BRPI1003749B1 - Proteína híbrida, sequência recombinante de ácidos nucleicos, vetor/plasmídeo, seus usos, e formulação farmacêutica e/ou veterinária para o controle de tumores induzidos pelo vírus do papiloma humano e/ou doenças infecciosas ou degenerativas - Google Patents

Abstract

proteína híbrida, sequência de ácidos nucleicos recombinante, vetores/ plasmídeos, formulações farmacêuticas e/ou veterinárias e seus usos no controle de tumores induzidos pelo vírus do papiloma humano e/ou doenças infecciosas ou degenerativas. a presente invenção provê uma proteina hibrida, não- natural, formada pela fusão genética da oncoproteína e7 do vírus do papiloma humano tipo- 16 (hpv- 16) com uma forma modificada da glicoproteina d (gd) do herpes simplex tipo- 1 (hsv- 1), deletada em seu peptídeo sinal e na região c-terminal que inclui a sequência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática (correspondente a sequência de aminoácidos 320 a 344), sequência de ácidos nucleicos recombinante (seq. id. no. 1 e seq. id. no. 2) que codifica a proteína recombinante, vetores/plasmídeos contendo a sequência recombinante e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias que contenham a proteína híbrida e/ou a sequência recombinante que a codifique, preferencialmente, na forma de vacinas. adicionalmente, o presente pedido de patente destina-se ao uso da construção genética, como adjuvante vacinal a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para o controle de tumores induzidos por vírus do papiloma humano e infecções por vírus herpes.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção provê uma proteína híbrida (SEQ. ID. No. 8), não-natural, formada pela fusão genética da oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) com uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal e na região C-terminal que inclui a sequência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática, sequência de ácidos nucleicos recombinante (SEQ. ID. No. 7) que codifica a proteína recombinante, vetores/plasmídeos contendo a sequência recombinante e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias que contenham a proteína hibrida e/ou a sequência recombinante que a codifique, preferencialmente, na forma de vacinas. Adicionalmente, o presente pedido de patente destina-se ao uso da construção genética, como adjuvante vacinal a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para o controle de tumores induzidos por vírus do papiloma humano e infecções por vírus herpes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Aproximadamente 500.000 novos casos de câncer de colo de útero são detectados anualmente, sendo o segundo tipo de câncer mais comum entre as mulheres em todo o mundo causando em torno de 270.000 mortes por ano. Dados comprovam que o vírus do papiloma humano (HPV) é o agente presente em mais de 99% dos casos de câncer cervical, e por isso é considerado o agente etiológico desta doença. Atualmente, estão descritos aproximadamente 200 genótipos distintos de HPV e o genótipo do HPV-16 é o mais frequentemente associado ao desenvolvimento de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) e de tumores, encontrado em aproximadamente 50% dos casos de câncer de colo de útero. Os genótipos do HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-45 são frequentemente encontrados em tecidos tumorais do colo do útero, sendo chamados de genótipos de alto risco. Os tipos de HPV que causam verrugas e lesões benignas e raramente são encontrados em carcinomas invasivos são chamados de genótipos de baixo risco, como o HPV-6 e o HPV-11 (WALBOOMERS, J. M.; JACOBS, M. V.; MANOS, M. M. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J. Pathol., v. 189, p. 12-19, 1999).

[0003] As proteínas E6 e E7 dos genótipos dos HPVs de alto risco são capazes de degradar o produto do gene supressor de tumor p53 e interferir no ciclo celular, através de pRB, respectivamente (YUGAWA, T.; KIYONO, T. Molecular mechanisms of cervical carcinogenesis by high- risk human papillomaviruses: novel functions of E6 and E7 oncoproteins. Rev. Med. Virol., v. 19, p. 97-113, 2009). As proteínas E6 e E7 são expressas constitutivamente em neoplasias cervicais e tumores e são essenciais para a manutenção do ciclo viral. Além de controlar o ciclo celular das células infectadas, as oncoproteínas E6 e E7 modulam o sistema imune de forma que as células tumorais tornem-se pouco imunogênicas (TINDLE, R. W. Immune evasion in human papillomavirus- associated cervical cancer. Nat. Rev. Cancer, v. 2, n. 1, p. 59-65, 2002).

[0004] Duas vacinas profiláticas baseadas na proteína L1 do capsídeo viral de HPV-6, -11, -16 e 18 (Gardasil) ou HPV-16 e -18 (Cervarix) estão disponíveis no mercado. Elas apresentam boa eficácia em mulheres que ainda não tiveram contato com o vírus mas não protegem mulheres em que a infecção está estabelecida ou que apresentam lesões, já que os anticorpos neutralizantes gerados nesta abordagem não são capazes de eliminar o vírus ou inibir o crescimento dos tumores. As vacinas com enfoque terapêutico visam desencadear respostas imunológicas baseadas em linfócitos T citotóxicos, capazes de localizar e matar as células tumorais sem atacar as células sadias são mais eficientes nestes casos. Esta estratégia vacinal vem sendo largamente explorada devido a milhões de mulheres infectadas pelo vírus e que podem vir a desenvolver tumores, visto que o HPV é geralmente contraído por mulheres jovens mas normalmente o câncer se manifesta apenas depois dos 50 anos de idade.

