疫疗法可包括以下免疫检查点蛋白或其片段的一种或更多种分子组合物：PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3(也称为CD276)、B7-H4(也称为B7-S1、B7x和VCTN1)、BTLA(也称为CD272)、HVEM、KIR、TCR、LAG3(也称为CD223)、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3(也称为HAVcr2)、GAL9、A2aR、ADORA CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA和CD244。
在一些实施例中，免疫途径检查点调节剂激活或增强免疫反应。在一些实施例中，免疫途径检查点调节剂抑制免疫反应抑制剂。在一些实施例中，免疫途径检查点抑制免疫反应。
在一些实施例中，分子组合物包括siRNA。在一些实施例中，分子组合物包括小分子。在一些实施例中，分子组合物包括配体的重组形式。在一些实施例中，分子组合物包括受体的重组形式。在一些实施例中，分子组合物包括抗体。在一些实施例中，组合疗法包括多于一种分子组合物和/或多于一种类型的分子组合物。如所属领域的技术人员应了解，在某些方面，也设想应涵盖将来发现的免疫检查点抑制途径的蛋白质。
在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节CTLA4的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节PD-1的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节PDL1的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节LAG3的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节B7-H3的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节B7-H4的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节TIM3的分子组合物。在一些实施例中，免疫途径检查点调节剂为针对于以下的单克隆或多克隆抗体：PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3(即，HAVcr2)、GAL9和A2aR。在一些实施例中，调节是增加或增强表达。在其它实施例中，调节是降低表达或使表达不存在。
两种例示性免疫检查点抑制剂包含细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白质-1(PD-1)。CTLA-4可仅在T细胞上表达，其中其调节T细胞活化的早期阶段。CTLA-4与共刺激T细胞受体CD28相互作用，这可引起抑制T细胞活性的信号传导。一旦发生TCR抗原识别，那么CD28信号传导可增强TCR信号传导，在一些情况下引起T细胞活化，且CTLA-4抑制CD28的信号传导活性。某些实施例提供如本文所提供的免疫疗法与抗-CTLA-4单克隆抗体组合，以用于治疗增殖性疾病和癌症。某些实施例提供如本文所提供的免疫疗法与CTLA-4分子组合物组合，以用于治疗增殖性疾病和癌症。
程序性死亡细胞蛋白质配体-1(PDL1)为B7家族的成员，且分布于各种组织和细胞类型中。PDL1可与PD-1相互作用，抑制T细胞活化和CTL介导的裂解。PDL1的显著表达已在各种人类肿瘤上证实，且PDL1表达为肿瘤避开宿主抗肿瘤免疫反应的一种关键机制。程序性死亡配体1(PDL1)和程序性细胞死亡蛋白质-1(PD-1)作为免疫检查点相互作用。这种相互作用可能是造成抗肿瘤免疫反应钝化且随后肿瘤进展的主要耐受性机制。PD-1存在于活化的T细胞上，且PDL1(PD-1的初级配体)通常在肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APC)以及其它细胞(包含B细胞)上表达。PDL1的显著表达已在各种人类肿瘤(包含HPV相关头颈癌)上证实。PDL1与T细胞上的PD-1相互作用，抑制T细胞活化和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的裂解。某些实施例提供如本文所提供的免疫疗法与抗PD-1或抗PDL1单克隆抗体组合，用于治疗增殖性疾病和癌症。某些实施例提供如本文所提供的免疫疗法与抗PD-1抗体或抗PDL1分子组合物组合，用于治疗增殖性疾病和癌症。某些实施例提供如本文所提供的免疫疗法与抗CTLA-4单克隆抗体和抗PD-1单克隆抗体组合，用于治疗增殖性疾病和癌症。某些实施例提供如本文所提供的免疫疗法与抗CTLA-4单克隆抗体和PDL1单克隆抗体组合，用于治疗增殖性疾病和癌症。某些实施例提供如本文所提供的免疫疗法与抗CTLA-4单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体或抗PDL1单克隆抗体或其组合进行组合，用于治疗增殖性疾病和癌症。
某些实施例提供如本文所提供的免疫疗法与临床研发用于癌症治疗的针对PDL1/PD-1途径的数种抗体组合。在某些实施例中，可使用抗PDL1抗体。相较于靶向T细胞的抗PD-1抗体，预期靶向肿瘤细胞的抗PDL1抗体具有较少副作用，包含较低风险的自身免疫相关的安全性问题，因为PDL1阻断使得PDL2/PD-1途径完整，促进外周自身耐受性。
为这个目的，已制备出阿维鲁单抗(avelumab)——一种完全的人IgG1抗PDL1抗体(药物代码MSB0010718C)。阿维鲁单抗与PDL1选择性结合，且竞争性地阻断其与PD-1的相互作用。
阿维鲁单抗还与鼠类PDL1具有交叉反应性，因此允许在正常实验室小鼠中进行体内药理学研究。然而，由于针对完全人阿维鲁单抗分子的免疫原性，给药方案限于在一周内给予三次剂量。
阿维鲁单抗的关键临床前药理学发现在下文概述。阿维鲁单抗显示响应于抗原特异性和抗原非特异性刺激，体外的初级T细胞活化的功能性增强；以及作为单药疗法，显著抑制体内肿瘤生长(表达PDL1的MC38结肠癌)。阿维鲁单抗的体内功效由CD8+T细胞驱动，如通过当全身性地耗尽这种细胞类型时抗肿瘤活性完全消失所证明的。其与局部分次放疗组合引起所建立的肿瘤完全消退，以及产生抗肿瘤免疫记忆。表明其体外针对人类肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；此外，体内ADCC缺陷环境的研究支持ADCC对于抗肿瘤功效的作用。阿维鲁单抗的额外发现包含：体外未观测到补体依赖性细胞毒性。对临床具有平移的相关性(translational relevance)的免疫监测分析进一步支持免疫作用机制：CD8+PD-1+T细胞和CD8+效应记忆T细胞的一致增加，如由荧光活化细胞分选仪(FACS)所测量的；增强的肿瘤-抗原特异性CD8+T细胞反应，如由五聚体染色和酶联免疫吸附斑点(ELISPOT)分析所测量的。
尽管报告指示在结肠直肠癌中使用干扰PD-1-PDL1结合的试剂，抗肿瘤放射反应是不太可能的，但此处已报告存在放射反应。此外，在多次临床试验中，已表明指示以下的相关性：肿瘤组织上的PDL1表达水平预测放射反应的可能性。然而，已变得清楚的是，PDL1表达(如目前所测量)不是抗肿瘤功效的决定性要求。已经注意到，结肠直肠肿瘤相较于更可能响应于PD-1-PDL1阻断的其它肿瘤很少表达PDL1。然而，众所周知，强力的抗肿瘤T细胞应答(产生IFN-γ)将诱导PDL1表达。
在一些实施例中，在不受理论束缚的情况下，考虑潜在(underlying)免疫反应对于PD-1-PDL1阻断以具有抗肿瘤效果是必需的。在不受理论束缚的情况下，进一步考虑免疫检查点抑制剂与标准疗法和腺病毒载体组合物(如Ad5-E6/E7免疫)的这种组合可能能够诱导PDL1表达，且从而增加PD-1-PDL1阻断的抗肿瘤活性。
在一些实施例中，采用选择性地结合PDL1的其它抗体，如帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、匹立珠单抗(pidilizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、BMS-936559、MPDL3280A和MEDI4736。
一些实施例提供与可增加抗肿瘤效果的PD-1阻断组合的Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫。通过Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗诱导的CMI反应可表征为显示抗肿瘤反应的动力学以评价治疗所建立的小肿瘤与大肿瘤的治疗可能。一些实施例提供与可增加抗肿瘤效果的PD-1阻断组合的Ad5[E1-、E2b-]-E6免疫。通过Ad5[E1-、E2b-]-E6疫苗诱导的CMI反应可表征为显示抗肿瘤反应的动力学以评价治疗所建立的小肿瘤与大肿瘤的治疗可能。一些实施例提供与可增加抗肿瘤效果的PD-1阻断组合的Ad5[E1-、E2b-]-E7免疫。通过Ad5[E1-、E2b-]-E7疫苗诱导的CMI反应可表征为显示抗肿瘤反应的动力学以评价治疗所建立的小肿瘤与大肿瘤的治疗可能。
免疫检查点分子可由T细胞表达。免疫检查点分子可有效地用作下调或抑制免疫反应的“制动器”。免疫检查点分子包含但不限于：程序性死亡1(PD-1，也称为PDCD1或CD279，登录号：NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，基因库登录号AF414120.1)、LAG3(也称为CD223，登录号：NM_002286.5)、Tim3(也称为HAVCR2，基因库登录号：JX049979.1)、BTLA(也称为CD272，登录号：NM_181780.3)、BY55(也称为CD160，基因库登录号：CR541888.1)、TIGIT(也称为IVSTM3，登录号：NM_173799)、LAIR1(也称为CD305，基因库登录号：CR542051.1)、SIGLECIO(基因库登录号：AY358337.1)、2B4(也称为CD244，登录号：NM_001166664.1)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIFl、ILIORA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3，所述分子直接抑制免疫细胞。举例来说，PD-1可与腺病毒疫苗组合，以治疗有需要的个体。在非穷尽性的情况下，表1显示可经失活以提高腺病毒疫苗的功效的例示性免疫检查点基因。免疫检查点基因可选自：表1中列出的这类基因；和参与以下的其它基因：共抑制性受体功能、细胞死亡、细胞因子信号传导、精氨酸色氨酸不足、TCR信号传导、诱导性T-reg抑制、控制耗尽或失能的转录因子和低氧介导的耐受性。
表1-例示性免疫检查点基因
相较于任一单独试剂，腺病毒类疫苗和免疫途径检查点调节剂的组合可引起所治疗个体的癌症复发降低。在又一实施例中，相较于任一单独试剂，腺病毒类疫苗和免疫途径检查点调节剂的组合可引起所治疗个体中癌转移或微癌转移的存在或出现降低。在另一实施例中，相较于任一单独试剂，腺病毒类疫苗和免疫途径检查点调节剂的组合可引起所治疗个体的总存活率提高。在一些情况下，相较于任一单独试剂，腺病毒疫苗和免疫途径检查点调节剂的组合可增加个体中肿瘤特异性T细胞反应的频率或强度。
一些实施例还公开免疫检查点抑用于提高腺病毒载体类疫苗的性能的用途。可在施用疫苗时施用免疫检查点抑制。免疫检查点抑制也可在疫苗之后施用。可在腺病毒疫苗施用同时进行免疫检查点抑制。可在疫苗接种之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或60分钟进行免疫检查点抑制。也可在疫苗接种之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时进行免疫检查点抑制。在一些情况下，可在疫苗接种之后1、2、3、4、5、6或7天进行免疫抑制。免疫检查点抑制可在疫苗接种之前或之后的任何时间进行。
在另一方面，提供一种疫苗，其包括抗原和免疫途径检查点调节剂。一些实施例涉及用于治疗患有如此病状的个体的方法，所述个体将从免疫检查点(例如PD-1)和所述个体的细胞上的其天然结合配偶体(一种或多种)的下调获益。
免疫途径检查点调节剂可与包括编码任何抗原的核苷酸序列的腺病毒疫苗组合。举例来说，抗原可为HPV E6和/或HPV E7。免疫途径检查点调节剂可在与疫苗组合时产生协同效应。免疫途径检查点调节剂也可在与疫苗组合时产生相加效应。
在特定实施例中，检查点免疫抑制剂可与包括编码任何抗原的核苷酸序列的载体组合，任选地与化疗或任何其它癌症护理或疗法(如VEGF抑制剂、血管生成抑制剂、放疗、其它免疫疗法或任何合适的癌症护理或疗法)组合。
B.自然杀伤(NK)细胞
在某些实施例中，可提供天然或工程改造的NK细胞，以结合如本文所描述的腺病毒载体类组合物或免疫疗法，向有需要的个体施用。
免疫系统是多种多样的免疫细胞家族的集合(tapestry)，所述免疫细胞其自身各自在保护免于感染和疾病中具有不同作用。在这些免疫细胞中，自然杀伤或NK细胞作为身体的第一道防线。NK细胞具有在无先前暴露或由其它支持分子活化的情况下，快速搜寻和破坏异常细胞(如癌症或受病毒感染细胞)的先天能力。与适应性免疫细胞(如T细胞)相比，NK细胞已在1期临床试验中用作基于细胞的“现成”治疗，且已证实对于癌症的肿瘤杀伤能力。
1.aNK细胞
除天然NK细胞以外，可向不表达杀伤抑制受体(KIR)的个体施用NK细胞，病变细胞通常采用所述杀伤抑制受体以避开NK细胞的杀伤功能。这种独特活化的NK细胞或aNK细胞缺乏这些抑制受体同时保留大量的能够选择性靶向和杀伤病变细胞的活化受体。aNK细胞还携载较大有效负载的含有颗粒酶和穿孔素的颗粒，从而使得其能够将较高有效负载的致死酶递送到多个靶标。
2.taNK细胞
嵌合抗原受体(CAR)技术是目前研发的最新颖癌症疗法之一。CAR为如此蛋白质，其允许免疫效应细胞靶向呈现特异性表面抗原的癌细胞(靶向活化的自然杀伤细胞)，其为其中aNK细胞经工程改造具有癌症上发现的靶蛋白的一种或更多种CAR的平台，且随后与广泛的CAR整合在一起。这种策略相较于使用个体或供体来源的效应细胞(如自身T细胞)的其它CAR方法具有多种优势，尤其在可扩展性、质量控制和一致性方面。
许多癌细胞杀伤依赖于ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)，于是效应免疫细胞附着于抗体，所述抗体又与靶癌细胞结合，从而促进效应细胞对癌症的杀伤。NK细胞为身体中ADCC的关键效应细胞，且使用专门的受体(CD16)来结合抗体。
3.haNK细胞
研究已显示，可能仅20％的人群均一地表达CD16的“高亲和力”变体(haNK细胞)，相较于具有“低亲和力”CD16的患者所述人群与更良好的治疗结果强烈相关联。此外，许多癌症患者具有由于化疗、疾病自身或其它因素而严重弱化的免疫系统。
在某些方面，NK细胞经修饰以表达高亲和力CD16(haNK细胞)。因此，haNK细胞可加强针对癌细胞的广泛抗体的治疗功效，且可与本文所描述的免疫疗法或载体组合使用。
C.共刺激分子
除使用含有HPV抗原的重组腺病毒类载体疫苗以外，还可将共刺激分子并入到所述疫苗中，这将增加免疫原性。
免疫反应的起始需要至少两个信号来由APC活化初始T细胞(Damle等人J Immunol148:1985-92(1992)；Guinan等人Blood 84:3261-82(1994)；Hellstrom等人CancerChemother Pharmacol 38:S40-44(1996)；Hodge等人Cancer Res 39:5800-07(1999))。抗原特异性第一信号通过肽/主要组织相容性复合物(MHC)被递送穿过T细胞受体(TCR)，且使得T细胞进入细胞周期。可递送第二或共刺激信号，以用于细胞因子产生和增殖。
已报告在专职抗原呈递细胞(APC)表面上正常发现的至少三种不同分子能够提供对T细胞活化关键的第二信号：B7-1(CD80)、ICAM-1(CD54)和LFA-3(人CD58)(Damle等人JImmunol 148:1985-92(1992)；Guinan等人Blood 84:3261-82(1994)；Wingren等人CritRev Immunol 15:235-53(1995)；Parra等人Scand.J Immunol 38:508-14(1993)；Hellstrom等人Ann NY Acad Sci 690:225-30(1993)；Parra等人J Immunol 158:637-42(1997)；Sperling等人J Immunol 157:3909-17(1996)；Dubey等人J Immunol 155:45-57(1995)；Cavallo等人Eur J Immunol 25:1154-62(1995))。
这些共刺激分子具有不同的T细胞配体。B7-1与CD28和CTLA-4分子相互作用，ICAM-1与CD11a/CD18(LFA-1/β-2整合素)复合物相互作用，且LFA-3与CD2(LFA-2)分子相互作用。因此，在某一实施例中，期望的是，具有分别含有B7-1、ICAM-1和LFA-3的重组腺病毒载体，当与含有编码靶抗原(如HPV抗原)的一种或更多种核酸的重组腺病毒类载体疫苗组合时，将进一步增加/增强针对于特定靶抗原的抗肿瘤免疫反应。
X.免疫融合配偶体抗原靶标
本文所描述的病毒载体或组合物可进一步包括编码蛋白质或“免疫融合配偶体”的核酸序列，所述蛋白质或“免疫融合配偶体”可增加靶抗原(如HPV E6和/或E7抗原)或本文中所公开的任何靶抗原的免疫原性。在这点上，在用含有这种蛋白质的病毒载体免疫后产生的蛋白质可以是融合蛋白，所述融合蛋白包括与增加所关注靶抗原的免疫原性的蛋白质融合的所关注靶抗原。此外，用编码HPV E6和/或E7抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起免疫反应增强，使得相较于编码单独HPV E6和/或E7抗原的Ad5[E1-、E2b-]载体或单独免疫融合配偶体，两种治疗部分的组合协同作用以增强免疫反应。举例来说，用编码HPV E6和/或E7抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起以下的协同增强：抗原特异性效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤受感染细胞的NK细胞反应的刺激、通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)针对杀伤受感染细胞的嗜中性粒细胞或单核细胞反应的刺激、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制或其任何组合。这种协同增强可极大地提高在施用至有需要的个体之后的存活率结果。在某些实施例中，用编码HPV E6和/或E7抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法，可引起产生免疫反应，包括相较于对照，施用腺病毒载体的个体中的靶抗原特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于对照，施用编码HPV E6和/或E7抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的个体中的靶特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在进一步实施例中，产生免疫反应，其包括相较于对照，靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加约1.5到20倍或更多倍，如由测量细胞因子分泌的ELISpot分析所测量的，所述细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其它细胞因子。在进一步实施例中，产生免疫反应包括相较于适当对照，施用如本文所描述的编码HPV E6和/或E7抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的个体中的靶特异性抗体产生增加1.5到5倍之间。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于对照，施用腺病毒载体的个体中的靶特异性抗体产生增加约1.5到20倍或更多倍。
作为额外实例，用编码靶表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起以下的协同增强：抗原特异性效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤受感染细胞的NK细胞反应的刺激、通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)针对杀伤受感染细胞的嗜中性粒细胞或单核细胞反应的刺激、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制或其任何组合。这种协同增强可极大地提高在施用至有需要的个体之后的存活率结果。在某些实施例中，用编码靶表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起产生免疫反应，包括相较于对照，施用腺病毒载体的个体中的靶抗原特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于对照，施用编码靶表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的个体中的靶特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在进一步实施例中，产生免疫反应，其包括相较于对照，靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加约1.5到20倍或更多倍，如由测量细胞因子分泌的ELISpot分析所测量的，所述细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其它细胞因子。在进一步实施例中，产生免疫反应包括相较于适当对照，施用如本文所描述的腺病毒载体的个体中的靶特异性抗体产生增加1.5到5倍之间。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于对照，施用腺病毒载体的个体中的靶特异性抗体产生增加约1.5到20倍或更多倍。
在一个实施例中，这种免疫融合配偶体来源于分枝杆菌属某种，如结核分枝杆菌来源的Ra12片段。来源于分枝杆菌属某种的免疫融合配偶体可为在SEQ ID NO:29-SEQ IDNO:37中所阐述的序列中的任一者。增强异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的Ra12组合物和其使用方法描述于美国专利第7,009,042号中，所述文献以全文通过引用并入本文中。简单来说，Ra12是指呈结核分枝杆菌MTB32A核酸的子序列的多核苷酸区。MTB32A为由毒性和无毒结核分枝杆菌菌株中的基因编码的32kDa丝氨酸蛋白酶。MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列已有描述(参见例如美国专利第7,009,042号；Skeiky等人,Infectionand Immun.67:3998-4007(1999)，其以全文通过引用并入本文中)。MTB32A编码序列的C端片段可以以高水平表达，且在整个纯化过程中保持为可溶多肽。此外，Ra12可增强与其融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。Ra12融合多肽可包括对应于MTB32A的氨基酸残基192到323的14kDa C端片段。其它Ra12多核苷酸一般可包括编码Ra12多肽的一部分的至少约15、30、60、100、200、300或更多个核苷酸。Ra12多核苷酸可包括天然序列(即，编码Ra12多肽或其部分的内源性序列)或可包括这种序列的变体。Ra12多核苷酸变体可含有一个或更多个取代、添加、缺失和/或插入，使得所编码融合多肽的生物活性相对于包括天然Ra12多肽的融合多肽基本上不减弱。变体与编码天然Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列可具有至少约70％、80％或90％同一性或更多。
在某些方面，免疫融合配偶体可衍生于蛋白质D——一种革兰氏阴性细菌B型流感嗜血杆菌的表面蛋白。衍生于蛋白质D的免疫融合配偶体可为SEQ ID NO:38中所阐述的序列。在一些情况下，蛋白质D衍生物包括大致前三分之一的蛋白质(例如前N端100-110氨基酸)。蛋白质D衍生物可经脂化。在某些实施例内，脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包含于N端上，提供具有额外外源性T细胞表位的多肽，其可增加在大肠杆菌中的表达水平，且可用作表达增强剂。脂质尾可确保将抗原最优呈递到抗原呈递细胞。其它融合配偶体可包含来自流感病毒的非-结构蛋白质NS1(血凝素)。通常地，使用N端81个氨基酸，尽管可使用包含T-辅助表位的不同片段。
在某些方面，免疫融合配偶体可为称为LYTA的蛋白质或其部分(特别是C端部分)。衍生于LYTA的免疫融合配偶体可为SEQ ID NO:39中所阐述的序列。LYTA来源于肺炎链球菌，所述肺炎链球菌合成称为酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码)。LYTA为特异性降解肽聚糖主链中的某些键的自溶素。LYTA蛋白的C端结构域负责对于胆碱或对于一些胆碱类似物(如DEAE)的亲和力。已采用这种特性来研发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。可采用在氨基端处含有C-LYTA片段的杂交蛋白质的纯化。在另一实施例内，可以将LYTA的重复部分并入到融合多肽中。重复部分可例如发现于C端区中在残基178处开始。一个特定重复部分并入残基188-305。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，包括选自以下的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。靶抗原融合物可产生与以下中的一种或更多种具有基本上同一性的蛋白质：IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。靶抗原融合物可编码核酸，所述核酸编码与以下中的一种或更多种具有基本上同一性的蛋白质：IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。在一些实施例中，靶抗原融合物进一步包括一种或更多种免疫融合配偶体，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，其包括选自以下的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。IFN-γ的序列可为但不限于SEQ ID NO:40中所阐述的序列。TNFα的序列可为但不限于SEQ ID NO:41中所阐述的序列。IL-2的序列可为但不限于SEQ ID NO:42中所阐述的序列。IL-8的序列可为但不限于SEQ ID NO:43中所阐述的序列。IL-12的序列可为但不限于SEQ ID NO:44中所阐述的序列。IL-18的序列可为但不限于SEQ ID NO:45中所阐述的序列。IL-7的序列可为但不限于SEQ ID NO:46中所阐述的序列。IL-3的序列可为但不限于SEQID NO:47中所阐述的序列。IL-4的序列可为但不限于SEQ ID NO:48中所阐述的序列。IL-5的序列可为但不限于SEQ ID NO:49中所阐述的序列。IL-6的序列可为但不限于SEQ ID NO:50中所阐述的序列。IL-9的序列可为但不限于SEQ ID NO:51中所阐述的序列。IL-10的序列可为但不限于SEQ ID NO:52中所阐述的序列。IL-13的序列可为但不限于SEQ ID NO:53中所阐述的序列。IL-15的序列可为但不限于SEQ ID NO:54中所阐述的序列。IL-16的序列可为但不限于SEQ ID NO:81中所阐述的序列。IL-17的序列可为但不限于SEQ ID NO:82中所阐述的序列。IL-23的序列可为但不限于SEQ ID NO:83中所阐述的序列。IL-32的序列可为但不限于SEQ ID NO:84中所阐述的序列。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，包括选自以下的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体一起在细胞中共表达，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，包括选自以下的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体包括CpG ODN(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:55中)、霍乱毒素(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:56中)、来源于细菌ADP核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:57中)、来源于细菌ADP核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:58中)、Hp91(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:59中)、CCL20(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:60中)、CCL3(非限制性实例序列显示于SEQ IDNO:61中)、GM-CSF(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:62中)、G-CSF(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:63中)、LPS肽模拟物(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:64-SEQ IDNO:75中)、志贺毒素(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:76中)、白喉毒素(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:77中)或CRM197(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:80中)。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体包括IL-15超激动剂。白介素15(IL-15)为在病毒感染之后分泌的天然存在的炎性细胞因子。分泌性IL-15可通过效应免疫细胞上的其同源受体信号传导来执行其功能，且因此可使得效应免疫细胞活性总体增强。
