CN101031584A - 脑膜炎球菌蛋白nmb1870的结构域和表位 - Google Patents

Abstract

“NMB1870”是在脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)所有血清群中表达的一种已知的表面蛋白。它具有三个不同的家族。产生的抗特定家族的血清在同一家族中具有杀菌活性，但对表达其他两种家族之一的菌株没有活性，即，存在家族内的交叉保护，却不具备家族间的交叉保护。发明人发现，NMB1870可分成两个结构域，不是所有结构域都是抗原性所需。可得到三个NMB1870家族中各自的抗原结构域并表达成单个多肽链。发明人还发现，NMB1870在位于α螺旋之间的表面环内暴露一些它的表位，将一个家族的环表位置换入另一个家族的环位置能够制备具有多家族抗原性的嵌合NMB1870。这种嵌合NMB1870蛋白可包含不同家族的NMB1870部分。

Description

脑膜炎球菌蛋白NMB1870的结构域和表位

这里所引用的所有文献全文纳入作为参考。

技术领域

本发明涉及免疫领域，尤其涉及针对由诸如脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)(脑膜炎球菌)等奈瑟菌属(Neisseria)的病原菌引起的疾病的免疫。

背景技术

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是一种寄居在约10％人群的上呼吸道中的荚膜包被的革兰阴性菌。虽然可以获得针对血清群A、C、W135和Y的多糖及缀合疫苗，这一方法不能应用于血清群B，因为该荚膜多糖是一种聚唾液酸多聚体，它是人体的自身抗原。为开发针对血清群B的疫苗，使用了包含在外膜囊泡(OMV)中的表面暴露蛋白。这些疫苗引起血清杀菌抗体反应并提供抗疾病的保护，但它们无法诱导交叉菌株保护[1]。因此一些工作者把注意力集中到用于疫苗的特定脑膜炎球菌抗原。

一种此类抗原是‘NMB1870’。这种蛋白质最初披露为菌株MC58的蛋白‘741’[参考文献2中的SEQ ID 2535和2536；这里的SEQ ID 1]，曾经称为‘GNA1870’[参考文献3，以下参考文献4]和‘ORF2086’[5、6]。这种蛋白在所有脑膜炎球菌血清群中均有表达并已在多种脑膜炎球菌菌株中发现。NMB1870序列分成三个家族，且已经发现，针对特定家族产生的免疫血清在同一家族中具有杀菌活性，但对表达其他两种家族之一的菌株没有活性，即，存在家族内的交叉保护，却不具备家族间的交叉保护。

因此，为用NMB1870获得交叉菌株保护，应当使用一种以上的家族。为避免需要表达和纯化单独的蛋白质，已有提议将不同家族表达为杂合蛋白[7]，其在单个多肽链中包括这些家族中的两个或三个。已测试了一些杂交体，得到鼓舞人心的抗-脑膜炎球菌功效。

本发明的一个目的是提供其它的和改进的方法以克服NMB1870所提供保护的家族特异性，以及利用这些方法来提供抗脑膜炎球菌疾病和/或感染，尤其是血清群B的免疫力。

发明内容

发明人发现，NMB1870可分成若干结构域，不是所有结构域都是抗原性所需。可得到三个NMB1870家族中各自的抗原性结构域并表达成单个多肽链。这种方法比将完整的NMB1870序列从末端到末端表达在单个多肽链中要简单。

发明人还发现，NMB1870在位于α螺旋之间的表面环内暴露一些它的表位。将一个家族的环表位置换入另一个家族的环位置能够制造具有多家族抗原性的嵌合NMB1870。

因此，本发明提供了含有不同家族的NMB1870蛋白的嵌合NMB1870蛋白。尽管各NMB1870家族能引起仅对同一NMB1870家族菌株有效的抗体(例如，在小鼠中)，但本发明的嵌合多肽能引起识别一种以上家族的NMB1870蛋白的抗体。

杀菌抗体反应可在小鼠内方便地测得并且是疫苗效能的标准指标[例如，见参考文献4的尾注14]。嵌合蛋白优选能引起抗以下三组菌株中至少两组各自的至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌抗体反应：

(I)MC58，gb185(＝M01-240185)，m4030，m2197，m2937，iss1001，NZ394/98，67/00，93/114，bz198，m1390，nge28，lnp17592，00-241341，f6124，205900，m198/172，bz133，gb149(＝M01-240149)，nm008，nm092，30/00，39/99，72/00，95330，bz169，bz83，cu385，h44/76，m1590，m2934，m2969，m3370，m4215，m4318，n44/89，14847.

(II)961-5945，2996，96217，312294，11327，a22，gb013(＝M01-240013)，e32，m1090，m4287，860800，599，95N477，90-18311，c11，m986，m2671，1000，m1096，m3279，bz232，dk353，m3697，ngh38，L93/4286.

(III)M1239，16889，gb355(＝M01-240355)，m3369，m3813，ngp165.

例如，嵌合多肽能引起有效地抗血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58、961-5945和M1239中两种或多种的杀菌反应。

所述嵌合多肽优选可以引起抗至少50％(例如至少60％、70％、80％、90％、95％或更高)的临床相关脑膜炎球菌血清群B菌株的杀菌抗体反应。该嵌合多肽可以引起抗脑膜炎球菌血清群B菌株和血清群A、C、W135和Y中至少一种(例如1、2、3、4)血清群的菌株的杀菌抗体反应。该嵌合多肽可以引起抗淋病奈瑟球菌(N.gonococcus)和/或灰色奈瑟球菌(N.cinerea)的杀菌抗体反应。该嵌合多肽可引起抗参考文献3的图5所示系统树的三个主要分枝中至少两个分枝的菌株的杀菌抗体反应。

所述嵌合多肽可以引起抗超毒谱系ET-37、ET-5、群落(cluster)A4、谱系3、亚群I、亚群III和亚群IV-1的至少两个(例如2、3、4、5、6、7)中的脑膜炎奈瑟球菌的杀菌抗体反应[8、9]。该嵌合体可以额外诱导抗一种或多种高度侵入性谱系的杀菌抗体反应。

所述嵌合体可以引起抗下列多位点序列型的至少2个(例如2、3、4、5、6、7)序列型中的脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体反应：ST1、ST4、ST5、ST8、ST11、ST32和ST41[10]。该嵌合体也可以引起抗ST44菌株的杀菌抗体反应。

所述组合物不需要诱导抗所述谱系或MLST中每种和全部MenB菌株的杀菌抗体；而是对于由具体超毒谱系或MLST中4种或更多种血清群B脑膜炎球菌菌株构成的任何特定组而言，所述组合物诱导的抗体具有抗该组至少50％(例如60％、70％、80％、90％或更高)成员的杀菌活性。优选的菌株组应包括从至少4个以下国家所分离的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。血清优选具有至少是1024的杀菌滴度(例如2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵、2¹⁶、2¹⁷、2¹⁸或更高，优选至少2¹⁴)，即所述血清经1024倍稀释时能够杀灭至少50％的特定菌株的待测菌，例如参考文献4的尾注14所述。优选的嵌合多肽甚至在将血浆稀释4096倍或更多倍时仍能引起杀菌抗体反应。

NMB1870结构域

SEQ ID NO：1是血清群B菌株MC58的全长家族INMB1870序列：

MNRTAFCCLSLTTALILTA CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK

LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ

IQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG

KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG

IRHIGLAAKQ

经过加工的成熟脂蛋白的N末端用下划线表示(Cys-20)。已将全长序列分成三个结构域(氨基酸1-119、120-183和184-274)：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK

LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYK QSHSALTAFQTEQ

IQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG

KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG

IRHIGLAAKQ

这三个结构域从N末端到C末端被称为‘A’、‘B’和‘C’。从成熟的C末端半胱氨酸开始的结构域‘A’的成熟形式称为‘A_成熟’。

对MC58而言，结构域是：‘A’＝SEQ ID NO：4；‘B’＝SEQ ID NO：5；‘C’＝SEQID NO：6；和‘A_成熟’＝SEQ ID NO：13。许多NMB1870序列是已知的[例如，见参考文献3、6和7]，采用标准方法不难比对。通过这种比对，技术人员能通过与MC58序列中的坐标相比较鉴定出任何给定的NMB1870序列中的结构域‘A’(和‘A_成熟’)、‘B’和‘C’。然而，为便于对照，如下定义结构域：

-给定的NMB1870序列中的结构域‘A’是下述序列片段，当用配对比对算法与SEQ ID NO：1比对时，该片段始于与SEQ ID NO：1的Met-1对准的氨基酸，终于与SEQ ID NO：1的Lys-119对准的氨基酸。

-给定的NMB1870序列中的结构域‘A_成熟’是下述序列片段，当用配对比对算法与SEQ ID NO：1比对时，该片段始于与SEQ ID NO：1的Cys-20对准的氨基酸，终于与SEQ ID NO：1的Lys-119对准的氨基酸。

-给定的NMB1870序列中的结构域‘B’是下述序列片段，当用配对比对算法与SEQ ID NO：1比对时，该片段始于与SEQ ID NO：1的Gln-120对准的氨基酸，终于与SEQ ID NO：1的Gly-183对准的氨基酸。

-给定的NMB1870序列中的结构域‘C’是下述序列片段，当用配对比对算法与SEQ ID NO：1比对时，该片段始于与SEQ ID NO：1的Lys-184对准的氨基酸，终于与SEQ ID NO：1的Gln-274对准的氨基酸。

用来定义结构域的优选配对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman-Wunsch global alignment algorithm)[11]，采用默认参数(例如，空位开放罚分(Gap opening penalty)＝10.0，空位延伸罚分(Gap extension penalty)＝0.5，采用EBLOSUM62评分矩阵)。该算法可用EMBOSS软件包的针工具(needle tool)方便地执行[12]。

NMB1870序列分成三个家族[3、7]，在这里被称为家族I、II和III。家族I-III的原型序列分别为SEQ ID NO：1-3。采用参考文献3的系统发生法和系统树法能方便地确定任何给定NMB1870序列的家族，也可用三种原型NMB1870序列各自的配对比对找到最接近的家族匹配。序列显然落入三个家族，家族I和II之间的序列相同性为74.1％、家族I和III之间为62.8％、家族II和III之间为84.7％，各家族内的序列变异较低(例如，家族I的相同性最小，为91.6％，家族II为93.4％，家族III为93.2％)。不需要系统发生分析而确定序列的家族的快速方法是，如果序列与SEQ IDNO：1的序列相同性至少为85％则将该序列归入家族I，如果它与SEQ ID NO：2的序列相同性至少为85％则归入家族II，如果它与SEQ ID NO：3的序列相同性至少为85％则可归入家族III。

根据参考文献3的图6的比对，NMB1870三个原型家族(SEQ ID NO：1-3)的示例性结构域A、B和C如下：

家族/结构域	A	B	C
				I	SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：5	SEQ ID NO：6
II	SEQ ID NO：7	SEQ ID NO：8	SEQ ID NO：9
				III	SEQ ID NO：10	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：12

用于本发明的优选结构域包括以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：4-12中的一个或多个有至少x％序列相同性，和/或(a)包含SEQ ID NO：4-12中一个或多个的至少y个连续氨基酸序列的片段。

x的值选自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。y的值选自6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50或更高。在含有不同家族的NMB1870序列的多肽中，各家族的x和y的值可以相同或不同。

结构域‘A’序列的长度优选在a₁和a₂(包括端点)个氨基酸之间，其中：a₁选自110、115、120、125或130；a₂选自115、120、125、130或135。

结构域‘B’序列的长度优选在b₁和b₂(包括端点)个氨基酸之间，其中：b1选自55、60、65或70；b₂选自60、65、70或75。

结构域‘C’序列的长度优选在c₁和c₂(包括端点)个氨基酸之间，其中：c₁选自80、85、90、95或100；c₂选自85、90、95、100或105。

NMB1870表面环

位于α螺旋之间的SEQ ID NO：1的的表面环是：(1)氨基酸134-141；(2)氨基酸162-168；(3)氨基酸181-182；(4)氨基酸197；(5)氨基酸219-223；(6)氨基酸234-236；(7)氨基酸261-267：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK

LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ

I QDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFD KLPEGGRATYRGTAFGSDD AGGKLTYTIDFAAKQG NG

KIEHLKSPELNVDLAAADIK PDGKRHAVISGSVLY NQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVK TVNG

IRHIGLAAKQ

通过将SEQ ID NO：1与任何其它NMB1870序列作比对，技术人员可以鉴定该序列中环(1)-(7)的位置。然而，为便于对照，这里将环的坐标定义为NMB1870序列中的氨基酸链，当采用配对比对算法与SEQ ID NO：1作比对时，它始于与上文在SEQID NO：1中定义的环的第一氨基酸残基对准的氨基酸，终上文在SEQ ID NO：1中定义的环的最后一个氨基酸。

嵌合蛋白

异源结构域B和C的连接

本发明提供一种嵌合多肽，其包含：(a)第一NMB1870家族的结构域‘B’序列；和(b)第二NMB1870家族的结构域‘C’序列。上述第一和第二家族各选自I、II或III，但彼此不同。该嵌合多肽优选地不含第一NMB1870家族的结构域‘C’序列和/或不含第二NMB1870家族的结构域‘B’序列。该嵌合多肽优选长度短于495个氨基酸。

优选的多肽包含氨基酸序列-X₁-B-X₂-C-X₃-，其中：-X₁-任选的氨基酸序列；-X₂-是任选的氨基酸序列；-X₃-是任选的氨基酸序列；-B-是第一家族NMB1870序列的结构域B氨基酸序列；和-C-是第二家族NMB1870序列的结构域C氨基酸序列。-B-结构域可与-C-结构域的C末端(相连)，但优选与-C-结构域的N末端(相连)。

优选：(1)第一NMB1870家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：11有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：11的至少y个连续氨基酸序列的片段；和(2)第二NMB1870家族的结构域C序列(i)与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12的至少y个连续氨基酸序列的片段；前提是，为(1)和(2)选择的两个SEQ ID NO不是：(i)5和6，(2)8和9的组合，或(3)11和12的组合。因此，(1)和(2)的合适SEQ ID NO组合是5和9、5和12、8和6、8和12、11和6以及11和9。

异源BC结构域的连接

本发明提供一种嵌合多肽，其包含：(a)NMB1870第一家族的结构域‘B’序列和结构域‘C’序列；和(b)NMB1870第二家族的结构域‘B’序列和结构域‘C’序列。该嵌合多肽优选不含第一家族的结构域‘A’序列和/或不含第二家族的结构域‘A’序列。第一和第二家族各选自I、II或III，但彼此不同。

第一家族的结构域‘B’和‘C’序列优选毗邻(‘BC结构域)。类似地，第二家族的结构域‘B’和‘C’序列优选毗邻。

优选的多肽包含氨基酸序列-X₁-B_j-X₂-C_j-X₃-B_k-X₄-C_k-X₅-，其中：-X₁-是任选的氨基酸序列；-X₂-是任选的氨基酸序列；-X₃-是任选的氨基酸序列；-X₄-是任选的氨基酸序列；-X₅-是任选的氨基酸序列；-B_j-是第一NMB1870家族的结构域‘B’氨基酸序列；-C_j-是第一家族的结构域‘C’氨基酸序列；-B_k-是第二NMB1870家族的结构域‘B’氨基酸序列；和-C_k-是第二家族的结构域‘C’氨基酸序列。序列-X₂-和-X₄-优选不存在，例如得到-X₁-B_j-C_j-X₃-B_k-C_k-X₅-。

优选在-B_k-和-C_k-结构域的N末端具有-B_j-和-C_j-结构域。

优选：(1)第一家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：J1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：J1的至少y个连续氨基酸序列的片段；(2)第一家族的结构域C序列(i)与SEQ ID NO：J2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：J2的至少y个连续氨基酸序列的片段；(3)第二家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：K1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：K1的至少y个连续氨基酸序列的片段；和(4)第二家族的结构域C序列(i)与SEQ ID NO：K2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：K2的至少y个连续氨基酸序列的片段，其中，J1、J2、K1和K2选自以下：

J1	J2	K1	K2
				5	6	8	9
5	6	11	12
				8	9	5	6
8	9	11	12
				11	12	5	6
11	12	8	9

(a)(b)(c)(d)(e)(f)

因此，上述多肽包含三个NMB1870家族中至少两个的BC结构域。更优选该多肽包含三个家族中各自的BC结构域。因此，本发明提供了一种嵌合多肽，其包含：(a)第一NMB1870家族的结构域‘B’序列和结构域‘C’序列；(b)第二NMB1870家族的结构域‘B’序列和结构域‘C’序列；和(c)第三NMB1870家族的结构域‘B’序列和结构域‘C’序列。该嵌合多肽优选地不含第一家族的结构域‘A’序列和/或不含第二家族的结构域‘A’序列和/或不含第三家族的结构域‘A’序列。

第一家族的结构域‘B’和‘C’序列优选毗邻。类似地，第二家族的结构域‘B’和‘C’序列优选毗邻。类似地，第三家族的结构域‘B’和‘C’序列优选毗邻。

优选的多肽包含氨基酸序列-X₁-B_j-X₂-C_j-X₃-B_k-X₄-C_k-X₅-B_L-X₆-C_L-X₇-，其中：-X₁-是可选氨基酸序列；-X₂-是任选的氨基酸序列；-X₃-是任选的氨基酸序列；-X₄-是任选的氨基酸序列；-X₅-是任选的氨基酸序列；-X₆-是任选的氨基酸序列；-X₇-是任选的氨基酸序列；-B_j-是第一NMB1870家族的结构域B氨基酸序列；-C_j-是第一家族的结构域C氨基酸序列；-B_k-是第二NMB1870家族的结构域B氨基酸序列；-C_k-是第二家族的结构域C氨基酸序列；-B_L-是第三NMB 1870家族的结构域B氨基酸序列；和-C_L-是第三家族的结构域C氨基酸序列。序列-X₂-、-X₄-和-X₆-优选不存在，即得到-X₁-B_j-C_j-X₃-B_k-C_k-X₅-B₁-C₁-X₇-。

优选：(1)第一家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：J1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：J1的至少y个连续氨基酸序列的片段；(2)第一家族的结构域C序列(i)与SEQ ID NO：J2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：J2的至少y个连续氨基酸序列的片段；(3)第二家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：K1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：K1的至少y个连续氨基酸序列的片段；(4)第二家族的结构域C序列(i)与SEQ ID NO：K2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：K2的至少y个连续氨基酸序列的片段；(5)第三家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：L1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：L1的至少y个连续氨基酸序列的片段；和(6)第三家族的结构域C序列(i)与SEQ ID NO：L2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：L2的至少y个连续氨基酸序列的片段，其中，J1、J2、K1、K2、L1和L2选自以下：

J1	J2	K1	K2	L1	L2
						5	6	8	9	11	12
5	6	11	12	8	9
						8	9	5	6	11	12
8	9	11	12	5	6
						11	12	5	6	8	9
11	12	8	9	5	6

(a)(b)(c)(d)(e)(f)

异源AB结构域的连接

本发明提供一种嵌合多肽，其包含：(a)NMB1870第一家族的结构域‘A’序列和结构域‘B’序列；和(b)NMB1870第二家族的结构域‘A’序列和结构域‘B’序列。该嵌合多肽优选不含第一家族的结构域‘C’序列和/或不含第二家族的结构域‘C’序列。第一和第二家族各选自I、II或III，但彼此不同。

