KR20010022952A - 나이세리아 락토페린 결합 단백질 - Google Patents

나이세리아 락토페린 결합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 LbpB 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드, 및 재조합 기술에 의해 이러한 폴리펩티드를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 나이세리아 질환을 치료하고, 이러한 질환을 진단 검정하기 위한 프로토콜 고안에서 LbpB 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

나이세리아 락토페린 결합 단백질 {NEISSERIA LACTOFERRIN BINDING PROTEIN}
수막염은 박테리아나 바이러스에 의해 유발되는데, 박테리아에 의해 유발된 형태가 가장 심각하다. 주된 원인이 되는 박테리아는 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 및 스테렙토코루스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)이다. 헤모필루스 인플루엔자 타입 B(Hib)에 대한 컨주게이트 백신의 개시와 통상의 유아 백신화로의 통합 이래로, 나이세리아 메닝지티디스는 전 세계 수막염의 대부분 경우를 차지하고 있으며, 미국에서만 연간, 2,600건으로 산정되고 있다.
나이세리아 메닝지티디스는 캡슐 모양의 다당류의 조성에 따라 13가지의 세로그룹으로 세분된다. 또한, 각각의 세로그룹은 박테리아의 다른 성분을 기준으로 하여 세로타입, 서브타입 및 이뮤노타임으로 더 분류된다. 세 가지의 세로그룹(A,B 및 C)이 수막염의 90% 이상을 차지하며, 개발된 산업국가에서는 세로그룹 B가 50내지 80%의 경우가 되고 있다.
캡슐형 폴리사카라이드를 기재로 한 효과적인 백신이 개발되어 나이세리아 메닝지티디스 세로그룹 A 및 C에 의해 유발된 수막염을 예방하고 있다. 세로그룹 C 다당류 백신은 2세 미만(수막염이 발병될 수 있는 가장 위험한 연령범위)의 유아에게는 보호효과를 발생시키지 못하지만, 이러한 단점은 다당류를 운반 단백질에 컨주게이팅시킴으로써 극복될 수 있다. 컨주게이션은 항원에 대한 면역학적 기억을 유도하는 추가의 장점이 있다.
반면, 나이세리아 메닝지티디스 세로그룹 B의 다당류는 컨주게이트된 형태이든 그렇지 않은 형태이든 관계없이 인체에서 면역원성을 나타내지 않거나 거의 나타내지 않는다. 따라서 다당류 기재 백신이 아닌 백신으로서, 나이세리아 메닝지티디스(특히, 세로그룹 B)에 의해 유발된 나이세리아 질환에 대한 백신을 개발하는 것이 상당히 요구되고 있다.
유력한 종류의 백신 후보로는 나이세리아 메닝지티디스의 외부막 단백질(OMPs)를 이용하는 백신에 있는데, 그 이유는 이러한 백신이 면역원성이며 사람 면역 반응과 유사하게 될 수 있는 항원을 제공할 수 있기 때문이다. 세포내로의 철의 흡수에 관여하는 OMPs가 특히 유망하다.
철은 대부분 박테리아의 필수 영양소이다. 인체의 세포외 구획에서, 철은 혈청중의 트랜스페린 및 점막 표면상의 락토페린과 주로 복합되며(Finkelstein et al., 1983), 무시될 만한 양이 유리된 형태로 있다. 따라서, 효과적인 철의 포착은 병원성 박테리아에 대한 중요한 특성 인자이다. 나이세리아 메닝지티디스, 특히 (사람의 정확한 병원체)에 관해서는, 이의 철 요구는 세포가 단백질과 결합하여 세포의 성장에 필요한 철을 흡수하게 할 수 있는 트랜스페린 또는 락토페린과 같은 사람의 철 킬레이트화 단백질에 대한 수용체를 이용함으로써 이루어지고 있다. 이러한 수용체 단백질의 합성은 박테리아가 철 한계를 감지하는 경우에 유도된다.
트랜스페린, 즉, TbpA 및 TbpB[문헌:Cornelissen et al., 1992; Legrain et al., 1993; Anderson et al., 1994] 및 락토페린 결합 단백질 A(LbpA)[문헌: Pettersson et al., 1993; 1994b; Biswas and Sparling, 1995]으로부터의 철의 흡수와 관련된 수용체 단백질이 클로닝되고 서열화되었다. 트랜스페린 결합 수용체 단백질은 외부막에서 복합체를 형성한다. 나이세리아 메닝지티디스에서는, TbpA 및 TbpB 모두가 철의 수송에 필수적인 듯하다(Irwin et al., 1993). TbpA는 통합성 막 단백질이지만, TbpB는 리포단백질이고 단지 지질 잔기로만 막에 고정되어 있다. 수용체의 현재 메카니즘 모델은 철 부화된 트랜스페린이 수용체 복합체에 결합함을 제시하고 있다. 이러한 복합체에서, TbpB 단백질이 철산염화된 트랜스페린과 아포-트랜스페린을 구별한다. 트랜스페린의 결합은 트랜스페린으로부터 철을 방출하고 TbpA중의 게이트가 있는 기공을 개방하는 수용체에서 형태적인 변화를 유도하고, 철을 외부막을 가로질러 수송할 수 있다(Cornelissen and Sparling, 1994; 1996).
락토페린 수용체가 또한 나이세리아 메닝지티디스의 중요한 독성 인자인 것으로 사료된다. 인체로의 주된 유입 부위는 락토페린이 주된 철 공급원인 경우에 코인두(nasopharynx)이다. 또한 예비적인 보고에 의하면 락토페린은 급성 염증 상태에서 혈액-뇌 방벽을 가로질를 수 있다고 하고 있다(Gschwentner et al., 1997). 락토페린은 또한 박테리아가 수막에 도달하는 경우에 감염 후기 단계의 메닝고코시(meningococci)에 대한 중요한 철 공급원이라는 것이 가능하다. 친화성 단리 방법을 이용함으로써, 단일의 락토페린 결합 단백질이 처음 분리되었다(Schryvers and Morris, 1988). LbpA라 명명된 이러한 수용체의 구조 유전자가 특정화되었으며(Pettersson et al., 1993; 1994b; Biswas and Sparling, 1995), 외부막에서의 단백질에 대한 위상 모델이 제안되었다(Pettersson et al., 1994a). 단백질은 TbpA와 동족성을 나타낸다. 또한, 가능한 개방 해독 프레임의 일부가 lbpA 유전자의 상류에서 동정되었으며, 추정된 아미노산 서열이 TbpB와 동족성을 나타냈다(Pettersson et al., 1994a).
TbpB 및 그 밖의 정제된 메닝고코시 OMP가 나이세리아 메닝지티디스에 대한 백신으로서의 용도에 관한 본 발명 이전의 특허원의 대상이였다(예, TbpB, WO 9307172; 22kDa surface protein, WO 9629412; heamaglobin receptor, WO 9612020; porin protein, WO 9503413; pilin proteins, WO 9408013; 64kDa OMP, EP 474313-B1)
이로 한정되는 것은 아니지만, 나이세리아 질환(예,수막염)을 포함한 기능부전 또는 질환을 예방하거나, 완화시키거나, 치료하는 역할을 할 수 있는 OMP계의 또 다른 구성원을 동정하고 특정화하는 것이 요구되고 있다.
LbpA에 대한 항체는 살균성이 아닌 듯하며 그로 인해서 백신으로서 제한적으로 사용될 수 있다(Pettersson et al., 1993).
본 발명은 또 다른 락토페린 결합 수용체 단백질, 락토페린 결합 단백질 B(LbpB), 락토페린으로부터의 철을 이용하는데 있어서의 이의 역할, 및 이의 치료학적 용도를 동정하고 특정화한다.
LbpB는 다른 OMP 백신류에 비해 몇가지 이점이 있다. 첫째, 메닝고코시 질환의 혈액 발병된 단계에서, 사람 락토페린은 유기체에 필수적인데, 그 이유는 이러한 락토페린이 사람 트랜스페린 보다 철을 결합하는 친화성이 300배 더 높으며, 그로 인해서, 철 공급원으로서 락토페린의 사용이 유기체에 필수적이기 때문이다. 둘째, 락토페린은 공지된 항균효과를 지니며, 이의 혈중 농도는 감염시에 증가한다. 따라서 이러한 효과에 대한 어떠한 내성을 얻는 방법으로서 유기체가 사람 락토페린과 결합하는 것이 중요하다. 마지막으로 사람 락토페린은 박테리아가 인체(nasopharynx)에 유입된 위치에서 나이세리아 메닝지티디스에 대한 철의 주요 공급원이다.
이러한 이점의 중요한 사항은 LbpB 항원이 체내의 대부분 메닝고코시의 세포표면에서 발현되는 것으로 여겨지며, LbpB의 세포 표면 도메인이 락토페린을 효과적으로 결합시켜야 하기 때문에 아주 잘 보존되는 것으로 여겨지며, LbpB 항원에 대해서 유도된 면역 반응이 혈중의 메닝고코시의 어떠한 감염을 중시시키며 코인두내에서 유기체의 운반을 중지시킬 수 있다는 것이다.
발명의 요약
한가지 관점으로, 본 발명은 LbpB 폴리펩티드, 및 이의 생산을 위한 제조합 재료 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 관점은 LbpB 폴리펩티드와 폴리누클레오티드를 이용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 용도는 여러 가지 다른 상황중에서도 나이세리아성 질환(예,수막염)의 예방 및 치료에 관한 것이다. 또 다른 관점으로, 본 발명은 LbpB의 존재와 연관된 질환을 검출하는 진단적인 검정 방법에 관한 것이다.
도면에 대한 간단한 설명
도 1은 철의 제한하에 성장한 전체 세포로부터 얻은 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시하는 도면이다. 래인 1과 5는 균주 BNCV이고; 래인 2와 6은 LbpA 돌연변이 CE1452이며; 래인 3과 7은 lbpB 돌연변이 CE1454이고; 래인 4와 8은 lbpAB 돌연변이 CE1042이다. 사용된 항혈청은 LbpB 서열을 기재로 하여 합성 펩티드에 대해 유도된다. 래인 1 내지 4는 펩티드 C1에 대한 혈청 17-3이다. 래인 5 내지 8은 펩티드 E1에 대한 혈청 19-1이다. 분자 크기 표준의 위치는 수천 단위로 오른쪽에 표시되어 있다. LbpB 단백질은 왼쪽에 화살표로 표시된다.
도 2는 균주 BNCV의 lbpB와 lbpA 유전자를 함유하는 DNA 단편의 제한 지도를 도시하는 도면이다. 상이한 재조합 플라스미드와 PCR 생성물(PCR) 중의 삽입체가 개방박스로 표시된다. 플라스미드 pAM23과 pAM1은 본 발명 이전에 특정화된 lbpBA 자리의 단편을 함유한다(Pettersson et al., 1993, 1994a). 개방 해독 프레임은 진한 화살표로 표시되어 있다. 라이브러리를 스크리닝하는데 사용되거나 서던 블롯팅을 위한 프로브가 개방 해독 프레임의 위에 있다. PCR 증폭에 사용된 프라이머의 위치가 개방 해독 프레임의 아래에 있다. pAM6k중의 카나마이신 내성 박스의 삽입 부위는 개방 삼각형으로 표시되어 있다. pAM23E 중의 에리트로마이신 내성 박스는 폐쇄된 삼각형으로 표시되어 있다.
도 3은 균주 BNCV의 단백질 LbpB와 균주 B16B6의 단백질 TbpB의 배열을 도시하는 도면이다. 동일한 아미노산은 점선으로 표시되어 있다. 오른쪽으로의 수치는 아미노산의 위치를 나타낸다. 갭(-)는 최적의 배열을 달성하도록 도입된다. 마우스를 면역화시키는데 사용된 펩티드가 LbpB의 서열위에 표시되어 있다. 음으로 하전된 전기가 풍부한 두 개의 스프레치가 밑줄그어져 있다. 추정성 시그날 펩티다제 Ⅱ 분해 부위가 서열위에 화살표로 표시되어 있다.
도 4는 lbpB 상류의 프로모터 영역의 서열을 도시하는 도면이다. 번역 개시 부위(ATG)가 진하게 표시되어 있다. 리보좀 결합부위 및 추정성-10 및 -35 박스가 밑줄그어져 있다(각각 두꺼운 선과 얇은 선). 추정성 Fur 박스는 박스안에 있다.
도 5는 TSB 배지(래인 1,3,5 및 7), 및 EDDA를 함유한 TSB(래인 2,4,6 및 8)에서 성장한 전체 세포로부터 얻은 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시하는 도면이다. 사용된 항체는 LbpA(패널 A)에 대해서 유도된 단일클론성 항체 mn98k1과 mn98k2, 또는 LbpB 펩티드 C1(패널 B)에 대한 항혈청 17-3이었다. 래인 1과 2는 균주 BNCV이고; 래인 3과 4는 lbpA 돌연변이 CE1452이며; 래인 5와 6은 lbpB 돌연변이 CE1454이고; 래인 7과 8은 lbpAB 돌연변이 CE1402이다.
도 6A는 철의 제한하에 성장한 메닝고코시 균주 BNCV의 외부막으로부터 얻은 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시하는 도면이다. 외부막 단백질은 비변성화 조건하에 전기영동되며, LbpB 단백질은 합성 팹티드 A1에 대해서 유도된 혈청으로 검출된다. 래인 1과 2는 전기영동전에 각각 0℃와 95℃에서 인큐베이팅된 샘플을 나타낸다. 분자 크기 표준의 위치가 수천단위로 오른쪽에 표시되어 있다. 도 6B는 철의 제한하에 성장한 메닝고코시 균주 BNCV의 외부막 복합체로부터 얻은 단백질에 의한 웨스턴 블롯상에서의 락토페린 결합 검정을 도시하는 도면이다. 외부막 단백질 복합체로부터 얻은 단백질을 비변성화 조건하에 전기영동하였으며, 블롯을 퍼옥시다제 결합된 사람 락토페린과 함께 인큐베이팅하였다. 래인 1 내지 3은 전기영동전에 각각 0℃, 37℃ 및 95℃에서 인큐베이팅된 샘플을 나타낸다. 분자 크기 표준의 위치가 수천단위로 오른쪽에 표시되어 있다.
도 7은 전체 세포 ELISA-다입 검점에서 락토페린이 lbp 돌연변이체에 결합하는 것을 도시하는 도면이다. 오른쪽에 표시된 균주가 웰에 피복된다. 락토페린은 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 및 Ong/ml(각각 순서에 따라 1-8)의 농도로 첨가된다. 세포에 결합된 락토페린은 퍼옥시다제-컨주게이트된 락토페린 특이적 항혈청으로 검출된다.
도 8은 재조합 사람 락토페린에 의한 균주의 플레이트 공급 검정을 도시하는 도면이다. 플레이트의 관련 부분만을 도시한다. 오른쪽에 표시된 균주의 세포가 철 제한된 플레이트상에 플레이팅된다. 지시된 농도의 락토페린의 방울에 의한 성장 자극을 밤새 성장후에 모니터링하였다. 화살표는 패널 B에서의 방울의 위치를 나타낸다. 이러한 실험에서, 11% 철 포화된 락토페린이 사용된다.
도 9는 다섯 가지의 메닝고코시 균주로부터 얻은 LbpB 단백질의 배열을 나타낸다. 배열은 CLUSTAL 프로그램(PC Gene, IntelliGenetics)으로 수행되며 수동으로 최적화된다. 오른쪽으로의 수치는 아미노산의 위치를 나타낸다. 갭(-)은 최적의 배열을 달성하도록 도입된다. 다섯 가지 모두의 서열이 동일한 위치가 별표(*)로 표시된다.