基于IL-15刺激和维持细胞免疫反应的广泛能力，认为其为可能治愈某些癌症的有前景的免疫治疗药物。然而，IL-15临床研发的主要限制可包含：在标准哺乳动物细胞表达系统中的低生产率和短血清半衰期。此外，包括由相同细胞共表达的蛋白质的IL-15:IL-15Rα复合物，而不是游离IL-15细胞因子，可负责刺激携带IL-15βγc受体的免疫效应细胞。
为了处理这些缺点，鉴定出具有增大的结合IL-15Rβγc的能力和增强的生物活性的新颖IL-15超激动剂突变(IL-15N72D)。向等摩尔浓度的IL-15N72D中添加小鼠或人IL-15Rα与Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区)可提供IL-15生物活性的进一步增加，使得IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物呈现对于支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)比游离IL-15细胞因子的低10倍以上。
在一些实施例中，IL-15超激动剂可以是新颖IL-15超激动剂突变(IL-15N72D)。在某些实施例中，向等摩尔浓度的IL-15N72D中添加小鼠或人IL-15Rα与Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区)可提供IL-15生物活性进一步增加，使得IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物呈现对于支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)可比游离IL-15细胞因子的低10倍以上。
因此，在一些实施例中，本公开提供一种IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物，其中对于支持IL-15依赖性细胞生长的EC50比游离IL-15细胞因子的低2倍以上、低3倍以上、低4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上、低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。
在一些实施例中，IL-15超激动剂为两个IL-15N72D分子与可溶IL-15Rα/Fc融合蛋白的二聚体的生物活性蛋白质复合物，也称为ALT-803。ALT-803的组成和制造与使用ALT-803的方法，描述于美国专利申请公开案2015/0374790中，所述文献通过引用并入本文中。众所周知，在N端含有所谓的“sushi”结构域(Su)的可溶IL-15Rα片段可携带负责高亲和力细胞因子结合的结构元件的大部分。可溶融合蛋白可通过将人IL-15RαSu结构域(成熟人IL-15Rα蛋白质的氨基酸1-65)与含有Fc域(232个氨基酸)的人IgG1CH2-CH3区连接来产生。这种IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白可具有以下优势：通过IgG1结构域的二硫键合形成二聚体；和易于使用标准蛋白A亲和色谱法来纯化。
在一些实施例中，ALT-803可具有可溶复合物，所述可溶复合物由与二聚体IL-15Rαsushi结构域/人IgG1Fc融合蛋白具有高亲和力相关联的人IL-15变体的2个蛋白质亚基组成。IL-15变体为114个氨基酸多肽，其包括在螺旋C的位置72处具有Asn取代为Asp(N72D)的成熟人IL-15细胞因子序列。人IL-15R sushi结构域/人IgG1Fc融合蛋白包括IL-15R亚基的sushi结构域(成熟人IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65)，所述sushi结构域与含有Fc结构域(232个氨基酸)的人IgG1CH2-CH3区连接。除N72D取代以外，所有蛋白质序列为人类的。基于亚基的氨基酸序列，包括两条IL-15N72D多肽(实例IL-15N72D序列显示于SEQ ID NO:78中)和二硫健连接的同源二聚体IL-l5RαSu/IgG1Fc蛋白(实例IL-15RαSu/Fc域显示于SEQ ID NO:79中)的复合物的计算分子量为92.4kDa。在一些实施例中，编码靶抗原和ALT-803的重组载体可具有本文所描述的任何序列来编码靶抗原，且可按任何次序具有SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:79来编码ALT-803。在其它实施例中，IL-15超激动剂(如ALT-803)可在用编码靶抗原的重组载体免疫之前或之后，作为单独药物组合物来施用。在进一步实施例中，IL-15超激动剂(如ALT-803)可作为蛋白质复合物或作为编码蛋白质复合物的重组载体以单独药物组合物施用。
各IL-15N720多肽具有大致12.8kDa的计算分子量，且IL-15RαSu/IgG 1Fc融合蛋白具有大致33.4kDa的计算分子量。IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG 1Fc蛋白质均可经糖基化，由尺寸排阻色谱法，得到ALT-803的表观分子量为大致114kDa。对于ALT-803所测定的等电点(pI)可以在大致5.6到6.5范围内。因此，融合蛋白在pH 7下可带负电。
用编码HPV E6和/或E7和ALT-803的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起免疫反应增强，使得相较于任一单独疗法，两个治疗部分的组合协同作用以增强免疫反应。举例来说，用编码HPV E6和/或E7抗原和ALT-803的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起以下的协同增强：抗原特异性效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤受感染细胞的NK细胞反应的刺激、通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)针对杀伤受感染细胞的嗜中性粒细胞或单核细胞反应的刺激、或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制。用编码HPV E6和/或E7抗原和ALT-803的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可协同增强以上反应中的任一者或以上反应的组合，极大地提高在施用至有需要的个体之后的存活率结果。
使用本文所描述的任何重组载体，通过在同一重组载体中表达免疫原性增强试剂和靶抗原，本文所描述的任何免疫原性增强试剂可与靶抗原融合或连接。
编码这类免疫原性增强试剂的核酸序列可为SEQ ID NO:29-SEQ ID NO:84中的任一者，且概述于表2中。
表2：免疫原性增强试剂的序列
在一些实施例中，靶抗原和免疫融合配偶体的核酸序列未由任何核酸分隔开。在其它实施例中，可将编码连接子的核酸序列插入在编码本文所描述的任何靶抗原的核酸序列与编码本文所描述的任何免疫融合配偶体的核酸序列之间。因此，在某些实施例中，在用含有靶抗原、连接子和免疫融合配偶体的病毒载体免疫之后产生的蛋白质可以是融合蛋白，所述融合蛋白包括所关注的靶抗原，随后连接子和最后的免疫融合配偶体，因此通过连接子将靶抗原与免疫融合配偶体连接，增加所关注的靶抗原的免疫原性。在一些实施例中，连接子核酸序列的长度可从约1到约150个核酸、约5到约100个核酸或约10到约50个核酸。在一些实施例中，核酸序列可编码一个或更多个氨基酸残基。在一些实施例中，连接子的氨基酸序列的长度可为约1到约50或约5到约25个氨基酸残基。在一些实施例中，连接子的序列包括小于10个氨基酸。在一些实施例中，连接子可以是聚丙氨酸连接子、聚甘氨酸连接子或具有丙氨酸和甘氨酸二者的连接子。
编码这类连接子的核酸序列可为SEQ ID NO:85-SEQ ID NO:99中的任一者，且概述于表3中。
表3：连接子的序列
SEQ ID NO 序列
SEQ ID NO:85 MAVPMQLSCSR
SEQ ID NO:86 RSTG
SEQ ID NO:87 TR
SEQ ID NO:88 RSQ
SEQ ID NO:89 RSAGE
SEQ ID NO:90 RS
SEQ ID NO:91 GG
SEQ ID NO:92 GSGGSGGSG
SEQ ID NO:93 GGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:94 GGSGGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:95 GGSGGSGGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:96 GGSGGSGGSGGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:97 GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGG
SEQ ID NO:98 GGSGGSGGSGGSGGSG
SEQ ID NO:99 GSGGSGGSGGSGGSGG
XI.制剂
一些实施例提供药物组合物，其包括疫苗接种方案，所述药物组合物可通过任何途径单独施用或与药学上可接受的载剂或赋形剂一起施用，且这类施用可以单一和多个剂量两种形式进行。更确切地说，药物组合物可与各种医药上可接受的惰性载剂呈以下形式进行组合：片剂、胶囊、糖锭、锭剂、硬糖、粉剂、喷雾剂、水性悬浮液、可注射溶液、酏剂、糖浆以及类似形式。这类载剂包含固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂等。此外，这类口服药物制剂可借助于各种通常用于这类目的的试剂类型，适当地增甜和/或调味。通篇所描述的组合物可调配成药物，且用于治疗诊断患有疾病(例如癌症)的有需要的人或哺乳动物。
对于施用，可将病毒载体储液与适当缓冲液、生理学上可接受的载剂、赋形剂或类似物合并。在某些实施例中，在适当缓冲液，例如无菌PBS或盐水中，施用适当数量的病毒颗粒(VP)。在某一实施例中，本文中所公开的载体组合物以用于皮下、肠胃外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内施用的特定制剂来提供。在某些实施例中，可在与表面活性剂(如羟基丙基纤维素)适当混合的水中，制备为游离碱或药理学上可接受盐的活性化合物的溶液中的制剂。也可在以下中制备分散液：甘油、液体聚乙二醇、角鲨烯类乳液、角鲨烯类水包油乳液、油包水乳液、水包油乳液、非水性乳液、石蜡油包水乳液和其混合物，以及油。在其它实施例中，病毒载体可以以用于通过吞咽或通过栓剂呈丸剂形式施用的特定制剂形式提供。
适合于可注射用途的说明性药物形式包含：无菌水溶液或分散液，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂(参见例如美国专利第5,466,468号)。在一定程度上，易于注射性存在的流体形式可为优选的。在一些实施例中，提供在制造和存储条件下稳定的形式。在不同实施例中，所保藏形成抵抗微生物(如细菌、霉菌和真菌)的污染作用。载剂可以是含有例如以下的溶剂或分散介质：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇以及类似物)、其合适混合物和/或植物油。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液情况下维持所需粒径和/或通过使用表面活性剂来维持适当流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞)来实现。可能适合于包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的长期吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
在一个实施例中，对于以水溶液形式肠胃外施用，溶液可进行适当地缓冲(必要时)，且液体稀释剂首先呈现与足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定水溶液尤其适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在此方面，根据本公开，可采用的无菌水性介质将为所属领域的技术人员所知的。举例来说，可将一个剂量溶解于1mL等渗NaCl溶液中，且添加到1000mL皮下输注液中或注射在建议输注位点处(参见例如“Remington's PharmaceuticalSciences”第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。剂量中的一些变化可以取决于所治疗个体的病症而进行。
制剂的载剂可包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬浮液、胶体以及类似物。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。还可将补充性活性成分并入到组合物中。
在某些实施例中，可结合一种或更多种免疫刺激剂如佐剂来施用病毒载体。免疫刺激剂是指增强或加强对于抗原的免疫反应(抗体和/或细胞介导的)的基本上任何物质。免疫刺激剂的一种类型包括佐剂。许多佐剂含有：设计成保护抗原免于快速代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油；和免疫反应的刺激剂，如脂质A、百日咳博德特氏菌(Bortadellapertussis)或结核分枝杆菌来源的蛋白质。在一些实施例中，可结合以下可商购的佐剂中的任一种来施用病毒载体：弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories)；默克佐剂65(Merck andCompany,Inc.)AS-2(SmithKline Beecham)；铝盐，如氢氧化铝凝胶(矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不可溶悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰脂质A和quil A。在一些实施例中，可结合作为佐剂的细胞因子来施用病毒载体，所述细胞因子如GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23和/或IL-32等，如生长因子。
在某些实施例内，佐剂组合物可为诱导主要Th1类型免疫反应的佐剂。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导对于所施用抗原的细胞介导的免疫反应。相比之下，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于促进诱导体液免疫反应。在施加如本文所提供的疫苗之后，个体可支持包含Th1型和/或Th2型反应的免疫反应。在反应主要为Th1型的某些实施例内，Th1型细胞因子的水平将比Th2型细胞因子的水平以更高程度增加。这些细胞因子的水平可容易地使用标准分析来进行评定。因此，各种实施例涉及使用与复制缺陷型病毒载体治疗同时供应的细胞因子来提高针对靶抗原(例如HPV E6和/或HPV E7)的免疫反应的疗法，所述细胞因子例如IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13和/或IL-15。在一些实施例中，与本文所描述的复制缺陷型病毒一起，施用细胞因子或编码细胞因子的核酸。在一些实施例中，在病毒载体施用之前或之后，进行细胞因子施用。在一些实施例中，能够提高针对靶抗原(例如HPV E6和/或HPV E7)的免疫反应的复制缺陷型病毒载体进一步包括编码细胞因子的序列。
引起主要Th1型反应的某些说明性佐剂包含例如单磷酰脂质A(如3-脱氧酰化单磷酰脂质A)与铝盐的组合。佐剂为可商购的(参见例如美国专利第4,436,727号、第4,877,611号、第4,866,034号和第4,912,094号)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)还诱导主要Th1反应。(参见例如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利第6,008,200号和第5,856,462号)。还可使用免疫刺激性DNA序列。所使用的另一佐剂包括皂苷(如Quil A)或其衍生物，包含QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.)、七叶皂苷；毛地黄皂苷；或满天星(Gypsophila)或昆诺藜(Chenopodium quinoa)皂苷。其它制剂可在佐剂组合中包含超过一种皂苷，所述佐剂组合例如以下包括QS21、QS7、QuilA、β-七叶皂苷或毛地黄皂苷的组中的至少两种的组合。
在一些实施例中，组合物可通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气溶胶递送媒介物来递送。可采用使用鼻内微粒树脂和溶血磷脂酰基-甘油化合物的药物递送(参见例如美国专利第5,725,871号)。同样，可采用呈聚四氟乙烯支持基质形式的说明性经粘膜药物递送(参见例如美国专利第5,780,045号)。
脂质体、纳米胶囊、微粒子、脂质颗粒、囊泡以及类似物可用于将组合物引入到合适的热细胞/生物体中。如本文所描述的组合物可被调配成包封于脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米粒子或类似物中进行递送。可选地，如本文所描述的组合物可与这类载剂媒介物的表面共价或非共价结合。可有效地使用脂质体，以将基因、各种药物、放射性治疗剂、酶、病毒、转录因子、别构效应子以及类似物引入到各种培养细胞系和动物中。此外，脂质体的使用似乎并不与在全身递送之后的自身免疫反应或不可接受的毒性相关联。在一些实施例中，脂质体是由分散于水性介质中的磷脂形成，且自发地形成多层同心双层囊泡(即，多层囊泡(MLV))。
在一些实施例中，提供组合物的药学上可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊可一般以稳定和可再现的方式捕获化合物。为了避免由于胞内聚合物过载的副作用，可使用能够在体内降解的聚合物来设计这类超细颗粒(大小约0.1μm)。
在一些实施例中，组合物包括化疗剂(例如可用于治疗癌症的化合物)或与其一起施用。可与所公开的T细胞组合使用的化学治疗癌症试剂包含但不限于：有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)，如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)和NavelbineTM(长春瑞宾(vinorelbine)、5'-noranhydroblastine)；拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱化合物(例如CamptosarTM(伊立替康HCL)、HycamtinTM(拓朴替康HCL)和衍生于喜树碱和其类似物的其它化合物)；鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)和米托鬼臼肼(mitopodozide)；烷化剂，如顺铂或卡铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)、白消安(busulfan)、苯丁酸氮芥、贝鲁司汀(belustine)、尿嘧啶氮芥、氯苯匹嗪(chlomaphazin)和达卡巴嗪(dacarbazine)；抗代谢物，如胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprime)和丙卡巴肼(procarbazine)；抗生素，如阿霉素、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素D、道诺霉素(daunorubicin)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素(daunomycin)；抗肿瘤抗体；达卡巴嗪(dacarbazine)；氮杂胞苷；安吖啶(amsacrine；美法仑(melphalan)；异环磷酰胺；以及米托蒽醌(mitoxantrone)。
本文中所公开的组合物可与其它抗肿瘤试剂组合施用，其包含细胞毒性/抗肿瘤剂和抗血管生成剂。细胞毒性/抗肿瘤试剂可定义为攻击和杀伤癌细胞的试剂。一些细胞毒性/抗肿瘤试剂可为烷化剂，其使肿瘤细胞中的基因物质烷基化，例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、贝鲁司汀、尿嘧啶氮芥、氯苯匹嗪和达卡巴嗪。其它细胞毒性/抗肿瘤试剂可为肿瘤细胞的抗代谢物，例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其它细胞毒性/抗肿瘤试剂可为抗生素，例如阿霉素、博莱霉素、放线菌素D、道诺霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。存在众多针对这些化合物的可商购的脂质体制剂。又其它细胞毒性/抗肿瘤试剂可为有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些试剂包含长春新碱、长春碱和依托泊苷。其它(miscellaneous)细胞毒性/抗肿瘤试剂包含紫杉醇和其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。
还可使用抗血管生成剂。用于所公开的方法和组合物中的合适抗血管生成剂包含抗VEGF抗体，包含人源化和嵌合抗体、抗VEGF适配体和反义寡核苷酸。血管生成的其它抑制剂包含血管生长抑素、内皮抑制素、干扰素、白介素1(包含α和β)、白介素12、视黄酸、和金属蛋白酶-1和金属蛋白酶-2的组织抑制剂(TIMP-1和TIMP-2)。还可使用小分子，包含拓扑异构酶，如雷佐生(razoxane)——一种抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
在某些方面，可结合本文提供一种或更多种疗法，具体来说包括编码一种或更多种靶抗原(如本文所描述的HPV抗原)的核酸序列的一种或更多种腺病毒载体，向有需要的个体施用包括IL-15的药物组合物。
白介素15(IL-15)为具有类似于IL-2的结构的细胞因子。与IL-2一样，IL-15与由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同γ链(γ-C，CD132)构成的复合物结合，且通过所述复合物发送信号。IL-15在受病毒(一种或多种)感染后由单核吞噬细胞(和一些其它细胞)分泌。这种细胞因子诱导自然杀伤细胞的细胞增殖，所述自然杀伤细胞为主要用于杀伤受病毒感染细胞的先天免疫系统细胞。
在临床前模型中，IL-15可增强CD8+T细胞的抗肿瘤免疫。在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)开始登记患者进行I期临床试验，以评价IL-15在患有转移性黑素瘤和肾细胞癌(肾癌)的患者中的安全性、给药剂量和抗肿瘤功效。本文中所公开的IL-15还可包含IL-15的突变体，所述突变体经修饰以维持其天然形式的功能。
IL-15为由小鼠中的染色体4的34kb区4q31和染色体8的中心区编码的14-15kDa糖蛋白。人IL-15基因包括九个外显子(1到8和4A)和八个内含子，其中的四个(外显子5到8)编码成熟蛋白质。已报告，编码相同蛋白质的这个基因的两个可变剪接转录变体。具有48个氨基酸的长信号肽的最初鉴定的同种型(IL-15LSP)由以下组成：316bp 5'-非翻译区(UTR)、486bp编码序列和C端400bp 3'-UTR区。其它同种型(IL-15SSP)具有由外显子4A和5编码的21氨基酸的短信号肽。两种同种型共用在N端信号序列之间的11个氨基酸。尽管两种同种型均产生相同成熟蛋白质，但它们的细胞运输不同。IL-15LSP同种型是在高尔基体[GC]、早期内体中和在内质网(ER)中鉴定的。其以两种形式存在——分泌性和膜结合形式，特别是在树突状细胞上。另一方面，IL-15SSP同种型不是分泌性的，且似乎受限于细胞质和细胞核，在其中，所述IL-15SSP在调控细胞周期中起重要作用。
已表明，IL-15mRNA的两种同种型在小鼠中是通过可变剪接产生。具有含有另一3'剪接位点的替代性外显子5的同种型呈现高翻译效率，且产物在N端信号序列中缺乏疏水性结构域。这表明，衍生于这种同种型的蛋白质位于细胞内。具有正常外显子5的其它同种型(其通过替代性外显子5的整体剪接产生)，可释放到细胞外。
尽管IL-15mRNA可在许多细胞和组织(包含肥大细胞、癌细胞或纤维母细胞)中找到，但这种细胞因子主要由树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞呈以成熟蛋白质形式产生。在IL-15mRNA的普遍存在与蛋白质的有限产量产生之间的这种不一致，可通过人中的十二个和小鼠内的五个上游起始密码子的存在来解释，所述密码子可抑制IL-15mRNA的翻译。翻译的无活性mRNA存储于细胞内，且可在特定信号后诱发。IL-15的表达可由细胞因子或在感染单核细胞疱疹病毒、结核分枝杆菌和白色念珠菌(Candida albicans)之后刺激，所述细胞因子如GM-CSF、双链mRNA、未甲基化CpG寡核苷酸、脂多醣(LPS)通过Toll样受体(TLR)、干扰素γ(IFN-γ)。
XII.制备方法
