PL189375B1 - Izolowane przeciwciało i jego zastosowanie - Google Patents
Izolowane przeciwciało i jego zastosowanieInfo
- Publication number
- PL189375B1 PL189375B1 PL97366360A PL36636097A PL189375B1 PL 189375 B1 PL189375 B1 PL 189375B1 PL 97366360 A PL97366360 A PL 97366360A PL 36636097 A PL36636097 A PL 36636097A PL 189375 B1 PL189375 B1 PL 189375B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- omp106
- catarrhalis
- polypeptide
- atcc
- antibodies
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 249
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 235
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 228
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 claims abstract description 152
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 26
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 20
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 claims description 4
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 39
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 35
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 26
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 26
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 16
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 16
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 14
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 12
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 8
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 8
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 6
- 101000692259 Homo sapiens Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Proteins 0.000 description 6
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 6
- 230000001492 haemagglutinating effect Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 101001124867 Homo sapiens Peroxiredoxin-1 Proteins 0.000 description 5
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102100029139 Peroxiredoxin-1 Human genes 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 4
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 4
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QICVAHODWHIWIS-HTFCKZLJSA-N Ile-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N QICVAHODWHIWIS-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588622 Moraxella bovis Species 0.000 description 3
- 241000588629 Moraxella lacunata Species 0.000 description 3
- 241001148188 Moraxella ovis Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- PFOYSEIHFVKHNF-FXQIFTODSA-N Asn-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PFOYSEIHFVKHNF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WZZSKAJIHTUUSG-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- XBWMTPAIUQIWKA-BYULHYEWSA-N Gly-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CN XBWMTPAIUQIWKA-BYULHYEWSA-N 0.000 description 2
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101100425739 Mus musculus Tnnc1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- -1 glycolipid oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N n-[(3s)-7-amino-1-chloro-2-oxoheptan-3-yl]-4-methylbenzenesulfonamide;hydron;chloride Chemical compound Cl.CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)CCl)C=C1 YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N Asp-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010037833 Bacterial Adhesins Proteins 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 101100190851 Chlamydia pneumoniae pmp9 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000761389 Copa Species 0.000 description 1
- 101150036540 Copb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000289427 Didelphidae Species 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000693916 Gallus gallus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101000597577 Gluconacetobacter diazotrophicus (strain ATCC 49037 / DSM 5601 / CCUG 37298 / CIP 103539 / LMG 7603 / PAl5) Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N Gly-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)CN CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N Ile-Gly-Ile Chemical compound N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N L-Fucose Natural products C[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N Lys-Gly-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMIDBHKWSYUBRZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SFTZTYBXIXLRGQ-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SFTZTYBXIXLRGQ-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 210000005058 airway cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003870 depth resolved spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- YVIGPQSYEAOLAD-UHFFFAOYSA-L disodium;dodecyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCCCCCCCCOP([O-])([O-])=O YVIGPQSYEAOLAD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000009743 drug hypersensitivity syndrome Diseases 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005428 food component Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010008385 glycolipid receptor Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FQXXSQDCDRQNQE-UHFFFAOYSA-N markiertes Thebain Natural products COC1=CC=C2C(N(CC3)C)CC4=CC=C(OC)C5=C4C23C1O5 FQXXSQDCDRQNQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N n-octyl beta-D-glucopyranoside Natural products CCCCCCCCOC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 101150018410 omp10 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229930003945 thebaine Natural products 0.000 description 1
- 210000005092 tracheal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
- C07K14/212—Moraxellaceae, e.g. Acinetobacter, Moraxella, Oligella, Psychrobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Izolowane przeciwcialo, znamienne tym, ze specyficznie wiaze sie z polipepty dem OMP106, który jest polipeptydem blony zewnetrznej Moraxella catarrhalis i ma ma- se czasteczkowa okolo 180 000 do okolo 230 000, jak okreslono przez elektroforeze w zelu poliakrylamidowym z SDS przy uzyciu miozyny miesnia szkieletowego królika i ß-galaktozydazy E. coli jako standardów masy czasteczkowej o odpowiednio 200 000 i 116 500, i który zawiera sekwencje SEQ ID nr: 1 Iub SEQ ID nr: 1 i SEQ ID nr: 2 Iub ich fragment skladajacy sie z przynajmniej 6 reszt aminokwasowych. 3. Zastosowanie izolowanego przeciwciala opisanego w zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia Iub zapobiegania infekcji M. catarrhalis. PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest izolowane przeciwciało, włączając przeciwciało cytotoksyczne, które specyficznie wiąże się z polipeptydem OMP106 błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, jak również jego zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia Iub zapobiegania infekcji M.catarrhalis u ssaków.
Moraxella catarrhalis, znana także jako Moraxella (Branhamella) catarrhalis Iub Branhamella catarrhalis, a wcześniej znana jako Neisseria catarrhalis Iub Micrococcus catarrhalis, jest gram-ujemną bakterią często występującą w drogach oddechowych ludzi. M.catarrhalis, którą uważano początkowo za nieszkodliwy organizm komensalny, obecnie uznaje się ją za istotny patogen infekcji górnych i dolnych dróg oddechowych u zwierząt. U ludzi M.catarrhalis powoduje poważne infekcje dolnych dróg oddechowych dorosłych z przewlekłymi chorobami płuc, infekcje układowe u pacjentów z obniżoną odpornością oraz zapalenie ucha środkowego i zapalenie zatok u niemowląt i dzieci. Patrz Helminen i in., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; B.W. Catlin, 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320; oraz odnośniki tu cytowane.
Składniki powierzchni zewnętrznej Moraxella catarrhalis studiowano w celu zrozumienia patogenicznego procesu infekcji M.catarrhalis oraz w celu wykorzystania użytecznych działań terapeutycznych i pomiarów profilaktycznych przeciw takim infekcjom. Białka błony zewnętrznej (OMP) w szczególności zwracały uwagę jako możliwe czynniki wirulencji i jako potencjalne antygeny szczepionki. M.catarrhalis posiada około 10-20 różnych OMP, przy czym 6-8 z nich, OMP od A do H są rodzajami najpowszechniejszymi (Murphy i Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174). Masy cząsteczkowe OMP A-H wynoszą odpowiednio od 97 do 20 kDa. Patrz Bartos i Murphy, 1988, J.Infect. Dis. 158:761-765; Helminen i in., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Murphy i in., 1993, Molecul. Microbiol. 10:87-97; oraz Sarwar i in., 1992, Infect. Immun. 60:804-809. Porównanie profili białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) preparatów błony zewnętrznej od 50 szczepów M. catarrhalis, wykazały prawie jednorodne wzory OMP A-H (Bartos i Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765).
Poza OMP A do H, zidentyfikowano także OMP o dużej masie cząsteczkowej, oznaczone HMW-OMP, posiadające znaczną masę, wynoszącą 350-720 kDa w SDS-PAGE, jako inny uwydatniający się składnik powierzchniowy obecny w wielu szczepach M. catarrhalis. HMW-OMP poddany denaturacji kwasem mrówkowym wytwarza pojedynczą wstęgę o 120-140 kDa, a więc jak okazuje się, jest białkiem oligomerycznym (Klingman i Murphy, 1994, Infect. Immun. 62:1150-1155). Okazuje się, ze HMW-OMPjest tym samym białkiem co
189 375 oznaczone przez Helminena i in. UspA, 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872) i wykazano, że jest obecne w licznych szczepach M. catarrhalis.
W całych bakteriach Iub pęcherzykach błony zewnętrznej pochodzącej od bakterii, kilka z powyżej określonych OMP prezentuje epitopy o ekspozycji powierzchniowej, które wywołują wytwarzanie przeciwciał, wiążących OMP. Te antygenne OMP obejmują OMP E i OMP G (Murphy i Bartos, 1989, Infect. Immun. 57:2938-2941); OMPC/D (Sarwar i in., 1992, Infect. Immun. 60:804-809); CoB, OMP o 80 kDa, (Helminen i in., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010); oraz UspA (Helminen i in., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).
Możliwości lecznicze przeciwciał wobec epitopów o ekspozycji powierzchniowej CopB i UspA, oceniono na modelu zwierzęcym. Model obejmował bezpośrednie zaszczepienie płuca myszy BALB/c VAF/Plus w jednej dużej dawce, kontrolowaną ilością komórek M.catarrhalis i następnie badanie tempa klirensu płucnego bakterii (Unhanand i in., 1992, J. Infect. Dis. 165:644-650). Różne izolaty kliniczne M.catarrhalis wykazywały różne tempa klirensu, które korelowały z poziomem rekrutacji granulocytów do miejsca infekcji. Immunizacja bierną przeciwciałem monoklonalnym skierowanym do epitopu o ekspozycji powierzchniowej albo CopA albo UspA zwiększała tempo klirensu płucnego M.catarrhalis (Helminen i in., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminen i in., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).
Przyleganie patogenów bakteryjnych do powierzchni komórkowej gospodarza pobudza kolonizację i początkuje patogenezę. Patrz. E.H.Beachey, 1981, J. Infect. Dis. 143:325-345. Gram-ujemne bakterie zwykle wykazują ekspresję lecytyn powierzchniowych, które wiążą się ze specyficznymi oligosacharydami glikoprotein i/lub glikolipidów na powierzchni komórkowej gospodarza. Takie lecytyny są często związane z piliami Iub fimbriami. Przyleganie bakterii może także występować przy nie-specyficznym wiązaniu wynikającym z interakcji hydrofobowych i/lub ładunkowych z powierzchnią komórkową gospodarza.
Mechanizm przylegania M.catarrhalis do komórek dróg oddechowych pozostaje słabo zrozumiany. Organizm przylega do hodowanych komórek nabłonka części ustnej gardła człowieka (Mbaki i in., 1987, Tohuku J. Exp. Med. 153:111-121). Badania Rikitomiego i in., sugeruj ą, że w przyleganiu do takich komórek mogą grać rolę fimbrie jako, ze denaturacja fimbrii Iub traktowanie przeciwciałami anty-fimbriom zmniejsza przyleganie u szczepów z fimbriami (Rikitomi i in., 1991, Scand. J. Infect. Dis. 23:559-587). Jednak wiązanie, w którym pośredniczą fimbrie, nie może być jedyną podstawą tego przylegania jako, ze szczepy najbardziej przylegające, wśród kilku badanych, były szczepami bez fimbrii.
W klasyfikacji adhezyn bakteryjnych reakcje hemaglutynacji często zastępują bardziej skomplikowane testy przylegania. Jednakże, Rikitomi i in. odkrył brak korelacji między przyleganiem do ludzkich komórek nabłonka części ustnej gardła i hemaglutynacja u szczepów M.catarrhalis (jak wyżej). To jest trzy szczepy o wysokim stopniu przylegania nie ulegają aglutynacji z erytrocytami człowieka. Tak więc, różne mechanizmy wiązania angażują się w przyleganie i hemaglutynację ludzkich komórek nabłonka ustnej części gardła.
Przeciwnie, ostatnie badanie Kellensa i in., sugeruje, że hemaglutynacja M.catarrhalis jest skorelowana z przyleganiem do komórek gospodarza (Kellens i in., 1995, Infection 23:37-41). Jednak badanie to wykorzystywało test przylegania na podstawie wiązania bakterii do skrawków tchawicy świni. Nie jest oczywiste, czy tkankę tchawicy świni można uznać za homologiczną z tkanką układu oddechowego człowieka pod względem przylegania patogennych szczepów M.catarrhalis.
Nie zwazając na problematyczne oznaczenie przylegania, Kellens i in., przebadali aktywność hamaglutynacji osiemdziesięciu kilku izolatów klinicznych M.catarrhalis (Kellens i in., 1995, Infection 23:37-41). Prawie trzy czwarte badanych szczepów, ulegało aglutynacji z erytrocytami ludzkimi, króliczymi, świnki morskiej, psimi Iub szczurzymi, podczas gdy pozostałe szczepy nie. Aktywność aglutynacji dla niektórych szczepów hemaglutynujących scharakteryzowano dalej i wykazano, że jest ona zależna od jonów wapnia i hamowana przez trawienie trypsyną Iub przez traktowanie wysoką temperaturą, albo dodanie D-glukozaminy lub D-galaktozaminy.
Badanie hemaglutynujących i nie-hemaglutynujących szczepów M.catarrhalis przez Tuckera i in. wykazało, ze wszystkie szczepy wiążą glikolipid gangliotetraozyloceramid lecz
189 375 tylko szczepy hemaglutynujące wiążą glikolipid globotetraozyloceramid (Tucker i in., 1994, Annual Meeting of Amer. Soc. Microbiol., skrót nr D124). Ponadto, aktywność hemaglutynującą M.catarrhalis jak się okazało, jest hamowana przez różne jednocukry, które zawierają cząstkę węglowodorową globotetraozyloceramidu. Te obserwacje doprowadziły Tuckera i in., do wniosku, ze M.catarrhalis hemaglutynuje przez wiązanie się z globotetraozyloceramidami w błonach komórkowych wrażliwych erytrocytów, także tymi z ludzkich krwinek czerwonych. Do dzisiaj nie zidentyfikowano cząsteczki na powierzchni zewnętrznej M.catarrhalis odpowiedzialnej albo za przyleganie do komórki gospodarza albo hemaglutynację.
Przytaczanie lub określanie jakiegokolwiek odnośnika w tej części albo w jakiejkolwiek innej części tego zgłoszenia, nie powinno być interpretowane jako wskazanie, ze taki odnośnik jest dostępny jako wcześniejszy stan techniki dla niniejszego wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest izolowane przeciwciało, charakteryzujące się tym, ze specyficznie wiąże się z polipeptydem OMP106, który jest polipeptydem błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis i ma masę cząsteczkową około 180 kDa do około 230 kDa, jak określono przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z SDS przy użyciu miozyny mięśnia szkieletowego królika i p-galaktozydazy E. coli jako standardów masy cząsteczkowej o odpowiednio 200 kDa i 116,5 kDa, i który zawiera sekwencję SEQ ID nr: 1 Iub SEQ ID nr: 1 i SEQ ID nr: 2 Iub ich f fragment składający się z przynajmniej 6 reszt aminokwasowych.
Korzystnie przeciwciało to stanowi przeciwciało cytotoksyczne, które pośredniczy w zabijaniu Moraxella catarrhalis z udziałem dopełniacza.
Wynalazek dotyczy również zastosowania izolowanego przeciwciała opisanego wyżej do wytwarzania leku do leczenia Iub zapobiegania infekcji M.catarrhalis.
Niniejszy wynalazek ma wiele zastosowań. Przykładowo, polipeptyd OMP106 i polipeptydy pochodzące od OMP106 można stosować jako ligandy do detekcji przeciwciał wzbudzonych w odpowiedzi na infekcję M.catarrhalis (np. w diagnozie infekcji M.catarrhalis). Polipeptyd OMP106 i polipeptydy pochodzące od OMP106 można także stosować jako immunogeny do indukcji przeciwciał specyficznych wobec M.catarrhalis. Takie przeciwciała są użyteczne w oznaczeniach immunologicznych do wykrywania M.catarrhalis w próbkach biologicznych. Przeciwciała cytotoksyczne według wynalazku są pożyteczne w biernej immunizacji przeciw infekcjom M.catarrhalis.
