ES2202624T3

ES2202624T3 - Proteina omp106 de la membrana exterior de moraxella catarrhalis, secuencia genica y sus usos.

Info

Publication number: ES2202624T3
Application number: ES97926409T
Authority: ES
Inventors: Kenneth Tucker; Laura Plosila
Original assignee: Antex Biologics Inc
Current assignee: Emergent Product Development Gaithersburg Inc
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-04-28
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2017-04-28
Also published as: HU223004B1; SK150998A3; HK1095358A1; CN100415871C; US20020177200A1; BR9711090A; NO324816B1; EE9800373A; CA2253636C; DE69723254D1; EP0900025A4; CA2253636A1; JP2000510696A; CZ352498A3; WO1997041731A1; EE04684B1; GEP20022695B; US20100021492A1; BG64832B1; US20080145916A1

Abstract

LA INVENCION EXPONE EL POLIPEPTIDO DE LA PROTEINA - 106 DE LA MEMBRANA EXTERIOR (OMP106) DE LA MORAXELLA CATARRHALIS, LOS POLIPEPTIDOS DERIVADOS DE LA MISMA (POLIPEPTIDOS DERIVADOS DE LA OMP106), SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN DICHOS POLIPEPTIDOS, Y ANTICUERPOS QUE FIJAN ESPECIFICAMENTE EL POLIPEPTIDO DE LA OMP106 Y/O LOS POLIPEPTIDOS DERIVADOS DE LA OMP106. SE EXPONEN TAMBIEN COMPOSICIONES INMUNOGENICAS, PROFILACTICAS O TERAPEUTICAS, INCLUIDAS VACUNAS, QUE COMPRENDEN EL POLIPEPTIDO OMP106 Y/O LOS POLIPEPTIDOS DERIVADOS DE LA OMP106. LA INVENCION EXPONE ADEMAS LOS PROCEDIMIENTOS PARA INDUCIR RESPUESTAS INMUNES A LOS POLIPEPTIDOS DE LA OMP106 DE LA M. CATARRHALIS Y M. CATARRHALIS, Y POLIPEPTIDOS DERIVADOS DE LA OMP106 EN ANIMALES.

Description

Proteína OMP106 de la membrana exterior de Morasella catarrhalis, secuencia génica y sus usos.

1. Introducción

La presente invención se refiere en general al polipéptido de la proteína 106 de la membrana externa (OMP106, del inglés "outer membrane protein-106") de Moraxella catarrhalis. La invención abarca un polipéptido OMP106 purificado y polipéptidos derivados del mismo (polipéptidos derivados de OMP106). La invención abarca también anticuerpos, incluyendo anticuerpos citotóxicos, que unen específicamente el polipéptido OMP106 y/o polipéptidos derivados de OMP106. La invención abarca además composiciones profilácticas o terapéuticas, incluyendo vacunas, que comprenden el polipéptido OMP106 y polipéptidos derivados de OMP106. La invención proporciona además métodos de inducción de respuestas inmunes frente a M. catarrhalis en mamíferos. La invención proporciona además las secuencias de nucleótidos aisladas que codifican el polipéptido OMP106 y los polipéptidos derivados de OMP106, los vectores que llevan dichas secuencias, y las células hospedantes que contienen dichos vectores.

2. Fundamentos de la invención

Moraxella catarrhalis, también conocida como Moraxella (Branhamella) catarrhalis o Branhamella catarrhalis y anteriormente conocida como Neisseria catarrhalis o Micrococcus catarrhalis, es una bacteria gram-negativa que se encuentra frecuentemente en el tracto respiratorio de los humanos. M. catarrhalis, que originariamente se pensaba era un organismo comensal inocuo, es ahora reconocido como un patógeno importante en infecciones del tracto respiratorio superior e inferior en animales. En humanos, M. catarrhalis causa serias infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos con enfermedad pulmonar crónica, infecciones sistémicas en pacientes inmunocomprometidos, y otitis media y sinusitis en bebés y niños. Véase Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Catlin, B. W., 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320; y las referencias citadas en ellas.

2.1. Proteínas de la membrana externa y anticuerpos protectores

Los componentes de la membrana externa de Moraxella catarrhalis se han estudiado en un intento de entender el proceso patogénico de las infecciones por M. catarrhalis y para desarrollar tratamientos terapéuticos útiles y medidas profilácticas contra tales infecciones. Las proteínas de la membrana externa (OMPs), en particular, han recibido una atención considerable como posibles factores de virulencia y como antígenos potenciales para vacunas. M. catarrhalis tiene entre aproximadamente 10 y 20 OMPs diferentes, con entre 6 y 8 de éstas, OMPs A a H, como las especies predominantes (Murphy y Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174). Los pesos moleculares de las OMPs A a H están en el intervalo de 97 a 20 kDa, respectivamente. Véase Bartos y Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765; Helminen et al. 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Murphy et al., 1993, Molecul. Microbiol. 10:87-97; y Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804-809. Las comparaciones de los perfiles de proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) de preparaciones de membrana externa de 50 cepas de M. catarrhalis muestran espectros casi homogéneos de las OMPs A a H (Bartos y Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765).

Además de las OMPs A a H, una OMP de alto peso molecular, designado HMW-OMP, que tiene una masa aparente de 350 a 720 por SDS-PAGE, se ha identificado también como otro componente superficial prominente en muchas cepas de M. catarrhalis. La HMW-OMP, tras desnaturalización con ácido fórmico, produce una única banda de 120 a 140 kDa y, por tanto, parece ser una proteína oligomérica (Klingman y Murphy, 1994, Infect. Immun. 62:1150-1155). La HMW-OMP parece ser la misma proteína que la designada UspA por Helminen et al., (1994, J. Infect. Dis. 170:867-872) y se ha mostrado que está presente en varias cepas de M. catarrhalis.

El documento WO96/34960 publicado después de la fecha de prioridad de la presente invención y por tanto únicamente relevante en términos de novedad según el Artículo 54(3)EPC, se refiere a una proteína de la membrana externa, y al ácido nucleico que codifica a la misma, de Moraxella catarrhalis que tiene un peso molecular de aproximadamente 200 kDa.

En bacterias intactas o vesículas de membrana externa derivadas de bacterias, varias de las OMPs arriba identificadas presentan epítopes expuestos en la superficie que provocan la producción de anticuerpos que unen las OMPs. Estas OMPs antigénicas incluyen la OMP E y la OMP G (Murphy y Bartos, 1989, Infect. Immun. 57:2938-2941); la OMP C/D (Sarwar et al., 1992, Infect. Immun. 60:804-809); CopB, una OMP de 80 kDa (Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010); y UspA (Helminen et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).

El potencial terapéutico de los anticuerpos frente a epítopes expuestos en la superficie de CopB y UspA se ha evaluado en un modelo animal. El modelo implicó la inoculación directa de una sola vez de los pulmones de ratones BALB/c VAF/Plus con un número controlado de células de M. catarrhalis y el examen subsiguiente de la tasa de aclaración pulmonar de la bacteria (Unhanand et al., 1992, J. Infect. Dis. 165:644-650). Los diferentes aislados clínicos de M. catarrhalis mostraron tasas de aclaración diferentes que se correlacionaban con el nivel de reclutamiento de granulocitos en el sitio de infección. La inmunización pasiva con un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítope expuesto en la superficie tanto de CopB como de UspA aumentó la tasa de aclaración pulmonar de M. catarrhalis (Helminen et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminen et al., 1994, J. Infect. Dis. 170:867-872).

2.2. Adherencia entre las células bacteriana/hospedante y hemoaglutinación

La adherencia de los patógenos bacterianos a la superficie de una célula hospedante promueve la colonización e inicia la patogénesis. Véase E. H. Beachey, 1981, J. Infect. Dis. 143:325-345. Las bacterias gram-negativas expresan típicamente lectinas superficiales que se unen a oligosacáridos específicos de glicoproteínas y/o glicolípidos en la superficie de la célula hospedante. Tales lectinas están a menudo asociadas con pili o fimbrias. La adherencia bacteriana puede tener lugar también mediante la unión inespecífica que resulta de la interacción hidrofóbica y/o de carga con la superficie de la célula hospedante.

El mecanismo de la adherencia de M. catarrhalis a las células del tracto respiratorio sigue estando mal entendido. El organismo se adhiere a células epiteliales orofaríngeas humanas en cultivo (Mbaki et al., 1987, Tohuku J. Exp. Med. 153:111-121). Un estudio de Rikitomi et al. sugiere que las fimbrias pueden tener un papel en la adherencia a tales células, ya que la desnaturalización de las fimbrias o el tratamiento con anticuerpos anti-fimbrias redujo la adherencia de cepas fimbiradas (Rikitomi et al., 1991, Scand. J. Infect. Dis. 23:559-567). La unión mediada por fimbrias, sin embargo, no puede ser la única base de esta adherencia, ya que la cepa de más alta adherencia, entre las varias examinadas, fue una cepa no fimbriada.

Las reacciones de hemoaglutinación reemplazan a menudo los ensayos de adherencia, más complicados, en la clasificación de las adhesiones bacterianas. Sin embargo, Rikimoti et al., no encontraron una correlación entre la adherencia a células epiteliales orofaríngeas humanas y la hemoaglutinación por cepas de M. catarrhalis (Id.). Esto es, tres cepas con alta adherencia no causaron aglutinación de eritrocitos humanos. Por tanto, existen diferentes mecanismos de unión implicados en la adherencia a células epiteliales orofaríngeas humanas y la hemoaglutinación.

Por el contrario, un estudio reciente de Kellens et al. sugiere que la hemoaglutinación por M. catarrhalis está correlacionada con la adherencia a la célula hospedante (Kellens et al., 1995, Infection 23:37-41). Sin embargo, este estudio utilizó un ensayo de adherencia basado en la unión de la bacteria a secciones traqueales porcinas. No está claro si el tejido traqueal porcino puede considerarse homólogo al tejido del tracto respiratorio humano con respecto a la adherencia por parte de cepas patógenas de M. catarrhalis.

A pesar del problemático ensayo de adherencia, Kellens et al. examinaron las actividades de hemoaglutinación de unos ochenta aislados clínicos de M. catarrhalis (Kellens et al., 1995, Infection 23:37-41). Cerca de tres cuartas partes de las cepas examinadas causaron la aglutinación de eritrocitos humanos, de conejo, de cobaya, de perro o de rata, mientras que las cepas restantes no lo hicieron. Las actividades de aglutinación para algunas de las cepas que causaron hemoaglutinación se caracterizaron más a fondo y se mostró que eran dependientes de ion calcio y que se inhibían por digestión con tripsina o tratamiento a alta temperatura o adición de D-glucosamina o D-galactosamina.

Una revisión de las cepas de M. catarrhalis que causan hemoaglutinación y que no causan hemoaglutinación de Tucker et al. ha mostrado que todas las cepas unen el glicolípido gangliotetraosilceramida pero sólo las cepas que causan hemoaglutinación unen el glicolípido globotetraosilceramida (Tucker et al., 1994, Annual Meeting of Amer. Soc. Microbiol., Resumen Nº D124). Además, se mostró que la actividad de hemoaglutinación de M. catarrhalis se inhibe por varios monosacáridos que componen el resto de carbohidrato de la globotetraosilceramida. Estas observaciones llevaron a Tucker et al. a sugerir que M. catarrhalis causa hemoaglutinación mediante la unión a globotetraosilceramidas en las membranas celulares de eritrocitos susceptibles, incluyendo los de las células rojas humanas. Hasta la fecha, ninguna técnica anterior ha identificado una molécula en la superficie externa de M. catarrhalis que sea responsable bien de la adherencia a la célula hospedante o de la hemoaglutinación.

La citación o identificación de cualquier referencia en esta sección o en cualquier otra sección de esta solicitud no debe interpretarse como una indicación de que tal referencia está disponible como una técnica anterior a la presente invención.

3. Compendio de la invención

La presente invención abarca el polipéptido OMP106 de M. catarrhalis y polipéptidos derivados de OMP106 y los métodos para preparar dichos polipéptidos. La invención abarca también antisueros y anticuerpos, incluyendo anticuerpos citotóxicos, específicos frente al polipéptido OMP106 y/o polipéptidos derivados de OMP106. La invención abarca además composiciones inmunógenas, profilácticas o terapéuticas, incluyendo vacunas, que comprenden uno o más de dichos polipéptidos. La invención abarca adicionalmente las secuencias de nucleótidos que codifican dichos polipéptidos. La invención abarca además composiciones inmunógenas, profilácticas o terapéuticas, incluyendo vacunas, que comprenden un cultivo de M. catarrhalis que no causa hemoaglutinación atenuado o inactivado.

La presente invención tiene muchas utilidades. Por ejemplo, el polipéptido OMP106 y los polipéptidos derivados de OMP106 pueden utilizarse como ligandos para detectar los anticuerpos que se manifiestan en respuesta a infecciones por M. catarrhalis (por ejemplo, en el diagnóstico de infecciones por M. catarrhalis). El polipéptido OMP106 y los polipéptidos derivados de OMP106 pueden utilizarse también como inmunógenos para inducir anticuerpos específicos frente a M. catarrhalis. Tales anticuerpos son útiles en inmunoensayos para detectar M. catarrhalis en muestras biológicas. Los anticuerpos citotóxicos de la invención son útiles en inmunizaciones pasivas frente a infecciones por M. catarrhalis. El polipéptido OMP106 y los polipéptidos derivados de OMP106 pueden utilizarse además como ingredientes activos en vacunas frente a infecciones por M. catarrhalis.

La invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que las cepas y cultivos de M. catarrhalis que causan hemoaglutinación tienen una proteína en la membrana externa, el péptido OMP106, que tiene un peso molecular entre aproximadamente 180 kDa y aproximadamente 230 kDa, y que las cepas y cultivos de M. catarrhalis que no causan hemoaglutinación, o bien no tienen el polipéptido OMP106 o tienen un polipéptido OMP106 modificado inapropiadamente que es inactivo en la hemoaglutinación y que no se tiñe con plata. La invención se basa además en el descubrimiento de que el antisuero policlonal inducido por el polipéptido OMP106 aislado de una cepa de M. catarrhalis que causa hemoaglutinación tiene actividad citotóxica frente a una cepa de M. catarrhalis que causa hemoaglutinación diferente, pero no frente a una cepa de M. catarrhalis que no causa hemoaglutinación.

