CN1275164A - 奈瑟氏球菌乳铁蛋白结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Lbp多肽和多核苷酸以及用重组技术生产这类多肽的方法。本发明还公开了利用Lbp多肽和多核苷酸设计奈瑟氏球菌病治疗方案的方法,特别是设计这类疾病诊断实验的方法。
Description
发明领域
本发明涉及新鉴定的多核苷酸、它们所编码的多肽以及这类多肽和多核苷酸的用途，以及它们的生产方法。更具体地说，本发明的多肽和多核苷酸涉及奈瑟氏球菌外膜蛋白(OMP)家族，具体涉及乳铁蛋白(lactoferrin)-结合蛋白B(LbpB)。另外，本发明还涉及LbpB的治疗用途，例如用于制备抗奈瑟氏球菌疾病的疫苗。
发明背景
脑膜炎是由细菌或病毒引起的，迄今为止由细菌引起的这类疾病最为严重。其中起主要作用的细菌是脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血菌和肺炎链球菌。由于抗乙型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗研究成功并结合到常规婴儿接种中，所以，脑炎奈瑟氏菌便成为全世界范围内的脑炎的主要病因，目前单美国每年就有约2600个病例。
根据荚膜多糖组成的不同，脑炎奈瑟氏菌可分为13个血清组。此外，根据该细菌的其他组分，每个血清组可以进一步分为血清型、亚型以及免疫型。其中的3个血清组(甲、乙和丙)引发的脑炎占全部病例的90％，在发达的工业化国家中，血清组乙引发的脑炎占全部病例的50～80％。
现已有的用荚膜多糖制成的高效疫苗可以预防由脑炎奈瑟氏菌血清组甲和丙引发的脑炎。血清组丙多糖疫苗在年龄不足2岁(该年龄段是脑炎发病的高危期)的幼儿体内不会产生保护效应，但是通过把这些多糖偶联到载体蛋白上，可以克服这一缺陷。偶联的另外一个优点是可以引发针对该抗原的免疫记忆。
相反，奈瑟氏菌血清组乙的多糖无论是否以偶联形式存在，都对人几乎或根本不具有免疫原性。因此，特别希望在以多糖为基础的疫苗之外，能得到抗由脑炎奈瑟氏菌(特别是血清组乙)引发的奈瑟氏球菌疾病的疫苗。
一类有希望的侯选疫苗是可以使用脑炎奈瑟氏菌外膜蛋白(OMPs)，因为它们可以提供具有免疫原性并能引发人体免疫应答的抗原。特别是负责把铁摄入细胞内的OMPs前景十分看好。
铁是大部分细菌的必需营养物。在人体的细胞外腔室中，铁主要是与血清中的运铁蛋白以及粘膜表面上的乳铁蛋白结合在一起，以复合态形式存在(Finkelstein et al.，1983)，而游离态的量极微。因此，获得有效数量的铁是病原菌的一个重要毒力因素。具体就脑炎奈瑟氏球菌(一种严格的人体致病菌)而言，它的铁需求是通过利用针对运铁蛋白或乳铁蛋白等人的铁-螯合蛋白的受体来满足的，这样使得该菌体细胞能够结合这些蛋白从而摄入其生长所需的铁。当该细菌感觉到铁限制时，便会诱导合成这些受体蛋白。
这些参与从运铁蛋白TbpA和TbpB(Cornelissen et al.，1992；Legrain et al.，1993；Anderson et al.，1994)以及乳铁蛋白结合蛋白A(LbpA)中(Pettersson et al.，1993；1994b；Biswas和Sparling，1995)摄取铁的受体蛋白已被克隆并测序。这些结合运铁蛋白的受体蛋白在外膜中形成复合物。在脑炎奈瑟氏球菌中，TbpA和TbpB二者对于铁转运来说都是必不可少的(Irwin et al.，1993)。TbpA是膜整合蛋白，而TbpB是一种脂蛋白，并且它仅以脂基元部分锚定在胞膜上。关于这些受体处理那些运载了铁的运铁蛋白的机制，目前的模式是结合形成受体复合物。在该复合物中，TbpB蛋白能够识别结合铁的-或脱铁的运铁蛋白。与运铁蛋白的结合可以导致该受体构象的改变，这使得铁从运铁蛋白上释放出来，并在TbpA上开放出一个闸门性的孔道，铁得以转运通过上述外膜(Cornelissen和Sparling，1994；1996)。
乳铁蛋白也被认为是脑炎奈瑟氏球菌的一种重要毒力因子。进入人体的主要位点是鼻咽部，这里乳铁蛋白是主要的铁来源。而且，初步报告显示在急性炎症中乳铁蛋白能够穿过血-脑屏障(Gschwentneret al.，1997)。在感染晚期，可能乳铁蛋白也是脑膜炎球菌的重要铁来源，这时该细菌已经到达脑膜。用亲和分离方法，最初鉴定出了单一的乳铁蛋白结合蛋白(Schryvers和Morris，1988)。该受体的结构基因定名为LbpA，其特征已清楚(Pettersson et al.，1993；1994b；Biswas和Sparling，1995)，已经提出了该蛋白在外膜中的拓扑学模型(Pettersson et al.，1994a)。该蛋白表现出与TbpA的同源性。此外，已经鉴定出了lbpA基因上游的部分可能的开放阅读框，并且推导的氨基酸序列与TbpB呈现出同源性(Pettersson etal.，1994a)。
TbpB和其他纯化的脑炎球菌OMPs是此前专利申请的主要目标，用它们来制备抗脑炎奈瑟氏球菌的疫苗(例如，TbpB，WO9307172；22kDa表面蛋白，WO9629412；血红蛋白受体，WO9612020；膜孔蛋白，WO9503413；菌毛蛋白，WO9408013；64kDa OMP，EP474313-B1)。
需要对OMP家族另外成员进行鉴定和并对其特征进行，这些成员在预防、缓解或矫正功能异常或疾病中发挥着作用，所述功能异常或疾病包括但不限于奈瑟氏球菌疾病(例如脑膜炎)。
抗LbpA的抗体似乎不能杀细菌，因而它在用作疫苗侯选蛋白方面受到限制(Pettersson et al.，1993)。
本发明鉴定并特征化了另一个结合乳铁蛋白的受体蛋白，即乳铁蛋白结合蛋白B(LbpB)，它在利用来自乳铁蛋白的铁方面发挥的作用，以及它的治疗用途。
LbpB具有多种优势，超过了其他的OMP疫苗侯选蛋白。首先，在脑膜炎球菌疾病的血液阶段，人乳铁蛋白是该机制的主要来源，因为与人运铁蛋白相比它结合铁的亲和力要大300倍，因此用乳铁蛋白作为铁来源对于该机制来说是必不可少的。第二，乳铁蛋白具有已知的抗细菌功效，感染时它在血液中的浓度会升高。因此，对于该机制来说，结合人乳铁蛋白是获得抗性的重要途径。最后，在细菌进入人体的部位(鼻咽部)，人乳铁蛋白是脑炎奈瑟氏球菌获得铁的主要来源。
这些优势的重要性在于：体内的绝大多数脑炎球菌的细胞表面都可能表达有LbpB抗原；由于必须高效地结合乳铁蛋白，所以LbpB的细胞表面结构域可能十分保守，抗LbpB抗原的免疫反应不仅能阻止血液中脑炎球菌的感染，而且它还能阻止上述机制在鼻咽部的运行。
发明概述
一方面，本发明涉及Lbp多肽以及用于生产这些多肽的重组材料和方法。本发明的另一方面涉及利用这类多肽或多核苷酸的方法。这些用途中包括对奈瑟氏球菌疾病的预防和治疗。还有另一方面，本发明涉及用于检测与Lbp存在有关的疾病的诊断方法。
附图简述
图1.对生长在铁含量低于最低限的全细胞中的蛋白进行Western印迹分析。泳道1和5，BNCV菌株；泳道2和6，lbpA突变的CE1452菌株；泳道3和7，lbpB突变的CE1454菌株；泳道4和8，1bpAB突变的CE1402菌株。使用的抗血清针对以lbpB序列为基础合成多肽。泳道1～4，血清17-3抗肽链C1。泳道5～8，血清19-1抗肽链E1。标准分子量的位置以千为单位标示在右侧。LbpB蛋白用箭头在左侧标明。
图2.BNCV菌株中lbpB和lbpA基因DNA片段的限制酶谱。不同重组质粒中的插入子和PCR产物(PCR)以开放框表示。包含lbpBA位点的质粒pAM23和pAMII的特征前面已有描述(Pettersson et al.，1993，1994a)。开放阅读框架用粗箭头标示。用于筛选文库和Southern杂交的探针显示在开放阅读框架之上。用于PCR扩增的引物显示在开放阅读框架之下。在pAM6K中卡那霉素抗性框的插入位点用开放的三角表示。在pAM23E中的红霉素抗性框的插入位点用封闭的三角表示。
图3.BNCV的LbpB蛋白和B16B6的TbpB蛋白序列比较。一致的氨基酸以破折号表示。右边的数字表示氨基酸位置。为了得到最佳对齐方式，允许有间断出现。用于免疫小鼠的肽显示在LbpB序列之上。富含阴性电荷的氨基酸残基的两个节段以下画线标示。可能的信号肽II切割位点在序列上以箭头标示。
图4.LbpB上游启动子序列。翻译起始位点(ATG)以粗体标示。核糖体结合位点、可能的-10和-35序列以下画线标记(分别以粗线和细线)；可能的Fur框用框标示。
图5.对来自培养在TSB培养基(泳道1、3、5和7)或加EDDA的TSB(泳道2、4、6和8)中全细胞抽提蛋白的Western分析。所用抗体为针对LbpA(组A)的单克隆抗体mn98K1和mn98K2及针对LbpB肽C1(组B)的抗血清17-3。泳道1和2，BNCV株；泳道3和4，lbpA突变的CE1452；泳道5和6，lbpB突变的CE1454；泳道7和8；lbpAB突变的CE1402。
图6.A.在缺铁状态下培养的脑膜炎球菌BNCV株外膜蛋白的Western分析。外膜蛋白在非变性条件下电泳，LbpB蛋白用针对合成肽A1的血清来检测。泳道1和2标示电泳前分别用0℃和95℃处理。分子量标准在图右以千计。B.在缺铁状态下培养的脑膜炎球菌BNCV株外膜蛋白在Western印迹中同乳铁蛋白的结合分析。外膜复合物中蛋白在非变性条件下电泳，转印膜同过氧化物酶偶连的人乳铁蛋白孵育。泳道1和3标示样品在电泳前分别在0，37，95℃孵育。分子量标准以千计，标示在右边。
图7.在全细胞ELISA中乳铁蛋白同lbp突变体的结合分析。包被用菌株指示在右边。乳铁蛋白分别以200，100，50，25，12.5，6.25，3.125和0ng/ml浓度加入(1-8排)。乳铁蛋白同细胞的结合用过氧化物酶偶连的乳铁蛋白的特异抗血清来检测。
图8.对重组人乳铁蛋白菌株的平板饲喂(plate feeding)分析。仅显示相关的平板部分。右边指示的细胞为铁限制条件平板中所铺细菌。滴加所指示浓度的乳铁蛋白对生长刺激作用在过夜培养后监测。箭头所示组B中滴加的位置。在本实验中，使用11％铁饱和的乳铁蛋白。
图9.5个来自脑膜炎球菌的LbpB蛋白的序列对比。对比用CLUSTAL程序(PC Genes，IntelliGenetics)，手工优化。右边数字标示氨基酸位置。为达到最佳对齐效果，允许右间隔出现。对于5个序列均一致的位置用*标示。
图10.A.pJP29(Bosch et al.，1986)、pAM31和pAM32相关部分的限制酶谱。仅显示插入部分。载体为pACYC184。pJP29在其自身启动子后面有phoE基因(浅灰色)。启动子和侧翼序列为白色。PstI位点相当于信号序列和phoE蛋白成熟部分的序列边缘。pAM31从左到右包含：phoE启动子(白色)、编码PhoE信号序列(浅灰色)和成熟LbpB(黑色)的重组基因。相当于LbpA(深灰色)N端部分、PhoE的C端部分(浅灰色)和侧翼序列(白色)也包含在内。pAM32是通过插入一编码His标签和因子Xa切割位点的接头插入pAM31的PstI位点来得到。pAM31和pAM32的详细构建参照实施例8。pAM32中的限制酶位点以括弧标示，因为这些位点在克隆过程中丢失。
B.野生型和重组构建体中LbpB氨基酸序列比较。仅显示LbpB/PhoE信号序列和成熟LbpB中的第一和最后一位氨基酸。整个His标签和因子Xa切割位点都有显示。导肽酶I和II(分别为LpaseI和II)和因子Xa切割位点以箭头指示。
图11.用PAGE对重组蛋白进行纯化。泳道1和2分别标示样品在电泳前在0℃和100℃孵育。分子量标准显示在右边，以KDa计。
图12.用折叠形式(泳道1、3、5、7、9)和变性形式(泳道2、4、6、8、10)的重组LbpB对5个康复人血清的Western分析。泳道1和2，血清69；泳道3和4，血清262439；泳道5和6，血清262532；泳道7和8，血清263017；泳道9和10，血清330。分子量标准在右边以千道尔顿计。左边箭头指示变性(dLbpB)和折叠蛋白(fLbpB)的位置。
图13.按实施例10描述的抗人全细胞和抗LbpB的ELISA结果。A.用脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV株全细胞免疫的抗LbpB应答。用PBS免疫作为对照。B..用LbpB或脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV株全细胞免疫的抗全细胞(BNCV生长在缺铁状态下)应答。用PBS免疫作为对照。C.用LbpB或脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV株全细胞免疫的抗全细胞(H44/76生长在缺铁状态下)应答。用PBS免疫作为对照。
图14.抗全细胞和抗BNCV株LbpB血清的杀菌活性(表8)结果，按实施例10完成。A.对脑膜炎奈瑟氏菌株H44/76的杀菌滴度(生长在富铁环境下)。B.对脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76菌株的杀菌滴度(生长在缺铁状态)。
发明详述
定义
提供下列定义是为了有助于理解本发明中使用的某些术语。
“LbpB”通常是指多肽，优选为一种脂蛋白，该多肽，具有SEQID NO：2、4、6、8或10所示的氨基酸序列，或者其等位基因突变体。
“LbpB活性或LbpB多肽活性”或者“LbpB或LbpB多肽的生物学活性”是指所述LbpB的代谢或生理功能，包括类似活性。特别地，LbpB活性是指与人乳铁蛋白结合的能力。LbpB的活性可以用实施例6中描述的方法来测试。该说明书中还包括了所述LbpB的抗原性和免疫原性。这种抗原性最好能用实施例9中描述的方法测试，优选按照实施例10A中的描述使用抗脑炎球菌BNCV菌株的LbpB的多克隆血清。按照实施例10B的描述，可以通过使用脑炎球菌BNCV菌株的纯化LbpB的ELISA实验测量抗体反应(使用突变株生产的抗体)。
“lbpB基因”是指具有SEQ ID NO：1所示的100～2274位核苷酸序列的多核苷酸，或SEQ ID NO：3、5、7或9所示的核苷酸全序列，或其等位突变体以及/或它们的互补序列。
本发明中使用的“抗体”包括多克隆及单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体，以及Fab片段，包括Fab的产物或者其他免疫球蛋白表达文库。
“分离的”是指从自然状态利用人工操作改变后的状态。如果“分离的”组合物或物质是天然生成的，那么它已经被改变或从原始的环境中移取出来了，或者两者情况兼而有之。例如，本发明使用该术语时，动物活体中天然出现的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是当同样的多核苷酸或多肽与其天然状态下的共存物隔离开后，这些物质就是“分离的”。
“多核苷酸”通常是指任一寡聚核糖核苷酸或寡聚脱氧核糖核苷酸，它们可以是未被修饰的RNA或DNA或者经过修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于：单链和双链DNA、具有单链和双链区域混合结构的DNA、单链和双链RNA、具有单链和双链区域混合结构的RNA、由单链或者更典型地由双链或具有单链和双链区域混合结构的DNA和RNA组成的杂合分子。此外，“多核苷酸”还可以是包括RNA或DNA或者RNA和DNA都包括的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰后的碱基的DNAs或RNAs以及具有为稳定或其他目的而修饰过的骨架的DNAs或RNAs。“修饰后的”碱基包括，例如三苯甲基化碱基以及次黄嘌呤核苷等非常见碱基。已经有多种修饰用于了DNA和RNA；因此，多核苷酸包括天然发现的典型多核苷酸的化学、酶学或代谢修饰形式，以及DNA和RNA的化学形式和作为病毒和细胞特征的RNA。“多核苷酸”还包括经常被称为寡核苷酸的较短的多核苷酸。
“多肽”是指任意一种包括2个或更多个氨基酸的肽或蛋白质，这些氨基酸彼此之间通过肽键或肽电子等排物等修饰后的肽键连接在一起。“多肽”是指通常被成为肽、寡肽或寡聚体的短链以及通常被成为蛋白质的长链。多肽可以包括除那20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括用翻译后处理等天然方法或者本领域熟知的化学修饰技术修饰后的氨基酸序列。在基本教科书和更详细的专著以及长篇研究文献中都有这类修饰的详细描述。修饰可以发生在多肽的任一位置，包括多肽骨架、氨基酸侧链或羧基末端。可以理解到同一类型的修饰可以在给定多肽的几个位置上以同样或不同的程度出现。另外，一种给定多肽可以包含多种类型的修饰。多肽可以因遍在蛋白化而具有分枝，它们可以是有或无分枝的环型。环型、分枝以及分枝环型多肽可以来自翻译后的天然处理或者通过合成方法获得。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接亚铁血红素基元、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂或脂类衍生物、共价连接磷酯酰肌醇、交连、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交连、形成焦谷氨酰、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI固定结构、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊二烯化、外消旋作用、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、精氨酸化等转运-RNA介导的蛋白质添加氨基酸作用、遍在化作用。参见，例如，蛋白质结构和分子特性，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，纽约，1993以及蛋白质翻译后共价修饰，B.C.Johnson，Academic press，纽约，1983中的Wold，f.，蛋白质翻译后修饰：展望和前景，pgs.1-12；Seifter et al.，“对蛋白修饰和非蛋白辅因子的分析”，Meth Enzymol(1990)182：626-646以及Rattan et al.，“蛋白分析：翻译后修饰及老化”，Ann NY Acad Sci(1992)663：48-62。
本发明中使用的术语“突变体”是指那些分别与参照多核苷酸或多肽不同但保留了生物特性的多核苷酸或多肽。一种多核苷酸典型突变体在核苷酸序列上与另一个参照多核苷酸不同。突变体核苷酸序列的变化可能或者不会改变参照多核苷酸所编码多肽的序列。正如下面讨论的那样，核苷酸的变化可能会导致标准序列所编码多肽中发生氨基酸的取代、添加、缺失、融合及截短。一种多肽的典型突变体在氨基酸序列上不同于另一个参照多肽。通常，差别限制在参照多肽和突变体的序列总体上十分近似而且在许多区域中完全相同。一种突变体和参照多肽之间可能因下列情况在氨基酸序列上不同：任一组合的1个或多个氨基酸的取代、添加、缺失。一个取代或插入的氨基酸可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸。多核苷酸或多肽的突变体可以是天然生成的，例如等位突变体(例如，SEQ ID NO：3、5、7或9是SEQ ID NO：1所示的lbpB多核苷酸的突变体；SEQ ID NO：4、6、8或10是SEQ ID NO：2所示的LbpB多肽的突变体)，或者它可能是未知的天然生成突变体。多核苷酸或多肽的非-天然生成可以通过诱变技术或通过指导合成获得。突变体应该保留LbpB多肽的一种或多种生物活性。它们要么能结合人乳铁蛋白(优选按照实施例6中的描述测试该活性)，或者具有与LbpB近似的抗原性或免疫原性。抗原性的测试最好采用实施例9中描述的免疫印迹法，优选使用实施例10A中描述的抗脑膜炎球菌BNCV株的LbpB的多克隆血清。免疫原性的测试最好按照实施例10B中描述的那样，使用来自脑膜炎球菌BNCV株的纯化LbpB通过ELISA测量抗体应答(使用用突变体制备的多克隆血清)。优选地，一种突变体应该保留上述全部生物活性。
“同一性”是指对核苷酸序列或氨基酸序列同一性的度量。通常，序列要对齐以便获得最高的序列匹配(order match)。就其本身而言，“同一性”具有技术识别意义，并且可以用公开的技术来计算。见，例如：(计算分子生物学，Lesk，A.M.，编.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，NewYork，1993；序列数据的计算机分析，第1部分，Griffin，a.M.，and Griffin，h.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；分子生物学中的序列分析，von Heijine，G.，Academic Press，1987；以及序列分析引物，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，1991)。有大量的方法可以用于测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性，术语“同一性”是本领域技术人员众所周知的(Carillo，h.，and Lipton，D.，SIAM J AppliedMath(1988)48：1073)。通常用于测定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括，但不限于下述文献公开的方法：巨型计算机指南，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994，andCarillo，H.，and Lipton，D.，AIAM J Appied Math(1988)48：1073。测定同一性和近似性的方法已被编制成电脑程序。优选的测定两个序列之间同一性及相似性的电脑程序方法包括，但不限于，GCS程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research(1984)12(1)：387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，s.F.Et al.，JMolec Biol(1990)215：403)。
举例说明，如果一段多核苷酸与SEQ ID NO：1所示的参照核苷酸序列具有至少例如95％的“同一性”，那么就可以认为该多核苷酸的核苷酸序列与标准序列之间是相同的，除去该多核苷酸序列可以在SEQ ID NO：1所示标准序列每100个核苷酸中有平均5个点的突变。换句话说，为了获得与标准序列之间具有至少95％同一性的多核苷酸，标准序列中至多可以有5％的核苷酸缺失或被另一个核苷酸取代，或者至多允许有占标准序列核苷酸总数5％的核苷酸插入到标准序列中。标准序列中这些突变可以发生在标准序列的5’末端或3’末端，或者这些末端之间的任一位置上，既可以单个地散布在标准序列中也可以连续成1或多个簇存在于标准序列中。
类似地，如果一段多肽与SEQ ID NO：2所示的参照氨基酸序列具有至少例如95％的“同一性”，那么就可以认为该多肽的氨基酸序列与标准序列之间是相同的，除去该多核苷酸序列可以在SEQ ID NO：2所示标准序列每100个氨基酸中有平均5个点的突变。换句话说，为了获得与标准序列之间具有至少95％同一性的多肽，标准序列中至多可以有5％的氨基酸缺失或被另一个氨基酸取代，或者至多允许有占标准序列氨基酸总数5％的氨基酸插入到标准序列中。标准序列中这些变化可以发生在该标准序列的氨基末端或羧基末端，或者这些末端之间的任一位置上，既可以单个地散布在标准序列残基中也可以连续成1或多个簇存在于标准序列中。
本发明的多肽
一方面，本发明涉及LbpB多肽(或LbpB蛋白)。所述的LbpB多肽包括SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的多肽(残基1～18是每个蛋白的天然信号肽，残基Cys19是天然成熟蛋白质中被脂化的氨基酸)、包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示氨基酸序列的多肽、以及包含在其全长序列上与SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示序列具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽，以及还可以更优选至少70％同一性，以及还可以更优选至少80％同一性，以及甚至更优选与SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示序列具有至少90％同一性。另外，具有95～99％同一性的序列是高度优选的。LbpB多肽中还包括那些氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示氨基酸序列在全长上具有65％同一性的多肽，以及更优选与SEQ ID NO：2、4、6、8或10至少70％同一性，以及更优选至少80％同一性，以及还有更优选至少90％同一性。另外，具有95～99％同一性的序列是高度优选的。
SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的Lbp多肽分别来脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV株、M981株、H44/76株、M990株以及881607株。
所述的Lbp多肽可以是“成熟”蛋白或者也可以是融合蛋白等更大蛋白的一部分。但所述多肽包括含有下列序列的附加氨基酸序列时会更有利：分泌或前导序列(例如天然LpbB前导序列、SEQ ID NO：2、4、6、8或10中的第1～18位残基)、原序列、多个组氨酸等有助于纯化的序列或者在重组生产过程中起稳定作用的外加序列。
