WO2010134225A1 - 部分糖鎖エピトープを用いた、病原性ナイセリア属細菌感染の検出方法およびそれら細菌に対するワクチン - Google Patents
部分糖鎖エピトープを用いた、病原性ナイセリア属細菌感染の検出方法およびそれら細菌に対するワクチン Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention provides a method and a biochip using a Neisseria bacterium-produced sugar chain partial structure and a vaccine against Neisseria bacterium containing the sugar chain partial structure as a tool for detecting infection to Neisseria bacteria.
- Bacterial meningitis caused by bacterial infections such as influenza b bacteria, Neisseria gonorrhoeae or Neisseria meningitidis increases in lethality with delayed diagnosis and treatment, with serious sequelae even if cured There are many.
- vaccines In order to protect infants and children with low immunity from such bacterial infection, vaccines have been developed in the United States and Europe since the 1980s. However, there is still no effective vaccine for Neisseria meningitidis serotype B.
- enzyme immunoassay EIA method
- liquid phase hybridization method PCR method
- LCR method LCR method and the like are used for the diagnosis of bacterial meningitis, but each method takes time (for example, several days). Therefore, development of a simple and quick diagnostic tool is required.
- LOS is a complex glycolipid in which oligosaccharide and lipid called lipid A are bound and has immunogenicity to the host, so it is expected to be a promising target for vaccines to prevent infection of these bacteria. Its immunochemistry and structural studies have been conducted.
- oligosaccharide chains are composed of core sugar chains and variable sugar chains peculiar to genera with few mutations, and such sugar chain structures govern the antigenicity of LOS.
- the variable sugar chain attached to the core sugar chain is the same as the partial structure of the host glycolipid. This means that bacteria do not mimic the host sugar chain structure and bypass the host immune surveillance mechanism. It has been suggested.
- the present invention does not use all the sugar chain structures of LOS produced by the meningococcus as described above, but focuses on the branched structure of the core sugar chain and uses the partial structure of the core sugar chain.
- An object is to provide a tool that enables diagnosis of meningitis.
- the present invention also removes a functional group such as a phosphate group and an acetyl group expressed in the core sugar chain in the deacylated LOS, and the core sugar chain containing such a functional group. It is another object of the present invention to provide a diagnostic tool that does not suffer from such limitations because it cannot detect bacteria that produce.
- Another object of the present invention is to provide a vaccine against Neisseria meningitidis that uses the partial structure of the core sugar chain without deacylation.
- the inventor binds anti-LOS human IgG to LOS and LPS with different structures, which recognizes at least three epitopes, rather than a single antibody recognizing a common epitope.
- the finding was obtained that a mixture of antibodies, ie oligoclonal antibodies, binds to LOS and LPS.
- Neisseria genus bacteria Neisseria gonorrhoeae 15235 strain (Yamasaki, R. et al., J. Biol. Chem. 269, 30345-30351 (1994)) as a ligand.
- the infected human serum was subjected to affinity chromatography to obtain anti-15235LOS IgG.
- this anti-15235LOS IgG has a different structure of Aspergillus oryzae JW31R (Yamasaki, R. et al., J. Biol. Chem. 269, 30345-30351 (1994)), Aspergillus WG strain (Yamasaki, R.
- 15253 IgG did not bind to Neisseria genus LOS other than JW31R LOS. However, it bound to Salmonella mutant LPS (Rb and ReLPS). Almost the same result as this 15253 LOS adsorption experiment was obtained when adsorbed with MS11 mkA LOS. From the results of these adsorption experiments, it was found that IgG2 binds to at least the following three epitopes with an oligoclonal antibody.
- sugar chain sequences are epitopes for human antibodies of immunogenic sugar chains: (1) Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep- ( ⁇ 1-5) -Kdo- ( ⁇ 2-4) -Kdo; (2) Glc- ( ⁇ 1-4) -Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep- (3-1 ⁇ ) -Glc- (4-1 ⁇ ) -Gal; (3) GlcNAc- ( ⁇ 1-2) -Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep; (4) Hep- ( ⁇ 1-2) -Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep; (5) Gal- ( ⁇ 1-4) -Glc- ( ⁇ 1-4) -Hep [I]-(3-1 ⁇ ) -Hep [II]; and (6) Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep.
- sugar chain (4) is derived from LOS of Haemophilus bacteria, and other sugar chains, ie, sugar chains (1) to (3), (5) and (6) are
- This approach makes it possible to develop tools that utilize specific sugar chain partial structures unique to bacteria or common sugar chain structures.
- a tool such as a detection tool or a vaccine, corresponding to a bacterial mutation resulting in a change in the variable sugar chain structure. That is, a plurality of sugar chains can be used to distinguish between Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis, or to identify the serotype of Neisseria meningitidis.
- this approach can provide a tool for bacteria that produce a core sugar chain containing a functional group by constructing a synthetic sugar chain containing a functional group.
- the present invention provides a diagnostic tool in which the above-mentioned specific bacterial specific sugar chain partial structures are arrayed on a microchip. By detecting antibodies produced by the host after bacterial infection using this arrayed sugar chain chip, bacterial infection of the host can be diagnosed quickly and accurately.
- This tool will be developed as a tool for detecting femtomole-level sugar chains with the aim of detecting a very small amount of blood in consideration of blood collection from infants.
- Neisseria 2,3 3,4-bifurcated LOS, Neisseria 3,4-branched LOS and mutant Salmonella LPS. Binding of anti-LOS-antibody (IgG) in human serum to microarrayed LOS, A: human serum 25-fold dilution, B: human serum 50-fold dilution. MALDI-MS analysis (positive mode), A: human serum albumin (HSA) and B: tetrasaccharide-HSA conjugate. Dihydroxybenzoic acid is used as a matrix.
- IgG anti-LOS-antibody
- the present invention provides a method for evaluating that a subject is infected with a Neisseria genus and / or Hemophilus genus, comprising a sample obtained from the subject and the following sugar chain sequence:
- the sugar chain molecule (1) Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep- ( ⁇ 1-5) -Kdo- ( ⁇ 2-4) -Kdo; (2) Glc- ( ⁇ 1-4) -Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep- (3-1 ⁇ ) -Glc- (4-1 ⁇ ) -Gal; (3) GlcNAc- ( ⁇ 1-2) -Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep; (4) Hep- ( ⁇ 1-2) -Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep; (5) Gal- ( ⁇ 1-4) -Glc- ( ⁇ 1-4) -Hep [I]-(3-1 ⁇ ) -Hep [II]; and (6) Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep A method comprising contacting one or more
- the present invention provides a chip for evaluating that a subject is infected with a Neisseria genus and / or Haemophilus genus, wherein the solid support is bound to the solid support.
- a chip containing the sugar chain of the present invention is provided.
- Hep Hep
- Kdo heptose
- Glc heptose
- GlcNAc glycosyl-N-(Glc)
- Gal glycosyl-N-(Glc)-N-(Glc)-N-(GlcNAc)
- Greek letters and numbers between sugars indicate the binding site and mode of binding between sugars.
- Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep means that heptose and heptose are ⁇ -bonded at the 1-position and 3-position.
- the bacteria measured herein are preferably Neisseria bacteria, which means N. gonorrhoeae and N. meningitidis, especially meningococcus, It is not limited to. Hemophilus bacteria typically include, but are not limited to, influenza b bacteria.
- a subject refers to a subject, particularly a human, who is infected with, suspected of being infected, or potentially infected. Samples obtained from a subject include, but are not limited to, subject's blood, serum, plasma, saliva, tears, urine, feces, cerebrospinal fluid. A sample obtained from a preferred subject is blood or serum because of its ease of collection and antibody content.