第一家族的结构域‘A’和‘B’序列优选毗邻。类似地，第二家族的结构域‘A’和‘B’序列优选毗邻。

优选的多肽包含氨基酸序列-X₁-A_j-X₂-B_j-X₃-A_k-X₄-B_k-X₅-，其中：-X₁-是任选的氨基酸序列；-X₂-是任选的氨基酸序列；-X₃-是任选的氨基酸序列；-X₄-是任选的氨基酸序列；-X₅-是任选的氨基酸序列；-A_j-是第一NMB1870家族的结构域A氨基酸序列；-B_j-是第一家族的结构域B氨基酸序列；-A_k-是第二NMB1870家族的结构域A氨基酸序列；和-B_k-是第二家族的结构域B氨基酸序列。序列-X₂-和-X₄-优选不存在，即得到-X₁-A_j-B_j-X₃-A_k-B_k-X₅-。

优选在-A_k-和-B_k-结构域的N末端具有-A_j-和-B_j-结构域。

优选：(1)第一家族的结构域A序列(i)与SEQ ID NO：J1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：J1的至少y个连续氨基酸序列的片段；(2)第一家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：J2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：J2的至少y个连续氨基酸序列的片段；(3)第二家族的结构域A序列(i)与SEQ ID NO：K1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：K1的至少y个连续氨基酸序列的片段；和(4)第二家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：K2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：K2的至少y个连续氨基酸序列的片段，其中，J1、J2、K1和K2选自以下：

J1	J2	K1	K2
				4	5	7	8
4	5	10	11
				7	8	4	5
7	8	10	11
				10	11	4	5
10	11	7	8

(a)(b)(c)(d)(e)(f)

因此，上述多肽包含三个NMB1870家族中至少两个的AB结构域。更优选该多肽包含三个家族中各自的AB结构域。因此，本发明提供了一种嵌合多肽，其包含：(a)NMB1870第一家族的结构域‘A’序列和结构域‘B’序列；(b)NMB1870第二家族的结构域‘A’序列和结构域‘B’序列；和(c)NMB1870第三家族的结构域‘A’序列和结构域‘B’序列。该嵌合多肽优选不含第一家族的结构域‘C’序列和/或不含第二家族的结构域‘C’序列和/或不含第三家族的结构域‘C’序列。

第一家族的结构域‘A’和‘B’序列优选毗邻。类似地，第二家族的结构域‘A’和‘B’序列优选毗邻。类似地，第三家族的结构域‘A’和‘B’序列优选毗邻。

优选的多肽包含氨基酸序列-X₁-A_j-X₂-B_j-X₃-A_k-X₄-B_k-X₅-A_L-X₆-B_L-X₇-，其中：-X₁-是可选氨基酸序列；-X₂-是任选的氨基酸序列；-X₃-是任选的氨基酸序列；-X₄-是任选的氨基酸序列；-X₅-是任选的氨基酸序列；-X₆-是任选的氨基酸序列；-X₇-是任选的氨基酸序列；-A_j-是第一NMB1870家族的结构域A氨基酸序列；-B_j-是第一家族的结构域B氨基酸序列；-A_k-是第二NMB1870家族的结构域A氨基酸序列；-B_k-是第二家族的结构域B氨基酸序列；-A₁-是第三NMB1870家族的结构域A氨基酸序列；和-B₁-是第三家族的结构域B氨基酸序列。序列-X₂-、-X₄-和-X₆-优选不存在，即得到-X₁-A_j-B_j-X₃-A_k-B_k-X₅-A₁-B₁-X₇-。

优选：(1)第一家族的结构域A序列(i)与SEQ ID NO：J1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：J1的至少y个连续氨基酸序列的片段；(2)第一家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：J2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：J2的至少y个连续氨基酸序列的片段；(3)第二家族的结构域A序列(i)与SEQ ID NO：K1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：K1的至少y个连续氨基酸序列的片段；(4)第二家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：K2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：K2的至少y个连续氨基酸序列的片段；(5)第三家族的结构域A序列(i)与SEQ ID NO：L1有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：L1的至少y个连续氨基酸序列的片段；和(6)第三家族的结构域B序列(i)与SEQ ID NO：L2有至少x％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：L2的至少y个连续氨基酸序列的片段，其中，J1、J2、K1、K2、L1和L2选自以下：

J1	J2	K1	K2	L1	L2
						4	5	7	8	10	11
4	5	10	11	7	8
						7	8	4	5	10	11
7	8	10	11	4	5
						10	11	4	5	7	8
10	11	7	8	4	5

(a)(b)(c)(d)(c)(f)

任选的Xn序列

本发明的多肽可包括连接有NMB1870-衍生序列的序列和/或可包括非衍生自NMB1870的N-和C-末端序列。这种序列在这里称为“X_n”(X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇等)。各X_n可存在或不存在，且各序列可以相同或不同。

接头氨基酸序列通常较短(例如，20个或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括易于克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(即Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)、以及组氨酸标签(即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其他适当的连接氨基酸序列对于精通本领域的人员来说显而易见。一种有用的接头是含由BamHI限制性位点形成的Gly-Ser二肽(从而有助于克隆和操作)的GSGGGG(SEQ ID NO：17)，另一种有用的接头是含由HindIII限制性位点形成的Gly-Lys二肽的GKGGGG(SEQ ID NO：45)。限制性位点之后是Gly₄四肽(SEQ ID NO：18)，这是一种典型的聚甘氨酸接头。其它有用的接头是SEQ ID NO：19和20。

任选的N-末端氨基酸序列通常较短(例如，40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括引导多肽运输的前导序列，或易于克隆或纯化的短肽序列(例如，组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其他适当的N-末端氨基酸序列对于精通本领域的人员来说显而易见。如果序列缺乏其自身N末端甲硫氨酸，则有用的N-末端序列在翻译的蛋白质中提供这样一个甲硫氨酸残基(例如，单个Met残基)。

任选的C-末端氨基酸序列通常较短(例如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括引导蛋白质运输的序列，或易于克隆或纯化的短肽序列(例如，包含组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)，或提高多肽稳定性的序列。其他适当的C-末端氨基酸序列对于精通本领域的人员来说显而易见。

构建嵌合NMB1870序列

本发明提供了制造嵌合NMB1870氨基酸序列的方法，该方法包括以下步骤：(a)将第一NMB 1870氨基酸序列与第二NMB 1870氨基酸序列作比对得到一对比对的序列；(b)选择第一氨基酸序列中始于所述第一氨基酸序列的氨基酸a₁终于所述第一氨基酸序列的氨基酸b₁的部分；(c)选择第二氨基酸序列中始于所述第二氨基酸序列的氨基酸a₂终于所述第二氨基酸序列的氨基酸b₂的部分，其中，残基a₁和a₂以及b₁和b2在该对比对的序列中是对准的；和(d)用第二氨基酸序列的所述部分取代第一氨基酸序列的所述部分，从而得到嵌合NMB 1870氨基酸序列。第一和第二序列不同，优选来自不同的NMB1870家族。

对于同一比对步骤(a)，步骤(b)-(d)可进行多次，即可进行多次从第二序列到第一序列的取代。类似地，步骤(a)-(d)可进行多次，在随后的步骤(a)中可任选使用不同的“第二氨基酸序列”，即可将第一序列与第二序列比对并用于取代过程，然后与不同的第二序列比对并用于进一步的取代，依此类推。

因此，本发明提供了制造嵌合NMB1870氨基酸序列的方法，该方法包括以下步骤：(a)将第一NMB1870氨基酸序列与第二NMB1870氨基酸序列作比对得到第一对比对的序列；(b)选择第一氨基酸序列中始于所述第一氨基酸序列的氨基酸a₁终于所述第一氨基酸序列的氨基酸b₁的部分；(c)选择第二氨基酸序列中始于所述第二氨基酸序列的氨基酸a₂终于所述第二氨基酸序列的氨基酸b₂的部分，其中，残基a₁和a₂以及b₁和b₂在第一对比对的序列中是对准的；(d)用第二氨基酸序列的所述部分取代第一氨基酸序列的所述部分，从而提供中间体-嵌合NMB 1870氨基酸序列；(e)将第一NMB1870氨基酸序列，或中间体嵌合序列，与第三NMB1870氨基酸序列作比对得到第二对比对的序列；(f)选择中间体嵌合序列中始于所述中间体嵌合序列的氨基酸a₃终于所述中间体嵌合序列的氨基酸b₃的部分；(g)选择第三氨基酸序列中始于所述第三氨基酸序列的氨基酸a₄终于所述第三氨基酸序列的氨基酸b₄的部分，其中，残基a₃和a₄以及b₃和b₄在第二对比对的序列中是对准的；和(h)用第三氨基酸序列的所述部分取代中间体嵌合序列的所述部分，从而提供嵌合NMB1870氨基酸序列。

选择的部分优选至少有c个氨基酸长，其中，c是3、4、5、6、7、8、9或更大。

取代的序列优选是表面环序列。本发明包括包含最多10次取代(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)或更多次取代的情况。

本发明还提供了含有嵌合NMB 1870氨基酸序列的多肽，其中，所述嵌合NMB1870氨基酸序列可用上述方法获得。

本发明的方法还可包括制造含有所述嵌合NMB1870氨基酸序列的多肽的步骤，例如，通过重组蛋白质表达。

本发明提供了含有氨基酸序列F₁-X₁-F₂的多肽，其中：F₁是第一NMB1870氨基酸序列的N末端片段；F₂是第二NMB1870氨基酸序列的C末端片段；-X₁-是任选的氨基酸序列；所述第一和第二NMB 1870氨基酸序列来自不同NMB1870家族；片段F₁和F₂都至少有10个氨基酸长；且片段F₁和F₂的组合长度至少为ff个氨基酸。ff的值为200、210、220、230、240、250或260。-X₁-序列优选不存在，从而得到序列F₁-F₂，这是不同家族中NMB1870蛋白的N-和C-末端的融合。本发明还提供了所述多肽的至少g个连续氨基酸的片段，前提是所述片段包含F₁和F₂各自的至少一个氨基酸，即该片段桥连在F₁和F₂之间。g的值为7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、75、100或更大。

本发明提供了含有氨基酸序列(F^m-X^m)_n的多肽，其中：各F^m是第m个NMB1870氨基酸序列的片段；各-X^m-是任选的氨基酸序列；各片段F_m至少有g个氨基酸长；F_m的n个例子包括三个NMB1870家族I、II和III中至少两个的片段。g的值如上定义。n的值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。

本发明提供了含有至少下述片段之二的多肽：(i)家族I NMB1870序列的不超过240个氨基酸的片段，其中，该片段包括所述家族I NMB1870序列的表位；(ii)家族II NMB1870序列的不超过240个氨基酸的片段，其中，该片段包括所述家族IINMB1870序列的表位；和(iii)家族III NMB1870序列的不超过240个氨基酸的片段，其中，该片段包括所述家族III NMB1870序列的表位。

环取代

发明人已经发现，NMB1870在位于α螺旋之间的表面环内暴露一些它的表位。将一个家族的环表位置换入另一个家族的环位置能够制造具有多家族抗原性的嵌合NMB1870。

因此，本发明提供了含有NMB1870第一家族的修饰的氨基酸序列的多肽，其中，所述修饰的序列包含至少一个(例如，1、2、3、4、5、6或7)取代了第一家族的表面环序列的NMB1870第二家族的表面环序列。

本发明还提供了含有以下氨基酸序列的多肽：

          -B₁-L₁-B₂-L₂-B₃-L₃-B₄-L₄-B₅-L₅-B₆-L₆-B₇-L₇-B₈-

其中：(a)所述B₁、B₂、B₃、B₄、B₅、B₆、B₇和B₈各自为：(i)SEQ ID NO：M的片段；(ii)与所述(i)的片段具有至少m％序列相同性的氨基酸序列和/或包含所述(i)的片段的至少mm个毗邻氨基酸的片段；(b)所述L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆和L₇各自为：(iii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的片段；(iv)与所述(iii)的片段具有至少n％序列相同性的氨基酸序列和/或包含所述(iii)的片段的至少nn个毗邻氨基酸的片段，前提是，所述L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆和L₇之的至少一个不是SEQID NO：M的片段。

因此，该多肽包含分为8个部分的基础主链序列和7个环，每个环在主链序列的各毗邻部分之间，但至少一个环序列来自与基础主链序列不同的NMB 1870家族的NMB 1870序列。优选使用一种以上不同NMB 1870序列的表面环，并且可能将这些环插入单个主链序列。

M的值选自1、2或3，且B₁、B₂、B₃、B₄、B₅、B₆、B₇和B₈以及L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆和L₇的定义视M的值而不同。

“(i)SEQ ID NO：M的片段”的含义如下：

	SEQ ID NO：M内的氨基酸坐标
									M	B1	B2	B3	B4	B5	B6	B7	B8
1	1-133	142-161	169-180	183-196	198-218	224-233	237-260	268-274
									2	1-133	142-161	168-179	182-195	197-217	223-232	236-259	267-273
3	1-141	150-169	176-187	190-203	205-225	231-240	244-267	275-281

类似地，“(iii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的片段”的定义如下：

	SEQ ID NO：1、2或3内的氨基酸坐标
								SEQ	L1	L2	L3	L4	L5	L6	L7
1	134-141	162-168	181-182	197	219-223	234-236	261-267
								2	134-141	162-167	180-181	196	218-222	233-235	260-266
3	142-149	170-175	188-189	204	226-230	241-243	268-274

例如，本发明提供了包含以下氨基酸序列的多肽：

             -B₁-L₁-B₂-L₂-B₃-L₃-B₄-L₄-B₅-L₅-B₆-L₆-B₇-L₇-B₈-

其中：B₁是SEQ ID NO：1的氨基酸1-139，或与所述氨基酸1-133有至少m％序列相同性的氨基酸序列和/或包含所述氨基酸1-133的至少mm个毗邻氨基酸的片段；B2是SEQ ID NO：1的氨基酸142-161，或与所述氨基酸142-161有至少m％序列相同性的氨基酸序列和/或包含所述氨基酸142-161的至少mm个连续氨基酸的片段，…，B7是SEQ ID NO：1的氨基酸268-274，或与所述氨基酸268-274有至少m％序列相同性的氨基酸序列和/或包含所述氨基酸268-274的至少mm个连续氨基酸的片段；L₁是SEQ ID NO：2的氨基酸134-141，或与所述氨基酸134-141有至少n％序列相同性的氨基酸序列和/或包含所述氨基酸134-141的至少nn个毗邻氨基酸的片段；L₂是SEQ ID NO：2的氨基酸162-167，或与所述氨基酸162-167有至少n％序列相同性的氨基酸序列和/或包含所述氨基酸162-167的至少nn个毗邻氨基酸的片段，…，L₇是SEQ ID NO：3的氨基酸268-274，或与所述氨基酸268-274有至少n％序列相同性的氨基酸序列和/或包含所述氨基酸268-274的至少nn个毗邻氨基酸的片段；等等。

m的值选自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更大。n的值选自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更大。mm的值选自6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、45、50、60、70、75、100或更大。nn的值选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。nn的值优选小于20。

本发明还提供了包含如上定义的以下嵌合氨基酸序列：

       -B₁-L₁-B₂-L₂-B₃-L₃-B₄-L₄-B₅-L₅-B₆-L₆-B₇-L₇-B₈-，还包括，到，NMB1870序列(可以在所述嵌合序列的N-末端或C-末端)的多肽，其中所述NMB1870序列与SEQ ID NO：M来自相同NMB1870家族。因此，该多肽同时包含：(i)特定家族的NMB 1870和(ii)来自同一家族，但其至少一个表面环被不同的NMB1870家族取代的NMB1870。

本发明提供包含与SEQ ID NO：Q具有q％的总体序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中：q的值至少为r；所述氨基酸序列与SEQ ID NO：Q的序列相同性在SEQ IDNO：Q的主链区域大于q％；所述氨基酸序列与SEQ ID NO：Q的序列相同性在SEQID NO：Q的环区域小于q％。r的值选自80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5。

Q的值为1、2或3，环区域和主链区域的边界根据上表选择(L₁到L₇为环，B₁到B₈为主链)。

当Q是1时，环区域的氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的相应环区域的序列相同性可以大于q％。当Q是2时，环区域的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的相应环区域的序列相同性可以大于q％。当Q是3时，环区域的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的相应环区域的序列相同性可以大于q％。

NMB1870片段

本发明提供了包含家族I NMB1870序列的片段的多肽，前提是：(a)所述片段包含氨基酸Arg-223，(b)所述多肽既不包含(i)完整的家族I NMB1870氨基酸序列也不包含(ii)完整的家族I？G-NMB 1870氨基酸序列。氨基酸残基的编号遵循这里SEQ IDNO：1的编号。该片段可包含完整的结构域B和C。

如果所述多肽包含所述片段N末端的氨基酸，则在所述多肽中紧邻所述片段N末端的所述氨基酸优选不同于SEQ ID NO：1中紧邻所述片段N末端发现的氨基酸。

类似地，如果所述多肽包含所述片段C末端的氨基酸，则在所述多肽中紧邻所述片段C末端的所述氨基酸优选不同于SEQ ID NO：1中紧邻所述片段C末端发现的氨基酸。

本发明还提供了含有氨基酸序列-Z₁-Arg-Z₂-的多肽，其中：

(a)-Z₁-是由y₁个氨基酸构成的氨基酸序列，其中，y₁的值至少是10(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220或更大)。

(b)-Z₂-是由y₂个氨基酸构成的氨基酸序列，其中，y₂的值至少是10(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50或更大)。

(c)-Z₁-与直接位于SEQ ID NO：1的氨基酸Arg-223上游的y₁个氨基酸有至少x％序列相同性；和

(d)-Z₂-与直接位于SEQ ID NO：1的氨基酸Arg-223下游的y₂个氨基酸有至少x％序列相同性。

y₁的值优选小于220。y₂的值优选小于50。

如果所述多肽包含-Z₁-上游的氨基酸序列，则所述序列优选不同于直接在y₁个氨基酸上游发现的序列，所述y₁个氨基酸直接位于SEQ ID NO：1的氨基酸Arg-223上游。

如果所述多肽包含-Z₂-下游的氨基酸序列，则所述序列优选不同于直接在y₂个氨基酸下游发现的序列，所述y₂个氨基酸直接位于SEQ ID NO：1的氨基酸Arg-223下游。

包含这些片段的本发明多肽优选不含任何已知多肽，例如，参考文献2、3、6、7中公开的多肽，等等。

本发明还提供了含有第一多肽和第二多肽的混合物，其中，该第一多肽是NMB1870结构域B的片段，而该第二多肽是NMB1870结构域C的片段，其中，第一和第二多肽可缔合(associate)产生单独在该第一或第二多肽上未发现的表位。对于任何给定的NMB1870，用这里提供的信息可直接鉴定结构域B和C，同时，将各结构域截短和/或分离(dissection)然后再混合可用来观察多肽是否缔合。用来确定构象表位的缔合和构造的方便测定方法涉及使用能识别NMB1870的结构域BC片段但不单独识别结构域B或C的单克隆抗体。采用标准筛选方法从多克隆的小鼠抗-NMB 1870抗血清中分离这种抗体。

