BRPI1003749A2 - proteìna hìbrida, sequência de ácidos nucléicos recombinante, vetores/plasmìdeos, formulações farmacêuticas e/ou veterinárias e seus usos no controle de tumores induzidos pelo vìrus do papiloma humano e/ou doenças infecciosas ou degenerativas - Google Patents

Abstract

PROTEìNA HìBRIDA, SEQUêNCIA DE áCIDOS NUCLEICOS RECOMBINANTE, VETORES/ PLASMìDEOS, FORMULAçõES FARMACêUTICAS E/OU VETERINáRIAS E SEUS USOS NO CONTROLE DE TUMORES INDUZIDOS PELO VìRUS DO PAPILOMA HUMANO E/OU DOENçAS INFECCIOSAS OU DEGENERATIVAS. A presente invenção provê uma proteina hibrida, não- natural, formada pela fusão genética da oncoproteìna E7 do vìrus do papiloma humano tipo- 16 (HPV- 16) com uma forma modificada da glicoproteina D (gD) do herpes simplex tipo- 1 (HSV- 1), deletada em seu peptídeo sinal e na região C-terminal que inclui a sequência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática (correspondente a sequência de aminoácidos 320 a 344), sequência de ácidos nucleicos recombinante (SEQ. ID. NO. 1 e SEQ. ID. NO. 2) que codifica a proteína recombinante, vetores/plasmídeos contendo a sequência recombinante e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias que contenham a proteína híbrida e/ou a sequência recombinante que a codifique, preferencialmente, na forma de vacinas. Adicionalmente, o presente pedido de patente destina-se ao uso da construção genética, como adjuvante vacinal a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para o controle de tumores induzidos por vírus do papiloma humano e infecções por vírus herpes.

Description

"PROTEÍNA HÍBRIDA, SEQÜÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLÉICOS RECOMBINANTE, VETORES/PLASMÍDEOS, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS E SEUS USOS NO CONTROLE DE TUMORES INDUZIDOS PELO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO E/OU DOENÇAS INFECCIOSAS OU DEGENERATIVAS"

Campo da Invenção

A presente invenção provê uma proteína híbrida, não- natural, formada pela fusão genética da oneoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) com uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal e na região C-terminal que inclui a seqüência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática (correspondente à seqüência de aminoácidos 320 a 344), seqüência de ácidos nucleicos recombinante (SEQ. ID. NO. 1 e SEQ. ID. NO. 2) que codifica a proteína recombinante, vetores/plasmídeos contendo a seqüência recombinante e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias que contenham a proteína híbrida e/ou a seqüência recombinante que a codifique, preferencialmente, na forma de vacinas. Adicionalmente, o presente pedido de patente destina-se ao uso da construção genética, como adjuvante vacinai a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para o controle de tumores induzidos por vírus do papiloma humano e infecções por vírus herpes.

Antecedentes da Invenção

Aproximadamente 500.000 novos casos de câncer de colo de útero são detectados anualmente, sendo o segundo tipo de câncer mais comum entre as mulheres em todo o mundo causando em torno de 270.000 mortes por ano. Dados comprovam que o vírus do papiloma humano (HPV) é o agente presente em mais de 99% dos casos de câncer cervical, e por isso é considerado o agente etiológico desta doença.

Atualmente, estão descritos aproximadamente 200 genótipos distintos de HPV e o genótipo do HPV-16 é o mais freqüentemente associado ao desenvolvimento de neoplasia intraepitelial cervical (CIN) e de tumores, encontrado em aproximadamente 50% dos casos de câncer de colo de útero. Os genótipos do HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 e HPV-45 são freqüentemente encontrados em tecidos tumorais do colo do útero, sendo chamados de genótipos de alto risco. Os tipos de HPV que causam verrugas e lesões benignas e raramente são encontrados em carcinomas invasivos são chamados de genótipos de baixo risco, comò o HPV-6 e o HPV-Il (WALBOOMERS, J. M.; JACOBS, Μ. V.; MANOS, M. M. Human papillomavirus is a necessaiy cause of invasive cervical câncer worldwide. J. Pathol., v. 189, p. 12-19, 1999).

As proteínas E6 e E7 dos genótipos dos HPVs de alto risco são capazes de degradar os produtos dos genes supressores de tumores p53 e pRb, interferindo no ciclo celular através de um estímulo excessivo para a proliferação dos queratinócitos infectados (YUGAWA, T.; KIYONO, T. Molecular mechanisms of cervical carcinogenesis by high-risk human papillomaviruses: novel functions of E6 and E7 oncoproteins. Rev. Med. Viroti v. 19, p. 97-113, 2009). As proteínas E6 e E7 são expressas continuamente em tumores e são essenciais para a manutenção do ciclo viral. Além de controlar o ciclo celular das células infectadas, as oncoproteínas E6 e E7 modulam o sistema imune de forma que as células tumorais tornem-se pouco imunogênicas (TINDLE, R. W. Immune evasion in human papillomavirus-associated cervical câncer. Nat Rev. Câncer, v. 2, η. 1, p. 59-65, 2002).