- the present invention is a method for evaluating that a subject is infected with a Neisseria genus bacterium, comprising a sample obtained from the subject and the following glycan molecule: (1) Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep- ( ⁇ 1-5) -Kdo- ( ⁇ 2-4) -Kdo; (2) Glc- ( ⁇ 1-4) -Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep- (3-1 ⁇ ) -Glc- (4-1 ⁇ ) -Gal; (3) GlcNAc- ( ⁇ 1-2) -Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep; (5) Gal- ( ⁇ 1-4) -Glc- ( ⁇ 1-4) -Hep [I]-(3-1 ⁇ ) -Hep [II]; and (6) Hep- ( ⁇ 1-3) -Hep A method comprising contacting one or more of the above and detecting the presence of a sugar chain-antibody conjugate.
- the sugar chain-antibody conjugate is a conjugate formed by binding an antibody that immunospecifically recognizes the sugar chain of the present invention to the sugar chain of the present invention.
- a conjugate is formed by an antigen-antibody reaction.
- the conditions for conjugate formation can be determined by various factors such as the type of antigen sugar chain to be used, the concentration of the antibody, the medium to be used, etc., but typically 0 to 40 ° C., for example 15 to Form a conjugate by bringing the antibody and sugar chain into contact with each other using, for example, a fluidized bed incubator at 37 ° C. for a short time, for example, 1 minute to 3 hours, preferably 1.5 hours or less, under static stirring. Can be made.
- the detection of the sugar chain-antibody conjugate can be performed using any method known in the art. Such detection methods include, for example, dot blot method, chemiluminescence method, immunoassay using secondary antibody, surface plasmon resonance, mass spectrometry and the like, but are not limited thereto.
- detection methods include, for example, dot blot method, chemiluminescence method, immunoassay using secondary antibody, surface plasmon resonance, mass spectrometry and the like, but are not limited thereto.
- the evaluation method of the present invention not only one sugar chain but also a plurality of sugar chains are used, and / or a polysaccharide other than the sugar chain of the present invention, for example, influenza b bacteria or meningococcus Evaluations using influenza b-type bacteria or meningococcal capsule polysaccharides known to be able to be evaluated for infection may be combined. With such combination evaluation, more reliable evaluation can be performed.
- the sugar chain-antibody conjugate can be detected by immunoassay methods well known to those skilled in the art.
- a secondary antibody that recognizes a specifically bound antibody molecule preferably a secondary antibody that binds at a site different from the site recognized by the sugar chain of the present invention is used.
- the antibody is fluorescently labeled or the bound antibody itself is detected by contacting the fluorescently labeled protein A that binds to all immunoglobulins with the sugar chain of the present invention or a chip containing the same.
- secondary antibodies may be fluorescently labeled, or they may be conjugated to a reporter enzyme that mediates the production of a detectable compound. Any variation of immunoassay known in the art can be used in the present invention.
- the sugar chain-antibody conjugate can be detected by competitive assay methods well known to those skilled in the art. After contacting the sugar chain of the present invention or the sugar chain bound to the chip with the sample obtained from the subject, a solution containing each target antibody in a predetermined amount is added. These target antibodies are fluorescently labeled by any method known in the art so that they can be detected. The labeled antibody molecule competes for binding to the sugar chain. Using the amount of labeled molecules at the time when the equilibrium is established, the amount of antibody molecules contained in the sample obtained from the subject is calculated.
- the sugar chain of the present invention may be a conjugate with a carrier molecule other than sugar, such as protein or lipid.
- the sugar chain terminal of the present invention may be converted into a spacer by a method known in the art and complexed with a carrier molecule via the spacer moiety.
- Carrier molecules that can be used include, but are not limited to, lipids such as human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA), carbosilane, ceramide, acyloxy fatty acid derivatives, and the like.
- the number of sugar chains bound to the carrier molecule may be one or more, for example 1 to 3, and a plurality of conjugates may form a dendrimer.
- the spacer may be, for example, an alkyl chain, an ether chain, and a peptide chain, but is not limited thereto.
- Typical spacers are alkyl chains or ether chains having 3 to 50, for example 5 to 20, preferably 7 to 15 carbon atoms.
- Spacer structures are C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, hydroxy, C 1-6 alkoxy, hydroxy C 1-6 alkyl, oxo ( ⁇ O), carboxy, C 1-6 alkyl It may be substituted with substituents including but not limited to -carboxy, amino, C 1-6 alkyl-amino, and the like.
- the sugar chain of the present invention may itself be labeled by a method known in the art.
- the sugar chain of the present invention may contain a substance that can be detected by methods well known in the art, such as fluorescent dye molecules, radioisotopes, and the like.
- the sugar chain of the present invention can be produced by chemical synthesis, semi-synthesis or fermentation known in the art.
- the reaction conditions and the like to be used can be appropriately selected depending on the intended final product, the starting material to be used, the production scale, and the like.
- a method of obtaining the sugar chain of the present invention by semi-synthesis for example, a glycolipid is isolated from a Neisseria genus bacterium, and the glycolipid of the present invention is enzymatically cleaved so as to obtain a target sugar chain. Chains can be produced.
- the sugar chain (4) of the present invention as a conjugate with HSA can be produced by the method described in the examples of the present specification. .
- the chip is a chip in which the sugar chain of the present invention is arrayed on the surface of a solid support.
- Solid supports include, but are not limited to, Langmuir-Blodgett membranes, functional glass, germanium, silicon, PTFE, polystyrene, gallium arsenide, gold and silver. Any other material known in the art that may incorporate functional groups such as amino, carboxy, thiol, or hydroxy onto the solid support surface can also be used.
- the shape of the solid support is not particularly limited, and may be a plate shape, a well shape, a bead shape, a fiber shape, a rod shape, a powder shape, or the like. It can also be incorporated directly into parts of known measuring devices such as cuvettes of surface plasmon resonance devices.
- the sugar chain of the present invention can be immobilized on a solid support by any method known in the art. Such methods include, but are not limited to, photolithography, methods of spatially arranging avidin bonds using photoactivatable biotin derivatives, template stamping and ink jet methods.
- the sugar chain of the present invention may be fixed to a solid support using a crosslinking group such as ethylene glycol oligomer, diamine and amino acid.
- a crosslinking group such as ethylene glycol oligomer, diamine and amino acid.
- the target antibody in a sample obtained from a subject can be detected, for example, in femtomolar order, for example, 10 femtomolar order by the method or chip of the present invention.
- a vaccine for obtaining immunity against Neisseria and / or Haemophilus bacteria comprising one or more sugar chains of the present invention To do.
- the vaccine of the present invention may contain other antigens and immunomodulators such as immunoglobulins, cytokines, lymphokines and chemokines.
- Vaccines generally contain one or more pharmaceutically acceptable excipients or vehicles such as water, saline, glycerol, ethanol and the like.
- auxiliary substances such as wetting agent emulsifiers or pH buffering substances may be included.
- the vaccine of the present invention may contain an adjuvant for enhancing its effectiveness.
- the adjuvant can be added directly to the vaccine composition or can be administered separately (either at the same time or immediately after the vaccine administration).
- Such adjuvants include, but are not limited to: (1) aluminum salts (alum) such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum sulfate, etc .; (2) oil-in-water emulsion formulations. E.g. MF59 (WO 90/14837), SAF and Ribi adjuvant system (RAS) (RibiImmunochem, Hamilton, MT); (3) saponin adjuvant (e.g.
- ISCOM Immuno Stimulation Complex
- CFA Complete Freund's Adjuvant
- IFA Incomplete Freund's Adjuvant
- Cytokines eg, interleukins (IL-1, IL-2, etc.), macrophage colony stimulation Factor (M-CSF), tumor necrosis factor (TNF), etc .