Wynalazek opiera się na zaskakującym odkryciu, że hemaglutynujące szczepy i hodowle M.catarrhalis, posiadają białko błony zewnętrznej, polipeptyd OMP106, którego masa wynosi około 180 kDa do około 230 kDa, oraz że niehemaglutynujące szczepy i hodowle M.catarrhalis albo nie posiadają polipeptydu OMP106 albo posiadają nieodpowiednio zmodyfikowany polipeptyd OMP106, który jest nieaktywny pod względem hemaglutynacji i nie ulega barwieniu srebrem. Wynalazek opiera się dalej na odkryciu, że poliklonalna surowica odpornościowa wzbudzona przez polipeptyd OMP106 wyizolowany z hemaglutynującego szczepu M.catarrhalis, ma aktywność cytotoksyczną przeciw innemu szczepowi hemaglutymującemu M.catarrhalis lecz nie przeciw nie-hemaglutynującemu szczepowi M.catarrhalis.
Definicje i skróty anty-OMP 106
ATCC pęcherzyki
GbHa = przeciwcaało lub surowica odpornościowa przeciw polipeptydowi OMP106 = Amerykański Zbiór Hodowl i Typowych = natuaalnie występujące {^<^(^l·errz/ylli Hony zewnętrznej M.catarrhalis = GalNacP 1 -3Galal-4Gaip 1 -4Glc 1 -1 Ceamid - l^i^nu^ghjf^i^ua^^^y immunoreaktywny = zdolny do wywoływania komórkowej lub humoralnej odpowiedzi immunologicznej knodaltony Mc;
Moraxella catarrhalis;
Moraxella (Branhamella) catarrhalis;
Branhamella catarrhalis;
Neisseria catarrhalis; lub kDa
M.catarrhalis
189 375
NHA
OG
OMP 106 polipeptyd
Micrococcus catarrhalis = nie-hemaglutynujący = N-oktylo-P~D-glukopiranp/.yd lzit» ol^tylogltil^(^^;iuk == pohpeptyd białka 100 bRny zeewiętirziej Moraxella catarrhalis, posiadający masę cząsteczkową około 180 kDa do 230 kDa przez SDS-PAGE; możliwy do ekstrakcji z pęcherzyków lub całych komórek M.catarrhalis przez OG lub detergent sarkozylnwy. o fragment polipeptydu OMP106; odmiana polipeptydu OMP106 dzikiego typu lub jego fragment, zawierający jedną lub więcej delecji aminokwasowych insercji lub substytucji; albo białko chimeryczne, zawierające polipeptyd heterologiczny połączony z segmentem C-terminalnym lub N-terminalnym albo wewnętrznym całego lub części polipeptydu OMP106 =o baalko Mony zewnęrrznej == Makka Μοι^ zewnęrrznej = roztwór sol i ί’^ί 0^^001 buforowanej fosforanem o żel poliakrylamidowy = peptyd o każdej długości, korzystnie dziesięć lub więcej reszt aminokwasowych = dodecylofosforan sodu = eRUm/oreza w żelu poliakrylamidowym z nodccyiosiarcyznem sodu
Sekwencje zukleoIydnwj lub kwasu nukleinowego tu określone przedstawia się za pomocą symboli jednoliterowych oznaczających zasady, jak następuje:
A ładzrZya)
C (cI0ozząa)
G (ganmaa)
T (tmniaa)
U (ułatyl)
M (A lub C)
R (A lub G)
W (A lub T/U)
S (C lub G)
Y (C lub T/Ul)
K (G lub TUJ)
V (A lub C albo Go nie T/U)
H (A lub C albo T/U; nie G)
D (A lub G albo T/U; nie C)
B (C lub G albo T/U; nie A)
N (A. bbb C abbo G bbb TUJO ^bbo inirznzny)
Sekwencje peptydowe i polipjptydowj tu określone przedstawia się za pomocą symboli jednoliterowych oznaczających reszty ymizokwysowe, jak następuje:
A ^amna)
R ^^ΐηΐηι)
N ^spamg^))
D kkwar aspałaginowy)
C ^seema)
Q (guta^mż^ij)
E (kwas ghtamih^i^^)
G {giicyna)
H ^łiis^d^n^^) l (żzoRucyna)
L (Rucyna)
K (Uzyna)
M (metiomna)
OMP
OMPs
PBS
PAG polipeptyd
SDS
SDS-PAGE
189 375
| F | (fenyloalanina) |
| P | (prolina) |
| S | (seryna) |
| T | (treonina) |
| W | (tryptofan) |
| Y | (tyrozyna) |
| V | (walina) |
| X | (nieznany) |
Niniejszy wynalazek może być pełniej zrozumiały przez odniesienie się do następującego szczegółowego opisu wynalazku, nieograniczających przykładów konkretnych postaci realizacji wynalazku oraz załączonych rysunków
Krótki opis rysunków
Figura 1: Porównanie profili w denaturującym PAGE białka błony zewnętrznej pęcherzyków M.catarrhalis lub ekstraktów oktyloglukozydowych (OG) całych komórek M.catarrhalis. Liczby nad torami odnoszą się do oznaczeń szczepów ATCC. Wstępnie barwionego standardu SDS-PAGE (katalog BioRad # 161-0305) użyto jako markera masy cząsteczkowej. Standard składał się z następujących polipeptydów z ich przybliżonymi masami cząsteczkowymi podanymi w nawiasach: fosforylaza B mięśnia królika (106 kDa); albumina surowicy bydlęcej (80 kDa); owoalbumina białka jaja kurzego (49,5 kDa); anhydraza węglowa bydła (32,5 kDa); inhibitor trypsyny sojowej (27,5 kDa); lizozym białka jaja kurzego (18,5 kDa). Pozycje markerów masy cząsteczkowej w żelu podano po lewej stronie rysunku za pomocą strzałek z masami cząsteczkowymi (kD) niektórych markerów powyżej strzałek.
Figura 2: Wyniki z nakładania chromatogramów cienkowarstwowych glikolipidów z pęcherzyków błony zewnętrznej znakowanych 125I. W tabelach A-C, tor 1 zawiera standardy glikolipidowe wskazane na lewo; tor 2 zawiera asialo-GMp tor 3 zawiera Gbą, Gbą i antygen Forssmana; i tor 4 zawiera ekstrakcje Folcha ludzkich erytrocytów. Chromatogram ukazany w tabeli A barwiono orcynolem, chromatogram ukazany w tabeli B nawarstwiono pęcherzykami znakowanymi ^I szczepu ATCC 49143 (szczep hemaglutynujący). Tylko szczep hemaglutynujący wiązał się z wstęgą glikolipidu Gbą w trzecim i czwartym torze.
Figura 3: Profile białkowe ekstraktów oktylo-glukozydu z barwieniem srebrem białek błony zewnętrznej, po trawieniu komórek M.catarrhalis proteazami wskazanymi na rysunku. Aktywność hemaglutynacji po trawieniu wskazuje się na dole rysunku w rzędzie oznakowanym HA. Użyte markery masy cząsteczkowej są takie jak dla fig.1.
Figura 4: Porównanie profili białkowych przez barwienie srebrem białek błony zewnętrznej z różnych szczepów ATCC M.catarrhalis. Oznaczenia szczepów wskazano nad torami. Aktywność hemaglutynacji szczepów wskazuje się w rzędzie oznakowanym HA na dole rysunku. Należy zauważyć, że białko, posiadające widoczną masę cząsteczkową większą niż fosforylaza B mięśnia królika (106 kDa) występuje powszechnie w szczepach hemaglutynujących, lecz nie ma go w szczepach nie-hemaglutynujących. Ten polipeptyd oznakowano OMP106. Użyte markery masy cząsteczkowej są takie jak dla fig. 1.
Figura 5: Porównanie profili białkowych przez barwienie srebrem białek błony zewnętrznej z dwóch hodowli
M.catarrhalis ATCC 49143: 49143 (hodowla hemaglutynująca) i 49143-NHA (hodowla nie-hemaglutynująca). Aktywność hemaglutynacji hodowli wskazuje się na dole rysunku w rzędzie oznakowanym Ha. Należy zauważyć nieobecność wstęgi polipeptydu OMP106 (oznaczone przez <) w hodowli nie-hemaglutynującej. Użyte markery masy cząsteczkowej są takie jak dla fig. 1.
Figura 6: Oszacowanie masy cząsteczkowej OMP106 w 6% denaturującym żelu poliakrylamidowym przy użyciu ekstraktów OG szczepu ATCC 49143, które inkubowano w buforze do próbek albo w temperaturze 25°C albo 100°C przed nałożeniem do żelu. Białka w żelu uwidoczniono przez redukujące barwienie srebrem. Należy zauważyć, że wstęga polipeptydu OMP106 (wskazana jako <) widoczna jest tylko w próbce inkubowanej w temperaturze 100°C. Jako markerów masy cząsteczkowej użyto standardu o szerokim zakresie SDS-PAGE (katalog BioRad # 161-0317). Standard składał się z następujących poli189 375 peptydów (przybliżoną masę cząsteczkową podano w nawiasach): miozyny mięśnia szkieletowego królika (200 kDa); (β-galaktozydazy E. coli (116 kDa); fosforylazy B mięśnia królika (97,5 kDa); albuminy surowicy bydlęcej (66,2 kDa). Pozycje markerów masy cząsteczkowej w żelu podaje się po prawej stronie rysunku za pomocą strzałek z masą cząsteczkową (kDa) markerów ponad strzałkami.
Figura 7: Analiza Southern błot trawienia endonukleazami restrykcyjnymi Dral i Hindill DNA chromosomowego M.catarrhalis sondowanego Mc5-72. DNA szczepu M.catarrhalis 49143 trawiono Dral lub Hindlll. Analizę Southern trawionego DNA przeprowadzono przy użyciu Mc 5-72 (SEQ ID nr: 4) jako sondy. Bardzo surowe przemywanie wynosiło 2X SSC, 1% SDS w temperaturze 50°C przez około 20 do około 30 minut. Tor 1 zawiera trawienie Hindlll; wstęga hybrydyzacji ma przybliżoną wielkość 8,0 kB. Tor 2 zawiera trawienie Dral: wstęga hybrydyzacji ma przybliżoną wielkość 4,2 kB.
Figury 8A i 8B: Western biot ekstraktów białkowych M.catarrhalis i gatunków pokrewnych, przy użyciu surowicy odpornościowej królika wobec OMP 106 jako sondy (fig. 8A), porównano z reaktywnością surowicy przed immunizacją królika OMP 106 (fig. 8B). Próbki w torach fig. 8A i 8B są następujące: tor A M.catarrhalis; tor B Moraxella ovis; tor C Moraxella lacunata; tor D Moraxella oslonensis; tor E Moraxella bovis; tor F Neisseria meningitidis; tor G Neisseria gonorrhoeae. Użyte markery masy cząsteczkowej są takie jak dla fig. 1.
Figura 9A: Wstem biot, przedstawiający, że surowica odpornościowa królika wobec polipeptydu OMP106 z M.catarrhalis ATCC 49143 reaguje krzyżowo z polipeptydem o podobnej masie cząsteczkowej w licznych szczepach HA i NHA M.catarrhalis (położenie polipeptydu OMP 106 wskazuje się strzałką). Western przebadał ekstrakty oktylo-glukozydowe różnych szczepów M.catarrhalis. Numery dostępu ATCC szczepów wskazuje się na górze torów. Stosowane procedury transferowe i Western błot były identyczne jak stosowane do otrzymania odcisków ukazanych na fig. 8.
Figura 9B: Western biot takich samych ekstraktów jak na fig. 9A, przy użyciu wstępnej surowicy odpornościowej, odpowiadającej stosowanej w fig. 9A.
Polipeptyd OMP 106 jest jedynym białkiem błony zewnętrznej szczepu lub odmiany M.catarrhalis, które ma widoczną masę cząsteczkową w SDS-PAGE, wynoszącą około 180 kDa do około 230 kDa, korzystnie około 190 kDa. Według wynalazku, białko błony zewnętrznej M.catarrhalis jest polipeptydem obecnym w pęcherzykach M.catarrhalis lub który można ekstrahować z pęcherzyków M.catarrhalis lub całych komórek przez n-oktylo-p-D-glukopiranozyd (OG) albo detergent sarkozylowy w roztworze buforowym w temperaturze pokojowej. Patrz Murphy i Loeb, 1989, Microbial Pathogenesis 6:159-174, pod względem omówienia pęcherzyków M.catarrhalis, które są naturalnie występującymi pęcherzykami, składającymi się z błony zewnętrznej M.catarrhalis. Szczepy lub odmiany NHA M.catarrhalis albo nie posiadają polipeptydu OMP106, albo posiadają polipeptyd OMP106 w postaci, która wiąże przeciwciała anty-OMP106 lecz nie reaguje z barwnikiem srebrnym (to jest przy użyciu Silver Stain Plus z BioRad [Richmond, CA] lub procedury opisanej przez Gottlieba i Chauko, 1987, Anal. Biochem. 165:33). Przeciwnie, polipeptyd OMP 106 ze szczepów lub odmian HA M.catarrhalis wiąże przeciwciała anty-OMP106 i reaguje z barwnikiem srebrnym.
Polipeptyd OMP 106 można zidentyfikować w pęcherzykach lub całych komórkach HA M.catarrhalis przez jego podatność na degradację przez traktowanie proteazą, która także niszczy lub osłabia aktywność hemaglutynacji takiego szczepu HA. lnnymi słowy, trawienie proteazą, która niszczy lub zmniejsza aktywność hemaglutynacji szczepu lub odmiany HA będzie także zmieniać w SDS-PAGE, obfitość lub położenie polipeptydu OMP 106 wyizolowanego ze szczepu lub odmiany po takim trawieniu w porównaniu z wyizolowanym z takiego samego szczepu lub odmiany przed trawieniem.
Polipeptyd OMP 106 można także zidentyfikować jako polipeptyd w ekstrakcie OG lub sarkozylowym pęcherzyków M.catarrhalis lub całych komórek, które posiadają widoczną masę cząsteczkową większą niż 106 kDa jak określono przez elekroforezę w żelu denaturującym w 12% PAG z SDS, przy użyciu preparatów jakie opisano u Harlow'a i Lane'a (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labofatory Press, Cold Spring Harbor, NY, załącznik l, 1988). Traktowanie gorącem ekstraktu OG lub sarkozylowego w temperaturze 100°C przez 5 minut może spowodować, ze polipeptyd OMP 106 będzie mial widoczną masę cząsteczkową
189 375 około 180 kDa do około 230 kDa, jak określono przez SDS-PAGE w 6%. PAG bez żadnego czynnika redukującego, przy użyciu preparatów jakie opisano u Harlow'a i Lane'a jak wyżej. W szczególnej postaci realizacji, polipeptyd OMP106 w ekstrakcie OG Iub sarkozylowym szczepu ATCC 49143 M.catarrhalis traktowanym gorącem, ma widoczną masę cząsteczkową, wynoszącą około 190 kDa.