本发明还包括LpbB多肽的片段。一种片段是其序列仅与上述LpbB多肽氨基酸序列中的一部分而非全长相同。与LpbB多肽相同，片段可以是“自由链”，或者包括在一种较大多肽中形成该多肽的一部分，优选形成该多肽中的单个连续区域。本发明多肽片段的代表性实例包括LpbB多肽中的起止氨基酸大约为下列序数的区段：1～20、21～40、61～80、81～100以及101～结尾。这种情况下的“大约”包括在一端或两端都比具体列举出范围多或少几个、5、4、3、2或1个氨基酸。
优选片段包括，例如，具有删减了下列残基的LpbB多肽序列的截短多肽：包括氨基末端在内的一连串残基，或者包括羧基末端和/或跨膜区在内的一连串残基，或者其中一串包括氨基端而另一串包括羧基端的两连串残基。另外还优选具有以下结构或功能特性的片段，例如包括α-螺旋和α-螺旋形成区域、β-折叠和B-折叠形成区域、转角和转角形成区域、卷曲和卷曲形成区域、亲水区、疏水区、α两亲性区域、β两亲性区域、柔性区、表面-形成区、底物结合区域以及高度抗原性标示区的片段。其他优选片段为生物活性片段。生物活性片段是指可以介导LpbB活性的片段，其中包括具有类似活性或改良活性或者消除了没用活性的片段。另外还包括对动物，特别是对人具有抗原性或免疫原性的片段。
片段应该保留LpbB多肽活性中的一种或多种。优选地，该多肽应该是从SEQ ID NO：2、4、6、8或10氨基酸序列的继续伸展(16个氨基酸以上)，具有全长LpbB多肽的抗原性和免疫原性，该多肽是从全长LpbB多肽衍生并经处理得到的。
已定义序列和片段的突变体也是本发明的部分。优选的突变体与标准物的区别在于保守的氨基酸取代-即，一个氨基酸被另一个具有相似特性的氨基酸取代。典型的这类取代是下列氨基酸间的取代：Ala、Val、Leu和Ile，Ser和Thr、酸性残基Asp和Glu；Asn和Gln；以及碱性残基Lys和Arg；或者芳香族残基Phe和Tyr。具体优选有几个、5～10个或1～2个氨基酸以任一组合被取代、缺失或添加。
最优选的突变体与标准物之间的区别在于：其他LpbB序列中结构上等效的位置(同源性对照显示)上的氨基酸取代(例如实施例9中所示的5个LpbB序列的同源性对比)。特别优选的突变体包含全长上与标准序列(例如SEQ ID NO：2、4、6、8或10)之间至少65％同源的氨基酸序列，以及还有更优选至少70％同一性，以及还有更优选至少80％同一性，以及甚至更优选与SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示序列具有至少90％同一性。另外，具有95～99％同一性的序列是高度优选的。例如，图9中如果来自BNCV的LpbB是标准序列，一种突变体将包括第300～308位残基被下列菌株LpbB序列中的等效位置上的氨基酸所取代：H44/76株(分别为第305～313位残基)、M990株(分别为第307～315位残基)、M981株(分别为第302～310位残基)或者881607株(分别为第303～311位残基)。因此，氨基酸序列NPDLAKSHA取代了STDVATNLA[ST(来自M981第302～303位残基)，D(来自BNCV第302位残基)，V(来自881607的第306位残基)、A(来自M990第311残基)、T(来自H44/76第310位残基)、NLA(来自M990的第313～315残基)]，得到的蛋白质可以归类为突变体和本发明的多肽。
这类取代还可以包括缺失，例如如果M981株LbpB的第357～366位残基缺失(这时来自BNCV的LbpB中没有任何等效氨基酸位置)，这种蛋白质可以成为本发明的突变体和多肽。
此外，脑膜炎奈瑟氏球菌和其他奈瑟氏菌株(例如淋病奈瑟氏球菌)的基因组彼此之间在基因组上的同源性很高。脑膜炎奈瑟氏球菌与粘膜炎莫拉氏菌(此前称为粘膜炎奈瑟氏球菌)的基因组也具有足够高的同源性，从而使得可以发生基因交换。如果奈瑟氏菌株与粘膜炎莫拉氏菌株之间的同源性百分比满足上述标准，那么它们的LbpB等效蛋白也是本发明所述的多肽。此外还有，如果在用BLAST程序(Altschul，S.F.et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Karlin，S.And Altschul，S.F.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68；Karlin，S.And Altschul，S.F.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-7)对蛋白全长进行测量时，它与标准序列其中之一(SEQ ID NO：2、4、6、8或10)具有至少65％序列相似性，那么这类等效蛋白也是本发明所述的多肽，以及还有更优选至少70％同一性，以及还有更优选至少80％同一性，以及甚至更优选与SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示序列具有至少90％同一性。另外，具有95～99％同一性的序列是高度优选的。这类蛋白应该结合人乳铁蛋白(根据定义)，而且还应该能与抗脑膜炎球菌菌株的LbpB的多克隆血清交叉反应。用来自SEQ ID NO：1-10所示的脑膜炎球菌多核苷酸和多肽的信息，可以容易地测定出这类突变体的确切氨基酸序列。
本发明的LbpB多肽可以用任一方式制备。这类多肽包括经分离的天然生成脂多肽，重组生产的多肽或脂多肽，合成制备的多肽，或这些方法组合制备的多肽。制备这类多肽的方法是本领域技术人员众所周知的。
本发明的多核苷酸
本发明的另一方面涉及LbpB多核苷酸。LbpB多核苷酸包括编码LbpB多肽及其片段的分离多核苷酸以及与其紧密相关的多核苷酸。更特定地，本发明的LbpB多核苷酸包括含有包括在SEQ ID NO：1、3、5、7或9中的核苷酸序列的多核苷酸以及具有SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示特定序列的多核苷酸，SEQ ID NO：1、3、5、7或9分别对应编码SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的LbpB多肽。LbpB多核苷酸进一步包括具有以下特征的多核苷酸：其中包含的核苷酸序列全长上与编码SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的LbpB多肽具有至少65％的同一性，以及其中包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中第100～2274位核苷酸核苷酸序列具有至少65％的同一性，以及其中包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3、5、7或9所示序列具有至少65％同一性。在这种情况下，更优选至少70％同一性的多核苷酸，特别优选至少80％同一性的多核苷酸，尤其优选至少90％同一性的多核苷酸。而且，至少95％同一性的多核苷酸是高度优选的以及至少98～99％同一性的多核苷酸是最优选的。LbpB多核苷酸还包括具有以下特征的核苷酸序列：与包含在SEQ ID NO：1、3、5、7或9中的核苷酸序列之间的同一性足以使得能在用于扩增或用作探针或标准物的情况下能发生杂交。本发明还提供了与这类LbpB多核苷酸互补的多核苷酸。
SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示的Lbp多核苷酸分别来脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV株、M981株、H44/76株、M990株以及881607株。
编码SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示多肽的核苷酸序列可以与包含在SEQ ID NO：1中第100～2274位中的多肽编码序列具有同一性，或者分别与包含在SEQ ID NO：3、5、7或9中的多肽编码序列具有同一性，或者由于遗传密码的丰余性(简并性)它可以是编码SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示多肽。
当本发明的多核苷酸用于重组制备LbpB多肽时，所述多核苷酸包括编码成熟多肽(从SEQ ID NO：2、4、6、8或10第18位残基直到C-末端)或其片段及其本身的序列；编码位于阅读框中的成熟多肽的序列，该序列带有编码下列序列其他编码序列：前导或分泌序列、前或原或前原蛋白序列、或者其他融合肽链部分(例如SEQ ID NO：2中的第1～18位残基、LbpB的天然信号序列)。例如，一种有助于融合蛋白纯化的标记序列也可以被编码。在本发明这方面的特定优选实施例中，标记序列是组氨酸6聚体肽链或HA标签，或者可以是谷胱甘肽-S-转移酶，上述组氨酸6聚体肽链可由pQE载体(Qiagen，Inc)提供，其描述见Gentz et al.，Proc Natl Acad Sci USA(1989)86：821-824。另外还优选把LbpB与其天然信号肽融合到一起(SEQ ID NO：2中的第1～18位残基)。所述多核苷酸还可以包括非编码的5’和3’端序列，例如转录但不翻译的序列，剪接及聚腺苷酸化信号，核糖体结合位点以及mRNA的稳定序列。
另外的优选实施方案是编码此前描述的LbpB多肽突变体的多核苷酸。最优选它们包括SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示LbpB多肽的氨基酸序列，其中有几个、10～25个、5～10个、1～5个、1～3个1～2个或1个氨基酸残基以任一组合被取代、缺失或添加，并且它们保留了至少一种LbpB多肽的生物学活性。
本发明进一步涉及能与本发明中上述序列杂交的多核苷酸。在这种情况下，本发明特别涉及能在严紧条件下与本发明上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本发明所述，术语“严紧条件”是指相互间具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选97～99％同一性的序列才能发生杂交的条件。
本发明的多核苷酸与包含在SEQ ID NO：1、3、5、7或9中的核苷酸序列或其片段相同或具有足够同一性，它们可以作为cDNA及基因组DNA的杂交探针，用于分离编码LbpB多肽的全长cDNAs和基因组克隆以及用于分离与LbpB基因具有高度相似性的其他基因(包括来自除脑膜炎奈瑟氏球菌之外菌种的编码同源基因和直向同源基因)的cDNA及基因组克隆。这类杂交技术对于本领域技术人员是已知的。典型地，这些核苷酸序列与标准序列具有80％同一性，优选90％同一性，更优选95％同一性。通常，这种探针包括至少15个核苷酸。优选地，这类探针有至少30个核苷酸以及可以有至少50个核苷酸。具体优选探针的长度范围为30～50个核苷酸。
在一个实施方案中，为了获得编码LbpB多肽的多核苷酸，其中包括来自除脑膜炎奈瑟氏球菌外菌种的同源基因或直向同源基因，进行以下步骤：在严紧条件下，用具有SEQ ID NO：1、3、5、7或9或其片段的核苷酸序列的标记探针对适当文库进行筛选；分离包含所述多核苷酸序列的全长cDNA及基因组克隆。因此另一方面，本发明的LbpB多核苷酸进一步包括核苷酸序列，该核苷酸序列能在严紧条件下与SEQ ID NO：1、3、5、7或9或其片段的核苷酸序列杂交。LbpB多肽还包括这样的多肽，其氨基酸序列由上述杂交条件下获得的核苷酸序列编码。这类杂交技术是本领域技术人员众所周知的。严紧条件如上所述，或者替代地，在含有下列物质的溶液中42℃过夜温育：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’溶液、10％硫酰葡聚糖以及20mg/ml经过变性的剪切后的鲑精DNA，然后在约65℃下用0.1×SSC洗涤滤膜。
本发明的多核苷酸和多肽可以作为研究试剂和材料，来发现动物与人类疾病的治疗和诊断方法。
载体、宿主细胞、表达
本发明还涉及含有多核苷酸或本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体通过遗传学手段构建的宿主细胞，本发明还涉及用重组技术生产本发明的多肽。也可以利用无细胞翻译系统，用来自本发明的DNA构建体的RNA生产这类蛋白。
对于重组生产，可以用遗传学手段构建宿主细胞，引入用于本发明多核苷酸的表达系统或其部分。将多核苷酸导入宿主细胞可以采用许多标准实验手册中描述的方法，例如，Davis et al.，BasicMethods In Molecular Biology(1986)以及Sambrook et al.，分子克隆：实验指南，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中的磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导转染、转染、微注射、阳离子脂类-介导的转染、电穿孔、转导、刮擦装载(scrape loading)、弹道(ballistic)转导或者感染等方法。
合适宿主的代表性实例包括脑膜炎球菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌以及枯草芽孢杆菌等菌体细胞，酵母细胞以及曲霉属细胞等真菌细胞，果蝇S2和粘虫Sf9细胞等昆虫细胞，CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293以及Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞，以及植物细胞。
绝大多数的表达系统都可以使用。这类系统包括，尤其是，染色体、附加型以及病毒衍生系统，例如从细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入基元、酵母染色体基元、病毒中衍生而来的载体，以及从其组合衍生而来的载体，例如从粘粒和噬菌粒等质粒及噬菌体遗传因子中衍生而来的载体，上述病毒包括杆状病毒、SV40等乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒以及反转录病毒等。所述表达系统可以包括调节并启动表达的调控区。通常，适用于在所用宿主中保持、增殖或表达多核苷酸制备多肽的任一系统或载体都可以使用。可以从多种熟知的常规技术中选用一种，将合适的核苷酸序列可以插入到表达系统中，例如下述文献中记载的技术，Sambrook et al.，分子克隆：实验指南，第2版(见上述)。
为了将翻译后的蛋白分泌到内质网的内腔、浆膜外周间隙或细胞外环境中，可以将合适的分泌信号引入到期望多肽中。这些信号对于所述多肽(SEQ ID NO：2、4、6、8或10的第1～18位残基)是内源性的或者它们也可以是异源信号。
为了表达出脂化的重组LbpB，优选上述内源性信号用基因构建体编码，而且优选宿主系统是细菌宿主。
如果表达的LbpB多肽用于筛选实验，那么通常，优选在细胞表面生产多肽。在这种情况下，可以在用于筛选实验之前收获细胞。如果LbpB多肽分泌到培养基中，那么就可以回收培养基从而回收并纯化出多肽；如果在细胞内制备，那么必须在回收多肽前首先裂解细胞。
可以采用熟知的方法，将LbpB多肽从重组细胞培养物中回收并纯化出来，例如硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水层析、亲和层析、羟磷灰石层析以及凝集素层析。最优选地，使用高效液相色谱进行纯化。当在分离和/或纯化的过程中多肽发生变性时，可以采用熟知的重折叠蛋白技术来重新生成活性构象。
诊断分析
本发明还涉及LbpB的用途、抗LbpB抗体以及展示抗用作诊断试剂的LbpB的抗体的噬菌体。LbpB的检测将会提供一种诊断方法，该方法尤其能够增加或定义奈瑟氏球菌疾病的诊断。
诊断材料可以从目的细胞中获得，例如血、尿、唾液、组织活检。
因此另一方面，本发明涉及用于疾病或疑是疾病，具体为奈瑟氏球菌疾病的诊断试剂盒，该试剂盒中包括：
(a)LbpB多核苷酸，优选SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示的核苷酸序列或其片段；
(b)与(a)中序列互补的序列；
(c)LbpB多肽，优选SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的多肽序列或其片段；或者
(d)抗LbpB多肽抗体，优选抗SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示多肽(以及更优选SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示多肽第19位残基至C-末端的区间)的抗体。
(e)展示抗LbpB多肽抗体的噬菌体，优选抗SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示多肽(以及更优选SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示多肽第19位残基至C-末端的区间)的抗体。
应该理解的是在任一种这样的试剂盒中，(a)、(b)、(c)、(d)或(e)可以包括一种基本成分。
抗体
本发明的多肽或其片段或其类似物，或者表达它们的细胞都可以用作免疫原，制备对于LbpB多肽具有免疫特异性的抗体。术语“免疫特异性”是指所述抗体与本发明多肽之间的亲和力基本上要比与现有技术中其他相关多肽之间的亲和力大得多。
可以通过常规方法用多肽或带有表位的片段、类似物或细胞对动物，优选非人的动物进行免疫，获得抗LbpB多肽的抗体。对于制备单克隆抗体，任意一种能提供连续细胞系培养生产的抗体的技术都可以使用。具体实例包括杂交瘤技术(Kohler，G.And Milstein，C.，Nature(1975)256：495-497)、trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，Immunology Today(1983)4：72)以及EBV杂交瘤技术(Cole et al.，单克隆抗体和癌症治疗，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.1985)。
也可以采用生产单链抗体的技术(US4946778)来制备抗本发明多肽的抗体。另外，转基因小鼠或包括其他哺乳动物的其他有机体可以用来表达人源抗体。
上述抗体可以用于分离或鉴定表达有多肽的克隆，或者用于亲和层析纯化抗体。
抗LbpB多肽的抗体尤其还可以用于治疗奈瑟氏球菌疾病(例如脑膜炎)。它们还可以用于诊断疾病。
疫苗
本发明另一方面涉及诱导哺乳动物(优选人)免疫应答的方法，该方法包括用LbpB多肽或带有表位的片段、类似物、外膜囊泡或细胞(减毒或其他)免疫动物，足以产生能够保护所述动物不患奈瑟氏球菌病的抗体和/或T细胞免疫应答。本发明还有另一方面涉及诱导哺乳动物免疫应答的方法，该方法包括通过指导LbpB多核苷酸表达的载体把LbpB多肽释放到体内，从而诱导免疫应答产生保护所述动物的抗体。
本发明另一方面涉及免疫组合物或疫苗制剂，当导入哺乳动物宿主时，所述免疫组合物或疫苗制剂能在该哺乳动物中诱导出针对LbpB多肽的免疫应答，其中所述的组合物包括LbpB基因、或LbpB多肽或带有表位的片段、类似物、外膜囊泡或细胞(减毒或其他)。所述疫苗制剂可以进一步包括一种合适载体。LbpB疫苗组合物优选口服或非消化道(包括皮下、肌内、静脉内、皮内等注射)免疫。适于非消化道免疫的制剂包括含水及不含水灭菌注射液，该注射液可以包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及能使制剂与受体血液等张力的溶质；以及含水及不含水灭菌悬液，该悬液可以包括助悬剂或增稠剂。所述制剂可以采用单位剂量或多剂量包装，例如密封安瓿和管瓶，可以冻干形式保存，只需要在使用前添加灭菌脂类载体。所述疫苗制剂也可以包括用于增强制剂免疫原性的佐剂系统，例如水包油系统及其他本领域已知系统。剂量取决于疫苗的特定活性，而且可以用常规实验容易地测定出来。
还有另一方面涉及包括本发明多肽的免疫原性/疫苗制剂。这类技术为本领域已知，参见例如Wolff et al.，Science，(1990)247：1465-8。
筛选实验
本发明的LbpB多肽可以用于筛选能拮抗(拮抗剂，或称为抑制剂)本发明LbpB多肽的化合物的方法中。因此，本发明的多肽还可以包括用于从细胞、无细胞制剂、化学文库以及天然产物混合物中鉴定拮抗剂。视情况而定，这些拮抗剂可以是本发明多肽的天然或修饰后的底物、配体、受体、酶等；或者可以本发明多肽的结构或功能模拟物。参见Coligan et al.，Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5(1991)。
LbpB多肽具有许多种生物活性，包括多种病原性。因此，希望发现能够抑制LbpB多肽功能的化合物和药物。通常，可以将拮抗剂用于奈瑟氏球菌病等病症的多种治疗和预防用途。
通常，这类筛选方法可以包括使用能表达LbpB多肽或本发明LbpB多肽对应物的合适细胞。这类细胞包括来自哺乳动物、酵母、果蝇或大肠杆菌的细胞。然后，将表达有LbpB多肽(或含有表达多肽的细胞膜)或LbpB多肽对应物的细胞与一种测试化合物接触，观察结合情况或对功能性应答的抑制。将上述细胞与侯选化合物接触的能力同未表达LbpB活性的同一种细胞进行比较。
该实验可以简单地测试侯选化合物的结合能力，其中与表达LbpB多肽细胞的结合是利用与侯选化合物直接或间接相连相连的标记物来检测的，或者用涉及与标记竞争物竞争的实验来检测。
另外，简单地说所述实验包括以下步骤：将侯选化合物与含有LbpB多肽的溶液混合形成混合物，测量混合物中的LbpB活性，以及将混合物的LbpB活性与标准物进行比较。
LbpB cDNA、蛋白以及抗该蛋白的抗体也可以用于配套下述实验，即用于检测加入的化合物对细胞中LbpB mRNA及蛋白的产量的影响的实验。例如，可以设计ELISA实验，用单克隆或多克隆抗体通过本领域已知的标准方法测量LbpB蛋白的分泌水平或细胞结合水平，用该实验可以发现能够抑制稳定操纵的细胞或组织中LbpB产量的药物(也可以称为拮抗剂)。
LbpB多肽强效拮抗剂的实例包括抗体，或者有时，与LbpB多肽的配体或底物紧密相关的寡核苷酸或蛋白，例如配体配体或底物的片段；或者能于本发明多肽结合但不激发应答的小分子，通过结合可以阻断所述多肽的活性。
因此另一方面，本发明涉及用于鉴定针对LbpB的拮抗剂、配体或底物，该试剂盒包括：
(a)LbpB多肽，优选SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的多肽；
(b)表达LbpB多肽的重组细胞，优选SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的多肽；
(c)表达LbpB多肽的细胞膜，优选SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的多肽；或者
(d)抗LbpB多肽的抗体，优选SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示的多肽。
应该理解的是，在任一这样的试剂盒中(a)、(b)、(c)、(d)或(e)可以包括一种基本成分。
制剂及给药
多肽，例如LbpB多肽的可溶形式，以及拮抗肽链或小分子可以与一种合适的药用载体结合配制。这类制剂包括治疗有效量的多肽或化合物，以及药用可接受载体或赋形剂。所述载体包括但不限于，盐、缓冲性能的盐、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其任一组合。制剂应该适合于给药方式，并且为本领域技术人员熟知。本发明进一步涉及其中包括1个或多个容器的药物包装和试剂盒，所述容器中盛满了上述的本发明组合物中的一种或多种成分。
本发明的多肽或其他化合物可以单独使用或与治疗用化合物等其他化合物配合使用。
上述药用组合物的优选系统给药方式包括注射，典型的为静脉内注射。也可以使用其他的注射途径，例如皮下注射、肌内注射或腹膜内注射。系统给药的替代方式包括用胆汁盐或梭链孢酸或其他去污剂等渗透剂经黏膜或经皮给药。此外，如果配制成肠溶或胶囊制剂，也可以采用口服给药。这些化合物的给药也可以采用以油膏、糊状、凝胶等形式局部和/或定位给药。
所需剂量范围视下列因素的选择而定：肽、给药途径、制剂的实质、患者的病情以及主治医师的判断。然而，合适的剂量范围为0.1～100μg/kg(患者体重)。然而，还需要根据所获得化合物的不同以及各种给药途径效率的不同，在必需的剂量范围内做大幅度的调整。例如，口服所需的剂量就应该比静脉注射要高。也可以根据经验调整剂量水平使之达到最佳，这也是本领域技术人员众所周知的。
实施例
除非有详细的描述，下述实施例按照标准的实验方法进行，这些标准方法对熟悉本领域的人来说是众所周知或常规的方法。实施例是用以说明而非限制本发明。
实施例1：菌株和培养条件
所使用的菌株列于表1。脑膜炎球菌培养在含Vitox(Oxiod)的GC琼脂平板(Difco)上，在含5％CO2的37℃潮湿环境中培养过夜。铁调控蛋白的优化表达是通过加入5μg/ml的铁螯合剂乙二胺二氧羟基苯乙酸(EDDA，Sigma)来实现。对制备用于SDS-PAGE、免疫印迹以及分离染色体DNA的样品，细胞培养条件如上所述(Pettersson etal.，1993)。