Duas vacinas profiláticas baseadas na proteína L1 do capsídeo viral de HPV-6, -11, -16 e 18 (Gardasil) ou HPV-16 e -18 (Cervarix) estão disponíveis no mercado. Elas apresentam boa eficácia em mulheres que ainda não tiveram contato com o vírus mas não protege mulheres em que a infecção está estabelecida ou que apresentam lesões, já que os anticorpos neutralizantes gerados nesta abordagem não são capazes de eliminar o vírus ou inibir o crescimento dos tumores. As vacinas com enfoque terapêutico visam desencadear respostas imunológicas baseadas em linfócitos T citotóxicos, capazes de localizar e matar as células tumorais sem atacar as células sadias são mais eficientes nestes casos. Esta estratégia vacinai vem sendo largamente explorada devido a milhões de mulheres infectadas pelo vírus e que podem vir a desenvolver tumores, visto que o HPV é geralmente contraído por mulheres jovens mas normalmente o câncer se manifesta apenas depois dos 50 anos de idade.

Diferentes estratégias vacinais com enfoque terapêutico vêm sendo testadas nos últimos anos com o objetivo de induzir resposta citotóxica contra as células neoplásicas que expressam as oncoproteínas do HPV-16, E6 e E7. Tais vacinas tem com objetivo controlar o câncer ou impedir seu surgimento em pessoas que foram infectadas pelo vírus ou apresentam o processo tumoral em diferentes estágios de desenvolvimento. São elas: vacinas de proteína purificada, fusionada ou não a adjuvantes, vacinas de DNA, vacinas virais ou de bactérias recombinantes, vacinas de células dendríticas e vacinas que utilizam peptídeos.

Testes com proteínas purificadas utilizadas como formulação vacinai contra o HPV vêm sendo realizados e revelam algumas vantagens: não apresentam restrição de MHC (Complexo Principal de Histocompatibilidade) e são menos dependente do HLA (Antígeno Leucocitário Humano) do paciente, além de ser consideradas biologicamente mais seguras em relação âs vacinas de DNA. Uma vacina baseada em proteínas purificadas foi desenvolvida compreendendo as oncoproteínas do HPV-16 E6 e E7 fusionadas à L2, proteína do capsídeo viral, denominada TA-CIN. A vacina foi administrada sem adjuvantes pela via intramuscular e desencadeou resposta de células T citotóxicas contra as oncoproteínas E6 e E7 e de anticorpos neutralizantes (IgG) contra proteínas do capsídeo do HPV em modelo murino mas os resultados não foram muito promissores em humanos (DE JONG, A.; O1NEILL, T.; KHAN, A. Y.; KWAPPENBERG, K. M.; CHISHOLM, S. E.; WHITTLE, N. R.; DOBSON, J. A,; JACK, L. C.; ST. CLAIR ROBERTS, J. A.; OFFRINGA, R.; VAN DER BURG, S. H.; HICKLING J. K. Enhancement of human papillomavirus (HPV) type 16 E6 and E7-specific T-cell immunity in healthy volunteers through vaccination with TA-CIN, an HPV16L2E7E6 fusion protein vaccine. Vaccine, v. 20, p. 3456-3464, 2002). Essa mesma formulação foi co- administrada ao adjuvante GPI-0100, um análogo semi-sintético da saponina, conhecida por promover respostas humoral e celular. Essa abordagem alcançou resultados muito promissores em modelo murino e em macacos (KARANAM, B.; GAMBHIRA, R.; PENG, S.; JAGU, S.; KIM, D. J.; KETNER, G. W.; STERN, P. L.; ADAMS, R. J.; RODEN, R. B. Vaccination with HPV16 L2E6E7 fusion protein in GPI-0100 adjuvant elicits protective humoral and cell-mediated immunity. Vaccine, v. 27, p. 1040-1049, 2009).

Vacinas contra o HPV-16 que utilizam a oncoproteína E7 purificada na sua forma nativa induzem baixos níveis de ativação de células T CD8+ e consequentemente não protegem animais contra o desafio com células tumorais imortalizadas pelo HPV. Estratégias alternativas de apresentação antigênica, como o direcionamento da expressão dessa proteína para compartimentos celulares específicos e o uso de adjuvantes, especialmente proteínas fusionados à oncoproteína E7, são capazes de aumentar as respostas imunológicas específicas e proteger animais contra os tumores causados pelo HPV (CHU, N. R.; WU, H. B.; WU, T. C. et al, Immunotherapy of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumor by administration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin (BCG) hsp65 and HPV16 E7. Clin. Exp. Immunol. v. 121, p. 216-225, 2000).

Os adjuvantes são componentes importantes nas formulações vacinais particularmente para as denominadas vacinas de subunidades que empregam apenas frações acelulares de microorganismos. Eles são capazes de aumentar a imunogenicidade do antígeno, atuando como imunomoduladores ou como sistemas de entrega (O1HAGAN, D. T.; VALIANTE, Ν. M. Recent advances in the discoveiy and delivery of vaccine adjuvants. Nat. Rev. Drug Discov., v. 2, n. 9, p. 727-35, 2003; REED, S. G.; BERTHOLET, S.; COLER, R. N.; FRIEDE, M. New horizons in adjuvants for vaccine development. Trends Immunol, v. 30, η. 1, p. 23-32, 2008).