多肽

本发明提供了上述多肽。

还提供了含有选自SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、23、24、43、44、52、53、61、62、63、64和65的氨基酸序列的多肽。还提供了含有以下氨基酸序列的多肽：(a)与选自SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、23、24、43、44、52、53、61、62、63、64和65的氨基酸序列有序列相同性和/或(b)含有选自SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、23、24、43、44、52、53、61、62、63、64和65的氨基酸序列的片段。序列相同性程度优选大于50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更大)。该片段优选含有起始序列的7个或更多个连续氨基酸(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、45、50、55、60、65、70、75、70、85、90、95、100或更多)。

NMB1870天然是脑膜炎奈瑟球菌的脂蛋白。还发现当其在大肠杆菌(E.coli)中表达时被脂化(lipidated)。优选的本发明多肽具有C末端半胱氨酸残基，该残基可被脂化，例如含有棕榈酰基。

本发明优选多肽的一个特征是在对宿主动物给药后能诱导杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。

本发明多肽可以通过多种方法制备，例如化学合成(至少是部分)、使用蛋白酶消化更长多肽、从RNA翻译、从细胞培养物中纯化(例如从重组表达或从脑膜炎奈瑟球菌培养物中纯化)等等。大肠杆菌宿主中的异源表达是优选的表达途径(例如菌株DH5α、BL21(DE₃)、BLR等等)。

本发明多肽可以与固体支持物连接或固定化。

本发明多肽可以包含可检测的标记，例如放射性标记、荧光标记或生物素标记。这在免疫测定技术中尤其有用。

多肽可以采取多种形式(例如天然的、融合的、糖基化的、非糖基化的、脂化的、二硫键等等)。

多肽优选制备成基本上纯的或基本上分离的形式(即与其他奈瑟菌或宿主细胞多肽基本上分开)或基本上分离的形式。通常，所述多肽处于非天然环境中，例如，它们与其天然环境分离。在某些实施方式中，所述多肽存在于与对照相比富集了该多肽的组合物中。同样，本发明提供了纯化的多肽，其中纯化是指该多肽存在于基本上不含其他表达的多肽的组合物中，其中基本上不含是指小于90％、通常小于60％、更通常小于50％的该组合物由其他表达的多肽构成。

术语“多肽”是指任何长度的氨基酸多聚体。该多聚体可以是线性的或是分枝的，它可以含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸所中断。该术语也包括天然或通过干涉修饰的氨基酸多聚体；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰(诸如与标记成分缀合)。该定义还包括，例如，包含某氨基酸的一个或多个类似物(包括，例如非天然氨基酸等等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。多肽可以存在单链或相连的链的形式。

核酸

本发明提供了编码如上定义的本发明多肽的核酸。本发明也提供了包含以下成分的核酸：(a)所述核酸的至少n个连续核苷酸的片段，其中n不小于10(例如12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或更多)；和/或(b)与所述核酸具有至少50％(例如60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列相同性的序列。

此外，本发明提供了能与编码本发明多肽的核酸优选在“高度严格”条件下(例如65℃在0.1×SSC、0.5％SDS溶液中)杂交的核酸。

本发明核酸可以在杂交反应(例如Northern或Southern印迹、或在核酸微阵列或“基因芯片”中)和扩增反应(例如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等等)以及其他核酸技术中使用。

本发明核酸可以用多种方法制备，例如完全或部分化学合成(例如，DNA的亚磷酰胺合成)、使用核酸酶(例如限制性酶)消化更长的聚核苷酸、连接较短的核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)，来自基因组或cDNA文库等等。

本发明核酸可采取多种形式，例如单链、双链、载体、引物、探针、标记的、未标记的等等。

本发明核酸优选是分离的或基本上分离的形式。

本发明包括含与上述述序列互补的序列(例如用于反义或检测，或用作引物)的核酸。

术语“核酸”包括DNA和RNA以及它们的类似物，诸如那些含修饰骨架的类似物和肽核酸(PNA)等等。

本发明核酸可以用例如放射性或荧光标记物标记。这对于在核酸检测技术中使用所述核酸尤其有用，例如当所述核酸在诸如PCR、LCR、TMA、NASBA等等技术中用作引物或探针时。

本发明也提供了含本发明核酸序列的载体(例如，克隆或表达载体，诸如那些适于核酸免疫的载体)和用这种载体转化的宿主细胞。

免疫

本发明的多肽优选免疫原性组合物，本发明提供一种用作药物的本发明免疫原性组合物。

本发明也提供了一种在哺乳动物产生抗体反应的方法，该方法包括将本发明免疫原性组合物给予哺乳动物。抗体反应优选保护性和/或杀菌抗体反应。

本发明也提供了一种保护哺乳动物免受奈瑟菌(例如脑膜炎球菌)感染的方法，该方法包括将本发明免疫原性组合物给予哺乳动物。

本发明提供了用作药物(例如作为免疫原性组合物或疫苗)或用作诊断试剂的本发明嵌合多肽。还提供了本发明核酸、多肽或抗体在制造预防哺乳动物的奈瑟菌(例如，脑膜炎球菌)感染的药物中的应用。

上述哺乳动物优选人。人可以是成人或优选儿童。当所述疫苗用于预防用途时，所述人优选儿童(例如，学步儿童或婴儿)；当所述疫苗用于治疗用途时，所述人优选成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，例如来评价安全性、剂量、免疫原性等。

所述的应用和方法在预防/治疗包括但不限于脑膜炎(尤其是细菌性脑膜炎)和菌血症的疾病中尤其有用。

可通过在本发明组合物给药后监测奈瑟菌感染来检验治疗效果。可通过在组合物给药后监测抗NMB1870的免疫反应检检预防效果。本发明组合物的免疫原性可以通过将其给予待检验对象(例如12-16月大的儿童或动物模型[13])给药，随后测定标准参数，包括血清杀菌抗体(SBA)和ELISA滴度(GMT)进行测定。这些免疫反应通常应在组合物给药约4周后测定，并与该组合物给药前测定的值进行比较。优选SBA提高至少4倍或8倍。在给予多剂组合物的情况下，可以进行多次给药后测定。

本发明优选的组合物在患者体内赋予的抗体滴度优于每种抗原性成分的可接受百分比人对象的血清保护标准。具有相关抗体滴度(高于该滴度则宿主被认为对该抗原是血清转化的)的抗原是熟知的，这种滴度由诸如WHO等组织发布。优选大于80％的对象的统计学显著样本是血清转化的，更优选大于90％，还更优选大于93％，最优选96-100％。

本发明组合物通常应直接给予患者。直接递送可以经胃肠外注射实现(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙注射)，或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜给药实现。优选大腿或上臂肌内给药。注射可以通过注射针(例如皮下注射用针)，但或者可使用无针注射。典型的肌内注射剂量是0.5ml。

本发明可以用于引起全身和/或粘膜免疫力。

剂量疗法可以是单一剂量进度或多剂量进度。多剂量可以用于初级免疫进度和/或加强免疫进度。初级剂量进度之后可以有加强剂量进度。致敏剂量之间(例如4-16周之间)以及致敏和加强之间的适当时间安排可以按常规确定。

本发明免疫原性组合物通常应包含药学上可接受的载体，该载体可以是任何本身不诱导产生对接受该组合物的患者有害的抗体的物质，并且可以给予而没有不适的毒性。适当的载体可以是诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物以及灭活的病毒颗粒等大的、缓慢代谢的大分子。这种载体是本领域普通技术人员熟知的。药学上可接受的载体可以包括诸如水、生理盐水、甘油和乙醇等液体。在这种运载体中也可存在诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等辅助物质。脂质体是适当的载体。药物载体的全面论述参见参考文献14。

奈瑟菌感染影响身体的各个部位，因此本发明组合物可以各种形式制备。例如，该组合物可以制备成可注射的(液体溶液或悬浮液)。也可制备成适于在注射前溶解或悬浮在液体运载体中的固体形式。该组合物可以制备为局部给药，例如乳膏、油膏或粉末的形式。该组合物可以制备为口服给药，例如药片、胶囊或糖浆(任选进行调味)的形式。该组合物可以制备为肺部给药，例如使用细微粉末或喷雾的吸入器的形式。该组合物可以制备为栓剂或阴道栓剂。该组合物可以为鼻、耳或眼睛给药而制备成，例如滴剂。

组合物优选无菌。优选无热原。优选缓冲的，例如pH 6和pH 8之间，通常在pH7附近。在组合物包含氢氧化铝的情况下，优选使用组氨酸缓冲液[15]。本发明组合物对人可以是等渗的。

免疫原性组合物包含免疫学有效量的免疫原以及任何其他具体成分(如果需要)。“免疫学有效量”是指，给予个体该量(单一剂量或作为系列剂量的一部分)对于治疗或预防是有效的。该用量取决于所治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗的个体的分类学分组(例如非人灵长类、灵长类等等)、该个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗剂型、主治医生对医学状况的评估以及其他相关因素而不同。估计该用量应处于可通过常规试验测定的相对较宽的范围内。剂量疗法可以是单一剂量进度或多剂量进度的(例如包括加强剂量)。该组合物可以与其他免疫调节药物联合给予。

可用于本发明的组合物的佐剂包括但不限于：

A.含有矿物质的组合物

适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(如过氧化物(oxyhydroxide))、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见参考文献16的第8和9章]，或不同矿物质化合物的混合物，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选(具有)吸附性。含有矿物质的组合物也可配配制为金属盐颗粒[17]。

特别优选磷酸铝，尤其是在包含流感嗜血杆菌(H.influenzae)糖类抗原的组合物中，典型的佐剂是PO₄/Al摩尔比在0.84和0.92之间的无定形羟基磷酸铝，含量为0.6mgAl³⁺/ml。可用低剂量磷酸铝吸附，例如每剂每缀合物50-100μg Al³⁺。当组合物中含有一种以上缀合物时，不需要吸附所有缀合物。

B.油乳剂

适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献16的第10章；也可参见参考文献18](利用微流化剂配制成亚微米颗粒的5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85)。也可用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

C.皂苷制剂[参考文献16的第22章]

皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologous group)。皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)(婚纱花(brides veil))和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根(soap root))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。QS21的商品名为Stimulon^TM。

也可利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术特别纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。参考文献19公开了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[20]。

可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献16的第23章]。ISCOM一般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有一种或多种QuilA、QHA和QHC。参考文献20-22进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它去污剂[23]。

皂苷佐剂开发的综述见参考文献24和25。

D.病毒体和病毒样颗粒

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种任选与磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白质。它们通常是非病原性、非复制性，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的病毒蛋白包括源自以下的蛋白质：流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白p1)。参考文献26-31进一步讨论了VLP。例如，参考文献32进一步讨论了病毒体。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。参考文献33公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可经0.22μm膜无菌过滤[33]。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[34、35]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A的衍生物，例如OM-174。例如，OM-174描述于参考文献36和37。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。

CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰物并且可以是双链或单链的。参考文献38、39和40公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献41-46进一步讨论了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。

CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[47]。CpG序列，例如CpG-A ODN特异地诱导Th1免疫应答，或者，例如CpG-B ODN更特异地诱导B细胞应答。参考文献48-50讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。

优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。两条CpG寡核苷酸序列任选在它们的3’端相连以形成“免疫聚物”(immunomer)。参见，例如参考文献47和51-53。

细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)霍乱(病毒)(“CT”)或百日咳(病毒)(“PT”)。参考文献54描述了解毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，参考文献55描述了其作为胃肠外佐剂的应用。毒素或类毒素优选为含有A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有解毒性突变；B亚基优选未突变。佐剂优选是解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献56-63。氨基酸取代的数字基准优选以参考文献64所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础，该文献专门全文纳入本文作为参考。

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[65]等)[66]、干扰素(如，干扰素-？)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

G.生物粘合剂和粘膜粘合剂

生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[67]，或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[68]。

H.微粒

微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm到150μm，优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。

I.脂质体(参考文献16的第13和14章)

适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献69-71。

J.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制剂

适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[72]。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[73]以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[74]。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。

K.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂描述于，例如参考文献75和76中。

L.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。

M.咪唑并喹诺酮化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物包括参考文献77和78中进一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，“瑞喹莫德3M”)。

本发明也包括联用一种或多种以上鉴定的佐剂的各方面。例如，以下佐剂组合物可用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[79]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[80]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[81]；(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂[82]；(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或搅拌(vortex)产生较大粒度的乳剂；(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)，其中含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(monophosphorylipidA)(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)组成的细菌细胞壁组分；和(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL)。

参考文献16的第7章公开了用作免疫刺激剂的其它物质。

铝盐(磷酸铝，尤其是羟基磷酸铝，和/或氢氧化铝，尤其是过氧化铝(oxyhydroxide))和MF59是肠胃外免疫的优选佐剂。毒素突变体是优选的粘膜佐剂。QS21是另一种有用的NMB 1870佐剂，它可单独使用或与一种或多种其它佐剂如铝盐联用。

胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。

其它抗原性组分

本发明组合物包含嵌合NMB1870多肽。尤其优选该组合物不应当包括抗原的复合物或不明确的混合物，例如，优选组合物中不包含外膜囊泡。本发明多肽优选以重组方式在异源宿主中表达，然后纯化。

本发明组合物包含嵌合NMB1870多肽。它也可以包含另一种奈瑟菌抗原，因为一种靶向每种细菌的多种抗原的疫苗降低了选择逃逸突变体的可能性。该组合物中包含的奈瑟菌抗原包括含有以下成分的蛋白质：

(a)参考文献83中所公开的446个偶数SEQ ID(即2、4、6、…、890、892)；

(b)参考文献84中所公开的45个偶数SEQ ID(即2、4、6、…、88、90)；

(c)参考文献2中所公开的1674个偶数SEQ ID 2-3020、偶数SEQ ID 3040-3114，以及所有SEQ ID 3115-3241；

(d)参考文献4中的NMB0001到NMB2160共2160氨基酸序列；

(e)任何亚型的脑膜炎球菌PorA蛋白，优选重组表达亚型；

(f)(a)-(e)的变体、同系物、直系同源物、旁系同源物、突变体等等；或

(g)从脑膜炎奈瑟球菌制备的外膜囊泡[例如见参考文献177]。

除了奈瑟菌蛋白抗原，所述组合物可以包括能赋予抗其他疾病或感染免疫性的抗原。例如，该组合物可以包括以下一种或多种其它抗原：

-来自脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖类抗原，如参考文献85所述的血清群C的寡糖[也可参见参考文献86]或参考文献87的寡糖。

-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖类抗原[例如，88、89、90]。

-甲肝病毒抗原，如灭活的病毒[例如，91、92]。

-乙肝病毒抗原，如表面及/或核心抗原[例如，92、93]。

-白喉抗原，如白喉类毒素[例如参考文献94第3章]，例如CRM197突变体[例如，95]。

-破伤风抗原，诸如破伤风类毒素[例如参考文献94第4章]。

-百日咳杆菌(Bordetella pertussis)抗原，如百日咳杆菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可以与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3[例如参考文献96和97]联用。

-流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B的糖类抗原[例如86]。

-脊髓灰质炎抗原[例如，98、99]，如IPV。

-麻疹、腮腺炎及/或风疹抗原[例如参考文献94的第9、10、11章]。

-流感抗原[例如参考文献94第19章]，如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

-粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)抗原[例如，100]。

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)蛋白抗原[例如，101、102]。

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)糖类抗原。

-化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)抗原[例如，102、103、104]。

-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原[例如，105]。

所述组合物可以包含一种或多种这些其它抗原。

如需要，可以对有毒的蛋白抗原进行解毒处理(例如通过化学和/或遗传手段对百日咳毒素的解毒处理[97])。

在所述组合物包含白喉抗原的情况下，优选同时包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，在组合物包含破伤风抗原的情况下，优选地也包含白喉和百日咳抗原。类似地，在组合物包含百日咳抗原的情况下，优选地也包含白喉和破伤风抗原。因此优选DTP组合。

糖类抗原优选缀合体的形式。缀合体的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[106]、合成肽[107、108]、热激蛋白[109、110]、百日咳蛋白[111、112]、流感嗜血菌蛋白D[113]、细胞因子[114]、淋巴因子[114]、链球菌蛋白、激素[114]、生长因子[114]、艰难梭菌(C.difficile)毒素A或B[115]、铁摄取蛋白[116]等等。CRM197白喉类毒素是一种优选的载体蛋白[117]。

组合物中的各抗原通常应以至少1μg/ml的浓度存在。通常，任何特定抗原的浓度应足以引起抗该抗原的免疫反应。

本发明免疫原性组合物可以用于治疗(即治疗已经存在的感染)或预防(即防止将来的感染)。

除了使用本发明免疫原性组合物中的蛋白抗原，可以使用编码该抗原的核酸(优选DNA，例如以质粒形式)。

本发明尤其优选的组合物包含(a)脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和(任选的)A的糖类抗原；(b)B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)糖类抗原；和/或(c)肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原中的一种、两种或三种。

脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和(任选的)A

抗血清群A、C、W135和Y的多糖疫苗是多年来已知的。这些疫苗(MENCEVAXACWY^TM和MENOMUNE^TM)基于生物体的荚膜多糖并且，虽然它们在青少年和成人中有效，它们产生的免疫反应弱且保护期间短，而且不能用于婴儿。

与这些疫苗中非缀合的多糖相反，最近批准的血清群C疫苗(Menjugate^TM[118、85]、Meningitec^TM和NeisVac-C^TM)包括缀合的糖类。Menjugate^TM和Meningitec^TM具有与CRM₁₉₇载体缀合的寡糖抗原，而NeisVac-C^TM使用与破伤风类毒素载体缀合的完整的多糖(去-O-乙酰化的)。所提出的MenActra^TM疫苗包含血清群Y、W135、C和A中各血清群的缀合的荚膜糖类。

本发明组合物优选包含一种或多种脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和(任选的)A的荚膜糖类抗原，其中所述抗原与载体蛋白缀合，和/或是寡糖。例如，该组合物可以包含以下血清群的荚膜糖类抗原：血清群C；血清群A和C、血清群A、C和W135；血清群A、C和Y；血清群C、W135和Y；或所有4种血清群A、C、W135和Y。

每剂量的各脑膜炎球菌糖类抗原的典型数量介于1μg和20μg之间，例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg、或约10μg(以糖类表示)。

当混合物同时包含血清群A和C的荚膜糖类时，MenA糖类∶MenC糖类的比率(w/w)可以大于1(例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。当混合物包含血清群Y的荚膜糖类以及血清群C和W135的一种或两种荚膜糖类时，MenY糖∶MenW135糖的比率(w/w)可以大于1(例如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)并且/或MenY糖∶MenC糖的比率(w/w)可以小于1(例如1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。血清群A∶C∶W135∶Y的糖类的优选比率(w/w)是：1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；以及2∶2∶2∶1。血清群C∶W135∶Y的糖类的优选比率(w/w)是：1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1；以及2∶1∶1。优选使用基本上相同量的每种糖类。

荚膜糖类通常应以寡糖形式使用。这不难通过破碎纯化的荚膜多糖(例如通过水解)形成，随后通常会纯化所需大小的片段。

优选破碎多糖以在寡糖中产生最终小于30的平均聚合度(DP)(例如对于血清群A介于10和20之间，优选为10左右；对于血清群W135和Y介于15和25之间，优选15-20左右；对于血清群C介于12和22之间；等等)。DP可以通过离子交换色谱或通过比色检测方便地测量[119]。