- M-CSF macrophage colony stimulation Factor
- TNF tumor necrosis factor
- the vaccine is in the form of an injection solution or suspension, or may be in a lyophilized form suitable for mixing with a liquid vehicle just prior to injection to form a solution or suspension.
- the vaccine may also be emulsified or encapsulated in liposomes.
- Such vaccines of the invention can be administered parenterally (eg, by injection, intravenously, subcutaneously, or intramuscularly) in one or more dosage regimens.
- the amount of vaccine to be administered can be appropriately determined by a clinician, physician or veterinarian based on the subject's weight, age, general health, sex, animal species, and the like.
- This compound 10 is condensed with suberic acid monomethyl ester (suberic acid: 1.5 equivalents, DMT-MM: 1.5 equivalents, 1% DMF), and then reacted with HSA in PBS by an acyl azide method to give Gal ( ⁇ 1-4) Synthesis of Glc ( ⁇ 1-4) Hep ⁇ 3-1 ⁇ Hep ⁇ -spacer-HSA11 was achieved.
- the tetrasaccharide conjugate could confirm IgG binding at 1 ⁇ g (FIG. 4B).
- antibody binding could be slightly confirmed at 25 ⁇ g (C in FIG. 4).
- An important point of this experimental example is that the partial sugar chain Gal ( ⁇ 1-4) Glc ( ⁇ 1-4) Hep ⁇ 3-1 ⁇ Hep ⁇ including the core sugar chain of LOS is also immunized by recognition of human IgG of the tetrasaccharide conjugate. It has been found that it has the originality. This demonstrated that even LOS partial oligosaccharide chains can be used as vaccines against pathogenic bacteria or as targets for infection / diagnostic tools.
- the detection sensitivity of 1 ⁇ g of the tetrasaccharide conjugate is ⁇ 13 pmole, nearly 100 times inferior to that of 15253 LOS recognized by purified human IgG.
- the affinity between the anti-15253LOS antibody and purified human IgG was detected, and it cannot be directly compared with the affinity with IgG in actual serum as in the experimental example.
- the anti-15253LOS antibody contains IgG that binds to several sugar chain epitopes, it cannot be directly compared with the detection sensitivity of the antibody bound to the tetrasaccharide sugar chain.
- analysis was performed with 1 ⁇ l of dots, but detection at a femtomole level is also possible by using a printer to dot (3 nl / dot).
Abstract
本発明は、髄膜炎起炎菌が産生するＬＯＳの全ての糖鎖構造を利用するのでなく、コア糖鎖の分岐構造に着目し、コア糖鎖の部分構造を利用した髄膜炎の診断を可能とするツールを提供することを目的とする。また、本発明は、上記の脱アシル化したＬＯＳでは、コア糖鎖内に発現するリン酸基、アセチル基等の官能基も除去することになり、このような官能基を含んだコア糖鎖を産生する細菌を検出できないため、このような制約を受けない診断ツールを提供することも目的とする。本発明の別の目的は、脱アシル化せずにコア糖鎖の部分構造を利用した髄膜炎起炎菌に対するワクチンを提供することである。コア糖鎖を含む部分糖鎖を１種以上、例えば数種使用することにより、髄膜炎起炎菌の変異に対応した、新しい発想に基づくワクチンを開発できる。
Description
本願は平成２１年５月２０日出願の日本国特許願（特願２００９－１２２５９５）に基づく優先権を主張する。当該出願の全内容は引用により本明細書の一部をなす。
本発明は、ナイセリア属細菌への感染を検出するためのツールとして、ナイセリア属細菌産生糖鎖部分構造を利用する方法およびバイオチップならびに該糖鎖部分構造を含むナイセリア属細菌に対するワクチンを提供する。
インフルエンザｂ型細菌、淋菌または髄膜炎菌のような細菌感染によって引き起こされる細菌性髄膜炎は、その診断および治療が遅れると、致死率が増大し、治癒したとしても深刻な後遺症を伴う場合が多い。免疫力の低い乳幼児や子供をこのような細菌感染から守るために、欧米では１９８０年代からワクチン開発が行われてきている。しかしながら、髄膜炎菌の血清Ｂ型には、未だに有効なワクチンが存在しない。さらに、これらの細菌性髄膜炎の診断には酵素免疫法（ＥＩＡ法）、液相ハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法等が用いられるが、いずれの方法も時間がかかる（例えば数日）ため、簡便で迅速な診断ツールの開発が求められている。
これまでは髄膜炎菌のワクチン開発は、これら細菌が産生する細胞外膜の糖質抗原であるカプセル多糖を用いて行われてきたが、近年、別の糖質抗原であるリポオリゴ糖(lipooligosaccharide、以下ＬＯＳと略)を用いた開発研究が行われている。ＬＯＳは、オリゴ糖とリピッドＡと呼ばれる脂質が結合した複合糖脂質であり、宿主に対し免疫原性を有することから、これらの細菌への感染予防のためのワクチンの有望な標的と期待されて、その免疫化学および構造研究が行われてきている。これらの研究によって、オリゴ糖鎖は変異の少ない属特有のコア糖鎖と可変糖鎖からなり、このような糖鎖構造がＬＯＳの抗原性を支配することが見出されている。コア糖鎖に結合している可変糖鎖は、宿主の糖脂質の部分構造と同一であり、このことから、細菌は宿主の糖鎖構造を模倣して宿主の免疫監視機構をくぐり抜けるのではないかと示唆されている。
しかしながら、本発明者や他の研究者により、宿主と同一の糖鎖が存在してもＬＯＳのコア糖鎖に結合する殺菌性抗体が存在することが明らかにされており、このコア糖鎖を標的としたワクチン開発の可能性が大きく浮かび上がってきている。これまでに、髄膜炎菌のＬＯＳを標的としたワクチンとしては、タンパクと脱アシル化したＬＯＳを結合したコンジュゲートとするアプローチ等が知られている。
特開２００１－１１０９６号公報
特開２０００－９７３３号公報
特開２００７－２５６２１４号公報
山崎良平著、「細菌感染と糖鎖 病原性細菌の糖鎖抗原、リポオリゴ糖の構造との病原性における役割」、化学と生物、Vol. 41, No.1, 2003, 15-21
