CN1882612A

CN1882612A - 乙酰化过低和过高的脑膜炎球菌荚膜糖

Info

Publication number: CN1882612A
Application number: CNA2004800345251A
Authority: CN
Inventors: P·科斯坦蒂诺
Original assignee: Chiron SRL
Current assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC
Priority date: 2003-10-02
Filing date: 2004-10-04
Publication date: 2006-12-20
Also published as: EP1678212B1; AU2004278170A1; CY2012024I1; JP5590760B2; RU2362784C2; CY1112763T1; PT1678212E; CN102977219A; AU2008202708A1; AU2004278170B2; HK1095154A1; JP2012097284A; US20140234368A1; EP1678212A1; RU2006114695A; WO2005033148A1; US20100092509A1; NZ546668A; BRPI0415048A; US9827301B2

Abstract

来自脑膜炎奈瑟球菌的血清群W135和Y的荚膜糖改变了它们的唾液酸残基的7和9位的O－乙酰化水平，并且可用于产生免疫原性组合物。相对于未修饰的天然糖，本发明的衍生物在与载体蛋白偶联期间择优选择，并且与天然多糖相比，这些衍生物的偶联物显示提高了免疫原性。

Description

乙酰化过低和过高的脑膜炎球菌荚膜糖

本文引用的所有文献全文纳入作为参考。

技术领域

本发明涉及脑膜炎球菌荚膜糖及其偶联衍生物的领域。

背景技术

多糖是重要的生物分子，它们广泛地应用于预防和治疗疾病的制药工业。例如，荚膜多糖在抗带荚膜的细菌，如脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis))、肺炎球菌(肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))和Hib(B型流感嗜血菌(Haemophilus infiuenzae))的疫苗中使用多年。

为增强荚膜多糖，特别是在儿童中的免疫原性，开发了偶联疫苗。这些疫苗含有与载体蛋白偶联的荚膜糖[例如，参考文献1-3]。偶联将不依赖于T的抗原转变为依赖于T的抗原。

脑膜炎奈瑟球菌血清群W135(“MenW135”)的荚膜糖含有唾液酸-半乳糖二糖单位的聚合物：

→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→

其中“Neu”指通常称为唾液酸的神经氨酸。

类似地，脑膜炎奈瑟球菌血清群Y(MenY)的荚膜糖含有唾液酸-葡萄糖二糖单位的聚合物：

→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→

实质上，这些荚膜糖在一些唾液酸残基的一些7和9位发现是O-乙酰化的。W135糖的O-乙酰化在参考文献4中“首次报道”，该文献报道了在O-7和O-9位的O-乙酰化。虽然作者注意到以前的工作表明O-乙酰化在O-7、O′-3或O′-4位发生，但血清群Y糖的O-7和O-9位也观察到乙酰化。参考文献5报道了糖的O-乙酰基含量的进一步研究。

参考文献5报道就血清群W135而言，“有越来越多的证据显示O-乙酰化在引发保护性抗体应答中不重要”。相反，参考文献6报道“有证据表明O-乙酰化影响多糖疫苗的免疫原性”。假定“CPS[荚膜多糖]的O-乙酰化在引发保护性免疫力中不重要”，然而参考文献5的作者研究了血清群W135和Y的乙酰化。他们的研究结果表明这两种血清群于室温在碱性条件下保存9天后O-乙酰化无变化。

参考文献7报道于四价多糖疫苗中的“W135和Y菌株的O-乙酰化状态”以前“未报道”。作者在参考文献8中继续报道“关于血清群W135和Y的O-乙酰化状态知之甚少”，并且他们说进一步的工作“可增进对最优化疫苗制剂的了解”，然而这种进一步工作的本质和可能的了解并未详细描述。参考文献9报道血清群W135的“O-乙酰化与疫苗开发的关联性尚未确定”。参考文献6同意“O-乙酰化对血清群W-135或Y多糖的免疫原性的影响尚未获得”的论据(2004年1月)。

对血清群W135和Y的这种误解和信息的缺乏与当前用作糖疫苗的两种其它血清群完全不同。脑膜炎奈瑟球菌血清群C荚膜多糖的O-乙酰化差异已广泛报道[10、11]，但似乎对免疫原性无任何负面影响，因为Menjugate^TM和NeisVac-C^TM产品均是有效的。相反，血清群A多糖的脱-O-乙酰化与“免疫原性的显著降低”有关[12]。

本发明的目标是提供用于生产免疫原性组合物，特别是当偶联于载体蛋白和脑膜炎血清群W135和Y时的荚膜糖衍生物。

发明内容

尽管O-乙酰化在脑膜炎球菌血清群W135和Y疫苗中的作用不确定，本发明人发现O-乙酰化实际上是有关的，特别是在制备偶联疫苗期间。本发明是基于以下发现：来源于MenW135和MenY并改变唾液酸残基7和9位的O-乙酰化水平的修饰荚膜糖可用于制造免疫原性组合物。相对于未修饰的天然糖，本发明的衍生物在与载体蛋白偶联期间择优选择。此外，与天然多糖相比，这些衍生物的偶联物显示提高了免疫原性。

修饰的糖

因此，本发明提供修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖，其中：(a)糖中≤x％的唾液酸残基在7位是O-乙酰化的；和/或(b)糖中≥y％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的。

类似地，本发明提供修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖，其中：(a)糖中≤x％的唾液酸残基在7-位是O-乙酰化的；和/或(b)糖中≥y％或≤z％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的。

x的值取决于血清群：就血清群W135而言，x是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)；就血清群Y而言，x是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)。

y的值也取决于血清群：就血清群W135而言，y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)；就血清群Y而言，y是29或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)。

z值是27或更少(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)。

优选x＞m，其中选自：0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。

优选z＞p，其中p选自：0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。

本发明的糖

更具体地说，本发明提供任选与载体蛋白偶联的修饰的脑膜炎球菌荚膜糖，其中该糖含有n个或更多个二糖重复单元{[唾液酸]-[己糖]}，其中己糖是半乳糖或葡萄糖，n是1-100的整数，并且其中(a)在所述n个或更多个重复单元中≤x％的唾液酸残基在7位是O-乙酰化的；和/或(b)当己糖是半乳糖时，在所述n个或更多个重复单元中≥y％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的，并且当己糖是葡萄糖时，在所述n个或更多个重复单元中≥y％或≤z％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的。

x值取决于己糖：当己糖是半乳糖时，x是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)；当己糖是葡萄糖时，x是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)。

y的值取决于己糖：当己糖是半乳糖时，y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)；当己糖是葡萄糖时，y是29或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)。

如上定义的，优选x＞m。如上定义的，优选z＞p。

唾液酸残基优选是N-乙酰神经氨酸。

当己糖是半乳糖时，{[唾液酸]-[己糖]}二糖单元优选是：

→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→

当己糖是葡萄糖时，{[唾液酸]-[己糖]}二糖单元优选是：

→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→

修饰的脑膜炎球菌荚膜糖优选与载体蛋白偶联。在这种偶联物中：(i)优选2-9％之间、更优选4-8％之间、还要优选5-7％之间、再优选约6％的唾液酸残基在7位O-乙酰化；(ii)优选35-55％之间、更优选40-50％之间、还要优选42-46％之间、再优选约43％(当己糖是Gal)或约45％(当己糖是Glc)的唾液酸残基在9位O-乙酰化。

本发明也提供包含a分子个血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖的组合物，其中每个荚膜糖分子的唾液酸残基的平均数目是b，并且其中：(a)组合物中≤x％的a·b个血清群W135唾液酸残基在7位O-乙酰化；和/或(b)组合物中≥y％的a·b个血清群W135唾液酸残基在9位O-乙酰化，并且其中x、y和z如上定义。