도 10A는 pJP29(Bosch et al., 1986), pAM31 및 pAM32의 관련부분의 제한지도를 도시하는 도면이다. 단지 삽입부만을 나타내고 있다. 벡터는 pACYC184이다. pJP29는 자신의 프로모터 뒤에 phoE 유전자(밝은 회색)를 함유한다. 프로모터와 플랭킹 서열은 백색이다. PstI-부위는 PhoE 단백질의 시그날 서열과 성숙한 부분에 상응하는 서열의 경계부에 있다. pAM31은 왼쪽으로부터 오른쪽으로 PhoE 프로모터(백색), PhoE의 시그날 서열을 암호화하는 재조합 유전자(밝은 회색), 및 성숙한 LbpB(검은색)를 함유한다. LbpA(짙은 회색)의 N 말단, PhoE(밝은 회색)의 C 말단, 및 플랭킹 서열(백색)에 상응하는 DNA 단편이 잘 나타나고 있다. pAM32는 His-tag 및 펙터 Xa(Factor Xa) 분해 부위를 암호화하는 링커(줄무늬 박스)를 pAM31의 PstI-부위내로 삽입시킴으로써 pAM31로부터 구성된다. pAM31 및 pAM32의 구성에 대한 자세한 사항은 실시예 8을 참조할 수 있다. pAM32상의 제한 부위는 괄호로 나타내고 있는데, 그 이유는 이러한 부위가 클로닝 과정에서 상실되기 때문이다.
도 10B는 재조합 LbpB 구성물의 아미노산 서열(하부)을 야생형 LbpB 서열(상부)과 비교하는 도면이다. 각각 LbpB/PhoE 시그날 서열과 성숙한 LbpB의 마지막과 첫 번째 아미노산 잔기만을 도시하고 있다. His-tag와 펙터 Xa 분해 부위가 전체적으로 도시되어 있다. 리더 펩티다제 I 및 II(각각, LPase I 및 II)와 펙터 Xa 분해 부위가 화살표로 표시되어 있다.
도 11은 정제된 재조합 LbpB 단백질의 PAGE를 도시하는 도면이다. 래인 1과 2는 전기영동전에 각각 0℃와 100℃에서 인큐베이팅된 샘플을 나타낸다. 분자량 표준의 위치가 kDa 단위로 오른쪽에 표시되어 있다.
도 12는 다섯 가지의 사람 회복기 혈청에 의한 폴디드(래인 1, 3, 5, 7 및 9) 재조합 LbpB 및 변성된(래인 2, 4, 6, 8 및 10) 재조합 LbpB의 웨스턴 블롯을 도시하는 도면이다. 래인 1과 2는 혈청 69이고; 래인 3과 4는 혈청 262439이며; 래인 5와 6은 혈청 262532이고; 래인 7과 8은 혈청 263017이며; 래인 9와 10은 혈청330이다. 분자 크기 표준의 위치는 킬로달톤 단위로 오른쪽에 표시되어 있다. 왼쪽의 화살표는 변성된(dLbpB) 및 폴디드 LbpB(fLbpB)의 위치를 나타낸다.
도 13은 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행된 항 전체 세포 및 항-LbpB ELISA(표 7)의 결과를 도시하는 도면이다. 도 13A는 LbpB 또는 나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV 전체 세포에 의해 면역된 마우스에서의 항-LbpB 반응을 도시하는 도면이다. 대조 면역화는 PBS 용액으로 수행되었다. 도 13B는 LbpB 또는 나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV 전체 세포로 면역된 마우스에서의 항 전체 세포(철 부족 조건에서 성장한 균주 BNCV)반응을 도시하는 도면이다. 대조 면역화는 PBS 용액으로 수행되었다. 도 13C는 LbpB 또는 나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV 전체세포로 면역된 마우스에서의 항 전체 세포(철 부족 조건하에 성장한 균주 H44/76) 반응을 나타내는 도면이다. 대조 면역화는 PBS 용액으로 수행되었다.
도 14는 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행된 항 전체세포 및 항 균주 BNCV LbpB 혈청의 박테리아 활성(표 8)의 결과를 도시하는 도면이다. 도 14A는 나이세리아 메닝지티디스 균주 H44/76(철 풍부 조건에서 성장)에 대한 살균 역가이다. 도 14B는 나이세리아 메닝지티디스 균주 H44/76(철 고갈된 조건에서 성장)에 대한 살균 역가이다.
본 발명은 신규의 폴리누클레오티드, 이러한 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드, 이러한 폴리누클레오티드와 폴리펩티드의 용도, 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 폴리누클레오티드와 폴리렙티드는 나이세리아 외막 단백질(OMP)계와 관련이 있으며, 특히 락토페린 결합 단백질 B(LbpB)와 관련이 있다. 또한, 본 발명은 나이세리아 질환에 대한 백신의 경우와 같은 LbpB의 치료학적 용도에 관한 것이다.
정의
이하의 정의는 본원에서 자주 사용되는 특정 용어의 이해를 용이하게 하고자 하는 것이다.
용어 "LbpB"는 일반적으로 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 대립유전자 변이체를 지니는 폴리펩티드, 바람직하게는 리포단백질을 나타낸다.
용어 "LbpB 활성 또는 LbpB 플리펩티드 활성" 또는 "LbpB 또는 LbpB 폴리펩티드의 생물학적 활성"은 유사한 활성을 포함한 LbpB의 대사성 또는 생리학적 기능을 의미한다. 특히, LbpB 활성은 사람 락토페린에 결합하는 능력이다. 이러한 LbpB의 활성은 실시예 6에 기재된 방법을 이용함으로써 시험될 수 있다. 또한 LbpB의 항원성 및 면역원성 활성이 본 정의에 포함된다. 이러한 항원성은 실시예 9에 기재된 면역블롯 방법, 바랍직하게는 실시예 10A에 기재된 메닝고코시 균주 BNCV의 LbpB에 대한 폴리클론성 혈청을 이용함으로써 최상으로 시험될 수 있다. 면역원성은 실시예 10B에 기재된 메닝고코시 균주 BNCV로부터의 정제된 LbpB를 사용하는 ELISA에서 항체반응(변이체에 대해서 발생된 폴리클론성 혈청을 이용)을 측정함으로써 최상으로 시험될 수 있다.
용어 "lbpB 유전자"는 서열번호 1에 기재된 누클레오티드 서열 100-2274, 또는 서열번호 3, 5, 7 또는 9에 기재된 완전한 누클레오티드 서열, 또는 이의 변이체 및/또는 이의 보체를 지니는 폴리누클레오티드를 의미한다.
용어 "항체"는 Fab 또는 그밖의 면역글로불린 발현 라이브러리의 생성물을 포함한 Fab 단편 뿐만 아니라, 폴리글론성 및 단일클론성 항체, 키메라체, 단일쇄, 및 인간화된 항체를 포함한다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 "사람의 손에 의해" 변화됨을 의미한다. "단리된" 조성 또는 물질이 천연이면, 이는 최초의 환경으로부터 변화되거나, 제거되거나, 변화되고 제거된 것이다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리되"지 않은 것이지만, 자연 상태의 공론 물질로부터 분리된 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이며, 그러한 용어가 본원에 사용되고 있는 것이다.
용어 "폴리누클레오티드"는 일반적으로 변화되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 변화된 RNA 또는 DNA일 수 있는 모든 폴리리보누클레오티드 또는 폴레데옥시리보누클레오티드를 의미한다. "폴리누클레오티드"는 제한없이 단일 및 이중가닥 DNA, 단일 및 이중가닥 RNA, 및 단일 및 이중가닥이 혼합되어 있는 RNA, 및 단일가닥이거나, 더욱 전형적으로는 이중가닥이거나, 단일가닥과 이중가닥 영역이 혼합될 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, "폴리누클레오티드"는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함하는 삼중가닥 영역을 의미한다. 용어 폴리누클레오티드는 또한 하나 이상의 변화된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 그 밖의 이유로 변화된 골격을 지닌 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변화된" 염기는, 예를 들어, 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 특정의 염기를 포함한다. 다양한 변화가 DNA 또는 RNA에 적용됨으로써, "폴리누클레오티드"는 바이러스 및 세포 특성의 DNA 및 RNA의 화학적 형태 뿐만 아니라, 자연에서 전형적으로 발견되는 폴리누클레오티드의 화학적, 효소적, 또는 대사적으로 변화된 형태를 포함한다. "폴리누클레오티드"는 또한 올리고누클레오티드로 일컬어지기도 하는 비교적 단쇄의 폴리누클레오티드를 포함한다.
용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변화된 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 둘 이상의 아미노산, 즉, 펩티드 이소스테레를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 의미한다. "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 또는 올리고머라 일컬어지는 단쇄, 및 일반적으로 단백질이라 일컬어지는 장쇄 둘 모두를 의미한다. 폴리펩티드는 20 유전자-암호화된 아미노산이 아닌 아미노산을 함유할 수 있다. "폴리펩티드"는 후번역 과정과 같은 자연과정, 또는 기술 분야에 공지된 화학적 변화기술에 의해서 변화된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변화는 방대한 조사 문헌 뿐만 아니라 기초 문헌, 및 보다 상세된 연구 논문에 잘 기재되어 있다. 변화는 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 포함한 폴리펩티드내에서 발생할 수 있다. 동일한 변화 형태가 주어진 폴리펩티드내의 몇몇 부위에서 동일하거나 변화된 정도로 존재할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 많은 형태의 변화를 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 유비퀴틴화에 의해 측쇄를 지닐 수 있으며, 측쇄가 있거나 없는 상태로 고리화될 수 있다. 고리형 폴리펩티드, 측쇄 함유 폴리펩티드 및 측쇄 함유 고리형 폴리펩티드는 후번역성 자연과정으로부터 유도되거나, 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. 변화는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합, 헤메(heme)잔기의 공유결합, 누클레오티드 또는 누클레오티드 유도체의 공유결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합, 포스포티딜이노시톨의 공유결합, 가교결합, 고리화, 이황화물 결합 형성, 탈메틸화, 공유성 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 과정, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 술페이트화, 아르기닐화와 같은 단백질에의 아미노산의 첨가로서 트랜스퍼-RNA 중재된 첨가, 및 유비퀴틴화를 포함한다. 참조예[PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ND Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-2 in PROSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646 and Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62]
본원에 사용된 "변이체"는 각각 기준 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드와는 다르지만, 필수적인 생물학적 성질을 보유하고 있는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드이다. 폴리누클레오티드의 전형적인 변이체는 다른 기준 폴리누클레오티드와는 누클레오티드 서열이 다르다. 변이체의 누클레오티드에서의 변화는 기준 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키거나 변화시키지 않을 수 있다. 누클레오티드 변화는 이하 설명되는 바와 같이 기준 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 첨가, 삭제, 융합, 및 절단을 유도할 수 있다. 전형적인 폴리펩티드 변이체는 다른 기준 폴리펩티드와는 아미노산 서열이 다르다. 일반적으로 차이는 기준 폴리펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로는 아주 유사하고, 많은 영역에서 동일하도록 제한된다. 변이체와 기준 폴리펩티드는 어떠한 조합 형태의 하나 이상의 치환, 첨가, 삭제에 의해 아미노산 서열이 다를 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화된 잔기이거나 그렇지 않을 수 있다. 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 자연적으로 발생되거나(예를 들어, 서열번호 3, 5, 7 또는 9는 서열번호 1의 lbpB 폴리누클레오티드의 변이체이며; 서열번호 4, 6, 8 또는 10은 서열번호 2의 LbpB 폴리펩티드의 변이체이다), 자연적으로 발생되는 것으로 공지되지 않는 변이체일 수 있다. 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드의 비천연 변이체는 돌연변이 유발기술 또는 직접적인 합성에 의해 생성될 수 있다. 이러한 변이체는 LbpB 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유해야 한다. 이들은 또한 사람 락토페린과 결합할 수 있거나(바람직하게는, 실시예 6에서의 활성에 대한 시험에 기재된 바와 같이), LbpB와 유사한 항원성 또는 면역원성 활성을 지녀야 한다. 항원성은 실시예 9에 기재된 면역블롯 방법, 바람직하게는 실시예 10A에 기재된 메닝고코시 균주 BNCV의 LbpB에 대한 폴리클린성 혈청을 이용함으로써 최상으로 시험될 수 있다. 면역원성은 실시예 10B에 기재된 바와 같이 메닝고코시 균주 BNCV로부터의 정제된 LbpB를 사용하는 ELISA에서 항체반응(변이체에 대해서 생성된 폴리클론성 혈청을 사용)을 측정함으로써 최상으로 시험될 수 있다. 바람직하게는, 변이체는 모든 상기된 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
용어 "상동성"은 누클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 상동성의 수치이다. 일반적으로, 서열은 가장 높은 차수의 매치가 얻어지도록 정렬된다. "상동성"은 본질적으로 본 기술 분야에서 인식되는 의미를 지니며 공개된 문헌을 참조함으로써 계산할 수 있다. 참조예[COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed., Academic press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New jersey, 1994; SEQUENCE ALALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heijne, G., Acdemic Press, 1987; SEQUENCE ALALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]. 두 가지의 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 상동성을 측정하는 많은 방법이 있지만, 용어 "상동성"은 본 기술 분야의 전문가에게는 잘 알려져 있다. [문헌: Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math(1988) 48: 1073]. 두 개의 서열 사이의 상동성 또는 유사성을 측정하는데 일반적으로 이용되는 방법에는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 문헌[Guide to Huge Computers, Martin J. Bioshop, ed., Academic Press, SanDiego, 1994, and Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math(1988) 48:1073]에 기재된 방법이 포함된다. 상동성 및 유사성을 측정하는 방법은 컴퓨터 프로그램으로 암호화되어 있다. 두 개의 서열 사이의 상동성 및 유사성을 측정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은, 이로 제한되는 것은 아니지만, GCS 프로그램 패키지[문헌:Devereux, J., et al., Nucleic Acids research (1984) 12(1): 387], BLASTP, BLSTN, FASTA[문헌: Atschul, S.F. et al., J Molec Biol(1990) 215:403]를 포함한다.
예시하여 보면, 서열번호 1의 기준 누클레오티드 서열과 예를 들어 95% 이상의 "상동성"을 지니는 누클레오티드 서열을 지닌 폴리누클레오티드는 폴리누클레오티드의 누클레오티드 서열이 서열번호 1의 기준 누클레오티드 서열의 100 누클레오티드 당 평균 5개까지의 돌연변이를 포함할 있음을 제외하고는 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 달리 설명하면, 기준 누클레오티드 서열과 95%이상 동일한 누클레오티드 서열을 지니는 폴리누클레오티드를 얻기 위해서는, 기준 서열중의 5%까지의 누클레오티드가 삭제되거나 다른 누클레오티드로 치환되거나, 기준 서열중의 전체 누클레오티드 중 5%까지의 많은 누클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 돌연변이는 기준 누클레오티드 서열 5'또는 3' 말단 위치, 또는 기준 서열내의 하나 이상의 인접 그룹에 존재하는 누클레오티드중에 개별적으로 산재된 이들 말단 사이의 어떠한 곳에서 발생될 수 있다.
유사하게, 서열번호 2의 기준 아미노산 서열과 예를 들어 95% 이상의 "상동성"을 지니는 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드는 폴리펩티드 서열이 서열번호 2의 기준 아미노산 서열의 100 아미노산 당 평균 5개까지의 아미노산 변경을 포함할 있음을 제외하고는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 달리 설명하면, 기준 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 이미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 얻기 위해서는, 기준 서열중의 5%까지의 아미노산 잔기가 삭제되거나 다른 아미노산으로 치환되거나, 기준 서열중의 전체 아미노산 잔기 중 5%까지의 많은 아미노산이 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단, 또는 기준 서열내의 하나 이상의 인접 그룹에 존재하는 잔기중에 개별적으로 산재된 말단 위치 사이의 어떠한 곳에서 발생될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드
한 가지 관점으로, 본 발명은 LbpB 폴리펩티드(또는 LbpB 단백질)에 관한 것이다. LbpB 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 폴리펩티드(잔기 1-18은 각각의 단백질의 천연 시그날 펩티드이며, 잔기 Cys19는 천연의 성숙한 단백질에 지질화되는 N-말단 아미노산이다); 서열번호 2, 4, 6, 8 또는10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 2, 4, 6, 8 또는10의 아미노산 서열과 65% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10과 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상,보다 더 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 95 내지 99% 이상의 상동성을 지니는 서열을 폴리펩티드라면 아주 바람직다. 또한 LbpB 폴리펩티드는 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 아미노산을 서열을 지니는 폴리펩티드에 65% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10과 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80%이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드를 포함한다. 또한 95 내지 99%의 상동성을 지니는 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드라면 아주 바람직하다.