[0005] Diferentes estratégias vacinais com enfoque terapêutico vêm sendo testadas nos últimos anos com o objetivo de induzir resposta citotóxica contra as células neoplásicas que expressam as oncoproteínas do HPV-16, E6 e E7. Tais vacinas tem com objetivo controlar o câncer ou impedir seu surgimento em pessoas que foram infectadas pelo vírus ou apresentam o processo tumoral em diferentes estágios de desenvolvimento. São elas: vacinas de proteína purificada, fusionada ou não a adjuvantes, vacinas de DNA, vacinas virais ou de bactérias recombinantes, vacinas de células dendríticas e vacinas que utilizam peptídeos.

[0006] Testes com proteínas purificadas utilizadas como formulação vacinal contra o HPV vêm sendo realizados e revelam algumas vantagens: não apresentam restrição de MHC (Complexo Principal de Histocompatibilidade) e são menos dependente do HLA (Antígeno Leucocitário Humano) do paciente, além de ser consideradas biologicamente mais seguras em relação às vacinas de DNA. Uma vacina baseada em proteínas purificadas foi desenvolvida compreendendo as oncoproteínas do HPV-16 E6 e E7 fusionadas à L2, proteína do capsídeo viral, denominada TA-CIN. A vacina foi administrada sem adjuvantes pela via intramuscular e desencadeou resposta de células T citotóxicas contra as oncoproteínas E6 e E7 e de anticorpos neutralizantes (IgG) contra proteínas do capsídeo do HPV em modelo murino mas os resultados não foram muito promissores em humanos (DE JONG, A.; O'NEILL, T.; KHAN, A. Y.; KWAPPENBERG, K. M.; CHISHOLM, S. E.; WHITTLE, N. R.; DOBSON, J. A.; JACK, L. C.; ST. CLAIR ROBERTS, J. A.; OFFRINGA, R.; VAN DER BURG, S. H.; HICKLING J. K. Enhancement of human papillomavirus (HPV) type 16 E6 and E7-specific T-cell immunity in healthy volunteers through vaccination with TA-CIN, an HPV16L2E7E6 fusion protein vaccine. Vaccine, v. 20, p. 3456-3464, 2002). Essa mesma formulação foi co-administrada ao adjuvante GPI-0100, um análogo semi-sintético da saponina, conhecida por promover respostas humoral e celular. Essa abordagem alcançou resultados muito promissores em modelo murino e em macacos (KARANAM, B.; GAMBHIRA, R.; PENG, S.; JAGU, S.; KIM, D. J.; KETNER, G. W.; STERN, P. L.; ADAMS, R. J.; RODEN, R. B. Vaccination with HPV16 L2E6E7 fusion protein in GPI- 0100 adjuvant elicits protective humoral and cell-mediated immunity. Vaccine, v. 27, p. 1040-1049, 2009).

[0007] Vacinas contra o HPV-16 que utilizam a oncoproteína E7 purificada na sua forma nativa induzem baixos níveis de ativação de células T CD8+ e consequentemente não protegem animais contra o desafio com células tumorais imortalizadas pelo HPV. Estratégias alternativas de apresentação antigênica, como o direcionamento da expressão dessa proteína para compartimentos celulares específicos e o uso de adjuvantes, especialmente proteínas fusionados à oncoproteína E7, são capazes de aumentar as respostas imunológicas específicas e proteger animais contra os tumores causados pelo HPV (CHU, N. R.; WU, H. B.; WU, T. C. et al., Immunotherapy of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumor by administration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin (BCG) hsp65 and HPV16 E7. Clin. Exp. Immunol. v. 121, p. 216-225, 2000).

[0008] Os adjuvantes são componentes importantes nas formulações vacinais particularmente para as denominadas vacinas de subunidades que empregam apenas frações acelulares de microorganismos. Eles são capazes de aumentar a imunogenicidade do antígeno, atuando como imunomoduladores ou como sistemas de entrega (O'HAGAN, D. T.; VALIANTE, N. M. Recent advances in the discovery and delivery of vaccine adjuvants. Nat. Rev. Drug Discov., v. 2, n. 9, p. 727-35, 2003; REED, S. G.; BERTHOLET, S.; COLER, R. N.; FRIEDE, M. New horizons in adjuvants for vaccine development. Trends Immunol., v. 30, n. 1, p. 23-32, 2008).