本发明也提供包含a分子个血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖的组合物，其中每个荚膜糖分子的唾液酸残基的平均数目是b，并且其中：(a)组合物中≤x％的a·b个血清群Y唾液酸残基在7位O-乙酰化；和/或(b)组合物中≥y％或≤z％的a·b个血清群Y唾液酸残基在9位O-乙酰化，并且其中x、y和z如上定义。

所述种群中的糖可偶联于蛋白质运载体和/或游离于溶液中。

本发明的糖或偶联物优选是纯化的形式，例如基本上在没有天然多糖的情况下。

结构表示

本发明提供一种任选偶联于载体蛋白的糖，该糖含有n个或更多个以下二糖重复单元：

其中：

-n是1-100的整数，

-X和Y是选自-H和-OH的不同基团，

-R¹独立地选自-H和-COCH₃，并且在每个二糖单元中可相同或不同，

-R²独立地选自-H和-COCH₃，并且在每个二糖单元中可相同或不同，并且当

-X是-OH并且Y是-H时，(a)≤x％的R¹是-COCH₃和/或(b)≥y％的R²是-COCH₃。

-X是-H并且Y是-OH时，(a)≤x％的R¹是-COCH₃和/或(b)≥y％或≤z％的R²是-COCH₃

当X是-OH并且Y是-H时，x是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)并且y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)。

当X是-H并且Y是-OH时，x是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)，y是29或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)并且z值是27或更少低(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0)。

优选x＞m，其中m如上定义。优选z＞p，其中p如上定义。

糖优选偶联于载体蛋白。

当糖偶联于载体蛋白并且X是-OH和Y是-H时：(a)优选约2-10％、更优选约4-8％、还要优选约5-7％、再优选约6％的R¹是-COCH₃；和/或(b)优选约35-55％、更优选约40-50％、还要优选约42-44％、再优选约43％的R²是-COCH₃。

当糖偶联于载体蛋白并且X是-H和Y是-OH时：(a)优选约2-9％、更优选约4-8％、还要优选约5-7％、再优选约6％的R¹是-COCH₃；和/或(b)优选约35-55％、更优选约40-50％、还要优选约42-46％、再优选约45％的R²是-COCH₃。

本发明的糖和偶联物中唾液酸在7和9位的乙酰化状态可使用下述的1D和2D质子NMR检测。HPAEC可用于检测总的O-乙酰化，但它不能区别不同的位置[234]。离子喷雾MS用于分析MenA中的O-乙酰化[235]。

制备修饰的糖的方法

本发明也提供制备免疫原性偶联物的方法，包括以下步骤：(1)提供起始脑膜炎球菌荚膜糖和载体蛋白，其中一个或二两个均是任选修饰的以赋予它/它们与另一个的反应性；(2)在糖和载体蛋白之间形成共价键；和(3)纯化得到的糖偶联物，其中在步骤(1)和(3)之间(例如，在反应步骤(2)期间)，起始糖中唾液酸残基的9位O-乙酰化程度增加。

脑膜炎球菌荚膜糖优选来自血清群W135或Y。

荚膜糖起始物质

本发明的修饰的荚膜糖可得自在脑膜炎奈瑟球菌血清群W135或Y的荚膜中发现的糖。因此，本发明的糖优选是修饰的脑膜炎奈瑟球菌血清群W135糖和修饰的脑膜炎奈瑟球菌血清群Y糖。

脑膜炎球菌荚膜多糖一般通过包括以下步骤的方法制备：多糖沉淀(例如，使用阳离子洗涤剂)、乙醇分级、冷苯酚萃取(以除去蛋白质)和超离心(以除去LPS)[例如，参考文献13]。

更优选的方法[14]包括多糖沉淀，然后使用低级醇进行沉淀多糖的增溶。可使用阳离子洗涤剂，例如四丁基铵和十六烷基三甲基铵盐(如，溴化物盐)或溴化己二甲胺和十四烷基三甲基铵盐实现沉淀。溴化十六烷基三甲基铵(“CTAB”)尤其优选[15]。可使用低级醇实现沉淀的物质的增溶，所述低级醇例如是甲醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二元醇等，但乙醇是尤其适合于增溶CTAB-多糖复合物。乙醇优选加入沉淀的多糖以得到50％和95％之间的最终浓度(以乙醇和水的总含量为基准)。

再次增溶后，还可处理多糖以除去污染物。这在即使最少的污染也是不可接受的场合(例如，用于人疫苗生产)尤其重要。这通常包括一步或多步过滤，例如可使用深部过滤、经活性碳过滤、体积过滤(size filtration)和/或超滤。一旦过滤除去污染物，可沉淀多糖用于进一步处理和/或加工。这可通过阳离子交换容易地实现(例如，通过加入钙盐或钠盐)。

本发明的糖可是多糖或寡糖。寡糖的聚合化程度低于在细菌的天然荚膜多糖中发现的。

本发明优选使用寡糖。这些寡糖优选具有低于30，例如15和25之间，优选约15-20的聚合程度。聚合程度可通过离子交换色谱或通过比色分析容易地检测[16]。

寡糖通过纯化的荚膜多糖的断裂(例如，通过水解、弱酸处理、加热等)容易地形成，然后通常纯化所需体积的片段。如果进行水解，水解产物通常要按大小分级以除去长度短的寡糖。这可通过各种方式获得，例如超滤然后进行离子交换色谱。就血清群W135和Y而言，优选除去聚合程度低于约4的寡糖。

作为从天然来源纯化的替代方案，荚膜糖(特别是寡糖)可由完全或部分合成获得，例如参考文献17公开的Hib合成，参考文献18公开的MenA合成。

共价偶联

本发明的修饰的糖可经应用于糖的任何常规下游加工(例如，衍生化、偶联、断裂等)。为提高免疫原性，本发明修饰的糖优选偶联于载体蛋白。与载体蛋白偶联在儿科疫苗中特别有用[19]并且是熟知的技术[例如，参考文献20-28等综述的]。

因此。本发明提供载体蛋白和本发明的糖的偶联物。

优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉类毒素或破伤风类毒素。特别优选白喉毒素的CRM₁₉₇衍生物[29-31]。其它合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[32]、合成肽[33，34]、热休克蛋白质[35，36]、百日咳蛋白[37，38]、细胞因子[39]、淋巴因子[39]、激素[39]、生长因子[39]、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[40](例如，N19蛋白[41]、流感嗜血菌的蛋白D[42，43]、肺炎球菌表面蛋白PspA[44]、肺炎球菌溶菌素[45]、离子摄取蛋白[46]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[47])、突变细菌毒素(例如，霍乱毒素“CT”或大肠杆菌热不稳定毒素“LT”)，如在Glu-29处有取代的CT[48]等。优选的运载体是白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血菌蛋白D和CRM₁₉₇。

本发明的组合物中可使用多种载体蛋白，例如来降低运载体抑制的风险。因此，不同的血清群可使用不同的载体蛋白，例如血清群W135糖可偶联于CRM₁₉₇，而血清群Y糖可偶联于破伤风类毒素。一种特定的糖抗原也可使用多种载体蛋白，例如血清群Y糖可分为两组，一些偶联于CRM₁₉₇，其它偶联于破伤风类毒素。然而，所有血清群一般优选使用同一载体蛋白，其中优选CRM₁₉₇。

