CN1222618C - 卡他摩拉克菌外膜蛋白－106多肽及其基因序列和用途 - Google Patents

卡他摩拉克菌外膜蛋白－106多肽及其基因序列和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开卡他摩拉克菌外膜蛋白-106(OMP106)多肽及其衍生多肽(OMP106衍生多肽)、编码所述多肽的核苷酸序列和特异性结合所述OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的抗体。也公开包含OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的免疫原性、预防性或治疗性组合物，包括疫苗。本发明还公开在动物中诱导对卡他摩拉克菌和卡他摩拉克菌OMP106多肽及OMP106衍生多肽免疫应答的方法。

Description

卡他摩拉克菌外膜蛋白-106多肽 及其基因序列和用途
1. 介绍
本发明一般涉及卡他摩拉克菌的外膜蛋白-106(OMP106)多肽。本发明包括纯化的OMP106多肽和其衍生多肽(OMP106衍生多肽)。本发明也包括特异性结合所述OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的抗体，包括胞毒抗体。本发明还包括包含OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的预防或治疗组合物，包括疫苗。本发明另外还提供在哺乳动物中诱导对卡他摩拉克菌的免疫应答的方法。本发明还提供编码所述OMP106多肽和OMP106衍生多肽的分离的核苷酸序列、具有所述序列的载体和含有所述载体的宿主细胞。
2. 发明背景
卡他摩拉克菌也称作卡他摩拉克菌(布兰汉氏球菌)或卡他布兰汉氏球菌，而以前也被称作卡他奈瑟菌或卡他微球菌，该菌是常常发现于人类呼吸道的革兰氏阴性细菌。最初认为卡他摩拉克菌是无害的共生生物，现在认为该菌是动物上下呼吸道感染的重要病原体。在人类，卡他摩拉克菌在患有慢性肺病的成人中引起严重的下呼吸道感染、在无免疫应答的病人引起全身性感染以及在婴幼儿和儿童引起中耳炎和窦炎。参见Helminen等，1993，Infect.Immun.61：2003-2010；Catlin，B.W.，1990，Clin.Microbiol.Rev.3：293-320；和其中引用的文献。
2.1. 外膜蛋白和保护性抗体
已经研究了卡他摩拉克菌的外表面成分，以试图了解卡他摩拉克菌感染的致病过程和开发针对这类感染的有用的治疗方法和预防措施。所述外膜蛋白(OMP)作为可能的毒性因子和有潜力的疫苗抗原已特别受到极大的关注。卡他摩拉克菌有大约10-20种不同的OMP，其中的6-8种(OMP A-H)为主要种类(Murphy和Loeb，1989，MicrobialPathogen.6：159-174)。OMP A-H的分子量范围分别为97-20kD。参Bartos Murphy，1988，J.Infect.Dis.158：761-765；Helminen等，1993，Infect.Immun.61：2003-2010；Murphy等，1993，Molecul.Microbiol.10：87-97；和Sarwar等，1992，Infect.Immun.60：804-809。通过自50种卡他摩拉克菌株的外膜制品的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，进行蛋白型的比较表明，OMP A-H的带型几乎同型(Bartos和Murphy，1988，J.Infect.Dis.158：761-765)。
除了OMP A-H外，一个命名为HMV-OMP、SDS-PAGE显示表观质量为350-720kD的高分子量OMP，也已被鉴定为存在于许多卡他摩拉克菌菌株的另一主要表面成分。用甲酸变性时，HWM-OMP产生120-140kD的单链，因此，它似乎是一种寡聚蛋白质(Klingman和Murphy，1994，Infect.Immun.62：1150-1155)。HMW-OMP似乎是与Helminen等(1994，J.Infect.Dis 170：867-872)命名为UspA的蛋白相同的蛋白，且表明存在于许多卡他摩拉克菌菌株中。
在完整的细菌或细菌衍生的外膜泡囊中，几种以上鉴定的OMP存在引发结合所述OMP的抗体产生的表面暴露的表位。这些抗原性OMP包括OMP E和OMP G(Murphy和Bartos，1989，Infect.Immun.57：2938-2941)；OMP C/D(Sarwar等，1992，Infect.Immun.60：804-809)；Cop B，为-80kD的OMP(Helminen等，1993，Infect.Immun.61：2003-2010)；和UspA(Helminen等，1994，J.Infect.Dis.170：867-872)。
已经在一种动物模型中评价了Cop B和UspA表面暴露表位的抗体的治疗潜力。所述模型涉及用受控数目的卡他摩拉克菌细胞直接团块接种在BALB/C VAF/Plus小鼠的肺部，然后检查肺部的该细菌清除率(Unhanand等，1992，J.Infect.Dis.165：644-650)。卡他摩拉克菌的不同临床分离菌显示不同的清除率，该清除率与粒细胞募集到该感染部位的水平有关。用导向或者Cop B或者UspA的表面暴露表位的单克隆抗体进行被动免疫，提高卡他摩拉克菌的肺清除率(Helminen等，1993，Infect.Immun.61：2003-2010；Helminen等，1994，J.Infect.Dis.170：867-872)。
2.2.细菌/宿主细胞粘着和血凝集
细菌性病原体粘着到宿主细胞表面，促进定居和引发病理过程。参见E.H.Beachey，1981，J.Infect.Dis.143：325-345。革兰氏阴性细菌通常表达结合到宿主细胞表面的糖蛋白和/或糖脂的特异性寡糖的表面凝集素。这类凝集常常与菌毛(pili)或菌毛(fimbriae)相关。与宿主细胞表面发生疏水和/或电荷相互作用引起的非特异结合也可以使细菌发生粘着。
卡他摩拉克菌粘着到呼吸道细胞的机理仍然了解甚少。所述生物粘着到培养的人口咽上皮细胞(Mbaki等，1987，Tohuku J.Exp.Med.153：111-121)。Rikitomi等的研究提示，菌毛在粘着到这类细胞方面可能有作用，因为菌毛变性或用抗菌毛抗体处理降低有菌毛菌株的粘着(Rikitomi等，1991，Scand.J.Infect.Dis.23：559-567)。然而，介导结合的菌毛不可能是这种粘着的唯一基础，因为在检查的几种菌株中最高粘着力菌株为无菌毛菌株。
在分类细菌粘附素时血凝集常常取代更为复杂的粘着检测法。然而，Rikitomi等发现人口咽上皮细胞粘着与卡他摩拉克菌菌株的血凝集无关(文献同前)。即3种高粘着菌株不凝集人红细胞。因此，在人口咽上皮细胞粘着和血凝集反应中涉及不同结合机制。
相反，Kellens等的最近一项研究提示由卡他摩拉克菌引起的血凝集与宿主细胞粘着有关(Kellens等，1995，Infection 23：37-41)。然而，该研究采用基于细菌结合到猪气管切片的粘着检测法。就卡他摩拉克菌致病菌株的粘着而言，不知道是否可以认为猪气管组织与人呼吸管组织是同源的。
尽管所述粘着检测法有问题，Kellens等还是检查了卡他摩拉克菌的80个临床分离菌的血凝集活性(Kellens等，1995，Infection 23：37-41)。差不多四分之三的所检查菌株凝集人、兔、豚鼠、狗或大鼠红细胞，而其它菌株不发生凝集。某些血凝集性菌株的血凝集活性进一步特征鉴定并表明是钙离子依赖性的，而且受胰蛋白酶消化或高温处理或加入D-葡萄糖胺或D-半乳糖胺的抑制。
由Tucker等对血凝集性和非血凝集性卡他摩拉克菌株的调查已表明，所有菌株结合糖脂神经节四糖神经酰胺，但是只有血凝集性菌株结合糖脂红细胞四糖神经酰胺(Tucker等，1994，Annual Meeting ofAmer.Soc.Microbiol.，文摘号D124)。而且表明，卡他摩拉克菌的血凝集活性受构成红细胞四糖神经酰胺的碳水化合物部分的各种单糖的抑制。这些观测结果引导Tucker等提出卡他摩拉克菌通过结合到易感红细胞细胞膜(包括人红细胞细胞膜)上的红细胞四糖神经酰胺引起血凝集。到目前为止，现有技术未鉴定出负责或者宿主细胞粘着或者血凝集的卡他摩拉克菌的外表面分子。
不能把本申请在这一小节或任何其它小节中任一文献的引用或标引认为是表示本发明可以采用作为先有技术的这类文献。
3. 发明概述
本发明包括卡他摩位克菌的OMP106多肽和OMP106衍生多肽以及制备所述多肽的方法。本发明也包括所述OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的特异抗血清和特异抗体，包括胞毒抗体。本发明还包括含一种或多种所述多肽的免疫原组合物、预防组合物或治疗组合物，包括疫苗。本发明又包括编码所述多肽的核苷酸序列。本发明还包括含减毒或灭活非血凝集性卡他摩位克菌品种的免疫原组合物、预防组合物或治疗组合物，包括疫苗。
本发明具有多种用途。例如，所述OMP106多肽和OMP106衍生多肽可以用作检测应答卡他摩拉克菌感染所产生的抗体的配基(例如，在诊断卡他摩拉克菌感染方面)。所述OMP106多肽和OMP106衍生多肽也可以用作诱导卡他摩拉克菌特异性抗体的免疫原。这类抗体用于免疫检测中以检测生物样品中的卡他摩拉克菌。本发明的胞毒抗体在抗卡他摩拉克菌感染的被动免疫中是有用的。所述OMP106多肽和OMP106衍生多肽还可以用作抗卡他摩拉克菌感染的疫苗的活性成分。
本发明基于下述惊人的发现，即血凝集性卡他摩拉克菌菌株和其品种具有分子量大约180kD至大约230kD的外膜蛋白OMP106多肽，而非血凝集性卡他摩拉克菌菌株和其培养物或者不具有OMP106多肽或者具有不引起血凝集和不可银染色的不当修饰的OMP106多肽。本发明还基于发现，自血凝集性卡他摩拉克菌菌株分离的OMP106多肽诱导的多克隆抗血清对不同的血凝集性卡他摩拉克菌菌株具有胞毒活性，但是对非血凝集性卡他摩拉克菌菌株无胞毒活性。
3.1. 定义和缩写
抗-OMP106        ＝抗-OMP106多肽抗体或抗血清
ATCC             ＝美国典型培养物保藏中心
大囊泡(blebs)    ＝天然产生的卡他摩拉菌外膜囊泡
Gb4             ＝GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc1-1神经酰胺
HA               ＝血凝集
免疫应答性的     ＝能激发细胞免疫应答或体液免疫应答
kD               ＝千道尔顿
卡他摩拉克菌     ＝Mc；
                   卡他摩拉克菌
                   卡他摩拉克菌(布兰汉氏球菌)
                   卡他布兰汉氏球菌
                   卡他奈瑟菌；或
                    卡他微球菌
NHA               ＝非血凝集性
OG                ＝正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(n-octyl β-D-
                    glucopyranoside)或辛基葡糖苷
OMP106            ＝卡他摩拉克菌的外膜蛋白-106多肽，SDS-
                    PAGE显示其分子量为180kD-230kD；用
                    OG或Sarkosyl去污剂可从卡他摩拉克菌的
                    大囊泡或完整细胞提取
OMP106衍生多肽    ＝所述OMP106多肽的片段；变异体，含一个
                    或多个氨基酸缺失、插入或置换的野生型
                    OMP106多肽或其片段；或者嵌合蛋白，含
                    有融合到整个或部分OMP106多肽的C-末
                    端或N-末端或内部区段的异源多肽
OMP               ＝外膜蛋白
OMPs              ＝多种外膜蛋白
PBS               ＝磷酸缓冲盐溶液
PAG               ＝聚丙烯酰胺凝胶
多肽              ＝任何长度的多肽，最好为含十个或更多氨基
                    酸残基的多肽
