ES2275314T3 - Proteina de neisseria de union a lactoferrina. - Google Patents

Abstract

Una vacuna que comprende una cantidad eficaz de una proteína B de unión a lactoferrina no unida a lípidos de Neisseria meningitidis, o una proteína de fusión de la misma, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Description

Proteína de Neisseria de unión a lactoferrina.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polipéptidos recién identificados y al uso de dichos polipéptidos, y a su producción. Más particularmente, los polipéptidos de la presente invención se refieren a la familia de las proteínas de la membrana externa de Neisseria (OMP), y en particular a la proteína de unión a lactoferrina B (LbpB). Además, la invención se refiere al uso terapéutico de LbpB, tal como vacunación contra enfermedad causada por Neisseria.

Antecedentes de la invención

La meningitis es de origen bacteriano o vírico, siendo de lejos la bacteriana la más grave. Las bacterias principalmente responsables son Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae. Desde el lanzamiento de una vacuna conjugada contra H. influenzae tipo B (Hib), y su integración en la vacunación rutinaria de lactantes, N. meningitidis se está convirtiendo en la causa principal de la meningitis por todo el mundo, estimándose 2.600 casos por año solamente en los Estados Unidos.

La especie N. meningitidis se divide en 13 serogrupos de acuerdo con la composición de los polisacáridos de la cápsula. Además, cada serogrupo se subclasifica en serotipos, subtipos, e inmunotipos en base a otros componentes de las bacterias. Tres serogrupos (A, B, y C) suponen más del 90% de los casos de meningitis, y en las naciones desarrolladas e industriales, el serogrupo B es el responsable del 50 al 80% de los casos.

Existen vacunas eficaces basadas en polisacáridos de la cápsula para prevenir meningitis causada por N. meningitidis de los serogrupos A y C. Las vacunas de polisacáridos del serogrupo C no producen un efecto protector en niños de menos de 2 años de edad (el intervalo de edad donde existe un mayor riesgo de desarrollar meningitis), sin embargo esta desventaja puede superarse conjugando esos polisacáridos con una proteína vehículo. La conjugación tiene la ventaja adicional de inducir una memoria inmunológica contra el antígeno.

Por el contrario, el polisacárido de N. meningitidis del serogrupo B muestra poca o ninguna inmunogenicidad en el hombre, sin importar si está o no de una forma conjugada. Por lo tanto, sería muy deseable obtener una vacuna contra enfermedad causada por Neisseria inducida por N. meningitidis (en particular del serogrupo B) diferente de una vacuna basada en polisacáridos.

Una clase de candidatos a la vacuna prometedora son los que usan las proteínas externas de membrana (OMP) de N. meningitidis, porque pueden proporcionar antígenos que son inmunogénicos y accesibles a la respuesta inmune humana. Las OMP responsables de la captación de hierro en la célula son particularmente prometedoras.

El hierro es un nutriente esencial para la mayoría de las bacterias. En los compartimentes extracelulares del cuerpo humano el hierro está complejado principalmente con transferrina en el suero y con lactoferrina en las superficies de las mucosas (Finkelstein y col., 1983), con cantidades insignificantes en forma libre. Por lo tanto, la adquisición eficaz de hierro es un factor de virulencia importante para las bacterias patogénicas. Teniendo en cuenta N. meningitidis en particular (un patógeno estricto del hombre), sus requerimientos de hierro se alcanzan usando receptores para proteínas quelantes de hierro humanas, tales como transferrina o lactoferrina, que permiten a la célula unirse a estas proteínas y en lo sucesivo tomar el hierro necesario para su crecimiento. La síntesis de esas proteínas receptoras se induce cuando la bacteria detecta limitación de hierro.

Las proteínas receptoras implicadas en la captación de hierro de la transferrina, TbpA y TBPB (Cornelissen y col., 1992; Legrain y col., 1993; Anderson y col., 1994) y de la proteína de unión a lactoferrina A (LpbA) (Pettersson y col., 1993; 1994b; Biswas y Sparling, 1995) se han clonado y secuenciado. Las proteínas receptoras de unión a transferrina forman un complejo en la membrana externa. En N. meningitidis, tanto TbpA como TbpB parecen ser necesarias para el transporte de hierro (Irwin y col., 1993). TbpA es una proteína integral de la membrana, mientras que TbpB es una lipoproteína y está anclada a la membrana solamente con su resto lipídico. El modelo actual para el mecanismo del receptor propone que la transferrina cargada con hierro se une al complejo receptor. En este complejo, la proteína TbpB distingue entre transferrina con hierro y apotransferrina. La unión de la transferrina da como resultado el cambio conformacional en el receptor, que libera el hierro de la transferrina y abre un poro en TbpA, y el hierro puede transportarse a lo largo de la membrana externa (Cornelissen y Sparling, 1994; 1996).

También se piensa que receptor de lactoferrina es un factor de virulencia importante de N. meningitidis. El sitio principal de entrada en el cuerpo humano es la nasofaringe, donde la lactoferrina es la fuente principal de hierro. Además, informes anteriores muestran que la lactoferrina es capaz de cruzar la barrera sangre-cerebro en la inflamación aguda (Gschwentner y col., 1997). Es posible que la lactoferrina sea también una fuente importante de hierro para los meningococos en una etapa tardía de infección, cuando las bacterias han alcanzado las meninges. Usando un procedimiento de aislamiento por afinidad, se identificó originalmente una única proteína de unión a lactoferrina (Schryvers y Morris, 1988). El gen estructural para este receptor, denominado LpbA, se ha caracterizado (Pettersson y col., 1993; 1994b; Biswas y Sparling, 1995) y se ha propuesto un modelo de topología para la proteína de la membrana externa (Pettersson y col., 1994a). La proteína muestra homología a TbpA. Además, se identificó parte de un posible marco de lectura abierto cadena arriba del gen lbpA, y la secuencia de aminoácidos deducida mostraba homología a TbpB (Pettersson y col., 1994a), La Solicitud de Patente canadiense CA-A-2 162 193 (Connaught Laboratories Limited) describe una proteína receptora de lactoferrina aislada y purificada a partir de de patógenos bacterianos.

TbpB y otras OMP de meningococos purificadas han sido objeto de solicitudes de patentes previas con respecto a su uso como vacunas contra N. meningitidis (por ejemplo TbpB, WO 9307172; 22 kDa surface protein, WO 9629412; haemoglobin receptor, WO 9612020; porin protein, WO 9503413; pilin protein, WO 9408013; 64 kDa OMP, EP 474313-B1).

Existe una necesidad de identificación y caracterización de otros miembros de la familia de OMP que puedan jugar un papel en la prevención, mejora, o corrección de disfunciones o enfermedades, incluyendo, aunque sin limitación, enfermedades causadas por Neisseria (por ejemplo meningitis).

Los anticuerpos contra LbpA no parecen ser bactericidas y pueden ser por lo tanto de uso limitado como un candidato de vacuna (Pettersson y col., 1993).

Esta invención identifica y caracteriza otra proteína receptora de unión a lactoferrina, la proteína de unión a lactoferrina B (LbpB), su papel en la utilización del hierro de la lactoferrina, y sus usos terapéuticos.

Hay varias ventajas que LbpB tiene sobre los otros candidatos de vacuna de OMP. En primer lugar, en la etapa de transporte por la sangre de la enfermedad causada por meningococos la lactoferrina humana es esencial en el organismo y tiene una afinidad 300 veces mayor para unirse al hierro que la transferrina humana, y por tanto el uso de lactoferrina como fuente de hierro es esencial para el organismo. En segundo lugar, la lactoferrina tiene un efecto antibacteriano conocido, y su concentración en la sangre aumenta después de la infección. También es importante para el organismo la unión de lactoferrina humana como una vía para ganar alguna resistencia a este efecto. Por último, la lactoferrina humana es la fuente principal de hierro para N. meningitidis en el lugar de entrada de la bacteria al cuerpo humano (la nasofaringe).

El significado de estas ventajas es que los antígenos de LbpB podrían expresarse en la superficie celular de la amplia mayoría de meningococos en el cuerpo, ya que es probable que el dominio de la superficie celular de LbpB se conserve porque debe unirse eficazmente a lactoferrina, y una respuesta inmune eficaz dirigida contra el antígeno de LbpB podría no solamente detener cualquier infección de meningococos en la sangre, sino que también podría detener incluso el transporte del organismo en la nasofaringe.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a vacunas que comprenden polipéptidos no unidos a lípidos de LbpB y materiales recombinantes y procedimientos para su producción. Otro aspecto de la invención se refiere a procedimientos para usar dichas vacunas de polipéptidos de LbpB. Dichos usos incluyen la prevención y tratamiento de enfermedad causada por Neisseria (por ejemplo meningitis), entre otros.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Análisis de transferencia de Western de proteínas de cultivo de células completas con limitación de hierro. Las pistas 1 y 5, cepa BNCV; pistas 2 y 6, lbpA mutante CE1452; pistas 3 y 7, lbpB mutante CE1454; pistas 4 y 8, lbpAB mutante CE1402. Los antisueros usados se dirigieron contra péptidos sintéticos, en base a la secuencia de LbpB. Pistas 1 a 4, suero 17-3 contra el péptico C1. Pistas 5 a 8, suero 19-1 contra el péptido E1. Las posiciones de los patrones de tamaño molecular se indican a la derecha en miles. La proteína LbpB está marcada con una flecha a la izquierda.

Figura 2. Mapa de restricción de los fragmentos de ADN que contienen los genes de lbpB y lbpA de la cepa BNCV. Los insertos en los diferentes plásmidos recombinantes y el producto de PCR (PCR) se muestran como cajas abiertas. Los plásmidos pAM23 y pAM1 contienen fragmentos del locus de lbpBA que se caracterizaron previamente (Pettersson y col. 1993, 1994a). Los marcos de lectura abiertos están marcados mediante flechas rellenas. Las sondas, usadas para explorar la biblioteca o para transferencia de Southern se muestran sobre los marcos de lectura abiertos. La posición de los cebadores usados para las amplificaciones de PCR se muestra por debajo de los marcos de lectura abiertos. El sitio de inserción de la caja de resistencia a kanamicina en pAM6K se muestra mediante un triángulo abierto. La caja de resistencia a eritromicina en pAM23E se muestra mediante un triángulo cerrado.

Figura 3. Alineación de las proteínas LbpB de la cepa BNCV y TbpB de la cepa B16B6. Se marcan los aminoácidos idénticos mediante rayas. Las cantidades a la derecha indican la posición de los aminoácidos. Se introdujeron huecos (-) para alcanzar al alineación óptima. Los péptidos usados para inmunizar a los ratones se indican encima de la secuencia de LbpB. Se subrayan dos tramos ricos en restos cargados negativamente. El supuesto sitio de escisión de la peptidasa II de señal, se muestra con una flecha por encima de la secuencia.

Figura 4. Secuencia del área promotora cadena arriba de LbpB. El sitio de inicio de la traducción (ATG) está marcado en negrita. El sitio de unión al ribosoma, y las supuestas cajas -10 y -35 se subrayan (línea gruesa y línea fina respectivamente). La supuesta caja Fur está encerrada dentro de un cuadrado.

Figura 5. Análisis de transferencia de Western de proteínas de cultivo de células completas en medio TSB (pistas 1, 3, 5 y 7) o en TSB con EDDA (pistas 2, 4, 6 y 8). Los anticuerpos usados fueron mn98kl y mn98k2 monoclonales dirigidos contra LbpA (Panel A) o antisuero 17-3 contra péptido C1 de LbpB (Panel B). Pistas 1 y 2 cepa BNCV; pistas 3 y 4, lbpA mutante CE1452; pistas 5 y 6, lbpB mutante CE1454; pistas 7 y 8 lbpAB mutante CE1402.

