CN1276833A - 疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供连接至免疫融合伴侣的人乳头瘤病毒(HPV)融合蛋白,所述免疫融合伴侣提供对HPV抗原的T辅助表位。提供可用于治疗或预防HPV诱导的损害的疫苗制剂。
Description
本发明涉及融合蛋白,所述融合蛋白包含提供T辅助表位的蛋白或蛋白部分和一种抗原,所述抗原得自人乳头瘤病毒并发现在人乳头瘤病毒诱导的肿瘤的治疗或预防中有实用性。具体地说,本发明涉及包含连接至流感嗜血菌B的蛋白D的HPV毒株16或18的E6或E7蛋白。
乳头瘤病毒是小的裸露的DNA肿瘤病毒(7.9千碱基,双链),它是高度物种特异性的。已经描述了超过70种各种人乳头瘤(HPV)基因型。乳头瘤病毒在来源物种(人、牛等)和来自相同物种的其它乳头瘤病毒的遗传相关性程度的基础上进行分类。HPV一般对皮肤或粘膜表面是特异性的,已经在异常组织或肿瘤组织中检测为稀少和常见的基础上,大致分别分为“低”和“高”风险。低风险HPV通常引起持续数月或数年的良性损害(疣或乳头瘤)。高风险HPV与癌症相关。HPV病毒和人癌症之间最强的正相关性在于,在HPV16和18与宫颈癌之间存在最强的正相关性。在宫颈癌中也已经发现了10种以上的其它HPV类型,包括HPV31和HPV33,尽管其频率较低。
在年轻的性活跃妇女中生殖器HPV感染是常见的,大多数个体或者清除感染,或者如果损害发展,这些生殖器将退化。仅一个亚群的受感染个体的损害发展至高级上皮内瘤形成,这些瘤形成的仅一部分进一步发展至侵入性癌。
尚未清楚地确立导致HPV感染的分子事件。缺乏合适的体外系统繁殖人乳头瘤病毒,这已经阻碍了关于该病毒周期最佳信息的进展。
今天,已经分离出不同类型的HPV,并借助细菌中的克隆系统和新近通过PCR扩增进行了特征鉴定。在与充分特征鉴定的1型牛乳头瘤病毒(BPV1)比较的基础上,已经限定了所述HPV基因组的分子结构。
尽管确实存在微小变异,但描述的所有HPV基因组均具有至少7个早期基因E1-E7和两个晚期基因L1和L2。另外,上游调节区带有看来控制所述HPV基因组大多数转录事件的调节序列。
E1和E2基因分别参与病毒复制和转录控制,往往由于病毒整合而被破坏。E6和E7参与病毒转化。E5也涉及该过程。
在诸如HPV16和18的涉及宫颈癌的HPV中,致癌过程在病毒DNA整合后开始。整合导致编码衣壳蛋白L1和L2的基因失活,E2阻抑物功能的丧失导致使连续装配的E6/E7可读框去调节,过量表达两种早期蛋白E6和E7,这将导致正常细胞分化的逐渐丧失并发生癌。通过分别使成视网膜瘤基因产物的主要肿瘤抑制蛋白p53和pRB失活,E6和E7克服了正常的细胞周期。
宫颈癌在妇女中是常见的,通过癌前期中间期发展至通常导致死亡的侵入性癌。该疾病的中间期称为宫颈上皮内瘤形成,根据增强的严重性分为I-III级(CIN I-III)。
在临床上,女性肛殖道HPV感染表现为宫颈扁头湿疣,这是koilocytosis的标志,主要影响宫颈扁平上皮的表面细胞和中间细胞。
koilocyte为该病毒细胞病变效应的结果,表现为具有核周透明晕(clear haloe)的多核细胞。由于导致该损害疣状外观的异常角质化,上皮变厚。
这种扁头湿疣当为HPV16或18血清型阳性时,是向宫颈上皮内瘤形成和原位癌(CIS)进化的高风险因子,这些本身被认为是侵入性宫颈癌的前体损害。
致癌HPV感染的自然史是3个连续的时期,即:
(1)潜伏感染期,
(2)具有完整病毒体产物的核内病毒复制期,这对应于koilocytes的出现。在此期,HPV产生其所有的蛋白,包括E2、E5、E6、E7、L1和L2。
(3)病毒整合入细胞基因组的时期,这触发了恶性转化的开始,对应于CIN II和CFNIII/CIS,koilocytes进行性消失。在此期,E2的表达向下调节,E6和E7的表达增强。在CIN II/III和CIN III/宫颈癌之间,病毒DNA由在基层细胞中游离变为仅整合E6和E7基因(肿瘤细胞)。所有宫颈癌中的85%是最主要与HPV16血清型相关的扁平细胞(Squamos cell)癌。10%和5%分别为腺癌和腺扁平细胞癌,这两种类型均主要与HPV18血清型相关。然而,存在其它的致癌HPV。
国际专利申请第WO 96/19496号公开了人乳头瘤病毒E6和E7蛋白的变异体,特别是在E6和E7蛋白中均有缺失的E6/E7的融合蛋白。这些缺失融合蛋白被认为具有抗原性。
本发明提供组合物,所述组合物包含连接具有T细胞表位的免疫融合伴侣的或者E6或E7或者E6/E7融合蛋白。
在本发明的一个优选形式中,所述免疫融合伴侣得自流感嗜血菌B的蛋白D。所述蛋白D衍生物最好包含该蛋白的约前1/3,特别是N末端前100-110个氨基酸。可以将蛋白D脂化(lipidate)(Lipo蛋白D)。其它免疫融合伴侣包括来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。通常,利用N末端81个氨基酸,尽管可以使用不同的片段,只要它们包括T辅助表位。
在另一实施方案中,所述免疫融合伴侣是称为LYTA的蛋白。最好使用该分子C末端部分。Lyta得自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae),由N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶LYTA(由lytA基因编码{Gene,43(1986)第265-272页})合成,该酶是特异性降解肽聚糖骨架中某些键的自溶素。LYTA蛋白的C末端结构域负责对胆碱或诸如DEAE的某些胆碱类似物的亲和性。该特性已经用来开发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。已经描述了于氨基末端含该C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化{Biotechnology:10,(1992)第795-798页}。如本文所用的,一个优选实施方案利用在C末端中发现始于178残基的Lyta分子的重复部分。一种特别优选的形式掺入残基188-305。
因此,本发明在优选实施方案中提供融合蛋白,所述融合蛋白包含蛋白D-HPV16的E6、蛋白D-HPV16的E7、蛋白D-HPV18的E7、蛋白D-HPV18的E6和蛋白D-HPV16和18的E6 E7。所述蛋白D部分最好包含蛋白D的前1/3。人们会认识到可以利用来自其它HPV亚型的其它E6和E7蛋白。
本发明的蛋白最好在大肠杆菌中表达。在一个优选实施方案中,表达具有包含5-9个、最好6个组氨酸残基的组氨酸尾的所述蛋白。这些在辅助纯化中是有利的。
在一个优选实施方案中,所述蛋白E7可以携带一个突变,以减少对rb位点(成视网膜瘤基因产物)的结合,并因此消除任何潜在的转化能力。HPV16 E7的优选突变包括用甘氨酸取代Cys24或用谷胺酰胺取代谷氨酸26。在一个优选实施方案中,所述E7蛋白含有这两种突变。
HPV 18 E7的优选突变包括用甘氨酸取代Cys27和/或用谷胺酰胺取代谷氨酸29。此外,优选存在两种突变。
也可以将单突变或双突变引入E6的p53区,以消除任何潜在的转化能力。
在本发明再一实施方案中,提供连接至免疫融合伴侣的HPV的E6 E7融合蛋白。优选的免疫融合伴侣为蛋白D,更优选为蛋白D的前1/3。
本发明也提供编码本发明蛋白的DNA。这种序列可以插入合适的表达载体中,并在合适的宿主中表达。
编码本发明蛋白的DNA序列可以用标准DNA合成技术合成,诸如D.M.Roberts等,Biochemistry 1985,24,5090-5098描述的酶连接、化学合成、体外酶聚合或利用例如热稳定性聚合酶的PCR技术、或这些技术的组合。
可以采用诸如DNA聚合酶I(Klenow片段)的DNA聚合酶,在合适的缓冲液中于10-37℃,体外进行DNA的酶聚合,所述缓冲液根据需要含有三磷酸核苷dATP、dCTP、dGTP和dTTP,反应体积一般为50μl或更少。采用诸如T4 DNA连接酶的DNA连接酶,于4℃至室温的温度下,一般在50ml或更少的体积的合适缓冲液中,进行DMA片段的酶连接,所述缓冲液诸如0.05MTris(pH7.4)、0.01M MgCl2、0.01M二硫苏糖醇、1mM亚精胺、1mM ATP和0.1mg/ml牛血清白蛋白。可以采用诸如以下文献中描述的固相技术,通过常规磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学进行DNA聚合物或片段的化学合成,所述文献为‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-ALaboratory Manual’(H.G.Gassen和A Lang编辑),Verlag Chemie,Weinheinm(1982),或在其它科学出版物例如M.J.Gait,H.W.D.Matthes,M.Singh,B.S.Sproat,和R.C.Titmas,Nucleic Acids Research,1982,10,6243;B.S.Sproat和W.Bannwarth,Tetrahedron Letters,1983,24,5771;M.D.Matteucci和M.H.Caruthers,Tetrahedron Letters,1980,21,719;M.D.Matteucci和M.H.Caruthers,Joumal of the AmericanChemical Society,1981,103,3185;S.P.Adams等,Journal of theAmerican Chemical Society,1983,105,661;N.D.Sinha,J.Biernat,J.McMannus和H.Koester,Nucleic Acids Research,1984,12,4539;和H.W.D.Matthes等,EMBO Journal,1984,3,801。
可以采用诸如Maniatis等,Molecular Cloning-A LaboratoryManual;Cold Spring Harbor,1982-1989中描述的常规重组技术,进行本发明的方法。
特别是,所述方法可以包括以下步骤:
i)制备复制型或整合型表达载体,所述载体能够在宿主细胞中表达其包含的核苷酸序列编码该蛋白或其免疫原性衍生物的DNA聚合物;
ii)用所述载体转化宿主细胞;
iii)在允许表达所述DNA聚合物的条件下培养所述转化的宿主细胞,以产生所述蛋白;和
iv)回收所述蛋白。
术语“转化”本文用来是指将外源DNA引入宿主细胞。例如采用Genetic Engineering;S.M.Kingsman和A.J.Kingsman编辑;BlackwellScientific Publications;Oxford,England,1988中描述的常规技术,用合适的质粒或病毒载体进行转化、转染或感染,可以达到这一点。术语“转化的”或“转化子”在下文应用于所得的含有并表达目的外源基因的宿主细胞。
本发明的重组抗原最好在大肠杆菌中表达。表达策略包括将E7、E6或E6/E7融合体融合至流感嗜血菌B的蛋白D的1/3-N末端部分,该部分是提供T细胞辅助表位的免疫融合伴侣。于该融合蛋白的羧基末端工程加入亲和多组氨酸尾,便于简化的纯化。这种重组抗原在大肠杆菌中作为不溶性蛋白过量产生。
本发明的蛋白最好与反式硫氧还蛋白(TIT)共同表达。最好是反式对顺式硫氧还蛋白的共同表达,以保持抗原无硫氧还蛋白,而不需要蛋白酶。硫氧还蛋白的共同表达使本发明蛋白易于溶解。硫氧还蛋白的共同表达也对在蛋白纯化得率、纯化蛋白的溶解性和质量有显著影响。
所述表达载体是新的,也构成本发明的部分。
可以按照本发明制备所述复制型表达载体,即切割与所述宿主细胞相匹配的载体,提供具有完整复制子的线性DNA区段;并在连接条件下将所述线性区段与一种或多种DNA分子混合,所述DNA分子与所述线性区段一起编码所需产物,诸如编码本发明蛋白的DNA聚合物或其衍生物。
因此,根据需要,可以预形成或在构建载体期间形成所述DNA聚合物。
载体的选择将部分由宿主细胞决定,所述宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞,但最好是大肠杆菌。合适的载体包括质粒、噬菌体、粘粒和重组病毒。
采用例如以上引用的Maniatis等描述的方法,用合适的限制性酶、所述DNA的聚合和连接,常规进行所述复制型表达载体的制备。
按照本发明,通过在转化条件下用本发明的复制型表达载体转化宿主细胞,制备重组宿主细胞。合适的转化条件是常规的转化条件,描述于例如以上引用的Maniatis等的文献或“DNA Cloning”第II卷,D.M.Glover编辑,IRL Press Ltd,1985。