Muitos compostos de origem bacteriana e viral possuem propriedades adjuvantes. As glicoproteínas do HSV são componentes estruturais do envelope do vírion e são expressas na membrana plasmática de células infectadas por esse vírus. Estudos demonstram que a glicoproteína D é o principal alvo para ativação de linfócitos TCD4+ e de células dendríticas em estratégias vacinais contra o HSV-I e sua utilização está relacionada com secreção de IFN-γ através da ativação de NF-kB (POLLARA, G.; JONES, M.; HANDLEY, M. E.; RAJPOPAT, M.; KWAN, A.; COFFIN, R. S.; FOSTER, G.; CHAIN, B.; KATZ, D. R. Herpes simplex vírus type-1-induced activation of myeloid dendritic cells: the roles of vírus cell interaction and paracrine type I IFN secretion. J. Immunol., v. 173, p. 4.108-4.119, 2004). Além disso, a porção N-terminal da proteína gD possui um domínio de ligação ao receptor celular HVEM (aminoácidos 7-15 e 24-32), cuja função é transmitir sinais co-estimulatórios ou co-inibitórios ao sistema imune através da interação com moléculas imunomoduladoras como LIGHT e as linfotoxinas a, e BTLA e CD160 respectivamente (CAI, G.; FREEMAN, G. J. The CD160, BTLA, LIGHT/HVEM pathway: a bidirectional switch regulating T-cell activation. Immunol Rev., v. 229, η. 1, p. 244-58, 2009).

Diversos trabalhos demonstraram que os sítios de ligação da gD e das moléculas estimulatórias linfotoxinas α e LIGHT estão posicionados em lados opostos no receptor e não se sobrepõem. Porém, mostraram também que a gD compete pelo mesmo sítio de interação de BTLA e CD160 no receptor HVEM. (CONNOLLY, S. A.; LANDSBURG, D. J.; CARFI, A.; WILEY, D. C.; EISENBERG, R. J.; COHEN G. H. Structure-Based Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entiy Mediator HveA (HVEM), J. Virol., v. 76, n. 21, p. 10894-10904, 2002; GONZALEZ, L. C.; LOYET, K. M.; CALEMINE-FENAUX, J.; CHAUHAN, V.; WRANIK, B.; OUYANG, W.; EATON, D. L. A coreceptor interaction between the CD28 and TNF receptor family members B and T lymphocyte attenuator and herpesvirus entry mediator. PNAS, v. 102, n. 4, p. 1116-1121, 2005).

Essas observações sugerem que a via co-estimulatória do sistema imune mediadas por LIGHT e linfotoxina α é favorecida quando a gD está presente no meio e bloquea a sinalização negativa de BTLA e CD160. Ainda, ensaios de ligação ao HVEM mostraram que a afinidade da proteína gD pelo receptor HVEM aumenta cerca de 100 vezes quando a região C-terminal é deletada em relação à gD nativa. Acredita-se que a inserção de seqüências heterólogas na região C-terminal da gD também tenha um efeito semelhante e exerça o mesmo efeito sobre o grau de afinidade da gD pelo HVEM. (RUX, A. H.; WILLIS, S. H.; NICOLA, Α. V.; HOU, W.; PENG, C.; LOU, H.; COHEN, G. H.; EISENBERG, R. J. Functional region IV of glycoprotein D from herpes simplex virus modulates glycoprotein binding to the herpesvirus entry mediator. .J. Virol., v. 72, n. 9, ρ 7091-7098, 1998. 1998).

O pedido de patente internacional WO 2008/027394 revela uma construção que prevê uso de uma seguência gênica que codifica à glicoproteína D de HSV-I fusionada geneticamente a um polipeptídeo heterólogo (ex. antígeno) que aumenta as respostas imunes contra o polipeptídeo heterólogo. Essa construção prove o uso de sequencias de DNA, e correspondentes proteínas codificadas, em que a proteína gD do HSV-I é empregada na sua forma completa incluindo toda a região C- terminal na qual está situada uma região de ancoramento na membrana citoplasmática (aminoácidos 320 a 344). A presença dessa região impede a purificação das proteínas recombinantes, fusionada ou não a antígenos heterólogos, inviabilizando qualquer emprego profllático ou terapêutico com proteínas recombinantes.

Diante de todo o exposto, a Depositante desenvolveu uma construção genética composta pela oncoproteína E7 de HPV-16 fusionada à gD de HSV-I onde a seqüência do peptídeo sinal e a região de ancoramento à membrana citoplasmática da proteína foram deletadas.

