ES2646590T3

ES2646590T3 - Polinucleótidos para el tratamiento de tumores positivos para polipéptidos víricos oncogénicos

Info

Publication number: ES2646590T3
Application number: ES13740950.4T
Authority: ES
Inventors: John H. Lee; Daniel W. VERMEER
Original assignee: Sanford Health
Current assignee: Sanford Health
Priority date: 2012-01-24
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2017-12-14
Anticipated expiration: 2033-01-23
Also published as: JP6655051B2; HK1203833A1; JP2018038405A; IN2014DN06118A; DK2806889T3; US20150023996A1; EP3269387A1; US20180237477A1; CN110042110A; KR20140131929A; WO2013112549A1; EP3269387B1; CN104159607A; EP2806889B1; US20160376324A1; US9969779B2; JP2015506179A; EP2806889A4; JP6219849B2; US9492526B2

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende: una primera secuencia de nucleótidos que codifica un primer polipéptido antigénico, en el que el primer polipéptido antigénico: a. comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; b. es capaz de iniciar una respuesta inmunitaria contra el primer polipéptido vírico oncogénico en un hospedador inmunocompetente; y c. no es oncogénico en el hospedador inmunocompetente; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un segundo polipéptido antigénico, en el que el segundo polipéptido antigénico: a. comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:30; b. es capaz de iniciar una respuesta inmunitaria contra el segundo polipéptido vírico oncogénico en un hospedador inmunocompetente; y c. no es oncogénico en el hospedador inmunocompetente; en el que el primer polipéptido antigénico tiene las siguientes mutaciones con respecto a la SEQ ID NO:2: a. una mutación puntual o deleción en L50; b. una mutación puntual o deleción en E148; c. una mutación puntual o deleción en T149; d. una mutación puntual o deleción en Q150; y e. una mutación puntual o deleción en L151; y en el que el segundo polipéptido antigénico tiene las siguientes mutaciones con respecto a la SEQ ID NO:4: a. una mutación puntual o deleción en H2; b. una mutación puntual o deleción en C24; c. una mutación puntual o deleción en E46; y d. una mutación puntual o deleción en L67.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

Las composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden envasar como formulaciones premezcladas o como componentes separados que se pueden mezclar antes de su uso. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden envasar en dosis individuales. En otras realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden envasar en envases que contienen múltiples dosis que se miden antes de la administración. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden formular como un concentrado que se diluye antes de la administración. En todavía otras realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente memoria pueden producirse mezclando los componentes separados antes de la administración. El envasado puede incluir además la documentación apropiada, el etiquetado y similares.

Debe entenderse que los siguientes ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Mutagénesis de HPV16 E6/E7 y construcción vírica

Mutagénesis de HPV16 E6/E7. Se introdujeron seis mutaciones en HPV16 E6 y E7 en un ácido nucleico que codifica el E6/E7 de tipo silvestre como se muestra en la Figura 1 usando mutagénesis dirigida al sitio in vitro. Para la mutación designada como L50G, se realizó una mutación de leucina a glicina en la posición 50 en E6 dentro de un dominio de sitio de unión a p53 y activación de la telomerasa. Para la mutación designada PDZ, el dominio de unión de PDZ C-terminal de E6 en los residuos 146-151 se sustituyó con cuatro residuos de alanina. Para la mutación designada como H2P, un residuo de histidina se sustituyó con un residuo de prolina dentro de un sitio de unión de Rb en E7 en la posición 2. Para la mutación designada C24G, un residuo de cisteína se sustituyó con un residuo de glicina dentro de un sitio de unión de Rb en E7 en la posición 24. Para la mutación designada E46A, un residuo de ácido glutámico se cambió a alanina dentro de un sitio de unión a Rb en E7 en la posición 46. Para la mutación designada como L67R, se realizó la mutación de leucina a arginina dentro de una región de unión a Mi2β de E7 en la posición 67. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó en un ácido nucleico que codifica HPV16 E6 y E7 (SEQ ID NO:5) según las instrucciones del fabricante (Agilent Technologies N.º 200521) usando los cebadores enumerados en la Tabla 1.

Mutación: Cebador directo Cebador inverso

L50G: imagen6 imagen7

PDZ: imagen8 imagen9

H2P: imagen10 imagen11

C24G: imagen12 imagen13

E46A: imagen14 imagen15

L67R: imagen16 imagen17

Tabla 1

La construcción mutada se clonó en un vector lanzadera adenoviral Ad5 VQ. La fidelidad de la construcción final se verificó mediante secuenciación directa de ADN.