根据宿主细胞,决定转化条件的选择。因此,诸如大肠杆菌的细菌宿主可以用CaCl2溶液(Cohen等,Proc.Nat.Acad.Sci.,1973,69,2110)或包含RbCl、MnCl2、乙酸钾和甘油的混合物的溶液、然后用3-[N-吗啉基]-丙磺酸、RbCl和甘油处理。培养中的哺乳动物细胞可以通过将载体DNA钙共沉淀至所述细胞上进行转化。本发明也扩展至用本发明的复制型表达载体转化的宿主细胞。
如按照例如以上引用的Maniatis等的文献或“DNA Cloning”所述,在允许表达所述DNA聚合物的条件下常规培养转化的宿主细胞。因此,最好提供营养给细胞,并在50℃以下的温度培养。
根据宿主细胞,采用常规方法回收产物。因此,当宿主为诸如大肠杆菌的细菌细胞时,可以进行物理、化学或酶裂解细胞,从所得的裂解液中分离所述蛋白产物。当所述宿主细胞为哺乳动物细胞时,一般可以从营养培养基或从无细胞提取物中分离所述产物。常规的蛋白分离技术包括选择性沉淀、吸附层析和亲和层析,包括单克隆抗体亲和柱。
当本发明的蛋白与组氨酸尾(His标志)一起表达时,利用离子金属亲和层析柱(IMAC)柱,可以容易地通过亲和层析纯化所述蛋白。
在IMAC柱产生高度纯化的蛋白之前或之后,可以利用第二个层析步骤,诸如Q-sepharose。如果所述免疫融合伴侣为C-LYTA,则可能利用CLYTA对胆碱和/或DEAE的亲和性来纯化该产物。在包括差别亲和层析的两步骤方法中,可以容易并有效地纯化含C-LYTA和his标志的产物。一个步骤涉及His标志对IMAC柱的亲和性,另一步骤涉及LYTA的C末端结构域对胆碱或DEAE的亲和性。
包含C-LYTA和组氨酸标志的蛋白是新蛋白,因此构成本发明的一个方面。采用简单的两步骤差别亲和方法,可以将这些蛋白纯化至高水平(高于80%,最好高于90%)。
提供的本发明蛋白的纯度最好通过SDS PAGE显示至少为80%,更优选90%。当通过SDS PAGE在还原条件下分析时,该蛋白为一条主要的单条带,而蛋白质印迹分析显示低于5%的宿主细胞蛋白污染。
本发明也提供在药学上可接受的赋形剂中包含本发明蛋白的药用组合物。优选的疫苗组合物包含至少蛋白D-HPV16的E6或其衍生物与蛋白D-PHV16的R7。或者,所述E6和E7可以以单分子存在,最好为蛋白DE6/E7融合蛋白。这种疫苗可以可任选地含有HPV18的E6和E7蛋白之一或两者,优选形式为蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白DE6/E7融合蛋白。本发明的疫苗可以含有HPV16或18的其它HPV抗原。特别是,所述疫苗可以含有L1或L2抗原单体。或者,这种L1或L2抗原可以作为病毒样颗粒一起存在,或仅所述L1蛋白作为病毒样颗粒或壳粒结构存在。这种抗原、病毒样颗粒和壳粒本身是已知的。参见例如WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792和WO93/02184。可以包括另外的早期蛋白,诸如E2或最好是例如E5。本发明的疫苗可以还包含来自其它HPV毒株的抗原,最好来自毒株HPV611、HPV31或33。
疫苗的制备一般描述于Vaccin Design-The subunit and adjuvantapproach(Powell和Newman编辑)Pharmaceutical Biotechnology第6卷Plenum Press 1995。Fullerton的美国专利4,235,877描述了在脂质体内包衣壳。
本发明的蛋白最好在本发明的疫苗制剂中加上佐剂。合适的佐剂包括铝盐,诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝,但也可以为钙、铁或锌盐,或可以为酰化酪氨酸或酰化糖、多糖的阳离子或阴离子衍生物或聚磷腈的不溶性悬浮液。
在本发明的制剂中,最好是所述佐剂组合物诱导优先的TH1应答。合适的佐剂系统包括例如单磷脂酰脂质A(最好为3-脱-O-酰化单磷脂酰脂质A(3D-MPL))与铝盐的组合物。
增强的系统包括单磷脂酰脂质A和皂苷衍生物的组合物,特别是WO94/00153中公开的SQ21和3D-MPL的组合物,或WO96/33739中公开的其中QS21用胆固醇猝灭的反应原性较低的组合物。
在WO95/17120中描述了一种特别有效的在水包油乳液中包括QS21、3D-MPL和生育酚的佐剂制剂。
因此,在本发明的一个实施方案中,提供用单磷脂酰脂质A或其衍生物作为佐剂、包含蛋白D(或其衍生物)-E6或蛋白D(或其衍生物)-E7的疫苗。
所述疫苗最好还包含皂苷,最好是QS21。
所述制剂最好还包含水包油乳液和生育酚。本发明也提供生产疫苗制剂的方法,包括将本发明的蛋白与药学上可接受的赋形剂(诸如3D-MPL)一起混合。
本发明将参考以下实施例进一步描述:实施例I:构建表达融合蛋白-D1/3-E7-His(HPV16)的大肠杆菌菌株1)-表达质粒的构建
a)-质粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)为pMG81(描述于以WO97/01640公开的英国专利申请n°951 3261.9)的衍生物,其中流感的NS1编码区的密码子4-81被对应于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等,1991,Infection and Immunity,Jan.第119-125页)残基Ser20→Thr127的密码子取代。Prot-D1/3的序列后接一个多克隆位点(11个残基)和一个C末端组氨酸尾(6His)的编码区。该质粒用来表达融合蛋白D1/3-E7-His。
b)-HPV16型的HPV基因组E6和E7序列(参见Dorf等,Virology 1985,145,第181-185页)从的pBR322中克隆的HPV16全长基因组(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ),Refernzzentrumfür人病原体乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)进行扩增,并将其亚克隆入pUC19,得到TCA301(=pRIT14462)。表达融合蛋白-D1/3-E7-His的质粒TCA308(=pRIT14501)的构建
从pRIT14462扩增对应于E7蛋白氨基酸1→98的核苷酸序列。在聚合酶链式反应期间,于所述E7序列的5’端和3’端产生NcoI和SpeI限制性位点,允许插入质粒pMGMCS prot D1/3的相同位点,产生质粒TCA308(=pRIT14501)。对插入片段进行测序,以证实在聚合酶链式反应期间没有产生修饰。融合蛋白-D1/3-E7-His(HPV16)的序列描述于图1。2)-AR58菌株的转化
将质粒pRIT14501引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl。Acad.Sci.,82:88)中,该菌株为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3)-细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E7-His的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培养基中培养用质粒pRIT14501转化的AR58细胞。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白D1/3-E7-His的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。实施例II:融合蛋白D1/3-E7-His(HPV16)的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中,在弗氏压碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎细胞(通过3次)。提取物于4℃以16.000g离心30分钟。
将以上提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。通过考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的约33kDa的一条主带,并在蛋白质印迹中,用兔多克隆抗蛋白D和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。考马斯染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶显示,表达水平代表约5%的总蛋白。实施例III:蛋白-D1/3-E7-His(HPV16)的纯化
将1升表达蛋白-D1/3-E7-His的细菌培养物于4℃以11,300g离心30分钟,将细胞沉淀于-80℃保持,直至进一步处理。在75ml PBS缓冲液中再悬浮后,大肠杆菌细胞在弗氏压碎器(SLM Aminco)中以20,000psi破碎。以17,000g离心30分钟沉淀裂解的细胞。含有蛋白D1/3-E7-His的沉淀在30ml 2M NaCl、50mM磷酸盐pH7.5中洗涤1次,然后在30ml 50mM磷酸盐pH7.5中洗涤2次。于室温下将沉淀在30ml 8M尿素、50mM磷酸盐pH7.5中温育2小时后,蛋白溶解。于4℃以17,000g离心15分钟去除细胞碎片。于室温下进行蛋白纯化,将15ml溶解的蛋白上样至5ml Ni2+NTA(Qiagen)树脂(Pharmacia柱XK16/20),该柱在8M尿素、50mM磷酸盐pH7.5中以0.2ml/min的流速预平衡。该柱在相同的缓冲液洗涤,直至280nm下的吸光度达到基线。用8M尿素、50mM磷酸盐pH7.5中的0-600mM咪唑梯度洗脱该蛋白。最后两个步骤的流速达到1ml/min。洗脱的流分经SDS聚丙烯酰胺凝较电泳和蛋白质印迹分析。用多克隆抗蛋白D或单克隆抗E7抗体经考马斯蓝染色显现的ProtD1/3-E7-His,作为约32kDa的主要单条带出现,估计为纯度为95%的蛋白。用多克隆抗大肠杆菌蛋白抗体示踪,没有观察到大肠杆菌污染。
为了去除尿素,于室温下将9ml 1.33mg/ml的纯化抗原(Bradford)对3升PBS缓冲液透析过夜,然后对新鲜的PBS缓冲液透析4小时。回收作为可溶性蛋白的80%的无尿素蛋白。为了去除污染性内毒素,在温和搅拌下,将6ml透析的蛋白与1ml Affiprep polymixin凝胶(Biorad)于4℃温育3小时。与500μl Affiprep polymixin树脂进行第二次温育,将内毒素水平减少至8.8EU/μg蛋白。在0.22μm过滤装置(Milex 0.22GV,Millipore)上除菌过滤后,以0.665mg/ml分析prot-D1/3-E7-His蛋白的稳定性。SDS PAGE分析显示,在于-20℃、4℃、室温或37℃下温育7天后,没有放出该蛋白。实施例IV:表达融合蛋白-D1/3-E6-His/HPV16的大肠杆菌菌株的构建1.表达质粒的构建
a)-质粒pMG MCSprotD1/3(=pRIT14589)为pMG81(描述于WO97/01640)的衍生物,其中流感的NS1编码区的密码子4-81被对应于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等,1991,Infection and Immunity,Jan.第119-125页)残基Ser20→Thr127的密码子取代。Prot-D1/3的序列后接一个多克隆位点(11个残基)和一个C末端组氨酸尾(6His)的编码区。该质粒用来表达融合蛋白D1/3-E7-His。
b)-HPV16型的HPV基因组E6和E7序列(参见Dorf等,Virology1985,145,第181-185页)从在pBR322中克隆的HPV16全长基因组(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ),Refernzzentrum fr人病原体乳头瘤病毒-D69120-Heidelberg)进行扩增,并将其亚克隆入pUC19,得到TCA301(=pRIT14462)。表达融合蛋白-D1/3-E6-His/HPV16的质粒TCA307(=pRIT14497)的构建
