CN110042110A - 用于治疗致癌病毒多肽阳性肿瘤的多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本文件涉及编码诱导对致癌病毒多肽的免疫应答的抗原性多肽的多核苷酸。还提供了包含编码抗原性多肽的多核苷酸的组合物及使用方法。在提供的方法中，所述病毒可以是人乳头瘤病毒。在一些实施方案中，提供一种用于杀死受试者中表达第一致癌病毒多肽的细胞的方法。所述方法包括以足以启动针对所述第一致癌病毒肽的免疫应答的量对所述受试者施用组合物，所述组合物包含药学可接受载体和本文中提供的多核苷酸，且所述免疫应答在所述细胞中有效引起细胞毒性效应。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码第二抗原性多肽的第二核苷酸序列。第一致癌病毒多肽可以是E6，且第二致癌病毒多肽可以是E7。
Description
本申请是申请日为2013年1月23日，申请号201380012419.2，PCT申请号：PCT/US2013/022696，发明名称为“用于治疗致癌病毒多肽阳性肿瘤的多核苷酸”的中国发明专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2012年1月24日提交的临时申请No.61/590,089的优先权，其通过提及完整收入本文。
发明领域
本文中公开的各个实施方案涉及病毒疫苗。具体地，各个实施方案涉及用于治疗癌症的病毒疫苗。
发明背景
已知一些病毒，诸如乳头状瘤病毒(例如HPV16，HPV18)，逆转录病毒(例如HTLV，猫白血病病毒)，疱疹病毒(例如埃巴病毒)，和肝炎病毒(例如HBV)引起人类和其它动物的癌症。虽然利用病毒外壳蛋白或病毒样颗粒的疫苗在预防感染方面经常是成功的，但是需要治疗建立的疾病和病毒相关癌症的疗法。
发明概述
在一些实施方案中，提供了分离的多核苷酸。分离的多核苷酸可以包含编码第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一抗原性多肽包含与第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，能够在免疫感受态宿主中启动对所述第一致癌病毒多肽的免疫应答；及在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码第二抗原性多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二抗原性多肽包含与第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，能够在免疫感受态宿主中启动对所述第二致癌病毒多肽的免疫应答；及在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。
病毒可以是人乳头瘤病毒。第一致癌病毒多肽可以是E6，且第二致癌病毒多肽可以是E7。
所述第一核苷酸序列可以编码具有特定突变的SEQ ID NO:2，例如L50处的点突变或缺失，E148处的点突变或缺失，T149处的点突变或缺失，Q150处的点突变或缺失，和L151处的点突变或缺失。第一核苷酸序列可以编码SEQ ID NO:29。
所述第二核苷酸序列可以编码具有特定突变的SEQ ID NO:4，例如H2处的点突变或缺失，C24处的点突变或缺失，E46处的点突变或缺失，和L67处的点突变或缺失。第二核苷酸序列可以编码SEQ ID NO:30。
在一些实施方案中，提供了组合物。组合物包含药学可接受载体和本文中提供的多核苷酸。多核苷酸可以包含编码第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一抗原性多肽包含与第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，能够在免疫感受态宿主中启动对所述第一致癌病毒多肽的免疫应答；及在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码第二抗原性多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二抗原性多肽包含与第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，能够在免疫感受态宿主中启动对所述第二致癌病毒多肽的免疫应答；及在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。
提供的组合物中的病毒可以是人乳头瘤病毒。在提供的组合物中，第一致癌病毒多肽可以是E6，且第二致癌病毒多肽可以是E7。
提供的组合物中第一核苷酸序列可以编码具有特定突变的SEQ ID NO:2，例如L50处的点突变或缺失，E148处的点突变或缺失，T149处的点突变或缺失，Q150处的点突变或缺失，和L151处的点突变或缺失。组合物中提供的第一核苷酸序列可以编码SEQ ID NO:29。
提供的组合物中第二核苷酸序列可以编码具有特定突变的SEQ ID NO:4，例如H2处的点突变或缺失，C24处的点突变或缺失，E46处的点突变或缺失，和L67处的点突变或缺失。组合物中提供的第二核苷酸序列可以编码SEQ ID NO:30。
在提供的组合物的一些实施方案中，提供的组合物中的药学可接受载体可以是腺病毒包膜。
在一些实施方案中，提供了用于杀死受试者中表达第一致癌病毒多肽的细胞的方法。该方法包括以足以启动针对所述第一致癌病毒肽的免疫应答的量对所述受试者施用组合物，其中组合物包含药学可接受载体和本文中提供的多核苷酸，且免疫应答在所述细胞中有效引起细胞毒性效应。多核苷酸可以包含编码第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一抗原性多肽包含与第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，能够在免疫感受态宿主中启动对所述第一致癌病毒多肽的免疫应答，及在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码第二抗原性多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二抗原性多肽包含与第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，能够在免疫感受态宿主中启动对所述第二致癌病毒多肽的免疫应答；及在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。
在提供的方法中，病毒可以是人乳头瘤病毒。在提供的方法中，第一致癌病毒多肽可以是E6，且第二致癌病毒多肽可以是E7。
在提供的方法中，所述第一核苷酸序列可以编码具有特定突变的SEQ ID NO:2，例如L50处的点突变或缺失，E148处的点突变或缺失，T149处的点突变或缺失，Q150处的点突变或缺失，和L151处的点突变或缺失。在提供的方法中，第一核苷酸序列可以编码SEQ IDNO:29。
在提供的方法中，所述第二核苷酸序列可以编码具有特定突变的SEQ ID NO:4，例如H2处的点突变或缺失，C24处的点突变或缺失，E46处的点突变或缺失，和L67处的点突变或缺失。在提供的方法中，第二核苷酸序列可以编码SEQ ID NO:30。
在提供的方法的一些实施方案中，药学可接受载体可以是腺病毒包膜。
在提供的方法的一些实施方案中，所述细胞可以是新生物(neoplasia)的一部分。在提供的方法的一些实施方案中，所述细胞可以是恶性新生物的一部分。
虽然公开了多个实施方案，从显示和描述本发明的例示性实施方案的以下详细描述看，其它实施方案仍然会对本领域技术人员变得显而易见。因而，图和详细描述视为本质上例示的而非限制的。
附图简述
图1是显示HPV16 E6和E7中突变的示意图。
图2显示用对照逆转录病毒，编码野生型E6/E7的逆转录病毒，和编码突变体E6/E7的逆转录病毒感染的细胞中肿瘤阻抑蛋白表达(A)，HPV16 E6/E7表达(B)，和相对端粒末端转移酶活性(RTA)(C)。
图3显示了用对照逆转录病毒(A)，编码野生型E6/E7的逆转录病毒(B)，和编码突变体E6/E7的逆转录病毒(C)感染的细胞的生长特征。
图4A-B显示了用对照逆转录病毒(LXSN)，编码野生型E6/E7的逆转录病毒，和编码突变体E6/E7的逆转录病毒(B)感染的细胞的生长速率(A)和p53表达。
