JP2006506467A - ワクチン組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ナイセリア疾患の治療および予防のための免疫原性組成物およびワクチンに関する。本発明の免疫原性組成物は、アドヘジン、自己輸送体タンパク質、毒素、鉄獲得タンパク質および膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）を含む少なくとも2つの異なるクラスの抗原から選ばれる抗原の組合せを含有する。そのような抗原組合せ物はナイセリアの生活環の種々の態様に対する免疫応答に標的化されることが可能であり、より有効な免疫応答を引き起こしうる。

Description

本発明は、ナイセリア免疫原性組成物およびワクチン、それらの製造、ならびに医学におけるそのような組成物の使用の分野に関する。より詳しくは、本発明は、防御アッセイまたは血清殺菌アッセイで測定した場合に驚くべき優れた免疫応答を本発明のワクチンが惹起するのを可能にする性質を有する抗原の組合せを含むワクチン組成物に関する。
ナイセリア細菌株はヒトにおける多数の病理の原因因子であり、それに対する有効なワクチンの開発が必要とされている。特に、ナイセリア・ゴノレエ（淋菌）（Neisseria gonorrhoeae）およびナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）は、ワクチン接種により治療されうる病理を引き起こす。
ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）は淋病の病原体である。淋病は、世界中で最も頻繁に報告されている性感染症の1つであり、その推定年間発生数は6200万件である（Gerbaseら 1998 Lancet 351; (Suppl 3) 2-4）。淋病の臨床症状には、尿路、咽喉または直腸の粘膜の炎症、および新生児の眼の感染症が含まれる。女性における上行性淋菌感染は不妊、子宮外妊娠、慢性骨盤炎症性疾患および卵管卵巣膿瘍形成を引き起こしうる。敗血症、関節炎、心内膜炎および髄膜炎は淋病の合併症に関連している。
抗生物質耐性を有する多数の淋菌株が、罹患率の増加および淋病に伴う合併症の一因となっている。抗生物質での淋病の治療に代わる魅力的な方法はワクチン接種によるその予防であろう。現在のところ、ナイセリア・ゴノレエ（N. gonorrhoeae）感染に対するワクチンは存在しない。
ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）は、特に子供および若年成人において重要な病原体である。敗血症および髄膜炎は、侵襲性髄膜炎菌疾患（IMD）の、最も命を脅かす形態である。この疾患は、その高い罹患率および死亡率のため、世界的な健康問題となっている。
莢膜多糖における抗原の相違に基づいて13個のナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型が同定されており、そのなかで最も一般的なものはA、BおよびCであり、これらが全世界で90％の疾患を引き起こしている。血清型Bは、欧州、米国および幾つかのラテンアメリカの国々における髄膜炎菌疾患の最も一般的な原因である。
血清型A、C、WおよびYの莢膜多糖に基づくワクチンが開発されており、髄膜炎菌疾患の発生を抑制することが示されている（Peltolaら 1985 Pediatrics 76; 91-96）。しかし、血清型Bは免疫原性に乏しく、主としてIgMイソタイプの一過性抗体応答を誘導するに過ぎない（Ala’Aldeen DおよびCartwright K 1996, J. Infect. 33; 153-157）。したがって、現在のところ、ほとんどの温帯国における疾患の大部分の原因となる血清型B髄膜炎菌に対する広範に有効なワクチンは入手不可能である。これは特に問題である。なぜなら、欧州、オーストラリアおよびアメリカにおいては、主に5歳未満の子供において、血清型B疾患の発生率が増加しているからである。血清型B髄膜炎菌に対するワクチンの開発は、特有の難しさを伴う。なぜなら、多糖莢膜は、ヒト神経細胞接着分子に対するその免疫学的類似性のため、免疫原性に乏しいからである。したがって、ワクチンの製造方法は髄膜炎菌外膜の表面露出構造体に焦点が絞られているが、これらの抗原における株間の著しいばらつきが、そのような方法の障害となっている。
更なる開発により、細菌膜の通常含量を占める多数のタンパク質を含有する外膜小胞から構成されるワクチンが導入された。これらのうちの1つは、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型BおよびCに対するVA-MENGOC-BC（登録商標）Cubanワクチンである（Rodriguezら 1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440）。このワクチンは、莢膜多糖ACワクチンを使用する予防接種計画によっては排除されなかったキューバにおける侵襲性髄膜炎菌疾患の突発的発生に対処するために設計された。優勢な血清型はBおよびCであり、VA-MENGOC-BC（登録商標）ワクチンは、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）の血清型B株に対して推定ワクチン効率83％で該突発的発生を成功裏に抑制した（Sierraら 1990 In Neisseria, Walter Gruyter, Berlin, m. Atchmanら (編) p 129-134, Sierraら 1991, NIPH Ann 14; 195-210）。しかし、このワクチンは特定のそのような突発的発生には有効であったが、惹起される免疫応答は他のナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株に対する防御をもたらさないであろう。
後に、ラテンアメリカにおいて同種および異種血清型B髄膜炎菌株が引き起こした疾患の流行中に行われた有効性の研究は、年長の子供および成人においては或る程度の有効性を示したが、最大の感染リスクを有する年少の子供においては、その有効性は有意に低かった（Milagresら 1994, Infect. Immun. 62; 4419-4424）。英国のような多株流行性疾患が生じる国々においては、そのようなワクチンがどの程度有効であるかは疑わしい。異種株に対する免疫原性の研究は、特に乳児においては、限られた交差反応性血清殺菌活性しか示していない（Tapperoら 1999, JAMA 281; 1520-1527）。
スカンジナビアにおいて優勢なものに典型的な血清型B分離株を使用して、もう1つの外膜小胞ワクチンがノルウェーにおいて開発された（Fredriksenら 1991, NIPH Ann, 14; 67-80）。このワクチンは臨床試験において試験され、29ヵ月後に57％の防御効力を有することが判明した（Bjuneら 1991, Lancet, 338; 1093-1096）。
しかし、ワクチンにおける外膜小胞（OMV）の使用は幾つかの問題を伴う。例えば、OMVは毒性リポ多糖を含有し、それらは、株特異的にまたは変動的に発現される免疫優性抗原を含有する可能性がある。外膜小胞調製物ワクチンの問題の幾つかを克服するために用いうる幾つかの方法が記載されている。WO01/09350は、例えば、毒性を軽減することによりおよび外膜小胞上に存在する抗原を改変することにより、これらの問題の幾つかに対処する方法を記載している。
WO01/52885は、外膜小胞を他の抗原と組合せる可能性を記載しており、2,000種を超える可能性のあるナイセリアタンパク質の一覧が含まれており、それらから、広範囲の血清型に対して有効性を示すワクチンが開発されうると推測される。
現在入手可能な抗髄膜炎菌ワクチンには様々な問題がある。タンパク質に基づく外膜ワクチンは、少数の株にのみ特異的かつ有効となる傾向にある。また、多糖ワクチンは、特に血清型Bに対しては、乏しくかつ短期間の免疫応答しか惹起しない傾向にあるため最適とはいえない（Lepowら 1986; Peltola 1998, Pediatrics 76; 91-96）。
ナイセリア感染は深刻な医療問題であり、ナイセリア・ゴノレエ（N. gonorrhoeae）の場合には、それに対するワクチンは入手不可能であり、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）の場合には、有効性と異種株に対する防御能とが限定されたワクチンしか入手できない。現在入手可能なワクチンの有効性を改良し、より広範囲の株に対する防御を可能にする、ナイセリア感染に対するより優れたワクチンを開発することが必要とされていることは明らかである。
詳細な説明
本発明は、組み合わされた場合にナイセリア感染に対するワクチンの有効性の驚くべき増強をもたらす、ナイセリア抗原の特定の組合せを開示する。
ナイセリア感染は幾つかの異なる段階を経て進行する。例えば、髄膜炎菌の生活環は、鼻咽腔コロニー形成、粘膜付着、血流内への侵入、血液中での増殖、毒素ショックの誘発、血液／脳関門の通過、ならびに脳脊髄液および／または髄膜内での増殖を含む。該細菌の表面上の異なる分子が、異なる感染サイクル段階に関与している。異なるナイセリア感染過程に関与する特定の抗原の組合せの有効量に対して免疫応答を標的化することにより、驚くべき高い有効性を有するナイセリアワクチンが得られる。
特に、そのいくつかは宿主細胞への接着に関与し、いくつかは鉄獲得（iron acquisition）に関与し、いくつかは自己輸送体（autotransporter）であり、いくつかは毒素である異なるクラスの特定の抗原の組合せが、多段階の感染から防御する免疫応答を惹起しうる。驚くべきことに、そのような抗原の組合せは、ナイセリア感染に対するワクチン有効性の改善（好ましくは、相乗的改善）をもたらすことが可能であり、この場合、該細菌の2以上の機能が該免疫応答により最適に標的化される。
ワクチンの有効性は種々のアッセイにより評価することができる。動物モデルにおける防御アッセイは当技術分野でよく知られている。さらに、血清殺菌アッセイ（SBA）は、髄膜炎菌ワクチンの有効性を評価するための最も一般に認められている免疫学的指標である（Perkinsら J Infect Dis. 1998, 177:683-691）。
抗原の組合せ（例えば、或る自己輸送体タンパク質と或る鉄獲得タンパク質との組合せ）には、動物モデルアッセイにおける防御の改善、および／または、相乗的に、より高いSBA力価をもたらしうるものがある。理論に束縛されるものではないが、抗原のそのような相乗的組合せは、そのような抗原の組合せに対する免疫応答の多数の特性により可能となる。抗原自体は、通常、ナイセリア細胞の表面に露出しており保存されている傾向にあるが、同時に、それは、該抗原のみに対して惹起される抗体により最適な殺菌応答が生じるのに十分な量では表面細胞上に存在しない傾向にある。本発明の抗原の組合せは、臨界的閾値を超えてナイセリア細胞と相互作用する殺菌抗体の有利な組合せを惹起する製剤を与えうる。この臨界値において、十分な量の十分な抗体が該細菌の表面に結合して、補体による効率的な殺菌を可能にし、その結果、はるかに高い殺菌作用が認められる。
血清殺菌アッセイ（SBA）はワクチン候補の有効性を厳密に表すため、抗原の組合せによる良好なSBA力価の達成は、抗原のその組合せを含有するワクチンの防御の有効性の良好な指標となる。本発明は、単離された2つの抗原の組合せの使用、または他の抗原との混合物中で富化（enriched）された2つの抗原の組合せの使用に関する。そのような抗原組合せ物は、組み合わされると有利に相互作用し、好ましくは、殺菌活性（例えば、血清殺菌アッセイ、すなわちSBAにより測定されるもの）において、より高い免疫応答を相乗的に惹起し、好ましくは、それらの抗原により個別に惹起される相加的応答より高い、より好ましくは、少なくとも1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9倍高い、最も好ましくは少なくとも10倍高い免疫応答を相乗的に惹起する。
本発明の更なる利点は、免疫原性組成物中の種々のタンパク質ファミリーからの本発明の抗原の組合せが、より広範囲の株に対する防御を可能にしうることである。
本発明は、ナイセリアにおいて異なる機能を果たす少なくとも2つの異なるカテゴリーのタンパク質から選ばれる複数（2以上）のタンパク質を含んでなる免疫原性組成物に関する。そのようなカテゴリーのタンパク質の具体例としては、アドヘジン、自己輸送体タンパク質、毒素、内在性外膜タンパク質およびFe獲得タンパク質が挙げられる。本発明のワクチン組合せ物は、同種ナイセリア株（抗原が由来する株）に対する、そしてまた好ましくは異種ナイセリア株に対するワクチンの有効性における驚くべき改善を示す。
本発明は、
・少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、
・少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、
・少なくとも1つのナイセリア毒素、
・少なくとも1つのFe獲得タンパク質、
・少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは、外膜タンパク質、特に、内在性外膜タンパク質）、
から選ばれる少なくともまたは正確に2つ、3つ、4つまたは5つ全ての抗原カテゴリーから選ばれる少なくともまたは正確に2、3、4、5、6，7、8、9または10個の異なる抗原を含んでなる免疫原性組成物を提供する。
好ましくは、本発明は、少なくともまたは正確に2、3、4、5、6、7、8、9または10個の異なるナイセリア抗原を含んでなる免疫原性組成物を提供する。最も好ましくは、これらの抗原は、以下：
・FhaB、NspA PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119およびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、
・Hsf、Hap、IgAプロテアーゼ、AspAおよびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、
・FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT、ならびにLPS免疫型（immunotype）L2およびLPS免疫型L3の一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア毒素、
・TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28 (GNA2132)、Sibp、NMB0964、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrBおよびP2086 (XthA)よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質、ならびに
・PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MltA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA (GNA1946)、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrAおよびPldA (Omp1A)よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質、好ましくは外膜タンパク質、特に内在性外膜タンパク質、
から選ばれる少なくともまたは正確に2、3、4または5個のタンパク質群から選ばれる。
本発明の抗原はすべて、単離されたものである。すなわち、それらは人間の手により変化が加えられている。好ましくは、それらは（本発明の免疫原性組成物のその他の成分と組み合あわされる前に）、ある程度、最も好ましくは、40、50、60、70、80、90、95または99％以上の純度まで精製されている。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、および少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、および場合によっては、ナイセリア毒素、ナイセリアFe獲得タンパク質またはナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、および少なくとも1つのナイセリア毒素、および場合によっては、ナイセリア自己輸送体、ナイセリアFe獲得タンパク質またはナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、および少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質、および場合によっては、ナイセリア毒素、ナイセリア自己輸送体またはナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、および少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）、および場合によっては、ナイセリア毒素、ナイセリアFe獲得タンパク質またはナイセリア自己輸送体を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、および少なくとも1つのナイセリア毒素、および場合によっては、ナイセリアアドヘジン、ナイセリアFe獲得タンパク質またはナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、および少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質、および場合によっては、ナイセリアアドヘジン、ナイセリア毒素またはナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、および少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）、および場合によっては、ナイセリアアドヘジン、ナイセリアFe獲得タンパク質またはナイセリア毒素を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリア毒素、および少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質、および場合によっては、ナイセリアアドヘジン、ナイセリア自己輸送体またはナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリア毒素、および少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）、および場合によっては、ナイセリアアドヘジン、ナイセリア自己輸送体またはナイセリア毒素を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質、および少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）、および場合によっては、ナイセリアアドヘジン、ナイセリア自己輸送体またはナイセリア毒素を含む。好ましくは、該抗原は、前記の名称の抗原から選ばれる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物において5群すべての抗原が示される。
本明細書においてタンパク質が具体的に挙げられている場合には、それは、好ましくは、天然の完全長タンパク質およびその天然変異体（すなわち、ナイセリア、好ましくは髄膜炎菌株から入手可能な天然タンパク質）を意味するが、それは（特にサブユニットワクチンの場合には）その抗原性断片を包含しうる。これらは、該タンパク質のアミノ酸配列から連続的に選ばれる少なくとも10アミノ酸、好ましくは20アミノ酸、より好ましくは30アミノ酸、より好ましくは40アミノ酸、最も好ましくは50アミノ酸を含有するまたは含む断片（多くの場合には、本明細書中に具体的に記載されているもの）である。また、抗原性断片は、ナイセリア完全長タンパク質に対して産生された抗体とまたは哺乳類宿主へのナイセリア感染により産生された抗体と免疫学的に反応性である断片を意味する。抗原性断片はまた、有効量で投与されるとナイセリア感染に対して防御免疫応答を惹起する断片を含み、より好ましくは、それはナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）および／またはナイセリア・ゴノレエ（N. gonorrhoeae）感染に対して防御性であり、最も好ましくは、それはナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B感染に対して防御性である。
また、本発明は、本発明のナイセリアタンパク質またはその断片の組換え融合タンパク質を含む。これらは、同一ポリペプチド中に、異なるナイセリアタンパク質またはそれらの断片を組み合わせて有する。あるいは、本発明はまた、T細胞エピトープまたは精製タグの供与体のような異種配列、例えばβガラクトシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（GFP）、エピトープタグ、例えばFLAG、mycタグ、ポリヒスチジンまたはウイルス表面タンパク質、例えばインフルエンザウイルス赤血球凝集素、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197との融合タンパク質としての、ナイセリアタンパク質またはその断片の個々の融合タンパク質を含む。
本発明の抗原
NMBに対する言及は、www.neisseria.orgからアクセス可能な配列の参照番号を示す。
1．アドヘジン
アドヘジンとしては、例えばFhaB (WO98/02547)、NadA (J. Exp.Med (2002) 195:1445; NMB 1994)、NhhAとしても公知のHsf (NMB 0992) (WO99/31132)、Hap (NMB 1985)(WO99/55873)、NspA (WO96/29412)、MafA (NMB 0652)およびMafB (NMB 0643) (Annu Rev Cell Dev Biol. 16; 423-457 (2000); Nature Biotech 20; 914-921 (2002))、Omp26 (NMB 0181)、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119およびPilC (Mol. Microbiol.1997, 23; 879-892)を包含する。これらは、宿主細胞の表面へのナイセリアの結合に関与するタンパク質である。Hsfはアドヘジンの一例であり、これは自己輸送体タンパク質でもある。したがって、本発明の免疫原性組成物はHsfと他の自己輸送体タンパク質との組合せを含むことが可能であり、この場合、Hsfがアドヘジンとしてその能力を発揮する。これらのアドヘジンはナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）またはナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）または他のナイセリア株に由来しうる。本発明はまた、ナイセリア由来の他のアドヘジンを包含する。
FhaB
この抗原はWO98/02547の配列番号38（ヌクレオチド3083-9025）に記載されている。NMB0497も参照されたい。本発明者らは、FhaBが、単独でおよび特に本発明の他の抗原と共に、抗接着抗体を特に有効に誘導することを見出した。完全長FhaBを使用することは可能であるが、驚くべきことに、本発明者らは、特定のC末端トランケート化体（末端切断型）が、交差株作用（cross-strain effect）の点で、それと少なくとも同等に有効である、好ましくは、それより有効であることを見出した。また、好都合にも、そのようなトランケート化体は、クローニングが遥かに容易であることが示されている。本発明のFhaBトランケート化体は、典型的には、FhaB分子のN末端側の3分の2に相当し、好ましくは、新たなC末端は1200-1600位、より好ましくは1300-1500位、最も好ましくは1430-1440位に位置する。特定の実施形態は1433または1436位にC末端を有する。したがって、本発明のそのようなFhaBトランケート化体、およびそのようなトランケート化体を含むワクチンは、本発明の独立した態様であり、かつ、本発明の組合せ免疫原性組成物の1成分である。該N末端も、10、20、30、40または50個までのアミノ酸がトランケート（末端切断）されうる。
2．自己輸送体タンパク質
自己輸送体タンパク質には、典型的には、シグナル配列、パッセンジャードメイン、および外膜への結合のためのアンカードメインから構成される。自己輸送体タンパク質の具体例には、Hsf (WO99/31132) (NMB 0992)、HMW、Hia (van Ulsenら Immunol. Med. Microbiol. 2001 32; 53-64)、Hap (NMB 1985) (WO99/55873; van Ulsenら Immunol. Med. Microbiol. 2001 32; 53-64)、UspA、UspA2、NadA (NMB 1994) (Comanducciら J. Exp. Med. 2002 195; 1445-1454)、AspA (Infection and Immunity 2002, 70(8); 4447-4461; NMB 1029)、Aida-1様タンパク質、SSh-2およびTshが包含される。NadA (J. Exp.Med (2002) 195:1445)は、自己輸送体タンパク質のもう1つの例であり、かつ、アドヘジンでもある。本発明の免疫原性組成物は、NadAとアドヘジンとの組合せを含むことが可能であり、この場合、NadAが自己輸送体タンパク質としてその能力を発揮する。これらのタンパク質はナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）またはナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）または他のナイセリア株に由来しうる。本発明はまた、ナイセリア由来の他の自己輸送体タンパク質を包含する。
Hsf
Hsfは、自己輸送体タンパク質に共通の構造を有する。例えば、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株H44/76由来のHsfは、アミノ酸1-51から構成されるシグナル配列、表面に露出しており可変領域（アミノ酸52-106、121-124、191-210および230-234）を含有する成熟タンパク質のアミノ末端の頭部領域（アミノ酸52-479）、ネック部領域（アミノ酸480-509）、疎水性αへリックス領域（アミノ酸518-529）、および4個の膜貫通ストランドが外膜に伸長するアンカードメイン（アミノ酸539-591）からなる。
本発明の免疫原性組成物中では完全長Hsfを使用することが可能であるが、種々のHsfトランケート化体および欠失体も、ワクチンのタイプに応じて有利に使用されうる。
Hsfをサブユニットワクチン中で使用する場合には、可溶性パッセンジャードメインの一部、例えばアミノ酸52-479の完全ドメイン、最も好ましくはその保存的部分、例えばアミノ酸134-479の特に好ましい配列を使用することが好ましい。Hsfの好ましい形態は、WO01/55182に開示されているタンパク質の可変領域を欠失するようトランケート化されているものでありうる。好ましい変異体は、WO01/55182に記載されている1、2、3、4または5個の可変領域の欠失を含むであろう。前記の配列および後記の配列は、N末端またはC末端の一方または両方において1、3、5、7、10または15個までのアミノ酸が伸長またはトランケート化していてもよい。
したがって、Hsfの好ましい断片は、Hsfの頭部領域の全体、好ましくはアミノ酸52-473を含有する該領域を含む。Hsfの更なる好ましい断片は、アミノ酸配列52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440および469-479のうち1以上を含む該頭部の表面露出領域が挙げられる。
Hsfが外膜小胞調製物中に存在する場合には、それは完全長タンパク質として、好ましくは、アミノ酸1-51とアミノ酸134-591（アミノ酸配列134からC末端までの成熟外膜タンパク質をもたらす）との融合体から構成される好ましい変異体として発現されうる。Hsfの好ましい形態は、WO01/55182に開示されているタンパク質の可変領域を欠失するようトランケート化されていることが可能である。好ましい変異体は、WO01/55182に記載されている1、2、3、4または5個の可変領域の欠失を含むであろう。好ましくは、第1および第2の可変領域が欠失している。好ましい変異体は、アミノ酸配列52-237または54-237の間の残基、より好ましくはアミノ酸52-133または55-133の間の残基を欠失しているであろう。該成熟タンパク質はシグナルペプチドを欠いているであろう。
Hap
ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）由来のHap様タンパク質のコンピューター解析は少なくとも3つの構造ドメインを示している。株H44/76由来のHap様配列を基準配列とすると、アミノ酸1-42を含むドメイン1は、自己輸送体ファミリーに特徴的なsec依存性シグナルペプチドをコードしており、アミノ酸43-950を含むドメイン2は、表面に露出しており免疫系に接近しうると考えられるパッセンジャードメインをコードしており、残基951からC末端まで（1457）を含むドメイン3は、バレル様構造に組み立てられ外膜内に繋ぎ止められるらしいβストランドをコードしていると推定される。ドメイン2は表面に露出していると考えられ、よく保存されており（試験した全ての株において80％を上回る）、大腸菌（E. coli）内でサブユニット抗原として産生されうるため、それは興味深いワクチン候補の1つである。ドメイン2および3は表面に露出していると考えられ、よく保存されているため（Pizzaら (2000), Science 287: 1816-1820）、それらは興味深いワクチン候補の1つである。ドメイン2はパッセンジャードメインとして公知である。
本発明の免疫原性組成物は、好ましくはOMV調製物中に組み入れられた完全長Hapタンパク質を含みうる。また、本発明の免疫原性組成物は、株H44/76においてはアミノ酸残基43-950から構成されるHapのパッセンジャードメインを含みうる。Hapのこの断片は本発明のサブユニット組成物中で特に有利に使用されるであろう。Hapのパッセンジャードメインの前記配列は、N末端またはC末端の一方または両方において1、3、5、7、10、15、20、25または30個までのアミノ酸が伸長またはトランケートされたものでありうる。