用于扩增λgtl1噬菌体的E.coli菌株Y1090(Young and Davis，1983)培养在含氨苄青霉素(100μl/ml)、0.2％麦芽糖和10mM MgCl2的Luria-Bertoldi(LB)培养基中。用于克隆的菌株DH5α培养在LB培养基中，当用于重组子筛选时，补加100μl/ml氨苄青霉素、25μg/ml卡那霉素或100μg/ml红霉素。在转化pEMBL19衍生菌后，将细菌铺在含合适抗生素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(40μg/ml)和0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，用于筛选含插入子的质粒。用于制备单链DNA的PC2494菌株培养在极限培养基板上，含有5μg/ml硫胺和0.2％葡萄糖。
实施例2：
2A：肽的鼠抗血清的制备
肽(图3)的合成使用自动肽合成仪并参照所述方法(van der Leyet al.，1991)偶连到破伤风类毒素上。BALB/c小鼠用50μg肽和20μg QuilA佐剂免疫。加强两次。在第一次注射后54天收集血清。
2B：lhpB基因产物的鉴定
为了检测可能的lbpB基因是否编码一蛋白，根据部分开放阅读框架推断的氨基酸序列合成肽(如图3所示的Al-E1)制备抗血清。用生长在铁限制条件下的BNCV菌株的全细胞做Western来检测抗血清。抗肽B1的血清没表现出任何反应(数据未显示)。抗其它肽的抗血清则同一大小为大约95KDa(图1)的条带有反应。因为lbpB突变体(其构建如下所述)缺乏该条带(图1，泳道3和7)，可以得出lbpB是在野生型菌株表达、编码一表观分子量(Mr)为95000的蛋白的结论。抗肽D1和E1的一些血清还呈现出对一分子量为60000(图1)的条带有反应。这两种肽包含VVFGAK序列，TbpB也含该序列(图3)。因此，68K带可能是TbpB。为了检验这种可能性，用Western印迹对TbpB的突变体N91及其父系株B16B6进行了检测。血清19-1(抗肽E1)同B16B6菌株的95K和68K两条带均有反应，但仅同N91菌株的95K带有反应。该结果表明68K带实际上就是TbpB(结果未显示)。
实施例3：SDS-PAGE和免疫印迹
全细胞蛋白的SDS-PAGE参照以前所描述的方法进行(Pettersson et al.，1990，1993)。对于防止LbpB变性的实验，则需要进行以下改动。样品缓冲液不能包含β-巯基乙醇。在电泳前，含外膜蛋白复合物的样品缓冲液要在冰上或37℃孵育10分钟，而不是在95℃加热。在乳铁蛋白结合实验中，聚丙烯酰胺胶是由含0.05％(w/v)SDS的5％(w/v)浓缩胶和8％(w/v)分离胶组成。电极缓冲液仅含0.05％(w/v)SDS，而不是0.1％(w/v)SDS。在100V恒压及4℃条件下电泳2小时。标准样品缓冲液则使用含2％SDS。
用以检测LbpB折叠形式的外膜蛋白电泳用PhastSystem(Pharmacia)电泳系统，按照生产厂家的使用说明进行，使用7.5％(w/v)的均一聚丙烯酰胺和SDS缓冲液。
免疫印迹参照以前的描述进行(Pettersson et al.，1990)。在使用PhastSystem胶时，转印缓冲液含0.05％(w/v)SDS，过氧化物酶活性的检测使用ECL系统，按照生产厂家(Amersham)的说明进行。鼠的抗血清以1∶500稀释使用。LbpA特异的单克隆抗体mn98K1和mn98K2(Pettersson et al，1993)分别做1∶2000稀释后混合使用。
实施例4：
4A：克隆和测序策略
来自BNCV菌株的λgt11基因文库最初由E.C.Gotschlich(洛克菲勒大学，纽约，美国)提供。文库在E.coli菌株Y1090中扩增，然后用DNA探针BE1和AP6(图2)筛选。BE1的制备是用质粒pAM1(Pettersson et al.，1993)的BstEII-EcoRI的355bp酶解片段。AP6的制备是用质粒pAM6的EcoRI-EcoRV的417bp酶解片段。探针标记、噬斑转印和检测参照所述方法(Pettersson et al.，1993)来进行，使用地高辛DNA标记和检测试剂盒(BoheringerMannheim)。分离λDNA(Sambrook et al.，1989)，将插入片段亚克隆入嗜菌粒pEMBL 19。使用Jetstar微型柱(Genomed)按照使用说明抽提质粒DNA。单链DNA用辅助噬菌体VCSM13(Stratagene)进行扩增。
染色体DNA的分离参照文献(Ausubel et al.，1989)。DNA用AccI和DraI消化，在1％琼脂糖凝胶上电泳分离。Southern转印按文献(Pettersson et al.，1993)进行。探针ES1(图2)是pAM13的EcoRI-SalI的320bp酶解片段，标记方法同上。探针同AccI/DraI酶解的1.5kb的转印片段有反应。从胶上分离该片段并连入pEMBL19。连接混合物用M13通用引物(Pharmacia)和LB11引物(表2)进行PCR扩增。PCR扩增使用一种Taq聚合酶的衍生物(Eurogentec)Goldstar聚合酶，根据使用说明进行。PCR扩增的1.3kb片段用琼脂糖凝胶进行纯化。
测序用deaza G/A T7测序混合物(Pharmacia)手工进行，或使用ABI Prism 310 Genetic Analyzer(Perkin Elmer)进行自动测序。对于自动测序，用Dye Terminator Cycle测序试剂盒(PerkinElmer)进行标记。内部引物(由Pharmacia或Gibco BRL合成)和M13通用引物及反向引物(Pharmacia)用于单链DNA、双链质粒DNA和PCR产物的测序。
相同的测序策略用于来自脑膜炎奈瑟氏的H44/76和M981菌株lbpB基因的测序。
4B：lbpB基因的克隆和测序
为了克隆lbpB基因的缺失部分，用DNA探针对BNCV的λgt11基因文库进行了筛选。获得了两个不同的克隆。将插入片段亚克隆入pEMBL19，获得了质粒pAM6和pAM13(图2)，进行测序。用这种方法没有获得lbpB基因的启动子和起始序列。另外几种试图克隆基因5’端的方法也没成功，说明其表达对E.coli有毒性作用。为了获得其余的序列，制备了用AccI和DraI消化的染色体DNA富集库。将大小大约为1.5kb的片段连接入pEMBL19，用PCR对连接混合物直接进行扩增，引物分别是M13和基于lbpB已知序列的引物(LB11，见图2)。得到的PCR产物(图2)直接用于测序。该策略避免了克隆基因对E.coli的可能毒性。
对lbpB的不同片段进行测序发现一2175bp的开放阅读框架。它编码一分子量为79.4KDa的蛋白，含725个氨基酸残基。对N末端序列的分析发现一被信号肽酶II(yon Heijne，1989)识别的信号序列特征。这类信号序列出现在脂蛋白的前体，成熟蛋白的N末端半胱氨酸残基被乙酰化。在TbpB蛋白中也发现了类似的信号序列，该蛋白已被证明是脂修饰的(Anderson et al.，1994)。估算的成熟LbpB蛋白分子量为77.5KDa，明显低于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)(图1)所观察到的表观分子量95KDa。对Swiss Prot数据库同其它蛋白的相似性搜索发现同Neisseriae和大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的TbpB蛋白同源。同脑膜炎奈瑟氏球菌的B16B6菌株(Legrain et al.，1993)(图3)的TbpB具有最高的同源性，为33％(使用PALIGN程序)。在TbpB蛋白内部发现重复序列，因此提出该分子有一双叶(bi-lobed)结构，该结构是由内部复制进化而来(Fuller et al.，1996，Renauld-Mongenie et al.，1996)。当将成熟LbpB蛋白的氨基端的354个氨基酸同C端的353个氨基酸相比较时，发现30％的一致性和10％的相似性(结果未显示)。该结果表明LbpB也存在一bi-lobed结构。蛋白等电点为4.5。在序列中还可发现两个富含酸性残基的节段(图3)。因为TbpB缺乏这些节段，它们可能在结合乳铁蛋白方面很重要，乳铁蛋白同转铁蛋白相反，带有正电荷。
在启动子区域，有一典型的Shine-Dalgarno序列。此外，也发现了可能的-10和-35框(图4)。一可能的Fur结合位点序列同-10框重叠。Fur连同Fe2+通过和启动子区域(Bagg and Neilands，1987)的19bp序列结合，来作为铁调控基因的阻遏子。Fur框的一致序列为GATAATGATAATCATTATC，在lbpB启动子中，这19bp序列中的16bp是保守的。在启动子的更上游序列中发现一131bp的直接重复(结果未显示)。该序列在此位置至少出现两次。相同的直接重复序列在lbpA基因的下游也有发现(Prinz et al.，未发表)。FASTA同源性检索显示该重复序列同很多奈瑟氏菌属序列同源，大部分在开放阅读框架的侧翼(结果未显示)。
脑膜炎奈瑟氏球菌的BNCV菌株和M981菌株LbpB蛋白的同源性为72.7％，而BNCV和H44/7的同源性仅为78.5％。
实施例5：
5A：同基因突变体的构建
质粒pAM23和pAM6分别用于lbpA和lbpB的插入失活。用ClaI和HindIII从pER2(Jennings et al.，1993)上切下红霉素抗性(Ermr)匣子。用T4 DNA聚合酶处理，连接到EcoRV消化的pAM23，得到质粒pAM23E。用HincII从pUC4K(Pharmacia)上切下卡那霉素抗性(Kmr)匣子。质粒pAM6用BglII线性化，用T4 DNA聚合酶处理。将卡那霉素抗性(Kmr)匣子连接到该位点，得到质粒pAM6K。由寡核苷酸nus1和nus2组成的接头克隆入pAM6K的KpnI位点，得到质粒pAM6K-nus，其中nus1和nus2含奈瑟氏菌属摄入序列(GCCGTCTGAA)和同KpnI匹配的单链末端。抗生素抗性基因的插入方向同克隆lbpA和lbpB基因的质粒pAM23E和pAM6K(-nus)中的方向一致。质粒pAM23E用KpnI线性化后，转化H44/76菌株，方法同以前所描述(Vander Ley and Poolman，1992)。在含5μg/ml红霉素的GC平板上筛选转化子，其中一个转化子CE1449中正确的基因置换被PCR和Southern杂交所证实，PCR所用引物为FW5和DVAS2(表2)，Southern杂交探针为AP23(图2，pAM23中SspI和HindIII的184bp酶解片段)。对于Southern杂交，染色体DNA用ClaI和SalI消化。BCNV的同基因突变体用电穿孔(Genco et al.，1991)方法制备，因为该菌株似乎不可转化。lbpA突变菌株CE1449的染色体DNA用于制备lbpA突变体，转化子在含红霉素GC平板上的筛选和鉴定如上所述。质粒pAM6K-nus用于制备lbpB突变体。转化子筛选在含100μg/ml卡那霉素的GC平板上进行。正确的置换用PCR和Southern方法来证实，PCR引物为SDA1和PR1(表2)，Southern杂交的探针为AP23。
5B：同基因突变体的构建
为了证实94KDa蛋白及单个乳铁蛋白结合蛋白在乳铁蛋白结合和利用中的功能，构建了一系列缺乏lbpA或lbpB的BNCV的同基因衍生物突变，按实施例5A所述方法进行构建。正确的基因置换用PCR和Southern杂交来证实。lbpA和lbpB在突变体CE1452不表达LbpA(图5A，泳道4)，而lbpB突变体CE1454不表达94KDa(图5B，泳道6)。该结果证实了lbpB基因在野生型菌株中表达，编码一分子量为94000的蛋白，显著高于估算的分子量77.5KDa。此外，图4的结果表明lbpB基因的失活对lbpA基因的表达没有极性影响。因为插入到lbpB基因中的卡那霉素抗性匣子不含转录终止子，所以该结果是可以预期的。以前描述的lbpA自发突变体CE1452(Pettersson et al.，1994b)似乎也不表达LbpB(图5B，泳道8)。既然这两个突变体和BNCV为菌株M986的衍生物，它们的遗传背景应该同其它突变体一致。LbpA和LbpB的表达似乎是铁调控的(图5)。即使细胞生长在无铁螯合剂存在的条件下，菌株CE1454中也有很弱的LbpA表达(图5A，泳道5)。该表达可能是从lbpB中卡那霉素抗性基因的启动子开始转录。但是，在同样条件之下，当有铁螯合剂存在情况下，LbpA的表达可增高几倍(图5A，泳道6)。
实施例6
6A：乳铁蛋白结合实验
乳铁蛋白同全细胞的结合用ELISA方法来评估。来自泡盛曲霉的重组人乳铁蛋白由得克萨斯休斯顿的Agennix公司惠赠。乳铁蛋白按照文献方法(Van Berkel et al.，1995)用铁饱和，做以下改动。用FeCl3代替Fe(NO3)3，用5mM pH7.7的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液透析4小时。将平板中菌落悬浮于pH7.5的Tris缓冲盐溶液(TBS)中，56℃热灭活30分钟。将620nm处OD值为0.05的样品100μl加入微量滴定板孔中，37℃干燥过夜。实验在37℃进行。用100μl封闭液封闭1小时防止非特异结合，该封闭液为含0.5％Protifa(Nutricia)和0.1％土温20的TBS溶液。封闭后，每孔封闭液中加不同浓度的乳铁蛋白，其浓度变化范围为3.125-20ng/ml。孵育1小时后，用自来水洗3次，加入偶连有过氧化物酶的抗人乳铁蛋白的兔多克隆血清(ICN，Biomedicals)。抗体在封闭液中稀释5000倍使用。孵育1小时后，用自来水洗3次。检测过氧化物酶量(Abdillahiand Poolman，1987).
乳铁蛋白的点结合实验按如下方法进行。将膜在含0.5％Protifa(Nutricia)和0.1％土温20的pH5.7的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中封闭非特异结合，孵育2小时。然后同含1.2μg/ml过氧化物酶偶连的人乳铁蛋白(Pettersson et al.，1993)的封闭液孵育1小时，用封闭液洗3次。过氧化物酶活性检测用ECL系统按照使用说明进行(Amersham)。
6B：平板饲喂(plate feeding)分析
脑膜炎球菌在含Vitox的TSB中培养过夜，如实施例1所述。将300μl过夜培养物加入3ml顶层琼脂(1％GC琼脂和20μg/ml EDDA，冷至42℃)立即在含Vitox和20μg/ml EDDA的GC琼脂平板上铺板。将人重组乳铁蛋白(用11％铁饱和，或按上述方法饱和)滴在平板上。乳铁蛋白的浓度分别为10和20μg/ml，平板培养过夜。
6C：乳铁蛋白同折叠LbpB的结合斑点分析
为了检测乳铁蛋白能否同LbpB斑点结合，对LbpB在非变性条件下进行SDS-PAGE(参见实施例6A)。当电泳前样品在样品缓冲液中不加热时，可以检测到LbpB的快速迁移形式，该形式可能是天然折叠形式的蛋白(图6A)。该形式的分子量大约为80KDa。在加热10分钟后，LbpB完全变性，迁移在94KDa位置(图6A，泳道2)。令人感兴趣的是，仅有抗肽A1(图2)的血清与蛋白迁移形式有反应。该肽含有两段富含阴性电荷氨基酸的区域，可能参与乳铁蛋白的结合。抗体同折叠蛋白的结合说明该部分是暴露的，而其余肽则掩盖在折叠结构LbpB的内部。
随后对乳铁蛋白同折叠LbpB蛋白的结合进行了评估。将BNCV菌株的外膜蛋白点在硝酸纤维素膜，同过氧化物酶偶连的人乳铁蛋白孵育。乳铁蛋白结合的特异性似乎对孵育条件非常敏感，最重要的是pH。在优化条件下，乳铁蛋白特异地同分子量80KDa(图6B，泳道1和2)的蛋白结合。而在SDS-PAGE电泳前样品经95℃处理10分钟的样品则观察不到结合(图6B，泳道3)。在LbpB突变体CE1454样品中没检测到。因此可以断定LbpB的快速迁移形式是蛋白得折叠形式，可以结合乳铁蛋白。
6D：乳铁蛋白对全细胞的结合和利用
乳铁蛋白同全细胞的结合用ELISA方法进行。ELISA板用BNCV的同基因突变体菌株全细胞包被，将不同浓度的乳铁蛋白加入孔中。乳铁蛋白同细胞的结合用偶连过氧化物酶的抗人乳铁蛋白的抗体来检测(图7)。LbpB突变体对乳铁蛋白的结合力有轻微的减弱，LbpA突变体结合的有效性要低于LbpB突变体，而双突变体则无任何结合活性。
用乳铁蛋白作为唯一铁源的能力用平板饲喂实验进行。脑膜炎球菌在铁限制条件下培养，将人重组乳铁蛋白滴在平板上，监测生长刺激作用。LbpB突变体可在乳铁蛋白上生长，而LbpA突变体则不能(图8)。乳铁蛋白用11％铁饱和，相同实验在有铁乳铁蛋白上进行，结果基本一致(结果未显示)。这些结果表明，LbpA蛋白对经乳铁蛋白的铁吸收是必需的，而LbpB则不是必需的。
实施例7
为了检测脑膜炎球菌LbpB蛋白的变异性，对来自4个另外的lbpB基因进行了测序。这4个菌株分别为H44/76、M990、M981和881607(见表1)。
7A：另4个脑膜炎球菌菌株lbpB的测序-方法
细菌培养同实施例1。染色体DNA从培养在平板上的细菌抽提。在过夜培养后，从板上刮下细菌，悬浮在1.5ml 10mM Tris-HCl，10mMEDTA，pH8.0的溶液中，加入10μl溶菌酶(10mg/ml)。悬浮物在室温孵育15分钟，然后加入1.5ml 2％Triton X-100，150mMTris-HCl，100mM EDTA，pH8.0。孵育15分钟后，加入10μl蛋白酶K(10mg/ml)。室温孵育30分钟。混合物用酚、氯仿和异戊醇(混合比例24∶24∶1)抽提一次，然后用水饱和氯仿再抽一次。染色体DNA用乙醇沉淀。
染色体DNA用于PCR扩增lbpB基因。引物LB20和REV2(表3)用于H44/76、M990和881607菌株的扩增。引物LB20和LB23用于M981菌株的扩增。引物的序列基于BNCV中lbpB的序列。LB20结合在lbpB基因的上游，LB23和REV2在lbpA的基因开始。LB23在5’端有一额外的BamHI位点。Taq聚合酶的一种衍生物Goldstar聚合酶(Eurogentec)用于PCR扩增，按照使用说明进行。退火温度均为50℃，共30个循环。用β-agarase(New England Biolabs)从琼脂糖凝胶上纯化PCR产物。
DNA序列测定根据lbpB基因设计引物进行基因步进测序，引物由Gibco BRL合成，测序用ABI Prism 310 Genetic Analyzer(PerkinElmer)自动测序。标记用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin Elmer)。
软件包PC Gene 6.70(IntelliGenetic)中的TRANSL，PALIGN和CLUSTAL程序分别用于将核苷酸序列翻译成蛋白序列、成对和多对序列对比。
7B：另4个脑膜炎球菌菌株lbpB的测序-结果
4个菌株lbpB基因的核苷酸序列见SEQ ID NO：3、5、7和9。核苷酸序列翻译成蛋白质序列以及5个已知LbpB蛋白的序列对比见表9。在氨基酸水平，LbpB蛋白在不同菌株的一致性为70-80％，一致性对比总结于表4。
实施例8
LbpB在脑膜炎奈瑟氏球菌中表达水平非常低，当用外膜蛋白进行SDS-PAGE时检测不到蛋白。为了对LbpB蛋白进行免疫学和结构/功能进行研究，构建了在E.coli中表达的构建体。为了有利于重组蛋白的纯化，构建体编码的蛋白含有一His标签，通过替换原始信号和成熟蛋白的头两个氨基酸来防止N末端的脂修饰。
8A：重组LbpB的表达-菌株和培养条件
脑膜炎球菌菌株BNCV(-：2a：p1.2)在含Vitox(Oxoid)的GC琼脂板(Difco)上培养过夜，培养条件为含5％ CO2的37℃潮湿环境。编码重组蛋白的构建体在E.coli菌株CE1448(C.Jansen惠赠)中表达，该菌株为CE1224(Tommassen et al.，1983)的htrA ompT衍生菌株。菌株于37℃在Hepes缓冲合成培养基(Tommassen andLugtenberg.，1980)上培养，该培养基补加有因营养缺陷突变所需的营养和1.32mM KH2PO4(磷酸盐充足环境)。过夜培养后，培养物用相同的无KH2PO4(磷酸盐缺乏环境)培养基稀释13.5倍，37℃培养6小时。
8B：重组LbpB的表达-在E.coli中的克隆
染色体DNA从培养在平板上的脑膜炎细菌抽提。在过夜培养后，从板上刮下细菌，悬浮在1.5ml 10mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0溶液中，加入10μl溶菌酶(10mg/ml)。悬浮物在室温孵育15分钟，然后加入1.5ml 2％Triton X-100，150mMTris-HCl，100mM EDTA，pH8.0。孵育15分钟后，加入10μl蛋白酶K(10mg/ml)。室温孵育30分钟。混合物用酚、氯仿和异戊醇(混合比例24∶24∶1)抽提一次，然后用水饱和氯仿再抽一次。染色体DNA用乙醇沉淀。
染色体DNA用作模板扩增相当于成熟LbpB的部分lbpB基因，PCR引物为LB22和LB23(表5)。LB22引物位点相当于LbpB氨基端部分，引物末端加一PstI位点。LB23引物在lbpB的下游，在lbpA的起始，并引入一BamHI位点。有校正功能的聚合酶Pwo(BoehringerMannheim)用于扩增，按照使用说明进行。退火温度60℃，共30个循环。用β-agarase(New England Biolabs)根据使用说明从胶上分离PCR产物。PCR产物用PstI和BamHI消化后连入经同样酶消化的pJP29(图10A)。得到的pAM31丢失了BamHI和BglII位点。构建体中LbpB蛋白从phoE启动子表达，并用PhoE信号序列取代了原来的信号序列。此外，N端的起始两个氨基酸分别由Cys和Ile换成了Ala和Val。为了有利纯化，在信号序列和成熟蛋白之间插入了一His标签。pAM31用PstI消化后，同一由寡聚核苷酸VGO12a和VGO13a(表5)组成的接头连接，得到质粒pAM32(图10A)。PstI位点在连接后丢失。接头编码6个His残疾和因子Xa的切割位点。
8C：重组LbpB蛋白的纯化
重组LbpB在含pAM32的CE1448菌株中生产。在磷酸盐限制的条件下，在5升经6小时培养物中收集细菌。用500ml生理盐水洗涤细胞两次，悬浮在150ml 10mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH8.0，溶液中，悬浮物在-20℃冷冻过夜，融解细胞并加入三种蛋白酶抑制剂的混合物(CompleteTM，Boehringer Mannheim)。用一French press以8000psi的压力挤压细胞两次。未破裂的细胞在Sorvall GSA转子中5000rpm离心20分钟去处。上清在Beckman Ti60转子40000rpm离心90分钟，细胞膜溶解在5mM pH7.6的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中。
细胞层用2％正辛基-寡-氧乙烯(Octyl-POE)在37℃抽提两次。第一次1小时，第二次3小时。在抽提中及抽提后，不溶性蛋白通过在Beckman TLA 100.2转子在100000rpm离心1小时来沉淀。含有LbpB蛋白的上清混合加入Ni-NTA琼脂糖。蛋白的纯化在天然条件下成批处理，按生产使用说明进行(Qiagen)。在结合和洗涤中，咪唑和NaCL的浓度分别为200和300mM。总共2ml的Ni-NTA琼脂糖被使用，共分成10管。洗脱分别用100、200和250mM咪唑。洗脱后，蛋白用Spectra/Por2透析袋(Spectrum)对2.5l磷酸盐缓冲液透析。用Fugisept Maxi Centrifugal Concentrator(Intersept)富集大于10KDa的蛋白。在Sorvall GSA转子5000rpm离心，至总体积为1-1.5ml。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)按Lugtenberg等(1975)所述方法进行，略作改动。聚丙烯酰胺胶是由5％(w/v)浓缩胶和8％(w/v)分离胶组成，无SDS。为了防止LbpB变性，样品缓冲液(Lugtenberg等，1975)不能包含β-巯基乙醇，且电泳前样品一直保存在0℃。为了变性LbpB，样品缓冲液中加β-巯基乙醇。样品煮沸5分钟。在20mA恒流及4℃条件下电泳。用考马斯亮兰染色。
8D：重组LbpB的表达和纯化-结果
脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV菌株的重组LbpB表达在E.coli菌株CE1448。构建体pAM32编码-重组蛋白，该蛋白由PhoE信号序列、His标签和成熟的LbpB蛋白组成(图10A)。蛋白表达由phoE启动子在磷酸盐限制条件下启动。LbpB的II型信号序列由I型信号序列代替，带有因子Xa切割位点的His标签位于信号序列和成熟LbpB蛋白之间。此外，成熟LbpB的头两个氨基酸Cys和Ile改变成Ala和Vla(图10B)。因此，重组蛋白的N端Cys不能被脂化。重组蛋白与脂膜形成一体，无可溶性蛋白部分(结果未显示)。因此，必需用去污剂从膜上抽提蛋白。用Octyl-POE可以从膜上溶解50％的总量重组蛋白。此外，当抽提蛋白没经在样品缓冲液中煮沸变性时，它在PAGE中的迁移比变性蛋白快(结果未显示)。说明蛋白是正确折叠的。抽提后，具有His标签的蛋白用Ni层析柱纯化。大部分的蛋白可在100和200mM的咪唑洗脱。无论如何，在透析前要合并所有含重组蛋白的部分。蛋白的纯度用考马斯亮兰染胶(图11)，大部分以折叠形式出现，其在PAGE中迁移比在变性胶中快。折叠形式的LbpB，而不是变性形式，在图6显示同乳铁蛋白有结合斑点。
实施例9
为了研究LbpB蛋白对人的免疫原性，用免疫印迹检测了识别康复病人血清中BNCV株LbpB蛋白的抗体。