Construcción vírica. Los vectores Ad5 CMV deficientes en E1 y E2b (vector vacío designado [E1-, E2b-]) que contiene el mutante E6/E7 (designado [E1-, E2b-]mut-E6/E7) y tipo silvestre E6/E7 (designado [E1-, E2b-]wt-E6/E7) fueron construidos y producidos como se describió previamente (Amalfitano et al. (1998) J. Virol. 72(2): 926-33) Brevemente, las secuencias de E6/E7 de tipo silvestre y mutante se subclonaron en la región E1 del vector Ad5[E1-, E2b-] usando un enfoque basado en la recombinación homóloga. El virus deficiente en replicación se propagó en la línea celular de empaquetamiento E.C7, se purificó con CsCl2 y se tituló. Se determinó el título infeccioso vírico

7 5

15

25

35

45

55

65

como unidades formadoras de placa (PFU) en una monocapa de células E.C7. La concentración de partícula vírica (VP) se determinó por disrupción con dodecilsulfato de sodio (SDS) y espectrofotometría a 260 nm y 280 nm. La relación entre VP y unidades formadoras de placa (PFU) fue de 36,7/1 VP/PFU. El inserto mut-E6/E7 así como wt-E6/E7 se cortó y se ligó a continuación al vector retroviral pLXSN usando los sitios de restricción EcoRI y BamHI. Se generaron partículas de retrovirus en la línea celular Phoenix A de acuerdo con los métodos recomendados (Nolan Lab, Stanford University, California) con polibreno (Sigma H9268) añadido a una concentración final de 8 μg/ml.

Ejemplo 2. Efecto de las mutaciones E6/E7 sobre la oncogénesis

Oncogénesis en una línea celular de epitelio basal alveolar de adenocarcinoma humano. Para determinar si la oncogénesis promovida por E6/E7 mutada, células A549 (línea celular de epitelio basal alveolar de adenocarcinoma humano) se infectaron con un retrovirus que contenía wt-E6/E7 (SEQ ID NO:6), mut-E6/E7 (SEQ ID NO:31), o vector de control, y se clonaron en anillo. Los clones se analizaron mediante transferencia Western. La Figura 2A muestra que la expresión de wt-E6/E7 disminuye la expresión de las proteínas PTPN13, pRb y p53 mientras que los niveles de expresión de PTPN13, pRb y p53 son similares al control en las células que expresan mut-E6/E7. El análisis por PCR de los clones confirmó que mut-E6/E7 se expresaba a niveles similares a wt-E6/E7 (Figura 2B), lo que sugiere que los cambios evidentes por transferencia Western fueron una consecuencia de la función E6/E7 alterada en lugar de los niveles de expresión y confirman una pérdida de función oncogénica en la construcción mut-E6/E7. La actividad telomerasa también se examinó en estos clones. El mut-E6/E7 y el control del vector mostraron una actividad telomerasa relativa (RTA) significativamente menor en comparación con el wt-E6/E7 (Figura 2C). Debido a que wt-E6/E7 induce cambios morfológicos del tipo mesenquimal, también se examinaron las características morfológicas de los clones. La Figura 3 muestra que el control y mut-E6/E7 crecen en colonias ajustadas, mientras que la expresión de wt-E6/E7 induce un cambio mesenquimatoso en la morfología y las células crecen de forma no adherente. En conjunto, estos datos sugieren que, a diferencia de la expresión de wt-E6/E7, la expresión estable de mut-E6/E7 no induce los cambios bioquímicos o morfológicos asociados con la transformación celular.

Transformación en células epiteliales humanas primarias. Para demostrar adicionalmente que mut-E6/E7 no transforma células, se infectaron epitelios de amígdala humanos (HTE) primarios con retrovirus que contenían wt-E6/E7, mut-E6/E7 o vector vacío (LXSN). Las células HTE no infectadas (HTE052) sirvieron como control adicional. La expresión de wt-E6/E7 da como resultado la inmortalización celular. Sin embargo, los HTE que expresan mut-E6/E7 y, al igual que los controles, no se inmortalizaron (Figura 4A). Estos resultados demuestran que la expresión estable de mut-E6/E7, incluso expresada a partir de un retrovirus integrador, no da como resultado la inmortalización celular.