图5显示了用对照逆转录病毒，编码野生型E6/E7的逆转录病毒，和编码突变体E6/E7的逆转录病毒感染的细胞的生长速率。
图6显示了暴露于指定抗原的用缓冲液对照，对照腺病毒(载体对照)，或编码突变体E6/E7的腺病毒免疫的小鼠的脾细胞的干扰素gamma应答。
图7显示了暴露于指定抗原的用缓冲液对照，对照腺病毒(载体对照)，或编码突变体E6/E7的腺病毒免疫的小鼠的脾细胞的IL-2应答。
图8显示了用对照腺病毒(载体对照)，编码突变体E6/E7的腺病毒，或编码野生型E6/E7的腺病毒接种疫苗的小鼠中的HPV+肿瘤生长。每条线标示个体小鼠中的肿瘤生长。
图9显示了植入有HPV+癌细胞并且用对照腺病毒(Ad5[E1-,E2b-]-null)，或编码突变体E6/E7的腺病毒(Ad5[E1-,E2b-]-E6Δ/E7Δ)接种疫苗的小鼠的存活。
发明详述
本文中公开的各个实施方案涉及抗原性多肽，其在免疫感受态宿主中启动对致癌病毒多肽的免疫应答，但是在免疫感受态宿主中是非致癌的。本文中还提供了包含编码此类抗原性多肽的序列的多核苷酸，包含此类多核苷酸的组合物，和使用方法。
如本文中使用的，致癌病毒多肽是由病毒基因组编码的多肽，所述病毒基因组在宿主细胞中表达时转化细胞。致癌病毒多肽包括但不限于HPV(人乳头瘤病毒)16 E6，HPV16E7，HPV18 E6，HPV18 E7，HBV(乙肝病毒)HBXAg，HCV(丙肝病毒)核心蛋白，HCV NS5A，HTLV(人T细胞亲淋巴病毒)TAX，EBV(埃巴病毒)EBNA，和EBV LMP-1。在一些实施方案中，致癌病毒多肽(例如HPV E6)足以单独转化宿主细胞。在其它实施方案中，致癌病毒多肽仅在存在一种或多种别的特定辅因子(例如其它病毒癌基因，宿主细胞基因突变)的情况下转化宿主细胞。例如，HPV E6可以永生化具有ErbB2突变的细胞，该突变可以诱导一些细胞的侵入性生长。
如本文中使用的，抗原性多肽是在免疫感受态宿主中存在时引发免疫应答的多肽。如本文中使用的，免疫感受态宿主是能够产生导致细胞毒性(例如细胞毒性T细胞介导的细胞毒性或抗体介导的细胞毒性)的免疫应答的动物。
本文中提供的抗原性多肽源自致癌病毒多肽，并且与衍生其的致癌病毒多肽相比含有至少一处突变(例如一个或多个氨基酸的取代，缺失，或添加)。本文中提供的抗原性多肽含有至少一处突变，其在衍生其的致癌病毒多肽转化宿主细胞的相同条件下使其为非致癌的。使致癌病毒多肽为非致癌的突变包括那些失活致癌功能，诸如但不限于破坏对肿瘤阻抑蛋白的结合，破坏活化域，和破坏对DNA的结合的。例如，源自HPV16 E6的抗原性多肽可以包含破坏p53结合位点，端粒末端转移酶活化位点，PDZ结合域，或其组合的突变。在另一个例子中，源自HPV16 E7的抗原性多肽可以包含破坏Rb蛋白结合位点，Mi2β结合位点，或其组合的突变。
本文中提供的抗原性多肽与致癌病毒多肽具有至少70％序列同一性(例如至少72％，至少75％，至少80％，至少85％，至少95％，至少96％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或至少99.7％序列同一性，或70％至99％，75％至99％，80％至99％，或88％至99.9％序列同一性)，并且对表达致癌病毒多肽的细胞引发细胞毒性免疫应答。在一些实施方案中，抗原性多肽和衍生其的致癌病毒多肽是约95.9％相同的，约96.7％相同的，约96.9％相同的，约97.2％相同的，约97.9％相同的，约98.6％相同的，约99％相同的，或约99.3％相同的。抗原性多肽的例子包括SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，和SEQ ID NO:31。
“百分比序列同一性”指任何给定的致癌病毒多肽序列，例如SEQ ID NO:2或SEQID NO:4，和自其衍生的抗原性多肽序列之间的序列同一性程度。抗原性多肽通常具有衍生其的致癌病毒多肽的全长的70％至130％百分比，例如衍生其的致癌病毒多肽的全长的71％，74％，75％，77％，80％，82％，85％，87％，89％，90％，93％，95％，97％，99％，100％，105％，110％，115％，120％，或130％的长度。可以如下测定任何抗原性多肽相对于衍生其的致癌病毒多肽的百分比同一性。将致癌病毒多肽(例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4)与一种或多种候选序列比对，其在商业名称ClustalW(第1.83版，缺省参数)可购得的计算机程序进行，该计算机程序容许核酸或多肽序列在其整个长度间实施比对(全局比对)。Chema等,Nucleic Acids Res.,31(13):3497-500(2003)。
ClustalW计算参照(例如致癌病毒多肽)和一种或多种候选序列(例如源自致癌病毒多肽的抗原性多肽)间的最佳匹配，并且比对它们使得可以检测同一性，相似性和差异。可以将一个或多个残基的缺口插入参照序列，候选序列，或者两者中，从而使序列比对最大化。对于核酸序列的快速成对比对，使用以下缺省参数：字大小：2；窗大小：4；评分方法：百分比；顶部对角线的数目：4；和缺口罚分：5。对于核酸序列的多序列比对，使用以下参数：缺口打开罚分：10.0；缺口延伸罚分：5.0；和权重转变(weight transition)：是。对于蛋白质序列的快速成对比对，使用以下参数：字大小：1；窗大小：5；评分方法：百分比；顶部对角线的数目：5；缺口罚分：3。对于蛋白质序列的多比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；缺口打开罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.05；亲水性缺口：开；疏水性残基：Gly，Pro，Ser，Asn，Asp，Gln，Glu，Arg，和Lys；残基特异性缺口罚分：开。ClustalW输出是反映序列间关系的序列比对。ClustalW可以例如万维网上的欧洲生物信息学研究所站点(ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)运行，或者从例如万维网上的Clustal.org站点(clustal.org/clustal2/)下载。
为了测定抗原性多肽与致癌病毒多肽的百分比同一性，使用ClustalW比对序列，用比对中相同匹配的数目除以参照序列的长度，并且将结果乘以100。注意百分比同一性数值可以四舍五入到最近的十分位。例如，78.11，78.12，78.13，和78.14向下四舍五入到78.1，而78.15，78.16，78.17，78.18，和78.19向上四舍五入到78.2。
本文中提供的多核苷酸(例如SEQ ID NO:34)包括包含编码本文中提供的抗原性多肽的核苷酸序列的双链或单链，线性或环形DNA或RNA。在一些实施方案中，本文中提供的多核苷酸包括超过一种核苷酸序列，其各编码抗原性多肽。在一些实施方案中，多核苷酸可以包含编码相同抗原性多肽的核苷酸序列的多联体(concatamer)。
本文中提供的多核苷酸还包含与编码抗原性多肽的核苷酸序列可操作连接的一种或多种核苷酸序列，其促进从其中含有的抗原性多肽核苷酸序列表达蛋白质。此类序列包括但不限于启动子、增强子、RNA稳定序列、内部核糖体进入位点(IRES)、和蛋白质稳定序列。适合于在提供的多核苷酸中使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子，CMV立即早期启动子，逆转病毒长末端重复(LTR)，可调节启动子(例如四环素或IPTG响应启动子)，和RSV启动子。
在本文中提供的多核苷酸中包含多个编码抗原性多肽的核苷酸序列时，自其表达的多肽可以以分开的蛋白质表达，例如经由分开的启动子或者通过使用IRES，或者它们可以以融合蛋白表达。
在一些实施方案中，本文中提供的多核苷酸包含编码蛋白质标签(例如myc标签或FLAG标签)的核苷酸序列，其与抗原性多肽核苷酸序列可操作连接，使得标签在表达时附接于抗原性多肽。如本文中使用的，为了测定与衍生抗原性多肽序列的致癌病毒多肽的百分比序列同一性，其中不包含蛋白质标签。