3．鉄獲得タンパク質
鉄獲得タンパク質には、TbpA (NMB 0461) (WO92/03467, 米国特許第5912336号, WO93/06861およびEP586266)、TbpB (NMB 0460) (WO93/06861およびEP586266)、LbpA (NMB 1540) (Med Microbiol (1999) 32:1117)、LbpB (NMB 1541)(WO/99/09176)、HpuA (U73112.2) (Mol Microbiol. 1997, 23; 737-749)、HpuB (NC_003116.1) (Mol Microbiol. 1997, 23; 737-749)、XthAとしても公知のP2086 (NMB 0399) (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002)、FbpA (NMB 0634)、FbpB、BfrA (NMB 1207)、BfrB (NMB 1206)、GNA2132としても公知のLipo28 (NMB 2132)、Sibp (NMB 1882)、HmbR、HemH、Bcp (NMB 0750)、鉄(III) ABC輸送体パーミアーゼタンパク質 (Tettelinら Science 287; 1809-1815 2000)、鉄(III) ABC輸送体-ペリプラズム (Tettelinら Science 287; 1809-1815 2000)、TonB依存性受容体 (NMB 0964およびNMB 0293)(Tettelinら Science 287; 1809-1815 2000)およびトランスフェリン結合タンパク質関連タンパク質 (Tettelinら Science 287; 1809-1815 2000) が包含される。これらのタンパク質はナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）またはナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）または他のナイセリア株に由来しうる。本発明はまた、ナイセリア由来の他の鉄獲得タンパク質を包含する。
TbpA
TbpAはTbpBと相互作用してナイセリアの外膜上にタンパク質複合体を形成し、これはトランスフェリンに結合する。構造上は、TbpAは、短い細胞内ループおよびより長い細胞外ループにより連結された複数の膜貫通βストランド、TonBボックスおよびプラグ（plug）ドメインと共に、細胞内N末端ドメインを含有する。
TbpBの2つのファミリー（それぞれ、高い分子量を有するものおよび低い分子量を有するもの）が特徴づけられている。TbpBの高分子量形態および低分子量形態は、相同性に基づいて区別されうる異なるファミリーのTbpAと会合する。それらは、類似した分子量であるにもかかわらず、高分子量ファミリーおよび低分子量ファミリーとして公知である。なぜなら、それらはTbpBの高分子量形態または低分子量形態に会合するからである（Rokbiら FEMS Microbiol. Lett. 100; 51, 1993）。これらの2つの形態のTbpAを表すためにTbpA(高)およびTbpA(低)なる語が用いられ、また、TbpBも同様に称される。本発明の免疫原性組成物は、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型A、B、C、YおよびW-135由来のTbpAおよびTbpB、ならびにナイセリア・ゴノレエ（N. gonorrhoeae）を含む他の細菌に由来する鉄獲得タンパク質を含みうる。トランスフェリン結合タンパク質TbpAおよびTbpBはそれぞれTbp1およびTbp2とも称される（Cornelissenら Infection and Immunity 65; 822, 1997）。
TbpAは幾つかの異なる領域を含有する。例えば、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株H44/76由来のTbpAの場合には、アミノ末端の186アミノ酸が内部球状ドメインを形成し、22個のβストランドが該膜を横切ってβバレル構造を形成している。これらは、短い細胞内ループおよびより大きな細胞外ループにより連結されている。細胞外ループ2、3および5は最高度の配列可変性を有し、ループ5は表面に露出している。ループ5および4はリガンドの結合に関与する。
TbpAの好ましい断片はTbpAの細胞外ループを含む。ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株H44/76由来のTbpAの配列を用いると、これらのループでは、ループ1はアミノ酸200-202に対応し、ループ2はアミノ酸226-303に対応し、ループ3はアミノ酸348-395に対応し、ループ4はアミノ酸438-471に対応し、ループ5はアミノ酸512-576に対応し、ループ6はアミノ酸609-625に対応し、ループ7はアミノ酸661-671に対応し、ループ8はアミノ酸707-723、ループ9はアミノ酸769-790に対応し、ループ10はアミノ酸814-844に対応し、ループ11はアミノ酸872-903に対応する。配列アライメントの後の他のTbpタンパク質における対応配列も、好ましい断片を構成するであろう。最も好ましい断片は、Tbpのループ2、ループ3、ループ4またはループ5を構成するアミノ酸配列を含むであろう。
本発明の免疫原性組成物がTbpAを含む場合、TbpA（高）およびTbpA（低）の両方を含むのが好ましい。
TbpAは、好ましくは、OMVワクチン中に存在するが、それはサブユニットワクチンの一部であることも可能である。例えば、本発明の免疫原性組成物中に導入されうる単離された鉄獲得タンパク質は当技術分野においてよく知られている（WO00/25811）。それらを細菌宿主内で発現させ、界面活性剤（例えば、2％ Elugent）を使用して抽出し、アフィニティークロマトグラフィーによりまたは当技術分野においてよく知られた標準的なカラムクロマトグラフィー技術（Oakhillら Biochem J. 2002 364; 613-6）を用いて精製することが可能である。
TbpAがOMVワクチン中に存在する場合には、その発現を本明細書に記載の遺伝子工学的技術によりアップレギュレーションすることが可能であり、あるいは好ましくは、後記の鉄制限条件下の親株の増殖によりアップレギュレーションすることが可能である。この方法は、免疫優性となりうる可変性鉄調節タンパク質（特にFrpB）のアップレギュレーションをも引き起こす。したがって、広範なナイセリア株において存在する抗原に対する免疫応答を本発明の免疫原性組成物が惹起するのが保証されるよう、後記のとおりそのようなタンパク質（特にFrpB）の発現をダウンレギュレーションする（そのようなタンパク質をコードする遺伝子を欠失させる）のが有利である。TbpA（高）およびTbpA（低）の両方を該免疫原性組成物中に存在させるのが好ましく、これは、好ましくは、そのような別形態のTbpAを発現する2つの株に由来するOMVを一緒にすることにより達成される。
4．毒素
毒素には、FrpA (NMB 0585; NMB 1405)、FrpA/C (定義については後記を参照されたい)、FrpC (NMB 1415; NMB 1405) (WO92/01460)、NM-ADPRT (NMB 1343) (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al p135)、VapD (NMB 1753)、リポ多糖 (LPS; リポオリゴ糖またはLOSとも称される) 免疫型L2およびLPS免疫型L3が包含される。FrpAおよびFrpCは、これらの2つのタンパク質間で保存された領域を含有し、これらのタンパク質の好ましい断片は、この保存断片を含有するポリペプチド、好ましくは、FrpA/Cの配列のアミノ酸227-1004を含むポリペプチドであろう。これらの抗原はナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）またはナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）または他のナイセリア株に由来しうる。本発明はまた、ナイセリア由来の他の毒素を包含する。
もう1つの実施形態においては、毒素には、毒性の調節に関与する抗原、例えば、リポ多糖の合成において機能するOstAが含まれうる。
FrpAおよびFrpC
ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）は、鉄が制限された際に分泌される、FrpAおよびFrpCと称される2つのRTXタンパク質をコードしている（Thompsonら, (1993) J. Bacteriol. 175:811-818; Thompsonら, (1993) Infect. Immun.. 61:2906-2911）。RTX（Repeat ToXin）タンパク質ファミリーは共通して、それらのC末端付近に、コンセンサス配列Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa (LXGGXGN/DDX)を有する一連の9アミノ酸の反復配列を有する。大腸菌（E. coli）HlyAにおける反復配列はCa2+の結合部位であると考えられる。図4に示すとおり、株FAM20において特徴づけられている髄膜炎菌FrpAおよびFrpCタンパク質は、それらの中央領域およびC末端領域においてはかなりのアミノ酸類似性を共有するが、N末端においては（有するとしても）非常に限られた類似性しか有さない。さらに、FrpAとFrpCとの間で保存された領域は、9アミノ酸モチーフの反復性（FrpAにおいては13回およびFrpCにおいては43回）により幾らかの多型を示す。
本発明の免疫原性組成物は完全長FrpAおよび／またはFrpCを含むことが可能であり、好ましくは、FrpAとFrpCとの間で保存された配列を含む断片を含む。該保存配列は9アミノ酸の反復単位から構成される。本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、3個を超える反復、10個を超える反復、13個を超える反復、20個を超える反復、または23個を超える反復を含む。
そのようなトランケート化体は完全長分子より有利な特性を有し、そのような抗原を含むワクチンは、本発明の独立した態様を形成し、かつ、本発明の免疫原性組成物に含まれうる。
FrpAとFrpCとの間で保存された配列はFrpA/Cと称され、FrpAまたはFrpCが本発明の免疫原性組成物の構成成分に相当する場合には、FrpA/Cが有利に使用されうるであろう。FrpA配列のアミノ酸277-1004は好ましい保存領域である。前記配列はN末端またはC末端の一方または両方において1、3、5、7、10、15、20、25または30個までのアミノ酸が伸長またはトランケート化されていてもよい。
LPS
LPS（リポ多糖；LOS-リポオリゴ糖としても公知である）はナイセリアの外膜上の内毒素である。LPSの多糖部分は殺菌抗体を誘導することが公知である。
LPSのオリゴ糖部分における不均一性は種々のナイセリア株間で構造および抗原性の多様性をもたらす（Griffissら Inf. Immun. 1987; 55: 1792-1800）。これは、髄膜炎菌株を12個の免疫型に細分するのに利用されている（Scholtanら J Med Microbiol 1994, 41:236-243）。免疫型L3、L7およびL9は免疫学的に同一であり、構造的に類似しており（あるいは更には同一であり）、したがってL3,7,9と称される（あるいは、本明細書の目的においては「L3」と総称される）。髄膜炎菌LPS L3,7,9 (L3)、L2およびL5はシアル酸化によりまたはシチジン 5'- 一リン酸-N-アセチルノイラミン酸の付加により修飾されうる。L2、L4およびL6 LPSは免疫学的に区別されうるが、それらは構造的には類似しており、本明細書中でL2に言及する場合には、所望により、本発明の範囲内で、L2の代わりにL4またはL6のいずれかを用いることが可能である。LPSの構造および不均一性の更なる説明は、M. P. Jenningsら, Microbiology 1999, 145, 3013-3021およびMol Microbiol 2002, 43:931-43を参照されたい。
LPS、好ましくは髄膜炎菌LPSが本発明のワクチン中に含まれている場合には、好ましくはおよび有利には、免疫型L2およびL3の一方または両方が存在する。LPSは、好ましくは、外膜小胞中に存在するが、（好ましくは、低パーセントの界面活性剤、より好ましくは0〜0.5％、0.02〜0.4％、0.04〜0.3％、0.06〜0.2％、0.08〜0.15％または0.1％の界面活性剤、最も好ましくはデオキシコラート [DOC]で該小胞を抽出した場合）サブユニットワクチンの一部であるってもよい。LPSは、熱水-フェノール法（WesphalおよびJann Meth. Carbo. Chem. 5; 83-91 1965）を含むよく知られた方法を用いて単離することが可能である。Galanosら 1969, Eur J Biochem 9:245-249およびWuら 1987, Anal Bio Chem 160:281-289も参照されたい。LPSは、無修飾（plain）形態で、あるいは破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM-197またはOMV外膜タンパク質のようなT細胞エピトープ源に結合させて使用することが可能である。単離されたLOSを結合させるための技術も公知である（例えば、参照により本明細書に組み入れるEP 941738を参照されたい）。
LOS（特に、本発明のLOS）をブレブ（bleb）製剤中に存在させる場合には、好ましくは、同様に該ブレブ調製物上に存在する1以上の外膜タンパク質（例えば、髄膜炎菌におけるPorAまたはPorB）へのLOSの結合を可能にする方法により、LOSをin situで結合させる。
この方法は、該ブレブ製剤中のLOS抗原の安定性および／または免疫原性（T細胞の補助をもたらす）および／または抗原性を有利に増強し、すなわち髄膜炎菌外膜の表面上の天然環境中のLOSと同様に、該T依存性オリゴ糖免疫原にT細胞の補助をその最も防御性のコンホメーションにおいて与えうる。また、該ブレブ中のLOSの結合はLOSの解毒をもたらしうる（リピドA部分が外膜内に安定に埋もれることにより、毒性の生じる可能性が減少する）。したがって、htrB-またはmsbB-突然変異体からブレブを単離する、本明細書に記載の解毒法、あるいはポリミキシンB［リピドAに対して高いアフィニティーを有する分子］の無毒性ペプチド機能等価体を該組成物に加えることは必ずしも必要ないかもしれない（しかし、念のために、それを併せて加えることは可能である）（ポリミキシンBの無毒性ペプチド機能等価体の更なる詳細、特に、ペプチドSEAP 2（これは配列KTKCKFLKKCを有し、ここで、2個のシステインがジスルフィド架橋を形成している）の使用に関しては、WO 93/14115、WO 95/03327、Velucchiら (1997) J Endotoxin Res 4: 1-12およびEP 976402を参照されたい）。したがって、本発明者らは、該ブレブ中に存在するLOSがブレブ内様式で外膜タンパク質に結合しているブレブ含有組成物が、該ブレブが由来する生物により引き起こされる疾患の治療または予防用のワクチンの基礎を形成するものであり、そのようなワクチンは実質的に無毒性であり、LOSに対してその天然環境中でT依存性殺菌応答を誘導しうることを見出した。
したがって、本発明は更に、そのようなブレブ内LOS結合髄膜炎菌ブレブ調製物を提供する。
そのようなブレブ調製物を、関心のある細菌から単離し（WO 01/09350を参照されたい）、ついで公知の結合化学法に付して、LOSのオリゴ糖部分上の官能基（例えば、NH2またはCOOH）をブレブ外膜タンパク質上の官能基（例えば、NH2またはCOOH）に連結することが可能である。グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド／ホルムアルデヒド混合物を使用する架橋技術を用いることが可能であるが、EDACまたはEDAC/NHS（J.V. Staros, R.W. WrightおよびD. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); ならびにBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) pp173-176）のような、より選択的な化学法を用いることが好ましい。使用しうるタンパク質分子とLOSとの間に共有結合を生成させることができる他の結合化学法または処理はEP 941738に記載されている。
好ましくは、莢膜多糖の非存在下で該ブレブ調製物を結合させる。該ブレブは、（天然でまたは後記の突然変異により）莢膜多糖を産生しない株から単離することが可能であり、あるいはほとんど、好ましくは全ての混入莢膜多糖から精製することが可能である。このように、ブレブ内LOS結合反応は遥かに効率的である。
好ましくは、該ブレブ中に存在するLOSの10、20、30、40、50、60、70、80、90または95％以上が架橋／結合している。
ブレブ内結合は、好ましくは、以下の処理工程の1、2または3つ全てを含む：結合pHはpH 7.0より大きく、好ましくはpH 7.5以上（最も好ましくはpH 9未満）であるべきであり；1〜5％、好ましくは2〜4％、最も好ましくは約3％ スクロースの条件を該反応の間、維持すべきであり；NaClは該結合反応の間は最小限にすべきであり、好ましくは0.1M未満、0.05M未満、0.01M未満、0.005M未満、0.001M未満で存在すべきであり、最も好ましくは全く存在しないようにすべきである。これらの処理上の特徴の全ては、ブレブが該結合過程の全体にわたって安定に溶液中に維持されることを保証するものである。
EDAC/NHS結合法は、ブレブ内結合のための好ましい方法である。EDAC/NHSは、過度に架橋して濾過性に悪影響を及ぼしうるホルムアルデヒドのために好ましい。EDACはカルボン酸（例えば、LOS中のKDO）と反応して活性エステル中間体を与える。アミン求核試薬（例えば、PorBのような外膜タンパク質中のリシンなど）の存在下、アミド結合が生成され、副産物としてイソ尿素が放出される。しかし、EDAC媒介反応の効率は、スルホ-NHSエステル中間体の生成を通じて増加しうる。該スルホ-NHSエステルは、EDACのみとカルボキシラートとの反応から生成した活性エステルより長く、水溶液中で存続する。したがって、この2段階法を用いることにより、より高い収率のアミド結合形成を達成することができる。EDAC/NHS結合はJ.V. Staros, R.W. WrightおよびD. M. Swingle， Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986)ならびにBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) pp173-176に記載されている。該反応においては、好ましくは、ブレブ1mg当たり0.01〜5mgのEDAC、より好ましくは、ブレブ1mg当たり0.05〜1mgのEDACを使用する。EDACの使用量は、サンプル中に存在するLOSの量に左右され、そしてこれは、ブレブを抽出するために使用するデオキシコラート（DOC）のパーセンテージ（％）に左右される。低いパーセンテージ（例えば、0.1％）のDOCの場合は、大量（1mg/mg以上）のEDACを使用するが、より高いパーセンテージ（例えば、0.5％）のDOCでは、過度のブレブ内架橋を防ぐために、より少量（0.025〜0.1mg/mg）のEDACを使用する。
したがって、本発明の好ましい方法は、EDAC/NHSの存在下、pH 7.0〜pH 9.0（好ましくは、pH約7.5）のpHで、1〜5％（好ましくは約3％）スクロース中、場合によってはNaClを実質的に含有しない条件中（前記のとおり）、ブレブを結合させ、該反応混合物から該結合ブレブを単離する工程を含む、（好ましくは髄膜炎菌の）ブレブ内結合LOSの製造方法である。
反応時間が経過するにつれて、ブレブ中のLOSの割合が増えてLOSの分子量が増加するのを示すために、抗LOS（例えば、抗L2または抗L3）mAbを使用して該反応混合物のウエスタン分離ゲル上で該反応を追跡することが可能である。
そのような技術を用いて、収率99％でブレブを回収することが可能である。
EDACは、LOSのT依存性免疫原性の改善に十分な程度にLOSをOMPに架橋するが、乏しい濾過性、凝集およびブレブ間架橋のような問題が生じるほど過度にはそれを架橋しなかったため、EDACは優れたブレブ内架橋剤であることが判明した。生成したブレブの形態学的特徴は（電子顕微鏡によれば）未結合ブレブのものに類似している。また、前記プロトコールは、過度の架橋（これは、該ブレブの表面上に天然で存在する防御性OMP、例えばTbpAまたはHsfの免疫原性を減少させうる）が生じるのを防いだ。
ブレブが由来する髄膜炎菌株は、莢膜多糖を産生し得ない突然変異株（例えば、後記の突然変異株の1つ、特にsiaD-）であることが好ましい。また、髄膜炎菌疾患に対して有効な免疫原性組成物はL2およびL3の両方のブレブを含んでおり、ここで、L2およびL3 LOSは共に、ブレブ外膜タンパク質に結合していることが好ましい。さらに、ブレブ内結合ブレブ内のLOS構造は、（後記のとおり）lgtB-髄膜炎菌株に由来するそれと合致することが好ましい。最も好ましくは、免疫原性組成物は、莢膜多糖を産生し得ない、lgtB-である突然変異髄膜炎菌株に由来するブレブ内結合ブレブを含むか、または莢膜多糖を産生し得ない突然変異髄膜炎菌株に由来するL2およびL3ブレブを含むか、またはlgtB-である突然変異髄膜炎菌株に由来するL2およびL3ブレブを含むか、または最も好ましくは、莢膜多糖を産生し得ない、lgtB-である突然変異髄膜炎菌株に由来するL2およびL3ブレブを含む。
本発明に使用しうる典型的なL3髄膜炎菌株はH44/76 menB株である。典型的なL2株はB16B6 menB株または39E髄膜炎菌C型株である。
前記のとおり、本発明のブレブは、結合の作用により或る程度解毒されており、それ以上解毒する必要はないが、安全性を高めるために更なる解毒法を用いてもよく、例えば、htrB-またはmsbB-である髄膜炎菌株に由来するブレブを使用したり、あるいはポリミキシンB［リピドAに対する高いアフィニティーを有する分子］の無毒性ペプチド機能等価体（好ましくはSEAP2）を該ブレブ組成物に加えること（前記のとおり）が可能である。
前記の方法により、実質的に無毒性であり自己免疫の問題を伴わずT依存性を有しその天然環境中に存在し（L2+L3組成物の場合には）髄膜炎菌株の90％以上に対する殺菌抗体応答を誘導しうるLOSを重要な抗原として有する髄膜炎菌ブレブおよびブレブ含有免疫原性組成物が提供される。
好ましくは、ブレブ内LOS結合は以下の処理工程の1、2または3つ全てを含む：結合pHはpH 7.0より大きく、好ましくはpH 7.5以上（最も好ましくはpH 9未満）であるべきである；1〜5％、好ましくは2〜4％、最も好ましくは約3％ スクロースの条件を該反応の間、維持すべきである；NaClは該結合反応中には最小限にすべきであり、好ましくは0.1M未満、0.05M未満、0.01M未満、0.005M未満、0.001M未満で存在すべきであり、最も好ましくは全く存在しないようにすべきである。これらの処理上の特徴の全ては、ブレブが該結合過程の全体にわたって安定に溶液中に維持されることを保証するものである。
種々の技術および化学技法によりLOSをブレブ内で外膜タンパク質に結合させることが可能であるが、ブレブ内結合にはEDAC/NHS結合法が好ましい方法である。EDAC/NHSは、過度に架橋して濾過性に悪影響を及ぼしうるホルムアルデヒドのために好ましい。EDACはカルボン酸と反応して活性エステル中間体を与える。アミン求核試薬の存在下、アミド結合が形成され、副産物としてイソ尿素が放出される。しかし、EDAC媒介反応の効率は、スルホ-NHSエステル中間体の生成を介することにより増加しうる。該スルホ-NHSエステルは、EDACのみとカルボキシラートとの反応から生成した活性エステルより長く、水溶液中で存続する。したがって、この2段階法を用いることにより、より高い収率のアミド結合形成を達成することができる。EDAC/NHS結合はJ.V. Staros, R.W. WrightおよびD. M. Swingle， Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986)ならびにBioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) pp173-176に記載されている。
したがって、本発明の好ましい方法は、EDAC/NHSの存在下、pH 7.0〜pH 9.0（好ましくは、pH約7.5）のpHで、1〜5％（好ましくは約3％）スクロース中、場合によっては（前記のとおり）NaClを実質的に含有しない条件中、ブレブを結合させ、該反応混合物から該結合ブレブを単離する工程を含む、（好ましくは髄膜炎菌の）ブレブ内結合LOSの製造方法である。
反応時間が経過するにつれて、ブレブ中のLOSの割合が増えてLOSの分子量が増加するのを示すために、抗LOS（例えば、抗L2または抗L3）mAbを使用して該反応混合物の分離ゲル上で該反応を追跡することが可能である。
そのような技術を用いて、収率99％でブレブを回収することが可能である。
EDACは、LOSのT依存性免疫原性の改善に十分な程度にLOSをOMPに架橋したが、乏しい濾過性およびブレブ間架橋のような問題が生じるほど過度にはそれを架橋しなかったため、EDACは優れたブレブ内架橋剤であることが判明した。該ブレブの表面上に天然で存在する防御性OMP、例えばTbpAの免疫原性の減少を防ぐために、過度の架橋は避けるべきである。
5．内在性外膜タンパク質
他のカテゴリーのナイセリアタンパク質も、本発明のナイセリアワクチン中に含有させる候補となる可能性があり、驚くべきほど有効に他の抗原と組み合わせることができる。膜結合タンパク質、特に内在性膜タンパク質、最も有利には外膜タンパク質、特に内在性外膜タンパク質を、本発明の組成物中で使用することが可能である。そのようなタンパク質の一例は、ナイセリアホスホリパーゼ外膜タンパク質である、Omp1A (NMB 0464) (WO00/15801)としても公知のPldAである。更なる具体例としては、TspA (NMB 0341) (Infect. Immun. 1999, 67; 3533-3541) およびTspB (T細胞刺激性タンパク質) (WO 00/03003; NMB 1548, NMB 1628 またはNMB 1747)が挙げられる。更なる具体例には、PilQ (NMB 1812) (WO99/61620)、D15としても公知のOMP85 (NMB 0182) (WO00/23593)、NspA (U52066) (WO96/29412)、FhaC (NMB 0496またはNMB 1780)、PorB (NMB 2039) (Mol. Biol. Evol. 12; 363-370, 1995)、HpuB (NC_003116.1)、TdfH (NMB 1497) (Microbiology 2001, 147; 1277-1290)、OstA (NMB 0280)、GNA33およびLipo30としても公知のMltA (NMB0033)、HtrA (NMB 0532; WO 99/55872)、HimD (NMB 1302)、HisD (NMB 1581)、GNA 1870 (NMB 1870)、HlpA (NMB 1946)、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、TbpA (NMB 0461) (WO92/03467) (前記の鉄獲得タンパク質の説明も参照されたい) ならびにLbpA (NMB 1541) が含まれる。
OMP85
本発明の免疫原性組成物は完全長OMP85を、好ましくはOMV調製物の一部として含みうる。本発明の免疫原性組成物においては、OMP85の断片も使用することが可能であり、特に、アミノ酸残基1-475または50-475から構成されるOMP85の表面露出ドメインを、好ましくは、本発明の免疫原性組成物のサブユニット成分中に含有させる。OMP85の表面露出ドメインの前記配列は、N末端またはC末端の一方または両方において1、3、5、7、10、15、20、25または30個までのアミノ酸が伸長またはトランケートされうる。シグナル配列はOMP85断片から除去するのが好ましい。
OstA
OstAはリポ多糖の合成において機能し、毒性の調節因子であるとみなされうる。あるいは、毒素のカテゴリーを、毒素だけでなく毒性の調節因子をも含有するように拡張すると、OstAは毒素のカテゴリーに含まれうる。
免疫原性組成物
免疫原性組成物は、宿主に投与されると免疫応答を生成しうる少なくとも1つの抗原を含む組成物である。好ましくは、そのような免疫原性調製物は、ナイセリア、好ましくはナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）およびナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）の感染に対する防御免疫応答を生成しうる。
本発明は、好ましくは、相乗的な殺菌性、防御性または接着阻害応答のうち1以上を惹起する少なくとも2つの抗原を含む免疫原性組成物に関する。
本発明のSBA殺菌アッセイ
そのような相乗的応答は、抗原の組合せにより惹起されるSBAが、各抗原により別々に惹起されるSBAより少なくとも50％、2倍、3倍、好ましくは4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、最も好ましくは10倍高いことにより特徴づけられうる。好ましくは、SBAは、該抗原が由来する同種株に対して、好ましくはまた、一群の異種株に対して測定される（代表的な群、例えば、A-4クラスターに属するBZ10 (B:2b:P1.2)、ET-37複合体に属するB16B6 (B:2a:P1.2)およびH44/76 (B:15:P1.7,16)については、後記を参照されたい）。SBAは、髄膜炎菌ワクチンの有効性を評価するための最も一般に認められている免疫学的指標である（Perkinsら J Infect Dis. 1998, 177:683-691）。任意の公知方法により、十分なSBAを確認することが可能である。SBAは、動物モデルから（実施例17〜20を参照されたい）またはヒト被験者から得た血清を使用して行うことができる。