如果进行水解，应对水解产物进行筛分以去除长度短的寡糖[86]。这可以通过多种方法实现，例如超滤后进行离子交换色谱。对于血清群A，优选去除具有小于或等于约为6的聚合度的寡糖，对于血清群W135和Y，优选去除那些聚合度小于约4的寡糖。

参考文献118中公开了如Menjugate^TM中所用的优选MenC糖类抗原。

糖类抗原可以进行化学修饰。这对于减少血清群A的水解尤其有用[120；见下文]。可以进行脑膜炎球菌糖类的去-O-乙酰化。对于寡糖而言，修饰可以发生在解聚作用之前或之后。

当本发明组合物包含MenA糖类抗原时，该抗原优选其中天然糖类中的一个或多个羟基已被封闭基团(blocking group)取代的修饰的糖类分子[120]。这一修饰提高了对水解的抗性。

具有封闭基团的单糖单位的数量可变。例如，所有或基本上所有的单糖单位可以具有封闭基团。另外，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的单糖单位可以具有封闭基团。至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个单糖单位可以具有封闭基团。

同样地，单糖单位上封闭基团的数量可变。例如，一个单糖单位上的封闭基团数量可以是1或2。封闭基团通常应位于单糖单位的4位和/或3位。

末端的单糖单位可以具有或不具有取代其天然羟基的封闭基团。为了提供进一步反应(例如缀合反应)的把手，优选在末端单糖单位上保留自由的异头羟基。通过还原氨化(用例如NaBH₃CN/NH₄Cl)，异头羟基可以转换成氨基(-NH₂或-NH-E，其中E是氮保护基)，然后可在其他羟基被转换成封闭基团之后再生。

取代羟基的封闭基团可通过羟基的衍生化反应(即通过用其他基团取代羟基的氢离子)直接取得。作为封闭基团的羟基的适当衍生物是，例如，氨基甲酸基、磺酸基、羧基、酯、醚(例如甲硅烷醚或烷基醚)和缩醛。这种封闭基团的一些具体实例是烯丙基、Aloc、苯甲基、BOM、叔丁基、三苯甲基、TBS、TBDPS、TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、THP等等。其他不能直接取得，要完全取代羟基的封闭基团包括C_1-12烷基、C_3-12烷基、C_5-12芳基、C_5-12芳基-C_1-6烷基、NR¹R²(R¹和R²在以下段落中作了定义)、H、F、Cl、Br、CO₂H、CO₂(C_1-6烷基)、CN、CF₃、CCl₃等等。优选的封闭基团是吸电子基团。

优选的封闭基团如式：-O-X-Y或-OR³所示，其中X是C(O)、S(O)或SO₂；Y是C_1-12烷基、C_1-12烷氧基、C_3-12环烷基、C_5-12芳基或C_5-12芳基-C_1-6烷基，其中每种任选用独立选自F、Cl、Br、CO₂H、CO₂(C_1-6烷基)、CN、CF₃或CCl₃的1、2或3个基团取代；或Y是NR¹R²；R¹和R²独立选自H、C_1-12烷基、C_3-12环烷基、C_5-12芳基、C_5-12芳基-C_1-6烷基；或R¹和R²可以连接形成C_3-12饱和杂环基团；R³是C_1-12烷基或C_3-12环烷基，其中每种任选用独立选自F、Cl、Br、CO₂(C_1-6烷基)、CN、CF₃或CCl₃的1、2或3个基团取代；或R³是C_5-12芳基或C_5-12芳基-C_1-6烷基，其中每种任选用独立选自F、Cl、Br、CO₂H、CO₂(C_1-6烷基)、CN、CF₃或CCl₃的1、2、3、4或5个基团取代。当R³是C_1-12烷基或C_3-12环烷基时，其通常用以上定义的1、2或3个基团取代。当R¹和R²连接形成C_3-12饱和杂环基团时，这意味着R¹和R²与氮原子共同形成含有介于3和12之间任何数量碳原子的饱和杂环基团(例如C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂)。该杂环基团可以包含1或2个不同于氮原子的杂原子(如N、O或S)。C_3-12饱和杂环基团的实例是吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、咪唑烷基、吖丁啶基和吖丙啶基。

封闭基团-O-X-Y和-OR³可以通过标准衍生化过程(诸如羟基与酰卤、烷卤、磺酰卤的反应)由-OH基团制备。因此，-O-X-Y中的氧原子优选羟基的氧原子，同时-O-X-Y中的-X-Y基团优选取代羟基的氢原子。

另外，封闭基团可以经取代反应(诸如Mitsonobu类取代)取得。从羟基制备封闭基团的这些和其他方法是熟知的。

更优选封闭基团是-OC(O)CF₃[121]或氨基甲酸基团-OC(O)NR¹R²，其中R¹和R²独立选自C_1-6烷基。更优选R¹和R²都是甲基，即所述封闭基团是-OC(O)NMe₂。氨基甲酸封闭基团对糖苷键具有稳定作用并可以在温和条件下制备。

优选的修饰的MenA糖包含n个单糖单位，其中至少h％的单糖单位在3和4位均不含-OH基团。h值是24或更高(例如25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99或100)，优选是50或更高。缺失-OH的基团是如上所定义的优选的封闭基团。

其他优选的修饰的MenA糖包含单糖单位，其中至少s个单糖单位在3位不具有-OH并且在4位不具有-OH。s值至少是1(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90)。缺失的-OH基团是如上所定义的优选的封闭基团。

用于本发明的适当修饰的MenA糖类具有下式：

其中，n是从1到100的整数(优选地是从15到25的整数)；

T如式(A)或(B)所示：

每个Z基团独立选自OH或如上定义的封闭基团；并且

每个Q基团独立选自OH或如上定义的封闭基团；

Y选自OH或如上定义的封闭基团；

E是H或氮保护基团；

并且其中大于约7％(例如8％、9％、10％或更高)的Q基团是封闭基团。

n+2个Z基团彼此可以相同或有差异。同样地，n+2个Q基团彼此可以相同或有差异。所有的Z基团可以是OH。另外，至少10％、20％、30％、40％、50％或60％的Z基团可以是OAc。优选约70％的Z基团是OAc，而其余Z基团是OH或如上定义的封闭基团。至少约7％的Q基团是封闭基团。优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％的Q基团是封闭基团。

脑膜炎球菌荚膜多糖通常通过包括多糖沉淀(例如使用阳离子去垢剂)、乙醇分馏、冷苯酚抽提(以去除蛋白质)和超高速离心(去除LPS)[例如参考文献122]等步骤的方法制备。然而，更优选的方法[87]包括多糖沉淀，随后用低级醇溶解所沉淀的多糖。可以用诸如四丁基铵盐和十六烷基三甲基铵盐(如溴盐)、或海美溴铵(hexadimethrinrbromide)和十四烷基三甲基铵盐等阳离子去垢剂实现沉淀。尤其优选十六烷基三甲基溴铵(CTAB)[123]。通过使用诸如甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、2-甲基-正丙醇、2-甲基-异丙醇、二醇等等低级醇溶解沉淀物质，但乙醇尤其适于溶解CTAB-多糖复合物。优选将乙醇添加到沉淀的多糖中至终浓度介于50％到95％之间(以乙醇和水的总含量计)。

重溶后，可进一步处理多糖以去除污染物。这在不接受即使较少污染的情况(例如对于人类疫苗生产)中尤其重要。这通常应包括一步或多步过滤，例如可用深层过滤、经活性碳过滤、体积排阻过滤和/或超滤。一旦过滤去除了污染物，可沉淀该多糖以进一步处理和/或加工。这不难通过阳离子交换(例如通过添加钙盐或钠盐)实现。

作为纯化的另一种选择，可以通过完全或部分合成(例如参考文献124中公开的Hib合成以及参考文献125中公开的MenA合成)来获得本发明的荚膜糖。

本发明组合物包含脑膜炎奈瑟球菌的至少两种血清群的荚膜糖。所述糖类优选分别制备(包括任何破碎、缀合、修饰等等)，然后混合以产生本发明的组合物。

然而，当该组合物包含血清群A的荚膜糖时，为尽可能降低水解，优选直到使用前才将血清群A的糖类与其他糖类混合。这不难通过使血清群A的组分(通常与适当赋形剂一起)处于冻干粉末的形式并且使其他血清群的组分处于液体形式(也与合适赋形剂一起)来实现，当需要使用时用液体组分复原冻干的MenA组分。在使用铝盐佐剂的情况下，优选在含液体疫苗的小瓶中包括佐剂，并且不添加佐剂对MenA组分进行冻干。

因此，本发明组合物可以由试剂盒制备，该试剂盒包括：(a)冻干形式的脑膜炎奈瑟球菌血清群A的荚膜糖类；以及(b)液体形式的该组合物的其它抗原。本发明也提供了制备本发明组合物的方法，该方法包括将冻干的脑膜炎奈瑟球菌血清群A的荚膜糖类与其它抗原混合，其中所述其它抗原是液体形式的。

本发明也提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：(a)包含冻干形式的脑膜炎奈瑟球菌血清群C、W135和Y中两种或多种荚膜糖类的第一容器；以及(b)包含液体形式的以下物质的第二容器，(i)在给予对象后能诱导对象体内抗体反应的组合物，其中的抗体反应具有抗脑膜炎奈瑟球菌血清群B的超毒谱系A4、ET-5和谱系3中两种或多种(例如2和3)谱系的杀菌活性，(ii)脑膜炎奈瑟球菌血清群C、W135和Y之一或不是这些血清群的荚膜糖类，以及任选的(iii)不包括脑膜炎球菌荚膜糖类的其它抗原(见下文)，其中，用容器(b)内容物复原容器(a)内容物提供了本发明的组合物。

在各剂量范围内，各糖类抗原的用量通常应介于1-50μg(以糖类的质量检测)，其中优选的每种约2.5μg、5μg或10μg。由于A∶C∶W135∶Y的重量比是1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；以及2∶2∶2∶1，所以，数字1所表示的用量优选约2.5μg、5μg或10μg。因此，就1∶1∶1∶1比率的A∶C∶W∶Y组合物以及每种糖类10μg而言，每剂量给予40μg糖类。优选的组合物每剂量包含约以下μg的糖类：

A	10	0	0	0	10	5	2.5
								C	10	10	5	2.5	5	5	2.5
W135	10	10	5	2.5	5	5	2.5
								Y	10	10	5	2.5	5	5	2.5

本发明优选的组合物每剂量包含少于50μg脑膜炎球菌糖类。其他优选的组合物每剂量包含≤40μg脑膜炎球菌糖类。其他优选的组合物每剂量包含≤30μg脑膜炎球菌糖类。其他优选的组合物每剂量包含≤25μg脑膜炎球菌糖类。其他优选的组合物每剂量包含≤20μg脑膜炎球菌糖类。其他优选的组合物每剂量包含≤10μg脑膜炎球菌糖类，但是，本发明组合物每剂量宜包含至少10μg脑膜炎球菌糖类。

Menjugate^TM和NeisVac^TM MenC缀合物使用羟化物佐剂，而Meningitec^TM使用磷酸盐。氢氧化铝可能吸附本发明组合物中一些抗原，而其他抗原与磷酸铝结合。对于四价血清群组合，例如可以使用下面的排列：

血清群	铝盐(H＝羟化物；P＝磷酸盐)
																	A	P	H	P	H	H	H	P	P	P	H	H	H	P	P	P	H
C	P	H	H	P	H	H	P	H	H	P	P	H	P	H	P	P
																	W135	P	H	H	H	P	H	H	P	H	H	P	P	P	P	H	P
Y	P	H	H	H	H	P	H	H	P	P	H	P	H	P	P	P

对于三价脑膜炎奈瑟球菌血清群组合，可以使用下面的排列：

血清群	铝盐(H＝羟化物；P＝磷酸盐)
									C	P	H	H	H	P	P	P	H
W135	P	H	H	P	H	P	H	P
									Y	P	H	P	H	H	H	P	P

B型流感嗜血杆菌

当组合物包括B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)抗原时，该抗原通常是Hib荚膜糖类抗原。B型流感嗜血杆菌糖类抗原是熟知的。

Hib糖与载体蛋白共价缀合可有利地增强其免疫原性(特别是在儿童体内)。多糖缀合物(特别是Hib荚膜多糖)的制备方法一般是充分公开的[例如参考文献126-134等等]。本发明可以使用任何适当的Hib缀合物。下面描述了适当的载体蛋白，Hib糖优选的载体是CRM₁₉₇(‘HbOC’)、破伤风类毒素(‘PRP-T’)以及脑膜炎奈瑟球菌的外膜复合物(‘PRP-OMP’)。

缀合物的糖类部分可以是多糖(例如全长的磷酸聚核糖基核糖醇(PRP))，但优选水解多糖以形成寡糖(例如分子量约1-5kDa)。

一种优选的缀合物包括经脂肪酸接头与CRM₁₉₇共价连接的Hib寡糖[135、136]。破伤风类毒素也是一种优选的载体。

本发明组合物可以包括多种Hib抗原。

当组合物包括Hib糖类抗原时，优选不同时包括氢氧化铝佐剂。如果组合物包含磷酸铝佐剂，则Hib抗原可以被佐剂吸附[137]，或可不被吸附[138]。

Hib抗原可以冻干，例如与脑膜炎球菌抗原一起冻干。

肺炎链球菌

当所述组合物包含肺炎链球菌(S.pneumoniae)抗原时，该抗原通常是优选与载体蛋白缀合的荚膜糖类抗原[例如参考文献88-90]。抗原优选包括肺炎链球菌多种血清型的糖类。例如，广泛使用23种不同血清型的多糖混合物，诸如使用5到11种不同血清型多糖的缀合疫苗[139]。例如，PrevNar^TM[140]包含7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，每种糖类通过还原氨化与CRM₁₉₇缀合，每0.5毫升剂量(4μg的血清型6B)含2μg每种糖类，缀合物吸附在磷酸铝佐剂上。本发明组合物优选至少包括血清型6B、14、19F和23F。缀合物可以吸附于磷酸铝。

作为使用肺炎球菌糖类抗原之外的另一种选择，组合物可以包含一种或多种多肽抗原。可获得几种肺炎球菌菌株的基因组序列[141、142]，进行反向疫苗学(研究)[143-146]来鉴别适当的多肽抗原[147、148]。例如，组合物可以包括一种或多种以下抗原：PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128和Sp130，如参考文献149中所定义的。

在有些实施方式中，组合物可以同时包含肺炎球菌的糖类和多肽抗原。这些糖类和多肽抗原可以简单的混合物使用，或肺炎球菌糖类抗原可以与肺炎球菌蛋白缀合。适合于这种实施方式的载体蛋白包括前一段中所列举的抗原[149]。

肺炎球菌抗原可以冻干，例如与脑膜炎球菌和/或Hib抗原一起冻干。

共价缀合

本发明组合物中的荚膜糖类通常应与载体蛋白缀合。通常，由于缀合将其从T非依赖性抗原转变为T依赖性抗原，从而能启动免疫记忆，进而增强了糖类的免疫原性。缀合对于儿科疫苗尤其有用并且是熟知的技术[参见参考文献150和126-134]。

优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，诸如白喉类毒素或破伤风类毒素。尤其优选CRM197突变白喉毒素[117、151、152]。其他适当的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[106]，合成肽[107、108]，热激蛋白[109、110]，百日咳蛋白[111、112]，细胞因子[114]，淋巴因子[114]，激素[114]，生长因子[114]，包含各种源自病原体的抗原的多种人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[153]，流感嗜血杆菌蛋白D[113、154]，肺炎球菌表面蛋白PspA[155]，铁摄取蛋白[116]，艰难梭菌毒素A或B[115]等等。优选的载体是白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血杆菌蛋白D和CRM₁₉₇。

在本发明组合物中，可以使用多种载体蛋白，例如以降低载体抑制的风险。因此，对于不同的血清群可以使用不同的载体蛋白，例如，血清群A糖类可以与CRM₁₉₇缀合而血清群C糖类可以与破伤风类毒素缀合。也可以对一种具体糖类抗原使用多种载体蛋白，例如血清群A糖类可以分成两组，一些与CRM₁₉₇缀合，其他与破伤风类毒素缀合。然而，所有糖类通常宜用相同载体蛋白。

一种载体蛋白可以携带多种糖类抗原[156]。例如，一种载体蛋白可以与血清群A和C的糖类缀合。为实现这一目标，可在缀合反应之前混合糖类分子。然而，各种血清群通常宜具有独立的缀合物。

糖类∶蛋白比率(w/w)优选介于1∶5(蛋白过量)和5∶1(糖类过量)之间。比率优选介于1∶2和5∶1之间，更优选介于1∶1.25和1∶2.5之间。对于MenC和MenA优选载体蛋白过量。

缀合物可以与游离的载体蛋白联用[157]。当本发明组合物中一种特定载体蛋白同时以游离和缀合形式存在时，以该组合物中所有载体蛋白总量计，非缀合形式优选不超过5％，并且更优选少于2重量％。

可以使用任何适当的缀合反应，需要时可用任何合适的接头。

缀合之前糖类通常应活化或功能化。活化可以涉及，例如氰化试剂，如CDAP(例如1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐)[158、159等]。其他合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU(也可参见参考文献132的介绍)。

可采用任何已知方法，例如参考文献160和161中所描述的方法经连接基团进行连接。一种类型的连接涉及多糖的还原氨化，获得的氨基与己二酸连接基团的一端偶联，随后将己二酸连接基团的另一端与一种蛋白质偶联[130、162、163]。其他接头包括B-丙酰胺[164]、硝基苯-乙胺[165]、卤酰基卤(haloacyl halide)[166]、糖苷接头[167]、6-氨基己酸[168]、ADH[169]、C₄到C₁₂部分[170]等等。作为使用接头的另一种选择，可以采用直接连接。与蛋白质的直接连接可以包括氧化多糖，随后与该蛋白进行还原氨化，例如参考文献171和172所述。

优选的方法包括在糖类中引入氨基基团(例如通过用-NH₂取代末端＝O基团)，随后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生化并与载体蛋白反应。另一种优选的反应使用CDAP活化并与蛋白D载体(反应)，例如用于MenA或MenC的。

缀合之后，可分离游离的和缀合的糖类。有多种合适的方法可用，包括疏水层析、切线超滤、渗滤等等[参见参考文献173和174等]。

在本发明的合物包含缀合的寡糖的情况下，优选先制备寡糖再缀合。

外膜囊泡

优选的本发明组合物不应包括抗原的复杂或不明确的混合物，这是OMV的典型特征。然而当OMV按多剂量进度表给药时，本发明可以适用于OMV。

当给予对剂量OMV时，每一剂量可以补充(通过添加纯化的蛋白质或在OMV所来源的细菌内表达该蛋白)如前文定义的第1种、第2种或第3种蛋白质之一。优选不同剂量补充不同的NMB1870家族。例如，在3剂量的OMV进度表中，每种剂量可以包含第1种、第2种或第3种蛋白质中不同的一种，从而在接受3种剂量OMV后接受了全部3种家族。在2剂量OMV进度表中，每种OMV剂量可以使用一种家族(因此忽略了一种家族)，或一种或两种OMV剂量可以补充多种家族以涵盖所有3种家族。在优选的实施方式中，存在3种OMV剂量，并且3种OMV剂量各自包含3种不同的遗传工程改造的囊泡群，每种囊泡群展示3种亚型，从而总共产生9种不同亚型。