Yamasaki, R. Etc. J. Biol. Chem. 269, 30345-30351 (1994)
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Mandrell, R. E. Etc. J. Exp. Med. 171, 1649-1664 (1990)
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Ichiyanagi, T. Etc. Carbohydr Res. 2005 Dec 12; 340(17): 2682-7. Epub 2005 Sep 29
したがって本発明は、上記のような髄膜炎起炎菌が産生するＬＯＳの全ての糖鎖構造を利用するのでなく、コア糖鎖の分岐構造に着目し、コア糖鎖の部分構造を利用した髄膜炎の診断を可能とするツールを提供することを目的とする。また、本発明は、上記の脱アシル化したＬＯＳでは、コア糖鎖内に発現するリン酸基、アセチル基等の官能基も除去することになり、このような官能基を含んだコア糖鎖を産生する細菌を検出できないため、このような制約を受けない診断ツールを提供することも目的とする。
本発明の別の目的は、脱アシル化せずにコア糖鎖の部分構造を利用した髄膜炎起炎菌に対するワクチンを提供することである。
驚くべきことに、本発明者は、抗ＬＯＳヒトＩｇＧが構造の異なるＬＯＳおよびＬＰＳに結合するが、これは単一の抗体が共通のエピトープを認識するのではなく、少なくとも三つのエピトープを認識する抗体の混合物、すなわちオリゴクローナル抗体がＬＯＳおよびＬＰＳに結合するという知見を得た。
すなわち本発明者は、まず髄膜炎起炎菌であるナイセリア属細菌、淋菌１５２３５株（Yamasaki, R.ら、J. Biol. Chem. 269, 30345-30351 (1994)）のＬＯＳをリガンドとして淋菌感染ヒト血清についてアフィニティークロマトグラフィーを行って抗１５２３５ＬＯＳ ＩｇＧを得た。次に、この抗１５２３５ＬＯＳ ＩｇＧはそれぞれ構造が異なる淋菌ＪＷ３１Ｒ株（Yamasaki, R.ら、J. Biol. Chem. 269, 30345-30351 (1994)）、淋菌ＷＧ株（Yamasaki, R. ら、Eleventh international pathogenic Neisseria conference, 298. (1988)）、淋菌ＰＩＤ－２株（Schneider, H.ら、J. Exp. Med. 174, 1601-1605 (1991)）、淋菌ＭＳ１１ｍｋＡ株（Kerwood, D. E. ら、Biochemistry 31, 12760-12768 (1992)）のＬＯＳにも結合するが、淋菌の２４－１株（Gulati, S.,ら、J. Infecti. Dis. 174, 1223-1237 (1996)）には結合しないことを見出した。
そして上記の抗１５２３５ＬＯＳ ＩｇＧを１５２３５ＬＯＳ、ＭＳ１１ｍｋＡ ＬＯＳおよびサルモネラミネソタＲｅ ５９５ ＬＰＳ吸着の前後で、ＪＷ３１Ｒ ＬＯＳ、ＭＳ１１ｍｋＡ ＬＯＳ、ＰＩＤ－２ ＬＯＳ、サルモネラミネソタＲｅ ５９５ ＬＰＳ、サルモネラミネソタＲｂ ＬＰＳと接触させてそれぞれＰＡＧＥ／ウェスタンブロットを実施した。その結果、サルモネラミネソタＲｅ ５９５ ＬＰＳ吸着後では、サルモネラミネソタＲｂ ＬＰＳとサルモネラミネソタＲｅ ５９５ ＬＰＳへの結合は検出できなかったが、１５２５３ ＬＯＳ、ＰＩＤ－２ ＬＯＳ、ＭＳ１１ｍｋＡ ＬＯＳ、ＪＷ３１Ｒ ＬＯＳへの結合能は吸着前と比較して低下しないことを見出した。また、１５２５３ ＬＯＳを用いて吸着した後では、１５２５３ ＩｇＧは、ＪＷ３１Ｒ ＬＯＳ以外の、ナイセリア属ＬＯＳには結合しなかった。しかし、サルモネラ変異体ＬＰＳ（ＲｂとＲｅＬＰＳ)には結合した。この１５２５３ ＬＯＳ吸着実験と殆ど同一の結果が、ＭＳ１１ｍｋＡ ＬＯＳで吸着した場合で得られた。これらの吸着実験の結果より、ＩｇＧ２はオリゴクローナル抗体で少なくとも以下の三つのエピトープに結合することを見出した。1) ＪＷ３１Ｒ ＬＯＳ以外の、３，４分岐ＬＯＳと２，３：３，４－二分岐ＬＯＳの糖鎖間に存在する交叉エピトープ、２）ＪＷ３１Ｒ ＬＯＳの非還元末端部分に特異的に発現するエピトープ、３）ＫＤＯ-ＫＤＯ二糖の糖鎖エピトープ。更に、この抗体は、ナイセリア属とサルモネラ変異体のＬＯＳ・ＬＰＳだけでなく、ヘモフィルス属のＬＯＳにも結合した。これらのエピトープは、３，４分岐ＬＯＳと２，３：３，４－二分岐ＬＯＳの糖鎖全体でなく、コア糖鎖構造の一部、あるいは、可変部糖鎖の一部を含む部分糖鎖構造である。本発明は、このような、宿主の抗体がＬＯＳの可変部糖鎖を含むコア糖鎖の部分構造を認識する、という知見に基づいてなしたものである。
上記知見に従って、本発明者は、次の糖鎖配列が免疫源糖鎖のヒト抗体に対するエピトープであることを見出した：
（１）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（α１－５）－Ｋｄｏ－（α２－４）－Ｋｄｏ；
（２）Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（３－１α）－Ｇｌｃ－（４－１β）－Ｇａｌ；
（３）ＧｌｃＮＡｃ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（４）Ｈｅｐ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（５）Ｇａｌ－（β１－４）－Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ［Ｉ］－（３－１α）－Ｈｅｐ［ＩＩ］；および
（６）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ。
ここで、糖鎖（４）はヘモフィルス属細菌のＬＯＳに由来し、それ以外の糖鎖、すなわち糖鎖（１）～（３）、（５）および（６）はナイセリア属細菌のＬＯＳに由来する。
（１）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（α１－５）－Ｋｄｏ－（α２－４）－Ｋｄｏ；
（２）Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（３－１α）－Ｇｌｃ－（４－１β）－Ｇａｌ；
（３）ＧｌｃＮＡｃ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（４）Ｈｅｐ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（５）Ｇａｌ－（β１－４）－Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ［Ｉ］－（３－１α）－Ｈｅｐ［ＩＩ］；および
（６）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ。
ここで、糖鎖（４）はヘモフィルス属細菌のＬＯＳに由来し、それ以外の糖鎖、すなわち糖鎖（１）～（３）、（５）および（６）はナイセリア属細菌のＬＯＳに由来する。
上記（１）～（６）の配列を有する単離糖鎖分子の構造は、それぞれ次の通りである：
このアプローチにより、特定の細菌固有な糖鎖部分構造、あるいは、共通の糖鎖構造を利用したツールの開発が可能となる。これら１種以上、例えば２～５種の部分糖鎖構造を用いることにより、可変糖鎖構造の変化に帰結する細菌の変異に対応したツール、例えば検出ツールまたはワクチンを提供することができる。すなわち、複数の糖鎖を用いて淋菌と髄膜炎菌の区別、あるいは髄膜炎菌の血清型を特定することができる。また、このアプローチでは、官能基を含んだ合成糖鎖を構築することにより、官能基を含んだコア糖鎖を産生する細菌に対応したツールを提供することができる。
特に本発明は、上記した特定の細菌固有な糖鎖部分構造をマイクロチップ上にアレー化した診断ツールを提供する。このアレー化糖鎖チップを用いて宿主が細菌感染後産生する抗体を検出することによって、宿主の細菌感染を迅速かつ正確に診断することができる。このツールには、幼児からの採血も考えて、微量の血液での検出を狙い、フェムトモルレベルの糖鎖を検出するツールとして開発する。
第１の態様において、本発明は、対象がナイセリア属細菌および／またはヘモフィルス属細菌に感染していることを評価するための方法であって、対象から得られた試料と以下の糖鎖配列からなる糖鎖分子：
（１）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（α１－５）－Ｋｄｏ－（α２－４）－Ｋｄｏ；