[0009] Muitos compostos de origem bacteriana e viral possuem propriedades adjuvantes. As glicoproteínas do HSV são componentes estruturais do envelope do vírion e são expressas na membrana plasmática de células infectadas por esse vírus. Estudos demonstram que a glicoproteína D é o principal alvo para ativação de linfócitos TCD4+ e de células dendríticas em estratégias vacinais contra o HSV-1 e sua utilização está relacionada com secreção de IFN-y através da ativação de NF-kB (POLLARA, G.; JONES, M.; HANDLEY, M. E.; RAJPOPAT, M.; KWAN, A.; COFFIN, R. S.; FOSTER, G.; CHAIN, B.; KATZ, D. R. Herpes simplex virus type-1-induced activation of myeloid dendritic cells: the roles of virus cell interaction and paracrine type I IFN secretion. J. Immunol., v. 173, p. 4.108-4.119, 2004). Além disso, a porção N-terminal da proteína gD possui um domínio de ligação ao receptor celular HVEM cuja função é transmitir sinais co-estimulatórios ou co-inibitórios ao sistema imune através da interação com moléculas imunomoduladoras como LIGHT e as linfotoxinas α, e BTLA e CD160 respectivamente (CAI, G.; FREEMAN, G. J. The CD160, BTLA, LIGHT/HVEM pathway: a bidirectional switch regulating T-cell activation. Immunol. Rev., v. 229, n. 1, p. 244-58, 2009).

[0010] Diversos trabalhos demonstraram que os sítios de ligação da gD e das moléculas estimulatórias linfotoxinas α e LIGHT estão posicionados em lados opostos no receptor e não se sobrepõem. Porém, mostraram também que a gD compete pelo mesmo sítio de interação de BTLA e CD160 no receptor HVEM. (CONNOLLY, S. A.; LANDSBURG, D. J.; CARFI, A.; WILEY, D. C.; EISENBERG, R. J.; COHEN G. H. StructureBased Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entry Mediator HveA (HVEM), J. Virol., v. 76, n. 21, p. 10894-10904, 2002; GONZALEZ, L. C.; LOYET, K. M.; CALEMINE- FENAUX, J.; CHAUHAN, V.; WRANIK, B.; OUYANG, W.; EATON, D. L. A coreceptor interaction between the CD28 and TNF receptor family members B and T lymphocyte attenuator and herpesvirus entry mediator. PNAS, v. 102, n. 4, p. 1116-1121, 2005). Essas observações sugerem que a via co-estimulatória do sistema imune mediadas por LIGHT e linfotoxina α é favorecida quando a gD está presente no meio e bloquea a sinalização negativa de BTLA e CD160. Ainda, ensaios de ligação ao HVEM mostraram que a afinidade da proteína gD pelo receptor HVEM aumenta cerca de 100 vezes quando a região C-terminal é deletada em relação à gD nativa. Acredita-se que a inserção de sequências heterólogas na região C-terminal da gD também tenha um efeito semelhante e exerça o mesmo efeito sobre o grau de afinidade da gD pelo HVEM. (RUX, A. H.; WILLIS, S. H.; NICOLA, A. V.; HOU, W.; PENG, C.; LOU, H.; COHEN, G. H.; EISENBERG, R. J. Functional region IV of glycoprotein D from herpes simplex virus modulates glycoprotein binding to the herpesvirus entry mediator. J. Virol., v. 72, n. 9, p 7091-7098, 1998. 1998).

[0011] O pedido internacional de patente WO 2008/027394 revela uma construção que prevê uso de uma seguência gênica que codifica a glicoproteína D de HSV-1 fusionada geneticamente a um polipeptídeo heterólogo (ex. antígeno) que aumenta as respostas imunes contra o polipeptídeo heterólogo. Essa construção provê o uso de sequências de DNA, e correspondentes proteínas codificadas, em que a proteína gD do HSV-1 é empregada na sua forma completa incluindo toda a região C- terminal na qual está situada uma região de ancoramento na membrana citoplasmática. A presença dessa região dificulta a produção e purificação da proteína recombinante, fusionada ou não a antígenos heterólogos, inviabilizando qualquer emprego profilático ou terapêutico.

[0012] Diante de todo o exposto, a Depositante desenvolveu uma construção genética composta pela oncoproteína E7 de HPV-16 fusionada à gD de HSV-1 onde a sequência do peptídeo sinal e a região C-terminal, que inclui o sítio de ancoramento à membrana citoplasmática, da proteína foram deletadas.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] A figura 1A mostra a análise in vitro da resposta imunológica E7-específica gerada pela imunização profilática de camundongos machos C57BL/6 com as proteínas gD (SEQ ID No. 4), gDE7 (SEQ ID No. 8) e E7 (SEQ ID No. 6) recombinantes solúveis por meio da marcação de citocinas intracelulares de linfócitos de sangue periférico re-estimulados in vitro com o peptídeo E7 CD8-específico, sendo que os valores nos quadrantes superiores direitos, indicam a porcentagem de linfócitos T CD8+ produtores de IFN-y mediante o número total de linfócitos CD8+ utilizados no ensaio. Na figura 1B, mostra-se a capacidade citotóxica dos linfócitos de camundongos imunizados com as proteínas recombinantes solúveis, onde o resultado representa o porcentual médio de células-alvo mortas pelos linfócitos TCD8+ citotóxicos que reconhecem o epítopo E7 CD8-específico em um total de 2x107 células-alvo.