3.1. Definiciones y abreviaturas

anti-OMP106: = anticuerpo o antisuero anti-polipéptido OMP106

ATCC: = Colección Americana de Cultivos Tipo

ampollas: = vesículas de la membrana externa de M. catarrhalis existentes en la naturaleza

Gb_{4}: = GalNAc\beta1-3Gal\alpha1-4Gal\beta1-4Glcl-1Ceramida

HA: = que causa hemoaglutinación

inmuno-reactivo: = capaz de provocar una respuesta inmune celular o humoral

kDa: = kilodaltons

M. catarrhalis: = Mc;

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Moraxella catarrhalis;

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Moraxella (Branhamella) catarrhalis;

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Branhamella catarrhalis;

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Neisseria catarrhalis; o

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Micrococcus catarrhalis

NHA: = que no causa hemoaglutinación

OG: = n-octil-\beta-D-glucopiranósido u octil-glucósido OMP106 & = el polipéptido de la proteína 106 de la membrana externa de Moraxella catarrhalis, que tiene un peso molecular entre aproximadamente 180 kDa y 230 kDa por SDS-PAGE; extraíble de ampollas o células intactas de M. catarrhalis mediante OG o detergente sarcosilo.

polipéptido derivado de OMP106: = fragmento del polipéptido OMP106; variante del polipéptido OMP106 salvaje o un fragmento del mismo, que contiene una o más deleciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos; o proteína quimérica que comprende un heterólogo polipéptido fusionado al extremo C-terminal o al extremo N-terminal o al segmento interno de todo o de una porción del polipéptido

OMP: = proteína de la membrana externa

OMPs: = proteínas de la membrana externa

PBS: = solución salina tamponada con fosfato

PAG: = gel de poliacrilamida

polipéptido: = un péptido de cualquier longitud, preferiblemente uno que tenga diez o más restos de aminoácido

SDS: = dodecilsulfato sódico

SDS-PAGE: = electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico

Las secuencias de nucleótidos o ácidos nucleicos que se definen en la presente se representan mediante los símbolos de una letra para las bases como sigue:

A: (adenina)

C: (citosina)

G: (guanina)

T: (timina)

U: (uracilo)

M: (A o C)

R: (A o G)

W: (A o T/U)

S: (C o G)

Y: (C o T/U)

K: (G o T/U)

V: (A o C o G; no T/U)

H: (A o C o T/U; no G)

D: (A o G o T/U; no C)

B: (C o G o T/U; no A)

N: (A o C o G o T/U) o (desconocido)

Las secuencias de péptidos y polipéptidos que se definen en la presente se representan por los símbolos de una letra para los restos de aminoácido como sigue:

A: (alanina)

R: (arginina)

N: (asparagina)

D: (ácido aspártico)

C: (cisteína)

Q: (glutamina)

E: (ácido glutámico)

G: (glicina)

H: (histidina)

I: (isoleucina)

L: (leucina)

K: (lisina)

M: (metionina)

F: (fenilalanina)

P: (prolina)

S: (serina)

T: (treonina)

W: (triptófano)

Y: (tirosina)

V: (valina)

X: (desconocido)

La presente invención puede entenderse más completamente mediante referencia a la siguiente descripción detallada de la invención, los ejemplos no limitantes de realizaciones específicas de la invención y las figuras que acompañan.

4. Breve descripción de las figuras

Fig. 1: Comparación de PAGE desnaturalizante de los perfiles de proteínas de la membrana externa de ampollas de M. catarrhalis o extractos con octil-glucósido (OG) de células de M. catarrhalis completas. Los números sobre los carriles hacen referencia a las designaciones de las cepas de la ATCC. Como marcadores de peso molecular se utilizó un estándar para SDS-PAGE preteñido (# 161-0305 del catálogo de BioRad). El estándar constaba de los siguientes polipéptidos con sus pesos moleculares aproximados señalados entre paréntesis: fosforilasa B de músculo de conejo (106 kDa); albúmina de suero bovino (80 kDa); ovoalbúmina de clara de huevo de gallina (49,5 kDa); anhidrasa carbónica bovina (32,5 kDa); inhibidor de tripsina de soja (27,5 kDa); lisozima de clara de huevo de gallina (18,5 kDa). Las posiciones de los marcadores de peso molecular en el gel se señalan en el lado izquierdo del dibujo mediante flechas con los pesos moleculares (kDa) de algunos de los marcadores sobre las flechas.

Fig. 2: Resultados de los cromatogramas de capa fina de glicolípidos cubiertos con ampollas de la membrana externa marcadas con ^{125}I. En los Paneles A-C, el Carril 1 contiene los estándares de glicolípidos indicados a la izquierda; el Carril 2 contiene GM_{1} desprovisto de ácidos siálicos; el Carril 3 contiene Gb_{3}, Gb_{4}, y antígeno Forssman; y el Carril 4 contiene una extracción Folch de eritrocitos humanos. El cromatograma que se muestra en el Panel A está teñido con orcinol, el cromatograma que se muestra en el Panel B está cubierto con ampollas marcadas con ^{125}I de la cepa 8176 de la ATCC (una cepa que no causa hemoaglutinación), y el cromatograma que se muestra en el Panel C está cubierto con ampollas marcadas con ^{125}I de la cepa 49143 de la ATCC (una cepa que causa hemoaglutinación). Únicamente la cepa que causa hemoaglutinación se unió a la banda del glicolípido GB_{4} en los carriles tercero y cuarto.

Fig. 3: Perfiles de proteína mediante tinción con plata de extractos con octil-glucósido de proteínas de la membrana externa después de la digestión de las células de M. catarrhalis con las proteasas que se indican en la figura. La actividad de hemoaglutinación de las células después de la digestión se indica debajo de la figura en la fila marcada como HA. Los marcadores de peso molecular utilizados son como los de la Fig. 1.

Fig. 4: Comparación de los perfiles de proteína mediante tinción con plata de proteínas de la membrana externa de varias cepas ATCC de M. catarrhalis. Las designaciones de las cepas se indican encima de los carriles. La actividad de hemoaglutinación de las cepas se indica en la fila marcada como HA debajo de la figura. Obsérvese que una proteína que tiene un peso molecular aparente mayor que el de la fosforilasa B de músculo de conejo (106 kDa) es común a las cepas que causan hemoaglutinación, pero está ausente en las cepas que no causan hemoaglutinación. Este polipéptido se designa OMP106. Los marcadores de peso molecular utilizados son como los de la Fig. 1.

Fig. 5: Comparación de los perfiles de proteína mediante tinción con plata de proteínas de la membrana externa de dos cultivos de la cepa ATCC 49143 de M. catarrhalis: 49143 (cultivo que causa hemoaglutinación) y 49143-NHA (cultivo que no causa hemoaglutinación). Las actividades de hemoaglutinación de los cultivos se indican debajo de la figura en la fila marcada como HA. Obsérvese la ausencia de la banda del polipéptido OMP106 (indicada por <) en el cultivo que no causa hemoaglutinación. Los marcadores de peso molecular utilizados son como los de la Fig. 1.

Fig. 6: Estimación del peso molecular de OMP106 en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 6% utilizando extractos con OG de la cepa 49143 de la ATCC que se incubaron en tampón de muestra bien a 25ºC o a 100ºC antes de su aplicación en el gel. Las proteínas en el gel se visualizaron mediante tinción reductiva con plata. Obsérvese que la banda del polipéptido OMP106 (indicada por <) se ve sólo en la muestra incubada a 100ºC. Como marcadores de peso molecular se utilizó un estándar para SDS-PAGE de amplio intervalo (# 161-0317 del catálogo de BioRad). El estándar constaba de los siguientes polipéptidos (pesos moleculares aproximados señalados entre paréntesis): miosina de músculo esquelético de conejo (200 kDa); \beta-galactosidasa de E. coli (116 kDa); fosforilasa B de músculo de conejo (97,4 kDa); albúmina de suero bovino (66,2 kDa). Las posiciones de los marcadores de peso molecular en el gel se señalan en el lado derecho de la figura mediante flechas con los pesos moleculares (kDa) de los marcadores encima de las flechas.

Fig. 7: Análisis mediante transferencia Southern de los productos de digestión con las endonucleasas de restricción DraI y HindIII del DNA cromosómico de M. catarrhalis con la sonda Mc5-72. El DNA de la cepa 49143 de M. catarrhalis se sometió a digestión con DraI o HindIII. El análisis de Southern del DNA digerido se llevó a cabo utilizando Mc5-72 (SEC ID Nº 4) como sonda. El lavado de alta rigurosidad fue en 2X SSC, SDS al 1% a 50ºC durante aproximadamente 20 a aproximadamente 30 minutos. El Carril 1 contiene el producto de digestión con HindIII; la banda que hibrida tiene un tamaño aproximado de 8,0 kb. El Carril 2 contiene el producto de digestión con DraI: la banda que hibrida tiene un tamaño aproximado de 4,2 kb.

Figs. 8A y 8B: Transferencias Western de los extractos de proteína de M. catarrhalis y especies relacionadas utilizando antisuero de conejo frente a OMP106 como sonda (Fig. 8A), comparado con la reactividad del suero antes de la inmunización del conejo con OMP106 (Fig. 8B). Las muestras en los carriles de las Figs. 8A y 8B son como sigue: Carril A, M. catarrhalis; Carril B, Moraxella ovis; Carril C, Moraxella lacunata; Carril D, Moraxella osloensis; Carril E, Moraxella bovis; Carril F, Neisseria meningitidis; Carril G, Neisseria gonorrhoeae. Los marcadores de peso molecular utilizados son como los de la Fig. 1.

Fig. 9A: Transferencia Western que demuestra que un antisuero de conejo frente al polipéptido OMP106 de la cepa ATCC 49143 de M. catarrhalis reacciona entrecruzadamente con un polipéptido de un peso molecular similar en varias cepas HA y NHA de M. catarrhalis (la situación del polipéptido OMP106 se indica mediante una flecha). El análisis de Western examinó extractos con octil-glucósido de varias cepas de M. catarrhalis. Los números de acceso ATCC de las cepas se indican en la parte de arriba de los carriles. Los procedimientos de transferencia y transferencia Western utilizados fueron idénticos a los utilizados para obtener las transferencias que se muestran en la Fig. 8.

Fig. 9B: Transferencia Western de los mismos extractos que los de la Fig. 9A utilizando el suero preinmune correspondiente al utilizado en la Fig. 9A.

5. Descripción detallada de la invención 5.1. Cultivos que causan hemoaglutinación y que no causan hemoaglutinación

La invención proporciona un polipéptido OMP106 aislado o sustancialmente puro de M. catarrhalis. El polipéptido OMP106 comprende la totalidad o una subunidad de una proteína incrustada o situada en la superficie externa de la membrana externa de cepas que causan hemoaglutinación (HA) y muchas cepas y cultivos que no causan hemoaglutinación (NHA) de M. catarrhalis. OMP106 contribuye directamente o indirectamente al fenotipo que causa hemoaglutinación de las cepas y cultivos HA. Conforme a la invención, las células de M. catarrhalis HA causan la aglutinación de eritrocitos humanos o de conejo en cualquier ensayo de hemoaglutinación estándar, tal como el mostrado por Soto-Hernández et al., 1989, J. Clin. Microbiol. 27:903-908. Aunque sin intentar limitarse a algún mecanismo de acción en particular, actualmente se considera que M. catarrhalis causa la aglutinación de los eritrocitos uniéndose al resto de globotetrosa (Gb_{4}) de los receptores glicolipídicos y glicoproteicos en las superficies de las células hospedantes y que la actividad de hemoaglutinación está mediada en parte por el polipéptido OMP106 apropiadamente modificado, que tiene la particular propiedad de ser susceptible a la tinción con plata. Por el contrario, el polipéptido OMP106 sin modificar o inapropiadamente modificado no es activo mediando la hemoaglutinación ni se tiñe con plata. Además, el polipéptido OMP106 es el único polipéptido que tiene un peso molecular aparente entre aproximadamente 180 kDa y aproximadamente 230 kDa por SDS-PAGE que es extraíble mediante OG o sarcosilo a partir de ampollas o células intactas de M. catarrhalis HA o NHA.

La actividad de hemoaglutinación de células de M. catarrhalis HA es inhibida por globotetrosa (GalNAc\beta1-3Gal\alpha1-4Gal\beta1-4Glc\beta1; Gb_{4}) y los monosacáridos que componen la Gb_{4}, incluyendo N-acetil-D-galactosamina, D-galactosa y glucosa, y derivados de los mismos, tales como metil-á-galactosa o metil-\beta-galactosa. La actividad de hemoaglutinación de células de M. catarrhalis HA es inhibida también por concentraciones relativamente más altas de varios otros azúcares incluyendo, pero sin limitarse a ellos, D-manosa, L-fucosa, D-glucosa, y N-acetil-D-glucosamina.

La actividad de hemoaglutinación y el polipéptido OMP106 de células de M. catarrhalis HA intactas son ambos reducidos o destruidos por digestión de células de M. catarrhalis intactas mediante varias proteasas incluyendo, pero sin limitarse a ellas, quimotripsina tratada con TLCK (N\alpha-tosil-L-lisina-clorometilcetona [también conocida como 1-cloro-3-tosilamino-7-amino-L-2-heptanona]), proteinasa K y tripsina tratada con TPCK (N-tosil-L-fenilalanina-clorometilcetona). La digestión con proteasa V8 de células de M. catarrhalis HA intactas, sin embargo, no afecta la actividad de hemoaglutinación ni la integridad física del polipéptido OMP106 de tales células.

Un cultivo que no causa hemoaglutinación (NHA) puede obtenerse de una cepa o cultivo de M. catarrhalis HA mediante pasos de incubación sucesivos en cultivos líquidos estáticos (es decir, cultivos líquidos mantenidos a 35ºC sin agitación). Por ejemplo, una cepa o cultivo de M. catarrhalis HA se cultiva en medio Mueller Hinton y cada cinco días se toma un inóculo de la superficie del cultivo estático para inocular un cultivo estático subsiguiente. El inóculo preferido es cualquier conjunto de células que flote en la superficie del cultivo. Los pasos de incubación en cultivos estáticos se mantienen hasta que se produce un cultivo NHA. Un cultivo NHA de la invención puede utilizarse para producir vacunas protectoras, tales como vacunas con células completas, frente a infecciones por M. catarrhalis.