ヒト血清を使用してSBAを行うための好ましい方法は以下のとおりである。初回ワクチン接種の前、2回目のワクチン接種の2ヵ月後および3回目のワクチン接種の1ヵ月後に血液サンプルを採取する（1年に3回のワクチン接種が典型的なヒト初回ワクチン接種計画であり、例えば、0、2および4ヶ月、または0、1および6ヶ月の時点で投与を行う）。そのようなヒト初回ワクチン接種計画は、1歳未満または2〜4歳の小児に実施することが可能であり（例えば、Hibワクチン接種と同時に実施する）、あるいは、そのような初回ワクチン接種計画によるSBAを試験するために、青年にもワクチン接種することが可能である。初回ワクチン接種の6〜12ヶ月後、および追加接種が適用可能な場合には追加接種の1ヵ月後に、更なる血液サンプルを採取することが可能である。
3回目のワクチン接種（初回ワクチン接種計画の3回目のワクチン接種）（2〜4歳の小児または青年、好ましくは1歳以下の小児におけるもの）の1ヶ月後、本発明の抗原が由来する髄膜炎菌株に対するSBA（抗体希釈）力価において（ワクチン接種前の力価と比較して）4倍の増加を示す被験者の割合が該被験者の30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、最も好ましくは60％以上である場合には、SBAは、同種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物に関して満足しうるものであろう。
もちろん、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物は、それが由来する髄膜炎菌株に対してそれが十分なSBAを惹起しうる場合には、同種殺菌活性を有するブレブ調製物を構成することもできる。
3回目のワクチン接種（初回ワクチン接種計画の3回目のワクチン接種）（2〜4歳の小児または青年、好ましくは1歳以下の小児におけるもの）の1ヶ月後、3つの異種髄膜炎菌株に対するSBA（抗体希釈）力価において（ワクチン接種前の力価と比較して）4倍の増加を示す被験者の割合が該被験者の20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは35％以上、最も好ましくは40％以上である場合には、SBAは、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物に関して満足しうるものであろう。そのような試験は、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物が種々の髄膜炎菌株に対する交差殺菌性抗体を誘導しうるかどうかの良好な指標である。好ましくは、そのような3つの異種株は、互いに異なる、および好ましくは、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物の原料となったまたはそれが由来する株とは異なる、電気泳動型（ET）複合体または多遺伝子座配列タイピング（multilocus sequence typing）（MLST）パターン（Maidenら PNAS USA 1998, 95:3140-5を参照されたい）を有するべきである。当業者は、髄膜炎菌、特に、重要な病難の原因であると認められておりおよび／または認識されているMenB超ビルレント系統に相当する髄膜炎菌B型株において認められる遺伝的多様性を表す異なるET複合体を有する3つの株を容易に決定しうるであろう（Maidenら, 前掲を参照されたい）。例えば、使用しうる3つの株としては以下のものが挙げられる：A-4クラスターに属するBZ10 (B:2b:P1.2)、ET-37複合体に属するB16B6 (B:2a:P1.2)、およびET-5複合体に属するH44/76 (B:15:P1.7,16)、または同じET/クラスターに属する他の任意の株。例えばET-5複合体に属する髄膜炎菌CU385（B:4:P1.15）から製造されたまたはそれに由来する、異種殺菌活性を有する抗原またはブレブ調製物を試験するために、そのような株を使用することが可能である。使用しうるもう1つのサンプル株は系統3流行性(epidemic)クローン（例えば、NZ124 [B:4:P1.7,4]）に由来する。もう1つのET-37株はNGP165 (B:2a:P1.2)である。
SBA活性の測定方法は当技術分野において公知である。例えば、使用しうる方法はWO 99/09176の実施例10Cに記載されている。一般には、被験株の培養物を（好ましくは、EDDAのような鉄キレート剤の増殖培地への添加による鉄枯渇条件において）対数増殖期まで増殖させる。約20000 CFU/mlに調節された実施細胞懸濁液を得るために、これを、BSAを含有する培地（例えば、0.3％ BSAを含有するハンクス培地）に懸濁させることが可能である。被験血清の2倍連続希釈液（好ましくは、56℃で30分間熱不活性化されたもの）［例えば、50μl/ウェルの容量中］と20000 CFU/ml 被験髄膜炎菌株懸濁液［例えば、25μl/ウェルの容量中］とを混合することにより、一連の反応混合物を調製することができる。反応バイアルをインキュベート（例えば、37℃で15分間）し、振とう（例えば、210rpm）すべきである。最終反応混合物［例えば、100μl容量］は更に、補体源［例えば、25％最終容量の予備試験された子ウサギ血清］を含有し、それを前記のとおりに［例えば、37℃で60分間］インキュベートする。このアッセイには無菌ポリスチレンU底96ウェルマイクロタイタープレートを使用することができる。アリコート［例えば、10μl］を、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから採取し、ミュラー・ヒントン（Mueller-Hinton）寒天プレート（好ましくは、1％ Isovitalexおよび1％ 熱不活性化ウマ血清を含有する）上に滴下し、インキュベート（例えば、5％ CO2中、37℃で18時間）する。好ましくは、個々のコロニーは80 CFU/アリコートまで計数されうる。対照として、以下の3つの試験サンプルを使用することができる：バッファー + 細菌 + 補体；バッファー + 細菌 + 不活性化補体；血清 + 細菌 + 不活性化補体。SBA力価は、殺細胞の50％に対応する希釈度の測定値を回帰計算により与えるデータ処理プログラムを使用して、簡単に算出することができる。
動物防御アッセイ
あるいは、相乗的応答は、動物防御アッセイにおいて、抗原の組合せの有効性により特徴づけることが可能である。例えば、実施例12または13に記載のアッセイを用いることが可能である。好ましくは、抗原の組合せにより防御される動物の数は、抗原（特に、準最適量（suboptimal）の抗原）を単独で使用した場合と比較して有意に改善される。
淋菌（N. gono）感染の予防のための有効なワクチンは、以下の要素の2以上を要しうる：淋菌の補体媒介殺菌を促進するおよび／または多形核白血球のような白血球による食作用および殺微生物を増進するおよび／または宿主組織への淋菌の接着を妨げる血清および／または粘膜抗体の産生。また、細胞性免疫応答の誘導も防御に関与しうる。
本発明のブレブ淋菌ワクチン製剤の有効性の改善は、文献記載のようにして（McChesney Dら, Infect. Immun. 36: 1006, 1982; Boslego Jら: Efficacy trial of a purified gonococcl pilus vaccine, in Program and Abstracts of the 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, American Society for Microbiology, 1984; Siegel Mら, J. Infect. Dis 145: 300, 1982; de la Pas, Microbiology, 141 (Pt4): 913-20, 1995）、抗接着性および／またはオプソニン特性および／または殺菌活性を有する血清および／または粘膜抗体に関して、誘導された免疫応答を分析することにより評価することができる。
最近、淋菌（N. gono）による性器感染のマウスモデルが記載された（Plante M, J. Infect. Dis., 182: 848-55, 2000）。本発明のブレブ淋菌ワクチンの有効性の改善は、それがこのマウス感染モデルにおいて淋菌によるコロニー形成を予防または軽減する能力によっても評価することが可能であろう。
接着阻止アッセイ
あるいは、相乗的応答は、接着阻止アッセイにおいて、抗原の組合せの有効性により特徴づけることが可能である。例えば、実施例11に記載のアッセイを用いることが可能である。好ましくは、抗原の組合せに対して産生された抗血清により誘導される阻止の度合は、抗原の単体に対して産生された抗血清（特に、準最適量の抗体）を使用した場合と比較して有意に改善される。
サブユニット組成物
本発明の免疫原性組成物はサブユニット組成物でありうる。サブユニット組成物は、抗原性組成物を生成するために成分を混合する前には、成分が単離され少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、70％、80％、90％の純度まで精製されている組成物である。
本発明の免疫原性サブユニット組成物は、好ましくは、FhaB、PilC、Hsf、Hap、NadA、OMP85、IgAプロテアーゼ、AspA、AspAのパッセンジャードメイン、Hsfのパッセンジャードメイン、Hapのパッセンジャードメイン、FrpA、FrpC、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、TspA、TspB、PldA、PilQ、FhaC、NspA、ならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方、から選ばれる少なくとも2つの抗原を含む。
サブユニット組成物は水溶性タンパク質の水溶液でありうる。それらは、該抗原の疎水性部分を可溶化するために界面活性剤、好ましくは非イオン性、両性イオン性またはイオン性界面活性剤を含みうる。脂質膜を横断する構造を有する抗原の提示を可能にするリポソーム構造が形成されうるよう、それらは脂質を含みうる。
外膜小胞調製物
ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B（menB）は、外膜ブレブを、工業的規模でのその製造を可能にするのに十分な量で排出する。外膜小胞は、細菌細胞の界面活性剤抽出の方法により調製することが可能である（例えば、EP 11243を参照されたい）。
本発明の免疫原性組成物は、組換えによりまたは鉄枯渇条件下での増殖を含む他の手段によりアップレギュレーションされた少なくとも2つの抗原を有する外膜小胞調製物を含みうる。そのような外膜小胞調製物においてアップレギュレーションされる抗原の具体例には、NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、AspA、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafBおよびPldAが含まれる。場合により、そのような調製物はLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方をも含むであろう。
ナイセリア株からのブレブ調製物の製造は、当業者によく知られた方法のいずれかにより達成されうる。好ましくは、EP 301992、米国特許第5,597,572号、EP 11243または米国特許第4,271,147号、Frederiksonら (NIPH Annals [1991], 14:67-80)、Zollingerら (J. Clin. Invest. [1979], 63:836-848)、Saundersら (Infect. Immun. [1999], 67:113-119)、Drabickら (Vaccine [2000], 18:160-172) またはWO 01/09350 (実施例8)に開示されている方法を用いる。一般には、OMVを界面活性剤、好ましくはデオキシコラートにより抽出する。所望により、核酸を酵素的に除去することが可能である。精製は、超遠心および場合によってはそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより達成される。本発明の、2以上の異なるブレブを含める場合には、それらを単一の容器内に一緒にして本発明の多価調製物を形成させることが可能である（但し、本発明の異なるブレブが、宿主に同時に［1回の通院で］投与される別々の容器内の別々の組成物である場合にも、その調製物は多価であるとみなされる）。OMV調製物は、通常、0.2μmフィルターで濾過滅菌し、好ましくは、該ブレブ調製物を安定化することが知られているショ糖溶液（例えば、3％）中で保存する。
外膜小胞調製物中のタンパク質のアップレギュレーションは、OMV調製物が由来するナイセリア株内への遺伝子の過剰コピーの挿入により達成されうる。あるいは、遺伝子のプロモーターを、OMV調製物が由来するナイセリア株における、より強力なプロモーターで置換することが可能である。そのような技術はWO01/09350に記載されている。タンパク質のアップレギュレーションは、OMV中に存在するタンパク質のレベルを、未改変ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）（例えば、株H44/76）に由来するOMV中に存在するタンパク質のレベルよりも上昇させる。好ましくは、該レベルは1.5、2、3、4、5、7、10または20倍高くなる。
LPSがOMV中の追加的抗原であると意図される場合には、好ましくは、結合LPSを高レベルで維持するが、特に毒性であり不十分に結合したLPSは除去するようなOMC製造方法において、低濃度の抽出用界面活性剤（例えば、デオキシコラートまたはDOC）を使用するプロトコールを用いる。使用するDOCの濃度は、好ましくは0〜0.5％ DOC、0.02〜0.4％ DOC、0.04〜0.3％ DOC、より好ましくは0.06〜0.2％ DOCまたは0.08〜0.15％ DOC、最も好ましくはおよそまたは正確に0.1％ DOCである。
「強力なプロモーター配列」は、関心のある抗原をコードする遺伝子の転写を増強する調節制御要素を意味する。
「発現のアップレギュレーション」は、未改変（すなわち、天然に存在する）ブレブの発現に比べて、関心のある抗原の発現を増強するための任意の手段を意味する。「アップレギュレーション」の量は個々の関心抗原に応じて様々となるが、ブレブの膜の完全性を破壊する量を超えないと理解される。抗原のアップレギュレーションは、未改変ブレブの発現より少なくとも10％高い発現を意味する。好ましくは、それは少なくとも50％高い。より好ましくは、それは少なくとも100％（2倍）高い。最も好ましくは、それは3、4、5、7、10、20倍高い。その代わりにまたはそれに加えて、発現のアップレギュレーションは、特にTbpA、TbpB、LbpAおよびLbpBの場合には、代謝性または栄養性変化に対して発現を非条件付（non-conditional）にすることを意味しうる。ブレブが、鉄制限条件（例えば、鉄キレート剤の存在下）で増殖させた細菌に由来する場合には、好ましくは、発現のレベルを評価する。
再び明瞭化の目的において、「該抗原の産生量を減少させるために細菌株を操作する」またはダウンレギュレーションは、未改変（すなわち、天然に存在するブレブ）の発現と比べて、関心のある抗原の発現（または機能的遺伝子産物の発現）を減少させるための任意の手段を意味し、好ましくは、発現が未改変ブレブより少なくとも10％低くなるよう、欠失により行う。好ましくは、それは少なくとも50％低く、最も好ましくは全く生じない。ダウンレギュレーションされるタンパク質が酵素または機能的タンパク質である場合には、該ダウンレギュレーションは、酵素活性または機能活性において10％、20％、50％、80％または好ましくは100％の減少が得られるよう1以上の突然変異を導入することにより達成することができる。
ナイセリアタンパク質の発現をモジュレーションするのに必要な操作工程は、当業者に公知の種々の方法により行うことが可能である。例えば、配列（例えば、プロモーターまたはオープンリーディングフレーム）を挿入することが可能であり、トランスポゾン挿入の技術によりプロモーター／遺伝子を破壊することが可能である。例えば、遺伝子の発現をアップレギュレーションするために、トランスポゾンを介して、該遺伝子の開始コドンの上流2kbまで（より好ましくは200〜600bp上流、最も好ましくは約400bp上流）に、強力なプロモーターを挿入することが可能であろう。点突然変異または欠失を（特に、遺伝子の発現をダウンレギュレーションするために）利用することも可能である。
しかし、そのような方法は非常に不安定であり不確実でありうるため、相同組換え事象を介して該操作工程を行うことが好ましい。好ましくは、該事象は、細菌染色体上の少なくとも30ヌクレオチドの配列（組換え発生領域）と、該株内で形質転換されるベクター上の少なくとも30ヌクレオチドの配列（もう1つの組換え発生領域）との間で生じる。好ましくは、該領域は40〜1000ヌクレオチド、より好ましくは100〜800ヌクレオチド、最も好ましくは500ヌクレオチドである。これらの組換え発生領域は、高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしうるのに十分な程度に類似しているべきである。
本明細書に記載の遺伝子改変事象（例えば、組換え事象およびナイセリアゲノム内への更なる遺伝子配列の導入による遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）を用いるための方法はWO01/09350に記載されている。ナイセリア内に組込まれうる典型的な強力なプロモーターとしては、porA、porB、lgtF、Opa、p110、lstおよびhpuABが挙げられる。PorAおよびPorBは、強力な構成性プロモーターとして好ましい。PorBプロモーター活性は、porBの開始コドンの上流のヌクレオチド-1〜-250に対応する断片中に含まれることが確認されている。
鉄制限培地内での増殖による抗原の発現のアップレギュレーション
本発明の外膜小胞調製物中の幾つかの抗原のアップレギュレーションは、好ましくは、鉄制限条件下で増殖させたナイセリアの親株から外膜小胞を単離することにより達成される。培地内の低濃度の鉄は、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuBおよびP2086を含む、鉄獲得に関与するタンパク質の発現の増加をもたらす。それにより、関与遺伝子の組換え修飾（例えば、より強力なプロモーターの挿入または該遺伝子の追加的なコピーの挿入によるもの）を行わなくても、これらのタンパク質の発現がアップレギュレーションされる。本発明はまた、該遺伝子の組換え修飾をも用いる、鉄制限培地内での増殖による鉄獲得タンパク質のアップレギュレーションを含む。
鉄制限は、培地への鉄キレート剤の添加により達成される。適当な鉄キレート剤には、2,2-ジピリジル、EDDHA（エチレンジアミン-ジ(o-ヒドロキシフェニル酢酸)）およびデスフェラル（Desferal）（デフェロキサミンメシラート, Sigma）が含まれる。デスフェラルが好ましい鉄キレート剤であり、10〜100μM、好ましくは25〜75μM、より好ましくは50〜70μM、最も好ましくは60μMの濃度で培地に加えられる。培地の鉄含量は、主として、酵母エキスおよびダイズペプトン成分に由来し、存在量はバッチによって異なりうる。したがって、鉄獲得タンパク質のアップレギュレーションを達成するために最適なデスフェラルの濃度は、培地のバッチによって異なりうる。当業者は最適濃度を容易に決定しうるはずである。基本的には、所望の鉄調節タンパク質の発現をアップレギュレーションするのに十分であるが、該細菌の増殖には悪影響を及ぼさない程度の量の鉄キレート剤を培地に加えるべきである。
好ましくは、本発明の外膜小胞を得るために、鉄制限条件下の増殖による鉄獲得タンパク質のアップレギュレーションを他の抗原の組換えアップレギュレーションと組み合わせる。
可変性および非防御免疫優性抗原のダウンレギュレーション／除去
多数の表面抗原は細菌株間で可変性であり、その結果、密接に関連した株の、限られた組に対してのみ、防御性であるに過ぎない。本発明の1つの態様は、他のタンパク質の発現が減少した、あるいは好ましくは、可変性表面タンパク質をコードする遺伝子が欠失した、本発明の外膜小胞を含む。そのような欠失により生じる細菌株が産生するブレブは、ワクチンとして投与されると、保存タンパク質（外膜上に保持されている）によってもたらされるワクチン被接種者の免疫系への影響がより大きいため、種々の株に対する交差反応性をより強く示す。本発明のブレブ免疫原性組成物においてダウンレギュレーションされうるナイセリアにおけるそのような可変性抗原の具体例には、PorA、PorB、Opaが包含される。
ダウンレギュレーションされうるまたはスイッチが切られうる他のタイプの遺伝子は、in vivoにおいて、該細菌により容易にスイッチが入れられうる（発現されうる）または切られうる遺伝子である。そのような遺伝子にコードされる外膜タンパク質は該細菌上に必ずしも存在するわけではないため、該ブレブ調製物中のそのようなタンパク質の存在は、前記の理由により、ワクチンの有効性に悪影響を及ぼしうる。ダウンレギュレーションまたは欠失させるべき好ましい一例は、ナイセリアOpcタンパク質である。感染生物は容易にOpc-となりうるため、Opc含有ブレブワクチンにより誘導される抗Opc免疫は、限られた防御能しか有さないであろう。
例えば、これらの可変性または非防御性遺伝子は発現においてダウンレギュレーションされたり、または該遺伝子のスイッチが一時的に切られうる。これは、ブレブの外表面上に少量で存在するより良好な抗原に、免疫系を集中させるという利点を有する。ダウンレギュレーションはまた、前記外膜タンパク質の表面露出可変性免疫優性ループを改変しまたは欠失させて、生じる外膜タンパク質の免疫優性の度合を低下させうることも意味する。
発現のダウンレギュレーションのための方法はWO01/09350に開示されている。本発明のブレブ免疫原性組成物においてダウンレギュレーションされるべきタンパク質の好ましい組合せには、PorAおよびOpA; PorAおよびOpC; OpAおよびOpC; PorAおよびOpAおよびOpCが含まれる。
4つの異なるOpa遺伝子が髄膜炎菌ゲノム内に存在することが公知である（Ahoら 1991 Mol. Microbiol. 5:1429-37）。したがって、Opaが発現においてダウンレギュレーションされるというのは、好ましくは、髄膜炎菌内に存在する1、2、3または（好ましくは）4個すべての遺伝子がそのようにダウンレギュレーションされることを意味する。そのようなダウンレギュレーションは、WO 01/09350に記載されているとおりに遺伝子工学的に行われうる。あるいはそのようなダウンレギュレーションは、Opa遺伝子座からの発現が全くまたは低レベルでしか生じない容易に見出される天然の安定した髄膜炎菌株を探すことにより行われうる。そのような株は、Poolmanら (1985 J. Med. Micro. 19:203-209)に記載の技術を用いて見出すことが可能であり、この場合、Opa-である細胞は、Opaを発現する細胞とは異なる表現型を有し、これは、プレート上または顕微鏡下で細胞の外観を観察することにより認められうる。そのような株を見出したら、Opaの欠失を確認するために、発酵の実施後、細胞内容物に対してウエスタンブロットを行うことにより、該株が安定にOpa-であることを示すことが可能である。
外膜小胞内の幾つかの抗原のアップレギュレーションが鉄制限条件下での増殖により達成される場合には、可変性タンパク質FrpB（Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999)）もアップレギュレーションされるであろう。本発明者らは、WO01/09350に記載されているとおりにFrpBタンパク質全体の発現をダウンレギュレーションすることにより、またはFrpBの可変性領域を欠失させることにより、これらの状況下でFrpBの発現をダウンレギュレーションすることが有利であることを見出した。これは、該免疫原性組成物により惹起される免疫応答が、広範な株に存在する抗原に向かうことを保証するであろう。本発明のブレブ免疫原性組成物においては、好ましくは、FrpBのダウンレギュレーションを、PorAおよびOpA; PorAおよびOpC; OpAおよびOpC; PorAおよびOpAおよびOpCのダウンレギュレーションと組み合わせる。
本発明のもう1つの実施形態においては、鉄制限条件下で増殖させたものではないナイセリア株から調製した外膜小胞においてFrpBをダウンレギュレーションする。
LPSの解毒
本発明の免疫原性組成物中のブレブは、WO01/09350に開示されているLPSの解毒方法により解毒されうる。特に、本発明のLPSの解毒方法は、WO01/09350に開示されているhtrBおよび／またはmsbB酵素のダウンレギュレーション／欠失を含む。ナイセリアのmsbBおよびhtrB遺伝子はそれぞれlpxL1およびlpxL2と称され（WO 00/26384）、これらの遺伝子の欠失突然変異は、一方の第2級アシル鎖を欠くmsbB-突然変異LOS、および両方の第2級アシル鎖を欠くhtrB-突然変異LOSにより、表現型により特徴づけられる。WO93/14155およびWO 95/03327は、本発明の組成物中で使用しうるポリミキシンBの無毒性ペプチド機能等価体を記載している。
そのような方法は、好ましくは、低レベルのDOC、好ましくは0〜0.3％ DOC、より好ましくは0.05％〜0.2％ DOC、最も好ましくはおよそまたは正確に0.1％ DOCを使用するブレブ抽出の方法と組合せる。他のLPS解毒方法は、前記のとおり、ポリミキシンBの無毒性ペプチド機能等価体（好ましくはSEAP2）をブレブ調製物に加えることを含む。
交差反応性多糖
被包性グラム陰性細菌からの細菌外膜ブレブの単離は、しばしば、莢膜多糖の同時精製をもたらす。場合によっては、この「混入」物質が有用となろう。なぜなら、多糖は、他のブレブ成分によりもたらされる免疫応答を増強しうるからである。しかし、場合によっては、細菌ブレブ調製物中の混入多糖物質の存在は、ワクチンにおけるブレブの使用に有害となろう。例えば、少なくともナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型Bの場合には、莢膜多糖は防御免疫を付与せず、ヒトにおいては有害な自己免疫応答を誘導しやすいことが示されている。したがって、ブレブの製造のために、莢膜多糖を含有しないように操作された細菌株から本発明の外膜小胞を単離することが可能である。したがって、該ブレブはヒトにおける使用に適しているであろう。そのようなブレブ調製物の特に好ましい一例は、莢膜多糖を欠くナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型Bからのものである。
これは、莢膜の生合成および／または輸送に必要な遺伝子が損なわれた改変ブレブ産生株を使用することにより達成されうる。莢膜多糖の生合成または輸送をコードする遺伝子の不活性化は、制御領域およびコード領域のうちの一方または両方の突然変異（点突然変異、欠失または挿入）により（好ましくは、前記の相同組換え技術を用いる）、あるいはそのような遺伝子の酵素機能を低下させる任意の他の方法により達成されうる。さらに、莢膜生合成遺伝子の不活性化は、アンチセンス過剰発現またはトランスポゾン突然変異誘発によっても達成されうる。好ましい方法は、多糖の生合成および輸送に必要なナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）cps遺伝子の一部または全部の欠失である。この目的には、cpsCAD (+ galE)遺伝子クラスターを欠失させる突然変異を挿入するために、置換プラスミドpMF121（Froshら 1990, Mol. Microbiol. 4:1215-1218に記載されている）を使用することが可能である。
L3またはL2 LPSに対して産生された抗体の安全性は、ヒトスフィンゴ糖脂質中に存在するラクト-N-ネオテトラオースオリゴ糖類（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-）に類似した構造の存在のため、疑問視されている。残余量のL3 LPSを含有するデオキシコラート抽出小胞ワクチンで多数の人が安全にワクチン接種されたとしても（G. Bjuneら, Lancet (1991), 338, 1093-1096; GVG. Sierraら, NIPH ann (1991), 14, 195-210）、LOS多糖の末端部分の欠失は、ヒト組織の表面に存在する構造体との交差反応の阻止に好都合である。好ましい実施形態においては、lgtB遺伝子の不活性化は、末端ガラクトース残基およびシアル酸が存在しない中間LPS構造を与える（該突然変異はL2およびL3 LOS中に4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-構造を残す）。そのような中間体はL3およびL2 LPS株において入手可能であろう。もう1つのそれほど好ましくない（短い）LPS形態は、lgtE遺伝子のスイッチを切ることにより入手可能である。もう1つのそれほど好ましくないLPS形態は、lgtA遺伝子のスイッチを切ることにより入手可能である。そのようなlgtA-突然変異を選択した場合には、非免疫原性L1免疫型の生成を阻止するためにlgtC発現のスイッチを切ることも好ましい。
本発明者らは、LgtB-突然変異体が、殺菌性抗体応答を尚も誘導しうるLPS防御オリゴ糖エピトープをなおも保有する一方で、安全性の問題の解決に最適なトランケート化体であることを見出したため、LgtB-突然変異体が最も好ましい。
したがって、一般に、L2またはL3調製物（精製ブレブであっても単離ブレブであってもよい）または髄膜炎菌ブレブ調製物を更に含む本発明の免疫原性組成物は、lgtB、lgtAまたはlgtE遺伝子からの機能遺伝子産物の発現を（好ましくは該遺伝子のスイッチを切ることにより、最も好ましくは該遺伝子のプロモーターおよび／またはオープンリーディングフレームの全部または一部を欠失させることにより）恒久的にダウンレギュレーションするよう遺伝子工学的に操作されたナイセリア株（好ましくは髄膜炎菌）に由来するのが好都合である。
本発明の前記免疫原性組成物が髄膜炎菌B株に由来する場合には、（ヒト様多糖構造をも含有する）莢膜多糖も除去されていることが更に好ましい。これを達成するために多数の遺伝子のスイッチを切ることが可能であるが、本発明者らは好都合にも、siaD遺伝子からの機能遺伝子産物の発現を（好ましくは該遺伝子のスイッチを切ることにより、最も好ましくは該遺伝子のプロモーターおよび／またはオープンリーディングフレームの全部または一部を欠失させることにより）恒久的にダウンレギュレーションするために（すなわち、α-2-8ポリシアリルトランスフェラーゼ活性をダウンレギュレーションするために）該ブレブ産生株が遺伝子工学的に操作されていることが好ましいことを示した。そのような不活性化はWO 01/09350に記載されている。siaD（synDとしても公知である）突然変異は、莢膜多糖からヒト類似エピトープを除去しうる多数の突然変異のうちで最も有利である。なぜなら、それは、LOSの防御エピトープの生合成に影響を及ぼさないため、防御抗原としてLOSを最終的に使用することを目的とした方法において有利であり、該細菌の増殖に最低限度の影響しか及ぼさない突然変異のうちの1つだからである。したがって、本発明の好ましい態様は、lgtE- siaD-、lgtA- siaD- 、または好ましくはlgtB- siaD- 髄膜炎菌B突然変異株に由来する前記のとおりのブレブ免疫原性調製物である。その株自体も本発明のもう1つの態様である。