Para determinar si wt-E6/E7 o mut-E6/E7 en una infección por vector vírico adenoviral no replicativo de queratinocitos amigdalinos humanos primarios puede dar como resultado una transformación, se infectaron HTE con [E1-, E2b-] que expresan GFP, [E1-, E2b-]mutE6/E7 o [E1-, E2b-]wt-E6/E7. Wt-E6/E7 fue capaz de inducir la pérdida de p53 (Figura 4B), sin embargo, ni wt-E6/E7 ni mut-E6/E7 pudieron inmortalizar las células epiteliales de la amígdala primaria después de la infección (Figura 5). Para determinar si esto se debió a la pérdida vírica con la replicación, examinamos la persistencia del ADN vírico con el crecimiento celular. Se realizó una Q-PCR y se demostró que, a medida que las células se replicaban, el ADN vírico se perdía a una velocidad similar con todos los insertos, lo que sugiere que los genes víricos no se integraron en el ADN de la célula hospedadora. Por lo tanto, los genes del HPV en el vector adenoviral [E1-, E2b-] no persisten con la división y la expresión transitoria de wt-E6/E7 de un vector adenoviral deficiente en replicación no es suficiente para transformar las células primarias.

Cultivo de células. Se cultivaron células A549 en medio Eagle modificado de Dulbecco (Thermo Fisher N.º SH30022.01) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Thermo Fisher N.º SH3007103). Se aislaron células epiteliales de amígdala humanas (HTE) primarias de la amigdalectomía quirúrgica de pacientes consentidos con aprobación institucional del IRB utilizando técnicas conocidas (Williams et al. (2009) Head Neck. 31(7):911-8). Las HTE primarias fueron mantenidas en medios SFM de queratinocitos (KSFM, Invitrogen N.º17005-042).

Infección retroviral. Las células HTE y A549 se infectaron con sobrenadante retroviral que contenía wt-E6/E7, mut-E6/E7, o retrovirus de vector vacío y se incubaron a 37 °C con CO2 5 % durante la noche. Los medios se aspiraron 24 horas después de la infección y los medios frescos se complementaron con neomicina (RPI N.º G64000) para su selección. Las colonias individuales se clonaron en anillo y se sometieron a selección con 800 μg/ml de neomicina. Los datos que se muestran utilizando clones infectados retroviralmente son representativos de múltiples clones probados. Debido a su densidad de dependencia para el crecimiento celular, las líneas celulares de HTE no se colocaron bajo la selección de antibióticos, sino que se mantuvieron en KSFM hasta la muerte o inmortalización celular.

Se realizó una PCR estándar para analizar el ARNm en líneas celulares estables que expresan LXSN, LXSN wt-E6/E7 o LXSN mut-E6/E7 para validar que los cambios realizados en mutE6/E7 no afectaron a la tasa de transcripción E6/E7. La PCR se realizó usando el cebador directo E6/E7 5'-CAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTA-3'(SEQ ID NO:19) y el cebador inverso E6/E7 5'-GCTTTTTGTCCAGATGTCTTTGC-3' (SEQ ID NO:20), y los niveles de expresión se normalizaron a los niveles de GADPH usando el cebador directo GAPDH 5'-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 '(SEQ ID NO:21) y el cebador inverso GAPDH 5'

8 5

15

25

35

45

55

65

TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3' (SEQ ID NO:22). Todas las concentraciones del cebador fueron 450 nM. La preincubación fue de 94 °C durante 10 min. Las condiciones de ciclización fueron de 94 °C durante 40 segundos, 55 °C durante 40 segundos y 72 °C durante 1 minuto durante un total de 30 ciclos.

Infección adenoviral. Las células epiteliales de amígdala humanas primarias crecidas hasta el 80 % de confluencia se infectaron con [E1-, E2b-]nulo, [E1-, E2b-]wt-E6/E7, [E1-, E2b-]mut-E6/E7 o Ad GFP a un MOI de 100 por 24 horas. El ADN se recogió en los pases 4, 5 y 6 después de la infección. Las células se trataron con tripsina, se enjuagaron y se volvieron a suspender en solución salina tamponada con fosfato 1X. La extracción de ADN se realizó usando el protocolo estándar de columna de centrifugado de tejido animal del DNeasy DNA Blood and Tissue Kit (Qiagen N.º 69504).

Q-PCR. Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa para analizar el número de copias de HPV16 usando el conjunto de cebadores de HPV16 520 5'-TTGCAGATCATCAAGAACACGTAGA-3' (SEQ ID NO:32) y 671 5'-CTTGTCCAGCTGGACCATCTATTT-3' (SEQ ID NO:33). Se usó como control un conjunto de cebadores 18S de Applied Biosystems. La reacción de amplificación incluyó SyberGreen Universal Master Mix (Applied Biosystems), 250 nM (conjunto de cebadores HPV16) o 100 nM (conjunto de cebadores 18S) de cada cebador y un molde de 25 ng. Las condiciones de ciclización fueron de 95 °C durante 10 minutos con 40 ciclos a 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 60 segundos utilizando el termociclador Stratagene Mx3000P.