（２）Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（３－１α）－Ｇｌｃ－（４－１β）－Ｇａｌ；
（３）ＧｌｃＮＡｃ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（４）Ｈｅｐ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（５）Ｇａｌ－（β１－４）－Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ［Ｉ］－（３－１α）－Ｈｅｐ［ＩＩ］；および
（６）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ
の１種または複数（以下、本発明の糖鎖と略）を接触させ、糖鎖－抗体結合体の存在を検出することを含む方法を提供する。
（１）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（α１－５）－Ｋｄｏ－（α２－４）－Ｋｄｏ；
（２）Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（３－１α）－Ｇｌｃ－（４－１β）－Ｇａｌ；
（３）ＧｌｃＮＡｃ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（４）Ｈｅｐ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（５）Ｇａｌ－（β１－４）－Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ［Ｉ］－（３－１α）－Ｈｅｐ［ＩＩ］；および
（６）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ
の１種または複数（以下、本発明の糖鎖と略）を接触させ、糖鎖－抗体結合体の存在を検出することを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、対象がナイセリア属細菌および／またはヘモフィルス属細菌に感染していることを評価するためのチップであって、固相支持体と、該固相支持体に結合した本発明の糖鎖を含むチップを提供する。
上記糖鎖配列において使用している略語「Ｈｅｐ」、「Ｋｄｏ」、「Ｇｌｃ」、「ＧｌｃＮＡｃ」および「Ｇａｌ」は、それぞれヘプトース、２－ケトデオキシオクトン酸、グルコース、Ｎ－アセチルグルコサミンおよびガラクトースを意味する。糖間のギリシャ文字及び数字は、糖間の結合部位および結合様式を示す。例えばＨｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐは、ヘプトースとヘプトースが１位と３位でα結合していることを意味している。
本明細書において測定される細菌は好ましくはナイセリア属細菌であり、ナイセリア属細菌は、淋菌（N. gonorrhoeae）と髄膜炎菌（N. meningitidis）、特に髄膜炎菌を意味するが、これらに限定されない。ヘモフィルス属細菌は、典型的にはインフルエンザｂ型細菌を含むが、これに限定されない。
本明細書において、対象は、ナイセリア属細菌に感染しているか、感染した疑いがあるか、または感染する可能性のある対象、特にヒトを意味する。対象から得られた試料は、対象の血液、血清、血漿、唾液、涙液、尿、糞便、脳脊髄液を含むが、これらに限定されない。好ましい対象から得られた試料は、採取の簡便さと抗体含有量から、血液または血清である。
本明細書において、対象は、ナイセリア属細菌に感染しているか、感染した疑いがあるか、または感染する可能性のある対象、特にヒトを意味する。対象から得られた試料は、対象の血液、血清、血漿、唾液、涙液、尿、糞便、脳脊髄液を含むが、これらに限定されない。好ましい対象から得られた試料は、採取の簡便さと抗体含有量から、血液または血清である。
従ってより好ましい態様において、本発明は、対象がナイセリア属細菌に感染していることを評価するための方法であって、対象から得られた試料と以下の糖鎖配列からなる糖鎖分子：
（１）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（α１－５）－Ｋｄｏ－（α２－４）－Ｋｄｏ；
（２）Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（３－１α）－Ｇｌｃ－（４－１β）－Ｇａｌ；
（３）ＧｌｃＮＡｃ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（５）Ｇａｌ－（β１－４）－Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ［Ｉ］－（３－１α）－Ｈｅｐ［ＩＩ］；および
（６）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ
の１種または複数を接触させ、糖鎖－抗体結合体の存在を検出することを含む方法を提供する。
（１）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（α１－５）－Ｋｄｏ－（α２－４）－Ｋｄｏ；
（２）Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（３－１α）－Ｇｌｃ－（４－１β）－Ｇａｌ；
（３）ＧｌｃＮＡｃ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（５）Ｇａｌ－（β１－４）－Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ［Ｉ］－（３－１α）－Ｈｅｐ［ＩＩ］；および
（６）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ
の１種または複数を接触させ、糖鎖－抗体結合体の存在を検出することを含む方法を提供する。
糖鎖－抗体結合体は、本発明の糖鎖を免疫特異的に認識する抗体が本発明の糖鎖と結合することによって形成される結合体である。抗体と糖鎖を接触させると抗原－抗体反応によって結合体が生じる。結合体形成のための条件は、使用する抗原糖鎖の種類、抗体の濃度、使用する媒体等の多様な要因によって決定することができるが、典型的には、０～４０℃、例えば１５～３７℃で短時間、例えば１分～３時間、好ましくは１．５時間以下、静置乃至ゆるやかな撹拌下で、例えば流動床インキュベーターを用いて、抗体と糖鎖を接触させて結合体を形成させることができる。
糖鎖－抗体結合体の検出は、当該技術分野において既知の何れかの方法を用いて行うことができる。かかる検出方法は、例えばドットブロット法、化学発光法、２次抗体を用いたイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、質量分析等を含むが、これらに限定されない。また、本発明の評価方法において、１種の糖鎖のみならず、複数種の糖鎖を用いるか、そして／または本発明の糖鎖以外の多糖、例えばインフルエンザｂ型細菌または髄膜炎菌の感染について評価することができると知られているインフルエンザｂ型細菌または髄膜炎菌のカプセル多糖を用いた評価を組み合わせてもよい。かかる組合せ評価によって、より信頼性の高い評価を行うことができる。
より具体的な態様において、糖鎖－抗体結合体は、当業者に周知のイムノアッセイ法により検出することができる。イムノアッセイ法では、特異的に結合した抗体分子を認識する２次抗体、好ましくは本発明の糖鎖が認識した部位と異なる部位で結合する２次抗体を用いる。そのようなイムノアッセイ法では、抗体を蛍光標識するか、またはすべての免疫グロブリンに結合する蛍光標識プロテインＡと本発明の糖鎖またはそれを含むチップを接触させることにより、結合抗体そのものを検出することができる。あるいは、２次抗体は蛍光標識されていてもよく、またはそれらはレポーター酵素に結合しており、この酵素が検出可能な化合物の産生を仲介してもよい。当技術分野で既知のイムノアッセイのあらゆる変法を本発明に使用できる。
他の態様においては、当業者に周知の競合アッセイ法により糖鎖－抗体結合体を検出することができる。本発明の糖鎖またはチップに結合した糖鎖と対象から得られた試料を接触させた後、各ターゲット抗体を所定の量で含有する溶液を添加する。これらのターゲット抗体は、それらを検出できるように、当技術分野で既知の任意の方法で蛍光標識されている。標識した抗体分子は、糖鎖への結合に対し競合する。平衡成立時の標識分子の量を用いて、対象から得られた試料に含有されていた抗体分子の量を計算する。