单独一种载体蛋白可携带多种糖抗原[49]。例如，单独一种载体蛋白可偶联血清群W135和Y的糖。然而，一般优选每种血清群具有独立的偶联物。

优选具有糖∶运载体比例(w/w)在1∶5(即，过量的蛋白)和5∶1(即，过量的糖)之间的偶联物。优选1∶2和5∶1之间的比例，最优选1∶1.25和1∶2.5之间的比例。MenW135偶联物的比例可为约1.1，MenY偶联物可为0.7。以10μg量的MenW135或MenY糖为基准，优选的偶联物含有6.6-10μg CRM₁₉₇运载体。

偶联物可与游离的载体蛋白联用[50]。当给定的载体蛋白以游离和偶联形式存在于本发明的组合物中时，未偶联形式优选不超过组合物中载体蛋白总量的5％，更优选低于2重量％。

可使用任何合适的偶联反应，需要时可使用任何合适的接头。

偶联之前，糖通常可活化或功能化。活化可包括，例如(使用)氰化试剂，如CDAP(如，四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶[51，52等])。其它合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活化酯、降硼烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也参见参考文献26的介绍。

可使用任何已知的方法经接头基团连接，例如参考文献3和53所述的方法。一种类型的连接包括多糖的还原性胺化，得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联于该己二酸接头基团的另一端[24，54，55]。优选的连接类型是羰基接头，该类型可通过修饰的糖的游离羟基与CDI反应[56，57]，然后与蛋白反应形成氨基甲酸酯连接。另一优选的连接类型是通过己二酸接头，该类型可通过修饰的糖的游离-NH₂基团与己二酸偶联(例如，用二酰亚胺激活)，然后与蛋白偶联以形成糖-己二酸中间体[24，54，58]。另一优选的连接类型可通过糖的游离羟基与氰化试剂(例如，对-硝基苯基氰酸酯，四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(CDAP)，四氟硼酸N-氰基三乙基铵(CTEA)或)反应，然后与蛋白的胺基团反应(任选经间隔臂，例如肼)[59，60]。其它接头包括B-丙酰氨基[61]、硝基苯基-乙胺[62]、卤酰基卤化物[63]、糖苷键[2，64]、6-氨基己酸[65]、ADH[66]、C₄-C₁₂部分[67]等。可使用直接连接来代替使用接头。如参考文献2和68中所述，与蛋白的直接连接可包括氧化多糖，然后与蛋白还原性胺化。

偶联可包括：还原伯羟基的端基异构末端，伯羟基的任选保护/脱保护；伯羟基与CDI反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体；CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上的氨基偶联。

优选的方法包括将氨基引入糖(例如，通过用-NH₂取代末端的＝O基团)，然后用己二酸二酯(例如，己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生和与载体蛋白反应。另一优选的反应使用CDAP激活与蛋白D运载体。

偶联后可分离游离和偶联的糖。包括疏水层析、切向超滤、渗滤等的许多合适的方法。[也参见参考文献69和70等]。

当本发明的组合物含有偶联的寡糖时，寡糖优选在偶联之前制备。

药物组合物

本发明提供含有以下组分的免疫原性组合物(例如，疫苗)：(a)本发明的修饰的荚膜糖和/或本发明的偶联物，和(b)一种药学上可接受的运载体。基于糖或糖-蛋白偶联物的疫苗是本领域熟知的，包括基于脱-O-乙酰化糖的偶联物(NeisVac-C^TM)。本发明的疫苗可是预防性(即，防止感染)或治疗性的(即，治疗感染)，但一般是预防性的。

“药学上可接受的运载体”包括其本身不诱导对接受药物组合物的个体产生有害抗体的任何运载体。合适的运载体一般是大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖[71]、脂质聚集体(如油液滴或脂质体)和灭活的病毒颗粒。这种运载体是本领域的普通技术人员熟知的。疫苗也可含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。对药学上可接受的赋形剂的详细讨论见参考文献72。

药物组合物通常制备为液体溶液或悬浮液的可注射形式；也可制备成适合于在注射前溶解或悬浮于液体载体中的固体形式。制剂也可乳化或包囊在用于增强佐剂作用的脂质体中。药物组合物的直接递送通常是胃肠外(例如，通过注射，皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内，或递送至组织的间隙区)。药物组合物也可施用入伤口。其它给予方式包括口服和肺部给药、直肠(栓剂)、和透皮或经皮涂布[例如，参考文献73]、针孔喷注和皮下喷注。

组合物的pH优选在6-8之间，优选约7。可使用缓冲液维持稳定的pH。当组合物含有氢氧化铝盐时，优选使用组氨酸缓冲液[74]。组合物可是无菌和/或无热源的。本发明的组合物可是对人等渗的。

本发明的组合物可是水性形式(即，溶液或悬浮液)或干燥形式(例如，冻干粉)。液体制剂使得组合物可直接从它们的包装形式给予，而无需在水性介质中重建，因此适合于注射。这种组合物可存在于小瓶中，或者它们可存在于预充填的注射器中。这些注射器可有或没有针头。注射器含有单剂量的组合物，而小瓶可含有单剂量或多剂量。

本发明的液体组合物也适合于从冻干形式重建其它疫苗，例如重建冻干的Hib或DTP抗原。当本发明的组合物要用于这种临时重建时，本发明提供一种含有两个小瓶或者一个预充填的注射器和一个小瓶的试剂盒，其中注射器中的内含物用于在注射前再活化小瓶中的内含物。

本发明的干燥组合物具有保存稳定性，但必须在给药前重建为液体形式。本发明提供包含第一容器和第二容器的试剂盒，其中第一容器含有干燥的本发明组合物，第二容器含有用于重建第一容器中内含物的水性组合物。第二容器中的水性组合物可含有抗原(例如，非脑膜炎球菌)或者可仅含有赋形剂。第一容器通常可是小瓶；第二容器也可是小瓶或是预充填的注射器。

为制备干燥的组合物，可使用稳定剂，例如二糖，如海藻糖和蔗糖，或者糖醇，如甘露醇。这些组分可在冻干前加入并且存在于重建的组合物中。

组合物的其它成分包括：氯化钠(用于渗透性)，例如约9mg/ml；洗涤剂，例如吐温(聚山梨酸酯)，如吐温80，通常是低水平，如＜0.01％；和缓冲盐，例如，磷酸缓冲液。组合物可含有抗生素试剂。

本发明的组合物可包装为单位剂量形式或多剂量形式。就液体多剂量形式而言，预充填注射器优选小瓶。可常规确定有效剂量，但用于注射的典型的人剂量具有0.5ml的体积。

用作疫苗的免疫原性组合物含有免疫有效量的抗原以及任何其它成分(如需要)。“免疫有效量”指以单剂量或一系列剂量的一部分给予个体的量对治疗或预防有效。该量依待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的制剂、主治医生对医学状况的评价和其它相关因素而变。预计该量属于由常规试验确定的相对宽的范围。

每剂量中每种脑膜炎球菌糖抗原的典型量是在1μg和20μg之间，例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(表示为糖)。

每剂量中每种糖的量可基本相同。然而，优选MenY糖过量，例如MenY∶MenW135的比例(w/w)是1.5∶1或更高。

当存在偶联物时，组合物也可含有游离的载体蛋白[50]。存在的游离载体蛋白优选低于组合物重量5％；更优选低于2重量％。

本发明的组合物通常含有一种或多种佐剂。这种佐剂包括，但不限于：

A.含有矿物质的组合物

本发明中合适用作佐剂的含有矿物质的本发明组合物包括天然盐，例如铝盐和钙盐。本发明包含天然盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献75的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物，化合物可采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选具有吸附性。含有矿物质的组合物也可配制为金属盐的颗粒[76]。

B.油乳剂

在本发明中适合用作佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献75的第10章；也参见参考文献77](5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，使用微流化器配制成亚微米颗粒)。也可使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

C.皂苷制剂[参考文献75的第22章]