서열번호 2, 4, 6, 8 및 10에 제공된 LbpB 폴리펩티드는 각각 나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV, M981, H44/76, M990 및 881607로부터 얻은 LbpB 폴리펩티드이다.
LbpB 폴리펩티드는 "성숙한" 단백질의 형태이거나, 융합 단백질과 같은 보다 큰 단백질의 일부일 수 있다. 분비성 서열 또는 리더 서열(예컨데, 천연 LbpB 리더 서열; 서열번호 2, 4, 6, 8 및 10내의 잔기 1-18), 프로-서열, 다중 히스티딘 잔기와 같은 정제에 도움을 주는 서열, 또는 재조합 생산 동안의 안정성을 위한 추가의 서열을 함유하는 추가의 아미노산 서열을 포함하는 것이 유리할 수 있다.
LbpB 폴리펩티드의 단편이 또한 본 발명에 포함된다. 단편은 상기된 LbpB 폴리펩티드의 아미노산 서열의 전체는 아니지만 일부가 완전히 동일한 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드이다. LbpB 폴리펩티드에 관하여 설명하면, 단편은 "그 자체로 독립적(free-standing)"이거나, 일부 또는 영역을 형성하는 보다 큰 폴리펩티드내에 포함될 수 있는데, 가장 바람직한 것은 단일의 연속 영역으로 존재하는 것이다. 본 발명의 대표적인 폴리펩티드 단편의 예에는 예를들어, 아미노산 수 약 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, 및 101로부터 LbpB 폴리펩티드의 발단에 이르는 단편이 포함된다. 상기 문장에서 "약"은 어느 한쪽 끝부분 또는 양쪽 끝부분에서 몇 개, 5, 4, 3, 2 또는 1 아미노산에 의해 더 길거나 더 짧은 특정적으로 열거된 범위를 포함한다.
바람직한 단편에는, 예를 들어, 아미노 말단을 포함하는 연속적인 일련의 잔기 또는 카르복실 말단 및/또는 트랜스막 영역을 포함하는 연속적인 잔기의 삭제, 또는 하나는 아미노 말단을 포함하고 하나는 카르복실 발단을 포함하는 두 개의 연속적인 일련의 잔기의 삭제를 제외한, LbpB 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지닌 절단 폴리펩티드가 포함된다. 또한 바람직한 단편은 알파-나선 및 알파-나선 형성 영역, 메타-시이트 및 메타-시이트 형성 영역, 베타 양친매성 영역, 가요성 영역, 표면-형성 영역, 기질-결합 영역, 및 높은 항원성 지수 영역을 포함하는 단편과 같이 구조적 또는 기능적 특성에 의해 특정화된 단편이다. 그 밖의 바람직한 단편은 생물학적 활성 단편이다. 생물학적 활성 단편은 LbpB 활성을 중재하는 단편이며, 유사한 활성 또는 개선된 활성을 지니는 단편, 또는 감소된 바람직하게 않은 활성을 지니는 단편이 포함된다. 또한 동물, 특히 사람에서 항원성 또는 면역원성인 단편이 포함된다.
단편은 LbpB 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유해야 한다. 바람직하게는, 폴리펩티드 단편은 전체 LbpB 폴리펩티드가 보유하고 있는 항원성 또는 면역원성 생물학적 활성을 지닌 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10으로부터 유도된 아미노산 서열의 연속 스트레치(16 아미노산 이상)이어야 한다.
단편 및 정의된 서열의 변이체가 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 바람직한 변이체는 보존성 아미노산 치환에 의해 기준물로부터 변화되는 것들, 즉, 잔기가 유사한 특성의 다른 것으로 치환되는 것들이다. 전형적인 치환은 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서; Ser 및 Thr 중에서; 산성 잔기 Asp 및 Glu 중에서; Asn 및 Gln 중에서; 및 염기성 잔기 Lys 및 Arg 중에서; 및 방향족 잔기 Phe 및 Tyr 중에서 있다. 특히 바람직한 변이체는 몇 개, 즉, 5-10, 1-5 또는 1-2 아미노산이 어떠한 조합으로 치환되거나 삭제되거나 첨가되는 변이체이다.
가장 바람직한 변이체는 다른 LbpB 서열(예, 도 9에 표시된 5 LbpB 서열의 동족성 배열)내의 구조적으로 등가의 위치(동족성 배열에 의해 표시된 바와 같이)에서 발견되는 아미노산 치환에 의해 기준 물질로부터 변화된 변이체이다. 특히 바람직한 변이체는 전체 길이에 걸쳐서 기준 서열(예,서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10)의 아미노산 서열과 65% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열을 포함하는 변이체이며, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열을 포함하는 변이체이다. 또한, 95-99% 이상의 상동성을 지니는 변이체라면 아주 바람직하다. 예를 들어, 도 9에서 BNCV로부터의 LbpB가 기준 서열이면, 변이체는 균주 H44/76(각각 잔기 305-313), 균주 M990(각각 잔기 307-315),균주 M981(각각 잔기 302-310) 또는 균주 881607(각각 잔기 303-311)의 LbpB 서열내의 동일한 위치에서 어떠한 잔기로 치환되는 잔기 300-308을 포함할 것이다. 따라서, 아미노산 서열 NPDLAKSHA는 STDVATNLA[ST(M981 잔기302-303으로부터), D(BNCV 잔기 302로부터), V(881607 잔기 306으로부터), A(M990 잔기 311로부터), T(H44/76잔기 310으로부터), NLA(M990 잔기 313-315로부터)]로 치환할 수 있으며, 생성되는 단백질은 변이체 및 본 발명의 폴리펩티드에 속할 수 있다.
이러한 치환은 또한 삭제를 포함할 수 있는데, 예를 들어, 균주 M981의 LbpB의 잔기 357-366이 삭제되는 경우(균주 BNCV로부터의 LbpB에는 동일한 아미노산 위치가 없음-참조 도 9), 이러한 단백질은 변이체 및 본 발명의 폴레펩티드를 구성할 수 있다.
또한, 나이세리아 메닝지티디스와 그 밖의 나이세리아 균주(예, 나이세리아 고노르호에아: Neisseria gonorrhoeae)의 게놈은 서로 게놈적으로 아주 동족성이다. 나이세리아 메닝지티디스와 모락셀라 카타르할리스(Morrxella cntarrhalis: 이전에는 나이세리아 카타르할리스라 일컬어짐)는 유전자 교환이 수행될 만큼 충분히 동족성이다. 나이세리아 균주 및 모락셀라 카타르할리스 균주의 LbpB 동일성 단백질(또는 LbpB 대립유전자 변이체)가 또한 상기된 % 서열 상동성 기준을 충족시키는 한 본 발명의 폴리펩티드를 구성한다. 또한, 이러한 동일성 단백질은 프로그램 BLAST[문헌: Altschul, S.F. et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Karlin, S. and Altschul, S.F. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. and Altschul, S.F. (1993)proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7]로 측정하는 경우 전체 길이에 걸쳐서 기준 서열(서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10)의 서열과 65% 이상의 서열 유사성을 지니는 경우라면, 더욱더 바람직하게는 70% 이상의 유사성, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상의 유사성, 보다 더 바람직하게는 90% 이상의 유사성을 지니는 경우라면 본 발명의 폴리펩티드를 구성할 수 있다. 또한 95-99% 이상의 유사성을 지니는 단백질이라면 아주 바람직하다. 이러한 단백질은 사람 락토페린(정의에 의함)과 결합해야 하며, 메닝고코시 균주로부터의 LbpB에 대한 폴리클론성 혈청과 교차반응을 할 수 있어야 한다. 이러한 변이체의 정확한 아미노산 서열은 서열번호 1-10의 메닝고코시 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 서열로 부터의 정보를 이용함으로써 용이하게 측정될 수 있다.
본 발명의 LbpB 폴리펩티드는 어떠한 적합한 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는 단리된 천연 리포폴리펩티드, 재조합 생산된 폴리펩티드 또는 리포폴리펩티드, 합성 생산된 폴리펩티드, 또는 상기 방법의 조합에 의해 생산된 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 폴리펩티드를 제조하는 수단은 본 기술 분야에서 잘 이해되고 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드
본 발명의 또 따른 관점은 LbpB 폴리누클레오티드에 관한 것이다. LbpB 폴리누클레오티드는 LbpB 폴리펩티드 및 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리누클레오티드 및 이와 밀접하게 관련된 폴리누클레오티드를 포함한다. 더욱 특히, 본 발명의 LbpB 폴리누클레오티드는 각각 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 LbpB 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9에 함유된 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드, 및 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9의 특정 서열을 지니는 폴리누클레오티드를 포함한다. LbpB 폴리누클레오티드는 또한 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 LbpB 폴리펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열과 전체 길이에 걸쳐서 65% 이상의 상동성을 지니는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드, 및 누클레오티드 100부터 누클레오티드 2274까지 서열번호 1의 서열과 65% 이상 동일한 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레티드, 및 서열번호 3, 5, 7 또는 9의 서열과 65% 이상 동일한 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 70% 이상 동일한 폴리누클레오티드가 더욱 바람직하며, 80% 이상 동일한 폴리누클레오티드가 더욱 더 바람직하며, 90% 이상 동일한 폴리누클레오티드가 특히 바람직하다. 또한 95% 이상 동일한 폴리누클레오티드라면 아주 바람직하고, 98~99% 이상 동이한 폴리누클레오티드라면 아주 더 바람직하고, 99% 이상 동일한 폴리누클레오티드라면 가장 바람직하다. 또한 LbpB 폴리누클레오티드는 증폭에 이용될 수 있는 조건하에 혼성화되거나, 프로브 또는 마아커로서의 사용을 위해 혼성화되도록 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9에 함유된 누클레오티드 서열에 대해 충분히 상동성을 지니는 누클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 LbpB 폴리누클레오티드에 상보적인 폴리누클레오티드를 제공한다.
서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9에 제공된 LbpB 폴리누클레오티드는 각각 나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV, M981, H44/76, M990 및 881607로부터의 LbpB 폴리누클레오티드이다.
서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 LbpB 폴리누클레오티드를 암호화하는 누클레오티드 서열은 서열번호 1의 누클레오티드를 100 내지 2274에 함유된 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 각각 서열번호 3, 5, 7 또는 9에 함유된 폴리펩티드 암호화 서열과 동일하거나, 유전 코드의 중복(퇴화)의 결과로서 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 폴리펩티드를 암호화하는 서열일 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드가 LbpB 폴리펩티드의 재조합 생산에 사용되는 경우, 폴리누클레오티드는 성숙한 폴리펩티드(서열번호 2, 4, 6, 8 및 10의 잔기 19 내지 C-말단) 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열; 리더 또는 분비성 서열, 프리-단백질 서열, 프로-단백질 서열, 프리프로-단백질 서열, 또는 그 밖의 융합 펩티드 부분(예, 서열번호 2의 잔기 1 내지18, LbpB의 천연 시그날 서열)을 암호화하는 서열과 같은 다른 코딩 서열을 지닌 해독 프레임내의 성숙한 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 마아커 서열이 암호화될 수 있다. 본 발명의 이러한 관점의 특징의 바람직한 양태에서, 마아커 서열은 pQE 벡터(Qiagen Inc.)로 제공되고 문헌[Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:821-824]에 기재된 바에 의하면 헥사-히스티딘펩티드이거나, HA tag이거나, 글루타티온-s-트랜스페라제이다. 천연 시그날 서열(서열번호 2의 잔기 1 내지 18)에 융합된 LbpB가 또한 바람직하다. 폴리누클레오티드는 또한 전사된 서열, 비번역된 서열, 스플라이싱 및 폴리아테닐화 시그날, 리보좀 결합 부위 및 mRNA를 안정화시키는 서열과 같은 비-코딩 5' 및 3' 서열을 함유할 수 있다.
또한 바람직한 양태는 상기된 LbpB 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 폴리누클레오티드이다. 가장 바람직하게는 폴리누클레오티드는 몇 개, 즉, 10-25, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2, 또는 1 아미노산 잔기가 어떠한 조합으로 치환되거나, 삭제되거나, 첨가되며 있으며, LbpB 폴리펩티드의 생물학적 활성중 적어도 한 활성을 보유하는 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 LbpB 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 상기된 서열에 혼성화되는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 특히 스트린젠트(striugent)조건하에 상기된 폴리누클레오티드에 혼성화되는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "스트린젠드 조건"은 혼성화가 서열 사이에서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 97-99% 상동성이 있는 경우에만 발생될 수 있는 것을 의미한다.
서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9에 함유된 누클레오티드 서열 또는 이의 단편과 동일하거나 충분히 동일한 본 발명의 폴리누클리오티드는 cDNA 및 게놈성 DNA에 대한 혼성화 프로브로 사용되어, 전체길이 cDNA 및 LbpB 폴리펩티드를 암호화하는 게놈성 클론을 단리시키고, LbpB 유전자와 높은 서열 유사성을 지니는 다른 유전자(나이세리아 메닝지티디스가 아닌 다른 종으로부터의 동족체 및 오르톨로그를 암호화하는 유전자를 포함)의 cDNA 및 게놈성 클론을 단리시키는데 사용될 수 있다. 이러한 혼성화 기술은 본 기술분야의 전문가에게는 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 누클레오티드 서열은 기준체의 서열과 80%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 동일하다. 프로브는 일반적으로 15 이상의 누클레오티드를 포함할 것이다. 바람직하게는, 이러한 프로브는 30 이상의 누클레오티드를 지닐 것이며, 50이상의 누클레오티드를 지닐 수 있다. 특히 바람직한 프로브는 30 내지 50 누클레오티드 범위일 것이다.
한 가지 양태에 있어서, 나이세리아 메닝지티디스가 아닌 다른 종류로부터의 동족체와 오르톨로그를 포함하는 LbpB 폴리펩티드를 암호화하는 폴리누클레오티드를 얻는데는, 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9에 함유된 누클레오티드 서열 또는 이의 단편을 지니는 표지된 프로브로 스트린젠 혼성화 조건하에 적절한 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및 전체길이 cDNA 및 폴리누클레오티드 서열을 함유하는 게놈성 클론을 단리하는 단계가 포함된다. 또 다른 관점으로, 본 발명의 LbpB 폴리누클레오티드는 또한 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9에 함유된 누클레오티드 서열 또는 이의 단편을 지니는 누클레오티드 서열에 스트린젠트 조건하에 혼성화되는 누클레오티드 서열을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 또한 LbpB 폴리펩티드는 상기 혼성화를 조건에 의해 얻은 누클레오티드 서열에 의해서 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 이러한 혼성화 기술은 본 기술 분야의 전문가에게는 공지되어 있다. 스트린젠트 혼성화 조건은 상기 정의된 바와 같거나, 50% 포름아미드, 5 x SSC(150mM NaCl, 15mM 삼나트륨 시트레이트), 50mM 인산나트륨(pH7,6), 5 x 덴하트(Denhardt) 용액, 10% 텍스트란 술페이트, 및 20㎍/ml의 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액에서 42℃로 밤새 인큐베이팅한 후에, 약 65℃의 0.1 x SSC에서 필터를 세척하는 조건이다.
본 발명의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드는 동물 및 사람의 질환에 대한 치료제 및 진단제를 발명하기 위한 연구 시약 및 재료로서 이용될 수 있다.
