PL189995B1

PL189995B1 - Izolowany polipeptyd OMP106, fragment polipeptydowy, szczepionka, kompozycja antygenowa oraz zastosowanie polipeptydu OMP106 i jego fragmentu

Info

Publication number: PL189995B1
Application number: PL97330935A
Authority: PL
Inventors: Kenneth Tucker; Laura Plosila
Original assignee: Antex Biolog Inc
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-04-28
Publication date: 2005-10-31
Also published as: BR9711090A; PL189375B1; AU3118097A; EP0900025A4; US20100021492A1; HUP9902695A2; CZ352498A3; NO324816B1; US20080145916A1; SK284812B6; WO1997041731A1; EE04684B1; GEP20022695B; CZ298034B6; CA2253636C; HK1095358A1; ATE244016T1; EA002743B1; US7341727B1; EP0900025A1

Abstract

1 . Izolowany polipeptyd OMP1O 6, znamienny tym, ze stanowi polipeptyd blony zewnetrznej Moraxella catarrhalis i ma mase czasteczkowa okolo 180 000 do okolo 230 000, jak okreslono przez elektroforeze w zelu poliakrylamidowym z SDS przy uzyciu miozyny miesnia szkieletowego królika i ß-galaktozydazy E. coli jako standardów masy czasteczkowej o odpowiednio 200 000 i 116 500, i zawiera sekwencje oznaczona jako SEQ ID nr: 1 lub sekwencje w przynajmniej 80% identyczna z SEQ C D nr 1 . 8. Fragment polipeptydowy, znamienny tym, ze sklada sie z przynajmniej 6 reszt aminokwa- sowych polipeptydu OMP10 6 opisanego w zastrzezeniu 1 . 9. Szczepionka, znamienna tym, ze zawiera polipeptyd OMP10 6 opisany w zastrz. 1. 10. Szczepionka, znamienna tym, ze zawiera fragment polipeptydu OMP106 opisany w zastrz. 8. 11. Kompozycja antygenowa, znamienna tym, ze zawiera polipeptyd OMP106 opisany w zastrz. 1 . 12. Kompozycja antygenowa, znamienna tym, ze zawiera fragment polipeptydu OMP106 opi- sany w zastrz. 8. 13. Zastosowanie polipeptydu opisanego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia lub za- pobiegania infekcji M.catarrhalis. 14. Zastosowanie fragmentu polipeptydu OMP106 opisanego w zastrz. 8 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji M.catarrhalis. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd OMP1O6, fragment polipeptydowy, szczepionka, kompozycja antygenowa oraz zastosowanie polipeptydu OMP106 i jego fraampntn

Moraxella catarrhalis, znana także jako Moraxella (Branhamella) catarrhalis lub Branhamella catarrhalis, a wcześniej znana jako Neisseria catarrhalis lub Micrococcus catarrhalis, jest gram-ujemną bakterią często występującą w drogach oddechowych ludzi. M.catarrhalis, którą uważano początkowo za nieszkodliwy organizm komensalny, obecnie uznaje się ją za istotny patogen infekcji górnych i dolnych dróg oddechowych u zwierząt. U ludzi M.catarrhalis powoduje poważne infekcje dolnych dróg oddechowych dorosłych z przewlekłymi chorobami płuc, infekcje układowe u pacjentów z obniżoną odpornością oraz zapalenie

189 995 ucha środkowego i zapalenie zatok u niemowląt i dzieci. Patrz Helminen i in., 1993, Infect.

Immun. 61:2003-2010; B.W. Catlin, 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320; oraz odnośniki tu cytowane.

Białka błony zewnętrznej i przeciwciała zabezpieczające

Składniki powierzchni zewnętrznej Moraxella catarrhalis studiowano w celu zrozumienia patogennego procesu infekcji M.catarrhalis oraz w celu opracowania użytecznych działań terapeutycznych i środków profilaktycznych przeciw takim infekcjom. Białka błony zewnętrznej (OMP) w szczególności zwracały uwagę jako możliwe czynniki wirulencji i jako potencjalne antygeny szczepionki. M.catarrhalis posiada około 10-20 różnych OMP, przy czym 6-8 z nich, OMP od A do H są rodzajami najpowszechniejszymi (Murphy i Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174). Masy cząsteczkowe OMP A-H wynoszą odpowiednio od 97 do 20 000. Patrz Bartos i Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765; Helminen i in., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Murphy i in., 1993, Molecul. Microbiol. 10:87-97; oraz Sarwar i in., 1992, Infect. Immun. 60:804-809. Porównanie profili białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) preparatów błony zewnętrznej od 50 szczepów M.catarrhalis, wykazały prawie jednorodne wzory OMP A-H (Bartos i Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765).

Poza OMP A-H, zidentyfikowano także OMP o wysokiej masie cząsteczkowej, oznaczony HMW-OMP, posiadające znaczną masę, wynoszącą 350-720 000 w SDS-PAGE, jako inny uwydatniający się składnik powierzchniowy obecny w wielu szczepach M.catarrhalis. HMW-OMP poddany denaturacji kwasem mrówkowym wytwarza pojedynczą wstęgę o 120-140 000, a więc jak okazuje się, jest białkiem oligomerycznym (Klingman i Murphy, 1994, Infect. Immun. 62:1150-1155). Okazuje się, że HMW-OMP jest takim samym białkiem jak to, oznaczone przez Helminena i in., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872) jako UspA i wykazano, że jest obecne w licznych szczepach M.catarrhalis.

W całych bakteriach lub pęcherzykach błony zewnętrznej pochodzącej od bakterii, kilka z powyżej określonych OMP prezentuje epitopy o ekspozycji powierzchniowej, które wywołują wytwarzanie przeciwciał, wiążących OMP. Te antygenne OMP obejmują OMP E i OMP G (Murphy i Bartos, 1989, Infect. Immun. 57:2938-2941); OMPC/D (Sarwar i in., 1992, Infect. Immun. 60:804-809); CoB, OMP o 80000, (Helminen i in., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010); oraz UspA (Helminen i in., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).

Możliwości lecznicze przeciwciał wobec epitopów o ekspozycji powierzchniowej CopB i UspA, oceniono na modelu zwierzęcym. Model obejmował bezpośrednie zaszczepienie płuca myszy BALB/c VAF/Plus w jednej dużej dawce, kontrolowaną ilością komórek M.catarrhalis i następnie badanie tempa klirensu płucnego bakterii (Unhanand i in., 1992,

J. Infect. Dis. 165:644-650). Różne izolaty kliniczne M.catarrhalis wykazywały różne tempa klirensu, które korelowały z poziomem rekrutacji granulocytów do miejsca infekcji. Immunizacja bierna przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko epitopowi o ekspozycji powierzchniowej albo CopA albo UspA zwiększała tempo klirensu płucnego M.catarrhalis (Helminen i in., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminen i in., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).

Przyleganie i hemaglutynacja komórek bakteryjnych/gospodarza

Przyleganie patogenów bakteryjnych do powierzchni komórkowej gospodarza pobudza kolonizację i początkuje patogenezę. Patrz. E.H. Beachey, 1981, J. Infect. Dis. 143:325-345. Gram-ujemne bakterie zwykle wykazują ekspresję lecytyn powierzchniowych, które wiążą się ze specyficznymi oligosacharydami glikoprotein i/lub glikolipidów na powierzchni komórkowej gospodarza. Takie lecytyny są często związane z piliami lub fimbriami. Przyleganie bakterii może także występować przy nie-specyficznym wiązaniu wynikającym z interakcji hydrofobowych i/lub ładunkowych z powierzchnią komórkową gospodarza.

Mechanizm przylegania M.catarrhalis do komórek dróg oddechowych pozostaje słabo zrozumiany. Organizm przylega do hodowanych komórek nabłonka części ustnej gardła człowieka (Mbaki i in., 1987, Tohuku J. Exp. Med. 153:111-121). Badania Rikitomi'ego i in., sugerują, że w przyleganiu do takich komórek mogą grać rolę fimbrie jako, że denaturacja fimbrii lub traktowanie przeciwciałami anty-fimbriom zmniejsza przyleganie u szczepów z fimbriami (Rikitomi i in., 1991, Scand. J. Infect. Dis. 23:559-587). Jednak wiązanie, w którym

189 995 pośredniczą fimbrie, nie może być jedyną podstawą tego przylegania jako, że szczepy najbardziej przylegające, wśród kilku badanych, były szczepami bez fimbrii.

W klasyfikacji adhezyn bakteryjnych reakcje hemaglutynacji często zastępują bardziej skomplikowane testy przylegania. Jednakże, Rikitomi i in. odkrył brak korelacji między przyleganiem do ludzkich komórek nabłonka części ustnej gardła i hemaglutynacją u szczepów M.catarrhalis (jak wyżej). To jest trzy szczepy o wysokim stopniu przylegania nie ulegają aglutynacji z erytrocytami człowieka. Tak więc, różne mechanizmy wiązania angażują się w przyleganie i hemaglutynację ludzkich komórek nabłonka ustnej części gardła.

Przeciwnie, ostatnie badanie Kellensa i in., sugeruje, że hemaglutynacja M.catarrhalis jest skorelowana z przyleganiem do komórek gospodarza (Kellens i in., 1995, Infection 23:37-41). Jednak badanie to wykorzystywało test przylegania na podstawie wiązania bakterii do skrawków tchawicy świni. Nie jest oczywiste, czy tkankę tchawicy świni można uznać za homologiczną z tkanką układu oddechowego człowieka pod względem przylegania patogennych szczepów M.catarrhalis.

Nie zważając na problematyczne oznaczenie przylegania, Kellens i in., przebadali aktywność hamaglutynacji osiemdziesięciu kilku izolatów klinicznych M.catarrhalis (Kellens i in., 1995, Infection 23:37-41). Prawie trzy czwarte badanych szczepów, ulegało aglutynacji z erytrocytami ludzkimi, króliczymi, świnki morskiej, psimi lub szczurzymi, podczas gdy pozostałe szczepy nie. Aktywność aglutynacji dla niektórych szczepów hemaglutynujących scharakteryzowano dalej i wykazano, że jest ona zależna od jonów wapnia i hamowana przez trawienie trypsyną lub przez traktowanie wysoką temperaturą, albo dodanie D-glukozaminy lub D-galaktozaminy.

Badanie hemaglutynujących i nie-hemaglutynujących szczepów M.catarrhalis przez Tuckera i in. wykazało, że wszystkie szczepy wiążą glikolipid gangliotetraozyloceramid lecz tylko szczepy hemaglutynujące wiążą glikolipid globotetraozyloceramid (Tucker i in., 1994, Annual Meeting of Amer. Soc. Microbiol., skrót nr D124). Ponadto, aktywność hemaglutynująca M.catarrhalis jak się okazało, jest hamowana przez różne jednocukry, które zawierają cząstkę węglowodorową globotetraozyloceramidu. Te obserwacje doprowadziły Tuckera i in., do wniosku, że M.catarrhalis hemaglutynuje przez wiązanie się z globotetraozyloceramidami w błonach komórkowych wrażliwych erytrocytów, także tymi z ludzkich krwinek czerwonych. Do dzisiaj nie zidentyfikowano cząsteczki na powierzchni zewnętrznej M.catarrhalis odpowiedzialnej albo za przyleganie do komórki gospodarza albo hemaglutynację.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest izolowany polipeptyd OMPlOó stanowiący polipeptyd błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis o masie cząsteczkowej około 180 000 do około 230 000, określonej przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z SDS przy użyciu miozyny mięśnia szkieletowego królika i β-galaktozydazy E. coli jako standardów masy cząsteczkowej o odpowiednio 200 000 i 116 500, i zawierający sekwencję oznaczoną jako SEQ ID nr: 1 lub sekwencję w przynajmniej 80 % identyczną z SEQ ID nr 1.

Korzystnie polipeptyd OMPlOó zawiera ponadto sekwencję SEQ ID nr: 2.

Korzystniej polipeptyd OMPlOó ma masę cząsteczkową około 190 000.

Korzystnie polipeptyd OMPlOó stanowi polipeptyd błony zewnętrznej szczepu Moraxella catarrhalis wybranego z grupy składającej się z ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628 i ATCC 49143.

Korzystniej szczep Moraxella catarrhalis stanowi szczep ATCC 49143.

Również korzystnie polipeptyd OMPlOó stanowi polipeptyd Moraxella catarrhalis odmiany hemaglutynującej.

Korzystnie polipeptyd OMPlOó reaguje z barwnikiem srebrnym.

Przedmiotem wynalazku jest również fragment polipeptydowy składający się z przynajmniej 6 reszt aminokwasowych polipeptydu OMPlOó opisanego powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca polipeptyd OMPlOó opisany powyżej.

Korzystnie szczepionka zawiera fragment polipeptydu OMP-lOó opisany powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja antygenowa zawierająca polipeptyd OMPlOó opisany powyżej.

189 995

Korzystnie kompozycja antygenowa zawiera fragment polipeptydu OMP106 opisany powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu OMP1O6 opisanego powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji M. catarrhalis.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie fragmentu polipeptydu OMP106 opisanego powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji M. catarrhalis.

Niniejszy wynalazek ma wiele zastosowań. Przykładowo, polipeptyd OMP106 i polipeptydy pochodzące od OMP106 można stosować jako Ugandy do detekcji przeciwciał wzbudzonych w odpowiedzi na infekcję M.catarrhalis (np. w diagnozie infekcji M.catarrhalis). Polipeptyd OMP106 i polipeptydy pochodzące od OMP106 można także stosować jako immunogeny do indukcji przeciwciał specyficznych wobec M.catarrhalis.

Takie przeciwciała są użyteczne w oznaczeniach immunologicznych do wykrywania M.catarrhalis w próbkach biologicznych. Przeciwciała cytotoksyczne według wynalazku są pożyteczne w biernej immunizacji przeciw infekcjom M.catarrhalis. Polipeptyd OMP106 i polipeptydy pochodzącej od OMP106 można dalej stosować jako składniki aktywne szczepionek przeciw infekcjom M.catarrhalis.

Wynalazek opiera się na zaskakującym stwierdzeniu, że hemaglutynujące szczepy i hodowle M.catarrhalis, posiadają białko błony zewnętrznej, polipeptyd OMP106, którego masa wynosi około 180 000 do około 230 000, oraz że nie-hemaglutynujące szczepy i hodowle M.catarrhalis albo nie posiadają polipeptydu OMP106 albo posiadają nieodpowiednio zmodyfikowany polipeptyd OMP106, który jest nieaktywny pod względem hemaglutynacji i nie ulega barwieniu srebrem.

Wynalazek opiera się dalej na stwierdzeniu, że poliklonalna surowica odpornościowa wzbudzona przez polipeptyd OMP106 wyizolowany z hemaglutynującego szczepu M.catarrhalis, ma aktywność cytotoksyczną przeciw innemu szczepowi hemaglutynującemu M.catarrhalis lecz nie przeciw nie-hemaglutynującemu szczepowi M.catarrhalis.

Definicje i skróty = prasciwciuto lub surowica odpornościowa przeciw polipeptydowi OMP106 = Amerykański Zbiór Hodowli Typowych = natiu-aanie pęcherzyki błłorn^' zewnętrznej

M.catarrhalis = Ga1Nac β1-3Galα1-4Galβ1-4Glrl-1Ceramid = hemaglutynujący = zakbny do ws'wolywania kcom:3i^r^^o^<2j ll^łb hŁU^moibHli^j odpowiedzi immunologicznej kD = kilodaltony

M^atarThalis = Mc;

anty-OMP 106

ATCC pęcherzyki

Gb4

Ha

Immunoreaktywny

NHA

OG

OMP106 polipeptyd

Moraxella catarThalis;

Moraxella (Branhamella) catarrhalis;

Branhamella catanhalis;

Neisseria ratarbhalis; lub Mirbococrus catarThalis = nie-hemaglutynujący = N-o=Nlo^-D-gbikoplranozyd bab dktyl oglukozyd = poHpeptyd bii^b^a 11)ć> błony zewnętrznej MoraxeHa catanhalis, posiadający masę cząsteczkową około 180 000 do 230 000 określoną w SDS-PAGE; możliwy do ekstrakcji z pęcherzyków lub całych komórek M.catarrhalis przez OG lub detergent sai'kozyk)wy.