从pRIT14462扩增对应于E6蛋白氨基酸1→151的核苷酸序列。在聚合酶链式反应期间,于所述E6序列的5’端和3’端产生NcoI和SpeI限制性位点,允许插入质粒pMGMCS Prot D1/3的相同位点,产生质粒TCA307(=pRIT14497)(参见图2)。对插入片段进行测序,以证实在聚合酶链式反应期间没有产生修饰。融合蛋白-D1/3-E6-His的编码序列描述于图3。2.AR58菌株的转化
将质粒pRIT14497引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88)中,该菌株为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E6-His的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培养基中培养用质粒pRIT14497转化的AR58细胞。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白D1/3-E6-his的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。4.融合蛋白D1/3-E6-his(HPV16)的特征鉴定提取物的制备
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中,在弗氏压碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎细胞(通过3次)。提取物于4℃以16.000g离心30分钟。考马斯染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶与蛋白质印迹的分析
将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。
考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的约32kDa的一条主带,并在蛋白质印迹中,用兔多克隆抗蛋白D和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。表达水平代表约5%的总蛋白。5.与硫氧还蛋白共同表达
以类似于pro D1/3E7His(HPV18)表达(实施例XIII)的方式,用编码硫氧还蛋白和蛋白D1/3E7His(HPV16)的质粒转化大肠杆菌菌株AR58。实施例V:蛋白D1/3 E6 His(HPV 16)的纯化
在大肠杆菌(AR58)中表达HPV-16 ProtD1/3 E6重组抗原。表达策略包括将E6融合至流感嗜血菌蛋白D的1/3-N末端部分,该部分为提供T细胞辅助表位的免疫融合伴侣。将亲和性多组氨酸尾工程改造在所述融合蛋白的羧基末端。该重组抗原在大肠杆菌中以不溶性蛋白过量表达。
该抗原的溶解需要变性剂。在缺乏变性剂的情况下,ProtD1/3-E6-His于中性pH下沉淀,为了避开溶解性问题,将这些蛋白与一种折叠伴侣反式硫氧还蛋白(TIT)共同表达。
当共同表达硫氧还蛋白时,在存在0.05mg/ml卡那霉素的情况下,于30℃在补充0.2mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中进行细菌表达。当细胞光密度(OD600nm)达到0.4时,通过将细胞转移至42℃,热诱导重组蛋白的表达。蛋白表达维持4小时。按照以下方案进行纯化。细胞培养物沉淀 60 OD600
1 mM pefabloc,2M NaCl,PBS pH 7.4(缓冲液A)弗氏压碎器 通过3次
20,000psi离心 17,000g 30 min,4℃沉淀洗涤液 2MNaCl,PBS pH 7.4(缓冲液B)x1
PBS pH 7.4(缓冲液C) x2离心 17,000g 30 min,4℃沉淀溶解 6M盐酸胍,20mM PO4,pH 7.0(缓冲液D)
于4℃过夜离心 17,000g 30 min,4℃上清液上样至 平衡:IMAC 6M盐酸胍,20mM PO4,pH7.0(缓冲液D)
洗脱:8M尿素,20mM PO4,pH7.0中的咪唑阶
梯(0.025M,01M,0.5M)Affiprep Polymyxin 8M尿素,20mM PO4,pH7.0(缓冲液E)
2h室温透析 4M尿素,0.5M精氨酸,150mM NaCl,10mM
PO4,pH6.8(缓冲液I)
2M尿素,0.5M精氨酸,150mM NaCl,10mM
PO4,pH6.8(缓冲液J)
0M尿素,0.5M精氨酸,150mM NaCl,10mM
PO4,pH6.8(缓冲液K)
通过采用弗氏细胞压碎装置进行高压匀浆,有效地破碎细胞。用高浓度蛋白变性剂提取抗原。这第一步打开细菌细胞壁,从细菌不溶性部分提取抗原。在4升培养物上进行以下纯化。
A. PBS/2 M NaCl/1 mM Pefabloc
B. PBS/2M NaCl
C. PBS:137mM NaCl,2.7mM KCl,8.1mM NaH2PO4,1.47mMKH2PO4 pH7.4。
D. 6M盐酸胍,20mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O)pH7.0
原料为10个烧瓶,每个烧瓶400ml培养物。
在使细胞通过弗氏压碎器(20,000psi)三次进行细胞裂解之前,将细胞糊状物在缓冲液A(在这种情况下为240ml缓冲液A)中悬浮于60OD600。于4℃将裂解细胞以15,000g沉淀30分钟。在240ml缓冲液B中将含所述重组蛋白的细菌细胞沉淀洗涤1次,然后在240ml缓冲液C中洗涤2次。
在摇床(rotating wheel)上,用240ml缓冲液D将Prot D E6-His(TIT)溶解过夜。于4℃以15,000g将细胞碎片沉淀30分钟。上清液(230ml)于-20℃贮存。然后将该材料经IMAC层析。
将螯合配体NTA(次氮基-三-乙酸)连接至琼脂糖支持体(Qiagen)。用镍金属离子使NTA配体带电荷,镍金属离子通过镍的6个配位点中的4个配位点与其相互作用。镍的其余两个配位点与6xHis-标记蛋白的组氨酸残基强烈地相互作用。通过用结合至N-NTA的咪唑竞争并取代标记的抗原,完成洗脱。
使用Ni-NTA琼脂糖Qiagen(分类目录号:30 250)。溶液D: 6M盐酸胍,20MPO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O))pH
7.0E: 8M尿素,20mMPO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O))pH 7.0F: E+0.025M咪唑G: E+0.1M咪唑H: E+0.5M咪唑0.5MNaOH去离子水0.02%NaN3纯化a) 填充树脂(15ml树脂/230ml样品),并在10倍柱体积(C.V.)缓冲
液D中以15cm h-1平衡。b) 将得自溶解部分的上清液以15cm h-1注射到柱上。c) 柱子用缓冲液D以15cm h-1洗涤,直至OD 280mm回至基线。d) 柱子用2CV缓冲液E以15cm h-1洗涤。回收洗涤部分。e) 柱子首先用5CV缓冲液F洗脱。消除25kD主要污染物。f) 柱子然后用2CV缓冲液G洗脱。g) 柱子最后用3CV缓冲液H洗脱。洗脱所述抗原。合并抗原阳性
流分(30ml)
通过affiprep层析去除内毒素。Affi-PrepPolymyxin支持体包括偶联至Affi-PrepMatrix的USP级Polymyxin B。由于它对内毒素脂质A部分具有高度亲和性,polymixinB以高容量和选择性结合内毒素分子。溶液E: 8M尿素,20mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O))pH 7.0(无热原)。0.5 MNaOH去离子无热原水步骤1)将Affi-PrepPolymyxin树脂在10倍体积的0.1M NaOH中洗涤,然后在10倍体积的无热原水中洗涤。2)树脂在10倍体积的缓冲液E中平衡。3)15ml(半个库)IMAC洗脱的样品与3ml Affi-PrepPolymyxin树脂以分批模式一起温育。4)温育在摇床上于室温进行4小时或于4℃O/N。5)样品以2000g(Beckman GS-6R)离心10分钟。6)收集含该抗原的上清液,进行内毒素和蛋白分析。7)弃去树脂。
小分子通过半透膜扩散,而保留大分子。由于膜两边溶质浓度的差异而驱动透析过程。引入新的缓冲液,直至每边的缓冲液组分相同。缓冲液I: 4M尿素,0.5M精氨酸,15M NaCl,10mM PO4(NaH2PO4(2H2O)
/K2HPO4(3H2O))pH6.8J: 2M尿素,0.5M精氨酸,0.15M NaCl,10mM PO4(NaH2PO4(2H2O)
/K2HPO4(3H2O))pH6.8K: 0M尿素,0.5M精氨酸,0.15M NaCl,10mM PO4(NaH2PO4(2H2O)
/K2HPO4(3H2O))pH6.81)将样品(15ml)引入透析管(直径20.4mm,高度6cm)2)于4℃搅拌下,将透析管置于含缓冲液I的2升量筒中2小时。3)于4℃将透析管置于含缓冲液J的2升量筒(在搅拌下)中2小时。4)于4℃将透析管置于含缓冲液K的2升量筒(在搅拌下)中O/N。更换缓冲液,于4℃透析2小时以上。
Millipore无菌Millex-GV 0.22μ,13mm。分类目录号:SLGV0130S。
所有步骤均在室温(RT≈22℃)进行,该抗原似乎稳定。
使抗原溶液通过0.2μm滤器过滤,以防止任何细菌生长。将抗原于-20℃保持在Nunc管制瓶中。特征鉴定:
蛋白D1/3 E6 His特征鉴定如下:
蛋白D1/3-E6-His为长273个氨基酸的肽,112个氨基酸来自蛋白D部分。蛋白D1/3-E6-His的理论分子量为32kD,在SDS-PAGE上迁移为33kD蛋白。蛋白D1/3-E6-His的理论等电点为8.17。
病毒蛋白E6为含14个半胱氨酸残基的碱性蛋白,其中8个(Cys30、33、63、66和Cys 103、106、136、139)参与两个C-末端锌结合基元。
蛋白D1/3-E6-His作为不溶性蛋白在大肠杆菌-AR58菌株中与折叠伴侣反式硫氧还蛋白一起表达。在400ml烧瓶中产生细胞培养物。
每升培养物获得5.4mg 95%纯蛋白。实施例VI:表达融合蛋白-D1/3-E6E7-his/HPV16的大肠杆菌菌株的构建1.表达质粒的构建
a)质粒pMG MCS protD1/3(=pRIT14589)为pMG81(上文描述的)的衍生物,其中流感的NS1编码区的密码子4-81被对应于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等,1991,Infection andImmunity,Jan.第119-125)残基Ser 20→Thr 127的密码子取代。Prot-D1/3的序列后接一个多克隆位点(11个残基)和一个C末端组氨酸尾(6His)的编码区。该质粒用来表达融合蛋白D1/3-E6E7-hs。
b)HPV16型的HPV基因组E6和E7序列(参见Dorf等,Virology1985,145,第181-185页)从在pBR322中克隆的HPV16全长基因组(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ),Refernzzentrum für人病原体乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)进行扩增,并将其亚克隆入pUC19,得到TCA 301(=pRIT14462)。
c)TCA301(=pRIT14462)中的E6和E7编码序列用合成的寡核苷酸连接物(在AflIII和NsiI位点之间插入)修饰,引入E6和E7基因之间5个核苷酸的缺失,以去除E6终止密码子,并在质粒TCA309(=pRIT14556)中产生融合的E6和E7编码序列,参见图4。表达融合蛋白-D1/3-E6E6-His/HPV16的质粒TCA 311(=pRIT14512)的构建
从pRIT14556扩增对应于融合E6E7蛋白氨基酸1→249的核苷酸序列。在聚合酶链式反应期间,于E6E7融合序列的5’端和3’端产生NcoI和SpeI限制性位点,允许插入质粒pMGMCS ProtD1/3的相同位点,产生质粒TCA311(=pRIT14512)(参见图5)。对插入片段进行测序,以证实在聚合酶链式反应期间没有产生修饰。融合蛋白-D1/3-His的编码序列描述于图6。2.AR58菌株的转化