[0014] A figura 2A mostra a dosagem da citocina IFN-y por ensaio de ELISA e a análise do padrão de resposta Th1/Th2 desencadeado pelas formulações vacinais, onde, os animais foram imunizados de forma profilática com quatro doses pela via subcutânea e desafiados com a linhagem tumoral TC-1. Após quinze dias do desafio, os esplenócitos (107 células) foram coletados e re-estimulados in vitro com o peptídeo E7 (SEQ ID No. 11) CD8-específico. Nesses ensaios a imunização dos camundongos com a proteína gDE7 (SEQ ID No. 8) foi capz de induzir a produção de IFN-y após estímulo com o peptídeo derivado da proteína E7 e específico para linfócitos T CD8+. Os esplenócitos dos animais imunizados com o antígeno E7 (SEQ ID No. 6) e com a proteína de fusão (SEQ ID No. 8) foram re-estimulados com a proteína E7 (SEQ ID No. 6) para análise do perfil dos linfócitos TCD4+ envolvidos na resposta quando a proteína gD está fusionada ao antígeno E7 sendo, A: IFN-Y; B: IL-12 e C: IL-10, como indicado na figura 2B. A resposta de citocinas para células T CD4+ mostra que os animais imunizados com gDE7 (SEQ ID No. 8) induzem a produção de IFN-y e bloqueiam a produção de IL-10, enquanto que o comportamento inverso foi observado nos animais imunizados com a protína E7 (SEQ ID No. 6).

[0015] A figura 3A ilustra a análise da adjuvanticidade da proteína gD (SEQ ID No. 4) nas formulações vacinais solúveis por meio dos níveis de anticorpos gerados contra o antígeno E7 (SEQ ID No. 6) por ensaio de ELISA, sendo, A: 1o dose; B: 2o dose; C: 3o dose e D: 4o dose. Já a figura 3B demonstra a avaliação das subclasses de IgG, onde (■) representa os valores para IgG1 e (□) os valores para IgG2c. Os camundongos C57BL/6 receberam quatro doses das vacinas pela via subcutânea e os soros foram coletados uma semana após cada dose. Os dados mostrados representam a média dos resultados obtidos com o soro de cinco animais analisados na forma de pool e as barras indicam o erro padrão de dois ensaios de ELISA. Os valores do grupo pré-imune já foram descontados dos valores presentes no gráfico, sendo, ND - título não determinado.

[0016] A figura 4 mostra um ensaio de proteção profilática anti- tumoral em camundongos C57BL/6 desafiados com células TC-1, onde, os animais foram imunizados com quatro doses das formulações vacinais (□ PBS, ♦ gD, ▲ gDE7, • gD+E7 e x E7) com intervalos de sete dias entre as doses, pela via subcutânea. A quantidade do antígeno E7 (SEQ ID No. 6) administrado foi padronizado em 10 μg/dose e os animais imunizados com a proteína de fusão gDE7 (SEQ ID No. 8) receberam 30 μg/dose. O desafio foi realizado quinze dias após a última dose do protocolo vacinal após inoculação por via subcutânea de 7,5x104células tumorais TC-1 por animal.

[0017] A figura 5 mostra um ensaio de proteção terapêutica anti- tumoral em camundongos C57BL/6 desafiados com células TC-1. Os animais foram imunizados com quatro doses da proteína híbrida gDE7 (SEQ ID No. 8, 30μg/dose), sendo, as formulações vacinais (□ PBS, ▲ gDE7 próximo ao tumor, • gDE7 distante do tumor e x E7) com intervalos de sete dias entre as doses pela via subcutânea. Os protocolos vacinais tiveram início no dia seguinte ao desafio. O desafio foi realizados por meio da inoculação por via subcutânea de 7,5x104 células tumorais TC-1 por animal.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0018] A presente invenção provê uma proteína híbrida (SEQ ID No. 8), não-natural, formada pela fusão genética da oncoproteína E7 (SEQ ID No. 6) do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) com uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1) (SEQ ID No. 4), deletada em seu peptídeo sinal e na região C-terminal que inclui a sequência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática (correspondente a sequência de aminoácidos 320 a 344), sequência de ácidos nucleicos recombinante (SEQ. ID. NO. 7) que codifica a proteína recombinante, vetores/plasmídeos contendo a sequência recombinante (SEQ ID No. 8) e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias que contenham a proteína híbrida (SEQ ID No. 8) e/ou a sequência recombinante (SEQ ID No. 7) que a codifique, preferencialmente, na forma de vacinas. Adicionalmente, o presente pedido de patente destina- se ao uso da construção genética, como adjuvante vacinal a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para o controle de tumores induzidos por vírus papiloma e infecções por vírus herpes.

[0019] Em uma primeira realização, o presente pedido de patente trata da construção de uma proteína híbrida de SEQ ID No. 8, não- natural, formada por: (i) a SEQ ID No. 4, um primeiro segmento da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal, (ii) a SEQ ID No. 6, uma oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) . e (iii) a SEQ ID No. 8, segunda porção da glicoproteína D (gD) do HSV-1 deletada na região C- terminal com a exclusão da região de ancoramento à membrana citoplasmática .