在一些实施例中，组合物和方法使用人类溶细胞T细胞(CTL)，如识别与所选择MHC分子结合的HPV E6和/或HPV E7表位的那些T细胞，所述MHC分子例如HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24。对于使用如本文所描述的方法和组合物的疗法，可选择表达某一血清型的MHC分子(例如HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24)的个体。举例来说，对于包含使用本文所描述的方法和组合物来提高针对HPV E6和/或HPV E7的免疫反应的疗法，可选择表达某一血清型的MHC分子(例如HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24)的个体。
在不同实施例中，可通过使用经所关注的刺激外周血液单核细胞的表位脉冲的抗原呈递细胞进行体外培养，来产生这些T细胞。另外，还可在用HPV E6和/或HPV E7乳胶珠、HPV E6和/或HPV E7蛋白质脉冲的塑性贴壁外周血液单核细胞或用HPV E6和/或HPV E7RNA致敏的DC刺激之后，来产生T细胞系。T细胞还可由用编码HPV E6和/或HPV E7免疫原的疫苗载体免疫的个体产生。
一些实施例涉及HPV E6和/或HPV E7的HLA-A2限制性表位，其具有刺激来自用疫苗HPV E6和/或HPV E7免疫的癌症患者的CTL的能力。序列包含不规则(非锚定位置)突变，产生增强被T细胞受体识别的氨基酸变化。一些实施例在HPV E6(例如26、98、106)、HPV E7(例如86)的一个或更多个位置处或其组合并入氨基酸变化。相较于未突变的抗原，并入激动剂表位可增强CTL的致敏作用100到1,000倍。因此，在一些实施例中，提供编码这类变体抗原的HPV E6和HPV E7核酸序列。
XIII.治疗HPV相关疾病的方法
在某些实施例中，提供增强有需要的个体中的免疫反应的方法，所述方法包括：向个体施用药物组合物，所述药物组合物包括含有编码HPV抗原的核酸序列的复制缺陷型腺病毒载体；以及向个体施用免疫检查点抑制剂。在某些实施例中，方法可进一步定义为：治疗HPV感染或HPV相关疾病，如HPV相关癌症，其包含但不限于头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、口咽和扁桃体癌、宫颈癌、阴茎癌、外阴癌或肛门癌。
A.人乳头瘤病毒(HPV)相关HNSCC
已有证据表明，高风险HPV16感染与HPV相关的HNSCC的发展和进展相关联，且更具体地说，HPV早期6(E6)和早期7(E7)基因有助于癌症发展。在美国，头颈癌的发病率估计为约370,000例，且这些的25％到38％为HPV相关HNSCC。因此，HPV相关HNSCC的发病率估计在92,750到140,000例范围内。关于HPV相关HNSCC的近期研究估计，在美国约35,000例新的病例，其中不管目前疗法如何，预计每年7,600例癌症相关死亡。因此，对于此患者群体研究新治疗方法的医学需要仍未满足。基于所估计的HPV相关HNSCC发病率，这个群体够资格通过FDA的罕用产品药物研发，且Etubics已接受指定研发新免疫治疗性疫苗(Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7)的罕用产品，以治疗HPV相关HNSCC。
B.HIV和HPV相关口咽和扁桃体癌
人乳头瘤病毒(HPV)全世界每年造成多达100,000例头颈部鳞状细胞癌(HNSSC)。这些中的大部分为口咽和扁桃体癌。在美国，口咽HPV感染的估计发病率在9.2％到18.6％范围内。16型HPV(HPV16)为在口腔癌瘤中发现的最普遍HPV，且参与这些癌症的病原学。从1973到1995年，美国的扁桃体癌症的发病率已以2-3％/年增加。HIV感染个体发展口咽和扁桃体癌的风险增加2到6倍。尽管AIDS疗法有显著进步，但这种流行病继续在全世界造成破坏性发病率和死亡率，尤其在抗反转录病毒药品受限得到的地区中。HPV感染和疾病尚未显著下降，这是由于引入强效组合疗法以控制HIV和高活性抗反转录病毒疗法似乎对于HPV相关口腔疾病具有极小的有益效果。因此，仍有必要研究可应用于HIV和HIV相关恶性疾病的新疫苗。
某些方面提供基于HPV的病原性作用，用于HIV相关恶性疾病的治疗性策略。待使用的疫苗是基于本文所描述的新重组腺病毒血清型5(Ad5)载体平台(Ad5[E1-、E2b-])。这种重组载体允许插入特定疾病相关抗原基因，所述基因将在直接转染抗原呈递细胞之后表达。重要的是，这种新疫苗可在设计成刺激针对特异性靶抗原的强效细胞介导的免疫(CMI)反应的多种同源免疫方案中使用，且具有在对抗HIV/HPV相关口咽和扁桃体恶性疾病中称为重要免疫治疗剂的可能。
向患有HPV相关HNSCC的患者施用多方面治疗，并且用Ad5[E1-、E2b-]-E6疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-E7疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的免疫疗法可在治疗这种疾病的医疗设备中起重要作用。
C.HPV相关宫颈癌
在女性中，宫颈癌为癌症相关死亡的第二主要原因。众所周知，致癌性人乳头瘤病毒(HPV)在肛门与生殖器癌中起关键病原学作用，且至少70％的宫颈癌与16型(HPV-16)或18型(HPV-18)相关联。HPV-16和HPV-18还为与大部分外阴和阴道初癌相关的病毒类型。外阴上皮内瘤形成为一种外阴皮肤的慢性癌变前病症，其由高风险人乳头瘤病毒(HPV)类型引起；HPV-16参与大于75％的病例。女性罹患任何HPV感染的终生风险大于80％。一半的女性在开始性活动的3年内罹患宫颈感染。约90％的HPV感染已通过免疫系统在6-24个月内清除。性活跃女性中的HPV感染的发病率为10-20％，且在年轻女性中甚至更高。HPV-16/18二价(希瑞适(Cervarix))和HPV-6/11/16/18四价(加德西(Gardasil))疫苗，在预防在疫苗接种时HPV阴性的女性中的疫苗型HPV相关生殖器初癌中为高效的。尽管这些疫苗在预防HPV感染上为高效的，但仍有一定群体的女性未进行接种且受到HPV感染，且因此处于发展瘤形成的高风险下。在近期的元分析研究中，没有以下的迹象：向有证据先前疫苗型HPV暴露的女性给予以上HPV疫苗，可在3到4年时间范围内预防与这些HPV类型相关的癌前病变。就是这个女性群体被认为能从用设计成预防发展HPV相关癌症的这种新腺病毒疫苗(Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗；Ad5[E1-、E2b-]-E6疫苗；Ad5[E1-、E2b-]-E7疫苗)的疫苗接种获益。
XIV.降低HPV阳性个体中的HPV阳性细胞的方法
在某些实施例中，本公开提供降低个体中HPV感染或预防个体中发展HPV诱发癌症的方法，所述个体在防治时或在施用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-E6疫苗和/或Ad5[E1-、E2b-]-E7疫苗之前为HPV阳性的或在发展HPV诱发癌症的风险下。在一些实施例中，施用如本文所描述的HPV-E6/E7疫苗、HPV-E6疫苗和/或HPV E7疫苗可破坏HPV感染细胞，且从而预防HPV诱发癌症的发展。在某些实施例中，个体并未患HPV诱发或HPV相关癌症，或在施用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-E6疫苗和/或Ad5[E1-、E2b-]-E7疫苗之前，确定未患HPV诱发或HPV相关癌症。
在性传播的感染(STI)中，HPV为最频繁扩散的病毒。HPV感染的症状可能会不被注意到，导致在不了解疾病情况下传播。HPV感染可引起慢性疾病，如生殖器疣和癌症。降低HPV感染的比率可通过预防性疫苗接种来实现。然而，在一些情况下，在疫苗接种现有疫苗之前，HPV感染可能发生，且造成HPV致癌基因的表达和繁殖，这可引起发展癌症。举例来说，HPV感染可为16型HPV或18型HPV或其组合，其引起早期6(E6)和/或早期7(E7)致癌基因的感染和表达。针对HPV的疫苗接种可用于预防HPV致癌基因(包含E6和E7)的繁殖。在某些实施例中，可防治性施用本公开的Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫疗法、Ad5[E1-、E2b-]-E6免疫疗法和/或Ad5[E1-、E2b-]-E7免疫疗法，以接种HPV阳性个体，且降低或消除可导致发展HPV诱发或HPV相关癌症的HPV感染。在某些方面，HPV阳性细胞降低可通过蛋白质或核酸检测所属领域中可用的任何方法(如PCR)来测定。
XV.剂量和施用
通过、破坏或消除HPV E6/E7表达细胞，如本文所描述的组合物和方法涵盖在疫苗接种期间的各种剂量和施用方案，来用于通过减少、破坏或消除HPV E6/E7表达细胞降低HPV感染的疫苗接种期间的各种剂量和方案，来以预防HPV相关癌症或治疗HPV相关癌症或疾病。个体可接受一种或更多种复制缺陷型腺病毒或腺病毒载体，例如Ad5[E1-、E2B-]-HPVE6、Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7和/或Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7，所述载体能够提高个体中针对本文所描述的靶抗原的免疫反应。在不同实施例中，以适合于实现这种免疫反应的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×108个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×109个病毒颗粒到约5×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×108个病毒颗粒到约5×108个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×108个病毒颗粒到约1×109个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×109个病毒颗粒到约5×109个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×109个病毒颗粒到约1×1010个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1010个病毒颗粒到约5×1010个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×1010个病毒颗粒到约1×1011个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1011个病毒颗粒到约5×1011个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×1011个病毒颗粒到约1×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1012个病毒颗粒到约5×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×1012个病毒颗粒到约1×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1013个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×108个病毒颗粒到约5×1010个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1010个病毒颗粒到约5×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1011个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×108个病毒颗粒到约1×1010个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1010个病毒颗粒到约1×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1011个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些情况下，以大于或等于以下个病毒颗粒(VP)/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、1.5×1012、2×1012、3×1012或更多。在一些情况下，以小于或等于以下个病毒颗粒(VP)/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、1.5×1012、2×1012、3×1012或更多。在一些实施例中，可以以上述剂量中的任一种以单次剂量形式调配或施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，可以1×109-3×1012、1×109-1×1011或5×109-5×1011个病毒颗粒(VP)/单次免疫剂量的浓度，调配和施用复制缺陷型腺病毒。在一些情况下，以10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg或更多病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在不同实施例中，以合适体积的制剂缓冲液，例如约0.1-10mL、0.2-8mL、0.3-7mL、0.4-6mL、0.5-5mL、0.6-4mL、0.7-3mL、0.8-2mL、0.9-1.5mL、0.95-1.2mL或1.0-1.1mL的体积，施用本文所描述的所需剂量。所属领域的技术人员应了解，体积可在以这些值中任一者为界的任何范围(例如约0.5mL到约1.1mL)内。病毒颗粒的施用可通过各种合适的递送进行，例如其可通过注射(例如真皮内、真皮内、肌肉内、静脉内或皮下)、鼻内(例如通过抽吸)、以丸剂形式(例如吞咽)、用于阴道或直肠递送的栓剂。在一些实施例中，皮下递送可为优选的，且可提供到树突状细胞的更高大通路。
可重复向个体施用病毒颗粒。可按照时间表重复递送病毒颗粒，或可选地，可以根据需要来进行。举例来说，个体针对靶抗原(例如HPV E6和/或HPV E7)的免疫可进行测试，且根据需要补充额外递送。在一些实施例中，递送时间表包含以规则间隔施用病毒颗粒。联合递送方案可设计成包括以下中的一个或更多个：具有时间表的时段；和/或在施用之前所评定的基于需要施用的时段。举例来说，疗法方案可包含施用，如每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、每十周、每十一周、每十二周、每十三周、每十四周、每十五周、每十六周、每十七周、每十八周、每十九周或每二十周皮下施用一次，随后每三个月另一免疫疗法治疗，直到出于任何原因(包含死亡)退出疗法为止。另一实例方案包括每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、每十周、每十一周、每十二周、每十三周、每十四周、每十五周、每十六周、每十七周、每十八周、每十九周或每二十周，三次施用，随后每三个月另一组三次免疫疗法治疗。另一实例方案包括：第一时段，以第一频率进行第一数量的施用；第二时段，以第二频率进行第二数量的施用；第三时段，以第三频率进行第三数量的施用等；和任选地一个或更多个时段，按需要进行未确定数量的施用。各时段中的施用数量可独立地进行选择，且可例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。各时段中的施用频率也可独立地进行选择，可例如为约每天、每隔一天、每隔两天、一周两次、一周一次、每隔一周一次、每三周、每月、每六周、每隔一月、每隔两个月、每隔三个月、每隔四个月、每隔五个月、一年一次等。免疫方案可耗费上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36个月或更多的总时段。免疫之间的安排间隔可进行调整，以使得免疫之间的间隔修改了上至间隔的五分之一、四分之一、三分之一或一半。举例来说，对于3-周间隔时间表，免疫可在20和28天(3周-1天到3周+7天)之间进行重复。对于最先3次免疫，如果第二和/或第三免疫延迟，那么随后免疫可偏移，允许免疫之间的最小量缓冲。举例来说，对于三间隔时间表，如果一免疫延迟，那么随后免疫可安排为不早于前一免疫后17、18、19或20天发生。在一些实施例中，可在上述初次疫苗免疫中的任一个之后施用加强免疫。在一些实施例中，施用治疗有效量，随后施用包括与初次免疫相同的组合物或药物组合物的一个或更多个加强免疫。在一些方面，每一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二个月或更多，施用加强免疫。在一些方面，重复加强免疫三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二或更多次。在一些方面，施用治疗有效量为每一、二或三周重复三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二或更多次的初次免疫，随后每一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二或更多个月，重复三次或更多次加强免疫。
组合物，如Ad5[E1-、E2B-]-HPV E6、Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7和Ad5[E1-、E2b-]-HPVE6/E7病毒颗粒，可以以各种状态提供，例如在室温下、在冰上或冷冻。组合物可提供于合适大小的容器中，例如2mL小瓶。在一个实施例中，具有1.0mL可提取疫苗的2ml小瓶含有5×1011个总病毒颗粒/毫升。包含温度和湿度在内的存储条件可变化。举例来说，用于疗法中的组合物可存储在室温、4℃、-20℃或更低温度下。
在一个方面，提供了选择施用组合物的人的方法，其包括：测定人的HLA亚型；以及如果HLA亚型测定为预选择的HLA亚型子组中的一个，那么向该人施用组合物。在一些实施例中，预选择的HLA亚型子组包括HLA-A2、HLA-A3和HLA-A24中的一个或更多个。
在一个方面，提供治疗人癌症或传染性疾病的方法，其包括向该人施用重组病毒载体。
在一个方面，提供在人中产生针对HPV E6、HPV E7或其组合的免疫反应的方法，其包括向该人施用组合物。在一些实施例中，重复施用步骤至少一次。在一些实施例中，在前一施用步骤之后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周，重复施用步骤。在一些实施例中，在前一施用步骤之后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月，重复施用步骤。在一些实施例中，重复施用步骤两次。
在不同实施例中，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物的治疗的个体，进行一般评估。可以按需要或在安排基础上，如在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时对比在无免疫时间点进行不同测试组。
一般评估可包含以下中的一个或更多个：病史、ECOG性能评分、Karnofsky性能情况和由主治医生进行的全面身体检查(含有体重)。可记录个体正接受或自上次问诊起已接受的任何其它治疗、药品、生物制剂或血液产品。可在诊所追踪个体合适时段，例如在接受疫苗后大致30分钟，以监测任何不良反应。每天评定在每剂疫苗之后局部和全身性反应原性，持续一段选择时间，例如3天(免疫当天和其后2天)。日记卡可用于报告症状，且直尺可用于测量局部反应原性。可评定免疫注射位点。可以进行胸、腹部和骨盘的CT扫描或MRI。
在不同实施例中，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物的治疗的个体，进行血液学和生物化学评估。可以按需要或在安排基础上，如在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时对比在无免疫时间点进行不同测试组。血液学和生物化学评估可包含以下中的一个或更多个：化学和血液学的血液测试、具有差异的CBC、Na、K、Cl、CO2、BUN、肌酐、Ca、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT、葡萄糖和ANA。
在不同实施例中，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物的治疗的个体，评价生物标记。可以按需要或在安排基础上，如在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时对比在无免疫时间点进行不同测试组。
生物标记评估可包含测量来自适当体积的血清样本的HPV E6和/或HPV E7的抗体或Ad5载体中的一个或更多个，例如如果确定和可获得，那么可审查约5ml生物标记(例如CEA或CA15-3)。
在不同实施例中，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物治疗的个体，进行免疫评定。可以按需要或在安排基础上，如在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时对比在无免疫时间点进行不同测试组。
可在每次免疫之前和在至少一些免疫后的时候，抽取外周血液，例如约90mL，来测定在研究期间和/或在特定数量的免疫之后特定时间点时，对于免疫反应是否有效果。免疫评定可包含以下中的一个或更多个：使用ELISpot分析外周血液单核细胞(PBMC)对HPVE6和/或HPV E7的T细胞反应、增殖分析、多参数流式细胞测量分析和细胞毒性分析。可将来自每次抽血的血清存档，且发送和测定。
在不同实施例中，在HPV相关疾病的治疗性治疗的情况下，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物的治疗的个体，进行肿瘤评定。可以按需要或在安排基础上，如在治疗之前，在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时对比在无免疫时间点进行不同测试组。肿瘤评定可包含：在治疗之前、在至少一些免疫之后的某一时间和在完成所选择数量(例如2、3或4)的第一治疗之后大致每三个月和例如直到退出治疗为止，进行胸、腹部或骨盘的CT或MRI扫描中的一个或更多个。
可从样本，如个体的外周血液样本，使用一种或更多种合适的免疫反应测试，如ELISpot、细胞因子流式细胞测量术或抗体反应，评价针对本文所描述的靶抗原(如HPV抗原)的免疫反应。可通过测量T细胞反应来测定阳性免疫反应。如果六个具有抗原的孔中针对背景进行调整的斑点的平均数量超过六个对照孔中的斑点的数量10个，且使用学生t检验(Student's t-test)，含有抗原的六个孔与六个对照孔的单一值之间的差异在p≤0.05水平下统计学上显著，那么T细胞反应可被视为阳性。免疫原性分析可在每一免疫之前和在治疗时段期间的安排时间点时发生。举例来说，可安排在治疗的约第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、20、24、30、36或48周的时间点进行免疫原性分析，即使此时无安排的免疫。在一些情况下，如果个体接受至少最小数量的免疫，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多免疫，那么个体可被视为可进行免疫反应评价。
在一些实施例中，免疫反应包括产生针对抗原的抗体。在一些实施例中，免疫反应包括细胞介导的免疫(CMI)。在一些实施例中，编码HPV E6抗原的序列与SEQ ID NO:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，编码HPV E7抗原的序列与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，抗原包括25、15、10、5或更少个氨基酸的修饰。在一些实施例中，重组病毒载体包括复制缺陷型腺病毒载体。在一些实施例中，重组病毒载体包括复制缺陷型腺病毒5载体。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括E2b基因区中的缺失。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括E1基因区中的缺失。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括E3基因区中的缺失。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括E4基因区中的缺失。在一些实施例中，重组病毒载体在经转染的细胞中实现抗原的过表达。在一些实施例中，重组病毒在人中诱导针对表达抗原的细胞比基础高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25倍的特异性免疫反应。在一些实施例中，人具有大于50、75、100、125、150、160、175或200的反向Ad5中和抗体滴度。在一些实施例中，人具有大于250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或4767的反向Ad5中和抗体滴度。在一些实施例中，免疫反应测量为抗原特异性抗体反应。
在一些实施例中，免疫反应测量为抗原特异性细胞介导的免疫(CMI)。在一些实施例中，免疫反应测量为抗原特异性IFN-γ分泌。在一些实施例中，免疫反应测量为抗原特异性IL-2分泌。在一些实施例中，通过ELISpot分析测量针对抗原的免疫反应。在一些实施例中，抗原特异性CMI大于25、50、75、100、150、200、250或300IFN-γ斑点形成细胞(SFC)/106个外周血液单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，通过来自肿瘤细胞系或来自自身肿瘤的经HPV E6和/或HPV E7抗原脉冲的抗原呈递细胞、同种异体抗原表达细胞的T细胞裂解，来测量免疫反应。
在一些实施例中，在HPV相关疾病的治疗性治疗的情况下，根据患有可测量/可评价疾病的个体中的RECIST 1.1标准，进行疾病进展或临床反应测定。在一些实施例中，使用如本文所描述的方法和组合物的疗法在接受疗法的个体中实现完全反应(CR；所有目标病变消失或所有非目标病变消失，和非目标病变的肿瘤标记水平正常化)。在一些实施例中，使用方法和组合物的疗法在接受疗法的个体中实现部分反应(PR；考虑目标病变的基线总LD作为参考，目标病变的LD的总和降低至少30％)。
在一些实施例中，使用方法和组合物的疗法在接受疗法的个体中实现稳定疾病(SD；考虑自治疗开始目标病变的最小总LD作为参考，既没有足够缩小以获准PR又没有足够增加以获准PD)。在一些实施例中，使用如本文所描述的方法和组合物疗法在接受疗法的个体中实现不完全反应/稳定疾病(SD；持续一个或更多个非目标病变或/和维持肿瘤标记水平高于非目标病变的正常界限)。在一些实施例中，使用如本文所描述的方法和组合物的疗法在接受疗法的个体中实现进展性疾病(PD；考虑自开始治疗记录的最小总LD作为参考，目标病变的LD的总和增加至少20％，或出现目标病变的一个或更多个新病变，或持续一个或更多个非目标病变，或/和维持肿瘤标记水平高于非目标病变的正常界限)。
XVI.试剂盒
某些实施例提供用于在个体中产生免疫反应以对抗HPV感染和HPV相关或HPV诱发癌症的组合物、方法和试剂盒。某些实施例提供用于产生针对靶抗原、或表达或呈递靶抗原的细胞、或包括至少一种靶抗原的靶抗原标志的免疫反应的组合物、方法和试剂盒。组合物、免疫疗法或疫苗可以以试剂盒形式提供。试剂盒可进一步包括关于剂量和或施用的说明书，所述说明书包含治疗方案信息。
在一些实施例中，试剂盒包括用于提供组合多靶向癌症免疫疗法的组合物和方法。在一些实施例中，试剂盒包括用于组合多靶向治疗传染性疾病的组合物和方法。在一些实施例中，试剂盒可进一步包括可用于施用试剂盒组分的组分和关于如何制备所述组分的说明书。在一些实施例中，试剂盒可进一步包括用于在治疗前后用适当实验室测试监测个体或与医务人员的交流结果和个体数据的软件。
包括组分的试剂盒可呈干燥或液体形式。如果其呈干燥形式，那么试剂盒可包含溶解干燥材料的溶液。试剂盒还可包含呈液体或干燥形式的传输因子。如果传输因子呈干燥形式，那么试剂盒将包含溶解传输因子的溶液。试剂盒还可包含用于混合和制备组分的容器。试剂盒还可包含用于辅助施用的仪器，例如针、导管、施用器、吸入器、注射器、移液管、镊子、标准匙(measured spoon)、滴眼器或任何这类医学上批准的递送媒介物。在一些实施例中，如本文所描述的试剂盒或药物递送系统还包含用于容纳本文中所公开的组合物的装置，密封以用于商业销售和配送。