= fragmenn polipeppydu OMP106; odmiana poilpepCydu OMP106 dzikiego typu lub jego fragment, zawierający jedną lub więcej delecji aminokwasowych, insercji lub substytucji; albo białko chimeryczne, zawierające poliCectyC heterolopicany połączony z segmentem C-terminal6

189 995 nym lub N-terminalnym albo wewnętrznym całego lub części polipeptydu OMP1O6

OMPs = białko błony zewęęrrznej

MPs = białka łłO^i^y zewnętrznej

PBS = fiejologiczny roztwór soii bułorowany Oosłoranem

PAG = że i poiiaky/iamidowy

Polipeptyd = peptyd o dowolner dbigości , posiadejący dziefięć lub wiecej reszt aminokwasowych

SDS = i^od^t^^ksOc^^fctr^n sodu

SDS-PAGE = eeektroOoreza w żelu poiiaktyiamidotymi z iOoi^^^^k-siarczanem sodu

Sekwencje nukleotydowe lub kwasu nukleinowego tu określone przedstawia się za pomocą symboli jednoliterowych kznrśrrjącyśh zasady, eak następuie:

A (adenina)

C (cytozyna)

G (guanina)

T (tymina)

U (uracyl)

M (A lub C)

R (A lub G)

W (A lub T/U)

S (C lub G)

Y (C lub T/U)

K (G lub T/U)

V (A lub C albo G, nie TUJ)

H (A lub C albo TUJ, nie G)

D (A lub G albo T/U; nie C)

B (C lub G albo T/U, nie A)

N (A lub C albo G lub TU) albo (nieznany)

Sekwencie peptydowe i polipeptydowe tu określone przedstawia się za pomocą symboli jednolitetkwych oznrcząjąśyśh reszty aminokwasowe, eak następie:

A (alanina)

R (arginina)

N (aspat^a^ir^a)

D (kwas asparaginowy)

C (cysteina)

Q (glutamina)

E (kwas glutaminowy)

G glicyna)

H (histydyna)

I (izoleucyna)

L (leucyna)

K (lizyna)

M (metionina)

F (fenyloalanina)

P (prolina)

S (seryna)

T (treonina)

W (ttyptofan)

Y (tyrozyna)

V (walina)

X (nieznany)

Ninieeszy wynalazek może być pełniee zrozumiały przez odniesienie się do następ^ącego szczegółowego opisu wynalazku, nieogtanicrąjących przykładów konkretnych postaci realizacji wynalazku oraz załączonych rysunków.

189 995

Krótki opis rysunków

Figura 1: Porównanie profili w denaturującym PAGE białka błony zewnętrznej pęcherzyków M.catarrhalis lub ekstraktów oktylo-glukozydowych (OG) całych komórek M.catarrhalis. Liczby nad torami odnoszą się do oznaczeń szczepów ATCC. Wstępnie barwionego standardu SDS-PAGE (katalog BioRad # 161-0305) użyto jako markera masy cząsteczkowej. Standard składał się z następujących polipeptydów z ich przybliżonymi masami cząsteczkowymi podanymi w nawiasach: fosforylaza B mięśnia królika (106 000); albumina surowicy bydlęcej (80 000); owoalbumina białka jaja kurzego (49500); anhydraza węglowa bydła (32500); inhibitor trypsyny sojowej (27500); lizozym białka jaja kurzego (18500). Pozycje markerów masy cząsteczkowej w żelu podano po lewej stronie rysunku za pomocą strzałek z masami cząsteczkowymi (kD) niektórych markerów powyżej strzałek.

Figura 2: Wyniki z nakładających się chromatogramów cienkowarstwowych glikolipidów z pęcherzykami błony zewnętrznej znakowanymi ^l25I. W tabelach A-C, tor 1 zawiera standardy glikolipidowe wskazane na lewo; tor 2 zawiera asialo-GMi tor 3 zawiera Gb3, Gb4 i antygen Forssmana; i tor 4 zawiera ekstrakcje Folcha ludzkich erytrocytów. Chromatogram ukazany w tabeli A barwiono orcynolem, na chromatogram ukazany w tabeli B nawarstwiono pęcherzyki znakowane ^⁵I szczepu ATCC 8176 (szczep nie-hemaglutynujący), a na chromatogram ukazany w tabeli C nawarstwiono pęcherzyki znakowane szczepu ATCC 49143 (szczep hemaglutynujący). Tylko szczep hemaglutynujący wiązał się z wstęgą glikolipidu Gb4 w trzecim i czwartym torze.

Figura 3: Profile białkowe ekstraktów oktylo-glukozydu z barwieniem srebrem białek błony zewnętrznej, po trawieniu komórek M.catarrhalis proteazami wskazanymi na rysunku. Aktywność hemaglutynacji po trawieniu wskazuje się na dole rysunku w rzędzie oznakowanym HA. Użyte markery masy cząsteczkowej są takie jak dla fig. 1.

Figura 4: Porównanie profili białkowych przez barwienie srebrem białek błony zewnętrznej z różnych szczepów ATCC M.catarrhalis. Oznaczenia szczepów wskazano nad torami. Aktywność hemaglutynacji szczepów wskazuje się w rzędzie oznakowanym HA na dole rysunku. Należy zauważyć, że białko, posiadające widoczną masę cząsteczkową większą niż fosforylaza B mięśnia królika (106 000) występuje powszechnie w szczepach hemaglutynujących, lecz nie ma go w szczepach nie-hemaglutynujących. Ten polipeptyd oznakowano OMP106. Użyte markery masy cząsteczkowej są takie jak dla fig. 1.

Figura 5: Porównanie profili białkowych przez barwienie srebrem białek błony zewnętrznej z dwóch hodowli M.catarrhalis ATCC 49143: 49143 (hodowla hemaglutynująca) i 49143-NhA (hodowla nie-hemaglutynująca). Aktywność hemaglutynacji hodowli wskazuje się na dole rysunku w rzędzie oznakowanym HA. Należy zauważyć nieobecność wstęgi polipeptydu OMP106 (oznaczone przez <) w hodowli nie-hemaglutynującej. Użyte markery masy cząsteczkowej są takie jak dla fig. 1.

Figura 6: Oszacowanie masy cząsteczkowej OMP106 w 6% denaturującym żelu poliakrylamidowym przy użyciu ekstraktów OG szczepu ATCC 49143, które inkubowano w buforze do próbek albo w temperaturze 25°C albo 100°C przed nałożeniem do żelu. Białka w żelu uwidoczniono przez redukujące barwienie srebrem. Należy zauważyć, że wstęga polipeptydu OMP1O6 (wskazana jako <) widoczna jest tylko w próbce inkubowanej w temperaturze 100°C. Jako markerów masy cząsteczkowej użyto szerokiego zakresu standardu SDS-PAGE (katalog BioRad # 161-0317). Standard składał się z następujących polipeptydów (przybliżoną masę cząsteczkową podano w nawiasach): miozyna mięśnia szkieletowego królika (200 000); β-galaktozydaza E. coli (116 000); fosforylaza B mięśnia królika (97500); albumina surowicy bydlęcej (66200). Pozycje markerów masy cząsteczkowej w żelu podaje się po prawej stronie rysunku za pomocą strzałek z masą cząsteczkową (kD) markerów ponad strzałkami.

Figura 7: Analiza Southern biot trawienia endonukleazami restrykcyjnymi Dral i Hindlll DNA chromosomowego M.catarrhalis sondowanego Mc5-72. DNA szczepu M.catarrhalis 49143 trawiono Dral lub Hindlll. Analizę Southern trawionego DNA przeprowadzono przy użyciu Mc 5-72 (SEQ ID nr: 4) jako sondy. Bardzo surowe przemywanie wynosiło 2X SSC, 1% SDS w temperaturze 50°C przez około 20 do około 30 minut. Tor 1 zawiera trawienie Hindlll; wstęga hybrydyzacji ma przybliżoną wielkość 8,0 kB. Tor 2 zawiera trawienie Dral: wstęga hybrydyzacji ma przybliżoną wielkość 4,2 kB.

Figura 8A i 8B: Western biot ekstraktów białkowych M.catarrhalis i gatunków pokrewnych, przy użyciu surowicy odpornościowej królika wobec OMP106 jako sondy (fig. 8A),

189 995 porównano z reaktywnością surowicy przed immunizacją królika OMP106 (fig. 8B). Próbki w torach fig. 8a i 8B są następujące: tor A M.catarrhalis; tor B Moraxella ovis; tor C Moraxella lacunata; tor D Moraxella oslonensis; tor E Moraxella bovis; tor F Neisseria meningitidis; tor G Neisseria gonorrhoeae. Użyte markery masy cząsteczkowej są takie jak dla fig. 1.

Figura 9A: Western biot, przedstawiający, że surowica odpornościowa królika wobec polipeptydu OMP106 z M.catarrhalis ATCC 49143 reaguje krzyżowo z polipeptydem o podobnej masie cząsteczkowej w licznych szczepach HA i NHA M.catarrhalis (położenie polipeptydu OMP106 wskazuje się strzałką). Western przebadał ekstrakty oktylo-glukozydowe różnych, szczepów M.catarrhalis. Numery dostępu ATCC szczepów wskazuje się na górze torów. Stosowane procedury transferowe i Western biot były identyczne jak stosowane do otrzymania odcisków ukazanych w fig. 8.

Figura 9B: Western biot takich samych ekstraktów jak w fig. 9A, przy użyciu wstępnej surowicy odpornościowej, odpowiadającej stosowanej w fig. 9A.

Hodowle hemaglutynujące i nie-hemaglutynujące

Wyizolowany lub zasadniczo czysty polipeptyd OMP106 M.catarrhalis według wynalazku obejmuje całość lub podjednostkę białka osadzonego lub umiejscowionego na zewnętrznej powierzchni błony zewnętrznej hemaglutynującego szczepu (HA) i wielu szczepów i hodowli nie-hemaglutynujących (NHA) M.catarrhalis. OMP106 przyczynia się bezpośrednio lub pośrednio do fenotypu hemaglutynacji szczepów i hodowli Ha. Komórki M.catarrhalis HA ulegają aglutynacji z erytrocytami ludzkimi lub króliczymi w każdym standardowym oznaczeniu hemaglutynacji, takim jak polecane przez Soto-Hemandeza i in., 1989, J. Clin. Microbiol. 27:903-908. Bez ograniczania się w zamierzeniu żadnym szczególnym mechanizmem działania, niniejszym uwidacznia się, że M.catarrhalis aglutynuje erytrocyty przez wiązanie się z cząsteczką globotetrozy (Gb0 receptorów glikolipidowych i glikoproteinowych na powierzchni komórki gospodarza oraz że w aktywności hemaglutynacji pośredniczy częściowo odpowiednio zmodyfikowany polipeptyd OMP106, który posiada szczególną własność wrażliwości na barwienie srebrem. Przeciwnie, niemodyfikowany lub nieodpowiednio zmodyfikowany polipeptyd OMP106 nie jest ani aktywny pod względem pośredniczenia w hemaglutynacji, ani nie barwi się srebrem. Ponadto, polipeptyd OMP106 jest jedynym polipeptydem, posiadającym widoczną masę cząsteczkową wynoszącą około 180 000 do około 230 000 w SDS-PAGE, który można ekstrahować OG lub sarkozylem z pęcherzyków lub całych komórek M.catarrhalis HA lub NHA.

Aktywność hemaglutynacji komórek M.catarrhalis HA hamuje globotetroza (Gal-NAce1-3Gala1-4Gale1-4Glce1; Gb4) oraz monosacharydy, które zawierają Gb4, włączając N-acetylo-D-galaktozaminę, D-galaktozę i glukozę oraz ich pochodne, takie jak metylo-a-galaktoza lub metylo-e-galaktoza. Aktywność hemaglutynacji komórek M.catarrhalis HA hamuje także stosunkowo wysokie stężenie licznych innych cukrów, włączając bez ograniczenia D-mannozę, L-fruktozę i N-acetylo-D-glukozaminę.

Aktywność hemaglutynacji i polipeptyd OMP106 całych komórek M.catarrhalis HA są zarówno redukowane jak i niszczone przez trawienie całych komórek M.catarrhalis przez różne proteazy, włączając lecz bez ograniczenia, chymotrypsynę traktowaną TLCK (chlorometyloketon Na-ptosylo-L-lizyny [znany także jako 1-chloro-3-tosyloammo-7-amino-L-2-heptanon]), proteinazę K i trypsynę traktowaną TPCK (chlorometyloketon N-tosylo-L-fenyloalaniny). Jednak trawienie proteazą V8 całych komórek M.catarrhalis HA nie wpływa ani na aktywność hemaglutynacji ani na spójność fizyczną polipeptydu OMP106 takich komórek. Hodowla niehemaglutynująca (NHA) może pochodzić ze szczepu lub odmiany M.catarrhahs HA poddanej seryjnym pasażom w statycznych hodowlach płynnych (to jest hodowlach płynnych utrzymywanych w temperaturze 35°C bez wytrząsania). Przykładowo szczep lub odmianę M.catarrhalis HA hoduje się w bulionie Muellera Hintona i co pięć dni pobiera się posiew z powierzchni hodowli płynnej, aby zaszczepić następną hodowlę statyczną.

Zalecanym posiewem jest każdy kożuch komórek pływający na powierzchni hodowli. Pasażowanie w hodowlach statycznych utrzymuje się dopóki wytwarza się odmiana NHA. Odmianę NHA można stosować do wytwarzania szczepionek zabezpieczających, takich jak szczepionki z całych komórek, przeciw infekcjom M.catarrhalis.

189 995

Przeciwnie, fenotyp hemaglutynujący szczepu lub odmiany M. catarrhalis HA można utrzymywać przez pasażowanie szczepu lub odmiany w płynnych hodowlach wytrząsanych. W jednej z postaci realizacji, szczep lub odmianę Ha M.catarrhalis, hoduje się w bulionie Muellera Hintona w temperaturze 35 do 37°C z wytrząsaniem przy około 200 obrotach na minutę i pasażuje co 24-48 godzin. Fenotyp hemaglutynujący szczepu lub odmiany HA M.catarrhalis można także utrzymywać przez pasażowanie na pożywce stałej. Przykładowo szczep lub odmianę HA M.catarrhalis hoduje się na płytce, zawierającej agar z krwią lub agar Muellera Hintona..

Polipeptyd OMP106

Polipeptyd OMP106 według wynalazku jest jedynym białkiem błony zewnętrznej szczepu lub odmiany M.catarrhalis, które ma widoczną masę cząsteczkową w SDS-PAGE, wynoszącą około 180 000 do około 230 000, korzystnie około 190 000. Białko błony zewnętrznej M.catarrhalis jest polipeptydem obecnym w pęcherzykach M.catarrhalis lub które można ekstrahować z pęcherzyków M.catarrhalis lub całych komórek przez n-oktylo-P-D-glukopiranozyd (OG) albo detergent sarkozylowy w roztworze buforowym w temperaturze pokojowej. Patrz Murphy i Loeb, 1989, Microbial Pathogenesis 6:159-174, pod względem omówienia pęcherzyków M.catarrhalis, które są naturalnie występującymi pęcherzykami, składającymi się z błony zewnętrznej M.catarrhalis. Szczepy lub odmiany NHA M.catarrhalis albo nie posiadają polipeptydu OMP106, albo posiadają polipeptyd OMP106 w postaci, która wiąże przeciwciała anty-OMP106 (patrz poniżej) lecz nie reaguje z barwnikiem srebrnym (to jest przy użyciu Silver Stain Plus z BioRad [Richmond, CA] lub procedury opisanej przez Gottiieba i Chauko, 1987, Anal. Biochem. 165:33). Przeciwnie, polipeptyd OMP106 ze szczepów lub odmian HA M.catarrhalis wiąże przeciwciała anty-OMP106 i reaguje z barwnikiem srebrnym.