Por el contrario, el fenotipo que causa hemoaglutinación de una cepa o cultivo de M. catarrhalis HA puede mantenerse mediante pasos de incubación de la cepa o cultivo en cultivos líquidos con agitación. En una realización, una cepa o cultivo de M. catarrhalis HA se cultiva en medio Mueller Hinton entre 35 y 37ºC con agitación a aproximadamente 200 rpm y se somete a un paso de incubación cada 24 a 48 horas. El fenotipo que causa hemoaglutinación de una cepa o cultivo de M. catarrhalis HA puede mantenerse también mediante pasos de incubación en medio sólido. Por ejemplo, una cepa o cultivo de M. catarrhalis HA se cultiva en una placa que contiene agar sangre o agar Mueller Hinton.

5.2. Polipéptido OMP106

El polipéptido OMP106 de la invención es la única proteína de la membrana externa de una cepa o cultivo de M. catarrhalis HA que tiene un peso molecular aparente por SDS-PAGE entre aproximadamente 180 kDa y aproximadamente 230 kDa, preferiblemente aproximadamente 190 kDa. Conforme a la invención, una proteína de la membrana externa de M. catarrhalis es un polipéptido que está presente en ampollas de M. catarrhalis, o que puede extraerse de ampollas o células intactas de M. catarrhalis mediante n-octil-\beta-D-glucopiranósido (OG) o detergente sarcosilo en una solución tamponada a temperatura ambiente. Véase Murphy y Loeb, 1989, Microbial Pathogenesis 6:159-174, para una discusión acerca de las ampollas de M. catarrhalis, que son vesículas existentes en la naturaleza que constan de la membrana externa de M. catarrhalis. Las cepas o cultivos de M. catarrhalis NHA, o no tienen el polipéptido OMP106, o tienen un polipéptido OMP106 en una forma que une los anticuerpos anti-OMP106 (véase la Sección 5.5., abajo) pero no reacciona con el tinte de plata (es decir, utilizando el Silver Stain Plus de BioRad [Richmond, CA], o el procedimiento descrito por Gottlieb y Chauko, 1987, Anal. Biochem. 165:33). Por el contrario, el polipéptido OMP106 de las cepas o cultivos de M. catarrhalis HA unen los anticuerpos anti-OMP106, y reacciona con el tinte de plata.

El polipéptido OMP106 puede identificarse en ampollas o células intactas de M. catarrhalis HA por su susceptibilidad a la degradación por tratamiento con proteasa que también suprime o atenúa la actividad de hemoaglutinación de la misma cepa HA (véase la Sección 5.1. arriba para los ejemplos de proteasas que destruyen o no la actividad de hemoaglutinación de células de M. catarrhalis intactas). En otras palabras, la digestión con una proteasa que destruya o reduzca la actividad de hemoaglutinación de una cepa o cultivo HA cambiará también, en SDS-PAGE, la abundancia o la situación del polipéptido OMP106 aislado de la cepa o cultivo después de tal digestión comparado con el aislado de la misma cepa o cultivo antes de la digestión.

El polipéptido OMP106 puede identificarse también como el polipéptido en el extracto con OG o sarcosilo de ampollas o células intactas de M. catarrhalis que tiene un peso molecular aparente mayor de 106 kDa, determinado mediante electroforesis en gel desnaturalizante en PAG al 12% con SDS, utilizando formulaciones como se describe en Harlow y Lane (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Apéndice I, 1988). El tratamiento con calor del extracto con OG o sarcosilo a 100ºC durante 5 minutos puede causar que el polipéptido OMP106 tenga un peso molecular aparente entre aproximadamente 180 kDa y aproximadamente 230 kDa, determinado por SDS-PAGE en PAG al 6% sin agentes reductores, utilizando formulaciones como se describen en Harlow y Lane, id. En una realización particular, el polipéptido OMP106 en el extracto con OG o sarcosilo tratado con calor de la cepa ATCC 49143 de M. catarrhalis tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 190 kDa.

En realizaciones particulares, el polipéptido OMP106 es el preparado de cualquiera de las cepas de M. catarrhalis incluyendo, pero sin limitarse a ellas, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 y ATCC 43628. La fuente preferida de polipéptido OMP106 es un cultivo HA de tales cepas. La fuente más preferida es un cultivo HA de la cepa ATCC 49143.

En una realización particular, el polipéptido OMP106 comprende, preferiblemente en el extremo amino-terminal, la secuencia de aminoácidos IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEC ID Nº 1) o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma. El polipéptido OMP106 puede comprender adicionalmente, distal del extremo carboxilo de la secuencia arriba mencionada, un octapéptido que tiene una secuencia de aminoácidos GTVLGGKK (SEC ID Nº 2) o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma. Como se utiliza en la presente, una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga es al menos un 80%, preferiblemente un 100%, idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia.

Conforme a varios aspectos de la invención, los polipéptidos de la invención se caracterizan por sus pesos moleculares aparentes basados en la migración de los polipéptidos en SDS-PAGE relativa a la migración de marcadores de peso molecular conocido. Aun cuando pueden utilizarse cualesquier estándares de peso molecular conocidos en la técnica con la SDS-PAGE, los marcadores de peso molecular preferidos comprenden al menos miosina de músculo esquelético de conejo, \beta-galactosidasa de E. coli y fosforilasa B de músculo de conejo. El experto en la técnica apreciará que los polipéptidos de la invención pueden migrar de forma diferente en diferentes tipos de sistemas de geles (por ejemplo, diferentes tampones; diferente concentración de gel, agente reticulante o SDS). El experto en la técnica apreciará también que los polipéptidos pueden tener diferentes pesos moleculares aparentes debido a los diferentes marcadores de peso molecular utilizados con la SDS-PAGE. Por tanto, se pretende que la caracterización del peso molecular de los polipéptidos de la invención esté dirigida a cubrir los mismos polipéptidos en cualesquier sistemas de SDS-PAGE y con cualesquier marcadores de peso molecular que pudieran indicar pesos moleculares aparentes ligeramente diferentes para los polipéptidos que los que se describen aquí.

5.3. Polipéptidos derivados de OMP106

Un polipéptido derivado de OMP106 de la invención puede ser un fragmento del polipéptido OMP106. El polipéptido OMP106 intacto puede contener uno o más restos de aminoácido que no son necesarios para su inmunogenicidad. Puede darse el caso, por ejemplo, de que sólo los restos de aminoácido que forman un epítope particular del polipéptido OMP106 sean necesarios para la actividad inmunógena. Las secuencias de aminoácidos innecesarias pueden eliminarse mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos no deseadas pueden eliminarse mediante digestión proteolítica limitada utilizando enzimas tales como tripsina, papaína, o enzimas proteolíticas relacionadas o mediante escisión química utilizando agentes tales como bromuro de cianógeno, y seguido de la separación en fracciones de los productos de digestión o escisión.

Un polipéptido derivado de OMP106 de la invención puede ser también un polipéptido OMP106 modificado o un fragmento del mismo (es decir, un polipéptido OMP106 o un fragmento que tiene una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos de la secuencia del OMP106 salvaje). Tales modificaciones pueden intensificar la inmunogenicidad del producto polipeptídico resultante o no tener ningún efecto en dicha actividad. Las técnicas de modificación que pueden utilizarse incluyen las descritas en la Patente de los EE.UU. Nº 4.526.716.

Un polipéptido derivado de OMP106 puede ser además un polipéptido quimérico que comprende uno o más polipéptidos heterólogos fusionados al extremo amino-terminal o al extremo carboxilo-terminal o al interior de un polipéptido OMP106 completo o una porción o un fragmento del mismo. Los polipéptidos heterólogos útiles que comprende tal polipéptido quimérico incluyen, pero sin limitarse a ellos, a) pre- y/o pro- secuencias que facilitan el transporte, la translocación y/o el procesamiento del polipéptido derivado de OMP106 en una célula hospedante, b) secuencias purificadas por afinidad, y c) cualesquier secuencias inmunógenas útiles (por ejemplo, las secuencias que codifican uno o más epítopes de una proteína expuesta en la superficie de un patógeno microbiano).

Preferiblemente, los polipéptidos derivados de OMP106 de la invención reaccionan de forma entrecruzada inmunológicamente con el polipéptido OMP106, siendo así capaces de provocar en un animal una respuesta inmune frente a M. catarrhalis. Más preferiblemente, los polipéptidos derivados de OMP106 de la invención comprenden secuencias que forman uno o más epítopes del polipéptido OMP106 nativo en la superficie externa de M. catarrhalis (es decir, los epítopes del polipéptido OMP106 expuestos en la superficie como existe en células de M. catarrhalis intactas). Tales polipéptidos derivados de OMP106 preferidos pueden identificarse por su capacidad para unir específicamente anticuerpos producidos frente a células de M. catarrhalis intactas (por ejemplo, anticuerpos obtenidos mediante células de M. catarrhalis fijadas con formaldehído o glutaldehído; tales anticuerpos se denominan en la presente como anticuerpos "anti-célula completa"). Por ejemplo, los polipéptidos o péptidos de una digestión con proteasa limitada o completa del polipéptido OMP106 se separan en fracciones utilizando métodos estándar y se someten a ensayo relativo a su capacidad para unir anticuerpos anti-célula completa. Los polipéptidos reactivos comprenden los polipéptidos derivados de OMP106 preferidos. Se aíslan y se determinan sus secuencias de aminoácidos por métodos conocidos en la técnica.

También preferiblemente, los polipéptidos derivados de OMP106 de la invención comprenden secuencias que forman uno o más epítopes del polipéptido OMP106 nativo que median la hemoaglutinación por células de M. catarrhalis HA. Tales polipéptidos derivados de OMP106 preferidos pueden identificarse por su capacidad para interferir con la hemoaglutinación por células de M. catarrhalis HA. Por ejemplo, los polipéptidos de una digestión con proteasa limitada o completa o una escisión química del polipéptido OMP106 se separan en fracciones utilizando métodos estándar y se someten a ensayo relativo a su capacidad para interferir con la hemoaglutinación por células de M. catarrhalis. Una vez identificados y aislados, las secuencias de aminoácidos de tales polipéptidos derivados de OMP106 preferidos se determinan utilizando métodos de secuenciación estándar. La secuencia determinada puede utilizarse para posibilitar la producción de tales polipéptidos mediante medios químicos sintéticos y/o de ingeniería genética.

Estos polipéptidos derivados de OMP106 preferidos pueden identificarse también utilizando anticuerpos anti-célula completa para someter a escrutinio colecciones de bacterias que expresan fragmentos al azar del DNA genómico de M. catarrhalis o secuencias de nucleótidos clonadas que codifican el polipéptido OMP106. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, NY, Vol. 1, Capítulo 12. Se identifican los clones reactivos y sus insertos se aíslan y secuencian para determinar las secuencias de aminoácidos de tales polipéptidos derivados de OMP106 preferidos.

5.4. Aislamiento y purificación del polipéptido OMP106 y de los polipéptidos derivados de OMP106

La invención proporciona polipéptidos OMP106 y polipéptidos derivados de OMP106 aislados. Como se utiliza en la presente, el término "aislado" significa que el producto está significativamente libre de otros materiales biológicos con los que está naturalmente asociado. Esto es, por ejemplo, una composición del polipéptido OMP106 aislado es entre aproximadamente un 70% y un 94% polipéptido OMP106 puro en peso. Preferiblemente, los polipéptidos OMP106 y polipéptidos derivados de OMP106 de la invención se purifican. Como se utiliza en la presente, el término "purificado" significa que el producto está sustancialmente libre de otro material biológico con el que está naturalmente asociado. Esto es, una composición del polipéptido OMP106 purificado es al menos un 95% polipéptido OMP106 puro en peso, preferiblemente al menos un 98% polipéptido OMP106 puro en peso, y más preferiblemente al menos un 99% polipéptido OMP106 puro en peso.

El polipéptido OMP106 de la invención puede aislarse a partir de extractos de proteínas, incluyendo extracto de células completas, de cualquier cepa o cultivo de M. catarrhalis. Preferiblemente, el extracto de proteínas es un extracto con octil-glucósido o sarcosilo de vesículas de la membrana externa (es decir, ampollas) o de células completas de M. catarrhalis incluyendo, pero sin limitarse a ellas, cualquiera de las cepas ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 y ATCC 43628. La fuente preferida de tales extractos es un cultivo HA de tales cepas. La fuente más preferida de tales extractos es un cultivo HA de la cepa ATCC 49143. Otra fuente del polipéptido OMP106 es preparaciones de proteínas de sistemas de expresión de genes que expresen secuencias clonadas que codifican el polipéptido OMP106 o polipéptidos derivados de OMP106 (véase la Sección 5.8., abajo).

El polipéptido OMP106 puede aislarse y purificarse del material de la fuente utilizando cualquier técnica bioquímica y planteamiento bien conocidos por los expertos en la técnica. En un planteamiento, se obtiene la membrana externa de M. catarrhalis mediante técnicas estándar y las proteínas de la membrana externa se solubilizan utilizando un compuesto de solubilización tal como un detergente. Una solución de solubilización preferida es una que contiene octil-glucopiranósido aproximadamente al 1,25% p/v (OG). Otra solución de solubilización preferida es una que contiene sarcosilo aproximadamente al 1,25%. El polipéptido OMP106 está en la fracción solubilizada. Los desechos celulares y el material insoluble en el extracto se separan y eliminan preferiblemente mediante centrifugación. Los polipéptidos en el extracto se concentran, se incuban en tampón de muestra para gel de Laemmli que contiene SDS a 100ºC durante 5 minutos y se separan en fracciones mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida (PAG) al 6% desnaturalizante en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS) sin agente reductor. Véase Laemmli, 1970, Nature 227:680-685. La banda o fracción identificada como el polipéptido OMP106 como se describe arriba (por ejemplo, la banda de polipéptido teñida con plata que está presente en el extracto con OG o sarcosilo de un cultivo HA pero no el de un cultivo NHA correspondiente o el de un cultivo HA después de la digestión con una proteasa que suprima la actividad de hemoaglutinación) puede aislarse a continuación directamente de la fracción o de la lámina cortada del gel que contiene el polipéptido OMP106. En una realización preferida, el polipéptido OMP106 tiene un peso molecular aparente de 190 kDa determinado comparando su distancia o tasa de migración en un SDS-PAGE desnaturalizante con relación a las de la miosina de músculo esquelético de conejo (200 kDa) y la \beta-galactosidasa de E. coli (116 kDa).