前記の理由によりsiaD-突然変異が好ましいが、髄膜炎菌B莢膜多糖の合成のスイッチを切る他の突然変異を使用することも可能である。したがって、遺伝子ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA (synXおよびsiaAと等価)、synB (siaBと等価)またはsynC (siaCと等価) のうち1以上からの機能遺伝子産物の発現を（好ましくは該遺伝子のスイッチを切ることにより、最も好ましくは該遺伝子のプロモーターおよび／またはオープンリーディングフレームの全部または一部を欠失させることにより）恒久的にダウンレギュレーションするようにブレブ産生株を遺伝子工学的に操作することが可能である。lgtE-突然変異をこれらの突然変異の1以上と組合せることが可能である。好ましくは、lgtB-突然変異をこれらの突然変異の1以上と組合せる。したがって、本発明のもう1つの態様は、そのような髄膜炎菌Bの組合せ突然変異株に由来する前記のブレブ免疫原性調製物である。該株自体も本発明のもう1つの態様である。
lgtBおよびlgtEを含む種々のlgt遺伝子を含有するナイセリア遺伝子座ならびにその配列は当技術分野において公知である（M. P. Jenningsら, Microbiology 1999, 145, 3013-3021およびそれにおいて引用されている参考文献ならびにJ. Exp. Med. 180:2181-2190 [1994]）。
最終産物中で完全長（非トランケート化）LOSを使用する場合には、LOSがシアル酸化されていないことが望ましい（なぜなら、そのようなLOSは、同様に非シアル酸化体である最も危険な侵襲性髄膜炎菌B株に対する免疫応答を生成するからである）。そのような場合、synA (synXおよびsiaAと等価)、synB (siaBと等価) またはsynC (siaCと等価)遺伝子が欠失した莢膜陰性株を使用することが有利である。なぜなら、そのような突然変異は、menB LOSを、シアル酸化され得なくするからである。
ブレブ調製物、特に、低濃度のDOCで抽出した調製物においては、本発明の免疫原性組成物中の抗原としてLPSを使用することが可能である。しかし、ヒト様ラクト-N-ネオテトラオース構造を除去するために、lgtE、lgtA（特にlgtCと共に）、または好ましくはlgtB遺伝子／遺伝子産物の酵素機能をダウンレギュレーション／欠失／不活性化することが有利である。LPSオリゴ糖構造の生合成のためのlgt遺伝子を含むナイセリア遺伝子座（およびその配列）は当技術分野において公知である（Jenningsら Microbiology 1999 145; 3013-3021およびそれにおいて引用されている参考文献、ならびにJ. Exp. Med. 180:2181-2190 [1994]）。lgtB（または機能的遺伝子産物）のダウンレギュレーション／欠失が好ましい。なぜなら、それはLPS防御エピトープを無傷のまま残すからである。
本発明のナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型Bブレブ調製物においては（髄膜炎菌Bブレブ産生株におけるlgtB-とctrA-、ctrB-、ctrC-、ctrD-、synA- (synX- およびsiaA-と等価）、synB- (siaB-と等価) またはsynC- (siaC-と等価)のいずれかとの組合せを使用することも可能であるが）、最適な安全性を有しLPS防御エピトープを保有するブレブ調製物を与える、siaDおよびlgtBの両方のダウンレギュレーション／欠失が好ましい。
したがって、本発明のもう1つの態様は、髄膜炎菌Bのそのような組合せ突然変異株に由来する前記のブレブ免疫原性調製物である。該株自体も本発明のもう1つの態様である。
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも1、2、3、4または5個の異なる外膜小胞調製物を含みうる。2以上のOMV調製物が含まれている場合には、各OMVにおいて本発明の少なくとも1つの抗原をアップレギュレーションする。そのようなOMV調製物は、同じ種および血清型のナイセリア株、あるいは好ましくは、異なる綱、血清型、血清型、亜血清型または免疫型のナイセリア株に由来しうる。例えば、免疫原性組成物は、免疫型L2のLPSを含有する1以上の外膜小胞調製物と、免疫型L3のLPSを含有する1以上の外膜小胞調製物とを含みうる。L2またはL3 OMV調製物は、好ましくは、LPSオリゴ糖合成遺伝子座における最小の相可変性を有する安定株に由来する。
サブユニット組成物と組合された外膜小胞
本発明の免疫原性組成物はまた、サブユニット組成物および外膜小胞の両方を含みうる。可溶性の点でサブユニット組成物に加えるのに特に適した幾つかの抗原が存在する。そのようなタンパク質の具体例には、FhaB、NspA、Hsfのパッセンジャードメイン、Hapのパッセンジャードメイン、AspAのパッセンジャードメイン、AspA、OMP85、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilQが含まれる。該外膜小胞調製物は、外膜小胞において組換えによりアップレギュレーションされている以下：NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA (高)、TbpA (低)、LbpA、TbpB、LbpB、NadA、TspA、TspB、PilC、PilQ、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafBおよびPldAから選ばれる少なくとも1つの異なる抗原を有し、所望により、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方を含みうる。
本発明の特異的免疫原性組成物
後述した特定の組合せにおいては、抗原の組合せがブレブ中に存在する場合には、抗原のそのような組合せを、前記のとおりにアップレギュレーションすべきである。
本発明の特に好ましい実施形態は、自己輸送体タンパク質および鉄獲得タンパク質、より好ましくはHsfおよびTbpA (高)および／またはTbpA (低)を含む。そのような免疫原性組成物は、より好ましくは、更に、OMP 85、FrpA、FrpC、LbpA、LbpB、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TspA、NadA、TspB、PilQ、FhaC、NspA、PldA、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaB、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、VapDおよびHapのうち少なくとも1つを含みうる。前記免疫原性組成物はすべて、さらに、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方を含みうる。
本発明のもう1つの好ましい実施形態は、Hsfと、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、Hap、AspA、IgAプロテアーゼ、OMP85、NspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaC、NadA、PldA、TspA、TspB、TdfH、PorBおよびFhaBよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。前記免疫原性組成物はすべて、さらに、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方を含みうる。好ましい組合せは、HsfおよびOMP85 (所望により、Hap、FrpAまたはLbpBの1以上を含みうる); HsfおよびHap (所望により、FrpA、LbpBまたはOMP85の1以上を含みうる); HsfおよびFrpA (所望により、Hap、LbpBまたはOMP85の1以上を含みうる); HsfおよびLbpB (所望により、Hap、OMP85またはFrpAの1以上を含みうる)を含む。Hsfはアドヘジンであり自己輸送体タンパク質であるため、特に好ましい組合せは、好ましくは多価ブレブ調製物中に、代表される全5群の抗原のメンバーを有する、Hsf、OMP85、TbpA、LPS免疫型L2および／またはL3を含む。好ましくは、TbpA(低) およびTbpA (高)の両方が存在する。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、FhaBと、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TdfH、PorB、PldA、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspAおよびTspBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。好ましい組合せは、FhaBおよびHsf (所望により、OMP85、LbpB、HapまたはFrpAの1以上を含む); FhaBおよびOMP85 (所望により、LbpB、HapまたはFrpAの1以上を含む); FhaBおよびLbpB (所望により、HapまたはFrpAの1以上を含む); FhaBおよびHap (所望により、FrpAを含む)を含む。好ましい組合せは、代表される全5群の抗原のメンバーを有するFhaB、LbpB、（OMPとしての）HsfおよびFrpAを含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、NspAと、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、OMP85、PilQ、AspA、IgAプロテアーゼ、NadA、PldA、Hsf、Hap、TspA、TspB、TdfH、PorB、ならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。好ましい組合せは、NspAおよびHsf (所望により、OMP85、Hap、LbpAまたはTbpAの1以上を含む); NspAおよびOMP85 (所望により、Hap、LbpAまたはTbpAの1以上を含む); NspAおよびHap (所望により、LbpAまたはTbpAの1以上を含む); NspAおよびLbpA (所望により、TbpAを含む)を含む。特に好ましい組合せは、好ましくは多価ブレブ調製物中に、代表される全5群の抗原のメンバーを有するNspA、Hsf、TbpA、LPS免疫型L2および／またはL3を含む。好ましくは、TbpA(低) およびTbpA (高)の両方が存在する。
WO 00/25811に開示されている抗原の個々の組合せを含有する免疫原性組成物は本発明においては特許請求されない。好ましくは、免疫原性組成物またはワクチンは、それらが、トランスフェリン結合タンパク質とNspAとのみよりなる抗原内容物を有する場合（あるいはブレブワクチンの場合には、トランスフェリン結合タンパク質とNspAとのみよりなるアップレギュレーションされたまたは富化された抗原内容物を有する場合）には、本発明によっては保護されない。しかし、NspAならびにTbpA(高) およびTbpA (低)の両方よりなる特定の組合せの抗原（またはアップレギュレーションされた抗原）は含まれうる。場合によっては、トランスフェリン結合タンパク質およびNspAの組合せ（サブユニット）またはアップレギュレーション（ブレブ）を含む組成物またはワクチンは特許請求されない。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、NadAと、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、OMP85、NspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、HpuA、HpuB、AspA、IgAプロテアーゼ、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、TbpA (低)と、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、IgAプロテアーゼ、NspA、HpuA、HpuB、Hap、OMP85、NspA (更にTbpA(高)と組合せた場合)、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、AspA、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorBおよびFhaBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。好ましい組合せは、TbpA(低)およびHsfおよびLbpA; TbpA(低)およびOMP85 (所望により、LbpAおよびHapのうちの一方または両方を含みうる); TbpA(低)およびLbpAおよびHapを含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、TbpA (高)と、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、Hap、OMP85、NspA (更にTbpA(低)と組合せた場合)、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、MafA、MafB、AspA、IgAプロテアーゼ、PldA、FhaB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorBおよびFhaBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。好ましい組合せは、TbpA(高)およびHsfおよびLbpA; TbpA(高)およびOMP85 (所望により、LbpAおよびHapのうちの一方または両方を含みうる); TbpA(高)およびLbpAおよびHapを含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、LbpAと、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、TbpB、Hap、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA、MafB、IgAプロテアーゼ、AspA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH、PorBおよびFhaBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。好ましい組合せはLbpAおよびHsf (所望により、Hapを含みうる)を含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、LbpBと、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpA、TbpB、Hap、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA、MafB、IgAプロテアーゼ、AspA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH、PorBおよびFhaBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。好ましい組合せは、LbpBおよびHsf (所望により、OMP85、HapまたはFrpAの1以上を含みうる); LbpBおよびOMP85 (所望により、HapまたはFrpAの1以上を含みうる); LbpBおよびHap (所望により、FrpAを含みうる)を含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、OMP85と、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、Hsf、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、PilQ、TdfH、PorBおよびFhaBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。好ましい組合せは、OMP85およびHsf (所望により、LbpAまたはNspAのうちの一方または両方を含みうる); OMP85およびLbpA (所望により、HapおよびNspAのうちの一方または両方を含みうる); OMP85およびHap (所望により、NspAを含みうる)を含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、Hapと、FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、NspA、IgAプロテアーゼ、AspA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorBおよびFhaBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、FrpAと、LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、NadA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorBおよびFhaBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、FrpCと、LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、NadA、FhaB、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorBおよびFhaBならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。
本発明のもう1つの免疫原性組成物は、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方と、LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、NadA、FhaB、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorBおよびFhaBよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物中の抗原の好ましい組合せとしては、鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびFhaB; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびPilC; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびNadA; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびFrpA; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびPilQ; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびTspA; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびTspB; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびNspA; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびFrpC; より好ましくは、鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびHap; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびFrpA/C; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびLbpB; 鉄獲得タンパク質、自己輸送体タンパク質およびOMP85 (D15)を含む組合せが挙げられる。最も好ましくは、外膜小胞調製物の一部としてOMP85 (D15)が含まれる。
LPSを含有する本発明の免疫原性組成物においては、好ましくは、該LPSが、Tヘルパーエピトープ源、好ましくはタンパク質（OMV中のLPSの場合には、好ましくは外膜タンパク質）に結合している。特に好ましい実施形態は、外膜小胞調製物（例えば、前記のもの）中に、in situでOMPに（好ましくはブレブ内）結合したLPSを含有する。
本発明の免疫原性組成物は、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型A、B、C、Y、W-135またはナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）に由来する抗原（タンパク質、LPSおよび多糖）を含みうる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、WO 00/71725の第3頁18行〜第52頁2行の表に記載の配列番号の特定の組合せおよび／またはWO 00/71725の実施例1〜11に記載の任意の個々の組合せよりなるおよび／または含むものではない。
好ましくは、WO 01/52885に開示されている個々の組合せはいずれも、本発明においては特許請求されない。
他の組合せ
本発明の免疫原性組成物は更に、細菌莢膜多糖またはオリゴ糖を含みうる。該莢膜多糖またはオリゴ糖は、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型A、C、Yおよび／またはW-135、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）b、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）、A群レンサ球菌、B群レンサ球菌、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）およびスタヒロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）のうち1以上に由来しうる。
本発明のもう1つの態様は、本発明の抗原性組成物と、ウイルスまたはグラム陽性菌に関連した病態を含む或る病態に対して有利に使用される他の抗原とを含むワクチンの組合せである。
1つの好ましい組合せにおいては、本発明の抗原性組成物は、無修飾であってもタンパク質担体に結合していてもよい髄膜炎菌莢膜多糖またはオリゴ糖A、C、YまたはW-135のうち1、2、3または好ましくは4個すべてとともに製剤化される。好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、AおよびC；またはC；またはCおよびYを使用して製剤化される。ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）、好ましくは血清型Bに由来するタンパク質を含有するそのようなワクチンは、包括的髄膜炎菌ワクチンとして有利に使用されうる。
もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の抗原性組成物、好ましくは、無修飾のまたは結合させた髄膜炎菌莢膜多糖またはオリゴ糖A、C、YまたはW-135の1、2、3または4個すべてとともに製剤化される抗原性組成物（前記のとおり）は、結合させたヘモフィルス・インフルエンザ（H. influenzae）b莢膜多糖またはオリゴ糖および／または1以上の無修飾のまたは結合させた肺炎球菌多糖またはオリゴ糖を使用して製剤化される。所望により、該ワクチンは、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）感染に対して宿主を防御しうる1以上のタンパク質抗原をも含みうる。そのようなワクチンは包括的な髄膜炎ワクチンとして有利に使用されうる。
さらにもう1つの好ましい実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）b、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）、A群レンサ球菌、G群レンサ球菌、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）またはスタヒロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）のうち1以上に由来しうる莢膜多糖またはオリゴ糖を使用して製剤化される。肺炎球菌莢膜多糖抗原は、好ましくは、血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33F (最も好ましくは、血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23F)から選ばれる。もう1つの好ましい実施形態はヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）のPRP莢膜多糖を含有するであろう。もう1つの好ましい実施形態はスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の5型、8型または336型莢膜多糖を含有するであろう。もう1つの好ましい実施形態はスタヒロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）のI型、II型またはIII型莢膜多糖を含有するであろう。もう1つの好ましい実施形態はB群レンサ球菌のIa型、Ic型、II型またはIII型莢膜多糖を含有するであろう。もう1つの好ましい実施形態はA群レンサ球菌の莢膜多糖を含有し、好ましくは更に、少なくとも1つのMタンパク質を含み、より好ましくは、複数の型のMタンパク質を含む。
本発明のそのような莢膜多糖は非結合形態であっても、あるいは破傷風トキソイド、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリジン、プロテインD（米国特許第6342224号）のような担体タンパク質に結合していてもよい。該多糖結合体は任意の公知カップリング技術により製造することができる。例えば、該多糖をチオエーテル結合によりカップリングすることができる。この結合方法は、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジミウムテトラフルオロボラート（CDAP）で多糖を活性化してシアン酸エステルを生成することに基づく。したがって、該活性化多糖を、直接的にまたはスペーサー基を介して、担体タンパク質上のアミノ基にカップリングすることが可能である。好ましくは、該シアン酸エステルをヘキサンジアミンにカップリングし、該アミノ誘導体化多糖を、チオエーテル結合の形成を含むヘテロ連結化学法を用いて担体タンパク質に結合させる。そのような結合体はUniformed Services UniversityのPCT公開出願WO93/15760に記載されている。
該結合体は、米国特許第4365170 (Jennings)および米国特許第4673574号(Anderson)に記載の直接的な還元的アミノ化法によっても製造することが可能である。他の方法はEP-0-161-188、EP-208375およびEP-0-477508に記載されている。もう1つの方法は、アジピン酸ヒドラジド（ADH）で誘導体化された臭化シアン活性化多糖の、カルボジイミド縮合（Chu C.ら Infect. Immunity, 1983 245 256）によるタンパク質担体へのカップリングを含む。オリゴ糖が含まれる場合には、それは結合していることが好ましい。
好ましい肺炎球菌タンパク質抗原は、（肺炎球菌の生活環の少なくとも一部において宿主の免疫系により認識されうる）肺炎球菌の外表面上に露出した肺炎球菌タンパク質、あるいは肺炎球菌により分泌または放出されるタンパク質である。最も好ましくは、該タンパク質は、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）の毒素、アドヘジン、2成分シグナルトランスデューサーもしくはリポタンパク質またはそれらの断片である。特に好ましいタンパク質には、ニューモリジン（好ましくは、化学処理または突然変異により解毒されているもの）[Mitchellら Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchellら Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspAおよびその膜貫通欠失変異体 (米国特許第5804193号 - Brilesら); PspCおよびその膜貫通欠失変異体 (WO 97/09994 - Brilesら); PsaAおよびその膜貫通欠失変異体 (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); 肺炎球菌コリン結合タンパク質およびその膜貫通欠失変異体; CbpAおよびその膜貫通欠失変異体 (WO 97/41151; WO 99/51266); グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beatoら FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); M様タンパク質 (EP 0837130)およびアドヘジン18627, (EP 0834568)が含まれるが、これらに限定されるものではない。更なる好ましい肺炎球菌タンパク質抗原としては、WO 98/18931に開示されているもの、特に、WO 98/18930およびPCT/US99/30390において選ばれているものが挙げられる。
本発明の免疫原性組成物／ワクチンは、所望により、他のグラム陰性菌、例えばモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）またはヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）から製造された外膜小胞調製物を含みうる。
モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）ブレブ調製物
本発明の免疫原性組成物は更に、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）由来のOMV調製物を含みうる。操作されたOMV調製物は、WO01/09350に記載のとおりにモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）から誘導されうる。アップレギュレーションには、以下の遺伝子（防御抗原をコードするもの）の1以上が好ましい：OMP106 (WO 97/41731 & WO 96/34960)、HasR (PCT/EP99/03824)、PilQ (PCT/EP99/03823)、OMP85 (PCT/EP00/01468)、lipo06 (GB 9917977.2)、lipo10 (GB 9918208.1)、lipo11 (GB 9918302.2)、lipo18 (GB 9918038.2)、P6 (PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB (Helminen MEら, (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010)、D15 (PCT/EP99/03822)、OmplA1 (PCT/EP99/06781)、Hly3 (PCT/EP99/03257)、LbpAおよびLbpB (WO 98/55606)、TbpAおよびTbpB (WO 97/13785 & WO 97/32980)、OmpE、UspA1およびUspA2 (WO 93/03761)、ならびにOmp21。それらはまた、他のグラム陰性菌内に異種的に導入されうる遺伝子としても好ましい。
ダウンレギュレーションには、以下の遺伝子の1以上が好ましい：CopB、OMP106、OmpB1、TbpA、TbpB、LbpAおよびLbpB。
ダウンレギュレーションには、以下の遺伝子の1以上が好ましい：htrB、msbBおよびlpxK。
アップレギュレーションには、以下の遺伝子の1以上が好ましい：pmrA、pmrB、pmrEおよびpmrF。
ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）ブレブ調製物
本発明の免疫原性組成物は更に、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）由来のOMV調製物を含みうる。操作されたOMV調製物は、WO01/09350に記載のとおりにヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）から誘導されうる。アップレギュレーションには、以下の遺伝子（防御抗原をコードするもの）のうち1以上が好ましい：D15 (WO 94/12641)、P6 (EP 281673)、TbpA (WO96/40929; WO95/13370)、TbpB (WO96/40929; WO95/13370)、P2、P5 (WO 94/26304)、OMP26 (WO 97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47およびHif (このオペロン内のすべての遺伝子は、ピリンをアップレギュレーションするためにアップレギュレーションされるべきである)。それらはまた、他のグラム陰性菌内に異種的に導入されうる遺伝子としても好ましい。
ダウンレギュレーションには、以下の遺伝子の1以上が好ましい：P2、P5、Hif、IgA1-プロテアーゼ、HgpA、HgpB、HMW1、HMW2、Hxu、htrB、msbBおよびlpxK。
アップレギュレーションには、以下の遺伝子の1以上が好ましい：pmrA、pmrB、pmrEおよびpmrF。
本発明の免疫原性組成物／ワクチンは、場合により、ジフテリア、破傷風およびボルデテラ・ペルツッシス（Bordetella pertussis）感染の1以上に対する防御をもたらす抗原をも含みうる。百日咳成分は、PT、FHAおよび69kDaのペルタクチン（pertactin）からの少なくとも1つの抗原（好ましくは2つまたは3つ全て）を含有する殺滅全細胞ボルデテラ・ペルツッシス（B. pertussis）（Pw）または無細胞ペルツッシス（Pa）でありうる。典型的には、ジフテリアおよび破傷風に対する防御をもたらす抗原はジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドであろう。該トキソイドは、化学的に不活化された毒素、または点突然変異の導入により不活化された毒素でありうる。
該免疫原性組成物／ワクチンは、所望により、型別不能（non-typeable）ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）RSVに対して宿主を防御しうる1以上の抗原、および／またはインフルエンザウイルスに対して宿主を防御しうる1以上の抗原をも含みうる。そのようなワクチンは包括的中耳炎ワクチンとして有利に使用されうる。
好ましい型別不能ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）タンパク質抗原には、フィンブリンタンパク質（米国特許第5766608号）、ならびにそのペプチド（例えば、LB1融合体）（米国特許第5843464号- Ohio State Research Foundation）、OMP26、P6、プロテインD、TbpA、TbpB、Hia、Hmw1、Hmw2、HapおよびD15を含む融合体が含まれうる。
好ましいインフルエンザウイルス抗原には、全ウイルス、生ウイルスまたは不活化ウイルス、スプリットインフルエンザウイルス（卵またはMDCK細胞、またはVero細胞内で増殖させたもの）、または全fluビロゾーム（R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920に記載されている）またはその精製もしくは組換えタンパク質、例えばHA、NP、NAまたはMタンパク質、またはそれらの組合せが含まれる。
好ましいRSV（呼吸器合胞体ウイルス）抗原には、F糖タンパク質、G糖タンパク質、HNタンパク質、Mタンパク質またはそれらの誘導体が含まれる。
本発明の免疫原性組成物は、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）のタンパク質、例えばTbpA (WO97/13785; WO99/52947)、TbpB (WO97/13785; WO99/52947; Mathersら FEMS Immunol Med Microbiol 1997 19; 231-236; Myersら Infect Immun 1998 66; 4183-4192)、LbpA、LbpB (Duら Infect Immun 1998 66; 3656-3665)、UspA1、UspA2 (Aebiら Infect Immun. 1997 65; 4367-4377)、OMP106 (米国特許第6214981号)、Ton-B依存性受容体 (WO00/78968)、CopB (Sethiら Infect. Immun. 1997 65; 3666-3671)、およびHasR受容体 (WO00/78968); ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）のタンパク質、例えばHMW (St Gemeら Infect Immun 1998 66; 364-368)、Hia (St Gemeら J. Bacteriol. 2000 182; 6005-6013)、Tbp1 (WO96/40929; WO95/13370)、Tbp2 (WO96/40929; WO95/13370; Gray-Owenら Infect Immun 1995 63; 1201-1210)、LbpA、LbpB (Schryversら 1989, 29:121-130)、HasR、TonB依存性受容体 (Fleishmannら Science 1995 269; 496-512)、ヘモグロビン結合タンパク質、HhuA (Copeら Infect Immun 2000 68; 4092-4101)、HgpA (Maciverら Infect Immun 1996 64; 3703-3712)、HgbA、HgbBおよびHgbC (Jinら Infect Immun 1996 64; 3134-3141)、HxuA (Copeら Mol Microbiol 1994 13; 863-873)、HxuC (Copeら Infect Immun 2001 69; 2353-2363); ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）のタンパク質、例えばTbp1、Tbp2、FbpA、FbpB、BfrA、BfrB (Tettelinら Science 2000 287; 1809-1815)、LbpA、LbpBおよびHmbRを含みうる。
ワクチン製剤
本発明の好ましい実施形態は、製薬上許容される賦形剤または担体をも含みうるワクチン中の本発明の免疫原性組成物の製剤である。
前記の任意の改変株からの外膜小胞調製物の製造は、当業者によく知られた任意の方法により達成されうる。好ましくは、EP 301992、米国特許第5,597,572号、EP 11243または米国特許第4,271,147号に開示されている方法を用いる。最も好ましくは、WO 01/09350に記載されている方法を用いる。
ワクチン製剤は、全般的には、「ワクチン設計（Vaccine Design）」(“The subunit and adjuvant approach” (Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995) Plenum Press New York)に記載されている。
本発明のワクチン製剤においては、本発明の抗原性組成物をアジュバント化することが可能である。適当なアジュバントは、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムを含むが、カルシウムの塩（特に、炭酸カルシウム）、鉄の塩または亜鉛の塩であることも可能であり、あるいはアシル化チロシンまたはアシル化糖の不溶性懸濁液、陽イオンまたは陰イオンにより誘導体化された多糖、またはポリホスファゼンが含まれる。
使用しうる適当なTh1アジュバント系には、モノホスホリルリピドA、特に3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA、およびモノホスホリルリピドA、好ましくは3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）とアルミニウム塩（好ましくはリン酸アルミニウム）との組合せが含まれる。増強された系は、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体との組合せ、特に、WO 94/00153に開示されているQS21と3D-MPLとの組合せ、あるいはWO96/33739に開示されている、QS21がコレステロールでクエンチされた、より低い反応生成性（reactogenic）の組成物を含む。水中油型エマルション中にQS21 3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤がWO95/17210に記載されており、好ましい製剤である。
該ワクチンはサポニン、より好ましくはQS21を含みうる。それは水中油型エマルションおよびトコフェロールをも含みうる。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド（WO 96/02555）もTH1応答の選択的誘導物質であり、本発明における使用に適している。
本発明のワクチン製剤は、全身または粘膜経路により該ワクチンを投与することにより、感染に感受性の哺乳動物を防御または治療するために使用することが可能である。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路による注射、あるいは口内／食事、呼吸器、尿生殖管への粘膜投与を含みうる。したがって、本発明の1つの態様は、グラム陰性菌の感染により引き起こされる疾患に対してヒト宿主を免疫する方法であって、本発明のOMV調製物の免疫防御用量を該宿主に投与することを含んでなる方法である。
各ワクチン用量中の抗原量は、典型的なワクチン被接種者においてかなりの有害な副作用を伴うことなく免疫防御応答を誘導する量として選ばれる。そのような量は、使用する具体的な免疫原および投与方法に左右されるであろう。一般に、各用量は1〜100μg、好ましくは5〜50μg、最も典型的には5〜25μgのタンパク質抗原またはOMV調製物を含むと予想される。
個々のワクチンの最適量は、被験体における適当な免疫応答の観察を含む標準的な試験により確認することができる。初回ワクチン接種の後、適当な間隔を空けて1回または数回の追加免疫を被験体に実施することが可能である。
本発明のワクチンは、好ましくは、免疫防御性であり、無毒性であり、小児または青年に対する使用に適している。
小児に対する使用は、4歳未満の小児における使用を意味する。
免疫防御性は、前記のSBAおよび／または動物防御モデルおよび接着阻止アッセイにおいて満足な結果が得られることを意味する。
無毒性は、よく知られたLALおよび発熱原性アッセイによる測定で、ワクチン中に十分なレベルの内毒素活性が認められないことを意味する。
本発明のポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」は、一般には、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これらは未修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNAでありうる。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖のDNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるRNA、一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物でありうるDNAとRNAとを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、「ポリヌクレオチド」は、RNAもしくはDNAまたはRNAとDNAとの両方を含む三本鎖領域を意味する。ポリヌクレオチドなる語には、1以上の修飾塩基を含有するDNAまたはRNA、および安定性または他の理由のために修飾された主鎖を有するDNAまたはRNAも含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンのような異常塩基が含まれる。DNAおよびRNAには種々の修飾が施されうるが、「ポリヌクレオチド」には、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態の、典型的には天然で見出されるポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態が含まれる。「ポリヌクレオチド」にはまた、オリゴヌクレオチドとしばしば称される比較的短いポリヌクレオチドが含まれる。
本発明のもう1つの態様は、1以上のポリヌクレオチドを含む免疫学的／ワクチン製剤に関する。そのような技術は当技術分野で公知であり、例えば、Wolffら, Science, (1990) 247: 1465-8を参照されたい。
そのようなワクチンは、前記の本発明のタンパク質の組合せに対応する複数のタンパク質をコードする1以上のポリヌクレオチドを含む。
そのようなポリヌクレオチドからのタンパク質の発現は、哺乳類細胞内で発現を駆動しうる真核生物プロモーターの制御下にあるであろう。該ポリヌクレオチドはまた、他の抗原をコードする配列を含みうる。発現を駆動しうる真核生物プロモーターの具体例には、ウイルス由来のウイルスプロモーター、例えばアデノウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーターが含まれる。あるいは、発現を駆動するために、哺乳類プロモーターを使用することが可能であろう。
本発明の他の態様
本発明のもう1つの態様は、ナイセリア疾患の治療または予防方法であって、それを要する宿主に本発明のワクチンの防御用量（または有効量）を投与することを含んでなる方法を含む。ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型A、B、C、YまたはW135および／またはナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）の感染が有利に予防または治療されうるであろう。
本発明はまた、ナイセリア感染の治療または予防用の医薬の製造における、本発明のワクチンの使用を含む。この場合にも、ナイセリア感染には、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型A、B、C、YまたはW135および／またはナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）の感染が含まれる。
本発明のもう1つの態様は、本発明の外膜小胞が由来する遺伝子工学的に操作されたナイセリア株（前記のとおり、本発明の少なくとも2つのタンパク質が組換えによりアップレギュレーションされているもの）である。そのようなナイセリア株はナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）またはナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）でありうる。
該株は、他のナイセリアタンパク質の発現、例えば、LgtB、LgtE、SiaD、OpC、OpA、PorA、FrpB、msbBおよびHtrBの1、2、3、4、5、6、7または8個の発現をダウンレギュレーションするために（前記のとおりに）操作されていてもよい。ダウンレギュレーションの好ましい組合せには、少なくともLgtBおよびSiaDのダウンレギュレーション（好ましくは欠失）、少なくともPorAおよびOpCのダウンレギュレーション、少なくともPorAおよびOpAのダウンレギュレーション、ならびに少なくともPorA、OpAおよびOpCのダウンレギュレーションが含まれる。
本発明の他の態様は、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの製造方法である。これらには、本発明のナイセリア株に由来するブレブの形態で存在しうる、ナイセリアからの少なくとも2つの単離された抗原またはタンパク質を一緒に混合して本発明の免疫原性組成物を得る工程を含んでなる方法、および本発明の免疫原性組成物と製薬上許容される担体とを一緒にする工程を含んでなる、本発明のワクチンの製造方法が含まれる。
本発明には、ナイセリア培養物から本発明の外膜小胞を単離する工程を含んでなる、本発明の免疫原性組成物の製造方法も含まれる。そのような方法は、少なくとも2つの外膜小胞調製物を一緒にするもう1つの工程を含んでもよく、この場合、好ましくは、少なくとも1つの外膜小胞調製物は免疫型L2のLPSを含有し、少なくとも1つの外膜小胞調製物は免疫型L3のLPSを含有する。本発明はまた、0〜0.5％の濃度のDOCで抽出することにより該外膜小胞を単離する、そのような方法を含む。LPS含量を最小限にするためには、0.3％〜0.5％のDOC濃度を使用する。LPSを抗原として保存させたいOMV調製物においては、0〜0.3％、好ましくは0.05％〜0.2％、最も好ましくは約0.1％のDOC濃度を抽出に用いる。
ゴーストまたは殺滅全細胞ワクチン
本発明者らは、ブレブ調製物およびワクチンに対する前記改良がゴーストまたは殺滅全細胞調製物およびワクチンに容易に拡張されうる（同じ利点を有する）と予想している。該ブレブ調製物の原料となる本発明の改変グラム陰性株は、ゴーストおよび殺滅全細胞調製物を製造するためにも使用することができる。グラム陰性株からのゴースト調製物（無傷エンベロープを有する空細胞）の製造方法は当技術分野においてよく知られている（例えば、WO 92/01791を参照されたい）。ワクチンに使用する不活化細胞調製物を製造するために全細胞を殺滅する方法もよく知られている。したがって、本発明の目的においては、「ブレブ［またはOMV］調製物」および「ブレブ［またはOMV］ワクチン」なる語ならびに本明細書の全体にわたって記載されている方法は、それぞれ「ゴースト調製物」および「ゴーストワクチン」ならびに「殺滅全細胞調製物」および「殺滅全細胞ワクチン」に適用可能である。
抗体および受動免疫
本発明のもう1つの態様は、本発明のワクチンでレシピエントを免疫し、該レシピエントから免疫グロブリンを単離する工程を含んでなる、ナイセリア感染の予防または治療に使用する免疫グロブリンの製造方法である。この方法により製造された免疫グロブリンは本発明のもう1つの態様である。本発明の免疫グロブリンと製薬上許容される担体とを含む医薬組成物は、ナイセリア疾患の治療または予防用の医薬の製造において使用しうる本発明のもう1つの態様である。本発明の医薬製剤の有効量を患者に投与する工程を含んでなる、ナイセリア感染の治療または予防方法は、本発明のもう1つの態様である。
ポリクローナル抗体の製造のための接種物は、典型的には、生理的に許容される希釈剤、例えば食塩水、またはヒトにおける使用に適した他のアジュバントに該抗原性組成物を分散させて水性組成物を得ることにより製造する。免疫刺激量の接種物を哺乳動物に投与し、ついで該接種哺乳動物を、該抗原性組成物が防御抗体を誘導するのに十分な時間にわたり維持する。
該抗体は、アフィニティークロマトグラフィー（HarlowおよびLane Antibodies; a laboratory manual 1988）のようなよく知られた技術により、所望の度合にまで単離することができる。
抗体には、種々の一般に使用される動物、例えばヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウマ、モルモット、ラットまたはヒトからの抗血清調製物が含まれうる。該動物から採血し、血清を回収する。
本発明に従い製造した免疫グロブリンには、全抗体、抗体フラグメントまたはサブフラグメントが含まれうる。抗体は任意のクラスの全免疫グロブリン、例えばIgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、キメラ抗体、または本発明の2以上の抗原に対する二重特異性を有するハイブリッド抗体でありうる。それらは、ハイブリッドフラグメントを含む例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどのようなフラグメントでありうる。免疫グロブリンには、特異的抗原に結合して複合体を形成することにより抗体と同様に作用する天然、合成または遺伝子工学的に操作されたタンパク質も含まれる。
本発明のワクチンをレシピエントに投与し、ついで該レシピエントを、該特異的ワクチンからのチャレンジに応答して産生される免疫グロブリンの源として用いることが可能である。このようにして処理された被験体からは血漿が得られ、通常の血漿分画法により該血漿から過免疫グロブリンが得られるであろう。該過免疫グロブリンは、ナイセリア感染に対する抵抗性を付与するためにまたはナイセリア感染を治療するために、別の被験体に投与されるであろう。本発明の過免疫グロブリンは、小児、免疫無防備状態の個体におけるナイセリア疾患の治療または予防において、あるいは治療を要するが、ワクチン接種に応答した抗体を個体に産生させる時間が無い場合に、特に有用である。本発明のもう1つの態様は、グラム陰性菌、好ましくはナイセリア、より好ましくはナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）またはナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）、最も好ましくはナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型Bによる感染を治療または予防するために使用しうる、本発明の免疫原性組成物の少なくとも2つの構成成分に対して反応性である2以上のモノクローナル抗体（またはそのフラグメント、好ましくはヒトのまたはヒト化されたもの）を含んでなる医薬組成物である。
そのような医薬組成物は、任意のクラスの全免疫グロブリン、例えばIgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、キメラ抗体、または本発明の2以上の抗原に対する二重特異性を有するハイブリッド抗体でありうるモノクローナル抗体を含む。それらは、ハイブリッドフラグメントを含む例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどのようなフラグメントでありうる。
モノクローナル抗体の製造方法は当技術分野においてよく知られており、脾細胞と骨髄腫細胞との融合を含みうる（KohlerおよびMilstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies - a laboratory manual HarlowおよびLane 1988）。あるいは、適当なファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによりモノクローナルFvフラグメントを得ることが可能である（Vaughan TJら 1998 Nature Biotechnology 16; 535）。モノクローナル抗体は公知方法によりヒト化または部分ヒト化されうる。
本特許明細書中に引用されている全ての参考文献または特許出願を、参照により本明細書に組み入れることとする。
本明細書中の「含んでなる」および「含む」なる語は、いずれの場合においても、所望により、「よりなる」という語で置換されうる、と本発明者らにより意図される。
本発明の産業上の利用の方法
以下の実施例は、特に断り書きが無い限り、当業者によく知られた通常の標準的な技術を用いて実施される。これらの実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
外膜小胞調製物において使用するナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型Bの株の構築方法
WO01/09350は、外膜小胞を製造するための、および外膜小胞が由来する該細菌株を操作するための詳細な方法を記載している。外膜小胞にリポタンパク質、例えばTbpB、および／またはリポ多糖を、保持させようとする場合には、デオキシコラートを低レベルで使用するかまたは使用しない単離方法が好ましい。
機能的cps遺伝子を欠くがPorAを発現する組換えナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型B株におけるHsfタンパク質抗原のアップレギュレーション
WO01/09350の実施例に記載のとおり、特定の地方においては、外膜小胞中のPorAの存在が有利となることがあり、改良された組換えブレブのワクチンの有効性を増強しうる。本実施例においては、本発明者らは、機能的cps遺伝子を欠くがPorAを発現する株におけるHsfタンパク質抗原の発現をアップレギュレーションするために修飾pCMK(+)ベクターを使用した。元々のpCMK(+)ベクターは、lacIqを発現する大腸菌（E. coli）宿主においては抑制されるがナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）においては転写活性があるキメラporA/lacOプロモーターを含有する。該修飾pCMK(+)においては、天然porAプロモーターを使用してhsf遺伝子の転写を駆動した。後記の表に記載のHSF 01-NdeIおよびHSF 02-NheIオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Hsfをコードする遺伝子をPCR増幅した。Hsf 01-NdeIプライマーの配列のため、発現されるHsfタンパク質は5'末端に2個のメチオニン残基を含有することになる。PCR増幅に用いる条件は、供給業者が記載している条件であった（HiFi DNAポリメラーゼ, Boehringer Mannheim, GmbH）。熱サイクルは以下のとおりであった：25回（94℃で1分、48℃で1分、72℃で3分）および1回（72℃で10分、4℃で回収まで）。ついで対応アンプリコンをpCMK(+)運搬ベクターの対応制限部位においてクローニングした。pCMK(+)-Hsfと称されるこの組換えプラスミドにおいては、組換えPCR法によりキメラporA/lacOプロモーター中に存在するlacOを欠失させた。pCMK(+)-Hsfプラスミドを鋳型として使用して次の2つの別々のDNA断片をPCR増幅した。
・断片1は、porA 5'組換え発生領域、カナマイシン耐性遺伝子およびporAプロモーターを含有する。使用したオリゴヌクレオチドプライマーRP1(SacII)およびRP2を、後記の表に示す。RP1プライマーは、lacオペレーターのすぐ上流の配列と相同である。
・断片2は、porA遺伝子のシャインダルガルノ配列、hsf遺伝子およびporA 3'組換え発生領域を含有する。使用したオリゴヌクレオチドプライマーRP3およびRP4 (ApaI)を、後記の表に示す。RP3プライマーは、lacオペレーターのすぐ下流の配列と相同である。断片1の3'末端と断片2の5'末端とは48塩基の重複を有する。500ngの各PCR (1および2)を、プライマーRP1およびRP4を使用する最終PCR反応に使用した。得られた最終アンプリコンを、SacIIおよびApaIで制限酵素処理されたpSL1180ベクター中にサブクローニングした。QIAGENマキシプレップ（maxiprep）キットを使用して、修飾プラスミドpCMK(+)-Hsfを大規模精製し、この物質を2μg使用して、機能的cps遺伝子を欠くナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型B株を形質転換した。porAの発現を維持するために、一重交差から生じた組込みを、PCRとウエスタンブロットスクリーニング法との組合せにより選択した。porA特異的PCRおよびウエスタンブロットにより陽性を示したカナマイシン耐性クローンをグリセロールストックとして-70℃で保存し、更なる研究に使用した。細菌（約5.108個の細菌相当量）を50μlのPAGE-SDSバッファーに再懸濁させ、3回の凍結（-20℃）／沸騰（100℃）に付し、ついで12.5％ ゲル上のPAGE-SDS電気泳動により分離した。NmB [Cps-, PorA+] またはNmB [Cps-, PorA+, Hsf+]に由来する全細胞細菌ライセート（WCBL）においてHsfの発現を調べた。クーマシー染色は（内在性Hsfレベルに関して）Hsfの発現における有意な増加を検出した。この結果は、修飾pCMK(+)-Hsfベクターが機能的であり、主要なPorA外膜タンパク質抗原の産生を損なうことなく外膜タンパク質の発現をアップレギュレーションするために成功裏に使用されうることを証明している。