Figura 6. Análisis de transferencia de Western de proteínas de las membranas externas de la cepa BNCV de meningococos cultivada con limitación de hierro. Las proteínas de la membrana externa se sometieron a electroforesis en condiciones no desnaturalizantes y la proteína LbpB se detectó con el suero dirigido contra el péptido A1 sintético. Las pistas 1 y 2 muestran muestras incubadas a 0ºC y 95ºC, respectivamente antes de la electroforesis. Las posiciones de los patrones de tamaño molecular se indican a la derecha en miles. B. Ensayo de unión a lactoferrina en una transferencia de Western con proteínas de complejos de la membrana externa de la cepa BNCV de meningococos cultivada con limitación de hierro. Las proteínas de los complejos de la membrana externa se sometieron a electroforesis en condiciones no desnaturalizantes y la transferencia se incubó con lactoferrina humana acoplada a peroxidasa. Las pistas 1 a 3 muestran muestras incubadas a 0ºC, 37ºC y 95ºC, respectivamente antes de la electroforesis. Las posiciones de los patrones de tamaño molecular se indican a la derecha en miles.

Figura 7. Unión de lactoferrina a mutantes de lbp en un ensayo de tipo ELISA de células completas. Las cepas, indicadas a la derecha, se depositaron en los pocillos. Se añadió lactoferrina en concentraciones de 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 y 0 ng/ml (filas 1-8 respectivamente). La lactoferrina unida a las células se detectó con antisuero específico para lactoferrina conjugada con peroxidasa.

Figura 8. Ensayos de carga de placas de cepas con lactoferrina humana recombinante. Solamente se muestra la parte relevante de la placa. Las células de las cepas indicadas a la derecha se colocaron en placas de restricción de hierro. Se estimuló el crecimiento mediante gotas de lactoferrina a las concentraciones indicadas, controladas después del crecimiento mediante una noche. Las flechas muestran la posición de las gotas en el Panel B. En este experimento se usó la lactoferrina saturada con hierro al 11%.

Figura 9. Alineación de las proteínas LbpB de cinco cepas de meningococos. La alineación se realizó con el programa CLUSTAL (PC Gene, IntelliGenetics), y se optimizó a mano. Las cantidades a la derecha indican las posiciones de los aminoácidos. Se introdujeron huecos (-) para conseguir una alineación óptima. Las posiciones donde las cinco secuencias eran idénticas, están marcadas con un asterisco.

Figura 10. A. Mapas de restricción de las partes relevantes de pJP29 (Bosch y col., 1986), pAM31 y pAM32. Solamente se muestran los insertos. El vector es pACYC184. pJP29 contiene el gen phoE (en gris claro) detrás de su propio promotor. El promotor y las secuencias que lo flanquean están en blanco. El sitio PstI está en el borde de las secuencias que corresponden a la secuencia señal y a la parte madura de la proteína PhoE. pAM31 contiene, de izquierda a derecha: el promotor de PhoE (en blanco), y un gen recombinante que codifica la secuencia señal de PhoE (gris claro) y la LbpB madura (negro). Los fragmentos de ADN correspondientes al extremo N de LbpA (gris oscuro), el extremo C de PhoE (gris claro), y las secuencias que lo flanquean (blanco) también están presentes. pAM32 se construyó a partir de pAM31 insertando un engarce (la caja rayada), que codifica una marca His y un sitio de escisión del factor Xa, en el sitio PstI de pAM31. Véase el Ejemplo 8 para detalles sobre la construcción de pAM31 y pAM32. Los sitios de restricción en pAM32 están enmarcados con corchetes, puesto que se pierden durante el procedimiento de clonación.

B. Las secuencias de aminoácidos de la construcción LbpB recombinante (por debajo) en comparación con la secuencia de LbpB de tipo silvestre (por encima). Solamente se muestran el primer y el último resto de aminoácidos de las secuencias señal de LbpB/PhoE y LbpB madura respectivamente. La marca His y el sitio de escisión del factor Xa se muestran en su totalidad. Las peptidasas líder I y II (LPasa I y II, respectivamente) y los sitios de escisión del factor Xa se muestran mediante flechas.

Figura 11. PAGE de la proteína LbpB recombinante purificada. Las pistas 1 y 2 muestran muestras incubadas a 0ºC y 100ºC, respectivamente, antes de la electroforesis. Las posiciones de los patrones de peso molecular se indican a la derecha en kDa.

Figura 12. Transferencia de Western con LbpB recombinante plegada (pistas 1, 3, 5, 7, y 9) y desnaturalizada (pistas 2, 4, 6, 8, y 10) con sueros de cinco seres humanos convalecientes. Pistas 1 y 2, suero 69; pistas 3 y 4, suero 262439; pistas 6 y 5, suero 262532; pistas 7 y 8, suero 263017, pistas 9 y 10, suero 330. Las posiciones de los patrones de tamaño molecular se indican a la derecha en kilodaltons. Las flechas a la izquierda indican las posiciones de la LbpB desnaturalizada (dLbpB) y plegada (fLbpB).

Figura 13. Resultados del ELISA anti célula completa y anti-LbpB (Tabla 7) realizados como se describe en el Ejemplo 10. A. Respuesta anti-LbpB en ratones inmunizados con LbpB o células completas de N. meningitidis cepa BNCV. Se realizó una inmunización de control con solución de PBS. B. Respuesta anti célula completa (cepa BNCV cultivada en condiciones de deficiencia de hierro) en ratones inmunizados con LbpB o células completas de N. meningitidis de la cepa BNCV. Se realizó una inmunización de control con solución de PBS. C. Respuesta anti célula completa (cepa H44/36 cultivada en condiciones de deficiencia de hierro) en ratones inmunizados con LbpB o células completas de N. meningitidis cepa BNCV. Se realizó una inmunización de control con solución de PBS.

Figura 14. Resultados de las actividades bactericidas (tabla 8) de los sueros anti célula completa y anti cepa BNCV de LbpB realizados como se describe en el Ejemplo 10. A. Título bactericida contra N. meningitidis de la cepa H44/36 (cultivada en condiciones ricas en hierro). B. Título bactericida contra N. meningitidis cepa H44/76 (cultivada en condiciones de agotamiento de hierro).

Descripción de la invención Definiciones

Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de ciertos términos usados frecuentemente en este documento.

"LbpB" se refiere generalmente a un polipéptido, preferiblemente una lipoproteína, que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10, o una variante alélica de las mismas.

"Actividad de LbpB o actividad del polipéptido LbpB" o "actividad biológica de LbpB o del polipéptido LbpB" se refiere a la función metabólica o fisiológica de dicho LbpB incluyendo actividades similares. Específicamente, la actividad de LbpB es la capacidad de unirse a la lactoferrina humana. Esta actividad de LbpB puede ensayarse usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 6. También se incluyen en esta definición las actividades antigénica e inmunogénica de dicho LbpB. Esta antigenicidad puede ensayarse usando el procedimiento de inmunotransferencia descrito en el Ejemplo 9, preferiblemente usando suero policlonal contra LbpB de la cepa BNCV de meningococos como se describe en el Ejemplo 10A. La inmunogenicidad puede ensayarse midiendo las respuestas de anticuerpos (usando suero policlonal generado contra la variante) en ELISA usando LbpB purificado de la cepa BNCV de meningococos, como se describe en el Ejemplo 10B.

"Gen lbpB" se refiere a un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos 100-2274 que se muestra en la SEC ID Nº: 1, o la secuencia de nucleótidos completa que se muestra en la SEC ID Nº: 3, 5, 7, ó 9, o variantes alélicas de las mismas y/o sus complementos.

"Anticuerpos" como se usa en este documento incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como fragmentos Fab, incluyendo los productos de un Fab u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulina.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural. Si una composición o sustancia "aislada" se produce en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su entorno original, o las dos cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales con los que coexiste en su estado natural está "aislado", como se emplea el término en este documento.

"Polinucleótido" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. "Polinucleótidos" incluyen, sin limitación ADN de cadena sencilla y doble, ADN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble, ARN de cadena sencilla y doble, y ARN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de cadena sencilla o, más típicamente, de cadena doble o una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble. Además, "polinucleótido" se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término polinucleótido incluye también ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas y ADN y ARN con estructuras modificadas para la estabilidad o por otras razones. Bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se ha preparado una diversidad de modificaciones al ADN y al ARN; por tanto, "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de polinucleótidos que se encuentran típicamente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN características para virus y células. "Polinucleótido" también abarca polinucleótidos relativamente cortos, denominados a menudo oligonucleótidos.

"Polipéptido" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos. "Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas largas, denominadas generalmente proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por los genes. "Polipéptidos" incluye secuencias de aminoácidos modificadas mediante procedimientos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que se conocen bien en la técnica. Dichas modificaciones se describen bien en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la amplia bibliografía de investigación. Pueden producirse modificaciones en cualquier lugar de un polipéptido, incluyendo la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Se entenderá que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o en diferentes grados en varios sitios en un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ramificarse como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y ramificados cíclicos pueden ser el resultado de procedimientos postraduccionales naturales o pueden prepararse mediante procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de un lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, unión cruzada, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclas GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesos proteolíticos, fosforilación, prenilación, racemización, selenioilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN transferente tales como arginilación, y ubiquitinación. Véase, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, págs. 1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter y col., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646 y Rattan y col., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62.

"Variante" como se usa el término en este documento, es un polinucleótido o polipéptido que es diferente de un polinucleótido o polipéptido de referencia respectivamente, pero que retiene sus propiedades biológicas esenciales. Una variante típica de un polinucleótido es diferente en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o pueden no alterar la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el nucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se describe a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de modo que la secuencia del polipéptido de referencia y la variante son bastante similares en general, y en muchas regiones idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en secuencias de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede o puede no ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de producción natural tal como una variante alélica (por ejemplo, SEC ID Nº: 3, 5, 7 ó 9 son variantes del polinucleótido lbpB de la SEC ID Nº: 1; y SEC ID Nº: 4, 6, 8 ó 10 son variantes del polipéptido LbpB de la SEC ID Nº: 2), o puede ser una variante que no se sabe que se produzca de forma natural. Las variantes de producción no natural de polinucleótidos y polipéptidos pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa. Las variantes deben retener una o más de las actividades biológicas del polipéptido LbpB. Deben ser capaces de unirse a la lactoferrina humana (preferiblemente como se describe en el ensayo para esta actividad en el Ejemplo 6), o tener actividades antigénicas o inmunogénicas similares a las de LbpB. La antigenicidad puede ensayarse usando el procedimiento de inmunotransferencia descrito en el Ejemplo 9, preferiblemente usando sueros policlonales contra LbpB de la cepa BNCV de meningococos como se describe en el Ejemplo 10A. La inmunogenicidad puede ensayarse mejor midiendo la respuesta de anticuerpos (usando sueros policlonales generados contra la variante) en ELISA usando LbpB purificada de la cepa BNCV de meningococos, como se describe en el Ejemplo 10B. Preferiblemente, una variante retendría todas las actividades biológicas anteriores.

"Identidad" es una medida de la identidad de las secuencias de nucleótidos de o de secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias se alinean de modo que se obtenga la coincidencia de orden más alto. "Identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas. Véase, por ejemplo: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed., Academic Press, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heijne, G., Academic Press, 1987; y SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Donde existe varios procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" se conoce bien por los especialistas en la técnica (Carillo, H., y Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073). Los procedimientos comúnmente empleados para determinar la identidad o la similitud entre dos secuencias incluyen, aunque sin limitación, los descritos en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H., y Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073. Los procedimientos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas de ordenador. Los procedimientos informáticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, aunque sin limitación, el grupo de programas GCS (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. y col., J Molec Biol (1990) 215:403).