SDS               ＝十二烷基硫酸钠
SDS-PAGE          ＝十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
本文定义的核苷酸或核酸序列如下用一个字母符号表示碱基：
A(腺嘌呤)
C(胞嘧啶)
G(鸟嘌呤)
T(胸腺嘧淀)
U(尿嘧啶)
M(A或C)
R(A或G)
W(A或T/U)
S(C或G)
Y(C或T/U)
K(G或T/U)
V(A或C或G；非T/U)
H(A或C或T/U；非G)
D(A或G或T/U；非C)
B(C或G或T/U；非A)
N(A或C或G或T/U)或(未知碱基)
本文所定义的肽和多肽序列用一个字母符号如下表示氨基酸残基：
A(丙氨酸)
R(精氨酸)
N(天冬酰胺)
D(天冬氨酸)
C(半胱氨酸)
Q(谷氨酰胺)
E(谷氨酸)
G(甘氨酸)
H(组氨酸)
I(异亮氨酸)
L(亮氨酸)
K(赖氨酸)
M(蛋氨酸)
F(苯丙氨酸)
P(脯氨酸)
S(丝氨酸)
T(苏氨酸)
W(色氨酸)
Y(酪氨酸)
V(缬氨酸)
X(未知的)
通过参看本发明的以下详细说明、本发明具体实施方案的非限制性例子和附图可以更全面地理解本发明。
4. 附图简述
图1：变性PAGE比较卡他摩拉克菌大囊泡或整个卡他摩拉克菌细胞辛基葡糖苷(OG)提取物的外膜蛋白型。泳道上的数字指的是美国典型培养物保藏中心(ATCC)菌株标识。预染色的SDS-PAGE标准品(BioRad分类目录号161-0305)用作分子量标记物。所述标准品由以下多肽(括号内数字为其近似分子量)组成：兔肌肉磷酸化酶B(106kD)；牛血清白蛋白(80kD)；鸡卵清蛋白(49.5kD)；牛碳酸酐酶(32.5kD)；大豆胰蛋白酶抑制剂(27.5kD)；鸡卵清溶菌酶(18.5kD)。分子量标记物在凝胶中的位置用箭头标注在该图的左侧，箭头上为部分标记物的分子量(kD)。
图2：用125I标记外膜大囊泡覆盖糖脂的薄层层析谱结果。在A-C薄层板中，第1道含糖脂标准品(标示在左侧)；第2道含去唾液酸-GM1；第3道含Gb3、Gb4和福斯曼抗原；和第4道含人红细胞的Folch提取物。板A中显示的层析谱是用地衣二酚染色的，板B中显示的层析谱是用双ATCC菌株8176(非血凝集性菌株)的125I标记的大囊泡覆盖的，而板C中显示的层析谱是用ATCC菌株49143(血凝集性菌株)的125I标记的大囊泡覆盖的。只有所述血凝集性菌株结合到第3和第4道的Gb4糖脂带上。
图3：用该图中所示蛋白酶消化所述卡他摩拉克菌细胞后，银染外膜蛋白辛基葡糖苷提取物的蛋白型。消化后所述细胞的血凝集活性标示在该图下方标记为HA的行中。所用分子量标记物同图1。
图4：通过银染不同ATCC卡他摩拉克菌菌株的外膜蛋白的蛋白质型比较。菌株标识标示在泳道的上方。所述菌株的血凝集活性标示在该图下方的标记为HA的行中。注意到表观分子量大于兔肌肉磷酸化酶B(106kD)的一种蛋白普遍存在于血凝集性菌株中，但是不存在于非血凝集性菌株中。这一种多肽命名为OMP106。所用分子量标记物同图1。
图5：通过银染得自卡他摩拉克菌ATCC 49143的两个品种49143(血凝集性品种)和49143-NHA(非血凝集性品种)的外膜蛋白的蛋白质型比较。所述品种的血凝集活性标示在图下方的标记为HA的行中。注意到在所述非血凝集性品种中无所述OMP106多肽电泳带(用＜表示)。所用分子量标记物同图1。
图6：在6％变性聚丙烯酰胺凝胶中用ATCC菌株49143的OG提取物估测OMP106的分子量，所述菌株在上样到凝胶之前于或者25℃或者100℃温育于样品缓冲液中。通过还原银染色可见到凝胶中的蛋白质。注意到所述OMP106多肽电泳带(用＜表示)仅见于100℃温育的样品。宽范围的SDS-PAGE标准品(Biorad分类目录号161-0317)用作分子量标记物。所述标准品由下列多肽(括号内为其近似分子量)组成：兔骨骼肌肌球蛋白(200kD)；大肠杆菌β-半乳糖苷酶(116kD)；兔肌肉磷酸化酶B(97.4kD)；牛血清白蛋白(66.2kD)。分子量标记物在凝胶中的位置用箭头标注在该图右侧，箭头上方为标记物的分子量。
图7：用Mc5-72探查的卡他摩拉克菌染色体DNA的DraI和HindIII限制性内切核酸酶消化产物的Southen印迹分析。用DraI或HindIII消化卡他摩拉克菌菌株49143的DNA。用Mc5-72(SEQ IDNO：4)作探针进行消化DNA的Southern分析。用2×SSC、1％SDS于50℃高度严格洗涤大约20至大约30分钟。第1道含HindIII消化产物；其杂交带大小大约为8.0kb。第2道含DraI消化产物：其杂交带大小大约为4.2KB。
图8A和8B：用OMP106的兔抗血清作探针进行的卡他摩拉克菌和相关菌种的蛋白提取物的Westen印迹分析(图8A)，与用OMP106免疫该兔前的血清反应性比较(图8B)。图8A和8B各泳道中的样品如下：A道为卡他摩拉克菌；B道为羊摩拉克菌；C道为腔隙摩拉克菌；D道为奥斯陆摩拉克菌；E道为牛摩拉克菌；F道为脑膜炎奈菌；G道为淋病奈瑟菌。所用分子量标记物同图1。
图9A：蛋白质印迹分析，表明卡他摩拉克菌ATCC 49143的所述OMP106多肽的兔抗血清与许多HA和NHA卡他摩拉克菌菌株类似分子量的多肽发生交叉反应(箭头指示所述OMP106多肽的位置)。所述蛋白质印迹检查不同卡他摩拉克菌菌株的辛基葡糖苷提取物。所述菌株的ATCC登记号标示在泳道的顶部。所用转移和蛋白质印迹方法与用于获得图8所示印迹的方法相同。
图9B：用与图9A中所用的相应的免疫前血清对与图9A中相同的提取物的蛋白质印迹。
5. 本发明详细说明
5.1 血凝集和非血凝集品种
本发明提供卡他摩拉克菌的分离的或大致纯的OMP106多肽。所述OMP106多肽包括包埋在细菌外膜中或位于外膜外表面的整个蛋白或其蛋白亚基，所述细菌为卡他摩拉克菌的血凝集(HA)菌株和许多非血凝集(NHA)菌株以及品种。OMP106直接或间接组成所述HA菌株和品种的血凝集表型。按照本发明，在诸如Soto-Hernandez等(1989，J.Clin.Microbiol.27：903-908)讲述的任何标准血凝集检测中，HA卡他摩拉克菌细胞均凝集人或兔红细胞。虽然不想被限制于任何具体的作用机理，但是目前仍然设想卡他摩拉克菌通过结合到宿主细胞表面糖脂和糖蛋白受体的红细胞四糖(Gb4)部分，从而使红细胞凝集，而且设想所述血凝集活性部分由具有易于银染色特殊性质的经适当修饰的OMP106多肽介导。相反，未修饰或不当修饰的OMP106多肽既不能有效介导血凝集也不能银染。而且，OMP106多肽是唯一在SDS-PAGE中具有大约180kD至大约230kD表观分子量、可从HA或NHA卡他摩拉克菌大囊泡或完整细胞用OG或Sarkosyl提取的多肽。
HA卡他摩拉克菌细胞的血凝集活性被红细胞四糖(GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1；Gb4)和组成Gb4的单糖抑制，所述单糖包括N-乙酰-D-半乳糖胺、D-半乳糖和葡萄糖和其衍生物，诸如甲基-α-半乳糖或甲基-β-半乳糖。HA卡他摩拉克菌细胞的血凝集活性也受相对较高浓度的许多其它糖的抑制，所述糖包括(但不限于)D-甘露糖、L-岩藻糖、D-葡萄糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺。
通过用各种蛋白酶消化完整的卡他摩拉克菌细胞使完整HA卡他摩拉克菌细胞的血凝集活性和OMP106多肽均减少或破坏，所述蛋白酶包括(但不限于)TLCK(Na-对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮(也叫作1-氯-3-甲苯磺酰氨基-7-氨基-L-2-庚酮)处理后的胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和TPCK(N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮)处理后的胰蛋白酶。然而，蛋白酶V8消化完整的HA卡他摩拉克菌细胞既不影响这类细胞的OMP106多肽血凝集活性，也不影响其生理完整性。
通过在静止液体培养物(即，没有振荡的维持在35℃的液体培养物)中连续传代，从HA卡他摩拉菌菌株或品种可以衍生获得非血凝集(NHA)品种。例如，HA卡他摩拉克菌菌株或品种生长在Mueller Hinton肉汤中，并每5天从静止培养物表面取出接种物，以接种后续的静止培养物。最好的接种物是在培养物表面的任何漂浮层(floating mat)细胞。在静止培养物中连续传代直到产生NHA品种。本发明的NHA品种可以用于产生抗卡他摩拉克菌感染的保护性疫苗，诸如全细胞疫苗。
相反，通过在振荡的液体培养物中，将所述菌株或品种传代，可以保持HA卡他摩拉菌菌株或品种的血凝集表现型。在实施方案中，HA卡他摩拉克菌菌株或品种生长于35-37℃的Mueller Hinton肉汤中，并以大约200RPM振荡，而且每24-48小时传代一次。在固体培养基上传代也可以维持HA卡他摩拉克菌菌株或品种的血凝集表现型。例如，HA卡他摩拉克菌菌株或品种生长于含血琼脂或MuellerHinton琼脂平板上。
5.2. OMP106多肽
本发明的OMP106多肽是HA卡他摩拉克菌菌株或品种的唯一外膜蛋白，该外膜蛋白在SDS-PAGE中的表观分子量大约为180kD至大约230kD，优选大约为190kD。根据本发明，卡他摩拉克菌外膜蛋白是存在于卡他摩拉克菌大囊泡、或者可以在室温下用含正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)或者Sarkosyl去污剂的缓冲液从卡他摩拉克菌大囊泡或完整细胞提取的多肽。关于卡他摩拉克菌大囊泡的讨论，参见Murphy和Loeb，1989，Microbial Pathogenesis 6：159-174，该菌大囊泡是由卡他摩拉克菌外膜组成的天然产生的泡囊。NHA卡他摩拉克菌菌株或品种或者不具有OMP106多肽，或者具有结合抗OMP106抗体(参见下文的5.5.小节)形式但不与银染色剂反应(即采用Silver Stain Plus ofBioRad[Richmond，CA]的OMP106多肽，或者采用Gottlieb和Chauko，1987，Anal.Biochem.165：33所述的方法)。相反，HA卡他摩拉菌菌株或品种的OMP106多肽结合抗-OMP106抗体，且与银染色剂发生反应。
利用其易于被蛋白酶处理降解的特性，可以在HA卡他摩拉克菌大囊泡或完整细胞中鉴定OMP106多肽，所述蛋白酶处理也消除或减弱同一HA菌株的血凝集活性(参见上面5.1.小节关于破坏或不破坏完整卡他摩拉克菌细胞血凝集活性的蛋白酶例子)。换言之，与消化前从同一菌株或品种分离的OMP106多肽比较，用破坏或减弱HA菌株或品种血凝集活性的蛋白酶消化，也会改变从经这种消化之后的菌株或品种分离的OMP106多肽在SDS-PAGE中的多度和位置。
OMP106也可以作为存在于卡他摩拉克菌大囊泡或完整细胞的OG或Sarkosyl提取物中的多肽鉴定，正如采用在Harlow和Lane(抗体：实验室操作手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，附录I，1988)中所述的制剂，在具有SDS的12％PAG中的变性凝胶电泳测定的，该多肽的表观分子量大于106kD。于100℃热处理所述OG或Sarkosyl提取物5分钟，可以使所述OMP106具有大约108kD至大约230kD的表观分子量，所述分子量为采用在Harlow和Lane(同上)中所述的制剂，在没有任何还原剂的6％PAG中的SDS-PAGE测定的。在具体实施方案中，在卡他摩位克菌菌株ATCC 49143的热处理OG或sarkosyl提取物中的OMP106多肽具有大约190kD的表观分子量。
在具体实施方案中，所述OMP106多肽是从任何一种卡他摩拉克菌菌株制得的多肽，所述菌株包括(但不限于)ATCC 49143、ATCC25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628。OMP106多肽的优选来源是这些菌株的HA品种。更为优选的来源是ATCC 49143的HA品种。
在具体实施方案中，OMP106多肽在氨基末端最好含有氨基酸序列IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQ ID NO：1)或与该序列大致同源的序列。所述OMP106多肽还可以在上述序列的远侧羧基端含有氨基酸序列GTVLGGKK(SEO ID NO：2)的八肽或与该序列大致同源的序列。本文所用的大致同源氨基酸序列至少90％、最好100％与所述参照氨基酸序列相同。