在一个方面，提供用于在人类中诱导免疫反应的试剂盒，其包括：组合物，所述组合物包括体积在0.8-1.2mL范围内的治疗性溶液，治疗性溶液包括至少1.0×1011个病毒颗粒；其中病毒颗粒包括重组复制缺陷型腺病毒载体；组合物，所述组合物包括含有免疫途径检查点调节剂的分子组合物的治疗性溶液；和说明书。
在一些实施例中，治疗性溶液包括1.0-5.5×1011个病毒颗粒。在一些实施例中，腺病毒载体能够在经转染的细胞中实现经修饰的HPV E6和/或HPV E7的过表达。在一些实施例中，腺病毒载体包括编码抗原的核酸序列，所述抗原在人中诱导针对HPV E6和/或HPV E7表达细胞的特异性免疫反应。在一些实施例中，免疫途径检查点调节剂靶向选自以下的内源性免疫途径检查点蛋白质或其片段：PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA和CD244。在一些实施例中，分子组合物包括siRNA、反义物、小分子、模拟物、配体的重组形式、受体的重组形式、抗体或其组合。
在一些实施例中，说明书针对治疗增殖性疾病或癌症。在一些实施例中，腺病毒载体包括复制缺陷型腺病毒5载体。在一些实施例中，治疗性溶液包括至少1.0×1011、2.0×1011、3.0×1011、3.5×1011、4.0×1011、4.5×1011、4.8×1011、4.9×1011、4.95×1011或4.99×1011个病毒颗粒，所述病毒颗粒包括重组核酸载体。在一些实施例中，治疗性溶液包括最多7.0×1011、6.5×1011、6.0×1011、5.5×1011、5.2×1011、5.1×1011、5.05×1011或5.01×1011个病毒颗粒。在一些实施例中，治疗性溶液包括1.0-7.0×1011或1.0-5.5×1011个病毒颗粒。在一些实施例中，治疗性溶液包括4.5-5.5×1011个病毒颗粒。在一些实施例中，治疗性溶液包括4.8-5.2×1011个病毒颗粒。在一些实施例中，治疗性溶液包括4.9-5.1×1011个病毒颗粒。在一些实施例中，治疗性溶液包括4.95-5.05×1011个病毒颗粒。在一些实施例中，治疗性溶液包括4.99-5.01×1011个病毒颗粒。在一些实施例中，试剂盒进一步包括免疫原性组分。在一些实施例中，免疫原性组分包括选自以下的细胞因子：IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23和IL-32。在一些实施例中，免疫原性组分选自IL-7、编码IL-7的核酸、与IL-7具有基本上同一性的蛋白质、和编码与IL-7具有基本上同一性的蛋白质的核酸。
实例
包含以下实例以显示本发明的优选实施例。所属领域的技术人员应了解，以下实例中所公开的技术表示本发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，并且因此可以视为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，所属领域的技术人员应了解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定实施例作出许多改变且仍获得相同或类似结果。
实例1
含有HPV E6和/或HPV E7的Ad5载体的生产和评价
本实例描述Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7载体的生产和评价。HPV E6和HPV E7为天然E6和E7蛋白的非致癌变体。
病毒构建
构建和生产Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7。简单来说，使用基于同源重组的方法，将转基因亚克隆到Ad5[E1-、E2b-]载体中，复制缺陷型病毒在E.C7包装细胞系中繁殖，CsCl2纯化，和感染性滴度测定为E.C7细胞单层上的空斑形成单位(PFU)。通过十二烷基硫酸钠(SDS)破坏和在260nm和280nm下的分光光度法，测定病毒颗粒(VP)浓度。作为载体对照，采用Ad5[E1-、E2b-]-null，其为不具有转基因插入物的Ad5平台主链。
免疫和脾细胞制备
向雌性C57BL/6小鼠(n＝5只/组)皮下(SQ)注射不同剂量的Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7或Ad5[E1-、E2b-]-null。剂量以25μL注射缓冲液(具有3％蔗糖的20mM HEPES)形式施用，且以14天间隔免疫小鼠三次。在最终注射之后十四天，收集脾和血清。将来自小鼠的血清冷冻在-20℃下，直到进行评价为止。通过破坏脾囊和轻轻地按压内含物通过70μm尼龙细胞过滤器，来生成脾细胞悬浮液。通过添加红细胞裂解缓冲液来裂解红细胞，且在裂解之后，在R10(RPMI 1640，其补充有L-谷氨酰胺(2mM)、HEPES(20mM)(Corning,Corning,NY)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/mL)和10％胎牛血清)中，洗涤脾细胞两次。通过ELISpot和流式细胞测量术，分析脾细胞的细胞因子产生。
酶联免疫吸附斑点(ELISpot)分析
通过ELISpot分析，使用如上文所描述制备的新鲜经分离小鼠脾细胞，测定HPV E6和HPV E7特异性干扰素-γ(IFN-γ)分泌T细胞。进行ELISpot分析。将跨越HPV E6和HPV E7的全编码序列的重叠肽库合成为具有11个氨基酸重叠的15聚体(且将冻干肽库溶解于DMSO中)。用衍生于E6或E7的库中的2μg/mL/肽的重叠15聚体肽刺激脾细胞(2×105个细胞)。用伴刀豆球蛋白A(Con A)以0.06μg/孔的浓度作为阳性对照刺激细胞。衍生于SIV-Nef(AIDSResearch and Reference Reagent Program,Division of AIDS,NIAID,NIH)的重叠15聚体完全肽库用作无关肽对照。使用免疫斑点ELISpot板读取器，测定斑点形成细胞(SFC)的数量(且结果报告为SFC数量/106个脾细胞)。
胞内细胞因子刺激
如以上关于ELISpot分析所描述的，制备脾细胞。在96孔U形底板中，使用106个活脾细胞/孔，进行刺激分析。通过以下来刺激R10培养基中的脾细胞：在37℃、5％CO2下，以2μg/mL/肽，添加HPV E6、HPV E7或SIV-Nef肽库，持续6h，以及在温育开始之后两小时，添加蛋白质转运抑制剂(GolgiStop,BD)。随后，对已刺激的脾细胞进行淋巴细胞表面标记CD8α和CD4染色，用多聚甲醛固定，经通透，且进行胞内积聚的IFN-γ和TNF-α染色。针对小鼠CD8α(克隆53-6.7)、CD4(克隆RM4-5)、IFN-γ(克隆XMG1.2)和TNF-α(克隆MP6-XT22)的荧光缀合抗体购自BD，且在存在抗CD16/CD32(克隆2.4G2)的情况下进行染色。使用Accuri C6流式细胞仪(BD)来进行流式细胞测量术，且使用BDAccuri C6软件进行分析。
肿瘤免疫疗法
对于体内肿瘤免疫疗法研究，向8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠，在左侧腹，SQ植入2×105个TC-1HPV E6/E7表达肿瘤细胞。以7天间隔，用SQ注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，处理小鼠三次。根据相同方案，向对照小鼠注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-nullVP。在组合研究中，在免疫同时，向小鼠IP给予100μg大鼠抗PD-1抗体(克隆RMP1-14)或同型大鼠对照抗体(克隆2A3)。大鼠抗PD-1抗体和大鼠IgG2a同型对照抗体购自BioXcell。通过两个相对尺寸(a，b)来测量肿瘤大小，且根据式V＝(肿瘤宽度2×肿瘤长度)/2来计算体积，其中a为较短尺寸。当肿瘤达到1500mm3时，或当肿瘤变成溃疡时，将动物安乐死。
通过流式细胞测量术对肿瘤浸润性细胞(TIL)的分析
在第0天，向四组8-10周龄雌性C57BL/6小鼠(n＝5只/组)，在左侧腹，SQ植入2×105个TC-1肿瘤细胞。向这些组中的两个组用1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP载体对照进行SQ免疫，且其它两组用1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP疫苗进行SQ免疫。自第12天开始，以7天间隔，施用这些免疫两次。除免疫以外，还在第12和16天，向一个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7组和一个Ad5[E1-、E2b-]-null组中的小鼠，SQ施用100μg大鼠抗PD-1抗体(克隆RMP1-14)，且在第19和23天，施用100μg仓鼠抗PD-1抗体(克隆J43)，以增加抗PD-1抗体的有效剂量。为了用这些免疫途径检查点调节剂治疗的对照，在同一天，向剩余Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和Ad5[E1-、E2b-]-null组中的小鼠，施用相关大鼠和仓鼠对照IgG抗体。仓鼠抗PD-1抗体和同型对照购自BioXcell。在第27天，测量肿瘤、切除且称重。将肿瘤剁碎，且在室温下，用在汉克氏(Hank's)平衡盐溶液(HBSS)中的胶原蛋白酶IV(1mg/ml)、玻尿酸酶(100μg/ml)和DNA酶IV(200U/ml)的混合物消化30min，且在80rpm下旋转。酶购自Sigma-Aldrich。在消化之后，将肿瘤悬浮液放入通过70μm尼龙细胞过滤器，且离心。通过添加红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)来去除红细胞，且在裂解之后，在含有1％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤肿瘤悬浮液两次，且再悬浮于荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液(PBS，pH 7.2，1％胎牛血清和2mM EDTA)中，以进行染色。针对CD45(30-F11)、CD4(RM4-5)和PDL1(MIH5)的荧光缀合抗体购自BD。针对CD8β(H35-17.2)、CD25(PC61.5)、FoxP3(FJK-16s)、PD-1(RMP1-30)、LAG-3(C9B7W)和CTLA4(UC10-4B9)的荧光缀合抗体均购自eBioscience。在4℃下，在含有抗CD16/CD32抗体(克隆2.4G2)的100μL FACS缓冲液中，进行表面染色30分钟。已染色细胞在FACS缓冲液中洗涤，用多聚甲醛固定，和在100μL含有抗CD16/CD32抗体(克隆2.4G2)的通透缓冲液中，于4℃下，用荧光缀合的抗FoxP3抗体或抗CTLA4抗体染色60分钟之前，在通透缓冲液(eBioscience)中通透(如果需要)。细胞用通透缓冲液洗涤，洗回FACS缓冲液中，且通过流式细胞测量术使用BDAccuri C6流式细胞仪，分析固定体积的各样本。肿瘤细胞定义为包含小细胞和大型细胞的散射门(scatter gate)中的CD45-事件。CD4+TIL定义为淋巴细胞散射门中的CD45+/CD4+事件。CD8+TIL定义为淋巴细胞散射门中的CD45+/CD8β+事件。调节性T细胞(Treg)定义为淋巴细胞散射门中的CD45+/CD4+/CD25+/FoxP3+事件。效应CD4+T细胞定义为淋巴细胞散射门中的CD45+/CD4+/CD25-/FoxP3-事件。同型匹配的对照抗体用于测定FoxP3、PDL1、PD-1、LAG-3和CTLA4的阳性表达。使用Accuri C6流式细胞仪(BD)来进行流式细胞测量术，且在BD Accuri C6软件中进行分析。
通过Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7诱导的HPV E6/E7特异性细胞介导的免疫反应
进行研究，以测定增加剂量的Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫对于小鼠中的CMI反应诱导的效果。以14天间隔，用108、109或1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，SQ免疫C57BL/6小鼠组(n＝5只/组)三次。对照小鼠接受108、109或1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP(空白载体对照)。在最后免疫之后两周，通过ELISpot分析，评定IFN-γ分泌细胞的脾细胞CMI反应。观测剂量效果，且通过用1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP进行免疫，得到最高CMI反应水平。在注射Ad5[E1-、E2b-]-null的对照小鼠中，未检测到反应。
还测定用1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP进行免疫的小鼠中的CD8α+和CD4+脾细胞群体中的IFN-γ和TNF-α的胞内积聚。在用重叠肽库刺激之后的胞内细胞因子染色(ICS)揭示从用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫的所有小鼠分离的CD8α+淋巴细胞中的E6和E7抗原特异性IFN-γ积聚。还对肽刺激的脾细胞的胞内TNF-α积聚染色，且能够检测到大量群体的对E6和E7两者具有特异性的多功能性(IFN-γ+/TNF-α+)CD8α+脾细胞。
HPV E6/E7表达肿瘤的治疗
研究免疫疗法治疗在携带HPV E6/E7TC-1肿瘤的小鼠中的抗肿瘤效果。这些肿瘤细胞表达PDL1，如通过流式细胞分析评定的。当用PE缀合的抗PDL1标记时，TC-1细胞的中值荧光强度(MFI)为537；而用PE缀合的同型对照抗体标记的细胞的MFI为184，这表明TC-1细胞表面上存在免疫抑制PDL1(数据未显示)。在第0天，向两组C57BL/6小鼠(n＝5只/组)，SQ接种2×105个TC-1肿瘤细胞到右肋下区域中。在第1、8和14天，通过SQ注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP(载体对照)或1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，来处理小鼠。监测所有小鼠的肿瘤大小，且计算肿瘤体积。用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫的小鼠，从第12天开始，比对照小鼠具有显著小的肿瘤(p<0.01)，且在实验其余部分仍保持显著小肿瘤(p<0.02)，包含3/5的小鼠显示完全肿瘤消退。来自载体对照处理组的小鼠中的肿瘤，从第26天开始，开始达到安乐死阈值，且在第33天，将这个组中的所有小鼠安乐死，而Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7处理组中的小鼠均存活，在第36天实验结束时，具有小肿瘤(<150mm3)的完全肿瘤消退。
为了测定用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法对于较大肿瘤是否有效，在两组C57BL/6小鼠(n＝4只/组)中，植入TC-1肿瘤细胞，且随后在肿瘤植入后在肿瘤为小的但可触知时，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7每周延迟治疗6天。在第6天开始治疗的小鼠首先表明类似于对照组的肿瘤生长；然而，在第16天开始治疗的小鼠，观测到肿瘤消退。在第6天开始治疗的小鼠中的肿瘤比在第20天开始治疗的对照组的显著小(p<0.05)，且3/4小鼠到第27天具有完全消退。在第6天开始Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7施用还赋予显著的存活益处(p<0.01)。
最后，为了测定用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法对于建立的大型肿瘤是否有效，在两组C57BL/6小鼠(n＝4只/组)中，植入TC-1肿瘤细胞，随后直到肿瘤植入后13天在肿瘤为～100mm3时，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7每周延迟治疗。在这个处理组中，观测到类似于对照组的初始肿瘤生长，但对照组中的一些小鼠在第23天达到安乐死标准，这阻止在进一步时间点的显著性分析。然而，到第29天(在所述时间点，来自载体对照组中的所有小鼠的肿瘤均已超过1500mm3且进行安乐死)，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7处理组中的肿瘤体积低于安乐死阈值。这些结果指示，在TC-1肿瘤模型中，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫治疗剂为肿瘤生长的强力抑制剂，且引起显著总存活益处；然而，仅当在较小肿瘤中开始治疗时，观测到肿瘤完成清除。此外，这些结果表明，尽管肿瘤细胞上存在免疫抑制PDL1，但用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫治疗性治疗引起肿瘤生长的显著抑制。
实例2
对于HPV E6和HPV E7的免疫反应的诱导
本实例描述Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7产品的用途，其用于诱导对于HPV E6和HPV E7的免疫反应，以用于治疗HPV E6/E7表达肿瘤。
HPV E6/E7表达肿瘤的治疗
此前，研究免疫疗法治疗在携带HPV E6/E7TC-1肿瘤的小鼠中的抗肿瘤效果。这些肿瘤细胞表达PDL1，如通过流式细胞分析评定的。当用PE缀合的抗PDL1标记时，TC-1细胞的中值荧光强度(MFI)为537；而用PE缀合的同型对照抗体标记的细胞的MFI为184，这表明TC-1细胞表面上存在免疫抑制PDL1。在第0天，向两组C57BL/6小鼠(n＝5只/组)，SQ接种2×105个TC-1肿瘤细胞到右肋下区域中。在第1、8和14天，通过SQ注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-nullVP(载体对照)或1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，来处理小鼠。监测所有小鼠的肿瘤大小，且计算肿瘤体积。用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫的小鼠从第12天开始比对照小鼠具有显著小的肿瘤(p<0.01)，且在实验其余部分仍保持显著较小肿瘤(p<0.02)，包含3/5的小鼠显示完全肿瘤消退(图1A)。来自载体对照处理组的小鼠中的肿瘤从第26天开始开始达到安乐死阈值，且在第33天，将这个组中的所有小鼠安乐死，而Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7处理组中的小鼠均存活，在第36天实验结束时，具有小肿瘤(<150mm3)的完全肿瘤消退(图1B)。
为了测定用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法对于较大肿瘤是否有效，在两组C57BL/6小鼠(n＝4只/组)中，植入TC-1肿瘤细胞，且随后在肿瘤植入后在肿瘤为小的但可触知时，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7每周延迟治疗6天。在第6天开始治疗的小鼠首先表明类似于对照组的肿瘤生长；然而，在第16天开始治疗的小鼠，观测到肿瘤消退(图2A)。在第6天开始治疗的小鼠中的肿瘤比在第20天开始治疗的对照组的显著小(p<0.05)，且3/4小鼠到第27天具有完全消退。在第6天开始的Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7施用还赋予显著的存活益处(p<0.01)(图2B)。
最后，为了测定用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法对于建立的大型肿瘤是否有效，在两组C57BL/6小鼠(n＝4只/组)中，植入TC-1肿瘤细胞，随后直到肿瘤植入后13天在肿瘤为～100mm3时，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7每周延迟治疗。在这个处理组中，观测到类似于对照组的初始肿瘤生长，但对照组中的一些小鼠在第23天达到安乐死标准，这阻止在进一步时间点的显著性分析(图3A)。然而，在第29天(在所述时间点，来自载体对照组中的所有小鼠的肿瘤均已超过1500mm3且进行安乐死)，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7处理组中的肿瘤体积低于安乐死阈值(图3B)。这些结果指示，在TC-1肿瘤模型中，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫治疗剂为肿瘤生长的强力抑制剂，且引起显著总存活益处；然而，仅当在较小肿瘤中开始治疗时，观测到肿瘤完成清除。此外，这些结果表明，尽管肿瘤细胞上存在免疫抑制PDL1，但用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫治疗性治疗引起肿瘤生长的显著抑制。
与免疫检查点抑制的组合免疫疗法
为了测定Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的治疗效果在大型肿瘤的情况中是否可以改进，共施用抗PD-1抗体。在第0天，向四组小鼠(n＝7只/组)植入2×105个TC-1肿瘤细胞，且从第10天开始，小鼠每周接受SQ施用1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP加IP施用100μg抗PD-1抗体、1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP加100μg抗PD-1抗体、1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP加100μg大鼠IgG2a同型对照抗体、或1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP加100μg大鼠IgG2a同型对照抗体。随着时间推移监测肿瘤大小，且当肿瘤大小超过1500mm3时或当存在肿瘤溃疡时，将小鼠安乐死。接受Ad5[E1-、E2b-]-null加100μg大鼠IgG2a同型对照抗体的对照小鼠(图4A)和用Ad5[E1-、E2b-]-null加100μg抗PD-1抗体处理的小鼠(图4B)，呈现相似的肿瘤生长模式。在这两个组之间，未观测到显著存活益处。相较于对照，接受Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加大鼠IgG2a同型对照抗体的小鼠具有延迟的肿瘤生长模式，且所述小鼠中的2只在肿瘤植入后第52天具有基线水平附近的肿瘤消退(图4C)。接受Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和抗PD-1抗体的4/7小鼠从第25天开始具有肿瘤消退，且这些小鼠中的两只在第53天实验结束时产生肿瘤清除(图4D)。
用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加大鼠IgG2a同型对照抗体处理的小鼠(图5)还经历存活益处，其中在研究终止时，28.6％的动物存活，而100％的对照小鼠(Ad5[E1-、E2b-]-null加大鼠IgG2a同型对照抗体)和Ad5[E1-、E2b-]-null加抗PD-1抗体处理的小鼠，分别到第28和32天终止(图5)。用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和抗PD-1抗体两者处理的小鼠具有最大的治疗益处(图5)，表明相较于对照，延迟的肿瘤生长和存活率显著提高(P≤0.0006)。
通过第二注射(端点抗体滴度1:200，通过ELISA，数据未显示)大鼠抗PD-1抗体，诱导小鼠抗大鼠IgG抗体反应，且这些反应通过第三注射(端点抗体滴度1:4000到1:8000，通过ELISA，数据未显示)大大增强。这个抗大鼠抗体反应可解释为何在注射单独抗PD-1抗体之后未观测到抗肿瘤活性。另外，有可能的是，结合Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫疗法的第一和可能第二注射抗PD-1抗体有效，但第三注射抗PD-1抗体通过诱导的小鼠抗大鼠IgG抗体反应被有效地中和。
在组合免疫疗法之后的肿瘤微环境
为了分析有助于Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7处理的小鼠中的延迟肿瘤生长和存活的细胞群体，通过流式细胞测量术分析肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。向四组小鼠植入2×105个TC-1细胞，且开始治疗10天后，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加PD-1抗体每周两次免疫。在第27天，收集整个肿瘤，且如材料和方法中所描述进行加工。相较于接受Ad5[E1-、E2b-]-null的组，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7处理的组中的每毫克肿瘤的浸润性CD8+T细胞的数量显著增加(图6C)。抗PD-1抗体治疗对于浸润性CD8+T细胞的数量具有极少效果或没有效果(图6C)。在每毫克肿瘤的浸润性Treg(CD4+CD25+Foxp3+)的数量方面，在四个组中的任意之间无差异(图6B)。然而，当小鼠用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗加抗PD-1抗体治疗处理时，CD8+T细胞增加引起肿瘤微环境中的Treg:CD8+T细胞比率降低(图6A)。
为了进一步研究抗PD-1抗体与Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫疗法的协同/相加效应，检查TIL上PD-1、LAG-3和CTLA-4的表达。已显示肿瘤微环境内T细胞上这些共抑制性分子的表达下调抗原特异性T细胞的活化。用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加对照抗体治疗的免疫显著地增加PD-1+和LAG-3+CD8+TIL的分数，而CD4+TIL上的这些共抑制性分子的表达不受该治疗影响。表达CTLA-4的CD4+和CD8+TIL的百分比不受疫苗治疗显著影响(数据未显示)。相比于来自用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加对照抗体处理的小鼠的肿瘤中发现的那些，将抗PD-1抗体注射与Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗治疗组合引起PD-1+CD8+和CD4+TIL的分数显著降低(对于CD8+TIL，p＝0.0083；和对于CD4+TIL，p＝0.0016)。此外，PD-1+CD8+TIL的分数降低到在Ad5[E1-、E2b-]-null处理的对照组中观测到的表达水平，且PD-1+CD4+TIL的分数显著地降低到低于在对照组中观测到的(p＝0.0016，图7A)。另外，当Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫与抗PD-1抗体组合时，还观测到LAG-3+CD8+TIL的百分比降低(p＝0.0363，图7B)。由于先前已显示，疫苗治疗可增强离体肿瘤细胞上的PDL1表达，因此检查肿瘤细胞上PDL1的表达。在疫苗治疗之后，肿瘤细胞上PDL1的中值荧光强度增强。然而，在用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和抗PD-1抗体的组合处理的小鼠中，PDL1表达降低——尽管这个水平仍显著地表示高于在Ad5[E1-、E2b-]-null处理的对照小鼠中观测到的。