Otro método de purificación del polipéptido OMP106 es mediante cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos anti-OMP106 (véase la Sección 5.5.). Preferiblemente, se utilizan anticuerpos anti-OMP106 monoclonales. Los anticuerpos se unen covalentemente a geles de agarosa activados con bromuro de cianógeno o ésteres de succinamida (Affi-Gel, BioRad, Inc.) o mediante otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. El extracto de proteínas se carga en la parte alta del gel como se describe arriba. El contacto ocurre durante un periodo de tiempo y bajo condiciones de reacción estándar suficientes para que el polipéptido OMP106 se una al anticuerpo. Preferiblemente, el soporte sólido es un material utilizado en una columna de cromatografía. El polipéptido OMP106 se separa a continuación del anticuerpo, permitiendo de esta forma la recuperación del polipéptido OMP106 en forma aislada o, preferiblemente, purificada.

Un polipéptido derivado de OMP106 de la invención puede producirse por escisión o degradación química y/o enzimática del polipéptido OMP106 aislado o purificado. Un polipéptido derivado de OMP106 puede también sintetizarse químicamente basándose en la secuencia de aminoácidos conocida del polipéptido OMP106 y, en el caso de un polipéptido quimérico, las del polipéptido heterólogo por métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY.

Un polipéptido derivado de OMP106 puede producirse también en un sistema de expresión génica que exprese una construcción nucleotídica recombinante que comprende secuencias que codifican los polipéptidos derivados de OMP106. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención pueden sintetizarse, y/o clonarse, y expresarse conforme a las técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, Capítulo 9.

Los polipéptidos derivados de OMP106 de la invención pueden separarse en fracciones y purificarse mediante la aplicación de técnicas de purificación de proteínas estándar, modificadas y aplicadas en conformidad con los descubrimientos y enseñanzas descritos en la presente. En particular, los polipéptidos OMP106 preferidos de la invención, aquellos que forman un epítope del polipéptido OMP106 nativo en la superficie externa, pueden aislarse y purificarse conforme a los procedimientos de afinidad descritos arriba para el aislamiento y purificación del polipéptido OMP106 (por ejemplo, purificación por afinidad utilizando anticuerpos anti-OMP106).

Si se desea, los polipéptidos de la invención pueden purificarse además utilizando técnicas de purificación de proteínas o péptidos estándar incluyendo, pero sin limitarse a ellas, electroforesis, centrifugación, penetrabilidad en gel, precipitación, diálisis, cromatografía (incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de afinidad inmunoadsorbente, cromatografía de líquidos de alta eficiencia de fase inversa, y cromatografía de líquidos de alta eficiencia de permeabilidad en gel), isoelectroenfoque, y variaciones y combinaciones de las mismas.

Una o más de estas técnicas pueden utilizarse secuencialmente en un procedimiento diseñado para separar moléculas conforme a sus características físicas o químicas. Estas características incluyen la hidrofobicidad, carga, capacidad de unión, y peso molecular de la proteína. Las distintas fracciones de los materiales obtenidas después de cada técnica se someten a ensayo relativo a sus capacidades para unir el receptor o ligando de OMP106, para unir anticuerpos anti-OMP106 o para interferir en la hemoaglutinación por células de M. catarrhalis HA (actividades de "ensayo"). Aquellas fracciones que muestran tal actividad se someten a continuación a la siguiente técnica en el procedimiento secuencial, y las nuevas fracciones se someten otra vez a ensayo. El proceso se repite hasta que sólo queda una fracción que tiene las actividades de "ensayo" descritas arriba, y esa fracción produce sólo una única banda o entidad cuando se somete a electroforesis en gel de poliacrilamida o a cromatografía.

5.5. Inmunógenos OMP106 y anticuerpos anti-OMP106

La presente invención proporciona anticuerpos que unen específicamente el polipéptido OMP106 o los polipéptidos derivados de OMP106. Para la producción de tales anticuerpos se utilizan preparaciones aisladas o, preferiblemente, purificadas del polipéptido OMP106 o de polipéptidos derivados de OMP106 como inmunógenos.

En una realización, el polipéptido OMP106 se separa de otras proteínas de la membrana externa presentes en el extracto con OG o sarcosilo de la membrana externa de células o ampollas de M. catarrhalis HA utilizando SDS-PAGE (véase la Sección 5.2. arriba) y la lámina cortada del gel que contiene el polipéptido OMP106 se utiliza como inmunógeno y se inyecta en un conejo para producir antisuero que contenga los anticuerpos OMP106 policlonales. El mismo inmunógeno puede utilizarse para inmunizar ratones para la producción de líneas de hibridomas que produzcan anticuerpos anti-OMP106 monoclonales. En realizaciones particulares, se utiliza una lámina cortada de PAG que contiene OMP106 aislado o purificado de cualquiera de las cepas ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 y ATCC 43628 como inmunógeno. En realizaciones preferidas, se utiliza una lámina cortada de PAG que contiene OMP106 aislado o purificado de un cultivo HA de tales cepas. En una realización más preferida, se utiliza una lámina cortada de PAG que contiene OMP106 aislado o purificado de un cultivo HA de la cepa ATCC 49143 como inmunógeno.

En otras realizaciones, se utilizan fragmentos peptídicos del polipéptido OMP106 como inmunógenos. Preferiblemente, se utilizan fragmentos peptídicos del polipéptido OMP106 purificado. Los péptidos pueden producirse mediante digestión con proteasa, escisión química del polipéptido OMP106 aislado o purificado o síntesis química, y a continuación pueden aislarse o purificarse. Tales péptidos aislados o purificados pueden utilizarse directamente como inmunógenos. En realizaciones particulares, los fragmentos peptídicos útiles incluyen, pero sin limitarse a ellos, aquellos que tienen la secuencia IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEC ID Nº 1) o cualquier porción de la misma que tenga una longitud de 6 o más aminoácidos. En otra realización, el fragmento peptídico tiene la secuencia GTVLGGKK (SEC ID Nº 2).

Los inmunógenos útiles pueden comprender también tales péptidos o fragmentos peptídicos conjugados con una molécula portadora, preferiblemente una proteína portadora. Las proteínas portadoras pueden ser cualesquiera comúnmente utilizadas en inmunología, incluyen, pero sin limitarse a ellas, albúmina de suero bovino (BSA), albúmina de pollo, hemocianina de lapa "keyhole" (KLH) y similares. Para una discusión sobre conjugados hapteno-proteína, véase, por ejemplo, Hartlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, o un libro de texto de inmunología estándar tal como Roitt, I. et al., IMMUNOLOGY, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1985) o Klein, J., IMMUNOLOGY, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA (1990).

En otra realización más, para la producción de anticuerpos que se unan específicamente a uno o más epítopes del polipéptido OMP106 nativo en la membrana externa, se utilizan células de M. catarrhalis HA intactas o ampollas preparadas a partir de las mismas como inmunógeno. Las células o ampollas pueden fijarse con agentes tales como formaldehído o glutaldehído antes de la inmunización. Véase Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, Capítulo 15. Se prefiere que tales anticuerpos anti-célula completa sean anticuerpos monoclonales. Las líneas de hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales deseados pueden identificarse utilizando el polipéptido OMP106 purificado como ligando para el escrutinio. Se utilizan células o ampollas de cualquiera de las cepas de M. catarrhalis incluyendo, pero sin limitarse a ellas, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 y ATCC 43628 como el inmunógeno para inducir estos anticuerpos. Preferiblemente, se utilizan células o ampollas de un cultivo HA de tales cepas como el inmunógeno. Más preferiblemente, se utilizan células o ampollas de un cultivo HA de la cepa ATCC 49143 como inmunógeno para inducir estos anticuerpos.

Los anticuerpos policlonales producidos mediante inmunizaciones con células completas o ampollas contienen anticuerpos que unen otras proteínas de la membrana externa de M. catarrhalis ("anticuerpos no anti-OMP106") y por tanto son más engorrosos de utilizar cuando se sabe o se sospecha que la muestra contiene otras proteínas de la membrana externa de M. catarrhalis o materiales que reaccionan entrecruzadamente con estas otras proteínas de la membrana externa. En tales circunstancias, cualquier unión por parte de los anticuerpos anti-célula completa de una muestra o banda dada debe verificarse por la unión coincidente de la misma muestra o banda por anticuerpos que unan específicamente el polipéptido OMP106 (por ejemplo, anti-OMP106) y/o un polipéptido derivado de OMP106, o mediante ensayos de competición utilizando anticuerpos anti-OMP106, polipéptido OMP106 o un polipéptido derivado de OMP106 como el competidor (es decir, la adición de anticuerpos anti-OMP106, polipéptido OMP106 o un polipéptido derivado de OMP106 a la mezcla de reacción disminuye o suprime la unión de la muestra por parte de anticuerpos anti-célula completa). Alternativamente, tal antisuero policlonal, que contiene anticuerpos "no anti-OMP106", puede despejarse de tales anticuerpos mediante planteamientos o métodos estándar. Por ejemplo, los anticuerpos no anti-OMP106 pueden separarse mediante precipitación con células de cultivos de M. catarrhalis NHA o cepas de M. catarrhalis que se sabe no contienen el polipéptido OMP106 (por ejemplo, ATCC 8176, más preferiblemente un cultivo NHA de ATCC 49143); o mediante absorción en columnas que comprenden tales células o las proteínas de la membrana externa de tales células.

En realizaciones adicionales, los inmunógenos útiles para obtener los anticuerpos de la invención comprenden mezclas de dos o más de cualquiera de los inmunógenos individuales mencionados arriba.

La inmunización de mamíferos con los inmunógenos descritos en la presente, preferiblemente humanos, conejos, ratas, ratones, ovejas, cabras, vacas o caballos, se realiza siguiendo los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, con los propósitos de obtener antisuero que contenga anticuerpos policlonales o líneas de hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante técnicas estándar, a la vista de las enseñanzas que contiene la presente. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. Nº 4.271.145 y la Patente de los EE.UU. Nº 4.196.265. Brevemente, se inmuniza un animal con el inmunógeno. Los hibridomas se preparan fusionando células del bazo del animal inmunizado con células de mieloma. Los productos de fusión se someten a escrutinio relativo a los que producen anticuerpos que se unan al inmunógeno. Los clones de hibridomas positivos se aíslan, y los anticuerpos monoclonales se recuperan a partir de estos clones.

Los regímenes de inmunización para la producción de anticuerpos tanto policlonales como monoclonales son bien conocidos en la técnica. El inmunógeno puede inyectarse por cualquiera entre varias vías, incluyendo subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intradermal, intramuscular, mucosal, o una combinación de éstas. El inmunógeno puede inyectarse en forma soluble, en forma agregada, unido a un portador físico, o mezclado con un adyuvante, utilizando métodos y materiales bien conocidos en la técnica. El antisuero y los anticuerpos pueden purificarse utilizando métodos de cromatografía en columna bien conocidos por los expertos en la técnica.

Conforme a la presente invención, los polipéptidos OMP106 de las cepas de M. catarrhalis, HA o NHA, reaccionan inmunológicamente de forma entrecruzada. Por tanto, los anticuerpos producidos frente al polipéptido OMP106 de una cepa o cultivo de M. catarrhalis unen específicamente el polipéptido OMP106 y polipéptidos derivados de OMP106 de otras cepas y cultivos de M. catarrhalis. Por ejemplo, los anticuerpos anti-OMP106 policlonales inducidos por el polipéptido OMP106 de la cepa ATCC 49143 unen específicamente no sólo el polipéptido OMP106 homólogo (es decir, el polipéptido OMP106 de la cepa ATCC 49143) sino también el polipéptido OMP106 y/o polipéptidos derivados de OMP106 de otras cepas de M. catarrhalis incluyendo, pero sin limarse a ellas, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240 y ATCC 25238.

Los anticuerpos de la invención, incluyendo pero sin limitarse a ellos los anticuerpos anti-OMP106, pueden utilizarse para facilitar el aislamiento y purificación del polipéptido OMP106 y polipéptidos derivados de OMP106. Los anticuerpos pueden utilizarse también como sondas para la identificación de clones en genotecas de expresión que llevan insertos que codifican el polipéptido OMP106 o fragmentos del mismo. Los anticuerpos pueden utilizarse también en inmunoensayos (por ejemplo, ELISA, RIA, Westerns) para detectar específicamente y/o cuantificar M. catarrhalis en muestras biológicas. Los anticuerpos anti-OMP106 de la invención unen específicamente el polipéptido OMP106 y no unen proteínas de patógenos bacterianos relacionados tales como Moraxella ovis, Moraxella lacunata, Moraxella osloensis, Moraxella bovis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae. Por tanto, los anticuerpos anti-OMP106 pueden utilizarse para diagnosticar infecciones por M. catarrhalis.

Los anticuerpos de la invención, particularmente aquellos que son citotóxicos, pueden utilizarse también en inmunización pasiva para prevenir o atenuar infecciones por M. catarrhalis de animales, incluyendo humanos. (Como se utiliza en la presente, un anticuerpo citotóxico es uno que intensifica la opsonización y/o la destrucción complementaria de la bacteria unida por el anticuerpo). Puede administrarse una concentración eficaz de anticuerpos policlonales o monoclonales producidos frente a los inmunógenos de la invención a un hospedante para alcanzar tales efectos. La concentración exacta de anticuerpos administrada variará conforme a cada preparación de anticuerpo específica, pero puede determinarse utilizando técnicas estándar bien conocidas por los que poseen una experiencia normal en la técnica. La administración de los anticuerpos puede llevarse a cabo utilizando una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, las descritas en la Sección 5.6. para el suministro de vacunas.

Las eficacias profilácticas y terapéuticas de los anticuerpos de la invención pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en animales experimentales. Los datos obtenidos a partir de los estudios con animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosificaciones para su utilización en humanos.

5.6. Vacunas

La presente invención proporciona también vacunas terapéuticas y profilácticas frente a infecciones por M. catarrhalis de animales, incluyendo mamíferos, y más específicamente roedores, primates, y humanos. La utilización preferida de las vacunas es en humanos. Las vacunas pueden prepararse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica y podrían comprender, por ejemplo, el antígeno en forma de inmunógeno, un vehículo farmacéuticamente aceptable, posiblemente un adyuvante apropiado, y posiblemente otros materiales encontrados tradicionalmente en las vacunas. La cantidad inmunológicamente eficaz del inmunógeno que se va a utilizar en la vacuna se determina por medios conocidos en la técnica a la vista de las enseñanzas de la presente.