根据本发明的各个不同方面，本发明的多肽的特征为，它们基于在SDS-PAGE中相对于已知分子量标记物迁移的该类多肽的迁移的表观分子量。尽管本领域已知的任何分子量标准品可以用于SDS-PAGE，但是最好的分子量标记物至少包括兔骨骼肌肌球蛋白、大肠杆菌β-半乳糖苷酶和兔肌肉磷酸化酶B。本领域技术人员会知道本发明的多肽在不同类型凝胶系统(例如，不同缓冲液；不同浓度的凝胶、交联剂或SDS)中可能迁移距离不同。本领域技术人员也会知道因为用于SDS-PAGE的分子量标记物不同，所述多肽可以有不同的表观分子量。所以，本发明多肽的分子量特征是指在任何SDS-PAGE系统和应用任何分子量标记物涉及同一类多肽，所述分子量标记物可能显示该类多肽较此处公开的多肽的表观分子量略有不同。
5.3. OMP106衍生多肽
本发明的OMP106多肽可以是所述OMP106多肽的片段。所述完整的OMP106多肽可以含有其免疫原性非必需的一个或多个氨基酸残基。可以是这种情况，例如，只有形成所述OMP106多肽特定表位的氨基酸残基是免疫原活性必需的。采用本领域熟知的技术可以去除非必需氨基酸序列。例如，通过用诸如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或相关蛋白水解酶的有限蛋白水解消化，或通过用诸如溴化氰类的试剂化学切割，可以去除不需要的氨基酸序列，然后分级分离所消化或切割的产物。
本发明的OMP106衍生多肽也可以是修饰的OMP106多肽或其片段(即，OMP106多肽或片段含有所述野生型OMP106序列的一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失)。这类修饰可以增强所产生的多肽产物的免疫原性或者对此活性没有影响。可以利用的修饰技术包括美国专利号4,526,716中公开的技术。
OMP106衍生多肽还可以是包含一种或多种异源多肽的嵌合多肽，所述异源多肽融合到完整OMP106多肽或其部分或其片段的氨基末端或羧基末端或内部。构成这种嵌合多肽的有用的异源多肽包括(但不限于)，a)促进宿主细胞中的所述OMP106衍生多肽的转运、易位和/或加工的前和/或原序列，b)亲和纯化序列，和c)任何有用的免疫原序列(例如，编码微生物病原体表面暴露蛋白的一种或多种表位的序列)。
可优选的是，本发明的OMP106衍生多肽可与该OMP106多肽发生免疫交叉反应，因此能够在动物中引发对卡他摩拉克菌的免疫应答。更为优选的是，本发明的OMP106衍生多肽包含形成卡他摩拉克菌天然OMP106多肽的一种或多种外表面表位(即，OMP106多肽本身存在于完整的卡他摩拉克菌细胞时的表面暴露表位)的序列。通过它们特异性结合针对整个卡他摩位克菌细胞产生的抗体(例如，由甲醛或戊二醛固定的卡他摩拉克菌细胞诱发的抗体；在此处这类抗体称为“抗全细胞”抗体)的能力，可以鉴定这类优选OMP106衍生多肽。例如，对得自所述OMP106多肽有限的或完全的蛋白酶消化的多肽或肽采用标准方法分级分离，并检测它们结合抗全细胞抗体的能力。反应性多肽包括优选的OMP106衍生多肽。可以分离这些多肽以及采用该领域已知的方法确定其氨基酸序列。
也可以优选的是，本发明的OMP106衍生多肽包含形成介导HA卡他摩拉克菌细胞血凝集的天然OMP106多肽的一种或多种表位的序列。由它们干扰HA卡他摩拉克菌细胞血凝集的能力可以鉴定这类优选OMP106衍生多肽。例如，用标准方法分段分离得自有限或完全蛋白酶消化或化学切割OMP106多肽的多肽，并检测其干扰卡他摩拉克菌细胞血凝集的能力。一旦鉴定和分离后，就用标准序列分析方法确定这类优选OMP106衍生多肽的氨基酸顺序。采用合成化学和/或遗传工程方法可以用所述确定序列实现这类多肽的生产。
通过用抗全细胞抗体筛选表达卡他摩拉克菌基因组DNA的随机片段的细菌库或编码所述OMP106多肽的克隆核苷酸序列，也可以鉴定这些优选OMP106衍生多肽。参见例如Sambrook等，分子克隆，实验室操作手册，第2版，冷泉港出版社，纽约，第1卷，第12章。鉴定反应性克隆，然后分离及序列分析其插入片段，以确定这类优选OMP106衍生多肽的氨基酸顺序。
5.4. OMP106多肽和OMP106衍生多肽的分离和纯化
本发明提供分离的OMP106多肽和OMP106衍生多肽。本文所用的术语“分离的”指该产品明显不含与其天然相连的其它生物物质。也就是说，例如，一种分离的OMP106多肽组合物为纯度约为70％-94％(重量)的OMP106多肽。最好纯化本发明的OMP106和OMP106衍生多肽。本文所用的术语“纯化的”指该产品大致不含与其天然相连的其它生物物质。也就是说，纯化的OMP106多肽组合物为纯度至少为95％(重量)的OMP106多肽，优选为纯度至少为98％(重量)的OMP106多肽，和最优选为纯度至少为99％(重量)的OMP106多肽。
可以从任何卡他摩拉克菌菌株或品种的蛋白提取物(包括全细胞提取物)中分离本发明的OMP106多肽。所述蛋白提取物最好是卡他摩拉克菌外膜泡囊(即大囊泡)或全细胞的辛基葡糖苷或sarkosyl提取物，所述卡他摩拉克菌包括(但不限于)菌株ATCC 49143、ATCC25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628中的任何菌株。这类提取物的优选来源是这类菌株的HA品种。这类提取物更优选来源是ATCC 49143的HA品种。所述OMP106多肽的另一来源是得自表达编码OMP106多肽或OMP106衍生多肽的克隆序列的基因表达系统的蛋白质制剂(参见下文5.8.小节)。
可以采用本领域技术人员熟知的任何生化技术和方法，从源材料分离和纯化所述OMP106多肽。在一种方法中，用标准技术获得卡他摩拉菌外膜，之后用诸如去污剂的增溶化合物溶解外膜蛋白。优选增溶溶液是含约1.25％(w/v)辛基吡喃葡萄糖苷(OG)的增溶溶液。另一优选增溶溶液是含约1.25％Sarkosyl的增溶溶液。OMP106多肽存在于增溶溶解部分。分离且最好通过离心去除提取物中的细胞碎片和不溶性物质。浓缩提取物中的多肽，并将该多肽于100℃在含SDS的Laemmli凝胶样品缓冲液中温育5分钟，然后在没有还原剂的6％变性十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶(PAG)中电泳分级分离该多肽。参见Laemmli，1970，Nature 227：680-685。然后可以直接从含所述OMP106多肽的分级分离部分或凝胶片分离如上述的鉴定为OMP106多肽的带或分级分离部分(例如，存在于HA的OG或Sarkosyl提取物中的银染多肽带，所述提取物不是相应的NHA品种的提取物或者用消除血凝集活性的蛋白酶消化之后的HA品种的提取物)。在优选实施方案中，正如通过比较在变性SDS-PAGE中相对于兔骨骼肌肌球蛋白(200kD)和大肠杆菌β-半乳糖苷酶(116kD)的迁移距离或迁移率所确定的，OMP106多肽具有190kD的表观分子量。
纯化OMP106的另一方法是用抗-OMP106抗体的亲和层析法(参见5.5.小节)。最好用单克隆的抗-OMP106抗体。该类抗体共价连接到通过溴化氰或琥珀酸胺酯(Affi-Gel，BioRad，Inc.)或通过本领域技术人员已知的其它方法活化的琼脂糖凝胶上。如上所述将蛋白质提取物加到凝胶顶部。让其接触一定时间并在标准反应条件下让OMP106多肽充分结合到所述抗体。固相支持体最好是用于层析柱的材料。然后使OMP106与所述抗体分离，这样允许OMP106多肽以分离的或最好是纯化的形式回收。
通过分离或纯化的OMP106的化学和/或酶切割或者降解，可以产生本发明的OMP106衍生多肽。在已知OMP106多肽氨基酸顺序的基础上，而在嵌合多肽的情况下，在通过本领域熟知的方法知道这些异源多肽的氨基酸顺序的基础上，也可以化学合成OMP106衍生多肽。参见例如Creighton，1983，Proteins：Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.，NY。
也可以在表达重组核苷酸构建物的基因表达系统中产生OMP106衍生多肽，其中所述重组基因构建物含OMP106衍生多肽编码序列。根据本领域技术人员熟各的技术可以合成、和/或克隆及表达编码本发明多肽的核苷酸序列。参见例如Sambrook等，1989，分子克隆，实验室操作手册，第1-3卷，冷泉港出版社，纽约，第九章。
可以应用标准蛋白质纯化技术分级分离及纯化本发明的OMP106衍生多肽，根据本文所述的发现和内容可以修饰及应用本发明的OMP106衍生多肽。特别是，根据以上公开的分离及纯化OMP106多肽的亲和方法，可以分离和纯化形成天然OMP106多肽外表面表位的这些本发明的优选OMP106多肽(例如，用抗-OMP106抗体进行亲和纯化)。
假如需要的话，可以采用标准蛋白质或肽纯化技术进一步纯化本发明的多肽，所述纯化技术包括(但不限于)电泳、离心、凝胶过滤、沉淀、透析、层析(包括离子交换层析、亲和层析、免疫吸附亲和层析、反相高效液相层析和凝胶渗透高效液相层析)、等电聚焦、和以上方法的变化方法及联用。
一种或多种这些技术可以连续用在设计的程序中，以便根据其物理或化学特性分离分子。这些特性包括该蛋白质的疏水性、电荷、结合能力和分子量。检测每一技术后获得材料的不同部结合所述OMP106受体或配体、结合抗-OMP106抗体或干扰HA卡他摩拉克菌细胞血凝集的能力(“试验”活性)。然后将显示此活性的那些部分提供给连续程序中的下一技术，并再检测所述新部分。重复此过程，直到只存在一种部分具有上述“试验”活性，并且当进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或层析时该部分时，只产生唯一的条带或实体。
5.5  OMP106免疫原和抗-OMP106抗体
本发明提供特异性结合OMP106多肽或OMP106衍生多肽的抗体。为了生产这类抗体，将OMP106多肽或OMP106衍生多肽的分离的或最好是纯化的制剂用作免疫原。
在一实施方案中，用SDS-PAGE(参见前面5.2.小节)从存在于HA卡他摩拉克菌细胞或大囊泡外膜的OG或Sarkosyl提取物中的其它外膜蛋白质中分离所述OMP106多肽，将含OMP106多肽的凝胶片用作免疫原并注射到兔中，以产生含多克隆OMP106抗体的抗血清。可以用同一免疫原免疫小鼠，以生产产生单克隆抗-OMP106抗体的杂交瘤系。在具体实施方案中，将含有得自任何一种菌株的分离的或纯化的OMP106的PAG片用作免疫原，所述菌株为ATCC 49143、ATCC25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628。在优选实施方案中，使用含有得自这类菌株的HA品种的分离的或纯化的OMP106的PAG片。在更优选实施方案中，将得自菌株ATCC 49143的HA品种的分离或纯化的OMP106的PAG片用作免疫原。
在其它实施方案中，OMP106多肽的肽片段用作免疫原。优选使用纯化的OMP106多肽的肽片段。可以通过蛋白酶消化、化学切割分离或纯化的OMP106多肽或者通过化学合成生产所述肽，然后可以分离或纯化所述肽。这类分离或纯化的肽可以直接用作免疫原。在具体实施方案中，有用的肽片段包括(但不限于)含有序列IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQ ID NO：1)的那些肽或长度为6个或更多氨基酸的其任何部分。在另一实施方案中，所述肽片段含有序列GTVLGGKK(SEQ ID NO：2)。
有用的免疫原也可以包括缀合到载体分子、最好是载体蛋白的这类肽或肽片段。载体蛋白可以是通常用于免疫学的任何载体蛋白，包括(但不限于)牛血清白蛋白(BSA)、鸡白蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)等等。关于半抗原蛋白缀合物的讨论，参见例如Hartlow等，抗体：实验室操作手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1988，或者标准免疫学教科书，诸如Roitt.I.等，免疫学，C.V.Mosby Co.，St.Louis，MO(1985)或Klein，J.免疫学，Blackwell Scientific Publications，Inc.，Cambridge，MA，(1990)。