总之，数据表明，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7可以以剂量依赖性方式诱导针对HPV E6/E7的CMI反应，这使得肿瘤细胞上的PDL1上调。在肿瘤携带小鼠中，用最高剂量的疫苗进行多次同源免疫引起显著的抗肿瘤活性和存活率增加，特别是在携带小肿瘤的小鼠中。重要的是，在具有大型肿瘤的小鼠中，当将用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法与抗PD-1抗体组合时，实现更大程度的抗肿瘤活性。总体来说，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的免疫与抗PD-1抗体组合使得具有较少穷尽性/无反应性表型的CD8+和CD4+效应子群体增加，且因此促进肿瘤微环境中向更高促炎性状态的平衡。组合治疗与大型肿瘤质量降低相关联的观测指示，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法与抗PD-1抗体组合可增加在患有HPV相关头颈癌或宫颈癌的个体的免疫疗法期间的临床效果。此外，数据表明，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的临床试验应与免疫途径检查点调节剂组合，且保持高优先级。
实例3
Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的临床试验
本实例描述用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的免疫，在16型人乳头瘤病毒(HPV-16)阳性的个体中，在患有HPV相关头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的个体中和在患有HPV相关宫颈癌的个体中的安全性和免疫原性的评价。
HNSCC患者中的目前干预包含用顺铂与放疗或西妥昔单抗(cetuximab)与放疗的疗法。然而，许多最初反应或并不反应的HNSCC患者最终复发。疫苗设计成诱导针对HPV的早期6(E6)和早期7(E7)基因的抗肿瘤T细胞介导的免疫反应。疫苗的一个重要特征是其可与化疗/放疗治疗组合。
疫苗的主链为腺病毒血清型5(Ad5)载体，其已通过去除E1、E2b和E3基因和插入经修饰融合的非致癌HPV E6/E7基因进行修饰。所得重组复制缺陷型载体可仅在最新工程改造的基于专属人293的细胞系(E.C7)中繁殖，所述细胞系以反式供应载体生产所需的E1和E2b基因功能。
未对于此方案提出基因转移插入；该产品以游离型起作用且保持游离型。
疫苗产品用于在个体中以安全和有效方式诱导HPV E6/E7特异性细胞介导的免疫反应。进行空心标记的剂量递增临床研究，以评价Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗注射的安全性和免疫原性。待评价的剂量水平为5×1010、1×1011和5×1011个病毒颗粒(VP)的Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗。个体参与到连续增加剂量水平中，所述剂量水平包含三(3)组监测剂量限制性毒性(DLT)的个体。通过每3周SQ注射，给予每个个体Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗，3次免疫。在组中的所有个体已在接受其最后剂量的疫苗之后至少3周进行研究问诊之后，针对剂量递增，进行DLT的评定。
表达HPV E6/E7的Ad5主链用于对HPV-16+和处于发展HPV+癌症高风险下或患有HPV+癌症的个体，进行免疫(疫苗接种)。个体为动物，如人、非人灵长类动物(例如恒河猴或其它猕猴类型)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠或家禽。
在Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗接种之后的CMI反应的诱导，如通过流式细胞术评定的
为了通过流式细胞测量术评定在用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7多次同源免疫之后的CMI诱导，以2周间隔，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，SQ免疫C57BL/6小鼠组(n＝5只/组)三次。在最后免疫之后两周，将脾细胞暴露于HPV E6/E7肽或无关抗原，且通过流式细胞测量术分析IFN-γ和/或TNFα表达T细胞的数量。如图11中所显示，由于用最高剂量的Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7进行多次同源免疫，IFN-γ和/或TNFα表达T细胞均被诱导。特异性研究揭示CMI反应对HPV E6和E7具有特异性，且无针对无关抗原(如SIV-vif或SIV-nef)的反应。
毒理学
进行广泛临床前毒理学研究，以评定Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7在SQ注射后于C57BL/6小鼠中的毒性。评定在注射后不同时间点的毒性端点。在第1、22和43天，以与用于考虑身体质量差异的临床试验一致的剂量，向动物施用上至3次SQ注射媒介物对照或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7。评估由以下组成：对于体重的效果、体重增加、食物消耗病理学、血液血液学分析、血液化学分析和关于凝血时间的测试。
用单独疫苗对所建立的HPV E6/E7表达肿瘤的治疗
评价体内用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7治疗所建立的HPV E6/E7表达肿瘤的效果。在第0天，向C57BL/6小鼠，SQ植入106个HPV E6/E7表达肿瘤细胞到右肋下中。到第4-6天，肿瘤为可触知的。在第6、13和20天，通过SQ注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP(空白载体对照)或1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，来处理小鼠。监测所有小鼠的肿瘤生长，且计算肿瘤体积。如图12中所显示，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫的小鼠具有比对照小鼠显著小的肿瘤(p<0.01)。这些结果表明，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7载体平台具有用作治疗HPV E6/E7表达肿瘤的免疫治疗剂的可能。
用疫苗和化疗/放疗治疗对所建立HPV E6/E7表达肿瘤的治疗
评价体内用Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ与化疗/放疗治疗组合治疗HPV16E6/E7表达肿瘤的效果。在第0天，向C57BL/6小鼠SQ植入106个HPV16E6/E7表达肿瘤细胞。通过在第7、14、和21天的免疫疗法与在第13、20和27天的顺铂/放疗治疗组合，处理所建立的HPV16-E6Δ/E7Δ表达肿瘤。通过注射Ad-null(空白载体对照)与顺铂/放疗治疗组合，来处理对照肿瘤携带小鼠。如图13中所显示，相比于接受治疗Ad5[E1-、E2b-]-null和化疗/放疗的对照小鼠，使用Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ和化疗/放疗的组合治疗引起存活时间显著延长。这些结果显示疫苗免疫疗法可与化疗/放疗治疗组合，且这种组合在HPV16E6/E7表达癌症的小鼠模型中得到显著更高的存活延长。
根据这些结果，在鼠类模型中研究用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7和顺铂/放疗治疗的组合免疫与单独顺铂/放疗治疗对于免疫反应的效果。相较于用单独Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的免疫，Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ免疫加顺铂/放疗治疗的组合，引起诱导更高的CMI反应(图14)。这些结果指示，免疫疗法可与化疗治疗组合，以便实现更高的抗肿瘤CMI反应。
总之，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7为靶向HPV E6和HPV E7、诱导稳健免疫反应的非致癌疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7，在ELISpot和流式细胞测量术研究评定的小鼠中，诱导针对HPV E6/E7的强效CMI。Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7，在HPV E6/E7表达癌症的鼠类模型中，显著抑制所建立肿瘤的进展。用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法与化疗/放疗治疗组合，可在肿瘤携带小鼠中，显著地增加存活。目标是为了进一步研究这种新颖Ad5载体系统，其克服用其它Ad5系统存在的屏障，且临床测试这种疫苗，以确定在已免疫(接种)个体中诱导出显著针对HPV E6/E7的免疫反应。这个临床研究的结果确立使用这种新Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的安全性和免疫原性。
实例4
含有HPV E6和/或HPV E7激动剂表位变体的Ad5载体的产生和评价
本实例显示，以类似方式，构建和评价含有不同激动剂表位的Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7产品。在实例4-6中，使用这些载体。
病毒构建
Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗为腺病毒血清型5(Ad5)载体，其已通过去除E1、E2b和E3基因和插入经修饰的HPV E6和/或HPV E7基因进行修饰，所述经修饰的HPV E6和/或HPV E7基因具有带有以下中所阐述的编码序列的激动剂表位变体：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:18、SEQID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:21。
另外，Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗为腺病毒血清型5(Ad5)载体，其已通过去除E1、E2b和E3基因和插入经修饰的HPV E6和/或HPV E7基因进行修饰，所述经修饰的HPV E6和/或HPV E7基因编码以下序列中所阐述的HPV抗原：(1)SEQ ID NO:8(具有E6A1表位的HPV16E6)和SEQ ID NO:12(具有E7A3表位的HPV16E7)；(2)SEQ ID NO:9(具有E6A3表位的HPV16E6)和SEQ ID NO:12(具有E7A3表位的HPV16E7)；和(3)SEQ ID NO:10(具有E6A1+E6A3表位的HPV16E6)和SEQ ID NO:12(具有E7A3表位的HPV16E7)。以下序列中的任一者(其编码HPVE6或HPV E7抗原)单独使用，或将任何HPV E6序列与任何HPV E7序列组合，以获得E6/E7疫苗：SEQ ID NO:18(具有E6A1表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:19(具有E6A3表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:20(具有E6A1和E6A3表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:21(具有E7A3表位的HPV16E7)、SEQ ID NO:13(具有JL的HPV16E6)、SEQ ID NO:8(具有NCI E6A1表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:9(具有NCI E6A3表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:10(具有E6A1和E6A3表位的HPV16E6)、SEQ ID NO:14(具有JL的HPV16E7)、SEQ ID NO:12(具有NCI E7A3表位的HPV16E7)、SEQ ID NO:15(HPV E6E7)、SEQ ID NO:2(具有E6A1和E7A3表位的HPV16E6E7)、SEQ ID NO:3(具有E6A3和E7A3表位的HPV16E6E7)、SEQID NO:4(具有E6A1、E6A3和E7A3表位的HPV16E6E7)。
简单来说，使用基于同源重组的方法，将转基因亚克隆到Ad5[E1-、E2b-]载体中，复制缺陷型病毒在E.C7包装细胞系中繁殖，CsCl2纯化，和测定E.C7细胞单层上表示为空斑形成单位(PFU)的感染性滴度。通过十二烷基硫酸钠(SDS)破坏和在260nm和280nm下的分光光度法，测定病毒颗粒(VP)浓度。采用Ad5[E1-、E2b-]-null(例如SEQ ID NO:14)作为载体对照，其为不具有转基因插入物的Ad5平台主链。
免疫和脾细胞制备
向雌性C57BL/6小鼠(n＝5只/组)，皮下(SQ)注射不同剂量的Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7、Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7或Ad5[E1-、E2b-]-null。剂量以25μL注射缓冲液(具有3％蔗糖的20mM HEPES)形式施用，且以14天间隔免疫小鼠三次。在最终注射之后十四天，收集脾和血清。将来自小鼠的血清冷冻在-20℃下，直到进行评价为止。通过破坏脾囊和轻轻地按压内含物通过70μm尼龙细胞过滤器，来生成脾细胞悬浮液。通过添加红细胞裂解缓冲液来裂解红细胞，且在裂解之后，在R10(RPMI 1640，其补充有L-谷氨酰胺(2mM)、HEPES(20mM)(Corning,Corning,NY)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/mL)和10％胎牛血清)中，洗涤脾细胞两次。通过ELISpot和流式细胞测量术，分析脾细胞的细胞因子产生。
酶联免疫吸附斑点(ELISpot)分析
通过ELISpot分析，使用如上文所描述制备的新鲜经分离小鼠脾细胞，测定HPV E6和HPV E7特异性干扰素-γ(IFN-γ)分泌T细胞。进行ELISpot分析。将跨越HPV E6和HPV E7的全编码序列的重叠肽库合成为具有11个氨基酸重叠的15聚体(且将冻干肽库溶解于DMSO中)。用衍生于E6或E7的库中的2μg/mL/肽的重叠15聚体肽刺激脾细胞(2×105个细胞)。用伴刀豆球蛋白A(Con A)以0.06μg/孔的浓度作为阳性对照刺激细胞。衍生于SIV-Nef(AIDSResearch and Reference Reagent Program,Division of AIDS,NIAID,NIH)的重叠15聚体完全肽库用作无关肽对照。使用免疫斑点ELISpot板读取器，测定斑点形成细胞(SFC)的数量，且结果报告为SFC数量/106个脾细胞。
胞内细胞因子刺激
如以上关于ELISpot分析所描述的，制备脾细胞。在96孔U形底板中，使用106个活脾细胞/孔，进行刺激分析。通过以下来刺激R10培养基中的脾细胞：在37℃、5％CO2下，以2μg/mL/肽，添加HPV E6、HPV E7或SIV-Nef肽库，持续6h，以及在温育开始之后两小时，添加蛋白质转运抑制剂(GolgiStop,BD)。对已刺激的脾细胞进行淋巴细胞表面标记CD8α和CD4染色，用多聚甲醛固定，经通透，且进行胞内积聚的IFN-γ和TNF-α染色。针对小鼠CD8α(克隆53-6.7)、CD4(克隆RM4-5)、IFN-γ(克隆XMG1.2)和TNF-α(克隆MP6-XT22)的荧光缀合抗体购自BD，且在存在抗CD16/CD32(克隆2.4G2)的情况下进行染色。使用Accuri C6流式细胞仪(BD)来进行流式细胞测量术，且使用BD Accuri C6软件进行分析。
肿瘤免疫疗法
对于体内肿瘤免疫疗法研究，向8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠，在左侧腹，SQ植入2×105个TC-1HPV E6/E7表达肿瘤细胞。以7天间隔，用SQ注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，处理小鼠三次。根据相同方案，向对照小鼠注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP。在组合研究中，在免疫同时，向小鼠IP给予100μg大鼠抗PD-1抗体(克隆RMP1-14)或同型大鼠对照抗体(克隆2A3)。大鼠抗PD-1抗体和大鼠IgG2a同型对照抗体购自BioXcell。通过两个相对尺寸(a，b；例如a＝肿瘤宽度且b＝肿瘤长度)来测量肿瘤大小，且根据式V＝(a2×b)/2来计算体积，其中a为较短尺寸。当肿瘤达到1500mm3时，或当肿瘤变成溃疡时，将动物安乐死。
通过流式细胞测量术对肿瘤浸润性细胞(TIL)的分析
在第0天，向四组8-10周龄雌性C57BL/6小鼠(n＝5只/组)，在左侧腹，SQ植入2×105个TC-1肿瘤细胞。这些组中的两个组用1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP载体对照SQ免疫，且另外两组用1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP疫苗SQ免疫。自第12天开始，以7天间隔，施用这些免疫两次。除免疫以外，还向一个Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7组和一个Ad5[E1-、E2b-]-null组中的小鼠，在第12和16天，SQ施用100μg大鼠抗PD-1抗体(克隆RMP1-14)，且在第19和23天，施用100μg仓鼠抗PD-1抗体(克隆J43)，以增加抗PD-1抗体的有效剂量。为了用这些免疫途径检查点调节剂治疗的对照，在同一天，向剩余Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7组和Ad5[E1-、E2b-]-null组中的小鼠，施用相关大鼠和仓鼠对照IgG抗体。仓鼠抗PD-1抗体和同型对照购自BioXcell。在第27天，测量肿瘤，切除且称重。将肿瘤剁碎，且在室温下，用在汉克氏(Hank's)平衡盐溶液(HBSS)中的胶原蛋白酶IV(1mg/ml)、玻尿酸酶(100μg/ml)和DNA酶IV(200U/ml)的混合物消化30min，且在80rpm下旋转。酶购自Sigma-Aldrich。在消化之后，将肿瘤悬浮液放入通过70μm尼龙细胞过滤器，且离心。红细胞通过添加红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)来去除，且在裂解之后，在含有1％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤肿瘤悬浮液两次，并再悬浮于荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液(PBS，pH 7.2，1％胎牛血清和2mM EDTA)中，以进行染色。针对CD45(30-F11)、CD4(RM4-5)和PDL1(MIH5)的荧光缀合抗体购自BD。针对CD8β(H35-17.2)、CD25(PC61.5)、FoxP3(FJK-16s)、PD-1(RMP1-30)、LAG-3(C9B7W)和CTLA4(UC10-4B9)的荧光缀合抗体均购自eBioscience。在4℃下，在含有抗CD16/CD32抗体(克隆2.4G2)的100μL FACS缓冲液中，进行表面染色30分钟。已染色细胞在FACS缓冲液中洗涤，用多聚甲醛固定，和在100μL含有抗CD16/CD32抗体(克隆2.4G2)的通透缓冲液中，于4℃下，用荧光缀合的抗FoxP3抗体或抗CTLA4抗体染色60分钟之前，在通透缓冲液(eBioscience)中通透(如果需要)。细胞用通透缓冲液洗涤，洗回FACS缓冲液中，且通过流式细胞测量术使用BD Accuri C6流式细胞仪，分析固定体积的各样本。肿瘤细胞定义为包含小细胞和大型细胞的散射门中的CD45-事件。CD4+TIL定义为淋巴细胞散射门中的CD45+/CD4+事件。CD8+TIL定义为淋巴细胞散射门中的CD45+/CD8β+事件。调节性T细胞(Treg)定义为淋巴细胞散射门中的CD45+/CD4+/CD25+/FoxP3+事件。效应CD4+T细胞定义为淋巴细胞散射门中的CD45+/CD4+/CD25-/FoxP3-事件。同型匹配的对照抗体用于测定FoxP3、PDL1、PD-1、LAG-3和CTLA4的阳性表达。使用Accuri C6流式细胞仪(BD)来进行流式细胞测量术，且在BD Accuri C6软件中进行分析。
通过Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7诱导的HPV E6/E7特异性细胞介导的免疫反应
进行研究，以测定增加剂量的Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫对于诱导小鼠中的CMI反应的效果。以14天间隔，用108、109或1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，SQ免疫C57BL/6小鼠组(n＝5只/组)三次。对照小鼠接受108个、109个或1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP(空白载体对照)。在最后免疫之后两周，通过ELISpot分析，评定IFN-γ分泌细胞的脾细胞CMI反应。还测定用1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP免疫的小鼠中的CD8α+和CD4+脾细胞两个群体中的IFN-γ和TNF-α的胞内积聚。
HPV E6/E7表达肿瘤的治疗
研究免疫疗法治疗在携带HPV E6/E7TC-1肿瘤的小鼠中的抗肿瘤效果。在第0天，向两组C57BL/6小鼠(n＝5只/组)，SQ接种2×105个TC-1肿瘤细胞到右肋下区域中。在第1、8和14天，通过SQ注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP(载体对照)或1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP，来处理小鼠。监测所有小鼠的肿瘤大小，且计算肿瘤体积。
为了测定用Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法针对较大肿瘤是否有效，向两组C57BL/6小鼠(n＝4只/组)植入TC-1肿瘤细胞，且随后在肿瘤植入后在预期肿瘤为小的但可触知时，用Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7每周延迟治疗6天。
最后，为了测定用Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7的免疫疗法针对所建立的大型肿瘤是否有效，向两组C57BL/6小鼠(n＝4只/组)植入TC-1肿瘤细胞，随后直到肿瘤植入后第13天在预期肿瘤为～100mm3时，用Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7每周延迟治疗。
实例5
对于HPV E6和/或HPV E7激动剂表位变体的免疫反应的诱导
本实例显示可以以类似方式评价含有不同激动剂表位的Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7产品诱导免疫治疗性反应的能力。
在组合免疫疗法之后的肿瘤微环境
为了分析有助于Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7处理小鼠中的延迟肿瘤生长和存活的细胞群体，通过流式细胞术评定肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。向四组小鼠植入2×105个TC-1细胞，且开始治疗10天后，用Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7加抗PD-1抗体每周两次免疫。在第27天，收集整个肿瘤，且如材料和方法中所描述进行加工。
为了进一步研究抗PD-1抗体与Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7免疫疗法是否存在协同/相加效应，检查TIL上PD-1、LAG-3和CTLA-4的表达。
实例6
HPV E6和/或HPV E7激动剂表位变体疫苗的临床试验
本实例描述使用含有不同激动剂表位的Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7产品评价相关免疫，在16型人乳头瘤病毒(HPV-16)阳性的个体中、在患有HPV相关头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的个体中和在患有HPV相关宫颈癌的个体中的安全性和免疫原性。
HNSCC患者中的目前干预包含用顺铂与放疗或西妥昔单抗(cetuximab)与放疗的疗法。然而，许多最初反应或并不反应的HNSCC患者最终复发。Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗设计成诱导针对HPV的早期6(E6)和早期7(E7)基因的抗肿瘤T细胞介导的免疫反应。Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的一个重要特征是其可与化疗/放疗治疗组合。
所得重组复制缺陷型载体可在最新工程改造的基于专属人293的细胞系(E.C7)中繁殖，所述细胞系以反式供应载体生产所需的E1和E2b基因功能。
Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗产品用于在个体中以安全和有效方式诱导HPV E6和/或HPV E7特异性细胞介导的免疫反应。进行空心标记的剂量递增临床研究，以评价Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗注射的安全性和免疫原性。待评价的剂量水平为5×1010、1×1011和5×1011个病毒颗粒(VP)的Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7。个体参与到连续增加剂量水平中，所述剂量水平包含三(3)组监测剂量限制性毒性(DLT)的个体。通过每3周SQ注射，向每个个体给予Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗，3次免疫。在组中的所有个体已在接受其最后剂量的疫苗之后至少3周进行研究问诊之后，针对剂量递增，进行DLT的评定。
个体为动物，如人、非人灵长类动物(例如恒河猴或其它猕猴类型)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠或家禽。
在Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗接种之后的CMI反应的诱导，如通过流式细胞术评定的
为了通过流式细胞测量术评定在用Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗多次同源免疫之后的CMI诱导，以2周间隔，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP疫苗，SQ免疫C57BL/6小鼠(n＝5只/组)组三次。在最后免疫之后两周，将脾细胞暴露于HPV E6和/或HPV E7肽或无关抗原，且通过流式细胞测量术分析IFN-γ和/或TNFα表达T细胞的数量。
毒理学
进行广泛临床前毒理学研究，以评定在SQ注射之后，Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7激动剂表位变体疫苗在C57BL/6小鼠中的毒性。评定在注射后不同时间点的毒性端点。在第1、22和43天，以与用于考虑身体质量差异的临床试验中一致的剂量，向动物施用上至3次SQ注射媒介物对照或Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗。评估由以下组成：对于体重的效果、体重增加、食物消耗病理学、血液血液学分析、血液化学分析和关于凝血时间的测试。