此方法通常可用于改善脑膜炎奈瑟球菌血清群B微泡[175]、“天然OMV”[176]、细胞泡(bleb)或外膜囊泡[例如参考文献177-182等]的制备。这些囊泡可以从经遗传改造的细菌制备[183-186]，例如以提高免疫原性(例如超表达免疫原)、降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调ProA表达等等。它们可以从多泡(hyperblebbing)菌株制备[187-190]。可以包括非致病奈瑟菌的囊泡[191]。OMV可以不使用去垢剂而进行制备[192、193]。它们可以在其表面表达非奈瑟菌蛋白质[194]。它们可以是LPS去除的(deplete)。它们可以与重组抗原混合[177、195]。可以使用具有不同的I型外膜蛋白亚型的细菌的囊泡，例如使用两种各自展示3种亚型的不同遗传改造的囊泡群的6种不同亚型[196、197]，或使用三种各自展示3种亚型的不同遗传改造的囊泡群的9种不同亚型等等。有用的亚型包括：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1；P1.18-1，3，6。

当然也可以给囊泡制剂补充两种或三种不同家族。

单克隆抗体

本发明提供能识别脑膜炎球菌NMB1870蛋白中表位的单克隆抗体，其中，所述表位要求同时存在所述NMB1870的结构域B和C。因此，该单克隆抗体不结合单独的结构域B或结合单独的结构域C，而是结合结构域B和C的组合(也结合完整的NMB 1870)。因此，该表位可以是由结构域B和结构域C中的氨基酸残基形成的不连续表位。

术语‘单克隆抗体’包括各种可获得的人工抗体和抗体衍生的蛋白质，例如，人抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单结构域抗体，单链Fv(scFV)抗体，单克隆寡体(oligobody)，二聚或三聚抗体片段，或者能结合所述抗原的它们的构建物、微体或功能性片段。所述抗体优选为基本上分离的形式。

天然抗体分子中存在两条重链和两条轻链。各重链和各轻链在其N-末端具有可变结构域。各可变结构域由交替出现的4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)构成。可变结构域中的残基通常按照Kabat等设计的系统编号[198]。Kabat残基编号并不总与氨基酸残基的线性编号相一致，线性氨基酸序列可能含有少于严格Kabat编号中的氨基酸或额外的氨基酸。这可能对应于基础可变结构域结构的结构性组分(框架或CDR)的缩短或插入。

为避免在人的非特异性抗-小鼠免疫反应，非人抗体优选为人源化抗体或嵌合抗体[例如，参考文献199和200]。或者可采用全人抗体。在嵌合抗体中，非人恒定区被人恒定区取代，但可变区仍旧是非人的。可通过各种方法获得人源化抗体，包括，例如：(1)将非人可变区的互补决定区(CDR)移植到人框架(“CDR-嫁接”)，还可任选额外转移一个或多个非人抗体的框架残基(“人源化”)；(2)嫁接整个非人可变结构域，但通过表面残基取代用人样表面“覆盖”它们(“镶盖(veneering)”)。在本发明中，人源化抗体包括那些通过CDR-嫁接、人源化和镶盖可变区获得的抗体[例如，参考文献201-207]。

也可用经工程改造而含有人免疫球蛋白基因座的转基因动物来产生人源化抗体或全人抗体。例如，参考文献208公开了具有人Ig基因座的转基因动物，其中，该动物由于内源重链和轻链基因座失活而不产生功能性内源免疫球蛋白。参考文献209也公开了能够对免疫原产生免疫反应的转基因非灵长类哺乳动物宿主，其中，所述抗体具有灵长类恒定区和/或可变区，其中，编码内源免疫球蛋白的基因座被替代或灭活。参考文献210公开了用Cre/Lox系统来修饰哺乳动物的免疫球蛋白基因座，例如用来替代所有的或部分恒定区或可变区以形成修饰的抗体分子。参考文献211公开了具有灭活的内源Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳动物宿主。参考文献212公开了制备转基因小鼠的方法，所述小鼠缺乏内源重链，并表达含有一个或多个异种恒定区的外源免疫球蛋白基因座。

抗体天然含有两条分开的链，但优选使用单链抗体(“sFv”)，在单链抗体中，轻链和重链的可变结构域通过接头连接在一起得到单个多肽链。用来制备sFv的试剂盒有现货供应，抗-配体sFv是优选用于本发明的第二序列。单结构域抗体也可从骆驼科动物(camelids)或鲨鱼获得[213]或者通过骆驼化(camelisation)制备[214]。

sFv多肽是一种共价连接的V_H-V_L异质二聚体，它由包含编码肽的接头连接的V_H-和V_L-编码基因的融合基因表达[215]。许多鉴定和开发化学结构(接头)的方法已见描述，这些结构能将天然凝聚但可通过化学方法分离的抗体V区域的轻和重多肽链转变为sFv分子，sFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本类似的三维结构。参见，例如，参考文献216-218。可用在本领域所述的方法制备sFv分子。设计标准包括测定一条链的C-末端与另一条链的N-末端之间距离的大致长度，其中所述接头通常由不卷曲或形成二级结构的小的亲水氨基酸残基形成。这种方法在本领域已见描述[例如，参考文献216-218]。合适的接头通常包含具有交替的多组甘氨酸和丝氨酸的多肽链，并可包含插入的谷氨酸和赖氨酸残基以增强溶解性。

“微小抗体(mini-antibody)”或“微体(minibody)”也可用于本发明。微体是sFv多肽链，在它们的C-末端包含通过绞链区与sFv分开的寡聚化结构域[219]。寡聚化结构域包含可通过其它二硫键使之更加稳定的自缔合α-螺旋，例如亮氨酸拉链。寡聚化结构域被设计成与跨膜矢量折叠(vectorial folding)相一致，认为该过程有利于多肽体内折叠成功能性结合蛋白。通常采用本领域熟知的重组方法制备微体。参见，例如，[219]，[220]。

“寡体”也可用于本发明。寡体是合成的抗体。这些试剂的特异性可通过Western印迹分析和免疫组织化学证实。它们具有一些所需特性，即它们的产生不依赖于免疫系统，它们可在几天内产生并且无需纯化靶蛋白[221]。可用本领域熟知的重组方法制造寡体[222]。

抗体可用本领域技术人员熟知的技术制备[例如，参考文献223-228]。通常用Kohler和Milstein的方法(1975)[229]或其改进方法制备单克隆抗体。通常，如上述免疫小鼠或大鼠。也可使用家兔。然而，并非是对动物取血提取血清，而是取出脾脏(以及任选地取出几个大的淋巴结)，将其分散成单细胞。如果需要，可将细胞悬液(在除去非特异性粘附的细胞后)加入包被了抗原的板或孔中，对脾细胞进行筛选。表达抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞结合到板上，不随悬液其它物质一起洗去。然后诱导所得B细胞或所有分离的脾细胞，使其与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，培养在选择性培养基(如“HAT”培养基)中。通过有限稀释接种所得杂交瘤，并测定特异性结合免疫抗原(且不结合无关抗原)的抗体的产生。然后，体外(例如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(如小鼠腹水中)培养所选的分泌单克隆抗体的杂交瘤。

本发明还提供了表达本发明抗体的杂交瘤。这种杂交瘤可用于各种途径，例如，作为单克隆抗体的来源，或者作为编码本发明单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)的来源来克隆抗体基因供随后的重组表达。

抗体可通过任何合适方法(例如通过重组表达)制备。相比从B细胞或杂交瘤表达，从重组来源表达更常用于药学目的，例如，出于稳定性、再现性、易于培养等原因。

保留识别NMB1870能力的抗体片段也包括在本发明范围内。本领域已知许多抗体片段，其包含能够显示完整抗体分子的免疫结合特性的抗原结合位点。例如，可用例如胃蛋白酶从抗体分子上切除不负责抗原结合的恒定区以制备功能性抗体片段从而制得F(ab’)₂片段。这些片段含有两个抗原结合位点，但缺乏各重链的恒定区部分。类似地，如果需要，例如可用木瓜蛋白酶消化单克隆抗体以制备含有单个抗原结合位点的Fab片段。采用标准技术如重组制造或免疫球蛋白分子的优先蛋白水解切割也可制备仅含有重链和轻链可变区的功能性片段。这些片段是已知的，如Fv。参见，例如，[230]、[231]和[232]。

也可用非常规方法来产生和鉴定本发明抗体。例如，可用噬菌体展示文库来筛选本发明抗体[233-236]。

本发明抗体可以是任何同种型(例如，IgA、IgG、IgM，即α、γ或μ重链)，但优选IgG。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。本发明抗体可具有κ或λ轻链。

蛋白表达

细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是能结合细菌RNA聚合酶并启动编码序列(例如结构基因)向下游(3’)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子应具有通常位于邻近编码序列5’端的转录起始区域。此转录起始区域通常包括一个RNA聚合酶结合位点和一个转录起始位点。细菌启动子也可以具有第二个称为操纵子的结构域，它可以与邻近的RNA开始合成的RNA聚合酶结合位点重叠。由于基因阻遏蛋白可以结合该操纵子从而抑制具体基因的转录，操纵子允许负调节(可诱导的)转录。在不存在诸如操纵子的负调节元件时，可以发生组成型表达。此外，通过基因激活蛋白结合序列(如果存在的话通常位于RNA聚合酶结合序列的5’附近)可以实现正调节。基因激活蛋白的一个实例是分解代谢物激活蛋白(CAP)，它能协助启动大肠杆菌中lac操纵子转录[Raibaud等，(1984)Annu.Rev.Genet.18：173]。因此，受调节的表达可以是正或负的，从而能增强或降低转录。

编码新陈代谢途径的酶的序列提供了尤其有用的启动子序列。实例包括源自诸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等，(1977)Nature 198：1056]和麦芽糖等糖代谢的酶的启动子序列。其它实例包括源自诸如色氨酸(trp)的生物合成酶的启动子序列[Goeddel等，(1980)Nuc.Acids Res.5：4057；Yelverton等，(1981)Nucl.Acids Res.9：731；美国专利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775]。β-内酰胺酶(bla)启动子系统[见I.Gresser编的《干扰素3》(Interferon 3)中Weissmann(1981)著《干扰素的克隆及其他错误》(Thecloning of interferon and other mistakes)]、lambda噬菌体PL[Shimatake等，(1981)Nature，292：128]和T5[美国专利4,689,406]启动子系统也提供了有用的启动子序列。另一种感兴趣的启动子是可诱导的阿拉伯糖启动子(pBAD)。

此外，自然界中不存在的合成启动子也可以作为细菌启动子起作用。例如，一种细菌或噬菌体启动子的转录激活序列可以与另一种细菌或噬菌体启动子的操纵子序列相连，从而产生了合成的杂合启动子[美国专利4,551,433]。例如，tac启动子是由trp启动子和lac操纵子序列构成的、由lac阻遏物调节的杂合trp-lac启动子[Amann等，(1983)Gene 25：167；de Boer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：21]。此外，细菌启动子可以包含天然存在的、能结合细菌RNA聚合酶并启动转录的非细菌来源的启动子。天然存在的非细菌来源启动子也可以与相容的RNA聚合酶偶联从而在原核细胞中高水平表达一些基因。噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统是偶联启动子系统的一个实例[Studier等，(1986)J.Mol.Biol.759：113；Tabor等，(1985)Proc NatlAcad.Sci.52：1074]。此外，杂合启动子也可以由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域构成(EPO-A-0 267 851)。

除了功能性启动子序列之外，有效的核糖体结合位点也可用于在原核细胞中的表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称为Shine-Dalgarno(SD)序列并包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等，(1975)Nature 254：24]。认为SD序列通过SD序列和大肠杆菌16S rRNA 3’末端之间的碱基配对促进mRNA与核糖体的结合[R.F.Goldberger主编《生物学调控和发育：基因表达》(Biological Regulation and Development：Gene Expression)一书中Steitz等(1979)所著《信使RNA中的遗传信号和核苷酸序列》(Genetic signals andnucleotide sequences in messenger RNA)]。为了表达具有弱核糖体结合位点的原核基因与真核基因[Sambrook等，(1989)《分子克隆：实验手册》(Molecular Cloning：ALavoratory Manual)一书中《大肠杆菌中克隆基因的表达》(Expression of cloned genesin Escherichia coli.)]。

启动子序列可以直接与DNA分子相连，在这种情况下，N端的第一个氨基酸应该总是由ATG起始密码子所编码的甲硫氨酸。如果需要，N端的甲硫氨酸可以通过与溴化氰体外培育或通过与细菌甲硫氨酸N端肽酶的体外或体内培育从蛋白上切去[EP-A-0219237]。

通常，细菌识别的转录终止序列位于翻译终止密码子3’端的调控区，从而与启动子一起位于编码序列的侧翼。这些序列指导能翻译成DNA编码的多肽的mRNA转录。转录终止序列经常包括能形成帮助终止转录的茎环结构的约50个核苷酸的DNA序列。实例包括源自具有强启动子的基因，例如大肠杆菌trp基因以及其他生物合成基因的转录终止序列。

通常，包括启动子、信号序列(如果需要)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列的上述组分组合在一起形成表达构件。表达构件经常保持复制子的形式，诸如能稳定维持在诸如细菌的宿主中的染色体外元件(例如质粒)。该复制子应具有复制系统，从而能维持在原核宿主中来表达或克隆和扩增。此外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数质粒。高拷贝数质粒通常应具有介于约5到200之间、通常是约10到150的拷贝数。包含高拷贝数质粒的宿主优选应包含至少约10个、更优选至少约20个质粒。可根据载体和外来蛋白对宿主的影响选择高拷贝数或低拷贝数载体。

或者，可以用整合载体将表达构件整合入细菌基因组。整合载体通常包含至少一段与细菌染色体同源从而允许其整合的序列。整合似乎是载体和细菌染色体的同源DNA之间重组的结果。例如，用各种棒状杆菌菌株的DNA构建的整合载体整合入棒状杆菌染色体(EP-A-0127328)。整合载体也可以包含噬菌体或转座子序列。

通常，染色体外的和整合表达构件可以包含可选择标记从而能选择已转化的细菌菌株。可选择标记可以在细菌宿主中表达并可以包含赋予细菌对诸如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环素等药物的抗性的基因[Davies等，(1978)Annu.Rev.Microbiol.52：469]。可选择标记也可以包含生物合成基因，诸如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径上的那些基因。

或者，上述的有些组分可以在转化载体中组合。如上所述，转化载体通常包含维持在复制子中或开发成整合载体的可选择标记。

已经开发了用于转化入多种细菌的表达和转化载体，无论染色体外复制子或整合载体。例如，特别为以下细菌开发了表达载体：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[Palva等，(1982)Proc.Natl.Acad Sci.USA 79：5582；EP-A-0 036 259和EP-A-0 063 953；WO84/04541]、大肠杆菌[Shimatake等，(1981)Nature 292：128；Amann等，(1985)Gene.40：183；Studier等，(1986)J.Mol.Biol.189：113；EP-A-0 036 776、EP-A-0 136 829和EP-A-0 136 907]、变铅青链球菌(Streptococcus lividans)[Powell等，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655]、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)[美国专利4,745,056]。

向细菌宿主导入外源DNA的方法是本领域熟知的，通常包括用CaCl₂或诸如二价阳离子和DMSO等其它试剂处理的细菌转化。DNA也可以通过电转化导入细菌细胞。转化过程通常随所转化的细菌种属而不同，参见例如[Masson等，(1989)FEMSMicrobiol.Lett.60：273；Palva等，(1982)Proc.Natl Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0 036 259和EP-A-0 063 953；WO 84/04541，棒状杆菌]、[Miller等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.55：856；Wang等，(1990)J.Bacteriol.772：949，弧形杆菌]、[Cohen等，(1973)Proc.Natl.Acad Sci.69：2110；Dower等，(1988)Nucleic Acids Res.76：6127；H.W.Boyer和S.Nicosia主编《遗传工程：遗传工程国际论坛会议录》(Genetic Engineering：Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering)中Kushner(1978)所著《一种用ColE1来源质粒转化大肠杆菌的改进方法》(An improved method fortransformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids)；Mandel等，(1970)J.Mol.Biol.53：159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta 949：318；埃希氏菌]、[Chassy等，(1987)FEMS Microbiol.Lett.44：113乳酸菌]、[Fiedler等，(1988)Anal.Biochem 770：38，假单胞菌]、[Augustin等，(1990)FEMS Microbiol.Lett.66：203，葡萄球菌]、[Barany等，(1980)J.Bacteriol.144：698；J.Ferretti和R.Curtiss主编《链球菌遗传学》(Streptococcal Genetics)中Harlander(1987)所著《乳链球菌的电脉冲转化》(Transformation of Streptococcuslactis by electroporation)；Perry等，(1981)Infect.Immun.32：1295；Powell等，(1988)Appl.Environ Microbiol.54：655；Somkuti等，(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1：412，链球菌]。

概要

术语“包含”意味着“包括”以及“由…构成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X构成，或可以包括其它物质，例如X+Y。

与数值x有关的术语“约”表示，例如x±10％。

“基本上”不排斥“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在需要的情况下，“基本上”这个词可以从本发明定义中省略。

“序列相同性”优选通过如MPSRCH程序(Oxford Molecular)所执行的Smith-Waterman同源检索算法测定，该算法使用参数为空位开放罚分＝12及空位延伸罚分＝1的仿射(affine)空位检索。

血清群分类后，脑膜炎球菌分类包括血清型、血清亚型和随后的免疫型，标准命名法列出了血清群、血清型、血清亚型和免疫型，各自用冒号分隔，例如B:4:P1.15:L3，7，9。在血清群B中，有些谱系经常引发疾病(高侵袭性)，有些谱系比其他谱系引发更严重形式的疾病(超毒性)，其他的根本很少引发疾病。识别了7个超毒性谱系，即亚群I、III和IV-1、ET-5复合物、ET-37复合物、A4群落和谱系3。这些谱系已经通过多基因座酶电泳(MLEE)进行了定义，但是多基因座序列分型(MLST)也已经用于脑膜炎球菌的分类[参考文献10]。4种主要的超毒性群落是ST32、ST44、ST8和ST11复合物。

术语“烷基”是指直链和支链形式的烷基基团。烷基基团可以被选自-O-、-NH-或-S-的1、2或3个杂原子中断。烷基基团也可以用1、2或3个双键和/或三键所中断。然而，术语“烷基”通常是指不含有杂原子中断或双键或三键中断的烷基基团。在提及C_1-12烷基的情况下，这意味着烷基基团可以包含介于1到12之间任何数目的碳原子(例如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂)。类似地，当提及C_1-6烷基时，意味着烷基基团可以包括介于1和6之间任何数目的碳原子(例如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆)。

术语“环烷基”包括环烷基、聚环烷基和环烯烃基，以及它们与烷基的组合，诸如环烷基烷基。环烷基可以用选自-O-、-NH-或-S-的1、2或3个杂原子中断。然而，术语“环烷基”通常是指不含有杂原子中断的环烷基。环烷基的实例包括环戊基、环己基、环己烯基、环己基甲基以及金刚烷基。在提及C_3-12环烷基的情况下，意味着环烷基可以包含介于3和12之间任何数目的碳原子(例如C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂)。

术语“芳基”是指诸如苯基和萘基的芳香基团。当提及C_5-12芳基时，这意味着芳基可以包含介于5和12之间任何数木的碳原子(例如C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂)。