在一些实施方案中，本文中提供的多核苷酸包含标志物序列，其促进多核苷酸和/或多核苷酸的蛋白质表达的检测。在一些实施方案中，标志物序列可以编码标志物蛋白质，诸如荧光标志物(例如GFP，RFP，或YFP)以促进从多核苷酸表达蛋白质的检测。在其它实施方案中，标志物序列不编码蛋白质，但是可以使用核酸检测技术，诸如聚合酶链式反应检测。在一些实施方案中，可以使用标志物序列破坏致癌病毒多肽中促成致癌病毒多肽的致癌活性的区域以生成抗原性多肽。在此类情况中，为了测定与衍生抗原性多肽序列的致癌病毒多肽的百分比序列同一性，其中不包含标志物序列，并且剩余的序列可以与衍生其的致癌病毒多肽保留100％序列同一性。
本文中提供的多核苷酸可以使用已知的方法生成，诸如致癌病毒多肽编码多核苷酸(例如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，和SEQ ID NO:5)的定点诱变。
可以将本文中提供的任何多核苷酸掺入药学可接受载体中。合适的药学可接受载体包括但不限于病毒包膜、阳离子脂质载体、自体细胞、质粒载体、和病毒载体。在将本文中提供的多核苷酸掺入病毒包膜中时，它可以包含一种或多种支持对包膜的掺入的包装序列。
在某些实施方案中，将包含本文中提供的多核苷酸和药学可接受载体的组合物配制以导入(例如肠，经皮，静脉内，皮下，或肌肉内)免疫感受态宿主中。在使用中，对有风险被其基因组编码致癌病毒多肽的病毒感染的免疫感受态宿主施用组合物。在一些实施方案中，对免疫感受态宿主施用组合物，所述免疫感受态宿主已经用此类病毒感染，或者表达致癌病毒多肽的细胞(例如癌细胞)。
在依照一个实施方案对免疫感受态宿主施用时，本文中提供的组合物引发对表达致癌病毒多肽的细胞的细胞毒性免疫应答。在一些实施方案中，本文中提供的组合物的施用可以用于治疗，改善，和/或预防受试者中与致癌病毒多肽表达有关的癌症。在一些实施方案中，本文中提供的组合物的施用可以导致表达致癌病毒多肽的细胞群体的减少。可以使用任何合适的手段，诸如例如测量包含表达致癌病毒多肽的细胞的肿瘤的大小变化，或测量表达致癌病毒多肽的循环癌细胞的数目变化测量表达致癌病毒多肽的细胞群体的减少。在一些实施方案中，与已经类似治疗，但是不施用本文中提供的组合物的对照群体相比，具有与致癌病毒多肽表达有关的癌症的受试者群体施用本文中提供的组合物可以导致更长的平均存活。
在一些实施方案中，本文中提供的组合物可以与一种或多种标准疗法(例如放射，手术或化学疗法)组合使用以治疗具有与致癌病毒多肽表达有关的癌症的受试者。在与标准疗法组合使用时，可以在施用标准疗法之前，期间或之后施用本文中提供的组合物。在一些实施方案中，可以调节本文中提供的组合物和/或标准疗法的施用时机以提高组合物或标准疗法之一或两者的效力。例如，本文中提供的组合物可以以初始剂量施用，接着随时间用额外的加强剂量以提高免疫应答。在另一个例子中，可以在化学疗法前或在从化学疗法的免疫恢复后施用本文中提供的组合物以提高足够免疫应答的可能性。
可以以足以引发细胞毒性免疫应答的量将本文中提供的组合物给药。可以调节剂量以引发免疫应答，但不诱导对组合物中载体的系统性不利反应。例如，在使用腺病毒载体时，合适的剂量可以在每剂约108至1012个颗粒的范围中。在一些实施方案中，剂量的量和/或剂量数目可以随着用于促进编码抗原性多肽的表达的序列类型，受试者中的免疫应答强度，或使用的药学可接受载体的类型而调节。
本文中提供的组合物可以包装为预先混合的配制剂或为可以在使用前混合的分开组分。在一些实施方案中，本文中提供的组合物可以在单独的剂量中包装。在其它实施方案中，本文中提供的组合物可以在含有施用前测量的多剂的容器中包装。在一些实施方案中，可以将本文中提供的组合物配制为施用前稀释的浓缩物。在又一些实施方案中，可以通过在施用前混合分开的组分生成本文中提供的组合物。包装可以进一步包含合适的文件，标签，等等。
应当理解，以下实施例并不意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：HPV16 E6/E7的诱变和病毒构建
HPV16 E6/E7诱变。使用体外定点诱变将HPV16 E6和E7中的6处突变引入野生型E6/E7编码核酸中，如图1中显示的。对于称作L50G的突变，在p53结合和端粒末端转移酶活化位点域内E6中的位置50进行亮氨酸至甘氨酸突变。对于称作PDZ的突变，将残基146-151处的E6的C端PDZ结合域用4个丙氨酸残基替代。对于称作H2P的突变，在E7中的Rb结合位点内位置2处用脯氨酸残基取代组氨酸残基。对于称作C24G的突变，在E7中的Rb结合位点内位置24处用甘氨酸残基替换半胱氨酸残基。对于称作E46A的突变，在E7中的Rb结合位点内位置46处，将谷氨酸残基改变成丙氨酸。对于称作L67R的突变，在E7的Mi2β结合区内在位置67处进行亮氨酸至精氨酸突变。按照制造商的指导(Agilent Technologies#200521)使用表1中列出的引物对编码HPV16 E6和E7的核酸(SEQ ID NO:5)实施定点诱变。
表1
将突变的构建体克隆到腺病毒穿梭载体Ad5 VQ中。通过直接DNA测序确认最终构建体的保真性。
病毒构建。将含有突变体E6/E7(称作[E1-,E2b-]mut-E6/E7)和野生型E6/E7(称作[E1-,E2b-]wt-E6/E7)的E1和E2b缺陷型Ad5 CMV载体(称作[E1-,E2b-]的空载体)构建并生成，如先前描述的(Amalfitano等(1998)J.Virol.72(2):926-33)。简言之，使用基于同源重组的方法将野生型和突变体E6/E7序列亚克隆到Ad5[E1-,E2b-]载体的E1区中。将复制缺陷病毒在E.C7包装细胞系中增殖，用CsCl2纯化，并滴定。将病毒感染滴度在E.C7细胞单层上以空斑形成单位(PFU)测定。通过十二烷基硫酸钠(SDS)破坏及260nm和280nm的分光光度法测定病毒颗粒(VP)浓度。VP与空斑形成单位(PFU)的比率是36.7/1VP/PFU。然后，将mut-E6/E7插入物及wt-E6/E7切割，并且使用EcoRI和BamHI限制性位点连接到逆转录病毒载体pLXSN中。依照推荐的方法(Nolan Lab,Stanford University,California)在Phoenix A细胞系中生成逆转录病毒颗粒，其中聚凝胺(polybrene)(Sigma H9268)添加至终浓度8μg/ml。
实施例2：E6/E7突变对肿瘤发生的影响
人腺癌肺泡基底上皮细胞系中的肿瘤发生。为了测定突变的E6/E7是否促进肿瘤发生，将A549细胞(人腺癌肺泡基底上皮细胞系)用含有wt-E6/E7(SEQ ID NO:6)，mut-E6/E7(SEQ ID NO:31)，或对照载体的逆转录病毒感染，并用环克隆。通过western印迹分析克隆。图2A显示了wt-E6/E7的表达降低PTPN13，pRb，和p53蛋白表达，而PTPN13，pRb，和p53表达水平在mut-E6/E7表达细胞中与对照类似。对克隆的PCR分析确认mut-E6/E7以与wt-E6/E7相似的水平表达(图2B)，提示了根据Western印迹明显的变化是改变的E6/E7功能而不是表达水平的结果，并且确认了mut-E6/E7构建体中的致癌功能丧失。还在这些克隆中检查端粒末端转移酶活性。与wt-E6/E7相比，mut-E6/E7和载体对照显示显著更小的相对端粒末端转移酶活性(RTA)(图2C)。由于wt-E6/E7诱导形态学间充质类型变化，还检查克隆的形态学特征。图3显示了对照和mut-E6/E7在紧密集落中生长，而wt-E6/E7表达诱导形态学的间充质样变化，并且细胞以非粘附方式生长。这些数据共同提示了与wt-E6/E7的表达不一样，mut-E6/E7的稳定表达不诱导与细胞转化有关的生物化学或形态学变化。
原代人上皮细胞的转化。为了进一步显示了mut-E6/E7不转化细胞，用含有wt-E6/E7，mut-E6/E7，或空载体(LXSN)的逆转录病毒感染原代人扁桃体上皮(HTE)。未感染的THE细胞(HTE052)充当另外的对照。wt-E6/E7的表达导致细胞永生化。然而，表达mut-E6/E7及对照的THE没有永生化(图4A)。这些结果证明了即使从整合型逆转录病毒表达的mut-E6/E7的稳定表达不导致细胞永生化。
为了测定原代人扁桃体角质形成细胞的非复制型腺病毒病毒载体感染中的wt-E6/E7或mut-E6/E7是否可以导致转化，用表达GFP，[E1-,E2b-]mut-E6/E7，或[E1-,E2b-]wt-E6/E7的[E1-,E2b-]感染HTE。Wt-E6/E7能够诱导p53损失(图4B)，然而wt-E6/E7或mut-E6/E7在感染后都不能永生化原代扁桃体上皮细胞(图5)。为了测定这是否是由于伴随复制的病毒损失，我们在细胞生长的情况下检查病毒DNA的持续性。实施Q-PCR，并且其证明随细胞复制，病毒DNA在所有插入物的情况下以相似的速率损失，提示了病毒基因没有整合到宿主细胞DNA中。因此，[E1-,E2b-]腺病毒载体中的HPV基因不随分裂而持续，并且从复制缺陷腺病毒载体瞬时表达wt-E6/E7不足以转化原代细胞。