[0020] Particularmente, a ligação entre o primeiro segmento da glicoproteína D (gD) de SEQ ID No. 4 ocorre através da porção N-terminal (correspondente aos aminoácidos 1 a 249) conectada à sequência de SEQ ID No. 6, um antígeno, de aminoácidos correspondente à proteína E7 do HPV-16 (aminoácidos 1 a 98 da proteína viral), sendo que o primeiro aminoácido na extremidade N-terminal desse antígeno encontra-se, também, fusionado ao aminoácido 249 da proteína gD (SEQ. ID. N°. 4), e em seguida, a SEQ ID No. 6, pelo segundo segmento da glicoproteína que corresponde aos aminoácidos 250 a 319 da proteína gD do HSV-1, excluindo-se a porção C-terminal da proteína gD nativa.

[0021] A proteína híbrida (SEQ ID No. 8) do presente pedido pode ser fusionada a outros antígenos de natureza viral, bacteriana, fúngica e/ou parasitária. Em particular, destacam-se proteínas do HIV, como Gag, Env, Nef, e Pol e proteínas do vírus da dengue, tais como, proteína E, NS1, NS2, e NS3, entre outros patógenos que infectam os seres humanos e animais, preferencialmente, no setor agropecuário.

[0022] Em uma segunda realização, a invenção trata de sequências de ácidos nucleicos referentes a: glicoproteína D do HSV-1 desprovida do peptídeo sinal e da porção C-terminal envolvendo a região de ancoramento à membrana citoplasmática (SEQ. ID. N°. 3); e glicoproteína D do HSV-1 desprovida do peptídeo sinal e da porção C-terminal envolvendo a região de ancoramento à membrana citoplasmática, fusionada geneticamente à oncoproteína E7 de HPV-16 no sítio permissivo de Apa I (gDE7) (SEQ. ID. N°. 7) que codifica a proteína híbrida gDE7 (SEQ ID No. 8).

[0023] Em uma terceira realização, a invenção refere-se a vetores/plasmídeos que albergam a sequência (SEQ. ID. N°. 7) e que, preferencialmente, a expressem sob o controle de promotores bacterianos, como por exemplo o T5 e o T7-lac para Escherichia coli, assim como em sistemas eucariotos de expressão, como por exemplo, células de inseto, leveduras e células de mamíferos que permitam a purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade, preferencialmente, por afinidade a níquel mediada por resíduos de histidina adicionados à porção N ou C-terminal da proteína.

[0024] Em uma quarta realização a presente invenção refere-se a formulações farmacêuticas e/ou veterinárias contendo a proteína recombinante (SEQ ID No. 8) e/ou a sequência de ácidos nucleicos recombinantes (SEQ ID No. 7) que a codifique. Preferencialmente, as formulações farmacêuticas devem conter a proteína gD híbrida (SEQ ID No. 8) purificada em veículos farmaceuticamente aceitáveis, opcionalmente, na presença de adjuvantes vacinais, particularmente, sais de alumínio (alúmen), MF59, saponina, entre outros.

[0025] As formulações do presente pedido podem apresentar concentrações da proteínagD recombinante (SEQ ID No. 8) entre 1 μg/dose a 500 μg/dose, preferencialmente, 30 μg/dose de proteína purificada administrada por via intramuscular, intra-dérmica, preferencialmente, via subcutânea.

[0026] De forma opcional, a invenção também provê o emprego de formulações vacinais que empreguem a SEQ ID No. 7 como vacinas de DNA administrada por via intramuscular e/ou subcutânea que codifiquem a proteína gD (SEQ ID No. 8) modificada geneticamente. Nesse caso, a formulação vacinal na forma de informação genética expressa em vacinas de DNA pode ser administrada, preferencialmente, pela via intramuscular em concentração de 100 μg/dose ou intradérmica em concentração de 2 μg/dose.

[0027] Em uma quinta realização, a presente invenção destina-se ao uso da construção genética (proteína de SEQ ID No. 8) como adjuvante vacinal a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para doenças infecciosas e/ou degenerativas, particularmente, no controle de tumores induzidos por papilomavírus e/ou infecções causadas por vírus herpes. A invenção pode ter aplicação em outras doenças infecciosas como a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), hepatites, dengue, entre outras e doenças degenerativas, como diferentes tipos de câncer.

EXEMPLOS CONSTRUÇÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA HÍBRIDA

[0028] O gene que codifica para a proteína híbrida gDE7 (SEQ ID No. 7) foi amplificado por PCR utilizando iniciadores específicos sintetizados a partir da sequência do gene da proteína gD nativa (SEQ ID No. 1) depositada no banco de nucleotídeos do NCBI (L09242).

[0029] O primeiro iniciador (FwBamHIgD - 5’ TCG TCA TAG TGG GAT CCC ATG GGG GT 3’) (SEQ ID No. 11) alinhou-se imediatamente após o término da sequência sinal da gDE7 presente no vetor pRE4E7, enquanto o segundo iniciador (RvXhoIgD - 5’ TCA GCT CGA GGT TGT TCG GGG TG 3’) (SEQ ID No. 12) alinhou-se imediatamente antes da região de ancoramento à membrana da proteína gDE7 em sentido reverso, de forma a gerar o fragmento sem sequência sinal e sem a região transmembrana em relação à sequência original da gD. Um fragmento de DNA de aproximadamente 1.2 kb foi obtido na reação de PCR e foi clonado no vetor de clonagem pGEM - T Easy (Promega) de acordo com as orientações do fabricante. O vetor de expressão pET28a foi preparado para abrigar definitivamente os fragmentos de DNA por meio de uma dupla digestão com as endonucleases de restrição BamHI e XhoI (Fermentas), de modo a permitir uma clonagem forçada do gene no vetor.