Polipeptyd OMP106 można zidentyfikować w pęcherzykach lub całych komórkach HA M.catarrhalis przez jego wrażliwość na rozkład przez traktowanie proteazą, która także niszczy lub osłabia aktywność hemaglutynacji takiego samego szczepu HA (patrz powyżej, przykłady proteaz, które niszczą lub nie niszczą aktywności hemaglutynacji całych komórek M.catarrhalis). Innymi słowy, trawienie proteazą, która niszczy lub zmniejsza aktywność hemaglutynacji szczepu lub odmiany HA będzie także zmieniać w SDS-PAGE, obfitość lub położenie polipeptydu OMP106 wyizolowanego ze szczepu lub odmiany po takim trawieniu w porównaniu z wyizolowanym z tego samego szczepu lub odmiany przed trawieniem.

Polipeptyd OMP106 można także zidentyfikować jako polipeptyd w ekstrakcie OG lub sarkozylowym pęcherzyków M.catarrhalis lub całych komórek, które posiadają widoczną masę cząsteczkową większą niż 106 000 jak określono przez elekroforezę w żelu denaturującym w 12% PAG z SDS, przy użyciu preparatów jakie opisano u Harlowa i Lane'a (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, załącznik I, 1988). Traktowanie gorącem ekstraktu OG lub sarkozylowego w temperaturze 100°C przez 5 minut może spowodować, że polipeptyd OMP106 będzie miał widoczną masę cząsteczkową około 180 000 do około 230 000, jak określono przez SDS-PAGE w 6% PAG bez żadnego czynnika redukującego, przy użyciu preparatów jakie opisano u Harlowa i Lane'a jak wyżej. W jednej z postaci realizacji, polipeptyd OMP106 w ekstrakcie OG lub sarkozylowym szczepu ATCC 49143 M.catarrhalis traktowanym gorącem, ma widoczną masę cząsteczkową wynoszącą około 190 000.

Polipeptyd OMP106 według wynalazku wytwarza się z każdego szczepu M.catarrhalis, włączając lecz bez ograniczenia ATCC 49143, ATCC25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC43628. Zalecanym źródłem polipeptydu OMP106 jest odmiana HA takich szczepów. Najbardziej zalecanym źródłem jest odmiana HA ATCC 49143.

Zaleca się by polipeptyd OMP 106 według wynalazku zawierał przy końcu aminowym, sekwencję aminokwasową IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID nr: 1) lub sekwencję zasadniczo do niej homologiczną. Polipeptyd OMP106 może dodatkowo zawierać w położeniu karboksylodystalnym do wyżej wspomnianej sekwencji, oktapeptyd, posiadający sekwencję aminokwasową GTVLGGKK (SEQ ID nr: 2) lub sekwencję zasadniczo do niej homologiczną. W stosowanym tu znaczeniu, sekwencja zasadniczo

189 995 homologiczna jest w co najmniej 80%, korzystnie w 100% identyczna z przytaczaną sekwencją aminokwasową.

Polipeptydy według wynalazku charakteryzują się swą widoczną masą cząseeczkową opartą na migracji polipeptydów w SDS-PAGE w stosunku do migracji znanych markerów masy cząsteczkowej. Mimo, że w SDS-PAGE można użyć każdego standardu masy cząsteczkowej znanego w tej dziedzinie, zalecanymi markerami masy cząsteczkowej są co najmniej miozyna mięśnia szkieletowego królika, β-galaktozydaza E. coli i fosforylaza B mięśnia królika. Fachowiec zauważy, że polipeptydy według wynalazku mogą różnie migrować w różnych rodzajach układów żelowych (np. różnych buforach; różnych stężeniach żelu, czynnika sieciującego lub SDS). Fachowiec zauważy także, że polipeptydy mogą mieć różną widoczną masę cząsteczkową z powodu użycia w sDS-PAGE różnych markerów masy cząsteczkowej. Stąd, charakteryzacja masy cząsteczkowej polipeptydów według wynalazku ukierunkowana jest w zamierzeniu na pokrycie wszystkich takich samych polipeptydów w każdym układzie SDS-PAGE i z każdym markerem masy cząsteczkowej, który mógłby wskazać wyraźnie inną widoczną masę cząsteczkową dla polipeptydów, niż ten, który tu opisano.

Polipeptydy pochodne OMP106

Polipeptyd pochodny OMP106 może być fragmentem polipeptydu OMP106 według wynalazku. Nieuszkodzony polipeptyd OMP106 może zawierać jedną lub więcej reszt aminokwasowych, które nie są konieczne do jego immunogenności. Może tak być w przypadku, np. gdy tylko reszty aminokwasowe, tworzące poszczególny epitop polipeptydu OMP106 są konieczne do aktywności immunogennej.

Niekonieczne sekwencje aminokwasowe można usunąć technikami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Przykładowo niepożądane sekwencje aminokwasowe można usunąć przez ograniczone trawienie proteolityczne przy użyciu enzymów, takich jak trypsyna, papaina lub pokrewne enzymy proteolityczne, albo przez cięcie chemiczne przy użyciu czynników, takich jak bromek cyjanogenu, po czym przez frakcjonowanie produktów trawienia lub cięcia.

Polipeptyd pochodny OMP106 według wynalazku może być także modyfikowanym polipeptydem OMP106 lub jego fragmentem (to jest polipeptydem lub fragmentem, posiadającym jedną lub więcej substytucji, insercji i/lub delecji aminokwasowych sekwencji OMP106 dzikiego typu). Takie modyfikacje mogą wzmagać immunogeniczność otrzymanego produktu polipeptydowego lub nie mieć wpływu na taką aktywność. Techniki modyfikacyjne, które można stosować, obejmują te, które ujawniono w zgłoszeniu patentowym US nr 4 526 716.

Polipeptyd pochodny OMP106 może być dalej chimerycznym polipeptydem, zawierającym jeden lub więcej polipeptydów heterologicznych, dołączonych do końca aminowego lub końca karboksylowego albo wnętrza kompletnego polipeptydu OMP106 lub jego części albo fragmentu. Użytecznymi polipeptydami heterologicznymi, zawierającymi takie polipeptydy chimeryczne, są lecz bez ograniczenia a) pre- i/lub prosekwencje, ułatwiające transport, translokację i/lub obróbkę polipeptydu pochodnego OMP106 w komórkach gospodarza, b) sekwencje oczyszczania przez powinowactwo oraz c) wszystkie użyteczne sekwencje immunogenne (np. sekwencje, kodujące jeden lub więcej epitopów białek o ekspozycji powierzchniowej patogenów drobnoustrojowych).

Zaleca się, by polipeptydy pochodne OMP1O6 były immunologicznie reaktywne krzyżowo z polipeptydem OMP 106 według wynalazku, będąc przez to zdolnymi do wzbudzania u zwierzęcia odpowiedzi odpornościowej wobec M.catarrhalis. Bardziej zaleca się, by polipeptydy pochodne OMP106 zawierały sekwencje, tworzące jeden lub więcej epitopów zewnętrznej powierzchni natywnego polipeptydu OMP106 M.catarrhalis (to jest epitopów o ekspozycji powierzchniowej polipeptydu OMP106, jako, że istnieje on w całych komórkach M.catarrhalis). Takie zalecane polipeptydy pochodne OMP106 można identyfikować przez ich zdolność do specyficznego wiązania przeciwciał wzbudzonych wobec całych komórek M.catarrhalis (np. przeciwciał wzbudzonych przez komórki M.catarrhalis utrwalone formaldehydem lub glutaldehydem; takie przeciwciała przytacza się to jako przeciwciała „przeciw całym komórkom”). Przykładowo, polipeptydy lub peptydy z ograniczonego lub pełnego trawienia proteazami polipeptydu OMP106 frakcjonuje się przy użyciu standardowych metod i testuje pod względem ich zdolności do wiązania przeciwciał przeciw całym komórkom. Izoluje się je i określa ich sekwencje aminokwasowe metodami znanymi w tej dziedzinie.

189 995

Zaleca się także, aby polipeptydy pochodne OMPlOó według wynalazku zawierały sekwencje, które tworzą jeden lub więcej epitopów natywnego polipeptydu OMPlOó, który jest mediatorem hemaglutynacji przez komórki HA M.catarrhalis. Takie zalecane polipeptydy pochodne OMPlOó można identyfikować przez ich zdolność do zakłócania hemaglutynacji przez komórki HA M.catarrhalis. Przykładowo, polipeptydy z ograniczonego lub pełnego trawienia protezami lub cięcia chemicznego polipeptydu OMPlOó frakcjonuje się stosując standardowe metody i testuje pod względem ich zdolności do zakłócania hemaglutynacji przez komórki M.catarrhalis. Określone i wyizolowane, sekwencje aminokwasowe takich zalecanych polipeptydów pochodnych OMPlOó określa się przy użyciu standardowych metod sekwencjonowania. Określoną sekwencję można użyć do umożliwienia wytwarzania takich polipeptydów sposobami syntezy chemicznej i/lub inżynierii genetycznej.

Te zalecane polipeptydy pochodne OMPlOó można także identyfikować przy użyciu przeciwciał przeciw całym komórkom, w celu przesiewu bibliotek bakteryjnych, wykazujących ekspresję losowych fragmentów genomowego DNA M.catarrhalis lub klonowanych sekwencji nukleotydowych, kodujących polipeptyd OMPlOó. Patrz np. Sambrook i in., Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, 2-gie wydanie, Cold Spring Harbor Press, NY, tom 1, rozdział 12. Klony reaktywne identyfikuje się i izoluje ich wstawki oraz sekwencjonuje, aby określić sekwencje aminokwasowe takich zalecanych polipeptydów pochodnych OMPlOó.

Izolacja i oczyszczanie polipeptydu OMPlOó i polipeptydów pochodnych OMP1O6

Wyizolowany polipeptyd OMPlOó według wynalazku i polipeptydy pochodne OMPlOó. W stosowanym tu znaczeniu, określenie „wyizolowany” oznacza, że produkt zasadniczo nie zawiera innych materiałów biologicznych, z którymi jest naturalnie związany. To jest, np. kompozycja izolowanego polipeptydu OMPlOó jest w około 70-94% wagowych czystym polipeptydem OMPlOó. Zaleca się, by polipeptydy OMPlOó według wynalazku i poiipeptydy pochodne OMPlOó były oczyszczone. W stosowanym tu znaczeniu, określenie „oczyszczony” oznacza, że produkt zasadniczo nie zawiera innych materiałów biologicznych, z którymi jest naturalnie związany. To jest zawiera kompozycje polipeptydu OMPlOó, która jest w co najmniej 95% wagowych czystym polipeptydem OMPlOó, co bardziej zalecane co najmniej 98% wagowych czystym polipeptydem OMPlOó i co najbardziej zalecane w co najmniej 99% wagowych czystym polipeptydem OMPlOó.

Polipeptyd OMPlOó według wynalazku można izolować z ekstraktów białkowych, włączając ekstrakt całych komórek, każdego szczepu lub hodowli M.catarrhalis. Korzystnie ekstrakt białkowy jest ekstraktem oktylo-glukozydowym lub sarkozylowym pęcherzyków błony zewnętrznej (to jest pęcherzyków) lub całych komórek M.catarrhalis, włączając lecz bez ograniczenia, wszystkie szczepy ATCC 49143, ATCC25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628. Zalecanym źródłem takich ekstraktów jest hodowla HA takich szczepów. Bardziej zalecanym źródłem takich ekstraktów jest hodowla HA ATCC 49143. Innym źródłem polipeptydu OMPlOó jest preparat białkowy z układów ekspresji genowej, wykazujący ekspresję klonowanych sekwencji, kodujących polipeptyd OMPlOó lub polipeptyd pochodny OMPlOó (patrz poniżej).

Polipeptyd OMPlOó można izolować i oczyszczać z materiału źródłowego przy użyciu każdej techniki biochemicznej i prób dobrze znanych fachowcom. W jednej próbie, błonę zewnętrzną M.catarrhalis otrzymuje się standardowymi technikami, a białka błony zewnętrznej rozpuszcza się w związku rozpuszczającym, takim jak detergent. Zalecanym roztworem rozpuszczającym jest taki, który zawiera około 1,25% sarkozylu. Polipeptyd OMPlOó znajduje się we frakcji rozpuszczonej. Resztki komórek i materiał nierozpuszczalny w ekstrakcie oddziela się i usuwa korzystnie przez wirowanie. Polipeptydy w ekstrakcie zatęża się, inkubuje w buforze uo próbek z żelem Laemmiiego, zawierającym SDS, w temperaturze i00⁼C przez 5 minut, a następnie frakcjonuje przez elektroforezę w 6% denaturującym żelu poliakrylamidowym (PAG) z dodecylosiarczanem sodu (SDS) bez cz.ynników redukujących. Patrz Laemmli, 1970, Naturę 227:680-685. Wstęgę lub frakcję zidentyfikowaną jako polipeptyd OMPlOó jaki opisano powyżej (np. zabarwioną srebrem wstęgę polipeptydową, która jest obecna w ekstrakcie OG lub sarkozylowym HA lecz nie w odpowiadającej hodowli NHA, albo tę z hodowli HA po trawieniu proteazą, niszczącą aktywność hemaglutynującą) można potem izolować bezpośrednio z frakcji lub szkiełka z żelem, zawierającego polipeptyd

189 995

OMP1O6. W zalecanej postaci realizacji, polipeptyd OMPlOó posiada widoczną masę cząsteczkową, wynoszącą 190 000 jak określono przez porównanie odległości lub tempa jego migracji w denaturującym SDS-PAGE, w stosunku do miozyny mięśnia szkieletowego królika (200 000) i β-galaktozydazy E. coli (116 000).

Inną metodą oczyszczania polipeptydu OMPlOó jest chromatografia powinowactwa przy użyciu przeciwciał anty-OMPlOó (patrz poniżej), przy czym zaleca się przeciwciała monoklonalne anty-OMPlOó. Przeciwciała wiąże się kowalencyjnie z żelami agarozowymi aktywowanymi przez bromek cyjanogenu lub estry sukcynoamidu (Affi-Gel, BioRad, Inc.) lub innymi metodami znanymi fachowcowi. Ekstrakt białkowy nakłada się na wierzch żelu jak opisano powyżej. Kontakt zachodzi przez okres czasu i w standardowych warunkach reakcyjnych, wystarczających dla związania polipeptydu OMPlOó z przeciwciałem. Korzystnie, w kolumnie chromatograficznej stosowanym materiałem jest podłoże stałe. Potem polipeptyd OMPlOó usuwa się z przeciwciała, pozwalając przez to na odzyskanie polipeptydu OMPlOó w izolowanej lub, korzystnie, oczyszczonej postaci.

Polipeptyd pochodny OMPlOó według wynalazku można wytworzyć przez chemiczne i/lub enzymatyczne cięcie lub rozkład wyizolowanego lub oczyszczonego polipeptydu OMPlOó. Polipeptyd pochodny OMPlOó można także syntetyzować chemicznie na podstawie znanej sekwencji aminokwasowej polipeptydu OMPlOó, oraz w wypadku polipeptydu chimerycznego, z peptydu heterologicznego, metodami znanymi w tej dziedzinie. Patrz np. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H.Freeman and Co., NY.

Polipeptyd pochodny OMPlOó można także wytwarzać w układzie ekspresji genowej, wykazującym ekspresję rekombinowanej konstrukcji nyukleotydowej, zawierającej sekwencje, kodujące polipeptydy pochodne OMPlOó. Sekwencje nukleotydowe, kodujące polipeptydy według wynalazku można syntetyzować i/lub klonować oraz powodować ekspresję zgodnie z technikami dobrze znanymi fachowcom. Patrz np. Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manuał, tomy 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, rozdział 9.