细胞培养物。在补充有10％胎牛血清(Thermo Fisher#SH3007103)的Dulbecco改良Eagle培养基(Thermo Fisher#SH30022.01)中培养A549细胞。使用已知技术(Williamset al.(2009)Head Neck.31(7):911-8)在机构IRB批准下从得到同意的患者的手术扁桃体切除术分离原代人扁桃体上皮细胞(HTE)。将原代HTE在角质形成细胞SFM培养基(KSFM,Invitrogen#17005-042)中维持。
逆转录病毒感染。将HTE和A549细胞用含有wt-E6/E7，mut-E6/E7，或空载体逆转录病毒的逆转录病毒上清液感染，并于37℃在5％CO2情况下温育过夜。在感染后24小时吸出培养基，并给新鲜培养基补充新霉素(RPI#G64000)以进行选择。将个别集落用环克隆，并且置于800ug/ml新霉素选择下。使用逆转录病毒感染的克隆显示的数据代表测试的多个克隆。由于它们的细胞生长密度依赖性，没有将THE细胞系置于抗生素选择下，而是在KSFM中维持，直到细胞死亡或永生化。
进行标准的PCR以分析表达LXSN，LXSN wt-E6/E7，或LXSN mut-E6/E7的稳定细胞系中的mRNA，从而确认对mut-E6/E7进行的变化不影响E6/E7转录速率。使用E6/E7正向引物5’-CAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTA-3’(SEQ ID NO:19)和E6/E7反向引物5’-GCTTTTTGTCCAGATGTCTTTGC-3’(SEQ ID NO:20)实施PCR，并且相对于使用GAPDH正向引物5’-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’(SEQ ID NO:21)和GAPDH反向引物5’-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO:22)得到的GADPH水平标准化表达水平。所有引物浓度是450nM。预温育是94℃持续10分钟。循环条件是94℃持续40秒，55℃持续40秒，和72℃持续1分钟，总共为30个循环。
腺病毒感染。将培养至80％汇合的原代人扁桃体上皮细胞用[E1-,E2b-]null，[E1-,E2b-]wt-E6/E7，[E1-,E2b-]mut-E6/E7或Ad GFP以MOI为100感染24小时。在感染后第4、5、和6代收集DNA。将细胞用胰蛋白酶处理，漂洗并在1倍磷酸盐缓冲盐水中重悬。使用来自DNeasy DNA血液和组织试剂盒(Qiagen#69504)的标准动物组织旋转柱方案实施DNA提取。
Q-PCR。实施定量实时聚合酶链式反应以测定HPV16拷贝数，其使用HPV16引物组520 5’-TTGCAGATCATCAAGAACACGTAGA-3’(SEQ ID NO:32)和671 5’-CTTGTCCAGCTGGACCATCTATTT-3’(SEQ ID NO:33)进行。使用来自Applied Biosystems的18S引物组作为对照。扩增反应包括SyberGreen通用主混合物(Applied Biosystems)，250nM(HPV16引物组)或100nM(18S引物组)每种引物，和25ng模板。循环条件是95℃持续10分钟，于95℃持续15秒和60℃持续60秒的40个循环，其使用Stratagene Mx3000P热循环仪进行。
Western印迹分析。将稳定的细胞系A549 wt-E6/E7，A549 mut-E6/E7和亲本A549细胞培养至80-90％汇合，用PBS漂洗，并用裂解溶液(50mM Tris HCl pH 7.5；150mM NaCl；5mM EDTA；2mM Na3VO4；100mM NaF；10mM NaPPi；10％甘油；1％Triton；1XHalt蛋白酶抑制剂；17.4μg/μl PMSF)收获。通过离心(10,000rpm于4℃)将膜沉淀，并收集可溶性蛋白质。使用BCA蛋白质测定试剂盒按照制造商的指示(Pierce)量化总蛋白质，并通过western印迹分析相等的总蛋白质。简言之，通过SDS-PAGE分离蛋白质，将其转移至PVDF膜(Immobilon-P)，用5％牛血清清蛋白(MP Biomedicals)或脱脂奶粉封闭，并通过化学发光在胶片上或经由UVP生物成像系统(Upland,CA)显现。将膜与以下抗体一起温育：FAP-1(1:500,Santa Cruzsc15356)，p53(1:500,Calbiochem OP43)，pRb(1:250,BD Biosciences 554136)和GAPDH(1:5000,Ambion#Am4300)。
实施例3：HPV特异性的细胞介导的免疫应答
响应突变体E6/E7的细胞介导的免疫。为了测定使其为非致癌的E6/E7中的突变是否在体外在[E1-,E2b-]腺病毒载体的背景中改变启动HPV特异性免疫应答的能力，从对照和免疫的小鼠收获脾，并且检查脾细胞在通过E6/E7或来自用E6/E7永生化的细胞的裂解物刺激时分泌IFN-γ和IL-2的能力。使用酶联免疫点(immunospot)(ELISpot)分析通过评估在从个体小鼠的组收获的脾细胞中IFN-γ和IL-2分泌细胞的数目在对照非接种疫苗的和接种疫苗的小鼠中测定细胞介导的免疫(CMI)应答。如图6和7中显示的，在用Ad5[E1-,E2b-]mut-E6/E7免疫的小鼠中检测到CMI应答。这通过免疫小鼠而非用缓冲液溶液或Ad5[E1-,E2b-]null注射的对照小鼠中诱导的IFN-γ(图6)和IL-2(图7)点形成细胞(SFC)的显著升高水平证明。虽然IL-2SFC应答一致性地低于那些对IFN-γ观察到的应答，但是它们显著升高到高于对照值。CMI应答的特异性通过将来自所有组的脾细胞暴露于无关抗原HIV-gag或CMV时缺乏反应性证明。通过对伴刀豆球蛋白A(ConA)的阳性应答确认所有小鼠组中功能活性脾细胞的存在。这些结果指示非致癌性mut-E6/E7是免疫原性的，并且诱导HPV特异性E6/E7免疫应答，处于或高于在从腺病毒载体表达时由wt-E6/E7诱导的应答水平。
动物免疫。在机构动物护理和使用审阅的批准下实施所有动物研究。以7天时间间隔三次给雄性C57Bl/6小鼠8至10周龄皮下注射缓冲液溶液(N＝4)，1010个VP Ad5[E1-,E2b-]null，或1010个VP Ad5[E1-,E2b-]mut-E6/E7。第3次免疫后2周的第4次免疫充当额外的加强注射。最后一次注射/免疫后2周，将所有小鼠处死，并收获脾。将脾细胞分离以用于ELISpot测试。将每只小鼠的血清收集，并将其于-20℃贮存，直至测试。
细胞培养。将表达HPV16 E6，E7，Ras，和萤光素酶(luciferace)的小鼠扁桃体上皮细胞(mEERL)(Williams等(2009)Head.Neck.31(7):911-8)在补充有22.5％Hams F-12培养基，10％热灭活FCS，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.5μg/mL氢化可的松，0.0084μg/mL霍乱毒素，5μg/mL运铁蛋白，5μg/mL胰岛素，0.00136μg/mL三碘甲腺原氨酸，和5μg/mL EGF的DMEM中维持。
HPV+细胞裂解物制备。将HPV+(mEERL)细胞在2个T125烧瓶中培养，直到汇合，此后将细胞在无菌条件下刮离塑料表面，用无菌PBS清洗三次，并在1mL无菌PBS中重悬。通过冻融3次裂解细胞，并通过离心除去细胞碎片。用无菌PBS使可溶性蛋白质达到总体积2mL。通过如别处(Gabitzsch等(2009)Immunol.Lett.122(1):44-51)描述的那样实施的western印迹分析确认裂解物中HPV-E7的存在。