Como ilustración, por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 95% de "identidad" con una secuencia de nucleótidos de referencia de la SEC ID Nº: 1, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir de media hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia de la SEC ID Nº: 1. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos el 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede delecionarse o sustituirse con otros nucleótidos, o puede insertarse en la secuencia de referencia una cantidad de nucleótidos de hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones 5' ó 3' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas o individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

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De forma similar, por polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos, por ejemplo, el 95% de "identidad" a una secuencia de aminoácidos de referencia de la SEC ID Nº: 2 se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polipéptidos puede incluir de media hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia de la SEC ID Nº: 2. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los restos de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse con otro aminoácido, o pueden insertarse en la secuencia de referencia una cantidad de aminoácidos de hasta el 5% de los restos de aminoácidos totales en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas de forma individual entre dos restos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Vacunas de polipéptido de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a vacunas que comprenden polipéptidos LbpB (o proteínas LbpB). Los polipéptidos LbpB incluyen los polipéptidos de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 ó 10 (los restos 1-18 es el péptido señal natural de cada una de las proteínas, y el resto Cys19 es el aminoácido N-terminal que está unido a un lípido en la proteína madura natural); así como polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 ó 10; y polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad a la de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10, a lo largo de toda su longitud, y aún más preferiblemente al menos el 80% de identidad, e incluso aún más preferiblemente al menos el 90% a la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10. Además, se prefieren aquellas con al menos 95-99% de identidad. También se incluyen dentro de polipéptidos LbpB polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 ó 10 durante toda su longitud, y aún más preferiblemente el 80% de identidad, e incluso aún más preferiblemente al menos el 90% de identidad a la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10. Además, se prefieren aquellas con al menos el 95-99% de identidad.

Los polipéptidos LbpB que se proporcionan en la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, y 10 son los polipéptidos LbpB de las cepas BNCV, M981, H44/76, M990 y 881607 de Neisseria meningitidis respectivamente.

Los polipéptidos LbpB pueden estar en forma de la proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína mayor tal como una proteína de fusión. Puede ser ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o líder (tal como la secuencia líder de LbpB natural; restos 1-18 en la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 y 10), prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como múltiples restos de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante.

También se incluyen en la invención fragmentos de los polipéptidos LbpB. Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma que una parte, pero no toda, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos LbpB anteriormente mencionados. Como en los polipéptidos LbpB, los fragmentos, pueden estar "en forma libre", o comprendidos dentro de un polipéptido mayor del que forman una parte o región, más preferiblemente como una única región continua. Ejemplos representativos de fragmentos de polipéptidos de la invención, incluyen, por ejemplo, fragmentos de aproximadamente los aminoácidos 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100 y 101 hasta el final del polipéptido LbpB. En este contexto "aproximadamente" incluye los intervalos enumerados particularmente más grandes o más pequeños en varios, 5, 4, 3, 2 ó 1 aminoácido en un extremo o en ambos extremos.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen la secuencia de aminoácidos de polipéptidos LbpB, excepto por la deleción de una serie continua de restos que incluyen el extremo amino, o una serie continua de restos que incluye el extremo carboxilo y/o la región transmembrana o la deleción de dos series continuas de restos, una que incluye el extremo amino y una que incluye el extremo carboxilo. También se prefieren fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden alfa hélices y regiones formadoras de alfa hélices, láminas beta, y regiones formadoras de láminas beta, giros y regiones formadoras de giros, espirales y regiones formadoras de espirales, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie, regiones de unión a sustrato, y regiones con un alto índice antigénico. Otros fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son aquellos que median en la actividad de LbpB, incluyendo aquellos con una actividad similar o una actividad mejorada, o con una actividad no deseada disminuida. También se incluyen aquellos que son antigénicos o inmunogénicos en una animal, especialmente en un ser humano.

Los fragmentos deben retener una o más de las actividades biológicas del polipéptido LbpB. Preferiblemente, los fragmentos de polipéptido deben ser tramos continuos (por encima de 16 aminoácidos) de secuencia de aminoácido obtenida de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10 que tienen una actividad biológica antigénica o inmunogénica que también posee el polipéptido LbpB de longitud completa del que se obtiene.

Las variantes de la secuencia definida y los fragmentos también forman parte de la presente invención. Las variantes preferidas son aquellas que varían de las referencias en sustituciones de aminoácidos conservativas, es decir, aquellas que sustituyen un resto con otro de similares características. Las sustituciones típicas son entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los restos básicos Lys y Arg; o restos aromáticos de Phe y Tyr. Se prefieren particularmente las variantes en las que se sustituyen varios, 5-10, 1-5, ó 1-2 aminoácidos, se delecionan o se añaden en cualquier combinación.

Las variantes más preferidas son aquellas que varían de las de referencia en sustituciones de aminoácidos que se encuentran en posiciones estructuralmente equivalentes (como se muestra en una alineación de homología) en otras secuencias de LbpB (por ejemplo alineamientos de homología de 5 secuencias de LbpB mostrados en la Figura 9). Las variantes especialmente preferidas comprenden la secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 65% de identidad con la secuencia de referencia (por ejemplo SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10) durante toda su longitud, y aún más preferiblemente al menos el 70% de identidad, y aún más preferiblemente al menos el 80% de identidad, e incluso aún más preferiblemente al menos el 90% de identidad. Además, aquellos con al menos el 95-99% de identidad se prefieren más. Por ejemplo, en la Figura 9 si LbpB de BNCV es la secuencia de referencia, una variante podría abarcar restos 300-308 reemplazados con cualquiera de los restos en las posiciones equivalentes en las secuencias de LbpB de la cepa H44/76 (restos 305-313 respectivamente), cepa M990 (restos 307-315 respectivamente), cepa M981 (restos 302-310 respectivamente), o cepa 881607 (restos 303-311 respectivamente). La secuencia de aminoácidos STDVATNLA podría por ejemplo sustituirse por NPDLAKSHA [ST (de M981 restos 302-303), D (de BNCV resto 302), V (de 881607 resto 306), A (de M990 resto 311), T (de H44/76 resto 310), NLA (de M990 restos 313-315)] y la proteína resultante podría clasificarse como una variante, y un polipéptido de la invención.

Dichas sustituciones también pueden incluir deleciones, por ejemplo, si se delecionan los restos 357-366 de LbpB de la cepa M981 (puesto que no hay posiciones equivalentes de aminoácidos de LbpB de la cepa BNCV - véase Figura 9) dicha proteína podría constituir una variante, y un polipéptido de la invención.

Además, se sabe bien que los genomas de Neisseria meningitidis y otras cepas de Neisseria (por ejemplo Neisseria gonorrhoeae) son genómicamente muy homólogas entre sí. Los genomas de Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis (llamada originalmente Neisseria catarrhalis) también son lo suficientemente homólogos como para permitir que tenga lugar el intercambio de genes. Las proteínas equivalentes de LbpB (o variantes alélicas de LbpB) de las cepas de Neisseria y de las cepas de Moraxella catarrhalis también constituyen polipéptidos de la invención si satisfacen los criterios de porcentaje de identidad de secuencia descrito anteriormente. Y además, dichas proteínas equivalentes podrían también constituir polipéptidos de la invención si compartieran preferiblemente al menos el 70% de similitud de secuencia con una de las secuencias de referencia (SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 ó 10) durante toda su longitud según lo medido con el programa BLAST (Altschul, S. F. y col., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Karlin, S. y Altschul, S. F. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. y Altschul, S. F. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7), y más preferiblemente al menos el 80% de similitud, y aún más preferiblemente al menos el 90%. Además, se prefieren más aquellas con al menos el 95-99% de identidad. Dichas proteínas deben unirse a la lactoferrina humana (por definición), y también deben ser capaces de reaccionar de forma cruzada con sueros policlonales contra LbpB de cepas de meningococos. La secuencia de aminoácidos precisa de dichas variantes puede determinarse fácilmente usando información de las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos de meningococos de la SEC ID Nº: 1-10.

Los polipéptidos de LbpB de la invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Dichos polipéptidos incluyen lipopolipéptidos que se producen de forma natural aislados, polipéptidos o lipopolipéptidos producidos de forma recombinante, polipéptidos producidos de forma sintética, o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar dichos polipéptidos se comprenden bien en la técnica.

Polinucleótidos para uso en el procedimiento de preparación de una vacuna

Los polinucleótidos de LbpB incluyen polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos y fragmentos de LbpB y polinucleótidos relacionados estrechamente con los mismos. Más específicamente, polinucleótidos LbpB incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, ó 9 que codifica un polipéptido LbpB de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10 respectivamente, y un polinucleótido que tiene la secuencia particular de la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, ó 9. Los polinucleótidos LbpB incluyen además un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 65% de identidad durante toda su longitud con una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido LbpB de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 65% idéntica a la de la SEC ID Nº: 1 del nucleótido 100 al nucleótido 2274, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 65% idéntica a la de la SEC ID Nº: 3, 5, 7, ó 9. A este respecto, se prefieren más los polinucleótidos al menos el 70% idénticos, se prefieren particularmente polinucleótidos al menos el 80% idénticos, y se prefieren especialmente aquellos con al menos el 90% de identidad. Además, se prefieren altamente aquellos con al menos el 95% de identidad y aquellos con al menos el 98-99% de identidad se prefieren más altamente, siendo los más preferidos aquellos con al menos el 99% de identidad. También se incluyen en polinucleótidos LbpB una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad suficiente con una secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, ó 9 para hibridar en condiciones útiles para la amplificación o para uso como una sonda o marcador. También se incluyen polinucleótidos que son complementarios a dichos polinucleótidos LbpB.

Los polinucleótidos LbpB proporcionados en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, y 9 son los polinucleótidos LbpB de las cepas BNCV, M981, H44/76, M990, y 881607 de Neisseria meningitidis respectivamente.

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La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido LbpB de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10 puede ser idéntica a la secuencia que codifica polipéptidos contenida en los nucleótidos 100 a 2274 de la SEC ID Nº: 1, o la secuencia que codifica polipéptidos de la SEC ID Nº: 3, 5, 7, ó 9 respectivamente, o puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10.

Cuando los polinucleótidos se usan para la producción recombinante de polipéptido LbpB, el polinucleótido puede incluir una secuencia para la proteína madura (resto 19 del extremo C de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, y 10) o un fragmento de la misma, por sí mismo; la secuencia codificante para el polipéptido maduro o un fragmento en marco de lectura con otras secuencias codificantes, tales como las que codifican una secuencia líder o secretora, una secuencia pre o pro o prepro proteína, u otras porciones de fusión a péptidos (por ejemplo restos 1 a 18 de la SEC ID Nº: 2, la secuencia señal natural de la LbpB). Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen Inc.) como se describe en Gentz y col., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:821-824, o es una marca HA, o es glutatión-s-transferasa. También se prefiere LbpB fusionado con su secuencia señal natural (restos 1 a 18 de la SEC ID Nº: 2). El polinucleótido puede contener también secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como secuencias transcritas no traducidas, señales de corte y empalme y de poliadenilación, sitios de unión al ribosoma y secuencias que estabilizan el ARNm.

Otras realizaciones preferidas son polinucleótidos que codifican variantes del polipéptido LbpB descritas anteriormente. Más preferiblemente comprenden la secuencia de aminoácidos del polipéptido LbpB de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10 en la que varios restos de aminoácido 10-25, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 se sustituyen, delecionan o añaden, en cualquier combinación, y retienen al menos una de las actividades biológicas del polipéptido LbpB.