在又一实施方案中，为了产生特异性结合所述天然OMP106多肽的一种或多种外表面表位的抗体，完整HA卡他摩拉克菌细胞或由其制备的大囊泡用作免疫原。在免疫之前可以用诸如甲醛或戊二醛之类的试剂固定所述细胞或大囊泡。参见Harlow和Lane，抗体：实验室操作手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1988，第15章。最好这类抗-全细胞抗体是单克隆抗体。通过用纯化的OMP106多肽作为筛选配位，可以鉴定产生所需要的单克隆抗体的杂交瘤系。任何一种卡他摩拉克菌菌株的细胞或大囊泡用作诱导这些抗体的免疫原，所述菌株包括(但不限于)ATCC 49143、ATCC 25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628。可优选的是，这些菌株的HA品种的细胞或大囊泡用作免疫原。更优选的是，菌株ATCC 49143的HA品种的细胞或大囊泡用作诱导这些抗体的免疫原。
由全细胞或大囊泡免疫产生的多克隆抗体含有结合其它卡他摩拉克菌外膜蛋白的抗体(“非-抗-OMP106抗体”)，因此，当已知或怀疑所述样品含有与这些其它外膜蛋白交叉反应的其它卡他摩拉克菌外膜蛋白或物质时，其使用更为麻烦。在这类情况下，必须通过同一样品或带同时与特异性结合OMP106多肽(例如，抗OMP106)和/或OMP106衍生多肽的抗体结合，或通过用抗OMP106抗体、OMP106多肽或OMP106衍生多肽作竞争物的竞争试验(即，将抗-OMP106抗体、OMP106多肽或OMP106衍生多肽加入到反应混合物中，使样品与抗-全细胞抗体结合减少或消除)，证实给定样品或带与抗-全细胞抗体的任何结合。另一方面，这类含有“非-抗-OMP106”抗体的多克隆抗血清可以采用标准途径和方法去除这类抗体。例如，通过用NHA卡他摩拉克菌品种或已知不含所述OMP106多肽的卡他摩拉克菌菌株(例如ATCC 8176，更优选ATCC 49143的NHA品种)的细胞进行沉淀；或者通过吸附到含有这类细胞或这类细胞的外膜蛋白的柱子，可以去除这类非-抗-OMP106抗体。
在再一类实施方案中，引发本发明的抗体的有用免疫原包括二种或多种任何上述单个免疫原的混合物。
按照本领域技术人员熟知的方法，用本文所述免疫原免疫哺乳动物，最好是人、兔、大鼠、小鼠、绵羊、山羊、牛或马，目的是获得含多克隆抗体的抗血清或分泌单克隆抗体的杂交瘤系。
可以用标准技术制备单克隆抗体，已知其内容包含在本文中。这类技术例如公开在美国专利号4,271,145和美国专利号4,196,265中。简单地说，用免疫原免疫动物。通过将已免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤。融合产物在产生结合所述免疫原的抗体的杂交瘤克隆方面进行筛选。分离阳性杂交瘤克隆，并从那些克隆回收所述单克隆抗体。
用于生产多克隆和单克隆抗体的免疫方法是本领域众所周知的。免疫原注射可以采用许多途径中任何一种途径，包括皮下、静脉内、腹膜内、皮内、肌内、粘膜或这些途径的联用。采用本领域众所周知的方法和材料，可以注射可溶形式、凝聚形式、吸附到物理载体或与佐剂混合的免疫原。采用本领域技术人员熟知的柱层析法可以纯化所述抗血清和抗体。
根据本发明，HA或NHA卡他摩拉克菌菌株的OMP106多肽是免疫交叉反应性的。因此，针对一种卡他摩拉克菌菌株或品种的OMP106多肽产生的抗体特异性结合其它卡他摩拉克菌菌株及培养物的OMP106多肽和OMP106衍生多肽。例如，由菌株ATCC 49143的OMP106多肽诱导的多克隆抗-OMP106抗体不仅特异性地结合同源的OMP106多肽(即，菌株ATCC 49143的OMP106多肽)，而且结合其它卡他摩拉克菌菌株的OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽，所述其它卡他摩拉克菌菌株包括(但不限于)ATCC 43628、ATCC 43627、ATCC 43618、ATCC 43617、ATCC 25240和ATCC 25238。
本发明的抗体(包括但不限于抗-OMP106抗体)可以用来促进OMP106和OMP106-衍生多肽的分离及纯化。所述抗体也可以用作探针，以鉴定表达库中具有编码OMP106多肽或其片段的插入片段的克隆的。这类抗体也可以用于特异性检测和/或定量生物样品中的卡他摩拉克菌的免疫检测法(例如，ELISA、RIA、免疫印迹)中。本发明的抗-OMP106抗体特异性结合OMP106多肽，而不结合得自相关细菌病原体的蛋白质，相关细菌病原体诸如羊摩克拉克菌、腔隙摩拉克菌、奥斯陆摩拉克菌、牛摩拉克菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。因此抗-OMP106抗体可以用来诊断卡他摩拉克菌感染。
本发明的抗体，尤其是那些胞毒抗体，也可以用来进行被动免疫，以防止或减轻动物(包括人类)的卡他摩拉克菌感染。(本文使用的胞毒抗体是促进免疫调理和/或补体杀伤已被该抗体结合的细菌的抗体)。可以给予宿主有效浓度的由本发明的免疫原产生的多克隆或单克隆抗体以获得这类效应。给予所述抗体的确切浓度随每一具体抗体制剂而变化，但是可以采用本领域普通技术人员熟知的标准技术确定给与的准确抗体浓度。可以采用各种技术，包括(但不限于)5.6.小节中所述的传递疫苗的这些技术，完成所述抗体的给与。
采用在实验动物中的标准药学方法可以确定本发明抗体的预防和治疗效能。从动物研究获得的数据可以用来计算用于人类的剂量范围。
5.6. 疫苗
本发明也提供对抗动物卡他摩拉克菌感染的治疗和预防疫苗，所述动物包括哺乳动物，更具体为啮齿动物、灵长类动物以及人类。这些疫苗的最好应用于人类。可以采用本领域技术人员已知的技术制备该类疫苗，而且这类疫苗包括例如免疫原形式的抗原、药学上可接受的载体、可能的适合佐剂、以及在疫苗中常规发现的可能的其它物质。从本文的内容来看，采用本领域已知的方法确定用于疫苗的免疫原的免疫学有效量。
本发明的疫苗包括免疫学有效量的任何在5.5.小节中公开的药学上可接受载体中的免疫原。
根据另一实施方案，本发明的疫苗包括免疫学有效量的本发明的灭活或减毒的HA卡他摩拉克菌品种或NHA卡他摩拉克菌品种。采用本领域已知的任何方法，包括(但不限于)化学处理(例如，福尔马林)、热处理及辐射，获得灭活或减毒HA卡他摩拉克菌品种或NHA卡他摩拉克菌品种。
本文使用的术语“免疫学有效量”是指足以诱导免疫应答的量，该免疫应答可以防止卡他摩拉克菌感染或减轻任何先前存在或后来的卡他摩拉克菌感染的严重程度。其确切浓度将取决于给予的具体免疫原，但是通过采用本领域技术人员熟知的检测免疫应答发展的标准技术，可以确定免疫原的准确浓度。
有用的多肽免疫原包括所述分离的OMP106多肽及OMP106-衍生多肽。优选免疫原包括所述纯化的OMP106多肽和OMP106衍生多肽或肽。混合的免疫原和载体可以是水溶液、乳液或悬液。一般来说，多肽免疫原每一剂量的量为0.1-500微克。这类载体是本领域技术人员已知的，而且包括稳定剂、稀释剂和缓冲剂。合适的稳定剂包括碳水化合物，诸如山梨醇、乳糖、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖和葡萄糖及蛋白质，诸如白蛋白或酪蛋白。合适的稀释剂包括盐水、Hanks平衡盐溶液、和Ringers液。合适的缓冲剂包括碱金属磷酸盐、碱金属碳酸盐或碱土金属碳酸盐。所述疫苗也可以含有一种或多种佐剂以提高或增强免疫应答。合适的佐剂包括(但不限于)肽类；氢氧化铝；磷酸铝；氧化铝；由例如Marcol 52类的矿物油、或者植物油与一种或多种乳化剂、或者诸如溶血卵磷脂、聚阳离子、聚阴离子类的表面活性物质组成的组合物；以及潜在有用的人类佐剂，例如卡介菌和小棒杆菌。所述疫苗也可以含有其它免疫原。这种联合疫苗的优点是通过单次给与就可以获得对几种病原体的免疫性。其它免疫原的例子是用于已知的DPT疫苗中的那些免疫原。
采用本领域技术人员已知的技术制备本发明的疫苗，已知其内容已包含在本文中。一般来说，将免疫原与载体混合形成溶液、悬液或乳液。前面讨论的一种或多种添加剂可以在载体中加入或者可以随后加入。可以例如通过冻干干燥所述疫苗制剂，达到贮藏目的。假如如此，随后可以通过加入适宜的液体载体将它们再复制成液体疫苗。
将所述疫苗给予人类或其它哺乳动物，包括啮齿动物和灵长类动物。它们可以以一剂或多剂给与。可以由已知的给药途径给与疫苗。许多方法可以用来输入此处描述的疫苗制剂。这些方法包括(但不限于)经口、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下及鼻内途径。优选途径是肌内或皮下注射。
本发明也提供在哺乳动物诱导针对卡他摩拉克菌的免疫应答的方法，以便保护该哺乳动物抗感染和/或减轻由卡他摩拉克菌引起的疾病。所述方法包括给与宿主免疫有效量的本发明的免疫原，而且优选给与宿主本发明的疫苗。
5.7. 编码OMP106多肽和OMP106-衍生多肽的核酸
本发明也提供编码OMP106多肽和OMP106-衍生多肽的核酸、DNA和RNA。一方面，采用本领域已知的方法可以合成本发明的核酸。具体地说，采用本领域技术人员熟知的技术，例如通过Edman降解技术(参见例如Creighton，1983，蛋白质：结构与分子原理，W.H.Freeman & Co.，N.Y.，第34-49页)，可以确定OMP106或OMP-衍生多肽的部分或全部氨基酸顺序。所获得的氨基酸序列用作合成编码OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的DNA的指导物，并采用常规化学方法或聚合酶链式反应(PCR)扩增重叠的寡核苷酸。
另一方面，所述氨基酸序列可以用作合成寡核苷酸混合物的指导物，所述寡核苷酸混合物可以再用来筛选卡他摩拉克菌基因组文库中的OMP106多肽编码序列。可以从任何卡他摩拉克菌菌株细胞分离DNA制得这类文库。对于基因组文库以及PCR扩增而言，优选用作所述OMP106多肽编码序列的DNA从任何卡他摩拉克菌菌株细胞制得，所述卡他摩拉克菌菌株包括(但不限于)ATCC 49143、ATCC25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628。
在基因组文库的制备中产生DNA片段，其中某些片段编码部分或整个卡他摩拉克菌OMP106多肽。采用不同限制酶在特定位点切割该DNA。或者，在锰存在下可以用DNA酶使该DNA断裂成片段，或者可以物理剪切该DNA，例如超声处理。然后，可以采用标准技术根据片段大小分离所述DNA片段，所述标准技术包括(但不限于)琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析以及蔗糖梯度离心。之后将所述DNA片段插入到合适的载体，载体包括(但不限于)质粒、粘粒、λ或T4噬菌体及酵母人工染色体(YAC)。(参见例如Sambrook等，1989，分子克隆，实验室操作手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Glover，D.M.(编辑)，1985，DNA克隆：实用方法，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.，第I、II卷)。通过核酸与标记探针杂交可以筛选基因组文库(Benton和Davis，1977，Science 196：180；Grunstein和Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 72：3961)。
采用本领域熟知的最佳方法，用相应于OMP106多肽的任何肽氨基酸顺序的标记变性寡核苷酸，可以筛选所述基因组文库，在特定实施方案中，所述筛选探针是一简并寡核苷酸，它相应于具有序列IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQID NO：1)或其部分的肽。在另一实施方案中，所述筛选探针可以是相应于具有序列GTVLGGKK(SEQ ID NO：2)的肽的简并寡核苷酸。在又一实施方案中，将均相应于OMP106肽GTVLGGKK(SEQ ID NO：2)的寡核苷酸GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR(SEQ ID NO：3)和GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR(SEQ ID NO：7)用作探针。在再一实施方案中，序列GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA(SEQ ID NO：4)或其任何片段、或者该序列或片段的任何互补序列可以用作探针。所用的任何探针最好为15个核苷酸或更长。