用单独疫苗对所建立的HPV E6/E7表达肿瘤的治疗
评价体内用Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗治疗所建立的HPV E6和/或HPV E7表达肿瘤的效果。在第0天，向C57BL/6小鼠，SQ植入106个HPV E6和/或HPV E7表达肿瘤细胞到右肋下中。预期到第4-6天，肿瘤为可触知的。在第6、13和20天，通过SQ注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-null VP(空白载体对照)或1010个Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7VP疫苗，来处理小鼠。监测所有小鼠的肿瘤生长，且计算肿瘤体积。
这个临床研究结果确立，使用新Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7激动剂表位变体疫苗的安全性和免疫原性。
实例7
在HPV阳性个体中，Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的临床试验
本实例描述，用Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的免疫，在HPV阳性个体中消除或破坏HPV E6和/或HPV E7表达细胞的安全性和免疫原性的评价。
疫苗设计成诱导针对HPV的早期6(E6)和早期7(E7)基因的T细胞介导的免疫反应。疫苗的主链为腺病毒血清型5(Ad5)载体，其已通过去除E1、E2b和E3基因和插入经修饰融合的非致癌HPV E6/E7基因进行修饰。所得重组复制缺陷型载体可仅在最新工程改造的基于专属人293的细胞系(E.C7)中繁殖，所述细胞系以反式供应载体生产所需的E1和E2b基因功能。
疫苗产品用于在个体中以安全和有效方式诱导HPV E6和/或HPV E7特异性细胞介导的免疫反应。进行空心标记的剂量递增临床研究，以评价Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗注射的安全性和免疫原性。个体参与到连续增加剂量水平中，所述剂量水平包含三(3)组监测剂量限制性毒性(DLT)的个体。通过皮下注射，向每一个体给予Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗。在组中的所有个体已在接受其最后剂量的疫苗之后至少3周进行研究问诊之后，针对剂量递增，进行DLT的评定。表达HPV E6/E7的Ad5主链用于对HPV阳性的个体进行免疫(疫苗接种)。
还进行临床研究，以评定Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗在HPV阳性但未患HPV相关癌症的个体中消除或破坏HPV E6和/或HPV E7表达细胞的功效。个体参与通过皮下注射向他们给予Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的研究。监测个体，以评价对于抵抗HPV E6和E7基因的疫苗接种的时序性细胞和体液反应。
向个体疫苗接种本公开的Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗，以便消除或破坏HPV阳性个体中的HPV E6和/或HPV E7表达细胞。个体为动物，如人、非人灵长类动物(例如恒河猴或其它猕猴类型)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠或家禽。
实例8
Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7激动剂表位变体疫苗在HPV阳性个体中的临床试验
本实例描述使用含有不同激动剂表位的Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7产品评价相关免疫在HPV阳性的个体中消除或破坏HPV E6/E7表达细胞的安全性和免疫原性。
疫苗设计成诱导针对HPV的早期6(E6)和早期7(E7)基因的T细胞介导的免疫反应。疫苗的主链为腺病毒血清型5(Ad5)载体，其已通过去除E1、E2b和E3基因和插入经修饰融合的非致癌HPV E6/E7基因进行修饰。所得重组复制缺陷型载体可仅在最新工程改造的基于专属人293的细胞系(E.C7)中繁殖，所述细胞系以反式供应载体生产所需的E1和E2b基因功能。
Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗产品用于以安全和有效方式在HPV阴性的个体中诱导HPV E6和/或HPV E7特异性细胞介导的免疫反应。进行空心标记的剂量递增临床研究，以评价Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗注射的安全性和免疫原性。个体参与到连续增加剂量水平中，所述剂量水平包含三(3)组监测剂量限制性毒性(DLT)的个体。通过每3周SQ注射，向每一个体给予Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗，3次免疫。在组中的所有个体已在接受其最后剂量的疫苗之后至少3周进行研究问诊之后，针对剂量递增，进行DLT的评定。
还进行临床研究，以评定Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗在HPV阳性但未患HPV相关癌症的个体中消除或破坏HPV E6和/或HPVE7表达细胞的功效。个体参与通过皮下注射向他们给予Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗的研究。监测个体，以评价对于抵抗HPV E6和/或HPV E7基因的疫苗接种的时序性细胞和体液反应。
向个体疫苗接种本公开的Ad5[E1-、E2b-]-E6、Ad5[E1-、E2b-]-E7或Ad5[E1-、E2b-]-E6/E7疫苗，以便消除或破坏HPV阳性个体中的HPV E6和/或HPV E7表达细胞。个体为哺乳动物，如人或小鼠。
个体为动物，如人、非人灵长类动物(例如恒河猴或其它猕猴类型)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠或家禽。
实例9
I/Ib期研究：通过漱口液或宫颈刮片样本，评价Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ在HPV-16阳性的健康个体中的安全性和免疫原性
本实例描述I/Ib期试验，所述试验通过漱口液或宫颈刮片样本，评定Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ免疫在HPV 16阳性的健康个体中的安全性和免疫原性。该研究以两部分进行：第一部涉及使用6名患者递增设计的剂量递增；且第二部涉及扩展最大耐受剂量(MTD)或最高测试剂量(HTD)(和MTD或HTD-1)，以进一步评价安全性、初步功效和免疫原性。
在第一部分中，每一组相继参与6名个体。评定在以下剂量下个体的剂量限制性毒性(DLT)：组1：5×109个病毒颗粒(VP)；组2：5×1010个VP；以及组3：5×1011个VP。
当测定MTD或HTD时发生剂量扩展。额外28名个体参与试验的剂量扩展部分，总共46名个体。
上至46名个体参与该研究。在剂量递增部分中，在组1处开始相继参与6名个体。在剂量扩展部分(即，一旦确定MTD或HTD)中，额外28名个体参与，在MTD/HTD组中总共46名个体，以获得进一步安全性、初步功效和免疫原性数据。
个体纳入标准
基于以下标准中的一个或更多个，选择个体纳入研究中。个体为健康的；且年龄>18岁；已记录为HPV-16阳性，如通过漱口液或宫颈刮片所确定的；和/或具有适当血液学功能，如由白细胞(WBC)计数≥3000个/微升、血红蛋白≥9g/dL且血小板≥75,000个/微升所测量的，符合纳入该研究中。以下个体也符合纳入该研究中：具有适当肾和肝功能的个体，如由血清肌酐水平<2.0mg/dL、胆红素<1.5mg/dL(除吉伯特氏(Gilbert's)综合征以外，其将允许胆红素≤2.0mg/dL)和ALT和AST水平≤正常值上限的2.5倍所测量的；和无有生育可能或使用有效避孕的女性个体。
个体排除标准
基于以下标准中的一个或更多个，将个体排除在该研究外。以下个体无资格于该研究：个体，其患有自身免疫疾病、活动性肝炎、HIV感染或任何严重的间发慢性或急性病痛；孕妇和乳母；和/或个体，其目前正使用已知具有免疫抑制效果的任何药品(包含全身静脉内或口服皮质类固醇疗法)。以下个体也无资格于该研究：目前正参与使用研究性药物或装置的研究的个体；在研究开始前30天之内，已接受任何活病毒疫苗的个体；和/或具有宫颈非典型增生>CIN 1或涉及恶性疾病的口咽病变的个体。
研究设计
这是I/Ib期临床研究性研究，所述研究设计成测试Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ]疫苗产品在HPV-16阳性的健康个体中的给药、安全性和免疫原性。研究涉及最多三(3)个六(6)名患者的组，每一名患者在测试Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ疫苗的递增剂量的I期中。在Ib期中，测试额外患者，在MTD，上至总共20名，且在MTD-1，上至总共20名。
I期
对于组1，六名患者，以5×109个病毒颗粒(VP)的剂量，每3周，接受Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，3次免疫。个体的参与是错开的，使得每一名个体的第一次免疫与下一个体分隔至少1周，以允许监测前一名个体中的不良事件。在这个组中的最后一名患者已接受其最后剂量的疫苗之后至少2周，对于剂量递增，进行剂量限制性毒性(DLT)的评定。如果≤1/6DLT，那么患者开始参与到组2中。如果在前六名个体中，≥2/6DLT，那么重新评估该研究，包含进一步降低初始剂量的可能。
DLT定义为以下事件中的任一种。将以下个体分类为已经历DLT：呈现2级或更高的过敏性或即刻超敏反应、2级或更高的自身免疫毒性(除白癜风和与甲状腺相关的分离的实验室异常之外，不需要医学介入)和/或2级或更高神经毒性的个体。也将以下的任何个体分类为已经历DLT：呈现3级或4级主要器官毒性、3级(溃疡或坏死)或更高注射位点反应和/或4级发热。
对于组2，六名患者，以5×1010个VP的剂量，每3周，接受Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，3次免疫。个体的参与是错开的，使得每一名个体的第一次免疫与下一个体分隔至少1周，以允许监测前一名个体中的不良事件。在这个组中的最后一名患者已接受其最后剂量的疫苗之后至少2周，对于剂量递增，进行DLT的评定。如果≤1/6DLT，那么患者开始参与到组3中。如果≥2/6经历DLT，那么MTD定义为下一最低剂量(1号剂量水平)(5×109个VP)，且患者开始参与到在所述剂量水平下的1b期中。
对于组3，六名患者，以5×1011个VP的剂量，每3周，接受Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，3次免疫。个体的参与是错开的，使得每一名个体的第一次免疫与下一个体分隔至少1周，以允许监测前一名个体中的不良事件。在这个组中的最后一名患者已接受其最后剂量的疫苗之后至少2周，进行DLT的评定。如果≤1/6DLT，那么HTD定义为5×1011个VP，且患者开始参与到所述剂量水平(3号剂量水平)和下一较低剂量水平(2号剂量水平)的Ib期中。如果≥2/6经历DLT，那么MTD定义为下一较低剂量(2号剂量水平)(5×1010个VP)，且患者开始参与到在所述剂量水平(2号剂量水平)和下一较低剂量水平(1号剂量水平)下的1b期中。
如表4中所示，进行剂量递增。不允许患者内剂量递增。
表4-剂量水平
组 Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6<sup>Δ</sup>/E7<sup>Δ</sup>(VP)
1 5×10<sup>9</sup>
2 5×10<sup>10</sup>
3 5×10<sup>11</sup>
Ib期
在测定初始MTD或HTD之后，个体开始以两个最高耐受剂量组参与到两个扩展组中。总共20名个体参与2个特异性剂量水平中的每一个，这20名个体包含来自1期中的初始剂量递增的6名个体加来自1b期的另外14名个体。评定安全性、免疫原性和抗病毒活性。
对于组4，额外患者(N＝14)，以MTD/HTD(-1)，每3周，接受Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，3次免疫。如果≥4DLT(在所述特定剂量水平下的20名个体中)，那么这个组停止参与，且下一较低剂量开始参与(如果这个组为1号剂量水平，那么停止研究且重新评估)。
对于组5，额外患者(N＝14)，以MTD/HTD，每3周，接受Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，3次免疫。如果≥4DLT(在所述特定剂量水平下的20名个体中)，那么这个组停止参与，且现在下一较低剂量定义为MTD。
Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ
研究性产品为含有HPV16的非致癌早期6(E6)和早期7(E7)基因的非复制性重组腺病毒血清型(Ad5)，且被称作Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ。Ad5[E1-、E2b-]载体为非复制性的，且其基因组不整合到人基因组中。研究药物描述于表5中。
表5-研究性产品
Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ剂量制备和施用
待注射的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的剂量为5×109个VP(组1)/1mL、5×1010个VP(组2)/1mL或5×1011个VP(组3)/1mL。在注射之前，将适当小瓶从冷冻柜移出，且允许在受控室温(20-25℃，68-77℉)下解冻至少20分钟且不大于30分钟，此后其保持在2-8℃(35-46℉)下。
每一小瓶用橡胶塞密封，且具有白色翻盖密封。产品的终端用户用其拇指向上翻/翻开盖的白色塑料部分以将橡胶塞暴露，且随后用注射针头穿刺塞子以抽取液体。用铝卷曲密封件，将橡胶塞紧固到小瓶。
将已解冻小瓶涡旋，且随后使用无菌技术，药剂师使用1mL注射器，从适当小瓶抽取适当体积。
使用1到1/2英寸、20到25号针，尽快注射疫苗剂量。如果疫苗不能立即注射，那么将注射器送回药店，且根据机构政策和程序处置，且处置必须在研究性产品问责记录上记录。
小瓶中的疫苗于2-8℃(35-46℉)下的存储不超过8小时。一旦疫苗已解冻，其不能进行再冷冻。
对于5×1011个病毒颗粒的剂量制备，从小瓶抽取1mL内含物，注射位点用酒精准备，且进行通过SC注射向个体施用到大腿中而无需任何进一步操纵。
对于5×1010个病毒颗粒的剂量制备，使用1.0mL结核菌素注射器，从5.0mL 0.9％无菌生理盐水小瓶取出0.50mL流体，留下4.50mL。随后，使用另一1.0mL结核菌素注射器，从标记Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的小瓶取出0.50mL，且递送到在5mL无菌生理盐水小瓶中剩余的4.5mL无菌生理盐水中。通过将已稀释的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的5mL溶液倒置，来混合内含物。抽取1mL已稀释的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，注射位点用酒精准备，且进行通过SQ注射向个体施用到大腿中。
对于5×109个病毒颗粒的剂量制备，使用0.50mL结核菌素注射器，从5.0mL 0.9％无菌生理盐水小瓶取出0.05mL流体，留下4.95mL。随后，使用另一0.50mL结核菌素注射器，从标记Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的小瓶取出0.05mL，且递送到在5mL无菌生理盐水小瓶中剩余的4.95mL无菌生理盐水中。通过将5mL已稀释的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ倒置，来混合内含物。抽取1mL已稀释的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，注射位点用酒精准备，且进行通过SQ注射向个体施用到大腿中。
在第1天、第3周和第6周，施用Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，总共三次注射(图15)。在用酒精准备位点之后，所有疫苗注射均以1mL的体积通过SC注射给予到大腿中。任一条大腿用于初始注射。在与初始注射相同的大腿中给予随后注射，且相隔至少5cm。
治疗时段程序和评估
在第1天、第3周和第6周，施用Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，总共三次注射。所有研究药物施用治疗发生在计划问诊日的±7天内。当第一次施用研究药物时，个体视为在研究第1天参与。
在每一次注射之前，有生育可能的女性进行尿液妊娠测试。个体在第一次注射之后留在诊所最少30分钟，且在随后注射之后留30分钟，以允许评价生命体征和监测注射位点反应。对于第一次注射，在注射之后30分钟，评定生命体征。
向个体提供患者日志、直尺和温度计，以监测位点反应、温度和不良事件(Ae)。在每一次注射后72小时，临床医护人员通过电话联系个体，以评定任何全身性症状。
探索性药效动力学评定
在研究期间的特定时间点，抽取大致90mL个体的外周血液。如果在第6或9周存在免疫反应迹象，那么仅在第6或12月抽取血液(图15)。在初次免疫之后6个月和12个月(+/-1个月)时，个体进行重复宫颈刮片或漱口液HPV16测试。
样本分析
对于ELISpot分析，使用ELISpot分析来评定抗原特异性CMI和溶细胞T淋巴细胞(CTL)活性。通过用纯化的HPV16-E6Δ/E7Δ肽再刺激PBMC来评定T细胞针对HPV16-E6Δ/E7Δ的CMI活性，并且测定IFN-γ分泌斑点形成细胞(SFC)的数量。使用颗粒酶B ELISPOT分析来评定细胞针对HPV16-E6Δ/E7Δ的CTL活性，所述颗粒酶B ELISPOT分析为测量功能性CTL的可接受的测试。PBMC用纯化的HPV16-E6Δ/E7Δ肽再刺激，且测定颗粒酶B分泌斑点形成细胞(SFC)的数量。如果在减去阴性对照之后检测到每106个细胞有≥50SFC，且SFC比在阴性对照孔中观测到的那些高≥2倍，那么CMI反应视为阳性。在基线、在第3次免疫之后4周、和在第一次免疫之后6个月和12个月，测定每一组中的患者CMI反应。采用学生T测试和/或曼惠特尼(Mann-Whitney)测试(PRISM,Graph Pad)，进行比较在每一取样点的免疫反应(SFC的数量)的统计分析。
对于流式细胞测量术分析，为了评定CD4+和CD8+T细胞反应，使用流式细胞测量术和胞内细胞因子染色方法，分析来自个体患者的PMBC样本的IFN-γ和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达。简单来说，将106个PBMC细胞/孔与2.0μg/ml HPV16-E6Δ/E7Δ肽库、2.0μg/mlSIV nef阴性对照肽库或单独培养基一起温育6小时。添加蛋白质转运抑制剂(GolgiStop)，以进行最终4小时刺激。在刺激之后，对细胞进行CD4和CD8染色，固定，经通透，IFN-γ和TNF-α染色，且随后通过流式细胞测量术进行分析。采用学生T测试和/或曼惠特尼测试(PRISM,Graph Pad)，进行比较每一取样点的免疫反应(IFN-γ和/或TNF-α表达细胞百分比)的统计分析。
抗体反应：采用先前描述的定量ELISA技术，使用纯化的E6和E7蛋白，来测量针对HPV16-E6Δ/E7Δ的血清IgG抗体(Ab)反应，且测定Ad5中和抗体(NAb)并报告为端点Ad5NAb滴度的倒数。采用学生T测试和/或曼惠特尼测试(PRISM,Graph Pad)，进行比较每一取样点(基线、每一次免疫时、在第3次免疫之后3周)的免疫反应的统计分析。
统计效能假设
对于ELIspot CMI测定，假设最小活性为自基线PBMC样本(N＝20)50(±10SD)个斑点形成细胞(SFC)，以及对于在免疫期间和之后时间点获取的PBMC样本(N＝10)，最小增加到100(±25SD)个SFC，对于95％置信区间，统计效能为>99％(双尾测试(two-tailtest))。
对于流式细胞测量术研究，假设背景水平为自基线PBMC样本(N＝10)大致0.5％(±0.5SD)CD4+或CD8+IFN-γ和/或TNF-α表达淋巴细胞，以及对于在免疫期间和之后时间点获取的PBMC样本(N＝10)，最小增加到1.0％(±0.5SD)CD4+或CD8+IFN-γ和/或TNF-α表达淋巴细胞，对于95％置信区间，统计效能为88.5％(双尾测试)。
对于血清HPV16-E6Δ/E7Δ抗体测定，假设患者样本(N＝10)在基线血清样本中具有10纳克IgG当量的Ab/ml(±5SD)的现有抗体水平，且这些抗体水平在免疫期间和之后时间点获取的血清样本中，增加到至少15纳克IgG当量的Ab/ml(±5SD)，对于95％置信区间，统计效能为88.5％(双尾测试)。
对于Ad5中和抗体(NAb)测定，假设患者(N＝10)具有预存Ad5免疫，其中反向Ad5NAb滴度水平为200(±100SD)，且这些水平在免疫期间和之后时间点获取的血清样本(N＝10)中，增加到至少400(±100SD)，对于95％置信区间，统计效能为>99％(双尾测试)。
安全性分析
连续评价组中的DLT。在前一组中的最后一名个体已接受其第一次注射之后至少3周，进行是否递增到下一剂量水平的总体评定。如果以某一剂量水平处理的个体中<20％的个体经历DLT(即，0/3、≤1/6或≤4/20名个体)，那么剂量水平视为安全的。在研究的剂量递增部分中，评价在每一剂量水平下，在6名个体中的安全性。在研究的剂量扩增部分中，继续监测在MTD或HTD下处理的额外个体中的安全性。如果用至少一次注射处理，那么个体视为可进行安全性评价。观测DLT直到9周，以提供多次剂量的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的安全性评价。
通过在剂量组内的使用按等级的AE列表频率，使用CTCAE版本4.0的描述性分析来评定总体安全性；且对于总体研究群体就治疗中出现的AE、严重不良事件(SAE)和在安全性实验室测试、身体检查和生命体征的临床上显著变化，评估总体安全性。
探索性免疫反应分析
通过剂量组和总体，来评价具有阳性免疫反应个体的百分比。阳性免疫反应由离体刺激分析中的CMI反应性与流动式细胞测量术读数(细胞因子产生或CD107表达)限定。抗原特异性肽刺激(challenge)分析需要高于背景>250个反应性T细胞/百万细胞的读数。
评定在(MTD/HTD)下处理的20名个体、和在(MTD/HTD-1)下处理的20名个体(6名在剂量递增中，且14名在剂量扩展中)中的免疫反应。描述反应的幅度。如果个体接受至少三次注射，那么其视为可进行免疫反应评价。
功效分析
通过剂量组和总体，来测定和评价实现阴性HPV-16病毒PCR测试的个体的百分比。评价反应率的95％置信区间。
实例10
I期研究：评价Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ在患有HPV-16阳性鳞状细胞癌的个体中的安全性、耐受性
本实例描述使用Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ(其为编码经修饰的/融合非致癌HPV-E6/E7基因的腺病毒载体)评价Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ当每3周向16型HPV阳性的个体皮下施用三次注射时的安全性。此外，通过低温保存PBMC样本的ELISpot分析，评定Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ对于E6和E7特异性CMI反应的药效动力学(PD)，且使用总体反应率(ORR)、6月疾病控制率(DCR)、无进展存活(PFS)率和总存活(OS)率，来测定单独Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的功效。
这是对于在以下位点中的一个中患有HPV-16阳性鳞状细胞癌的个体的I期试验：宫颈、阴道、外阴、头/颈、肛门和阴茎。使用剂量递增3+3设计来进行研究，以评价安全性和耐受性。从剂量组1开始，三到6名个体相继参与。评定个体的剂量限制性毒性(DLT)：组1：5×1010个病毒颗粒(VP)；组2：5×1011个VP；若需要，剂量降递增组(组-1)：5×109个VP。
当已确定MTD或HTD时，发生1b期研究中的剂量扩展。上至12名个体参与研究。从组1开始，三到6名个体相继参与。
研究设计
这是在于以下部位患有组织学上或细胞学上确认的HPV阳性鳞状细胞癌的个体中的I期试验：宫颈、阴道、外阴、头/颈、肛门、阴茎。研究涉及使用标准调整的Fibonacci组3+3设计。治疗从DL1开始，如表4中所概述。不允许患者内剂量递增。
在这个剂量递增部分中，从剂量组1开始，3到6名个体相继参与(表6)。在每一组参与期间，在参与之间需要最少7天。这允许在处理下一名个体之前，在前一名个体中监测剂量限制性毒性(DLT)。连续监测DLT。对于研究设计以及处理和相关性生物标记的示意图，分别参见图16和图17。
表6-剂量水平
剂量水平(DL) 剂量(VP) 参与者数量
DL-1 5×10<sup>9</sup> 3-6
DL 1* 5×10<sup>10</sup> 3-6
DL 2 5×10<sup>11</sup> 6
*开始剂量
对在最后研究治疗之后4周(28天)内发生的事件可进行DLT评价。表7详述哪些事件视为DLT。
表7-DLT
Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ疫苗
研究性产品为含有HPV16的非致癌早期6(E6)和早期7(E7)基因的非复制性重组腺病毒血清型(Ad5)，且被称作Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ。研究药物具有Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ标识，且先前在表5中描述。Ad5[E1-、E2b-]载体为非复制性的，且其基因组不整合到人基因组中。
Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ剂量制备和施用
待注射的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的剂量为：5×109个VP(对于降递增组-1)/mL、5×1010个VP(组1)/mL或5×1011个VP(组2)/1mL。在注射之前，将适当小瓶从冷冻柜移出，且允许在受控室温(20-25℃，68-77℉)下解冻至少20分钟且不大于30分钟，此后其保持在2-8℃(35-46℉)下。
每一小瓶用橡胶塞密封，且具有白色翻盖密封。产品的终端用户用其拇指向上翻/翻开盖的白色塑料部分以将橡胶塞暴露，且随后用注射针头穿刺塞子以抽取液体。用铝卷曲密封件，将橡胶塞紧固到小瓶。
将已解冻小瓶涡旋，且随后使用无菌技术，药剂师使用1mL注射器，从适当小瓶抽取适当体积。
使用1到1/2英寸、20到25号针，尽快注射疫苗剂量。如果疫苗不能立即注射，那么将注射器送回药店，且根据机构政策和程序处置，且处置必须在研究性产品问责记录上记录。
小瓶中的疫苗于2-8℃(35-46℉)下的存储不超过8小时。一旦疫苗已解冻，其不能进行再冷冻。
对于5×1011个病毒颗粒的剂量制备，从小瓶抽取1mL内含物，注射位点用酒精准备，且进行通过SQ注射进行向个体施用到大腿中而无需任何进一步操纵。