Otras realizaciones son polinucleótidos que hibridan con las secuencias descritas anteriormente en este documento. A este respecto, otras realizaciones se refieren especialmente a polinucleótidos que hibridan en condiciones estrictas con los polinucleótidos descritos anteriormente en este documento. Como se usa en este documento, la expresión "condiciones estrictas" significa que la hibridación se producirá solamente si existe al menos un 80%, y preferiblemente al menos un 90%, y más preferiblemente al menos un 95%, e incluso más preferiblemente un 97-99% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que son idénticos o suficientemente idénticos a una secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, ó 9 o un fragmento de la misma, pueden usarse como sondas de hibridación para ADNc y ADN genómico, para aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican polipéptido LbpB y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes (incluyendo genes que codifican homólogos y ortólogos de especies diferentes de Neisseria meningitidis) que tienen una alta similitud de secuencia con el gen LbpB. Dichas técnicas de hibridación se conocen por los especialistas en la técnica. Típicamente estas secuencias de nucleótidos son idénticas en el 80%, preferiblemente idénticas en el 90%, más preferiblemente idénticas en el 95% a las de referencia. Las sondas generalmente comprenderán al menos 15 nucleótidos. Preferiblemente dichas sondas tendrán al menos 30 nucleótidos y pueden tener al menos 50 nucleótidos. Las sondas particularmente preferidas variarán entre 30 y 50 nucleótidos.

En una realización, para obtener un polinucleótido que codifica un polipéptido LbpB, incluyendo homólogos y ortólogos de especies diferentes de Neisseria meningitidis, comprende las etapas de explorar una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas con una sonda marcada que tiene una secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, ó 9 o un fragmento de la misma; y aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos. De este modo, en otro aspecto, los polinucleótidos LbpB incluyen además una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones estrictas con una secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, ó 9 o un fragmento de la misma. También se incluyen como polipéptidos LbpB polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos obtenidas mediante las condiciones de hibridación anteriores. Dichas técnicas de hibridación se conocen bien por los especialistas en la técnica. Las condiciones de hibridación estrictas son como se han descrito anteriormente o, como alternativa, condiciones en incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavar los filtros en SSC 0,1x a aproximadamente 65ºC.

Los polipéptidos descritos en este documento de la presente invención pueden emplearse como reactivos de investigación y materiales para el descubrimiento, tratamientos y diagnóstico de enfermedades animales y humanas.

Vectores, Células Huésped, Expresión, para uso en el procedimiento de preparación de una vacuna

Las vacunas de la invención se preparan opcionalmente usando células huésped que se manipulan genéticamente con vectores que contienen polinucleótidos y codifican LbpB, y para la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de traducción sin células también pueden emplearse para producir dichas proteínas usando ARN obtenidos de las construcciones de ADN descritas. Para la producción recombinante, pueden manipularse células huésped para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos para los polinucleótidos descritos. La introducción de polinucleótidos en células huésped puede efectuarse mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) tales como transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por cationes lipídicos, electroporación, transducción, carga por raspado, introducción balística o infección.

Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tal y como células de meningococos, estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces, y Bacillus subtilis; células de hongos, tales como células de levadura y células de Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoplera Sf9; células de animales tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 y células de melanoma del intestino; y células vegetales.

Pueden usarse una gran diversidad de sistemas de expresión; dichos sistemas incluyen, entre otros, sistemas obtenidos de cromosomas, episomas y virus, por ejemplo, vectores obtenidos de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papova virus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus pseudorabies y retrovirus, y vectores obtenidos de combinaciones de los mismos, tales como los obtenidos de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como promueven la expresión. Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos para producir un polipéptido en un huésped. La secuencia de nucleótidos apropiada puede insertarse en un sistema de expresión mediante cualquiera de diversas técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las que se muestran en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra).

Para la secreción de la proteína traducida en la luz del retículo endoplasmático, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido deseado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido (restos 1 a 18 de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, ó 10) o pueden ser señales heterólogas.

Para expresar LbpB recombinante unida a lípidos, se codifica preferiblemente el péptido señal endógeno en la construcción génica, y el sistema huésped preferido podría ser un huésped bacteriano.

Si el polipéptido LbpB se expresa para uso en ensayos de exploración, generalmente, se prefiere que el polipéptido se produzca en la superficie de la célula. En este caso, las células pueden recogerse antes del uso en el ensayo de exploración. Si el polipéptido LbpB se secreta en el medio, el medio puede recuperarse para recuperar y purificar el polipéptido; si se produce de forma intracelular, las células deben lisarse primero antes de que se recupere el polipéptido.

Los polipéptidos LbpB pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos en la técnica incluyendo precipitación con sulfato de amonio y etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, y cromatografía de lectina. Más preferiblemente, se emplea cromatografía líquida de alta resolución para la purificación. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para el replegamiento de proteínas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante el aislamiento o la purificación.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un mamífero (preferiblemente un ser humano) que comprende inocular al mamífero polipéptido LbpB o fragmentos que llevan el epítope, análogos, vesículas de la membrana externa o células (atenuadas o de otra manera), adecuadas para producir anticuerpos y/o respuesta inmune de células T para proteger a dicho animal de enfermedades causadas por Neisseria, entre otras. Otro aspecto más de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un mamífero (preferiblemente un ser humano) que comprende, suministrar polipéptido LbpB mediante un vector que dirige la expresión del polinucleótido LbpB in vivo para inducir una respuesta inmunológica para producir anticuerpos para proteger a dicho animal de las enfermedades.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica o formulación de vacuna que, cuando se introduce en un huésped mamífero (preferiblemente un ser humano), induce una respuesta inmunológica en este mamífero a un polipéptido LbpB en la que la composición comprende un gen LbpB, o un polipéptido LbpB o fragmentos que llevan el epítope, análogos, vesículas de la membrana externa o células (atenuadas o de otra manera). La formulación de vacuna puede comprender además un vehículo adecuado. La composición de vacuna de LbpB se administra preferiblemente por vía oral o por vía parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, etc.). Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyección acuosa o no acuosa estéril que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del receptor; y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis única o multidosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales y pueden almacenarse en condiciones de congelación en seco requiriendo solamente la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso. La formulación de vacuna también puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación tales como sistemas de aceite en agua y otros sistemas conocidos en la técnica. La dosificación dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede determinarse fácilmente mediante experimentación rutinaria.

Wolff y col., Science, (1990) 247: 1465-8 han informado de técnicas de formulación inmunológica/de vacuna para polinucleótidos.

Formulación y Administración

Los péptidos, tales como las formas solubles de polipéptidos LbpB, y péptidos antagonistas o pequeñas moléculas, pueden formularse junto con un vehículo farmacéutico adecuado. Dichas formulaciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del polinucleótido o compuesto, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos incluyen aunque sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración y se conoce bien en la técnica. La invención se refiere además a envases y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas.

Pueden emplearse los polipéptidos y otros compuestos de la presente invención en solitario o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las formas preferidas de administración sistémica de las composiciones farmacéuticas incluyen inyección, típicamente mediante inyección intravenosa. Pueden usarse otras vías de inyección tales como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Los medios alternativos de administración sistémica incluyen administración transmucosal y transdérmica usando penetradores tales como sales biliares, o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si se formula apropiadamente en formulaciones entéricas o encapsuladas, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en forma de pomadas balsámicas, pastas, geles y similares.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formación, la naturaleza de la afección del sujeto, y el juicio del médico. Las dosificaciones adecuadas, sin embargo, están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg del sujeto. Se esperarán sin embargo amplias variaciones en la dosificación necesaria en vista de la diversidad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de diversas vías de administración. Por ejemplo se esperará que la administración oral requiera dosificaciones más altas que la administración mediante inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas convencionales para la optimización, como se entiende bien en la técnica.

Ejemplos

Los ejemplos a continuación se realizan usando técnicas convencionales, que se conocen bien y son rutinarias para los especialistas en la técnica, excepto donde se describa otra cosa en detalle. Los ejemplos ilustran, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Las cepas bacterianas usadas se enumeran en la Tabla 1. Los menigococos se cultivaron durante una noche en placas de agar CG (Difco), suplementadas con Vitox (Oxoid) en una atmósfera de CO_{2} con humedad al 5% a 37ºC. La expresión óptima de proteínas reguladas por hierro se consiguió añadiendo 5 \mug/ml del quelante de hierro ácido etilendiamino di-o-hidroxifenilacético (EDDA, Sigma). Para la preparación de muestras para SDS-PAGE, inmunotransferencia, y para aislamiento del ADN cromosómico, las células se cultivaron como se ha descrito anteriormente (Pettersson y col., 1993).

La cepa Y 1090 de E. coli (Young y Davis, 1983), que se usó para propagar el fago \lambdagt11, se cultivo en medio Luria-Bertoldi (LB) suplementado con ampicilina (100 \mul/ml), maltosa al 0,2% y MgCl_{2} 10 mM. La cepa DH5\alpha usada para la clonación, se cultivó en medio LB, suplementado con 100 \mul/ml de ampicilina, 25 \mug/ml de kanamicina o 100 \mug/ml de eritromicina, cuando era necesaria la selección de recombinantes. Después de la transformación con derivados de pEMBL19, las células se colocaron en placas de LB suplementadas con el antibiótico apropiado, y con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido (40 \mug/ml), e isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido 0,5 mM para seleccionar plásmidos con insertos. La cepa PC2494, usada para preparar ADN de cadena sencilla, se conservó en placas con medio mínimo, suplementado con 5 \mug/ml de tiamina y glucosa al 0,2%.

Ejemplo 2 2A: Preparación de antisuero de ratón contra péptidos

Los péptidos (Figura 3) se sintetizaron un sintetizador de péptidos múltiple automatizado y se acoplaron a toxoide del tétanos como se describe (van der Ley y col., 1991). Se inmunizaron ratones BALB/c con 50 \mug de péptido y 20 \mug de Quil A como adyuvante. Se dieron dos refuerzos. El suero se recogió 54 días después de la primera inyección.

2B: Identificación del producto génico de lbpB

Para investigar si el supuesto gen lbpB codifica una proteína, se indujeron antisueros contra péptidos sintéticos (indicados como A1-E1 en la Fig. 3) que se basaban en la secuencia de aminoácidos deducida del marco de lectura abierto parcial. Los antisueros se ensayaron en transferencias de western contra células completas de la cepa BNCV cultivada con limitación de hierro. Los sueros contra el péptido B 1 no mostraron ninguna reacción (no se muestran los datos). Los antisuero contra los otros péptidos reaccionaron con una banda de aproximadamente 96 kDa (Fig. 1.). Puesto que esta banda carecía del mutante lbpB (construido como se describe a continuación) (Fig. 1, pistas 3 y 7), se concluyó que el gen lpbB se expresa en la cepa de tipo silvestre, y codifica una proteína con un peso molecular aparente (Mr) de 95.000. Algunos de los sueros contra los péptidos D1 y E1 mostraron una reacción adicional con una banda con Mr de 60.000 (Fig. 1). Estos dos péptidos contienen la secuencia WFGAK, que también está presente en TbpB (Fig. 3). Por lo tanto, la banda de 68 K podría ser TbpB. Para ensayar esta posibilidad, se ensayaron un mutante de TbpB, N91, y su cepa parental B16B6, en transferencias de Western. El suero 19-1 (contra el péptido E1) reaccionó con dos bandas de 95 K y 68 K respectivamente, en la cepa B16B6, pero solamente con la banda de 95K en la cepa N91. Este resultado indica que la banda de 68 K es de hecho TbpB (no se muestra los datos).