术语“C_5-12芳基-C_1-6烷基”是指诸如苯甲基、苯乙基和萘甲基的基团。

氮保护基包括甲硅烷基(诸如TMS、TES、TBS、TIPS)、酰基衍生物(诸如苯邻二甲酰亚胺、三氟乙酰胺、甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z或Cbz)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基(Troc))、磺酰基衍生物(诸如β-三甲基甲硅烷基乙基磺酰基(SES))、亚磺酰基衍生物、C_1-12烷基、苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、9-苯基芴基等等。优选的氮保护基是Fmoc。

本发明一般不包括参考文献3、5、6和7中特别公开各种NMB1870序列，尽管这些NMB1870序列也可用于本发明，例如用于构建嵌合序列，等等。

附图简述

图1-6显示了NMB1870的3D模型。

图7显示了NMB1870的表面环转移。

图8显示了家族I NMB1870蛋白的12聚体肽扫描表位绘图(PepScan epitopemapping)。从上到下的3幅图是用抗NMB1870家族I、II和III的抗血清得到的结果。结果表示为任意染料单位(dye unit)。

图9显示了NMB1870片段的western印迹，用多克隆血清染色。

图10显示了采用抗不同NMB1870片段的抗血清得到的FACS分析结果。

图11显示了NMB1870家族I、II或III菌株的western印迹，用单克隆抗体mAb502(左印迹)或用多克隆抗-NMB1870血清(右印迹)染色。

图12显示了NMB1870片段的western印迹，用mAb502染色。

图13显示了NMB1870片段的斑点印迹，用mAb502染色。分别检测结构域A-C。还检测了结构域B-C片段以及结构域B和C的混合物。

图14和15显示了细菌的FACS分析结果。三行分别用不同抗体染色：上＝mAb502；中＝多克隆血清；下＝抗荚膜糖类的单克隆抗体(阳性对照，SEAM3)。图14中的三列均为家族I菌株：MC58、M2934和BZ83。图15中的三列栏不表示家族I NMB1870：菌株MC58的？NMB1870同基因敲除；家族II菌株961-5945；家族III菌株M1239。

图16显示了NMB1870_MC58序列(SEQ ID NO：1)从残基120到274的亲水性和二级结构分析。

实施本发明的方式

表位绘图

NMB1870_MCS812聚体和10聚体片段被用于‘肽扫描’表位绘图。将该片段固定在纤维素膜上，与抗以下三个NMB1870家族各自一种菌株的抗血清反应：(I)MC58；(II)2996；和(III)M1239。12聚体分析的结果示于图8。

包含NMB1870大约前110个氨基酸的区域含有这三个家族共有的线性表位。残基120-183包含家族特异性表位。在更下游未发现阳性肽，说明这些序列埋在蛋白质的3D结构中因而不能引发血清中的任何抗体，或者这里的表位是不连续的且未见于‘肽扫描’分析。以下比对显示了与各种抗血清反应的NMB1870_MC58序列(SEQ ID NO：1)的区域：

(1)抗-MC58   MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHK DKGL

(2)抗-2996   MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAAD IGAGLADALTAPLDHKDKGL

(3)抗-M1239  MNRTAFCCLSLTTALI LTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGL

(1)抗-MC58    QSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKND KVSRFDFIRQ

(2)抗-2996    QSLTLDQSVRKNEKLK LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQ

(3)抗-M1239   QSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSR FDFIRQ

(1)抗-MC58      IEVDGQLITLESGEFQVYKQSH SALTAFQTEQIQDSEHSGKM VAKRQFRI

(2)抗-2996      IEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI

(3)抗-M1239     IEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI

(1)抗-MC58      GDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKI

(2)抗-2996     GDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKI

(3)抗-M1239    GDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKI

(1)抗-MC58     EHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA

(2)抗-2996     EHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA

(3)抗-M1239    EHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA

(1)抗-MC58     QEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

(2)抗-2996     QEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

(3)抗-M1239    QEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

因此，所有三个家族的共有表位是DKGLQSLTLDQSVR(SEQ ID NO：21)和FDFIRQIEVDGQLI(SEQ ID NO：22)。

根据表位绘图结果，可将NMB1870序列分成三个抽象的结构域：

(A)氨基酸1-119(SEQ ID NO：4)

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKL

KLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYK

(B)氨基酸120-184(SEQ ID NO：5)

QSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGG

(C)氨基酸185-274(SEQ ID NO：6)

KLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGG

KAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

这些结构域分别表达为含有结构域A、B或C(SEQ ID NO：4-6)的蛋白质，一起表达为含有A-B(SEQ ID NO：23)或B-C(SEQ ID NO：24)的蛋白质。

在构建这些蛋白质时使用以下寡核苷酸引物，并引入NdeI和XhoI限制性位点：

蛋白质	引物SEQ ID NO(正向和反向)
		(A)	25和26
(B)	27和28
		(C)	29和30
(A)(B)	31和32
		(B)(C)	33和34

采用多克隆抗-NMB1870_MC58作为标记的结构域A(截短，从VAA开始)、B和C的western印迹示于图9。还包括融合体AB和BC。印迹的之后一道含有全长蛋白。

在FACS分析中，抗各结构域A、B和C的抗血清能够结合全细胞(图10)。结构域A和C的荧光位移最强，说明它们是更可免疫接近的(immunoaccessible)。没有抗血清能识别？NMB1870敲除菌株。

用CFA或氢氧化铝(AH)作为佐剂在小鼠中产生抗蛋白质(和抗对照蛋白)的血清，抗三种不同脑膜炎球菌菌株的SBA结果如下：

蛋白质	MC58家族IB:15:P1.7，16b(ET5)		961-5945家族IIB:2b:P1.21，16(A4)		M1239家族IIIB:14:P1.23，14(lin.3)
							CFA	AH	CFA	AH	CFA	AH
	A	＜4	16	＜4	＜4	＜4							＜4
B							＜4	＜4	＜4	＜4	＜4	256
	C	＜4	512	＜4	＜4	＜4							＜4
AB							＜4	＜4	256	256	＜4	＜4
	BC	32768	8192	＜4	＜4	＜4							＜4
	SEQ ID NO：1	524288	16384	2048	＜8	＜4							＜4
SEQ ID NO：2							＜4	＜4	16384	2048	＜4	128
	SEQ ID NO：3	＜4	＜4	2048	1024	16384							4096

因此，在SEQ ID NO：1(MC58)内，最重要的杀菌表位要求同时存在结构域B和C(结构域BC)。这说明，该蛋白质可能包含由这两种结构域的序列构成的不连续表位[参考参考文献237]。

此外，能够被动保护大鼠免遭脑膜炎球菌感染的单克隆抗体Jar1、Jar3和Jar4能识别BC结构域，但不识别单独的结构域B或C。类似地，Jar5能识别AB结构域，但不识别单独的结构域A或B。

该工作的其它细节可见参考文献238。

嵌合蛋白-B_M1239-C_MC58

为研究BC结构域诱导的高杀菌活性，从家族III结构域B(M1239菌株)和家族I结构域C(MC58菌株)构建了杂合BC结构域。家族I和III的B结构域显示有43.8％的相同性。

SEQ ID NO：1是血清群B菌株MC58的全长家族I NMB1870序列。该序列分成三个结构域：(A)aa 1-119；(B)aa 120-183；(C)aa 184-274。

SEQ ID NO：3是来自血清群B菌株M1239的全长家族III NMB1870序列。该序列也可分成三个结构域：(A)aa 1-127；(B)aa 128-190；(C)aa 191-286。

采用特定菌株的染色体DNA作为模板和以下引物，通过PCR扩增编码M1239的B结构域和MC58的C结构域的DNA片段：

		序列(SEQ ID NO：)	限制性位点
				B(m1239)C(mc58)-His	正向	CGCGGATCC CATATG-CAGAACCACTCCGCCGT(35)	NdeI
反向	GCCC AAGCTT-GCCATTCGGGTCGTCGG(36)	HindIII
			正向		GCCC AAGCTT-AAACTGACCTACACCATAGA(37)	HindIII
反向	CCCG CTCGAG-TTGCTTGGCGGCAAGGC(38)	XhoI

扩增的片段作为NdeI/HindIII和HindIII/XhoI片段依次克隆入pET 21b+。最终的B_M1239C_MC58序列为SEQ ID NO：43，通过HindIII限制性位点引入位于结构域C_MC58起点的KL序列。

将蛋白质表达为C-末端His-标签融合蛋白、纯化并用来免疫小鼠(用AH或FCA作为佐剂)。分析血清抗三个NMB1870家族代表性菌株的杀菌活性。其效价如下：

	佐剂	脑膜炎球菌菌株
					MC58家族I	M1239家族III	961-5945家族II
		B(M1239)-C(MC58)-His	FCA	64				＜4	4
B(M1239)-C(MC58)-His	AH				128	＜4	16
		B-C(MC58)-His	FCA	32768				＜4	-
B-C(MC58)-His	AH				8192	＜4	-

B(1239)-C(MC58)嵌合体诱导的抗MC58的效价低于B(MC58)-C(MC58)对照诱导的效价，且 抗M1239菌株。这些结果证实，在B-C嵌合体中，B结构域的序列对于诱导杀菌抗体是重要的，且结构域B和C最好不要分开。

在western印迹中，单克隆IgG2a抗体(mAb502)识别仅存在于家族I蛋白质上的表位(图11)，而不识别任何单独的结构域A、B和C(图12)，但却识别结构域B-C片段。这些结果也见于单独的结构域A、B和C或结构域B-C片段的斑点印迹中(图13)。此外，然而该抗体识别分离的结构域B和C的混合物，这说明该抗体所识别的表位可在体外重建并可由这两个结构域上的氨基酸残基形成。该单克隆抗体不识别任何肽扫描片段。

因此，结构域B和C毗邻可形成构象表位。

嵌合蛋白-BC₂₉₉₆-BCM₁₂₃₉

SEQ ID NO：2是来自血清群B菌株2996的全长家族II NMB1870序列。该序列可分成三个结构域：(A)aa 1-119；(B)aa 120-182；(C)aa 183-273。

菌株2996的结构域B和C通过富含甘氨酸的接头(SEQ ID NO：17；BamHI限制性位点的GS；SEQ ID NO：18作为聚-甘氨酸接头)与菌株M1239的结构域B和C结合形成BC_IIBC_III嵌合体(SEQ ID NO：44)。用特定菌株的染色体DNA作为模板，采用以下引物，通过PCR扩增编码该结构域的DNA：

		序列(SEQ ID NO：)	限制性位点
				BC(2996)BC(M1239)-His	正向	CGCGGATCC CATATG-CAGGACCACTCCGCCG(39)	NdeI
反向	CGC GGATCC-CTGTTTGCCGGCGATGCC(40)	Bam-HI
			正向		CGC GGATCC-GGGGGGGGGGGGCAGMCCACTCCGCCGT(41)	BamHI
反向	CCC AAGCTT-CTGTTTGCCGGCGATGCC(42)	HindIII

将序列作为Nde I/Bam HI和Bam HI/Xho I片段依次克隆入pET 21b+。将蛋白质表达为C-末端His-标签融合蛋白、纯化并用来免疫小鼠。

简言之，使用铝佐剂或弗氏佐剂，用20μg蛋白质腹膜内免疫10只雌性CD1小鼠。单独或联用参考文献239第33页披露的“三种蛋白质”的组合给予这种蛋白质。进行3次免疫，第三次免疫两周后采集血清，分析抗三个NMB1870家族代表性菌株的杀菌活性。抗各NMB1870家族的三种示例性菌株的效价如下：

测试抗以下菌株的血清	ET	国家	分型	NMB1870家族	NabA	BC2996-BCM1239		BC2996-BCM1239+三联疫苗
										AH	FCA	AH	FCA
						394/98	lin3	NZ	B:4:P1.4					1	-	＜4	＜4	2048	8192
44/76	ET5	NO	B:15:P1.7，16	1	-					8	8	65536	＞524288
						MC58	ET5	UK	B:15:P1.7，16b					1	+	＜4	4	16384	512
961-5945	A4	AUS	B:2b:P1.21，16	2	+					512	8192	2048	32768
						NGH38	其它	NO	B:NT:P1.3					2	-	256	1024	16384	16384
M2552	其它	USA	B:NT:NT	2	-					128	128	512	4096
						M1239	lin3	USA	B:14:P1.23，14					3	-	256	1024	1024	8192
M3369	其它	USA	B:10:P1.19，15	3	-					2048	＞8192	512	2048
						M01-0240988	其它	UK	B:1:P1.22，14					3	+	1024	4096	4096	＞8192

因此，家族II和III的融合BC结构域有良好的抗-II和抗-III活性，但如所预期的，不能提供显著的抗-I活性。融合的BC结构域的SBA效价低于全长(？G)NMB1870序列融合体的效价。

嵌合蛋白-BC_MC58-RC_M1239-BC₂₉₉₆

采用类似方法构建所有三个NMB1870家族的BC结构域嵌合体。采用以下引物扩增结构域：

		序列(SEQ ID NO：)	限制性位点
				BC(mc58)	正向	CGCGGATCC CATATG-CAAAGCCATTCCGCCTTAA(46)	NdeI
反向	CGC GGATCC-TTGCTTGGCGGCAAGGC(47)	BamHI
			BC(M1239)		正向	CGC GGATCC-GGGGGGGGGGGGCAGAACCACTCCGCCGT(48)	BamHI
反向	CCC AAGCTT-CTGTTTGCCGGCGATGCC(49)	HindIII
				BC (2996)-His	正向	CGC GGATCC-GGGGGGGGGGGG-CAGGACCACTCCGCCG(50)	HindIII
反向	CCCG CTCGAG-CTGTTTGCCGGCGATGCC(51)	XhoI

最终的序列如SEQ ID NO：52所示，家族I序列通过SEQ ID NO：17(BamHI限制性位点，然后是聚-Gly接头)连接到家族III序列，家族III序列通过SEQ ID NO：45(HindIII限制性位点，然后是聚-Gly接头)连接到家族II序列。

制备了其它嵌合体，其中BC结构域的顺序为I-II-III而不是I-III-II。在杀菌试验中测试这种嵌合体，并测试了家族II菌株与家族III菌株相融合的BC结构域的嵌合体和SEAM-3阳性对照。结果如下：

	菌株	BCII-BCIII	BCI-BCII-BCIII	SEAM-3
					I	394/98	＜4	＜16	16384
44/76	8	65536	16384
				CU385		＜16	＞8192	16384
MC58	4	131072	16384
				II		NGH38	1024	512	32768
C11	＜16	512	8192
					2996	＜32	512	32768
5/99	＜16	＜16	8192
					D8221	256	512	2048
M2552	128	1024	4196
					M4458	＜16	＜16	4196
M6208	512	2048	8192
					M5258	＜16	＜16	4096
961-5945	8192	16384	8192
					M4287	＜16	256	8192
M01-240013	＜16	＜16	4096
					B3937	512	8192	8192
III	M1239	1024	4096						2048
				M3369	＞8192	32768	8192
	M01-0240988	4096	4096					4096

因此，在除一种情况(NGH38)之外的所有情况中，三嵌合体的结果好于双嵌合体。该发现对于家族I菌株并不奇怪，因为双嵌合体不含该家族的NMB1870序列。然而即便对于家族II和III结果也得到改善。显著的是，三嵌合体对家族II菌株的效价≥128的数目为9/13，而双嵌合体的仅为6/13。

单克隆抗体502

为选择具有杀菌活性的抗-NMB1870单克隆抗体，用家族I NMB1870_MCS8免疫CD1小鼠。在纯化的蛋白质和完整的MC58细胞上通过ELISA评价各小鼠的多克隆血清的抗体结合，并评价补体介导的抗MC58的杀菌活性。根据这些结果选择高反应小鼠的脾(细胞)与骨髓瘤细胞融合。分离产生抗体的一些杂交瘤细胞系并通过抗纯化蛋白质或抗MC58完整细菌细胞的阳性ELISA筛选。选择抗MC58菌株的IgG2a同种型单克隆抗体，MAb502用于进一步的研究。该抗体识别通过ELISA纯化的蛋白并在菌株MC58的FACS分析中呈阳性。

针对三种变体各自的NMB1870的Western印迹分析证实，mAb502识别仅存在于家族I序列中的表位。相反，多克隆血清识别所有三种变体。单克隆mAb502用于针对许多家族I菌株的FACS分析。在各种情况下，该抗体识别细胞表面抗原(图14，上行)。荧光位移不如使用抗-NMB 1870多克隆(中间行)或使用抗-荚膜单克隆SEAM3(下行)时那么大，但结合是特异性的。相反，mAb502不识别？NMB1870敲除菌株(图15，左列)，且不识别家族II或家族III菌株(中间列和右列)。抗-荚膜阳性对照识别所有未被识别的菌株(图15，下行)。

嵌合蛋白-NMB1870_MC58-NMB1870_M1239-NMB1870₂₉₉₆

提供含有所有三个NMB1870家族的单个多肽的另一种方法是，将全长蛋白(除了将N末端略微截短，直到包含天然聚-Gly序列，即？G蛋白)融合以制备三嵌合序列SEQ ID NO：53。家族I序列通过SEQ ID NO：19(BamHI限制性位点，然后是淋球菌接头，SEQ ID NO：20)连接到家族III序列，家族III序列通过SEQ ID NO：54(HindIII限制性位点，然后是淋球菌接头)连接到家族II序列。用以下引物扩增后该蛋白质表达为C-末端His-标签融合蛋白：

		序列(SEQ ID NO：)	限制性位点
				ΔG (MC58)	正向	CGCGGATCC CATATG-GTCGCCGCCGACATCG(55)	NdeI
反向	CGC GGATCC-TTGCTTGGCGGCAAGGC(56)	BamHI
			fu(ΔGmc58)-chimΔG(m1239)		正向	CGC GGATCC-GGCCCTGATTCTGACCG(57)	BamHI
反向	CCC AAGCTT-CTGTTTGCCGGCGATGCC(58)	HindIII
				fu(chimΔGm1239)-chimΔG(2996)-His	正向	CGC GGATCC-GGCCCTGATTCTGACCG(59)	HindIII
反向	CCCG CTCGAG-CTGTTTGCCGGCGATGCC(60)	XhoI

在30℃生长后该蛋白质可作为可溶性产物纯化。

将纯化的三嵌合体(3-C)蛋白给予小鼠，在抗菌试验中测试所得血清，使用氢氧化铝(AH)或完全弗氏佐剂。还测试了抗同源NMB1870蛋白(用AH作为佐剂)的血清：

佐剂	家族I菌株
													MC58	M2197	BZ133	F6124	M2937	LNP17592	NZ98/254	M4030	GB185	M6190	GB345
3-C AH	131072	4096	＞8192	＞8192	＞8192	＞8192	＞8192	＞8192	4096	＞8192	＞8192
												3-C FCA	16384	2048	8192	8192	＞8192	＞8192	4096	＞8192	1024	2048	4096
Homol AH	16384	512	1024	1024	1024	512	64	2048	32	128	512
													家族II菌株
	2996	961-5945	GB013	5/99	M986	M2671	M2552	BZ232	M0579
												3-C AH	2048	＞8192		1024	＜16			＞8192	＜16
3-C FCA	1024	＞8192		256	＜16			2048	＜16
												Homol AH	1024	2048	＜16	＜16	＜16	＜16	128	＜16
	家族III菌株
													GB364	M3369	M1239	NGP165	GB988
3-C AH	＞8192	＞8192	＞8192	＞8192	＞8192
												3-C FCA	＞8192	＞8192	＞8192	4096	8192
Homol AH	1024	4096	16384	＜16	2048