Descrição das Figuras

A figura IA mostra a análise in vitro da resposta imunológica E7-específlca gerada pela imunização profllática de camundongos machos C57BL/6 com as proteínas gD, gDE7 e E7 recombinantes solúveis por meio da marcação de citocinas intracelular de linfócitos de sangue periférico re-estimulados in vitro com o peptídeo E7 CD8-específico, sendo que os valores nos quadrantes superiores direitos, indicam a porcentagem de linfócitos T CD8+ produtores de IFN-γ mediante o número total de linfócitos CD8+ utilizados no ensaio. Na figura 1B, mostra-se a capacidade cito tóxica dos linfócitos de camundongos imunizados com as proteínas recombinantes solúveis, onde o resultado representa o porcentual médio de células-alvo mortas pelos linfócitos TCD8+ citotóxicos que reconhecem o epítopo E7 CD8- específico em um total de 2x10^7 células-alvo.

A figura 2A mostra a dosagem da citocina IFN-D por ensaio de ELISA e a análise do padrão de resposta Th1/Th2 desencadeado pelas formulações vacinais, onde, os animais foram imunizados de forma profilática com quatro doses pela via subcutânea e desafiados com a linhagem tumoral TC-1. Após quinze dias do desafio, os esplenócitos (10^7 células) foram coletados e re-estimulados in vitro com o peptídeo E7 CD8-específico. Nesses ensaios a imunização dos camundongos com a proteína gDE7 foi capz de induzir a produção de IFN-D após estímulo com o peptídeo derivado da proteína E7 e específico para linfócitos T CD8+. Os esplenócitos dos animais imunizados com o antígeno E7 e com a proteína de fusão foram re- estimulados com a proteína E7 para análise do perfil dos linfócitos TCD4+ envolvidos na resposta quando a proteína gD está fusionada ao antígeno E7 sendo, A: IFN-D; B: IL-12 e C: IL-10, como indicado na figura 2B. A resposta de citocinas para células T CD4+ mostra que os animais imunizados com gDE7 induzem a produção de IFN-D e bloqueiam a produçãod de IL-10 , enquanto que o comportamento inverso foi observa nos animais imunizados com a protína E7.

A figura 3A ilustra a análise da adjuvanticidade da proteína gD nas formulações vacinais solúveis por meio dos níveis de anticorpos gerados contra o antígeno E7 por ensaio de ELISA, sendo, A: 1° dose; B: 2° dose; C: 3° dose e D: 4° dose. Já a figura 3B demonstra a avaliação das subclasses de IgG, onde (■) representa os valores para IgGl e (D) os valores para IgG2c. Os camundongos C57BL/6 receberam quatro doses das vacinas pela via subcutânea e os soros foram coletados uma semana após cada dose. Os dados mostrados representam a média dos resultados obtidos com o soro de cinco animais analisados na forma de pool e as barras indicam o erro padrão de dois ensaios de ELISA. Os valores do grupo pré-imune já foram descontados dos valores presentes no gráfico, sendo, ND - título não determinado.

A figura 4 mostra um ensaio de proteção profilática anti- tumoral em camundongos C57BL/6 desafiados com células TC-1, onde, os animais foram imunizados com quatro doses das formulações vacinais (□ PBS, ♦ gD, ▲ gDE7, · gD+E7 e χ E7) com intervalos de sete dias entre as doses, pela via subcutânea. A quantidade do antígeno E7 administrado foi padronizado em 10 Mg/dose e os animais imunizados com a proteína de fusão gDE7 receberam 30 Mg/dose. O desafio foi realizado quinze dias após a última dose do protocolo vacinai após inoculação por via subcutânea de 7,5x104 células tumorais TC-I por animal.

A figura 5 mostra um ensaio de proteção terapêutica anti- tumoral em camundongos C57BL/6 desafiados com células TC-1. Os animais foram imunizados com quatro doses da proteína híbrida gDE7 (30μg/dose), sendo, as formulações vacinais (□ PBS, ▲ gDE7 próximo ao tumor, · gDE7 distante do tumor e χ E7) com intervalos de sete dias entre as doses pela via subcutânea. Os protocolos vacinais tiveram início no dia seguinte ao desafio. O desafio foi realizados por meio da inoculação por via subcutânea de 7,5xl04 células tumorais TC-I por animal.

Descrição da invenção

A presente invenção provê uma proteína híbrida, não- natural, formada pela fusão genética da oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) com uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal e na região C-terminal que inclui a seqüência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática (correspondente a seqüência de aminoácidos 320 a 344), seqüência de ácidos nucleicos recombinante (SEQ. ID. NO. 1 e SEQ. ID. NO. 2) que codifica a proteína recombinante, vetores/plasmídeos contendo a seqüência recombinante e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias que contenham a proteína híbrida e/ou a seqüência recombinante que a codifique, preferencialmente, na forma de vacinas. Adicionalmente, o presente pedido de patente destina-se ao uso da construção genética, como adjuvante vacinai a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para o controle de tumores induzidos por vírus papiloma e infecções por vírus herpes.

Em uma primeira realização, o presente pedido de patente trata da construção de uma proteína híbrida, não-natural, formada por (i) um primeiro segmento da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal (SEQ. ID. N°. 1), (ii) uma oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo- 16 (HPV-16) (SEQ. ID. N°. 2) e (iii) segunda porção da glicoproteína D (gD) do HSV-1 deletada na região C-terminal com a exclusão dos aminoácidos 320 a 340.