Ejemplo 3 SDS-PAGE e inmunotransferencia

Se realizó SDS-PAGE de proteínas de células completas como se ha descrito anteriormente (Petterson y col., 1990, 1993). En los experimentos donde debía prevenirse la desnaturalización de LbpB se incluyeron las siguientes modificaciones. El tampón de muestra no contenía \beta-mercaptoetanol. Los complejos de membrana externa no se calentaron a 95ºC en el tampón de muestra antes de la electroforesis, pero se incubaron con hielo a 37ºC durante 10 minutos. En el experimento de unión a lactoferrina, el gen de poliacrilamida estaba constituido por un gel pegajoso al 5% (p/v) y un gel de resolución al 8% (p/v) que contenía SDS al 0,05% (p/v). El tampón de electrodo contenía el 0,05% en lugar del 0,1% de SDS. La electroforesis se realizó a un voltaje constate de 100 V durante 2 horas a 4ºC. Se usó tampón de muestra convencional con SDS al 2%.

Se realizó electroforesis de proteínas de la membrana externa para detectar formas plegadas de LbpB con el PhastSystem (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando geles de poliacrilamida homogéneos al 7,5% (p/v) con bandas de tampón SDS.

Se realizó inmunotransferencia como se ha descrito previamente (Pettersson y col., 1990, 1993). En el caso de geles de Phast-System, el tampón de transferencia contenía SDS al 0,05% (p/v) y la actividad de la peroxidasa se detectó con el sistema ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham). Se usaron los antisueros de ratón a una dilución de 1:500. Se usaron los anticuerpos monoclonales específicos de LbpA mn98K1 y mn98K2 (Pettersson y col., 1993) como un cóctel a una dilución de 1:2000 cada uno.

Ejemplo 4 4A: Estrategias de clonación y secuenciación

La biblioteca de genes de \lambdagt11 de la cepa BNCV se proporcionó originalmente por E.C. Gotschlich (The Rockefeller University, Nueva York, EEUU). La librería se propagó en la cepa Y1090 de E. coli y se exploró con sonda de ADN BE1 y AP6 (Figura 2). BE1 se preparó mediante aislamiento del fragmento BstEII-EcoRI de 355 pb del plásmido pAM1 (Petterson y col., 1993). AP6 fue el fragmento EcoRI-EcoRV de 417 pb preparado a partir del plásmido pAM6. El marcado de las sondas, la transferencia en las placas, y las detecciones se realizaron como se describe (Pettersson y col., 1993), usando el kit de Marcado y Detección DIG DNA (Boehringer Mannheim). El ADN de \lambda se aisló (Sambrook y col., 1989) y los insertos se subclonaron en el fagémido pEMBL 19. El ADN del plásmido se aisló en mini columnas Jetstar (Genomed) como describe el fabricante. El ADN de cadena sencilla se propagó usando el fago ayudante VCSM13 (Stratagene).

El ADN cromosómico se aisló como se describe (Ausubel y col., 1989). El ADN se digirió con AccI y DraI, y se separó en un gel de agarosa al 1%. Se realizó transferencia de Southern como se describe (Pettersson y col., 1993). La sonda ES1 (Figura 2) se preparó mediante aislamiento del fragmento EcoRI-SalI de 320 pb de pAM13, y se marcó como anteriormente. La sonda reaccionó con un fragmento de 1,5 kb en el ADN cromosómico digerido con AccI/DraI en una transferencia de Southern. Se aislaron fragmentos de 1,5 kb a partir de gel y se ligaron en pEMBL19. La mezcla de ligamiento se amplificó con PCR con el cebador universal M13 (Pharmacia) y el cebador LB11 (Tabla 2). Se usó polimerasa Goldstar, una Taq polimerasa (Eurogentec) para amplificación por PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto de PCR de 1,3 kb se purificó a partir de gel de agarosa.

La secuenciación del ADN se realizó de forma manual usando las mezclas de secuenciación G/A T7 deaza (Pharmacia) o automáticamente usando el analizador genético ABI Prism 310 (Perkin Elmer). Para la secuenciación automática, el marcado se realizó con el kit de secuenciación Dye Terminator Cycle (Perkin Elmer). Los cebadores internos (sintetizados por Pharmacia o Gibco BRL) y el M13 universal y los cebadores inversos (Pharmacia) se usaron para secuenciar el ADN de cadena sencilla, el ADN del plásmido de doble cadena, o el producto de PCR.

Se usaron estrategias similares para secuenciar el gen lbpB de las cepas H44/76 y M981 de N. meningitidis.

4B: Clonación y secuenciación de gen lbpB

Para clonar la parte pérdida del gen lbpB se exploró una biblioteca génica de \lambdagt11 de la cepa BNCV con sondas de ADN. Se encontraron dos diferentes clones de lambda. Los insertos se subclonaron en pEMBL19, dando como resultados plásmidos pAM6 y pAM13 (Figura 2), y se secuenciaron. El promotor y el principio del gen lbpB no se encontraron de esta manera. Varios otros intentos de clonar el extremo 5' del gen también fallaron, sugiriendo que su expresión es tóxica para E. coli. Para obtener el resto de la secuencia, se preparó un banco rico de ADN cromosómico digerido con AccI y DraI. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 1,5 kb se ligaron en pEMBL19, y se realizó amplificación por PCR directamente en la mezcla de ligamiento, usando un cebador (LB11, véase Figura 2) en base a la parte conocida de la secuencia lbpB y un cebador M13. El producto de PCR resultante (Figura 2) se usó directamente para la secuenciación. Esta estrategia evita la clonación del gen posiblemente tóxico en E. coli.

La secuenciación de los diversos fragmentos de lbpB mostró un marco de lectura abierto de 2.175 pb. Este codifica una proteína de 725 restos de aminoácidos (Figura 3) con una masa molecular de 79,4 kDa. Los análisis de la secuencia N-terminal mostraron las características de una secuencia señal reconocida por la peptidasa de señal II (von Heijne, 1989). Dichas secuencias de señal están presentes en los precursores de lipoproteínas, que están acilados en el resto cisteína N-terminal de la proteína madura. Una secuencia de señal similar se descubrió en la proteína TbpB, lo que probaba de este modo que estaba modificada lipídicamente (Anderson y col., 1994). La proteína de LbpB madura tenía una masa molecular calculada de 77,5 kDa, que es considerablemente más baja que la masa molecular de 95 kDa aparente observada en electroforesis con poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) (Fig. 1). La exploración de la base de datos Swiss Prot para similitudes con otras proteínas mostró una homología con TbpB de Neisseriae y Actinobacillus pleuropneumoniae. La homología más alta, 33% de identidad (usando el programa PALIGN), se descubrió con TbpB de N. meningitidis de la cepa B16B6 (Legrain y col., 1993) (Fig. 3). En la proteína TbpB, se descubrieron algunas repeticiones internas, y se propuso que la molécula tenía una estructura bilobulada que estaba envuelta hacia dentro después de una duplicación interna (Fuller y col., 1996, Renauld-Mogénie y col., 1996). Cuando se alinearon los 354 aminoácidos N-terminales de la proteína LbpB madura con los 353 aminoácidos C-terminales, se descubrieron una identidad del 30% y una similitud del 10% (no se muestran los datos). Este resultado sugiere que también puede existir LbpB en estructura bilobulada. El punto isoeléctrico de la proteína es 4,5. Pueden distinguirse dos tramos largos, ricos en restos ácidos, en la secuencia (Figura 3). Puesto que estos tramos no están en TbpB, pueden ser importantes para la unión de lactoferrina, que es, a diferencia de transferrina, una molécula cargada positivamente.

En el área promotora, pudo distinguirse una secuencia típica Shine-Dalgamo. Además, de descubrieron una supuestas cajas -10 y -35 (Figura 4). Una secuencia reminiscente de un sitio de unión a Fur se solapa con la caja -10. Fur actúa, junto con Fe^{2+}, como un represor de los genes regulados por hierro, uniéndose a una secuencia de 19 pb de la región promotora (Bagg y Neilands, 1987). La secuencia de consenso de dicha caja Fur es GATAATGATAATCATTATC y 16 de los19 pb de esta secuencia se conservan en este elemento en el promotor lbpB. Además cadena arriba del promotor, se descubrió una repetición directa de 131 pb (no se muestran los datos). Esta secuencia está presente al menos dos veces en esta posición. La misma repetición directa se descubrió cadena abajo del gen lbpA (Prinz y col., observación no publicada). Una búsqueda de homología FASTA mostró homología de esta repetición con varias secuencias de Neisseria, la mayoría flanqueando marcos de lectura abiertos (no se muestran los datos).

La homología de secuencia entre las proteínas LbpB de las cepas BNCV y M981 de N. meningitidis y entre las proteínas LbpB de las cepas BNCV y H44/76 de N. meningitidis es del 72,7% y 78,5% respectivamente.

Ejemplo 5 5A: Construcción de mutantes isogénicos

Los plásmidos pAM23 y pAM6 se usaron para activación insercional de lbpA y lbpB, respectivamente. El casete resistente a eritromicina (Erm^{r}) de pER2 (Jennings y col., 1993) se cortó con ClaI y HindIII. El fragmento se trató con ADN polimerasa de T4 y se ligó a pAM23 digerido con EcoRV, dando como resultado el plásmido pAM23F. El casete resistente a kanamicina (Km^{r}) de pUC4K (Pharmacia) se cortó con HincII. El plásmido pAM6 se alineó con BglII y se trató con ADN polimerasa de T4. El casete Km^{r} se ligó en este sitio, dando como resultado el plásmido pAM6K. Un engarce constituido por los oligonucleótidos nus1 y nus2 (Tabla 2), que contiene la secuencia de captación de Neisseria (GCCGTCTGAA) y extremos de cadena sencilla compatibles con KpnI, se clonó en el sitio kpnI de pAM6K, dando como resultado el plásmido pAM6K-nus. Los genes de resistencia antibióticos estaban en las mismas direcciones que lbpA y lbpB en plásmidos pAM23E y pAM6K (-nus), respectivamente. El plásmido pAM23E, alineado con KpnI, se usó para transformar la cepa H44/76 como se ha descrito anteriormente, (van der Ley y Poolman, 1992). Se seleccionaron transformantes en placas GC que contenían 5 \mug de eritromicina por ml. La sustitución génica correcta en uno de los transformantes, denominado CE 1449, se verificó mediante PCR, usando cebadores FW5 y DVAS2 (Tabla 2), y mediante análisis de transferencia de Southern usando la sonda AP23 (Figura 2; aislado como el fragmento SspI-HindIII- de 184 pb de pAM23). Para la transferencia de Southern, se digirió ADN cromosómico con ClaI y SalI. Los mutantes isogénicos en la cepa BNCV se prepararon mediante electroporación (Genco y col., 1991) puesto que esta cepa parecía no ser transformable. Se usó ADN cromosómico del mutante lbpA CE1449 para preparar el mutante de lbpA. Se seleccionaron transformantes en placas GC con eritromicina y se verificaron como se ha mencionado anteriormente. Su usó plásmido pAM6K-nus para preparar el lbpB mutante. Los transformantes se seleccionaron en placas GC que contenían 100 \mug/ml de kanamicina. Se verificó la sustitución génica correcta mediante PCR, usando cebadores SDA1 y PR1 (Tabla 2), y mediante transferencia de Southern usando la sonda AP23.