因此，在几乎所有情况中，三嵌合蛋白得到的杀菌血清优于各同源蛋白。因此三嵌合体提供了以下两个优点：(1)在单个蛋白质中涵盖所有NMB1870家族；和(2)相对于单个同源NMB1870蛋白，增强了杀菌反应。

结构域免疫原性的比较

制备MC58？G-NMB1870序列(家族I)单独的A、B和C结构域以及AB和BC融合体，都具有C-末端His-标签。用它们来免疫小鼠并测试血清对各NMB 1870家族的菌株的杀菌活性。为进行比较还测试了对三个家族的？G-NMB1870序列起反应产生的血清。蛋白质用氢氧化铝或FCA作为佐剂。结果如下：

	佐剂	MC58B:15:P1.7，16bET5	961-5945B:2b:P1.21，16A4	M1239B:14:P1.23，14lin.3
					A	FCA	＜4	＜4	＜4
A	AH	16	＜4	＜4
					B	FCA	＜4	＜4	＜4
B	AH	＜4	＜4	256
					C	FCA	＜4	＜4	＜4
C	AH	512	＜4	＜4

AB	FCA	＜4	256	＜4
					AB	AH	＜4	256	＜4
BC	FCA	32768	＜4	＜4
					BC	AH	8192	＜4	＜4

MC58	FCA	524288	2048	＜4
					MC58	AH	16384	＜8	＜4
2996	FCA	＜4	16384	＜4
					2996	AH	＜4	2048	128
M1239	FCA	＜4	2048	16384
					M1239	AH	＜4	1024	4096

因此，单独的结构域不是特别有效的免疫原，AB结构域也不是特别有效，但BC结构域显示出良好活性。

BC结构域的3D模型

将MC58序列提交到HMMSTR/Rosetta服务器以获得BC结构域超二级结构的预测[240]。结果示于图1。

对3D结构进行VAST检索[241]以便找到与已解析的(solved)蛋白质结构的相似性以及细分(refine)环。VAST结果(图2)为：

NMB1870       RHAVISGSVLYNQa--EKGSYSlg----iFGGKa-----QEVA

1K32_A 311    IAFVSRGQAFIQDvsgTYVLKVpeplrirYVRRggdtkvAFIH 353

使用VAST结果，对229-259片段(图2，右上方)进一步建模并沿图2的虚线在主链中引入转角加以修饰。通过能量最低化精制所得模型从而得到图3所示最终模型。

该模型示于图6，高亮显示表面环。

表面表位绘图

将在western印迹(mAb502)中识别的菌株的NMB1870序列的BC结构域进行多序列比对揭示了各种序列信息。与抗体结合的所有菌株都含残基Arg223，但在印迹中未被识别的菌株内该残基是His。即便如此，不是所有具有Arg223的序列都产生杀菌血清，因此，总的杀菌表位必需广于该单个残基。

这种比对鉴定了可能涉及特定杀菌表位形成的其它残基：Phe128(F)、Ile133(I)、Asn197(N)、Gly2217(G)、Lys249(K)、Lys260(K)和Val262(V)。所有这些氨基酸(下面用灰色背景表示)在BCA-阳性的ET-5菌株(如MC58)中均完全保守的，但在BCA-阴性菌株中不同：

根据与杀菌多克隆血清反应的菌株的序列比对的类似工作鉴定了以下残基：Phe128、Ile133、Asn197和Gly221。用单克隆抗体鉴定的残基Lys249、Lys260和Val262在此阶段被弃去，因为这三个残基在BCA-阴性菌株(M2197)的NMB1870序列中是保守的。

从NMB1870的3D模型可见，Phe134和Ile139位于预测的α螺旋内，因此抗体不易接近。另一方面，Asn197和Gly221都包含在表面环内并充分暴露。Gly221和Asn197在空间上都接近Arg223，因此可能是该表位的一部分。就Gly221而言，BCA-阴性菌株通常用Glu或Lys取代这种小的中性氨基酸，Glu和Lys的体积都较大且带有电荷。这种取代可损害抗体对该表位的正确识别和结合。

因此，这种分析揭示了5个关键氨基酸：Phe128、Ile133、Asn197、Gly221和Arg223。当将这些残基绘制成3D模型时(图4)，其中的3个集中于蛋白质表面(图5)。将二级结构预测的比对(图16)也显示Ile133、Asn197、Gly221和Arg223位于亲水区内(即表面环内)。

其它的重要残基可能是215-216位的二肽AD，在大多数BCA-阴性菌株中它被AY取代，在一些弱反应者(responder)中被SD取代。

如下突变氨基酸197、221和223：

原始氨基酸	Asn-197	Gly-221	Arg-223	Asn-197 & Gly-221
					取代	His	Lys	His	His & Lys

诱变采用Invitrogen的GeneTailor^TM SDM系统。按照使用手册说明设计如下所示含有密码子改变的内部引物：

引物	序列(SEQ ID NO：)	突变
			741(1)-N197H正向741(1)-N197H反向	GATTTCGCCGCCAAGCAGGGAcACGGCAAAATCGAA(SEQ ID NO：66)TCCCTGCTTGGCGGCGAAATCTATGGTGTAGGT(SEQ ID NO：67)	AAC→cACN→H
741(1)-G221K正向741(1)-G221K反向	GCCGCCGATATCAAGCCGGATaaAAAACGCCATGCC(SEQ ID NO：68)ATCCGGCTTGATATCGGCGGCGGCCAGGTCGAC(SEQ ID NO：69)	GGA→aaAG→K
			741(1)-R223H正向741(1)-R223H反向	GATATCAAGCCGGATGGAAAACaCCATGCCGTCATCAGC(SEQ ID NO：70)TTTTCCATCCGGCTTGATATCGGCGGCGGCCAGGTC(SEQ ID NO：71)	CGC→CaCR→H

为产生各个突变体，在甲基化反应中用100ng pET-？G741(1)-His质粒DNA作为模板，然后将12.5ng甲基化的质粒作为诱变反应的基质，采用以下引物对：

                    741(1)-N197H正向/741(1)-N197H反向

                    741(1)-G221K正向/741(1)-G221K反向

                    741(1)-R223H正向/741(1)-R223H反向

按照GeneTailor^TM定点诱变系统(Site-Directed Mutagenesis System)的使用手册进行PCR。反应之后，在1％琼脂糖凝胶上分析10μl产物，然后按照手册说明将2μl诱变反应混合物转化入DH5a^TM-T1^R大肠杆菌菌株。通过质粒分离(QIAprep SpinMiniprep Kit，QIAGEN^TM)和测序来分析阳性菌落。为产生双突变体？G741₍₁₎-His-N197H-G221K，将阳性突变体？G741(1)-His-G221K的DNA用作下一个的基质，使用相应的引物对741₍₁₎-N197H正向/741₍₁₎-N197H反向。

为将重组蛋白表达为C末端-His-标签融合体，用1.5μl各构建物来转化大肠杆菌BL21-DE3菌株。将单个重组菌落接种到4ml LB+Amp(100μg/ml)，37℃孵育过夜，然后以1∶30稀释入125ml烧瓶中的20ml LB+Amp(100μg/ml)，使OD_600nm在0.1和0.2之间。然后将烧瓶在转动水浴摇床内37℃孵育至OD_600nm表明(到达)适合诱导表达的指数生长(0.4-0.8OD)。加入1.0mM IPTG诱导蛋白质表达。37℃孵育3小时后测量OD_600nm并检测表达。在离心机中离心1.0ml各种样品，将沉淀物重悬于PBS并通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析。所有突变体和野生型都得到表达，并在37℃作为可溶形式纯化。

环取代

根据3D模型和表位绘图工作，可将NMB1870家族II和家族III的表面环转移到家族I的框架中。

对于环1而言，该氨基酸序列在所有家族II和家族III的菌株中100％保守。在所有三个家族中，环1的侧翼是可能有助于环的正确暴露/折叠的两个α螺旋(在序列中不保守)。家族I M6190序列中未发现Gly140残基，并且尽管单克隆Jar3和Jar5结合家族I序列，但它们无法结合M6190，这进一步证实该环对于表位重要。选择家族II序列以插入家族I的框架。

环2对应于杀菌表位。该位置上家族II和III之间的不同仅为Asp/Gly取代。分析家族II菌株的杀菌反应提示了Asp残基的关键作用，因此选择家族II序列。

环3在家族II和III中高度可变，但在家族I中保守。在家族II中，大多数菌株具有序列PNG，但家族III中的大多数菌株具有AGG。尽管该环似乎不是保护所必需的(PNG菌株能够保护抵抗家族III AGG菌株)，但为涵盖这两种可能性用PN取代家族I的AG序列。

环4中的Asn197已被鉴定为区分家族I的BCA-阳性和BCA-阴性菌株的重要残基，它在ET-5菌株中总是保守的。该残基在所有家族II菌株和家族III菌株的亚群中被His取代。此外，His也存在于一些家族I菌株中。因此His用于该环以覆盖家族II和III，以及任何未被MC58序列覆盖的家族I序列。

环5、环6和环7在家族II和III中相同，但在家族I中不同。对于这三个环使用家族II/III序列。该环内的第二个残基是Gly而不是Val，这是由于对产生的抗菌株2996蛋白的血清易感的家族II菌株在该位置具有这个残基。

将SEQ ID NO：1变为SEQ ID NO：61的取代示于图7。环1、2和4接受了家族II的序列；环3接受了家族III的序列；环5、6和7接受了家族II和III中共有的序列。在总共274(SEQ ID NO：1)和273(SEQ ID NO：61)个氨基酸中有28个取代，表面环交换后的总体相同性仍＞90％。

进行一系列环取代。该系列中制备了7种蛋白质，按顺序取代？GNMB1870_MC58序列的各个环。7种取代的蛋白质被称为LP₁、LP₂、…、LP₇。LP₇突变体是SEQ ID NO：61。

该工作采用GeneTailor^TM SDM系统(见上文)，使用以下引物：

引物	序列	SEQ ID NO
			741(1)-LP1正向741(1)-LP1反向	GCCTTTCAGACCGAGCAAATAaAcaAccCGGAcaAaatCGacAgcATGGTTGCGAAACGCTATTTGCTCGGTCTGAAAGGCGGTTAAGGCGGA	7273
741(1)-LP2正向741(1)-LP2反向	GGCGAACATACATCTTTTGACcAGCTTCCCGAcGGCaaaAGGGCGACATATCGCGTCAAAAGATGTATGTTCGCCCGCTATGTCGCC	7475
			741(1)-LP3正向741(1)-LP3反向	ACGGCGTTCGGTTCAGACGATcCgaaCGGAAAACTGACCTACATCGTCTGAACCGAACGCCGTCCCGCGATATGTCGC	7677
741(1)-LP4正向	GATTTCGCCGCCAAGCAGGGAcACGGCAAAATCGAA	78
			741(1)-LP4反向	TCCCTGCTTGGCGGCGAAATCTATGGTGTAGGT	79
741(1)-LP5正向	CTGGCCGCCGCCGATATCAAGgCcGATGaAAAAaGCCATGCCGTCATC	80
			741(1)-LP5反向	CTTGATATCGGCGGCGGCCAGGTCGACATTGAG	81
741(1)-LP6正向	ATCAGCGGTTCCGTCCTTTACggCagcGaaGAGAAAGGCAGT	82
			741(1)-LP6反向	GTAAAGGACGGAACCGCTGATGACGGCATGGCG	14
741(1)-LP7正向	GCCGGCAGCGCGGAAGTGAAAAtCGgcgAaaaggTACaCgAaATCGGCCTTGCCGCC	15
			741(1)-LP7反向	TTTCACTTCCGCGCTGCCGGCAACTTCCTGGGCTTT	16

所有蛋白质和野生型蛋白质都得到表达，并且可在37℃生长后作为可溶性产物纯化。蛋白LP₁、LP₂、…、LP₇被用来免疫小鼠，并测试所得血清对血清群B脑膜炎球菌各种不同菌株的活性，其中包括至少三种来自各NMB1870家族的菌株。还测试了起始的蛋白质(LP0)。蛋白质的佐剂为氢氧化铝(AH)或FCA(F)。下表中，各行(最后一行除外)显示了对9种示例性菌株测得的单一血清的SBA。最后一行显示了用同源NMB1870的野生型抗原获得的血清的活性(即测试抗MC58等的抗-NMB1870_MC58血清)：

蛋白质佐剂		MC58	NZ 98/254	M4030	2996	961-5945	M2552	M1239	GB364	GB988
											ET 5	Lin..3	其它	A4	A4	其它	Lin.3	ET37	其它
		B:15:P1.7，16b	B:4:P1，4	B:17:P1，19，15	B:2b:P1.5，2	B:2b:P1.21，16	B	B:14:P1.23，14	B:2a:P1.5，2	B:1:P1.22，14
											NMB1870家族I			NMB1870家族II			NMB1870家族III
		LPO	F	16384	＜16	4096	64	128	＜16	＜16										256*	＜16
LP0	AH										8192	＜16	256	＜4	64	＜16	＜16	＜16	＜16
		LP1	F	32768	256	8192	＜4	512	128	＜16										512	＜16
LP1	AH										8192	64	2048	＜4	1024	128	＜16	256	＜16
		LP2	F	16384	＜16	4096	256	2048	256*	＜16										2048	＜16
LP2	AH										4096	128	1024	128*	4096	128	＜16	512	＜16
		LP3	F	65536	512	4096	256	4096		＜16										1024	256
LP3	AH										16384	256	1024	＜16	128		＜16	256	64
		LP4	F	65536	2048	8192	128*	2048		＜16										1024	1024
LP4	AH										16384	256	256	＜16	64		＜16	128	128
		Hom	AH	16384	64	2048	1024	2048	128	16384										1024	2048

^*＝血清是抑菌的

从LP0(无取代；NMB1870；家族I)经过LP1、LP2等直至LP7，产生的抗蛋白质的血清抗NMB1870是家族II或家族III的菌株的活性越来越强。与之前的预期不同，当用家族II/III的序列取代家族I的序列时，抗家族I菌株的杀菌反应有上升趋势。

因此，SEQ ID NO：61用家族II和III的表面表位代替了家族I的表位。这种嵌合多肽可用来产生抗家族II和III的NMB1870的抗体，并且可与正常的家族I序列组合以得到多家族抗原性。这种组合可以是两种分离的多肽的混合物，或者可以是杂交体的形式[7]，例如，NH₂-X₁-SEQ：61-X₂-SEQ：1-X₃-COOH、NH₂-X₁-SEQ：1-X₂-SEQ：61-X₃-COOH等等。

新的NMB1870序列

可获得更多NMB 1870的序列信息[例如，参考文献3、5、6和7]。也已经发现了其它新的NMB1870序列。

菌株4243的序列示于SEQ ID NO：62，其始于成熟蛋白质的N-末端半胱氨酸。被切割的前导肽与正常的家族I序列相同。

在菌株M.01.0240320(‘gb320’；SEQ ID NO：63)和菌株S10026(SEQ ID NO：64)中已经发现了NMB1870的第四个家族。m3813(参考文献的SEQ ID NO：21；这里的SEQ ID NO：65)也可被归类为家族IV。

应当理解，以上仅通过举例对本发明进行了描述，可以对其进行改动而不会超越本发明的范围和精神。

序列表简述

SEQ ID NO	说明
		1	菌株MC58的NMB1870-家族I
2	菌株961-5945和2996的NMB1870-家族II
		3	菌株M1239的NMB1870-家族III
4-6	SEQ ID NO：1的结构域A-C
		7-9	SEQ ID NO：2的结构域A-C
10-12	SEQ ID NO：3的结构域A-C
		13	SEQ ID NO：4的成熟结构域A
14-16	SDM引物
		17-20	接头和表达序列
21-22	共有表位
		23	AB
24	BC
		25-42	引物
43	BM1239CMC58
		44	BC2996BCM1239

45	接头
		46-51	引物
52	BCMC58-BCM1239-BC2996
		53	NMB1870MC58-NMB1870M1239-NMB18702996
54	表达序列
		55-60	引物
61	表面环取代
		62-65	NMB1870序列
66-82	SDM引物

参考文献(其内容全文纳入本文以供参考)

[1]Jodar等，(2002)Lancet 359(9316)：1499-1508.

[2]WO99/57280.

[3]Masignani等，(2002)Expert Opin Biol Ther 2：895-905.

[4]Pizza等，(2000)Science 287：1816-1820.

[5]WO03/063766.

[6]Fletcher等，(2004)Infect Immun 72：2088-2100.

[7]WO2004/048404.

[8]Cartwight编的《流行性脑膜炎球菌病》(Meningococcal disease)，ISBN：0-471-95259-1，第159-175页，Achtman(1995)著《流行性脑膜炎球菌病的全球流行病学》(Global epidemiologyof meningococcal disease)。

[9]Caugant(1998)APMIS 106：505-525.

[10]Maiden等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3140-3145.

[11]Needleman & Wunsch(1970)J.Mol Biol 48，443-453.

[12]Rice等，(2000)Trends Genet 16：276-277.

[13]WO01/30390.

[14]Gennaro(2000)《雷明顿：制药科学与实践》(Remington：The Science and Practice ofPharmacy)，第20版，ISBN：0683306472.

[15]WO03/009869.

[16]Powell和Newman编的《疫苗设计…》(Vaccine design…)，ISBN：030644867X，Plenum.

[17]WO00/23105.

[18]WO90/14837.

[19]美国专利5,057,540.

[20]WO96/33739.

[21]EP-A-0109942.

[22]WO96/11711.

[23]WO00/07621.

[24]Barr等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：247-271.

[25]Sjolanderet等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：321-338.

[26]Niikura等，(2002)Virology 293：273-280.

[27]Lenz等，(2001)J Immunol 166：5346-5355.

[28]Pinto等，(2003)J Infect Dis 188：327-338.

[29]Gerber等，(2001)Virol 75：4752-4760.

[30]WO03/024480

[31]WO03/024481

[32]Gluck等，(2002)Vaccine 20：B10-B16.

[33]EP-A-0689454.

[34]Johnson等，(1999)BioorgMed Chem Lett 9：2273-2278.

[35]Evans等，(2003)Expert Rev Vaccines 2：219-229.

[36]Meraldi等，(2003)Vaccine 21：2485-2491.

[37]Pajak等，(2003)Vaccine 21：836-842.

[38]Kandimalla等，(2003)Nucleic Acids Research 31：2393-2400.

[39]WO02/26757.

[40]WO99/62923.

[41]Krieg(2003)Nature Medicine 9：831-835.

[42]McCluskie等，(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology 32：179-185.

[43]WO98/40100.

[44]美国专利6,207,646.

[45]美国专利6,239,116.

[46]美国专利6,429,199.

[47]Kandimalla等，(2003)Biochemical Society Transactions 31(第3部分)：654-658.

[48]Blackwell等，(2003)J Immunol 170：4061-4068.

[49]Krieg(2002)Trends Immunol 23：64-65.

[50]WO01/95935.