W poszczególnych postaciach realizacji, polipeptyd OMP106 wytwarza się z każdego szczepu M.catarrhalis, włączając lecz bez ograniczenia ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628. Zalecanym źródłem polipeptydu OMP106 jest odmiana HA takich szczepów. Najbardziej zalecanym źródłem jest odmiana HA ATCC 49143.
W szczegółowej postaci realizacji, polipeptyd OMP106 zawiera, korzystnie przy końcu aminowym, sekwencję aminokwasową IGISEADGGKGGANARGDKSLAIGDIAQALGSQSIAIGDNKTV (SEQ ID nr: 1) Iub sekwencję zasadniczo do niej homologiczną. Polipeptyd OMP106 może dodatkowo zawierać w położeniu karboksylo-dystalnym do wyżej wspomnianej sekwencji, oktapeptyd, posiadający sekwencję aminokwasową GTVLGGKK (SEQ ID nr: 2) Iub sekwencję zasadniczo do niej homologiczną. Jak się tu stosuje, sekwencja zasadniczo homologiczna jest w co najmniej 80%, korzystnie w 100% identyczna z przytaczaną sekwencją aminokwasową.
Zgodnie z różnymi aspektami wynalazku, polipeptydy charakteryzują się swą widoczną masą cząsteczkową opartą o migrację polipeptydów w SDS-PAGE w stosunku do migracji znanych markerów masy cząsteczkowej. Mimo, że w SDS-PAGE można użyć każdego standardu masy cząsteczkowej znanego w tej dziedzinie, korzystne markery masy cząsteczkowej obejmują co najmniej miozynę mięśnia szkieletowego królika, p-galaktozydazę E coli i fosforylazę B mięśnia królika. Fachowiec zauważy, że polipeptydy mogą różnie migrować w różnych rodzajach układów żelowych (np. różnych buforach; różnych stężeniach zelu, czynnika sieciującego Iub SDS). Fachowiec zauwazy także, że polipeptydy mogą mieć różną widoczną masę cząsteczkową z powodu użycia w SDS-PAGE różnych markerów masy cząsteczkowej. Zatem, charakteryzacja masy cząsteczkowej polipeptydów ukierunkowana jest w zamierzeniu, aby obejmowała takie same polipeptydy w dowolnym układzie SDS-PAGE i z dowolnymi markerami masy cząsteczkowej, które mogłyby wskazać nieco różne widoczne masy cząsteczkowe dla polipeptydów, niż te, które tu ujawniono.
Niniejszy wynalazek opisuje przeciwciała, które specyficznie wiążą polipeptyd OMP106 Iub polipeptydy pochodne OMP106. Do wytworzenia takich przeciwciał, jako immunogeny stosuje się wyizolowane Iub korzystnie oczyszczone preparaty polipeptydu OMP106 Iub polipeptydów pochodnych OMP106.
W postaci realizacji, polipeptyd OMP106 oddziela się od innych białek błony zewnętrznej obecnych w ekstrakcie OG Iub sarkozylowym błony zewnętrznej komórek HA M.catarrhalis Iub pęcherzyków, przy użyciu SDS-PAGE, płatki żelu, zawierające polipeptyd OMP106 stosuje się jako immunogen i wstrzykuje królikowi w celu wytworzenia surowicy odpornościowej, zawierającego przeciwciała poliklonalne OMP106. Taki sam immunogen można stosować do immunizacji myszy w celu wytworzenia linii hybrydomy, która wytwarza przeciwciała monoklonalne anty-OMP106. W poszczególnych postaciach realizacji, jako immunogen stosuje się szkiełko PAG, zawierające wyizolowany Iub oczyszczony OMP106 z każdego ze szczepów ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628. W zalecanych postaciach realizacji stosuje się szkiełko PAQ zawierające wyizolowany Iub oczyszczony OMP106 z hodowli HA takiego szczepu. W bardziej zalecanej postaci realizacji jako immunogen stosuje się szkiełko z żelem, zawierające wyizolowany Iub oczyszczony OMP106 z hodowli Iub szczepu HA ATCC 49143.
W innych postaciach realizacji, jako immunogen stosuje się fragmenty peptydowe polipeptydu OMP106. Korzystnie, stosuje się fragmenty oczyszczonego polipeptydu OMP106. Peptydy można wytworzyć przez trawienie proteazją rozszczepienie chemiczne wyizolowanego Iub oczyszczonego polipeptydu OMP106 Iub syntezę chemiczną, a potem można izolować Iub oczyszczać. Takie izolowane Iub oczyszczone peptydy można stosować bezpośrednio jako immunogeny. W szczegółowych postaciach realizacji, użyteczne fragmenty peptydowe obejmują lecz bez ograniczenia te, które posiadają sekwencję IGISEADGGKGGANARGDKSIA189 375
IGDIAQALGS Q SIAIGDNKIV (SEQ ID nr: 1) Iub każdą ich część, której długość wynosi 6 Iub więcej aminokwasów. W innej postaci realizacji, fragment peptydowy posiada sekwencję GTYLGGKK (SEQ ID nr: 2).
Użyteczne immunogeny mogą także obejmować takie peptydy Iub fragmenty peptydów sprzęzonych z cząsteczką nośnika, korzystnie nośnika białkowego. Białka nośnika mogą być wszystkimi powszechnie stosowanymi w immunologii, włączając lecz bez ograniczenia albuminę surowicy bydlęcej (BSA), albuminę kurczęcia, hemocyjaninę doświadczalnego zapalenia stawów (KLH) i temu podobne. Pod względem omówienia koniugatów białek haptenowych patrz np. Hartlow i in., Przeciwciała: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, Iub zwykły podręcznik do immunologii taki jak Roitt I i wsp., Immunology C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1985) Iub Klein, J., Immunology, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA, (1990).
W jeszcze innej postaci realizacji, do wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z jednym Iub więcej epitopami powierzchni zewnętrznej natywnego polipeptydu OMP 106, jako immunogen stosuje się całe komórki M.catarrhalis HA Iub pęcherzyki z nich wytworzone. Komórki Iub pęcherzyki można utrwalić przed immunizacją przy pomocy czynników takich jak formaldehyd Iub glutaldehyd. Patrz, Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, rozdział 15. Korzystnie takie przeciwciała przeciw całym komórkom stanowią przeciwciała monoklonalne. Linie hybrydomy, wytwarzające żądane przeciwciała monoklonalne można identyfikować przez użycie oczyszczonego polipeptydu OMP 106 jako liganda do przeszukiwania. Jako immunogen stosuje się komórki Iub pęcherzyki każdego ze szczepów M.catarrhalis, włączając lecz bez ograniczenia ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628. Korzystniej jako immunogen do indukcji tych przeciwciał stosuje się komórki Iub pęcherzyki hodowli szczepu HA ATCC 49143.
Przeciwciała poliklonalne wytworzone przez immunizację całą komórką Iub pęcherzykiem, zawierają przeciwciała, które wiążą inne białka błony zewnętrznej M.catarrhalis (przeciwciała „nie anty-OMP106”) i w ten sposób są bardziej niewygodne do użytku tam, gdzie wiadomo Iub podejrzewa się, że próbka zawiera inne białka błony zewnętrznej M.catarrhalis Iub materiały, reagujące krzyżowo z tymi innymi białkami błony zewnętrznej. W tych okolicznościach każde wiązanie przez przeciwciała przeciw całej komórce danej próbki Iub wstęgi musi być zweryfikowane przez równoczesne wiązanie takiej samej próbki Iub wstęgi przez przeciwciała, które specyficznie wiążą polipeptyd OMP 106 (np. anty-OMP106 i/lub polipeptyd pochodny OMP 106), albo przez testy kompetycyjne przy użyciu przeciwciał antyÓMP106, polipeptydu OMP 106 Iub polipeptydu pochodnego OMP 106 jako czynnika współzawodniczącego (to jest dodanie przeciwciał anty-OMP106, polipeptydu OMP 106 Iub polipeptydu pochodnego OMP 106 do mieszaniny reakcyjnej obniża Iub znosi wiązanie próbki przez przeciwciała przeciw całej komórce). Alternatywnie, takie poliklonalne surowice odpornościowe, zawierające przeciwciała „nie anty-OMP106” można oczyścić z takich przeciwciał z użyciem standardowych podejść i metod. Przykładowo przeciwciała nie antyOMP106 można usunąć przez precypitację z użyciem komórek odmiany NHA M.catarrhalis Iub szczepów M.catarrhalis o których wiadomo, że nie posiadają polipeptydu OMP106 (np. ATCC 8176, korzystniej hodowlę NHA ATCC 49143)1 Iub przez absorpcję do kolumn, zawierających takie komórki Iub białka błony zewnętrznej takich komórek.
W dalszych postaciach realizacji, użyteczne immunogeny do wzbudzania przeciwciał według wynalazku obejmują mieszaniny dwóch Iub więcej każdego z wyżej wspomnianych poszczególnych immunogenów.
Immunizację ssaków immunogenem tu opisanym, korzystnie ludzi, królików, szczurów, myszy, owiec, kóz, krów Iub koni, przeprowadza się postępując zgodnie z procedurami dobrze znanymi fachowcom, w celu otrzymania surowic odpornościowych, zawierających przeciwciała poliklonalne Iub linie hybrydom, wydzielających przeciwciała monoklonalne.
Przeciwciała monoklonalne można wytworzyć standardowymi technikami, podanymi w odnośnikach tu zawartych. Takie techniki ujawnia się np. w zgłoszeniu patentowym US nr 4 271 145 i zgłoszeniu patentowym US nr 4 196 265. Krótko, zwierzę immunizuje się immunogenem. Hybrydomy wytwarza się przez łączenie komórek śledziony z immunizowa10
189 375 nego zwierzęcia z komórkami szpiczaka. Produkty fuzji przesiewa się pod względem, tych, które wytwarzają przeciwciała, wiążące immunogen. Klony dodatnich hybrydom izoluje się, a przeciwciała monoklonalne odzyskuje się z tych klonów.
Tryby immunizacji przy wytwarzaniu zarówno przeciwciał poliklonlanych jak i monoklonalnych, są dobrze znane w tej dziedzinie. Immunogen mozna wstrzykiwać każdą z licznych dróg, włączając podskórną, dożylną, dootrzewnową, śródskórną, domięśniową na śluzówkę, albo ich połączenia. Immunogen można wstrzykiwać w postaci rozpuszczalnej, postaci agregatu, przyczepiony do nośnika fizycznego lub wymieszany z adiuwantem, przy użyciu metod i materiałów dobrze znanych w tej dziedzinie. Surowice odpornościowe i przeciwciała można oczyszczać przy użyciu metod chromatografii kolumnowej dobrze znanych fachowcom w tej dziedzinie.
Polipeptydy OMP106 szczepów M.catarrhalis HA lub NHA są immunoreaktywne krzyżowo. Tak więc, przeciwciała wzbudzone wobec polipeptydu OMP106 jednego ze szczepów lub hodowli M.catarrhalis, specyficznie wiążą polipeptyd OMP106 i polipeptydy pochodne OMP106 innych szczepów i hodowli M.catarrhalis. Przykładowo, przeciwciała poliklonalne anty-OMP106 indukowane przez polipeptyd OMP106 szczepu ATCC 49143 specyficznie wiążą nie tylko polipeptyd homologiczny OMP106 (to jest polipeptyd OMP106 szczepu ATCC 49143) lecz także polipeptyd OMP106 i/lub polipeptydy pochodne OMP106 innych szczepów M.catarrhalis, włączając lecz bez ograniczenia ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240 i ATCC 25238.
Przeciwciała według wynalazku, włączając lecz bez ograniczenia przeciwciała antyOMP106, można stosować w celu ułatwienia izolacji i oczyszczenia polipeptydu OMP106 i polipeptydów pochodnych OMP106. Przeciwciała można także użyć jako sondy do identyfikacji klonów w bibliotekach ekspresji, które mają inserty, kodujące polipeptyd OMP106 lub jego fragmenty. Przeciwciała można także stosować w testach immunologicznych (np. ELlSA, RlA, Western) do specyficznego wykrywania i/lub oceny ilościowej M.catarrhalis w próbkach biologicznych. Przeciwciała anty-OMP106 według wynalazku wiążą specyficznie polipeptyd OMP106, a nie wiążą białek z pokrewnych patogenów bakteryjnych, takich jak Moraxella ovis, Moraxella lacunata, Moraxella oslonensis, Moraxella bovis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae. Tak więc, przeciwciała anty-OMP106 można stosować do diagnozowania infekcji M.catarrhalis.
Przeciwciała według wynalazku, szczególnie te, które są cytotoksyczne, można także stosować do immunizacji biernej, w celu zabezpieczenia przed lub osłabienia infekcji M.catarrhalis u zwierząt, włączając ludzi. (Jak się tu stosuje, przeciwciałem cytotoksycznym jest takie, które wzmaga opsonizację i/lub zabijanie z udziałem dopełniacza bakterii związanej przez przeciwciało). Aby uzyskać takie efekty, podaje się gospodarzowi skuteczne stężenie przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych według wynalazku wzbudzonych przeciw immunogenom. Dokładne stężenie podawanych przeciwciał będzie się zmieniać zgodnie z każdym konkretnym preparatem przeciwciał, lecz można je określić przy użyciu standardowych technik dobrze znanych fachowcowi w tej dziedzinie. Podawanie przeciwciał można osiągnąć przy użyciu różnych technik.
Skuteczność profilaktyczną i terapeutyczną przeciwciał według wynalazku można określić standardowymi procedurami farmaceutycznymi na zwierzętach doświadczalnych. Dane otrzymane z badań na zwierzętach można stosować do formułowania zakresu dawkowania do użytku u ludzi.
Kwasy nukleinowe, DNA i RNA, kodujące polipeptyd OMP106 i polipeptydy pochodne OMP106 można syntetyzować metodami znanymi w tej dziedzinie. Konkretnie, część całej sekwencji aminokwasowej polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106 można określić stosując techniki dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie, tak jak technika degradacji Edmana (patrz np. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., strony 34-49). Otrzymaną sekwencję aminokwasową stosuje się jako przewodnią do syntezy DNA, kodującego polipeptyd OMP106 lub polipeptyd pochodny OMP106 przy użyciu konwencjonalnych metod chemicznych albo powielenia reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) nakładających się oligonukleotydów.
189 375
W innych aspekcie, sekwencję aminokwasową można używać jako przewodnią do syntezy mieszanin oligonukleotydów, które można z kolei użyć do przesiewu bibliotek genomowych M.catarrhalis pod względem sekwencji kodujących polipeptyd OMP106. Takie biblioteki można wytworzyć przez izolowanie DNA z komórek dowolnego szczepu M.catarrhalis. Korzystnie DNA stosowany jako źródło sekwencji kodującej polipoptżd OMP 106, zarówno do bibliotek genomowych jak i amplifikacji PCR, wytwarza się z komórek dowolnego szczepu M.catarrhalis, włączając, lecz bez ograniczenia ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628.