PROCEDIMENTOS PARA O ISOLAMENTO E REFOLDING DA PROTEÍNA HÍBRIDA GDE7

[0030] As etapas desenvolvidas para o isolamento da proteína híbrida gDE7 (SEQ ID No. 8) do extrato bacteriano referem-se à expressão “in vitro” em E. coli, extração e cromatografia de afinidade ao níquel e refolding.

EXPRESSÃO EM ESCHERICHIA COLI

[0031] A linhagem BL21(DE3) de E. coli foi utilizada para os ensaios de expressão in vitro da gDE7 (SEQ ID No. 7); essa linhagem é capaz de expressar proteínas recombinantes sob o controle do promotor derivado do fago T7, induzível por IPTG em cultura. As culturas foram realizadas a 37°C, 200 rpm em agitador orbital até a fase de crescimento exponencial (DO600nm=0,5 — 0,8) quando adicionou-se à cultura o indutor IPTG na concentração final de 0,1 mM. A cultura induzida foi mantida por um período de 3 horas.

EXTRAÇÃO E CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE AO NÍQUEL

[0032] Após esse período as células foram recuperadas e rompidas em homogeneizador em alta pressão ou por sonicação com ultra-som a 40% de amplitude utilizando o tampão A (Tris 100 mM; NaCl 500 mM; pH 7,5). A fração solúvel foi separada da fração insolúvel por centrifugação e a fração insolúvel foi submetida à solubilização com tampão A, acrescido de ureia a 8 M (ureia 8 M, Tris 100 mM; NaCl 500 mM; pH 7,5) “overnight”. Foi observado que a proteína híbrida gDE7 (SEQ ID No. 8) foi depositada em 100% na fração insolúvel de E. coli. O extrato insolúvel contendo a proteína híbrida gDE7 (SEQ ID No. 8) foi submetido a filtração em membrana filtrante e aplicado em coluna de cromatografia de afinidade ao níquel. A eluição da proteína híbrida gDE7 purificada foi realizada pelo aumento gradual da concentração de imidazol do tampão B (ureia 8 M; Tris 100 mM; NaCl 500 mM; 1 M imidazol; pH 7,5).

REMODELAMENTO

[0033] O processo de remodelamento (refolding) das proteínas sucedeu a purificação com a retirada gradual do agente desnaturante com tampões com concentrações decrescentes de ureia. Para o refolding da proteína gDE7 (SEQ ID No. 8) utilizamos os tampões: ureia 4 M Tris 100 mM NaCl 500 mM pH 7,5; ureia 2 M Tris 100 mM NaCl 500 mM pH 7,5; ureia 1 M Tris 100 mM NaCl 500 mM pH 7,5 e Tris 100 mM NaCl 500 mM pH 7,5. O processo de refolding da proteína gDE7 ocorreu em aparelho de filtração tangencial com membranas Pellicon de corte de 30K.

ENSAIOS

[0034] A formulação vacinal da presente invenção foi testada em modelo murino e consiste em uma proteína híbrida de SEQ ID No. 8, composta pela oncoproteína E7 de HPV-16 fusionada geneticamente na gD de HSV-1 deletada em seu peptídeo sinal e a região C-terminal para o controle terapêutico de tumores induzidos pelo HPV-16.

ENSAIOSDE IMUNIZAÇÃO

[0035] A proteína híbrida recombinante (SEQ ID No. 8) foi administrada em quatro doses com intervalos de sete dias pela via subcutânea. As doses foram preparadas com proteínas purificadas, ressuspensas em PBS estéril em um volume final de 100 μL e inoculados na região do flanco inferior de camundongos C57BL/6 machos. Os grupos experimentais foram assim definidos: grupo PBS, grupo gD (SEQ ID No. 4) (10 μg), grupo gDE7 (SEQ ID No. 8) (30 μg), grupo gD+E7 (SEQ ID No. 4 + SEQ ID No. 6) (10 μg+10 μg) e grupo E7 (SEQ ID No. 6) (10 μg). A proteína de fusão (SEQ ID No. 8) foi administrada em doses de 30 μg, já que seu peso molecular corresponde em três vezes mais ao peso molecular do antígeno E7. A proteína E7 (SEQ ID No. 6) utilizada como antígeno no presente pedido foi produzida em nosso laboratório e corresponde aos 60 primeiros aminoácidos da proteína nativa onde o epítopo CD8 específico encontra-se preservado.