より好ましい態様において、本発明の糖鎖は、糖以外の担体分子、例えばタンパク質または脂質とのコンジュゲートとしてもよい。本発明の糖鎖末端を当該技術分野において既知の方法でスペーサー化し、当該スペーサー部分を介して担体分子と複合化してもよい。使用することができる担体分子としては、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カルボシラン、セラミド、アシルオキシ脂肪酸誘導体等の脂質等が含まれるが、これらに限定されない。担体分子に結合する糖鎖は１個以上、例えば１～３個であってよく、さらに複数のコンジュゲートがデンドリマーを形成してもよい。複数個の糖鎖のコンジュゲートとすることによって、抗体との結合能を向上させ、したがって抗体感度を向上させ、あるいはそのようなワクチンとすることによって優れた抗体提示能を与えることができる。
本明細書において、スペーサーは、例えばアルキル鎖、エーテル鎖およびペプチド鎖であり得るが、これらに限定されない。典型的なスペーサーは、３～５０個、例えば５～２０個、好ましくは７～１５個の炭素原子を有するアルキル鎖またはエーテル鎖である。スペーサー構造は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルコキシ、ヒドロキシＣ１－６アルキル、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、Ｃ１－６アルキル－カルボキシ、アミノ、Ｃ１－６アルキル－アミノ等を含むがこれらに限定されない置換基で置換されていてもよい。
本発明の糖鎖は、当該技術分野において既知の方法によって、それ自体標識化されていてもよい。例えば、本発明の糖鎖は、当該技術分野において周知の方法によって検出可能な物質、例えば蛍光色素分子、放射性同位体等を含んでいてもよい。
本発明の糖鎖は、当該技術分野において既知の化学合成、半合成または発酵によって製造することができる。使用する反応条件等は、目的とする最終生成物、使用する出発物質、製造スケールなどによって、適宜選択することができる。半合成によって本発明の糖鎖を得る方法として、例えばナイセリア属細菌から糖脂質を単離し、目的とする糖鎖が得られるように当該糖脂質を酵素的に切断することによって、本発明の糖鎖を製造することができる。あるいは化学合成によって本発明の糖鎖を得るための方法として、例えば本明細書の実施例に記載の方法によって、ＨＳＡとのコンジュゲートとした本発明の糖鎖（４）を製造することができる。
本発明においてチップは、本発明の糖鎖を固体支持体表面にアレーしたチップである。固体支持体にはラングミュア－ブロジェット膜、機能性ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴＦＥ、ポリスチレン、ヒ化ガリウム、金および銀が含まれるが、これらに限定されない。アミノ、カルボキシ、チオール、またはヒドロキシなどの官能基を固体支持体表面に取り込ませてもよい、当技術分野で既知の何れかの他の材料も使用できる。固体支持体の形状にも何ら制限はなく、プレート状、ウエル状、ビーズ状、繊維状、棒状、粉末状などであってよい。また、表面プラズモン共鳴装置のキュベットなど周知の測定装置の部品に直接組み込むこともできる。
本発明の糖鎖は、当該技術分野において既知の何れかの方法によって固体支持体に固定することができる。かかる方法には、フォトリソグラフィー、光活性化可能なビオチン誘導体を用いてアビジン結合を空間的に配置する方法、鋳型スタンピングおよびインクジェット法等が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、エチレングリコールオリゴマー、ジアミンおよびアミノ酸のような架橋基を用いて本発明の糖鎖を固体支持体に固定してもよい。複数の糖鎖を１つの固体支持体に固定するとき、固体支持体の表面領域を適切なサイズに区切って、区分領域毎に特定の１種の糖鎖を固定化してもよい。
本発明の方法またはチップによって、対象から得られた試料中の標的抗体を例えばフェムトモルオーダー、例えば１０フェムトモルオーダーで検出することができる。
本発明の別の態様において、ナイセリア属細菌および／またはヘモフィルス属細菌、好ましくはナイセリア属細菌に対する免疫を獲得させるためのワクチンであって、本発明の糖鎖の１種または複数を含むワクチンを提供する。本発明のワクチンは、他の抗原および免疫調節剤、例えば免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカインおよびケモカインを含んでいてもよい。
ワクチンは、一般に、１種以上の薬学的に許容される賦形剤またはビヒクル、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール等を含む。さらに、補助物質、例えば湿潤剤乳化剤またはｐＨ緩衝化物質等を含んでいてもよい
さらに本発明のワクチンは、その有効性を増強するためのアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントは、ワクチン組成物に直接添加され得るか、または別に（ワクチン投与と同時または直後のいずれかで）投与され得る。このようなアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油型エマルジョン処方物、例えばＭＦ５９（国際公開第WO 90/14837号）、ＳＡＦおよびＲｉｂｉアジュバントシステム（RAS）（RibiImmunochem、Hamilton、MT）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Stimulon（商標）（CambridgeBioscience、Worcester、MA）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（IL-1、IL-2など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；ならびに（６）免疫刺激剤として作用して組成物の有効性を増強し得る他の物質。
典型的には、ワクチンは、注射溶液または懸濁液の形態であり、あるいは注射の直前に液体ビヒクルと混合して溶液または懸濁液とするのに適切な凍結乾燥形態であってもよい。ワクチンはまた、リポソーム中に乳化またはカプセル化されていてもよい。かかる本発明のワクチンは、１回または複数回の投与レジメンで、非経口（例えば、注射により、静脈内、皮下、または筋内）投与することができる。投与するワクチンの量は、対象の体重、年齢、一般的な健康状態、性別、動物種等に基づいて臨床医、医師または獣医が適切に決定することができる。
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例の方法のあらゆる変法は当業者に容易に理解され、したがってこれらの態様も本発明の一部を成す。
ＬＯＳのフェムトモルレベルでの分析
ヒト血清と１５２５３ＬＯＳを用いて、マイクロアレー化したＬＯＳの検出限界を確認した。２５～１００ｐｇのＬＯＳをマイクロドット（３ｎｌ）して、それぞれ、１０～５０倍の希釈でヒト抗体の結合を確認できるかどうかの試験をした。ニトロセルロース膜に２５～１００ｐｇのＬＯＳをドットし、１％ＰＢＳ中カゼインでブロック後、希釈したヒト血清で一時間インキュベートし、抗ヒトＩｇＧ（１：３０００，アルカリホスファターゼコンジュゲート）で更に一時間インキュベート後、ウェスタンブルーで染色した。実験結果の一部を、図２に示す。このスクリーニングの結果、５０倍希釈の血清を用いた場合でも２５０ｐｇ（５０フェムトモル）のＬＯＳを検出できた。２５倍希釈の血清では、２５ｐｇ（５フェムトモル）のＬＯＳへのヒトＩｇＧの結合を確認できた。１００倍希釈の血清では、５００ｐｇ（１００フェムトモル）のＬＯＳへの結合を確認出来た。かかる結果は、フェムトモルレベルのＬＯＳのヒト血清の検出が可能であると同時に、ＬＯＳは抗ヒトＩｇＧで行っているために、このフェムトレベルのＬＯＳに結合する抗体の検出も可能であることを示す。すなわち、微量の細菌糖質抗原と共にその抗体の検出も可能であることを意味し、微量の血液サンプルで分析が必要な乳幼児の診断ツールとしても使用可能であることを示す。