Przy wytwarzaniu bibliotek genomowych, tworzy się fragmenty DNA, z których niektóre będą kodować części Iub całość polipeptydu OMP 106 M.catarrhalis. DNA można ciąć w specyficznych miejscach przy użyciu różnych enzymów restrykcyjnych. Alternatywnie do fragmentacji DNA można użyć DNA-azy w obecności manganu Iub można rozbić DNA fizycznie, jak np. sonifikację. Następnie fragmenty DNA można rozdzielić według wielkości standardowymi technikami, włączając, lecz bez ograniczenia, elektroforezę w żelu agarozowym i poliakrylamidowym, chromatografię kolumnową i wirowanie w gradiencie sacharozy. Potem fragmenty DNA można wprowadzać do odpowiednich wektorów, włączając, lecz bez ograniczenia, plazmidy, kosmidy, bakteriofagi lambda Iub T4 oraz sztuczne chromosomy drożdzowe (YAC). (Patrz np. Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wydanie 2, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork; D.M.Glover (wydawca), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oksford, U.K. tom I, II). Bibliotekę genomową można przeszukać przez hybrydyzację kwasu nukleinowego ze znakowaną sondą (Benton i Davis. 1977, Science 196:180; Grunstein i Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961). '
Biblioteki genomowe można przeszukiwać za pomocą znakowanego zdegonorowanogo oligonukleotydu, odpowiadającego sekwencji aminokwasowej dowolnego peptydu polieoptydu OMP 106 przy użyciu optymalnych podejść dobrze znanych w tej dziedzinie. W szczegółowych postaciach realizacji, sonda skriningowa jest /degenerowanym oligonukleotydem, który odpowiada peptydowi o sekwencji IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID nr: 1) Iub jej części. W innej postaci realizacji, sonda skrizingowa może być zdogezerowazżm oligozukleotżdom, który odpowiada peptydowi o sekwencji GTYLGGKK (SEQ ID nr: 2). W dodatkowej postaci realizacji każdy z oligonukleotydów GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (SEQ ID nr: 3) i GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (SEQ ID nr: 7) odpowiadających peptydowi oMp 106 GTYLGGKK (SEQ ID nr: 2) stosuje się jako sondę. W dalszej postaci realizacji, jako sondę można stosować sekwencję GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTA TTGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID nr: 4) Iub jej każdy fragment Iub każdą sekwencję komplementarną do tej sekwencji Iub fragmentów. Każda użyta sonda korzystnie ma długość nukleotydów Iub więcej.
Klony w bibliotekach z insertowym DNA, kodującym polipoetyd OMP106 Iub jego fragmenty będą hybrydyzować z jedną Iub więcej zdegezerowazych sond oligonukleotydowych. Hybrydyzację takich sond oligonuklootżdowyph z bibliotekami genomowymi przeprowadza się przy użyciu metod znanych w tej d/iod/izie. Przykładowo, hybrydyzację z dwiema wyżej wspomnianymi sondami oligonukleotydowymi można przeprowadzić w 2X SSC, 1,0% SDS w temperaturze 50°C i przemyć w takich samych warunkach. W szczegółowej postaci realizacji, sekwencja DNA ATCC 49143, kodująca całość Iub część polipeptydu OMP106 jest fragmentem restrykcyjnym Hindlll o długości około 8000 bp Iub fragmentem restrykcyjnym Dral o długości około 4200 bp.
W jeszcze innym aspekcie, klony sekwencji nukleotydowych, kodujących część Iub całość polipoptydu oMp 106 Iub eolieeptydów pochodnych OMP 106, można także otrzymać przez przeszukiwanie bibliotek ekspresji M.catarrhalis. Przykładowo, DNA M.catarrhalis izoluje się, wytwarza losowe fragmenty i liguje się do wektora ekspresyjnego (np. bakteriofaga, plazmidu, fagemidu Iub kosmidu) tak, ze wstawiona do wektora sekwencja zdolna jest do ekspresji przez komórkę gospodarza, do którego następnie wprowadza się wektor. Można następnie stosować różne metody przeszukiwania do selekcji pod względem ekspresji polipeptydu OMP106 Iub polrpoetżdów pochodnych OMP106. W jednej postaci realizacji można
189 375 stosować różne przeciwciała anty-OMP106 według wynalazku (patrz wyżej), do identyfikacji żądanych klonów, przy użyciu metod znanych w tej dziedzinie. Patrz np. Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, załącznik IV. Klony lub łysinki z biblioteki kontaktuje się z przeciwciałami w celu identyfikacji tych klonów, które się wiążą.
W postaci realizacji, kolonie lub łysinki, zawierające DNA, kodujący polipeptyd OMP106 lub polipeptydy pochodne OMP106 można wykrywać przy użyciu DYNA Beads, zgodnie z Olsvick'iem i in., 29 lCAAC, Houston, Tex. 1989, załączonym tu jako odnośnik. Przeciwciała anty-OMP106 sieciuje się do tosylowanych DYNA Beads M280 i te kulki, które zawierają przeciwciało, będą potem użyte do adsorpcji kolonii lub łysinek, wykazujących ekspresję polipeptydu OMP106 lub polipeptydów pochodnych OMP106. Kolonie lub łysinki, wykazujące ekspresję polipeptydu OMP106 lub polipeptydów pochodnych OMP106, identyfikuje się jako każdy z tych które wiążą się z kulkami.
Alternatywnie, przeciwciała anty-OMP106 można niespecyficznie unieruchamiać na odpowiednim podłożu, takim jak krzemionka lub żywica Celite™. Materiał ten byłby potem stosowany do adsorpcji kolonii bakteryjnych, wykazujących ekspresję polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106 jak opisano w poprzednim paragrafie.
W innym aspekcie, do wytwarzania zasadniczo czystego DNA, kodującego część lub całość polipeptydu OMP106 z genomowego DNA M.catarrhalis, można użyć amplifikacji PCR. Jako starterów używa się starterów oligonukleotydowych, zdegenerowanych lub nie, odpowiadających znanym sekwencjom polipeptydu OMP106. W szczegółowych postaciach realizacji, jako startera 5' można użyć oligonukleotydu, zdegenerowanego lub nie, kodującego peptyd lGlSEADGGKGGANARGDKSlAlGDlAQALGSQSlAlGDNKlV (SEQ lD nr: 1) lub każdą jego część. Przykładowo, starter 5' może być sekwencją nukleotydową GAAGCGGACGG GGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTA TTGGTG ACATTGCGCAA (SEQ lD nr: 4) lub dowolną jej częścią. Jako startera 3' można stosować sekwencje nukleotydowe, zdegenerowane lub nie, które są odwrotnymi sekwencjami komplementarnymi do sekwencji kodującej GTYLGGKK (SEQ lD nr: 2). Przykładowo jako startera 3' można użyć oligonukleotydu, zdegenerowanego lub nie, który posiada zdegenerowaną sekwencję nukleotydową YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (SEQ lD nr: 6) lub YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (SEQ lD nr: 8), w połączeniu z odmiennym starterem 5' omawianym powyżej.
PCR można przeprowadzić, np. przy użyciu termocyklera Perkin-Elmer Cetus i polimerazy Taq (Gene Amp™). Do zastosowania w reakcjach PCR, można zdecydować się na syntetyzowanie kilku zdegenerowanych starterów. Jest także możliwe zróżnicowanie surowości warunków hybrydyzacji stosowanych w w etapie przyłączania starterów reakcji PCR, aby pozwolić na większy lub mniejszy stopień podobieństwa sekwencji nukleotydowej między zdegenerowanymi starterami i odpowiadającymi sekwencjami DNA M.catarrhalis. Po przeprowadzeniu amplifikacji segmentu sekwencji kodującej polipeptyd OMP106, który to segment można molekularnie klonować i sekwencjonować, oraz wykorzystać jako sondę do izolacji pełnego klonu genomowego. To z kolei pozwoli na określenie pełnej sekwencji nukleotydowej genu, analizę jego ekspresji i wytworzenie na jego podstawie białka do analizy funkcjonalnej jaką opisano poniżej. Gdy wyizoluje się sekwencję kodującą polipeptyd OMP106 ze szczepu lub odmiany M.catarrhalis, możliwe jest użycie tego samego podejścia do izolacji sekwencji kodujących polipeptyd OMP106 z innych szczepów i odmian M.catarrhalis. Fachowiec rozpozna, że sekwencję DNA lub RNA kodującą polipeptyd OMP106 (lub jego fragmenty) można stosować do otrzymywania innych sekwencji dNa lub RNA, które hybrydyzują z nią w warunkach średnio lub bardzo surowych, przy użyciu ogólnych technik znanych w tej dziedzinie.
Hybrydyzacja z sekwencją OMP106 z jednego szczepu lub odmiany M.catarrhalis w warunkach bardzo surowych zidentyfikuje odpowiadającą sekwencję z innych szczepów i odmian. Bardzo surowe warunki zmieniają się z długością sondy i składem zasad. Wzór do określania takich warunków jest dobrze znany w tej dziedzinie. Patrz Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, rozdział 11. Tak jak i tutaj, bardzo surowe warunki hybrydyzacji jakie stosuje się dla sond
189 375 o większej długości niż 300 zasad, obejmują przemycie w 0,1 X SSC/0,1% SDS w temperaturze 68°C przez co najmniej 1 godzinę (Ausubel i in., Wyd. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, tom I, Greene Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork na stronie 2.10.3). W szczegółowych postaciach realizacji, bardzo surowe warunki przemywania w hybrydyzacji, przy użyciu sond, mających sekwencję SEQ ID nr: 4 lub jej dopełnienie, oznaczają 2X SSC, 1% SDS w temperaturze 50°C przez około 20 do około 30 minut.
Fachowiec będzie w stanie zidentyfikować pełne klony sekwencji kodującej polipeptydu OMPlOó przy użyciu podejść dobrze znanych w tej dziedzinie. Rozmiar sekwencji kodującej polipeptyd OMPlOó zawartej w wyizolowanym klonie, można sprawdzić przez sekwencjonowanie klonowanego insertu i porównanie wnioskowanej wielkości polipeptydu kodowanego przez otwarte ramki odczytu (ORF) z wielkością polipeptydu OMPlOó i/lub przez porównanie wnioskowanej sekwencji aminokwasowej ze znaną sekwencją aminokwasową oczyszczonego polipeptydu OMPlOó. Jeśli wyizolowano częściowy klon sekwencji kodującej polipeptydu OMPlOó, klony kompletne można wyizolować przez użycie insertu klonu częściowego jako sondy hybrydyzacji. Alternatywnie, pełną sekwencję kodującą polipeptydu OMPlOó można odtworzyć z nakładających się klonów częściowych przez składanie razem ich insertów.
Pełnymi klonami mogą być każde, które posiadają ORF z wnioskowaną sekwencją aminokwasową pasującą do polipeptydu OMPlOó lub, jeśli pełna sekwencja aminokwasową tego ostatniego nie jest osiągalna, który jest fragmentem peptydowym polipeptydu OMPlOó i ma masę cząsteczkową, odpowiadającą polipeptydowi OMPlOó. Dalej, pełne klony można identyfikować przez zdolność ich insertów, po umieszczeniu w wektorze ekspresyjnym, do wytwarzania polipeptydu, wiązącego przeciwciała specyficzne wobec końca karboksylowego polipeptydu OMPlOó.
Sekwencje kwasu nukleinowego, kodujące polipeptydy pochodne OMPlOó można wytworzyć metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie. W jednym aspekcie, sekwencje kodujące polipeptydy pochodne OMPlOó można uzyskać z sekwencji kodujących polipeptydu OMPlOó metodami rekombinacji DNA, biorąc pod uwagę odnośniki tu ujawnione. Przykładowo, sekwencję kodującą polipeptydu OMPlOó można zmienić tworząc substytucje aminokwasowe, które nie wpływają na immunogenność polipeptydu OMPlOó, lub które mogą polepszyć jego immunogenność. Można stosować rożne metody, włączając, lecz bez ograniczenia, oligonukleotydowo skierowaną mutagenezę ukierunkowaną. Te i inne techniki znane w tej dziedzinie, można stosować do utworzenia pojedynczych lub wielokrotnych mutacji, takich jak zastąpienia, insercje, delecje i transpozycje, jak opisano u Botsteina i Shortle'a, 1985, Science, 229:1193-1210.
Dalej, DNA sekwencji kodujących polipeptyd OMPlOó można skracać enzymem restrykcyjnym lub trawieniem egzonukleazą. Heterologiczną sekwencję kodującą można dodać do sekwencji kodującej polipeptydu OMPlOó przez ligację lub ampli fikację PCR. Ponadto, DNA, kodujący całość lub część polipeptydu pochodnego OMPlOó można syntetyzować chemicznie lub przez amplifikację PCR na podstawie znanej lub wnioskowanej sekwencji aminokwasowej polipeptydu OMPlOó i dowolnych pożądanych odmian tej sekwencji.
Zidentyfikowany i wyizolowany DNA, zawierający sekwencję kodującą polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó, można wstawić do odpowiedniego wektora do klonowania. Można zastosować dużą liczbę układów wektor-gospodarz znanych w tej dziedzinie. Możliwymi wektorami są, lecz bez ograniczenia, plazmidy lub zmodyfikowane wirusy, ale układ wektorowy musi być kompatybilny z użytą komórką gospodarza. Takie wektory obejmują, lecz bez ograniczenia, bakteriofagi, takie jak pochodne lambda lub plazmidy, takie jak pochodne plazmidów pBR322 lub pUC. Insercję do wektora do klonowania można uzyskać np. przez ligację fragmentu DNA do wektora do klonowania, który posiada komplementarny lepki koniec.
Jednak jeśli komplementarne miejsca restrykcji użyte dla fragmentu DNA, nie są obecne w wektorze do klonowania, końce cząsteczek DNA można modyfikować enzymatycznie. Alternatywnie, można wytworzyć każde pożądane miejsce przez ligację sekwencji nukleotydowych (linkerów) na końcach DNA; te dołączone linkery mogą zawierać specyficzne, chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy, kodujące sekwencje rozpoznawania endonukleaz
189 375 restrykcyjnych. W alternatywnym sposobie, cięty DNA można modyfikować przez ogonowanie homopolimeryczne. Rekombinowane cząsteczki można wprowadzać do komórek gospodarza poprzez transformację, transfekcję, infekcję, elektroporację itd. tak, że wytwarza się wiele kopii sekwencji genu.
W metodzie alternatywnej, pożądany DNA, zawierający sekwencję kodującą polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106, można identyfikować i izolować po wprowadzeniu do odpowiedniego wektora do klonowania, stosując podejście „strzelby genowej”. Wzbogacenie pod względem pożądanej sekwencji, np. przez frakcjonowanie wielkościowe, można wykonać przed insercjądo wektora do klonowania.
W konkretnych postaciach realizacji, transformacja komórek gospodarza za pomocą rekombinowanych cząsteczek DNA, które zawierają sekwencję kodującą polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106, umożliwia wytworzenie wielokrotnych kopii takiej sekwencji kodującej. W ten sposób, sekwencję kodującą można otrzymać w wielkich ilościach przez hodowlę transformantów, izolowanie rekombinowanych cząsteczek DNA z transformantów i, jeśli trzeba, odzyskanie wprowadzonej sekwencji kodującej z wyizolowanego rekombinowanego DNA.