Polipeptydy pochodne OMPlOó można frakcjonować i oczyszczać przez stosowanie standardowych technik oczyszczania białek, modyfikować i stosować zgodnie z odkryciami i pouczeniami tutaj opisanymi. W szczególności, zalecane polipeptydy OMPlOó według wynalazku, te które tworzą epitop na zewnętrznej powierzchni natywnego polipeptydu OMPlOó, można izolować i oczyszczać zgodnie z procedurami powinowactwa ujawnionymi powyżej dla izolacji i oczyszczania polipeptydu OMPlOó (np. oczyszczaniu przez powinowactwo przy użyciu przeciwciał anty-OMPlOó).

Jeśli trzeba, polipeptydy według wynalazku można dodatkowo oczyszczać przy użyciu standardowych technik oczyszczania białek lub peptydów, włączając lecz bez ograniczenia elektroforezę, wirowanie, filtrację żelową, precypitację, dializę, chromatografię (włączając chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, chromatografię powinowactwa z immunoadsorbentem, wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconą fazą oraz wysokosprawną chromatografię cieczową przenikania w żelu), ogniskowanie izoelektryczne oraz ich odmiany i połączenia.

Można wykorzystywać jedną lub więcej tych technik, kolejno w procedurze przeznaczonej do oddzielenia cząsteczek zgodnie z ich fizyczną lub chemiczną charakterystyką. Charakterystyka ta obejmuje hydrofobowość, ładunek, zdolność wiązania oraz masę cząsteczkową białka. Różne frakcje materiałów otrzymane przy użyciu każdej techniki testuje się pod względem ich zdolności do wiązania się z receptorem OMPlOó lub ligandem, wiązania się z przeciwciałami anty-OMPlOó lub zakłócania hemaglutynacji przez komórki HA M.catarrhalis (aktywności „testowe”). Te frakcje, wykazujące taką aktywność poddaje się potem następnej technice w kolejnej procedurze, a nowe frakcje testuje się znowu. Proces powiarza się dotąd, aż pozostanie tylko jedna frakcja, posiadająca wyżej opisane aktywności „testowe” i frakcja ta wytwarza tylko pojedynczą wstęgę lub całość po poddaniu elektroforezie w żelu poliakrylamidowym albo chromatografii.

Immunogeny OMP1O6 i przeciwciała anty-OMPlO6

Polipeptyd OMPlOó według wynalazku można stosować do wytwarzania przeciwciał przeciw niemu. W takim przypadku jako immunogeny stosuje się wyizolowane lub co bar189 995 dziej zalecane oczyszczone preparaty polipeptydu OMPlOó według wynalazku lub polipeptydów pochodnych OMP1O6.

Polipeptyd OMP 106 według wynalazku oddziela się od innych białek błony zewnętrznej obecnych w ekstrakcie OG lub sarkozylowym błony zewnętrznej komórek HA M.catarrhalis lub pęcherzyków, przy użyciu SDS-PAGE (patrz powyżej), płatki żelu, zawierające polipeptyd OMPlOó stosuje się jako immunogeny i wstrzykuje królikowi w celu wytworzenia surowicy odpornościowej, zawierającej przeciwciała poliklonalnE OMPlOó. Taki sam immunogen można stosować do immunizacji myszy w celu wytworzenia linii hybrydom, która wytwarza przeciwciała monoklonalne anty-OMP 106. Jako immunogeny można stosować płatek PAG, zawierający wyizolowany lub oczyszczony OMPlOó z dowolnego ze szczepów ATCC 49143, ATCC25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628. _

Zaleca się stosowanie płatka PAG, zawierającego wyizolowany lub oczyszczony OMPlOó z hodowli HA takiego szczepu. W bardziej zalecanej postaci realizacji jako immunogeny stosuje się szkiełko z żelem, zawierające wyizolowany lub oczyszczony OMPlOó z hodowli lub szczepu HA ATCC 49143.

Jako immunogeny można stosować fragmenty peptydowe według wynalazku polipeptydu OMPlOó według wynalazku, przy czym zaleca się stosowanie fragmentów oczyszczonego polipeptydu OMPlOó. Peptydy można wytworzyć przez trawienie proteazą, cięcie chemiczne wyizolowanego lub oczyszczonego polipeptydu OMPlOó lub syntezę chemiczną, a potem można izolować lub oczyszczać. Takie izolowane lub oczyszczone peptydy można stosować bezpośrednio jako immunogeny. Użyteczne fragmenty peptydowe obejmują lecz bez ograniczenia te, które posiadają sekwencję IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID nr: 1) lub każdą ich część, której długość wynosi 6 lub więcej aminokwasów. W innej postaci realizacji, fragment peptydowy posiada sekwencję GTVLGGKK (SEQ ID nr: 2).

Użyteczne immunogeny mogą także obejmować takie peptydy lub fragmenty peptydów sprzężonych z cząsteczką nośnika, korzystnie nośnika białkowego. Białka nośnika mogą być wszystkimi powszechnie stosowanymi w immunologii, włączając lecz bez ograniczenia albuminę surowicy bydlęcej (BSA), albuminę kurczęcia, hemocyjaninę skałoczepa (KLH) i temu podobne. Pod względem omówienia koniugatów białek haptenowych patrz np. Hartlow i in., Przeciwciała: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, rozdział i5. Zaleca się, aby takie przeciwciała przeciw całym komórkom były przeciwciałami monoklonalnym. Linie hybrydom, wytwarzające żądane przeciwciała monoklonalne można identyfikować przez użycie oczyszczonego polipeptydu OMPlOó jako liganda skriningu. Jako immunogeny stosuje się komórki lub pęcherzyki każdego ze szczepów M.catarrhalis, włączając ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628. Jako immunogeny do indukcji tych przeciwciał można stosować komórki lub pęcherzyki hodowli szczepu HA ATCC 49143.

Przeciwciała poliklonalne wytworzone przez immunizację całą komórką lub pęcherzykiem, zawierają przeciwciała, które wiążą inne białka błony zewnętrznej M.catarrhalis (przeciwciała „nie anty-OMP 106”) i w ten sposób są bardziej niewygodne do użytku tam, gdzie wiadomo lub podejrzewa się, że próbka zawiera inne białka błony zewnętrznej M.catarrhalis lub materiały reagujące krzyżowo z tymi innymi białkami błony zewnętrznej. W tych okolicznościach każde wiązanie przez przeciwciała przeciw całej komórce danej próbki lub wstęgi musi być zweryfikowane przez równoczesne wiązanie takiej samej próbki lub wstęgi przez przeciwciała, które specyficznie wiążą polipeptyd OMPlOó (np. anty-OMP 106 i/lub polipeptyd pochodny OMP 106), albo przez testy współzawodniczę przy użyciu przeciwciał anty-OMPlOó, polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó jako czynnika współzawodniczącego (to jest dodanie przeciwciał anty-OMP 106, polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó do mieszaniny reakcyjnej obniża lub znosi wiązanie próbki przez przeciwciała przeciw całej komórce). Alternatywnie, takie poliklonalne surowice odpornościowe, zawierające przeciwciała „nie anty-OMP 106” można oczyścić z takich przeciwciał z użyciem standardowych podejść i metod. Przykładowo przeciwciała nie anty-OMPlOó można usunąć przez precypitację z komórkami hodowli NHA M.catarrhalis lub

189 995 szczepów M.catarrhalis znanych eako nie posirdrjąśe polipeptydu OMP 106 (np. ATCC 8176, kotrystniej hodowlę NHA ATCC 49143)1 lub przez absotpcję do kolumn, zawierąjącyśh takie komórki lub białka błony zewnętrznee takich komórek.

Użyteczne immunogeny do wzbudzania przeciwciał przeciwko polipeptydowi OMP 106 według wynalazku obeemują też mieszaniny dwóch lub więcee każdego z wyżce wspomnianych poszczególnych immunogenów.

Immunizaśję ssaków immunogenem tu opisanym, korzystnie ludzi, królików, szczurów, myszy, owiec, kóz, krów lub koni, przeprowadza się postęp^ąc zgodnie z procedurami dobrze znanymi fachowcom, w celu otrzymania surowic odpornościowych, zawieraeących przeciwciała pkliklknrlne lub linie hybrydom, wydzieląjąśych przeciwciała monoklonalne.

Przeciwciała mknoklknalne można wytworzyć standardowymi technikami, podanymi w pouczeniach tu zawartych. Takie techniki ujawnir się np. w zgłoszeniu patentowym US nr 4 271 145 i zgłoszeniu patentowym US nr 4 196 265. Krótko, zwierzę immunizuie się immunogenem. Hybrydomy wytwarza się przez łączenie komórek śledziony z immunizowanego zwierzęcia z komórkami szpiczaka. Produkty Suzei przesiewa się pod względem tych, które wytwarzają przeciwciała, wiążące immunogeny. Klony dodatnich hybrydom izkluje się, a przeciwciała monoklonalne odzyskuee się z tych klonów.

Tryby immunizacii przy wytwarzaniu zarówno przeciwciał poliklknrlnyśh eak i monoklknrlnyśh, są dobrze znane w tee dziedzinie. Immunogeny można wstrzykiwać każdą z licznych dróg, włączaeąc podskórną, dożylną, dootrzewnową, śródskórną, domięśniową, na śluzówkę, albo ich połączenia. Immunogen można wstrzykiwać w postaci rozpuszczalnee, postaci agregatu, przyczepiony do nośnika fizycznego lub wymieszany z adiuwantem, przy użyciu metod i materiałów dobrze znanych w tee dziedzinie. Surowice odpornościowe i przeciwciała można oczyszczać przy użyciu metod chromatografii kolumnowoe dobrze znanych fachowcom w tee dziedzinie.

Polipeptydy OMP 106 według wynalazku szczepów M. catanbalis HA lub NHA są immunkrerktywne krzyżowo. Tak więc, przeciwciała wzbudzone wobec polipeptydowi OMP 106 według wynalazku eednego ze szczepów lub hodowli M.crtrrrhrlis, specyficznie wiążą polipeptyd OMP 106 i polipeptydy pochodne OMP 106 innych szczepów i hodowli M.catanhalis. Przykładowo, przeciwciała pkliklonrlne anty-OMPlOó indukowane przez polipeptyd OMP 106 według wynalazku szczepu ATCC 49143 specyficznie wiążą nie tylko polipeptyd homologiczny OMPIO6 (to eest polipeptyd OMPIO6 szczepu ATCC 49143) lecz także polipeptyd OMP 106 i/lub polipeptydy pochodne OMP 106 innych szczepów M.catarrhalis, włąśzaeąś lecz bez ograniczenia ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240 i ATCC 25238.

Przeciwciała przeciwko polipeptydowi OMP 106 lub eego fragmentowi według wynalazku, włąśząiąś lecz bez ograniczenia przeciwciała anty-OMPlOó, można stosować w celu ułatwienia izklaśei i oczyszczenia polipeptydu OMP 106 i polipeptydów pochodnych OMP 106. Przeciwciała można także użyć eako sondy do identySikacei klonów w bibliotekach ekspresei, które maeą wstawki, kod^ące polipeptyd OMP 106 lub eego fragmenty. Polipeptydy według wynalazku można także użyć do indukcei przeciwciał, które można także stosować w testach immunologicznych (np. ELISA, RIA, Western) do specyficznego wykrywania i/lub oceny ilościowee M^atanbalis w próbkach biologicznych. Tego typu przeciwciała nie wiążą białek z pokrewnych patogenów baktetyenych, takich eak MoraKella ovis, Moraxella lacunata, Moraxella oslonensis, Moraxella bwis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae. Tak więc, przeciwciała anty-OMPlOó więc można ee stosować do diagnozowania inSekcei M.catarrhalis.

Szczepionki

Szczepionki profilaktyczne i terapeutyczne według wynalazku przeciw inUekceom M.śrtatrhrlis zwierząt, włączająś ssaki, a konkretniee gryzonie, naczelne i ludzi. Zalecanym zastosowaniem szczepionek eest stosowanie u ludzi. Szczepionki można wytwarzać technikami znanymi fachowcom w tee dziedzinie i będą obeemować np. antygen w postaci immunogenu, Urtmaceutyśznie dopuszczalny nośnik, możliwie odpowiedni adiuwant i możliwie inne materiały, tradycyenie znaedueące się w szczepionkach. Immunologicznie skuteczną ilość immunogenu do użytku w szczepionce określa się sposobami znanymi w tee dziedzinie, bicrnąc pod uwagę pouczenia tu zawarte.

189 995

Szczepionki według niniejszego wynalazku zawierają immunologicznie skuteczną ilość każdego z immunogenów ujawnionych powyżej w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

Szczepionki według wynalazku mogą zawierać immunologicznie skuteczną ilość inaktywowanej lub osłabionej odmiany HA M.catarrhalis lub odmiany NHA.

Inaktywowaną lub osłabioną odmianę HA M.catarrhalis lub odmianę NHA M.catarrhalis otrzymuje się przy użyciu każdej metody znanej w tej dziedzinie, włączając lecz bez ograniczenia traktowanie chemiczne (np. formaliną), traktowanie gorącem i napromienianie.

Określenie „immunologicznie skuteczna ilość” stosuje się tu do oznaczenia ilości wystarczającej do indukcji odpowiedzi odpornościowej, która może zapobiec infekcji M.catarrhalis lub osłabić ciężkość każdej wcześniej istniejącej lub następującej infekcji M.catarrhalis.

Dokładne stężenie będzie zależeć od konkretnego podawanego immunogenu, lecz można je określić przez użycie standardowych technik dobrze znanych fachowcom w tej dziedzinie pod względem oznaczania rozwoju odpowiedzi odpornościowej.

Użyteczne immunogeny polipeptydowe obejmują wyizolowany polipeptyd OMPlOó i polipeptydy pochodne OMPlOó. Zalecanymi immunogenami są oczyszczony polipeptyd OMPlOó i polipeptydy pochodne lub peptydy OMP1O6. Połączenie immunogenu i nośnika może być roztworem wodnym, emulsją lub zawiesiną.

Generalnie, ilość immunogenu polipeptydowego będzie wynosić 0,1-500 mikrogramów na dawkę. Nośniki są znane fachowcom w tej dziedzinie i obejmują stabilizatory, rozcieńczalniki i bufory. Odpowiednimi stabilizatorami będą węglowodany, takie jak sorbitol, laktoza, mannitol, skrobia, sacharoza, dekstran i glukoza oraz białka, takie jak albumina lub kazeina. Odpowiednimi rozcieńczalnikami są sól fizjologiczna, Hanks Balanced Salts oraz roztwór Ringera. Odpowiednimi buforami są fosforany metali alkalicznych, węglany metali alkalicznych lub węglany metali ziem alkalicznych. Szczepionki mogą także zawierać jeden lub więcej adiuwantów, poprawiających lub wzmacniających odpowiedź immunologiczną. Odpowiednimi adiuwantami są, lecz bez ograniczenia, peptydy; wodorotlenek glinu; fosforan glinu; tlenek glinu; kompozycja, składająca się z oleju mineralnego, takiego jak Marcol 52 lub oleju roślinnego oraz jednego lub więcej emulgatorów, lub substancji powierzchniowo czynnych, takich jak Iizolecytyna, polikationy, polianiony; oraz potencjalnie użyteczne adiuwanty ludzkie, takie jak BCG i Corynebacterium parvum.

Szczepionka może także zawierać inne immunogeny. Taka mieszana szczepionka posiada tę zaletę, że można uzyskać odporność przeciw kilku patogenom przy pojedynczym podaniu. Przykładami innych immunogenów są te, które stosuje się w znanych szczepionkach DPT.