皂苷制剂也可在本发明中用作佐剂。皂苷是在大量的植物种类的树皮、叶、茎、根和甚至花中发现的异源种类的固醇糖苷和三萜糖苷。皂树(Quillaiasaponaria Molina)树皮的皂苷作为佐剂已广泛研究。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包含纯化的试剂，例如QS21，以及液体试剂，例如ISCOM。QS21的商品名为Stimulon^TM。

使用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。使用这些技术鉴定了特定的纯化部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选皂苷是QS21。生产QS21的方法公开于参考文献78。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[79]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献75的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用于ISCOM中。ISCOM优选含有一种或多种QuilA、QHA和QHC。对ISCOM的进一步描述见参考文献79-81。ISCOM任选没有额外的洗涤剂[82]。

基于皂苷的佐剂的开发综述可见参考文献83和84。

D.病毒体和病毒样颗粒

病毒体和病毒样颗粒(VLP)在本发明中也可用作佐剂。这些结构通常含有任选与磷脂组合或配制的病毒的一种或多种蛋白质。它们通常是非致病性、非复制的并且通常不含任何天然的病毒基因组。病毒蛋白可重组产生或从完整的病毒分离。适合用于病毒体或VLP中的这些病毒蛋白包括以下来源的蛋白：流感病毒(例如，HA或NA)、乙肝病毒(例如，核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外被蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白p1)。参考文献85-90进一步讨论了VLP。病毒体在，例如参考文献91中进一步讨论。

E.细菌或微生物衍生物

适合用于本发明中的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌的脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素以及它们的解毒衍生物。

LPS的非毒性衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰化的MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。优选的“小颗粒”形式的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A公开于参考文献92。这种3dMPL的“小颗粒”要小到足以经0.22μm膜的无菌过滤[92]。其它LPS非毒性衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如RC-529[93，94]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌(Eseherichia coli)的脂质A的衍生物，例如OM-174。OM-174描述于参考文献95和96的实施例中。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激寡核苷酸包括含有CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟嘌呤相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示免疫刺激性。

CpG可包括核苷酸修饰物/类似物，例如硫代磷酸酯修饰物并且可是双链或单链的。参考文献97、98和99公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献100-105进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂效应。

CpG序列可定向于TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[106]。CpG序列可特异地用于诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或者可更特异地用于诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献107-109讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。

CpG寡核苷酸优选构建使得5’端易于受体识别。可任选连接两条CpG寡核苷酸序列的3’端以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如参考文献106和110-112。

细菌ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物在本发明中可用作佐剂。蛋白质优选来源于大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。参考文献113和114描述了解毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂和胃肠外佐剂的应用。毒素或类毒素优选含有A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有解毒突变；B亚基优选未突变的。佐剂优选是解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及它们的解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献115-122。氨基酸取代的数值参考优选基于参考文献123所示的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对，该文献特别地全文纳入本文作为参考。

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)[124]、干扰素(例如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

G.生物粘合剂和粘膜粘合剂

生物粘合剂和粘膜粘合剂在本发明中也可用作佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[125]或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。脱乙酰壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[126]。

H.微粒

微粒也可用作本发明的佐剂。微粒(即，直径约100nm-150μm的颗粒，更优选直径约200nm-30μm，最优选直径约500nm-10μm)由生物可降解且非毒性的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)形成，其中优选聚(丙交酯-共-乙交酯)，微粒可任选处理使之具有带负电荷的表面(例如，用SDS处理)或带正电荷的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB处理)。

I.脂质体(参考文献75的第13和14章)

适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献127-129。

J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[130]。这种制剂还含有组合辛苯黄醇(octoxynol)的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[131]以及组合至少一种额外的非离子表面活性剂，例如辛苯黄醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[132]。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。

K.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂描述于，例如参考文献133和134中。

L.胞壁酰基肽

适合用作本发明的佐剂的胞壁酰基肽包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。

M.咪唑并喹诺酮(Imidazoquinolone)化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括描述于参考文献135和136的咪喹莫特(Imiquamod)及其类似物(例如，“雷西喹莫特(Resiquimod)3M”)。

本发明也可包括一种或多种以上鉴定的佐剂的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[137]；(2)皂苷(例如，QS21)+非毒性LPS衍生物(例如，3dMPL)[138]；(3)皂苷(例如，QS21)+非毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[139]；(5)3dMPL与，例如QS21和/或水包油乳剂的组合[140]；(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或涡流产生较大颗粒的乳剂；(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁成分的(Ribi Immunochem)，所述细胞壁成分由单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组成，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和(8)一种或多种天然盐(例如铝盐)+LPS的非毒性衍生物(例如3dMPL)。

参考文献75的第7章公开了其它作为免疫刺激剂的物质。

铝盐和磷酸钙是优选的胃肠外佐剂。突变型毒素是优选的粘膜佐剂。

优选含有磷酸铝佐剂的本发明组合物。优选不含有氢氧化铝。磷酸铝佐剂的含量可为每毫升约0.6毫克Al³⁺。

免疫原的组合

本发明的组合物可含有本发明修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖和本发明修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖。

其它抗原也可包含于本发明组合物中。因此，本发明提供的组合物含有本发明修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖和/或本发明修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖，还含有一种或多种选自下列的抗原：

-脑膜炎奈瑟球菌血清群A的荚膜糖抗原。

-脑膜炎奈瑟球菌血清群C的荚膜糖抗原。

-脑膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白质抗原，例如参考文献141-150中的。

-脑膜炎奈瑟球菌血清群B微泡的制剂[151]，“天然OMV”[152]，气泡或外膜小泡[例如，参考文献153-158等]。这些可从遗传操作的细菌[159-162]制备来，例如增加免疫原性(例如，过度表达免疫原)、降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调PorA表达等。它们可从气泡过多(hyperblebbing)的菌株制备[163-166]。可包括非致病性奈瑟球菌属的小泡[167]。无需使用洗涤剂可制备OMV[168，169]。它们可在其表面表达非奈瑟球菌蛋白[170]。它们可是LPS-消除的。它们可与重组抗原混合[153，171]。可用具有不同的I型外膜蛋白亚型的细菌的小泡，例如使用2种不同遗传改造小泡种群的6种不同的亚型[172，173]，每个种群显示3种亚型，或者使用3种不同遗传改造小泡种群的9种不同的亚型，每个种群显示3种亚型等。有用的亚型包括：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1；P1.18-1，3，6。

-流感嗜血菌B的糖抗原[例如174]。

-肺炎链球菌的抗原[例如208，209，210]。

-甲肝病毒的抗原，例如灭活病毒[例如175，176]。

-乙肝病毒的抗原，例如表面和/或核心抗原[例如176，177]。

-百日咳博德特菌的抗原，例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也任选与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3的组合[例如，参考文献178和179]。可使用细胞百日咳抗原。

-白喉抗原，例如白喉毒素[如，参考文献180的第3章]，如CRM₁₉₇突变体[如，181]。

-破伤风抗原，例如破伤风类毒素[例如，参考文献180的第4章]

-脊髓灰质炎病毒抗原[例如，182，183]，如IPV。

如需要，毒性蛋白抗原可解毒(例如，通过化学和/或遗传学方法解毒百日咳毒素[179])。

当药物组合物中含有白喉抗原时，也优选含有破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当含有破伤风抗原时，也优选含有白喉和百日咳抗原。类似地，当含有百日咳抗原时，也优选含有白喉和破伤风抗原。