将质粒pRIT14512引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci,82:88)中,该菌株为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E6E7-His的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素的100mlLB培养基中培养用质粒pRIT14512转化的AR58细胞。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白D1/3-E6E7-his的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。4.融合蛋白D1/3-E6-his的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中,在弗氏压碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎细胞(通过3次)。提取物于4℃以16.000g离心30分钟。
将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。
考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的约48kDa的一条主带,并在蛋白质印迹中,用兔多克隆抗蛋白D和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。表达水平代表约1%的总蛋白。实施例VIb
以类似方式,在存在硫氧还蛋白的情况下在大肠杆菌中表达LipoD 1/3和得自HPV16的E6-E7的融合蛋白。含MDF残基的前蛋白(388aa)的N末端后接16个氨基酸的脂蛋白D(来自流感嗜血菌)的信号肽,该信号肽在体内切割,产生成熟蛋白(370aa)。脂蛋白部分(aa 1-127)后接融合的蛋白E6和E7。该蛋白的C末端用TSGHHHHHH延长。
通过以下方案纯化该蛋白:实施例VII:脂蛋白D1/3-E6-D7-His(TIT)的纯化A)溶解
在使细胞通过弗氏压碎器(20,000psi)3次进行细胞裂解之前,在作为蛋白酶抑制剂的1 mM Pefabloc存在下,将细胞糊状物在2MNaCl,20mM磷酸盐(NaH2PO4/K2HPO4)pH7.5中悬浮至60OD600。将裂解的细胞以15,000g于4℃沉淀30分钟。为了降低内毒素水平,将含该重组蛋白的细菌细胞沉淀在4M尿素,2M NaCl,20mM磷酸盐pH7.5中洗涤2次,在2%Empigen BB,20mM磷酸盐pH7.5中洗涤1次,最后在20mM磷酸缓冲液pH7.0中洗涤2次,以去除痕量的去污剂(每次洗涤均以用于细胞悬浮的相同体积中进行)。于4℃LipoProtD1/3-E6-E7-His(TIT)用8M尿素的0.2M β巯基乙醇(=βMeOH),20mM PO4 pH12溶液中溶解过夜,然后于室温下用相同的缓冲液温育2小时。细胞碎片以15,000g于4℃沉淀30分钟。上清液于-20℃保持。B)纯化1)在Q-Sepharose快流柱上进行阴离子交换层析
将225ml冷冻样品于室温在冷水浴中复苏,上样至Q-Sepharose快流柱(Pharmacia,XK 26/20),该柱以45cm/h在8M尿素,0.2MβMEOH,20mM PO4 pH 12(30ml树脂/225ml上清液)中预平衡。柱子用8 M尿素,0.2M βMEOH,20mM PO4 pH 12洗涤,直至OD 280mm达到基线,然后在8M尿素,20mM磷酸盐pH12(在2倍柱体积中)进行第二次洗涤。通过在8M尿素,20mM磷酸盐pH12中经NaCl分步(0.1M、0.25M、0.5M NaCl,每个步骤在2倍柱体积中进行)进行洗脱,合并0.5MNaCl洗脱的流分。2)离子金属亲和层析(IMAC)
合并得自Q Sepharose步骤的0.5M NaCl洗脱的流分,将其对0.2M NaCl,8M尿素,20mM磷酸盐pH10透析,然后上样至在8M尿素,20mM磷酸盐pH12(30ml树脂/61ml样品)中以5.6cm/h预平衡的Ni2+-NTA(Qiagen)柱(XK 26/20,Pharmacia)。柱子在8M尿素,20mM磷酸盐pH12中洗涤直至达到基线,然后用8M尿素,20mM磷酸盐pH10洗涤。在8M尿素,20mM磷酸盐pH10中以45cm/h经咪唑分步洗脱该抗原。合并0.5M咪唑洗脱的流分。C)浓缩
在得自AMICON的搅拌槽中于室温下,将Imac样品在5kDaFiltron Omega膜上浓缩约5倍(至0.407mg/ml)。D)透析
于室温下,将浓缩样品对尿素浓度降低(4M、2M尿素)的0.5M精氨酸、150mM NaCl、10mM PO4 pH6.8分步透析。于4℃对0.5M精氨酸、150mM NaCl、10mM PO4 pH6.8进行最后透析。结果:
IMAC步骤能够于0.025 M咪唑下去除32kD污染物,它也洗脱出某些抗原。经SDS-PAGE考马斯蓝染色,估计0.05M咪唑洗脱的抗原的纯度为90%。在这两个纯化步骤之后,样品无大肠杆菌污染物。采用特异性抗原-N和/或C末端抗体进行的蛋白质印迹分析,显示比全长蛋白分子量大和小的异源条带模式。该模式提示存在与全长蛋白共同纯化的聚集物和不完全加工的蛋白和/或降解的蛋白。实施例VIII:表达融合ProtD1/3-突变E7(cys24->gly,glu26->gln)HPV16型的大肠杆菌菌株B1002的构建1)-表达质粒的构建
原材料:
a)质粒pRIT 14501(=TCA 308),编码融合ProtDl/3-E7-His
b)质粒LITMUS 28(New England Biolabs cat n°306-38),pUC衍生的克隆载体
c)质粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT 14589),pMG81的衍生物(上文描述的),其中流感的NS1编码区的密码子4-81被对应于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等,1991,Infection and Immunity,Jan.第119-125页)残基Ser 20→Thr 127的密码子取代。Prot-D1/3的序列后接一个多克隆位点(11个残基)和一个C末端组氨酸尾(6His)的编码区。表达具有His尾的融合蛋白-D1/3-突变E7(cys24->gly,glu26->gln)的质粒pRIT 14733(=TCA347)的构建
将带有HPV16的E7基因编码序列、得自pRIT 14501(=TCA308)、用His尾延长的NcoI-XbaI片段,亚克隆入可用于诱变的中间载体Litmus 28中,产生pRI 14909(=TCA337)。选择双突变cys24-->gly(Edmonds and Vousden,J.Virology 63:2650(1989))和glu26-->gln(Phelps等,J.Virology 66:2418-27(1992),以削弱与成视网膜瘤基因(pRB)抗癌基因产物的结合。用试剂盒“快速改变定点诱变”(Stratagenecat n°200518)实现在E7基因中引入突变,产生质粒pRIT 14681(=TCA343)。经测序证实存在突变且完整的E7基因的完整性后,将突变E7基因引入载体pRIT 14589(=pMG MCS ProtD1/3)中,产生质粒pRIT 14733(=TCA347)(图7)。
图8描述了融合蛋白-D1/3-突变E7(cys24->gly,glu26->gln)-His的序列。2)表达ProtD1/3-突变E7(cys24-->gly,glu26-->gln)-His/HPV16的菌株B1002的构建
将质粒pRIT 14733引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88)中,AR58为含λpL启动子的热敏感性阻抑物的缺陷型λ溶原菌,经选择抗卡那霉素的转化子,得到菌株B1002。3)-细菌菌株B1002的生长和诱导-Prot D1/3-突变E7(cys24-->gly,glu26-->gln)-His/HPV16的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素的100 mlLB培养基中培养用质粒pRIT 14733转化的AR58细胞(B1002)。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白D1/3-突变E7-His/HPV16的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。4)-融合Prot D1/3-突变E7(cys24->gly,glu26->gln)-His HPV16型的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中。在弗氏压碎器SLM Aminco中以20 000psi破碎细胞(通过3次)。提取物于4℃以16000g离心30分钟。
将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。
考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的约33kDa的一条主带,并在蛋白质印迹中,用兔多克隆22 J 70抗蛋白D、Zymed的单克隆抗E7/HPV16和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。表达水平代表约3-5%的总蛋白。
从培养物肉汤中离心分离B1002细胞。将浓缩的B1002细胞于-65℃贮存。
将冷冻的浓缩B1002细胞复苏,于4℃再悬浮于细胞破碎缓冲液中(参见表1),至最终的光密度OD650为60(相当于约25g DCW L-1的细胞浓度)。b)细胞破碎
通过使细胞于1000巴下通过高压匀浆器(Rannie)2次破碎细胞。破碎的细胞悬浮液收集于烧瓶中,于4℃维持。细胞破碎缓冲液:Na2HPO4(0.02N),NaCl(2M)pH用HCl 3N(Merck)调至7.5纯化2a) 动态膜过滤(MDF-PALL FILTRON)
将2升破碎的细胞悬浮液(OD 60)上样至得自PALL、装有0.2μm截留膜的动态过滤系统DMF。
从2升浓缩至1升,得到样品PCC1
用3倍体积(3L)empigen-EDTA缓冲液(浓度EDTA 1.86g,Empigen
(30%)3.33ml,PO4 3-0.5M 40.00ml 40.00ml)以恒定体积洗涤,得到
样品PD1
从1L浓缩至300ml,得到样品PCC2
用10倍体积(3L)empigen缓冲液(每升的浓度:Empigen 30%,3.33
ml,PO4 3-0.5M 40ml)pH7.5以恒定体积洗涤,得到样品
通过加入相同体积(300ml)盐酸胍8M缓冲液(每升的浓度:Gu.HCl
764g;Empigen 30%3.33ml,PO4 3-0.5M 40ml)pH7.5,将蛋白溶解
蛋白的回收:在浓缩至初始体积(300ml)期间收集渗透液-样品
P3,和
用3倍体积盐酸胍4M缓冲液(每升的浓度GuHCl 328.12g;
Empigen(30%)3.33ml,PO4 3-0.5M 40.00ml)pH7.5渗滤
所有这些步骤均在冷房(2-8℃)中进行,用0.5M PO4 3-调节pH。
将P3部分于-20℃贮存,等待用于下一步的纯化步骤。2b)Zn螯合sepharose层析
将P3部分解冻,注射到填充并平衡的Zn螯合sepharose FF中。
此后,该柱:
用约3倍体积的盐酸胍4M缓冲液(参见上文)洗涤-样品Zn-FT
用约5倍体积的尿素4M缓冲液(每升浓度:尿素240.24g,Empigen3.33ml PO4 3-0.5M 40.00ml))洗涤-样品Zn-W
用约3倍体积的尿素4M-咪唑20mM缓冲液(每升浓度:尿素240.24g,Empigen(30%)3.33ml咪唑(1.36g)PO4 3-0.5M 40.00ml,pH7.5)、如上的缓冲液但咪唑的每升浓度为34.04g洗脱-样品Zn-20
用尿素4M-咪唑500mM洗脱至所述UV峰结束-样品Zn-500
该柱用EDTA 50mM和NaOH 0.5M洗涤,在下一个纯化步骤之前,将Zn螯合sepharose洗出液(Zn-500)贮存于2-8℃,
于室温下进行Zn螯合sepharose层析操作。2c)Q-sepharose层析
将Zn-500流分注射到填充并平衡的Q-sepharose FF。
此后,该柱:
用约7倍体积的尿素4M缓冲液(参见上文)洗涤-样品QS-FT