Szczepionki według wynalazku wytwarza się technikami znanymi fachowcom w tej dziedzinie, podanymi w zawartych tu pouczeniach. Generalnie, immunogeny miesza się z nośnikiem, aby utworzyć roztwór, zawiesinę lub emulsję. Jeden lub więcej dodatków omawianych powyżej może się znajdować w nośniku lub można go dodawać kolejno. W celu przechowania preparaty szczepionki można suszyć, np. przez liofilizację. W takim przypadku można je następnie rekonstytuować do szczepionek płynnych przez dodanie odpowiedniej ilości płynnego nośnika.

Szczepionki podaje się ludziom lub innym ssakom, włączając gryzonie i naczelne. Można je podawać w jednej lub więcej dawek. Szczepionki można podawać znanymi drogami podawania. Można stosować wiele metod wprowadzania preparatu tu opisanej szczepionki. Metody te obejmują, lecz bez ograniczenia, drogę doustną, śródskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną, podskórną i donosową. Zalecaną drogą jest iniekcja domięśniowa lub podskórna.

W celu indukcji odpowiedzi odpornościowej wobec M.catarrhalis u ssaków, w celu zabezpieczenia ssaka przed infekcją i/lub osłabienia choroby spowodowanej przez M.catarrhalis można podać gospodarzowi immunologicznie skuteczną ilość polipeptydów OMPlOó według wynalazku lub- ich fragmentów według wynalazku i korzystnie, szczepionki według wynalazku.

Kwasy nukleinowe, kodujące polipeptyd OMPlOó i polipeptydy pochodne OMPlOó

Całą lub część całej sekwencji aminokwasowej polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó można określić stosując techniki dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie, tak jak technika, rozkładu Edmana (patrz np. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., strony 34-49). Otrzymaną sekwencję

189 995 aminokwasową stosuje się jako przewodnią do syntezy DNA, kodującego polipeptyd

OMPlOó lub polipeptyd pochodny OMPlOó przy użyciu konwencjonalnych metod chemicznych albo powielenia reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) nakładających się oligonukleotydów.

Sekwencję aminokwasową można używać jako przewodnią do syntezy mieszaniny oligonukleotydów, którą odwrotnie można użyć do przesiewu pod względem sekwencji, kodujących polipeptyd OMPlOó w bibliotekach genomowych M.catarrhalis. Takie biblioteki można wytworzyć przez izolowanie DNA z komórek każdego szczepu M.catarrhalis. Korzystnie DNA stosowany jako źródło sekwencji kodującej polipeptyd OMPlOó według wynalazku, zarówno do bibliotek genomowych jak i powielenia PCR, wytwarza się z komórek każdego szczepu M.catarrhalis, włączając, lecz bez ograniczenia ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628.

Przy wytwarzaniu bibliotek genomowych, tworzy się fragmenty DNA, z których niektóre będą kodować części lub całość polipeptydu OMPlOó M.catarrhalis według wynalazku. DNA można ciąć w specyficznych miejscach przy użyciu różnych enzymów restrykcyjnych. Alternatywnie można użyć DNA-azy w obecności manganu, aby podzielić DNA lub można podzielić DNA fizycznie, jak np. przez sonifikację. Następnie fragmenty DNA można rozdzielić według wielkości standardowymi technikami, włączając, lecz bez ograniczenia, elektroforezę w żelu agarozowym i poliakrylamidowym, chromatografię kolumnową i wirowanie w gradiencie sacharozy. Potem fragmenty DNA można wprowadzać do odpowiednich wektorów, włączając, lecz bez ograniczenia, plazmidy, kosmidy, bakteriofagi lambda lub T4 oraz sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC). (Patrz np. Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wydanie 2-gie, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork; D.M.Glover (wydawca), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oksford, U.K. tom I, II). Bibliotekę genomową można przesiać przez hybrydyzację kwasu nukleinowego ze znacznikowaną sondą (Benton i Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein i Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72:3961).

Biblioteki genomowe można przesiewać za pomocą znacznikowanego zdegenerowanego oligonukleotydu, odpowiadającego sekwencji aminokwasowej każdego peptydu polipeptydu OMP1O6 według wynalazku przy użyciu optymalnego podejścia dobrze znanego w tej dziedzinie. Sonda skriningowa może być zdegenerowanym oligonukleotydem, który odpowiada peptydowi, posiadającemu sekwencję IGIStśADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEQ ID nr: 1) lub jej część. Sonda skriningowa może też być zdegenerowanym oligonukleotydem, który odpowiada peptydowi, posiadającemu sekwencję GTVLGGKK (SEQ ID nr: 2). Każdy z oligonukleotydów GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (SEQ ID nr: 3) i GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (SEQ ID nr: 7), odpowiadających peptydowi OMPlOó GTVLGGKK (SEQ ID nr: 2) można stosować jako sondę. W dalszej postaci realizacji, jako sondę można stosować sekwencję GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID nr: 4) lub jej każdy fragment lub każde uzpełnienie sekwencji lub fragmentów. Każda użyta sonda korzystnie ma długość 15 nukleotydów lub więcej.

Klony w bibliotekach ze wstawkami DNA, kodującym polipeptyd OMPlOó lub jego fragmenty będą hybrydyzować z jedną lub więcej zdegenerowanych sond oligonukleotydowych. Hybrydyzację takich sond oligonukleotydowych z bibliotekami genomowymi przeprowadza się przy użyciu metod znanych w tej dziedzinie. Przykładowo, hybrydyzację z dwiema wyżej wspomnianymi sondami oligonukleotydowymi można przeprowadzić w 2X SSC, 1,0% SDS w temperaturze 50°C i przemyć w takich samych warunkach. Sekwencja DNA ATCC 49143, kodująca całość iub część polipeptydu OMPiOó jest fragmentem restrykcyjnym Hindlll o około 8000 pz długości lub fragmentem restrykcyjnym Dral o około 4200 pz długości.

Klony sekwencji nukleotydowych, kodujących część lub całość polipeptydu OMPlOó lub polipeptydów pochodnych OMPlOó, można także otrzymać przez skrining bibliotek ekspresji M.catarrhalis. Przykładowo, się izoluje DNA M.catarrhalis, wytwarza losowe fragmenty i poddaje ligacji do wektora ekspresyjnego (np. bakteriofaga, plazmidu, fagemidu lub kosmidu) tak, że wtrącona do wektora sekwencja zdolna jest do ekspresji przez komórkę gospodarza, do którego potem wprowadza się wektor. Można następnie stosować różne metody

189 995 skrinigowe do selekcji pod względem ekspresji colipjc^tydu OMP1O6 według wynalazku lub policeptydów pochodnych OMP106. Można stosować różne przeciwciała przeciwko polipeptydowi OMP106 według wynalazku (patrz powyżej), do identyfikacji żądanych klonów, przy użyciu metod znanych w tej dziedzinie. Patrz np. Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, załącznik IV. Klony lub łysinki z biblioteki poddaje się zetknięciu z przeciwciałami w celu identyfikacji tych klonów, które wiążą się.

Kolonie lub łysinki, zawierające DNA, kodujący polipeptyd OMP1O6 według wynalazku lub colipectydy pochodne OMP106 można wykrywać przy użyciu DYNA Beads, zgodnie z Olsvick'iem i in., 29 ICAAC, Houston, Tex. 1989, załączonym tu jako odnośnik. Przeciwciała anty-OMP106 sieciuje się do tosylowanych DYNA Beads M280 i te kulki, które zawierają przeciwciało, będą potem użyte do adsorpcji kolonii lub łysinek, wykazujących ekspresję coliceptydu OMP106 lub polipeptydów pochodnych OMP1O6. Kolonie lub łysinki, wykazujące ekspresję OMPW6 lub coiicectyCów pochodnych OMP106, identyfikuje się jako każdy z tych które wiążą się z kulkami.

Alternatywnie, przeciwciała anty-OMP106 można niespecyficznie unieruchamiać na odpowiednim podłożu, takim jak krzemionka lub żywica Celite™. Materiał ten byłby potem stosowany do adsorpcji kolonii bakteryjnych, wykazujących OMP106 lub pochod nego OMP 106 jak opisano powyżej.

Do wytworzenia zasadniczego czystego DNA, kodującego część lub całość polipeptyCu OMP106 z genomowego DNA M^tanhalis, można użyć powielania PCR. Jako starterów można używać starterów oliponukljotyCbwyrh, degenerowanych lub nie, odpowiadających znanym sekwencjom policectyCów OMP1O6. Jako startera 5' można użyć bliponukljotyCu, zCepenebowtnego lub nie, kodującego ceptyc igiseadggkgganargdkSiaigdiaqalgsqslaigdmkiv (SEQ id nr: 1) lub każdą jego część. Przykładowo, starter 5' może być sekwencją nukleotydową GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCT

ATTGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID nr 4) lub każdą jej częścią. Sekwencje nukleotydowe, zdegn^TOwane lub nie, które są odwrotnymi uzupełnieniami sekwencji, dokującej GTVLGGKK (SEQ ID nr: 2) można stosować jako startera 3'. Przykładowo oliponukieotydu, aCepenebowanego lub nie, który posiada zdegcneiOwainą sekwencję nukleotydową YTTYTTNCCNCCNAGNA· CNGTNCC (SEQ ID nr: 6) lub YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (SEQ ID nr: 8), można użyć jako startera 3' w połączeniu z odmiennym starterem 5' omawianym powyżej.

PCR można przeprowadzić, np. przy użyciu termocykieba Perkin-Eimeb Cetus i polimerazy Taq (Gene Amp™). Do użytku w reakcjach PCR, można wybrać do syntezy kilka zCegenerowanych starterów. Jest także możliwa zmiana surowości warunków hybrydyzacji stosowanych w początkowaniu reakcji PCR, aby pozwolić na większy lub mniejszy stopień podobieństwa sekwencji nukleotydowej między zdegenerowanymi starterami i odpowiadającymi sekwencjami DNA Mcatarrlialis. Po przeprowadzeniu powielenia segmentu sekwencji, kodującej policeptyC OMP1O6, który to segment można molekularnie klonować i sekwencjonować, oraz wykorzystać jako sondę do izolacji pełnego klonu gromowego. Pozwoli to z kolei na określenie pełnej sekwencji nukleotydowej genu, analizę jego ekspresji i wytworzenie na jego podstawie białka do analizy funkcjonalnej jaką opisano poniżej. Gdy wyizoluje się sekwencję kodującą coiipectyC OMP106 ze szczepu lub odmiany M.catarrhalis, możliwe jest użycie tego samego podejścia do izolacji sekwencji kodujących coiicectyC OMP106 z innych szczepów i odmian M. catarrhalis. Fachowiec rozpozna, że sekwencję DNA lub RNA, kodującą policjptyd OMP106 (lub jego fragmenty) według wynalazku, można stosować do otrzymywania innych sekwencji DNA lub RNA, które hybrydyzują z nią w warunkach średnio lub „---------U-a^zo surowym, przy użyciu z sekwencją OMP106 z jednego __Λ1____u — _______v ... ττ..ι___j,,— ogonnym tccnuik znanych w tej dziedzinie. Hybrydyzacja szczepu lub odmiany Mcatanhalis w warunkach bardzo surowych zidentyfikuje odpowiadającą sekwencję z innych szczepów i odmian. Bardzo surowe warunki zmieniają się z długością sondy i składem zasad. Wzór do określania takich warunków jest dobrze znany w tej dziedzinie. Patrz Samb^k i in., 1989, Moleruiar Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Hartaor, NY, rozdział 11. Tak jak i tutaj, bardzo surowe warunki hybrydyzacji jakie stosuje się dla sond o większej długości niż 300 zasad, obejmują przemycie w 0,1X SSC/0,1% SDS w temperaturze 68°C przez co

189 995 najmniej 1 godzinę (Ausubel i in., Wyd. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, tom I,

Greene Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork, na stronie 2.10.3).

W szczegółowych postaciach realizacji, surowe warunki przemywania w hybrydyzacji, przy użyciu sond, mających sekwencję SEQ ID nr: 4 lub jej dopełnienie, oznaczają 2X

SSC, 1% SDS w temperaturze 50°C przez około 20 do około 30 minut.

Fachowiec będzie w stanie zidentyfikować pełne klony sekwencji kodującej polipeptydu OMP106 przy użyciu podejść dobrze znanych w tej dziedzinie. Rozmiar sekwencji kodującej polipeptyd OMP106 zawartej w wyizolowanym klonie, można sprawdzić przez sekwencjonowanie klonowanej wstawki i porównanie wnioskowanej wielkości polipeptydu kodowanego przez otwarte ramki odczytu (ORF) z wielkością polipeptydu OMP106 i/lub przez porównanie wnioskowanej sekwencji aminokwasowej ze znaną sekwencją aminokwasową oczyszczonego polipeptydu OMP1O6. Jeśli wyizolowano częściowy klon sekwencji kodującej polipeptydu OMP1O6, klony kompletne można wyizolować przez użycie wstawki klonu częściowego jako sondy hybrydyzacji. Alternatywnie, pełną sekwencję kodującą polipeptydu OMP106 można odtworzyć z nakładających się klonów częściowych przez składanie razem ich wstawek.

Pełnym klonem może być każdy, który posiada ORF z wnioskowaną sekwencją aminokwasową, pasującą do polipeptydu OMP106 lub, jeśli pełna sekwencja tego ostatniego nie jest osiągalna, który jest fragmentem peptydowym polipeptydu OMP106 i ma masę cząsteczkową, odpowiadającą polipeptydowi OMP106 według wynalazku. Dalej, pełne klony można identyfikować przez zdolność ich wstawek, po umieszczeniu w wektorze ekspresyjnym, do wytwarzania polipeptydu, wiążącego przeciwciała specyficzne wobec końca karboksylowego polipeptydu OMP1O6.

Sekwencje kwasu nukleinowego, kodujące polipeptydy pochodne OMP106 można wytworzyć metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie, przykładowo sekwencje kodujące polipeptydy pochodne OMP106 można uzyskać z sekwencji kodujących polipeptydu OMP106 metodami rekombinacji DNA, biorąc pod uwagę pouczenia tu ujawnione.

Przykładowo, sekwencję kodującą polipeptydu OMP106 według wynalazku można zmienić tworząc substytucje aminokwasowe, które nie wpływają na immunogenność polipeptydu OMP106 lub które mogą polepszyć jego immunogenność. Można stosować różne metody, włączając, lecz bez ograniczenia, mutagenezę oligonukleotydowo ukierunkowaną. Te i inne techniki znane w tej dziedzinie, można stosować do utworzenia pojedynczych lub wielokrotnych mutacji, takich jak zastąpienia, insercje, delecje i transpozycje, jak opisano u Botsteina i Shortle'a, 1985, Science, 229:1193-1210.

Dalej, DNA sekwencji, kodujących polipeptyd OMP106 można skracać enzymem restrykcyjnym lub trawieniem egzonukleazą. Heterologiczne sekwencje kodujące można dodać do sekwencji kodującej polipeptydu OMP106 przez ligację lub powielenie PCR. Ponadto, DNA, kodujący całość lub część polipeptydu pochodnego OMP106 można syntetyzować chemicznie lub przy użyciu powielenia PCR na podstawie znanej lub wnioskowanej sekwencji aminokwasowej polipeptydu OMP106 i każdej żądanej zmiany tej sekwencji.

Identyfikowany i wyizolowany DNA, zawierający sekwencję kodującą polipeptydu OMP106 według wynalazku lub polipeptydu pochodnego OMP1O6, można wtrącić do odpowiedniego wektora do klonowania. Można stosować wielką liczbę układów wektor-gospodarz znanych w tej dziedzinie. Możliwymi wektorami są, lecz bez ograniczenia, plazmidy lub zmodyfikowane wirusy, ale układ wektorowy musi być kompatybilny z użytą komórką gospodarza. Takie wektory obejmują, lecz bez ograniczenia, bakteriofagi, takie jak pochodne lambda lub plazmidy, takie jak pochodne plazmidów pBR322 lub pUC. Insercję do wektora

4^ do Ko Jo n a_____o, rm λ j_ Kir.._______k uO KiOiiOwaina un/gua uepKtiu i ip. ugauję nageucutu iriYM UU WCWia uo KlUUUWdUia, który posiada komplementarny lepki koniec. Jednak jeśli komplementarne miejsca restrykcji użyte dla fragmentu DNA, nie są obecne w wektorze do klonowania, końce cząsteczek DnA można modyfikować enzymatycznie.