벡터, 숙주세포, 발현
본 발명은 또한 본 발명의 하나의 폴리누클레티드 또는 폴리누클레티드들을 포함하는 벡터, 및 본 발명의 벡터로 유전학적으로 조작된 숙주세포에 관한 것이며, 재조합 기술에 의해서 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 세포 유리 번역 시스템이 또한 본 발명의 DNA 구성물로부터 유도된 RNA를 이용하여 상기 단백질을 생산하는데 이용될 수 있다.
재조합 생산방법의 경우에, 숙주 세포는 본 발명의 폴리누클레오티드에 대한 발현 시스템 또는 이의 일부를 혼입하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 숙주 세포내로의 폴리누클레이티드의 도입은 문헌[Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986) and Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ed Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, N.Y.(1989)]과 같은 많은 균주 실험 매뉴얼에 기재된 방법, 예컨대, 인산칼슘 형질감염, DEAE-텍스트란 중재된 형질감염, 트랜스벡션, 미세주입, 양이온성 지질-중재된 형질감염, 전기영동, 형질유도, 스크렙 부하, 사출 도입 또는 감염으로 수행될 수 있다.
대표적인 적절한 숙주의 예로는 메닝고코시, 스트렙토코시(streptococci), 스타필로코시(staphylococci), 이.콜라이(E. coli), 스트렙토마이세스(streptomyces) 및 바실루스 섭틸리스(Bacilus subtilis) 세포와 같은 박테리아 세포; 효모세포 및 아스페르길루스(Aspergillus) 세포와 같은 진균 세포; 드로소필라 S2(Drosophila S2) 및 스포도프테라 Sf9 세포(Spodoptera Sf9 cell)와 같은 곤충세포; CHO, COS, Hela, C127, 3T3, BHK, HEK 293 및 바우스 멜라노마(Bowes melanoma) 세포와 같은 동물세포; 및 식물세포가 포함된다.
아주 다양한 반현 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 시스템에는 여러 가지 시스템중에서도 염색체, 에피좀 및 바이러스-유도된 시스템, 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 박테리오파아지, 트랜스포손, 효모 에피솜, 삽입 구성요소 및 효모 염색체 구성요소로부터 유도된 벡터, 및 바이러스, 예컨데, 바쿨로바이러스, 파포바 바이러스, 예컨데, SV40, 박시나 바이러스, 아데노바이러스, 전염성 상피층 바이러스, 수도라비에스 바이러스 및 레트로바이러스부터 유도된 벡터, 및 이들의 조합에 의해 유도된 벡터, 예컨대, 플라스미드와 박테리오파아지 유전 구성요소로부터 유로된 벡터, 예컨대, 코스미드와 파아지미드가 포함된다. 발현 시스템은 발현을 발생시킬 뿐만 아니라 조절하는 조절 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 폴리누클레오티드를 유지시키거나, 전파시키거나, 발현시켜, 숙주에서 폴리펩티드를 생성시키기에 적합한 어떠한 시스템 또는 벡터가 사용될 수 있다. 적절한 누클레오티드 서열은 어떠한 다양한 공지된 기술 및 통상의 기술, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL]에 기재된 기술에 의해서 발현 시스템에 삽입될 수 있다.
소포체의 루우멘, 주변세포질 간격 또는 세포내 환경으로 전사된 단백질의 분비의 경우, 적절한 분비 시그날이 요구되는 폴리펩티드내로 혼입될 수 있다. 이를 시그날은 폴리펩티드(서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 잔기 1 내지 8)에 내인성이거나, 이질성인 시그날일 수 있다.
지질화된 재조합 LbpB를 발현시키는데 있어서, 바람직하게는 내인성 시그날 펩티드가 유전자 구성물내에서 암호화되며, 바람직한 숙주 시스템은 박테리아 숙주일 수 있다.
LbpB 폴리펩티드가 스크리닝 검정용으로 발현되는 것인 경우, 일반적으로 폴리펩티드는 세포의 표면에서 생산되는 것이 바람직하다. 이러한 경우에, 세포는 스크리닝 검정에 사용하기 전에 수거될 수 있다. LbpB 폴리펩티드가 배지내로 분비되면, 배지는 폴리펩티드를 수거하고 정제하기 위해서 수거될 수 있으며; 세포내에서 생성되면, 폴리펩티드를 회수하기 전에 세포를 먼저 용해시켜야 한다.
LbpB 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실에퍼타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 공지된 방법에 의해서 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 고성능 액체 크로마토그래피가 정제에 사용된다. 단백질을 리폴딩하는 공지된 기술은 폴리펩티드가 단리 및/또는 정제동안 변성되는 경우에 활성 형태를 재생시키기 위해서 사용될 수 있다.
진단성 검정
본 발명은 또한 LbpB의 용도, LbpB에 대한 항체, 및 진단 시약으로 사용하기 위한 LbpB에 대한 파아지 디스플레잉 항체에 관한 것이다. LbpB의 검출은 여러 질병중에서도 나이세리아 질환의 진단제에 첨가되거나 이러한 진단제를 형성할 수 있는 진단 도구를 제공할 것이다.
진단을 위한 재료는 목적 세포, 예컨대, 혈액, 요, 타액, 또는 조직생검으로부터 얻을 수 있다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 질환 또는 질환에 대한 민감성, 특히 나이세리아 질환에 대한 진단 키드에 관한 것이며, 이러한 커트는 하기 구성 요소를 포함한다;
a) LbpB 폴리누클레오티드, 바람직하게는, 서열번호 1, 3, 5, 7 또는 9의 누클레오티드 서열, 또는 이의 단편;
b) a)의 서열에 상보성인 누클레오티드 서열;
c) LbpB 폴리펩티드, 바람직하게는, 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 폴리펩티드, 또는 이의 단편;
d) LbpB 폴리펩티드, 바람직하게는, 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 폴리펩티드(및 더욱 바람직하게는, 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 폴리펩티드의 잔기 19 내지 C-말단)에 대한 항체; 및
e) LbpB 폴리펩티드, 바람직하게는, 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10(및 더욱 더 바람직하게는, 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 폴리펩티드의 잔기 19 ?? C-말단)에 대한 항체를 디스플레이 하는 파아지.
어떠한 키드에서, (a), (b), (c), (d) 또는 (e)는 실질적인 성분을 포함할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.
항체
본 발명의 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 유사체, 이들을 발현하는 세포가 또한 면역원으로 사용되어 LbpB 폴리펩티드에 면역 특이적인 항체를 생성시킬 수 있다. 용어 "면역 특이적"은 항체가 종래의 관련 폴리펩티드에 대한 친화성 보다 본 발명의 폴리펩티드에 실질적으로 더 친화성을 지니는 것을 의미한다.
LbpB 폴리펩티드에 대해서 생성된 항체는 통상의 원안을 이용하여 폴리펩티드 또는 에피토프-함유 단편, 유사체 또는 세포를 동물, 바람직하게는 비사람에게 투여함으로써 얻을 수 있다. 단일클론성 항체를 제조하는 경우에, 연속적인 세포주 배양물에 의해 생성된 항체를 제공하는 어떠한 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술의 예에는 하이브리도마 기술[문헌: Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497], 티오마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술[문헌: Kozbor et al., Immunology Today(1983) 4:72] 및 EBV-하이브리도마 기술[문헌:Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985]이 포함된다.
단일쇄 항체를 제조하는 기술(미국특허 제4,946,778호)이 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일쇄 항체를 생산하는데 적용될 수 있다. 또한, 유전자 이식 마우스, 또는 그 밖의 동물을 포함하는 다른 유기체가 인간화된 항체를 발현시키는데 이용될 수 있다.
상기된 항체는 폴리펩티드를 발현하는 클론을 단리하거나 동정하거나, 친화성 크로마토그리피로 폴리펩티드를 정제하는데 이용될 수 있다.
LbpB 폴리펩티드에 대한 항체는 또한 여러 질환중에서도 나이세리아 질환(예, 수막염)을 치료하는데 이용될 수 있다. 이러한 항체는 또한 질환을 진단하는데 이용될 수 있다.
백신
본 발명의 또 다른 관점은 여러 질환 중에서도 나이세리아 질환으로부터 동물을 보호하기 위해서 항체 및/또는 T세포 면역 반응을 생성시키기에 충분한 LbpB 폴리펩티드 또는 에피토프 함유 단편, 유사체, 외부막 소포 또는 세포(감쇄되거나 달리 처리됨)로 포유동물을 접종함을 포함하여, 포유동물(바람직하게는, 사람)내에서 면역학적 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 관점은 면역학적 반응을 유도하여 질환으로부터 동물을 보호하기 위해서 생체내 LbpB 폴리누클레오티드의 발현을 유도하는 벡터를 통해서 LbpB 폴리펩티드를 전달함을 포함하여, 포유동물(바람직하게는, 사람)내에서 면역학적 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 포유동물 숙주(바람직하게는, 사람)내로 도입되는 경우에 LbpB 폴리펩티드에 대한 상기 포유동물내 면역학적 반응을 유도하는 면역하적 조성물 또는 백신 제형에 관한 것이다. 여기서, 조성물은 LbpB 유전자, 또는 LbpB 폴리펩티드 또는 에피토프 함유 단편, 유사체, 외부막 소포 또는 세포(감쇄되거나 달리 처리됨)를 포함한다. 백신 제형은 또한 적합한 담체를 포함할 수 있다. LbpB 백신 조성물은 바람직하게는 경구 또는 비경구(피하, 근육내, 정막내, 피내주입등을 포함)로 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형에는 제형이 수용자의 혈액과 등장성이 되게하는 항산화제, 완충액, 제균제 및 용질을 함유할 수는 수성 및 비수성 무균 주입 용액; 및 현탁제 또는 농후화제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 무균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위 용량 또는 다수 용량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알내에 담길 수 있으며, 사용 직전에 무균 액체 담체의 첨가만을 요하는 동결 건조된 상태로 저장될 수 있다. 백신 제형은, 또한, 기술 분야에 공지된 수중유 오일 시스템 및 그 밖의 시스템과 같은, 제형의 면역원성을 증진시키는 보조 시스템을 포함할 수 있다. 용량은 백신의 특이적 활성에 좌우될 수 있으며 통상의 실험에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 폴리누클레오티드를 포함하는 면역학적/백신 제형에 관한 것이다. 이러한 기술은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 참조예[Wolff et al., Science, (1990) 247:1465-8].
스크리닝 검정
본 발명의 LbpB 폴리펩티드는 본 발명의 LbpB 폴리펩티드를 길항(길항제, 또는 억제제)하는 화합물에 대한 스크리닝 과정에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어, 세포, 세포 유리 제제, 화학적 라이브러리 및 천연 생성 혼합물로부터 길항제를 동정하는데 사용될 수 있다. 이들 길항제는 본 발명의 폴리펩티드의 천연 또는 변화된 기질, 리간드, 수용체, 효소등일 수 있거나, 본 발명의 폴리펩티드의 주조적 또는 기능적 의태체일 수 있다. 참조[Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5(1991)].
LbpB 폴리펩티드는 많은 병리학적 작용을 포함한 많은 생물학적 작용이 있다. 따라서, LbpB 폴리펩티드의 작용을 억제할 수 있는 화합물 및 약제를 개발하는 것이 요구된다. 일반적으로, 길항제는 나이세리아 질환과 같은 상태에 대한 많은 치료학적 및 예방학적 목적으로 사용될 수 있다.
일반적으로, 그러한 스크리닝 과정은 LbpB 폴리펩티드를 발현하거나 본 발명의 LbpB 폴리펩티드에 반응하는 적절한 세포를 사용하는 것과 연관이 있을 수 있다. 그러한 세포는 포유동물, 효모, 드로소필라(Drosophila)또는 이.콜라이로부터의 세포를 포함한다. LbpB 폴리펩티드(또는, 발현된 폴리펩티드를 함유하는 세포막)를 발현하거나 LbpB 폴리펩티드에 반응하는 세포를 시험 화합물과 접촉시켜, 결합, 또는 작용성 반응의 억제를 관찰한다. 시험 화합물과 접촉되는 세포의 능력은 LbpB 활성에 접촉되지 않는 동일한 세포와 비교된다,
검정은 시험 화합물의 결합을 간단히 시험할 수 있으며, 여기서, LbpB 폴리펩티드를 지니는 세포에 대한 유착이 시험 화합물과 직접 또는 간접적으로 관련되는 표지의 수단에 의해서나, 표지된 경쟁체와의 경쟁과 연관된 검정에서 검출될 수 있다.
또한, 검정은 간단히 시험 화합물을 LbpB 폴리펩티드를 함유하는 용액과 혼합하여 혼합물을 형성시키고, 혼합물중의 LbpB 활성을 측정하고, 혼합물의 LbpB 활성을 표준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
LbpB cDNA, 단백질 및 단백질에 대한 항체는 또한 세포내의 LbpB mRNA 및 단백질의 생산시에 첨가된 화합물의 효과를 검출하는 검정을 형성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, ELISA는 기술 분야에 공지된 표준방법에 의해서 단일클론성 및 폴리클로성 항체를 사용하여 LbpB 단백질의 분비된 수준 또는 세포 관련된 수준을 측정하도록 구성될 수 있으며, 적합하게 처리된 세포 또는 조직으로부터 LbpB(또한, 길항제라 일컬어짐)의 생산을 억제할 수 있는 시약을 발견하는데 이용될 수 있다.
효능적인 LbpB 폴리펩티드 길항제의 예에는 항체, 또는 어떠한 경우에 있어서, LbpB 폴리펩티디의 리간드 또는 기질과 밀접하게 관련되어 있는 폴리누클레오티드 또는 단백질, 예를 들어, 리간드 또는 기질의 단편; 또는 본 발명의 폴리펩티드에 결합되지만 반응을 유도하지 않아서 폴리펩티드의 활성이 억제되게 하는 작은 분자가 포함된다.
따라서, 또 다른 관점으로, 본 발명은 하기 성분들을 포함하여, LbpB에 대한 기질, 리간드 또는 길항제를 동정할 수 있는 스크리닝 키드에 관한 것이다:
a) LbpB 폴리펩티드, 바람직하게는, 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 폴리펩티드;
b) LbpB 폴리펩티드, 바람직하게는, 서열번호 2, 4, 6, 8 도는 10의 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 세포;
c) LbpB 폴리펩티드, 바람직하게는, 서열번호 2, 4, 6, 8 도는 10의 폴리펩티드를 발현시키는 세포막; 또는
d) LbpB 폴리펩티드, 바람직하게는, 서열번호 2, 4, 6, 8 도는 10의 폴리펩티드에 대한 항체.
어떠한 키드에서, (a), (b), (c) 또는 (d)가 실질적인 성분을 포함할수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.
제형 및 투여
LbpB 폴레펩티드의 가용형과 같은 펩티드, 및 길항체 펩티드 또는 작은 분자는 적합한 약제학적 담체와의 조합으로 제형될 수 있다. 이러한 제형은 약제학적 유효량의 폴리펩티드 또는 화합물, 및 약제화적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체에는 이로 한정되는 것은 아니지만 염수, 완충된 염수, 텍스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 조합물이 포함된다. 제형은 투여 방식에 적합해야 하며, 기술분야에 잘 공지되어 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 상기된 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 및 그 밖의 화합물은 단독으로 사용되거나, 다른 치료 화합물과 같은 다른 화합물과 함께 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 바람직한 전신투여 형태는 전형적으로 정맥내 주입에 의한 주입을 포함한다. 피하, 근육내 또는 복강내 경로와 같은 그 밖의 주입 경로가 이용될 수 있다. 전신투여를 위한 또 다른 방법에는 담증염 또는 후시딘산 또는 그 밖의 세정제와 같은 침투제를 사용한 점막투여 및 경피 투여가 포함된다. 또한, 장용 또는 캡슐화된 제형으로 적합하게 제형되는 경우, 경구 투여가 가능하다. 상기 화합물은 연고, 페이스트 및 겔 등의 형태로 국소 및/또는 편재투여로 투여될 수 있다.