9A：LbpB对人的免疫原性-方法
10个病人的康复血清来自SmithKline Beecham，BiologicalsSA，Belgium，7个从荷兰国立卫生和环境研究所获得(表6)。每个血清均被不同血清型和亚型的菌株感染过。
重组LbpB的分离按照实施例8所述程序进行。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)按Lugtenberg等(1975)所述方法进行，略作改动。聚丙烯酰胺胶是由5％(w/v)浓缩胶和8％(w/v)分离胶组成，无SDS。为了防止LbpB变性，样品缓冲液(Lugtenberg等，1975)不能包含β-巯基乙醇，且电泳前样品一直保存在0℃。为了变性LbpB，样品缓冲液中加β-巯基乙醇。样品煮沸5分钟。在20mA恒流及4℃条件下电泳。
免疫印迹参照Pettersson等(1993)的方法进行。人血清以1∶500稀释。过氧化物酶偶连的兔抗人IgG(Dako A/S)用作二抗，其工作浓度为1∶5000。过氧化物酶活性检测用ECL系统，按照使用说明来进行(Amersham)。
9B：LbpB对人的免疫原性-结果
人血清中LbpB特异抗体的出现用纯化的BNCV(-：2a：p1.2)株Lb
pB蛋白来进行免疫印迹检测。同时对折叠和变性形式的反应性进行检测(见图2例)。结果总结于表6。有4种血清对变性和折叠形式的LbpB均反应强烈，5种血清与二者反应微弱，2种仅与折叠形式反应，2种与变性形式有微弱反应，4种血清根本不与任何菌株的LbpB反应。这些结果表明脑膜炎球菌的LbpB对人有免疫原性，说明不同株LbpB之间存在很大程度的交叉免疫原性。
实施例10：ELISA及用脑膜炎球菌细胞或LbpB免疫小鼠的血清杀菌实验
10A：免疫程序
用脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV株免疫：以10只小鼠为一组(6周龄Balb/c)，用在SBAS2佐剂中含5×108菌落形成单位热灭活的BNCV全细胞免疫3次(100μl皮内或皮下)。三次免疫之间间隔21天。在第56天心脏穿刺采血。按组分离血清。
用脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV的LbpB免疫：该免疫程序同上，不同的是前两次用10μg粗LbpB免疫(含重组LbpB的E.coli细菌外膜)，第3次用2.5μg的纯LbpB免疫(用实施例8所述方法制备)。
10B：全细胞ELISA(WCE)和纯化LbpB ELISA测定免疫应答
使用平底96孔板。100μl热灭活的脑膜炎奈瑟氏B菌株[在缺铁状态(Fe-)下培养，用实施例1中的EDDA法](20μg/ml总蛋白)在PBS中的悬浮液分别加入每孔中，在37℃挥发过夜。包被板用0.9％NaCl，0.05％土温20洗涤4次，用含0.3％Casein(Merch)的PBS在室温摇动饱和30分钟，洗涤同上。100μl血清用含0.05％土温20，Casein 0.1％的PBS稀释100倍，加入第一孔，然后依次倍比稀释至12孔，37℃摇动孵育30分钟。洗涤后，加入100μl含0.05％土温20，0.3％ Casein的PBS的兔抗鼠免疫球蛋白生物素，按照上述方法孵育。洗涤后加100μl用含0.05％土温20的PBS稀释4000倍的链霉亲和素-生物素化辣根过氧化物酶，孵育同上。洗涤后，加100μl新鲜配制的4mg邻苯二胺(OPDA)染料(Sigma P8787)，该染料溶在pH4.5的0.1M柠檬酸缓冲液。在黑暗的室温条件下孵育15分钟。用50μl 1N HCl终止反应。测定在490nm处的吸光度。
抗LbpB的ELISA操作方法基本同WCE，不同之处在于包被。每孔用100μl含0.5μg/ml纯LbpB的0.05M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)包被，37℃孵育过夜(防止蒸发)。
10C：杀菌实验
乙型脑膜炎球菌(H44/76株)培养(在缺铁状态(Fe-)如实施例1或在去处EDDA的有铁状态)至对数生长期(OD～0.3)，用含0.3％BSA的无菌Hanks培养基调整细胞浓度至200000CFU/ml。
制备基础反应混合物(75μl)，其中每孔含50μl 2倍稀释的测试血清(实施例10A)样品(已在56℃热灭活30分钟)和25μl20000CFU/ml对数生长期的乙型脑膜炎球菌。反应管在37℃孵育15分钟，并用210rpm摇荡。最终反应混合物(100μl)还需加入25％预试的小兔血清作为补体来源，在同样条件下孵育60分钟。灭菌的聚苯乙烯U形96孔板用于此分析。
用多道移液器从每孔取10μl混合物，滴在含1％Isovitalex和1％热灭活马血清的Mueller-Hinton平板；在含5％ CO2的37℃条件下孵育18小时。每份可计数至80CFU。
以下面3个检测样作为对照：缓冲液+细菌+补体；缓冲液+细菌+灭活补体；血清+细菌+灭活补体。
按照程序用Excel软件(Microsoft)计算滴度，该程序用回归算法可精确测出50％细胞被杀死的稀释度。
实施例10D：结果
表7和图13表明用LbpB免疫可诱发对LbpB(图13A)良好的免疫应答，对来自BNCV(重组LbpB来源)和H44/76(其LbpB同BNCV仅有78.5％的一致性)的全细胞同样有良好反应(图13B和C)。用适用于重组LbpB免疫程序获得的血清也有同样的结果(结果未显示)。很明显，同用BNCV和H44/76全细胞ELISA检测相比(图13B和C)，对BNCV的全细胞免疫可导致更高的应答。
此外，用脑膜炎奈瑟氏菌株BNCV的重组LbpB免疫诱发产生的抗体可以同粘膜炎莫拉氏菌全细胞样品中相似分子量的蛋白结合，免疫印迹按照实施例9中所述方法进行(结果未显示)。
表8和图14表明在重组LbpB(来自BNCV)免疫产生血清中的抗体对异源菌株(H44/76)有杀菌作用，该菌株中LbpB同BNCV的LbpB仅有78.5％的序列一致性。对仅用重组LbpB免疫程序获得的血清也有同样的结果(结果未显示)。在H44/76生长在含铁(图14A)和缺铁状态下(图14B)结果均如此。
正如预期，铁缺乏环境，如果细菌在缺铁状态下有更高量的表达，则缺铁似乎可能正如所预期的那样有重要作用。
因此，LbpB为一免疫保护抗原，此外，证据表明它对异源脑膜炎奈瑟氏菌株有交叉保护作用。表1.所用的菌株和质粒。菌株 描述a 参考文献/来源脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76 B：15：P1.7，16 E.HoltenCE1449 H44/76 lbpA∷Ermr 本申请BNCV M986的-：2a：P1.2的 E.C.Gotschlich
未包囊衍生物CE1452 BNCV lbpA∷Ermr 本申请CE1452 BNCV lbpB∷Kmr 本申请CE1402 M986 lbpA，lbpB Pettersson et al.1994aM990 B：6：P1.6881607 B：nt：P1.12B16B6 B：2a：P1.2 A.SchryversN91 B16B6 tbpB A.SchryversM981 B：4：nt大肠杆菌DH5α Laboratory stockY1090 Ampr Young and Davis，1983PC2494 JM101的hsdR衍生物 Phabagen Collection质粒pEMBL19 Ampr Laboratory stockpUC4K Kmr-box，Ampr Pharmacia BiotechpER2 pBluescript的Ermr盒子，AmprJennings et al.，1993pAM6 携带部分lbpA和lbpB 本申请
的pEMBL19pAM6K 带有插入到lbpB的BglII位点的 本申请
来自pUC4K的Kmr盒子的pAM6pAM6K-nus 带有插入在载体的多克隆位点 本申请
的KpnI位点的奈瑟氏球菌吸收
序列的pAM6KpAM13 携带部分lbpA和lbpB 本申请
的pEMBL19pAM1 携带部分lbpA和lbpB的pUC19 Pettersson et al.1993pAM23 携带lbpA和部分lbpB的pUC19 Pettersson et al.1994bpAM23E 带有插入到lbpA的EcoRV位点 本申请
的Ermr盒子a血清组、血清型及亚型被标明。nt：无法分型。
表2.用于PCR或接头克隆的引物名称 序列 注释DVAS2 AGACCGACCCTTCGACGACTTCGGFW5 GAAGAAGAAGCGATGGTGCGGSDA1 CCTCTTTAGTATCTTTCTTCGCACLB11 CTTAATTTCATCTTTTCCCPR1 GAGCGAGTCCGCGTTAGTGCT 结合到Kmr匣子中nus1 TTCAGACGGCTGTAC 奈瑟氏菌摄入互补于nus1nus2 AGCCGTCTGAAGTAC
表3.用于PCR扩增另外4个lbpB基因的引物名称 序列LB20 GGAGGAAAAGTAGGGATGLB23 CGGGATCCAGCCAAGGCAGTCAGGGTAAGCREV2 GCACGGACGGTAACCTCTTTCAGG
表4.LbpB序列的配对同一性，以％计
H44/76 M990 M981 881607BNCV 78.5 73.8 72.7 71.4H44/76 72.5 74.1 78.5M990 70.5 71.3M981 80.6
表5.用于表达重组LbpB的引物名称 序列LB22 AACTGCAGTCGGCGGCAATTTCGGCGTGCALB23 CGGGATCCAGCCAAGGCAGTCAGGGTAAGCVGO12a CACCACCACCACCACCACGTGATCGAGGGGCGTGCAVGO13a CGCCCCTCGATCACGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCA
表6.抗纯化LbpB人血清的免疫印迹实验结果。血清 特征a 天然b 变性b 来源c262439 B：NT：P1.4 + + SKB262532 B：15：P1.7，16 + + SKB262658 B：NT：P1.15 - - SKB262716 B：15：P1.7，16 - + SKB262892 B：2b：P1.10 ++ ++ SKB262917 B：4：NT ++ ++ SKB262941 B：1：P1.15 + + SKB262987 B：2a：P1.15 + + SKB263017 B：4：NT - - SKB263021 B：4：P1.4 - - SKB69 B：15：P1.16 + - RIVM322 B：15：P1.5 + - RIVM329 B：1：P1.4 - - RIVM330 B：1：P1.4 ++ ++ RIVM187 - - + RIVM195 - ++ ++ RIVM118 - + + RIVM
a当已知时，标明的是患者所感染菌株的血清型及亚型。NT：无法分型。
b与所述蛋白的天然或变性形式之间的反应程度，++代表强反应，+代表弱反应以及-代表无反应。
C SKB：SmithKline Beecham Biologicals，RIVM：NationalInstitute of Public Health and the Environment。
表7.按照实施例10描述进行的抗全细胞和抗-LbpB ELISA的实验结果
| 抗-LbpB应答 | |
| 100a 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 204800 | |
| BNCVLbpBPBS | 0.341b0.196 0.107 0.063 0.033 0.018 0.014 0.011 0.013 0.012 0.009 0.0122.772 2.918 2.794 2.867 2.687 2.487 2.046 1.504 1.043 0.668 0.405 0.2020.14 0.079 0.044 0.028 0.016 0.018 0.012 0.01 0.01 0.008 0.012 0.01 |
| 抗BNCV(Fe-)应答 | |
| 100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 204800 | |
| BNCVLbpBPBS | 2.476 3.09 3.04 3.154 3.034 3.112 3.111 2.905 2.745 2.436 1.659 1.0561.783 1.856 1.292 0.914 0.622 0.385 0.257 0.185 0.122 0.106 0.096 0.0890.687 0.55 0.358 0.243 0.154 0.123 0.099 0.088 0.083 0.081 0.031 0.081 |
| 抗H44/76(Fe-)应答 | |
| 100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 204800 | |
| BNCVLbpBPBS | 2.814 3.003 2.966 2.976 2.873 2.66 2.371 1.862 1.312 0.873 0.591 0.4522.653 2.287 1.683 1.123 0.748 0.536 0.409 0.35 0.309 0.298 0.289 0.2951.646 1.049 0.695 0.47 0.338 0.271 0.238 0.226 0.226 0.251 0.284 0.285 |
a血清稀释度。b490nm处的光密度。
表8.按照实施例10中描述进行的抗全细胞和抗-LbpB血清的杀菌活性的结果
a血清稀释度
| 抗H44/76(Fe-)的杀菌滴度 | |
| 200.0a 400.0 800.0 1600.0 3200.0 6400.0 12800.0 25600.0 | |
| H44/76BNCVLbpBPBS | 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 97.2100.0 94.4 93.0 83.2 81.8 63.7 48.3 34.410.6 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5-0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 |
| 抗H44/76(Fe+)的杀菌滴度 | |
| 200.0 400.0 800.0 1600.0 3200.0 6400.0 12800.0 25600.0 | |
| H44/76BNCVLbpBPBS | 100 98 100 100 100 100 100 98100 98 96 85 83 70 64 3234 25 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 |
本发明中列出的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请在此引入作为参考，就如同所有单个的出版物都被特别并单个地指出在此引入作为参考。
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序列表
(1)一般资料：
(i)申请人：University of Utrecht，Technology Foundation
(ii)发明题目：疫苗
(iii)序列数：10
(iv)通信地址：
(A)收信人：Smithkline Beecham，Corporate IPDepartment
(B)街道：Two，New Horizons Court，
(C)城市：Brentford
(D)州： Middlesex
(E)国家：英国
(F)邮政编码：TW8 9EP
(V)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM Compatible
(C)操作系统：DOS
(D)软件：FastSEQ for Windows Version 2.0
(vi)目前的申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类号：
(vii)在先申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：
(viii)律师/代理人信息：
(A)姓名：DALTON，Marcus Jonathan William
(B)注册号：XXXXXX
(C)资料/文档号：5106
(ix)通讯信息：
(A)电话：(0181)975 6348
(B)传真：(908)975 6177(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：2277个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV株
(ix)特征：
(A)名称/关键词：编码序列
(B)位置：100...2274
(D)其它信息：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TCCTGATTTT TGTTAATTCA CTATAAAAAC GGGTTGATAT TATCTGTACA TATTAATATA 60ATGATAATTA TTATTAATCA AATAGGAGGA AAAGTAGGG ATG TGT AAA CCG AAT 114
Met Cys Lys Pro Asn
1 5TAT GGC GGC ATT GTC TTG TTG CCC TTA CTT TTG GCA TCT TGT ATC GGC 162Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Ser Cys Ile Gly
10 15 20GGC AAT TTC GGC GTG CAG CCT GTT GTC GAA TCA ACG CCG ACC GCG TAC 210Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser Thr Pro Thr Ala Tyr
25 30 35CCC GTC ACT TTC AAG TCT AAG GAC GTT CCC ACT CCG CCC CCT GCC AAA 258Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr Pro Pro Pro Ala Lys
40 45 50CCT TCT ATA GAA ATC ACG CCG GTC AAC CGG CCC GCC GTC GGT GCG GCA 306Pro Ser Ile Glu Ile Thr Pro Val Asn Arg Pro Ala Val Gly Ala Ala
55 60 65ATG CGG CTG CCA AGG CGG AAT ACT GCT TTT CAT CGT GAA GAT GGC ACG 354Met Arg Leu Pro Arg Arg Asn Thr Ala Phe His Arg Glu Asp Gly Thr70 75 80 85GAA ATT CCA AAT AGC AAA CAA GCA GAA GAA AAG CTG TCG TTT CAA GAA 402Glu Ile Pro Asn Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys Leu Ser Phe Gln Glu
90 95 100GGT GAT GTT CTG TTT TTA TAC GGT TCA AAA GGA AAT AAA CTT CAA CAA 450Gly Asp Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Gly Asn Lys Leu Gln Gln
105 110 115CTT AAA AGC GAA ATT CAT AAA CGT GAT TCC GAT GTA GAA ATT AGG ACA 498Leu Lys Ser Glu Ile His Lys Arg Asp Ser Asp Val Glu Ile Arg Thr
120 125 130TCA GAA AAG GAA AAT AAA AAA TAT GAT TAT AAA TTT GTA GAT GCA GGT 546Ser Glu Lys Glu Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys Phe Val Asp Ala Gly
135 140 145TAT GTA TAT GTA AAG GGA AAA GAT GAA ATT AAG TGG ACT TCA GAT TAC 594Tyr Val Tyr Val Lys Gly Lys Asp Glu Ile Lys Trp Thr Ser Asp Tyr150 155 160 165AAG CAG TTT TCC AAC CGC TTA GGT TAT GAC GGT TTT GTA TAT TAT TCC 642Lys Gln Phe Ser Asn Arg Leu Gly Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Tyr Ser
170 175 180GGA GAA CGT CCT TCC CAA TCT TTA CCG AGT GCG GGA ACG GTG GAA TAT 690Gly Glu Arg Pro Ser Gln Ser Leu Pro 5er Ala Gly Thr Val Glu Tyr
185 190 195TCT GGT AAC TGG CAA TAT ATG ACC GAT GCC AAA CGT CAT CGA GCA GGT 738Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala Lys Arg His Arg Ala Gly
200 205 210AAG GCG GTT GGC ATT GAC AAT TTG GGT TAT TAC ACA TTT TAT GGT AAC 786Lys Ala Val Gly Ile Asp Asn Leu Gly Tyr Tyr Thr Phe Tyr Gly Asn
215 220 225GAT GTT GGT GCA ACT TCT TAT GCG GCT AAG GAT GTC GAC GAA AGG GAA 834Asp Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Lys Asp Val Asp Glu Arg Glu230 235 240 245AAA CAT CCT GCT AAA TAT ACG GTA GAT TTC GGT AAC AAA ACC CTG ACG 882Lys His Pro Ala Lys Tyr Thr Val Asp Phe Gly Asn Lys Thr Leu Thr
250 255 260GGC GAG CTG ATT AAA AAC CAA TAT GTC AAA CCC AGT GAG AAG CAA AAA 930Gly Glu Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val Lys Pro Ser Glu Lys Gln Lys
265 270 275CCG CTG ACC ATT TAC AAC ATC ACT GCC GAT TTA AAC GGC AAC CGC TTT 978Pro Leu Thr Ile Tyr Asn Ile Thr Ala Asp Leu Asn Gly Asn Arg Phe
280 285 290ACC GGC AGT GCC AAG GTC AAT CCT GAT TTA GCG AAA AGC CAT GCC AAT 1026Thr Gly Ser Ala Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala Lys Ser His Ala Asn
295 300 305AAG GAG CAT TTG TTT TTC CAT GCC GAT GCC GAT CAG CGG CTT GAG GGC 1074Lys Glu His Leu Phe Phe His Ala Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly310 315 320 325GGT TTT TTC GGC GAT AAG GGG GAA GAG CTT GCC GGA CGG TTT ATC AGC 1122Gly Phe Phe Gly Asp Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser
330 335 340AAC GAC AAC AGC GTA TTC GGT GTA TTC GCA GGC AAA CAA AAT AGC CCC 1170Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe Ala Gly Lys Gln Asn Ser Pro
345 350 355GTG CCG TCT GGA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT TCT CTG AAA ATT TCC 1218Val Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys Ile Ser