Alternatywnie, każde żądane miejsce można wytworzyć przez ligację sekwencji nukleotydowych (linkerów) na końcu DNA; te dołączone linkery mogą zawierać specyficzne, chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy, kodujące sekwencje rozpoznawania endonukleazy restrykcyjnej. W metodzie alternatywnej, rozszczepiony DNA można modyfikować przez

189 995 ogonowanie homopolimeryczne. Rekombinowane cząsteczki można wprowadzać do komórek gospodarza poprzez transformację, transfekcję, infekcję, elektroporację, itd., tak, że wytwarza się wiele kopii sekwencji genu.

Żądany DNA, zawierający sekwencję kodującą polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó, można identyfikować i izolować po wprowadzeniu do odpowiedniego wektora do klonowania za pomocą „strzelby”. Wzbogacenie pod względem żądanej sekwencji, np. przez frakcjonowanie wielkościowe, można wykonać przed insercją do wektora kloningowego.

Transformacja komórek gospodarza za pomocą rekombinowanych cząsteczek DNA, które zawierają sekwencję kodującą polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó, umożliwia wytworzenie wielokrotnych kopii takiej sekwencji kodującej. W ten sposób, sekwencję kodującą można otrzymać w wielkich ilościach przez hodowlę transformantów, izolowanie rekombinowanych cząsteczek DNA z transformantów i, jeśli trzeba, odzyskanie wprowadzonej sekwencji kodującej z wyizolowanego rekombinowanego DNA.

Rekombinacyjne wytwarzanie polipeptydu OMPlOó i polipeptdów pochodnych OMPlOó

Polipeptyd OMPlOó według wynalazku i polipeptydy pochodne OMPlOó, można wytwarzać poprzez techniki inżynierii genetycznej. W tym wypadku są one wytwarzane przez odpowiednią komórkę gospodarza, transformowaną DNA, który koduje polipeptyd. Sekwencję nukleotydową, kodującą polipeptyd OMPlOó według wynalazku i polipeptydy pochodne OMPlOó można wprowadzać do odpowiedniego wektora ekspresyjnego to jest wektora, który zawiera konieczne elementy transkrypcji i translacji wtrąconej sekwencji kodującej polipeptyd. Sekwencje nukleotydowe, kodujące polipeptyd OMPlOó lub polipeptydy pochodne OMPlOó wtrąca się do wektorów w taki sposób, że będą one podlegać ekspresji w odpowiednich warunkach (np. w odpowiedniej orientacji i prawidłowej ramce odczytu oraz z odpowiednimi sekwencjami ekspresji, włączając sekwencję, wiążącą polimerazę RNA i sekwencję, wiążącą rybosomy).

Do ekspresji sekwencji kodującej polipeptydu można wykorzystać różne układy gospodarz-wektor. Obejmują one, lecz bez ograniczenia, układy komórkowe ssaków zakażone wirusem (np. wirusem krowianki, adenowirusem itd.); układy komórkowe owadów, zakażone wirusem (np. bakulowirusem); drobnoustroje, takie jak drożdże, zawierające wektory drożdżowe lub bakterie transformowane DNA bakteriofaga, DNA plazmidowy lub DNA kosmidowy. Zaleca się by komórką gospodarza była bakteria, przy czym bardziej zaleca się bakterię taką jak E. coli, B.subtilis lub Salmonella.

Elementy ekspresji wektorów zmieniają się pod względem swej długości i specyficzności. W zależności od wykorzystanego układu gospodarz-wektor, można stosować każdy z wielu odpowiednich elementów transkrypcji i translacji. W jednej z postaci realizacji białko chimeryczne, zawierające sekwencję polipeptydu OMPlOó według wynalazku lub polipeptydu pochodnego OMPlOó oraz pre- i/lub prosekwencję komórki gospodarza poddaje się ekspresji. W innych postaciach realizacji, ekspresji poddaje się białko chimeryczne, zawierające sekwencję polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó i peptydu do oczyszczania przez powinowactwo. Ekspresji można również poddać białko chimeryczne, zawierające sekwencję polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó oraz użytecznego peptydu lub polipeptydu immunogennego. W zalecanych postaciach realizacji, polipeptyd pochodny OMPlOó, który podlega ekspresji, zawiera sekwencję, tworzącą albo epitop powierzchni zewnętrznej albo domenę, wiążącą receptor natywnego polipeptydu OMPlOó. Do zbudowania wektorów ekspresji, zawierających chimeryczny gen, składający się z odpowiednich sygnałów kontrolnych transkrypcji/translacji oraz sekwencji, kodujących polipeptyd, możną użyć każdej metody wprowadzenia fragmentów DNA do wektora, znanej w tej dziedzinie. Metody te obejmują techniki rekombinacyjne DNA in vitro oraz syntetyczne i rekombinantów in vivo (rekombinacji genetycznej). Ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego, kodującej polipeptyd OMPlOó lub polipeptyd pochodny OMPlOó, można regulować drugą sekwencją kwasu nukleinowego tak, że wtrącona sekwencja ulega ekspresji w gospodarzu transformowanym rekombinowaną cząsteczką DNA. Przykładowo, ekspresję wtrąconej sekwencji można kontrolować każdym elementem promotora/wzmacniacza znanym w tej dzie20

189 995 dżinie. Promotory, które można stosować do kontroli ekspresji wtrąconych sekwencji, obejmują, lecz bez ograniczenia, wczesny region promotora SV40 (Bemoist i Chambón, 1981, Naturę 290:304-310), promotor, zawarty w długim końcowym powtórzeniu 3 ’ wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto i in., 1980, Celi 22:787-797), promotor kinazy tymidynowej herpes (Wagner i in., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), sekwencje regulatorowe genu metalotioneiny (Brinster i in., 1982, Naturę 296:39-42) dla ekspresji w komórkach zwierzęcych; promotory β-laktamazy (Villa-Kamaroff i in., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:37273731), tac (DeBoer i in., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25), X Pi lub trc dla ekspresji w komórkach bakteryjnych (patrz „Useful proteins from recombinant bacteria” w Scentific American, 1980, 242:74-94); region promotorowy syntetazy nopaliny lub promotor RNA wirusa 35S mozaiki kalafiora (Gardner i in., 1981, Nuci. Acids Res. 9:2871), oraz promotor enzymu fotosyntezy karboksylazy rybulozobifosforanowej (Herrera-Estrella i in., 1984, Naturę 310:115-120) dla ekspresji w komórkach wszczepionych; elementy promotorowe z drożdży lub innych grzybów, tak jak promotor Gal4, promotor ADC (dehydrogenaza alkoholowa), promotor PGK (kinaza fosfoglicerolowa), promotor fosfatazy alkalicznej.

Wektory ekspresyjne, zawierające sekwencje kodujące polipeptyd OMPlOó lub peptyd pochodny OMPlOó, można identyfikować trzema ogólnymi metodami: (a) hybiydyzacji kwasu nukleinowego, (b) obecności lub nieobecności działania genu „markerowego” oraz (c) ekspresji wtrąconych sekwencji. W metodzie pierwszej, obecność obcego genu wtrąconego do wektora ekspresyjnego, można wykryć przez hybrydyzację kwasu nukleinowego, przy użyciu sond, zawierających sekwencje homologiczne do wprowadzanej sekwencji kodującej polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó. W metodzie drugiej, układ rekombinowany wektor/gospodarz można wykryć i zidentyfikować na podstawie obecności lub nieobecności pewnych funkcji genu „markerowego” (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki, fenotypu transformacji, tworzeniu ciała okluzyjnego w bakulowirusie, itd.) powodowanych przez insercję obcych genów w wektorze. Przykładowo, jeśli sekwencję kodującą polipeptyd OMPlOó lub polipeptyd pochodny OMPlOó wtrąca się do sekwencji genu markerowego wektora, rekombinanty, zawierające wstawkę można identyfikować przez nieobecność funkcji genu markerowego. W metodzie trzeciej, rekombinowane wektory ekspresyjne można identyfikować przez oznaczenie produktu obcego białka podlegającego ekspresji w rekombinancie. Takie oznaczenia można oprzeć, np. o fizyczne lub funkcjonalne właściwości polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó w układach oznaczania in vitro, np. wiązania z ligandem OMPlOó lub receptorem albo wiązania z przeciwciałami anty-OMP 106 według wynalazku, lub też zdolności komórki gospodarza do hemaglutynacji albo zdolności ekstraktu komórkowego do zakłócania hemaglutynacji przez M.catarrhalis.

Gdy poszczególną rekombinowaną cząsteczkę DNA zidentyfikuje się i wyizoluje, można użyć kilku metod znanych w tej dziedzinie, w celu jej powielenia. Gdy ustali się odpowiedni układ gospodarza i warunki wzrostu, rekombinowane wektory ekspresyjne można wielokrotnie powielać i wytwarzać. Jak objaśniono powyżej, wektory ekspresyjne, które można stosować obejmują, lecz bez ograniczenia, następujące wektory lub ich pochodne: ludzkie lub zwierzęce wirusy, takie jak wirus krowianki albo adenowirus; wirusy owadzie, takie jak bakulowirus; wektory drożdżowe; wektory bakteriofagowe (np. lambda) oraz wektory DNA plazmidów lub kosmidów, żeby nazwać choć kilka.

Poza tym, można wybrać szczep komórek gospodarza, który moduluje ekspresję wprowadzonych sekwencji lub modyfikuje i obrabia produkt genowy w żądany konkretny sposób. Ekspresję pewnych promotorów można wzbudzać w obecności pewnych inducerów; tak więc, ekspresję genetycznie wytwarzanego polipeptydu OMPlOó lub polipeptydu pochodnego OMPlOó, można kontrolować. Ponadto, różne komórki gospodarza mają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy obróbki traskrypcyjnej i po-traslacyjnej i modyfikacji białek. Można wybrać odpowiednie linie komórkowe lub układy gospodarza, aby zapewnić pożądaną modyfikację i obróbkę obcego białka, podlegającego ekspresji.

Odczynniki

Pol ijpe^^trydy według wynalazku są użyteczne jako odczynniki do diagnozowania klinicznego lub medycznego infekcji M.catarrhalis i do badań naukowych, dotyczących właściwości patogenności, wirulencji i zakaźności M.catarrhalis, jak również mechanizmów obrony gospodarza.

189 995

Polipeptydy i peptydy według wynalazku można stosować do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych, które można wykorzystać do dalszego oczyszczania kompozycji, zawierających polipeptydy według wynalazku, przez chromatografię powinowactwa. Polipeptydy i peptydy można także stosować w standardowych testach immunologicznych do przesiewu pod względem obecności przeciwciał wobec M.catarrhalis w próbce.

Przykład: Izolacja i charakteryzacja polipeptydu OMP 106 oraz genu, kodującego go ze szczepu ATCC 49143 lub innych szczepów

Materiały i metody

Test hemaglutynacji

Hemaglutynację przez M.catarrhalis testowano zgodnie z opisem Soto-Hemandeza i in., (J. Glin. Microbiol. 27:903-908) z wyjątkiem 5% zamiast 3% objętościowych erytrocytów użytych na szkiełku do testu aglutynacji. Pierwsze testy aglutynacji przeprowadzono przy użyciu 20 pg komórek bakteryjnych (masa wilgotna). Ponieważ szczep M.catarrhalis ATCC 49143 hodowany na płytkach z agarem z krwią w temperaturze 35°C, dawał silną reakcję hemaglutynacji, wybrano go jako szczep odnośnikowy. Seryjnie rozcieńczony szczep ATCC 49143 w rozcieńczeniach 1:2 dał w wyniku zmniejszenie reakcji hemaglutynacji. Wyniki ++++ do + oparto o hemaglutynację obserwowaną u szczepu ATCC 49143 po seryjnych rozcieńczeniach 1:2 tak, że uzyskano reakcję +, stosując 1/4 liczby komórek wymaganych do uzyskania reakcji +++.

Inhibicja hemaglutynacji

Zawiesinę komórkową ATCC 49143 M.catarrhalis rozcieńczono seryjnie 1:2, a rozcieńczenie, które dało reakcję hemaglutynacji + przy 7 pl soli fizjologicznej Dulbecco buforowanej fosforanem i 7 pl 5% (objętościowo) ludzkich erytrocytów 0+, użyto do testu inhibicji hemaglutynacji przez cukry proste i pochodne cukrów. Aby określić, czy cukry proste lub pochodne cukrów mogą hamować hemaglutynację przez M.catarrhalis, zmieszano 7 pl danego cukru przy 500 mM z 7 pl komórek M.catarrhalis i inkubowano przez 5 minut, pozwalając na interakcję między cukrem i komórkami. Następnie dodano 7 pl 5% (objętościowo) ludzkich erytrocytów 0+ i po 1 minucie oceniono wynik hemaglutynacji. Każdy cukier i pochodną cukru testowano pod względem zdolności do hamowania hemaglutynacji. Potem roztwór podstawowy cukru i pochodnej cukru rozcieńczono seryjnie 1:2, i te rozcieńczenia testowano pod względem zdolności do hamowania hemaglutynacji, przy użyciu procedury opisanej powyżej. W ten sposób określono minimalne stężenie węglowodanu wymagane do inhibicji hemaglutynacji

Wiązanie liganda i receptora

Wiązanie M.catarrhalis z receptorami glikolipidowymi komórek zwierzęcych zbadano przy użyciu frakcjonowania w chromatografii cienkowarstwowej (TLC) glikolipidów komórek gospodarza i nałożenia znakowanych komórek chromatogramu, postępując zgodnie z procedurami opisanymi przez Magnani'ego i in., 1982, J. Biol. Chem. 257:14365-14369). Krótko, glikolipidy otrzymane od Matreya Inc. (Pleasant Gap, PA) rozpuszczono na płytkach wysokosprawnego chromatografu cienkowarstwowego (HPTLC) w chloroformie, metanolu, wodzie (5:4:1). Płytki albo barwiono orcynolem w temperaturze 100°C, albo pokryto pęcherzykami M.catarrhalis znakowanymi ⁿ⁵I wytworzonymi jak opisano poprzednio (Murphy i Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174) przy 2 x 10⁶ cpm/ml przez 2 godziny. Płytki następnie przemyto 5 razy, wysuszono i poddano ekspozycji wobec błony rentgenowskiej.

Ekstrakcja OG oMp

Szczepy M.catarrhalis, hodowano w temperaturze 35°C przy 200 obrotach na minutę w 1 litrze bulionu Muellera Hintona w 4 litrowej kolbie. Wyizolowano białko błony zewnętrznej (OMP) przez traktowanie 50 mg komórek (masa wilgotna) 0,67 ml 1,25% n-oktylo-P-D-glukopiranozydu (to jest oktylo-glukozydu; OG) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki granulowano w mikrowirówce przez 5 minut i supernatant użyto jako ekstrakt oktylo-glukozydowy. Porównanie profili białkowych tych ekstraktów z licznych szczepów M.catarrhalis z pęcherzykami (to jest pęcherzykami błony zewnętrznej) wyizolowanymi przez wirowanie różnicujące, które są bardzo bogate w białka błony zewnętrznej (OMP) z M.catarrhalis (Murphy i Loeb, Microbial Pathogen. 6:159-174) wskazuje, że ekstrakty oktylo-glukozydowe zawierają przede wszystkim białka błony zewnętrznej M.catarrhalis (fig. 1). Pokazuje to, że ekstrakcja oktylo-glukozydowa za22

189 995 pewnia szybszą procedurę z wyższą wydajnością białek błony zewnętrznej, w porównaniu z białkami błony zewnętrznej otrzymanymi z pęcherzyków.