用约10倍体积的无empigen尿素4M缓冲液(每升浓度:尿素240.24g,PO4 3-0.5M 40.00ml))洗涤-样品QS-W1
用约10倍体积的无empigen尿素6M缓冲液(尿素360.36g/L)洗涤-样品QS-W2
用约5倍体积的尿素6M-NaCl 200mM缓冲液(每升浓度:尿素360.35g,NaCl 11.69g,40.00ml PO4 3-洗脱。
用约3倍体积的尿素6M-NaCl 500mM缓冲液(如上所述,但NaCl29.22g/L)洗脱。由所述UV峰终止确定所述流分的提取终止-样品QS-500
用4倍体积尿素4M-NaCl1M缓冲液(每升浓度:尿素360.36,NaCl58.44g 40.00ml PO4 3-(0.5)洗脱-样品QS-1M
然后该柱用NaOH0.5M洗涤
在下一个纯化步骤之前,QS-sepharose洗出液(QS-500)贮存于2-8℃。
于室温下进行Q-sepharose层析操作。2d)超滤
然后,在10kD超滤装置(Ultraette-Pall Filtron)上处理QS-500流分。
将该产物首先浓缩至约1mg/ml蛋白,然后对10倍体积的磷酸缓冲液渗滤。
弃去渗滤液(UF-P部分),将存留物(retentate)(UF-R部分)贮存于2-8℃,等待最后的过滤。
于2-8℃下进行超滤操作。2e)最后的过滤
最后的大批料(UF-R部分)在层流和无菌100级房间(aseptic class100room)中通过0.22μm无菌滤器(Millipak-Millipore)过滤。终浓度为0.5-1.0μg/ml。
将该无菌大批料贮存于-20℃。实施例X:表达融合clyta-E6-his(HPV16)的大肠杆菌菌株的构建1.表达质粒的构建
a)-质粒pRIT14497(=TCA307),编码融合ProtD1/3-E6-His/HPV16
b)-质粒pRIT14661(=DVA2),一种中间载体,含肺炎链球菌LytA的117个C末端密码子的编码序列。Lyta衍生自肺炎链球菌,合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶LYTA(由lytA基因编码,{Gene,43(1986)第265-272页}),这是一种特异性降解肽聚糖骨架中某些键的自溶素。
LYTA蛋白的C末端结构域负责对胆碱的亲和性,或对诸如DEAE的某些胆碱类似物的亲和性。1.b表达融合clyta-E6-His/HPV16的质粒pRIT14634(=TCA332)的构建
a)第一步为从质粒pRIT14497中纯化大的NcoI-AflII限制性片段和从pRIT14661中纯化小的AflII-AflIII限制性片段。
b)第二步为将clyta序列连接至E7-His序列(NcoI和AflIII为匹配的限制性位点),产生质粒pRIT 14634(=TCA332),它编码在pL启动子控制下的融合蛋白clyta-E6-His。(参见图9)
融合蛋白clya-E6-His的编码序列描述于图10。AR58菌株的转化
将质粒pRIT14634引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88),AR58为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。细菌菌株的生长和诱导-clyta-E6-His的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培养基中培养用质粒pRIT 14634转化的AR58细胞。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白clyta-E6-his的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。4.融合clyta-E6-his的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中。在弗氏压碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎细胞(通过3次)。提取物于4℃以16000g离心30分钟。将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。
考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的约33kDa的一条主带,并在蛋白质印迹中,用兔多克隆抗clyta抗体和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。表达水平代表约3%的总蛋白。实施例XI:表达融合clyta-E6-his(HPV16)的大肠杆菌菌株的构建1.表达质粒的构建1.a原材料
a)-质粒pRIT14501(=TCA308),编码融合ProtD1/3-E7-His/HPV16
b)-质粒pRIT14661(=DVA2),一种中间载体,含肺炎链球菌LytA的117个C末端密码子的编码序列。1.b表达融合clyta-E7-his/HPV16的质粒pRIT14626(=TCA330)的构建
a)第一步为从质粒pRIT14501中纯化大的NcoI-AflII限制性片段和从pRIT14661中纯化小的AflII-AflIII限制性片段。
b)第二步为将clyta序列连接至E7-His序列(NcoI和AflIII为匹配的限制性位点),产生质粒pRIT 14626(=TCA330),它编码在pL启动子控制下的融合蛋白clyta-E7-His。(图11)
融合蛋白clyta-E7-His的编码序列描述于图12。2.AR58菌株的转化
将质粒pRIT14626引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88)中,该菌株为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.细菌菌株的生长和诱导-clyta-E7-His的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培养基中培养用质粒pRIT14626转化的AR58细胞。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白clyta-E7-his的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。4.融合clyta-E7-his的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中,在弗氏压碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎细胞(通过3次)。提取物于4℃以16.000g离心30分钟。将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。
考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的约35kDa的一条主带,并在蛋白质印迹中,用兔多克隆抗clyta抗体和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。表达水平代表约5%的总蛋白。实施例XII:表达融合clyta-E6E7-his(HPV16)的大肠杆菌菌株的构建1.表达质粒的构建1.a原材料
a)-质粒pRIT14512(=TCA311),编码融合ProtD1/3-E6E7-His/HPV16
b)-质粒pRIT14661(=DVA2),一种中间载体,含肺炎链球菌LytA的117个C末端密码子的编码序列。1.b表达融合clyta-E6E7-His/HPV16的质粒pRIT14629(=TCA331)的构建
a)第一步为从质粒pRIT14512中纯化大的NcoI-AflII限制性片段和从pRIT14661中纯化小的AflII-AflIII限制性片段。
b)第二步为将clyta序列连接至E7-His序列(NcoI和AflIII为匹配的限制性位点),产生质粒pRIT 14629(=TCA331),它编码在pL启动子控制下的融合蛋白clyta-E6E7-His。(参见图13)
融合蛋白clyta-E6E7-His的编码序列描述于图14。2.AR58菌株的转化
将质粒pRIT14629引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88)中,该菌株为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.细菌菌株的生长和诱导-clyta-E6E7-His的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培养基中培养用质粒pRIT14629转化的AR58细胞。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白clyta-E6E7-his的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。4.融合clyta-E6E7-his的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中,在弗氏压碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎细胞(通过3次)。
将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。
考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的约48kDa的一条主带,并在蛋白质印迹中,用兔多克隆抗clyta抗体和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。表达水平代表约1%的总蛋白。实施例XIII:Prot D1/3 E7 his(HPV 18)(大肠杆菌B1011)、与反式硫氧还蛋白一起表达的蛋白D1/3 E7 his HPV(大肠杆菌B1012)1)-表达质粒的构建
1).a.表达融合蛋白-D1/3-E7-His/HPV18的质粒TCA316(=pRIT 14532)的构建
原材料
a)质粒pMG MCS_prot D1/3(=pRIT14589)为pMG81(描述于以WO97/01640公开的英国专利申请n°951 3261.9)的衍生物,其中流感的NS1编码区的密码子4-81被对应于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等,1991,Infection and Immunity,Jan.第119-125页)残基Ser 20→Thr127的密码子取代。Prot-D1/3的序列后接一个多克隆位点(11个残基)和一个C末端组氨酸尾(6His)的编码区(参见图15)。该质粒用来表达融合蛋白D1/3-E7-His。
b)原型HPV 18的HPV基因组E6和E7序列(Cole等,J.Mol.Biol.(1987)193,599-608)从在pBR322中克隆的HPV 16全长基因组(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ),Refernzzentrum fr人病原体乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)进行扩增,并将其亚克隆入pUC19,得到TCA 302(=pRIT14467)。质粒TCA 316(=pRIT14532)的构建
从pRIT14467扩增对应于E7蛋白的氨基酸1→105的核苷酸序列。在聚合酶链式反应期间,于E7序列的5’端和3’端产生NcoI和SpeI限制性位点,允许插入质粒pMGMCS prot D1/3的相同位点,产生质粒TCA316(=pRIT14532)。对插入片段进行测序,在E7基因中鉴定出一个对E7/HPV18原型序列的修饰(核苷酸128G->A),导致甘氨酸被谷氨酸取代(E7中的aa 43,在融合蛋白中为156位)。融合蛋白-D1/3-E7-His/HPV18的编码序列描述于图16。
1).b.表达硫氧还蛋白的质粒TCA313(=pRIT14523)的构建原材料
a)-质粒pBBR1MCS4(Antoine R.和C.Locht,Mol.Microbiol.1992,6,1785-1799;M.E.Kovach等,Biotechniques 16,(5),800-802),它与含ColE1或P15a复制起点的质粒相匹配。