360 365 370GTT GAT GAG GCA AGT GGT GAA AAT CCC CGA CCG TTT GCC ATT TCT CCT 1266Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro Phe Ala Ile Ser Pro
375 380 385ATG CCC GAT TTT GGT CAT CCC GAC AAA CTT CTT GTC GAA GGG CAT GAA 1314Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly His Glu390 395 400 405ATT CCT TTG GTT AGC CAA GAG AAA ACC ATC GAG CTT GCC GAC GGC AGG 1362Ile Pro Leu Val Ser Gln Glu Lys Thr Ile Glu Leu Ala Asp Gly Arg
410 415 420AAA ATG ACC GTC AGT GCT TGT TGC GAC TTT TTG ACC TAT GTG AAA CTC 1410Lys Met Thr Val Ser Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Val Lys Leu
425 430 435GGA CGG ATA AAA ACC GAA CGC CCC GCC GCC AAA CCG AAG GCG CAG GAC 1458Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Ala Lys Pro Lys Ala Gln Asp
440 445 450GAA GAG GAT TCG GAC ATT GAT AAT GGC GAA GAA AGC GAA GAC GAA ATC 1506Glu Glu Asp 5er Asp Ile Asp Asn Gly Glu Glu Ser Glu Asp Glu Ile
455 460 465GGC GAT GAA GAA GAA GGC ACC GAA GAT GCA GCC GCA GGA GAT GAA GGC 1554Gly Asp Glu Glu Glu Gly Thr Glu Asp Ala Ala Ala Gly Asp Glu Gly470 475 480 485AGC GAA GAA GAC GAA GCC ACA GAA AAC GAA GAC GGC GAA GAA GAC GAA 1602Ser Glu Glu Asp Glu Ala Thr Glu Asn Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu
490 495 500GCT GAA GAA CCT GAA GAA GAA TCG TCG GCA GAA GGC AAC GGC AGT TCA 1650Ala Glu Glu Pro Glu Glu Glu Ser Ser Ala Glu Gly Asn Gly Ser Ser
505 510 515AAC GCC ATC CTG CCT GTC CCG GAA GCC TCT AAA GGC AGG GAT ATC GAC 1698Asn Ala Ile Leu Pro Val Pro Glu Ala Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp
520 525 530CTT TTC CTG AAA GGT ATC CGC ACG GCA GAA ACG AAT ATT CCG CAA ACT 1746Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Thr Asn Ile Pro Gln Thr
535 540 545GGA GAA GCA CGC TAT ACC GGC ACT TGG GAA GCG CGT ATC GGC AAA CCC 1794Gly Glu Ala Arg Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Gly Lys Pro550 555 560 565ATT CAA TGG GAC AAT CAT GCG GAT AAA GAA GCG GCA AAA GCA GTA TTT 1842Ile Gln Trp Asp Asn His Ala Asp Lys Glu Ala Ala Lys Ala Val Phe
570 575 580ACC GTT GAT TTC GGC AAG AAA TCG ATT TCC GGA ACG CTG ACG GAG AAA 1890Thr Val Asp Phe Gly Lys Lys Ser Ile Ser Gly Thr Leu Thr Glu Lys
585 590 595AAC GGT GTA GAA CCT GCT TTC CGT ATT GAA AAC GGC GTG ATT GAG GGC 1938Asn Gly Val Glu Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asn Gly Val Ile Glu Gly
600 605 610AAC GGT TTC CAT GCG ACA GCG CGC ACT CGG GAT GAC GGC ATC GAC CTT 1986Asn Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Asp Asp Gly Ile Asp Leu
615 620 625TCC GGG CAG GGT TCG ACC AAA CCG CAG ATC TTC AAA GCT AAT GAT CTT 2034Ser Gly Gln Gly Ser Thr Lys Pro Gln Ile Phe Lys Ala Asn Asp Leu630 635 640 645CGT GTA GAA GGA GGA TTT TAC GGC CCG AAG GCG GAG GAA TTG GGC GGT 2082Arg Val Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly
650 655 660ATT ATT TTC AAT AAT GAT GGG AAA TCT CTT GGT ATA ACT GAA GGT ACT 2130Ile Ile Phe Asn Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly Ile Thr Glu Gly Thr
665 670 675GAA AAT AAA GTT GAA GCT GAT GTT GAT GTT GAT GTT GAT GTT GAT GTT 2178Glu Asn Lys Val Glu Ala Asp Val Asp Val Asp Val Asp Val Asp Val
680 685 690GAT GCT GAT GCT GAT GTT GAA CAG TTA AAA CCT GAA GTT AAA CCC CAA 2226Asp Ala Asp Ala Asp Val Glu Gln Leu Lys Pro Glu Val Lys Pro Gln
695 700 705TTC GGC GTG GTA TTC GGT GCG AAG AAA GAT AAT AAA GAG GTG GAA AAA T 2275Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Ly5 Asp Asn Lys Glu Val Glu Lys710 715 720 725GA 2277(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：725个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内在
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌BNCV株
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
20 25 30Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45Pro Pro Pro Ala Lys Pro Ser Ile Glu Ile Thr Pro Val Asn Arg Pro
50 55 60Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Pro Arg Arg Asn Thr Ala Phe His65 70 75 80Arg Glu Asp Gly Thr Glu Ile Pro Asn Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys
85 90 95Leu Ser Phe Gln Glu Gly Asp Val Leu Pne Leu Tyr Gly Ser Lys Gly
100 105 110Asn Lys Leu Gln Gln Leu Lys Ser Glu Ile His Lys Arg Asp Ser Asp
115 120 125Val Glu Ile Arg Thr Ser Glu Lys Glu Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys
130 135 140Phe Val Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Val Lys Gly Lys Asp Glu Ile Lys145 150 155 160Trp Thr Ser Asp Tyr Lys Gln Phe Ser Asn Arg Leu Gly Tyr Asp Gly
165 170 175Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Arg Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser Ala
180 185 190Gly Thr Val Glu Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala Lys
195 200 205Arg His Arg Ala Gly Lys Ala Val Gly Ile Asp Asn Leu Gly Tyr Tyr
210 215 220Thr Phe Tyr Gly Asn Asp Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Lys Asp225 230 235 240Val Asp Glu Arg Glu Lys His Pro Ala Lys Tyr Thr Val Asp Phe Gly
245 250 255Asn Lys Thr Leu Thr Gly Glu Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val Lys Pro
260 265 270Ser Glu Lys Gln Lys Pro Leu Thr Ile Tyr Asn Ile Thr Ala Asp Leu
275 280 285Asn Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala
290 295 300Lys Ser His Ala Asn Lys Glu His Leu Phe Phe His Ala Asp Ala Asp305 310 315 320Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys Gly Glu Glu Leu Ala
325 330 335Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe Ala Gly
340 345 350Lys Gln Asn Ser Pro Val Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp
355 360 365Ser Leu Lys Ile Ser Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro
370 375 380Phe Ala Ile Ser Pro Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu385 390 395 400Val Glu Gly His Glu Ile Pro Leu Val Ser Gln Glu Lys Thr Ile Glu
405 410 415Leu Ala Asp Gly Arg Lys Met Thr Val Ser Ala Cys Cys Asp Phe Leu
420 425 430Thr Tyr Val Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Ala Lys
435 440 445Pro Lys Ala Gln Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ile Asp Asn Gly Glu Glu
450 455 460Ser Glu Asp Glu Ile Gly Asp Glu Glu Glu Gly Thr Glu Asp Ala Ala465 470 475 480Ala Gly Asp Glu Gly Ser Glu Glu Asp Glu Ala Thr Glu Asn Glu Asp
485 490 495Gly Glu Glu Asp Glu Ala Glu Glu Pro Glu Glu Glu Ser Ser Ala Glu
500 505 510Gly Asn Gly Ser Ser Asn Ala Ile Leu Pro Val Pro Glu Ala Ser Lys
515 520 525Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Thr
530 535 540Asn Ile Pro Gln Thr Gly Glu Ala Arg Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala545 550 555 560Arg Ile Gly Lys Pro Ile Gln Trp Asp Asn His Ala Asp Lys Glu Ala
565 570 575Ala Lys Ala Val Phe Thr Val Asp Phe Gly Lys Lys Ser Ile Ser Gly
580 585 590Thr Leu Thr Glu Lys Asn Gly Val Glu Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asn
595 600 605Gly Val Ile Glu Gly Ash Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Asp
610 615 620Asp Gly Ile Asp Leu Ser Gly Gln Gly Ser Thr Lys Pro Gln Ile Phe625 630 635 640Lys Ala Asn Asp Leu Arg Val Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala
645 650 655Glu Glu Leu Gly Gly Ile Ile Phe Asn Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly
660 665 670Ile Thr Glu Gly Thr Glu Asn Lys Val Glu Ala Asp Val Asp Val Asp
675 680 685Val Asp Val Asp Val Asp Ala Asp Ala Asp Val Glu Gln Leu Lys Pro
690 695 700Glu Val Lys Pro Gln Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asn705 710 715 720Lys Glu Val Glu Lys
725(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：2169个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌M981株
(ix)特征：
(A)名称/关键词：编码序列
(B)位置：1...2166
(D)其它资料：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：ATG TGT AAA CCG AAT TAT GGC GGC ATT GTC TTG TTG CCC TTA CTT TTG 48Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15GCA TCT TGC ATC GGC GGC AAT TTC GGC GTG CAG CCT GTT GTC GAA TCA 96Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
20 25 30ACG CCG ACC GCG TAC CCC GTC ACT TTC AAG TCT AAG GAC GTT CCC ACT 144Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45TCG CCC CCT GCC GGG TCT TCG GTA GAA ACC ACG CCG GTC AAC CAG CCC 192Ser Pro Pro Ala Gly Ser Ser Val Glu Thr Thr Pro Val Asn Gln Pro
50 55 60GCC GTC GGT GCG GCA ATG CGG CTG TTG AGA CGG AAT ACT GCT TTT CAT 240Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Asn Thr Ala Phe His65 70 75 80CGT GAA GAT GGC ACG GCA ATT CCC GAT AGC AAA CAA GCA GAA GAA AAG 288Arg Glu Asp Gly Thr Ala Ile Pro Asp Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys
85 90 95CTG TCG TTT AAA GAA GGT GAT GTT CTG TTT TTA TAC GGT TCA AAA GAA 336Leu Ser Phe Lys Glu Gly Asp Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Glu
100 105 110AAT AAA CTT CAA CAA CTT AAA AGC GAA ATT CAT AAA CGT AAT CCT GAG 384Asn Lys Leu Gln Gln Leu Lys Ser Glu Ile His Lys Arg Asn Pro Glu
115 120 125GCA AGC ATT ACC ACA TCG GAA AAT GAA AAT AAA AAA TAT AAT TAT CGG 432Ala Ser Ile Thr Thr Ser Glu Asn Glu Asn Lys Lys Tyr Asn Tyr Arg
130 135 140TTT GTC AGT GCC GGT TAT GTG TTT ACT AAA AAC GGA AAA GAT GAA ATT 480Phe Val Ser Ala Gly Tyr Val Phe Thr Lys Asn Gly Lys Asp Glu Ile145 150 155 160GAG AAA ACA TCG GAT GAA AAG CAG TTT TCT AAT CGT TTA GGC TAT GAC 528Glu Lys Thr Ser Asp Glu Lys Gln Phe Ser Asn Arg Leu Gly Tyr Asp
165 170 175GGT TTT GTA TAT TAT CTC GGA GAA CAT CCT TCC CAA TCT TTA CCG AGC 576Gly Phe Val Tyr Tyr Leu Gly Glu His Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser
180 185 190GCG GGA ACG GTG AAA TAT TCC GGC AAC TGG CAA TAT ATG ACC GAT GCC 624Ala Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala
195 200 205ATA CGT CAT CGG AGA GGT AAG GGG GTT TCC AGT GTG GAT TTG GGT TAT 672Ile Arg His Arg Arg Gly Lys Gly Val Ser Ser Val Asp Leu Gly Tyr
210 215 220ACC ACA TAT TAT GGT AAT GAA ATT GGG GCA GCT TCT TAT GAG GCT AGG 720Thr Thr Tyr Tyr Gly Asn Glu Ile Gly Ala Ala Ser Tyr Glu Ala Arg225 230 235 240GAT GCC GAT GGC CGG GAA AAA CAT CCT GCC GAA TAT ACG GTT AAT TTC 768Asp Ala Asp Gly Arg Glu Lys His Pro Ala Glu Tyr Thr Val Asn Phe
245 250 255GAC AAA AAA AAC CTG GAA GGT AAG TTG ATT AAA AAT CAG TAT GTG CAA 816Asp Lys Lys Asn Leu Glu Gly Lys Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val Gln
260 265 270AAG AGA GAT GAT CCT AAA AAT CCA CTG ACC ATT TAC AAC ATT ACC GCA 864Lys Arg Asp Asp Pro Lys Asn Pro Leu Thr Ile Tyr Asn Ile Thr Ala
275 280 285ACA TTG GAC GGC AAC CGC TTT ACC GGC AGT GCC AAA GTT AGC ACC GAG 912Thr Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val Ser Thr Glu
290 295 300GTG AAG ACG CAA CAC GCT GAT AAA GAA TAT TTG TTT TTC CAT ACC GAT 960Val Lys Thr Gln His Ala Asp Lys Glu Tyr Leu Phe Phe His Thr Asp305 310 315 320GCC GAT CAG CGG CTT GAG GGC GGT TTT TTC GGC GAT AAC GGA GAA GAG 1008Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Asn Gly Glu Glu
325 330 335CTT GCC GGG CGG TTT ATC AGT AAC GAC AAC AGC GTA TTC GGC GTG TTC 1056Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe
340 345 350GCA GGC AAA CAA AAA ACA GAG ACA GCA AAC GCA TCA GAT ACA AAT CCT 1104Ala Gly Lys Gln Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ser Asp Thr Asn Pro
355 360 365GCC CTG CCG TCT GGA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT TCT CTA AAA ATT 1152Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys Ile