5B: Construcción de mutantes isogénicos

Para verificar la identidad de la proteína de 94 kDa y para investigar el papel de las proteínas de una lactoferrina individuales en la unión y en la utilización de lactoferrina, se construyó un conjunto de derivados exogénicos de BNCV que carecían de LbpA y LbpB como se describe en el Ejemplo 5A. Las sustituciones génicas correctas se verificaron en reacciones de PCR y mediante transferencia de Southern (no se muestran los datos). La expresión de LbpA y LbpB en los mutantes se comprobó en transferencia de Western (Figura 5). El LbpA mutante CE1452 no expresaba LbpA (Figura 5A, pista 4), y el lbpB mutante CE1454 no expresaba la proteína de 94 kDa (Figura 5B, pista 6). Este resultado confirma que el gen lbpB se expresa por tanto en la cepa de tipo silvestre, que codifica una proteína con un M de 94.000, que es considerablemente mayor que su masa molecular calculada de 77,5 kDa. Además, los resultados de la Figura 4 muestran que la inactivación de lbpB no tiene un efecto polar sobre la expresión de lbpA (Figura 5A, pista 6). Esto estaba anticipado, puesto que el casete de resistencia a kanamicina que se insertó en el lbpB no contiene un terminador de la transcripción. El mutante lbpA espontáneo descrito anteriormente CE 1402 (Pettersson y col., 1994b) parecía carecer también de la expresión de lbpB (Figura 5B, pista 8). Puesto que tanto este mutante como BNCV son derivados de la cepa M986, su trasfondo genético es el mismo que el de los otros mutantes. La expresión de lbpA y lbpB parecía estar regulada por hierro (Fig. 5). Se observó una expresión débil de LbpA en la cepa C1454 incluso cuando las células se cultivaban sin un quelante de hierro (Figura 5A, pista 5). Esta expresión se debe probablemente a la transcripción del promotor del gen de resistencia a kanamicina en lbpB. Sin embargo, también en este caso la expresión de LbpA se aumentó varias veces cuando la cepa se cultivaban en presencia de un quelante de hierro (Fig. 5A, pista 6).

Ejemplo 6 6A: Ensayo de unión a lactoferrina

La unión de lactoferrina a células completas se ensayó en un ensayo de tipo ELISA. La lactoferrina humana recombinante producida en Aspergillus avamori, se proporcionó amablemente por Agennix Inc. Houston, Texas, USA. La lactoferrina estaba saturada con hierro como se describe (van Berkel y col., 1995), con las siguientes modificaciones. Se usó FeCl_{3} en lugar de Fe(NO_{3})_{3}, y la diálisis se hizo contra Na_{2}HPO_{4} 5 mM/NaH_{2}PO_{4}, pH 7,7 durante 4 horas. Las colonias de las placas se suspendieron en solución tamponada con Tris, pH 7,5 (TBS) y se destruyeron calentando durante 30 minutos a 56ºC. Se dispensaron muestras (100 \mul) con una densidad óptica a 620 nm de 0,05 en los pocillos de una placa de microtitulación. Las muestras se dejaron secar durante una noche a 37ºC. El ensayo se realizó a 37ºC. Se impidió la unión no específica con 100 ml de solución de bloqueo que contenía Protifar al 0,5% (Nutricia) y Tween 20 al 0,1% en TBS durante 1 hora. Después del bloqueo, los pocillos se llenaron con diversas concentraciones de lactoferrina en solución de bloqueo. La concentración de lactoferrina en los pocillos variaba de 3,125 a 200 ng/ml. Después de la incubación durante 1 hora, y tres lavados con agua corriente, se añadió los pocillos un antisuero policlonal de conejo acoplado con peroxidasa contra lactoferrina humana (INC Biomedicals). El anticuerpo se usó a una dilución de 1:5000 en tampón de bloqueo. Después de la incubación durante una hora y tres lavados con agua corriente, se detectó la cantidad de peroxidasa (Abdillahi y Poolman, 1987).

La unión a lactoferrina en una transferencia se realizó de la siguiente manera. Se bloqueo la unión inespecífica incubando la membrana en Na_{2}HPO_{4} 0,2 M/NaH_{2}PO_{4}, pH 5,7 que contenía Tween-20 al 0,1% y Protifar al 0,5% (Nutricia) durante 2 horas. La transferencia se incubó con 1,2 \mug/ml^{-1} de lactoferrina humana conjugada con peroxidasa (Pettersson y col., 1993) en tampón de bloqueo durante una hora y se lavó tres veces con tampón de bloqueo. La actividad de la peroxidasa se detectó con el sistema ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham).

6B: Ensayos de carga de placas

Se cultivaron menigococos durante una noche en TBS suplementado con Vitox, como se describe en el Ejemplo 1. Del cultivo durante la noche, se suspendieron 300 \mul en 3 ml de top agar (agar GC al 1% con 20 \mug de EDDA por ml, enfriado hasta 42ºC) y se colocaron inmediatamente en placas de agar GC suplementadas con Vitox y 20 \mug de EDDA por ml. Se colocaron sobre las placas gotas (10 \mul) de lactoferrina humana recombinante (saturada con hierro al 11% o saturada como se ha descrito anteriormente). La concentración de lactoferrina en las gotas era de 10 y 20 mg/ml, respectivamente. Las placas se incubaron durante una noche.

6C: Unión de lactoferrina a LbpB plegada en las transferencias

Para investigar si la lactoferrina puede unirse a LbpB en las transferencias, se buscaron condiciones de SDS-PAGE bajo las cuales la LbpB no se desnaturaliza (véase el Ejemplo 6A). Cuando las muestras no se calentaban en tampón de muestra antes de la electroforesis, podía detectarse una forma de migración más rápida de la proteína LbpB, que representaba probablemente la forma plegada nativa de la proteína (Fig. 6A). Esto forma tenía una Mr de aproximadamente 80 kDa. Después de calentar durante 10 minutos a 95ºC, la proteína del LbpB estaba completamente desnaturalizada y migraba a la posición 94 kDa (Fig. 6A, pista 2). De forma interesante, solamente el suero contra el péptido Al (Fig. 2) reaccionaba con la forma de migración rápida de la proteína. Este péptido contiene uno de los dos tramos, ricos en aminoácidos careados negativamente y posiblemente implicados en la unión de lactoferrina. La unión de los anticuerpos a la proteína plegada sugiere que esta parte de la proteína está expuesta, mientras que todos los otros epítopes peptídicos están escondidos en la estructura plegada de LbpB.

La unión de lactoferrina a la proteína LbpB plegada se ensayó posteriormente. Se transfirieron proteínas externas de la membrana de la cepa BNCV a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con lactoferrina humana acoplada a peroxidasa. La especificidad de la unión a lactoferrina parecía ser extremadamente sensible a las condiciones de incubación, y lo que es más importante al pH. En condiciones optimizadas, la lactoferrina se une específicamente a una banda de proteína con una Mr de 80 kDa (Fig. 6B, pistas 1 y 2). No se observó unión cuando las muestras se calentaban durante 10 minutos a 95ºC antes de la SDS-PAGE (Fig. 6B, pista 3). La banda no se detectó en las muestras del LbpB mutante CE 1454 (no se muestran los datos). De hecho, se concluye que la forma de migración rápida de la proteína LbpB, representa probablemente la forma plegada de la proteína es capaz de unirse a lactoferrina.

6D: Unión a lactoferrina y utilización en células completas

Se investigó la unión a lactoferrina a células completas en un ensayo de tipo ELISA. Las placas de ELISA se revistieron con células completas de la cepa BNCV de los mutantes isogénicos, y se añadió lactoferrina en diversas concentraciones a los pocillos. La unión de lactoferrina a las células se sondeo con un anticuerpo conjugado a peroxidasa contra lactoferrina humana (Figura 7). Al mutante lbpB se redujo ligeramente su capacidad para unirse a lactoferrina. El mutante de lbpA se unía a lactoferrina de forma menos eficaz que el mutante lbpB, mientras que el doble mutante no se unía virtualmente a lactoferrina en absoluto (Fig. 7).

La capacidad de usar lactoferrina como una única fuente de hierro se investigó en ensayos de carga de placas. Se cultivaron meningococos en condiciones de limitación de hierro en placas, se colocaron sobre las placas gotas de lactoferrina humana recombinante, y se controló la estimulación del cultivo. El mutante lbpB fue capaz de crecer en lactoferrina, mientras que el mutante lbpA no fue capaz (Figura 8). La lactoferrina estaba saturada en hierro al 11%. Se realizó el mismo experimento con lactoferrina cargada de hierro con esencialmente los mismos resultados (los datos no se muestran). Estos datos demuestran que la proteína LbpA es necesaria para la captación de hierro mediante lactoferrina, mientras que la LbpB parece no ser esencial.

Ejemplo 7

Para estudiar la variabilidad de la proteína LbpB de meningococos, se secuenciaron los genes de lbpB de otras cuatro cepas: H44/76, M990, M981, 881607 (véase Tabla 1)

7A: Secuenciación de lbpB de otras cuatro cepas de meningococos - Procedimientos

Las bacterias se cultivaron de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1. Se aisló ADN cromosómico a partir del cultivo bacteriano en placas. Después de una noche de cultivo, se recogieron mediante rayado bacterias de las placas que se suspendieron en 1,5 ml de Tris-HCl 10 mM EDTA, 10 mM, pH 8 y se añadieron 10 \mul de lisozima (10 mg/ml). La suspensión se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente, antes se añadió 1,5 ml de Tritón X-100 al 2%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8. Después de 15 minutos de incubación se añadieron 10 \mul de proteinasa K (10 mg/ml). Los tubos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se extrajo una vez con fenol, cloroformo e isoamilalcohol (mezclado en una proporción 24:24:1), y una vez con cloroformo saturado con agua. El ADN cromosómico se precipitó con etanol.

Se usó el ADN cromosómico para amplificar por PCR los genes lbpB. Se usaron cebadores LB20 y REV2 (Tabla 3) sobre las cepas H44/76, M990 y 881607. Se usaron cebadores LB20 y LB23 en la cepa M981. Los cebadores se basan en la secuencia de lbpB de la cepa BNCV. LB20 se une cadena arriba del lbpB, y LB23 y RV2 en el comienzo del gen lbpA. LB23 tiene un sitio BamHI extra en el extremo 5'. La polimerasa Goldstar un derivado de Taq polimerasa (Eurogentec) se usó para amplificaciones por PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La temperatura de hibridación fue en todos los casos de 50ºC, y se realizaron 30 ciclos. Los productos de PCR se purificaron a partir de geles de agarosa, usando beta \beta-agarasa (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La secuenciación de ADN se realizó mediante avance de genes usando cebadores diseñados para los genes lbpB. Los cebadores se sintetizaron por Gibco BRL. La secuenciación se realizó automáticamente usando el analizador genético ABI Prism 310 (Perkin-Elmer). El marcado se realizó con el kit Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer).

Se usaron los programas de ordenador TRANSL, PALIGN y CLUSTAL del paquete de software PC Gene 6.70 (Intelli-Genetics) para traducir la secuencia de nucleótidos en secuencia de aminoácidos, alineamiento en pares de las secuencias y para alineamiento múltiple respectivamente.

7B: Secuenciación de lbpB a partir de otras cuatro cepas de meningococos -Resultados

Las secuencias de nucleótidos de los genes lbpB en las cuatro cepas se muestran en la SEC ID Nº 3, 5, 7 y 9. Las secuencias de nucleótidos se tradujeron en secuencias de aminoácidos y en la Fig. 9 se presenta una alineación de las cinco secuencias conocidas de las proteínas LbpB. A nivel de aminoácidos, la identidad entre las proteínas LbpB de las diferentes cepas era del 70-80%. Una comparación por pares de identidades se resume en la Tabla 4.