药物组合物中抗原的浓度通常是至少1μg/ml。任何给定抗原的浓度一般足够引发抗该抗原的免疫应答。

抗原优选吸附于铝盐佐剂上。

编码抗原的核酸可用作本发明的药物组合物中蛋白质抗原的替代品[例如，参考文献184-192]。因此，本发明药物组合物中的蛋白质组分可为编码该蛋白质的核酸(优选DNA，例如以质粒的形式)所代替。类似地，本发明的组合物可含有模拟糖抗原的蛋白质，例如模拟表位[193]或抗独特型抗体。这些可替代单个的糖组分或是对它们的补充。例如，疫苗可含有MenC[194]或MenA[195]荚膜多糖的肽模拟物来替代糖本身。

组合的脑膜炎球菌疫苗

优选的本发明组合物含有本发明修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖、本发明修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖和血清群C荚膜糖，其中荚膜糖偶联于载体蛋白。组合物也可含有优选偶联于载体蛋白的血清群A荚膜糖。这些组合物中的糖优选寡糖。寡糖偶联物可按照参考文献14公开的方法制备。

血清群A糖可是O-乙酰化或脱-O-乙酰化的。血清群C糖可是O-乙酰化或脱-O-乙酰化的。

以10μg糖为基准，优选的MenC偶联物含有12.5-25μg CRM₁₉₇运载体。以10μg糖为基准，优选的MenA偶联物含有12.5-33μg CRM₁₉₇运载体。

MenC和MenA偶联物的典型剂量与MenW135和MenY的相同，即在1μg-20μg之间，例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg。

血清群C、W135和Y的糖的优选比例(w/w)是：1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1和2∶1∶1。血清群A、C、W135和Y的糖的优选比例(w/w)是：1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2和2∶2∶2∶1。每剂量中优选使用基本上等量的每种糖。

当组合物含有血清群A糖时，可通过使用含有一种或多种血清群A、W135和/或Y糖的水性组合物从冻干形式重建血清群A糖来制备。

当组合物含有血清群A糖时，它可以是其中天然糖的一个或多个羟基被阻断基团取代的修饰的糖[196]。这种修饰提高了耐水解性。优选所有或基本上所有的单糖单元具有阻断基团取代。

除了含有血清群Y、W135和C(和任选的A)的糖抗原之外，本发明的组合物可含有一种或多种血清群B的抗原。与血清群A、C、W135和Y不同，血清群B的荚膜糖由于类似于自身抗原，故不适合于在人中用作免疫原。如果要使用MenB的糖抗原，需要使用修饰的糖，例如其中糖的唾液酸残基中的N-乙酰基被N-酰基取代。合适的N-酰基是C₁-C₈酰基，例如丙酰基[197]。然而除了使用糖抗原外，优选使用多肽抗原。

因此，组合物可含有一种或多种诱导抗MenB感染的免疫应答的多肽抗原。更一般地说，给予对象后，组合物可在对象中产生抗脑膜炎奈瑟球菌血清群B的超毒力谱系A4、ET-5和谱系3的两种或多种(例如2或3)的杀细菌抗体应答。

已公布了血清群B脑膜炎奈瑟球菌的基因组序列[148]并且可从编码的多肽中选择合适的抗原[150]。参考文献141-150公开了抗原的例子。优选的组合物含有以下5种抗原[198]的一种或多种：(1)“NadA”蛋白质，优选寡聚形式(例如，三聚形式)；(2)“741”蛋白质；(3)“936”蛋白质；(4)“953”蛋白质；和(5)“287”蛋白质。

这5种蛋白质的原型序列见以下参考文献143：

蛋白质	NadA	741	936	953	287
蛋白质	NadA	741	936	953	287	SEQ ID NOS	2934和2944	2535和2536	2883和2884	2917和2918	3103和3104

当血清群B蛋白质用于本发明的组合物时，它可含有这些原型序列之一的氨基酸序列，或者它可含有符合以下条件的氨基酸序列：(a)具有与原型序列50％或更高的同一性(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)；和/或(b)含有原型序列的至少n个连续氨基酸的片段，其中n是7或更大(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。优选的(b)的片段缺少原型序列的C末端和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它优选的片段含有这些序列的表位。

这5种MenB抗原可以5种独立的蛋白质存在于组合物中，但优选这些抗原中的至少两种以单一的多肽链表达(“杂种”蛋白[参考文献145-147])，即使得这5种抗原形成少于5种多肽。杂种蛋白具有两种主要的优点：第一，自身不稳定或表达不佳的蛋白可通过加入能克服这些问题的合适杂种配偶体来协助；第二，由于仅需采用一种表达和纯化(方法)来产生两种分别有用的蛋白质，简化了商业化生产。本发明组合物中包含的杂种蛋白可含有5种基本抗原的两种或多种(即，1、2、3、4或5)。优选由5种抗原中的两种构成的杂种，例如含有以下组合的杂种：NadA和741；NadA和936；NadA和953；NadA和287；741和936；741和953；741和287；936和953；936和287；953和287。

组合包含于本发明组合物中的3种优选MenB抗原是：

具有C末端缺失和加工的前导肽的菌株2996的NadA

ATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAK

VKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDE

TNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDITADIATNKDNIAKKANSADV

YTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG

287-953杂种

MASPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGGQDMAAVSEENTGNGGAAATDKPKNEDEGAQNDMPQNA

ADTDSLTPNHTPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGGENAGNTAAQGTNQAENNQTAGSQNPASS

TNPSATNSGGDFGRTNVGNSVVIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGL

VADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEK

LPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGF

KGTWTENGGGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQDGSGGGGATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGF

YGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKL

KAEKFNCYQSPMAKTEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ*

936-741杂种

MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIA

RSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQ

KVITLYQNYVQRGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKV

SRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAF

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如上所述，含有MenB抗原的本发明组合物可更适宜地诱导有效抗超毒力谱系A4、ET-5和谱系3的两种或三种血清杀细菌抗体应答。它们还可诱导抗超毒力谱系亚群I、亚群III、亚群IV-1或ET-37复合物的一种或多种，抗其它谱系，例如超侵入性谱系的杀细菌抗体应答。这些抗体应答易于在小鼠中检测并且是疫苗效力的标准指标[例如，参见参考文献150的尾注]。组合物无需诱导这些抗超毒力谱系中每种MenB菌株的杀细菌抗体；而是就特定超毒力谱系中血清群B脑膜炎球菌的4种或更多种菌株的任何给定组而言，组合物诱导的抗体对该组的至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或更高)是杀细菌的。菌株的优选组包括分离自以下至少4个国家的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。如参考文献150所述，血清优选具有至少1024的杀菌滴度(例如，2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵、2¹⁶、2¹⁷、2¹⁸或更高，优选至少2¹⁴)，即当血清稀释1/1024时，能杀死至少50％特定菌株的测试细菌。优选的组合物可诱导抗血清群B脑膜炎球菌的以下菌株的杀细菌应答：(i)来自簇A4，菌株961-5945(B:2b:P1.21，16)和/或菌株G2136(B:-)；(ii)来自ET-5复合物，菌株MC58(B:15:P1.7，16b)和/或菌株44/76(B:15:P1.7，16)；(iii)来自谱系3，菌株394/98(B:4:P1.4)和/或菌株BZ198(B:NT:-)。更优选的组合物可诱导抗菌株961-5945、44/76和394/98的杀细菌应答。菌株961-5945和G2136均是奈瑟球菌MLST参考菌株[同前参考文献199中的638和1002]。菌株MC58被广泛使用(例如，ATCC BAA-335)并且是参考文献148中测序的菌株。菌株44/76被广泛使用并鉴定(例如，参考文献200)并且是奈瑟球菌MLST参考菌株之一[同前参考文献237中的237；参考文献201中的表2的第32行]。菌株394/98于1998年在新西兰首次分离，并且已公布了使用该菌株的几项研究(例如，参考文献202和203)。菌株BZ198是另一个MLST参考菌株[同前参考文献199的409；参考文献201中表2的第41行]。组合物还可诱导抗来自ET-37复合物的血清群W135菌株LNP17592(W135:2a:P1.5，2)的杀细菌应答。这是2000年在法国分离的Haji菌株。