Figure 2006506467
プロモーター置換によるナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型BのtbpA遺伝子によるアップレギュレーション
この実験の目的は、TbpA抗原の産生をアップレギュレーションするためにtbpA遺伝子の内在性プロモーター領域を強力なporAプロモーターにより置換することであった。その目的のために、大腸菌（E. coli）クローニング法を用いて、プロモーター置換プラスミドを構築した。tbpAコード配列の上流に位置するDNA領域（731bp）を、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）株ATCC 13090の民間Incyte PathoSeqデータベースにおいて見出した。このDNAは、TbpB抗原をコードする配列を含有する。該遺伝子はオペロンとして組織されている。tbpB遺伝子は欠失させられて、CmR/porAプロモーターカセットにより置換されるであろう。その目的のために、tbpB遺伝子の509bpの5'フランキング領域、2139bpのtbpBコード配列、87bpの遺伝子間配列およびtbpAコード配列の最初の483bpヌクレオチドに対応する3218bpのDNA断片を、取込み配列とNheIおよびHindIII制限部位（下線部）とを含有するオリゴヌクレオチドBAD16（5’- GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC-3’）およびBAD17（5’-GGC CAA GCT TCA GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3’）を使用して、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型BのゲノムDNAからPCR増幅した。このPCR断片をHigh Pure Kit（Boerhinger Mannheim, Germany）を用いて精製し、pGemTベクター（Promega, USA）内に直接クローニングした。（i）CmR/PorAプロモーターカセットのクローニングを可能にする適当な制限部位を挿入するために、および（ii）tbpBの209bpの5'フランキング配列およびtbpBコード配列を欠失させるために、このプラスミドをサークル（circle）PCR突然変異誘発（Jones & Winistofer (1992)）に付した。該サークルPCRは、適当な制限部位XmaI、BglIIおよびXhoI（下線部）を含有するオリゴヌクレオチドBAD18（5’-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3’）およびBAD19（5’-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G -3’）を使用して行った。適当な制限部位XmaI、SpeI、BglIIおよびXhoI（下線部）を含有するプライマーBAD21（5’- GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’）およびBAD20（5’- TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3’）を使用して、既に記載されているpUC D15/Omp85プラスミドからCmR/PorAプロモーターカセットを増幅した。このPCR断片を該サークルPCRプラスミド中にクローニングした。このプラスミドは、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型B [cps-]および[cps- porA-]株を形質転換するために使用される。tbpAの上流領域における二重交差の組込みはtbpA ATGのすぐ上流へのporAプロモーターの挿入を導く。
2つの抗原TbpAおよびHsfの発現に関してアップレギュレーションされたナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B株の構築
この実験の目的は、同じナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B株においてTbpAおよびHsfの発現を同時にアップレギュレーションすることであった。TbpAの産生は、その内在性プロモーター領域を強力なporAプロモーターにより置換すること（プロモーター置換）によりアップレギュレーションした。この場合、tbpAの上流に位置するtbpB遺伝子は欠失しており、外膜内にTbpBタンパク質はもはや存在しない。Hsfの発現は、porA遺伝子座における対応遺伝子のもう1つのコピーの挿入（相同組換え）によりアップレギュレーションした（遺伝子送達）。両方の株は、WO01/09350と称される別の特許に記載されている。両方の方法において使用した選択マーカー（CmRまたはKanR）は、同一染色体内への両方の組込みが共に生じるのを可能にした。全ゲノムDNAをQiagen Genomicチップ500-Gプロトコールにより組換えNm.B(ナイセリア・メニンジティディス血清型B) cps-/TbpA+/PorA+株から抽出した。10μgのDNAをDraIII制限酵素で制限処理し、通常の形質転換プロトコールによりナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型Bを形質転換するために使用した。形質転換に使用した細胞は、組換えNmB(ナイセリア・メニンジティディス血清型B) cps-/Hsf+/PorA+（porA遺伝子座内への一重交差（1 crossing over）による相同組換え）または組換えNmB cps-/Hsf+/PorA-（porA遺伝子座内への２重交差（2 crossing over）による対立遺伝子交換／相同組換え）であった。それらを、200μg/ml カナマイシンを含有するGC寒天上で一晩プレーティングし、10mM MgCl2を含有するGC液体培地中にDO650= 0.1にまで希釈し、激しく攪拌しながら10μgのDraIII制限ゲノムDNAと共に37℃で6時間インキュベートした。二重交差事象（PCRスクリーニング）から生じた組換えナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）を、200μg/ml カナマイシンおよび5μg/ml クロラムフェニコールを含有するGC培地上で選択し、OMV調製物におけるTbpAおよびHsfの発現に関して分析した。図1に示すとおり、TbpAおよびHsfの産生は共に、TbpA/Hsf組換えNmB株から調製したOMVにおいては、対照NmB cps-株から調製したOMVの場合と比較して大幅に増加した。該二重組換え体における各タンパク質の過剰発現のレベルは、対応する一重組換え体において得られた発現のレベルに匹敵する。TbpAおよびHsfの過剰発現のレベルは、PorA+株およびPorA-株の場合と、匹敵するものであった（データは非表示）。総合すると、これらのデータは、（i）TbpAおよびHsfの発現が共におよび同時にナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）においてアップレギュレーションされうること、ならびに（ii）TbpAおよびHsfに関して富化された組換えブレブが入手可能であり免疫化に使用可能であることを示している。
2つの抗原TbpAおよびNspAの発現に関してアップレギュレーションされたナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B株の構築
この実験の目的は、同じナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B株においてTbpAおよびNspAの発現を同時にアップレギュレーションすることであった。TbpAの産生は、その内在性プロモーター領域を強力なporAプロモーターにより置換すること（プロモーター置換）によりアップレギュレーションした。NspAの発現は、porA遺伝子座における対応遺伝子のもう1つのコピーの挿入（相同組換え）によりアップレギュレーションした（遺伝子送達）。両方の個々の株は別の特許WO01/09350に記載されている。両方の方法において使用した選択マーカー（CmRまたはKanR）は、同一染色体内への両方の組込みが共に生じるのを可能にした。全ゲノムDNAをQiagen Genomicチップ500-Gプロトコールにより組換えNmB cps-/TbpA+/PorA+株から抽出した。10μgのDNAをAatII制限酵素で制限処理し、通常の形質転換プロトコールによりナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型Bを形質転換するために使用した。形質転換に使用した細胞は組換えNmB cps-/NspA+/PorA-であった。それを、200μg/ml カナマイシンを含有するGC寒天上で一晩プレーティングし、10mM MgCl2を含有するGC液体培地中にDO650= 0.1にまで希釈し、激しく攪拌しながら10μgのAatII制限ゲノムDNAと共に37℃で6時間インキュベートした。二重交差事象（PCRスクリーニング）から生じた組換えナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）を、200μg/ml カナマイシンおよび5μg/ml クロラムフェニコールを含有するGC培地上で選択し、OMV調製物におけるTbpAおよびNspAの発現に関して分析した。TbpAおよびNspAの産生は共に、TbpA/NspA組換えNmB株から調製したOMVにおいては、対照NmB cps-株から調製したOMVの場合と比較して大幅に増加した。該二重組換え体における各タンパク質の過剰発現のレベルは、対応する一重組換え体において得られた発現のレベルに匹敵する。総合すると、これらのデータは、（i）TbpAおよびNspAの発現が共におよび同時にナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）においてアップレギュレーションされうること、ならびに（ii）TbpAおよびNspAに関して富化された組換えブレブが入手可能であり免疫化に使用可能であることを示している。
2つの抗原NspAおよびD15/Omp85の発現に関してアップレギュレーションされたナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B株の構築
この実験の目的は、同じナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B株においてNspAおよびD15/Omp85の発現を同時にアップレギュレーションすることであった。D15/Omp85の産生は、その内在性プロモーター領域を強力なporAプロモーターにより置換すること（プロモーター置換）によりアップレギュレーションした。NspAの発現は、porA遺伝子座における対応遺伝子のもう1つのコピーの挿入（相同組換え）によりアップレギュレーションした（遺伝子送達）。両方の株は別の特許WO01/09350に記載されている。両方の方法において使用した選択マーカー（CmRまたはKanR）は、同一染色体内への両方の組込みが共に生じるのを可能にした。
全ゲノムDNAをQiagen Genomicチップ500-Gプロトコールにより組換えNmB cps-/D15-Omp85/PorA+株から抽出した。10μgのDNAをAatII制限酵素で制限処理し、通常の形質転換プロトコールによりナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型Bを形質転換するために使用した。形質転換に使用した細胞は組換えNmB cps-/NspA+/PorA-であった。それを、200μg/ml カナマイシンを含有するGC寒天上で一晩プレーティングし、10mM MgCl2を含有するGC液体培地中にDO650= 0.1にまで希釈し、激しく攪拌しながら10μgのAatII制限ゲノムDNAと共に37℃で6時間インキュベートした。二重交差事象（PCRスクリーニング）から生じた組換えナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）を、200μg/ml カナマイシンおよび5μg/ml クロラムフェニコールを含有するGC培地上で選択し、OMV調製物におけるNspAおよびD15/Omp85の発現に関して分析した。NspAおよびD15/Omp85の産生は共に、NspA/D15-Omp85組換えNmB株から調製したOMVにおいては、対照NmB cps-株から調製したOMVの場合と比較して大幅に増加した。該二重組換え体における各タンパク質の過剰発現のレベルは、対応する一重組換え体において得られた発現のレベルに匹敵する。総合すると、これらのデータは、（i）NspAおよびOmp85の発現が共におよび同時にナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）においてアップレギュレーションされうること、ならびに（ii）NspAおよびOmp85に関して富化された組換えブレブが入手可能であり免疫化に使用可能であることを示している。
大腸菌（E. coli）における組換えHsf形態の製造および精製
ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）のHsf様タンパク質のコンピューター解析は少なくとも4つの構造ドメインを示している。株H44/76のHsf配列を基準配列とすると、アミノ酸1-51を含むドメイン1は、自己輸送体ファミリーに特徴的なsec依存性シグナルペプチドをコードしており、アミノ酸52-473を含むドメイン2は、表面に露出しており免疫系に接近可能であるらしいパッセンジャードメインをコードしており、アミノ酸474-534を含むドメイン3は、タンパク質のオリゴマー化に必要な推定コイルドコイルドメインおよびヒンジ部（ネック部）をコードしており、残基535からC末端までを含むドメイン4は、バレル様構造に組み立てられ外膜内に繋ぎ止められるらしいβストランドをコードしていると推定される（Hendersonら (1998), Trends Microbiol. 6: 370-378; Hoiczykら (2000), EMBO 22: 5989-5999）。ドメイン2および3は表面に露出していると考えられ、よく保存されているため（試験した全ての株において80％を上回る；Pizzaら (2000), Science 287: 1816-1820に記載のとおり）、それらは興味深いワクチン候補の1つである。その目的のために、ドメイン2（Hsfパッセンジャードメインと称される）およびドメイン2 + 3（Hsfネック部＋コイルドコイルドメインと称される）を大腸菌（E. coli）内で発現させ、大腸菌（E. coli）から精製した。末端RcaI（フォワードプライマー）およびXhoI（リバースプライマー）制限部位を付加するオリゴヌクレオチドを使用して、アミノ酸52-473（Hsfパッセンジャー）およびアミノ酸52-534（Hsf n + cc(ネック部＋コイルドコイルドメイン)）をコードするDNA断片をPCR増幅した。精製アンプリコンを、供給業者が推奨した条件中でRcaI/XhoIで消化し、ついでpET24d（Novagen Inc., Madison WI）大腸菌（E. coli）発現ベクターのNcoI（rcaIと互換性あり）/XhoI部位内にクローニングした。組換えプラスミドを選択し、それを使用して精製組換えプラスミドを調製した。発現を調べるために、これらのベクター（pET-Hsf pas & pET-Hsf ncc）を大腸菌（Escherichia coli）株Bl21DE3（Novagen）内に導入した。この場合、T7ポリメラーゼの遺伝子をイソプロピル-β-Dチオガラクトシド（IPTG）調節性lacプロモーターの制御下に配置する。液体培養（700ml）のNovablue (DE3) [pET-24b/BASB029] 大腸菌（E. coli）組換え株を、600nmでの光学密度（OD600）が0.6に達するまで、攪拌下、37℃で増殖させた。その時点で、IPTGを1mMの最終濃度で加え、該培養物を更に4時間増殖させた。ついで該培養物を10,000rpmで遠心分離し、該ペレットを-20℃で少なくとも10時間凍結した。解凍後、該ペレット（680mlの培養物）を20mM リン酸バッファー（pH 7.0）に22℃で30分間再懸濁させ、ついでRannine破砕器への2回の通過による細胞溶解に付した。溶解した細胞を15,000rpm（Beckman J2-HS遠心機, JA-20ローター）、4℃で30分間かけてペレット化した。該上清を、20mM Tris-HClバッファー（pH 8.0）で平衡化されたQセファロース・ファースト・フロー・カラム（Pharmacia）上にローディングした。貫流通過の後、カラムを5カラム容量の20mM Tris-HClバッファー（pH 8.0）で洗浄した。該組換えタンパク質は250mM NaCl を含む20mM Tris-HClバッファー（pH 8.0）により該カラムから溶出させた。抗原陽性画分をプールし、20mMリン酸バッファー（pH 7.0）に対して一晩透析した。0.5M NaClおよび20mMイミダゾールを該透析サンプルに加えた。ついでサンプルを、500mM NaClおよび20mMイミダゾールを含有する20mMリン酸バッファー（pH 7.0）中で平衡化されたNi-NTAアガロースカラム（Qiagen）上にアプライした。貫流通過の後、カラムを、500mM NaClおよび20mMイミダゾールを含有する5カラム容量の20mMリン酸バッファー（pH 7.0）で洗浄した。混入物は20mMリン酸バッファー（pH 7.0）中の100mMイミダゾールにより溶出した。該組換えタンパク質は20mMリン酸バッファー（pH 7.0）中の250mMイミダゾールにより溶出した。抗原陽性画分をプールし、150mM NaClを含有する10mMリン酸バッファー（pH 6.8）に対して透析した。図2に示すとおり、約47kDa（推定相対分子量）に移動した富化された（純度はCBB染色SDS-PAGEにおいて90％を超えると推定される）Hsf様パッセンジャータンパク質が該カラムから溶出した。このポリペプチドは、5ヒスチジンモチーフに対して産生されたマウスモノクローナル抗体に対して反応性であった。総合すると、これらのデータは、HsfパッセンジャーおよびHsf ncc遺伝子が共に、大腸菌（E. coli）内で組換え形態で発現可能であり精製可能であることを示している。
大腸菌（E. coli）における組換えHapパッセンジャーの製造および精製
ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）のHap様タンパク質のコンピューター解析は少なくとも3つの構造ドメインを示している。株H44/76のHap様配列を基準配列とすると、アミノ酸1-42を含むドメイン1は、自己輸送体ファミリーに特徴的なsec依存性シグナルペプチドをコードしており、アミノ酸43-950を含むドメイン2は、表面に露出しており免疫系に接近可能であるらしいパッセンジャードメインをコードしており、残基951からC末端まで（1457）を含むドメイン3は、バレル様構造に組み立てられ外膜内に繋ぎ止められるらしいβストランドをコードしていると推定される。ドメイン2は表面に露出していると考えられ、よく保存されており（試験した全ての株において80％を超える）、大腸菌（E. coli）内でサブユニット抗原として産生されうるため、それは興味深いワクチン候補の1つである。ドメイン2および3は表面に露出していると考えられ、よく保存されているため（試験した全ての株において80％を超える；Pizzaら (2000), Science 287: 1816-1820に記載のとおり）、それらは興味深いワクチン候補の1つである。その目的のために、ドメイン2（Hapパッセンジャードメインと称される）を大腸菌（E. coli）内で発現させ、大腸菌（E. coli）から精製した。末端NcoI（フォワードプライマー）およびXhoI（リバースプライマー）制限部位を付加するオリゴヌクレオチドを使用して、アミノ酸43-950（Hapパッセンジャー）をコードするDNA断片をPCR増幅した。精製アンプリコンを、供給業者が推奨した条件中でNcoI/XhoIで消化し、ついでpET24d（Novagen Inc., Madison WI）大腸菌（E. coli）発現ベクターのNcoI/XhoI部位内にクローニングした。組換えプラスミドを選択し、大規模精製した。発現を調べるために、これらのベクター（pET-Hap pass）を大腸菌（Escherichia coli）株Bl21DE3（Novagen）内に導入した。この場合、T7ポリメラーゼの遺伝子をイソプロピル-β-Dチオガラクトシド（IPTG）調節性lacプロモーターの制御下に配置する。
発酵槽内での大腸菌（E. coli）BL21[pET-Hap pass]の培養
マスター種からのアリコート画分（100μl）を、FEC013AAプレート（ダイズペプトンA3 20g/L, 酵母エキス 5g/L, NaCl 5g/L, 寒天 18g/L, 1Lまでの蒸留水）上に広げ、37℃で20時間培養した。該細菌叢を集め、NaCl 0.9％を含有する無菌水に再懸濁させた。この溶液を使用して、バッチ様式で使用する20L発酵槽内のFEC011AC培地（ダイズペプトン 24g/L, 酵母エキス 48g/L, MgSO4/7H2O 0.5 g/L, K2HPO4 2g/L, NaH2PO4/2H2O 0.45g/L, グリセロール (87％) 40g および1Lまでの蒸留水）に接種した。温度（30℃）、pH（6.8, NaOH 25％ / H3PO4 25％）、圧力（500mbar）を一定に維持し、通気を20L/分に設定した。これらの条件において、攪拌を調整（100〜1000rpm）することにより、溶存酸素圧を20％に維持した。培養の8時間後（OD = 27.8）、誘導物質（IPTG, 1mM）を加えた。6時間後（OD = 49.2）および16H30（OD = 48.6）、サンプル（6L）を集めた。バイオマスを遠心分離により集め、対応ペレットを-20℃で保存した。
Hapパッセンジャーの精製：
バッチ様式の発酵槽からHAPパッセンジャーを精製した。精製法を開発した（以下を参照されたい）。
Figure 2006506467
細胞破砕後、Hapパッセンジャーの大部分が遠心分離ペレット内に回収される。8M尿素により可溶化が可能となった。N末端 His尾部があるにもかかわらず、IMACは第1工程としては機能しなかったが、SP-XL陽イオン交換体上の第1工程の後には十分に機能した。このSP-セファロース-XL上、NaCl（0〜250mM）線形勾配の中間において該タンパク質が定量的に溶出する。IMACは、FHAbの場合と同様に、Cu++負荷キレート化セファロースFFで行った。この場合、IMACは、FHAbとは異なり、有意な精製要因を示す。SDS-PAGE上、HAP2/3はIMAC後に純粋となるようである。しかし、HAP2/3のピークは0〜200mM イミダゾール勾配においては非常に幅広かったため、イミダゾール段階（10mM〜100mM）による溶出を試みた。しかし、純度の点では、勾配様式が、より効率的であるようである。第1工程として、ゲル浸透により、尿素からアルギニンへのバッファー交換を試みたが、この場合、該タンパク質は2つのピークで溶出した。これらの2つのピークは、SDS-PAGE上、同等なプロフィールを示す。したがって、それはHAPパッセンジャーの部分的リフォールディングによるものであると仮定されうる。ついでバッファー交換のための最終工程としての通常の透析に戻した。SDS-PAGE分析は最終物質の良好な純度を示している（図3を参照されたい）。HAPパッセンジャーの純度は更に、WB抗hisにより確認される。それは抗大腸菌（E. coli）により認識される。96.1KDの分子量が見出される。
大腸菌（E. coli）における組換えFrpA/C形態の製造および精製
ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）は、鉄が制限された際に分泌される、FrpAおよびFrpCと称される2つのRTXタンパク質をコードしている（Thompsonら, (1993) J. Bacteriol. 175:811-818; Thompsonら, (1993) Infect. Immun.. 61:2906-2911）。RTX（Repeat ToXin；反復配列毒素）タンパク質ファミリーは共通して、それらのC末端付近に、コンセンサス配列Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa (LXGGXGN/DDX)を有する一連の9アミノ酸反復配列を有する。大腸菌（E. coli）HlyAにおける反復配列はCa2+の結合部位であると考えられる。図4に示すとおり、株FAM20において特徴づけられている髄膜炎菌FrpAおよびFrpCタンパク質は、それらの中央領域およびC末端領域においてはかなりのアミノ酸類似性を有するが、N末端においては（有するとしても）非常に限られた類似性しか有さない。さらに、FrpAとFrpCとの間で保存された領域は、9アミノ酸モチーフの反復性（FrpAにおいては13回およびFrpCにおいては43回）により幾らかの多型を示す。FrpAおよびFrpCのワクチンの能力を評価するために、本発明者らは、FrpAとFrpCとの間で保存されたタンパク質領域を大腸菌（E. coli）内で組換え法により製造した。その目的のために、フォワードプライマーFrpA-19（5’-CTCGAGACCATGGGCAAATATCATGTCTACGACCCCCTCGC-3’）およびリバースプライマーFrpA-18（3’-GTGCATAGTGTCAGAGTTTTTGTCGACGTCGTAATTATAGACC-3’）を使用して、アミノ酸277-1007（ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）FAM20ペプチド配列の場合）を含むDNAセグメントをナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B H44/76ゲノムからPCR増幅した。それぞれ約1530bp（3反復）、約2130bp（13反復）および2732bp（23反復）の3つのアンプリコンを得、NcoIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼで消化した。ついでこれらの断片をpET24dのNcoI/XhoI（SalIと互換性あり）部位内に挿入し、組換えプラスミド（それぞれpET-Frp3、pET-Frp13およびpET-Frp23）を選択し、それらを使用して大腸菌（E. coli）BL21DE3細胞を形質転換した。図5に示すとおり、これらの構築物はすべて、誘導すると組換えFrpA/C保存ドメインを産生した。さらに、細胞分画分析による測定では、反復数が増加するにつれて、該組換えタンパク質の溶解度が増加した（データ非表示）。
ノナペプチドLXGGXGN/DDXの23反復を含有するFrpA/C保存ドメイン（合計911アミノ酸）の精製
3.5リットルの大腸菌（E. coli）Bl21DE3[pET-Frp23]を培養し、ODが0.6に達したら、2mM IPTGの添加により4時間誘導した。細胞を遠心分離により集め、対応ペレットを加圧破壊し、遠心分離により清澄化し、対応上清をNi2+イオン金属アフィニティーカラム（Ni-NTA-アガロース, Qiagen GmBh）上にローディングした。イミダゾールを溶出に使用し、最終的には、10mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、150mM NaClに対する十分な透析によりイミダゾール除去した。
大腸菌（E. coli）内での組換えFHA形態の製造および精製
ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）からのトランケート化FhaBのクローニング
QIAGENゲノムDNA抽出キット（Qiagen Gmbh）を使用して、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）血清型B株H44/76の1010個の細胞からゲノムDNAを抽出した。ついでこの物質（1μg）を、FhaB遺伝子に特異的なフォワードプライマー: JKP: 5'AAT GGA ATA CAT ATG AAT AAA GGT TTA CAT CGC ATT ATC3'および57JKP 5'CCA ACT AGT GTT TTT CGC TAC TTG GAG CTG T3'を使用するポリメラーゼ連鎖反応によるDNA増幅に付した。該タンパク質のN末端の最初の1433個のアミノ酸をコードする約4200bpのDNA断片を得、NdeI/SpeI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pMG MCS（pMG誘導体, Proc Natl Acad Sci U S A 1985 Jan;82(1):88-92）の対応部位内に、標準的な分子生物学の技術（Molecular Cloning,a Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, Fritsch & Maniatis編, Cold Spring Harbor press 1989）を用いて挿入した。Big Dye Cycle Sequencingキット（Perkin-Elmer）およびABI 373A/PRISM DNAシークエンサーを使用して、該クローン化FhaB断片のDNA配列を決定した（図1を参照されたい）。ついで組換えpMG-FhaBプラスミド（1μg）を、FhaBに特異的なプライマー：
Figure 2006506467
および
Figure 2006506467
を使用するポリメラーゼ連鎖反応によるDNA増幅に付した。4214bpのDNA断片を得、NdeI/XhoI制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pET-24bクローニング／発現ベクター（Novagen）の対応部位内に、標準的な分子生物学の技術（Molecular Cloning,a Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, Fritsch & Maniatis編, Cold Spring Harbor press 1989）を用いて挿入した。供給業者が記載している条件下でBig Dyesキット（Applied biosystems）を使用しABI 373/A DNAシークエンサー上で分析することにより、トランケート化FhaBを含有する組換えpET-24b（pET24b/FhaB2/3）の確認用配列決定を行った。得られたヌクレオチド配列を図6に示す。