Ejemplo 8

El nivel de expresión de LbpB en Neisseria meningitidis es muy bajo. La proteína no podía detectarse cuando se analizaron patrones de proteína externa de membrana mediante SDS-PAGE. Para estudios inmunológicos y estructural/funcionales de la proteína LbpB, se preparó una construcción para la expresión de la proteína en Escherichia coli. Para facilitar la purificación de la proteína recombinante, la proteína codificada por la construcción contenía una marca His, la modificación lipídica del extremo N terminal se prevenía mediante la obstrucción de la secuencia señal nativa y los primeros dos restos de aminoácidos del dominio maduro.

8A: Expresión de LbpB recombinante - Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

La cepa BNCV de meningococos (-:2a:P 1.2) se cultivó durante una noche en placas de agar GC (Difco), suplementadas con Vitox (Oxoid) en una atmósfera de CO_{2} con humedad al 5% a 37ºC. La construcción que codificaba la proteína LbpB recombinante se expresó en la cepa de E. coli CE 1448 (proporcionada amablemente por C. Jansen), que es un derivado htrA ompT de la cepa CE 1224 (Tommassen y col., 1983). La cepa se cultivó a 37ºC en un medio sintético tamponado con Hepes (Tommassen y Lugtenberg, 1980) suplementado con requisitos de cultivo debidos a las mutaciones auxotróficas y con K_{2}HPO_{4} 1,32 mM (condiciones de plenitud de fosfato). Después de una noche de cultivo, el cultivo se diluyó a 1:13,5 en el mismo medio, pero sin K_{2}HPO_{4} (condiciones de agotamiento de fosfato) y se cultivó durante 6 horas a 37ºC.

8B: Expresión de LbpB recombinante - Clonación en E. coli

Se aisló ADN cromosómico a partir de células de meningococos cultivados durante una noche en placas. Las bacterias se recogieron mediante rayado de las placas, se suspendieron en 1,5 ml de Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM, pH 8 y se añadieron 10 \mul de lisozima (10 mg/ml). La suspensión se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente, antes se añadieron 1,5 mil de Triton X-100 al 2%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM pH 8. Después de 15 minutos de incubación, se añadieron 10 \mul de proteinasa K (10 mg/ml). Los tubos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. El ADN se extrajo de la mezcla añadiendo fenol/cloroformo/isoamilalcohol (24:24:1 en volumen), y se purificaron
adicionalmente mediante extracción con cloroformo saturado con agua. El ADN cromosómico se precipitó con etanol.

El ADN cromosómico se usó como plantilla para amplificar la parte del gen lbpB correspondiente a la LbpB madura mediante PCR usando cebadores LB22 y LB23 (Tabla 5). El LB22 actúa en un sitio correspondiente a la parte N-terminal de LbpB e introduce un sitio PstI en el producto de PCR. El LB23 actúa justo cadena abajo del lbpB en el comienzo del gen lbpA e introduce un sitio BamHI. Se usó polimerasa Pwo (Boehriger Mannheim), una enzima a prueba de lectura, en la reacción de PCR, de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. La temperatura de hibridación fue de 60ºC, y se realizaron 30 ciclos. El producto de PCR se aisló de un gel, usando \beta-agarasa (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto de PCR se digirió con PstI y BamHI y se ligó en pJP29 (Fig. 10) que también se digirió con PstI y BglII. En la construcción resultante, pAM31, los sitios BamHI y BglII se pierden. La proteína LbpB se expresa en esta construcción a partir del promotor PhoE y contiene la secuencia de señal PhoE en lugar de la auténtica secuencia de señal. Además, los dos primeros residuos del extremo N terminal se cambiaron de Cys e Ile a Ala y Val, respectivamente. Para facilitar la purificación de la proteína, se insertó una marca His entre la secuencia de señal y la parte madura de LbpB. pAM31 se digirió con PstI y se ligó a un engarce constituido por los oligonucleótidos VGO12a y VGO13a (Tabla 5), dando como resultado el plásmido pAM32 (Fig. 10A). El sitio PstI se pierde después del ligamiento. El engarce codifica seis restos de histidina y un sitio de escisión del factor Xa (Fig. 10B).

8C: Purificación de LbpB recombinante

El LbpB recombinante se produjo en una cepa CE1448 que contenía pAM32. Se recogieron células limitadas en fosfato de un cultivo de 5 litros después de 6 horas de cultivo. Las células se lavaron una vez con 500 ml de solución salina fisiológica y se resuspendieron en 150 ml de Tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM, pH 8. La suspensión se congeló a -20ºC durante una noche. Las células se descongelaron y se añadieron 3 comprimidos de cóctel inhibidor de proteasa (Complete®, Boehringer Manheim). Las células se prensaron dos veces con una prensa francesa a una presión de 55.158,06 kPa (8.000 psi). Las células que no se rompieron se retiraron mediante centrifugado en un rotor Sorvall GSA a 5000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se centrifugó en un rotor Beckman Ti60 a 40.000 rpm durante 90 minutos. Las envueltas celulares se disolvieron en tampón Na_{2}HPO_{4} 5 mM -NaH_{2}PO_{4}, pH 7,6.

Las envueltas celulares se extrajeron dos veces con n-octil-oligo-oxietileno al 2% (Octyl-POE) a 37ºC. La primera extracción se realizó durante 1 hora, y la segunda durante 3 horas. Entre y después de las extracciones, se sedimentaron proteínas no solubles mediante centrifugado en un rotor Beckman TLA 100.2 a 100.000 rpm durante 1 hora. Los sobrenadantes, que contenía la proteína LbpB, se combinaron y se añadieron a agarosa Ni-NTA. La purificación de la proteína se realizó en un lote en condiciones naturales, de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Qiagen). Las concentraciones de imidazol y NaCl fueron 20 mM y 300 mM, respectivamente, durante la unión y el lavado. En total se usaron 2 ml de agarosa Ni-NTA, divididos en 10 tubos. La elución se realizó en etapas con 3 ml de imidazol 100 mM, 200 mM y 250 mM respectivamente. Después de la elución, la proteína se dializó dos veces en una bolsa de diálisis Spectra/Por 2 (Spectrum) contra 2,5 l de solución salina tamponada con fosfato. En un concentrado de centrifugado Fugisept Maxi (Intersept) con un límite de 10 kDa. El centrifugado se realizó en un rotor Sorvall GSA a 5000 rpm, hasta que el volumen total era de 1-1,5 ml.

Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) como se describe por Lugtenberg y col., (1975) con unas pocas modificaciones. El gen de poliacrilamida estaba constituido por gel de acumulación al 5% y gel de resolución al 12%, que no contenían SDS. Cuando tenía que prevenirse la desnaturalización del LbpB, el tampón de ensayo (Lugtenberg y col., 1975) no contenía \beta-mercaptoetanol, y las muestras se mantuvieron hasta 0ºC antes del PAGE. Para desnaturalizar LbpB, el tampón de muestra se suplementó con \beta-mercaptoetanol, y las muestras se hirvieron durante 5 minutos. La electroforesis se realizó a una corriente constante de 20 mA a 4ºC. El gel se tiñó con Azul Brillante Coomassie.

8D: Expresión y purificación de LbpB recombinante - Resultados

Se expresó una forma recombinante de LbpB de N. meningitidis cepa BNCV en la cepa de E. coli CE 1448. Se preparó una construcción, pAM32, que codifica una proteína recombinante constituida por la secuencia de señal de PhoE, una marca His y la proteína LbpB madura (Fig. 10A). La proteína se expresa a partir del promotor phoE en condiciones de limitación de fosfato. La auténtica secuencia de señal de tipo II de LbpB se sustituye por una secuencia de señal de tipo I, y se inserta una marca His seguida de un sitio de escisión del factor Xa entre la secuencia de señal y la LbpB madura. Además, los dos primeros aminoácidos Cys e Ile se cambiaron a Ala y Val (Fig. 10B). Como consecuencia, la proteína recombinante no podía modificarse de forma lipídica en el extremo Cys N-terminal. La proteína LbpB recombinante se fraccionaba con las membranas, y no con las proteínas solubles (los datos no se muestran). Por lo tanto, tenía que extraerse de la membrana con un detergente. Se usó octyl-POE porque solubilizadaba aproximadamente el 50% de la cantidad total de LbpB recombinante de la membrana. Además, cuando la proteína extraída no se desnaturaliza mediante hervido en un tampón de muestra, migra más rápido en PAGE que la proteína desnaturalizada (no se muestran los datos), sugiriendo que la proteína se plegaba de forma correcta. Después de la extracción, la proteína marcada con His se purificó mediante cromatografía de afinidad a Ni-. La mayoría de la proteína se eluyó en fracciones de imidazol 100 mM y 200 mM. Sin embargo, todas las fracciones se combinaron antes de diálisis. La proteína era pura según se evaluó en un gel teñido con Azul Brillante Coomassie (Figura 11), y la mayoría de este estaba presente en la zona plegada, que emigra más rápido durante PAGE que la forma desnaturalizada. La forma plegada de LbpB, pero no la forma desnaturalizada, demostró en el Ejemplo 6 unirse a lactoferrina en una transferencia.

Ejemplo 9

Para estudiar la inmunogenicidad de la proteína de LbpB en el hombre, se ensayó la presencia de anticuerpos que reconocen la proteína LbpB de la cepa BNCV en suero de ser humano convaleciente en inmunotransferencias.

9A: Inmunogenicidad de LbpB en el hombre - Procedimientos

Se obtuvieron diez sueros de seres humanos convalecientes de SmithKline Beecham Biological SA, Bélgica y siete sueros del National Institute of Public Health and the Environment, Países Bajos, (Tabla 6). Los individuos se había infectado con cepas de diversos sero- y subtipos.

Se aisló LbpB recombinante usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 8. Se realizó electroforesis con gel de poliacrilamida (PAGE) como se describe por Lugtenberg y col. (1975) con pocas modificaciones. El gel de poliacrilamida está constituido por gel de acumulación al 5% y gel de resolución al 11%, que no contenía SDS. Cuando tenía que prevenirse la desnaturalización de LbpB, el tampón de muestra (Lugtenberg y col., 1975) no contenía \beta-mercaptoetanol, y las muestras se mantuvieron a 0ºC antes de la electroforesis. Para desnaturalizar LpbB, el tampón de muestra se suplementó con \beta-mercaptoetanol, y las muestras se hirvieron durante 5 minutos. Se realizó electroforesis a una corriente constante de 20 mA a 4ºC.

Se realizó inmunotransferencia como se describe por Pettersson y col., (1993). Los sueros humanos se diluyeron a 1:500. Se usó IgG antihumana de conejo conjugada con peroxidasa (Dako A/S) como el anticuerpo secundario a una dilución de trabajo de 1:5000. La actividad de la peroxidasa se detectó con el sistema ELC de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Amersham).

9B: Inmunogenicidad de LbpB en el hombre - Resultados

La presencia de anticuerpos específicos para LbpB en sueros humanos se ensayó contra proteína LbpB recombinante purificada de la cepa BNCV (-:2a:P1.2) en inmunotransferencias. La reactividad se ensayó contra la LbpB plegada y contra la proteína desnaturalizada (véase Fig. 12 para ejemplos). Los resultados se resumen en la Tabla 6). Cuatro de los sueros reaccionaron fuertemente con las formas desnaturalizada y plegada de LbpB. Cinco sueros reaccionaron débilmente con ambas formas, dos sueros débilmente solamente con la zona plegada, dos sueros débilmente solamente con la forma desnaturalizada, y cuatro sueros no reaccionaron con LbpB en absoluto. Estos resultados demuestran que la LbpB de meningococos es inmunogénica en el hombre y sugieren un grado considerable de reactividad cruzada inmunológica entre las proteínas LbpB de diversas cepas.