요구되는 용량 범위는 선택되는 펩티드, 투여 경로, 제형의 특성, 대상의 질환 특성, 및 사용자의 판단에 좌우된다. 그러나 적절한 용량은 0.1내지 100㎍/대상㎏의 범위이다. 그러나, 이용될 수 있는 화합물의 다양성 및 투여 경로의 상이한 효율에 따라서 요구되는 용량이 광범위하게 다양할 것이다. 예를 들어, 경구투여는 정막내 주입에 의한 투여 보다 더 많은 용량이 요구되는 것으로 예측할 수 있다. 이러한 용량의 다양성은 표준 최적 실험 경로를 이용함으로써 조절될 수 있으며, 본 기술 분야에서 잘 이해되는 사항이다.
하기 실시예는 달리 상세히 설명하지 않는 한 본 기술 불야의 전문가에게는 공지되어 있으며 통상적인 표준 기술을 이용함으로써 수행되고 있는 것이다. 실시예는 본 발명을 단지 예시하고자 하는 것이며 이를 한정하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: 박테리아 균주 및 성장조건
사용된 박테리아 균주를 표 1에 기재하였다. 메닝고코시를 GC 한천 플레이트(Difco)상에서 밤새 배양하고, 37℃의 습도 5% CO2 대기하에 비톡스(Virox: Oxoid)를 보충하였다. 철 조절된 단백질의 최적 발현은 5㎍/ml의 철 킬레이터 에틸렌디아민 디-o-히드록시페닐아세트산(EDDA, Sigma)은 가함으로써 달성하였다. SDS-PAGE, 면역블롯팅을 위한 샘플의 제조, 및 염색체 DNA의 단리를 위해서, 세포를 상기된 문헌(Pettersson et al., 1993)에 기재된 바와 같이 성장시켰다.
λgtll 파아지를 전파시키는데 사용되었던 이.콜라이 균주 Y1090 (Yong and Davis 1983)을 암피실린(100㎕/ml), 0.2% 말토오스 및 10mM MgCl2가 보충된 루리아-베르톨디(Luria-Bertoldi: LB)배지에서 성장시켰다. 클로닝에 사용된 균주 DH5α를 재조합물의 선택에 요구되는 경우 100㎕/ml 암피실린, 25㎍/ml 카나마이신, 또는 100㎍/ml 에리트로마이신이 보충된 LB 배지에서 성장시켰다. pEMBL19-유도체로 형질전환시킨 후에, 세포를 적절한 항생제, 및 5-브로모-4클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드(40㎍/ml), 및 0.5mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드가 보충된 LB 플레이트에 평판시켜 삽입체를 함유하는 플라스미드를 스크리닝하였다. 단일가닥 DNA를 제조하는데 사용된 균주 PC2494를 5㎍/ml 티아민 및 0.2% 글루코스가 보충된 최소 배지 플레이트상에 유지시켰다.
실시예 2:
2A: 펩티드에 대한 마우스 항혈청의 제조
펩티드(도 3)를 자동화된 다중 펩티드 합성기를 이용함으로써 합성하고, 문헌(van der Ley et al., 1991)에 기재된 파상풍 독소에 결합시켰다. BALB/c 마우스를 50㎍의 펩티드와 보조제로서 20㎍의 쿠일 A(Quil A)로 면역시켰다. 두 마리의 마우스가 주었졌다. 혈청을 첫 번째 주입 54일 후에 수거하였다.
2B: LbpB 유전자 생성물의 동정
추정성 LbpB 유전자가 단백질을 암호화하는지를 조사하기 위해서, 항혈청을 부분적 개방 해독 프레임의 추정된 아미노산 서열을 기본으로 하는 합성 펩티드(도 3에서 A1-E1으로 표시됨)에 대해서 반응시켰다. 항혈청을 철의 제한하에 성장한 균주 BNCV의 전체 세포에 대해서 웨스턴 블롯으로 시험하였다. 펩티드 B1에 대한 혈청은 어떠한 반응을 나타내지 않았다(데이타는 기재하지 않음). 다른 펩티드에 대한 항혈청은 약 95kDa(도 1)의 밴드와 반응하였다. 이러한 밴드는 lbpB 돌연변이가 결핍되었기 때문에(하기 설명된 바와 같이 구성됨)(도 1, 래인 3 및 7), lbpB 유전자는 야생형 균주에서 발현되며, 분자량(Mr) 95,000의 단백질을 암호화한다는 결론을 얻었다. 펩티드 D1 및 E1에 대한 어떠한 혈청은 60,000(도 1)의 Mr을 지닌 밴드와 추가의 반응을 나타냈다. 이를 펩티드 둘다 TbpB (도 3)에도 존재하는 서열 VVFGAK를 함유한다. 따라서, 68K 밴드는 TbpB일 수 있다. 이러한 가능성을 시험하기 위해서, TbpB 돌연변이, N91, 및 이의 모체 균주 B16B6을 웨스턴 블롯에서 시험하였다. 혈청 19-1(펩티드 E1에 대한)은 균주 B16B6중에 각각 95K 및 68K의 두 밴드와 반응하였지만, 균주 N91에서는 95K 밴드와만 반응하였다. 결과는 68K 밴드가 TbpB라는 것을 나타낸다(데이타는 기재하지 않음)
실시예 3: SDS-PAGE 및 면역블로팅
전체 세포 단백질의 SDS-PAGE를 상기된 문헌(Pettersson et al., 1990, 1993)에 기재된 바와 같이 수행하였다. LbpB의 변성이 억제되어야 하는 실험에서는, 이하의 변화가 포함되었다. 샘플 완충액은 β-메르캅토에탄올을 함유하지 않았다. 외부막 복합체는 전기영동 전에 샘플 완충액중에서 95℃로 가열되지 않으며, 얼음상 또는 37℃에서 10분 동안 인큐베이팅되었다. 락토페린 결합 실험에서는, 폴리아크릴아미드 겔을 5%(w/v) 스태킹 겔, 및 0.05%(w/v) SDS를 함유하는 8%(w/v) 용해 겔로 구성시켰다. 전극 완충액은 0.1% SDS 대신 0.05%만 함유시켰다. 전기영동은 100V의 일정한 전압에서 4℃로 2시간(h) 동안 수행되었다. 2% SDS을 함유하는 표준 샘플 완충액을 사용하였다.
LbpB의 폴디드 형태를 검출하기 위한 외부막 단백질의 전기영동을 제조자의 지시에 따라 파스트시스템(PhastSystem: Pharmacia)로 SDS 완충 스트립을 함유한 7.5%(w/v) 균질의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행하였다.
면역블로팅을 상기 문헌(Pettersson et al., 1990, 1993)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 파스트시스템 겔의 경우에 있어서, 블로팅 완충액은 0.05%(w/v) SDS를 함유하였고 퍼옥시다제의 활성은 제조자(Amersham)의 지시에 따라 ECL 시스템으로 검출하였다. 마우스 항혈청을 1:500의 희석에 사용하였다. LbpA-특이적 단일클론성 항체 mn98K1 및 mn98K2(Pettersson et al., 1993)를 각각 1:2000의 희석의 칵테일로 사용하였다.
실시예 4:
4A: 클로닝 및 서열화 방법
λgtll 유전자 라이브러리를 이.씨. 고칠리치(E.C. Gotschlich: The Rockefeller University, New York, USA)에 의해서 얻었다. 라이브러리를 이. 콜라이 균주 Y1090에서 전파시키고, DNA 프로브 BE1 및 AP6으로 스크리닝 하였다(도 2). BE1은 프라스미드 pAM1의 355bp BstEII-EcoRI-단편으로 분리함으로써 제조하였다(Pettersson et al., 1993). AP6은 플라스미드 pAM6으로부터 제조된 417bp EcoRI-EcoRV-단편이었다. 프로브 표지화, 플라크 블로팅, 및 검출은 문헌(Pettersson et al., 1993)에 기재된 바와 같이 DIG DNA 표지화 및 검출 키드(Boehringer Mannheim)를 사용함으로써 수행하였다. λDNA를 분리하고(Sambrook et al., 1989), 삽입체를 파아지미드 pEMBL19에서 서브클로닝시켰다. 플라스미드 DNA를 제조자가 설명한 바와 같이 제츠타르 미니 칼럼(Jetstar mini columms: Genomed)상에서 단리시켰다. 단일가락 DNA를 헬퍼 파아지 VCSM13(Stratagene)을 사용함으로써 전파시켰다.
염색체 DNA를 문헌(Ausubel et al., 1989)에 기재된 바와 같이 단리시켰다. DNA를 AccI 및 DraI로 분해시키고, 1% 아가로스 겔상에서 분해시켰다. 서던 블로팅을 문헌(Pertersson et al., 1993)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 프로브 ES1(도 2)을 pAM13으로부터 320bp EcoRI-SalI-단편을 분리함으로써 제조하고 상기된 바와 같이 표지화시켰다. AccI/DraI내의 1.5kb 단편과 반응한 프로브는 서던블롯상에서 염색체 DNA를 분해시켰다. 1.5kb 단편을 겔로부터 단리시키고, pEMBL19에서 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 M13 보편적 프라이머(Pharmacia) 및 LBll 프라이머(표 2)로 PCR 증폭시켰다. 골드스타 폴리머라제, Taq 폴리머라제 유도체(Eurogentec)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 PCR 증폭시켰다. 1.3kb의 PCR 생성물을 한천 겔로부터 정제하였다.
DNA 서열화는 대자 G/A T7 서열화 혼합물(deasa G/A T7 sequencing mixes: Pharmacia)를 사용하여 수동으로 수행하거나, ABI 프리즘 310 유전분석기(Rerkin Elmer)를 사용하여 자동으로 수행하였다. 자동 서열화의 경우에, 표지화는 다이 터미네이터 사이클 서열화 키트(Dye Terminator Cycle sequencing kit: Perkin Elmer)로 수행되었다. 내부 프라이머(Pharmacia 또는 Gibco BRL에 의해 합성됨) 및 M13 보편적 및 역프라이머(Pharmacia)를 사용하여 단일가닥 DNA, 이중가닥 프라스미드 DNA 또는 PCR 생성물을 서열화시켰다.
유사한 방법을 이용하여 나이세리아 메닝지티디스의 H44/76 및 M981균주로부터의 lbpB 유전자를 서열화시켰다.
4B: lbpB 유전자의 클로닝 및 서열화
LbpB 유전자의 손실 부분을 클로닝하기 위해서, 균주 BNCV의 λgtll 유전자 라이브러리를 DNA 프로브로 스크리닝시켰다. 두 가지의 상이한 람다 클론이 발견되었다. 삽입체를 pEMBL19에서 서브클로닝시켜, 프라스미드 pAM6 및 pAM13을 생성시키고(도 2),서열화시켰다. LbpB 유전자의 개시와 프로모터는 이러한 방법에서 발견되지 않았다. 유전자의 5' 말단을 클로닝하는 몇 가지의 다른 방법이 성공하지 못 하였으며, 이는 발현이 이.콜라이에 독성임을 제시했다. 나머지의 서열을 얻기 위해서, 리치 뱅크를 AccI- 및 DraI-분해된 염색체 DNA로 제조하였다. 약 1.5kb의 염색체 DNA 단편을 pEMBL19에서 결찰시키고, PCR 증폭은 M13 프라이머 및 lbpB 서열의 공지된 부분을 기본으로 하는 프라이머(LBll,참조 도 2)를 사용하는 결찰 혼합물상에서 직접 수행시켰다. 생성되는 PCR 생성물(도 2)을 서열화에 직접 사용하였다. 이러한 방법은 이. 콜라이의 가능한 독성 유전자의 클로닝을 피하는 방법이다.
다양한 lbpB 단편의 서열화는 2,175bp의 개방 해독 프레임을 나타냈다. 이는 분자 질량 79.4kDa의 725 아미노산 잔기의 단백질(도 3)을 암호화한다. N-말단 서열의 분석은 시그날 펩티라제 II에 의해 인식된 시그날 서열의 특징을 나타냈다(von Heijne, 1989). 이러한 시그날 서열을 성숙한 단백질의 N-말단 시스테인 잔기에서 아실화되는 리포단백질의 전구체에 존재한다. 유사한 시그날 서열이 지질 변화된 것으로 입증되는 TbpB 단백질에서 발견되었다(Anderson et al., 1994). 성숙한 LbpB 단백질을 나트륨 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)(도 1)에서 관찰된 명백한 분자질량 95kDa 보다 상당히 적은 77.5kDa의 계산된 분자 질량을 지녔다. 그 밖의 단백질과의 유사성에 대한 스위스 프로트 데이터 베이스(Swiss Prot data base)의 스크리닝은 나이세리아 및 악티노바실루스 플루로뉴모니아의 TbpB에 대한 동족성을 나타냈다. 가장 높은 동족성, 즉, 33% 상동성(PALIGN 프로그램 사용)이 나이세리아 균주 B16B6의 TbpB에 대해 밝혀졌다(Legrain et al., 1993)(도 3). TbpB 단백질에서, 약간의 내부 반복부가 발견되었으며, 이는 분자가 내부 복제후에 진화되는 바이-로비드 구조(bi-lobed structure)를 지님을 제시하는 것이다(Fuller et al., 1996, Renauld-Mongenie et al., 1996). 성숙한 LbpB 단백질의 N-말단 354 아미노산이 C-말단 353 아미노산과 정렬되는 경우, 30% 상동성 및 10% 유사성이 발견되었다(도면에는 도시되지 않음). 이러한 결과는 LbpB가 또한 바이-로비드 구조로 존재함을 제시한다. 단백질의 등전점은 4.5이다. 산성 잔기가 풍부한 두 개의 긴 스트레치가 서열에서 식별될 수 있다(도 3). 이들 스트레치는 TbpB에서 결핍되기 때문에, 이들은 트랜스페린과는 대조적으로 양으로 하전된 분자인 락토페린의 결합에 중요할 수 있다.
프로모터 영역에서, 전형적인 샤인-달가르노 서열(Shine-Dalgarno sequence)이 식별될 수 있다. 또한, 추정성-10 및 -35 박스가 발견되었다(도 4). Fur-결합 부위의 서열은 -10 박스와 중첩된다. Fur은, Fe2+와 함께, 프로모터 영역내의 19bp 서열에 결합함으로써 철-조절된 유전자의 억제자로서 작용한다(Bagg and Neilands, 1987). 이러한 Fux-박스의 일치 서열은 GATAATGATAATCATTATC이며, 이러한 서열의 19bp의 16은 lbpB 프로모터내의 상기 구성 요소에 보존된다. 또한 프로모터의 상류, 즉, 131bp의 직접적인 반복부가 발견되었다(도면에는 표시되지 않음). 이러한 서열은 이러한 위치에서 2회 이상 존재한다. 동일한 직접적인 반복부가 lbpA 유전자의 하류에서 발견되었다(Prinz et al., unpublished observation). FASTA 동족성 연구는 많은 나이세리아 서열, 대부분의 플랭킹 개방 해독 프레임에 대한 상기 반복부의 동족성을 나타냈다(데이터는 기재되지 않음).
나이세리아 메닝지티디스의 BNCV와 M981 균주의 LbpB 단백질 사이의 서열 동족성, 및 나이세리아 메닝지티디스의 BNCV와 H44/76 균주의 LbpB 단백질 사이의 서열 동족성을 각각 72.7% 및 78.5%이다.