大腸菌（Escherichia coli）内での組換えトランケート化FhaBタンパク質の発現および精製
pET24b/FhaB2/3クローニング／発現ベクターの構築は前記で説明した。このベクターは、（組換え産物のC末端において）6ヒスチジン残基ストレッチと融合させる状態で、株H44/76から単離されたトランケート化FhaB遺伝子を含有し、この遺伝子は、強力なバクテリオファージT7遺伝子10プロモーターの制御下に配置されている。発現を調べるために、このベクターを大腸菌（Escherichia coli）株Novablue（DE3）（Novagen）内に導入した。この場合、T7ポリメラーゼの遺伝子をイソプロピル-β-Dチオガラクトシド（IPTG）調節性lacプロモーターの制御下に配置する。液体培養（100ml）のNovablue (DE3) [pET-24b/FhaB2/3] 大腸菌（E. coli）組換え株を、600nmでの光学密度（OD600）が0.6に達するまで、攪拌下、37℃で増殖させた。その時点で、IPTGを1mMの最終濃度で加え、該培養物を更に4時間増殖させた。ついで該培養物を10,000rpmで遠心分離し、該ペレットを-20℃で少なくとも10時間凍結した。解凍後、該ペレットをバッファーA（6M塩酸グアニジン, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris, pH 8.0）に25℃で30分間再懸濁させ、針に3回通過させ、遠心分離（20000rpm, 15分間）により清澄化した。ついで該サンプルを1ml/分の流速でNi2+負荷Hitrapカラム（Pharmacia Biotech）上にローディングした。貫流通過後、カラムを40mlのバッファーB（8M尿素, 0.1MNaH2PO4, 0.01M Tris, pH 8.0）、40mlのバッファーC（8M尿素, 0.1MNaH2PO4, 0.01M Tris, pH 6.3）で順次洗浄した。ついで組換えタンパク質FhaB2/3/His6を、500mM イミダゾールを含有する30mlのバッファーD（8M尿素, 0.1MNaH2PO4, 0.01M Tris, pH 6.3）カラムから溶出し、各3mlの画分を集めた。図7に示すとおり、約154kDa（推定相対分子量）に移動する、非常に富化されたFhaB2/3/His6が該カラムから溶出した。このポリペプチドは、5ヒスチジンモチーフに対して産生されたマウスモノクローナル抗体に対して反応性であった。総合すると、これらのデータは、FhaB2/3が大腸菌（E. coli）内で組換え形態で発現可能であり精製可能であることを示している。
組換えFhaB2/3/Hisでのマウスの免疫化
大腸菌（E. coli）内で発現させた部分精製組換えFhaB2/3/His6タンパク質をBalb/Cマウス（10匹/群）に3回、第0日、第14日および第29日に注射した。100μgのAlPO4上に吸着されたまたはSBAS2エマルション（1用量当たり5μgのMPLおよび5μgのQS21を含有するSB62エマルション）中に製剤化された2つの異なる製剤中の約5μgの抗原を動物に皮下注射した。SBAS2エマルションのみで免疫したマウスよりなる陰性対照群も該実験に加えた。特異的抗FhaB抗体を検出するために、第29日（2回目の注射の15日後）および第35日（3回目の注射の6日後）にマウスから採血した。プールした血清（マウス10匹/群からのもの）について、精製組換えFhaB2/3/Hisに対するELISAにより特異的抗FhaB抗体を測定した。
FHA、HapおよびHsf抗原に対して産生させたマウスおよびウサギ血清の接着阻止活性
髄膜炎菌FHAB様、Hsf様およびHap様タンパク質に相同なタンパク質は重要なビルレンス決定因子であり、ボルデテラ・ペルツッシス（Bordetella pertussis）（FHA）およびヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）（HapおよびHsf）の細菌接着を媒介することが既に記載されている。上皮細胞および内皮細胞への接着は、髄膜炎菌の鼻咽頭でのコロニー形成および血液脳関門の通過のために決定的に重要であることが公知である。したがって、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）の接着の阻害は、髄膜炎菌のコロニー形成および感染を抑制するための重要なアプローチの1つである。ここでは、本発明者らは、髄膜炎菌FHABの2/3、Hap様およびHsf様抗原に対して産生された抗血清が内皮細胞へのナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）の接着を妨げるかどうかを試験した。実験手順は以下を用いた。
HUVECへの接着の阻害
こ試験で使用した髄膜炎菌試験株は無莢膜、無線毛、Opa-およびOpc-誘導体のNmA8013株であった。400μlのRPMI、50μlのウシ胎児血清、および接着阻止特性に関して試験すべき50μlの血清から構成される培地内で髄膜炎菌細胞（2.10E5コロニー形成単位（CFU）のNmA8013誘導体）を37℃で30分間インキュベートした。ついでこの混合物を、培地が既に除去されたヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）のコンフルエント単層を含有するウェル内に入れる。細菌およびHUVEC細胞を37℃、5％ CO2下で4時間インキュベートした。ついで細胞単層を新鮮なRPMI血清で3回洗浄し、ついで該プレートから剥がした。ついで、HUVEC細胞に伴うCFUを、連続希釈および該細胞ライセートのGCプレート上のプレーティングにより測定した。細胞結合髄膜炎菌の回収および増殖が可能となるよう、プレートを37℃で48時間インキュベートした。
組換えFHABの2/3、Hapおよびhsf抗原に対して産生されたマウスおよびウサギ血清の接着阻止活性
抗FHA2/3、抗Hsf完全長（WO99/58683に記載されている）および抗Hap完全長（WO99/55873）抗体、ならびに対応HsfおよびHapパッセンジャードメインに対する抗血清は内皮HUVEC細胞への髄膜炎菌の接着を妨げる。図8は、AlPO4中に製剤化されたFHA 2/3により誘導された特異的抗体が、アジュバントのみの場合と比較してHUVEC細胞へのナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）Bの接着を抑制し得たことを示している。SBAS2アジュバントのみの場合（抗原無し、群4）と比較して、抗FHA 2/3抗体（SBAS2製剤）は尚も有効であるが、AlPO4ほどは強力ではない。SBAS2アジュバント（抗原無し）は単独では、接着を妨げうる抗体を誘導しない。群4と比較して、抗Hap抗体（群1）は若干の抑制効果を有しうる。群5においては、抗FHA 2/3抗体、抗Hsf抗体および抗Hap抗体の混合物を試験した場合には、該接着の抑制は抗FHA2/3のみの場合より強力であり、これは、抗Hap抗体および抗Hsf抗体によりもたらされる相乗効果を示唆している。第2の抑制実験（図2）においては、Hsf（候補タンパク質）を過剰発現する抗OMVに対する特異的ウサギ抗血清は、陰性対照（群3対4）と比較して内皮細胞へのナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）Bの固着を部分的に抑制することが可能であった。このウサギ抗血清は非常に高い特異的抗Hsf抗体力価を含有することを示している。rec Hsf（HsfパッセンジャーおよびHsf完全長）に対する抗体もHUVEC細胞上の細菌の接着を抑制しうる。これはマウス血清（群5〜6）およびウサギ血清（より低い程度である（laser extend））（群7〜8）の両方に当てはまる。この第2の実験においては、第1実験において既に試験した特異的抗rec FHA 2/3抗体（群1）の非常に高い抑制効果が証明されている。これらの結果は、これらの特異的抗原（Hap、FHA2/3およびHsf）が、単独でまたは組合せ物として、興味深いワクチン抗原であることを示している。
マウスチャレンジモデルにおける組換えOMVの防御効果
Balb/Cマウスにおいて、いつかの組換えOMVを、致死的チャレンジ後のそれらの防御効果に関して評価した。この能動免疫モデルは、皮下経路による一連の免疫化の後、いくつかの株の髄膜炎菌（鉄枯渇TSB培地に懸濁したもの）を成体Balb/CまたはOF1マウス（6〜8週齢）に腹腔内注射することを含むものであった。外的鉄源として使用した鉄デキストランは、感染動物において菌血症を維持し死を誘発するのに必要であるらしい。マウスにおけるこのIPモデルは、ビルレンス、免疫防御、および感染における鉄の役割を評価するのに有効であることが示されているが、それらは、ヒトにおいて菌血症および髄膜炎に先行する咽頭運搬段階を含んでいない。このモデルは、NspA、TbpAまたはHsfを過剰発現する本発明者らの幾つかのOMV候補をスクリーニングするために使用した。以下の実験においては、Al(OH)3（100μg Al(OH)3 /動物）（PV00N035およびPV00N043）またはAl PO4（100μg Al PO4/動物）に製剤化されたHsf、NspAまたはTbpAを過剰発現するrec.OMVの3（PV00N049）〜5μg（PV00N035およびPV00N043実験）でBalb/C（近交系）またはOF1（非近交系）マウスを皮下経路により3回、第0日、第14日および第28日に免疫した。ついで特異的Abの評価のために、第28日（2回目の免疫化の14日後）および第35日（3回目の免疫化の7日後）に動物から採血した。第35日に、チャレンジの1時間前に10mgの鉄デキストランを腹腔内注射する。該チャレンジはH44/76（B:15:P1.7,16）またはCU-385（B:4:P1.19,15）株で約1.10 e7 CFU/動物で行った（厳密なチャレンジ用量に関しては、結果の表を参照されたい）。CU-385株を用いて行った異種株は同種株を用いる場合より過酷（stringent）なものであった。第1日から第5日まで、死亡率を記録した。以下の表1に示すとおり、OMV TbpA (+)（porA(-)では1/10および3/5、ならびにporA (+)では9/10および3/5）、OMV NspA (+)（4/10および4/5）およびOMV Hsf (+)（3/10、2/10および3/5）を用いると、OMV porA(-)と比較して、そしてそれより低い程度ではあるがOMV porA(+)と比較して、すでに良好な防御が認められる。これは、これらの3つの実験において本発明者らがなしうる全体的な観察である。これらのデータは、ブレブ表面で発現されるTbpA、HsfおよびNspA抗原が将来のmenBワクチンにとって重要であることを裏付けるものである。
Figure 2006506467
マウスチャレンジモデルにおける組換えサブユニット抗原の防御効果
Balb/Cマウスにおいて、いつかの組換え精製タンパク質を、致死的チャレンジ後のそれらの防御効果に関して評価した。この能動免疫モデルは、皮下経路による一連の免疫化の後、いくつかの株の髄膜炎菌（鉄枯渇TSB培地に懸濁したもの）を成体Balb/CまたはOF1マウス（6〜8週齢）に腹腔内注射することを含むものであった。
外的鉄源として使用した鉄デキストランは、感染動物において菌血症を維持し死を誘発するのに必要であるらしい。マウスにおけるこのIPモデルは、ビルレンス、免疫防御、および感染における鉄の役割を評価するのに有効であることが示されているが、それらは、ヒトにおいて菌血症および髄膜炎に先行する咽頭運搬段階を含んでいない。このモデルは、組換えFrpC、TbpA、FHA2/3およびHap分子のような幾つかのmenBサブユニットワクチン候補をスクリーニングするために使用した。
この実験においては、10μg（動物1匹当たり）のMPLの存在下でAl PO4（100μg）に製剤化されたこれらのタンパク質の5μg（PV00N050）でOF1（非近交系）マウスを皮下経路により3回、第0日、第14日および第28日に免疫した。
ついで特異的Abの評価のために、第28日（2回目の免疫化の14日後）および第35日（3回目の免疫化の7日後）に動物から採血し、一方、第35日に、それらに対しチャレンジした。チャレンジの当日、チャレンジの1時間前に10mgの鉄デキストランを腹腔内注射する。該チャレンジはCU-385株（B:4:P1.19,15）で行った。該CU-385株はこの場合には異種であり、実際のところ、TbpAの配列がB16B6株（B:2a:P1.2）に由来することを除き、抗原配列はH44/76（B:15:P1.7,16）に由来する。
表2に示す結果は、このモデルにおいて、FrpC、TbpA、FHABの2/3、Hapが有意な防御を誘導したことを示している。すなわち、それにより、チャレンジ後、5匹中2〜4匹のマウスが生存したが、アジュバントのみの場合には僅か1/5が生存したに過ぎなかった。1群を除く全ての群において、特異的抗体価は高かった（特異的抗TbpA力価は中等度であった）。これらのデータはすべて、サブユニット抗原として提示されるFrpC、FrpA、FrpA/C保存ドメイン、TbpA、FHABの2/3、Hapが、単独でまたは組合せ物として、menBワクチンの開発にとって重要であることを裏付けるものである。
Figure 2006506467
ワクチン抗原組合せ物の相乗効果を示すための方法
入手可能な種々の組換えOMV（OMV porA (+) rmp-LbpB, OMV porA (-) TbpA (+) Hsf (+), OMV porA (-) TbpA (+), OMV porA (-) NspA (+), OMV porA (-) Hsf (+), OMV porA (-) TbpA (+) NspA (+)）を単独でまたは組合せ物として試験して、ワクチン候補のそのような組合せの相乗効果の検出において最良の組合せを統計的に決定することが可能である。また、この方法は、サブユニット抗原の組合せ、およびサブユニット抗原 + 組換えOMVの組合せを用いて行うことも可能である。32群の5匹/群のOF1マウスに注射し、該マウスモデルにおける血清殺菌・オプソニン活性、能動および受動防御に関して試験することが可能である（必要に応じて、準最適量の個々の抗原を使用する）。組合せ免疫化の後に付与される防御のレベルが個々の抗原の総和より高いかどうかが、相乗的な抗原組合せ物の指標となる。
外膜小胞クーマシーブルー染色SDS-PAGEのHsfおよびTbpA含量の分析
HsfもしくはTbpAまたはHsfとTbpAとの両方がアップレギュレーションされた外膜小胞調製物中の15μgのタンパク質を、βメルカプトエタノールを含有するサンプルバッファーで希釈し、95℃で10分間加熱した。ついで該サンプルをSDS-PAGEポリアクリルアミドゲル（Novex 4-20％ Tris-グリシン 1.5 m、二次元ウェル、SDS Page）上で泳動させ、クーマシーブルー中で1時間染色し、脱染剤での数回の洗浄により脱染した。結果を図9に示す。これは、HsfおよびTbpAのレベルが、それらの発現レベルが増強されたナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）外膜小胞調製物においては、かなり高いことを示している。
Hsfおよび／またはTbpAがアップレギュレーションされたOMVの免疫原性
1群20匹のマウス群を筋肉内経路によりOMVで3回、第0日、第21日および第28日に免疫した。各接種物は、MPLと共にAlPO4で製剤化された5μg（タンパク質含量）のOMVを含むものであった。莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされるよう操作されたナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株H44/76から、該OMVを得た。Hsf、TbpA、HsfとTbpAとの両方がアップレギュレーションされているOMV、またはそれらのいずれもがアップレギュレーションされていないOMVにおいて、比較を行った。第41日に、ELISAによる分析または血清殺菌アッセイのために、血液サンプルを採取した。
Hsfに対する抗体を検出するためのELISA
96ウェルマイクロプレート（Nunc, Maxisorb）を1μg/mlの特異的抗原含有PBS 100μlで4℃で一晩コートした。150mM NaCl、0.05％ Tween 20で洗浄した後、プレートを、振とうしながら100μlの1％ PBS-BSAで室温で30分間飽和させた。各工程（これは、0.2％ PBS-BSAを希釈バッファーとして使用して、振とうしながら、室温で30分間行った）の間に、NaCl-Tween 20での洗浄により過剰な試薬を除去した。マイクロウェル当たり100μlの希釈血清サンプルを加えた。結合抗体をビオチン化抗マウスIg（Prosan）（1/2000）により認識させた。該抗原抗体複合体は、ストレプトアビジン-ビオチン化ペルオキシダーゼコンジュゲート（Amersham）（1/4000）と共にインキュベーションすることにより明らかにした。オルトフェニレンジアミン／H2O2（4mg/10mlのクエン酸バッファー 0.1M pH 4.5 + 5μl H2O2）を使用して該アッセイの結果を示す。プレートを暗所中、室温で15分間インキュベートした後、50μlの1N HClの添加により反応を停止させた。吸光度を490nmで測定した。
Figure 2006506467
前記表に示す結果は、HsfまたはHsfとTbpAとの両方がアップレギュレーションされたOMVでの免疫化により、Hsfに対する高いおよび同等の抗体価が得られたことを示している。アジュバントのみの接種、またはHsfもTbpAもアップレギュレーションされていないOMVの接種、またはTbpAのみがアップレギュレーションされたOMVの接種の後に産生された血清においては、Hsfに対する抗体は実質的に全く検出することができなかった。
Hsfおよび／またはTbpAがアップレギュレーションされたOMVに対して産生された抗血清の血清殺菌活性
Hsf、TbpA、HsfとTbpAとの両方がアップレギュレーションされたOMV、または全くアップレギュレーションされていないOMVを接種したマウスからの抗血清の血清殺菌活性を、同種株H44/76または異種株Cu385を使用するアッセイにおいて比較した。血清殺菌アッセイは防御との良好な相関を示すことが示されており、したがって、防御免疫応答の惹起において候補組成物がどの程度有効であるかの良好な指標となる。
ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型B野生型株（H44/76株 =B:15 P1.7,16 L3,7,9およびCU385株 =B: 4 P1.19,15 L3,7,9）を、MH + 1％ Polyvitex + 1％ ウマ血清入りのペトリ皿上、37℃+ 5％ CO2において一晩培養した。470nmで約0.5の光学密度に達するまで、それらを、50μM デスフェラル（鉄キレート剤）で補足された液体TSB培地内で、振とうしながら37℃で3時間継代培養した。
プールしたまたは個々の血清を56℃で40分間不活化した。血清サンプルを0.3％ HBSS-BSAで1/100希釈し、ついで丸底マイクロプレート中、50μl容量に2倍に連続希釈（8個の希釈物）した。
適当なODの細菌を0.3％ HBSS-BSAで希釈して1.3 10e4 CFU/mlとした。37.5μlのこの希釈液を該血清希釈液に加え、マイクロプレートを、振とうしながら37℃で15分間インキュベートした。ついで12.5μlのウサギ補体を各ウェルに加えた。振とうしながら37℃で1時間のインキュベーションの後、該マクロプレートを氷上に配置して殺菌を停止させた。
傾斜法により、各ウェルの20μlをMH + 1％ Polyvitex + 1％ ウマ血清入りのペトリ皿上にプレーティングし、37℃+ CO2で一晩インキュベートした。CFUを計数し、殺菌の比率（％）を計算した。血清殺菌力価は、50％以上の殺菌を与える最終の希釈度である。
Figure 2006506467
他の2つの同様の実験においても、前記表に示したのと同様の結果が得られた。
HsfおよびTbpAの両方がアップレギュレーションされたOMVでのワクチン接種の後、同種株および異種株に対する殺菌力価（GMT）における劇的な増加が認められた。比較によると、HsfまたはTbpAがアップレギュレーションされたOMVでワクチン接種したマウスにおいて測定した殺菌GMTは、対照OMVでワクチン接種したマウスで得たGMTと同程度であった。
特に異種株を使用する実験において、有意なレベルの殺菌性抗体（1／100を超える力価）を産生するマウスの割合（％）における二重アップレギュレーションの利益が明らかに認められた。
殺菌活性に対する抗Hsf血清と抗TbpA血清との混合の効果
1群20匹のマウス群を筋肉内経路によりOMVで3回、第0日、第21日および第28日に免疫した。各接種物は、MPLと共にAlPO4で製剤化された5μg（タンパク質含量）のOMVを含むものであった。莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされるよう操作されたナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株H44/76から、該OMVを得た。1つの群のマウスは、タンパク質のアップレギュレーションを伴わない対照OMVで免疫した。第2の群では、Hsf発現がアップレギュレーションされており、第3の群では、TbpA発現がアップレギュレーションされており、第4の群では、HsfとTbpAとの両方の発現がアップレギュレーションされていた。
同じ群のマウスからの血清を使用して、またはHsfのみ若しくはTbpAのみがアップレギュレーションされた群から単離した血清を混合することにより、血清をプールした。プールした血清のそれぞれについて血清殺菌活性を測定し、結果を以下の表に示す。
Figure 2006506467
前記表の結果は、抗Hsf抗血清と抗TbpA抗血清との混合が、いずれかの抗血清の単独で得られたものより遥かに高い血清殺菌活性をもたらしたことを示している。該相乗効果はHsfおよびTbpAの両方に対する抗体の存在により達成されるものと考えられる。
トランケート化Hsfタンパク質はTbpAと相乗的に組み合わされうる
標準的な分子生物学的方法を用いて、一連のトランケート化Hsf構築物を作製した。これらには、Hsfのシグナル配列を含有するアミノ酸1-54とHsfのアミノ酸134-592とをコードする構築物（Tr1Hsf）が含まれる。もう1つのトランケート化Hsfは、Hsfのシグナル配列のアミノ酸1-53およびそれに続くHsfのアミノ酸238-592を含有していた（Tr2Hsf）。前記の方法を用いて、これらの2つのトランケート化Hsf構築物および完全長Hsfをナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）B株MC58 siaD-, Opc-, PorA-内に導入して、それらの発現がアップレギュレーションされ外膜小胞が産生されるようにした。
該外膜小胞調製物をAl(OH)3上に吸着させ、第0日、第21日および第28日にマウスに注射した。第42日に該マウスから採血し、血清を調製した。該血清を、TbpAをアップレギュレーションしたOMVでワクチン接種したマウスからの血清と混合し、前記のとおりに血清殺菌アッセイを行った。
結果
Figure 2006506467
上の表に示す結果は、第1トランケート化（Tr1Hsf）が、TbpAに対する抗血清と組み合わされうる免疫応答を惹起して、完全長Hsfを使用した場合よりも大きな血清殺菌活性をもたらすことを示している。しかし、該トランケート化の度合は重要であり、Tr2でもたらしたトランケート化は完全長Hsfよりも悪い効果を与えた。Tr1Hsfの増強された殺菌活性は、使用した両方の株に対して認められた。
TbpA、Hsfおよび第3の髄膜炎菌タンパク質に対する抗体の血清殺菌活性
PorAおよび莢膜多糖が前記のとおりにダウンレギュレーションされたナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株H66/76を、前記の方法を用いてTbpAおよびHsf、LbpB、D15、PilQまたはNspAをアップレギュレーションするためのバックグラウンド株として使用した。前記のとおりに、外膜小胞を各株から調製した。前記の技術および当技術分野で公知の技術（PCT/EP99/02766、WO92/01460およびWO98/02547に記載のもの）を用いて、組換えFHAb、FrpC、FrpA/CおよびHapを作製した。
該外膜小胞調製物および組換えタンパク質をAl(OH)3上に吸着させ、第0日、第21日および第28日にマウスに注射した。第42日に該マウスから採血し、血清を調製した。TbpAおよびHsfがアップレギュレーションされたOMVに対する血清を、アップレギュレーションされたLbpB、D15、PilQもしくはNspAまたは組換えFHAb、FrpC、FrpA/CもしくはHapを含有するOMVでワクチン接種したマウスからの血清と混合し、前記のとおりに血清殺菌アッセイを行った。
結果
結果を以下の表に示す。同種H44/76株を使用するアッセイにおいては、第3の髄膜炎菌抗原に対する抗体の添加は、FrpCの場合を除き、TbpAおよびHsfのみに対する抗体を使用した場合に得られたものより高い血清殺菌力価をもたらさなかった。
しかし、第3の抗原に対する抗体の添加は、異種株を使用する血清殺菌アッセイにおいて有利であった。D15 (OMP85)、Hap、FrpA/CおよびLbpBに対する抗体はCU385株に対する血清殺菌力価の上昇に特に有効であった。
Figure 2006506467
同種株および異種株における殺菌免疫応答を惹起する能力に対する外膜小胞中のFrpB KOの効果
LOS含量が約20％となるよう0.1％ DOCでの抽出を用いて、WO01/09350に記載のとおりに、H44/76ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）の2つの株を使用して外膜小胞調製物を調製した。株B1733はsiaD(-)、PorA(-)であり、これはTr1 Hsfがアップレギュレーションされており（実施例19）、lgtBはノックアウトされている。株B1820 B1733はsiaD(-)、PorA(-)であり、Tr1 Hsfはアップレギュレーションされており、lgtBはノックアウトされており、FrpBもノックアウトされている。LbpA/BおよびTbpA/Bのような鉄によって調節されるタンパク質がアップレギュレーションされるよう60μM デスフェラル（Desferal）で補足された培地内で両方の株を培養した。
該ブレブ調製物をAl(OH)3上に吸着させ、第0日および第21日に30匹のマウス群に筋肉内注射した。第28日に血液サンプルを採取した。
実施例17に記載のとおりに、3つのL3株（同種野生型株H44/76および2つの異種L3株; NZ124およびM97250687）に関して血清殺菌アッセイを行った。
結果
Figure 2006506467
結果は、FrpB KO (B1820)ブレブが、FrpB(+)ブレブ(B1733)より良好な異種交差殺菌応答を誘導することを明らかに示している。株M97250687およびNZ124においては、SBA力価がより高く、より高い比率のマウスが血清転換した。同種株における結果は、FrpBが欠失している場合には、それほど良好ではなかった。これらのデータが示唆するところによれば、FrpBは免疫応答を導くが、この外膜タンパク質は非常に可変性であるため、このタンパク質に対する抗体は同種株の殺傷を誘導しうるに過ぎない。
tbpAおよびhsfの発現に関してアップレギュレーションされた組換えナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株から調製されたOMVにおけるTbpAおよびHsfの検出。クーマシーブリリアントブルーで染色されたSDS-PAGE分析（4〜20％勾配ゲル）によるOMV調製物（10μg）の分離。 大腸菌（E. coli）内で産生された組換えHsfパッセンジャードメインの検出。分子量マーカー（レーン1）との比較において、10μgの精製Hsfパッセンジャータンパク質（レーン2および3）が12％ゲル上のSDS-PAGEにより分離された。 （A）クーマシー染色、（B）銀染色、（C）抗His5ウエスタンブロッティングおよび（D）抗大腸菌（E. coli）により検出されたHapパッセンジャーの純度の分析。10μgの精製抗原が4〜20％アクリルアミド勾配ゲル上のSDS-PAGEにより分離された。 ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株FAM20から単離されたFrpAおよびFrpCタンパク質により共有される配列類似性領域。（A）ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株FAM20 RTXタンパク質FrpAおよびFrpCのドメイン構成。（B）ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株H44/76から得たFrpA/C増幅産物。 大腸菌（E. coli）における組換えFrp23（23個の反復配列を有するFrpA/C保存領域）抗原の発現。対照ベクター（pET24d）または組換え構築物（それぞれFrp3、Frp13およびFrp23）で形質転換された大腸菌（E. coli）BL21DE3の非誘導（NI）および誘導（I）全細胞抽出物のSDS-PAGE分析。ゲルをクーマシーブルー（A）で染色し、またはニトロセルロースにトランスファーし抗His6マウス血清で免疫検出した。 大腸菌（E. coli）内で発現されたFHAB 2/3rd（FHABの2/3）断片の好ましいDNA配列。 大腸菌（E. coli）内で発現されたFHAB 2/3rd（FHABの2/3）断片の好ましいDNA配列。 誘導された大腸菌（E. coli）Bl21DE3抽出物からの組換えFHAB 2/3rdの精製。（A）該精製法における主要工程。（B）該精製法の種々の工程においてサンプル採取されたタンパク質画分のSDS-PAGE分析。 ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）のFHAB 2/3rd、Hap、Hapパッセンジャードメイン、HsfおよびHsfパッセンジャードメイン抗原に対する抗血清の接着阻止活性。 ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）のFHAB 2/3rd、Hap、Hapパッセンジャードメイン、HsfおよびHsfパッセンジャードメイン抗原に対する抗血清の接着阻止活性。 種々のナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）株に由来する外膜小胞調製物中のHsf、TbpAおよびNspAの発現レベルを示すクーマシー染色ゲル。レーン1：分子量マーカー。レーン2：莢膜多糖がダウンレギュレーションされた株H44/76から調製した外膜小胞。レーン3：莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされた株H44/76から調製した外膜小胞。レーン4：莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされNspAがアップレギュレーションされた株H44/76から調製した外膜小胞。レーン5：莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされHsfがアップレギュレーションされた株H44/76から調製した外膜小胞。レーン6：莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされTbpAがアップレギュレーションされた株H44/76から調製した外膜小胞。レーン7：莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされTbpAおよびHsfがアップレギュレーションされた株H44/76から調製した外膜小胞。レーン8：莢膜多糖およびPorAがダウンレギュレーションされTbpAおよびNspAがアップレギュレーションされた株H44/76から調製した外膜小胞。