Polipeptyd OMP106 i polipeptydy pochodne OMP106 można wytwarzać poprzez techniki inżynierii genetycznej. W tym wypadku są one wytwarzane przez odpowiednią komórkę gospodarza, którą transformowano DNa kodującym polipeptyd. Sekwencję nukleotydową, kodującą polipeptyd OMP106 i polipeptydy pochodne OMP106 można wprowadzać do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, to jest wektora, który zawiera elementy niezbędne do transkrypcji i translacji wstawionej sekwencji kodującej polipeptyd. Sekwencje nukleotydowe, kodujące polipeptyd OMP106 lub polipeptydy pochodne OMP106 wstawia się do wektorów w taki sposób, że będą one podlegać ekspresji w odpowiednich warunkach (np. w odpowiedniej orientacji i prawidłowej ramce odczytu oraz z odpowiednimi sekwencjami ekspresji, włączając sekwencję wiążącą polimerazę RNA i rybosomalną sekwencję wiążącą).
Do ekspresji sekwencji kodującej polipeptydu można wykorzystać różne układy gospodarz-wektor. Obejmują one, lecz bez ograniczenia, układy komórkowe ssaków zakażone wirusem (np. wirusem krowianki, adenowirusem itd.); owadzie układy komórkowe zakażone wirusem (np. bakulowirusem); drobnoustroje, takie jak drożdże, zawierające wektory drożdżowe lub bakterie transformowane DNA bakteriofaga, DNA plazmidowym lub DNA kosmidowym. Korzystnie, komórką gospodarza jest bakteria, a najkorzystniej bakterią jest E.coli, B.subtilis lub Salmonella.
Elementy ekspresji wektorów zmieniają się pod względem swej długości i specyficzności. W zależności od wykorzystanego układu gospodarz-wektor, można stosować każdy z wielu odpowiednich elementów transkrypcji i translacji. W konkretnej postaci realizacji, powoduje się ekspresję białka chimerycznego, zawierającego sekwencję polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106 oraz prę- i/lub prosekwencję komórki gospodarza. W innych konkretnych postaciach realizacji, powoduje się ekspresję białka chimerycznego, zawierającego sekwencję polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106 i peptydu do oczyszczania przez powinowactwo. W dalszej konkretnej postaci realizacji, powoduje się ekspresję białka chimerycznego, zawierającego sekwencję polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106 oraz użytecznego immunogennego peptydu lub polipeptydu.
W korzystnych postaciach realizacji, polipeptyd pochodny OMP106, który uległ ekspresji, zawiera sekwencję, tworzącą albo epitop powierzchni zewnętrznej albo domenę wiążącą receptor natywnego polipeptydu OMP106.
Do konstrukcji wektorów ekspresyjnych zawierających gen chimeryczny składający się z odpowiednich transkrypcyjnych/translacyjnych sygnałów kontrolnych i sekwencji kodującej polipeptyd, możną uzyć dowolnego sposobu, znanego w dziedzinie, do wprowadzenia fragmentów DNA do wektora. Sposoby te obejmują techniki rekombinacyjne DNA in vitro oraz techniki syntetyczne i rekombinantów in vivo (rekombinacji genetycznej).
Ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego, kodującej polipeptyd OMP106 lub polipeptyd pochodny OMP106, można regulować drugą sekwencją kwasu nukleinowego tak, ze wstawiona sekwencja ulega ekspresji w gospodarzu transformowanym rekombinowaną czą189 375 steczką DNA. Przykładowo, ekspresję wstawionej sekwencji można kontrolować każdym elementem promotora/wzmacniacza znanym w tej dziedzinie.
Promotory, które można stosować do kontroli ekspresji wstawionych sekwencji, obejmują, lecz bez ograniczenia, wczesny region promotora SV40 (Bemoist i Chambón, 1981, Naturę 290:304-310), promotor zawarty w długim końcowym powtórzeniu 3' wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto i in., 1980, Celi 22:787-797), promotor kinazy tymidynowej herpes (Wagner i in., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), sekwencje regulatorowe genu metalotioneiny (Brinster i in., 1982, Naturę 296:39-42) dla ekspresji w komórkach zwierzęcych; promotory β-laktamazy (Villa-Kamaroff i in., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), tac (DeBoer i in., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25), APl lub trc dla ekspresji w komórkach bakteryjnych (patrz „Useful proteins from recombinant bacteria” w Scentific American, 1980, 242:74-94); region promotorowy syntetazy nopaliny lub promotor RNA wirusa 35S mozaiki kalafiora (Gardner i in., 1981, Nuci. Acids Res. 9:2871), oraz promotor fotosyntetycznego enzymu karboksylazy rybulozobifosforanowej (Herrera-Estrella i in., 1984, Naturę 310:115-120) dla ekspresji w komórkach wszczepionych; elementy promotorowe z drożdży lub innych grzybów, takie jak promotor Ga 14, promotor ADC (dehydrogenazy alkoholowej), promotor PGK (kinazy fosfoglicerolowej), promotor fosfatazy alkalicznej.
Wektory ekspresyjne, zawierające sekwencje kodujące polipeptydu OMP106 łub peptydu pochodnego OMP106, można identyfikować trzema ogólnymi sposobami: (a) hybrydyzacji kwasu nukleinowego, (b) obecności lub braku działania genu „markerowego” oraz (c) ekspresji wstawionych sekwencji. W sposobie pierwszym, obecność obcego genu wstawionego do wektora ekspresyjnego, można wykryć przez hybrydyzację kwasu nukleinowego, przy użyciu sond, zawierających sekwencje homologiczne do wprowadzanej sekwencji kodującej polipeptydu OMP 106 lub polipeptydu pochodnego OMP 106.
W sposobie drugim, rekombinacyjny układ wektor/gospodarz można wykryć i zidentyfikować na podstawie obecności lub braku pewnych funkcji genu „markerowego” (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki, fenotypu transformacyjnego, tworzeniu ciała okluzyjnego w bakulowirusie, itd.) powodowanych przez insercję obcych genów w wektorze. Przykładowo, jeśli sekwencję kodującą polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106 wstawia się do sekwencji genu markerowego wektora, rekombinanty, zawierające insert można identyfikować przez nieobecność funkcji genu markerowego. W sposobie trzecim, rekombinowane wektory ekspresyjne można identyfikować przez oznaczanie produktu obcego białka podlegającego ekspresji w rekombinancie.
Takie oznaczenia można oprzeć, np. o fizyczne lub funkcjonalne właściwości polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106 w układach oznaczania in vitro, np. wiązania z ligandem OMP106 lub receptorem albo wiązania z przeciwciałami anty-OMP106 lub też zdolności komórki gospodarza do hemaglutynacji albo zdolności ekstraktu komórkowego do zakłócania hemaglutynacji przez M.catarrhalis.
Gdy poszczególną rekombinowaną cząsteczkę DNA zidentyfikuje się i wyizoluje, można użyć kilku sposobów znanych w tej dziedzinie, w celu jej powielenia. Gdy ustali się odpowiedni układ gospodarza i warunki wzrostu, rekombinowane wektory ekspresyjne można wielokrotnie powielać i wytwarzać. Jak objaśniono powyżej, wektory ekspresyjne, które można stosować obejmują, lecz bez ograniczenia, następujące wektory lub ich pochodne: ludzkie lub zwierzęce wirusy, takie jak wirus krowianki albo adenowirus; wirusy owadzie, takie jak bakulowirus; wektory drożdżowe; wektory bakteriofagowe (np. lambda) oraz wektory DNA plazmidów lub kosmidów, żeby nazwać choć kilka.
Poza tym, można wybrać szczep komórek gospodarza, który moduluje ekspresję wprowadzonych sekwencji lub modyfikuje i obrabia produkt genowy w żądany konkretny sposób. Ekspresję z pewnych promotorów można podnosić w obecności pewnych induktorów; w ten sposób, ekspresję genetycznie przetworzonego polipeptydu OMP106 lub polipeptydu pochodnego OMP106, można kontrolować. Ponadto, różne komórki gospodarza mają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy obróbki traskrypcyjnej i potraslacyjnej i modyfikacji białek. Można wybrać odpowiednie linie komórkowe lub układy gospodarza, aby zapewnić pożądaną modyfikację i obróbkę obcego podlegającego ekspresji białka.
189 375
Polipeptydy, peptydy, kwasy nukleinowe oraz przeciwciała według wynalazku są użyteczne jako odczynniki do diagnozowania klinicznego Iub medycznego infekcji M.catarrhalis i do badań naukowych, dotyczących właściwości patogenności, wirulencji i zakaźności M.catarrhalis, jak również mechanizmów obrony gospodarza. Przykładowo, DNA i RNA można stosować jako sondy do identyfikacji obecności M.catarrhalis w próbkach biologicznych, przez hybrydyzację Iub amplifikację PCR, DNA i RNA można także stosować do identyfikacji innych bakterii, które mogły kodować polipeptyd pokrewny z OMP106 M.catarrhalis.
Polipeptydy i peptydy można stosować do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych, które można wykorzystać do dalszego oczyszczania kompozycji, zawierających polipeptydy przez chromatografię powinowactwa. Polipeptydy i peptydy można także stosować w standardowych testach immunologicznych do przesiewu pod względem obecności przeciwciał wobec M.catarrhalis w próbce.
Należy rozumieć, że wykorzystanie pouczeń według niniejszego wynalazku w konkretnym problemie Iub środowisku znajdzie się w zakresie zdolności specjalisty, w świetle pouczeń tu zawartych. Przykłady produktów według niniejszego wynalazku i sposoby ich wytwarzania oraz zastosowanie uwidocznią się w następującym przykładzie.
Przykład 1: Izolacja i charakteryzacja polipeptydu OMP106 oraz genu go kodującego ze szczepu ATCC 49143 Iub innych szczepów
Materiały i metody
Test hemaglutynacji
Hemaglutynację przez M.catarrhalis testowano zgodnie z opisem Soto-Hemandeza i in., (J. Clin. Microbiol. 27:903-908) z wyjątkiem 5% zamiast 3% objętościowych erytrocytów stosowanych w teście aglutynacji szkiełkowej. Pierwsze testy aglutynacji przeprowadzono przy użyciu 20 pg komórek bakteryjnych (masa wilgotna). Ponieważ szczep M.catarrhalis ATCC 49143 hodowany na płytkach z agarem z krwią w temperaturze 35°C dawał silną reakcję hemaglutynacji, wybrano go jako szczep referencyjny. Seryjnie rozcieńczony szczep ATCC 49143 w rozcieńczeniach 1:2 dał w wyniku zmniejszenie reakcji hemaglutynacji.
Punktację ++++ do + oparto o hemaglutynację obserwowaną u szczepu ATCC 49143 po seryjnych rozcieńczeniach 1:2 tak, ze uzyskano reakcję + , stosując 1/4 liczby komórek wymaganych do uzyskania reakcji +++.
Inhibicja hemaglutynacji
Zawiesinę komórkową ATCC 49143 M.catarrhalis rozcieńczono seryjnie 1:2, a rozcieńczenie, które dało reakcję hemaglutynacj i + przy 7 μl roztworu soli fizjologicznej Dulbecco buforowanej fosforanem i 7 μl 5% (objętościowo) ludzkich erytrocytów 0+, użyto do testu inhibicji hemaglutynacji przez cukry proste i pochodne cukrów. Aby określić, czy cukry proste Iub pochodne cukrów mogą hamować hemaglutynację przez M.catarrhalis, zmieszano 7 (il danego cukru przy 500 mM z 7 pl komórek M.catarrhalis i inkubowano przez 5 minut, pozwalając na interakcję między cukrem i komórkami. Następnie dodano 7 pl 5% (objętościowo) ludzkich erytrocytów 0+ i po 1 minucie oceniono wynik hemaglutynacji. Każdy cukier i pochodną cukru testowano pod względem zdolności do hamowania hemaglutynacji. Potem roztwór podstawowy cukru i pochodnej cukru rozcieńczono seryjnie 1:2, i te rozcieńczenia testowano pod względem zdolności do hamowania hemaglutynacji, przy użyciu procedury opisanej powyżej. W ten sposób określono minimalne stężenie węglowodanu wymagane do inhibicji hameglutynacji.
Wiązanie liganda i receptora
Wiązanie M.catarrhalis z receptorami glilkolipidowymi komórek zwierzęcych zbadano przy użyciu frakcjonowania w chromatografii cienkowarstwowej (TLC) glikolipidów komórek gospodarza i nadkładu znakowanych komórek chromatogramu, postępując zgodnie z procedurami opisanymi przez Magnani'ego i in., 1982, J. Biol. Chem. 257:14365-14369). Krótko, glikolipidy otrzymane od Matreya Inc. (Pleasant Gap, PA) rozpuszczono na płytkach wysokosprawnego chromatografu cienkowarstwowego (HPTLC) w chloroformie, metanolu, wodzie (5:4:1). Płytki albo barwiono orcynolem w temperaturze 100°C, albo nadlano za pomocą pęcherzyków M.catarrhalis znakowanych l25I wytworzonych jak opisano poprzednio (Murphy
189 375 i Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174) przy 2 x 106 cpm/ml przez 2 godziny. Płytki następnie przemyto 5 razy, wysuszono i poddano ekspozycji wobec błony rentgenowskiej.
Ekstrakcja OG OMP
Szczepy M.catarrhalis, hodowano w temperaturze 35°C przy 200 obrotach na minutę w 1 litrze bulionu Muellera Hintona w 4 litrowej kolbie. Wyizolowano białko błony zewnętrznej (OMP) przez traktowanie 50 mg komórek (masa wilgotna) 0,67 ml 1,25% nlOktylo-β-D-glukopiranozydu (to jest oktylo-glukozydu; OG) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki osadzano w mikrowirówce przez 5 minut i nadsącz użyto jako ekstrakt oktyloglukozydowy. Porównanie profili białkowych tych ekstraktów z licznych szczepów M.catarrhalis z pęcherzykami (to jest pęcherzykami błony zewnętrznej) wyizolowanymi przez wirowanie różnicujące, które są bardzo bogate w białka błony zewnętrznej (OMP) z M.catarrhalis (Murphy i Loeb, Microbial Pathogen. 6:159-174) wskazuje, że ekstrakty oktyloglukozydowe zawierają przede wszystkim białka błony zewnętrznej M.catarrhalis (fig. 1). Pokazuje to, że ekstrakcja oktyloglukozydowa zapewnia szybszą procedurę z wyższą wydajnością białek błony zewnętrznej, w porównaniu z białkami błony zewnętrznej otrzymanymi z pęcherzyków.
Trawienie proteolityczne OMP106 mg komórek ze szczepu AT CC 49143 w 1 ml roztworu soli fizjologicznej Dulbecco buforowanego fosforanem, trawiono przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej następującymi proteazami: chymotrypsyną traktowaną TLCK (5 mg), proteinazą K (5 mg), trypsyną traktowaną TLCK (5 mg) lub proteazą V8 (100 jednostek). Wszystkie proteazy otrzymano z Sigma Chemicals (St.Louis, MO). Zaraz po traktowaniu proteazami, komórki przemyto raz w PBS, ponownie zawieszono w 1 ml PBS i testowano aktywność hemaglutynacji.