실시예 5:
5A: 동질 유전자 돌연변이의 구성
플라스미드 pAM23 및 pAM6을 사용하여 각각 lbpA 및 lbpB의 삽입성 불활성화시켰다. pER2로부터의 에리트로마이신 내성(Ermr) 카세트(Jennings et al., 1993)를 ClaⅠ 및 HindIII으로 절제하였다. 단편을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, EcoRV-분해된 pAM23에 결찰시켜서, 플라스미드 pAM23E를 생성시켰다. pUC4k(Pharmacia)로부터의 카나마이신 내성(Kmr) 카세트를 HincII를 절제하였다. 프라스미드 pAN6을 BglII로 선형화시키고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하였다. Kmr-카세트를 이러한 부위에서 결찰시켜서, 플라스미드 pAM6k를 생성시켰다. 나이세리아 흡수서열(GCCGTCTGAA) 및 KpnI- 양립성 단일가닥 말단을 함유하는 올리고누클레오티드 nus1 및 nus2(표 2)로 구성된 링커를 pAM6K의 KpnI-부위에서 클로닝시켜서, 플라스미드 pAM6K-nus를 생성시켰다. 항생 내성 유전자는 각각 플라스미드 pAM23E 및 pAM6K(-nus)에서 lbpA 및 lbpB와 동일한 방향으로 존재하였다. KpnI로 선형화된 플라스미드 pAM23E를 상기된 바와 같이 균주 H44/76을 형질전환시키는데 사용하였다(van der Ley and Poolman, 1992). 형질 전환체를 ml 당 5㎍의 에리트로마이신을 함유하는 GC 플레이트상에서 선택하였다. CE1449로 명명된 형질 전환체중 하나에서의 정확한 유전자 대체는 프라이머 FW5 및 DVAS2(표 2)를 이용한 PCR, 및 프로브 AP23을 사용한 서던 블롯 분석에 의해 확인하였다(도 2: pAM23으로부터 184 bp SsI-HindIII-단편으로서 단리됨). 서던 블롯의 경우에, 염색체 DNA를 ClaⅠ 및 SalⅠ로 분해시켰다. 균주 BNCV내의 동질 유전자 돌연변이를 전기영동에 의해 제조하였는데(Genco et al., 1991), 그 이유는 이러한 균주가 형질 전환이 가능하지 않은 듯하기 때문이다. lbpA 돌연변이 CE1449로부터의 염색체 DNA를 lbpA 돌연변이를 제조하는데 사용하였다. 형질전환체를 에리트로마이신으로 GC 폴레이트상에서 선택하여 상기된 바와 같이 확인하였다. 플라스미드 pAM6k-nus를 lbpB 돌연변이를 제조하는데 사용하였다. 형질전환체는 100㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 GC 플레이트상에서 선택하였다. 정확한 유전자 대체는 프라이머 SDAl 및 PRl(표 2)를 사용하는 PCR 및 프로브 AP23을 사용한 서던 블롯에 의해 확인하였다.
5B: 동질 유전자 돌연변이의 구성
94 kDa 단백질의 상동성을 확인하고, 락토페린 결합에서의 개개의 락토페린-결합 단백질의 역할 및 이용을 조사하기 위해서, LbpA 또는 LbpB 중 하나가 없는 BNCV의 동질 유전자 유도체 세트를 실시예 5A에 기재된 바와 같이 구성시켰다. 정확한 유전자 대체를 PCR 반응 및 서던 블로팅으로 확인하였다(데이타는 기재하지 않음). 돌연변이에서의 LbpA 및 LbpB의 발현을 웨스턴 블롯으로 검사였다(도 5). lbpA 돌연변이 CE1452는 LbpA를 발현하지 않았으며(도 5A, 래인 4), lbpB 돌연변이 CE1454는 94kDa 단백질을 발현하지 않았다(도 5B, 래인 6), 이러한 결과는 lbpB 유전자가 야생형 균주에서 발현되며, 77.5kDa의 계산된 분자 질량 보다 상당히 더 큰 94,000의 Mr을 지닌 단백질을 암호화한다는 것을 확인지켜 주고 있다. 또한 도 4로부터의 결과는 lbpB의 불활성화가 LbpA 발현에 대한 극성 효과를 나타내지 않는다는 것을 보여주고 있다(도 5A, 래인 6). 이러한 결과는 예상되었는데, 그 이유는 lbpB 에 삽입된 카나마이신 내성 카세트가 전사 종결자를 함유하지 않기 때문이다. 상기된 자발적인 lbpA 돌연변이 CE1402(Pettersson et al., 1994b)는 LbpB 발현이 결여된 것으로 나타났다(도 5B, 래인 8). 이러한 돌연변이 및 BNCV 둘 모두가 균주 M986의 유도체이기 때문에, 이의 유전적 바탕은 다른 돌연변이의 바탕과 동일하다. LbpA 및 LbpB 둘 모두의 발현은 철에 의해 조절되는 것으로 나타났다(도 5). 세포가 철 킬레이터 없이 성장하는 경우에도 약한 LbpA의 발현이 균주 CE1454에서 나타났다(도 5A, 래인 5). 이러한 발현은 lbpB에서 카나마이신 내성 유전자의 프로모터로부터의 전사에 기인되는 듯하다. 그러나, 이러한 경우에, LbpA의 발현은 균주가 철 킬레이터의 존재하에 성장하는 경우 몇 배로 증가하였다(도 5A, 래인 6).
실시예 6:
6A: 락토페린 결합 검정
전체 세포에 결합하는 락토페린을 ELISA-타입 검정으로 검정하였다. 아스페르길루스 아마모리(Aspergillus avamori)에서 생산된 제조합 사람 락토페린을 에이제닉스 인코포레이티드(Agennix Inc.; Houston, Texas, USA) 로부터 얻었다. 락토페린을 상기된 바와 같이(van Berkel et al., 1995) 철로 포화시키면서 다음과 같이 변화시켰다. FeCl3를 Fe(NO3)3대신 사용하였고, 5mM Na2HPO4/NaH2PO4-완충액, pH7.7에 대해서 4시간 동안 투석시켰다. 플레이트로부터의 콜로니를 트리스-완충된 염수, pH7.5(TBS)에 현탁시키고 56℃에서 30분 동안 가열함으로써 치사시켰다. 620nm에서 0.05의 광학밀도를 갖는 샘플(100ml)을 미세역가 플레이트의 웰에 분배하였다. 샘플을 37℃에서 밤새 건조시켰다. 검정을 37℃에서 수행하였다. 비특이적 결합을 TBS중의 0.1% 트윈(Tween) 및 0.5% 프로티파르(Protifar: Nutricia)를 함유하는 100㎕의 블로킹 용액으로 1시간 동안 억제시켰다. 블로킹 후에, 웰을 블로킹 용액중의 다양한 농도의 락토페린으로 충전시켰다. 웰중의 락토페린의 농도가 3.125로부터 200㎍/ml까지 변화되었다. 1시간 동안 인큐베이팅하고 수돗물로 3회 세척한 후에, 사람 락토페린(ICN Biomedical)에 대한 퍼옥시다제-결합된 토끼 폴리클론성 항혈청 웰에 가하였다. 항체를 블로킹 완충액중의 1:5000 희석액으로 사용하였다. 1시간 동안 인큐베이팅하고 수돗물로 3회 이상 세척한 후에, 퍼옥시다제의 양을 검출하였다(Abdillahi and Poolman, 1987).
블롯상의 락토페린 결합을 다음과 같이 수행하였다. 비특이적 결합은 0.1% 트윈-20 및 0.5% 프로티파르(Nutricia)를 함유하는 0.2M Na2HPO4/NaH2PO4완충액, pH5.7에서 막을 2시간 동안 인큐베이팅함으로써 블로킹하였다. 블롯을 블로킹 완충액중의 1.2㎍ml-1퍼옥시다제-컨주게이트된 사람 락토페린(Pettersson et al., 1993)과 함께 1시간 동안 인큐베이팅하고, 블로킹 완충액으로 3회 이상 세척하였다. 퍼옥시다제의 활성을 제조자(Amersham)의 지시에 따라 ECL 시스템으로 검출하였다.
6B: 플레이트 공급 검정
메닝고코시를 실시예 1에 기재된 바와 같은 비톡스로 보충된 TSB에서 밤새 성장시켰다. 밤새 성장한 배양물중 300㎕를 3ml의 상부 한천(ml 당 20㎍ EDDA를 함유하는 1% GC 한천, 42℃로 냉각)에 현탁시키고, ml당 20㎍ EDDA 및 비톡스로 보충된 GC 한천 플레이트상에 즉시 평판시켰다. 재조합 사람 락토페린의 방울(10㎕)(11% 철 포화, 또는 상기된 바와 같이 포화)를 플레이트상에 점적하였다. 방울내의 락토페린의 농도는 각각 10 및 20㎎/ml였다. 플레이트를 밤새 성장시켰다.
6C: 블롯상의 폴리드 LbpB에 대한 락토페린의 결합
락토페린이 블롯상의 LbpB에 결합할 수 있는 지를 조사하기 위해서는, SDS-PAGE 조건을 LbpB가 변성되지 않는 조건으로 해야 한다(실시예 6A). 샘플은 전기영동전에 샘플 완충액에서 가열하지 않았을 경우, LbpB의 보다 빠른 이동 형태가 검출될 수 있었는데, 단백질의 본래의 폴디드 형태를 나타내는 듯하다. 이러한 형태는 약 80kDa의 Mr을 지녔다. 95℃에서 10분 동안 가열한 후에, LbpB 단백질을 완전히 변성시키고, 94kDa 위치로 이동시켰다(도 6A,래인 2). 흥미롭게도, 펩티드 A1에 대한 혈청(도 2)만이 단백질의 보다 빠른 이동형과 반응하였다. 이러한 펩티드는 음으로 하전된 아미노산이 풍부한 두 개의 스트레치중 하나를 함유하며, 락토페린 결합에 관여할 수 있다. 폴디드 단백질에 대한 항체의 결합은 이러한 부분의 단백질이 노출되며, 다른 모든 펩티드에피토프가 LbpB의 폴디드 구조내에 가려진다는 것을 제시한다.
폴디드 LbpB 단백질에 대한 락토페린의 결합이 실질적으로 검정된다. 균주 BNCV의 외부막 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 블로팅하고, 퍼옥시다제 결합된 락토페린과 함께 인큐베이팅하였다. 락토페린 결합의 특이성은 인큐베이팅 조건, 가장 중요하게는, pH에 극히 민감성인 것으로 나타났다. 최적화된 조건하에, 락토페린은 80kDa의 Mr의 단백질 밴드에 특이적으로 결합되었다(도 6B, 래인 1 및 2). 샘플을 SDS-PAGE 전에 95℃에서 10분 동안 가열하는 경우 결합이 관찰되지 않았다(도 6B, 래인 3). 밴드는 lbpB 돌연변이 CE1454의 샘플에서 검출되지 않는다(데이타는 기재되지 않음). 따라서, 가능하게는 단백질의 폴디드 형태를 나타내는 LbpB 단백질의 보다 빠른 이동형이 락토페린에 결합할 수 있다는 결론이 나온다.
6D: 전체 세포에서의 락토페린 결합 및 이용
전체 세포에 결합하는 락토페린을 ELISA-타입 검정에서 조사하였다. ELISA 플레이트를 동질 유전자 돌연변이의 균주 BNCV의 전체 세포로 피복하고, 다양한 농도의 락토페린을 웰에 가하였다. 락토페린이 세포에 결합하는 것을 사람 락토페린에 대한 퍼옥시다제 컨주게이트된 항체로 탐침하였다(도 7). lbpB 돌연변이는 락토페린을 결합시키는 능력을 약간 감소시켰다. lbpA 돌연변이는 lbpB 돌연변이 보다 덜 효과적으로 락토페린과 결합하는 반면, 이중 돌연변이는 실질적으로 락토페린과 전혀 결합하지 않았다(도 7).
철의 단독 공급원으로 락토페린을 사용하는 능력을 플레이트 공급 검정으로 조사하였다. 메닝고코시를 플레이트상의 철 제한하에 성장시키고, 재조합 사람 락토페린의 방울을 플레이트상에 점적하고, 성장 자극을 모니터링하였다. lbpB 돌연변이는 락토페린상에서 성장할 수 있으며, lbpA 돌연변이는 성장할 수 없다(도 8). 락토페린을 11% 철로 포화시켰다. 동일한 실험을 철 부하된 락토페린으로 수행하여 기본적으로 동일한 결과를 얻었다(데이타는 기재하지 않음). 이러한 데이터는 LbpA 단백질이 락토페린을 통한 철의 흡수에 필요하지만 LbpB는 이를 요구하지 않는 듯하다는 것을 입증한다.
실시예 7:
메닝고코시 LbpB 단백질의 다양성을 연구하기 위해서, 4 가지의 또 다른 균주로부터의 lbpB 유전자를 서열화시켰다: H44/76, M990, M981, 881607(표 1 참조).
7A: 4 가지의 추가의 메닝고코시 균주로부터의 lbpB의 서열화-방법
박테리아를 실시예 1에 기재된 바와 동일한 방법으로 배양하였다. 염색체 DNA를 플레이트상에서 성장한 박테리아로부터 단리하였다. 밤새 성장시킨 후에, 박테리아를 플레이트로부터 스크렙하고 1.5ml 10mM 트리스-HCl, 10mM EDTA, pH8에 현탁시키고, 10㎕의 이소자임(10mg/ml)을 가하였다. 현탁액을 실온에서 15분 동안 인큐베이팅시킨 후에 1.5ml의 2% 트리톤 X-100, 50mM 트리스-HCl, 10mM EDTA, pH 8을 가하였다. 15분 동안 인큐베이팅시킨 후에, 10㎕의 프로테이나제 K(10mg/ml)를 가하였다. 튜브를 실온에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 혼합물을 페놀, 클로로포름, 이소아밀알콜(24:24:1의 비율로 혼합)로 일회 추출하고, 물이 포화된 클로로포름으로 일회 추출하였다. 염색체 DNA를 에탄올로 침전시켰다.
염색체 DNA를 사용하여 lbpB 유전자를 PCR 증폭시켰다. 프라이머 LB20 및 REV2(표 3)을 균주 H44/76, M990, 및 881607상에서 사용하였다. 프라이머 LB20 및 LB23을 균주 M981상에서 사용하였다. 프라이머는 균주 BNCV로부터의 lbpB의 서열을 기본으로 한다. LB20은 lbpB 유전자의 상류에서 결합되며 LB23 및 REV2는 lbpA 유전자의 시작부에서 결합된다. LB23은 5' 말단의 외부 BamHI 부위를 지니고 있다. 골드스타 폴리머라제, Taq 폴리머라제 유도체(Eurogentec)를 사용하여 제조자의 지시에 따라서 PCR 증폭시켰다. 어닐링 온도는 모든 경우에 50℃였으며, 30회 수행되었다. PCR 생성물을 제조자의 지시에 따라 β-아가라제(New England Biolabs)을 사용하여 한천 겔로부터 정제하였다.
DNA 서열화는 lbpB 유전자에 대해 디자인된 프라이머를 사용한 유전자 워킹에 의해서 수행되었다. 프라이머는 깁코 BRL(Gibco BRL)에 의해 합성된다. 서열화는 ABI 프리즘 310 유전자 분석기(Perkin-Elmer)를 사용함으로써 자동으로 수행된다. 표지화는 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit: Perkin-Elmer)로 수행하였다.
소프트웨어 패키지 PC 유전자 6.70(IntelliGenetics)로부터의 컴퓨터 프로그램 TRANSL, PALIGN 및 CLUSTAL을 사용하여 각각 서열의 쌍 배열 및 다중 배열을 위해서 누클레오티드 서열을 아미노산서열로 번역하였다.
7B: 4 가지의 추가의 메닝고코시 균주로부터 lbpB의 서열화-결과
4개의 균주의 lbpB 유전자의 누클레오티드 서열이 서열번호 3, 5, 7 및 9에 나타나 있다. 누클레오티드 서열을 아미노산 서열내로 번역시켰으며, LbpB 단백질의 4 개의 공지된 서열의 배열이 도 9에 나타나 있다. 아미노산 수준상에서, 상이한 균주의 LbpB 단백질 사이의 상동성이 70-80%였다. 상동성의 쌍 비교를 표 4에 요약하여 놓았다.