Ejemplo 10 Ensayos de ELISA y Bactericidas usando sueros obtenidos de ratones inmunizados con células de meningococos o LpbB 10A: Protocolo de inmunización

Inmunización con cepa BNCV de N. meningitidis: se inmunizaron grupos de 10 ratones (Balb/C de 6 semanas de edad) (100 \mul intraperitoneal o 100 \mul subcutánea) tres veces con 5 x 10^{8} CFU de células completas de BNCV inactivadas por calor en adyuvante SBAS2. Las tres inmunizaciones se realizaron separadas por 21 días, y se extrajo sangre en el día 56 mediante punción intracardiaca. Los sueros se reunieron por grupos.

Inmunización con LbpB de N. meningitidis cepa BNCV. Esta se realizó mediante el mismo procedimiento que anteriormente excepto que las dos primeras inmunizaciones se realizaron con 10 \mug de LbpB en bruto (envuelta celular de E. coli que contenía la LbpB recombinante) y la tercera inmunización se realizó con 2,5 \mug de LbpB pura (preparada de la misma manera que se describe en el Ejemplo 8).

10B: Medida de la respuesta en ELISA de células completas (WCE) y ELISA DE LbpB purificada

Se usaron placas inmunes Nunc de fondo plano de 96 pocillos. Se dividieron en alícuotas 100 \mul de una cepa de B de Neisseria meningitidis inactivada por el calor [que se había cultivado en condiciones de agotamiento de hierro condiciones (fe-) usando EDDA como se describe en el Ejemplo 1] (20 \mug/ml de proteína total) en suspensión en PBS, en pocillos individuales o placas y se dejó evaporar durante una noche a 37ºC.

Las placas revestidas se lavaron cuatro veces con NaCl al 0,9%, Tween 20 al 0,05% y se saturaron con PBS Caseína al 0,3% (Merck) durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación, y se lavaron de la misma manera. Se diluyeron 100 veces 100 \mul de sueros reunido en PBS Tween 20 al 0,05%, caseína al 0,1%, y se añadieron al primer pocillo, después se diluyeron dos veces hasta 12 diluciones y las placas se incubaron después durante 30 minutos a 37ºC con agitación. Después del lavado, se añadieron 100 \mul de una dilución de 2000 veces de inmunoglobulinas de conejo anti-ratón biotina (Dakopatts E0413) en PBS Tween 20 al 0,05%, caseína al 0,3% y las placas se incubaron de la misma manera que anteriormente. Las placas se lavaron y después se añadieron 100 \mul de una dilución de 4.000 veces en PBS Tween 20 0,05% de complejo de peroxidasa de rábano rusticano y Estreptavidina biotinilada y las placas se incubaron de la misma manera. Después del lavado, se añadieron 100 \mul de una solución recién preparada de 4 mg de cepa O-fenildiamina (OPDA) (sigma P8787) en tampón citrato 0,1 M, pH 4,5 y las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en una sala oscura. La reacción se detuvo añadiendo 50 \mul de HCl 1 N. Se leyeron las absorbancias a 490 nm.

El ELISA anti-LbpB funciona de la misma que WCE excepto que el revestimiento es diferente. Los pocillos se revistieron con 100 \mul de una solución de 0,5 \mug/ml de LbpB pura en tampón carbonato 0,05 M/bicarbonato pH 9,6 y se incubaron durante una noche a 37ºC (no se evaporó).

10C: Ensayo Bactericida

Se suspendió un cultivo de meningococos del grupo B (cepa H44/76) [cultivado en condiciones de agotamiento de hierro (fe-) como se describe en el Ejemplo 1, o en condiciones ricas en hierro (fe+) omitiendo la adición de EDDA] en fase log de cultivo (OD\sim0,3) en medio de Hanks estéril con BSA al 0,3% para obtener una suspensión celular de trabajo ajustada a 20.000 CFU/ml.

Se preparó una mezcla de reacción principal (75 \mul) que contenía 50 \mul/pocillo de diluciones de dos veces de muestras de suero de ensayo (Ejemplo 10A) (que se habían inactivado por calor a 56ºC durante 30 minutos) y 25 \mul por pocillo de los meningococos de grupo de fase log 20.000 CFU/ml. Los viales de reacción se incubaron a 37ºC durante 15 minutos y se agitaron a 200 rpm. La mezcla de reacción final (100 \mul) contenía adicionalmente suero de conejo pre-ensayado al 25% como una fuente complementaria, y se incubó en las mismas condiciones durante 60 minutos. Se usó una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo de U de poliestireno estéril para este ensayo.

Se tomó una alícuota de 10 \mul de cada pocillo usando una pipeta multicanal, y se depositaron en placas de agar Mueller-Hinton que contenían Isovitalex al 1% y suero de caballo inactivado por calor al 1% y se incubaron durante 18 horas a 37ºC en CO_{2} al 5%. Las colonias individuales podían contarse hasta 80 CFU por alícuota.

Se usaron las siguientes tres muestras de ensayo como controles: tampón + bacterias + complemento; tampón + bacterias + complemento inactivado; suero + bacterias + complemento inactivado.

Se calcularon los títulos usando un procedimiento con el programa Excel (Mcrosoft). Este procedimiento da una medida precisa de la dilución que corresponde al 50% de muerte celular mediante un cálculo de regresión.

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Ejemplo 10D

Resultados

La Tabla 7 y la Fig. 13 muestran que la inmunización con LbpB induce una buena respuesta contra LbpB (Fig. 13A), así como contra muestras de células completas de la cepa BNCV (la fuente del LbpB recombinante) y la cepa H44/76 (cuyo LbpB tiene solamente el 78,5% de identidad de secuencia con la de BNCV) (Fig. 13B y C). Los sueros obtenidos usando un programa de inmunización que implica solamente LbpB recombinante dieron un resultado similar (no se muestran los datos). Claramente, la inmunización anti-célula completa con la cepa BNCV conduce a un ELISA anti-célula completa mayor para las células BNCV y H44/76 (Figuras 13B y C, respectivamente).

Además, la inmunización con LbpB recombinante de la cepa BNCV de N. meningitidis induce anticuerpos que se unen a una proteína de peso molecular similar en muestras de células completas de Moraxella catarrhalis realizados en una inmunotransferencia realizada sustancialmente como se describe en el Ejemplo 9 (no se muestran los datos).

La Tabla 8 y la Fig. 14 muestran que los anticuerpos producidos en los sueros después de la inmunización con LbpB recombinante de la (cepa BNCV) son bactericidas contra una cepa heteróloga (H44/76), cuya LbpB tiene solamente el 78,5% de identidad de secuencia con la de BNCV. Este era también el caso usando sueros obtenidos después de un programa de inmunización que implicaba solamente LbpB recombinante (no se muestran los datos). Esto es verdad cuando el H44/76 se había cultivado en condiciones que contenían hierro (Figura 14A) y agotadas en hierro (Figura 14B). Parece haber un mayor efecto en condiciones de agotamiento de hierro que el que podría esperarse si el LpbB se expresara en grandes cantidades cuando la bacteria está en estas condiciones.

LpbB es por tanto un antígeno inmunoprotector y, además, muestra pruebas de proporcionar inmunoprotección cruzada contra cepas heterólogas de N. meningitidis

TABLA 1 Cepas Bacterianas y plásmidos usados

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2

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TABLA 2 Cebadores usados para PCR o clonación de engarce

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TABLA 3 Cebadores usados para amplificar por PCR los otros cuatros genes lbpB

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TABLA 4 Identidad por pares de las secuencias de LbpB, en %

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TABLA 5 Cebadores usados para expresar LbpB recombinante

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TABLA 6 Resultados de la inmunotransferencia de sueros humanos contra LbpB purificado

8

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9

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TABLA 8 Resultados de las actividades bactericidas de sueros anticélula completa y anti-LbpB realizados como se describe en el Ejemplo 10

11

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: University of Utrech, Technology Foundation

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

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(A)

DIRECCIÓN: SmithKline Beecham, Corporate IP Department

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(B)

CALLE: New Horizons Court, dos

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(C)

CIUDAD: Brentford

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(D)

ESTADO: Middlesex

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(E)

PAÍS: Reino Unido

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(F)

CÓDIGO POSTAL: TW8 EP

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(v)

FORMA LEGIBLE POR EL ORDENADOR

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM Compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

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(D)

SOFTWARE: FastseQ para Windows Versión 2,0

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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FECHA DE PRESENTACIÓN:

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CLASIFICACIÓN:

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DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE

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(A)

NOMBRE: DALTON, Marcus Jonathan William

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: XXXXXX

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(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE CERTIFICADO: B45106

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: (0181) 975 6348

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(B)

TELEFAX: (0181) 975 6177

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 2277 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa BNCV

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(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia Codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 100...2274

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 725 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa BNCV

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2169 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa M981

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia Codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2166

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 722 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa M981

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

25

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2226 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa H44/76

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia Codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2223

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

28

29

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 741 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa H44/76

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2262 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa M990

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia Codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2259

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

36

37

38

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 753 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa M990

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

42

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2142 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa 881607

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia Codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1...2121

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 707 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Neisseria meningitidis cepa 881607

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

Claims (12)

1. Una vacuna que comprende una cantidad eficaz de una proteína B de unión a lactoferrina no unida a lípidos de Neisseria meningitidis, o una proteína de fusión de la misma, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. La vacuna de la reivindicación 1 que comprende una cantidad eficaz de polipéptido LbpB recombinante de Neisseria meningitidis, que comprende una secuencia de aminoácidos adicional que facilita la purificación del polipéptido.

3. La vacuna de la reivindicación 1 ó 2, que comprende una cantidad eficaz de polipéptido LbpB que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 10, durante su longitud completa, o una proteína de fusión de la misma.

4. La vacuna de la reivindicación 1 ó 2, que comprende una cantidad eficaz de polipéptido LbpB que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 10 durante su longitud completa, o una proteína de fusión de la misma.

5. La vacuna de la reivindicación 1 ó 2 que comprende una cantidad eficaz de polipéptido LbpB de Neisseria meningitidis que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 ó 10, de la posición de aminoácido 19 al extremo C del polipéptido, o una proteína de fusión de la misma.

6. La vacuna de la reivindicación 5, en el que el polipéptido LbpB tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 ó 10, o una proteína de fusión de la misma.

7. La vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicha composición comprende al menos un antígeno de N. meningitidis diferente.

8. Un procedimiento para preparar una vacuna que comprende las etapas de producir LbpB recombinante unido a un lípido cultivando una célula huésped que comprende un sistema de fusión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es al menos el 70% idéntico al de la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10 durante su longitud completa, o una proteína de fusión de la misma, en la que dicho sistema de expresión es capaz producir un polipéptido LbpB recombinante en una célula huésped compatible; y recuperar el polipéptido del cultivo y formular con un vehículo adecuado.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el polipéptido LbpB recuperado del cultivo es parte de una vesícula de la membrana externa.

10. Un polipéptido LbpB no unido a lípidos de Neisseria meningitidis que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 10 durante su longitud completa, o una proteína de fusión del mismo, para uso en terapia, en el que el polipéptido se administra en una cantidad eficaz.

11. Uso de una cantidad eficaz de polipéptido LbpB no unido a lípidos de Neisseria meningitidis que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 10 durante su longitud completa, o una proteína de fusión del mismo, en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar enfermedad causada por Neisseria en un ser humano.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho polipéptido o proteína es para administrar por vía oral, por vía subcutánea, por vía intratraqueal, por vía intramuscular o por vía intranasal.