b)-质粒pMG42(描述于WO93/04175),含λ噬菌体启动子pL的序列。
c)-质粒pTRX(Invitrogen,试剂盒Thiofusion K350-01),带有硫氧还蛋白的编码序列后接AspA转录终止子。质粒TCA 313(=pRIT14523)的构建
纯化得自pMG42的EcoRI-NdeI片段,它带有pL启动子和pTRX的NdeI-HidIII片段、带有硫氧还蛋白的编码序列后接AspA终止子,将其连接到质粒载体pBBR1MCS4的EcoRI和HindIII位点中,产生质粒TCA313(=pRIT14523)(参见图17)。
硫氧还蛋白的序列描述于图18中。2)-AR58菌株的转化
2).a.为获得表达ProtD1/3-E7-His/HPV18的菌株1011
将质粒pRIT14523引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88)中,该菌株为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌,选择抗卡那霉素的转化子。
2).b.构建表达ProtD1/3-E7-His/HPV18和硫氧还蛋白的菌株1012
将质粒pRIT14532和pRIT14523引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88)中,该菌株为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌,经双选择选择抗卡那霉素和氨苄青霉素的转化子。3)-细菌菌株B1011和B1012的生长和诱导-具有或不具有反式硫氧还蛋白的Prot-D1/3-E7-His/HPV18的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素(对于B1011而言)以及补充50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素(对于B1012而言)的100ml LB培养基中,培养用质粒pRIT14523转化的AR58细胞(B1011菌株)和用质粒pRIT14523转化的AR58细胞(菌株B1012)。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白D1/3-E7-his/HPV18和硫氧还蛋白的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。融合蛋白D1/3-E7-His/HPV18的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中,在弗氏压碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎细胞(通过3次)。提取物于4℃以16.000g离心30分钟。考马斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹分析
将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。
在菌株B1011的沉淀部分中考马斯染色凝胶显示融合protD1/3-E7-His(约31kDa),部分位于(30%)菌株B1012的上清液部分,在蛋白质印迹中,用兔多克隆抗蛋白D和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。考马斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶显示,表达水平代表约1-3%的总蛋白。
对于菌株B1012的提取物而言,在上清液中考马斯染色凝胶显示硫氧还蛋白(约12kDa),并用单克隆抗硫氧还蛋白(Invitrogen R920-25)在蛋白质印迹中得到鉴定。Prot D1/3 E7-his/HPV18的纯化
在大肠杆菌(如上所述)AR58菌株中表达重组HPV 18-ProtD 1/3-E7-His。所有步骤均在室温(RT≈22℃)下进行。通过监测OD280nm监测蛋白。在各步骤之间,抗原阳性部分于-20℃保持。
纯化的抗原于-20℃和4℃稳定1周(不降解),但于37℃温育后看来对氧化更为敏感。d)-溶解性
蛋白的溶解性为pH依赖性的(参见下文),pH<7.4时溶解性降低:
PBS pH 7.4 686μg/ml 100%
PBS pH 7.2 560μg/ml 81%
PBS pH 7.0 498μg/ml 72%
PBS pH 6.8 327μg/ml 48%e)-HPV18 Prot D1/3 E7蛋白由227个氨基酸组成。其理论分子量为25.9kDa,理论等电点为5.83。在还原SDS PAGE中它以约31.5kDa迁移。实施例XIV:HPV 18蛋白D1/3 E7的纯化a)-溶解
在使细胞通过Rannie破碎器2次进行细胞裂解之前,将细胞糊状物在2M NaCl,20mM磷酸盐(NaH2PO4/K2HPO4)pH7.6中悬浮至60OD600。将裂解的细胞在JA 10转子中以9,000rpm于4℃沉淀30分钟。为了降低内毒素水平,将含该重组蛋白的细菌细胞沉淀在5mMEDTA,2M NaCl,PBS pH7.4中洗涤1次,在4M尿素,20mM磷酸盐pH7.4中洗涤1次,最后在PBSpH7.4中洗涤1次,以去除痕量的EDTA(每次洗涤均以用于细胞悬浮的2倍体积中进行)。于4℃HPV18-Prot D1/3-E7-His(对于反式硫氧还蛋白为TIT)用6M盐酸胍,50mMPO4 pH7.6溶液中溶解(在用于细胞悬浮的相同体积中)过夜。细胞碎片在JA 10转子中以9,000rpm于4℃沉淀30分钟。给上清液补充0.5%Empigen BB,并于室温温育。b)纯化1).a.固定化金属亲和层析
将125ml样品上样至Zn2+螯合Sepharose FF柱(XK 26/20,Pharmacia;50ml凝胶/125ml溶解),该柱以4ml/min在0.5%EmpigenBB,6M盐酸胍,50mM PO4 pH7.6中预平衡。柱子用盐酸胍6M,PO450mM pH7.6洗涤,直至达到基线,然后用盐酸胍6M,0.5MNaCl,PO450mM pH7.6洗涤。用0.25M咪唑的6M尿素,0.5M NaCl,PO4 50mMpH7.6溶液以2ml/min洗脱抗原(图1B)。将IMAC洗脱的样品于4℃对PBS pH7.4透析。1).b.Affi-PrepPolymixin(Bio-Rad)
为了降低内毒素水平,将28mg(37ml)抗原以分批模式与2mlAffiprep Polymyxin树脂一起温育,该树脂在PBS pH7.4中于室温下预平衡过夜。蛋白得率估计为60%,内毒素含量降低6.5倍。1).c.分析
在还原SDS-PAGE上分析的纯化抗原在考马斯蓝染色和银染后,显示30kDa的一条主带和55kDa的第二条带。在非还原性SDS-PAGE中,HPV-18-ProtD1/3-E7-His主要看来是分子量≥175kDa的成片条带。然而,通过加入5mM β-巯基乙醇可以逆转这种氧化。该带型被抗ProtD或抗His蛋白质印迹分析所证实。c)-稳定性
纯化的抗原于-20℃和4℃下稳定1周(不降解),但于37℃温育后看来对氧化更敏感。d)溶解性
蛋白的溶解性为pH依赖性的(参见下文),pH<7.4时溶解性降低:
PBS pH 7.4 686μg/ml 100%
PBS pH 7.2 560μg/ml 81%
PBS pH 7.0 498μg/ml 72%
PBS pH 6.8 327μg/ml 48%
HPV18-Prot D1/3-E7-His蛋白由227个氨基酸组成。其理论分子量为25.9kDa。在还原SDS PAGE中它以约31.5kDa迁移,理论等电点为5.83。实施例XV:表达融合ProtD1/3-突变E7(cys27->gly,glu29->g/n)HPV18型的大肠杆菌菌株B1098的构建1)-表达质粒的构建
原材料:
a)-质粒pRIT 14532(=TCA 316),编码融合ProtD1/3-E7-His
b)-质粒LITMUS 28(New Enland Biolabs cat n°306-38),pUC衍生的克隆载体
c)-质粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT 14589),pMG81的衍生物(上文描述的),其中流感的NS1编码区的密码子4-81被对应于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等,1991,Infection andImmunity,Jan.第119-125页)残基Ser 20→Thr 127的密码子取代。Prot-D1/3的序列后接一个多克隆位点(11个残基)和一个C末端组氨酸尾(6His)的编码区。表达具有His尾的融合蛋白-D1/3-突变E7(cys27->gly,glu29->gln)的质粒pRIT 14831(=TCA355)的构建
将带有HPV18的E7基因编码序列、用His尾延长的pRIT 14532(=TCA 316)的NcoI-XbaI片段,亚克隆入可用于诱变的中间载体Litmus28中,产生pRIT 14910(=TCA348)。与E7/HPV16诱变相似,选择双突变cys27-->gly和glu29-->gln,以削弱与成视网膜瘤基因(pRB)抗癌基因产物的结合。
用试剂盒“快速改变定点诱变”(Stratagene cat n°200518)实现在E7基因中引入突变。对pRIT14532的测序指出,在E7的43位存在谷氨酸,而非HPV18原型序列中的甘氨酸,实现第二个诱变循环,将甘氨酸引入43位。我们获得了质粒pRIT 14829 (=TCA353)。经测序证实存在突变且完整的E7基因的完整性后,将突变E7基因引入载体pRIT14589(=pMG MCS ProtD1/3)中,产生质粒pRIT 14831(=TCA355)(参见图17)。
图18描述了融合蛋白-D1/3-突变E7(cys27->gly,glu29->gln)-His的序列。2)表达ProtD1/3-突变E7(cys27-->gly,glu29-->gln)-His/HPV18的菌株B1098的构建
将质粒pRIT 14831引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88)中,AR58为含λpL启动子的热敏感性阻抑物的缺陷型λ溶原菌,经选择抗卡那霉素的转化子,得到菌株B1098。3)-细菌菌株B1098的生长和诱导-ProtD1/3-突变E7(cys27-->gly,glu29-->gln)-His/HPV18的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素的100mlLB培养基中,培养用质粒pRIT 14831转化的AR58细胞(B1098菌株)。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动ProtD1/3-突变E7-His/HPV18的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。4)-融合ProtD1/3-突变E7(cys27->gly,glu29->gln)-His HPV16型的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中。在弗氏压碎器SLMAminco中以20000psi破碎细胞(通过3次)。提取物于4℃以16000g离心30分钟。考马斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹法分析
将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的约31kDa的一条主带,并在蛋白质印迹中,用兔多克隆22 J 70抗蛋白D和检测可及的组氨酸尾的单克隆Penta-His(Qiagen cat.n°34660)进行了鉴定。表达水平代表约3-5%的总蛋白。实施例XVI:表达融合蛋白-D1/3-E6-his/HPV 18的大肠杆菌菌株的构建1.表达质粒的构建