其它可包含于本发明组合物中的MenB多肽抗原包括含有以下一种或多种氨基酸序列的多肽：参考文献141的SEQ ID NO：650；参考文献141的SEQ ID NO：878；参考文献141的SEQ ID NO：884；参考文献142的SEQ ID NO：4；参考文献143的SEQ ID NO：598；参考文献143的SEQ IDNO：818；参考文献143的SEQ ID NO：864；参考文献143的SEQ ID NO：866；参考文献143的SEQ ID NO：1196；参考文献143的SEQID NO：1272；参考文献143的SEQ ID NO：1274；参考文献143的SEQ ID NO：1640；参考文献143的SEQID NO：1788；参考文献143的SEQ ID NO：2288；参考文献143的SEQ ID NO：2466；参考文献143的SEQ ID NO：2554；参考文献143的SEQ ID NO：2576；参考文献143的SEQ ID NO：2606；参考文献143的SEQIID NO：2608；参考文献143的SEQ ID NO：2616；参考文献143的SEQ ID NO：2668；参考文献143的SEQ ID NO：2780；参考文献143的SEQ ID NO：2932；参考文献143的SEQ ID NO：2958；参考文献143的SEQ ID NO：2970；参考文献143的SEQ ID NO：2988、或含有符合以下条件的氨基酸序列的多肽：(a)与所述序列具有50％或更高同一性(例如，60％、70％、80％、90％、95％、99％和更高)；和/或(b)含有所述序列的至少n个连续氨基酸的片段，其中n是7或更大(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。优选的(b)的片段含有相关序列的表位。可含有多于一种(例如，2、3、4、5、6)的这些多肽。

与Hib糖组合

当组合物含有B型流感嗜血菌抗原时，它一般是Hib荚膜糖抗原。流感嗜血菌b的糖抗原是熟知的。

为增强其，特别是在儿童中的免疫原性，Hib糖与载体蛋白共价偶联是有利的。总体上，制备多肽偶联物，特别是Hib荚膜多糖是很好描述的。本发明可使用任何合适的Hib偶联物。合适的载体蛋白见上述，优选的Hib糖的运载体是CRM₁₉₇(“HbOC”)、破伤风类毒素(“PRP-T”)和脑膜炎奈瑟球菌的外膜复合物(“PRP-OMP”)。

偶联物的糖部分可是多糖(例如，全长的聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP))，但优选水解多糖形成寡糖(例如，分子量为约1-5kDa)。

优选的偶联物含有经己二酸接头与CRM₁₉₇共价连接的Hib寡糖[16，204]。破伤风类毒素也是优选的运载体。

Hib抗原的给药优选导致≥0.15μg/ml和更优选≥1μg/ml浓度的抗PRP抗体。

当组合物含有Hib糖抗原时，优选它不含氢氧化铝佐剂。如果组合物含有磷酸铝佐剂，则Hib抗原可吸附至佐剂[205]或者它可为非吸附的[206]。可通过选择抗原/佐剂混合期间正确的pH、具有合适的零荷电点的佐剂和组合物中各种不同抗原的合适混合顺序来防止吸附[207]。

本发明的组合物可含有多于一种Hib抗原。Hib抗原可是冻干的，例如通过本发明的脑膜炎球菌组合物重建。

与肺炎球菌抗原组合

当组合物含有肺炎链球菌抗原时，它通常是优选偶联于载体蛋白的荚膜糖[例如，参考文献208-210]。优选含有多于一种肺炎链球菌的血清型的糖。例如，广泛使用23种不同的血清型的多糖的混合物，这些混合物是具有5-11种之间不同血清型的多糖的偶联疫苗[211]。例如，PrevNar^TM[212]含有来自7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，其中每种糖通过还原性胺化分别偶联于CRM₁₉₇，每0.5ml剂量具有0.2μg各种糖(4μg的血清型6B)，偶联物吸附于磷酸铝佐剂。本发明的组合物优选包括至少血清型6B、14、19F和23F。偶联物可吸附到磷酸铝上。

组合物可含有一种或多种多肽抗原作为使用肺炎球菌的糖抗原的替代品。肺炎球菌的几种菌株的基因组序列可用[213，214]并且可经反向疫苗学[215-218]来鉴定合适的多肽抗原[219，220]。例如，如参考文献221所定义的，组合物可含有一种或多种以下抗原：PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp130。组合物可含有多于一种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14)的这些抗原。

在一些实施方案中，组合物可含有肺炎球菌的糖和多肽抗原。这些抗原可简单混合使用，或者肺炎球菌糖抗原可偶联于肺炎球菌蛋白。适合于这些实施方案的运载体包括上段所列的抗原[221]。

肺炎球菌抗原可是冻干的，例如与Hib抗原一起冻干。

治疗方法

本发明也提供用于产生哺乳动物抗体应答的方法，该方法包括将本发明的药物组合物给予哺乳动物。

本发明提供用于产生哺乳动物抗体应答的方法，该方法包括有效量的本发明组合物的给药步骤。免疫应答优选是保护性的并且优选涉及抗体。该方法可产生加强应答。

哺乳动物优选是人。当疫苗是预防性用途时，人优选是儿童(例如，幼童或婴儿)或青少年；当疫苗是治疗用途时，人优选是成年人。用于儿童的疫苗也可给予成年人，例如为评价安全性、剂量、免疫原性等。

本发明也提供用作药物的本发明组合物。所述药物优选能产生哺乳动物的免疫应答(即，它是免疫原性组合物)并且更优选是疫苗。

本发明也提供本发明修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖和/或本发明修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖在生产用于产生哺乳动物免疫应答的药物中的应用。糖优选是偶联的。药物优选是疫苗。

这些应用和方法优选用于预防和/或治疗奈瑟球菌引起的疾病(例如，脑膜炎、败血症、菌血症、淋病等)。优选预防和/或治疗细菌性和/或脑膜炎球菌性脑膜炎。

给予本发明的组合物后，检查治疗性治疗效果的一种方法包括监测奈瑟球菌感染。给予本发明的组合物后，检查预防性治疗效果的一种方法包括监测抗5种基本抗原的免疫应答。本发明组合物的免疫原性可通过将它们给予测试对象(例如，12-16个月大的儿童，或动物模型[222])，然后检测包括血清杀细菌活性(SBA)和总的与高亲和性抗荚膜IgG的ELISA滴度(GMT)的标准参数。这些免疫应答通常在给予组合物4周后检测，并且与给予组合物之前的数值比较。SBA测量由补体介导的细菌杀死并且可使用人或年幼家兔补体测定。WHO标准要求疫苗在多于90％的受者中诱导SBA至少上产生4倍。优选SBA增加至少4倍或8倍。当给予多次剂量时，需要进行多次给药后测定。

本发明的优选组合物赋予患者的抗体滴度应是人患者可接受百分比的高于每种抗原性组分的血清保护标准。具有相关抗体滴度的抗原是熟知的，在该滴度之上宿主可认为被血清转化为抗该抗原，这种滴度由，诸如WHO的组织公布。优选大于80％的对象的统计学显著样本是血清转化的，更优选大于90％，还要优选大于93％，最优选96-100％。

本发明的组合物一般可直接给予患者。直接递送可通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或递送至组织的间隙区)，或通过直肠、口服、阴道、局部、经皮，、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜给药来实现。优选大腿或上臂的肌肉内给药。注射可经针(例如，皮下注射针)，但也可选择无针注射。典型的肌肉内剂量是0.5ml。