Particularmente, a ligação entre o primeiro segmento da glicoproteína (gD) ocorre através da porção N-terminal da proteína (correspondente aos aminoácidos 1 a 249) (SEQ. ID. N°. 1) conectada a seqüência que codifica um antígeno, preferencilamente, aminoácidos correspondente à proteína E7 do HPV-16, (aminoácidos 1 a 98 da proteína viral), sendo que o primeiro aminoácido na extremidade N- terminal desse antígeno encontra-se, também, fusionado ao aminoácido 249 da proteína gD (SEQ. ID. N°. 2), e em seguida, pelo segundo segmento da glicoproteína que corresponde aos aminoácidos 250 a 319 da proteína gD do HSV-1, excluindo-se a porção C-terminal da proteína gD nativa correspondente aos aminoácidos 320 a 344.

A proteína híbrida do presente pedido pode ser fusionada a outros antígenos de natureza viral, bacteriana, fúngica e/ou parasitária. Em particular, destacam-se proteínas do HIV, como Gag, Env, Nef, e Pol e proteínas do vírus da dengue, tais como, proteína E, NS1, NS2, e NS3, entre outros patógenos que infectam os seres humanos e animais, preferencialmente, no setor agropecuário.

Em uma segunda realização, a invenção trata de seqüências de ácidos nucleicos referentes a glicoproteína D do HSV-I desprovida do peptídeo sinal e da porção C-terminal envolvendo a região de ancoramento à membrana citoplasmática (SEQ. ID. N°. 1) e glicoproteína D do HSV-I desprovida do peptídeo sinal e da porção C- terminal envolvendo a região de ancoramento à membrana citoplasmática, fusionada geneticamente à oncoproteína E7 de HPV-16 no sítio permissivo de Αρα I. (gDE7) (SEQ. ID. N°. 2) que codificam a proteína híbrida gDE7.

Em uma terceira realização a invenção refere-se a vetores/plasmídeos que albergam as seqüências (SEQ. ID. N°. 1 e SEQ. ID. N°. 2) e que, preferencialmente, a expresse sob o controle de promotores bacterianos, como por exemplo o T5 e o T7-lac para Escherichia coli, assim como em sistemas eucariotos de expressão, como por exemplo, células de inseto, leveduras e células de mamíferos que permitam a purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade, preferencialmente, por afinidade à níquel mediada por resíduos de histidina adicionados à porção N ou C-terminal da proteína. Em uma quarta realização a presente invenção refere-se a formulações farmacêuticas e/ou veterinárias contendo a proteína recombinante e/ou a seqüência de ácidos nucleicos recombinantes que a codifique. Preferencialmente, as formulações farmacêuticas devem conter a proteína gD híbrida purificada em veículos farmacêuticamente aceitáveis, opcionalmente, na presença adjuvantes vacinais, particularmente, sais de alúminio (alumen), MF59 e saponina, entre outros.

As formulações do presente pedido podem apresentar concentrações da proteína gD recombinante entre 1 μg/dose à 500 μg/dose, preferencilamente, 30 μg/dose de proteína purificada administrada por via intramuscular, intra-dérmica, preferencialmente, via subcutânea.

De forma opcional, a invenção também provê o emprego de formulações vacinais que empreguem vacinas de DNA administrada por via intramuscular e/ou subcutânea que codifiquem a proteína gD modificada geneticamente. Nesse caso, a formulação vacinai na forma de informação genética expressa em vacinas de DNA pode ser administrada, preferencialmente, pela via intramuscular em concentração de 100 μg/dose ou intradérmica em concentração de 2 μg/dose.

Em uma quinta realização, a presente invenção destina-se ao uso da construção genética (proteína), como adjuvante vacinai a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para doenças infecciosas e/ou degenerativas, particularmente, no controle de tumores induzidos por vírus papiloma e/ou infecções causadas por vírus herpes. A invenção pode ter aplicação em outras doenças infecciosas como a sindrome da imunodeficiencia adquirida (AIDS), hepatites, dengue, entre outras e doenças degenerativas, como diferentes tipos de câncer.

Exemplo

Construção ε Purificação da Proteína Híbrida

O gene que codifica para a proteína híbrida gDE7 foi amplificado por PCR utilizando iniciadores específicos sintetizados a partir da seqüência do gene da proteína gD nativa depositada no banco de nucleotídeos do NCBI (L09242).

O primeiro iniciador (FwBamHIgD - 5' TCG TCA TAG TGG GAT CCC ATG GGG GT31) alinhou-se imediatamente após o término da seqüência sinal da gDE7 presente no vetor pRE4E7, enquanto o segundo iniciador (RvXhoIgD - 5' TCA GCT CGA GGT TGT TCG GGG TG 3') alinhou-se imediatamente antes da região de ancoramento á membrana da proteína gDE7 em sentido reverso, de forma a gerar o fragmento sem seqüência sinal e sem a região transmembrana em relação à seqüência original da gD. Um fragmento de DNA de aproximadamente 1.2 kb foi obtido na reação de PCR e foi clonado no vetor de clonagem pGEM - T Easy (Promega) de acordo com as orientações do fabricante. O vetor de expressão pET28a foi preparado para abrigar definitivamente os fragmentos de DNA por meio de uma dupla digestão com as endonucleases de restrição BamHI e XhoI (Fermentas), de modo a permitir uma clonagem forçada do gene no vetor.