ELISpot分析。通过ELISpot检测免疫后从个别小鼠分离的脾细胞的HPV16-E6和E7特异性IFN-γ和IL-2生成，如别处描述的(Gabitzsch等(2009)Vaccine.27(46):6394-8)。简言之，用HPV16 E6和E7肽(对于每种为15聚体肽完全集；JPT Peptide Technologies,Berlin,Germany)刺激细胞。外周血单核细胞(PBMC)以2x105个细胞/孔的浓度使用，并且以每孔每106个细胞的点形成细胞(SFC)的数目报告。将所有E6肽组合，并且以单一合并物测试。类似地，将所有E7肽组合，并且以单一合并物测试。一式两份测试每个肽集合物。为了测试特异性，将脾细胞暴露于HIV-gag肽合并物和巨细胞病毒(CMV)肽合并物。以0.1μg每种肽/孔利用肽。为了测试对mEERL细胞裂解物的反应性，将25μL裂解物一式两份添加至测试孔。在所有ELISpot测定法中，以1μg/孔浓度用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的细胞充当阳性对照。使用Immunospot ELISpot读板仪(Cellular Technology,Shaker Heights,OH)计算有色的SFC，并且若1)扣除阴性对照后每106个细胞检出50个SFC或者2)SFC比阴性对照孔中的那些SFC大至少2倍并且显著升高，则认为响应呈阳性。
统计学分析。通过Student t检验测定动物组间的均值免疫应答的统计学显著差异，其中认为P值为0.05或更低是显著的，其使用GraphPad(GraphPad Software,Inc.)进行。
实施例4：HPV+肿瘤模型中的存活
为了测试对非致癌mut-E6/E7的免疫应答会与化学放射(chemoradiation)协同，因为已经证明了wt-E6/E7在腺病毒背景中如此，使用HPV+相关HNSCC的小鼠模型。在野生型小鼠中产生HPV+肿瘤，该小鼠然后接受与顺铂和放射(顺铂/xrt)组合的用表达mut-E6/E7(Ad5[E1-,E2b-]-E6Δ/E7Δ)或腺病毒对照(Ad5[E1-,E2b-]-null)的腺病毒的鼻内免疫。仅接受顺铂/xrt(历史数据)或顺铂/xrt+[E1-,E2b-]载体对照(Ad空)的小鼠具有相似的肿瘤生长和长期的存活。然而，接受mut-E6/E7或wt-E6/E7的小鼠具有显著改善的存活。mut-E6/E7小鼠显示了肿瘤生长和存活的最佳总体控制(图8和9)。这些数据确认mut-E6/E7在HPV相关癌症的标准疗法期间在体内增强免疫相关清除。
细胞培养。如实施例3中描述的那样将mEERL维持。
HPV+细胞制备。将HPV+(mEERL)细胞在单一T125烧瓶中培养，直到汇合，此后将细胞刮离塑料表面，并清洗。
肿瘤模型。雄性C57BlJ/6小鼠获自Jackson Labs，并且由Sanford Research LARF依照USDA指南维持。所有实验得到Sanford Research IACUC批准，并且在机构指南内实施。简言之，使用23号针，将1x106个mEERL细胞皮下植入小鼠的右后体侧中。在存在可触知的肿瘤后，在第7天，第14天，和第21天，对小鼠鼻内给予1010个病毒颗粒腺病毒对照(Ad5[E1-,E2b-]-null)，或编码mut-E6/E7的腺病毒(Ad5[E1-,E2b-]-E6Δ/E7Δ)。以20mg/m2将顺铂溶解于抑菌性0.9％氯化钠(Hospira Inc.Lake Forest,Il.)中，并且在肿瘤植入后13，20，和27天时腹膜内施用。与顺铂治疗同时用8Gy X-射线放射疗法(RadSource RS2000irradiator,Brentwood,TN)处理小鼠。使用测径器测量每周监测肿瘤的生长，并且使用以下公式计算肿瘤体积：体积＝(宽度2)(深度)。当肿瘤在任何维度达到1.5cm时对小鼠实施安乐死，动物变得消瘦，或者证明功能性腿损伤。对长期存活追踪大于70天。
实施例5：其它致癌病毒多肽。
实施例1-4中概述的方法可以用于生成源自其它致癌病毒多肽且有效启动对相应致癌病毒多肽的免疫应答的多肽。
在一个例子中，改变EBV癌基因LMP和EBNA之一或两者以使其变为非致癌的。单独或与顺铂和/或放射组合使用此类改变的EBV癌基因作为疗法，用于鼻咽癌。
在另一个例子中，改变HPV癌基因以治疗卡波西肉瘤。
可以在不偏离本发明的范围的前提下对讨论的例示性实施方案进行各种修改和添加。例如，虽然上文描述的实施方案涉及具体特征，但是本发明的范围还包括具有不同特征组合的实施方案和不包括所有上文描述的特征的实施方案。
序列表
<110> 桑福德健康公司
<120> 用于治疗致癌病毒多肽阳性肿瘤的多核苷酸
<130> 425909.000003
<150> 61/509,089
<151> 2012-01-24
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 456
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒类型16
<400> 1
atgtttcagg acccacagga gcgacccaga aagttaccac agttatgcac agagctgcaa 60
acaactatac atgatataat attagaatgt gtgtactgca agcaacagtt actgcgacgt 120
gaggtatatg actttgcttt tcgggattta tgcatagtat atagagatgg gaatccatat 180
gctgtatgtg ataaatgttt aaagttttat tctaaaatta gtgagtatag acattattgt 240
tatagtttgt atggaacaac attagaacag caatacaaca aaccgttgtg tgatttgtta 300
attaggtgta ttaactgtca aaagccactg tgtcctgaag aaaagcaaag acatctggac 360
aaaaagcaaa gattccataa tataaggggt cggtggaccg gtcgatgtat gtcttgttgc 420
agatcatcaa gaacacgtag agaaacccag ctgtaa 456
<210> 2
<211> 151
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒类型16
<400> 2
Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys
1 5 10 15
Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr
20 25 30
Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg
35 40 45
Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp
50 55 60
Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu
85 90 95
Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg
130 135 140
Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150
<210> 3
<211> 297
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒类型16
<400> 3
atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60
gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120
ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180
tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240
gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297
<210> 4
<211> 98
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒类型16
<400> 4
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1 5 10 15