本发明可用于引发全身性和/或粘膜免疫力。

剂量治疗可是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案之后可进行加强剂量方案。引发剂量之间与引发和加强之间合适的计时(例如，4-16周之间)可惯常确定。

奈瑟球菌感染身体的各种地方，所以本发明的组合物可以各种形式制备。例如，组合物可制备为液体溶液或悬浮液的可注射形式。也可制备为适合于在注射前溶解或悬浮于液体载体中的固体形式(例如，冻干组合物)。组合物可制备为局部给药形式，例如作为软膏、乳膏或粉末。组合物可制备为口服给药形式，例如作为片剂或胶囊，或作为糖浆(任选加入香料)。组合物可制备为使用细粉或喷雾的肺部给药形式，例如作为吸入剂。组合物可制备为栓剂或子宫托。组合物可制备为鼻、耳或眼给药形式，例如，作为喷雾、滴剂、凝胶或粉末[例如，参考文献223和224]。已有报道成功地经鼻给予肺炎球菌糖[225，226]、肺炎球菌多肽[227]、Hib糖[228]、MenC糖[229]与Hib和MenC糖偶联物的混合物[230]。

概要

术语“含有”表示“包含”以及“组成”，例如“含有”X的组合物可由除X以外的物质构成或可包含其它的物质，例如X+Y。

“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。“基本上”可视需要从本发明定义中省去。

与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。

例如，“≤x％的唾液酸残基在7位是O-乙酰化的”的表述不表示组合物中每个糖分子必需在7位具有相同程度的O-乙酰化。该表述不表示组合物中每个糖分子必需在7位具有≤x％的O-乙酰化。相反，一些可具有≥x％，而其它具有≤x％，但在全部种类的糖中所有唾液酸残基的7位的平均乙酰化程度≤x％。该情况同样适用于像“≥y％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的”和类似的表述。

应该理解的是糖环可以打开和封闭的形式存在，并且当本文的结构式显示是封闭形式时，本发明也包括打开的形式。

唾液酸也称为神经氨酸。

附图简述

图1和2分别显示了水解的MenW135和MenY的注释的NMR图谱。

图3和4分别显示了在制备MenW135-CRM₁₉₇和MenY-CRM₁₉₇偶联物期间，唾液酸残基在7和9位的O-乙酰化状态。

图5和6分别显示了使用MenW135和MenY在小鼠中获得的抗寡糖抗原的IgG滴度。

本发明的实施方式

A.脑膜炎球菌多糖的产生和纯化

如参考文献14所述从MenW135和MenY中纯化荚膜多糖。

B.制备修饰的血清群W135和Y多糖偶联物

纯化的多糖于80℃在乙酸的50mM乙酸钠缓冲液，pH4.7中水解约3小时。唾液酸(SA)和还原的末端SA之比确定水解产生平均DP约15-20的寡糖。

水解产物经30kDa截断膜超滤(12-20渗滤体积的5mM乙酸盐缓冲液/15-30mM NaCl pH6.5)。含有高分子量种类的渗余物弃去，渗透物上样在5mM乙酸盐缓冲液/15mM NaCl pH6.5中平衡的Q-琼脂糖快速流动柱。然后为除去DP≤3-4的寡糖，用10CV平衡缓冲液洗涤柱，并用3CV 5mM乙酸盐缓冲液/500mM NaCl pH 6.5洗脱。

向分级的寡糖溶液中加入氯化铵或乙酸铵至终浓度300g/L，然后加入氰基硼氢化钠至终浓度49g/L或73g/L。混合物于50℃孵育3天以产生氨基寡糖，然后使用13渗滤体积的0.5M NaCl和7渗滤体积的20mM NaCl通过具有1kDa或3kDa截断膜的切向流动超滤来纯化氨基寡糖。纯化的寡糖然后用旋转蒸发仪干燥以除水。

干燥的氨基寡糖以40mM氨基的浓度溶解于蒸馏水，然后加入9体积的DMSO，再加入三乙胺至终浓度200mM。向得到的溶液加入己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯至终浓度480mM。反应于室温搅拌2小时，然后用丙酮(80％v/v终浓度)沉淀激活的寡糖。离心收集沉淀物并用丙酮洗涤数次以除去未反应的己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯和副产物。最后，真空干燥激活的寡糖。引入寡糖结构的活性酯基团的量通过参考文献231所述的比色方法测定。

干燥的激活的寡糖以活性酯/蛋白质(摩尔/摩尔)比例为12∶1加入用0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.2配制的45mg/ml的CRM₁₉₇溶液中。反应于室温搅拌过夜。然后用30kDa膜经渗滤纯化偶联物(50渗滤体积的10mM磷酸盐缓冲液，pH7.2)。无菌过滤纯化的偶联物并保存于-20℃或-60℃直至疫苗配制。

C.偶联期间多糖的O-乙酰化状态

通过NMR分析检测来源于MenW135和Men Y的修饰的糖种类中唾液酸残基的C7和C9位的O-乙酰化状态。

使用1D和2D质子NMR实验鉴定偶联过程的中间体多糖和寡糖(水解后、胺化前、激活后和偶联后的天然多糖)。通过将冻干的寡糖溶解于0.75ml 99.9％的氘化的²H₂O(Aldrich^TM)得到10-15mM浓溶液来制备¹H NMR样品。所有实验使用5mm Wilmad NMR管。

¹H NMR图谱以298K记录在装有BGU单元并使用标准Bruker脉冲程序的Bruker nMR Spectrometer Avance DRX 600MHz上。使用具有自屏蔽z-梯度的5mm TBI三共振探针。使用Bruker XWINNMR 3.0软件处理数据。

质子标准波谱获取条件是在6000Hz的波谱窗上通过4次扫描收集32k数据点。应用0.1Hz线扩展功能并且参考4.72ppm处的单-氘化水(HDO)后，¹HNMR图谱是傅立叶转换。

基于参考文献的数据[232，4]进行共振子的分配进而确定分子结构。

为显示峰的分配，图1和二分别显示了水解的MenW135和水解的MenY的注释NMR图谱。

下表给出了所有唾液酸(n-乙酰基-神经氨酸)C7和C9位置在偶联制备期间发现O-乙酰化的来自MenW135的糖种类中的比例：

制备步骤	在7位的O-乙酰化％	在9位的O-乙酰化％
制备步骤	在7位的O-乙酰化％	在9位的O-乙酰化％	天然多糖	30.1	25.0

水解后	16.9	26.4
水解后	16.9	26.4	胺化前	15.0	26.2
激活后	5.1	26.3	胺化前	15.0	26.2
激活后	5.1	26.3	偶联后	6.3	43.1

因此，偶联物制备期间7位的唾液酸O-乙酰化的总百分比降低，从约30％降至约6％。同时，9位的唾液酸O-乙酰化的百分比从约25％升至约43％(图3)。最后步骤中9位的显著变化显示偶联择优选择在9位O-乙酰化的糖。

类似地，下表给出了偶联过程的每一步后唾液酸残基在来自MenY的修饰的糖种类中的O-乙酰化状态：

制备步骤	在7位的O-乙酰化％	在9位的O-乙酰化％
制备步骤	在7位的O-乙酰化％	在9位的O-乙酰化％	天然多糖	10.3	28.0
水解后	3.3	24.1	天然多糖	10.3	28.0
水解后	3.3	24.1	胺化前	5.1	25.1
激活后	2.4	20.9	胺化前	5.1	25.1
激活后	2.4	20.9	偶联后	6.1	45.1