Análisis de transferencia Western. Se cultivaron líneas celulares estables A549 wt-E6/E7, A549 mut-E6/E7 y células parentales A549 a 80-90 % de confluencia, se enjuagaron con PBS y se recogieron con solución de lisis (Tris HCl 50 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM; EDTA 5 mM; Na3VO4 2 mM; NaF 100 mM; NaPPi 10 mM; glicerol 10 %; Triton 1 %; 1X Inhibidores de la proteasa Halt; PMSF 17,4 μg/μl). Las membranas se sedimentaron por centrifugación (10.000 rpm a 4 °C) y se recogieron las proteínas solubles. La proteína total se cuantificó utilizando el kit de ensayo de la proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce) y se analizó la proteína total igual mediante transferencia Western. Brevemente, las proteínas se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF (Immobilon-P), se bloquearon con albúmina de suero bovino al 5 % (MP Biomedicals) o leche en polvo no grasa y se visualizaron mediante quimioluminiscencia en película o mediante el sistema de bioimagen de UVP (Upland, CA). Las membranas se incubaron con los siguientes anticuerpos: FAP-1 (1: 500, Santa Cruz sc15356), p53 (1:500, Calbiochem OP43), pRb (1:250, BD Biosciences 554136) y GAPDH (1: 5000, Ambion N.º Am4300)

Ejemplo 3. Respuesta inmunitaria mediada por células específicas del HPV

Inmunidad mediada por células en respuesta al mutante E6/E7. Para determinar si las mutaciones en E6/E7, que lo convierten en no oncogénico, alteran la capacidad de establecer una respuesta inmunitaria específica del HPV en el contexto del vector adenoviral [E1-, E2b-] in vitro, se extrajeron los bazos de ratones control e inmunizados y se examinó la capacidad de los esplenocitos para secretar IFN-γ e IL-2 cuando fueron estimulados por E6/E7 o lisados de células inmortalizadas con E6/E7. Las respuestas de inmunidad mediada por células (CMI) se determinaron en ratones control no vacunados y vacunados mediante la evaluación de los números de células secretoras de IFN-γ e IL-2 en esplenocitos recogidos de grupos de ratones individuales usando el análisis inmunospot ligado a enzimas (ELISpot). Como se muestra en las Figuras 6 y 7, las respuestas de CMI se detectaron en ratones inmunizados con Ad5 [E1-, E2b-]mut-E6/E7. Esto se demostró mediante niveles significativamente elevados de células formadoras de manchas (SFC) secretoras de IFN-γ (Figura 6) e IL-2 (Figura 7) inducidas en ratones inmunizados, pero no en ratones control inyectados con solución tampón o Ad5 [E1-, E2b-]nulo. Aunque las respuestas de SFC IL-2 fueron sistemáticamente más bajas que las observadas para IFN-γ, estas estaban significativamente por encima de los valores de control. La especificidad de las respuestas de CMI se demostró por la falta de reactividad cuando los esplenocitos de todos los grupos se expusieron a antígenos irrelevantes HIV-gag o CMV. La presencia de esplenocitos funcionalmente activos en todos los grupos de ratones se verificó mediante respuestas positivas a la concanavalina A (ConA). Estos resultados indican que el mut-E6/E7 no oncogénico es inmunogénico e induce una respuesta inmunitaria E6/E7 específica del HPV en o por encima del nivel inducido por wt-E6/E7 cuando se expresa a partir de un vector adenoviral.

Inmunizaciones en animales. Todos los estudios en animales se realizaron bajo la aprobación de la revisión institucional de cuidado y uso de los animales. Se inyectaron ratones C57B1/6 macho de 8 a 10 semanas de edad tres veces subcutáneamente a intervalos de 7 días con una solución tampón (N = 4), 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]nulo o 1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]mut-E6/E7. Una cuarta inmunización 2 semanas después de la tercera inmunización sirvió como inyección de refuerzo adicional. Dos semanas después de la última inyección/inmunización, todos los ratones se sacrificaron y se extrajeron los bazos. Los esplenocitos se aislaron para la prueba ELISpot. Se recogió el suero de cada ratón y se almacenó a -20 °C hasta la prueba.

Cultivo de células. Células epiteliales de amígdalas de ratón que expresan HPV16 E6, E7, Ras y Luciferasa (mEERL) (Williams et al. (2009) Head. Neck. 31(7): 911-8) se mantuvieron en DMEM complementado con medio F12 de Hams 22,5 %, FCS inactivado por calor 10 %, 100 U/ml de penicilina, estreptomicina 100 μg/ml, hidrocortisona 0,5 μg/ml, toxina colérica 0,0084 μg/ml, transferrina 5 μg/ml, insulina 5 μg/ml, tri-yodo-tironina 0,00136 μg/ml de EGF 5 μg/ml.

9

imagen18

Claims

imagen1

imagen2