Procedimentos para o Isolamento ε Refolding da Proteína Híbrida gDE7

As etapas desenvolvidas para o isolamento da proteína híbrida gDE7 do extrato bacteriano referem-se à expressão "in vitro" em E. coli, extração e cromatografia de afinidade ao níquel e refolding.

Expressão em Escherichia coli A linhagem BL21(DE3) de E. coli foi utilizada para os ensaios de expressão in vitro da gDE7, essa linhagem é capaz de expressar proteínas recombinantes sob o controle do promotor derivado do fago T7, induzível por IPTG em cultura. As culturas foram realizadas a 37°C, 200 rpm em agitador orbital até a fase de crescimento exponencial (D0600nm=0,5 - 0,8) quando adicionou-se à cultura o indutor IPTG na concentração final de 0,1 mM. A cultura induzida foi mantida por um período de 3 horas.

Extração ε Cromatografia de Afinidade ao Níquel

Após esse período as células foram recuperadas e rompidas em homogeneizador em alta pressão ou por sonicação com ultra-som a 40% de amplitude utilizando o tampão A (Tris 100 mM; NaCl 500 mM; pH 7,5). A fração solúvel foi separada da fração insolúvel por centrifugação e a fração insolúvel foi submetida à solubilização com tampão A, acrescido de uréia a 8 M (uréia 8 M, Tris 100 mM; NaCl 500 mM; pH 7,5) uOvemighf. Foi observado que a proteína híbrida gDE7 foi depositada em 100% na fração insolúvel de E. coli. O extrato insolúvel contendo a proteína híbrica gDE7 foi submetido à flltração em membrana filtrante e aplicado à coluna de cromatografla de afinidade ao níquel. A eluição da proteína híbrida gDE7 purificada foi realizada pelo aumento gradual da concentração de imidazol do tampão B (uréia 8 M; Tris 100 mM; NaCl 500 mM; 1 M imidazol; pH 7,5).

Remodelamento

O processo de remodelamento (refolding) das proteínas sucedeu à purificação com a retirada gradual do agente desnaturante com tampões com concentrações decrescentes de uréia. Para o refolding da proteína gDE7 utilizamos os tampões: uréia 4 M Tris 100 mM NaCl 500 mM pH 7,5; uréia 2 M Tris 100 mM NaCl 500 mM pH 7,5; uréia 1 M Tris 100 mM NaCl 500 mM pH 7,5 e Tris 100 mM NaCl 500 mM pH 7,5. O processo de refolding da proteína gDE7 ocorreu em aparelho de filtração tangencial com membranas Pellicon de corte de 30K.

Ensaios

A formulação vacinai da presente invenção foi testada em modelo murino e consiste em uma proteína híbrida composta pela oncoproteína E7 de HPV-16 fusionada geneticamente na gD de HSV-I deletada em seu peptídeo sinal e a região C-terminal para o controle terapêutico de tumores induzidos pelo HPV-16.

Ensaios de Imunização

A proteína híbrida recombinante foi administrada em quatro doses com intervalos de sete dias pela via subcutânea. As doses foram preparadas com proteínas purificadas, ressuspensas em PBS estéril em um volume final de 100 μΐ e inoculados na região do flanco inferior de camundongos C57BL/6 machos. Os grupos experimentais foram assim definidos: grupo PBS, grupo gD (10 pg), grupo gDE7 (30 μg), grupo gD+E7 (10 μg+10 μg) e grupo E7 (10 pg). A proteína de fusão foi administrada em doses de 30 pg, já que seu peso molecular corresponde em três vezes mais ao peso molecular do antígeno E7. A proteína E7 utilizada como antígeno no presente pedido foi produzida em nosso laboratório e corresponde aos 60 primeiros aminoácidos da proteína nativa onde o epítopo CD8 específico encontra-se preservado.

Avaliação da Resposta Celular Detecção de Linfócitos τ CD8 VINF-I+ por Marcação de Citocina Intracelular

Placas de fundo côncavo (Nunc) receberam IO6 células do baço ou do sangue por poço que foram incubada por 6 horas a 37°C à 5% de CO2 na presença de Brefeldin A (GolgiPlug; BD PharMingen) e do peptídeo E7 CD8 específico (aminoácidos 49-57). Com controle sem estímulo, as células receberam o mesmo volume de meio DMEM sem o peptídeo. Após este período as células foram incubadas por 30 minutos a 4°C com anticorpo anti-CD8 conjugado com FITC (BD PharMingen).

Após a permeabilização com Saponina por 20 minutos a 4°C, as células foram tratadas com anticorpo anti-IFN-γ conjugado à ficoeritrina (PE) (BD PharMingen) por 30 minutos a 4°C. As células foram ressuspensas em PBS e examinadas por citometria de fluxo utilizando o aparelho FACScalibur (BD Bioscience). Os dados foram analisados pelo programa FlowJo para a determinação das porcentagens de células INF-y+/CD8+ sobre o total de células CD8+.