在具有编码所述OMP106多肽或其片段的插入DNA的文库中的克隆，将与一种或多种简并寡核苷酸探针杂交。采用本领域已知的方法进行这类寡核苷酸探针与基因组文库的杂交。例如，与两种上述寡核苷酸探针的杂交可以在2×SSC、1.0％SDS中于50℃进行，并采用同样条件冲洗。在一特定实施方案中，编码完整或部分所述OMP106多肽的ATCC 49143 DNA序列是长度约8,000bp的HindIII限制片段或长度约4,200bp的DRAI限制片段。
又一方面，通过筛选卡他摩拉克菌表达文库，也可以获得编码部分或完整的OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的核苷酸序列的克隆。例如，分离卡他摩拉菌DNA，制备随机片段并将其连接到表达载体(例如，噬菌体、质粒、噬菌粒或粘粒)中，使得插入该载体中的序列能够由然后导入该载体的宿主细胞表达。然后可以应用各种筛选检测，在表达OMP106多肽或OMP106-衍生多肽方面进行选择。在一实施方案中，采用本领域已知的方法，可以用本发明的不同抗OMP106抗体(参见5.5.小节)来鉴定所需要的克隆。参见例如Harlow和Lane，1988，抗体：实验室操作手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，附录IV。使得自所述文库的克隆或噬菌斑与所述抗体接触，以鉴定那些结合的克隆。
在一实施方案中，根据Olsvick等，29th ICAAC，Houston，Tex.1989(通过引用结合到本文中)，可以采用DYNA珠检测含有编码OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的DNA的克隆或噬菌斑。将抗-OMP106抗体交联到对甲苯磺酰化的DYNA珠M280上，然后用这些含有抗体的珠来吸附表达OMP106多肽或OMP106衍生多肽的克隆或噬菌斑。将表达OMP106多肽或OMP106衍生多肽的克隆或噬菌体鉴定为结合所述珠的这些克隆中的任何一种。
另一方面，所述抗-OMP106抗体可以非特异地固定到合适的支持体，例如二氧化硅或CeliteTM树脂。然后可以如在前一段中所述，将这种材料用来吸附表达OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的细菌克隆。
再一方面，PCR扩增可以用来从卡他摩拉克菌基因组DNA中生产编码部分或完整OMP106多肽的大致纯的DNA。相应于已知OMP106多肽顺序的简并或非简并的寡核苷酸引可以用作引物。在一特定实施方案中，编码肽IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQ ID NO：1)或其任一部分简并性或非简并寡核苷酸可以用作5’引物。例如，5’引物可以是核苷酸序列GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA(SEQ ID NO：4)或其任何部分。例如，为编码GTVLGGKK(SEQ ID NO：2)的序列的反向互补序列的、简并或非简并核苷酸序列可以用作3’引物。例如，具有简并核苷酸顺序YTTYTTNCCNCCNAGNACNGTNCC(SEQ ID NO：6)或YTTYTTNCC NCCYAANACNGTNCC(SEQ ID NO：8)的简并或非简并寡核苷酸可以用作3’引物，该引物与前面讨论的不同的5’引物连接。
可以例如采用Perkin-Elmer Cetus热循环仪和Taq聚合酶(GeneAmpTM)进行PCR。人们可以选择合成几种不同的简并引物用于所述PCR反应。改变用于引发PCR反应的杂交条件的严格度也是可能的，以允许简并引物与卡他摩拉克菌DNA中的相应序列之间的核苷酸顺序相似性更高或更低。在成功扩增编码OMP106的序列的一个区段之后，可以分子克隆及序列分析该区段，并将其用作探针以分离全部基因组克隆。如下所述，这可以依次允许确定所述基因的全部核苷酸顺序、分析其表达及产生其蛋白产物以进行功能分析。
一旦从一种卡他摩拉克菌菌株或品种中分离出OMP106多肽编码序列，则可以采用同一方法从其它卡他摩拉克菌菌株及品种中分离OMP106多肽编码序列。本领域技术人员会知道，采用本领域已知的一般技术，可以用本发明的编码OMP106多肽(或其片段)的DNA或RNA序列来获得在中度至高度严格的条件下与其杂交的其它DNA或RNA序列。在高度严格条件下与得自一种卡他摩拉克菌株或品种的OMP106序列的杂交反应，可以鉴定得自其它菌株和品种的相应序列。高度严格的条件随探针长度及碱基组成而变化。确定这类条件的方法是本领域熟知的。参见Sambrook等，1989，分子克隆，实验室操作手册，冷泉港出版社，纽约，第11章。用在此处的用于大于300个碱基长度的探针的高度严格的杂交条件，包括最后在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃洗涤至少1小时(Ausubel等编辑，1989，Current Protocolsin Molecular Biology，第1卷，Greene Publishing Associates，Inc.andJohn Wiley & Sons，Inc.，纽约，第2.10.3页)。在具体实施方案中，在杂交反应中采用具有SEQ ID NO：4的序列或其相互序列的探针的高度严格冲洗，在2×SSC、1％SDS中于50℃洗涤约20至约30分钟。
本领域技术人员采用本领域熟知的方法能够鉴定OMP106多肽编码序列的全部克隆。通过序列分析所克隆的插入片段并比较可读框(ORFs)编码多肽的推测大小与OMP106多肽的大小，和/或通过比较所推测的氨基酸序列与纯化OMP106多肽已知的氨基酸顺序，可以确定在所分离的克隆中含有的OMP106多肽编码序列的程度。分离出OMP106多肽编码序列的部分克隆时，就可以采用该部分克隆酸插入片段作为杂交探针分离完整克隆。另一方面，通过将各部分克隆的插入片段剪接在一起，可以由重叠部分克隆再构建完整的OMP106多肽编码序列。
完整克隆可以是这样的任何克隆，其可读框的推测氨基酸序列与OMP106多肽的氨基酸序列相同或者，如果不知道后者的完整氨基酸顺序时，其可读框的推测氨基酸序列与OMP106多肽的肽片段氨基酸序列相同，并且所述推测的氨基酸序列的分子量与OMP106多肽的分子量相当。而且，可以由其插入片段的能力鉴定完整克隆，所述能力是指当其插入片段置于表达载体时，产生结合对OMP106多肽氨基端特异性的抗体和对OMP106多肽羧基端特异性的抗体的多肽。
编码OMP106-衍生多肽的核酸序列可以通过本领域熟知方法产生。一方面，根据本文公开的内容，通过重组DNA方法可以从OMP106多肽编码序列衍生编码OMP106-衍生多肽的序列。例如，可以改变OMP106多肽编码序列产生氨基酸置换，所述氨基酸置换不会影响所述OMP106多肽的免疫原性或者提高其免疫原性。可以使用各种不同方法，包括(但不限于)寡核苷酸指导的位点特异性诱变。可以使用这些及其它本领域已知技术以产生单个或多个突变，例如置换、插入、缺失及转座，如在Botstein和Shortle，1985，Science 299：1193-1210中所述。
此外，OMP106多肽编码序列的DNA可以通过限制酶或外切核酸酶消化截短。通过连接或PCR扩增可以将异源编码序列连接到OMP106多肽编码序列。而且，在已知或推测的OMP106多肽的氨基酸顺序及需要对该序列进行的任何改变的基础上，可以化学合成或用PCR扩增编码整个或部分OMP-衍生多肽的DNA。
含有OMP106多肽或OMP106-衍生多肽编码序列的经鉴定及分离的DNA，可以插入到合适的正在克隆的载体。可以使用本领域已知的许多载体-宿主系统。可能的载体包括(但不限于)质粒或经修饰的病毒，但是所述载体系统必须与所用的宿主细胞相容。这类载体包括(但不限于)诸如λ衍生物之类的噬菌体或诸如pBR322或pUC质粒衍生物之类的质粒。例如，通过将DNA片段连接到具有互补粘性末端的克隆化载体中，可以完成将所述插入片段片段插入到克隆载体中。然而，如果在克隆载体中没有用于使该DNA成片段的互补限制位点，可以酶修饰该DNA分子的末端。或者，通过连接核苷酸序列(接头)到该DNA末端可以产生任何需要的位点；这些连接接头可以包括编码限制性内切核酸酶识别序列的特定化学合成的寡核苷酸。在备选方法中，该被切割的DNA可以通过同聚物加尾进行修饰。通过转化、转染、感染、电穿孔等可以将重组分子导入宿主细胞，因此产生许多拷贝的该基因序列。
在备选方法中，含有OMP106多肽或OMP106-衍生多肽编码序列的所需DNA可以在以“鸟枪”法插入到合适的克隆载体后鉴定及分离。例如，在插入到克隆载体前可以通过大小分级分离富集所需要的序列。
在具体实施方案中，用含有OMP106多肽或OMP106-衍生多肽编码序列的重组DNA分子转化宿主，能够产生许多拷贝的该编码序列。因此，通过让转化体生长、从所述转化体分离所述重组DNA分子以及必要时，从分离的重组DNA中再取回插入编码序列，可以大量获得所述编码序列。
5.8. OMP106多肽和OMP106-衍生多肽的重组产物
通过基因工程技术可以生产本发明的OMP106多肽和OMP106-衍生多肽。在这种情况下，由编码所述多肽的DNA转化的合适宿主细胞生长它们。编码本发明的OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的核苷酸序列可以插入到合适的表达载体，即含有插入多肽编码序列转录及翻译必需元件的载体。编码OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的核苷酸序列以它们在适当条件(例如，在合适取向和正确阅读框中以及具有合适表达序列，包括RNA聚合酶结合序列和核糖体结合序列)下可以表达的方式插入到所述载体中。
各种各样的宿主-载体系统可以用来表达所述多肽编码序列。这些包括(但不限于)用病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，例如含有酵母载体的酵母或用噬菌体DNA、质粒DNA或粘质DNA转化的细菌。所述宿主细胞优选细菌，而最优选的细菌为大肠杆菌、枯草杆菌或沙门氏菌。
不同载体的表达元件的强度和特异性不同。根据所用的宿主-载体系统，可以使用许多合适转录和翻译元件中的任意一种。在一具体实施方案中，表达含OMP106多肽或OMP106-衍生多肽序列的嵌合蛋白及宿主细胞的前和/或原序列。在另一具体实施方案中，表达含OMP106多肽或OMP106-衍生多肽序列的嵌合蛋白和亲和纯肽。在其它具体实施方案中，表达含OMP106多肽或OMP106-衍生多肽序列的嵌合蛋白和有用的免疫原肽或多肽。在最佳实施方案中，表达的OMP106-衍生多肽含有形成天然OMP106多肽的或外表表位或受体结合域的序列。
将DNA片段插入载体的本领域已知的任何方法均可以用来构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因由合适的转录/翻译控制信号及所述多肽编码序列组成。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组体(遗传重组)。编码OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的核酸序列的表达，可以受第二个核酸序列的调节，使得该插入序列在用所述重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，所述插入序列的表达可以受本领域已知的任何启动子/增强子元件的控制。可以用来控制插入序列表达的启动子包括(但不限于)在动物细胞表达的SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、含于Rous肉瘤病毒的3’长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22：787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natt.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature 296：39-42)；在细菌细胞表达的的β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)、tac(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)、λPL或trc(也参见在Scientific American中的“得自重组细菌的有用蛋白质”，1980，242：74-94)；表达植入细胞的胭脂碱合成酶启动子区或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等，1981，Nucl.Acids Res.9：2871)以及光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等，1984，Nature 310：115-120)；得自酵母或其它真菌的启动子元件，例如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子。