Las vacunas de la presente invención comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de los inmunógenos descritos en la Sección 5.5. en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Conforme a otra realización, las vacunas de la invención comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de un cultivo de M. catarrhalis HA o un cultivo de M. catarrhalis NHA de la invención inactivado o atenuado. Un cultivo de M. catarrhalis HA o un cultivo de M. catarrhalis NHA inactivado o atenuado se obtiene utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, tratamiento químico (por ejemplo, formalina), tratamiento con calor e irradiación.

El término "cantidad inmunológicamente eficaz" se utiliza en la presente para referirse a una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune que pueda prevenir infecciones por M. catarrhalis o atenuar la severidad de cualesquier infecciones por M. catarrhalis preexistentes o subsiguientes. La concentración exacta dependerá del inmunógeno específico que se vaya a administrar, pero puede determinarse utilizando técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica para el ensayo del desarrollo de una respuesta inmune.

Los inmunógenos polipeptídicos útiles incluyen el polipéptido OMP106 aislado y los polipéptidos derivados de OMP106. Los inmunógenos preferidos incluyen el polipéptido OMP106 purificado y polipéptidos o péptidos derivados del OMP106. El inmunógeno y vehículo combinados pueden ser una solución acuosa, emulsión o suspensión. En general, la cantidad de inmunógeno polipeptídico estará entre 0,1 y 500 microgramos por dosis. Los vehículos son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen estabilizantes, diluyentes, y tampones. Los estabilizantes adecuados incluyen carbohidratos, tales como sorbitol, lactosa, manitol, almidón, sacarosa, dextrano y glucosa, y proteínas, tales como albúmina o caseína. Los diluyentes adecuados incluyen solución salina, Sales Equilibradas de Hanks, y solución de Ringers. Los tampones adecuados incluyen fosfato de un metal alcalino, carbonato de un metal alcalino, o carbonato de un metal alcalinotérreo. La vacuna puede también contener uno o más adyuvantes para mejorar o intensificar la respuesta inmune. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, péptidos; hidróxido de aluminio; fosfato de aluminio; óxido de aluminio; una composición que consiste en un aceite mineral, tal como Marcol 52, o un aceite vegetal y uno o más agentes emulsionantes, o sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, policationes, polianiones; y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG y Corynebacterium parvum. La vacuna puede contener también otros inmunógenos. Tal vacuna de tipo cóctel tiene la ventaja de que se puede obtener inmunidad frente a varios patógenos mediante una única administración. Ejemplos de otros inmunógenos son los utilizados en las conocidas vacunas DPT.

Las vacunas de la invención se preparan mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, a la vista de las enseñanzas contenidas en la presente. Generalmente, un inmunógeno se mezcla con un vehículo para formar una solución, suspensión, o emulsión. En el vehículo pueden estar uno o más de los aditivos señalados arriba, o pueden añadirse subsiguientemente. Las preparaciones de vacunas pueden secarse, por ejemplo, mediante liofilización para fines de almacenaje. Si es así, pueden reconstituirse subsiguientemente en vacunas líquidas mediante la adición de un vehículo líquido apropiado.

Las vacunas se administran a humanos u otros mamíferos, incluyendo roedores y primates. Pueden administrarse en una o más dosis. Las vacunas pueden administrarse por vías conocidas de administración. Pueden utilizarse muchos métodos para introducir las formulaciones de vacunas descritas aquí. Estos métodos incluyen, pero sin limitarse a ellos, las vías oral, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, e intranasal. Las vías preferidas son la inyección intramuscular o subcutánea.

La invención proporciona también un método para inducir una respuesta inmune frente a M. catarrhalis en
un mamífero, con objeto de proteger al mamífero frente a la infección y/o atenuar la enfermedad causada por M. catarrhalis. El método comprende la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de los inmunógenos de la invención al hospedante y, preferiblemente, la administración de las vacunas de la invención al hospedante.

5.7. Ácidos nucleicos que codifican el polipéptido OMP106 y Polipéptidos derivados de OMP106

La presente invención proporciona también ácidos nucleicos, DNA y RNA, que codifican el polipéptido OMP106 y polipéptidos derivados de OMP106. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención pueden sintetizarse utilizando métodos conocidos en la técnica. Específicamente, puede determinarse una porción o la secuencia de aminoácidos entera del polipéptido OMP106 o de un polipéptido derivado de OMP106 utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como a través de la técnica de degradación de Edman (véase, por ejemplo, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., NY, pp. 34-49). La secuencia de aminoácidos obtenida se utiliza como guía para la síntesis de DNA que codifica el polipéptido OMP106 o un polipéptido derivado de OMP106 utilizando planteamientos químicos convencionales o la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de oligonucleótidos solapantes.

En otro aspecto, la secuencia de aminoácidos puede utilizarse como guía para la síntesis de mezclas de oligonucleótidos que pueden utilizarse a su vez para el escrutinio relativo a secuencias codificantes del polipéptido OMP106 en genotecas genómicas de M. catarrhalis. Tales genotecas pueden prepararse aislando el DNA de células de cualquier cepa de M. catarrhalis. Preferiblemente el DNA utilizado como fuente de la secuencia codificante del polipéptido OMP106, tanto para las genotecas genómicas como para la amplificación por PCR, se prepara a partir de células de cualquier cepa de M. catarrhalis incluyendo, pero sin limitarse a ellas, ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 y ATCC 43628.

En la preparación de genotecas genómicas se generan fragmentos de DNA, algunos de los cuales codificarán partes o el total del polipéptido OMP106 de M. catarrhalis. El DNA puede escindirse en sitios específicos utilizando varias enzimas de restricción. Alternativamente, se puede utilizar DNasa en presencia de manganeso para fragmentar el DNA, o el DNA puede cortarse físicamente, como por ejemplo, por sonicación. Los fragmentos de DNA pueden separarse a continuación conforme a su tamaño mediante técnicas estándar, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida, cromatografía en columna y centrifugación en gradiente de sacarosa. Los fragmentos de DNA pueden insertarse a continuación en vectores adecuados, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, plásmidos, cósmidos, bacteriófagos lambda o T_{4}, y cromosoma artificial de levadura (YAC). (Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II). La genoteca genómica puede someterse a escrutinio mediante hibridación de ácidos nucleicos con una sonda marcada (Benton y Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein y Hogness, 1975, Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. 72:3961).

Las genotecas genómicas pueden someterse a escrutinio con un oligonucleótido degenerado marcado correspondiente a la secuencia de aminoácidos de cualquier péptido del polipéptido OMP106 utilizando planteamientos óptimos bien conocidos en la técnica. En realizaciones particulares, la sonda para el escrutinio es un oligonucleótido degenerado que corresponde al péptido que tiene la secuencia IGISEADGGKGGA NARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEC ID Nº 1) o una porción del mismo. En otra realización, la sonda para el escrutinio puede ser un oligonucleótido degenerado que corresponde al péptido que tiene la secuencia GTVLGGKK (SEC ID Nº 2). En una realización adicional, se utilizan como sonda los oligonucleótidos GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (SEC ID Nº 3) y GGNACNGTNTTRGGNGGNA ARAAR (SEC ID Nº 7), cada uno de ellos correspondiente al péptido de OMP106 GTVLGGKK (SEC ID Nº 2). En realizaciones adicionales, pueden utilizarse como sonda la secuencia GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATA AATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (SEC ID Nº 4) o cualesquier fragmentos de la misma, o cualquier secuencia complementaria de la secuencia o fragmentos. Cualquier sonda utilizada tiene preferiblemente 15 nucleótidos o más.

Los clones en las genotecas con el DNA insertado que codifica el polipéptido OMP106 o fragmentos del mismo hibridarán con una o más de las sondas de oligonucleótidos degenerados. La hibridación de tales sondas de oligonucleótidos con las genotecas genómicas se lleva a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la hibridación con las dos sondas de oligonucleótidos arriba mencionadas puede llevarse a cabo en 2X SSC, SDS al 1%, a 50ºC y lavarse utilizando las mismas condiciones. En una realización particular, la secuencia de DNA de la cepa ATCC 49143 que codifica todo o una parte del polipéptido OMP106 es un fragmento de restricción HindIII de aproximadamente 8.000 pb de longitud o un fragmento de restricción DraI de aproximadamente 4.200 pb de longitud.

En otro aspecto más, los clones de secuencias de nucleótidos que codifican una parte del polipéptido OMP106 entero o polipéptidos derivados de OMP106 pueden obtenerse también mediante el escrutinio de genotecas de expresión de M. catarrhalis. Por ejemplo, el DNA de M. catarrhalis se aísla y se preparan fragmentos al azar y se ligan en un vector de expresión (por ejemplo, un bacteriófago, plásmido, fagémido o cósmido) de tal forma que la secuencia insertada en el vector sea capaz de expresarse en una célula hospedante en la que seguidamente se introduce el vector. A continuación pueden utilizarse varios ensayos de escrutinio para seleccionar con relación al polipéptido OMP106 o polipéptidos derivados de OMP106 expresados. En una realización, los distintos anticuerpos anti-OMP106 de la invención (véase la Sección 5.5.) pueden utilizarse para identificar los clones deseados utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Apéndice IV. Los clones o placas de la genoteca se ponen en contacto con los anticuerpos para identificar los clones que los unen.

En una realización, las colonias o placas que contienen el DNA que codifica el polipéptido OMP106 o polipéptidos derivados de OMP106 podrían detectarse utilizando Perlas DYNA conforme a Olsvick et al., 29th ICAAC, Houston, Tex. 1989. Los anticuerpos anti-OMP106 se hacen reaccionar de forma cruzada con las Perlas DYNA M280 tosiladas, y estas perlas que contienen los anticuerpos se utilizarían a continuación para adsorber colonias o placas que expresen el polipéptido OMP106 o polipéptidos derivados de OMP106. Las colonias o placas que expresan el polipéptido OMP106 o polipéptido derivado de OMP106 se identifican como cualesquiera de aquellas que unen las perlas.

Alternativamente, los anticuerpos anti-OMP106 pueden inmovilizarse inespecíficamente en un soporte adecuado, tal como sílice o resina Celite^{TM}. Este material se utilizaría a continuación para adsorber colonias bacterianas que expresen el polipéptido OMP106 o polipéptidos derivados de OMP106 como se describe en el párrafo precedente.

En otro aspecto, puede utilizarse la amplificación por PCR para producir DNA sustancialmente puro que codifique una parte o todo el polipéptido OMP106 del DNA genómico de M. catarrhalis. Pueden utilizarse como cebadores oligonucleótidos cebadores, degenerados o de otra forma, correspondientes a secuencias del polipéptido OMP106 conocidas. En una realización particular, un oligonucleótido, degenerado o de otra forma, que codifica el péptido IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEC ID Nº 1) o una porción del mismo, puede utilizarse como el cebador 5'. Por ejemplo, un cebador 5' puede ser la secuencia de nucleótidos GAAGCGGACG GGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACA TTGCGCAA (SEC ID Nº 4) o cualquier porción de la misma. Las secuencias de nucleótidos, degenerados o de otra forma, que sean inversamente complementarios a la secuencia que codifica GTVLGGKK (SEC ID Nº 2) puede utilizarse como el cebador 3'. Por ejemplo, un oligonucleótido, degenerado o de otra forma, que tenga la secuencia de nucleótidos degenerados YTTYTTNCCNCCNAGNACNGTNCC (SEC ID Nº 6) o YTTYTTNCCNCCYAANACNGTNCC (SEC ID Nº 8) puede utilizarse como el cebador 3' junto con los distintos cebadores 5' señalados arriba.

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La PCR puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando un termociclador Perkin-Elmer Cetus y polimerasa Taq (Gene Amp^{TM}). Se puede elegir sintetizar varios cebadores degenerados diferentes para utilizar en las reacciones de PCR. También es posible variar la rigurosidad de las condiciones de hibridación utilizadas en el cebado de las reacciones de PCR, para permitir mayores o menores grados de similitud de las secuencias de nucleótidos entre los cebadores degenerados y las secuencias correspondientes en el DNA de M. catarrhalis. Después de la amplificación exitosa de un segmento de la secuencia que codifica el polipéptido OMP106, ese segmento puede clonarse molecularmente y secuenciarse, y utilizarse como sonda para aislar un clon genómico complementario. Esto, a su vez, permitirá la determinación de la secuencia de nucleótidos completa del gen, el análisis de su expresión, y la producción de su producto proteico para el análisis funcional, como se describe abajo.

Una vez que se ha aislado una secuencia codificante del polipéptido OMP106 de una cepa o cultivo de M. catarrhalis, es posible utilizar el mismo planteamiento para aislar secuencias codificantes del polipéptido OMP106 de otras cepas y cultivos de M. catarrhalis. Se reconocerá por los expertos en la técnica que la secuencia de DNA o RNA que codifica el polipéptido OMP106 (o fragmentos del mismo) de la invención puede utilizarse para obtener otras secuencias de DNA o RNA que hibriden con ella en condiciones de rigurosidad moderada a alta, utilizando técnicas generales conocidas en la técnica. La hibridación con una secuencia del OMP106 de una cepa o cultivo de M. catarrhalis en condiciones de alta rigurosidad identificará la secuencia correspondiente de otras cepas y cultivos. Las condiciones de alta rigurosidad varían con la longitud de la sonda y la composición de bases. La fórmula para determinar tales condiciones es bien conocida en la técnica. Véase Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, Capítulo 11. Como se utiliza en la presente, condiciones de hibridación de alta rigurosidad como las aplicadas a sondas de más de 300 bases de longitud implican un lavado final en 0,1X SSC, SDS al 0,1%, a 68ºC durante al menos 1 hora (Ausubel, et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecualr Biology, Vol. I, Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., New York, en la página 2.10.3). En realizaciones particulares, el lavado de alta rigurosidad en la hibridación en la que se utiliza una sonda que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 4 o su complementaria es en 2XSSC, SDS al 1%, a 50ºC durante aproximadamente 20 a aproximadamente 30 minutos.

El experto en la técnica será capaz de identificar clones completos de la secuencia codificante del polipéptido OMP106 utilizando planteamientos bien conocidos en la técnica. La medida de la secuencia codificante del polipéptido OMP106 contenida en un clon aislado puede averiguarse secuenciando el inserto clonado y comparando el tamaño deducido del polipéptido codificado por los marcos de lectura abiertos (ORFs, del inglés "open reading frames") con el del polipéptido OMP106 y/o comparando la secuencia de aminoácidos deducida con la secuencia de aminoácidos conocida del polipéptido OMP106 purificado. Cuando se haya aislado un clon parcial de la secuencia codificante del polipéptido OMP106, los clones completos pueden aislarse utilizando el inserto del clon parcial como sonda de hibridación. Alternativamente, puede reconstruirse una secuencia codificante del polipéptido OMP106 completa a partir de clones parciales solapantes cortando y empalmando sus insertos juntos.