ヒト血清と１５２５３ＬＯＳを用いて、マイクロアレー化したＬＯＳの検出限界を確認した。２５～１００ｐｇのＬＯＳをマイクロドット（３ｎｌ）して、それぞれ、１０～５０倍の希釈でヒト抗体の結合を確認できるかどうかの試験をした。ニトロセルロース膜に２５～１００ｐｇのＬＯＳをドットし、１％ＰＢＳ中カゼインでブロック後、希釈したヒト血清で一時間インキュベートし、抗ヒトＩｇＧ（１：３０００，アルカリホスファターゼコンジュゲート）で更に一時間インキュベート後、ウェスタンブルーで染色した。実験結果の一部を、図２に示す。このスクリーニングの結果、５０倍希釈の血清を用いた場合でも２５０ｐｇ（５０フェムトモル）のＬＯＳを検出できた。２５倍希釈の血清では、２５ｐｇ（５フェムトモル）のＬＯＳへのヒトＩｇＧの結合を確認できた。１００倍希釈の血清では、５００ｐｇ（１００フェムトモル）のＬＯＳへの結合を確認出来た。かかる結果は、フェムトモルレベルのＬＯＳのヒト血清の検出が可能であると同時に、ＬＯＳは抗ヒトＩｇＧで行っているために、このフェムトレベルのＬＯＳに結合する抗体の検出も可能であることを示す。すなわち、微量の細菌糖質抗原と共にその抗体の検出も可能であることを意味し、微量の血液サンプルで分析が必要な乳幼児の診断ツールとしても使用可能であることを示す。
四糖コンジュゲートＧａｌ（β１－４）Ｇｌｃ（β１－４）Ｈｅｐ｛３－１αＨｅｐ｝－スペーサー－ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の合成
この糖鎖部分の構築は、オリゴ糖鎖を構築後スペーサー化するのではなく、還元末端のヘプトース（Ｈｅｐ）をスペーサー化後、３，４分岐糖鎖を合成した。下記スキームに示すように、まず、還元末端のスペーサー化は、Ｈｅｐ合成中間体であるoctaenopyranoside 1をベンジル化（DMF中BnBr/NaH, ８８％）、脱アセタール化（９０％ TFA, ８８％），アセチル化（ピリジン／Ａｃ２Ｏ，９５％）、アセトリシス（８３％）後、エチルチオ配糖体２に変換し（ＥｔＳＨ：１５当量，ＢＦ３／Ｅｔ２Ｏ：５当量，ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏ＝３：２，３０℃，３ｈ，９３％）、グリコシル化反応（アクセプター：５当量，ＮＩＳ：２当量，ＴｆＯＨ：０．０２当量，ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏ＝１：１，－２０℃，４５ｍｉｎ，９２％）によりスペーサーを導入したoctaenopyranoside３を合成した。この化合物３を脱アセチル化（ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ，９７％）し、３位をエチルシリル化（ＴＥＳＣｌ／ピリジン，ｒ．ｔ．，１．５ｈ，８７％）後、クロロアセチル化（ＣＨ２Ｃｌ２中ＣｌＣＨ２ＣＯＣｌ：ピリジン＝１５：１，０℃，９ｈ，８０％）し、脱シリル化（９０％ＴＦＡ，９０％）することにより、３－ＯＨ受容体を合成した。この受容体とヘプトース供与体とのグリコシル化反応（ヘプトシルドナー：３当量，ＴＭＳＯＴｆ：０．０１当量，ＣＨ２Ｃｌ２，－１５℃，１０ｍｉｎ）により、α(１－３)結合したＨｅｐ－Ｏｃｔ誘導体４を８８％の収率で合成した。この４を脱クロロアセチル化（チオウレア：３当量，ＮａＨＣＯ３：１．１当量，７０℃，１２ｈ，８５％）し、分岐糖鎖合成の受容体５を合成した。この５とエチル－２，３－ジ－Ｏ－アセチル－４，６－Ｏ－ベンジリデン－１－チオ－グルコシルピラノシドを反応（グリコシルドナー：４当量，ＮＩＳ：２当量，ＴｆＯＨ：０．０２当量，ＣＨ２Ｃｌ２，－７２～１８℃，１．５ｈ）させ、目的とする３糖６を６８％で得た。この６をオスミレーション、ＮａＩＯ４酸化、ＮａＢＨ４還元し還元末端をＨｅｐ（７）に変換（２段階，９２％）した。４，６－Ｏ－ベンジリデンを選択的に解裂（ＴＥＳ：３当量，ＴｆＯＨ：１．５当量，ＣＨ２Ｃｌ２，－７８℃，１ｈ，８８％）し、４－ＯＨ受容体８に変換した。この８をテトラ－Ｏ－アセチル－ガラクトシルブロマイドと反応（ガラクトシルドナー：２当量，ＡｇＯＴｆ：２当量，ＣＨ２Ｃｌ２：トルエン＝１：１，－４５℃，９ｈ，５６％）させ、目的とする四糖９を合成した。この９を脱アセチル化（ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）後接触還元条件下（１０％Ｐｄ－Ｃ，Ｈ２，ＭｅＯＨ，ｒ．ｔ．，２ｈ）で、全ての保護基を外し、化合物１から１８段階を経て、スペーサー化した四糖１０を得た（［Ｍ＋Ｎａ＋］理論値：７６９．２７４８，実測値：７６９．２８４８）。この化合物１０とスベリン酸モノメチルエステルと縮合（スベリン酸：１．５当量，ＤＭＴ－ＭＭ：１．５当量，１％ＤＭＦ）後、アシルアジド化法によりＰＢＳ中ＨＳＡと反応させＧａｌ（β１－４）Ｇｌｃ（β１－４）Ｈｅｐ｛３－１αＨｅｐ｝－スペーサー－ＨＳＡ１１の合成を達成した。
この糖鎖部分の構築は、オリゴ糖鎖を構築後スペーサー化するのではなく、還元末端のヘプトース（Ｈｅｐ）をスペーサー化後、３，４分岐糖鎖を合成した。下記スキームに示すように、まず、還元末端のスペーサー化は、Ｈｅｐ合成中間体であるoctaenopyranoside 1をベンジル化（DMF中BnBr/NaH, ８８％）、脱アセタール化（９０％ TFA, ８８％），アセチル化（ピリジン／Ａｃ２Ｏ，９５％）、アセトリシス（８３％）後、エチルチオ配糖体２に変換し（ＥｔＳＨ：１５当量，ＢＦ３／Ｅｔ２Ｏ：５当量，ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏ＝３：２，３０℃，３ｈ，９３％）、グリコシル化反応（アクセプター：５当量，ＮＩＳ：２当量，ＴｆＯＨ：０．０２当量，ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏ＝１：１，－２０℃，４５ｍｉｎ，９２％）によりスペーサーを導入したoctaenopyranoside３を合成した。この化合物３を脱アセチル化（ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ，９７％）し、３位をエチルシリル化（ＴＥＳＣｌ／ピリジン，ｒ．ｔ．，１．５ｈ，８７％）後、クロロアセチル化（ＣＨ２Ｃｌ２中ＣｌＣＨ２ＣＯＣｌ：ピリジン＝１５：１，０℃，９ｈ，８０％）し、脱シリル化（９０％ＴＦＡ，９０％）することにより、３－ＯＨ受容体を合成した。この受容体とヘプトース供与体とのグリコシル化反応（ヘプトシルドナー：３当量，ＴＭＳＯＴｆ：０．０１当量，ＣＨ２Ｃｌ２，－１５℃，１０ｍｉｎ）により、α(１－３)結合したＨｅｐ－Ｏｃｔ誘導体４を８８％の収率で合成した。この４を脱クロロアセチル化（チオウレア：３当量，ＮａＨＣＯ３：１．１当量，７０℃，１２ｈ，８５％）し、分岐糖鎖合成の受容体５を合成した。この５とエチル－２，３－ジ－Ｏ－アセチル－４，６－Ｏ－ベンジリデン－１－チオ－グルコシルピラノシドを反応（グリコシルドナー：４当量，ＮＩＳ：２当量，ＴｆＯＨ：０．０２当量，ＣＨ２Ｃｌ２，－７２～１８℃，１．５ｈ）させ、目的とする３糖６を６８％で得た。この６をオスミレーション、ＮａＩＯ４酸化、ＮａＢＨ４還元し還元末端をＨｅｐ（７）に変換（２段階，９２％）した。４，６－Ｏ－ベンジリデンを選択的に解裂（ＴＥＳ：３当量，ＴｆＯＨ：１．５当量，ＣＨ２Ｃｌ２，－７８℃，１ｈ，８８％）し、４－ＯＨ受容体８に変換した。この８をテトラ－Ｏ－アセチル－ガラクトシルブロマイドと反応（ガラクトシルドナー：２当量，ＡｇＯＴｆ：２当量，ＣＨ２Ｃｌ２：トルエン＝１：１，－４５℃，９ｈ，５６％）させ、目的とする四糖９を合成した。この９を脱アセチル化（ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）後接触還元条件下（１０％Ｐｄ－Ｃ，Ｈ２，ＭｅＯＨ，ｒ．ｔ．，２ｈ）で、全ての保護基を外し、化合物１から１８段階を経て、スペーサー化した四糖１０を得た（［Ｍ＋Ｎａ＋］理論値：７６９．２７４８，実測値：７６９．２８４８）。この化合物１０とスベリン酸モノメチルエステルと縮合（スベリン酸：１．５当量，ＤＭＴ－ＭＭ：１．５当量，１％ＤＭＦ）後、アシルアジド化法によりＰＢＳ中ＨＳＡと反応させＧａｌ（β１－４）Ｇｌｃ（β１－４）Ｈｅｐ｛３－１αＨｅｐ｝－スペーサー－ＨＳＡ１１の合成を達成した。
ＨＳＡにリンカーを結合させた四糖への導入は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析により決定した。図３のパネルＡとＢを比較すると、四糖－ＨＳＡコンジュゲート由来のイオンピークは、ＨＳＡに比べて１万以上高分子量に観察された。この分子量シフトにより約１０分子の四糖－リンカーがＨＳＡに結合していることを明らかとした。
二糖コンジュゲートＨｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－スペーサー－ＨＳＡの合成
上記四糖コンジュゲートの合成と同様にして、表題化合物を製造する。
上記四糖コンジュゲートの合成と同様にして、表題化合物を製造する。
部分糖鎖コンジュゲートの免疫原性