由三种一般方法：(a)核酸杂交，(b)存在或缺乏“标记物”基因功能，以及(c)插入序列的表达，可以鉴定含有OMP106多肽或OMP106-衍生多肽编码序列的表达载体。在第一种方法中，采用含有与插入OMP106多肽或OMP106-衍生多肽编码序列同源的序列作探针，通过核酸杂交可以检测插入在表达载体中的外源基因的存在。在第二种方法中，基于外源基因插入载体产生的某些“标记物”基因功能(例如，胸苷激酶活性、抗生素抗性、转化表型、在杆状病毒中的内含体形成等)的存在或缺乏，可以鉴定及选择所述重组载体/宿主系统。例如，假如所述OMP106多肽或OMP106-衍生多肽编码序列插入在载体的标记物基因序列中，那么由缺乏所述标记物基因功能可以鉴定含有所述插入片段的重组体。在第三种方法中，通过检测由所述重组体表达的外源基因产物可以鉴定重组表达载体。这类检测可以基于例如，在体外检测系统中的OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的物理特性或功能特性，例如结合到OMP106配体或受体，或者与本发明的抗-OMP106抗体结合，或者宿主细胞使血凝集的功能或者细胞提取物干扰由卡他摩拉克菌引起的血凝集的能力。
一旦特定的重组DNA分子鉴定及分离，可以用本领域已知的几种方法繁殖它。在合适的宿主系统及生长条件建立后，能够繁殖且大量制备重组表达载体。如以上所解释的，能够应用的表达载体包括(但不限于)下面的载体或其衍生物：诸如牛痘病毒或腺病毒的人或动物病毒；诸如杆状病毒的昆虫病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如λ)及质粒和粘粒DNA载体，仅举几个例子。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以所需要的具体方式修饰及加工所述基因产物的宿主细胞株。可以在某些诱导物存在的情况下提高得自某些启动子的表达；因此，可以控制所述基因工程的OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的表达。而且，不同宿主细胞具有蛋白质翻译及翻译后的加工和修饰的特征性及特异性机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以保证表达的外源蛋白的所需修饰及加工。
5.9. 试剂
本发明的多肽、肽、抗体及核酸作为卡他摩拉克菌感染的临床或医疗疹断试剂和作为科学研究卡他摩拉克菌的致病性、毒力、感染性以及宿主防御机制的试剂是有用的。例如，本发明的DNA和RNA可以用作探针，以通过杂交或PCR扩增鉴定生物样品中卡他摩拉克菌的存在。所述DNA和RNA也可以用来鉴定可以编码与所述卡他摩拉克菌OMP106相关多肽的其它细菌。
本发明的多肽和肽可以用来制备多克隆和单克隆抗体，所述抗体可以用来经亲和层析进一步纯化含有本发明多肽的组合物。所述多肽和肽也能够用于标准免疫检测中，以在样品中存在的抗卡他拉克菌的抗体方面进行筛选。
应该理解的是，根据包含在本文中的内容，本发明的内容在具体问题或环境上的应用将在本领域普通技术人员的能力范围内。本发明的产物的例子及其制剂的加工和用途呈现在下面的实施例中。
6. 实施例：菌株ATCC 49143或其它菌株的OMP106多肽和及其编 码基因的分离和特征鉴定
6.1. 材料与方法
6.1.1. 血凝集检测
如Sato-Hernandez等(J.Clin.Microbiol.27：903-908)所述检测由卡他摩拉克菌引起的血凝集，只是在玻片凝集检测中使用5％而不是3％(v/v)的红细胞。最初是采用20μg的细菌细胞(湿重)进行血凝集检测。由于在35℃下生长在血琼脂板上的卡他摩拉克菌ATCC菌株49143引起强血凝集反应，就选择它作为参考菌株。以1∶2稀释度连续稀释ATCC菌株49143结果使血凝反应降低。结果记为+++至+是基于连续1∶2稀释后观察到的由ATCC菌株引起的血凝集反应，这样用获得+++反应所需要的细胞数的1/4产生+反应。
6.1.2. 血凝集反应的抑制
以1∶2连续稀释卡他摩拉克菌ATCC 49143细胞悬液，并且将当使用7μl Dulbecco氏磷酸缓冲盐溶液和7μl 5％(v/v)人O+红细胞时产生+血凝反应的稀释细胞悬液，用来检测单糖及糖衍生物对血凝反应的抑制。为了确定单糖或糖衍生物能否抑制由卡他摩拉克菌引起的血凝集反应，7μl 500mM某一给定糖与7μl卡他摩拉克菌混合并温育5分钟，以允许该糖与细胞相互作用。然后加入7μl 5％(v/v)人O+红细胞，并在1分钟之后记录血凝集。检测每一种糖和糖衍生物抑制血凝集的能力。之后，以1∶2连续稀释每一种糖和糖衍生物贮液，并且采用上述方法检测这些稀释液抑制血凝集的能力。以这种方式确定抑制血凝集所需要的最小碳水化合物浓度。
6.1.3. 配体与受体的结合
按照Magnani等(1982，J.Biol.Chem.257：14365-14369)所述方法，采用宿主细胞糖脂的薄层层析(TLC)分级分离部分和层析谱的标记细胞上层，检测卡他摩拉克菌与动物细胞糖脂受体的结合。简单地说，在氯仿、甲醇、水(5∶4∶1)中的高效薄层层析板(HPTLC)上分析得自Matreya Inc.(Pleasant Gap，PA)的糖脂。所述层析板或者于100℃用地衣二酚染色，或者用如前所述(Murphy和Loeb，1989，MicrobialPathogen.6：159-174)的制备的125I-标记的2×106cpm/ml的卡他摩拉克菌覆盖2小时。然后冲洗所述层析板5次，干燥后对X-光片曝光。
6.1.4  OMP的OG提取物
各种卡他摩拉克菌菌株在35℃、200rpm下各自培养在4升烧瓶中的1升Mueller Hinton肉汤中。通过用0.67ml 1.25％正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(即辛基葡糖苷；OG)的磷酸缓冲盐溶液在室温下处理50mg细胞(湿重)30分钟，分离外膜蛋白(OMP)制剂。细胞在微型离心机中离心5分钟后进行沉淀，而上清液用作辛基葡糖苷提取物。比较从许多卡他摩拉克菌菌株到通过差速离心分离的这些大囊泡(即外膜囊泡)的这些提取物的蛋白质型，它们高度富含卡他摩拉克菌外膜蛋白(OMPs)(Murphy和Loeb，1989，Microbial Pathogen.6：159-174)，表明辛基葡糖苷提取物主要含有卡他摩拉克菌外膜蛋白(图1)。这表明，与由大囊泡制备的外膜蛋白比较，辛基葡糖苷提取提供了一种外膜蛋白更高产率的更快速的方法。
6.1.5  OMP106的蛋白酶解消化
在1ml Dulbecco氏磷酸缓冲盐溶液中的得自ATCC菌株49143的50mg细胞于室温下用蛋白酶消化1个小时，所述蛋白酶如下：TLCK处理的胰凝乳蛋白酶(5mg)、蛋白酶K(5mg)、TPCK处理的胰蛋白酶(5mg)或蛋白酶V8(100单位)。所有蛋白酶均从Sigma Chemicals(St.Louis，MO)获得。在所述蛋白酶处理后，立即将细胞在PBS中洗涤一次并再悬浮在1ml PBS中，检测血凝集活性。此外，用辛基葡糖苷抽提蛋白酶处理的细菌细胞，这样能够溶解外膜蛋白以鉴定可能已被所述蛋白酶消化的特异性蛋白。
6.1.6. 非血凝集品种
一般来说，血凝集性卡他摩拉克菌培养物在含Mueller Hinton肉汤的摇瓶中在35-37℃、200rpm的条件下生长24-48小时。直接得自血琼脂平板或Mueller Hinton培养基的琼脂板的细胞也表现出所述血凝集表型。为了选择非血凝集性(NHA)品种，在35℃生长于MuellerHinton肉汤中生长的静止培养物中每5天连续传代ATCC菌株49143。对于每次传代，只从所述肉汤培养物的表面获取接种物。到第2次传代时，已生长细胞漂浮层，而这层细胞用作后续培养的接种物。以这种方式连续培养，通常在三次传代后产生ATCC 49143的NHA品种。
6.1.7. 分离OMP106多肽
只在所述提取物已在100℃温育5分钟后，才能在变性的凝胶中检测到(例如，用银染色或抗-OMP106抗体)得自卡他摩拉克菌ATCC49143的外膜提取物中的OMP106多肽。为了确定在100℃温育后出现的OMP106带是否为煮沸过程中低分子量的蛋白凝集的结果，或者是否煮沸使通常凝集的蛋白进入凝胶，因此，在天然聚丙烯酰胺凝胶上分析ATCC 49143的未经煮沸的辛基葡糖苷外膜提取物。切取并煮沸包括紧靠样品孔下方的凝胶的特定区域的凝胶。然后，将产生的样品在变性的聚丙烯酰胺凝胶上分离，并用银染色剂(Silver Stain P1us，分类目录号161-0449，BioRad Laboratories，Richmond，CA)染色。对于N-末端的序列分析，将ATCC 49143的辛基葡糖苷外膜提取物与含有SDS的PAGE样品缓冲液混合，并在沸水浴中温育5分钟。然后，将所述蛋白在含有SDS的12％PAG上分离，且用电印迹法转移到PVDF膜上。随后，切取含有所述OMP106带的膜部分用于氨基末端序列分析。用来分离所述OMP106多肽的PAGE方法之中没有一种在样品缓冲液或凝胶缓冲液中使用还原剂。
6.1.8. 抗OMP106抗血清
通过如前所述(Lammeli，1970，Nature 227：680-685)在变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中分离得自ATCC 49143的HA品种的OMP106多肽，且从凝胶中切取含OMP106的带，制备抗OMP106的抗血清。将切取的凝胶带离析并注射到兔中，以产生抗OMP106的抗体。如在前面的6.1.2小节中所述的，该抗血清用来抑制血凝集，但是用该抗血清代替所述碳水化合物。如在第7小节中所述的，也检查该抗血清的抗卡他摩拉克菌的补体介导的胞毒活性。
6.1.9 用抗-OMP106抗血清的蛋白质印迹法
卡他摩拉克菌ATCC 49143、ATCC 43628、ATCC 43627、ATCC 43618、ATCC 43617、ATCC 25240、ATCC 25238及ATCC8176；羊摩拉克菌ATCC 33078、腔隙摩拉克菌ATCC 17967；牛摩拉克菌ATCC 10900；奥斯陆摩拉克菌ATCC 10973；淋病奈瑟菌(临床分离菌)；以及脑膜炎奈瑟菌ATCC 13077在巧克力琼脂平板上于35℃、5％CO2中生长48小时。用聚苯乙烯接种环从琼脂表面刮擦菌落取出细胞。然后，在150μl PAGE样品缓冲液(360mM Tris缓冲液[pH8.8]，其中含4％十二烷基硫酸钠及20％甘油)中悬浮30μg细胞，并在100℃温育该悬浮液5分钟，从而使细胞溶解。如Laemmli所述，在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离溶解的细胞，而且如前所述(Thebaine等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：4350-4354)在100伏特电泳转移1.5小时使所分离的蛋白转移到PVDF膜上，只是将0.05％十二烷基硫酸钠加到转移缓冲液中，以促进蛋白质从凝胶移动转移。之后，用25ml含0.5％酪蛋白钠、0.5％牛血清白蛋白和1％山羊血清的Dulbecco氏磷酸缓冲盐溶液预处理所述PVDF膜。用这种预处理缓冲液进行所有随后的温育。
PVDF膜与25ml的免疫前兔血清或用OMP106多肽免疫的兔的血清(如上所述)的1∶500稀释液在室温下温育1小时。然后用洗涤缓冲液(20mM Tris缓冲液[pH7.5]，其中含150mM氯化钠及0.05％吐温-20)洗涤PVDF膜两次。PVDF膜与25ml过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove Penn.分类目录号111-035-003)的1∶5000稀释液在室温下温育30分钟。随后用洗涤缓冲液洗涤PVDF膜4次，用Sigma化学公司(St.Louis，Mo.分类目录号D-4418)供应的3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐及过氧化脲显色，每次显色4分钟。
6.1.10. 细胞表面的抗-OMP106免疫荧光染色