Los clones completos pueden ser cualesquiera que tengan ORFs con una secuencia de aminoácidos deducida que coincida con la del polipéptido OMP106 o, cuando la secuencia de aminoácidos completa de este último no esté disponible, con la de un fragmento peptídico del polipéptido OMP106 y que tenga un peso molecular que corresponda al del polipéptido OMP106. Además, los clones completos pueden identificarse por la capacidad de sus insertos, cuando se colocan en un vector de expresión, para producir un polipéptido que una anticuerpos específicos frente al extremo amino-terminal del polipéptido OMP106 y anticuerpos específicos frente al extremo carboxilo-terminal del polipéptido OMP106.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos derivados de OMP106 pueden producirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. En un aspecto, las secuencias que codifican los polipéptidos derivados de OMP106 pueden obtenerse a partir de las secuencias codificantes del polipéptido OMP106 mediante métodos de DNA recombinante a la vista de las enseñanzas descritas en la presente. Por ejemplo, la secuencia codificante del polipéptido OMP106 puede alterarse creando sustituciones de aminoácidos que no afectarán la inmunogenicidad del polipéptido OMP106 o que pueden mejorar su inmunogenicidad. Pueden utilizarse varios métodos, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, mutagénesis específica de un sitio, dirigida al oligonucleótido. Éstas y otras técnicas conocidas en la técnica pueden utilizarse para crear mutaciones únicas o múltiples, tales como sustituciones, inserciones, deleciones, y transposiciones, como se describe en Botstein y Shortle, 1985, Science 229:1193-1210.

Además, el DNA de las secuencias codificantes del polipéptido OMP106 puede truncarse mediante digestiones con enzimas de restricción o exonucleasas. Una secuencia codificante heteróloga puede añadirse a la secuencia codificante del polipéptido OMP106 mediante ligación o amplificación por PCR. Por otra parte, el DNA que codifica el total o una parte del polipéptido derivado de OMP puede sintetizarse químicamente o utilizando la amplificación por PCR basándose en la secuencia de aminoácidos conocida o deducida del polipéptido OMP106 y cualesquiera alteraciones deseadas en esa secuencia.

El DNA identificado y aislado que contiene la secuencia codificante del polipéptido OMP106 o del polipéptido derivado de OMP106 puede insertarse en un vector de clonación apropiado. Puede utilizarse un gran número de sistemas vector-hospedante conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero sin limitarse a ellos, plásmidos o virus modificados, pero el sistema del vector debe ser compatible con la célula hospedante utilizada. Tales vectores incluyen, pero sin limitarse a ellos, bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como derivados de los plásmidos pBR322 o pUC. La inserción en un vector de clonación puede, por ejemplo, llevarse a cabo ligando el fragmento de DNA en un vector de clonación que tenga terminaciones cohesivas complementarias. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios utilizados para fragmentar el DNA no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de DNA pueden modificarse enzimáticamente. Alternativamente, puede producirse cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) en las terminaciones del DNA; estos enlazadores ligados pueden constar de oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifiquen las secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el DNA escindido puede modificarse mediante la adición de una cola homopolimérica. Las moléculas recombinantes pueden introducirse en las células hospedantes mediante transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de tal forma que se generen muchas copias de la secuencia génica.

En un método alternativo, el DNA deseado que contiene la secuencia codificante del polipéptido OMP106 o del polipéptido derivado de OMP106 puede identificarse y aislarse después de la inserción en un vector de clonación adecuado en un planteamiento "shotgun". El enriquecimiento en la secuencia deseada, por ejemplo mediante separación en fracciones por tamaño, puede hacerse antes de la inserción en el vector de clonación.

En realizaciones específicas, la transformación de las células hospedantes con las moléculas de DNA recombinantes que contienen la secuencia codificante del polipéptido OMP106 o del polipéptido derivado de OMP106 permite la generación de múltiples copias de tal secuencia codificante. Por tanto, la secuencia codificante puede obtenerse en grandes cantidades cultivando los transformantes, aislando las moléculas de DNA recombinantes de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando la secuencia codificante insertada del DNA recombinante aislado.

5.8. Producción recombinante del polipéptido OMP106 y polipéptidos derivados de OMP106

El polipéptido OMP106 y polipéptidos derivados de OMP106 de la invención pueden producirse a través de técnicas de ingeniería genética. En este caso, se producen mediante una célula hospedante apropiada que se ha transformado con el DNA que codifica el polipéptido. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido OMP106 o polipéptidos derivados de OMP106 de la invención puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante del polipéptido insertada. Las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido OMP106 o polipéptidos derivados de OMP106 se inserta en los vectores de manera que se expresen en condiciones apropiadas (por ejemplo, en orientación apropiada y marco de lectura correcto y con secuencias de expresión apropiadas, incluyendo una secuencia de unión a RNA polimerasa y una secuencia de unión a ribosoma).

Puede utilizarse una variedad de sistemas hospedante-vector para expresar la secuencia codificante del polipéptido. Éstos incluyen, pero sin limitarse a ellos, sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (por ejemplo, virus de la viruela vacuna, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levaduras, o bacterias transformadas con DNA de un bacteriófago, DNA plasmídico, o DNA de tipo cósmido. Preferiblemente, la célula hospedante es una bacteria, y más preferiblemente la bacteria es E. coli, B. subtilis o Salmonella.

Los elementos de expresión de los vectores varían en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema hospedante-vector utilizado, puede utilizarse cualquiera entre varios elementos de transcripción y traducción adecuados. En una realización específica, se expresa una proteína quimérica que comprende la secuencia del polipéptido OMP106 o del polipéptido derivado de OMP106 y una pre y/o pro secuencia de la célula hospedante. En otras realizaciones específicas, se expresa una proteína quimérica que comprende la secuencia del polipéptido OMP106 o del polipéptido derivado de OMP106 y un péptido de purificación por afinidad. En realizaciones específicas adicionales, se expresa una proteína quimérica que comprende la secuencia del polipéptido OMP106 o del polipéptido derivado de OMP106 y un péptido o polipéptido inmunógeno útil. En realizaciones preferidas, el polipéptido derivado de OMP106 expresado contiene una secuencia que forma bien un epítope en la superficie externa o el dominio de unión del receptor del polipéptido OMP106 nativo.

Puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica para insertar fragmentos de DNA en un vector para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que consiste en señales de control transcripcional/traduccional apropiadas y las secuencias codificantes del polipéptido. Estos métodos pueden incluir técnicas de DNA recombinante y sintéticas in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido OMP106 o el polipéptido derivado de OMP106 puede regularse mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de tal forma que la secuencia insertada se exprese en un hospedante transformado con la molécula de DNA recombinante. Por ejemplo, la expresión de la secuencia insertada puede controlarse mediante cualquier elemento promotor/intensificador conocido en la técnica. Los promotores que pueden ser utilizados para controlar la expresión de las secuencias insertadas incluyen, pero sin limitarse a ellos, la región del promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42) para la expresión en células animales; los promotores de la \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25), \lambdaP_{L}, o trc para la expresión en células bacterianas (véase también "Useful proteins from recombinant bacteria en Scientific American", 1980, 242:74-94); la región del promotor de la nopalina sintasa o el promotor RNA 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120) para la expresión en células implantadas; elementos promotores de levaduras u otros hongos tales como el promotor Gal4, el promotor de la ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de la PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina.

Los vectores de expresión que contienen las secuencias codificantes del polipéptido OMP106 o polipéptido derivado de OMP106 pueden identificarse mediante tres planteamientos generales: (a) hibridación de ácidos nucleicos, (b) presencia o ausencia de funciones de genes "marcadores", y (c) expresión de secuencias insertadas. En el primer planteamiento, la presencia de un gen ajeno insertado en un vector de expresión puede detectarse mediante hibridación de ácidos nucleicos utilizando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a la secuencia codificante del polipéptido OMP106 o polipéptido derivado de OMP106 insertada. En el segundo planteamiento, el sistema vector recombinante/hospedante puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones de genes "marcadores" (por ejemplo, actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) causados por la inserción de genes ajenos en el vector. Por ejemplo, si la secuencia codificante del polipéptido OMP106 o polipéptido derivado de OMP106 se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contengan el inserto pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. En el tercer planteamiento, los vectores de expresión recombinantes pueden identificarse mediante ensayo relativo al producto del gen ajeno expresado por el recombinante. Tales ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas y funcionales del polipéptido OMP106 o polipéptido derivado de OMP106 en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, la unión a un ligando o receptor del OMP106, o la unión con anticuerpos anti-OMP106 de la invención, o la capacidad de la célula hospedante para causar hemoaglutinación, o la capacidad del extracto celular para interferir con la hemoaglutinación por M. catarrhalis.

Una vez que se identifica y aísla una molécula de DNA recombinante particular, pueden utilizarse varios métodos conocidos en la técnica para propagarla. Una vez que se establecen un sistema hospedante adecuado y las condiciones de crecimiento, los vectores de expresión recombinantes pueden propagarse y prepararse en cantidad. Como se ha explicado arriba, los vectores de expresión que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitarse a ellos, los vectores siguientes o sus derivados: virus humanos o animales tales como el virus de la viruela vacuna o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levaduras; vectores bacteriófagos (por ejemplo, lambda), y vectores de DNA de tipo plásmido y cósmido, por nombrar algunos.

Además, puede elegirse una cepa de células hospedantes que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico en la manera específica deseada. La expresión a partir de ciertos promotores puede elevarse en presencia de ciertos inductores; de este modo, la expresión del polipéptido OMP106 o polipéptido derivado de OMP106 modificado mediante ingeniería genética puede controlarse. Además, células hospedantes diferentes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación traslacional y post-traslacional de las proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedantes apropiados para asegurar la modificación y procesamiento deseados de la proteína ajena expresada.

5.9. Reactivos

Los polipéptidos, péptidos, anticuerpos y ácidos nucleicos de la invención son útiles como reactivos para diagnóstico clínico o médico de infecciones por M. catarrhalis y para la investigación científica sobre las propiedades de patogenicidad, virulencia, e infectividad de M. catarrhalis, además de como mecanismos de defensa de hospedantes. Por ejemplo, el DNA o RNA de la invención pueden utilizarse como sondas para identificar la presencia de M. catarrhalis en muestras biológicas mediante hibridación o amplificación por PCR. El DNA y RNA pueden utilizarse también para identificar otras bacterias que podrían codificar un polipéptido relacionado con el OMP106 de M. catarrhalis.

Los polipéptidos y péptidos de la invención pueden utilizarse para preparar anticuerpos policlonales y monoclonales que pueden utilizarse para purificar adicionalmente composiciones que contengan los polipéptidos de la invención mediante cromatografía de afinidad. Los polipéptidos y péptidos pueden utilizarse también en inmunoensayos estándar para el escrutinio relativo a la presencia de anticuerpos frente a M. catarrhalis en una muestra.

Debe entenderse que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema o medio específico estará dentro de las capacidades de alguien que tenga una experiencia normal en la técnica a la luz de las enseñanzas contenidas en la presente. En el siguiente ejemplo aparecen ejemplos de los productos de la presente invención y procedimientos para su preparación.

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6. Ejemplo

Aislamiento y caracterización del polipéptido OMP106 y del gen que codifica el mismo de la cepa atcc 49143 u otras cepas 6.1. Materiales y métodos 6.1.1. Ensayo de hemoaglutinación

La hemoaglutinación por M. catarrhalis se sometió a ensayo como se describe en Soto-Hernández et al. (J. Clin. Microbiol. 27:903-908) excepto que se utilizó un 5%, en vez de un 3%, v/v de eritrocitos en un ensayo de hemoaglutinación en portaobjetos. Los ensayos de hemoaglutinación iniciales se realizaron utilizando 20 \mug de células bacterianas (peso húmedo). Puesto que la cepa 49143 de la ATCC de M. catarrhalis cultivada en placas de agar sangre a 35ºC presentó una fuerte reacción de hemoaglutinación, se seleccionó como la cepa de referencia. La dilución sucesiva de la cepa 49143 de la ATCC en diluciones 1:2 dio como resultado la disminución de las reacciones de hemoaglutinación. Los resultados de ++++ a + se basaron en la hemoaglutinación observada por la cepa 49143 de la ATCC después de diluciones 1:2 sucesivas de tal forma que se obtuvo una reacción + utilizando ¼ del número de células requeridas para alcanzar una reacción +++.

6.1.2. Inhibición de la hemoaglutinación

Una suspensión de células de la cepa ATCC 49143 de M. catarrhalis se diluyó 1:2 sucesivamente, y la dilución que proporcionó una reacción de hemoaglutinación + cuando se utilizaron 7 \mul de solución salina tamponada de Dulbecco, y 7 \mul de eritrocitos 0^{+} humanos al 5% (v/v) se utilizaron para hacer un ensayo relativo a la inhibición de la hemoaglutinación por azúcares simples o derivados de azúcar. Para determinar si los azúcares simples o derivados de azúcar podrían inhibir la hemoaglutinación por M. catarrhalis, se mezclaron 7 mul de un azúcar dado a 500 mM con 7 \mul de células de M. catarrhalis y se incubaron durante 5 minutos para permitir que el azúcar interaccionara con las células. A continuación se añadieron 7 \mul de eritrocitos 0^{+} humanos al 5% (v/v) y se determinó la hemoaglutinación después de 1 minuto. Cada azúcar y derivado de azúcar se sometió a ensayo relativo a su capacidad para inhibir la hemoaglutinación. A continuación la solución de reserva de cada azúcar y derivado de azúcar se diluyó 1:2 sucesivamente, y estas diluciones se sometieron a ensayo relativo a su capacidad para inhibir la hemoaglutinación utilizando el procedimiento descrito arriba. De esta forma, se determinó la cantidad mínima de carbohidrato requerida para inhibir la hemoaglutinación.