Trawienie proteolityczne OMPlOó mg komórek ze szczepu ATCC 49143 w 1 ml soli fizjologicznej Dulbecco buforowanej fosforanem, trawiono przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej następującymi proteazami: chymotrypsyną traktowaną TLCK (5 mg), proteinazą K (5 mg), trypsyną traktowaną TLCK (5 mg) lub proteazą V8 (100 jednostek). Wszystkie proteazy otrzymano z Sigma Chemicals (St.Louis, MO). Zaraz po traktowaniu proteazami, komórki przemyto raz w PBS, ponownie zawieszono w 1 ml PBS i testowano aktywność hemaglutynacji. Dodatkowo ekstrahowano komórki bakteryjne traktowane proteazami, za pomocą oktylo-glukozydu, aby białka błony zewnętrznej można było rozpuścić w celu identyfikacji konkretnych białek, które mogły być trawione przez proteazy.

Odmiany nie hemaglutynujące

Normalnie, hemaglutynujące hodowle M.catarrhalis rosną w wytrząsanych kolbach, zawierających bulion Muellera Hintona w temperaturze 35-37°C przy 200 obrotach na minutę przez 24-48 godzin. Komórki pobrane bezpośrednio z płytki z agarem z krwią lub płytki agarowej z pożywką Muellera Hintona także wykazują ekspresję fenotypu hemaglutynującego. W celu selekcji do odmiany nie hemaglutynującej (NHA), szczep ATCC 49143 pasażowano seryjnie co 5 dni w statycznych hodowlach rosnących w bulionie Muellera Hintona w temperaturze 35°C. Przy każdym pasażu, szczep pobierano tylko z powierzchni hodowli bulionowej. Do drugiego pasażu rozwinął się pływający kożuch komórek i tego kożucha komórek użyto jako posiewu do kolejnej hodowli. Przez seryjne hodowanie w ten sposób, wytwarzano odmiany NHA ATCC 49143 zwykle po trzech pasażach.

Izolacja polipeptydu OMPlOó

Polipeptyd OMPlOó z ekstraktu błony zewnętrznej ATCC 49143 M.catarrhalis, wykrywa się (np. przez barwienie srebrem lub przeciwciała anty-OMPlOó) w denaturujących żelach jedynie po inkubowaniu ekstraktu w temperaturze 100°C przez pięć minut. W celu określenia czy pojawienie się wstęgi OMPlOó po inkubacji w temperaturze 100°C jest wynikiem agregacji białek o niższej masie cząsteczkowej podczas wrzenia, lub czy wrzenie pozwala normalnie zagregowanym białkom na wejście do żelu, nie gotowany ekstrakt oktylo-glukozydowy błony zewnętrznej ATCC 49143 analizowano na natywnym żelu poliakrylamidowym. Specyficzne regiony żelu, włączając te tuż poniżej próbki, odcięto i zagotowano. Otrzymane próbki rozpuszczono następnie na denaturującym żelu poliakrylamidowym i zabarwiono barwnikiem srebrnym (Silver Stain Plus, numer katalogowy 161-0449, BioRad Laboratories, Richmond, CA). W celu sekwencjonowania N-terminalnego wymieszano ekstrakt oktylo-glukozydowy ATCC 49143 z buforem do próbek PAGE, zawierającym SDS i inkubowano przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Potem rozpuszczono białka na 12% PAGE z SDS i przeniesiono na błonę PVDF przez elektroblotting. Region błon, zawierający wstęgę OMPlOó odcięto następnie w celu sekwencjonowania amino-terminalnego. W żadnej z procedur PAGE stosowanych do izolacji polipeptydu OMPlOó nie użyto czynników redukujących w buforach do próbek lub żelowych.

Surowica odpornościowa anty-OMPlOó

Wytworzono surowicę odpornościową wobec OMPlOó przez rozpuszczenie polipeptydu OMPlOó z odmiany HA ATCC 49143 w denaturującym żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu, jak opisano poprzednio (Laemmli, 1970, Naturę 227:680-685) i odcięcie wstęgi, zawierającej (OMPlOó od żelu. Odciętą wstęgę macerowano i wstrzyknięto królikowi, w celu wytworzenia surowicy odpornościowej wobec polipeptydu OMPlOó. Surowicę odpornościową użyto do inhibicji hemaglutynacji jak opisano powyżej, lecz stosując surowice odpornościową w miejsce węglowodanu. Surowicę odpornościową zbadano także pod względem aktywności cytotoksycznej, w której pośredniczy dopełniacz, przeciw M.catarrhalis, jak opisano dalej.

Western biot z surowicą odpornościową anty-OMPlOó

M.catarrhalis ATCC 49143, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240, ATCC 25238 i ATCC 8176; M.bovis ATCC 33078; M.lacunata ATCC 17967; M.bovis ATCC 10900; M.oslonensis ATCC 10973; Neisseria gonorhoeae (izolat kliniczny);

189 995 oraz N-meningitidis ATCC 13077, hodowano na płytkach agarowych z czekoladą przez 48 godzin w temperaturze 35°C przy 5% CO₂. Komórki usunięto przez zdrapanie kolonii z powierzchni agaru przy użyciu polistyrenowee pętli do posiewania. Następnie komórki roztworzono przez zawieszenie 30 pg komórek w 150 pl buforu do próbek pAGE (360 mM bufor Tris [pH 8,8], zawieraeąśym 4% dodecylosiatśzan sodu i 20% glicerol), i inkubowano zawiesinę w temperaturze 100°C przez 5 minut. Roztworzone komórki puszczono na 12% żelu pkliakrylamidkwym eak dla LaemmlLego i oddzielone białka przeniesiono przez elektroforezę na błony PVDF (Thebaine i in., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354) z wyeątkiem tego, że do buforu do przenoszenia dodano 0,05% dkdecylosiatśzan sodu w celu ułatwienia ruchu białek z żelu. Potem błony PVDF wstępnie traktowano 25 ml soli Uizjklkgicznee Dulbecco buforowanee fosforanem, zrwierąiącee 0,5% kazeinę sodową, 0,5% albuminę surowicy bydlęcee i 1% surowicę kozią. Wszystkie następne inkubacee przeprowadzono przy użyciu tego buforu do wstępnego traktowania.

Błony PVDF inkubowano z 25 ml rozcieńczoną 1:500 wstępną surowicą odpornościową królika lub surowicą królika immunizkwanegk polipeptydem OMP1O6 (eak opisano powyżej przez 1 godzinę w temperaturze pkkkekwee. Następnie błony PVDF przemyto dwukrotnie buforem do przemywania (20 mM bufor Tris [pH 7,5], zrwietąiącym 150 mM chlorku sodu i 0,05% Tween-20). Błony PVDF inkubowano z 25 ml rozcieńczknej 1:5000 koziee antykróliczee IgG znakowanee peroksydazą (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove Penn., numer katalogowy 111-035-003) przez 30 minut w temperaturze pokkekwee. Potem błony PVDF przemyto 4 razy buforem do przemywania i wywołano za pomocą tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny i nadtlenku mocznika, eakie dostarczono z Sigma Chemicals Co. (St.Louis, MO, numer katalogowy D-4418) przez 4 minuty każda.

M.catarrhalis ATCC 49143 hodowano przez noc w temperaturze 35°C w łaźni wodnee z wytrząsaniem w bulionie Muellera Hintona. Komórki granulowano przez wirowanie i następnie zawieszono ponownie w równee kbeętośśi soli fizeklkgicznee buforowanee fosforanem z modyfikacją Dutoe^o, bez wapnia ani magnezu (PBS/MC). 20 pl zawiesiny komórkowee nałożono na każde z 5 czystych szkiełek mikroskopowych. Po ustawieniu przez 10 sekund, nadmiar płynu usunięto pipetą i pozostawiono szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 1 godzinę. Następnie szkiełka utrwalono gorącem nad otwartym płomieniem aż do uzyskania szkła ciepłego w dotyku. Szkiełka traktowano początkowo 40 pl rozcieńczknej 1:40 surowicy kdpkmkśśikwej anty-OMP106 lub wstępną surowicą odpornościową od tego samego zwierzęcia, rozcieńczonee w PBS/MC lub PBS/MC przez 10 minut, potem przemyto 5 razy w PBS/MC. Szkiełka traktowano 40 pl z 5 pg/ml PBS/MC przeciwciałem kozim znakowanym izotikśyeanianem wobec IgG królika (Kbkegaard i Perry Laboratories, Inc., Gaithesburg, MD, numer katalogowy 02-15-06). Szkiełka inkubowano w ciemności przez 10 minut i przemyto 5 razy w PBS/MC. Każde szkiełko przechowywano przykryte PBS/MC pod szkiełkiem nakrywkowym i oglądano w mikroskopie Slukrescenśyenym zaopatrzonym w filtr 489 nm. Dla każdee próbki zbadano wzrokowo pięć obrazów mikroskopowych, w celu oceny obszaru zabarwienia.

Wyniki

Aktywność hemrglutynaśji

Aktywność aglutynacei Muatanhalis ze względu na erytrocyty u specyficznych gatunków o naesilnieeszee aktywności obsetwkwanee z erytrocytami człowieka. Erytrocyty królika także aglutynowały z M^atanbalis lecz mniee dramatycznie niż komórki ludzkie. Erytrocyty myszy, konia lub owcy nie aglutynowały (patrz tabela 1).

Tabela 1: Siła bemaglutynrśei erytrocytów różnych gatunków przy użyciu M.catarrhalis ATCC 49143

Źródło erytrocytów	Wynik bemaβlutynaciir
Człowiek	++++
Królik	++
Mysz	-
Koń	-
Owca	-
a ++++ = naisilnieisza rglutynrcia, - wskazuje	brak aglutynacp

189 995

Receptory i ligandy OMP106

Aktywność hemaglutynacji M.catarrhalis powoduje wiązanie z globotetrozą (GbG . Pęcherzyki ze szczepów hemaglutynujących wiążą się z glikolipidem, posiadającym Gb4, podczas gdy szczepy nie hemaglutynujące nie wiążą się z takim samym glikolipidem (patrz fig. 2). Aktywność hemaglutynacji M.catarrhalis hamują składniki jednocukrowe Gb4 lub pochodne takich jednocukrowców, przy czym najsilniejszymi inhibitorami są N-acetylogalaktozamina i galaktoza (zwłaszcza alfa anomer galaktozy) (patrz tabela 2).

Tabela 2: Minimalne stężenie cukrów wymagane do inhibicji hemaglutynacji (MIC) przez M.catarrhalis

Cukier	MIC (mM)*
D-glukoza	> 167
D-Mannoza	83
D-Galaktoza	41
L-Fukoza	83
N-acetylo-D- glukozamina	> 167
N-acetylo-D-galaktozamina	41
Metylo-a-glukoza	> 167
Metylo-a-mannoza	167
Metylo-a-galaktoza	10
Metylo-β- galaktoza	83

* Minimalne stężenie cukru wymagane do inhibicji reakcji hemaglutynacji 1+ przez M.catarrhalis ATCC 49143 za pomocą przemycia 5% erytrocytami 0+ człowieka.

Zarówno N-acetylogalaktozamina jak i alfa-galaktoza są częścią czterocukru Gb4. Korelacja między hemaglutynacją i wiązaniem z Gb4, oraz obserwacja, że hemaglutynację hamują jednocukry, zawierające receptor Gb4 sugerują, że komórki M.catarrhalis wiążą się z czterocukrem Gb4. Ten czterocukier jest obecny na ludzkich erytrocytach i tkankach i może pośredniczyć w przyczepianiu się M.catarrhalis do błon eukariotycznych.

Identyfikacja polipeptydu OMP106

Trawienie proteolityczne komórek M.catarrhalis i następnie analiza hemaglutynacji przez strawione komórki, pokazały, że traktowanie proteazowe chymotrypsyną i proteinazą K zniszczyło aktywność hemaglutynacji, wskazując, że w aktywności hemaglutynacji pośredniczy białko. Analiza profili białkowych OMP komórek M.catarrhalis trawionych proteazą wykazała, że w każdej próbce rozłożyło się wiele białek, tak, że profile nie dostarczają wskazówki, które białko jest bezpośrednio odpowiedzialne lub pośrednio związane z aktywnością hemaglutynacji (patrz fig. 3).

Ponieważ traktowanie proteazą wskazuje, że polipeptyd jest bezpośrednio lub pośrednio odpowiedzialny za aktywność hemaglutynacji, Zgłaszający użył SDS-PAGE do porównania profili OMP ze szczepów hemaglutynujących ze szczepami nie hemaglutynującymi (fig. 4). Analiza różnic między tymi profilami wskazała, że szczepy hemaglutynujące mają dwa unikalne polipeptydy, przy czym jeden o widocznej masie cząsteczkowej 27 000 (oznaczony OMP27) i drugi, który był jedynym białkiem o widocznej masie cząsteczkowej większym niż 106 000 (oznaczony OMP 106). W szczególności wstęga polipeptydu OMP 106 była nieobecna w preparatach OMP różnych komorek traktowanych proteazą, które posiadały zmniejszoną lub brak aktywności hemaglutynacji, podczas gdy wstęga OMP27 była obecna w preparacie OMP komórek traktowanych proteinazą K, które nie posiadały aktywności hemaglutynacji. Dodatkowo, wstęga polipeptydu OMP 106 nie została rozłożona przez trawienie proteinazą V8, która nie miała wpływu na aktywność hemaglutynacji traktowanych komórek.

Profil OMP odmian NHA

Seryjne hodowle odmiany NHA ATCC 49143 w statycznej hodowli w temperaturze 35°C wytworzyły odmianę NHA (oznaczoną 49143-NHA) po trzecim pasażu hodowli. Ta

189 995 utrata aktywności hemaglutynacji była powtarzalna. Analiza profili OMP ekstraktów OG błony zewnętrznej odmian HA i NHa wykazała, że wstęga polipeptydu OMP106 zniknęła z ekstraktu 49143-NHA (fig. 5). Sugerowało to, że polipeptyd OMP106 jest hemaglutyniną M.catarrhalis (to jest polipeptyd OMP106 wiąże receptor Gb4 lub jest podjednostką homopolimerycznego białka, które wiąże receptor Gb4) lub tworzy część hemaglutyniny M.catarrhalis (to jest polipeptyd OMP106 jest podjednostkąheteropolimerycznego białka, które wiąże receptor Gb4).

OMP106 i hemaglutynacja

Poliklonalna surowica odpornościowa wzbudzona wobec polipeptydu OMP106 ATCC 49143 neutralizowała hemaglutynację przez ATCC 49143. Podtrzymuje to dodatkowo konkluzję, że aktywność hemaglutynacji M.catarrhalis obejmuje polipeptyd OMP106 i że polipeptyd OMP106 jest antygennie konserwowany wśród szczepów. Patrz także fig. 9A, która ukazuje polipeptyd OMP106 heterologicznych szczepów M.catarrhalis.

Położenie OMP1O6 na powierzchni zewnętrznej

Króliczej surowicy odpornościowej anty-OMP 106 użyto do pośredniego barwienia immunoflurescencyjnego, aby określić, czy polipeptyd OMP106 podlega ekspozycji na powierzchni zewnętrznej komórek M.catarrhalis. Komórki M.catarrhalis traktowane surowicą odpornościową anty-OMP 106 barwiły się intensywniej i odmiennie niż komórki traktowane wstępną surowicą odpornościową lub PBS/MC. Wskazało to, że polipeptyd OMP106 nieuszkodzonych komórek M.catarrhalis był reaktywny wobec przeciwciał anty-OMP 106. Wynik ten dowodzi, że polipeptyd OMP106 podlega ekspozycji na powierzchni zewnetrznej M.catarrhalis. Stwierdzenie to jest zgodne z tym, że polipeptyd OMP106 pełni rolę w hemaglutynacji, a ponadto wskazuje, że polipeptyd OMP106 byłby użyteczny jako szczepionka.