卡他摩拉克菌ATCC 49143在Mueller Hinton肉汤中于35℃的振动水浴中生长过夜。离心使细胞沉淀，之后将细胞再悬浮在等体积的不含钙或镁的Dulbecco氏改良磷酸缓冲盐溶液(PBS/MC)中。将20μl该细胞悬液分别涂到5张洁净分显微镜载玻片上。在沉降10秒钟后，用微量加液器吸去多余的流体，并让载玻片空气干燥1小进。然后将该载体置于开放框架之上热固定，直到玻璃温至可以触摸为止。开始，用40μl抗-OMP106抗血清或得自同一动物的免疫前血清在PBS/MC或PBS/MC中稀释的1∶40稀释液，处理所述载玻片10分钟，然后用PBS/MC洗涤5次。用40μl的5μg/ml PBS/MC的抗兔IgG的异硫氰酸荧光素标记的山羊抗体(Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc，Gaithersburg，MD分类目录号02-15-06)处理所述载玻片。所述载玻片在黑暗中温育10分钟并在PBS/MS中洗涤5次。每一载玻片在盖玻下用PBS/MS覆盖后保藏，用配有489nm滤光片的荧光显微镜观察。对每一样品肉眼检查5个视野以评价染色程度。
6.2. 结果
6.2.1. 血凝集活性
卡他摩拉克菌对于红细胞的血凝集活性是种特异性的，且用人红细胞观察到最强的活性。兔红细胞也被卡他摩拉克菌凝集，但程度显著低于人红细胞。小鼠、马或羊红细胞不被凝集(参见表1)。
表1：用卡他摩位克菌ATCC 49143引起不同物种红细胞的血凝集强度
红细胞来源人兔小鼠马羊              血凝集结果 a++++++---
a++++＝最强凝集反应，-示无凝集反应
6.2.2. OMP106多肽和配体
卡他摩拉克菌血凝集活性是由于结合到红细胞(Gb4)。得自血凝集性菌株的大囊泡结合到具有Gb4的糖脂上，而非血凝集性菌株不结合相同糖脂上(参见图2)。卡他摩拉克菌血凝集活性受Gb4的单糖组分或这类单糖衍生物的抑制，而最有效的抑制剂是N-乙酰半乳糖胺和半乳糖(尤其是所述半乳糖的α异头物)(参见表2)。
表2：抑制卡他摩拉克菌引起的血凝集所需要的最小糖浓度(MIC)
糖D-葡萄糖D-甘露糖D-半乳糖L-岩藻糖N-乙酰-D-葡萄糖胺N-乙酰-D-半乳糖胺甲基-α-葡萄糖甲基-α-甘露糖甲基-α-半乳糖甲基-β-半乳糖               MIC(mM) *＞167834183＞16741＞1671671083
*抑制由卡他摩拉克菌ATCC 49143与5％洗涤的人O+红细胞的1个+的血凝集所需要的最小糖浓度。
N-乙酰半乳糖胺和α-半乳糖二者均是所述Gb4四糖的组成部分。血凝集与结合Gb4之间的关系以及血凝集受构成Gb4受体的单糖抑制的观察，提示卡他摩拉克菌细胞结合到四糖Gb4。这种四糖存在于人红细胞及组织上，且能够介导卡他摩拉克菌附着到真核细胞膜上。
6.2.3. OMP106多肽的鉴定
蛋白酶解消化卡他摩拉克菌细胞，继之分析所消化细胞引起的血凝集，证实用胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K蛋白酶处理破坏血凝集活性，而用胰蛋白酶处理部分破坏务凝集反应活性，表明血凝集活性是蛋白质介导的。分析蛋白酶消化的卡他摩拉克菌细胞的OMP蛋白质型表明，在每一样品中多种蛋白质已降解，因此，蛋白质型不能提供哪种蛋白质直接引起或间接作用于血凝集活性的线索(参见图3)。
因为蛋白酶处理表明多肽直接或间接负责血凝集活性，所以我们用SDS-PAGE来比较血凝集性菌株的OMP型与非血凝集性菌株的OMP型(图4)。分析这些蛋白质型间的不同表明，所述血凝集性菌株具有两种独特的多肽，一种的表观分子量为27kD(命名为OMP27)，而另一种是唯一的表观分子量大于106kD的蛋白质(命名为OMP106)。值得注意的是，在蛋白酶处理过的血凝集活性降低或无血凝集活性的细胞的OMP制剂中缺乏所述OMP106多肽带，而在蛋白酶K处理过的无血凝集活性的细胞的OMP制剂中存在所述OMP27带。此外，所述OMP106多肽带不被蛋白酶V8消化降解，蛋白酶V8消化不影响所处理细胞的血凝集活性。
6.2.4. NHA品种的OMP型
于35℃在静止培养中连续培养ATCC 49143的NHA品种，到该培养物的第三代时产生NHA品种(命名为49143-NHA)。这种所述血凝集活性的丧失是可重复的。分析所述HA和NHA品种的OG外膜提取物的OMP型，表明所述49143-NHA提取物缺失所述OMP106多肽带(图5)。这提示OMP106多肽是卡他摩拉克菌的血凝素(即，OMP106多肽结合Gb4受体或者是结合Gb4受体的同聚蛋白的亚基)或者构成卡他摩拉克菌血凝素的部分(即，OMP106多肽是结合Gb4受体的异聚蛋白的亚基)。
6.2.5. OMP106与血凝集
针对ATCC 49143 OMP106多肽产生的多克隆抗血清中和由ATCC 49143产生的血凝集以及由异种ATCC 43627产生的血凝集。这进一步支持这样的结论：卡他摩拉克菌的血凝集活性包括OMP106多肽，并且在种种菌株中OMP106是抗原保守的。也参见图9A，该图表明在多克隆抗血清中的抗体结合异种卡他摩拉克菌株的OMP106多肽。
6.2.6. OMP106的外表面定位
兔抗-OMP106抗血清用于间接免疫荧光染色，以确定OMP106多肽是否暴露在卡他摩拉克菌细胞的外表面。用抗-OMP106抗血清处理卡他摩拉克菌细胞较用免疫前血清或PBS/MC处理细胞染色更强、更均一。这表明在完整的卡他摩拉克菌细胞中，OMP106多肽是可与抗-OMP106抗体反应的。该结果表明OMP106多肽暴露在卡他摩拉菌的外表面。此发现与OMP106在血凝集中具有作用是一致的，而且表明OMP106多肽作为疫苗是有用的。
6.2.7. OMP106多肽的特性
OMP106在其天然状态作为大蛋白质复合物存在，或者当用辛基葡糖苷提取时产生凝集。该结论得到以下发现的支持，即用辛基葡糖苷提取卡他摩拉克菌细胞会增溶OMP106多肽，但是，所提取的OMP106多肽不进入变性的PAG中，除非该提取物首先在100℃温育(图6)。而且，所述OMP106多肽带似乎不是由加热时聚合或聚集的低分子量多肽形成的，因为在非热变性的样品中在样品孔中捕获到OMP106，且只有当该样品首先在100℃温育后才进入分离胶中。这一生化持性对鉴定各种凝胶中的OMP106多肽非常有用。
采用卡他摩拉克菌的辛基葡糖苷提取物，然后在100℃温育该提取物和十二烷基硫酸钠，以及在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离所述蛋白质，我们已估测得自卡他摩拉克菌各种菌株尤其是菌株ATCC 25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC43628的OMP106多肽的表观分子量范围为约180kD至230kD(图9A)，而菌株ATCC 49143的OMP106多肽似乎具有约190kD的表观分子量(图6)。
从凝胶片提取菌株ATCC 49143的OMP106多肽并对其N端进行序列分析。序列分析表明得自ATCC 49143外膜的OMP106多肽的N端是IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQ ID NO：1)。此外，已分离由Lys-C消化产生的OMP106的内部肽(Fernandez等，1994，Anal Biochem 218：112-117)，且已确定其序列顺序是GTVLGGKK(SEQ ID NO：2)。
我们制备3种寡核苷酸探针。2种探针与内部肽GTVLGGKK相对应，一种探针具有如下序列GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR(SEQ ID NO：3)，另一种具有如下序列GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR(SEQ ID NO：7)。另一探针Mc 5-72编码OMP106(SEQ ID NO：1)的氨基端序列的内部片段(SEQ ID NO：5)，该探针具有如下序列顺序GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA(SEQ ID NO：4)。在Southern印迹法分析中，Mc 5-72探针与卡他摩拉克菌DNA的HindIII或PraI完全消化物杂交，在每种情况下都产生单一的条带(图7)。在HindIII消化物中的杂交带大小约为8.0kb；在DraI消化物中的杂交带约为4.2kb大小(图7)。
6.2.8. OMP106多肽的保守性
若干卡他摩拉克菌菌株和相关种的细菌的外膜蛋白提取物的蛋白质印迹法分析表明，所述抗-OMP106抗体结合到许多卡他摩拉克菌菌株(包括HA和NHA两类菌株或品种)中的约180kD到约230kD的多肽(图9A)。所述抗-OMP106抗体不结合相关细菌的蛋白提取物中的任何多肽(图8A)。这些结果表明如下：1)抗-OMP106抗体可以用来特异性地鉴定和区别卡他摩拉克菌和相关种的细菌。2)OMP106多肽可以用来产生诊断性用于鉴定卡他摩拉克菌的抗体。3)针对一种菌株的OMP106多肽(例如，ATCC 49143的OMP106)的抗体可以用来鉴定和分离其它卡他摩拉克菌菌株的对应OMP106多肽。有趣的是，所述蛋白质印迹法结果表明，许多NHA卡他摩拉克菌菌株在其外膜的OG提取物中具有OMP106多肽。在PAGE后，得自NHA卡他摩拉克菌菌株的OG外膜提取物的OMPs的银染在180kD-230kD范围内不出现带，这一发现和所述事实表明，OMP106多肽由大多数卡他摩拉克菌菌株或品种表达，但是，为了在血凝集中是有活性的(即，结合到哺乳动物细胞表面的受体)或是可银染色的，所述OMP106多肽必须以某种方式适当第地修饰。显然，只有HA菌株和品种能够适当修饰OMP106多肽，因此，它能够介导细菌结合到哺乳动物细胞表面上的血凝素受体上。
7. 实施例：OMP106疫苗的效能：抗-OMP106抗血清的胞毒活性
检查抗-OMP106抗体的补体介导的胞毒活性，以确定OMP106多肽的疫苗潜能。如在前面的6.1.8.小节中所述，制备抗ATCC 49143的HA品种的OMP106多肽的抗血清。采用Zollinger等所述的“血清杀菌试验”(对脑膜炎奈瑟菌的免疫应答，载于临床实验室免疫学操作指南，第3版，第347-349页中)检查在介导补体杀伤卡他摩拉克菌中的所述免疫前血清和抗OMP106抗血清的活性，只是用HA和NHA卡他摩拉克菌菌株或品种的细胞替代脑膜炎奈瑟菌细胞。
所述结果表明，抗-OMP106抗血清介导补体杀伤异种卡他摩拉克菌ATCC 43627的HA品种，而不杀伤卡他摩拉克菌ATCC 43627的NHA品种或NHA卡他摩拉克菌ATCC 8176。表3概括了针对ATCC43627的HA品种的免疫前血清和抗-OMP106抗血清的补体介导的胞毒活性。
表3：免疫前血清和抗-OMP106抗血清的补体介导的胞毒活性
实验1实验2         细胞毒性效价 1
    免疫前168   抗-OMP10612864
1该效价为血清能够介导补体杀伤ATCC 43627的HA品种的最高稀释度(例如，16代表血清的16倍稀释度)，数字愈大，胞毒活性或效价愈高。
如表3所示，所述抗-OMP106抗血清的胞毒活性较所述免疫前血清高8倍。这一发现表明，OMP106多肽作为抗HA卡他摩拉克菌菌株及品种的疫苗是有用的。
尽管参考其具体实施方案详细描述了本发明，应该理解，功能上相同的各种变化在本发明的范围内。实际上，除了本文所表明和描述的这些实施方案之外，根据前面的描述和附图对于本领域技术人员来说本发明的各种修改是显而易见的。这类修改预定在所附的权利要求书范围内。
本文引用了各种出版物，其说明书通过引用整个结合到本文中。
                             序列表
(1)一般资料
(i)申请人：
   TUCKER，KENNETH
   PLOSILA，LAURA
(ii)发明名称：卡他摩拉克菌外膜蛋白-106多肽及其基因序列和
              用途
(iii)序列数：8
(iv)通信地址：
    (A)收信人：PENNIE & EDMONDS
    (B)街道：1155 Avenue of the Americas
    (C)城市：纽约
    (D)州：纽约州
    (E)国家：美国
    (F)邮政编码：10036-2711
(v)计算机可读形式
   (A)媒体类型：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本1.30
(vi)当前申请数据
    (A)申请号：US
    (B)提交日期：
    (C)分类：
(viii)代理律师/代理人资料
   (A)姓名：Baldwin，Geraldine F.