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Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
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65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 5
<211> 753
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒类型16
<400> 5
atgtttcagg acccacagga gcgacccaga aagttaccac agttatgcac agagctgcaa 60
acaactatac atgatataat attagaatgt gtgtactgca agcaacagtt actgcgacgt 120
gaggtatatg actttgcttt tcgggattta tgcatagtat atagagatgg gaatccatat 180
gctgtatgtg ataaatgttt aaagttttat tctaaaatta gtgagtatag acattattgt 240
tatagtttgt atggaacaac attagaacag caatacaaca aaccgttgtg tgatttgtta 300
attaggtgta ttaactgtca aaagccactg tgtcctgaag aaaagcaaag acatctggac 360
aaaaagcaaa gattccataa tataaggggt cggtggaccg gtcgatgtat gtcttgttgc 420
agatcatcaa gaacacgtag agaaacccag ctgtaaatgc atggagatac acctacattg 480
catgaatata tgttagattt gcaaccagag acaactgatc tctactgtta tgagcaatta 540
aatgacagct cagaggagga ggatgaaata gatggtccag ctggacaagc agaaccggac 600
agagcccatt acaatattgt aaccttttgt tgcaagtgtg actctacgct tcggttgtgc 660
gtacaaagca cacacgtaga cattcgtact ttggaagacc tgttaatggg cacactagga 720
attgtgtgcc ccatctgttc tcagaaacca taa 753
<210> 6
<211> 249
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒类型16
<400> 6
Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys
1 5 10 15
Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr
20 25 30
Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg
35 40 45
Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp
50 55 60
Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu
85 90 95
Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg
130 135 140
Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His
145 150 155 160
Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr
165 170 175
Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro
180 185 190
Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
195 200 205
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
210 215 220
Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile
225 230 235 240
Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
245
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gactattttg cttttcggga tggatg 26
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
cccatctcta tatactatgc atccatc 27
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gaactcgtag agcagccgcg gcgta 25
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gtgtatctcc atgcatgatt acgccg 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cagccgcggc gtaatcatgc ctgga 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gcaatgtagg tgtatctcca ggcatg 26
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ccagagacaa ctgatctcta cggtta 26
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gctgtcattt aattgctcat aaccgta 27
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ggtccagctg gacaagcagc accgg 25
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
gtaatgggct ctgtccggtg ctgctt 26
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
cgtgtgtgct ttgtacgcac ctccga 26
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gtgtgactct acgcttcgga ggtgc 25
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
caaaccgttg tgtgatttgt taatta 26
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gctttttgtc cagatgtctt tgc 23
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
gggaaggtga aggtcggagt 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
tggaagatgg tgatgggatt tc 22
<210> 23
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E6 L50G突变体
<400> 23
Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys
1 5 10 15
Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr
20 25 30
Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg
35 40 45
Asp Gly Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp
50 55 60
Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu
85 90 95
Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg
130 135 140
Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150
<210> 24
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E6 PDZ突变体
<400> 24
Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys
1 5 10 15
Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr
20 25 30
Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg
35 40 45
Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp
50 55 60
Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu
85 90 95
Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg
130 135 140
Thr Arg Arg Ala Ala Ala Ala
145 150
<210> 25
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E7 H2P突变体
<400> 25
Met Pro Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 26
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E7 C24G突变体
<400> 26
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 27
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E7 E46A突变体
<400> 27
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Ala Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 28
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E7 L67R突变体
<400> 28
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Arg Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 29
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E6 L50G/PDZ突变体
<400> 29
Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys
1 5 10 15
Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr
20 25 30
Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg
35 40 45
Asp Gly Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp
50 55 60
Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu
85 90 95
Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg
130 135 140
Thr Arg Arg Ala Ala Ala Ala
145 150
<210> 30
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E7 H2P/C24G/E46A/L67R突变体
<400> 30
Met Pro Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Ala Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Arg Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 31
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E6 L50G/PDZ E7 H2P/C24G/E46A/L67R突变体
<400> 31
Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys
1 5 10 15
Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr
20 25 30
Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg
35 40 45
Asp Gly Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp
50 55 60
Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu
85 90 95
Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg
130 135 140
Thr Arg Arg Ala Ala Ala Ala Met Pro Gly Asp Thr Pro Thr Leu His
145 150 155 160
Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr
165 170 175
Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro
180 185 190
Ala Gly Gln Ala Ala Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
195 200 205
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Arg Cys Val Gln Ser Thr His
210 215 220
Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile
225 230 235 240
Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
245
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
ttgcagatca tcaagaacac gtaga 25
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
cttgtccagc tggaccatct att 23
<210> 34
<211> 755
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人乳头瘤病毒类型16 E6 L50G/PDZ E7 H2P/C24G/E46A/L67R突变体
<400> 34
atgtttcagg acccacagga gcgacccaga aagttaccac agttatgcac agagctgcaa 60