Dodatkowo ekstrahowano komórki bakteryjne traktowane proteazami, za pomocą oktylo-glukozydu, aby białka błony zewnątrznej można było rozpuścić w celu identyfikacji konkretnych białek, które mogły być trawione przez proteazy.
Odmiany nie hemaglutynujące
Normalnie, hemaglutynujące hodowle M.catarrhalis rosną w wytrząsanych kolbach, zawierających bulion Muellera Hintona w temperaturze 35-37°C przy 200 obrotach na minutę przez 24-48 godzin. Komórki pobrane bezpośrednio z płytki z agarem z krwią lub płytki agarowej z pożywką Muellera Hintona także wykazują ekspresję fenotypu hemaglutynującego. W celu selekcji do odmiany nie hemaglutynującej (NHA), szczep ATCC 49143 pasażowano seryjnie co 5 dni w statycznych hodowlach rosnących w bulionie Muellera Hintona w temperaturze 35°C. Przy każdym pasażu, szczep pobierano tylko z powierzchni hodowli bulionowej. Do drugiego pasażu rozwinął się pływający kożuch komórek i tego kożucha komórek użyto jako posiewu do kolejnej hodowli. Przez seryjne hodowanie w ten sposób, wytwarzano odmiany NHA ATCC 49143 zwykle po trzech pasażach.
lzolacja polipeptydu OMP 106
Polipeptyd OMP106 z ekstraktu błony zewnętrznej ATCC 49143 M.catarrhalis, wykrywa się (np. przez barwienie srebrem lub przeciwciała anty-OMP106) w denaturujących żelach jedynie po inkubowaniu ekstraktu w temperaturze 10()°C przez pięć minut. W celu określenia czy pojawienie się wstęgi OMP106 po inkubacji w temperaturze 100°C jest wynikiem agregeacji białek o niższej masie cząsteczkowej podczas wrzenia, lub czy wrzenie pozwala normalnie zagregowanym białkom na wejście do żelu, nie gotowany ekstrakt oktyloglukozydowy błony zewnętrznej ATCC 49143 analizowano na natywnym żelu poliakrylamidowym. Specyficzne regiony żelu, włączając te tuż poniżej próbki, odcięto i zagotowano.
Otrzymane próbki rozpuszczono następnie na denaturującym żelu poliakrylamidowym i zabarwiono barwnikiem srebrnym (Silver Stain Plus, numer katalogowy 161-0449, BioRad Laboratories, Richmond, CA). W celu sekwencjonowania N-terminalnego wymieszano ekstrakt oktylo-glukozydowy ATCC 49143 z buforem do próbek PAGE, zawierającym SDS i inkubowano przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Potem rozdzielono białka w 12% PAG z SDS i przeniesiono na błonę PVDF przez elektroblotting.
Region błon, zawierający wstęgę OMP106 odcięto następnie w celu sekwencjonowania amino-końcowego. W żadnej z procedur PAGE stosowanych do izolacji polipeptydu OMP106 nie użyto czynników redukujących w buforach do próbek lub żelowych.
189 375
Surowica odpornościowa anty-OMP 106
Wytworzono surowicę odpornościową wobec OMP106 przez rozdzielenie polipeptydu OMP106 z odmiany HA ATCC 49143 w denaturującym żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu, jak opisano poprzednio (Laemmli, 1970, Nature 227:680-685) i odcięcie wstęgi, zawierającej OMP106 od żelu. Odciętą wstęgę macerowano i wstrzyknięto królikowi, w celu wytworzenia surowicy odpornościowej wobec polipeptydu OMP106. Surowicę odpornościową użyto do inhibicji hemaglutynacji jak opisano powyżej, lecz stosując surowicę odpornościową w miejsce węglowodanu. Surowicę odpornościową zbadano także pod względem aktywności cytotoksycznej, w której pośredniczy dopełniacz, przeciw M.catarrhalis, jak opisano w części 7.
Western biot z surowicą odpornościową anty-OMP 106
M.catarrhalis ATCC 49143, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240, ATCC 25238 i ATCC 8176; M.ovis ATCC 33078; M.lacunata ATCC 17967; M.bovis ATCC 10900; M.oslonensis ATCC 10973; Neisseria gonorhoeae (izolat kliniczny); oraz N.meningitidis ATCC 13077, hodowano na płytkach agarowych z czekoladą przez 48 godzin w temperaturze 35°C przy 5% CO2. Komórki usunięto przez zdrapanie kolonii z powierzchni agaru przy użyciu polistyrenowej pętli do posiewania.
Następnie komórki rozpuszczono przez zawieszenie 30 pg komórek w 150 μΐ buforu do próbek PAGE (360 mM bufor Tris [pH 8,8], zawierającym 4% dodecylosiarczan sodu i 20% glicerol), i inkubowano zawiesinę w temperaturze 100°C przez 5 minut. Roztworzone komórki rozpuszczono na 12% żelu poliakrylamidowym jak dla Laeminli'ego i oddzielone białka przeniesiono przez elektroforezę na błony PVDF (Thebaine i in., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354) z wyjątkiem tego, że do buforu do przenoszenia dodano 0,05% dodecylosiarczan sodu w celu ułatwienia ruchu białek z żelu. Potem błony PVDF wstępnie traktowano 25 ml roztworu soli fizjologicznej Dulbecco buforowanej fosforanem, zawierającej 0,5% kazeinę sodową, 0,5% albuminę surowicy bydlęcej i 1% surowicę kozią.
Wszystkie następne inkubacje przeprowadzono przy użyciu tego buforu wstępnego traktowania.
Błony PVDF inkubowano z 25 ml rozcieńczoną 1:500 wstępną surowicą odpornościową królika Iub surowicą królika immunizowanego polipeptydem OMP106 (jak opisano powyżej) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie błony PVDF przemyto dwukrotnie buforem do przemywania (20 mM bufor Tris [pH 7,5], zawierającym 150 mM chlorku sodu i 0,05% Tween-20). Błony PVDF inkubowano z 25 ml rozcieńczonej 1:5000 koziej antykróliczej IgG znakowanej peroksydazą (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove Penn., numer katalogowy 111-035-003) przez 30 minut w temepraturze pokojowej. Potem błony PVDF przemyto 4 razy buforem do przemywania i wywołano za pomocą tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny i nadtlenku mocznika, jakie dostarczono z Sigma Chemicals Co. (St.Louis, MO, numer katalogowy D-4418) przez 4 minuty każda.
M.catarrhalis ATCC 49143 hodowano przez noc w temperaturze 35°C w łaźni wodnej z wytrząsaniem w bulionie Muellera Hintona. Komórki osadzono przez wirowanie i następnie zawieszono ponownie w równej objętości roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z modyfikacją Dulbecco, bez wapnia ani magnezu (PBS/MC), 20 μΐ zawiesiny komórkowej nałożono na każde z 5 czystych szkiełek mikroskopowych. Po ustawieniu przez 10 sekund, nadmiar płynu usunięto pipetą i pozostawiono szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 1 godzinę. Następnie szkiełka utrwalono gorącem nad otwartym płomieniem aż do uzyskania szkła ciepłego w dotyku. Szkiełka traktowano początkowo 40 μΐ rozcieńczoną 1:40 surowicą odpornościową anty-OMP 106 Iub wstępną surowicą odpornościową od tego samego zwierzęcia, rozcieńczoną w PBS/MC Iub PBS/Mc przez 10 minut, potem przemyto 5 razy w PBS/MC.
Szkiełka traktowano 40 μΐ z 5 pg/ml PBS/MC przeciwciałem kozim znakowanym izotiocyjanianem wobec IgG królika (Kirkegaard i Perry Laboratories, Inc., Gaithesburg, MD, numer katalogowy 02-15-06). Szkiełka inkubowano w ciemności przez 10 minut i przemyto 5 razy w PBS/MC. Każde szkiełko przechowywano przykryte PBS/MC pod szkiełkiem nakrywkowym i oglądano w mikroskopie fluorescencyjnym zaopatrzonym w filtr 489 nm. Dla
189 375 każdej próbki zbadano wzrokowo pięć obrazów mikroskopowych, w celu oceny obszaru zabarwienia.
Wyniki
Aktywność hjmyglutyzacei
Aktywność aglutynacji M.caIarrhalis w odniesieniu do erytrocytów jest specyficzna gatunkowo, przy czym nyesilzijjsry aktywność obserwowana jest w odniesieniu do erytrocytów człowieka. Erytrocyty królika także aglutynowały z M.catarrhalis lecz mniej dramatycznie niż komórki ludzkie. Erytrocyty myszy, knziy lub owcy nie agluIyznwyły (patrz tabela 1j.
Tabela 1:
Siła hemaglutynacja erytrocytów różnych gatunków przy użyciu M.catarrhalis ATCC 49143
| Źródło erytrocytów | Wynik hemaglutynacja |
| Człowiek | ++++ |
| Królik | ++ |
| Mysz | - |
| Koń | - |
| Owca | - |
| a ++++ o ząjsilziejsza aglutynacja, - wskazuje brak aglutynacji |
Receptory i ligandy OMP106
Aktywność hjmaglutyzacji M.catarrhalis powoduje wiązanie z glnbntetrnzą (Gb4.J. Pęcherzyki ze szczepów hemagluIyzgeących wiążą się z glikolipidem, posiadającym Gb4, podczas gdy szczepy nie hjmyglutyzgjące nie wiążą się z takim samym glikolipidem (patrz fig. 2J. Aktywność hemagluIyzacji M^tan-halis hamują składniki jedzocukrnwe Gb4 lub pochodne takich jjdnncukrΌwców, przy czym najsilniejszymi inhibitorami są N-acetylogalyktnrymina i galaktoza (zwłaszcza alfa anomer galaktozyj (patrz tabela 2J.
Tabela 2:
Minimalne stężenie cukrów wymagane do inhibicji hemaglgIyzycji (MlCJ przez M.caIarrhylis
| Cukier | MlC (rnM) * |
| D-Glukoza | >167 |
| D-Marnoza | 83 |
| D-GabRoza | 41 |
| L-Fukoza | 83 |
| N-acetylo-D-glgkozymiza | >167 |
| N-aceIyln-D-gylakIozymiza | 41 |
| Metylo-a-glukoza | >167 |
| Metylo-α-mazzozy | 167 |
| Metylo-agalaktoza | 10 |
| Mjtylo-β-gylyktoza | 83 |
* Minimalne stężenie cukru wymagane do inhibicji reakcji hemaglgIyzacji 1+ przez M^tan-halis ATCC 49143 za pomocą przemycia 5% erytrocytami 0+ człowieka.
189 375
Zarówno N-acetylogalaktozamina jak i alfa-galaktoza są częścią czterocukru Gb4. Korelacja między hamaglutynacją i wiązaniem z Gb4, oraz obserwacja, że hemaglutynację hamują jednocukry zawierające receptor Gb4 sugeruje, że komórki M.catarrhalis wiążą się z czterocukrem Gb4. Ten czterocukier jest obecny na ludzkich erytrocytach i tkankach i może pośredniczyć w przyczepianiu się M.catarrhalis do błon eukariotycznych.
ldentyfikacja polipeptydu OMP106
Trawienie proteolityczne komórek M.catarrhalis i następnie analiza hemaglutynacji przez strawione komórki, pokazały, że traktowanie proteazowe chymotrypsyną i proteinazą K zniszczyło aktywność hemaglutynacji, wskazując, ze w aktywności hemaglutynacji pośredniczy białko. Analiza profili białkowych OMP komórek M.catarrhalis trawionych proteazą wykazała, że w każdej próbce rozłozyło się wiele białek, tak, że profile nie dostarczają wskazówki, według której białko jest bezpośrednio odpowiedzialne lub pośrednio związane z aktywnością hemaglutynacji (patrz fig. 3).
Ponieważ traktowanie proteazą wskazuje, że polipeptyd jest bezpośrednio lub pośrednio odpowiedzialny za aktywność hemaglutynacji, Zgłaszający użył SDS-PAGE do porównania profili OMP ze szczepów hemaglutynujących ze szczepami nie hemaglutynującymi (fig. 4). Analiza różnic między tymi profilami wskazała, że szczepy hemaglutynujące mają dwa unikalne polipeptydy, przy czym jeden o widocznej masie cząsteczkowej 27 kDa (oznaczony OMP27) i drugi, który był jedynym białkiem o widocznej masie cząsteczkowej większej niż 106 kDa (oznaczony OMP106).
W szczególności wstęga polipeptydu OMP106 była nieobecna w preparatach OMP różnych komórek traktowanych proteazą, które posiadały zmniejszoną lub brak aktywności hemaglutynacji, podczas gdy wstęga OMP27 była obecna w preparacie OMP komórek traktowanych proteinazą K, które nie posiadały aktywności hemaglutynacji. Dodatkowo, wstęgą polipeptydu OMP106 nie została zdegradowana przez trawienie proteinazą V8, która nie miała wpływu na aktywność hemaglutynacji traktowanych komórek.
Profil OMP odmian NHA
Seryjne hodowle odmiany NHA ATCC 49143 w statycznej hodowli w temperaturze 35°C wytworzyły odmianę NHA (oznaczoną 49143-NHA) po trzecim pasażu hodowli. Ta utrata aktywności hemaglutynacji była powtarzalna. Analiza profili OMP ekstraktów OG błony zewnętrznej odmian HA i NHa wykazała, że wstęga polipeptydu OMP106 zniknęła z ekstraktu 49143-NHA (fig. 5). Sugerowało to, że polipeptyd OMP106 jest hemaglutyniną M.catarrhalis (to jest polipeptyd OMP106 wiąże receptor Gb4 lub jest podjednostką homopolimerycznego białka, które wiąże receptor Gb_) lub tworzy część hemaglutyniny M.catarrhalis (to jest polipeptyd OMP106 jest podjednostką homopolimerycznego białka, które wiąże receptor Gb.4).
OMP106 i hemaglutynacja
Poliklonalna surowica odpornościowa wzbudzona wobec polipeptydu OMP106 ATCC 49143 neutralizowała hemaglutynację przez ATCC 49143. Podtrzymuje to dodatkowo konkluzję, że aktywność hemaglutynacji M.catarrhalis obejmuje polipeptyd OMP106 i ze polipeptyd OMP106 jest antygenowo chroniony wśród szczepów. Patrz także fig. 9A1, która ukazuje polipeptyd OMP106 heterologicznych szczepów M.catarrhalis.
Położenie OMP 106 na powierzchni zewnętrznej
Króliczej surowicy odpornościowej anty-OMP 106 użyto do pośredniego barwienia immunoflurescencyjnego, aby określić, czy polipeptyd OMP106 podlega ekspozycji na powierzchni zewnętrznej komórek M.catarrhalis. Komórki M.catarrhalis traktowane surowicą odpornościową anty-OMP 106 zabarwiły się intensywniej i odmiennie niż komórki traktowane wstępną surowicą odpornościową lub PBS/MC. Wskazało to, że polipeptyd OMP106 nieuszkodzonych komórek M.catarrhalis był reaktywny wobec przeciwciał anty-OMP 106. Wynik ten dowodzi, że polipeptyd OMP106 podlega ekspozycji na powierzchni zewnętrznej M.catarrhalis. Odkrycie to jest zgodne z tym, że polipeptyd OMP106 pełni rolę w hemaglutynacji, a ponadto wskazuje, że polipeptyd OMP106 byłby uzyteczny jako szczepionka.