6.1.3. Unión de ligando y receptor

Se examinó la unión de M. catarrhalis a receptores glicolipídicos de células animales utilizando la separación en fracciones mediante cromatografía de capa fina (TLC) de los glicolípidos de la célula hospedante y el cubrimiento con células marcadas del cromatograma siguiendo los procedimientos descritos por Magnani et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:14365-14369. Brevemente, los glicolípidos obtenidos de Matreya Inc. (Pleasant Gap, PA) se resolvieron en placas de cromatografía de capa fina de alta resolución (HPTLC) en cloroformo, metanol, agua (5:4:1). Las placas se tiñeron con orcinol a 100ºC, o se cubrieron con ampollas de M. catarrhalis marcadas con ^{125}I preparadas como se ha descrito con anterioridad (Murphy y Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174) a 2 X 10^{6} cpm/ml durante 2 horas. Las placas se lavaron a continuación 5 veces, se secaron y se expusieron a una película de rayos X.

6.1.4. Extracción con og de OMPs

Las cepas de M. catarrhalis se cultivaron cada una a 35ºC y 200 rpm en 1 litro de medio Mueller Hinton en un matraz de 4 litros. Las preparaciones de proteína de la membrana externa (OMP) se aislaron tratando 50 mg de células (peso húmedo) con 0,67 ml de n-octil-\beta-D-glucopiranósido (es decir, octil-glucósido; OG) al 1,25% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se sedimentaron en una microcentrífuga durante 5 minutos y el sobrenadante se utilizó como extracto con octil-glucósido. La comparación de los perfiles de proteínas de estos extractos de varias cepas de M. catarrhalis con los de ampollas (es decir, vesículas de la membrana externa) aisladas mediante centrifugación diferencial, que están altamente enriquecidas en proteínas de la membrana externa (OMPs) de M. catarrhalis (Murphy y Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6:159-174) indica que los extractos con octil-glucósido contienen predominantemente proteínas de la membrana externa de M. catarrhalis (Fig. 1). Esto indicó que la extracción con octil-glucósido proporcionaba un procedimiento más rápido con un mayor rendimiento de proteínas de la membrana externa comparado con las proteínas de la membrana externa preparadas a partir de ampollas.

6.1.5. Digestión proteolítica de OMP106

50 mg de células de la cepa 49143 de la ATCC en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco se sometieron a digestión durante 1 hora a temperatura ambiente con las siguientes proteasas: quimotripsina tratada con TLCK (5 mg), Proteinasa K (5 mg), tripsina tratada con TPCK (5 mg), o proteasa V8 (100 Unidades). Todas las proteasas se obtuvieron de Sigma Chemicals (St. Louis, MO). Inmediatamente después del tratamiento con la proteasa, las células se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en 1 ml de PBS y se hizo un ensayo relativo a la actividad de hemoaglutinación. Adicionalmente, las células bacterianas tratadas con proteasa se sometieron a extracción con octil-glucósido de tal forma que pudieran resolverse las proteínas de la membrana externa para identificar las proteínas específicas que podían haber sido digeridas por las proteasas.

6.1.6. Cultivos que no causan hemoaglutinación

Normalmente, los cultivos de M. catarrhalis que causan hemoaglutinación se cultivan en matraces agitados que contienen medio Mueller Hinton entre 35 y 37ºC a 200 rpm durante 24 a 48 horas. Las células tomadas directamente de una placa de agar sangre o de una placa de agar de medio Mueller Hinton expresan también el fenotipo que causa hemoaglutinación. Para seleccionar un cultivo que no causa hemoaglutinación (NHA), la cepa 49143 de la ATCC se sometió a pasos de incubación sucesivos cada 5 días en cultivos estáticos cultivados en medio Mueller Hinton a 35ºC. Con cada paso de incubación, se tomó un inóculo sólo de la superficie del caldo de cultivo. En el segundo paso de incubación, se había desarrollado un conjunto flotante de células y este conjunto de células se utilizó como inóculo para los cultivos subsiguientes. La realización de cultivos sucesivos de esta forma produjo cultivos NHA de la cepa ATCC 49143 típicamente después de tres pasos de incubación.

6.1.7. Aislamiento del polipéptido OMP106

El polipéptido OMP106 del extracto de membrana externa de la cepa ATCC 49143 de M. catarrhalis se detecta (por ejemplo, mediante tinción con plata o anticuerpos anti-OMP106) en geles de desnaturalizantes únicamente después de que el extracto se ha incubado a 100ºC durante 5 minutos. Con el fin de determinar si la aparición de la banda del OMP106 después de la incubación a 100ºC es el resultado de la agregación de las proteínas de bajo peso molecular durante la ebullición, o si la ebullición permite que una proteína normalmente agregada entre en el gel, se analizó un extracto de membrana externa con octil-glucósido sin hervir de la cepa ATCC 49143 en un gel de poliacrilamida nativo. Las regiones específicas del gel incluyendo las que estaban inmediatamente debajo del pocillo de muestra se cortaron e hirvieron. Las muestras resultantes se resolvieron a continuación en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se tiñeron con tinte de plata (Silver Stain Plus, número de catálogo 161-0449, BioRad Laboratories, Richmond, CA). Para la secuenciación del extremo N-terminal, se mezcló un extracto de membrana externa con octil-glucósido de la cepa ATCC 49143 con tampón de muestra para PAGE que contenía SDS, y se incubó durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo. Las proteínas se resolvieron a continuación en un PAG al 12% con SDS y se transfirieron a una membrana de PVDF mediante electrotransferencia. La región de la membrana que contenía la banda del OMP106 se cortó a continuación para la secuenciación del extremo amino-terminal. Ninguno de los procedimientos de PAGE utilizados para aislar el polipéptido OMP106 utilizó agentes reductores en los tampones de muestra o del gel.

6.1.8. Antisuero anti-OMP106

El antisuero frente a OMP106 se preparó resolviendo el polipéptido OMP106 de un cultivo HA de la cepa ATCC 49143 en un gel de poliacrilamida desnaturalizante en presencia de dodecilsulfato sódico como se ha descrito con anterioridad (Lammeli, 1970, Nature 227:680-685), y cortando la banda que contenía el OMP106 del gel. La banda cortada se remojó y se inyectó en un conejo para generar antisuero frente al polipéptido OMP106. El antisuero se utilizó para inhibir la hemoaglutinación como se describe en la Sección 6.1.2. arriba, pero utilizando el antisuero en lugar del carbohidrato. El antisuero se examinó también con relación a la actividad citotóxica mediada por el complemento frente a M. catarrhalis como se describe en la Sección 7.

6.1.9. Tranferencias western con el antisuero anti-OMP106

Las cepas ATCC 49143, ATCC 43628, ATCC 43627, ATCC 43618, ATCC 43617, ATCC 25240, ATCC 25238, y ATCC 8176 de M. catarrhalis; ATCC 33078 de M. ovis; ATCC 17967 de M. lacunata; ATCC 10900 de M. bovis; ATCC 10973 de M. osloensis; Neisseria gonorrhoeae (aislado clínico); y ATCC 13077 de N. meningitidis se cultivaron en placas de agar chocolate durante 48 horas a 35ºC en CO_{2} al 5%. Las células se retiraron raspando las colonias de la superficie de agar utilizando un asa de siembra de poliestireno. Las células se solubilizaron a continuación resuspendiendo 30 \mug de células en 150 \mul en tampón de muestra de PAGE (tampón Tris 360 mM [pH 8,8], que contenía dodecilsulfato sódico al 4% y glicerol al 20%), y la suspensión se incubó a 100ºC durante 5 minutos. Las células solubilizadas se resolvieron en geles de poliacrilamida al 12% como por Laemmli y las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente a membranas de PVDF a 100 V durante 1,5 horas como se ha descrito con anterioridad (Thebaine et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:4350-4354) excepto que se añadió dodecilsulfato sódico al 0,05% al tampón de transferencia para facilitar el movimiento de las proteínas desde el gel. Las membranas de PVDF se pretrataron a continuación con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía caseína sódica al 0,5%, albúmina de suero bovino al 0,5% y suero de cabra al 1%. Todas las incubaciones subsiguientes se llevaron a cabo utilizando este tampón de pretratamiento.

Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:500 de suero de conejo preinmune o suero de un conejo inmunizado con el polipéptido OMP106 (como se describe arriba) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas de PVDF se lavaron a continuación dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM [pH 7,5] que contenía cloruro de sodio 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG anti-conejo de cabra marcada con peroxidasa (Jackson InmunoResearch Laboratories, West Grove Penn. número de catálogo 111-035-003) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas de PVDF se lavaron a continuación cuatro veces con tampón de lavado, y se revelaron con tetrahidrocloruro de
3,3'-diaminobencidina y peróxido de urea como los suministrados por Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo. número de catálogo D-4418) durante 4 minutos cada uno.

6.1.10. Tinción con inmunofluorescencia anti-OMP106 de la supercifie celular

La cepa ATCC 49143 de M. catarrhalis se cultivó durante una noche a 35ºC en un baño de agua con agitación en medio Mueller Hinton. Las células se sedimentaron por centrifugación y a continuación se resuspendieron en un volumen igual de la modificación de Dulbecco de solución salina tamponada con fosfato sin calcio o magnesio (PBS/MC). Se aplicaron 20 \mul de la suspensión de células a cada uno de 5 portaobjetos para microscopio limpios. Después de dejar fijar durante 10 segundos, se retiró el exceso de fluido con una micropipeta, y los portaobjetos se dejaron secar al aire durante 1 hora. Los portaobjetos se fijaron a continuación por calor sobre una llama al aire hasta que el vidrio estaba caliente al tacto. Los portaobjetos se trataron inicialmente con 40 \mul de una dilución 1:40 de antisuero anti-OMP106 o suero preinmune del mismo animal diluido en PBS/MC, o PBS/MC durante 10 minutos, y a continuación se lavaron 5 veces con PBS/MC. Los portaobjetos se trataron con 40 \mul de 5 \mug/ml en PBS/MC de anticuerpo de cabra marcado con isotiocianato de fluoresceína frente a IgG de conejo (Kirkegaard y Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD número de catálogo 02-15-06). Los portaobjetos se incubaron en oscuridad durante 10 minutos y se lavaron 5 veces en PBS/MC. Cada portaobjetos se almacenó cubierto con PBS/MC bajo un cubreobjetos y se visualizó con un microscopio de fluorescencia con un filtro de 489 nm. Se examinaron visualmente cinco campos de visión para cada muestra para evaluar el alcance de la tinción.

6.2. Resultados 6.2.1. Actividad de hemoaglutinación

La actividad de aglutinación de M. catarrhalis con respecto a los eritrocitos es específica de la especie, con la actividad más intensa observada con eritrocitos humanos. Los eritrocitos de conejo sufren también aglutinación por M. catarrhalis, pero menos espectacularmente que las células humanas. Los eritrocitos de ratón, caballo u oveja no sufrieron aglutinación (véase la Tabla 1).

TABLA 1

Intensidad de la hemoaglutinación de eritrocitos de varias especies utilizando la cepa
ATCC 49143 de M. catarrhalis
Fuente de eritrocitos	Resultado de la hemoaglutinación^{a}
Humano	++++
Conejo	++
Ratón	-
Caballo	-
Oveja	-
^{a} ++++ = aglutinación más intensa, - indica no aglutinación

6.2.2. Receptores y ligandos de OMP106

La actividad de hemoaglutinación por M. catarrhalis se debe a la unión a globotetrosa (Gb_{4}). Las ampollas de las cepas que cusan hemoaglutinación se unen a un glicolípido que tiene Gb_{4}, mientras que las cepas que no causan hemoaglutinación no se unen al mismo glicolípido (véase la Fig. 2). La actividad de hemoaglutinación por M. catarrhalis se inhibe por constituyentes de tipo monosacárido de Gb_{4} o derivados de tales monosacáridos, siendo los inhibidores más potentes N-acetil-galactosamina y galactosa (especialmente el anómero alfa de la galactosa) (véase la Tabla 2).

TABLA 2

Concentración mínima de azúcares requerida para inhibir la hemoaglutinación (MIC) por M. catarrhalis
Azúcar	MIC (Mm) *
D-Glucosa	>167
D-Manosa	83
D-Galactosa	41
L-Fucosa	83
N-acetil-D-Glucosamina	>167
N-acetil-D-Galactosamina	41
Metil-\alpha-Glucosa	>167
Metil-\alpha-Manosa	167
Metil-\alpha-Galactosa	10
Metil-\beta-Galactosa	83
* Concetración mínima de azúcar requerida para inhibir una reacción de hemoaglutinación 1+ por la cepa
ATCC 49143 de M. catarrhalis con eritrocitos 0+ humanos lavados al 5%.

Tanto la N-acetil-galactosamina como la alfa-galactosa forman parte del tetrasacárido Gb_{4}. La correlación entre la hemoaglutinación y la unión a Gb_{4}, y la observación de que la hemoaglutinación se inhibe por monosacáridos que comprenden el receptor Gb_{4} sugiere que las células de M. catarrhalis se unen al tetrasacárido Gb_{4}. Este tetrasacárido está presente en eritrocitos y tejidos humanos, y podría mediar la fijación de M. catarrhalis a las membranas eucariotas.

6.2.3. Identificación del polipéptido OMP106

La digestión proteolítica de células de M. catarrhalis, y el subsiguiente análisis de hemoaglutinación por las células digeridas demostró que el tratamiento con proteasa con quimotripsina y proteinasa K destruía la actividad de hemoaglutinación, y el tratamiento con tripsina destruía parcialmente la actividad de hemoaglutinación, indicando que la actividad de hemoaglutinación está mediada por proteína. El análisis de los perfiles de proteína OMP de las células de M. catarrhalis digeridas con proteasa mostró que se habían degradado múltiples proteínas en cada muestra, de tal forma que los perfiles no proporcionaban una pista sobre qué proteína es directamente responsable o contribuye indirectamente a la actividad de hemoaglutinación (véase la Fig. 3).

Puesto que el tratamiento con proteasa indicó que un polipéptido es directa o indirectamente responsable de la actividad de hemoaglutinación, utilizamos SDS-PAGE para comparar los perfiles de OMP de cepas que causan hemoaglutinación con perfiles de OMP de cepas que no causan hemoaglutinación (Fig. 4). El análisis de las diferencias entre estos perfiles indicó que las cepas que causan hemoaglutinación tenían dos polipéptidos únicos, uno con un peso molecular aparente de 27 kDa (designado OMP27) y el otro era la única proteína con un peso molecular aparente mayor de 106 kDa (designado OMP106). Notablemente, la banda del polipéptido OMP106 estaba ausente en las preparaciones de OMP de varias células tratadas con proteasa que tenían una actividad de hemoaglutinación reducida o inexistente, mientras que la banda del OMP27 estaba presente en la preparación de OMP de células tratadas con proteinasa K que no presentan actividad de hemoaglutinación. Además, la banda del polipéptido OMP106 no se degradó por digestión con proteinasa V8, que no afectaba a la actividad de hemoaglutinación de las células tratadas.