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA CELULAR DETECÇÃO DE LINFÓCITOS T CD8+/INF-I+ POR MARCAÇÃO DE CITOCINA INTRACELULAR

[0036] Placas de fundo côncavo (Nunc) receberam 106 células do baço ou do sangue por poço que foram incubadas por 6 horas a 37°C a 5% de CO2 na presença de Brefeldin A (GolgiPlug; BD PharMingen) e do peptídeo E7 CD8 específico (aminoácidos 49-57). Com controle sem estímulo, as células receberam o mesmo volume de meio DMEM sem o peptídeo. Após este período as células foram incubadas por 30 minutos a 4°C com anticorpo anti-CD8 conjugado com FITC (BD PharMingen). Após a permeabilização com Saponina por 20 minutos a 4°C, as células foram tratadas com anticorpo anti-IFN-Y conjugado à ficoeritrina (PE) (BD PharMingen) por 30 minutos a 4°C. As células foram ressuspensas em PBS e examinadas por citometria de fluxo utilizando o aparelho FACScalibur (BD Bioscience). Os dados foram analisados pelo programa FlowJo para a determinação das porcentagens de células INF-Y+/CD8+ sobre o total de células CD8+.

CITOTOXICIDADE “IN VIVO”

[0037] O ensaio de citotoxicidade “in vivo” foi realizado para verificar a presença de células T CD8+ citotóxicas específicas para o peptídeo E7 (RAHYNIVTF, SEQ ID No. 11) em animais imunizados. Após 15 ou 30 dias do desafio, um grupo de animais não imunizados foi submetido à eutanásia, seus baços foram retirados e processados. As células foram incubadas com 0,5 μM ou 5 μM de CFSE (carboxifluoresceína succinimidil ester, Invitrogen) em PBS, por 15 minutos a 37°C. Após a incubação, as células foram lavadas e ressuspensas em meio RPMI acrescido de 1% de soro fetal bovino (RPMI 1%). Ao tubo contendo a população de células marcadas com 5 μM de CFSE foi adicionado 2,5 μg/mL do peptídeo E7 (SEQ ID No. 11) e incubado por 40 minutos a 37°C. Após esse período, as células foram lavadas com meio RPMI 1% para a remoção do peptídeo não ligado e, em seguida, contadas. Quantidades iguais das duas populações de células marcadas foram misturadas e centrifugadas a 1.500 rpm. O sedimento de células foi ressuspenso em RPMI de modo a conter 2-4x 107 células/100 μL e injetado nos animais imunizados pela via do plexo retro orbital.

[0038] No dia seguinte, todos os animais foram submetidos a eutanásia e os esplenócitos coletados. As células foram lavadas 3x com PBS 1X contendo soro fetal bovino a 1% (PBS 1%), ressuspensas em 400 μL de PBS 1% e examinadas por citometria de fluxo. Os dados foram analisados para a determinação das porcentagens de células marcadas com 0,5 μM ou 5 μM de CFSE pelo programa “FlowJo”.

PESQUISA DE CITOCINAS POR ELISA

[0039] Para avaliação da produção de citocinas frente a um re- estímulo in vitro, os animais foram submetidos a eutanásia após 15 dias do desafio com TC-1 e seus baços foram coletados para a obtenção dos esplenócitos. Os baços foram macerados em 5 mL de RPMI 1% e as células foram centrifugadas a 1.500 rpm e lavadas com RPMI 1%. Depois estas células foram tratadas com ACK (1 mL/baço) para a remoção das hemácias e novamente lavadas com RPMI 1%. As células foram contadas em câmara de Newbauer e 1x107 células/mL foram incubadas em estufa de CO2 a 37°C com a presença ou ausência de 1,5 μg do peptídeo E7 (SEQ ID No. 11) ou de 10μg da proteína E7 (SEQ ID No. 6) durante 72 horas. Em seguida, as amostras foram coletadas e centrifugadas e os sobrenadantes coletados e estocados a -80°C até serem usados para a dosagem das citocinas por ELISA. O ELISA foi realizado segundo protocolo descrito pelo fabricante (BD Biosciences).

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA HUMORAL PESQUISA DE ANTICORPOS POR ELISA

[0040] Os ensaios de ELISA foram realizados com 250 ng da proteína E7 (SEQ ID No. 6) purificada dispostas em placas PolySorp (Nunc). Após incubação de 12 horas a 4°C, as placas foram lavadas com PBS-Tween 0,05% (PBS-T) e bloqueadas com leite a 5% em PBS-T. Em seguida, incubou-se as placas com soros provenientes dos animais imunizados na diluição inicial de 1:500 para IgG anti-gD e 1:25 para IgG anti-E7, durante 1 hora a 37°C. Anticorpos anti-IgG de camundongo conjugados à peroxidase foram diluídos em PBS-T leite na concentração de 1:3000 e incubados nas placas previamente lavadas com PBS-Tween 0,05%. A presença de anticorpos ligados aos antígenos foi visualizada com a solução de revelação (12,5 mL de tampão Citrato-Fosfato 33 mM, pH 5.0; 5 mg de O-Fenilenodiaminadihidrocloreto (OPD), e 5 μL de H2O2) por 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 50 μL por poço de H2SO4 9 N. As densidades óticas das reações foram determinadas a 492 nm em leitor de ELISA modelo MultiScan EX (Labsystems).