Citotoxicidade "in vivo"

O ensaio de citotoxicidade "in vivo" foi realizado para verificar a presença de células T CD8+ citotóxicas específicas para o peptídeo E7 (RAHYNIVTF) em animais imunizados. Após 15 ou 30 dias do desafio, um grupo de animais não imunizados foi submetido à eutanásia, seus baços foram retirados e processados. As células foram incubadas com 0,5 μΜ ou 5 μΜ de CFSE (carboxifluorescina succinimidil ester, Invitrogen) em PBS, por 15 minutos a 37°C. Após a incubação, as células foram lavadas e ressuspensas em meio RPMI acrescido de 1% de soro fetal bovino (RPMI 1%). Ao tubo contendo a população de células marcadas com 5 μΜ de CFSE foi adicionado 2,5 μg/mL do peptídeo E7 e incubado por 40 minutos a 37°C. Após esse período, as células foram lavadas com meio RPMI 1% para a remoção do peptídeo não ligado e, em seguida, contadas. Quantidades iguais das duas populações de células marcadas foram misturadas e centrifugadas a 1.500 rpm. O sedimento de células foi ressuspenso em RPMI de modo a conter 2-4x IO7 células/100 μΐ^ e injetado nos animais imunizados pela via do plexo retro orbital.

No dia seguinte, todos os animais foram submetidos à eutanásia e os esplenócitos coletados. As células foram lavadas 3x com PBS IX contendo soro fetal bovino a 1% (PBS 1%), ressuspensas em 400 μl, de PBS 1% e examinadas por citometria de fluxo. Os dados foram analisados para a determinação das porcentagens de células marcadas com 0,5 μΜ ou 5 μΜ de CFSE pelo programa "FlowJo".

Pesquisa de Citocinas por ELISA

Para avaliação da produção de citocinas frente a um re- estímulo in vitro, os animais foram submetidos à eutanásia após 15 dias do desafio com TC-I e seus baços foram coletados para a obtenção dos esplenócitos. Os baços foram macerados em 5 mL de RPMI 1% e as células foram centrifugadas a 1.500 rpm e lavadas com RPMI 1%. Depois estas células foram tratadas com ACK (1 mL/baço) para a remoção das hemácias e novamente lavadas com RPMI 1%. As células foram contadas em câmara de Newbauer e IxlO7 células/mL foram incubadas em estufa de CO2 a 37°C com a presença ou ausência de 1,5 μg do peptídeo E7 ou de 10μg da proteína E7 durante 72 horas. Em seguida, as amostras foram coletadas e centrifugadas e os sobrenadantes coletados e estocados a -80°C até serem usados para a dosagem das citocinas por ELISA. O ELISA foi realizado segundo protocolo descrito pelo fabricante (BD Biosciences).

Avaliação da Resposta Humoral

Pesquisa de Anticorpos por ELISA

Os ensaios de ELISA foram realizados com 250 ng da E7 purificada dispostas em placas PolySorp (Nunc). Após incubação de 12 horas a 4°C, as placas foram lavadas com PBS-Tween 0,05% (PBS-T) e bloqueadas com leite a 5% em PBS-T. Em seguida, incubou-se as placas com soros provenientes dos animais imunizados na diluição inicial de 1:500 para IgG anti-gD e 1:25 para IgG anti-E7, durante 1 hora a 37°C. Anticorpos anti-IgG de camundongo conjugados à peroxidase foram diluídos em PBS-T leite na concentração de 1:3000 e incubados nas placas previamente lavadas com PBS-Tween 0,05%. A presença de anticorpos ligados aos antígenos foi visualizada com a solução de revelação (12,5 mL de tampão Citrato-Fosfato 33 mM, pH 5.0; 5 mg de O-Fenilenodiaminadihidrocloreto (OPD), e 5 pL de H2O2) por 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 50 μL por poço de H2SO4 9 N. As densidades óticas das reações foram determinadas a 492 nm em leitor de ELISA modelo MultiScan EX (Labsystems).

Ensaios de Desafio com Células TC-I

Os camundongos submetidos ao protocolo vacinai profilático e/ou terapêutico foram desafiados com a linhagem tumoral TC-1. As células, cultivadas em garrafas de plástico (TTP), foram lavadas duas vezes com PBS com pH 7.4 e em seguidas tratadas com Tripsina EDTA (CultLab). A seguir, as células foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino e coletadas em frascos de tipo Falcon de 15 mL. Em seguida foram centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos, sendo o precipitado de células ressuspenso em meio DMEM sem soro fetal bovino. A concentração celular foi determinada em câmara de aNewbauer". Dessa suspensão de células, inoculou-se 7,5 χ 10^4 células TC-I em um volume final de 100 μL por animal. O inóculo foi realizado no dorso de camundongos machos C57BL/6.

Claims (27)

1. PROTEÍNA HÍBRIDA, caracterizada pelo fato de compreender a fusão genética da oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) com uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal e na região C-terminal que inclui a seqüência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática

2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da região C-terminal que inclui a seqüência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática compreender a seqüência de aminoácidos 320 a 344.