실시예 8:
나이세리아 메닝지티디스내에서 LbpB의 발형수준은 아주 낮으며; 단백질은 외부막 단백질 패턴이 SDS-PAGE에 의해서 분석되는 경우에 검출될 수 없다. LbpB의 면역학적 및 구조적/기능적 연구의 경우에, 구성물을 이. 콜라이내에서의 단백질의 발현을 위해 제조하였다. 재조합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해서, 구성물에 의해서 암호화된 단백질은 His-tag를 함유하였으며, N 말단의 기질 변화가 성숙한 도메인의 첫번째 두 아미노산 잔기 및 본래의 시그날 서열의 치환에 의해 억제되었다.
8A: 재조합 LbpB의 발현-박테리아 균주 및 성장 조건
메닝고코시 균주 BNCV(-:2a:P1.2)를 37℃의 습도 5% CO2대기내에서 비톡스(Oxoid)로 보충된 GC 한천 플레이트(Difco)상에서 밤새 배양하였다. 재조합 LbpB 단백질을 암호화하는 구성물이 균주 CE1224(Tommassen et al., 1983)의 htrA ompT 유도체인 이. 콜라이 균주 CE1448(일반적으로 C. Jansen에 의해 제공됨)에서 발현되었다. 균주는 영양 요구성 돌연변이에 기인된 성장요건 및 1.32mM K2HPO4(포스페이트 풍부한 조건)가 보충된 헤페스-완충된 합성 배지(Tommassen and Lugtenberg, 1980)중에서 및 37℃에서 성장시켰다. 밤새 성장시킨 후에, 배양물을 K2HPO4(포스페이트 고갈된 조건)는 없지만 동일한 배지내로 1:13.5로 희석시키고, 6시간 동안 37℃에서 성장시켰다.
8B: 재조합 LbpB의 발현-이. 콜라이에서의 클로닝
염색체 DNA를 플레이트상에서 밤새 성장한 메닝고코시 세포로부터 단리시켰다. 박테리아를 플레이트로부터 스크렙하여, 1.5ml 10mM 트리스-HCl, 10mM EDTA, pH8에 현탁시키고, 10㎕의 리소짐(10mg/ml)를 가하였다. 현탁물을 실온에서 15분 동안 인큐베이팅시킨후에, 1.5ml의 2% 트리톤 X-100, 50mM 트리스-HCl, 10mM EDTA, pH8을 가하였다. 15분 동안 인큐베이팅시킨 후에, 10㎕의 프로테아제 K(10mg/ml)를 가하였다. 튜브를 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. DNA를 페농/클로로포름/이소아밀알콜(부피 24:24:1)을 가함으로써 혼합물로부터 추출하고, 추가로 물로 포화된 클로로포름으로의 추출에 의해 정제하였다. 염색체 DNA를 에탄올로 침전시켰다.
염색체 DNA를 주형으로 사용하여 성숙한 LbpB에 상응하는 lbpB 유전자의 일부를 프라이머 LB22 및 LB23을 이용한 PCR에 의해서 증폭시켰다(표 5). LB22는 LbpB의 N-말단 부분에 상응하는 부위에서 시발하고, PCR 생성물내에 PstI-부위를 도입시킨다. LB23은 lbpA 유전자의 시작 부위의 lbpB의 하류에서 시발하고, BamHI-부위를 도입한다. Pwo 폴리머라제(Boehringer Mannheim), 즉, 시험 해독 효소를 제조자의 지시에 따라서 PCR 반응에 사용하였다. 어닐링 온도는 60℃였으며 30회 수행하였다. PCR 생성물을 제조자의 지시에 따라서 β-아가라제(New England Biolabs)를 사용하여 갤로부터 단리하였다. PCR 생성물을 PstI 및 BamHI로 분해하고, pJP29내로 결찰시키고(도 10A), PstI 및 BglII로 분해시켰다. 생성되는 구성물에서, pAM31, BamHI 및 BglII 부위를 상실시켰다. LbpB 단백질을 phoE 프로모터로부터의 이러한 구성물에서 발현시키고, 확실한 시그날 서열 대신 PhoE 시크날 서열을 함유시켰다. 또한, N-말단으로부터의 첫번째 두 잔기를 각각 Cys 및 Ile로부터 Ala 및 Val 까지 변화시켰다. 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해서, His-tag를 시그날 서열과 LbpB의 성숙한 부분 사이에 삽입시켰다. pAM31을 PstI로 분해시켜고, 올리고누클레오티드 VGO12a와 VGO13a(표 5)로 구성된 링커에 결찰시켜서, 플라스미드 pAM32(도 10A)를 생성시켰다. PstI-부위는 결찰후에 상실되었다. 링커는 6개의 His 잔기 및 인자 Xa 분해 부위를 암호한다(도 10B).
8C: 재조합 LbpB의 정제
재조합 LbpB를 pAM32를 함유하는 균주 CE1448을 생성시켰다. 5L의 배양물로부터의 포스페이트 제한된 세포를 6시간 성장 후에 수거하였다. 세포를 500ml 생리학적 염 용액으로 1회 세척하고 및 150ml의 10mM 트리스-HCl, 5mM EDTA, pH8에 재현탁시켰다. 현탁액을 -20℃에서 밤새 동결시켰다. 세포를 해동시키고 세개의 프로테아제 억제제 칵테일 정제(CompleteTM, Boehringer Mannheim)을 가하였다. 세포를 프렌치 압축기(French press)를 통해 8000psi의 압력으로 압축하였다. 파괴되지 않은 세포를 소르발 GSA 로터(Sorvall GSA rotor)에서 5000rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상징액을 베크만 Ti60 로터(Beckman Ti60 rotor)에서 40,000rpm으로 90분동안 원심분리하였다. 세포 엔벨로프를 5mM Na2HPO4-NaH2PO4-완충액, pH 7.6에서 용해시켰다.
세포 엔벨로프를 37℃에서 2% n-옥틸-올리고-옥시에틸렌(Octyl-POE)로 2회 추출하였다. 첫번째 추출은 1시간 동안 수행하고 두번째 추출은 3시간 동안 수행하였다. 추출 사이 및 추출 후에, 비용해성 단백질을 베크만 TLA100.2 로터에서 100,000rpm으로 1시간 동안 원심분리함으로써 펠릿화시켰다. LbpB 단백질을 함유하는 상징액을 합하고 Ni-NTA 한천에 가하였다. 단백질의 정제는 제조자(Qiagen)에 의해 제공된 지시에 따라서 본래의 조건하에 배치식으로 수행되었다. 이미다졸 및 NaCl의 농도는 결합 및 세척 동안 각각 20mM 및 300mM였다. 전체적으로 2ml의 Ni-NTA 한천을 사용하여 10개 이상의 튜브로 분할하였다. 용리는 각각 3ml의 100mM, 200mM, 및 250mM 이미다졸로 단계별로 수행하였다. 용리후에, 단백질을 2.5ℓ의 포스페이트 완충된 염수에 대한 스펙트라/포르 2 투석 백(Spectra/Por 2 dialysis bag: Spectrum)에서 2회 투석하였다. 단백질을 10kDa의 컷오프로 푸지셉트 막시 센트리푸갈 컨센트레이터(Fugisept Maxi Centrifugal Concentrator: Intersept)에서 농축시켰다. 전체 용적이 1 내지 1.5ml가 될 때까지 소발 GSA 로터(Sorvall GSA rotor)에서 5,000 rpm으로 원심분리를 수행하였다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)를 문헌[Lugtenberg et al., (1975)]에 기재된 방법을 약간 변형시켜 수행하였다. 폴리아크릴아미드는 SDS를 함유하지 않으면서 5%의 스태킹 겔 및 11% 용해 겔로 구성된다. LbpB의 변성이 억제되어야 하는 경우, 샘플 완충액(Lugtenberg et al., 1975)에는 β-메르캅토에탄올을 함유시키지 않았으며, 샘플을 PAGE전에 0℃에서 유지시켰다. LbpB를 변성시키기 위해서 샘플완충액에 β-메르캅토에탄올을 보충하고, 샘플을 5분 동안 비등시켰다. 전기영동은 4℃ 40mA의 일정한 전류하에 수행하였다. 겔을 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색시켰다.
8D: 재조합 LbpB의 발현 및 정제-결과
나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV의 LbpB로부터의 재조합체를 이. 콜라이 균주 CE1448에서 발현시켰다. 구성물, 즉, pAM32를 PhoE의 시그날 서열, His-tag 및 성숙한 LbpB 단백질로 이루어진 재조합 단백질를 암호화함으로써 제조하였다(도 10A). 단백질은 포스페이트 제한하에 phoE 프로모터로부터 발현된다. LbpB의 확실한 타입 II 시그날 서열은 타입 I 시그날 서열로 치환되고 His-tag에 이어진 펙터 Xa 분해 부위(Factor Xa cleavage site)는 시그날 서열과 성숙한 LbpB 사이에 삽입된다. 또한 성숙한 LbpB의 첫번째 두 아미노산, 즉, Cys 및 Ile를 Ala 및 Val로 변화시켰다(도 10B). 결과적으로 재조합 단백질은 N-말단 Cys에서 지질 변화되지 않는다. 재조합 LbpB 단백질은 막에 의해 분별되며, 용해성 단백질로는 분별되지 않았다(데이타는 기재하지 않음). 따라서, 단백질은 세정제에 의해 막으로부터 추출되어야 한다. 옥틸-POE가 사용되는데, 그 이유는 옥틸 POE가 막으로부터의 전체 재조합 LbpB중 약 50%을 가용화시키기 때문이다. 또한, 추출된 단백질이 샘플 완충액중에서의 비등에 의해 변성되지 않는 경우, 이러한 단백질은 변성된 단백질 보다 PAGE에서 보다 빠르게 이동하는데, 이는 단백질이 정확하게 폴디드되었음을 제시한다. 추출후에, His-tag 단백질을 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 대부분의 단백질은 100mM 및 200mM 이미다졸 분획에서 용리되었다. 그러나, 모든 분획을 투석전에 합하였다. 단백질은 코마시 브릴리언트 블루우-염색된 겔상에서 평가된 바에 의하면 순수하였고(도 11), 이들 단백질 대부분은 변성된 형태 보다 PAGE 동안 더 빠르게 이동하는 폴디드 형태로 존재하였다. LbpB의 폴디드 형태, 그러나 변성되지 않은 형태가 블롯상에서 락토페린과 결합한다는 것이 실시예 6에 기재되어 있다.
실시예 9:
사람에서의 LbpB 단백질의 면역원성을 연구하기 위해서, 사람 회복기 혈청에서 균주 BNCV의 LbpB 단백질을 인식하는 항체의 존재를 면역블롯으로 시험하였다.
9A: 사람에서의 LbpB의 면역원성-방법
10 개의 사람 회복기 혈청을 스미스클라인 비참 바이올로지컬스 에스에이(SmithKline Beecham Biologicals SA: Belgium)로부터 얻었으며, 7개의 혈청을 내셔날 인스티튜트 오브 퍼블릭 헬스 엔드 더 엔바이런먼트(the National Institute of Public Health and the Environment: The Netherlands)로부터 얻었다. 각각의 혈청을 다양한 세로타입 및 서브타입의 균주로 감염시켰다.
재조합 LbpB를 실시예 8에 기재된 방법을 이용함으로써 단리하였다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)를 문헌(Lugtenberg et al., 1975)의 방법을 약간 변형시켜 수행하였다. 폴리아크릴아미드 겔을 SDS는 함유하지 않으며 5% 스태킹 겔 및 11% 용해 겔로 구성시켰다. LbpB의 변성이 억제되어야 하는 경우, 샘플 완충액(Lugtenberg et al., 1975)에 β-메르캅토에탄올을 함유시키지 않았으며, 샘플을 전기영동전에 0℃로 유지시켰다. LbpB를 변성시키기 위해서, 샘플 완충액에 β-메르캅토에탄올을 보충하고, 샘플을 5분 동안 비등시켰다. 전기 영동은 4℃ 20mA의 일정한 전류하에 수행된다.
면역블롯팅을 문헌(Pettersson et al., 1993)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 사람 혈청을 1:500으로 희석시켰다. 퍼옥시다제-컨주게이트된 토끼 항-사람 IgG(Dako A/S)를 1:5000의 작업 희석액으로 2차 항체로서 사용하였다. 퍼옥시다제의 활성을 제조자(Amersham)의 지시에 따라서 ECL 시스템으로 검출하였다.
9B: 사람에서의 LbpB의 면역원성-결과
사람 혈청내의 LbpB 특이적 항체의 존재는 면역블롯에서의 균주 BNCV(-:2a:P1.2)의 정제된 재조합 LbpB 단백질에 대해서 시험하였다. 반응성을 폴디드 LbpB 및 변성된 단백질 둘 모두에 대해서 시험하였다(참조, 도 12). 결과가 표 6에 요약되어 있다. 4 개의 혈청이 변성된 및 폴디드 형태의 LbpB 둘 모두와 강하게 반응하였고, 2 개의 혈청이 단지 폴디드 형태와 약하게 반응하였으며, 2개의 혈청이 단지 변성된 형태와 약하게 반응하였고, 4개의 혈청이 LbpB와 전혀 반응하지 않았다. 이러한 결과는 메닝고코시 LbpB가 사람에게 면역원성이며, 다양한 균주로부터의 LbpB 단백질 사이에서 상당한 정도의 면역학적 교차활성이 있음을 입증하는 것이다.
실시예 10: 메닝고코시 세포 또는 LbpB로 면역된 마우스로부터 얻은 혈청을 사용한 ELISA 및 살균시험
10A: 면역화 원안
나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV로의 면역화: 10 마우스의 그룹(6주 Balb/C)을 SBAS2 보조제중의 5x108CFU의 가열 불활성화된 BNCV 전체 세포로 3회(100㎕ 복강내 또는 100㎕ 피하) 면역화시켰다. 3회 면역화는 21일 간격으로 수행하였고, 혈액을 심장내 구멍에 의해 56일에 채혈하였다. 혈청을 그룹별로 모았다.
나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV로부터의 LbpB로 면역화: 본 면역화를 상기된 방법과 동일한 방법으로 수행하는데, 처음 2회의 면역화는 10㎍의 미정제 LbpB(재조합 LbpB를 함유하는 이. 콜라이 엔벨로우프)로 수행하였으며, 세번째 면역화는 2.5㎍의 순수한 LbpB(실시예 8에 기재된 방법과 동일한 방법으로 제조됨)로 수행되었다.
10B: 전체 세포 ELISA(WCE) 및 정제된 LbpB ELISA에서 반응의 측정
편평한 바닥 96-웰 넌크 면역 플레이트(96-well Nunc immuno plate)를 사용하였다. PBS중의 100㎕의 열 불활성화된 나이세리아 메닝지티디스 B 균주[실시예 1에 기재된 바와 같이 EDDA를 사용함 철 고갈 조건(fe-)하에 성장됨](20㎍/ml의 전체 단백질) 현탁액을 플레이트의 개개의 웰에 분취하고 37℃에서 밤새 증발시켰다.
피복된 플레이트를 0.9% NaCl, 0.05% 트윈 20으로 4회 세척하고, 교반하면서 실온에서 30분 동안 PBS 카제인 0.3%(Merck)로 포화시키고, 상기와 동일한 방법으로 세척하였다. 100㎕의 모은 혈청을 PBS 트윈 20 0.05% 카제인 0.1%에서 100배 희석시키고, 첫번째 웰에 가하고, 12 희석까지 2배 희석시키고, 플레이트를 교반하면서 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 세척후에, 100㎕의 PBS 트윈 20 0.05% 카제인 0.3%내의 토끼 항 마우스 면역글루블린 비오틴(Dakopatts E0413)의 2000배 희석액을 가하고, 플레이트를 상기된 방법과 동일한 방법으로 인큐베이팅하였다. 플레이트를 세척하고, 스트렙타비딘-비오티닐화된 호오스라디쉬 퍼옥시다제 복합체의 PBS 트윈 20 0.05%중에서 4000배 희석액 100㎕를 가하고, 플레이트를 동일한 방법으로 인큐베이팅하였다. 세척후에, 0.1 M 시트레이트 완충액 pH 4.5중의 4mg O-페닐디아민 (OPDA) 균주(sigma P8787)의 새롭게 제조된 용액 100㎕를 가하고, 플레이트를 암실내의 실온에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 반응을 50㎕ 1N HCl을 가함으로써 정지시켰다. 흡광도는 490nm에서 읽혀졌다.