Właściwości polipeptydu OMP 106
Polipeptyd OMP106 istnieje w postaci wielkiego kompleksu białkowego w swym natywnym stanie lub agreguje przy estrakcji oktylo-glukozydem. Wniosek ten poparty jest od189 375 kryciem, ze wyekstrahowane oktylo-glukozydem komórki M.catarrhalis rozpuszczą polipeptyd OMP106, lecz wyekstrahowany polipeptyd OMP106 nie wchodzi do denaturujących PAG chyba, że najpierw inkubuje się ekstrakt w temperaturze 100°C (fig. 6). Dalej, nie widać, żeby wstęga polipeptydu OMP106 tworzyła się z polipeptydów o niższej masie cząsteczkowej, które polimeryzują Iub ulegają agregegacji po ogrzaniu, ponieważ polipeptyd OMP106 w nie ogrzanej próbce denaturującej jest uwięziony w studzience z próbką i wchodzi do rozpuszczającego żelu tylko wtedy gdy próbkę inkubuje się najpierw w temperaturze 100°C. Ta właściwość biochemiczna jest bardzo użyteczna przy identyfikacji polipeptydu OMP106 w różnych żelach.
Stosując ekstrakty oktylo-glukozydu M.catarrhalis, potem inkubując ekstrakty z dodecylosiarczeneni sodu w temperaturze 100°C i rozpuszczając białka na denaturującym żelu poliakrylamidowym. Zgłaszający oszacował widoczną masę cząsteczkową polipeptydu OMP106 z różnych szczepów M.catarrhalis, konkretnie ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628, aby uszeregować je od około 180 kDa do około 230 kDa (fig 9A), podczas gdy polipeptyd ze szczepu ATCC 49143 jak się okazuje, posiada masę cząsteczkową około 190 kDa (fig. 6).
Polipeptyd OMP106 ze szczepu ATCC 49143 ekstrahowano z szkiełka z żelem i sekwencjonowano jego koniec N. Sekwencjonowanie pokazało, że koniec N polipeptydu OMP106 z błony zewnętrznej ATCC 49143 jest IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID nr: 1). Oprócz tego, wyizolowano wewnętrzny peptyd OMP106 wytworzony przez trawienie Lys-C (Fernandez i in., 1994, Anal. Biochem. 218:112-117) i jego sekwencję określono jako GTYLGGKK (SEQ ID nr: 2).
Zgłaszający utworzył trzy sondy oligonukleotydowe. Dwie sondy odpowiadają wewnętrznemu peptydowi GTYLGGKK, jedna posiada następującą sekwencję GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (SEQ ID nr: 3), inna ma następującą sekwencję GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (SEQ ID nr: 7). Inna sonda Mc 5-72, kodująca wewnętrzny fragment (SEQ ID nr: 5) sekwencji aminoterminalnej OMP106 (SEQ ID nr: 1) posiada następującą sekwencję GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCG CGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID nr: 4). Hybrydyzacja sondy Mc 5-72 uzupełniająca trawienie Hindlll i Dral DNA M.catarrhalis w każdym przypadku wytwarzała pojedynczą wstęgę w analizie Southern biot (fig. 7). Wstęga hybrydyzacji w miejscu trawienia Hindlll ma wielkość w przybliżeniu 8,0 kb; wstęga hybrydyzacji miejsca trawienia Dral posiada wielkość w przybliżeniu 4,2 kb (fig. 7).
Ochrona polipeptydu OMP106
Analiza Western błot ekstraktów białek błony zewnętrznej wielu szczepów M.catarrhalis i gatunków pokrewnych wykazała, że przeciwciała anty-OMP106 wiążą się z polipeptydem o około 180kD do około 230 kDa w wielu szczepach M.catarrhalis, zarówno szczepach i odmianach HA jak i NHA (fig.9A). Przeciwciała anty-OMP106 nie wiążą się z żadnym polipeptydem w ekstrakcie białkowym bakterii pokrewnych (fig. 8A). Wyniki te pokazują co następuje: 1) przeciwciała anty-OMP106 można stosować do specyficznej identyfikacji i odróżniania M.catarrhalis od pokrewnych gatunków bakterii. 2) Polipeptyd OMP106 można stosować do wytwarzania przeciwciał, które mają zastosowanie diagnostyczne przy identyfikacji M.catarrhalis. 3) Przeciwciała wobec polipeptydu OMP106 jednego szczepu (np. OMP106 ATCC 49143) można stosować do identyfikacji i izolacji odpowiadającego polipeptydu OMP106 innych szczepów M.catarrhalis. Co ciekawe, wyniki Western biot pokazują, ze wiele szczepów NHA M.catarrhalis posiada polipeptyd OMP106 w ekstraktach OG ich błon zewnętrznych. Odkrycie to i fakt, że barwienie srebrem OMP z ekstraktów błon zewnętrznych szczepów NHA M.catarrhalis po PAGE nie ujawnia wstęgi w zakresie 180 kDa do 230 kDa, wskazuje, ze polipeptyd OMP106 podlega ekspresji w większości szczepów Iub odmian M.catarrhalis lecz aby być aktywnym pod względem hemaglutynacji (to jest wiązać receptor na powierzchni komórki ssaka) Iub barwić się srebrem, polipeptyd OMP106 musi być odpowiednio modyfikowany w pewien sposób. Najwyraźniej tylko szczepy i odmiany HA są zdolne do odpowiedniej modyfikacji polipeptydu OMP106 tak, że może on pośredniczyć w wiązaniu bakterii z receptorem hemaglutyniny na powierzchni komórki ssaka.
189 375
Przykład 2: Skuteczność szczepionki OMP106: Aktywność cytotoksyczna surowicy odpornościowej anty-OMP 106
Zbadano aktywność cytotoksyczną przeciwciał anty-OMP 106, w której pośredniczy dopełniacz, aby określić siłę szczepionki polipeptydu OMP106. Wytworzono surowicę odpornościową polipeptydu OMP106 odmiany HA ATCC 49143 jak opisano w powyższej części 6.1.8. Zbadano aktywność wstępnej surowicy odpornościowej i surowicę odpornościową antyOMP106 w pośredniczeniu wią/azia dopełniacza M.catarrhalis, przy użyciu („Serum Bactericidal Test” opisanego przez Zollingera i in., (Immune Rospozsos to Neisseria mozingitidis, w Manuał of Clinical Laboratory Immunologa wyd. 3-cie, strony 347-349), z wyjątkiem tego, że stosowano komórki HA i NHA szczepów Iub odmian M.catarrhalis zamiast komórek Neisseria mezingitidis.
Wyniki ukazują, ze surowicą odpornościowa anty-OMP 106 pośredniczyła w wiązaniu dopełniacza odmiany HA heterologic/zego M.catarrhalis 43627 lecz nie odmiany NHA M.catarrhalis ATCC 43627 lub M.catarrhalis NHA ATCC 8176. Tabela 3 omawia aktywność cytotoksyczną wstępnej surowicy odpornościowej i surowicy odpornościowej anty-OMP 106, w której pośredniczy dopełniacz, przeciw odmianie HA ATCC 43627.
Tabela 3'
Aktywność cytotoksyczna wstępnej surowicy odpornościowej i surowicy odpornościowej anty-OMP106, w której pośredniczy dopełniacz
Miano pżtotoksżczze1
Surowica wstępna Anty-OMP 106
Doświadczenie 1 16 128
Doświadczenie 2 8 64 1 Miano znajduje się w najwyższym rozciończoziu, przy którym surowica może pośredniczyć w wiązaniu dopełniacza odmiany HA ATCC 43627 (np. 16 oznacza 16-krotne ro/cieńρ/ezie surowicy), wyższe liczby, wyższa aktywność cżtotoksżc/za lub miano.
Jak pokazano w tabeli 3, surowica odpornościowa anty-OMP 106 ma 8-krotzre większą aktywność cytotoksyczną niż wstępna surowica odpornościowa. Odkrycie to wskazuje, ze polipeptyd OMP106 jest użyteczny jako s/c/eeioZka przeciw szczepom i odmianom HA M.catarrhalis.
189 375
WYKAZ SEKWENCJI
1) informacje OGÓLNE:
i) ZGŁASZAJĄCY: TUCKER, KENNETH
PLOSILA, LAURA ii) TYTUŁ WYNALAZKU: POLIPEPTYD BIAŁKA 106 BŁONY ZEWNĘTRZNEJ
MORAXELLA CATARRHALIS, JEGO SEKWENCJA GENOWA
I ZASTOSOWANIA iii) LICZBA SEKWENCJI: 8 iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:
A) DRES: PENNIE & EDMONDS
B) ULICA: 1115ii Avenue of the Amencas
C) MIASTO : Nowy tok
D) STAN : Nowy tok
E) KFAJJ: USA
F) KOD : 10036-7711
v) POSTAĆ ODCZYTYWALNA PRZEZ KOMPUTER:
A) TYP STEROW/NIIA : Sj dysków
B) KOMPUTER : Zgodny z IBM PC
C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS
D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Realase #1,0, Wersja #1,30 vi) AKTUALNE DANE ZGŁOSZENIOWE:
A) NUMER ZGŁOSZENIA: US
B) DATA WYPEŁNIENIA:
C) KLASYFIKACJA:
viii) INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU/POŚREDNIKU
A) NAZWISKO: Baldwm, Geraldine F
B) NUMER rREJESTRACYJNY: 31,232
C) NUMER ŚWIADECTWA/POZWOLENIA: 7969-045 ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
A) TELEFON : (212) 790-9090
B) TELEFAKS: (212) 869-8864
C) TELEKS : 661-1 i PEENIE
2) INFORMACJE O SEQ ID nr 1:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 43 aminokwasy
B) TYP: ammokwas
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW:
D) TOPOLOGIA: nieznirna ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 1:
189 375
Ile Gly Ile Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn 5 10
Ala Arg Gly Asp Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln
20 25
Ala Leu Gly Ser Ile Ala Ile Ala Ile Gly Asp Asn Lys Ile
35 40
Val
2) INFORMACJE O SEQ ID nr 2:
| i) | CECHY SEKWENCJI: |
| A) | DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów |
| B) | TYP: aminokwas |
| C) | ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: |
| D) | TOPOLOGIA: niezanana |
| ii) | TYP CZĄSTECZKI: peptyd |
| v) | TYP FRAGMENTU: wewenętrzny |
| xi) | OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 2: |
Gly Thr Val Leu Gly Gly Lys Lys
5
2) INFORMACJE O SEQ ID nr 3:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad
B) TYP: kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nieznana
D) TOPOLOGIA: niezanana ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy A) OPIS: /opis = „sonda” xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 3:
GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR 2) INFORMACJE O SEQ ID nr 4:
i) CECHY SEKWENCJI:
A) DŁUGOŚĆ: 72 pary zasad
B) TYP. kwas nukleinowy
C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza
D) TOPOLOGIA: niezanana ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy kwas nukleinowy ix) WŁAŚCIWOŚĆ:
A) NAZWA/KLUCZ: CDS
B) POŁOŻENIE: 1..72 xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 4:
GAA GCG GAĆ GGG GGG AAA GGC GGA GCC AAT GCG CGC GGT GAT Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly ASP
189 375
5 10
AAA TCC ATT GCT ATT GGT GAĆ ATT GCG CAA Lys Ser Iie Ala Iie Gly Asp Iie Ala Gln
20
2J lNFORMACJH O SEQ lD nr 5: ij CECHY SEKWENCJl:
AJ DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasy BJ TYP: aminokwas DJ TOPOLOGlA: liniowa iij TYP CZĄSTECZKJ: białko xij OPlS SEKWENCJl: SEQ lD nr 5:
Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp
5 10
Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gin 15 20
2J INFORMACJE O SEQ ID nr 6: ij CECHY SEKWENCJI:
AJ DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad BJ TYP: kwaa nzgleinorvy
CJ ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nijrzyza DJ TOPOLOGIA: ntjzynana iij TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy AJ OPIS: /opos = „sonon” xij OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 6: YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC 2J INFORMACJE O SEQ ID nr 7:
ij CECHY SEKWENCJI:
Aj DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad BJ TYP: kwas nukleinowy CJ ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nieznana DJ TOPOLOGIA: niezyzana iij TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy Aj OPIS: /opis = „sonda” xij OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 7: GGNACNGTNT TRGGNGGNAA RAAR 2J INFORMACJE O SEQ ID nr 8:
ij CECHY SIE^^WE^CJI:
AJ DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad BJ TYP: kwas nukleinowy CJ ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nieznana DJ TOPOLOGIA: nijzynany
189 375 ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy A) OPIS: /opis = „sonda” xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 8: YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC
189 375
Orcynol 8176 49143 ·· . 3 ·.'·'·' . . . ; .· ; j
2 3 4 T 2 3 4 2 3 4
FIG. 2
189 375
CO
106 t H
495
325 275
185.
HA 4 0 0 2 4 4
FIG.3
189 375
HA
| frt | s | o | r- | CO | H- CM | eo CM |
| £ | Cu | CM | 3 | 3 | co | co |
| IO | to | PO | PO | ro | fO | |
| 5 | cu | CJ | *3* | sr | M* |
*··
PO o
•e
FIG,4
106 *80
49.5
32.5
27.5
18.5
189 375
49143-ΝΗΑ
495
32.5 * «Μ
27.5
HA 4+F1G.5
189 375
200
116
Μ· . I. . I
FIG.6
189 375
* POCZĄTEK
FIG.7
2000*
189 375
A B C D E F G
FIG. 8A
Mf
-106 ^80 «49.5
-32.5
-27.5
-18.5
ABCDE FGMr
FIG.8B
189 375
OMP 106
— 27.5 — 18.5
F1G.9A
189 375
FIG.9B
Mr — 106 — 80 — 49.5 — 32.5 — 27.5 — 18.5
189 375
8176 23246 25238 49143
FIG.1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz
Cena 6,00 zł.
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Izolowane przeciwciało, znamienne tym, że specyficznie wiąże się z polipeptydem OMP106, który jest polipeptydem błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis i ma masę cząsteczkową około 180 000 do około 230 000, jak określono przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z SDS przy użyciu miozyny mięśnia szkieletowego królika i β-galaktozydazy E. coli jako standardów masy cząsteczkowej o odpowiednio 200 000 i 116 500, i który zawiera sekwencję SEQ ID nr: 1 Iub SEQ ID nr: 1 i SEQ ID nr: 2 Iub ich fragment składający się z przynajmniej 6 reszt aminokwasowych.
- 2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi przeciwciało cytotoksyczne, które pośredniczy w zabijaniu Moraxella catarrhalis z udziałem dopełniacza.