Claims (91)

  1. 以下のカテゴリー：
    a）少なくとも1つのナイセリア（Neisserial）アドヘジン、
    b）少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、
    c）少なくとも1つのナイセリア毒素、
    d）少なくとも1つのFe獲得タンパク質、または
    e）少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質、好ましくは内在性外膜タンパク質、
    の少なくとも2つから選ばれる2以上の異なる抗原を含んでなる免疫原性組成物。
  2. 抗原が、以下のカテゴリー：
    a）FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119およびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、
    b）Hsf、Hap、IgAプロテアーゼ、AspAおよびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、
    c）FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT、ならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア毒素、
    d）TbpA高、TbpA低、TbpB高、TbpB低、LbpA、LbpB、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、FbpA、BfrA、BfrB、Bcp、NMB0964およびNMB0293よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質、あるいは
    e）PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、HpuB、TspA、TspB、TdfH、PorB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、MltA、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrAおよびPldAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質、好ましくは内在性外膜タンパク質、
    の少なくとも2つから選ばれる、請求項1記載の免疫原性組成物。
  3. サブユニット組成物である、請求項1または2記載の免疫原性組成物。
  4. FhaB、NspA、Hsfのパッセンジャードメイン、Hapのパッセンジャードメイン、OMP85の表面露出ドメイン、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PldA、PilC、Lipo28ならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方から選ばれる少なくとも2つの抗原を含む、請求項3記載の免疫原性組成物。
  5. 外膜小胞において抗原が（好ましくは組換えにより）アップレギュレーションされている外膜小胞調製物を含む、請求項1または2記載の免疫原性組成物。
  6. 外膜小胞においてアップレギュレーションされている、NspA、Hsf、Hap、OMP85、AspA、HpuA、HpuB、TspA、TspB、FhaC、TbpA (高)、TbpA (低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、NM-ADPRT、P2086、TdfH、PorB、MafA、MafB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、MltAおよびPldAから選ばれる少なくとも2つの抗原を含み、かつ、場合により、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方を含む、請求項5記載の免疫原性組成物。
  7. 前記抗原の1以上を有するサブユニット組成物と、外膜小胞においてアップレギュレーションされている少なくとも1つの抗原を有する外膜小胞調製物とを含む、請求項1または2記載の免疫原性組成物。
  8. サブユニット組成物および外膜小胞調製物を含み、ここで、該サブユニット組成物が、FhaB、NspA、Hsfのパッセンジャードメイン、Hapのパッセンジャードメイン、OMP85の表面露出ドメイン、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilC、Lipo28から選ばれる少なくとも1つの抗原を含み、該外膜小胞調製物が、外膜小胞において組換えによりアップレギュレーションされている、NspA、Hsf、Hap、OMP85、AspA、HpuA、HpuB、TspA、TspB、FhaC、TbpA (高)、TbpA (低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、NM-ADPRT、P2086、TdfH、PorB、MafA、MafB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、MltAおよびPldAから選ばれる少なくとも1つの異なる抗原を有し、かつ、場合により、LPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方を、好ましくは外膜小胞調製物中に含みうる、請求項7記載の免疫原性組成物。
  9. 請求項5または6記載の少なくとも2つの異なる外膜小胞調製物を含む、請求項5〜8のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  10. 1つの外膜小胞調製物が免疫型L2であり、1つの外膜小胞調製物が免疫型L3である、請求項9記載の免疫原性組成物。
  11. HsfおよびTbpA (高)が選ばれる、請求項1、2、5、6、7、8、9または10のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  12. HsfおよびTbpA (低)が選ばれる、請求項1〜2または5〜11のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  13. Hap、LbpB、OMP 85およびFrpAよりなる群から選ばれる1以上の追加的な抗原が更に選ばれる、請求項11または12記載の免疫原性組成物。
  14. LPS免疫型L2が更に選ばれる、請求項11〜13のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  15. LPS免疫型L3が更に選ばれる、請求項11〜14のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  16. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、NadA、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(低)、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、NspA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、FhaBが選ばれる、請求項1〜15のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  17. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、NadA、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(低)、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、NspAが選ばれる、請求項1〜16のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  18. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(低)、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、NadAが選ばれる、請求項1〜17のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  19. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、TbpA (低)が選ばれる、請求項1〜18のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  20. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、TbpA(高)が選ばれる、請求項1〜19のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  21. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、LbpBが選ばれる、請求項1〜20のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  22. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、OMP85が選ばれる、請求項1〜21のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  23. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、Hapが選ばれる、請求項1〜22のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  24. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、Hsfが選ばれる、請求項1〜23のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  25. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、FrpAが選ばれる、請求項1〜24のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  26. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDならびにLPS免疫型L2およびLPS免疫型L3のうちの一方または両方よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、FrpCが選ばれる、請求項1〜25のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  27. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapDおよびLPS免疫型L3よりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、LPS免疫型L2が選ばれる、請求項1〜26のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  28. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRTおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、LPS免疫型L3が選ばれる、請求項1〜27のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  29. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRTおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、PilQが選ばれる、請求項1〜28のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  30. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRTおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、HlpAが選ばれる、請求項1〜29のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  31. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRTおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、MltAが選ばれる、請求項1〜30のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  32. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRTおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、GNA1870が選ばれる、請求項1〜31のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  33. PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、NM-ADPRTが選ばれる、請求項1〜32のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  34. PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、MafAが選ばれる、請求項1〜33のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  35. PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、MafBが選ばれる、請求項1〜34のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  36. PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、NMB0315が選ばれる、請求項1〜35のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  37. PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、NMB1119が選ばれる、請求項1〜36のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  38. PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、HisDが選ばれる、請求項1〜37のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  39. PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、LbpAが選ばれる、請求項1〜38のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  40. PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、NMB0995が選ばれる、請求項1〜39のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  41. PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、Lipo28が選ばれる、請求項1〜40のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  42. PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、HimDが選ばれる、請求項1〜41のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  43. PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、NMB 1313が選ばれる、請求項1〜42のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  44. PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgAプロテアーゼ、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorBおよびVapDよりなる群から選ばれる少なくとも1つの他の抗原と共に、NMB 1953が選ばれる、請求項1〜43のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  45. 外膜小胞調製物が由来する宿主細胞が、lgtBまたはlgtEの1以上（好ましくは前者）からの発現をダウンレギュレーションするように操作されている、請求項5〜44のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  46. 外膜小胞調製物が由来する宿主細胞が、莢膜多糖を合成する能力を有さず、siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA（synXおよびsiaAの等価体）またはsynB（siaBの等価体）およびsynC（siaCの等価体）、好ましくはsiaDのうち1以上からの発現をダウンレギュレーションするように好ましくは操作されている、請求項5〜45のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  47. 外膜小胞調製物が由来する宿主細胞が、OpC、OpAまたはPorA、好ましくはPorAのうち1以上の発現をダウンレギュレーションするように操作されている、請求項5〜46のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  48. 外膜小胞調製物が由来する宿主細胞が、FrpBの発現をダウンレギュレーションするように操作されている、請求項5〜47のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  49. 外膜小胞調製物が由来する宿主細胞が、msbBおよび／またはhtrB、好ましくはmsbBからの発現をダウンレギュレーションするように操作されている、請求項5〜48のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  50. 外膜小胞調製物が、外膜タンパク質（OMP）に結合したLPSを含有する、請求項5〜49のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  51. 外膜小胞調製物においてLPSがin situでOMPに（好ましくはブレブ内で）結合している、請求項50記載の免疫原性組成物。
  52. ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）（好ましくは血清型B）に由来する抗原を含む、請求項1〜51のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  53. ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）に由来する抗原を含む、請求項1〜52のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  54. すべてのナイセリア抗原がナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）、好ましくは血清型Bに由来する、請求項1〜52のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  55. 1以上の細菌莢膜多糖またはオリゴ糖を更に含む、請求項1〜54記載の免疫原性組成物。
  56. 前記莢膜多糖またはオリゴ糖が、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型A、C、YおよびW-135、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）b、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）、A群レンサ球菌、B群レンサ球菌、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）およびスタヒロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）よりなる群から選ばれる細菌に由来する、請求項55記載の免疫原性組成物。
  57. 前記莢膜多糖またはオリゴ糖がタンパク質に結合している、請求項55〜56記載の免疫原性組成物。
  58. アジュバントを含む、請求項1〜57記載の免疫原性組成物。
  59. アルミニウム塩、好ましくはリン酸アルミニウムを含む、請求項58記載の免疫原性組成物。
  60. 3D-MPLを含む、請求項58または59記載の免疫原性組成物。
  61. 請求項1〜60のいずれか1項記載の免疫原性組成物と製薬上許容される担体とを含んでなるワクチン。
  62. 真核生物プロモーターにより発現が駆動される2以上の異なるタンパク質をコードする1以上のポリヌクレオチドを含んでなるワクチンであって、該タンパク質が、以下のカテゴリー：
    a）FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119およびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアアドヘジン、
    b）Hsf、Hap、IgAプロテアーゼ、AspAおよびNadAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア自己輸送体、
    c）FrpA、FrpC、FrpA/C、VapDおよびNM-ADPRTよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア毒素、
    d）TbpA高、TbpA低、TbpB高、TbpB低、LbpA、LbpB、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、FbpA、BfrA、BfrB、Bcp、NMB0964およびNMB0293よりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリアFe獲得タンパク質、あるいは
    e）PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、HpuB、TspA、TspB、TdfH、PorB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、MltA、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrAおよびPldAよりなる群から選ばれる少なくとも1つのナイセリア膜結合タンパク質、好ましくは内在性外膜タンパク質、
    の少なくとも2つから選ばれる、ワクチン。
  63. ナイセリア疾患の治療または予防方法であって、それを要する宿主に請求項61〜62のいずれか1項記載のワクチンの防御用量を投与することを含んでなる方法。
  64. ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）感染が予防または治療される、請求項63記載の方法。
  65. ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）感染が予防または治療される、請求項63記載の方法。
  66. ナイセリア感染の治療または予防のための医薬の製造における、請求項61〜62のいずれか1項記載のワクチンの使用。
  67. ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）感染が予防または治療される、請求項66記載の使用。
  68. ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）感染が予防または治療される、請求項66記載の使用。
  69. 請求項5〜60のいずれか1項記載の外膜小胞調製物が由来する遺伝子工学的に操作されたナイセリア株。
  70. ナイセリア由来の少なくとも2つの抗原を1つに混合する工程を含んでなる、請求項1〜60のいずれか1項記載の免疫原性組成物の製造方法。
  71. ナイセリア培養物から外膜小胞を単離する工程を含んでなる、請求項5〜60のいずれか1項記載の免疫原性組成物の製造方法。
  72. 少なくとも2つの外膜小胞調製物を一緒にする更なる工程を含む、請求項71記載の製造方法。
  73. 少なくとも1つの外膜小胞調製物が免疫型L2のLPSを含有し、少なくとも1つの外膜小胞調製物が免疫型L3のLPSを含有する、請求項72記載の製造方法。
  74. 0〜0.5％の濃度のDOCでの抽出により外膜小胞を単離する、請求項71〜73のいずれか1項記載の製造方法。
  75. 0.02％〜0.4％、0.04％〜0.3％、0.06％〜0.2％、0.08％〜0.15％、または好ましくはおよそまたは正確に0.1％の濃度のDOCでの抽出により外膜小胞を単離する、請求項74記載の製造方法。
  76. 請求項1〜60のいずれか1項記載の免疫原性組成物と製薬上許容される担体とを一緒にする工程を含んでなる、請求項61記載のワクチンの製造方法。
  77. 請求項61記載のワクチンでレシピエントを免疫し、該レシピエントから免疫グロブリンを単離する工程を含んでなる、ナイセリア感染の予防または治療に使用するための免疫グロブリンの製造方法。
  78. 請求項77記載の製造方法により製造された免疫グロブリン。
  79. 請求項78記載の免疫グロブリンと製薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
  80. 請求項79記載の医薬組成物の有効量を患者に投与する工程を含んでなる、ナイセリア感染の治療または予防方法。
  81. ナイセリア疾患の治療または予防のための医薬の製造における、請求項79記載の医薬組成物の使用。
  82. 免疫型L2の髄膜炎菌ブレブおよび免疫型L3の髄膜炎菌ブレブを含む、請求項5〜60のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  83. 前記ブレブの1つにおいてTbpA(高)がアップレギュレーションされている、請求項82記載の免疫原性組成物。
  84. 前記ブレブの1つにおいてTbpA(低)がアップレギュレーションされている、請求項82または83記載の免疫原性組成物。
  85. 前記ブレブの1つにおいてHsfがアップレギュレーションされている、請求項82〜84のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  86. 前記ブレブの1つにおいてOMP85がアップレギュレーションされている、請求項82〜85のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  87. 前記ブレブが、莢膜多糖を産生し得ない髄膜炎菌株（好ましくはsiaD-）から単離されたものである、請求項82〜86のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  88. lgtB-である髄膜炎菌株から単離されたブレブに合致するよう、L2および／またはL3 LPSオリゴ糖構造がトランケート化されている、請求項82〜87のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  89. 前記ブレブが、msbBの発現がダウンレギュレーションされた髄膜炎菌株から単離されたものである、請求項82〜88のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  90. L2および／またはL3 LPSオリゴ糖部分が、前記ブレブに内在する外膜タンパク質にブレブ内で結合している、請求項82〜89のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
  91. 前記ブレブが、FrpB、PorA、OpaまたはOpcのうち1以上の発現がダウンレギュレーションされた髄膜炎菌株に由来する、請求項82〜90のいずれか1項記載の免疫原性組成物。
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