370 375 380TCC GTT GAC GAG GCG ACT GAT GAC CAT GCC CGT AAG TTT GCC ATT TCC 1200Ser Val Asp Glu Ala Thr Asp Asp His Ala Arg Lys Phe Ala Ile Ser385 390 395 400ACT ATG CCC GAT TTT GGT CAT CCC GAC AAA CTT CTT GTC GAA GGG CGT 1248Thr Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly Arg
405 410 415GAA ATT CCT TTG GTT AGC CAA GAG AAA ACC ATC GAG CTT GCC GAC GGC 1296Glu Ile Pro Leu Val Ser Gln Glu Lys Thr Ile Glu Leu Ala Asp Gly
420 425 430AGG AAA ATG ACC ATC CGT GCT TGT TGC GAT TTT CTG ACC TAT GTG AAA 1344Arg Lys Met Thr Ile Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Val Lys
435 440 445CTC GGA CGG ATA AAA ACC GAC CGC CCC GCC GTC AAA CCG AAG GCG CAG 1392Leu Gly Arg Ile Lys Thr Asp Arg Pro Ala Val Lys Pro Lys Ala Gln
450 455 460GAT GAA GAG GAT TCG GAC ATT GAT AAT GGC GAA GAA AGC GAA GAC GAA 1440Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ile Asp Asn Gly Glu Glu Ser Glu Asp Glu465 470 475 480ATT TCC GAA GAT GAT AAC GGC GAA GAT GAA GTC ACC GAA GAA GAG GAA 1488Ile Ser Glu Asp Asp Asn Gly Glu Asp Glu Val Thr Glu Glu Glu Glu
485 490 495GCT GAA GAA ACC GAA GAA GAA ACT GAT GAA GAC GAA GAG GAA GAA CCC 1536Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Pro
500 505 510GAA GAA ACT GAA GAA ACT GAA GAA ACT GAA GAA ACT GAA GAA ACT GAA 1584Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu
515 520 525GAA ACT GAA GAA AAA TCG CCG ACA GAA GAA GGC AAC GGC GGT TCA GGC 1632Glu Thr Glu Glu Lys Ser Pro Thr Glu Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly
530 535 540AGC ATC CTG CCC ACT CCG GAA GCC TCT AAA GGC AGG GAC ATC GAC CTT 1680Ser Ile Leu Pro Thr Pro Glu Ala Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu545 550 555 560TTC CTG AAA GGT ATC CGC ACG GCG GAA GCC GAC ATT CCG CAA ATT GGA 1728Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Ala Asp Ile Pro Gln Ile Gly
565 570 575AAA GCA CGC TAT ACC GGC ACT TGG GAA GCG CGT ATC GGC GTG CCG GAT 1776Lys Ala Arg Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Gly Val Pro Asp
580 585 590AAG AAA GGC GAA CAG CTA GAT GGC ACT ACG TCC ATT CAA AAG GAT AGC 1824Lys Lys Gly Glu Gln Leu Asp Gly Thr Thr Ser Ile Gln Lys Asp Ser
595 600 605TAT GCG AAT CAA GCG GCA AAA GCA GAA TTT GAC GTT GAT TTT GGT GCG 1872Tyr Ala Asn Gln Ala Ala Lys Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe Gly Ala
610 615 620AAG TCG CTT TCA GGT AAG TTG ACA GAA AAA AAT GAT ACA CAC CCC GCT 1920Lys Ser Leu Ser Gly Lys Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr His Pro Ala625 630 635 640TTT TAT ATT GAA AAA GGT GTG ATT GAT GGC AAC GGT TTC CAC GCT TTG 1968Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala Leu
645 650 655GCG CGT ACT CGT GAA AAT GGT GTT GAT TTG TCT GGG CAA GGT TCG ACT 2016Ala Arg Thr Arg Glu Asn Gly Val Asp Leu Ser Gly Gln Gly Ser Thr
660 665 670AAT CCC CAA AGT TTT AAA GCC AGT AAT CTT CTC GTA GAA GGA GGA TTT 2064Asn Pro Gln Ser Phe Lys Ala Ser Asn Leu Leu Val Glu Gly Gly Phe
675 680 685TAT GGT CCG CAG GCG GCA GAG TTG GGT GGT AAT ATT ATC GAC AGT GAC 2112Tyr Gly Pro Gln Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser Asp
690 695 700CGG AAA ATC GGC GTG GTA TTC GGT GCG AAG AAA GAT ATG CAG GAG GTG 2160Arg Lys Ile Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Met Gln Glu Val705 710 715 720GAA AAA TGA 2169Glu Lys(2)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：722个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内在
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌M981株
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
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35 40 45Ser Pro Pro Ala Gly Ser Ser Val Glu Thr Thr Pro Val Asn Gln Pro
50 55 60Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Asn Thr Ala Phe His65 70 75 80Arg Glu Asp Gly Thr Ala Ile Pro Asp Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys
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100 105 110Asn Lys Leu Gln Gln Leu Lys Ser Glu Ile His Lys Arg Asn Pro Glu
115 120 125Ala Ser Ile Thr Thr Ser Glu Asn Glu Asn Lys Lys Tyr Asn Tyr Arg
130 135 140Phe Val Ser Ala Gly Tyr Val Phe Thr Lys Asn Gly Lys Asp Glu Ile145 150 155 160Glu Lys Thr Ser Asp Glu Lys Gln Phe Ser Asn Arg Leu Gly Tyr Asp
165 170 175Gly Phe Val Tyr Tyr Leu Gly Glu His Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser
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195 200 205Ile Arg His Arg Arg Gly Lys Gly Val Ser Ser Val Asp Leu Gly Tyr
210 215 220Thr Thr Tyr Tyr Gly Asn Glu Ile Gly Ala Ala Ser Tyr Glu Ala Arg225 230 235 240Asp Ala Asp Gly Arg Glu Lys His Pro Ala Glu Tyr Thr Val Asn Phe
245 250 255Asp Lys Lys Asn Leu Glu Gly Lys Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val Gln
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275 280 285Thr Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Sar Ala Lys Val Ser Thr Glu
290 295 300Val Lys Thr Gln His Ala Asp Lys Glu Tyr Leu Phe Phe His Thr Asp305 310 315 320Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Asn Gly Glu Glu
325 330 335Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe
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355 360 365Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys Ile
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530 535 540Ser Ile Leu Pro Thr Pro Glu Ala Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu545 550 555 560Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Ala Asp Ile Pro Gln Ile Gly
565 570 575Lys Ala Arg Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Gly Val Pro Asp
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610 615 620Lys Ser Leu Ser Gly Lys Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr His Pro Ala625 630 635 640Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala Leu
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675 680 685Tyr Gly Pro Gln Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser Asp
690 695 700Arg Lys Ile Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Met Gln Glu Val705 710 715 720Glu Lys(2)SEQ ID NO：5的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：2226个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76株
(ix)特征：
(A)名称/关键词：编码序列
(B)位置：1...2233
(D)其它资料：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：ATG TGT AAA CCG AAT TAT GGC GGC ATT GTC TTG TTG CCC TTA CTT TTG 48Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15GCA TCT TGT ATT GGC GGC AAT TTC GGC GTG CAG CCT GTT GTC GAA TCA 96Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
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290 295 300AAC ACC GAG TTG AAG ACG AGC CAC GCT GAT AAA GAG CAT TTG TTT TTC 960Asn Thr Glu Leu Lys Thr Ser His Ala Asp Lys Glu His Leu Phe Phe305 310 315 320CAT ACC GAT GCC GAT CAG CGG CTT GAG GGC GGT TTT TTC GGC GAT AAG 1008His Thr Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys
325 330 335GGG GAA GAG CTT GCC GGA CGG TTT ATC AGC AAC GAC AAC AGC GTA TTC 1056Gly Glu Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe
340 345 350GGC GTA TTC GCA GGC AAA AAA ACA AAC GCA TCA AAC GCA GCA GAT ACA 1104Gly Val Phe Ala Gly Lys Lys Thr Asn Ala Ser Asn Ala Ala Asp Thr
355 360 365AAT CCT GCT ATG CCG TCT GAA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT TCT CTG 1152Asn Pro Ala Met Pro Ser Glu Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu
370 375 380AAA ATT TCC GTT GAC GAG GCG ACG GAT AAA AAT GCC CGC CCG TTT GCC 1200Lys Ile Ser VAl Asp Glu Ala Thr Asp Lys Asn Ala Arg Pro Phe Ala385 390 395 400ATT TCC CCT CTG CCC GAT TTT GGC CAT CCC GAC AAA CTC CTT GTC GAA 1248Ile Ser Pro Leu Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu
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420 425 430GAC GGC AGG AAA ATG ACC GTC CGT GCT TGT TGC GAT TTT CTG ACC TAT 1344Asp Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr
435 440 445GTG AAA CTC GGA CGG ATA AAA ACT GAC CGC CCA GCA AGT AAA CCA AAG 1392Val Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Asp Arg Pro Ala Ser Lys Pro Lys
450 455 460GCG GAA GAT AAA GGG AAG GAT GAA GAG GAT ACA GGC GTT GGT AAC GAC 1440Ala Glu Asp Lys Gly Lys Asp Glu Glu Asp Thr Gly Val Gly Asn Asp465 470 475 480GAA GAA GGC ACG GAA GAT GAA GCC GCA GAA GGC AGC GAA GGA GGC GAA 1488Glu Glu Gly Thr Glu Asp Glu Ala Ala Glu Gly Ser Glu Gly Gly Glu
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530 535 540CCC GCT CCG GAA GCT CCT AAA GGC AGG GAT ATC GAC CTT TTC CTG AAA 1680Pro Ala Pro Glu Ala Pro Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys545 550 555 560GGT ATC CGC ACG GCG GAA GCC GAC ATT CCG CAA ACT GGA AAA GCA CGC 1728Gly Ile Arg Thr Ala Glu Ala Asp Ile Pro Gln Thr Gly Lys Ala Arg
565 570 575TAT ACC GGC ACT TGG GAA GCG CGT ATC AGC AAA CCC ATT CAA TGG GAC 1776Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Ser Lys Pro Ile Gln Trp Asp
580 585 590AAT CAT GCG GAT AAA AAA GCG GCA AAA GCA GAA TTT GAC GTT GAT TTC 1824Asn His Ala Asp Lys Lys Ala Ala Lys Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe
595 600 605GGC GAG AAA TCG ATT TCC GGA ACG CTG ACG GAG AAA AAC GGT GTA CAA 1872Gly Glu Lys Ser Ile Ser Gly Thr Leu Thr Glu Lys Asn Gly Val Gln
610 615 620CCT GCT TTC CAT ATT GAA AAC GGC GTG ATT GAG GGC AAT GGT TTC CAC 1920Pro Ala Phe His Ile Glu Asn Gly Val Ile Glu Gly Asn Gly Phe His625 630 635 640GCG ACA GCG CGC ACT CGG GAT AAC GGC ATC AAT CTT TCG GGA AAT GAT 1968Ala Thr Ala Arg Thr Arg Asp Asn Gly Ile Asn Leu Ser Gly Asn Asp
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660 665 670GGC TTT TAC GGC CCG CAG GCG GAG GAA TTG GGC GGT ACT ATT TTC AAT 2064Gly Phe Tyr Gly Pro Gln Ala Glu Glu Leu Gly Gly Thr Ile Phe Asn
675 680 685AAT GAT GGG AAA TCT CTT GGT ATA ACT GAA GAT ACT GAA AAT GAA GCT 2112Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly Ile Thr Glu Asp Thr Glu Asn Glu Ala
690 695 700GAA GCT GAA GTT GAA AAT GAA GCT GGT GTT GGC GAA CAG TTA AAA CCT 2160Glu Ala Glu Val Glu Asn Glu Ala Gly Val Gly Glu Gln Leu Lys Pro705 710 715 720GAA GCT AAA CCC CAA TTC GGC GTG GTA TTC GGT GCG AAG AAA GAT AAT 2208Glu Ala Lys Pro Gln Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asn
725 730 735AAA GAG GTG GAA AAA TGA 2226Lys Glu Val Glu Lys
740(2)SEQ ID NO：6的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：741个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内在
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76株
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
20 25 30Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
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195 200 205Asp Ala Ile Arg His Arg Thr Gly Lys Ala Gly Asp Pro Ser Glu Asp
210 215 220Leu Gly Tyr Leu Val Tyr Tyr Gly Gln Asn Val Gly Ala Thr Ser Tyr225 230 235 240Ala Ala Thr Ala Asp Asp Arg Glu Gly Lys His Pro A la Glu Tyr Thr
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435 440 445Val Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Asp Arg Pro Ala Ser Lys Pro Lys
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485 490 495Asp Glu Ile Gly Asp Glu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Glu Ala Ala Glu
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580 585 590Asn His Ala Asp Lys Lys Ala Ala Lys Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe
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660 665 670Gly Phe Tyr Gly Pro Gln Ala Glu Glu Leu Gly Gly Thr Ile Phe Asn
675 680 685Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly Ile Thr Glu Asp Thr Glu Asn Glu Ala