因此，在本发明的偶联物制备期间，7位的唾液酸O-乙酰化的百分比在偶联反应期间最后升至约6％之前从约10％降至约2％。同时，9位O-乙酰化的百分比在偶联反应期间最后升至45％之前从约28％降至约21％(图4)。最后步骤中9位的显著变化显示偶联择优选择在9位O-乙酰化的糖。

D.偶联物的免疫原性

融化冷冻的散装偶联物。每种在搅拌下稀释至终浓度为20μg糖/ml，5mM磷酸盐，9mg/ml NaCl，磷酸铝(得到Al³⁺浓度为0.6mg/ml)，pH7.2。然后不搅拌混合物，于2-8℃维持过夜并用盐水进一步稀释至4μg糖/ml用于小鼠免疫。

以相同的方法制备两种血清群的第二组疫苗，但加入相同体积的水替换磷酸铝。

每个免疫组(每组10只Balb/c小鼠)于0周和第4周皮下.注射0.5ml疫苗两次。免疫前、第2次给药前一天和第2次给药2周后放血。用(a)含或不含铝的偶联物，(b)盐水对照和(c)未偶联的多糖对照进行免疫。

基本上按照参考文献233所述在免疫小鼠的血清中检测特定的抗多糖IgG抗体。每只小鼠血清通过滴定曲线分析两次并计算每个免疫组的GMT。使用“Titerun”软件(FDA)计算小鼠酶联免疫吸附测定单位(MEU)的滴度。通过以相关多糖作为竞争物的竞争性ELISA测定抗多糖滴度的特异性。

如图5所示，MenW135偶联物在动物中诱导了高抗体滴度。如预期的一样，未偶联的多糖无免疫原性。与单用偶联物获得的滴度相比，含磷酸铝作为佐剂的偶联物制剂诱导了较高的抗体水平。MenY也发现了类似的结果(图6)。

使用体外测定测试了II期后血清的杀细菌活性来检测补体介导的细菌裂解。II期后血清在用于测定前于56℃灭活30分钟，并使用25％幼年家兔补体作为补体来源。杀细菌滴度表达为产生抗以下菌株的50％细菌杀死的血清稀释度倒数：MenW135，5554(OAc+)；MenY，242975(OAc+)。

来自MenW135的荚膜多糖不产生GMT值并且得到的杀细菌活性仅为4。相反，本发明的脱O-乙酰化偶联物得到14和565之间的GMT值，杀细菌滴度为64和2048之间。

来自MenY的荚膜多糖不产生GMT值并且得到的杀细菌活性仅为256。相反，本发明的脱O-乙酰化偶联物得到253和1618之间的GMT值，杀细菌滴度为256和16384之间。

应该理解的是，本发明仅通过实施例进行了描述，在不脱离本发明范围和构思的前提下可作出改进。特别是，不影响本发明修饰的荚膜糖的免疫原性的微小改进也包括在本发明范围内。

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Claims

1.一种修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖，其中：(a)所述糖中≤29％的唾液酸残基在7位是O-乙酰化的；和/或(b)所述糖中≥26％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的。

2.一种修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖，其中：(a)所述糖中≤9％的唾液酸残基在7位是O-乙酰化的；和/或(b)所述糖中≥29％或≤27％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的。

3.如权利要求1或2所述的修饰的脑膜炎球菌荚膜糖，其特征在于，所述糖中＞0％的唾液酸残基在7位是O-乙酰化的。

4.如权利要求1或2所述的修饰的脑膜炎球菌荚膜糖，其特征在于，所述糖中＞0％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的。

5.一种任选偶联于载体蛋白的修饰的脑膜炎球菌荚膜糖，其中所述糖含有n个或更多个二糖重复单元：

{[唾液酸]-[己糖]}，

其中的己糖是半乳糖或葡萄糖，n是1-100的整数，并且其中：

(a)在所述n个或更多个重复单元中≤x％的唾液酸残基在7位是O-乙酰化的；和/或

(b)当己糖是半乳糖时，在所述n个或更多个重复单元中≥y％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的，并且当己糖是葡萄糖时，在所述n个或更多个重复单元中≥y％或≤z％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的，

其中当己糖是半乳糖时，x是29且y是26；当己糖是葡萄糖时，x是9、y是29且z是27。

6.如权利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是半乳糖，在所述n个或更多个重复单元中约6％的唾液酸残基在7位是O-乙酰化的，并且在所述n个或更多个重复单元中约43％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的。

7.如权利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是葡萄糖，在所述n个或更多个重复单元中约6％的唾液酸残基在7位是O-乙酰化的，并且在所述n个或更多个重复单元中约45％的唾液酸残基在9位是O-乙酰化的。

8.一种含有血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖分子的组合物，其中每个荚膜糖分子的唾液酸残基平均数目是b，并且其中：(a)组合物中≤29％的a·b个血清群W135唾液酸残基在7位O-乙酰化；和/或(b)组合物中≥26％的a·b个血清群W135唾液酸残基在9位O-乙酰化。

9.一种含有血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖分子的组合物，其中每个荚膜糖分子的唾液酸残基平均数目是b，并且其中：(a)组合物中≤9％的a·b个血清群Y唾液酸残基在7位O-乙酰化；和/或(b)组合物中≥29％或≤27％的a·b个血清群Y唾液酸残基在9位O-乙酰化。

10.如权利要求8或9所述的组合物，其特征在于，所述荚膜糖偶联于蛋白质运载体。

11.一种含有n个或更多个以下二糖重复单元的糖：

其中：

-n是1-100的整数，

-X和Y是选自-H和-OH的不同基团，

-R₁是独立选自-H和-COCH₃并且在每个二糖单元中可相同或不同，

-R₂是独立选自-H和-COCH₃并且在每个二糖单元中可相同或不同，并且

-当X是-OH和Y是-H时，(a)≤29％的R¹是-COCH₃和/或(b)≥26％的R²是-COCH₃。

-当X是-H和Y是-OH时，(a)≤9％的R¹是-COCH₃和/或(b)≥29％或≤27％的R²是-COCH₃。

12.如以上任一项权利要求所述的糖，其特征在于，所述糖具有低于30的平均聚合度。

13.(i)以上任一项权利要求所述的糖和(ii)选自白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血菌蛋白D和CRM₁₉₇的载体蛋白的偶联产物。

14.一种免疫原性组合物，所述组合物含有(a)以上任一项权利要求所述的修饰的荚膜糖或偶联物，和(b)药学上可接受的运载体。

15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物呈含水形式。

16.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物呈冻干形式。

17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖抗原。

18.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖抗原。

19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述血清群A抗原

20.如权利要求14-19中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的抗原。

21.如权利要求14-20中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自B型流感嗜血菌的糖抗原。

22.如权利要求14-21中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自肺炎链球菌的抗原。

23.如权利要求14-22中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有一种或多种以下抗原：甲肝病毒的抗原；乙肝病毒的抗原；百日咳博德特菌的抗原；白喉类毒素；破伤风类毒素和/或脊髓灰质炎病毒抗原。

24.如权利要求14-23中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用作药物。

25.一种用于产生哺乳动物的抗体应答的方法，所述方法包括将权利要求14-23中任一项所述的组合物给予哺乳动物。

26.如权利要求1-13中任一项所述的修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖和/或修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖在生产抗脑膜炎球菌性脑膜炎的药物中的应用。

27.一种制备免疫原性偶联物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供起始血清群W135或血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖和载体蛋白，其中一个或两个均是任选修饰的以赋予它/它们与另一个的反应性；(2)在糖和载体蛋白之间形成共价键；和(3)纯化得到的糖偶联物，其中，在步骤(1)和(3)之间，起始糖中唾液酸残基9位的O-乙酰化程度增加。