6.2.4. Perfil de OMP de cultivos NHA

La realización de cultivos sucesivos de un cultivo NHA de la cepa ATCC 49143 en cultivo estático a 35ºC produjo un cultivo NHA (designado 49143-NHA) en el tercer paso de incubación del cultivo. Esta pérdida de actividad de hemoaglutinación era reproducible. El análisis de los perfiles de OMP de extractos de la membrana externa con OG de los cultivos HA y NHA mostró que la banda del polipéptido OMP106 estaba ausente en el extracto 49143-NHA (Fig. 5). Esto sugería que el polipéptido OMP106 es el hemoaglutinante de M. catarrhalis (es decir, el polipéptido OMP106 se une al receptor Gb_{4} o es una subunidad de una proteína homopolimérica que se une al receptor Gb_{4}) o forma parte del hemoaglutinante de M. catarrhalis (es decir, el polipéptido OMP106 es una subunidad de una proteína heteropolimérica que se une al receptor Gb_{4}).

6.2.5. OMP106 y hemoaglutinación

El antisuero policlonal producido frente al polipéptido OMP106 de la cepa ATCC 49143 neutralizó la hemoaglutinación por la cepa ATCC 49143, así como aquella por la cepa heteróloga ATCC 43627. Esto respalda adicionalmente la conclusión de que la actividad de hemoaglutinación de M. catarrhalis comprende el polipéptido OMP106, y que el polipéptido OMP106 está antigénicamente conservado entre las cepas. Véase también la Fig. 9A, que muestra los anticuerpos en el antisuero policlonal uniendo el polipéptido OMP106 de cepas de M. catarrhalis heterólogas.

6.2.6. Situación de OMP106 en la superficie externa

El antisuero anti-OMP106 de conejo se utilizó en una tinción con inmunofluorescencia indirecta para determinar si el polipéptido OMP106 está expuesto en la superficie externa de las células de M. catarrhalis. Las células de M. catarrhalis tratadas con el antisuero anti-OMP106 se tiñeron más intensamente y uniformemente que las células tratadas con suero preinmune o PBS/MC. Esto indicó que, en las células de M. catarrhalis intactas, el polipéptido OMP106 era reactivo con los anticuerpos anti-OMP106. Este resultado indica que el polipéptido OMP106 está expuesto en la superficie externa de M. catarrhalis. Este descubrimiento es consistente con que el polipéptido OMP106 tiene un papel en la hemoaglutinación y, además, indica que el polipéptido OMP106 podría ser útil como vacuna.

6.2.7. Propiedades del polipéptido OMP106

El polipéptido OMP106 existe como un gran complejo proteico en su estado nativo o agrega cuando se somete a extracción con octil-glucósido. Esta conclusión está respaldada por el descubrimiento de que la extracción de células de M. catarrhalis con octil-glucósido solubiliza el polipéptido OMP106, pero el polipéptido OMP106 extraído no entra en PAGs desnaturalizantes a menos que el extracto se incube primero a 100ºC (Fig. 6). Además, la banda del polipéptido OMP106 no parece formarse a partir de polipéptidos de menor peso molecular que polimerizan o agregan con el calor, puesto que el polipéptido OMP106 en una muestra desnaturalizada no calentada queda atrapada en el pocillo de muestra y entra en el gel de resolución únicamente si la muestra se ha incubado primero a 100ºC. Esta propiedad bioquímica es muy útil para identificar el polipéptido OMP106 en varios geles.

Utilizando extractos con octil-glucósido de M. catarrhalis, incubando a continuación los extractos con dodecilsulfato sódico a 100ºC, y resolviendo las proteínas en un gel de poliacrilamida desnaturalizante, hemos estimado el peso molecular aparente del polipéptido OMP106 de varias cepas de M. catarrhalis, específicamente aquellos de ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 y ATCC 43628, que están en el intervalo de aproximadamente 180 kDa a aproximadamente 230 kDa (Fig. 9A), mientras que el polipéptido OMP106 de la cepa ATCC 49143 parece tener un peso molecular aparente de aproximadamente 190 kDa (Fig. 6).

El polipéptido OMP106 de la cepa ATCC 49143 se extrajo de la lámina cortada del gel y se secuenció su extremo N-terminal. La secuenciación mostró que el extremo N-terminal del polipéptido OMP106 de la membrana externa de la cepa ATCC 49143 era IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV (SEC ID Nº 1). Además, se ha aislado un péptido interno de OMP106 producido por digestión con Lys-C (Fernández et al., 1994, Anal. Biochem. 218:112-117) y se ha determinado su secuencia que es GTVLGGKK (SEC ID Nº 2).

Generamos tres sondas de oligonucleótidos. Dos sondas corresponden al péptido interno GTVLGGKK, una tiene la siguiente secuencia GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR (SEC ID Nº 3), la otra tiene la siguiente secuencia GGNACNGTNTTRGGN GGNAARAAR (SEC ID Nº 7). La otra sonda, Mc 5-72, que codifica un fragmento interno (SEC ID Nº 5) de la secuencia del extremo amino-terminal de OMP106 (SEC ID Nº 1) tiene la secuencia siguiente GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGC GCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA (SEC ID Nº 4). La hibridación de la sonda Mc 5-72 con un producto de digestión completo HindIII o DraI del DNA de M. catarrhalis produjo en cada caso una única banda en el análisis de transferencia Southern (Fig. 7). La banda de hibridación en el producto de digestión HindIII tiene un tamaño aproximado de 8,0 kb; la banda de hibridación en el producto de digestión DraI tiene un tamaño aproximado de 4,2 kb (Fig. 7).

6.2.8. Conservación del polipéptido OMP106

El análisis de transferencia Western de extractos de proteína de la membrana externa de varias cepas de M. catarrhalis y especies relacionadas de bacterias mostró que los anticuerpos anti-OMP106 se unen a un polipéptido de entre aproximadamente 180 kDa y aproximadamente 230 kDa en muchas cepas de M. catarrhalis, cepas o cultivos tanto HA como NHA (Fig. 9A). Los anticuerpos anti-OMP106 no se unían a polipéptido alguno en los extractos de proteína de bacterias relacionadas (Fig. 8A). Estos resultados demuestran lo siguiente: 1) Los anticuerpos anti-OMP106 pueden utilizarse para identificar y distinguir específicamente M. catarrhalis de especies relacionadas de bacterias. 2) El polipéptido OMP106 puede utilizarse para generar anticuerpos que tienen una aplicación diagnóstica para la identificación de M. catarrhalis. 3) Los anticuerpos frente al polipéptido OMP106 de una cepa (por ejemplo, OMP106 de ATCC 49143) puede utilizarse para identificar y aislar el polipéptido OMP106 correspondiente de otras cepas de M. catarrhalis. De manera interesante, los resultados de la transferencia Western muestran que muchas de las cepas de M. catarrhalis NHA tienen polipéptido OMP106 en los extractos con OG de sus membranas externas. Este descubrimiento, y el hecho de que la tinción con plata de OMPs de extractos de membrana externa con OG de cepas de M. catarrhalis NHA después de PAGE no muestra una banda en el intervalo de 180 kDa a 230 kDa, indican que el polipéptido OMP106 se expresa en la mayoría de las cepas o cultivos de M. catarrhalis pero que, para ser activo en la hemoaglutinación (es decir, unirse al receptor en superficies de células animales) o teñirse con plata, el polipéptido OMP106 debe ser apropiadamente modificado de alguna forma. Aparentemente sólo las cepas y cultivos HA son capaces de modificar apropiadamente el polipéptido OMP106 de tal forma que pueda mediar en la unión bacteriana al receptor del hemoaglutinante en las superficies de las células animales.

7. Ejemplo

Eficacia de una vacuna OMP106: actividad citotóxica del antisuero anti-OMP106

Se examinó la actividad citotóxica mediada por el complemento de anticuerpos anti-OMP106 para determinar el potencial como vacuna del polipéptido OMP106. Se preparó antisuero frente al polipéptido OMP106 de un cultivo HA de la cepa ATCC 49143 como se describe en la Sección 6.1.8. arriba. Las actividades del suero preinmune y del antisuero anti-OMP106 en la mediación de la destrucción por el complemento de M. catarrhalis se examinó utilizando el "Ensayo Bactericida con Suero" descrito por Zollinger et al. (Immune Responses to Neisseria meningitis, en el Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3ª ed., pg. 347-349), excepto que se utilizaron células de cepas o cultivos de M. catarrhalis HA y NHA en lugar de células de Neisseria meningitis.

Los resultados muestran que el antisuero anti-OMP106 mediaba la destrucción por el complemento de un cultivo HA de la cepa heteróloga ATCC 43627 de M. catarrhalis pero no un cultivo NHA de la cepa ATCC 43627 de M. catarrhalis o la cepa NHA ATCC 8176 de M. catarrhalis. La Tabla 3 resume las actividades citotóxicas mediadas por el complemento de suero preinmune y antisuero anti-OMP106 frente a un cultivo HA de la cepa ATCC 43627.

TABLA 3

Actividades citotóxicas mediadas por el complemento de suero preinmune y antisuero anti-OMP106
	Título Citotóxico^{1}
	Preinmune	Anti-OMP106
Experimento 1	16	128
Experimento 2	8	64
^{1}El título es en la dilución más alta a la que el suero puede mediar la destrucción por el complemento de
un cultivo HA de la cepa ATCC 43627 (por ejemplo, 16 representa una sisolución de 16 veces del suero),
cuanto mayor es el número, mayor es la actividad o título citotóxico.

Como se muestra en la Tabla 3, el antisuero anti-OMP106 tiene una actividad citotóxica 8 veces mayor que el suero preinmune. Este descubrimiento indica que el polipéptido OMP106 es útil como vacuna frente a cepas y cultivos de M. catarrhalis HA.

Aunque la invención se describe en detalle con referencia a realizaciones específicas de la misma, se entenderá que las variaciones que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción precedente y de los dibujos que acompañan. Se pretende que tales modificaciones entren dentro del alcance de las reivindicaciones que acompañan.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: TUCKER, KENNETH

\hskip3.4cm

PLOSILA, LAURA

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POLIPÉPTIDO DE LA PROTEÍNA 106 DE LA MEMBRANA EXTERNA DE MORAXELLA CATARRHALIS, SECUENCIA GÉNICA Y UTILIZACIONES DEL MISMO

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: PENNIE & EDMONDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 1155 Avenue of the Americas

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(C): CIUDAD: Nueva York

\vskip0.333000\baselineskip

(D): ESTADO: Nueva York

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 10036-2711

\vskip0.666000\baselineskip

(v): FORMA LEÍBLE EN ORDENADOR:

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(A): SOPORTE: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible de IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD EN CURSO:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE ARCHIVO:

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/APODERADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Baldwin, Geraldine F.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 31.232

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7969-045

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (212) 790-9090

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TELEFAX: (212) 869-8864

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TELEX: 66141 PENNIE

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Glu Ile Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg}

\sac{Gly Asp Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln Ala Leu Gly Ser}

\sac{Gln Ser Ile Ala Ile Gly Asp Asn Lys Ile Val}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Thr Val Ley Gly Gly Lys Lys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "sonda"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..72

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:

1

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser}

\sac{Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "sonda"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

YTTYTTNCCN CCNAGNACNG TNCC

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "sonda"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGNACNGTNT TRGGNGGNAA RAAR

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "sonda"

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC

\hfill

Claims

1. Un polipéptido OMP106 aislado o sustancialmente puro, que es un polipéptido de la membrana externa de Moraxella catarrhalis, y tiene un peso molecular entre aproximadamente 180 kDa y aproximadamente 230 kDa determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS utilizando miosina de músculo esquelético de conejo y \beta-galactosidasa de E. coli como estándares de peso molecular 200 kDa y 116,25 kDa, respectivamente, y que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2.

2. El polipéptido OMP106 de la reivindicación 1, que comprende las secuencias de la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2.

3. El polipéptido OMP106 de las reivindicaciones 1 ó 2 que tiene un peso molecular de aproximadamente 190 kDa.

4. El polipéptido OMP106 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un polipéptido de la membrana externa de una cepa de Moraxella catarrhalis seleccionada entre el grupo que consta de ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627, ATCC 43628 y ATCC 49143.

5. El polipéptido OMP106 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, cuya cepa de Moraxella catarrhalis es la ATCC 49143.

6. El polipéptido OMP106 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que Moraxella catarrhalis es un cultivo que causa hemoaglutinación.

7. El polipéptido OMP106 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que reacciona con tinte de plata.

8. Un anticuerpo aislado que une específicamente el polipéptido OMP106 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o que se une a un fragmento de OMP106, comprendiendo dicho fragmento 6 o más aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 2.

9. El anticuerpo aislado de la reivindicación 8 que es un anticuerpo citotóxico que media en la destrucción mediante el complemento de Moraxella catarrhalis.

10. Un fragmento peptídico del polipéptido OMP106 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que se une específicamente a un anticuerpo que une específicamente dicho polipéptido OMP106.

11. Una vacuna que comprende el polipéptido OMP106 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. Una vacuna que comprende el fragmento peptídico de la reivindicación 10.

13. Una composición antigénica que comprende el polipéptido OMP106 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

14. Una composición antigénica que comprende el fragmento peptídico de la reivindicación 10.

15. Un DNA aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido OMP106 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

16. Un DNA aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de la SEC ID Nº 1.

17. Un DNA aislado que codifica un polipéptido OMP106, el cual DNA comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de la SEC ID Nº 4 o la complementaria a la secuencia de la SEC ID Nº 4.

18. El DNA de la reivindicación 16, que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 4 o la complementaria a la secuencia de la SEC ID Nº 4.

19. La utilización de un polipéptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección con M. catarrhalis.

20. La utilización de un anticuerpo aislado conforme a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección con M. catarrhalis.

21. La utilización de un fragmento peptídico conforme a la reivindicación 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección con M. catarrhalis.

\newpage

22. Un DNA conforme a cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16 para utilizar en la identificación o diagnosis de infección con M. catarrhalis.