690 695 700Glu Ala Glu Val Glu Asn Glu Ala Gly Val Gly Glu Gln Leu Lys Pro705 710 715 720Glu Ala Lys Pro Gln Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asn
725 730 735Lys Glu Val Glu Lys
740(2)SEQ ID NO：7的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：2262个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌M990株
(ix)特征：
(A)名称/关键词：编码序列
(B)位置：1...2259 (D)其他信息：(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：ATG TGT AAA CCG AAT TAT GGC GGC ATT GTC TTG TTG CCC TTA CTT TTA 48Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15GCA TCT TGT ATC GGC GGC AAT TTC GGC GTA CAG CCT GTT GTC GAA TCA 96Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
20 25 30ACG CCG ACC GCG CCA ACT CTG TCA GAT TCC AAA TCT TCC AAT CCT GCG 144Thr Pro Thr Ala Pro Thr Leu Ser Asp Ser Lys Ser Ser Asn Pro Ala
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50 55 60GTC AAG CGG CCC GCC GTC GGT GCG GCA ATG CGG CTG CCA AGG CGG AAT 240Val Lys Arg Pro Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Pro Arg Arg Asn65 70 75 80ATC GCA ACT TTT GAT AAA AAT GGT AAT GAA ATT CCC AAT AGT AAG CAG 288Ile Ala Thr Phe Asp Lys Asn Gly Asn Glu Ile Pro Asn Ser Lys Gln
85 90 95GCA GAG GAG TAT CTG CCG CTC AAA GAG AAG GAT ATC CTG TTT TTA GAC 336Ala Glu Glu Tyr Leu Pro Leu Lys Glu Lys Asp Ile Leu Phe Leu Asp
100 105 110GGT ACG CCG AAA GAA CAG GCT GAC AAA CTT AAA AAG GAA ATC AAC GGA 384Gly Thr Pro Lys Glu Gln Ala Asp Lys Leu Lys Lys Glu Ile Asn Gly
115 120 125CGG CAT CCT AAT GCA CCA ATC TAC ACG TCC GAT TTA AAA GAT GAT GCG 432Arg His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Thr Ser Asp Leu Lys Asp Asp Ala
130 135 140TAT CAA TAT AAA TAT GTC CGG GCC GGA TAT GTT TAT ACT AGA TAT GGA 480Tyr Gln Tyr Lys Tyr Val Arg Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Arg Tyr Gly145 150 155 160ACA GAT GAA ATC GAA CAG AAC TCA GGC GGT AAG CGG GTT ACC CAC CGC 528Thr Asp Glu Ile Glu Gln Asn Ser Gly Gly Lys Arg Val Thr His Arg
165 170 175TTA GGT TAT GAC GGT TTT GTA TAT TAT TCC GGA GAA CGT CCT TCC CAA 576Leu Gly Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Arg Pro Ser Gln
180 185 190TCT TTA CCG AGT GCG GGA ACG GTG GAA TAT TCT GGT AAC TGG CAA TAT 624Ser Leu Pro Ser Ala Gly Thr Val Glu Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr
195 200 205ATG ACC GAT GCC AAA CGT CAT CGA GCA GGT CAG GCG GTT GGC ATT GAC 672Met Thr Asp Ala Lys Arg His Arg Ala Gly Gln Ala Val Gly Ile Asp
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245 250 255ACG GTT GAT TTT GAT AAC AAA ACC ATG AAT GGC AAG CTG ATT AAA AAT 816Thr Val Asp Phe Asp Asn Lys Thr Met Asn Gly Lys Leu Ile Lys Asn
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290 295 300AAG GTC AAT CCT GAT TTA GCG AAA AAC CTT GCC GGT AAT GAG CGT TTG 960Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala Lys Asn Leu Ala Gly Asn Glu Arg Leu305 310 315 320TTT TTC CAT GCC GAT GCC GAT CAG CGG CTT GAG GGC GGT TTT TTC GGC 1008Phe Phe His Ala Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly
325 330 335GAT AAC GGA GAA GAG CTT GCC GGA CGG TTT ATC AGC AAC GAC AAC AGC 1056Asp Asn Gly Glu Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser
340 345 350GTA TTC GGC GTA TTC GCA GGC AAA AAA ACA GAG ACA GCA AAC GCA GCA 1104Val Phe Gly Val Phe Ala Gly Lys Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ala
355 360 365GAT ACA AAA CCT GCC CTG CCG TCT GGA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT 1152Asp Thr Lys Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp
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405 410 415GTC GAA GGG CGT GAA ATT CCT TTG GTA AAC GAA GAA CAA ATC ATC AAG 1296Val Glu Gly Arg Glu Ile Pro Leu Val Asn Glu Glu Gln Ile Ile Lys
420 425 430CTT GCC GAC GGC AGG AAA ATG ACC GTC CGT GCT TGT TGC GAC TTT TTG 1344Leu Ala Asp Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu
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450 455 460CCA AAG GCG GAA GAT AAA GGG GAG GAT GAA GAG GGT GCA GGC GTT GAT 1440Pro Lys Ala Glu Asp Lys Gly Glu Asp Glu Glu Gly Ala Gly Val Asp465 470 475 480AAC GAC GAA GAA AGC GAA GAC GAA GCC GTA GAA GAC GAA GGC GGC GAA 1488Asn Asp Glu Glu Ser Glu Asp Glu Ala Val Glu Asp Glu Gly Gly Glu
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595 600 605GTT GAT TTC GAC AAG AAA TCG ATT TCC GGA AAG CTG ACG GAG CAA AAC 1872Val Asp Phe Asp Lys Lys Ser Ile Ser Gly Lys Leu Thr Glu Gln Asn
610 615 620GGC GTA GAA CCT GCT TTC CAT ATT GAA GAC GGC AAG ATT GAT GGC AAC 1920Gly Val Glu Pro Ala Phe His Ile Glu Asp Gly Lys Ile Asp Gly Asn625 630 635 640GGT TTC CAC GCG ACA GCG CGC ACT CGG GAG AGC GGC ATC AAT CTT TCG 1968Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Glu Ser Gly Ile Asn Leu Ser
645 650 655GGA AAT GGT TCG ACC GAC CCC AAA ACA TTC CAA GCT AGT AAT CTT CGT 2016Gly Asn Gly Ser Thr Asp Pro Lys Thr Phe Gln Ala Ser Asn Leu Arg
660 665 670GTA GAA GGA GGA TTT TAC GGC CCG CAG GCG GCG GAA TTG GGC GGT ACT 2064Val Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Gln Ala Ala Glu Leu Gly Gly Thr
675 680 685ATT TTC AAT AAT GAT GGG AAA TCT CTT AGT ATA ACT GAA AAT ATT GAA 2112Ile Phe Asn Asn Asp Gly Lys Ser Leu Ser Ile Thr Glu Asn Ile Glu
690 695 700AAT GAA GCT GAA GCT GAA GTT GAA GTT GAA GCT GAA GCT GAA GTT GAA 2160Asn Glu Ala Glu Ala Glu Val Glu Val Glu Ala Glu Ala Glu Val Glu705 710 715 720GTT GAA GCT GAT GTT GGC AAA CAG TTA GAA CCT GAT GAA GTT AAA CAC 2208Val Glu Ala Asp Val Gly Lys Gln Leu Glu Pro Asp Glu Val Lys His
725 730 735AAA TTC GGC GTG GTA TTC GGT GCG AAG AAA GAT ATG CAG GAG GTG GAA 2256Lys Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Met Gln Glu Val Glu
740 745 750AAA TGA 2262Lys(2)SEQ ID NO：8的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：753个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内在
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌M990株
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
20 25 30Thr Pro Thr Ala Pro Thr Leu Ser Asp Ser Lys Ser Ser Asn Pro Ala
35 40 45Asp Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Glu Pro Ser Val Glu Ile Thr Pro
50 55 60Val Lys Arg Pro Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Pro Arg Arg Asn65 70 75 80Ile Ala Thr Phe Asp Lys Asn Gly Asn Glu Ile Pro Asn Ser Lys Gln
85 90 95Ala Glu Glu Tyr Leu Pro Leu Lys Glu Lys Asp Ile Leu Phe Leu Asp
100 105 110Gly Thr Pro Lys Glu Gln Ala Asp Lys Leu Lys Lys Glu Ile Asn Gly
115 120 125Arg His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Thr Ser Asp Leu Lys Asp Asp Ala
130 135 140Tyr Gln Tyr Lys Tyr Val Arg Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Arg Tyr Gly145 150 155 160Thr Asp Glu Ile Glu Gln Asn Ser Gly Gly Lys Arg Val Thr His Arg
165 170 175Leu Gly Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Arg Pro Ser Gln
180 185 190Ser Leu Pro Ser Ala Gly Thr Val Glu Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr
195 200 205Met Thr Asp Ala Lys Arg His Arg Ala Gly Gln Ala Val Gly Ile Asp
210 215 220Asn Leu Gly Tyr Ile Thr Phe Tyr Gly Asn Asp Val Gly Ala Thr Ser225 230 235 240Tyr Ala Ala Lys Asp Val Asp Glu Arg Glu Lys His Pro Ala Lys Tyr
245 250 255Thr Val Asp Phe Asp Asn Lys Thr Met Asn Gly Lys Leu Ile Lys Asn
260 265 270Gln Tyr Val Arg Asn Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Pro Leu Thr Ile
275 280 285Tyr Asp Ile Thr Ala Lys Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly ser Ala
290 295 300Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala Lys Asn Leu Ala Gly Asn Glu Arg Leu305 310 315 320Phe Phe His Ala Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly
325 330 335Asp Asn Gly Glu Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser
340 345 350Val Phe Gly Val Phe Ala Gly Lys Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ala
355 360 365Asp Thr Lys Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp
370 375 380Ser Leu Lys Ile Ser Val Asp Glu Ala Thr Asp Gly His Ala Arg Lys385 390 395 400Phe Ala Ile Ser Ser Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu
405 410 415Val Glu Gly Arg Glu Ile Pro Leu Val Asn Glu Glu Gln Ile Ile Lys
420 425 430Leu Ala Asp Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu
435 440 445Thr Tyr Val Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Asp Arg Pro Ala Ser Lys
450 455 460Pro Lys Ala Glu Asp Lys Gly Glu Asp Glu Glu Gly Ala Gly Val Asp465 470 475 480Asn Asp Glu Glu Ser Glu Asp Glu Ala Val Glu Asp Glu Gly Gly Glu
485 490 495Glu Asp Glu Thr Ser Glu Glu Asp Asn Gly Glu Asp Glu Glu Ala Thr
500 505 510Ala Glu Glu Glu Thr Glu Glu Val Asp Glu Ala Glu Glu Glu Glu Val
515 520 525Glu Glu Pro Glu Glu Lys Ser Pro A la Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly
530 535 540Ser Ile Leu Pro Ala Leu Glu Ala Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu545 550 555 560Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Thr Asp Ile Pro Gln Ser Gly
565 570 575Thr Ala His Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Gly Lys Pro Ile
580 585 590Gln Trp Asp Asn Gln Ala Asp Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Phe Thr
595 600 605Val Asp Phe Asp Lys Lys Ser Ile Ser Gly Lys Leu Thr Glu Gln Asn
610 615 620Gly Val Glu Pro Ala Phe His Ile Glu Asp Gly Lys Ile Asp Gly Asn625 630 635 640Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Glu Ser Gly Ile Asn Leu Ser
645 650 655Gly Asn Gly Ser Thr Asp Pro Lys Thr Phe Gln Ala Ser Asn Leu Arg
660 665 670Val Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Gln Ala Ala Glu Leu Gly Gly Thr
675 680 685Ile Phe Asn Asn Asp Gly Lys Ser Leu Ser Ile Thr Glu Asn Ile Glu
690 695 700Asn Glu Ala Glu Ala Glu Val Glu Val Glu Ala Glu Ala Glu Val Glu705 710 715 720Val Glu Ala Asp Val Gly Lys Gln Leu Glu Pro Asp Glu Val Lys His
725 730 735Lys Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Met Gln Glu Val Glu
740 745 750Lys(2)SEQ ID NO：9的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：2124个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌881607株
(ix)特征：
(A)名称/关键词：编码序列
(B)位置：1...2121
(D)其它资料：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：ATG TGT AAA CCG AAT TAT GGC GGC ATT GTC TTG TTG CCC TTA CTT TTG 48Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15GCA TCT TGC ATC GGC GGC AAT TTC GGC GTG CAG CCT GTT GTC GAA TCA 96Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
20 25 30ACG CCG ACC GCG TAC CCC GTC ACT TTC AAG TCT AAG GAC GTT CCC ACT 144Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45TCG CCT CCT GCC GGG TCT TCG GTA GAA ACC ACG CCG GTC AAC CGA CCC 192Ser Pro Pro Ala Gly Ser Ser Val Glu Thr Thr Pro Val Asn Arg Pro
50 55 60GCC GTT GGT GCG GCA ATG CGG CTG TTG AGA CGG AAT ATT GCA ACT TCT 240Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Asn Ile Ala Thr Ser65 70 75 80GAT AAG GAT GGC AAT GAT TTT CCA AAT AGC AAA CAA GCA GAA GAA AAG 288Asp Lys Asp Gly Asn Asp Phe Pro Asn Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys
85 90 95CTG TCG TTT AAA GAG GAA GAT ATC CTG TTT TTA TAC GGT TCC AAA AAA 336Leu Ser Phe Lys Glu Glu Asp Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Lys
100 105 110GAT CAA CGT CAG CAG CTT AAA GAT AAA ATT CGT CAA CCA AAT CCT ACG 384Asp Gln Arg Gln Gln Leu Lys Asp Lys Ile Arg Gln Pro Asn Pro Thr
115 120 125GCA AGC ATT ACC ACA TCG GAA AAG AAA AAT AAA AAA TAT GAT TAT AAA 432Ala Ser Ile Thr Thr Ser Glu Lys Lys Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys
130 135 140TTT GTA GAT GCA GGT TAT GTA TAT ACT AAA GAC GGA AAA GAT GAA ATT 480Phe Val Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Gly Lys Asp Glu Ile145 150 155 160GAG TGG ACT TCA AAT TAC AAG CAG TCT ACC AAC CGG TTT GGT TAT GAC 528Glu Trp Thr Ser Asn Tyr Lys Gln Ser Thr Asn Arg Phe Gly Tyr Asp
165 170 175GGT TTT GTA TAT TAT TCC GGA GAA CAT CCT TCG CAA TCT TTA CCG AGC 576Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu His Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser
180 185 190GCG GGA ACG GTG AAA TAT TCC GGC AAC TGG CAA TAT ATG ACC GAT GCC 624Ala Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala
195 200 205ATA CGT CAT CGA ACA GGA AAA GCA GGA GAT CCT AGC GAA GAT TTG GGT 672Ile Arg His Arg Thr Gly Lys Ala Gly Asp Pro Ser Glu Asp Leu Gly
210 215 220TAT ATC GTT TAT TAC GGT CAA AAT GTC GGA GCA ACT TCT TAT GCT GCG 720Tyr Ile Val Tyr Tyr Gly Gln Asn Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala225 230 235 240ACT GCC GAC GAC CGG GAG GGA AAA CAT CCT GCC GAA TAT ACG GTT AAT 768Thr Ala Asp Asp Arg Glu Gly Lys His Pro Ala Glu Tyr Thr Val Asn
245 250 255TTC GAC CAA AAA ACT CTG AAT GGC AAG CTG ATT AAA AAT CAG TAT GTG 816Phe Asp Gln Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val
260 265 270CAA AAG AGA GAT GAT CCT AAA AAA CCA CTG ACC ATT TAC GAC ATT ACT 864Gln Lys Arg Asp Asp Pro Lys Lys Pro Leu Thr Ile Tyr Asp Ile Thr
275 280 285GCA AAA TTG GAC GGC AAC CGC TTT ACC GGC AGT GCC AAA GTT AAC ACA 912Ala Lys Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val Asn Thr
290 295 300GAG GTG AAG ACG AAT CAC GCT GAT AAA GAA TAT TTG TTT TTC CAT ACC 960Glu Val Lys Thr Asn His Ala Asp Lys Glu Tyr Leu Phe Phe His Thr305 310 315 320GAT GCC GAT CAG CGG CTT GAG GGC GGT TTT TTC GGC GAT AAG GGG GAA 1008Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys Gly Glu
325 330 335GAG CTT GCC GGA CGG TTT ATC AGC AAC GAC AAC AGC GTA TTC GGC GTG 1056Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val
340 345 350TTC GCA GGC AAA CAA AAA ACA GAG ACA GCA AAC GCA TCA GAT ACA AAT 1104Phe Ala Gly Lys Gln Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ser Asp Thr Asn
355 360 365CCT GCC CTG CCG TCT GGA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT TCT CTA AAA 1152Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys
370 375 380ATT TCC GTT GAC GAG GCA AGT GGT GAA AAT CCC CGA CCG TTT GAG GTT 1200Ile Ser Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro Phe Glu Val385 390 395 400TCC ACT ATG CCC GAT TTT GGT CAT CCC GAC AAA CTT CTT GTC GAA GGG 1248Ser Thr Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly
405 410 415CGT GAA ATT CCT TTG GTA AAC AAA GAA CAA ACC ATC GAT CTT GCC GAC 1296Arg Glu Ile Pro Leu Val Asn Lys Glu Gln Thr Ile Asp Leu Ala Asp
420 425 430GGC AGG AAA ATG ACC GTC CGT GCT TGT TGC GAC TTT TTG ACC TAT GTG 1344Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Val
435 440 445AAA CTC GGA CGG ATA AAA ACC GAA CGC CCC GCC GTC CAA CCG AAG GCG 1392Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Val Gln Pro Lys Ala
450 455 460CAG GAT GAA GAG GGG GAC GAA GAG GGT GTA GGC GTT GAT AAC GGT AAA 1440Gln Asp Glu Glu Gly Asp Glu Glu Gly Val Gly Val Asp Asn Gly Lys465 470 475 480GAA AGC GAA GAC GAA ATC GGC GAT GAA GAA AGC ACC GGA GAC GAA GTC 1488Glu Ser Glu Asp Glu Ile Gly Asp Glu Glu Ser Thr Gly Asp Glu Val
485 490 495GTA GAA GAT GAA GAC GAA GAT GAA GAC GAA GAA GAA ATC GAA GAA GAA 1536Val Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Ile Glu Glu Glu
500 505 510CCT GAA GAA GAA GCT GAA GAG GAA GAA CCC GAA GAA GAA TTG CCG GCA 1584Pro Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Leu Pro Ala
515 520 525GAA GAA GGC AAC GGC GGT TCA GGC AGC ATC CTG CCC ACT CCG GAA GCC 1632Glu Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly Ser Ile Leu Pro Thr Pro Glu Ala
530 535 540TCT AAA GGC AGG GAC ATC GAC CTT TTC CTG AAA GGT ATC CGC ACG GCG 1680Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala545 550 555 560GAA GCC GAC ATT CCA AAA AAC GGA ACG GCG CAT TAT ACC GGC ACT TGG 1728Glu Ala Asp Ile Pro Lys Asn Gly Thr Ala His Tyr Thr Gly Thr Trp
565 570 575GAA GCG CGT ATC GGC GTA TCG GAT AGT GGT ACG TCC ATT CAA AAG GAT 1776Glu Ala Arg Ile Gly Val Ser Asp Ser Gly Thr Ser Ile Gln Lys Asp
580 585 590AGC TAT GCG AAT CAA GGG GCA AAA GCA GAA TTT ACC GTT GAT TTC GAA 1824Ser Tyr Ala Asn Gln Gly Ala Lys Ala Glu Phe Thr Val Asp Phe Glu
595 600 605GCG AAG ACG GTG TCC GGA ATG CTG ACA GAA AAA AAT GAT ACA ACC CCC 1872Ala Lys Thr Val Ser Gly Met Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr Thr Pro
610 615 620GCT TTT TAT ATT GAA AAA GGT GTG ATT GAC GGT AAC GGT TTC CAC GCT 1920Ala Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala625 630 635 640TTG GCG CAT ACT CGG GAG AAC GGT ATT GAC CTT TCT GGG CAG GGT TCG 1968Leu Ala His Thr Arg Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gly Gln Gly Ser
645 650 655ACT AAC CCG AAG AAC TTC AAA GCC GAC AAT CTT CTT GTA ACA GGC GGC 2016Thr Asn Pro Lys Asn Phe Lys Ala Asp Asn Leu Leu Val Thr Gly Gly
660 665 670TTT TAT GGC CCG CAG GCG GCA GAA TTG GGC GGT AAT ATT ATC GAC AGC 2064Phe Tyr Gly Pro Gln Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser
675 680 685GAC CGG AAA TTC GGT GCG GTA TTT GGG GCG AAA AAA GAT GAC AAG GAG 2112Asp Arg Lys Phe Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asp Lys Glu
690 695 700GCA ACA CGA TGA 2124Ala Thr Arg705(2)SEQ ID NO：10的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：707个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内在
(vi)来源：
(B)菌株：脑膜炎奈瑟氏球菌881607株
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
20 25 30Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45Ser Pro Pro Ala Gly Ser Ser Val Glu Thr Thr Pro Val Asn Arg Pro
50 55 60Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Asn Ile Ala Thr Ser65 70 75 80Asp Lys Asp Gly Asn Asp Phe Pro Asn Ser Lys Gln Ala Glu Glu Lys
85 90 95Leu Ser Phe Lys Glu Glu Asp Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Lys
100 105 110Asp Gln Arg Gln Gln Leu Lys Asp Lys Ile Arg Gln Pro Asn Pro Thr
115 120 125Ala Ser Ile Thr Thr Ser Glu Lys Lys Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys
130 135 140Phe Val Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Gly Lys Asp Glu Ile145 150 155 160Glu Trp Thr Ser Asn Tyr Lys Gln Ser Thr Asn Arg Phe Gly Tyr Asp
165 170 175Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu His Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser
180 185 190Ala Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala
195 200 205Ile Arg His Arg Thr Gly Lys Ala Gly Asp Pro Ser Glu Asp Leu Gly
210 215 220Tyr Ile Val Tyr Tyr Gly Gln Asn Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala225 230 235 240Thr Ala Asp Asp Arg Glu Gly Lys His Pro Ala Glu Tyr Thr Val Asn
245 250 255Phe Asp Gln Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val
260 265 270Gln Lys Arg Asp Asp Pro Lys Lys Pro Leu Thr Ile Tyr Asp Ile Thr
275 280 285Ala Lys Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val Asn Thr
290 295 300Glu Val Lys Thr Asn His Ala Asp Lys Glu Tyr Leu Phe Phe His Thr305 310 315 320Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys Gly Glu
325 330 335Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val
340 345 350Phe Ala Gly Lys Gln Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ser Asp Thr Asn
355 360 365Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys
370 375 380Ile Ser Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro Phe Glu Val385 390 395 400Ser Thr Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly
405 410 415Arg Glu Ile Pro Leu Val Asn Lys Glu Gln Thr Ile Asp Leu Ala Asp
420 425 430Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Val
435 440 445Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Val Gln Pro Lys Ala
450 455 460Gln Asp Glu Glu Gly Asp Glu Glu Gly Val Gly Val Asp Asn Gly Lys465 470 475 480Glu Ser Glu Asp Glu Ile Gly Asp Glu Glu Ser Thr Gly Asp Glu Val
485 490 495Val Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Ile Glu Glu Glu
500 505 510Pro Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Leu Pro Ala
515 520 525Glu Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly Ser Ile Leu Pro Thr Pro Glu Ala
530 535 540Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala545 550 555 560Glu Ala Asp Ile Pro Lys Asn Gly Thr Ala His Tyr Thr Gly Thr Trp
565 570 575Glu Ala Arg Ile Gly Val Ser Asp Ser Gly Thr Ser Ile Gln Lys Asp
580 585 590Ser Tyr Ala Asn Gln Gly Ala Lys Ala Glu Phe Thr Val Asp Phe Glu
595 600 605Ala Lys Thr Val Ser Gly Met Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr Thr Pro
610 615 620Ala Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala625 630 635 640Leu Ala His Thr Arg Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gly Gln Gly Ser
645 650 655Thr Asn Pro Lys Asn Phe Lys Ala Asp Asn Leu Leu Val Thr Gly Gly
660 665 670Phe Tyr Gly Pro Gln Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser
675 680 685Asp Arg Lys Phe Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asp Lys Glu
690 695 700Ala Thr Arg705
Claims (30)
1.一种编码脑膜炎奈瑟氏球菌LbpB的分离多核苷酸。
2.权利要求1中的多核苷酸，它是SEQ ID NO：1(第100～2274位核苷酸)、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：9所示的多核苷酸。
3.一种分离的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中第100～2274位核苷酸之间具有至少65％的同一性。
4.一种分离的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3所示序列之间具有至少65％的同一性。
5.一种分离的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：5所示序列之间具有至少65％的同一性。
6.一种分离的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：7所示序列之间具有至少65％的同一性。
7.一种分离的多核苷酸，其中包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：9所示序列之间具有至少65％的同一性。
8.权利要求3～7中的多核苷酸，其中包含一种重组表达系统，其中所述表达系统能在相容性宿主细胞中制备出LbpB多肽。
9.一种含有权利要求8中的表达系统的宿主细胞。
10.一种用于生产LbpB多肽的方法，其中包括在足以生产所述多肽的条件下培养权利要求9中所述的宿主细胞以及从培养物中回收宿主细胞。
11.一种用于制备用来生产LbpB多肽细胞的方法，其中包括用权利要求8中的表达系统转化或转染宿主细胞，从而宿主细胞在合适的培养条件下生产出LbpB多肽。
12.来自脑膜炎奈瑟氏球菌的LbpB多肽。
13.权利要求12中的多肽，它是SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示多肽。
14.一种分离的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示序列之间在序列全长上具有至少65％的同一性。
15.一种分离的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示序列之间在序列全长上具有至少65％的同一性。
16.一种分离的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：6所示序列之间在序列全长上具有至少65％的同一性。
17.一种分离的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：8所示序列之间在序列全长上具有至少65％的同一性。
18.一种分离的LbpB多肽，其中包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：10所示序列之间在序列全长上具有至少65％的同一性。
19.权利要求14、15、16、17或18中的多肽，其中分别包含SEQID NO：2、4、6、8或10所示的氨基酸序列中19位～C末端的氨基酸。
20.一种针对权利要求14-19中的LbpB多肽具有免疫特异性的抗体。
21.一种用于鉴定能抑制权利要求14-19中LbpB多肽的化合物的方法，其中包括：
(a)让侯选化合物与表达有LbpB多肽的细胞接触；以及
(b)观察结合情况或对功能性应答的抑制，或者将上述细胞与侯选化合物接触的能力同未表达LbpB活性的同一种细胞进行比较。
22.一种疫苗，其中包括有效剂量的权利要求14-19所述多肽以及一种药用载体。
23.根据权利要求22中的疫苗，其中所述的组合物包括至少一种其他脑膜炎奈瑟氏球菌抗原。
24.一种用于对人进行接种抵抗奈瑟氏球菌病的方法，其中包括向所述人施用含有有效剂量权利要求14-19所述多肽的组合物。
25.一种用于对人进行接种抵抗奈瑟氏球菌病的方法，其中包括向所述人施用含有有效剂量权利要求3-7所述多核苷酸的组合物。
26.根据权利要求24中所述的方法，其中所述多肽采用口服、皮下、直肠、气管内、肌内、或鼻腔内给药。
27.根据权利要求25中所述的方法，其中所述多核苷酸采用皮下、气管内、肌内、或鼻腔内给药。
28.一种用于诊断人奈瑟氏球菌病的方法，其中包括下述步骤：用来自待诊断人的生物体液样品与一种抗体温育，该抗体是通过用权利要求14-19所述多肽免疫合适的人或动物制备而成的，其中如有奈瑟氏细菌存在则形成抗原-抗体复合物，然后分析所述体液样品中是否有所述复合物存在。
29.一种用于治疗奈瑟氏球菌病人的治疗性组合物，其中包括至少一种抗权利要求14-19所述多肽的抗体以及一种合适药用载体。
30.一种用于诊断人体中奈瑟氏菌感染的试剂盒，其中包括一种权利要求3-7所述多核苷酸或一种权利要求14-19所述多肽或者一种权利要求20所述抗体。
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