   (B)注册号：31,232
   (C)参考/档案号：7969-045
(ix)电讯资料
   (A)电话：(212)790-9090
   (B)传真：(212)869-8864
      (C)电报：66141 PENNIE
(2)SEQ ID NO：1的信息：
    (i)顺序特征：
       (A)长度：43个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (C)链型：
       (D)拓扑学：未知
(ii)分子类型：肽
(xi)顺序描述：SEQ ID NO：1：
Ile Gly Ile Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg
1               5                   10                  15
Gly Asp Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln Ala Leu Gly Ser
            20                  25                  30
Gln Ser Ile Ala Ile Gly Asp Asn Lys Ile Val
        35                  40
(2)SEQ ID NO：2的信息：
    (i)顺序特征：
       (A)长度：8个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (C)链型：
       (D)拓扑学：未知
(ii)分子类型：肽
(v)片段类型：内部的
(xi)顺序描述：SEQ ID NO：2：
Gly Thr Val Leu Gly Gly Lys Lys
1               5
(2)SEQ ID NO：3的信息：
     (i)顺序特征：
        (A)长度：24个碱基对
          (B)类型：核酸
          (C)链型：未知
          (D)拓扑学：未知
      (ii)分子类型：其它核酸
          (A)描述：/desc＝“探针”
      (xi)顺序描述：SEQ ID NO：3：
GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR                                            24
(2)SEQ ID NO：4的信息：
     (i)顺序特征：
        (A)长度：72个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑学：未知
     (ii)分子类型：DNA(基因组)
     (ix)特征：
         (A)名称/关键词：CDS
         (B)位置：1...72
     (xi)顺序描述：SEQ ID NO：4：
GAA GCG GAC GGG GGG AAA GGC GGA GCC AAT GCG CGC GGT GAT AAA TCC        48
Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser
  1               5                  10                  15
ATT GCT ATT GGT GAC ATT GCG CAA                                        72
Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln
             20
(2)SEQ ID NO：5的信息：
     (i)顺序特征：
        (A)长度：24个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑学：线性
     (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)顺序描述：SEQ ID NO：5：
Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser
  1               5                  10                  15
Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln
             20
(2)SEQ ID NO：6的信息：
     (i)顺序特征：
        (A)长度：24个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：未知
        (D)拓扑学：未知
     (ii)分子类型：其它核酸
         (A)描述：/desc＝“探针”
     (xi)顺序描述：SEQ ID NO：6：
YTTYTTNCCN CCNAGNACNG TNCC                                            24
(2)SEQ ID NO：7的信息：
     (i)顺序特征：
        (A)长度：24个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：未知
        (D)拓扑学：未知
     (ii)分子类型：其它核酸
         (A)描述：/desc＝“探针”
     (xi)顺序描述：SEQ ID NO：7：
GGNACNGTNT TRGGNGGNAA RAAR                                            24
(2)SEQ ID NO：8的信息：
     (i)顺序特征：
           (A)长度：24个碱基对
           (B)类型：核酸
           (C)链型：未知
           (D)拓扑学：未知
       (ii)分子类型：其它核酸
          (A)描述：/desc＝“探针”
       (v)片段类型：N-末端
       (xi)顺序描述：SEQ ID NO：8：
YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC                                            24

Claims (18)

1.一种分离后的OMP 106多肽，它是卡他摩拉克菌的外膜多肽，在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有大约180KD至大约230KD的分子量，其中采用兔骨骼肌肌球蛋白和大肠杆菌β-半乳糖苷酶分别作200KD和116.25KD分子量标准，另外它包括SEQ ID NO：1的序列，或SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列。
2.权利要求1的所述OMP 106多肽，它包括SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的序列
3.权利要求1或2的所述OMP 106多肽，它具有大约190KD的分子量。
4.权利要求1或2的所述OMP 106多肽，它是选自ATCC 25238、ATCC25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627、ATCC 43628及ATCC 49143的卡他摩拉克菌菌株的外膜多肽。
5.权利要求1或2的所述OMP 106多肽，所述卡他摩拉克菌菌株是ATCC 49143。
6.权利要求1或2的所述OMP 106多肽，其中所述卡他摩拉克菌是血凝集反应培养物。
7.权利要求1或2的所述OMP 106多肽，它与银染色剂发生反应。
8.一种分离后的抗体，它特异性结合权利要求1-7中任一项的所述OMP 106多肽。
9.权利要求8的所述分离后的抗体，它是介导补体杀死卡他摩拉克菌的细胞毒抗体。
10.权利要求1-7中任一项的所述OMP 106多肽的免疫原性肽片段，它特异性结合到特异性结合所述OMP 106多肽的抗体。
11.一种疫苗，它包括权利要求1-7中任一项的任何的所述OMP106多肽。
12.一种抗原性组合物，它包括权利要求1-7中任一项的所述OMP 106多肽。
13.一种抗原性组合物，它包括权利要求10的所述肽片段。
14.一种分离后的DNA，它包括编码权利要求1-7中任一项的所述OMP 106多肽的核苷酸序列。
15.一种分离后的编码OMP 106多肽的DNA，它包括在高度严格条件下杂交到SEQ ID NO：4的序列或SEQ ID NO：4的序列的互补序列的核苷酸序列，其中所述高度严格条件包括在2×SSC、1％SDS中于50℃最终洗涤30分钟。
16.权利要求1-7中任一项的多肽在制备用于治疗或预防卡他摩拉克菌感染的药物中的用途。
17.权利要求8或9的抗体在制备用于治疗或预防卡他摩拉克菌感染的药物中的用途。
18.权利要求14的DNA在制备用于鉴定和诊断卡他摩拉克菌感染的药物中的用途。
CNB971959900A 1996-05-03 1997-04-28 卡他摩拉克菌外膜蛋白－106多肽及其基因序列和用途 Expired - Fee Related CN1222618C (zh)

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Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6335018B1 (en) * 1995-05-01 2002-01-01 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US6440425B1 (en) * 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US7341727B1 (en) * 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
AUPO652897A0 (en) 1997-04-30 1997-05-29 University Of Melbourne, The Synthetic peptide constructs for the diagnosis and treatment of periodontitis
GB9714276D0 (en) * 1997-07-08 1997-09-10 Univ Dundee Peptides and related compounds
US8129500B2 (en) 1997-12-10 2012-03-06 Csl Limited Porphyromonas gingivalis polypeptides and nucleotides
GB9808720D0 (en) * 1998-04-23 1998-06-24 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9810084D0 (en) 1998-05-11 1998-07-08 Cortecs Uk Ltd Proteins
US6627728B1 (en) 1998-05-12 2003-09-30 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Compounds from moraxella catarrhalis
GB9810193D0 (en) * 1998-05-12 1998-07-08 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9810285D0 (en) 1998-05-13 1998-07-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US6541616B1 (en) 1998-10-01 2003-04-01 Antex Biologics Inc. Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof
WO2000056360A2 (en) 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against antigens from bacteriae
US6673910B1 (en) 1999-04-08 2004-01-06 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to M. catarrhalis for diagnostics and therapeutics
ES2306662T3 (es) * 1999-05-24 2008-11-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Nuevos compuestos de moraxella catarrhalis.
GB9915031D0 (en) * 1999-06-25 1999-08-25 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9921691D0 (en) 1999-09-14 1999-11-17 Smithkline Beecham Sa Novel compounds
ATE368686T1 (de) * 1999-09-14 2007-08-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Polypeptide aus moraxella (branhamella) catarrhalis
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB0103171D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
SE0102410D0 (sv) * 2001-07-04 2001-07-04 Arne Forsgren Novel surface exposed immunoglobulin D-binding protein from moraxella catarrhalis
EP1961427A3 (en) 2002-08-02 2009-11-04 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Neisserial vaccine compositions comprising a combination of antigens
IL308456A (en) 2005-04-08 2024-01-01 Wyeth Llc A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation
CN100357318C (zh) * 2005-10-11 2007-12-26 中山大学 美人鱼发光杆菌外膜蛋白w和编码序列及其制备方法和应用
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP3020411A1 (en) 2005-12-22 2016-05-18 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Vaccine
EA015561B1 (ru) 2006-01-17 2011-08-30 Арне Форсгрен НОВЫЙ ПОВЕРХНОСТНЫЙ БЕЛОК HAEMOPHILUS INFLUENZAE (БЕЛОК E; pE)
JP2009544279A (ja) * 2006-06-27 2009-12-17 オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド 歯周病の予防に有用なポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチド
WO2009000825A2 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
US20100297179A1 (en) 2007-07-12 2010-11-25 Stuart Geoffrey Dashper Immunology Treatment for Biofilms
US8241611B2 (en) 2007-07-12 2012-08-14 Oral Health Austrailia Pty. Ltd. Biofilm treatment
US8642046B2 (en) * 2007-10-09 2014-02-04 Tufts University Cholera vaccines
KR101721904B1 (ko) 2008-08-29 2017-04-11 오럴 헬스 오스트레일리아 피티와이 엘티디 Ｐ．진지발리스 감염의 예방, 치료 및 진단
US8140041B2 (en) * 2009-08-27 2012-03-20 Mediatek Inc. Tunable capacitive device with linearization technique employed therein
ES2366735B1 (es) * 2009-10-08 2012-09-13 Fundación Pública Andaluza Para La Gestión De La Investigación En Salud De Sevilla Vacuna frente a acinetobacter baumannii.
US9855735B2 (en) 2009-11-23 2018-01-02 Cyvek, Inc. Portable microfluidic assay devices and methods of manufacture and use
EP2504701B1 (en) 2009-11-23 2017-09-13 Cyvek, Inc. Method and apparatus for performing assays
US9759718B2 (en) 2009-11-23 2017-09-12 Cyvek, Inc. PDMS membrane-confined nucleic acid and antibody/antigen-functionalized microlength tube capture elements, and systems employing them, and methods of their use
US10022696B2 (en) 2009-11-23 2018-07-17 Cyvek, Inc. Microfluidic assay systems employing micro-particles and methods of manufacture
US10065403B2 (en) 2009-11-23 2018-09-04 Cyvek, Inc. Microfluidic assay assemblies and methods of manufacture
US9500645B2 (en) 2009-11-23 2016-11-22 Cyvek, Inc. Micro-tube particles for microfluidic assays and methods of manufacture
US9700889B2 (en) 2009-11-23 2017-07-11 Cyvek, Inc. Methods and systems for manufacture of microarray assay systems, conducting microfluidic assays, and monitoring and scanning to obtain microfluidic assay results
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
GB201003924D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
CN102869378A (zh) 2010-03-10 2013-01-09 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
EA201690310A1 (ru) 2010-04-13 2016-12-30 Селлдекс Терапьютикс Инк. Антитела, связывающие cd27 человека, и их применение
WO2011137334A1 (en) * 2010-04-30 2011-11-03 The Research Foundation Of State University Of New York Compositions and methods for stimulating immune response against moraxella catarrhalis
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
CN106552682B (zh) 2011-03-22 2020-06-19 西维克公司 微流体装置以及制造方法和用途
RU2481401C2 (ru) * 2011-07-15 2013-05-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ГОУ ВПО УГМА Минздравсоцразвития России) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ β-ЛАКТАМАЗОПРОДУЦИРУЮЩИХ ОКСИДАЗОПОЗИТИВНЫХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ДИПЛОКОККОВ, ПОДОЗРИТЕЛЬНЫХ НА ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ К MORAХELLA (BRANCHAMELLA) CATARRHALIS
KR102070469B1 (ko) 2012-03-08 2020-01-28 싸이벡, 아이엔씨 미세유체 분석 어셈블리 및 제조방법
US11210432B2 (en) * 2013-08-20 2021-12-28 Janus Technologies, Inc. Method and apparatus for selectively snooping and capturing data for secure computer interfaces
EP3268037B1 (en) 2015-03-09 2022-08-31 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US10228367B2 (en) 2015-12-01 2019-03-12 ProteinSimple Segmented multi-use automated assay cartridge
US20200377606A1 (en) 2016-04-18 2020-12-03 Celldex Therapeutics, Inc. Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof
GB201621686D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for inducing an immune response
BR112019025193A2 (pt) 2017-05-30 2020-06-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Métodos de fabricação de um adjuvante lipossomal, de fabricação de um concentrado lipossomal, para a preparação de uma composição imunogênica com adjuvante e para a preparação de uma solução, adjuvante lipossomal, composição imunogênica com adjuvante, e, solução
JP2021504424A (ja) 2017-12-01 2021-02-15 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム サポニン精製
MX2020010913A (es) 2018-04-17 2021-01-08 Celldex Therapeutics Inc Anticuerpos anti-cd27 y anti-pd-l1 y constructos biespecíficos.
BR112021000965A2 (pt) 2018-08-07 2021-04-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. processos e vacinas
CN111157735B (zh) * 2018-11-07 2023-02-07 广州万孚生物技术股份有限公司 凝集性卡他莫拉菌单克隆抗体及其制备方法和应用
US20220339282A1 (en) 2018-11-29 2022-10-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Methods for manufacturing an adjuvant
WO2020123444A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy
EP3980044A1 (en) 2019-06-05 2022-04-13 GlaxoSmithKline Biologicals SA Saponin purification
CN111778226B (zh) * 2020-07-21 2022-04-05 东北师范大学 一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白及其应用
WO2022217019A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Celldex Therapeutics, Inc. Antibodies against ilt4, bispecific anti-ilt4/pd-l1 antibody and uses thereof
WO2023077521A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Celldex Therapeutics, Inc Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs
GB202205833D0 (en) 2022-04-21 2022-06-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bacteriophage
WO2024017827A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Continuous process for vaccine production

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4675176A (en) * 1983-12-12 1987-06-23 Norden Laboratories Moraxella bovis protease vaccine
US4879213A (en) * 1986-12-05 1989-11-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse
US5552146A (en) * 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
US5607846A (en) 1994-05-17 1997-03-04 Research Foundation Of State University Of New York Vaccine for moraxella catarrhalis
US6335018B1 (en) * 1995-05-01 2002-01-01 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US7341727B1 (en) * 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
GB9809683D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9812163D0 (en) 1998-06-05 1998-08-05 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds

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Publication number Publication date
BG102983A (en) 2000-05-31
SK284812B6 (sk) 2005-12-01
EE9800373A (et) 1999-04-15
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SK150998A3 (en) 1999-05-07
HK1021299A1 (en) 2000-06-09
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NO324816B1 (no) 2007-12-10
US7341727B1 (en) 2008-03-11
US7914795B2 (en) 2011-03-29
JP4401437B2 (ja) 2010-01-20
NZ332896A (en) 2000-05-26
CN1223549A (zh) 1999-07-21
JP2000510696A (ja) 2000-08-22
EP0900025B1 (en) 2003-07-02
NO985113D0 (no) 1998-11-02
BR9711090A (pt) 1999-08-17
DE69723254T2 (de) 2004-04-22
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UA68332C2 (en) 2004-08-16
ZA973809B (en) 1997-12-01
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JP2008161194A (ja) 2008-07-17
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BG64832B1 (bg) 2006-06-30
US20080145916A1 (en) 2008-06-19
US6214981B1 (en) 2001-04-10
US20100021492A1 (en) 2010-01-28
DE69723254D1 (de) 2003-08-07
WO1997041731A1 (en) 1997-11-13
US20070087019A1 (en) 2007-04-19
GEP20022695B (en) 2002-05-27
HU223004B1 (hu) 2004-03-01
US20020177200A1 (en) 2002-11-28
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TW541314B (en) 2003-07-11
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CA2253636A1 (en) 1997-11-13
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PL189375B1 (pl) 2005-07-29
EA199800973A1 (ru) 1999-06-24
ES2202624T3 (es) 2004-04-01

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