3. PROTEÍNA, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato da fusão genética compreender a construção de (i) um primeiro segmento da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal, (ii) uma oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) e (iii) segunda porção da glicoproteína D (gD) do HSV-1 deletada na região C-terminal.

4. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato do primeiro segmento da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal compreender a SEQ. ID. N°. 1.

5. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato do primeiro segmento da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal fusionada a uma oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) compreender a SEQ. ID. N°. 2.

6. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato do primeiro segmento da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simplex tipo-1 (HSV-I) compreender os aminoácidos 1 a 249.

7. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato da uma oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) compreender os aminoácidos 1 a 98 da proteína viral.

8. PROTEÍNA, de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato da construção genética compreender uma ligação entre o primeiro segmento da glicoproteína (gD) através da porção N-terminal da proteína conectada a seqüência que codifica um antígeno, sendo que o aminoácido 1 na extremidade N-terminal do antígeno encontra-se fusionado ao aminoácido 249 da proteína gD.

9. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato da construção genética compreender, ainda, uma ligação entre o segundo segmento da glicoproteína que corresponde aos aminoácidos 250 a 319 da proteína gD do HSV-I e o antígeno.

10. PROTEÍNA, de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato da proteína híbrida compreender, opcionalmente, a fusão de antígenos de natureza viral, bacteriana, fúngica e/ou parasitária.

11. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato dos antígenos compreenderem preferencilamente, proteínas do HIV, como Gag, Env, Nef, Pol e proteínas do vírus da dengue, tais como, proteína E, NS1, NS2, NS3, entre outros patógenos que infectam os seres humanos e animais.

12. SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de compreender a SEQ. ID. N°. 2 que codifica a proteína recombinante.

13. SEQÜÊNCIA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender a glicoproteína D do HSV-I desprovida do peptídeo sinal e da porção C-terminal envolvendo a região de ancoramento à membrana citoplasmática fusionada geneticamente à oncoproteína E7 de HPV-16 no sítio permissivo de Αρα I. (gDE7) que codificam a proteína híbrida gDE7.

14. VETORES/PLASMÍDEOS, de acordo com as reivindicações 1 a 13, caracterizados pelo fato de compreender a proteína híbrida e/ou seqüência recombinante (SEQ. ID. N°. 2), isoladas ou combinadas.

15. VETORES/PLASMÍDEOS, de acordo com a reivindicação 14, caracterizados pelo fato de compreender, preferencilamente, promotores bacterianos, como por exemplo o T5 e o TT-Iac para Escherichia coli, assim como em sistemas eucariotos de expressão, como por exemplo, células de inseto, leveduras e células de mamíferos.

16. VETORES/PLASMÍDEOS, de acordo com a reivindicação 15, caracterizados pelo fato dos sistemas eucariotos compreederem a purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade, preferencialmente, por afinidade à níquel mediada por resíduos de histidina adicionados à porção N ou C- terminal da proteína.

17. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS, de acordo com as reivindicações 1 a 16, caracterizadas pelo fato de compreender a proteína hibrida e/ou a seqüência recombinante, preferencialmente, na forma de vacinas.

18. FORMULAÇÕES, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadas pelo fato das formulações compreenderem, preferecilamente, a proteína gD híbrida purificada em veículos farmacêuticamente aceitáveis.

19. FORMULAÇÕES, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadas pelo fato das formulações compreenderem, opcionalmente, adjuvantes vacinais, particularmente, sais de alúminio (alumen), MF59 e saponina.

20. FORMULAÇÕES, de acordo com as reivindicações 17 a 19, caracterizadas pelo fato das formulações compreenderem concentrações da proteína gD recombinante entre 1 μg/dose à 500 μg/dose, preferencilamente, 30 μg/dose de proteína purificada.

21. FORMULAÇÕES, de acordo com as reivindicações 17 a 20, caracterizadas pelo fato das formulações compreenderem formas farmacêuticas administradas via intramuscular, intra-dérmica, preferencialmente, via subcutânea.

22. FORMULAÇÕES, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadas pelo fato da formulações vacinais compreenderem, opcionalmente, vacinas de DNA que codifiquem a proteína gD modificada.

23. FORMULAÇÕES, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadas pelo fato da vacina de DNA compreender, preferencialmente, concentração de 100 pg/dose para administração via intramuscular.

24. FORMULAÇÕES, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadas pelo fato da vacina de DNA compreender, preferencialmente, concentração de 2 pg/dose para administração intradérmica.

25. USO DA PROTEÍNA HÍBRIDA, de acordo com as reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de compreender a construção genética, como adjuvante vacinai a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para doenças infecciosas e/ou degenerativas.

26. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato das doenças infecciosas e/ou degenerativas compreenderem, preferencialmente, o controle de tumores induzidos por vírus do papiloma humano e infecções por vírus herpes.

27. USO, de acordo com as reivindicação 25, caracterizado pelo fato das doenças, ainda, compreenderem a sindrome da imunodeficiencia adquirida (AIDS), hepatites, dengue, entre outras e/ ou doenças degenerativas, como diferentes tipos de câncer.