Właściwości polipeptydu OMP106

Polipeptyd OMP106 istnieje w postaci wielkiego kompleksu białkowego w swym natywnym stanie lub w postaci agregeratów po estrakcji oktylo-glukozydem. Wniosek ten opiera się na stwierdzeniu, że wyekstrahowane oktylo-glukozydem komórki M.catarrhalis rozpuszczą polipeptyd OMP1O6, lecz wyekstrahowany polipeptyd OMP106 nie wchodzi do denaturujących PAG chyba, że najpierw inkubuje się ekstrakt w temperaturze 100°C (fig. 6). Dalej, nie widać, żeby wstęga polipeptydu OMP106 tworzyła się z polipeptydów o niższej masie cząsteczkowej, które polimeryzują lub ulegają agregeracji po ogrzaniu, ponieważ polipeptyd OMP106 w nieogrzanej próbce denaturującej jest uwięziony w studzience z próbką i wchodzi do rozpuszczającego żelu tylko wtedy gdy próbkę inkubuje się najpierw w temperaturze 100°C. Ta właściwość biochemiczna jest bardzo użyteczna przy identyfikacji polipeptydu OMP 106 w różnych żelach.

Stosując ekstrakty oktylo-glukozydowe M.catarrhalis, potem inkubując ekstrakty z dodecy losiarczanem sodu w temperaturze 100°C i rozpuszczając białka na denaturującym żelu poliakrylamidowym. Zgłaszający oszacował widoczną masę cząsteczkową polipeptydu OMP106 z różnych szczepów M.catarrhalis, konkretnie ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 i ATCC 43628, aby uszeregować je od około 180 000 do około 230 000 (fig 9A), podczas gdy polipeptyd ze szczepu ATCC 49143 jak się okazuje, posiada masę cząsteczkową około 190 000 (fig. 6).

Polipeptyd OMP106 ze szczepu ATCC 49143 ekstrahowano z szkiełka z żelem i sekwencjonowano jego koniec N. Sekwencjonowanie pokazało, że koniec N polipeptydu OMP106 z błony zewnętrznej ATCC 49143 stanowi IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSlAIGDNKIV (SEQ ID nr: 1). Oprócz tego, wyizolowano wewnętrzny peptyd OMP106 wytworzony przez trawienie Lys-C (Femandez i in., 1994, Anal. Biochem. 218:112-117) i jego sekwencję określono jako GTVLGGKK (DEQ ID nr: 2).

Zgłaszający utworzył trzy sondy oligonukleotydowe. Dwie sondy odpowiadają wewnętrznemu peptydowi GTVLGGKK, jedna posiada następującą sekwencję GGNACNGTNCtNgGNgGnAARAAR (SEQ ID nr: 3), inna ma następującą sekwencję GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR (SEQ ID nr: 7). Inna sonda Mc 5-72, kodująca wewnętrzny fragment (SEQ ID nr: 5) sekwencji amino-terminalnej OMP106 (SEQ ID nr: 1) posiada następującą sekwencję GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (SEQ ID nr: 4). Hybrydyzacja sondy Mc 5-72

189 995 uzupełniająca trawienie Hindlll i Dral DNA M.catarrhalis w każdym przypadku wytwarzała pojedynczą wstęgę w analizie Southern biot (fig. 7). Wstęga hybrydyzacji w miejscu trawienia Hindlll ma wielkość w przybliżeniu 8,0 kb; wstęga hybrydyzacji miejsca trawienia Dral posiada wielkość w przybliżeniu 4,2 kb (fig. 7).

Ochrona polipeptydu OMPlOó

Analiza Western biot ekstraktów białek błony zewnętrznej wielu szczepów M.catarrhalis i gatunków pokrewnych wykazała, że przeciwciała anty-OMPlOó wiążą się z polipeptydem o około 180000 do około 230 000 w wielu szczepach M.catarrhalis, zarówno szczepach i odmianach HA jak i NHA (fig.9A). Przeciwciała anty-OMPlOó nie wiążą się z żadnym polipeptydem w ekstrakcie białkowym bakterii pokrewnych (fig. 8A). Wyniki te pokazują co następuje: 1) Polipeptyd OMPlOó można stosować do wytwarzania przeciwciał, które mają zastosowanie diagnostyczne przy identyfikacji M.catarrhalis. 2) Przeciwciała wobec polipeptydu OMPlOó jednego szczepu (np. OMPlOó ATCC 49143) można stosować do identyfikacji i izolacji odpowiadającego polipeptydu OMPlOó innych szczepów M.catarrhalis. Co ciekawe, wyniki Western biot pokazują, że wiele szczepów NHA M.catarrhalis posiada polipeptyd OMP106 w ekstraktach OG ich błon zewnętrznych.

Odkrycie to i fakt, że barwienie srebrem OMP z ekstraktów błon zewnętrznych szczepów NHA M.catarrhalis po PAGE nie ujawnia wstęgi w zakresie 180 000 do 230 000, wskazuje, że polipeptyd OMPlOó podlega ekspresji w większości szczepów lub odmian M.catarrhalis lecz aby być aktywnym pod względem hemaglutynacji (to jest wiązać receptor na powierzchni komórki ssaka) lub barwić się srebrem, polipeptyd OMPlOó musi być odpowiednio modyfikowany w pewien sposób. Najwyraźniej tylko szczepy i odmiany HA są zdolne do odpowiedniej modyfikacji polipeptydu OMPlOó tak, że może on pośredniczyć w wiązaniu bakterii z receptorem hemaglutyniny na powierzchni komórki ssaka.

Przykład: Skuteczność szczepionki OMPlOó: Aktywność cytotoksyczna surowicy odpornościowej anty-OMPlOó.

Zbadano aktywność cytotoksyczną przeciwciał anty-OMPlOó, w której pośredniczy dopełniacz, aby określić siłę szczepionki polipeptydu OMPlOó. Wytworzono surowicę odpornościową wobec polipeptydu OMP 106 odmiany HA ATCC 49143 jak opisano powyżej. Zbadano aktywność wstępnej surowicy odpornościowej i surowicy odpornościowej anty-OMP106 w pośredniczeniu wiązania dopełniacza M.catarrhalis, przy użyciu „Serum Bactericidal Test” opisanego przez Zollingera i in., (Immune Responses to Neisseria meningitidis, w Manuał of Clinical Laboratory Immunology, wyd. 3-cie, strony 347-349), z wyjątkiem tego, że stosowano komórki HA i NHA szczepów lub odmian M.catarrhalis zamiast komórek Neisseria meningitidis.

Wyniki ukazują, że surowica odpornościowa anty-OMPlOó pośredniczyła w wiązaniu dopełniacza odmiany HA heterologicznego M.catarrhalis 43627 lecz nie odmiany NHA M.catarrhalis ATCC 43627 lub M.catarrhalis NHA ATCC 8176. Tabela 3 omawia aktywność cytotoksyczna wstępnej surowicy odpornościowej i surowicy odpornościowej anty-OMP106, w której pośredniczy dopełniacz, przeciw odmianie HA ATCC 43627.

Tabela 3: Aktywność cytotoksyczna wstępnej surowicy odpornościowej i surowicy odpornościowej anty-ÓMP106, w której pośredniczy dopełniacz__

Miano cytotoksyczne^{* 1}

S urowica wstępna Anty-OMP 106

Doświadczenie 1 16 128

Doświadczenie 2_8_64_ ¹ Miano znajduje się w najwyższym rozcieńczeniu, przy którym surowica może pośredniczyć w wiązaniu dopełniacza odmiany HA ATCC 43627 (np. 16 oznacza 16-krotne rozcieńczenie surowicy), wyższe liczby, wyższa aktywność cytotoksyczna lub miano.

Jak ukazano w tabeli 3, surowica odpornościowa anty-OMPlOó ma 8-krotnie większą aktywność cytotoksyczną niż wstępna surowica odpornościowa. Odkrycie to wskazuje, że polipeptyd OMPlOó jest użyteczny jako szczepionka przeciw szczepom i odmianom HA

M.catarrhalis.

189 995

WYKAZ SEKWENCJI

1) INFOIRMACJ'E 0GÓL1NE:

ZGŁASZAJĄCY: TUCKER, KENNETH

PŁOSILA , LAURA ii) TYTUŁ WYNALAZKU: POLIPEPTYD BIAŁKA 106 BŁONY ZEWNĘTRZNEJ

MORAXELLA CATARRHALIS, JEGO SEKWENCJA GENOWA I ZASTOSOWANIA iii) LICZBA SEKWENCJI : 8 iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

A) ADRE S: PEINHIE & EDMONDS

B) ULICA: 115 5 Avenue o tthe Ameriaas

C) MIASTO: Nowy Jork

D) SAAN:Nowy»

E) KRAJ: UJA

F) KOD: 10036-7711

v) POSTAĆ ODCZYTYWALNA PRZEZ KOMPUTER:

A) TYP TTEROWANAA: S^tajya yykóów

B) KOMPUEER: Zoonny z IBM PC

C) SYSPEM OPPRACYESY: CC-DOS/MS-ODS

D) OPRaGA-MOWA/HEP Patnnt eealase 11,0, Wej a 11,30 vi) AKTUALNE DANE ZGŁOSZENIOWE:

A) NUMER ZGŁOSZENIA: US

B) DAAA WYPŁENIE^AA:

C) KLASYFIKUJĄ:

viii) INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU/POŚREDNIKU

A) NAZWISKO: BaWum, GealddmeF.

A) NUMER RyPESTRACYOSY: 11,322

A) NUMER ŚWADDECTWA^/TOZWOPENIA: 969--045 ix) RNOIRMACJE TELEKOMUNIKACYJNE;

A) THIFEON: 2212) 790-9090

B) TELEFAKS: 2212) 869-8864

C) TELEKS :6614) ^^NIm

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 1:

1) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 43 aminokwasy

b) ΊΎΡ: ammokwas

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW:

D) TOPOLOGIA: nieznana ii) TYP CZĄSTECZKI:

xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 1:

Ile Gly Ile Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn 5 10

Ala Arg Gly Asp Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gin

20 25

Ala Leu Gly Ser Gln Ser He Ala Ile Gly Asp Asn Lys Ile 30 35 40

Val

2) INFTRMAPJP O SEQ ID nr 2:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW:

D) TOPOLOGIA: nieznana

v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 2:

189 995

Gly Thr Val Leu Gly Gly Lys Lys 1 5

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 3:

1) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad

B) TYP : kwa s nukliinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nieznana

D) TOPOŁOG!A : nieanana ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

A) OPIS: /opis = „sonda xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 3:

GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 4:

ί) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 72 pary zasad

B) TYP : kwss nukteżnowy

C) HLOŚĆ ŁAŃCUCHÓW : ppiedynena

D) TOPOLOGM.:

ii) TYP CZĄSTECZKI: genomowy kwas nukleinowy ix) WŁAŚCIWOŚĆ:

A) NAZWA/KŁUCZ : CDS

B) POŁOŻENIE : 1..72 xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 4:

GAA GCG GAC GGG GGG AAA GGC GGA GCC AAT GCG CGC GGT GAT Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp

5 10

AAA TCC ATT GCT ATT GGT GAC ATT GCG CAA

Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln

20

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 5:

CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ : 24 ammokwasy

b) TYP: ammokwas

D) TOPOLOGIA : Umowa ii) TYP CZĄSTECZKI: białko xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 5:

Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp

5 10

Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln

20

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 6:

1) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 24 parp zasza

B) TYP: : kwas nukleinooy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nieznana

D) TOPOLOGA: : nieznana ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

AA O\T)TQ· /r\ri,p = psiadn^,,

KJ „JUllUU.

xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 6:

YTTYTTNCCNCCNAGNACNG TNCC

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 7:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 24 {3:117 zasza

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: nieznana

189 995

D) TOPOLOGIA: neezaana ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

A) OPIS : oopi s = „^ηά”” xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 7: GGNACNGTNT TRGGNGGNAA RAAR 2) INFORMACJE O SEQ ID nr 8:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad

B) TYP; kwss nukeiinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW

D) ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

A) OPSS : oppśs = „jond”” xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 8: YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC

189 995

8176 23246 25238 49143

FIG.1

189 995

Orcynol 8176 49143

2 3 4 T 2 3 4 7 2 3 4

FIG.2 eo >

O <n

106

8(Γ

o. <

> N	<
a: <	z
I- z O ΰ	> co
ż Σ l-	a.
	>
δια:	κ
co o a.	t-

tu

I

o.

hiasri.SsBi^ \gnZ 'w*' ’ ' ’ ·.·* · ?-ΛΑ •^: ‘νλ'ξ^Λ.ϊίΐτ^ί *S3Pv ·_: ^!2··?Ο ic $

CD .α~μκ$

495

FIG.3

189 995 <ο § 00 <Μ

Ο «>

CM £

00 <0	55 φ	00 3	5
m	to	to	3?

J06

JJ0

Λ⁹·⁵

J32.5

J7.5

18.5

HA 0 1

0 0 4 2

FIG.4

Κ» Γ0 Μ- Μ*

S $ ?

106^ ^<

80^

49.5^....... .......

).·

32,5^

27.5^

18.5_ιμ»«μ ΗΑ 4+ FIG.5

189 995

FIG.6 a a

Ϊ

4)

6000*

4000 ♦

2000*

♦ POCZĄTEK

FIG.7

189 995

OMP 106

A B C D E F G

FIG.8A

M_r •<106

-«80 «49.5 «32.5 «27.5

-«16.5

ABCDEFGMr

FIG.8B

— 27.5

FIG.9A

189 995

FIG.9B

189 995

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowany polipeptyd OMP106, znamienny tym, że stanowi polipeptyd błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis i ma masę cząsteczkową około 180 000 do około 230 000, jak określono przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z SDS przy użyciu miozyny mięśnia szkieletowego królika i β-galaktozydazy E. coli jako standardów masy cząsteczkowej o odpowiednio 200 000 i 116 500, i zawiera sekwencję oznaczoną jako SEQ ID nr: 1 lub sekwencję w przynajmniej 80 % identyczną z SEQ ID nr 1.
2. Polipeptyd OMP106 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto sekwencję SEQ ID nr: 2.
3. Polipeptyd OMP106 według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że ma masę cząsteczkową około 190 000.
4. Polipeptyd OMP106 według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi polipeptyd błony zewnętrznej szczepu Moraxella catarrhalis wybranego z grupy składającej się z ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628 i ATCC 49143.
5. Polipeptyd OMP106 według zastrz. 4, znamienny tym, że szczep Moraxella catarrhalis stanowi szczep ATCC 49143.
6. Polipeptyd OMP106 według zastrz. 1, znamienny tym, że Moraxella catarrhalis jest odmianą hemaglutynującą.
7. Polipeptyd OMP106 według zastrz. 1, znamienny tym, że reaguje z barwnikiem srebrnym.
8. Fragment polipeptydowy, znamienny tym, że składa się z przynajmniej 6 reszt aminokwasowych polipeptydu OMP106 opisanego w zastrzeżeniu 1.
9. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera polipeptyd OMP106 opisany w zastrz. 1.
10. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera fragment polipeptydu OMP106 opisany w zastrz. 8.
11. Kompozycja antygenowa, znamienna tym, że zawiera polipeptyd OMP106 opisany w zastrz. 1.
12. Kompozycja antygenowa, znamienna tym, że zawiera fragment polipeptydu OMP106 opisany w zastrz. 8.
13. Zastosowanie polipeptydu opisanego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji M.catarrhalis.
14. Zastosowanie fragmentu polipeptydu OMP106 opisanego w zastrz. 8 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania infekcji M. catarrhalis.