항-LbpB ELISA는 피막을 다르게 하는 것을 제외하고는 WCE와 동일한 방법으로 수행하였다. 웰을 0.05M 카르보네이트/바이카르보네이트 완충액 pH 9.6중의 0.5㎍/ml의 순수한 LbpB의 100㎕의 용액으로 피복시키고, 37℃에서 밤새 인큐베이팅하였다(증발시키지 않음).
10C: 살균 검정
로그상 성장(OD 약0.3)중의 그룹 B 메닝고코시(균주 H44/76)[실시예 1에 기재된 바와 같이 철의 고갈(fe-) 조건, 또는 EDDA의 첨가를 생략함에 의한 풍부한 철(fe+) 조건 중의 어느 한 조건하에 성장]의 배양물을 0.3% BSA가 함유된 무균의 행크스 배지중에 현탁시켜 20000CFU/ml로 조절된 세포 현탁액을 얻었다.
50㎕/웰의 2배 희석액의 시험 혈청(실시예 10A) 샘플(56℃에서 30분동안 열 불활성화됨) 및 25㎕/웰의 20000CFU/ml 로그상 그룹 B 메닝고코시를 함유하는 주요 반응 혼합물(75㎕)을 제조하였다. 반응 바이알을 37℃에서 15분 동안 인큐베이팅시키고, 210rpm으로 교반하였다. 최종 반응 혼합물(100㎕)에 보충 공급물로서 25% 예비 시험된 베이비 토끼 혈청을 가하고, 동일한 조건 하에서 60분 동안 인큐베이팅하였다. 무균의 폴리스티렌 U-바닥 96-웰 미세역가 플레이트를 본 검정에 이용하였다.
10㎕의 분취량을 다중 채널 피펫을 사용하여 각각의 웰로부터 취하여, 1% 이소비탈렉스(Isovitalex) 및 1% 열 불활성화된 말 혈청을 함유하는 뮤엘러-힌톤(Mueller-Hinton) 한천 플레이트상에 점적하고 5% CO2중의 37℃에서 18시간 동안 인큐베이팅하였다. 각각의 콜로니를 분취액당 80CFU까지 계수할 수 있다.
하기의 3가지 시험 샘플을 대조군으로 사용하였다: 완충액+박테리아+보출물; 완충액+박테리아+불활성화된 보충물; 혈청+박테리아+불활성화된 보충물.
역가를 프로그램 엑셀(Microsoft)에 의한 과정을 이용하여 계산하였다. 이러한 과정은 누감계산에 의한 50% 세포 치사에 상응하는 정확한 희석치를 계산할 수 있게 한다.
실시예 10D: 결과
표 7 및 도 13은 LbpB의 면역화가 LbpB(도 13A)에 대한 양호한 반응 뿐만 아니라, 균주 BNCV(재조합 LbpB의 공급원) 및 균주 H44/76(BNCV의 서열과 78.5% 서열 상동성을 지니는 LbpB)(도 13B 및 도 13C)로부터의 전체 세포 샘플에 대한 양호한 반응을 유도한다는 것을 나타낸다. 단지 재조합 LbpB와 관련된 면역화 스케쥴을 이용하여 얻은 혈청이 유사한 결과를 나타냈다(데이타는 기재되지 않음). 명확하게는, 균주 BNCV에 의한 항-전체 세포 면역화가 BNCV 세포 및 H44/76 세포에 대한 보다 높은 항-전체 세포 ELISA를 유도한다(각각, 도 13B 및 도 13C).
또한, 나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV로부터의 재조합 LbpB에 의한 면역화는 실시예 9에 기재된 바와 같이 실질적으로 수행된 면역블롯을 수행한 모라셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)로부터의 전체 세포 샘플에서 유사한 분자량의 단백질에 결합하는 항체를 유도한다(데이터는 기재되지 않음).
표 8 및 도 14는 재조합 LbpB(균주 BNCV로부터)에 의해 면역화된 후에 혈청에서 생성된 항체가 이질성 균주(HH44/76)에 대해 살균성이며, LbpB는 BNCV의 서열과 단지 78.5% 서열 상동성을 지닌다. 본 경우는 또한 단지 재조합 LbpB과 관련되는 면역 스케쥴후에 얻은 혈청을 이용한 경우이다(데이터는 기재하지 않음). 이러한 결과는 H44/76이 철을 함유하는 조건(도 14A) 및 철이 고갈된 조건(도 14B)에서 성장하는 경우에 있어서 사실이다. 박테리아가 이러한 조건하에 있는 경우에 보다 많은 양으로 LbpB가 발현된다면 예측할 수 있는 바에 의하면 철이 고갈된 조건에서 보다 더 효과적인 듯하다.
LbpB는 따라서 면역 보호성 항원이며, 그로 인해서, 나이세리아 메닝지티디스의 이질성 균주에 대한 교차 면역 보호를 제공하는 증거를 나타낸다.
표 1. 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드
균주 설명a 참조/공급원
나이세리아 메닝지티디스
H44/76 B:15:P1.7,16 E. Holten
CE1449 H44/76 lbpA::Ermr 본원
BNCV -:2a:P1.2 M986의 비캡슐화된 유도체 E.C. Gotschlich
CE1452 BNCV lbpA::Ermr 본원
CE1452 BNCV lbpB::Kmr 본원
CE1402 M986 lbpA, lbpB Pettersson et al. 1994a
M990 B:6:P1.6
881607 B:nt:P1.12
B16B6 B:2a:P1.2 A. Schryvers
N91 B16B6 tbpB A. Schryvers
M981 B:4:nt
이. 콜라이
DH5α Laboratory stock
Y1090 Ampr Young and Davis, 1983
PC2494 JM101의 hsdR 유도체 Phabagen Collection
플라스미드
pEMBL19 Ampr Laboratory stock
pUC4K Kmr-박스, Ampr Pharmacia Biotech
pER2 pBluescript내의 Ermr-박스, Ampr Jennings et al., 1993
pAM6 lbpA 및 lbpB의 일부를 지니는 pEMBL19 본원
pAM6K lbpB의 BglII 부위에서 삽입된 pUC4K로부터의 Kmr-박스를 지니는 pAM6 본원
pAM6K-nus 벡터의 다중 클로닝 부위의 Kpnl-부위에서 삽입된 나이세리아 흡수서열을 지니는 pAM6K 본원
pAM13 lbpA의 일부 및 lbpB의 일부를 지니는 pEMBL19 본원
pAM1 lbpA의 일부 및 lbpB의 일부를 지니는 pUC19 Pettersson et al. 1993
pAM23 lbpA 및 lbpB의 일부를 지니는 pUC19 Pettersson et al., 1994b
pAM23E lbpA의 EcoRV-부위에서 삽입된 Ermr-박스를 지니는 pAM23 본원
a세로그룹, 세로타입 및 서브타입이 모니터링된다. nt:기재할 수 없음.
표 2. PCR 또는 링커 클로닝에 사용된 프라이머
명칭 서열 설명
DVAS2 AGACCGACCCTTCGACGACTTCGG
FW5 GAAGAAGAAGCGATGGTGCGG
SDA1 CCTCTTTAGTATCTTTCTTCGCAC
LB11 CTTAATTTCATCTTTTCCC
PR1 GAGCGAGTCCGCGTTAGTGCT Kmr-카세트에서의 결합
nus1 TTCAGACGGCTGTAC nus1에 상보성인 나이세리아 흡수 서열
nus2 AGCCGTCTGAAGTAC
표 3. 4개의 추가 lbpB 유전자을 PCR 증폭시키는데 사용된 프라이머
명칭 서열
LB20 GGAGGAAAAGTAGGGATG
LB23 CGGGATCCAGCCAAGGCAGTCAGGGTAAGC
REV2 GCACGGACGGTAACCTCTTTCAGG
표 4. LbpB 서열의 쌍 상동성(%)
표 5. 재조합 LbpB를 발현시키는데 사용된 프라이머
표 6. 정제된 LbpB에 대한 사람 혈청의 면역블롯의 결과
a공지된 경우의 환자가 감염된 균주의 세로- 및 서브타입을 나타낸다. NT: 기재할 수 없음.
b++는 단백질의 본래 또는 변성된 형대와의 강한 반응을 나타내며, +는 약한 반응을 나타내고, -는 반응없음을 나타낸다.
cSKB: 스미스클라인 비참 바이올로지칼스, RIVM: 내셔날 인스티튜트 오브 퍼블릭 헬쓰 앤드 더 엔바이런먼트
표 7. 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행된 항 전체 세포 및 항 LbpB ELISA의 결과
a혈청 희석.b490nm에서의 광학 밀도
표 8. 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행된 항 전체 세포 및 항-LbpB 혈청의 살균활성 결과
a혈청 희석
이로 한정되는 것은 아니지만 본 명세서에서 인용된 특허 및 특허원을 포함한 모든 문헌은 각각의 문헌을 본원에서 완전히 기재하고는 있지만 특별히 및 개별적으로 참조로서 인용되고 있는 바와 같이 참조로서 인용되는 것이다.
인용 문헌
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(1) 일반적 사항
(ⅰ) 출원인: 유니버시티 오브 유트레히트, 테크놀로지 파운데이션
(ⅱ) 발명의 명칭: 백신
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(B) 주명: 나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV
(ⅸ) 서열의 특징:
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(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :1:
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(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 725 아미노산
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(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
(ⅴ) 단편형: 중간 단편
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(B) 주명: 나이세리아 메닝지티디스 균주 BNCV
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :2:
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
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(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
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(B) 주명: 나이세리아 메닝지티디스 균주 M981
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: 코딩 서열
(B) 존재 위치: 1...2166
(D) 기타 정보:
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :3:
(2) 서열 번호 4에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 722 아미노산
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(B) 주명: 나이세리아 메닝지티디스 균주 M981
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(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
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(B) 주명: 나이세리아 메닝지티디스 균주 H44/76
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(A) 특징을 나타내는 기호: 코딩 서열
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(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
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(ⅵ) 기원:
(B) 주명: 나이세리아 메닝지티디스 균주 H44/76
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :6:
(2) 서열 번호 7에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 2262 염기쌍
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(D) 기타 정보:
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :7:
(2) 서열 번호 8에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
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(C) 쇄의 수: 1본쇄
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(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
(ⅴ) 단편형: 중간 단편
(ⅵ) 기원:
(B) 주명: 나이세리아 메닝지티디스 균주 M990
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :8:
(2) 서열 번호 9에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 2124 염기쌍
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(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: cDNA
(ⅵ) 기원:
(B) 주명: 나이세리아 메닝지티디스 균주 881607
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: 코딩 서열
(B) 존재 위치: 1...2121
(D) 기타 정보:
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :9:
(2) 서열 번호 10에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 707 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: 단백질
(ⅴ) 단편형: 중간 단편
(ⅵ) 기원:
(B) 주명: 나이세리아 메닝지티디스 균주 881607
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :10:

Claims (30)

  1. 나이세리아 메닝지티디스 LbpB를 암호화하는 단리된 폴리누클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 1(누클레오티드 100 내지 누클레오티드 2274), 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 폴리누클레오티드임을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  3. 누클레오티드 100 내지 누클레오티드 2274의 서열번호 1의 서열과 65% 이상 상동성인 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  4. 서열번호 3의 서열과 65% 이상 상동성인 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  5. 서열번호 5의 서열과 65% 이상 상동성인 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  6. 서열번호 7의 서열과 65% 이상 상동성인 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  7. 서열번호 9의 서열과 65% 이상 상동성인 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  8. 제 3항 내지 제 7항중의 어느 한 항에 있어서, 양립성 숙주 세포내에서 LbpB 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 재조합 발현 시스템을 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  9. 제 8항에 기재된 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포.
  10. 폴리펩티드를 생산하기에 충분한 조건하에 제 9항의 숙주를 배양하고, 배양물로부터 폴리펩티드를 수거함을 포함하여 LbpB 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  11. 제 8항에 기재된 발현 시스템으로 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시켜서, 숙주세포가 적절한 배양 조건하에 LbpB 폴리펩티드를 생산하게 함을 포함하여, LbpB 폴리펩티드를 생산하는 세포를 제조하는 방법.
  12. 나이세리아 메닝지티디스로부터의 LbpB 폴리펩티드.
  13. 제 12항에 있어서, 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  14. 서열 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 2의 아미노산 서열과 65% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 LbpB 폴리펩티드.
  15. 서열 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 4의 아미노산 서열과 65% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 LbpB 폴리펩티드.
  16. 서열 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 6의 아미노산 서열과 65% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 LbpB 폴리펩티드.
  17. 서열 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 8의 아미노산 서열과 65% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 LbpB 폴리펩티드.
  18. 서열 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 10의 아미노산 서열과 65% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 LbpB 폴리펩티드.
  19. 제 14항 내지 제 18항중의 어느 한 항에 있어서, 아미노산 위치 19로부터 폴리펩티드의 C-말단까지 각각 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  20. 제 14항 내지 제 19항중의 어느 한 항의 LbpB 폴리펩티드에 대해 면역특이적인 항체.
  21. (a) 목적하는 화합물을 LbpB 폴리펩티드를 발현하는 세포와 접촉시키고,
    (b) 결합 또는 작용성 반응의 억제를 관찰하거나; 목적하는 화합물과 접촉되는 세포의 능력을 LbpB 폴리펩티드 활성에 대해 접촉되지 않는 동일한 세포와 비교함을 포함하여, 제 14항 내지 제 19항중의 어느 한 항의 LbpB 폴리펩티드를 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
  22. 유효량의 제 14항 내지 제 19항중의 어느 한 항의 폴리펩티드와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
  23. 제 22항에 있어서, 조성물이 하나 이상의 다른 나이세리아 메닝지티디스 항원을 포함함을 특징으로 하는 백신.
  24. 유효량의 제 14항 내지 제 19항중의 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 사람에게 투여함을 포함하여, 나이세리아 질환에 대해서 사람을 백신화시키는 방법.
  25. 유효량의 제 3항 내지 제 7항중의 어느 한 항의 폴리누클레오티드를 포함하는 조성물을 사람에게 투여함을 포함하여, 나이세리아 질환에 대해서 사람을 백신화시키는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 폴리펩티드가 경구, 피하, 직장내, 기관지내, 근육내 또는 비내 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 폴리누클레오티드가 피하, 기관지내, 근육내 또는 비내 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 14항 내지 제 19항중의 어느 한 항의 폴리펩티드를 적합한 사람 또는 동물에게 투여함으로써 생성된 항체를 진단하고자 하는 사람으로부터의 생물학적 체액의 샘플과 함께 인큐베이팅하여, 나이세리아 박테리아의 존재하에 항원-항체 복합체가 형성되게 하는 단계, 및 체액 샘플을 복합체의 존재에 대해 분석하는 단계를 포함하여, 인체에서 나이세리아 질환을 진단하는 방법.
  29. 제 14항 내지 제 19항중의 어느 한 항의 폴리펩티드에 대해서 유도된 하나 이상의 항체 및 적합한 약제학적 담체를 포함하여, 나이세리아 질환을 앓고 있는 사람을 처리하는데 유용한 치료학적 조성물.
  30. 제 3항 내지 제 7항중의 어느 한 항의 폴리누클레오티드 또는 제 14항 내지 제 19항중의 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제 20항의 항체를 포함하는 사람의 나이세리아 박테리아 감염을 진단하는 키트.
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