对于5×1010个病毒颗粒的剂量制备，使用1.0mL结核菌素注射器，从5.0mL 0.9％无菌生理盐水小瓶取出0.50mL流体，留下4.50mL。随后，使用另一1.0mL结核菌素注射器，从标记Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的小瓶取出0.50mL，且递送到在5mL无菌生理盐水小瓶中剩余的4.5mL无菌生理盐水中。通过将已稀释的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的5mL溶液倒置，来混合内含物。抽取1mL已稀释的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，注射位点用酒精准备，且进行通过SQ注射向个体施用到大腿中。
对于5×109个病毒颗粒的剂量制备，使用0.50mL结核菌素注射器，从5.0mL 0.9％无菌生理盐水小瓶取出0.05mL流体，留下4.95mL。随后，使用另一0.50mL结核菌素注射器，从标记Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ的小瓶取出0.05mL，且递送到在5mL无菌生理盐水小瓶中剩余的4.95mL无菌生理盐水中。通过将5mL已稀释的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ倒置，来混合内含物。抽取1mL已稀释的Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，注射位点用酒精准备，且进行通过SQ注射向个体施用到大腿中。
在用酒精准备位点之后，所有疫苗注射，均以1mL的体积，通过SC注射给予到大腿中。任一条大腿用于初始注射。在与初始注射相同的大腿中给予随后注射，且相隔至少5cm。
治疗时段程序和评价
在第1、21和43天，施用Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ，三次注射。所有研究药物施用治疗应发生在计划问诊日的±2天内，除第1天以外。当施用研究药物时，个体视为在第1天参与。
个体在第一次注射之后留在诊所最少30分钟，以允许评价生命体征和监测注射位点反应。对于第一次注射，在注射30分钟之后，必须评定生命体征。
进行以下程序和评估，且记录在个体的源记录中：定向身体检查、生命体征和体重；ECOG性能情况评定、伴随药品审查、AE评定、临床实验室测试(化学：钠、氯化钾、碳酸氢盐、钙、镁、磷、葡萄糖、BUN、血清肌酐、ALT、AST、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白、白蛋白、和总胆红素与直接胆红素；血液学：具有差异的CBC和血小板与血红蛋白和红细胞压积；尿分析)、收集全血以用于探索性免疫分析，以及肿瘤成像和评定。在第65天且随后此后每12周(±7天)或更早(如果临床上指示)，进行肿瘤成像和评定。在初始记录的完全反应(CR)或部分反应(PR)之后至少4周(最少28天)，确认客观反应。记录且追踪目标病变和非目标病变。根据RECIST版本1.1，评定肿瘤反应。
探索性药效动力学评定
在研究期间和/或在指定注射之后的特定时间点，抽取大致90mL个体的外周血液，以评价研究药物对于免疫反应的效果。在每一次注射之前且在第三次注射之后大致3周(第65天)，总共4个时间点，完成抽血。对于PBMC样本，抽取六管10mL绿顶肝素钠管；对于血清样本，抽取两管8mL血清分离管。进行免疫评定，且包含ELISpot分析、基于流式细胞测量术的分析和血清分析。
对于PBMC的分析，使用胞内细胞因子染色分析，分析通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离的疗法前后的PBMC的抗原特异性免疫反应。体外用编码肿瘤相关抗原HER2的重叠15聚体肽库，刺激PBMC。对照肽库涉及使用人白细胞抗原肽作为阴性对照，且CEFT肽混合物作为阳性对照。CEFT为CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、流感病毒和破伤风毒素的肽的混合物。CD4和CD8T细胞的刺激后分析涉及IFN-γ、IL-2、肿瘤坏死因子和CD107a的产生。如果可获得足够的PBMC，那么还进行T细胞对其它肿瘤相关抗原的发展的分析。
还评价PBMC的标准免疫细胞类型(CD4和CD8T细胞、自然杀伤[NK]细胞、调节性T细胞[Treg]、骨髓衍生的抑制细胞[MDSC]和树突状细胞)以及123免疫细胞子集的变化。如果可获得足够的PBMC，那么分析来自所选择个体的PBMC的特定免疫细胞子集的功能，所述子集包含CD4和CD8T细胞、NK细胞、Treg和MDSC。
对于ELISpot分析，使用ELISpot分析来评定抗原特异性CMI和溶细胞T淋巴细胞(CTL)活性。通过用纯化的HPV16-E6Δ/E7Δ肽再刺激PBMC评定T细胞针对HPV16-E6Δ/E7Δ的CMI活性，并且测定IFN-γ分泌斑点形成细胞(SFC)的数量。使用颗粒酶B ELISPOT分析来评定细胞针对HPV16-E6Δ/E7Δ的CTL活性，所述颗粒酶B ELISPOT分析为测量功能性CTL的可接受的测试。PBMC用纯化的HPV16-E6Δ/E7Δ肽再刺激，且测定颗粒酶B分泌斑点形成细胞(SFC)的数量。使用先前描述的标准(17、18)，如果在减去阴性对照之后检测到每106个细胞有≥50SFC，且SFC比在阴性对照孔中观测到的那些高≥2倍，那么CMI反应视为阳性。在基线、在第3次免疫之后4周、和在第一次免疫之后6个月和12个月，测定每一组中的患者CMI反应。采用学生T测试和/或曼惠特尼(Mann-Whitney)测试(PRISM,Graph Pad)，进行比较在每一取样点的免疫反应(SFC的数量)的统计分析。
对于可溶因子的分析，分析在疗法前后的血清的以下可溶因子：可溶CD27、可溶CD40配体、和HPV E6抗体、HPV E7抗体、和其它肿瘤相关抗原抗体。使用定量ELISA技术，使用纯化的E6和E7蛋白，来测量对于HPV16-E6和/或HPV E7的血清IgG抗体(Ab)反应，且测定Ad5中和抗体(NAb)，并报告为端点Ad5NAb滴度的倒数。采用学生T测试和/或曼惠特尼测试(PRISM,Graph Pad)，进行比较每一取样点(基线、每一次免疫时、在第3次免疫之后3周)的免疫反应的统计分析。
探索性基因组学和蛋白质组学分子分析
通过下一代测序和基于质谱法的定量蛋白质组学，对于FFPE肿瘤组织和全血(个体匹配的针对肿瘤组织的正常比较剂)，进行探索性基因组学和蛋白质组学分子谱。对于此研究，要求收集肿瘤组织和全血。在基线时，获得肿瘤组织和全血。
需要单一FFPE肿瘤组织块，以用于提取肿瘤DNA、肿瘤RNA和肿瘤蛋白。需要全血样本，以用于提取个体正常DNA。肿瘤组织和全血在CLIA注册和CAP认可/CLIA认证的实验室中加工。表8描述分子谱的收集时间表。
表8-探索性分子谱的收集时间表
a在基线收集的全血仅用于基因组测序。在血液样品试剂盒中提供的1PAXgene血液DNA试管中，需要2.5mL个体的全血。
b在基线收集的FFPE组织块/切片用于基因组测序、RNA测序和蛋白质组分析。需要满足基因组学和蛋白质组学最小需求的单一块。根据当地病理学实验室程序收集FFPE组织块。
纳入标准
必须满足以下条件中的一个或更多个，以便个体符合纳入于该研究中。以下个体符合纳入于该研究中：个体，其具有以下类型中的一个的组织学上或细胞学上确认的HPV16阳性恶性疾病：宫颈、阴道或外阴、头颈部、肛门或阴茎的鳞状细胞癌；个体，其患有不可通过治愈性目的疗法(即，手术切除、化学放射治疗等)治疗的疾病；和/或个体，其患有进展性转移性或复发性疾病，用转移性/复发性情况中的至少1种先前疗法方案(其必须包含铂试剂)治疗。符合研究的个体还必须能够提供试验的书面知情同意书，且在签署知情同意当天，年龄必须≥18岁。患有可测量的疾病(如通过实体肿瘤中的反应评价标准(ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumors；RECIST)1.1所测定)的个体，也符合纳入于该研究中。
进一步符合标准包含：个体愿意提供来自最近获得的肿瘤病变核心或切除活检的组织(定义为参与前上至30天获得的样品)；个体愿意在治疗之后第65天(+7天)进行重复活检；和如果个体在ECOG性能量表上具有0或1的性能情况，那么个体符合条件。符合纳入于该研究中的个体展现充足的器官功能，如由以下所测量：白血球(WBC)≥2000个/μL、嗜中性粒细胞≥1500个/μL、血小板≥100×103个/μL、血红蛋白≥9.0g/dL、肌酐血清≥1.5×上限正常值(ULN)或肌酐清除(CrCl)≥40毫升/分钟(使用Cockcroft/Gault式)、AST≤3×ULN、和ALT≤3×ULN、总胆红素≤1.5×ULN(患有吉尔伯特综合征的个体除外，其可具有<3.0mg/dL的总胆红素)。
如果个体为女性且具有生育可能，那么个体应在接受第一剂量的研究药物治疗之前24小时内具有阴性尿液妊娠，以便符合纳入于该研究中。如果尿液测试为阳性或不能确认为阴性，那么将需要血清妊娠测试。具有生育可能的女性个体应愿意使用两种节育方法、或以手术方式绝育、或在研究过程直到最后一个剂量的研究药物治疗之后30天中放弃异性性活动，以便符合纳入条件。具有生育可能的个体为未以手术方式绝育或停经未>1年的那些个体。最后，如果个体为男性个体，且同意从开始第一剂量的研究疗法直到在最后一个剂量的研究疗法之后30天，使用适当的避孕方法，那么个体符合条件，以便被视为纳入于该研究中。
排除标准
以下情况为将个体排除在试验外的理由。在开始研究治疗的四周内，接受任何其它研究性试剂、化疗、免疫疗法、放疗或分子靶向剂的个体，不符合纳入于该研究中。患有视为可用局部疗法治愈的个体也无资格。进一步排除标准包含：目前参与在其中其接受研究疗法的研究，和/或在第一剂量治疗的四周内曾经参与研究疗法或使用研究性装置。
以下个体排除在临床试验外：诊断具有免疫缺陷的个体；或在第一剂量的试验治疗之前七天内，正接受全身性甾类疗法或任何其它形式的免疫抑制疗法的个体；或具有已知活动性TB(芽孢杆菌肺结核)病史的个体。以下患者也视为无资格纳入于这个试验中：在研究第1天之前四周内已具有先前抗癌单克隆抗体(mAb)的患者；或未从由于超过四周前所施用的试剂的不良事件恢复(即，≤1级或在基线)的患者。此外，以下个体排除在试验外：具有已知额外呈进展性或需要有效治疗的恶性疾病的个体(例外包含：皮肤基底细胞癌或皮肤鳞状细胞癌(已进行潜在治愈性疗法)或原位宫颈癌)；或具有已知活性中枢神经系统(CNS)癌转移和/或癌性脑膜炎的个体。患有CNS癌转移、用放疗治疗的参与者为符合条件的，只要其在参与之前完成放疗≥四周且在成像(用IV造影的头部CT，或MRI)上无记录的进展即可。这些参与者必须能够稳定——离开皮质类固醇(在参与之前至少2周，≥10mg或强的松(prednisone)或等效物)。
以下个体排除在试验外：患有在过去两年需要系统性治疗(即使用疾病调节剂、皮质类固醇或免疫抑制药物)的活性自身免疫疾病的个体。然而，替代治疗(例如用于肾上腺或垂体功能不全的甲状腺素、胰岛素或生理学皮质类固醇替代治疗等)不视为系统性治疗形式。以下个体排除在试验外：个体，其具有已知活性、非感染性局部肺炎(需要系统性疗法的活性感染)的病史或任何迹象；或个体，其具有可混淆试验结果、干扰个体参与试验全部持续时间的任何病状、疗法或实验室异常病史或其目前迹象；或个体，其在治疗研究者的观点上，不在对参与最感兴趣的个体中。如果个体具有将干扰与试验需求协作的已知精神或药物滥用病症；或如果其怀孕或哺乳；或期望在试验预计持续时间内(从筛选前或筛选问诊开始直到最后一个剂量的试验治疗之后120天)怀孕或生孩子，那么将他们排除。
最后，以下个体无资格纳入于这个临床试验中：个体，其具有已知人免疫缺陷病毒(HIV)(HIV-1/2抗体)病史、已知活性乙型肝炎(例如HBsAg反应性)或丙型肝炎(例如检测到HCV RNA[定性])；或个体，其在研究疗法计划开始30天内，已接受活疫苗。用于注射的季节性流感疫苗一般为灭活流感疫苗，且为允许的；然而，鼻内流感疫苗(例如)为活的减毒疫苗，且为不允许的。
统计学考虑
这是一种单臂I期研究，其被设计成使用如先前描述的标准经调整的Fibonacci组3+3设计，来测定Ad5[E1-、E2b-]-HPV16-E6Δ/E7Δ在患有顽固性晚期/转移性HPV+恶性疾病(宫颈、外阴、阴道、肛门、阴茎和头颈部的鳞状细胞癌)的患者中的R2PD和不良事件谱。R2PD为总体估计的，且对疾病类型不具有特异性。
样本大小是基于每一剂量递增组中需要的参与者的数量。基于DL，可包含最少9名参与者和最大12名参与者。
安全性分析
连续评价组中的DLT。在前一组中的最后一名个体已接受其第一次注射之后至少3周，进行是否递增到下一剂量水平的总体评定。如果在某一剂量水平下治疗的个体中<33％的个体经历DLT(即，0/3、≤1/6、≤2/9、≤3/12、≤4/15或≤5/18名个体)，那么剂量水平视为安全的。DLT在上文定义。在研究的剂量递增部分中，评价在每一剂量水平下，在3或6名个体中的安全性。如果用至少一次注射处理，那么个体视为可进行安全性评价。观测DLT直到9周，以提供多次剂量的疫苗的安全性评价。
通过在剂量组内的使用按等级的AE列表频率，使用CTCAE版本4.0的描述性分析来评定总体安全性；且对于总体研究群体就治疗中出现的AE、SAE和在安全性实验室测试、身体检查和生命体征的临床上显著变化，评定总体安全性。
功效分析
在第65天之后，每3个月，追踪所有个体的进展/存活，直到死亡为止。通过剂量组和总体，来评价实现使用RECIST版本1.1客观确认的完全或部分总体肿瘤反应个体的百分比。评价反应率的95％置信区间。以类似方式，分析疾病控制(确认的反应或SD持续至少6个月)。
通过剂量组和总体，来评价总体反应的持续时间。从时间测量标准满足CR或PR(无论哪个首先记录)直到客观地记录复发或PD的第一日(以PD作为参考，从治疗开始记录的最小测量值)为止，来测量总体反应的持续时间。
通过剂量组和总体，使用卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)方法，来评价PFS。PFS定义为从第一治疗之日到疾病进展或死亡(任何原因)(无论哪个先发生)之日的时间。在最后一个已知个体无进展日期，检查不具有疾病进展或在随访结束时未死亡的个体。
通过剂量组和总体，使用卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)方法，来评价OS。OS定义为从第一治疗之日到死亡(任何原因)之日的时间。在最后一个已知存活日，检查在随访结束时存活的个体。
实例11
用Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7和/或Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7对HPV诱发或HPV相关癌症的治疗
本实例描述在有需要的个体中对HPV诱发或HPV相关癌症中的HPV表达细胞的治疗。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，向有需要的个体，皮下施用编码E6、E7和/或E6/E7的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，每两个月(隔月地)给予增强注射。个体为任何动物，例如哺乳动物，如小鼠、人或非人灵长类。在施用疫苗后，起始针对HPV表达癌症的细胞和体液反应，且消除癌症。
实例12
用Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7和/或Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7与共刺激分子对HPV诱发或HPV相关癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中对HPV诱发或HPV相关癌症中的HPV表达细胞的治疗。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，结合共刺激分子，向有需要的个体皮下施用编码E6、E7和/或E6/E7的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，隔月地施用增强注射。共刺激分子为B7-1、ICAM-1或LFA-3。个体为任何动物，例如哺乳动物，如小鼠、人或非人灵长类。在施用疫苗和共刺激分子后，起始针对HPV表达癌症的细胞和体液反应，且消除癌症。
实例13
用Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7和/或Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7与检查点抑制剂对HPV诱发或HPV相关癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中对HPV诱发或HPV相关癌症中的HPV表达细胞的治疗。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，结合检查点抑制剂，向有需要的个体皮下施用编码E6、E7和/或E6/E7的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，隔月地施用增强注射。检查点抑制剂为抗PDL1抗体，如阿维鲁单抗。按照药品说明书标注，以10mg/kg，给药和施用阿维鲁单抗。个体为任何动物，例如哺乳动物，如小鼠、人或非人灵长类。在施用疫苗和检查点抑制剂后，起始针对HPV表达癌症的细胞和体液反应，且消除癌症。
实例14
用Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7和/或Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7与工程改造的NK细胞对HPV诱发或HPV相关癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中对HPV诱发或HPV相关癌症中的HPV表达细胞的治疗。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，结合共刺激分子，向有需要的个体皮下施用编码E6、E7和/或E6/E7的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，隔月地施用增强注射。向个体另外施用工程改造的NK细胞、特异性活化的NK细胞(aNK细胞)。在第-2、12、26和40天，以2×109个细胞/治疗的剂量，输注aNK细胞。有需要的个体具有HPV表达癌细胞，如HPV相关或HPV诱发癌症。个体为任何哺乳动物，如人或非人灵长类。
实例15
用Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7和/或Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7与ALT-803对HPV诱发或HPV相关癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中对HPV诱发或HPV相关癌症中的HPV表达细胞的治疗。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，结合共刺激分子，向有需要的个体皮下施用编码E6、E7和/或E6/E7的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，隔月地施用增强注射。分别在第1、2、4、5、7和8周，还以10μg/kgSC的剂量，向个体施用超激动剂/超激动剂复合物，如ALT-803。有需要的个体具有HPV表达癌细胞，如HPV相关或HPV诱发癌症。个体为任何哺乳动物，如人或非人动物。
实例16
用Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7和/或Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7与低剂量化疗对HPV诱发或HPV相关癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中对HPV诱发或HPV相关癌症中的HPV表达细胞的治疗。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，结合共刺激分子，向有需要的个体皮下施用编码E6、E7和/或E6/E7的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，隔月地施用增强注射。
还向个体施用低剂量化疗。化疗为环磷酰胺。化疗以低于临床护理给药标准的剂量施用。举例来说，化疗在每2周的第1-5天和第8-12天，以50mg，一日两次(BID)施用，总共8周。有需要的个体患有HPV表达，如HPV相关或HPV诱发癌症。个体为任何哺乳动物，如人或非人动物。
实例17
用Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6、Ad5[E1-、E2b-]-HPV E7和/或Ad5[E1-、E2b-]-HPV E6/E7与低剂量放疗对HPV诱发或HPV相关癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中对HPV诱发或HPV相关癌症中的HPV表达细胞的治疗。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，结合共刺激分子，向有需要的个体皮下施用编码E6、E7和/或E6/E7的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，隔月地施用增强注射。
还向个体施用低剂量放疗。低剂量放疗以低于临床护理给药标准的剂量施用。在第8、22、36、50天，给予在8Gy下的并行立体定向身体放疗(SBRT)(每2周，4次剂量)。使用SBRT向所有可行的肿瘤位点施用放疗。有需要的个体患有HPV表达，如HPV相关或HPV诱发癌症。个体为任何哺乳动物，如人或非人动物。
虽然已经在本文中显示和描述了本发明的优选实施例，但所属领域的技术人员应清楚，这类实施例仅是作为举例而提供的。所属领域的技术人员现在将在不脱离本发明的情况下想到众多变型、变化和取代。应理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。预期所附权利要求界定本发明的范围，并且因此涵盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
序列

Claims (132)

1.一种组合物，其包括复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括含有以下中的一个或更多个的核酸序列：
a)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；
b)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；
c)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；
d)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；以及
e)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括编码与SEQ ID NO:8至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括编码与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括编码与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括编码与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列的核酸序列。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:2至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:3至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:4至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:18至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:6至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:19至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:7至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:20至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括含有与SEQ ID NO:21至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区的核酸序列。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的组合物，其中所述载体为腺病毒载体。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述载体包括E1区、E2b区、E3区、E4区或其组合中的缺失。
19.根据权利要求17到18中任一项所述的组合物，其中所述载体包括E2b区中的缺失。
20.根据权利要求17到19中任一项所述的组合物，其中所述载体包括E1区、E2b区和E3区中的缺失。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的组合物，其中所述组合物或所述载体进一步包括编码共刺激分子的核酸序列。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。
23.根据权利要求21或22所述的组合物，其中所述共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括位于相同复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
25.根据权利要求1到23中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括位于单独复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括至少5×1011个复制缺陷型病毒载体。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括编码含有HPV E6和HPV E7的融合蛋白的核苷酸序列。
28.根据权利要求1到26中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括：
第一复制缺陷型腺病毒载体，其包括：E2b区中的缺失，和编码HPV E6的核酸序列；以及
第二复制缺陷型腺病毒载体，其包括：E2b区中的缺失，和编码HPV E7的核酸序列。
29.根据权利要求1到28中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型病毒载体进一步包括编码可选标记的核酸序列。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述可选标记为lacZ蛋白、胸苷激酶、gpt、GUS、或牛痘K1L宿主范围蛋白或其组合。
31.根据权利要求1到30中任一项所述的组合物，其中经修饰的HPV抗原为经修饰的HPVE6抗原与经修饰的HPV E7抗原的组合。
32.根据权利要求1到31中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的HPV抗原为非致癌HPV抗原。
33.根据权利要求1到32中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的HPV抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合结合。
34.根据权利要求1到33中任一项所述的组合物，其中所述核酸序列具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其组合的位置23-496和502-795至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
35.根据权利要求1到33中任一项所述的组合物，其中所述核酸序列与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