a)质粒pMG MCS_prot D1/3(=pRIT14589)为pMG81(描述于以WO97/01640公开的英国专利申请n°951 3261.9)的衍生物,其中流感的NS1编码区的密码子4-81被对应于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等,1991,Infection and Immunity,Jan.第119-125页)残基Ser 20→Thr127的密码子取代。Prot-D1/3的序列后接一个多克隆位点(11个残基)和一个C末端组氨酸尾(6His)的编码区。该质粒用来表达融合蛋白D1/3-E6-His。
HPV 18型的HPV基因组E6和E7序列(Cole等,J.Mol.Biol.1987,193,第599-608页)从在pBR322中克隆的HPV18全长基因组(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ),Refernzzentrum für人病原体乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)进行扩增,并将其亚克隆入pUC19,得到TCA 302(=pRIT14467)。表达融合蛋白-D1/3-E6-His/HPV18的质粒TCA 314(=pRIT14526)的构建
从pRIT14467扩增对应于E6蛋白的氨基酸1→158的核苷酸序列。在聚合酶链式反应期间,于E6序列的5’端和3’端产生NcoI和SpeI限制性位点,以允许插入质粒pMGMCS Prot D1/3的相同位点,产生质粒TCA314(=pRIT14526)(参见图21)。对插入片段进行测序,证实在所述聚合酶链式反应期间没有产生修饰。所述融合蛋白-D1/3-E6-His的编码序列描述于图22。AR58菌株的转化
将质粒pRIT14526引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88)中,该菌株为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E6-His的表达
于30℃在补充50μg/rl卡那霉素的100mlLB培养基中,培养用质粒pRIT14526转化的AR58细胞。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白D1/3-E6-his的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。4.融合蛋白D1/3-E7-his的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中,在弗氏压碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎细胞(通过3次)。将提取物以16.000g于4℃离心30分钟。将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。
考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的一条约32kDa的主带,在蛋白质印迹中,用兔多克隆抗蛋白D和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。表达水平代表约3-5%的总蛋白。实施例XVII:表达融合蛋白-D1/3-E6E7-his/HPV 18的大肠杆菌菌株的构建1.表达质粒的构建
a)质粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)为pMG81(描述于以WO97/01640公开的英国专利申请n°951 3261.9)的衍生物,其中流感的NS1编码区的密码子4-81被对应于流感嗜血菌772株2生物型的成熟蛋白D(H.Janson等,1991,Infection and Immunity,Jan.第119-125页)残基Ser 20→Thr127的密码子取代。Prot-D1/3的序列后接一个多克隆位点(11个残基)和一个C末端组氨酸尾(6His)的编码区。该质粒用来表达融合蛋白D1/3-E6E7-his。
b)HPV 18型的HPV基因组E6和E7序列(Cole等,J.Mol.Biol.1987,193,599-608)从在pBR322中克隆的HPV 18全长基因组(得自Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ),Refernzzentrum für人病原体乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)进行扩增,并将其亚克隆入pUC19,得到TCA 302(=pRIT1 4467)。
c)TCA302(=pRIT 14467)中的E6和E7的编码序列用合成寡核苷酸连接物(插入Hga I和NsiI位点之间)修饰,引入E6和E7基因之间的11个核苷酸缺失,去除了E6的终止密码子,并在质粒TCA320(=pRIT 14628)中产生融合的E6和E7编码序列,参见图23。表达融合蛋白-D1/3-E6E7-His/HPV18的质粒TCA 328(=pRIT14567)的构建
从pRIT14618扩增对应于融合的E6E7蛋白的氨基酸1→263的核苷酸序列。在聚合酶链式反应期间,于E6E7融合序列的5’端和3’端产生NcoI和SpeI限制性位点,以允许插入质粒pMGMCS Prot D1/3的相同位点,产生质粒TCA328(=pRIT14567)(参见图24)。对插入片段进行测序,证实在所述聚合酶链式反应期间没有产生修饰。所述融合蛋白-D1/3-E6E7-His的编码序列描述于图25。2.AR58菌株的转化
将质粒pRIT14567引入大肠杆菌AR58(Mott等,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:88)中,该菌株为含λpL启动子的热敏感阻抑物的缺陷型λ溶原菌。3.细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E6E7-His的表达
于30℃在补充50μg/ml卡那霉素的100ml LB培养基中,培养用质粒pRIT14512转化的AR58细胞。在对数生长期中,将细菌转移至39℃,以失活λ阻抑物,并启动蛋白D1/3-E6E7-his的合成。于39℃的温育持续4小时。沉淀细菌并贮存于-20℃。4.融合蛋白D1/3-E6E7-his的特征鉴定
将冷冻细胞复苏,再悬浮于10ml PBS缓冲液中,在弗氏压碎器SLM Aminco中以20.000psi破碎细胞(通过3次)。将提取物以16.000g于4℃离心30分钟。
将上述提取物离心后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析等份的上清液和沉淀。
考马斯染色凝胶显示位于沉淀部分的一条约48kDa的主带,在蛋白质印迹中,用兔多克隆抗蛋白D和偶联至牛小肠碱性磷酸酶的Ni-NTA缀合物(Qiagen cat.n°34510)进行了鉴定,所述缀合物检测可及的组氨酸尾。表达水平代表约1%的总蛋白。实施例XVIII:疫苗制剂
用得自以上实施例、在大肠杆菌菌株AR58中表达的蛋白和作为佐剂的制剂配制疫苗,所述作为佐剂的制剂包含油/水乳液中的3脱-O-酰化单磷脂酰脂质A(3D-MPL)和氢氧化铝或3D-MPL和/或可任选的QS21的组合物,所述疫苗可任选地用胆固醇配制。
3D-MPL:为革兰氏阴性菌明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota)的化学解毒形式的脂多糖(LPS)。在Smith Kline BeechamBiologicals进行试验已经表明,与各种载体结合的3D-MPL强烈增强体液免疫,也强烈增强TH1型细胞免疫。
QS21:为从皂树Saponaria Molina树皮粗提取物中纯化的一种皂苷,它具有强佐剂活性:它不仅激活抗原特异性淋巴组织增生,而且激活对几种抗原的CTL。
含本发明抗原、含3D-MPL和明矾的疫苗,按WO93/19780或92/16231中描述的类似方式进行制备。
在Smith Kline Beecham Biologicals进行试验已经证明了3D-MPL和QS21的组合物在诱导体液免疫应答和TH1型细胞免疫应答中均有明显的协同效应。在US 5750110中描述了含这种抗原的疫苗。
油/水乳液由2种油(生育酚和角鲨烯)和含作为乳化剂的Tween 80的PBS组成。该乳液包含5%角鲨烯、5%生育酚、0.4%Tween 80,其平均粒度为180nm,被称为SB62(参见WO 95/17210)。
在Smith Kline Beecham Biologicals进行试验已经证明,将这种O/W乳液附加至MPL/QS21进一步增强其免疫刺激剂的性质。乳液SB62(2倍浓缩物)的制备
将Tween80溶于磷酸缓冲盐水(PBS)中,得到2%的PBS溶液。为了提供100ml 2倍浓缩乳液,将5g DL α生育酚和5ml角鲨烯充分涡旋混合。加入90ml PBS/Tween溶液,并充分混合。然后使所得的乳液通过注射器,最后用M110S微流化仪微流化。所得油滴的大小约为180nm。Prot.D1/3 E7 QS21/3D MPL水包油制剂的制备
将ProtD1/3-E7(5μg)在10倍浓缩的PBS pH 6.8和水中稀释,然后以5分钟的间隔连续加入SB62、3 D MPL(5μg)、QS21(5μg)和50μg/ml作为防腐剂的破柳汞。乳液体积等于总体积的50%(对于100μl的剂量为50μl)。所有温育均于室温、搅拌下进行。用PBS取代所述蛋白,制备无抗原的佐剂对照。用Prot D E7进行的肿瘤退化试验(HPV16)疫苗抗原:融合蛋白ProtD E7
蛋白D是一种暴露于革兰氏阴性菌流感嗜血菌表面的脂蛋白。掺入包括蛋白D前109个残基作为融合伴侣,为疫苗抗原提供旁观者辅助特性(bystander help properties)。如上所述,用QS21 3D-MPL和SB62配制抗原。实施例XIX:体内肿瘤退化试验肿瘤细胞系TC1:
用HPV 16 E6和E7将得自C57BL.6小鼠的原代肺上皮细胞无限增殖化,然后用活化的ras癌基因转化,产生表达E6和E7的致癌细胞系(Lin KY等,1996)。通过用小鼠抗HPV 16 E7 Mab(Triton Corp.Alameda,CA)对固定的透化TC1细胞进行FACS分析已经证实了E7的表达。肿瘤生长:
用胰蛋白酶消化体外培养生长的TC1细胞,在无血清培养基中洗涤2次,皮下注射到小鼠的右胁腹。为了评价所建立肿瘤的治疗,注射3×10e4细胞/小鼠剂量的TC1细胞。注射肿瘤细胞后1周和2周,用5μg 100μl protD 1/3 E7 His爪垫内(50μl爪垫)的PBS溶液或3D-MPL、QS21和SB62溶液,或用PBS或单独的佐剂,对小鼠进行疫苗接种。每组使用5只C57BL/6小鼠(Iffa Credo)。1周2次监测小鼠肿瘤的生长。平均肿瘤质量/组示于图26,用proD 1/3 E7 His的PBS溶液或用PBS或用单独的佐剂疫苗接种的小鼠进行性发展生长的肿瘤(0-1只无肿瘤小鼠/组)。相反,用佐剂中的proD1/3 E7 His疫苗接种的5只小鼠中的4只没有发生肿瘤,1只动物在第40天时出现非常小的稳定的肿瘤。该结果表明,得自HPV16、在佐剂中配制的蛋白protD1/3 E7His能够诱导表达该抗原的小的建立肿瘤的退化。免疫学读出(read out)增殖测定:
对于体外测定,通过于第69天将接种疫苗的小鼠的脾或腘淋巴结压碎,制备淋巴细胞。将1等份2×10e5细胞以一式三份接种到包被有浓度降低的(10、1、0.1μg/ml)protD 1/3 E7His的96孔板中,或接种到胶乳微珠(Sigma),以在体外再刺激所述细胞(72小时)。通过3H胸苷掺入测定T细胞的增殖。
图27和28比较了protD E7刺激脾细胞和淋巴结细胞增殖的能力,所述脾细胞和淋巴结细胞在体内用PBS、3D-MPL、QS21 SB62、ProtD1/3 E7 His和ProtD1/3 E7 His+3D-MPL、QS21、SB62佐剂之一引发,表明:与其它组相比,仅在用佐剂中的protD1/3 E7 His免疫的小鼠中检测到在脾脏中的高增殖应答。抗体应答
在取器官的同时取个体的血清,进行间接ELISA。
将5μg/ml纯化E7蛋白用作包被抗原。在PBS+1%新生小牛血清中于37℃饱和1小时后,在所述饱和缓冲液中连续稀释血清(以1/100开始),并于4℃温育过夜(O/N)或于37℃温育90分钟。在0.1%PBSTween 20中洗涤后,将生物素化山羊抗小鼠Ig(1/1000)或山羊抗小鼠Ig亚类(总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b)抗血清(1/5000)用作第二抗体,在于37℃温育90分钟后,加入偶联至过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白,用TMB(四甲基-联苯胺/过氧化物)用作底物,10分钟后,用0.5M硫酸终止反应,测定O.D.450。