- 3. Zastosowanie izolowanego przeciwciała opisanego w zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji M. catarrhalis.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/642,712 US7341727B1 (en) | 1996-05-03 | 1996-05-03 | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
| PCT/US1997/007679 WO1997041731A1 (en) | 1996-05-03 | 1997-04-28 | Moraxella catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, gene sequence and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL189375B1 true PL189375B1 (pl) | 2005-07-29 |
Family
ID=24577687
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97366359A PL189374B1 (pl) | 1996-05-03 | 1997-04-28 | Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego i jej zastosowanie |
| PL97330935A PL189995B1 (pl) | 1996-05-03 | 1997-04-28 | Izolowany polipeptyd OMP106, fragment polipeptydowy, szczepionka, kompozycja antygenowa oraz zastosowanie polipeptydu OMP106 i jego fragmentu |
| PL97366360A PL189375B1 (pl) | 1996-05-03 | 1997-04-28 | Izolowane przeciwciało i jego zastosowanie |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97366359A PL189374B1 (pl) | 1996-05-03 | 1997-04-28 | Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego i jej zastosowanie |
| PL97330935A PL189995B1 (pl) | 1996-05-03 | 1997-04-28 | Izolowany polipeptyd OMP106, fragment polipeptydowy, szczepionka, kompozycja antygenowa oraz zastosowanie polipeptydu OMP106 i jego fragmentu |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US7341727B1 (pl) |
| EP (1) | EP0900025B1 (pl) |
| JP (2) | JP4401437B2 (pl) |
| CN (2) | CN100415871C (pl) |
| AR (1) | AR006999A1 (pl) |
| AT (1) | ATE244016T1 (pl) |
| AU (1) | AU723528B2 (pl) |
| BG (1) | BG64832B1 (pl) |
| BR (1) | BR9711090A (pl) |
| CA (1) | CA2253636C (pl) |
| CZ (1) | CZ298034B6 (pl) |
| DE (1) | DE69723254T2 (pl) |
| EA (1) | EA002743B1 (pl) |
| EE (1) | EE04684B1 (pl) |
| ES (1) | ES2202624T3 (pl) |
| GE (1) | GEP20022695B (pl) |
| HK (2) | HK1021299A1 (pl) |
| HU (1) | HU223004B1 (pl) |
| NO (2) | NO324816B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ332896A (pl) |
| PL (3) | PL189374B1 (pl) |
| SK (1) | SK284812B6 (pl) |
| TW (1) | TW541314B (pl) |
| UA (1) | UA68332C2 (pl) |
| WO (1) | WO1997041731A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA973809B (pl) |
Families Citing this family (71)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6440425B1 (en) * | 1995-05-01 | 2002-08-27 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
| US6335018B1 (en) * | 1995-05-01 | 2002-01-01 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
| US7341727B1 (en) * | 1996-05-03 | 2008-03-11 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
| AUPO652897A0 (en) | 1997-04-30 | 1997-05-29 | University Of Melbourne, The | Synthetic peptide constructs for the diagnosis and treatment of periodontitis |
| GB9714276D0 (en) | 1997-07-08 | 1997-09-10 | Univ Dundee | Peptides and related compounds |
| US8129500B2 (en) | 1997-12-10 | 2012-03-06 | Csl Limited | Porphyromonas gingivalis polypeptides and nucleotides |
| GB9808720D0 (en) * | 1998-04-23 | 1998-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| GB9810084D0 (en) | 1998-05-11 | 1998-07-08 | Cortecs Uk Ltd | Proteins |
| EP1078065A2 (en) | 1998-05-12 | 2001-02-28 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | Compounds from moraxella catarrhalis |
| GB9810193D0 (en) * | 1998-05-12 | 1998-07-08 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| GB9810285D0 (en) | 1998-05-13 | 1998-07-15 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| US6541616B1 (en) | 1998-10-01 | 2003-04-01 | Antex Biologics Inc. | Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof |
| CA2365296A1 (en) | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Pierre Michel Desmons | Vaccine |
| US6673910B1 (en) | 1999-04-08 | 2004-01-06 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to M. catarrhalis for diagnostics and therapeutics |
| CA2374364A1 (en) * | 1999-05-24 | 2000-11-30 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Polypeptides and polynucleotides from moraxella catarrhalis |
| GB9915031D0 (en) * | 1999-06-25 | 1999-08-25 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| GB9921691D0 (en) * | 1999-09-14 | 1999-11-17 | Smithkline Beecham Sa | Novel compounds |
| ATE368686T1 (de) * | 1999-09-14 | 2007-08-15 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Polypeptide aus moraxella (branhamella) catarrhalis |
| GB0022742D0 (en) | 2000-09-15 | 2000-11-01 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| GB0103171D0 (en) | 2001-02-08 | 2001-03-28 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
| SE0102410D0 (sv) * | 2001-07-04 | 2001-07-04 | Arne Forsgren | Novel surface exposed immunoglobulin D-binding protein from moraxella catarrhalis |
| JP2006506467A (ja) | 2002-08-02 | 2006-02-23 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン組成物 |
| CN104815327A (zh) | 2005-04-08 | 2015-08-05 | 惠氏有限责任公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
| CN100357318C (zh) * | 2005-10-11 | 2007-12-26 | 中山大学 | 美人鱼发光杆菌外膜蛋白w和编码序列及其制备方法和应用 |
| TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
| GB0607088D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| CA2808919C (en) | 2005-12-22 | 2016-04-19 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine |
| ZA200805602B (en) | 2006-01-17 | 2009-12-30 | Arne Forsgren | A novel surface exposed haemophilus influenzae protein (protein E; pE) |
| EP2038297A4 (en) | 2006-06-27 | 2010-03-03 | Oral Health Australia Pty Ltd | PORPHYROMONAS GINGIVALIS POLYPEPTIDES SUITABLE FOR PREVENTION OF PERIODONTITIS |
| DK2167121T3 (en) | 2007-06-26 | 2015-11-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | A vaccine comprising Streptococcus pneumoniae kapselpolysaccharidkonjugater |
| US20100297179A1 (en) | 2007-07-12 | 2010-11-25 | Stuart Geoffrey Dashper | Immunology Treatment for Biofilms |
| EP2175851B1 (en) * | 2007-07-12 | 2013-05-15 | Oral Health Australia Pty Ltd | Biofilm treatment |
| US8642046B2 (en) * | 2007-10-09 | 2014-02-04 | Tufts University | Cholera vaccines |
| BRPI0917321A2 (pt) | 2008-08-29 | 2015-11-17 | Oral Health Australia Pty Ltd | prevenção, tratamento e diagnóstico de infecção por p. gingivalis |
| US8140041B2 (en) * | 2009-08-27 | 2012-03-20 | Mediatek Inc. | Tunable capacitive device with linearization technique employed therein |
| ES2366735B1 (es) * | 2009-10-08 | 2012-09-13 | Fundación Pública Andaluza Para La Gestión De La Investigación En Salud De Sevilla | Vacuna frente a acinetobacter baumannii. |
| US9700889B2 (en) | 2009-11-23 | 2017-07-11 | Cyvek, Inc. | Methods and systems for manufacture of microarray assay systems, conducting microfluidic assays, and monitoring and scanning to obtain microfluidic assay results |
| US9759718B2 (en) | 2009-11-23 | 2017-09-12 | Cyvek, Inc. | PDMS membrane-confined nucleic acid and antibody/antigen-functionalized microlength tube capture elements, and systems employing them, and methods of their use |
| US9500645B2 (en) | 2009-11-23 | 2016-11-22 | Cyvek, Inc. | Micro-tube particles for microfluidic assays and methods of manufacture |
| JP5701894B2 (ja) | 2009-11-23 | 2015-04-15 | サイヴェク・インコーポレイテッド | アッセイを行う方法及び装置 |
| US10065403B2 (en) | 2009-11-23 | 2018-09-04 | Cyvek, Inc. | Microfluidic assay assemblies and methods of manufacture |
| WO2013134744A2 (en) | 2012-03-08 | 2013-09-12 | Cyvek, Inc | Microfluidic assay assemblies and methods of manufacture |
| US9855735B2 (en) | 2009-11-23 | 2018-01-02 | Cyvek, Inc. | Portable microfluidic assay devices and methods of manufacture and use |
| US10022696B2 (en) | 2009-11-23 | 2018-07-17 | Cyvek, Inc. | Microfluidic assay systems employing micro-particles and methods of manufacture |
| GB201003924D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
| JP2013521770A (ja) | 2010-03-10 | 2013-06-13 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン組成物 |
| CA2796571C (en) | 2010-04-13 | 2019-10-29 | Celldex Therapeutics Inc. | Antibodies that bind human cd27 and uses thereof |
| WO2011137334A1 (en) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | The Research Foundation Of State University Of New York | Compositions and methods for stimulating immune response against moraxella catarrhalis |
| GB201103836D0 (en) | 2011-03-07 | 2011-04-20 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
| WO2012129455A2 (en) | 2011-03-22 | 2012-09-27 | Cyvek, Inc | Microfluidic devices and methods of manufacture and use |
| RU2481401C2 (ru) * | 2011-07-15 | 2013-05-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ГОУ ВПО УГМА Минздравсоцразвития России) | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ β-ЛАКТАМАЗОПРОДУЦИРУЮЩИХ ОКСИДАЗОПОЗИТИВНЫХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ДИПЛОКОККОВ, ПОДОЗРИТЕЛЬНЫХ НА ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ К MORAХELLA (BRANCHAMELLA) CATARRHALIS |
| US11210432B2 (en) * | 2013-08-20 | 2021-12-28 | Janus Technologies, Inc. | Method and apparatus for selectively snooping and capturing data for secure computer interfaces |
| US20180044429A1 (en) | 2015-03-09 | 2018-02-15 | Celldex Therapeutics, Inc. | Cd27 agonists |
| GB201518684D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| US10228367B2 (en) | 2015-12-01 | 2019-03-12 | ProteinSimple | Segmented multi-use automated assay cartridge |
| WO2017184619A2 (en) | 2016-04-18 | 2017-10-26 | Celldex Therapeutics, Inc. | Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof |
| GB201621686D0 (en) | 2016-12-20 | 2017-02-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Novel methods for inducing an immune response |
| WO2018219521A1 (en) | 2017-05-30 | 2018-12-06 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Methods for manufacturing an adjuvant |
| JP2021504424A (ja) | 2017-12-01 | 2021-02-15 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | サポニン精製 |
| US11459393B2 (en) | 2018-04-17 | 2022-10-04 | Celldex Therapeutics, Inc. | Anti-CD27 and anti-PD-L1 antibodies and bispecific constructs |
| WO2020030572A1 (en) | 2018-08-07 | 2020-02-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Processes and vaccines |
| CN111157735B (zh) * | 2018-11-07 | 2023-02-07 | 广州万孚生物技术股份有限公司 | 凝集性卡他莫拉菌单克隆抗体及其制备方法和应用 |
| EP3886901A1 (en) | 2018-11-29 | 2021-10-06 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Methods for manufacturing an adjuvant |
| US20220016168A1 (en) | 2018-12-11 | 2022-01-20 | Celldex Therapeutics, Inc. | Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy |
| US20220235095A1 (en) | 2019-06-05 | 2022-07-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Saponin purification |
| CN111778226B (zh) * | 2020-07-21 | 2022-04-05 | 东北师范大学 | 一种水稻耐碱胁迫相关的质膜H+-ATPase蛋白及其应用 |
| EP4320159A1 (en) | 2021-04-09 | 2024-02-14 | Celldex Therapeutics, Inc. | Antibodies against ilt4, bispecific anti-ilt4/pd-l1 antibody and uses thereof |
| WO2023077521A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Celldex Therapeutics, Inc | Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs |
| GB202205833D0 (en) | 2022-04-21 | 2022-06-08 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Bacteriophage |
| WO2024017827A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-01-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Continuous process for vaccine production |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4675176A (en) * | 1983-12-12 | 1987-06-23 | Norden Laboratories | Moraxella bovis protease vaccine |
| US4879213A (en) * | 1986-12-05 | 1989-11-07 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse |
| US5552146A (en) * | 1991-08-15 | 1996-09-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis |
| US5607846A (en) | 1994-05-17 | 1997-03-04 | Research Foundation Of State University Of New York | Vaccine for moraxella catarrhalis |
| US6335018B1 (en) * | 1995-05-01 | 2002-01-01 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
| US6440425B1 (en) | 1995-05-01 | 2002-08-27 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
| US7341727B1 (en) * | 1996-05-03 | 2008-03-11 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
| GB9809683D0 (en) | 1998-05-06 | 1998-07-01 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| GB9812163D0 (en) | 1998-06-05 | 1998-08-05 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
-
1996
- 1996-05-03 US US08/642,712 patent/US7341727B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-04-28 AT AT97926409T patent/ATE244016T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 UA UA98126370A patent/UA68332C2/uk unknown
- 1997-04-28 WO PCT/US1997/007679 patent/WO1997041731A1/en active IP Right Grant
- 1997-04-28 NZ NZ332896A patent/NZ332896A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 PL PL97366359A patent/PL189374B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 CA CA002253636A patent/CA2253636C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-28 SK SK1509-98A patent/SK284812B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 AU AU31180/97A patent/AU723528B2/en not_active Ceased
- 1997-04-28 CN CNB2005100924509A patent/CN100415871C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-28 PL PL97330935A patent/PL189995B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 GE GEAP19974595A patent/GEP20022695B/en unknown
- 1997-04-28 CN CNB971959900A patent/CN1222618C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-28 EE EE9800373A patent/EE04684B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 HU HU9902695A patent/HU223004B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 ES ES97926409T patent/ES2202624T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-28 PL PL97366360A patent/PL189375B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 CZ CZ0352498A patent/CZ298034B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 EA EA199800973A patent/EA002743B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-04-28 EP EP97926409A patent/EP0900025B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-28 JP JP54015697A patent/JP4401437B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-28 DE DE69723254T patent/DE69723254T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-28 BR BR9711090A patent/BR9711090A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-05-01 TW TW086105809A patent/TW541314B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-05-02 ZA ZA9703809A patent/ZA973809B/xx unknown
- 1997-05-05 AR ARP970101850A patent/AR006999A1/es active IP Right Grant
- 1997-11-12 US US08/968,685 patent/US6214981B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-11-02 NO NO19985113A patent/NO324816B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-12-02 BG BG102983A patent/BG64832B1/bg unknown
-
2000
- 2000-01-18 HK HK00100316A patent/HK1021299A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-03-20 US US09/813,214 patent/US7128910B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-08-18 NO NO20063711A patent/NO20063711L/no not_active Application Discontinuation
- 2006-10-16 US US11/580,854 patent/US7576179B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-01-12 HK HK07100467.7A patent/HK1095358A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2007-10-26 US US11/925,586 patent/US20080145916A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-01-10 JP JP2008003407A patent/JP2008161194A/ja active Pending
-
2009
- 2009-08-14 US US12/541,701 patent/US7914795B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL189375B1 (pl) | Izolowane przeciwciało i jego zastosowanie | |
| US7846451B2 (en) | Moraxella catarrhalis protein, nucleic acid sequence and uses thereof | |
| US20020018782A1 (en) | Neisseria meninigitidis polypeptide, nucleic acid sequence and uses thereof | |
| KR100500000B1 (ko) | 모락셀라카타르할리스외측막단백질-16폴리펩티드,이의유전자서열및이의용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20100428 |