36.根据权利要求1到33中任一项所述的组合物，其中所述核酸序列与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
37.根据权利要求1到36中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型病毒进一步包括编码一种或更多种额外靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述一种或更多种额外靶抗原为肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、丝裂原或其组合。
39.根据权利要求37到38中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种额外靶抗原为CEA、叶酸受体α、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSCA、PSMA、PAP、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、Her2/neu、BRCA1、BRACHYURY、BRACHYURY(TIVS7-2，多态性)、BRACHYURY(IVS7T/C多态性)、T BRACHYURY、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、Her2/neu、Her3、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、或TEL/AML1、或其经修饰的变体、剪接变体、功能性表位、表位激动剂或组合。
40.根据权利要求37到39中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种额外靶抗原为CEA、Brachyury和MUC1。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中CEA包括与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的位置1057-3165至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的序列。
42.根据权利要求40到41中任一项所述的组合物，其中MUC1-c包括与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的序列。
43.根据权利要求40到42中任一项所述的组合物，其中Brachyury包括与SEQ ID NO:28至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的序列。
44.根据权利要求1到43中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括至少1×109个病毒颗粒到至少5×1012个病毒颗粒。
45.根据权利要求1到44中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括至少1×1011个病毒颗粒。
46.根据权利要求1到45中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括至少5×1011个病毒颗粒。
47.根据权利要求1到46中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型病毒载体进一步包括编码免疫融合配偶体的核酸序列。
48.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到47中任一项所述的组合物和药学上可接受的载剂。
49.一种宿主细胞，其包括根据权利要求1到47中任一项所述的组合物。
50.一种制备肿瘤疫苗的方法，其包括制备根据权利要求48所述的药物组合物，或制备根据权利要求1到47中任一项所述的组合物。
51.一种增强有需要的个体中的HPV特异性免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1到47中任一项所述的组合物或根据权利要求48所述的药物组合物。
52.一种预防或治疗有需要的个体的HPV诱发的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1到47中任一项所述的组合物或根据权利要求48所述的药物组合物。
53.根据权利要求51到52中任一项所述的方法，其中所述施用消除所述个体中的HPVE6表达细胞或HPV E7表达细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述方法为预防在所述施用之前确定为HPV阳性的个体的HPV诱发的癌症的方法。
55.根据权利要求53到54中任一项所述的方法，其中所述个体对于16型HPV或18型HPV致癌基因的表达呈阳性。
56.根据权利要求51到55中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用佐剂，其中所述佐剂包括弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、默克佐剂65、AS-2、氢氧化铝凝胶(矾)、磷酸铝、钙盐、铁盐或锌盐、酰化酪氨酸、酰化糖、阳离子或阴离子衍生的多糖、聚磷腈、生物可降解的微球体、单磷酰脂质A、quil A、GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23或IL-32。
57.根据权利要求51到56中任一项所述的方法，其中所述个体为HPV阳性的，或表达HPVE6或HPV E7。
58.根据权利要求51到57中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用免疫检查点抑制剂。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA或CD244。
60.根据权利要求58到59中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1或PDL1。
61.根据权利要求58到60中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体或抗PDL1抗体。
62.根据权利要求58到61中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗PDL1抗体。
63.根据权利要求58到62中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为阿维鲁单抗。
64.根据权利要求58到63中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括治疗有需要的个体的HPV感染、HPV诱发的癌症或HPV相关疾病。
65.根据权利要求58到64中任一项所述的方法，其中所述个体患有HPV感染、HPV诱发的癌症或HPV相关疾病。
66.根据权利要求64到65中任一项所述的方法，其中所述HPV诱发的癌症为HPV诱发的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、口咽和扁桃体癌、阴道癌、阴茎癌、外阴癌、肛门癌或宫颈癌。
67.根据权利要求51到66中任一项所述的方法，其中所述个体患有以下的HPV阳性鳞状细胞癌：宫颈、阴道、外阴、头/颈、肛门或阴茎。
68.根据权利要求51到67中任一项所述的方法，其中所述个体对于Ad5具有预存免疫。
69.根据权利要求51到68中任一项所述的方法，其中每三周重复施用治疗有效量的所述组合物。
70.根据权利要求51到69中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包括至少5×1011个腺病毒载体。
71.根据权利要求51到70中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用化疗、放疗或其组合。
72.根据权利要求51到71中任一项所述的方法，其中施用途径为静脉内、皮下、淋巴管内、肿瘤内、皮内、肌肉内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、口服、经膀胱滴注或经划痕。
73.根据权利要求51到72中任一项所述的方法，其中所述个体在所述施用之后具有增强的免疫反应，所述免疫反应为细胞介导的反应或体液反应。
74.根据权利要求51到73中任一项所述的方法，其中所述个体具有增强的免疫反应，所述增强的免疫反应为B细胞增殖、CD4+T细胞增殖、CD8+T细胞增殖或其组合的增强。
75.根据权利要求51到74中任一项所述的方法，其中所述个体具有增强的免疫反应，所述增强的免疫反应为IL-2产生、IFN-γ产生或其组合的增强。
76.根据权利要求51到75中任一项所述的方法，其中所述个体具有增强的免疫反应，所述增强的免疫反应为抗原呈递细胞增殖、功能或其组合的增强。
77.根据权利要求51到76中任一项所述的方法，其中所述个体先前已施用腺病毒载体。
78.根据权利要求51到77中任一项所述的方法，其中确定所述个体对于腺病毒载体具有预存免疫。
79.根据权利要求51到78中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用包括工程改造的自然杀伤(NK)细胞的群体的药物组合物。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述工程改造的NK细胞包括已经修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制性受体)表达的一个或更多个NK细胞，其已经修饰以表达高亲和力CD16变体的一个或更多个NK细胞，和已经修饰以表达一种或更多种CAR(嵌合抗原受体)的一个或更多个NK细胞，或其任何组合。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述工程改造的NK细胞包括已经修饰为基本上缺乏KIR表达的一个或更多个NK细胞。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述工程改造的NK细胞包括已经修饰以表达高亲和力CD16变体的一个或更多个NK细胞。
83.根据权利要求80所述的方法，其中所述工程改造的NK细胞包括已经修饰以表达一种或更多种CAR的一个或更多个NK细胞。
84.根据权利要求80或83所述的方法，其中所述CAR为针对以下的CAR：肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1或其任何组合。
85.根据权利要求51到84中任一项所述的方法，其中所述腺病毒载体为复制缺陷型的。
86.根据权利要求51到85中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型腺病毒载体包括于细胞中。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述细胞为树突状细胞(DC)。
88.根据权利要求51到87中任一项所述的方法，其进一步包括施用药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的IL-15或含有编码IL-15的核酸序列的复制缺陷型载体。
89.根据权利要求51到88中任一项所述的方法，其进一步包括施用药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的IL-15超激动剂或含有编码IL-15超激动剂的核酸序列的复制缺陷型载体。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述IL-15超激动剂为ALT-803。
91.一种降低有需要的个体中的HPV表达细胞的方法，所述方法包括施用有效量的组合物，所述组合物包括含有编码经修饰的HPV E6、经修饰的HPV E7抗原或其组合的核酸序列的复制缺陷型病毒载体。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述核酸序列编码经修饰的HPV E6和经修饰的HPV E7。
93.根据权利要求91到92中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒载体包括：
a)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；
b)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；
c)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；
d)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQID NO:7、SEQ ID NO:20至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；
e)核酸序列，其具有与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区；
f)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:13至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；
g)核酸序列，其编码与SEQ ID NO:14至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列；或
h)核酸序列，其包括与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
94.根据权利要求91到93中任一项所述的方法，其中所述施用消除所述个体中的HPVE6表达细胞或HPV E7表达细胞。
95.根据权利要求91到94中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括预防在所述施用之前确定为HPV阳性的个体的HPV诱发的癌症。
96.根据权利要求91到95中任一项所述的方法，其中所述载体为腺病毒载体。
97.根据权利要求96所述的组合物，其中所述载体包括E1区、E2b区、E3区、E4区或其组合中的缺失。
98.根据权利要求96所述的方法，其中所述载体包括E2b区中的缺失。
99.根据权利要求96所述的组合物，其中所述载体包括E1区、E2b区和E3区中的缺失。
100.根据权利要求91到99中任一项所述的方法，其中所述组合物或所述载体进一步包括编码共刺激分子的核酸序列。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。
103.根据权利要求91到102中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括位于相同复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
104.根据权利要求91到102中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括位于单独复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
105.根据权利要求91到104中任一项所述的方法，其中所述组合物包括至少5×1011个复制缺陷型病毒载体。
106.根据权利要求91到105中任一项所述的方法，其中所述组合物包括编码含有HPVE6和HPV E7的融合蛋白的核苷酸序列。
107.根据权利要求91到106中任一项所述的方法，其中所述组合物包括：
第一复制缺陷型腺病毒载体，其包括：E2b区中的缺失，和编码HPV E6的核酸序列；以及
第二复制缺陷型腺病毒载体，其包括：E2b区中的缺失，和编码HPV E7的核酸序列。
108.根据权利要求91到107中任一项所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒载体进一步包括编码可选标记的核酸序列。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述可选标记为lacZ蛋白、胸苷激酶、gpt、GUS、或牛痘K1L宿主范围蛋白或其组合。
110.根据权利要求91到109中任一项所述的方法，其中所述经修饰的HPV E6或HPV E7抗原为非致癌HPV抗原。
111.根据权利要求91到110中任一项所述的方法，其中所述经修饰的HPV E6或HPV E7抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合结合。
112.根据权利要求91到111中任一项所述的方法，其中所述核酸序列包括与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其组合的位置23-496和502-795至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的区。
113.根据权利要求91到112中任一项所述的方法，其中所述核酸序列包括与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:20的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
114.根据权利要求91到113中任一项所述的方法，其中所述核酸序列包括与SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:21的至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
115.根据权利要求91到114中任一项所述的方法，其中所述个体对于16型HPV或18型HPV致癌基因的表达呈阳性。
116.根据权利要求91到114中任一项所述的方法，其中确定所述个体为HPV阳性的，或表达HPV E6或HPV E7。
117.根据权利要求91到116中任一项所述的方法，其中所述个体患有HPV感染。
118.根据权利要求91到117中任一项所述的方法，其中已通过漱口液或宫颈刮片确定所述个体患有HPV感染。
119.根据权利要求91到118中任一项所述的方法，其中所述个体对于Ad5具有预存免疫。
120.根据权利要求91到119中任一项所述的方法，其中每三周重复所述施用。
121.根据权利要求91到120中任一项所述的方法，其中所述组合物包括至少5×1011个腺病毒载体。
122.根据权利要求91到121中任一项所述的方法，其中施用途径为静脉内、皮下、淋巴管内、肿瘤内、皮内、肌肉内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、口服、经膀胱滴注或经划痕。
123.根据权利要求91到121中任一项所述的方法，其中施用途径为皮下施用。
124.根据权利要求91到123中任一项所述的方法，其中所述个体先前已施用腺病毒载体。
125.根据权利要求91到124中任一项所述的方法，其中确定所述个体对于腺病毒载体具有预存免疫。
126.根据权利要求51到125中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量的所述组合物包括1×109至5×1012个病毒颗粒/剂。
127.根据权利要求51到126中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量的所述组合物包括至少1×1011个病毒颗粒/剂。
128.根据权利要求51到127中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量的所述组合物包括至少5×1011个病毒颗粒/剂。
129.根据权利要求51到128中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量的所述组合物，随后施用包括相同组合物或药物组合物的一种或更多种加强免疫。
130.根据权利要求129所述的方法，其中每一个月、两个月或三个月施用所述加强免疫。
131.根据权利要求129或130所述的方法，其中重复所述加强免疫三次或更多次。
132.根据权利要求51到131中任一项所述的方法，其中所述施用治疗有效量为初次免疫，每一周、两周或三周，重复三次；随后加强免疫，每一个月、两个月或三个月，重复三次或更多次。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3042703A1 (en) * 2016-11-07 2018-05-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Development of agonist epitopes of the human papillomavirus
CA3056630A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
CA3064435A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
JP7097438B2 (ja) 2017-07-11 2022-07-07 アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッド 遺伝子操作された免疫刺激性細菌菌株およびその使用
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US20210024586A1 (en) * 2018-03-06 2021-01-28 Precigen, Inc. Human papillomavirus vaccines and uses of the same
CN111867612A (zh) 2018-03-26 2020-10-30 阿尔托生物科学有限责任公司 抗PDL1、IL-15和TGF-β受体组合分子
EP3844276A2 (en) 2018-08-28 2021-07-07 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
WO2020231855A1 (en) 2019-05-10 2020-11-19 Nant Holdings Ip, Llc Nogapendekin alfa-inbakicept for immune stimulant therapies and treatment of viral infections
BR112021023345A2 (pt) 2019-05-20 2022-02-01 Pandion Operations Inc Imunotolerância com alvo em madcam
US20220018844A1 (en) * 2020-07-20 2022-01-20 University Of Baltimore, Maryland Method for Treating a Cancer Based on Inflammatory Subtype Thereof
EP4320278A1 (en) * 2021-04-08 2024-02-14 Board of Regents, The University of Texas System Methods and systems for hpv detection and quantification

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020088014A1 (en) * 1996-05-31 2002-07-04 Xiangming Fang Minimal adenovirus mediated recombinant vaccine
US20100061957A1 (en) * 2006-04-21 2010-03-11 Transgene S.A. Hpv-16-based papillomavirus vaccines
US20100143408A1 (en) * 2007-01-30 2010-06-10 Martine Baudin Papillomavirus vaccines
CN102002105A (zh) * 2009-09-03 2011-04-06 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Hpv 16型e7e6融合蛋白基因、表达载体、方法、细胞和用途
US20150110832A1 (en) * 2008-04-18 2015-04-23 Vaxinnate Corporation Deletion Mutants of Flagellin and Methods of Use
US20160076053A1 (en) * 2012-08-24 2016-03-17 Frank R. Jones Replication defective adenovirus vector in vaccination

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2794370B1 (fr) * 1999-06-03 2003-10-17 Biovector Therapeutics Fragments proteiques polyepitopiques, leur obtention et leurs utilisations notamment en vaccination
ES2646590T3 (es) * 2012-01-24 2017-12-14 Sanford Health Polinucleótidos para el tratamiento de tumores positivos para polipéptidos víricos oncogénicos
JP6647315B2 (ja) * 2015-01-09 2020-02-14 イーチュービクス コーポレイション 組み合わせ免疫療法のための方法および組成物
US11149087B2 (en) * 2015-04-20 2021-10-19 Etubics Corporation Methods and compositions for combination immunotherapy

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020088014A1 (en) * 1996-05-31 2002-07-04 Xiangming Fang Minimal adenovirus mediated recombinant vaccine
US20100061957A1 (en) * 2006-04-21 2010-03-11 Transgene S.A. Hpv-16-based papillomavirus vaccines
US20100143408A1 (en) * 2007-01-30 2010-06-10 Martine Baudin Papillomavirus vaccines
US20150110832A1 (en) * 2008-04-18 2015-04-23 Vaxinnate Corporation Deletion Mutants of Flagellin and Methods of Use
CN102002105A (zh) * 2009-09-03 2011-04-06 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Hpv 16型e7e6融合蛋白基因、表达载体、方法、细胞和用途
CN102002105B (zh) * 2009-09-03 2013-01-23 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Hpv 16型e7e6融合蛋白基因、表达载体、方法、细胞和用途
US20160076053A1 (en) * 2012-08-24 2016-03-17 Frank R. Jones Replication defective adenovirus vector in vaccination

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