与血清的相对平均中点稀释度相比,通过在不同组小鼠中接种疫苗引发的亚类特异性抗E7的效价示于图29。
这些结果表明,以2次注射单独ProtD 1/3 E7 HOV 16触发弱抗体应答。
当在存在佐剂SB62、QS21+3D-MPL的情况下注射ProtD1/3 E7时,产生的抗E7抗体多得到。
在任何血清样品中,甚至在接受佐剂SB62、QS2 1+3D-MPL中的ProtD 1/3 E7的小鼠血清中(数据未显示),既没有检测到IgA,也没有检测到IgM。相反,通过用单独的ProtD 1/3 E7疫苗接种,略微增强了总的IgG水平,通过将佐剂SB62、QS21+3D-MPL加至该蛋白,大大增加了总IgG水平。对不同IgG亚类浓度的分析表明,与接受单独的该抗原或单独的佐剂的小鼠血清中观察到的浓度相比,当在接受含佐剂抗原的小鼠的血清中分析的所有类型IgG亚类(IgG1、IgG2a和IgG2b)的浓度提高时,已经诱导出混合抗体应答。所发现的主要同种型为IgG2b,它占总IgG的80%以上),该同种型一般认为与TH1型免疫应答的诱导有关。实施例XX:体内肿瘤保护试验
以14天的间隔,用或者PBS、实施例1的佐剂、5μg protD1/3 E7His或者实施例1佐剂中的5μg protD1/3 E7 His,以100μl的体积(50μl/爪垫)爪垫内免疫小鼠2次。肿瘤的生长:
最后一次疫苗接种后4周,用2X10e5 TC1细胞/小鼠在胁腹中皮下攻击小鼠。用胰蛋白酶消化体外培养生长的TC1细胞,在无血清培养基中洗涤2次,并注射。1周2次监测每组中所用的5只小鼠的肿瘤生长。
图30表明,用SB62 QS21,3D-MPL佐剂中的E7蛋白接种,保护所有其它组小鼠抵抗肿瘤的发生(每5只动物中仅1只具有非常小而稳定的肿瘤),在接受无佐剂的E7蛋白或单独的佐剂的组中,发生生长的肿瘤。免疫学读出
最后一次疫苗接种后3周,在肿瘤攻击之前,处死每组的5只小鼠用于免疫学读出。增殖测定
对于体外测定,如上所述,由脾或腘淋巴结制备淋巴细胞。将1等份2×10e5细胞一式三份接种到包被有浓度降低的(10、1、0.1μg/ml)protD 1/3 E7 His的96孔板中,或接种到胶乳微珠(Sigma),以在体外再刺激所述细胞(72小时)。通过3H胸苷掺入测定T细胞的增殖。
图31和32分别表明,用脾细胞和腘淋巴结细胞,如在治疗环境中观察到的,接受SB62 QS21,3D-MPL佐剂中的E7蛋白的小鼠获得的较好的淋巴组织增殖活性,抗体应答。
图33表明,如在治疗环境中一样,在用于3D-MPL、QS21 O/W佐剂中配制的ProtD1/3 E7蛋白疫苗接种的小鼠的血清中,观察到较好的抗体应答。触发了混合抗体应答,在这种情况下,作为所有测试的IgG亚类(IgG 2a、IgG2b、IgG1),IgG2b是发现的主要同种型,占总IgG的75%。实施例XXI:用Prot D1/3 E7(HPV 18)进行疫苗接种试验
以2周间隔,用100μl 5μg protD 1/3 18 E7 His爪垫内(50μl/爪垫)的PBS溶液或QS21、3D-MPL和WO96/33739中所述的SB62,DQ MPL溶液或WO98/15827中所述的DQ明矾MPL溶液,对小鼠进行2次疫苗接种。每组使用8只6-8周龄的Balb/c小鼠(Iffa Credo)。第II次后14天,取脾脏和淋巴结用于免疫学读出,取血液样品作血清学分析。●免疫学读出:增殖测定:
对于体外测定,通过于第28天将接种疫苗的小鼠的脾或腘淋巴结压碎,制备淋巴细胞。
将1等份2×10e5细胞一式三份接种到包被有浓度降低的(10、1、0.1、0.01μg/ml)protD 1/3 18 E7 His的96孔板中,以在体外再刺激所述细胞(72小时)。通过3H胸苷掺入测定T细胞的增殖。结果以刺激指数(cpm样品/cpm基线)表示。
图34和35比较了protD 1/3 18 E7刺激脾细胞和淋巴结细胞增殖的能力,所述脾细胞和淋巴结细胞在体内或者用ProtD1/3 18 E7 His或者用ProtD1/3 18 E7 His+佐剂引发,表明在接受单独的蛋白的小鼠中仅观察到基本的淋巴组织增殖,而在用佐剂中的protD1/3 18 E7 His免疫的小鼠中检测到脾脏中高的增殖应答和淋巴结中非常高的应答。细胞因子的产生● 用培养基或ProtD1/3 18E7(1或3μg/ml)体外再刺激脾细胞或淋巴
结细胞96小时后,如所述通过ELISA测定培养上清液中产生的
细胞因子(IL-5和IFNg):● IFNg(Genzyme)用Genzyme的试剂,通过Elisa进行IFNγ的定量。每孔用50μl样品和抗体溶液溶液。96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate,Nunc,丹麦)于4℃用50μl仓鼠抗小鼠IFNg包被过夜,其中仓鼠抗小鼠IFNg以1.5μg/ml在碳酸盐缓冲液pH9.5中稀释。然后将板于37℃与100μl含1%牛血清白蛋白和0.1%Tween 20的PBS(饱和缓冲液)温育1小时。将得自体外刺激(于1/2开始)在饱和缓冲液中2倍稀释的上清液,加至抗IFNg包被板中,于37℃温育1小时30分钟(1 hr 30)。板用PBSTween 0.1%(洗涤缓冲液)洗涤4次,将在饱和缓冲液中稀释的终浓度为0.5μg/ml的生物素缀合的山羊抗小鼠IFNg加入每孔,于37℃温育1小时。洗涤步骤后,于37℃加入于饱和缓冲液中稀释1/10000的AMDEX缀合物(Amersham)30分钟。将板如上所述洗涤,并与50μlTMB(Biorad)一起温育15分钟。用0.4N硫酸终止反应,于450nm读数。用标准曲线(小鼠IFNγ标准品),通过SofrmaxPro(四参数公式)计算浓度,并以pg/ml表示。●IL-5(Pharmingen)
用Pharmingen的试剂,通过Elisa进行IL5的定量。每孔用50μl样品和抗体溶液溶液。96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate,Nunc,丹麦)于4℃用50μl大鼠抗小鼠IL5包被过夜,其中大鼠抗小鼠IL5以1μg/ml在碳酸盐缓冲液pH9.5中稀释。然后将板于37℃与100μl含1%牛血清白蛋白和0.1%Tween 20的PBS(饱和缓冲液)温育1小时。将得自体外刺激(于1/2开始)在饱和缓冲液中2倍稀释的上清液,加至抗IFNg包被板中,于37℃温育1小时30分钟(1 hr 30)。板用PBS Tween0.1%(洗涤缓冲液)洗涤4次,将在饱和缓冲液中稀释的终浓度为1μg/ml的生物素缀合的大鼠抗小鼠IL5加入每孔,于37℃温育1小时。洗涤步骤后,于37℃加入于饱和缓冲液中稀释1/10000的AMDEX缀合物(Amersham)30分钟。将板如上所述洗涤,并与50μl TMB(Biorad)一起温育15分钟。用0.4N硫酸终止反应,于450nm读数。用标准曲线(重组小鼠IL5),通过SofrmaxPro(四参数公式)计算浓度,并以pg/ml表示。
用脾细胞开始,无论测试哪个组,均不能检测到IL-5,相反,在所有组中均观察到非常高的IFNg产生,而与其它组相比,在接受以SBASlc作为佐剂的蛋白的小鼠组中仅观察到略微增强。这提示TH1型免疫应答的诱导。
关于淋巴结细胞,在仅接受该蛋白的小鼠组中获得非常弱的IFNg产生,而在接受含佐剂的蛋白的小鼠组中观察到5-10倍的增强。只能在接受SBAS2佐剂化蛋白的小鼠组中检测到IL5。
图36和37比较了在体外分别再刺激脾细胞和淋巴结细胞后,ProtD1/3 18 E7 His刺激细胞因子IFNg和IL5产生的能力。抗体应答
在取器官的同时取个体的血清,进行间接ELISA。
将2.5μg/ml纯化protD1/3 18E7蛋白HPV18用作包被抗原。在PBS+1%新生小牛血清中于37℃饱和1小时后,在所述饱和缓冲液中连续稀释血清(以1/100开始),并于4℃温育过夜(O/N)或于37℃温育90分钟。在0.1%PBS Tween 20中洗涤后,将生物素化山羊抗小鼠Ig(1/1000)或山羊抗小鼠Ig亚类(总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b)抗血清(1/5000)用作第二抗体,在于37℃温育90分钟后,加入偶联至过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白,用TMB(四甲基-联苯胺/过氧化物)用作底物,10分钟后,用0.5M硫酸终止反应,测定O.D.450。
注射2次单独的ProtD 1/3 18 E7,触发非常弱的抗体应答。通过将佐剂加入该蛋白疫苗,大大提高了总IgG水平。
对不同IgG亚类浓度的分析表明,当在存在佐剂DQS21 3D-MPL或SB62,QS21/3D-MPL的情况下注射该蛋白,获得略微增加的IgG2a亚型百分比:分别为28%IgG1、48%IgG2a和43%IgG1、44%IgG2a,相比之下,无佐剂蛋白为46%IgG1、32%IgG2a。用在DQ明矾配制的该蛋白获得最强的抗体应答,所述同种型浓度有明显变化(80%IgG1、8%IgG2a)。由于Balb/c小鼠中的IgG2a同种型一般被认为与TH1型免疫应答的诱导有关,因此这些结果提示DQS21,3D-MPL和SB62 QS21/3D-MPL佐剂倾向于增加体液应答的TH1型分布型,而SBAS5诱导明显的TH2型应答。
图38.显示了血清中点稀释度和通过在不同小鼠组中接种疫苗引发的不同同种型的相对百分比的比较。结论:
我们已经证明,1/3 Prot D和HPV 16早期蛋白E7融合蛋白诱导有效的系统抗肿瘤免疫,ProtD1/3和HPV18的E7融合蛋白也已经证明在用prot D1/3 E7 HPV16融合蛋白疫苗接种的小鼠中具免疫原性,保护小鼠抵抗表达E7的肿瘤细胞的肿瘤攻击,并消除距疫苗接种位点远位点注射而预建立的表达HPV16 E7的小肿瘤。
我们已经证明,佐剂中的ProtD1/3 E7 HPV16蛋白能够增强辅助T细胞增殖,提示用该疫苗诱导的抗肿瘤免疫应答至少部分与CD4+T细胞应答有关。
我们也已经证明,通过在含3D-MPL佐剂存在下用Prot D1/3 E7疫苗接种,触发了较好的抗体应答。在C57BL/6小鼠血清中发现的主要同种型为IgG2b,提示产生了TH1型免疫应答。
Claims (23)
1.得自HPV、连接至免疫融合伴侣的E6或E7或E6/E7融合蛋白。
2.权利要求1要求保护的蛋白,其中所述融合伴侣选自:流感嗜血菌B的蛋白D或其片段、流感嗜血菌B的脂蛋白D或其片段、流感病毒的NS1或其片段和肺炎链球菌的LYTA或其片段。
3.权利要求1或2要求保护的蛋白,其中所述E6或E7蛋白得自HPV16或HPV18。
4.权利要求1、2或3要求保护的蛋白,其中使所述E7蛋白突变。
5.权利要求1、2或3要求保护的蛋白,其中使所述E6蛋白突变。
6.权利要求1-5中任一项要求保护的蛋白,还包含至少4个组氨酸残基的组氨酸标记。
7.包含异源蛋白、组氨酸标记和C-LYTA标记的融合蛋白。
8.编码本文要求保护的蛋白的DNA序列。
9.疫苗,含权利要求1-7中任一项中要求保护的蛋白和药学上可接受的稀释剂或赋形剂。
10.权利要求9要求保护的疫苗,还包含佐剂。
11.权利要求9或10要求保护的疫苗,其中所述蛋白存在于水包油乳液载体中。
12.权利要求10或11要求保护的疫苗,其中所述佐剂包括3D-MPL或QS21或这两者。
13.本文要求保护的疫苗,包含另一种HPV抗原。
14.本文要求保护的用于药物的疫苗。
15.本文要求保护的蛋白的用途,用于生产免疫治疗性治疗患有HPV诱导的肿瘤损害(良性或恶性)的患者的疫苗。
16.本文要求保护的蛋白的用途,用于生产预防HPV病毒感染的疫苗。
17.含权利要求8的DNA序列的载体。
18.含权利要求8要求保护的DNA序列和编码硫氧还蛋白的DNA序列的载体。
19.用权利要求8的DNA序列转化的宿主。
20.用权利要求17或18的载体转化的宿主。
21.权利要求19要求保护的宿主,还用编码硫氧还蛋白的DNA序列转化。
22.本文要求保护的蛋白的生产方法,包括用权利要求6的DNA序列转化宿主细胞,表达所述序列并分离所需产物。
23.本文要求保护的疫苗的生产方法,包括将本文要求保护的蛋白与合适的佐剂、稀释剂或其它药学上可接受的赋形剂混合。
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