acaactatac atgatataat attagaatgt gtgtactgca agcaacagtt actgcgacgt 120
gaggtatatg actttgcttt tcgggatgga tgcatagtat atagagatgg gaatccatat 180
gctgtatgtg ataaatgttt aaagttttat tctaaaatta gtgagtatag acattattgt 240
tatagtttgt atggaacaac attagaacag caatacaaca aaccgttgtg tgatttgtta 300
attaggtgta ttaactgtca aaagccactg tgtcctgaag aaaagcaaag acatctggac 360
aaaaagcaaa gattccataa tataaggggt cggtggaccg gtcgatgtat gtcttgttgc 420
agatcatcaa gaactcgtag agcagccgcg gcgtaatcat gcctggagat acacctacat 480
tgcatgaata tatgttagat ttgcaaccag agacaactga tctctacggt tatgagcaat 540
taaatgacag ctcagaggag gaggatgaaa tagatggtcc agctggacaa gcagcaccgg 600
acagagccca ttacaatatt gtaacctttt gttgcaagtg tgactctacg cttcggaggt 660
gcgtacaaag cacacacgta gacattcgta ctttggaaga cctgttaatg ggcacactag 720
gaattgtgtg ccccatctgt tctcagaaac cataa 755
Claims (25)
1.一种分离的多核苷酸，其包含编码第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一抗原性多肽：
a.包含与第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
b.能够在免疫感受态宿主中启动对所述第一致癌病毒多肽的免疫应答；及
c.在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码第二抗原性多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二抗原性多肽：
a.包含与第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
b.能够在免疫感受态宿主中启动对所述第二致癌病毒多肽的免疫应答；及
c.在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。
3.权利要求2的多核苷酸，其中所述病毒是人乳头瘤病毒。
4.权利要求3的多核苷酸，其中所述第一致癌病毒多肽是E6，且所述第二致癌病毒多肽是E7。
5.权利要求4的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列编码具有选自下组的突变的SEQID NO:2：
a.L50处的点突变或缺失；
b.E148处的点突变或缺失；
c.T149处的点突变或缺失；
d.Q150处的点突变或缺失；和
e.L151处的点突变或缺失。
6.权利要求4的多核苷酸，其中所述第二核苷酸序列编码具有选自下组的突变的SEQID NO:4：
a.H2处的点突变或缺失；
b.C24处的点突变或缺失；
c.E46处的点突变或缺失；和
d.L67处的点突变或缺失。
7.权利要求4的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列编码SEQ ID NO:29，且所述第二核苷酸序列编码SEQ ID NO:30。
8.一种组合物，其包含：
a.药学可接受载体；和
b.多核苷酸，所述多核苷酸包含编码第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一抗原性多肽：
i.包含与第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
ii.能够在免疫感受态宿主中启动对所述第一致癌病毒多肽的免疫应答；及
iii.在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。
9.权利要求8的组合物，其中所述多核苷酸包含编码第二抗原性多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二抗原性多肽：
a.包含与第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
b.能够在免疫感受态宿主中启动对所述第二致癌病毒多肽的免疫应答；及
c.在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。
10.权利要求9的组合物，其中所述病毒是人乳头瘤病毒。
11.权利要求10的组合物，其中所述第一致癌病毒多肽是E6，且所述第二致癌病毒多肽是E7。
12.权利要求11的组合物，其中所述第一核苷酸序列编码具有选自下组的突变的SEQID NO:2：
a.L50处的点突变或缺失；
b.E148处的点突变或缺失；
c.T149处的点突变或缺失；
d.Q150处的点突变或缺失；和
e.L151处的点突变或缺失。
13.权利要求11的组合物，其中所述第二核苷酸序列编码具有选自下组的突变的SEQID NO:4：
a.H2处的点突变或缺失；
b.C24处的点突变或缺失；
c.E46处的点突变或缺失；和
d.L67处的点突变或缺失。
14.权利要求11的组合物，其中所述第一核苷酸序列编码SEQ ID NO:29，且所述第二核苷酸序列编码SEQ ID NO:30。
15.权利要求8的组合物，其中所述药学可接受载体是腺病毒包膜。
16.一种用于杀死受试者中表达第一致癌病毒多肽的细胞的方法，该方法包括以足以启动针对所述第一致癌病毒肽的免疫应答的量对所述受试者施用组合物，所述组合物包含：
a.药学可接受载体；和
b.多核苷酸，所述多核苷酸包含编码第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一抗原性多肽：
i.包含与第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
ii.能够在免疫感受态宿主中启动对所述第一致癌病毒多肽的免疫应答；及
iii.在所述免疫感受态宿主中是非致癌的；
所述免疫应答在所述细胞中有效引起细胞毒性效应。
17.权利要求16的方法，其中所述多核苷酸包含编码第二抗原性多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二抗原性多肽：
i.包含与第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；
ii.能够在免疫感受态宿主中启动对所述第二致癌病毒多肽的免疫应答；及
iii.在所述免疫感受态宿主中是非致癌的。
18.权利要求17的方法，其中所述细胞是新生物的一部分。
19.权利要求18的方法，其中所述新生物是恶性的。
20.权利要求17的方法，其中所述病毒是人乳头瘤病毒。
21.权利要求20的方法，其中所述第一致癌病毒多肽是E6，且所述第二致癌病毒多肽是E7。
22.权利要求21的方法，其中所述第一核苷酸序列编码具有选自下组的突变的SEQ IDNO:2：
a.L50处的点突变或缺失；
b.E148处的点突变或缺失；
c.T149处点突变或缺失；
d.Q150处的点突变或缺失；和
e.L151处的点突变或缺失。
23.权利要求21的方法，其中所述第二核苷酸序列编码具有选自下组的突变的SEQ IDNO:4：
a.H2处的点突变或缺失；
b.C24处的点突变或缺失；
c.E46处的点突变或缺失；和
d.L67处的点突变或缺失。
24.权利要求21的方法，其中所述第一核苷酸序列编码SEQ ID NO:29，且所述第二核苷酸序列编码SEQ ID NO:30。
25.权利要求17的方法，其中所述药学可接受载体是腺病毒包膜。
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