ENSAIOS DE DESAFIO COM CÉLULAS TC-1

[0041] Os camundongos submetidos ao protocolo vacinal profilático e/ou terapêutico foram desafiados com a linhagem tumoral TC-1. As células, cultivadas em garrafas de plástico (TTP), foram lavadas duas vezes com PBS com pH 7.4 e em seguidas tratadas com Tripsina EDTA (CultLab). A seguir, as células foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino e coletadas em frascos de tipo Falcon de 15 mL. Em seguida foram centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos, sendo o precipitado de células ressuspenso em meio DMEM sem soro fetal bovino. A concentração celular foi determinada em câmara de “Newbauer”. Dessa suspensão de células, inoculou-se 7,5 x 104 células TC-1 em um volume final de 100 μL por animal. O inóculo foi realizado no dorso de camundongos machos C57BL/6.

Claims (16)

1. PROTEÍNA HÍBRIDA, caracterizada pelo fato de ser definida pela SEQ ID No. 8.

2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por consistir na fusão genética da oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16), com uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal e na região C-terminal que inclui a sequência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática.

3. PROTEÍNA, de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de a fusão genética consistir na construção de um primeiro segmento (aminoácidos 1 a 249) corresponde à porção N- terminal da SEQ ID No. 4 (gD do HSV-1, destituída do peptídeo sinal e da região C-Terminal), o segundo segmento (aminoácidos 250 a 347) corresponde à sequência polipeptídica de 98 aa da oncoproteína E7 do HPV-16 (SEQ ID No. 6) e o terceiro segmento (aminoácidos 348 a 419) corresponde à porção C-terminal (em versão reduzida conforme explicado acima) da SEQ ID No. 4, sendo que o terceiro segmento se inicia com os aminoácidos glicina e prolina correspondentes à reconstrução do sítio da enzima de restrição Apa I, utilizada na clonagem da E7 (SEQ ID No. 5) na gD (SEQ ID No. 3).

4. PROTEÍNA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de a construção genética consistir em uma ligação entre o primeiro segmento da glicoproteína (gD) através da porção N- terminal da proteína conectada à sequência que codifica um antígeno, sendo que o aminoácido 1 na extremidade N-terminal do antígeno encontra-se fusionado ao aminoácido 249 da proteína gD.

5. SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, que codifica a proteína híbrida definida nas reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de ser definida pela SEQ. ID. N°. 7.

6. SEQUÊNCIA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de consistir na glicoproteína D do HSV-1 desprovida do peptídeo sinal e da porção C-terminal envolvendo a região de ancoramento à membrana citoplasmática fusionada geneticamente à oncoproteína E7 de HPV-16 no sítio permissivo de Apa I. (gDE7) que codificam a proteína híbrida gDE7.

7. VETORES/PLASMÍDEOS, que albergam a sequência definida nas reivindicações 5 a 6, caracterizados pelo fato de consistirem na proteína híbrida definida pela SEQ ID No. 8 e/ou sequência recombinante definida pela SEQ. ID. N°. 7, isoladas.

8. VETORES/PLASMÍDEOS, de acordo com a reivindicação 7, caracterizados por consistirem preferencilamente, em promotores bacterianos, como por exemplo o T5 e o T7-lac para Escherichia coli, assim como em sistemas eucariotos de expressão, como células de inseto, leveduras e células de mamíferos.

9. VETORES/PLASMÍDEOS, de acordo com a reivindicação 8, caracterizados pelo fato de os sistemas eucariotos consistirem em purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade, preferencialmente, por afinidade a níquel mediada por resíduos de histidina adicionados à porção N ou C-terminal da proteína.

10. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS, caracterizadas pelo fato de consistirem na proteína hibrida definida nas reivindicações 1 a 4 e/ou na sequência recombinante definida nas reivindicações 5 a 6 e veículos farmaceuticamente aceitáveis, como PBS (tampão fosfato-salino) sais de alumínio, MF59® (emulsão água em óleo) e saponina, preferencialmente, na forma de vacinas.

11. FORMULAÇÕES, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato de as formulações consistirem, preferecialmente, na proteína híbrida definida nas reivindicações 1 a 4, purificada em veículos farmaceuticamente aceitáveis.

12. FORMULAÇÕES, de acordo com as reivindicações 10 a 11, caracterizadas pelo fato de apresentarem concentrações da proteína híbrida entre 1 μg/dose à 500 μg/dose, preferencialmente, 30 μg/dose de proteína purificada.

13. FORMULAÇÕES, de acordo com as reivindicações 10 a 12, caracterizadas pelo fato de as formulações serem apresentadas em formas farmacêuticas administradas via intramuscular, intra-dérmica, preferencialmente, via subcutânea.

14. USO DA PROTEÍNA HÍBRIDA E SEQUÊNCIA, definidas nas reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para preparar formulações farmacêuticas e/ou veterinárias para o tratamento de doenças infecciosas e/ou degenerativas, ou para a preparação de adjuvante vacinal a outros antígenos.

15. USO, de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato de ser para preparar formulações, preferencialmente, para o controle de tumores induzidos por vírus do papiloma humano e infecções por vírus herpes.

16. USO, de acordo com as reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser para preparar formulações para tratar síndrome da imunodeficiencia adquirida (AIDS), hepatites, dengue, entre outras e/ou doenças degenerativas, como diferentes tipos de câncer.

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