[51]Kandimalla等，(2003)BBRC 306：948-953.

[52]Bhagat等，(2003)BBRC 300：853-861.

[53]WO03/035836.

[54]WO95/17211.

[55]WO98/42375.

[56]Beignon等，(2002)Infect Immun 70：3012-3019.

[57]Pizza等，(2001)Vaccine 19：2534-2541.

[58]Pizza等，(2000)Int J Med Microbiol 290：455-461.

[59]Scharton-Kersten等，(2000)Infect Immun 68：5306-5313.

[60]Ryan等，(1999)Infect Immun 67：6270-6280.

[61]Partidos等，(1999)Immunol Lett 67：209-216.

[62]Peppoloni等，(2003)Expert Rev Vaccines 2：285-293.

[63]Pine等，(2002)J Control Release 85：263-270.

[64]Domenighini等，(1995)Mol Microbiol 15：1165-1167.

[65]WO99/40936.

[66]WO99/44636.

[67]Singh等，(2001)J Cont Release 70：267-276.

[68]WO99/27960.

[69]美国专利6,090,406

[70]美国专利5,916,588

[71]EP-A-0626169.

[72]WO99/52549.

[73]WO01/21207.

[74]WO01/21152.

[75]Andrianov等，(1998)Biomaterials 19：109-115.

[76]Payne等，(1998)Adv Drug Deliveiy Review 31：185-196.

[77]Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27：571-577.

[78]Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs 4：214-218.

[79]WO99/11241.

[80]WO94/00153.

[81]WO98/57659.

[82]欧洲专利申请0835318、0735898和0761231.

[83]WO99/24578.

[84]WO99/36544.

[85]Costantino等，(1992)Vaccine 10：691-698.

[86]Costantino等，(1999)Vaccine 17：1251-1263.

[87]WO03/007985.

[88]Watson(2000)Pediatr Infect Dis J 19：331-332.

[89]Rubin(2000)Pediatr Clin North Am 47：269-285，v.

[90]Jedrzejas(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65：187-207.

[91]Bell(2000)Pediatr Infect Dis J 19：1187-1188.

[92]Iwarson(1995)APMIS 103：321-326.

[93]Gerlich等，(1990)Vaccine 8增刊：S63-68 & 79-80.

[94]Vaccines(1988)eds.Plotkin & Mortimer.ISBN 0-7216-1946-0.

[95]Del Guidice等，(1998)Molecular Aspects of Medicine 19：1-70.

[96]Gustafsson等，(1996)N.Engl.J.Med.334：349-355.

[97]Rappuoli等，(1991)TIBTECH 9：232-238.

[98]Sutter等，(2000)Pediatr Clin North Am 47：287-308.

[99]Zimmerman & Spann(1999)Am Fam Physician 59：113-118，125-126.

[100]McMichael(2000)Vaccine 19增刊1：S101-107.

[101]Schuchat(1999)Lancet 353(9146)：51-6.

[102]WO02/34771.

[103]Dale(1999)Infect Dis Clin North Am 13：227-43，viii.

[104]Ferretti等，(2001)PNAS USA 98：4658-4663.

[105]Kuroda等，(2001)Lancet 357(9264)：1225-1240；也可参见第1218-1219页.

[106]EP-A-0372501

[107]EP-A-0378881

[108]EP-A-0427347

[109]WO93/17712

[110]WO94/03208

[111]WO98/58668

[112]EP-A-0471177

[113]WO00/56360

[114]WO91/01146

[115]WO00/61761

[116]WO01/72337

[117]Research Disclosure，453077(2002-01)

[118]Jones(2001)Curr Opin Investig Drugs 2：47-49.

[119]Ravenscroft等，(1999)Vaccine 17：2802-2816.

[120]WO03/080678.

[121]Nilsson & Svensson(1979)Carbohydrate Research 69：292-296)

[122]Mizrahi和Van Wezel编的《生物技术方法进展》(Advances in BiotechnologicalProcesses)第13卷，Frash(1990)所著，第123-145页.

[123]Inzana(19S7)Infect.Immun.55：1573-1579.

[124]Kandil等，(1997)Glycoconj J14：13-17.

[125]Berkin等，(2002)Chemistry 8：4424-4433.

[126]Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2：S28-36.

[127]Buttery & Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34：163-168.

[128]Ahmad & Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13：113-33，vii.

[129]Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47：563-567.

[130]欧洲专利0477508.

[131]美国专利5,306,492.

[132]WO98/42721.

[133]Cruse等编的《缀合疫苗》(Conjugate Vaccines)中Dick等著，10：48-114，Karger，Basel，1989.

[134]Hermanson《生物缀合技术》(Bioconjugate Techniques)，Academic Press，San Diego(1996)ISBN：0123423368.

[135]Kanra等，(1999)The Turkish Joumal of Paediatrics 42：421-427.

[136]Ravenscroft等，(2000)Dev Biol(Basel)103：35-47.

[137]WO97/00697.

[138]WO02/00249.

[139]Zielen等，(2000)Infect.Immun.68：1435-1440.

[140]Darkes & Plosker(2002)Paediatr Drugs 4：609-630.

[141]Tettelin等，(2001)Science 293：498-506.

[142]Hoskins等，(2001)J Bacteriol 183：5709-5717.

[143]Rappuoli(2000)Curr Opin Microbiol 3：445-450

[144]Rappuoli(2001)Vaccine 19：2688-2691.

[145]Masignani等，(2002)Expert Opin Biol Ther 2：895-905.

[146]Mora等，(2003)Drug Discov Today 8：459-464.

[147]Wizemann等，(2001)Infect Immun 69：1593-1598.

[148]Rigden等，(2003)Crit Rev Biochem Mol Biol 38：143-168.

[149]WO02/22167.

[150]Ramsay等，(2001)Lancet 357(9251)：195-196.

[151]Anderson(1983)Infect Immun 39(1)：233-238.

[152]Anderson等，(1985)J Clin Invest 76(1)：52-59.

[153]Falugi等，(2001)Eur J Immunol 31：3816-3824.

[154]EP-A-0594610.

[155]WO02/091998.

[156]WO99/42130

[157]WO96/40242

[158]Lees等，(1996)Vaccine 14：190-198.

[159]WO95/08348.

[160]美国专利4,882,317

[161]美国专利4,695,624

[162]POITO等，(1985)Mol Immunol 22：907-919.s

[163]EP-A-0208375

[164]WO00/10599

[165]Gever等，Med.Microbiol.Immunol，165：171-288(1979).

[166]美国专利4,057,685.

[167]美国专利4,673,574；4,761,283；4,808,700.

[168]美国专利4,459,286.

[169]美国专利4,965,338

[170]美国专利4,663,160.

[171]美国专利4,761,283

[172]美国专利4,356,170

[173]Lei等，(2000)Dev Biol(Basel)103：259-264.

[174]WO00/38711；美国专利6,146,902.

[175]WO02/09643.

[176]Katial等，(2002)Infect Immun 70：702-707.

[177]WO01/52885.

[178]欧洲专利0301992.

[179]Bjune等，(1991)Lancet 338(8775)：1093-1096.

[180]Fukasawa等，(1999)Vaccine 17：2951-2958.

[181]WO02/09746.

[182]Rosenqvist等，(1998)Dev.Biol.Stand.92：323-333.

[183]WO01/09350.

[184]欧洲专利0449958.

[185]EP-A-0996712.

[186]EP-A-0680512.

[187]WO02/062378.

[188]WO99/59625.

[189]美国专利6,180,111.

[190]WO01/34642.

[191]WO03/051379.

[192]美国专利6,558,677.

[193]WO2004/019977.

[194]WO02/062380.

[195]WO00/25811.

[196]Peeters等，(1996)Vaccine 14：1008-1015.

[197]Vermont等，(2003)Infect Immun 71：1650-1655.

[198]Kabat等，1987，引自《免疫感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，美国健康和人类服务部(US Department of Health and HumanServices)，NIH，USA

[199]Breedveld(2000)Lancet 355(9205)：735-740.

[200]Gorman & Clark(1990)Semin.Immunol.2：457-466

[201]Jones等，(1986)Nature 321：522-525

[202]Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci，USA.，81：6851-6855

[203]Morrison & Oi，(1988)Adv.Immunol，44：65-92.

[204]Verhoeyer等，(1988)Science 239：1534-36.

[205]Padlan(1991)Molec.Immun.28：489-98.

[206]Padlan(1994)Molec.Immunol.31：169-217.

[207]Kettleborough等，(1991)Protein Eng.4：773-83.

[208]WO98/24893

[209]WO91/10741

[210]WO96/30498

[211]WO94/02602

[212]美国专利5,939,598.

[213]Conrath等，(2003)Dev Comp Immunol 27：87-103.

[214]Muyldermans(2001)J Biotechnol 74：277-302.

[215]Huston等，(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：5879-5883.

[216]美国专利5,091,513

[217]美国专利5,132,405

[218]美国专利4,946,778

[219]Pack等，(1992)Biochem 31：1579-1584

[220]Cumber等，(1992)J.Immunology 149B：120-126

[221]Radrizzani M等，(1999)Medicina(B Aires)59(6)：753-8.

[222]Radrizzani M等，(2000)Medicina(B Aires)60增刊2：55-60.

[223]美国专利4,011,308

[224]美国专利4,722,890

[225]美国专利4,016,043

[226]美国专利3,876,504

[227]美国专利3,770,380

[228]美国专利4,372,745

[229]Kohler & Milstein(1975)Nature 256：495-497

[230]Inbar等，(1972)Proc.Nat.Acad.Sci USA 69：2659-2662

[231]Hochman等，(1976)Biochem 15：2706-2710

[232]Ehrlich等，(1980)Biochem 19：4091-4096

[233]Siegel，Transfus.Clin.Biol.(2002)9(1)：15-22；

[234]Sidhu，Curr.Opin.Biotechnol(2000) 11(6)：610-616；

[235]Sharon等，Comb.Chem.High Throughput Screen(2000)3(3)：185-196；

[236]Schmitz等，Placenta，(2000)21增刊A：S106-12

[237]Bartoloni等，(1988)Bio/technology 6：709-712.

[238]Giuliani等，(2005)Infect Immun 73：1151-60.

[239]WO2004/032958.

[240]http://www.bioinfo.rpi.edu/～bystrc/hmmstr/server.php

[241]http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml

Claims (32)

1.一种嵌合NMB1870蛋白，所述蛋白包含不同NMB1870家族的NMB1870部分。

2.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含：(a)第一NMB1870家族的结构域‘B’序列；和(b)第二NMB1870家族的结构域‘C’序列，其中，第一和第二家族彼此不同并选自NMB1870的家族I、家族II或家族III，且其中，(i)所述嵌合多肽不含第一NMB1870家族的结构域‘C’序列，和/或(ii)所述嵌合多肽不含第二NMB1870家族的结构域‘B’序列，且其中，(1)结构域‘B’是所述NMB1870的片段，当用配对比对算法与SEQ ID NO：1比对时，该片段始于与SEQ ID NO：1的Gln-120对准的氨基酸终于与SEQ ID NO：1的Gly-183对准的氨基酸；和(2)结构域‘C’是所述NMB1870的片段，当用配对比对算法与SEQ ID NO：1比对时，该片段始于与SEQ IDNO：1的Lys-184对准的氨基酸终于与SEQ ID NO：1的Gln-274对准的氨基酸。

3.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含：(a)第一NMB1870家族的结构域‘B’序列；和(b)第二NMB1870家族的结构域‘C’序列，其中，第一和第二家族彼此不同并选自NMB1870的家族I、家族II或家族III，且其中，所述嵌合多肽的长度小于495个氨基酸。

4.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含氨基酸序列-X₁-B-X₂-C-X₃-，其中：-X₁-是任选的氨基酸序列；-X₂-是任选的氨基酸序列；-X₃-是任选的氨基酸序列；-B-是第一家族NMB1870序列的结构域B氨基酸序列；和-C-是第二家族NMB1870序列的结构域C氨基酸序列，其中，第一和第二家族彼此不同并选自NMB1870的家族I、家族II或家族III。

5.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含：(a)NMB1870第一家族的结构域‘B’序列和结构域‘C’序列；和(b)NMB1870第二家族的结构域‘B’序列和结构域‘C’序列，其中，第一和第二家族彼此不同并选自NMB1870的家族I、家族II或家族III，且其中，所述嵌合多肽(i)不含第一家族的结构域‘A’序列和/或(ii)不含第二家族的结构域‘A’序列。

6.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含氨基酸序列-X₁-B_j-X₂-C_j-X₃-B_k-X₄-C_k-X₅-，其中：-X₁-是任选的氨基酸序列；-X₂-是任选的氨基酸序列；-X₃-是任选的氨基酸序列；-X₄-是任选的氨基酸序列；-X₅-是任选的氨基酸序列；-B_j-是第一NMB1870家族的结构域‘B’氨基酸序列；-C_j-是第一家族的结构域‘C’氨基酸序列；-B_k-是第二NMB1870家族的结构域‘B’氨基酸序列；和-C_k-是第二家族的结构域‘C’氨基酸序列，其中，第一和第二家族彼此不同并选自NMB1870的家族I、家族II或家族III。

7.一种制备嵌合NMB1870氨基酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将第一NMB1870氨基酸序列与第二NMB1870氨基酸序列作比对以得到一对对准的序列；(b)选择第一氨基酸序列中始于所述第一氨基酸序列的氨基酸a₁终于所述第一氨基酸序列的氨基酸b₁的部分；(c)选择第二氨基酸序列中始于所述第二氨基酸序列的氨基酸a₂终于所述第二氨基酸序列的氨基酸b₂的部分，其中，残基a₁和a₂以及b₁和b₂在所述一对对准的序列中是对准的；和(d)用第二氨基酸序列的所述部分取代第一氨基酸序列的所述部分，从而得到嵌合NMB1870氨基酸序列。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述第一和第二序列不同且来自不同NMB1870家族。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述第一序列是家族INMB1870序列。

10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中，所选择的部分至少长3个氨基酸。

11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中，所述部分是表面环序列。

12.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含用权利要求7-11中任一项所述方法可获得的嵌合NMB1870氨基酸序列。

13.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含氨基酸序列F₁-X₁-F₂，其中：F₁是第一NMB1870氨基酸序列的N末端片段；F₂是第二NMB1870氨基酸序列的C末端片段；X₁是任选的氨基酸序列；所述第一和第二NMB1870氨基酸序列来自不同NMB1870家族；片段F₁和F₂都至少长10个氨基酸；且片段F₁和F₂的组合长度至少为200个氨基酸。

14.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含氨基酸序列(F^m-X^m)_n，其中：n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；各F^m是第m个NMB1870氨基酸序列的片段；各-X^m-是任选的氨基酸序列；各片段F^m至少长7个氨基酸；且F^m的n个例子包括三个NMB1870家族I、II和III中至少两个的片段。

15.如权利要求14所述的多肽，其中，n是3并包含氨基酸序列F¹-X¹-F²-X²-F³-X³。

16.如权利要求14所述的多肽，其中，n是5并包括氨基酸序列F¹-X¹-F²-X²-F³-X³-F⁴-X⁴-F⁵-X⁵。

17.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含至少以下两种：(i)家族I NMB1870序列不超过240个氨基酸的片段，其中，该片段包含所述家族I NMB1870序列的表位；(ii)家族II NMB1870序列不超过240个氨基酸的片段，其中，该片段包含所述家族II NMB1870序列的表位；和(iii)家族III NMB1870序列不超过240个氨基酸的片段，其中，该片段包含所述家族III NMB1870序列的表位。

18.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含NMB1870第一家族的修饰的氨基酸序列，其中，所述修饰的序列包含至少一个取代了第一家族的表面环序列的NMB 1870第二家族的表面环序列。

19.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含氨基酸序列：

-B₁-L₁-B₂-L₂-B₃-L₃-B₄-L₄-B₅-L₅-B₆-L₆-B₇-L₇-B₈-

其中：

(a)B₁是SEQ ID NO：1的氨基酸1-133；B₂是SEQ ID NO：1的氨基酸142-161；B3是SEQ ID NO：1的氨基酸169-180；B₄是SEQ ID NO：1的氨基酸183-196；B₅是SEQ ID NO：1的氨基酸198-218；B₆是SEQ ID NO：1的氨基酸224-233；B₇是SEQID NO：1的氨基酸237-260；和B₈是SEQ ID NO：1的氨基酸268-274；

(b)L₁是SEQ ID NO：2的氨基酸134-141或SEQ ID NO：3的氨基酸142-149；L₂是SEQ ID NO：2的氨基酸162-167或SEQ ID NO：3的氨基酸170-175；L₃是SEQ IDNO：2的氨基酸180-181或SEQ ID NO：3的氨基酸188-189；L₄是SEQ ID NO：2的氨基酸196或SEQ ID NO：3的氨基酸204；L₅是SEQ ID NO：2的氨基酸218-222或SEQ ID NO：3的氨基酸226-230；L₆是SEQ ID NO：2的氨基酸233-235或SEQ ID NO：3的氨基酸241-243；和L₇是SEQ ID NO：2的氨基酸260-266或SEQ ID NO：3的氨基酸268-274。

20.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含与SEQ ID NO：1的总体序列相同性至少为80％的氨基酸序列，其中：所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1的序列相同性在SEQID NO：1的主链区域超过80％；和所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1的序列相同性在SEQ ID NO：1的环区域低于80％。

21.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含与SEQ ID NO：2的总体序列相同性至少为80％的氨基酸序列，其中：所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的序列相同性在SEQID NO：2的主链区域超过80％；和所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的序列相同性在SEQ ID NO：2的环区域低于80％。

22.如权利要求1所述的嵌合多肽，其包含与SEQ ID NO：3的总体序列相同性至少为80％的氨基酸序列，其中：所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3的序列相同性在SEQID NO：3的主链区域超过80％；和所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3的序列相同性在SEQ ID NO：3的环区域低于80％。

23.一种多肽，其包含家族I NMB1870序列的片段，条件是，(a)所述片段包含氨基酸Arg-223，(b)所述多肽既不包含(i)完整的家族I NMB1870氨基酸序列也不包含(ii)完整的家族I？G-NMB1870氨基酸序列。

24.一种多肽，其包含氨基酸序列-Z¹-Arg-Z²-，其中：(a)-Z1-是由至少100个氨基酸构成的氨基酸序列；(b)-Z²-是由至少30个氨基酸构成的氨基酸序列；(c)-Z¹-与直接位于SEQ ID NO：1的氨基酸Arg-223上游的100个氨基酸有至少75％序列相同性；和(d)-Z²-与直接位于SEQ ID NO：1的氨基酸Arg-223下游的30个氨基酸有至少75％序列相同性。

25.一种多肽，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、5、6、7、23、24、43、44、52、53、61、62、63、64和65。

26.编码如上述权利要求中任一项所述多肽的核酸。

27.一种免疫原性组合物，其包含上述权利要求中任一项所述的多肽。

28.如权利要求27所述的组合物，其还包含铝盐佐剂。

29.如权利要求27或28所述的组合物，其还包含脑膜炎球菌PorA蛋白。

30.如权利要求27或28所述的组合物，其还包含脑膜炎奈瑟球菌的外膜囊泡制品。

31.如上述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其被用作药物。

32.一种在哺乳动物体内引起抗体反应的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物如权利要求27-30中任一项所述的免疫原性组合物。

Images