合成した部分糖鎖コンジュゲート、Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－スペーサー－ＨＳＡとＧａｌ（β１－４）Ｇｌｃ（β１－４）Ｈｅｐ｛３－１αＨｅｐ｝－スペーサー－ＨＳＡが実際にＮＨＳ（健常ヒト血清）に存在するＩｇＧによって認識されるかどうかは、ドットブロット分析により確認した。ＬＯＳおよびコンジュゲートとの結合の検出には健常ヒト血清（１：１０）を用いた。各サンプル（１μｌ）をニトロセルロース膜にアプライした。膜を抗ヒトＩｇＧ（ＰＯＤコンジュゲート）で処理し、次いでSuper Signal West Duraで処理して可視化した。結果を図４に示す。この実験条件下では、四糖コンジュゲートは、１μｇでＩｇＧの結合を確認できた（図４のＢ）。また、二糖コンジュゲートでは、２５μｇで抗体の結合をわずかながら確認出来た（図４のＣ）。
この実験例の重要なポイントは、四糖コンジュゲートのヒトＩｇＧの認識により、ＬＯＳのコア糖鎖を含む部分糖鎖Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ（β１－４）Ｈｅｐ｛３－１αＨｅｐ｝も免疫原性を有することを見いだしたことにある。このことにより、ＬＯＳの部分オリゴ糖鎖でも、病原性細菌に対するワクチン、あるいは、感染・診断ツールの標的として、使用出来るということを実証した。
実験例では、四糖コンジュゲート１μｇの検出感度は、～１３ｐｍｏｌｅで、精製ヒトＩｇＧにより認識される１５２５３ＬＯＳのそれに比べ１００倍近く劣る。しかし、この実験は、抗１５２５３ＬＯＳ抗体と精製ヒトＩｇＧとのアフィニティーを検出したものであり、実験例のような実際の血清中のＩｇＧとのアフィニティーとは直接比較できない。また、抗１５２５３ＬＯＳ抗体は数種の糖鎖エピトープに結合するＩｇＧを含んでいるため、四糖糖鎖に結合した抗体の検出感度と直接的な比較はできない。さらに、実験例では、１μｌのドットで分析を行ったが、プリンターを使用してドットする（３ｎｌ／ドット）ことにより、フェムトモルレベルでの検出も可能となる。
合成した部分糖鎖コンジュゲート、Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－スペーサー－ＨＳＡとＧａｌ（β１－４）Ｇｌｃ（β１－４）Ｈｅｐ｛３－１αＨｅｐ｝－スペーサー－ＨＳＡが実際にＮＨＳ（健常ヒト血清）に存在するＩｇＧによって認識されるかどうかは、ドットブロット分析により確認した。ＬＯＳおよびコンジュゲートとの結合の検出には健常ヒト血清（１：１０）を用いた。各サンプル（１μｌ）をニトロセルロース膜にアプライした。膜を抗ヒトＩｇＧ（ＰＯＤコンジュゲート）で処理し、次いでSuper Signal West Duraで処理して可視化した。結果を図４に示す。この実験条件下では、四糖コンジュゲートは、１μｇでＩｇＧの結合を確認できた（図４のＢ）。また、二糖コンジュゲートでは、２５μｇで抗体の結合をわずかながら確認出来た（図４のＣ）。
この実験例の重要なポイントは、四糖コンジュゲートのヒトＩｇＧの認識により、ＬＯＳのコア糖鎖を含む部分糖鎖Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ（β１－４）Ｈｅｐ｛３－１αＨｅｐ｝も免疫原性を有することを見いだしたことにある。このことにより、ＬＯＳの部分オリゴ糖鎖でも、病原性細菌に対するワクチン、あるいは、感染・診断ツールの標的として、使用出来るということを実証した。
実験例では、四糖コンジュゲート１μｇの検出感度は、～１３ｐｍｏｌｅで、精製ヒトＩｇＧにより認識される１５２５３ＬＯＳのそれに比べ１００倍近く劣る。しかし、この実験は、抗１５２５３ＬＯＳ抗体と精製ヒトＩｇＧとのアフィニティーを検出したものであり、実験例のような実際の血清中のＩｇＧとのアフィニティーとは直接比較できない。また、抗１５２５３ＬＯＳ抗体は数種の糖鎖エピトープに結合するＩｇＧを含んでいるため、四糖糖鎖に結合した抗体の検出感度と直接的な比較はできない。さらに、実験例では、１μｌのドットで分析を行ったが、プリンターを使用してドットする（３ｎｌ／ドット）ことにより、フェムトモルレベルでの検出も可能となる。
Claims (8)
- 対象がナイセリア属細菌および／またはヘモフィルス属細菌に感染していることを評価するための方法であって、対象から得られた試料と以下の糖鎖配列からなる糖鎖分子：
（１）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（α１－５）－Ｋｄｏ－（α２－４）－Ｋｄｏ；
（２）Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（３－１α）－Ｇｌｃ－（４－１β）－Ｇａｌ；
（３）ＧｌｃＮＡｃ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（４）Ｈｅｐ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（５）Ｇａｌ－（β１－４）－Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ［Ｉ］－（３－１α）－Ｈｅｐ［ＩＩ］；および
（６）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ
の１種または複数を接触させ、糖鎖－抗体結合体の存在を検出することを含む方法。 - 糖鎖分子が担体分子とコンジュゲートしているものである、請求項１に記載の方法。
- 担体分子がヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである、請求項２に記載の方法。
- ナイセリア属細菌に感染していることを評価するための方法である、請求項１～３の何れかに記載の方法。
- 対象がナイセリア属細菌および／またはヘモフィルス属細菌に感染していることを評価するためのチップであって、固相支持体と、該固相支持体に結合した以下の糖鎖配列からなる糖鎖分子：
（１）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（α１－５）－Ｋｄｏ－（α２－４）－Ｋｄｏ；
（２）Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（３－１α）－Ｇｌｃ－（４－１β）－Ｇａｌ；
（３）ＧｌｃＮＡｃ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（４）Ｈｅｐ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（５）Ｇａｌ－（β１－４）－Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ［Ｉ］－（３－１α）－Ｈｅｐ［ＩＩ］；および
（６）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ
の１種または複数を含むチップ。 - ナイセリア属細菌に感染していることを評価するためのチップである、請求項５に記載のチップ。
- 以下の糖鎖配列からなる糖鎖分子：
（１）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（α１－５）－Ｋｄｏ－（α２－４）－Ｋｄｏ；
（２）Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ－（３－１α）－Ｇｌｃ－（４－１β）－Ｇａｌ；
（３）ＧｌｃＮＡｃ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（４）Ｈｅｐ－（α１－２）－Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ；
（５）Ｇａｌ－（β１－４）－Ｇｌｃ－（β１－４）－Ｈｅｐ［Ｉ］－（３－１α）－Ｈｅｐ［ＩＩ］；および
（６）Ｈｅｐ－（α１－３）－Ｈｅｐ
の１種または複数を含む、ナイセリア属細菌および／またはヘモフィルス属細菌に対するワクチン。 - ナイセリア属細菌に対するワクチンである、請求項７に記載のワクチン。
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|---|---|
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Also Published As
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| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 09844954 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |