ES2327895T3 - Vacuna contra infeccion por neisseria. - Google Patents
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Abstract
Una vacuna para el tratamiento de una enfermedad producida por Neisseria patogénica, comprendiendo la vacuna un componente inmunogénico basado en el núcleo interno de un lipopolisacárido, LPS, de Neisseria y que puede provocar anticuerpos funcionales contra al menos el 50% de las cepas dentro de las especies de la Neisseria patogénica, en la que el componente inmunogénico es un epítopo en el núcleo interno de LPS, caracterizada por la presencia de un resto de fosfoetanolamina unido a la posición 3 en HepII del núcleo interno.
Description
Vacuna contra infección por
Neisseria.
La presente invención se refiere a vacunas
contra infección por Neisseria, especialmente a la infección
por Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae
patogénicas.
La septicemia y la meningitis producidas por
Neisseria meningitidis siguen siendo un problema de salud
global, especialmente en niños pequeños. Neisseria
meningitidis normalmente es una especie comensal de la
nasofaringe, el único reservorio principal natural de este
microorganismo. Los factores de virulencia que potencian la
capacidad de Neisseria meningitidis para producir una
enfermedad invasiva incluyen los polisacáridos capsulares, las
pilosidades (fimbrias) o los lipopolisacáridos y las proteínas de la
membrana externa (DeVoe, I. W. 1982. Microbiol Rev 46:
162-190, Jennings, H. J. 1989. Contrib Microbiol
Immunol 10: 151-165, Tonjum, T., y M. Koomey. 1997.
Gene 192: 155-163, Nassif, X., et al. 1997.
Gene 192: 149-153, Poolman, J. T. 1996. Adv Exp Med
Biol 397: 73-33, Verheul, A. F., et al. 1993.
Microbiol Rev 57: 34-49, Preston, A., et al.
1996. Crit Rev Microbiol 22: 139-180).
Están disponibles vacunas autorizadas existentes
contra los serogrupos capsulares A, C, W y X (Frasch, C. E. 1989.
Clin Microbiol Rev 2 Supl: S134-138, Herbert, M. A.,
et al. 1995. Commun Dis Reg CDR Rev 5:
R130-135, Rosenstein, N., et al. 1998.
J.A.M.A. 279: 435-439), pero generalmente carecen de
inmunogenicidad satisfactoria en niños muy pequeños y no inducen
inmunidad protectora de larga duración (Peltola, H., et al.
1977. N Engl J Med 297: 686-691, Peltola, H., et
al. 1985. Pediatrics 76: 91-96, Reingold, A. L.,
C. V. Broome, et al. 1985. Lancet II:
114-118, Lepow, M. L., et al. 1986. J Infect
Dis 154: 1033-1036, Cadoz, M. 1998. Vaccine 16:
1391-1395). No obstante, su utilidad ha sido
significativa en permitir la protección para poblaciones
seleccionadas tales como militares, viajeros y los que están en
riesgo excepcional de brotes o epidemias (CDC. 1990. MMWR Morb
Mortal Wkly Rep 39, n.º 42: 763). Muy recientemente, se han
introducido vacunas de conjugado meningocócico del grupo C como
inmunización de rutina en el Reino Unido.
La principal prioridad de la salud pública
acerca de las infecciones meningocócicas invasivas es identificar
vacunas del grupo B que sean altamente eficaces en lactantes y que
den protección a largo plazo. Las cepas del grupo B han
representado una parte sustancial, a menudo una mayoría de las
infecciones invasivas por Neisseria meningitidis en muchos
países en Europa y Norteamérica (CDR. Abril de 1997. Communicable
Disease Weekly Report. 7, n.º 14). La prevención de la enfermedad
invasiva de grupo B representa un reto particularmente difícil en
el desarrollo de vacunas ya que el polisacárido capsular es muy
escasamente inmunogénico e incluso los conjugados han demostrado
ser de inmunogenicidad decepcionante (Jennings, H. J. y H. C.
Lugowski. 1981. J. Immunology 127: 1011-1018).
Además, hay preocupación acerca de la seguridad de las vacunas cuyo
fundamento es introducir anticuerpos frente al polisacárido de
grupo B, un homopolímero de ácido neuramínico unido mediante enlace
\alpha-2-8. El poli(ácido siálico)
(PSA) idéntico es una modificación postraduccional de una
glicoproteína presente en células humanas, especialmente en las
neuronas, denominándose esta última molécula de adhesión de células
neuronales (N-CAM) (Finne, J., et al. 1983.
Lancet 2: 355-357). Se han usado pruebas tanto
teóricas como experimentales para argumentar que la inducción de
anticuerpos podría dar como resultado una lesión patológica,
autoinmunitaria para los tejidos del huésped.
Se están explorando activamente enfoques
alternativos para desarrollar candidatos de vacuna contra
Neisseria meningitidis del grupo B. Éstos incluyen: porinas
de la membrana externa (Poolman, J. T., et al. 1995.
Meningococcal disease, págs. 21-34K. Cartwright
(ed.). John Wiley and sons, Wetzler, L. M. 1994. Ann N Y Acad Sci
730: 367-370, Rosenqvist, E., et al. 1995.
Infect Immun 63:4642-4652, Zollinger, W. D., et
al. 1997. Infect Immun 65: 1053-1060),
proteínas de unión a transferrina (AI'Aldeen, A. A. y K. A.
Cartwright. 1996. J Infect 33: 153-157) y
lipopolisacáridos (Verheul, A. F., et al. 1993. Infect Immun
61: 187-196, Jennings, H. J., et al. 1984.
Infect Immun 43: 407-412, Jennings, H. J., et
al. 1987. Antonie Van Leeuwenhoek 53: 519-522,
Gu, X. X. y C. M. Tsai. 1993. Infect Immun 61:
1873-1880, Moxon, E. R., et al. 1998. Adv
Exp Med Biol 435: 237-243).
La estructura del LPS de Neisseria
meningitidis se ha estudiado en detalle considerable por
Jennings H. y colaboradores con contribuciones adicionales de otros
(Griffiss, J. M., et al. 1987. Infect Immun 55:
1792-1800, Stephens, D. S., et al. 1994.
Infect Immun 62: 2947-2952, Apicella, M. A., et
al. 1994. Methods Enzymol 235: 242-252,
Poolman, J. T. 1990. Polysaccharides and membrane vaccines, págs.
57-86. En Bacterial vaccines, A. Mizrahi (ed.).,
et al. 1997. FEMS Microbiol Lett 146:
247-253). Se han publicado las estructuras de las
glicoformas principales para varios inmunotipos
(L1-L9) L1, L6 (Di Fabio, J. L., et al.
1990. Can J Chem 68: 1029-1034, Wakarchuk, W. W.,
et al. 1998. Eur J Biochem 254: 626-633); L3
(Pavliak, V., et al. 1993. J Biol Chem 268:
14146-14152); L5 (Michon, F., et al. 1990. J.
Biol Chem 265: 7243-7247); L2 (Gamian, A., et
al. 1992. J Biol Chem 267: 922-925); L4, L7
(Kogan, G., et al. 1997. Carbohydr Res 298:
191-199): L8 (Wakarchuk, W. W., et al., 1996,
J. Biol. Chem. 271, 19166 - 19173), L9 (Jennings, H. J., et
al. 1983. Carbohydr. Res. 121: 233-241). También
se hace referencia a la siguiente discusión de la figura 1
adjunta.
Se sabe que, además de esta variación entre
cepas, las cepas individuales de Neisseria meningitidis
muestran una amplia variación de fase de las estructuras del LPS
del núcleo externo (revisado en van Putten, J. P. y B. D.
Robertson. 1995. Mol Microbiol 16: 847-853 y
Andersen, S. R., et al. 1997. Microb Pathog 23:
139-155). El mecanismo molecular de esta variación
dentro de una cepa implica loci hipermutables dentro de los marcos
de lectura que codifican varias glicosil transferasas (Gotschlich,
E. C. 1994. J Expt Med 180: 2181-2190, Jennings, M.
P., et al. 1995. Mol Microbiol 18: 729-740).
Se han notificado mecanismos similares de variación fenotípica para
otros componentes de superficie de fase variable de Neisseria
patogénica, incluyendo Opc (Sakari, J., et al. 1994. Mol.
Microbiol 13: 207-217), Opa (Stem, A., et al.
1986. Cell 47: 61-71) y proteínas PilC (Jonsson, A.
B., et al. 1991. EMBO J 10: 477-488). El
cambio molecular reversible de alta frecuencia está mediado por
tractos homopoliméricos de citosinas o guaninas a través de
mecanismos de tipo deslizamiento que dan como resultado
desplazamientos de marco (Gotschlich, E. C. 1994. J Expt Med 180:
2181-2190, Jennings, M. P., et al. 1995. Mol
Microbiol 18: 729-740, Stem, A., y T. F. Meyer.
1987. Mol. Microbiol 1: 5-12).
Pese a la amplia variación antigénica de LPS, se
ha considerado que el núcleo interno de LPS está altamente
conservado relativamente y, por tanto, se ha sugerido el uso del
núcleo interno de la estructura del LPS para su uso en el diseño de
vacunas. Sin embargo, son numerosos los problemas con la generación
de vacunas candidatas de esta forma.
En primer lugar, aunque se sabía que ciertos
componentes del núcleo interno podían ser inmunogénicos (Jennings,
H. J. Lugowski, C. y Ashton, F. E. 1984. Infect. Immun. 43:
407-412 y Verheul, A. F., et al., 1991.
Infect. Immun. 59: 3566-3573), se desconocía el
grado de conservación de estos epítopos a través de la diversidad
de aislados de enfermedad meningocócica y no se han mostrado pruebas
de actividad bactericida de anticuerpos frente a estos epítopos. El
documento US-A-5.705.161 da a
conocer que los oligosacáridos de los inmunotipos meningocócicos
difieren, por ejemplo, con respecto a la composición de
monosacáridos, a la cantidad y a la ubicación de grupos de
fosfoetanolamina y al grado de acetilación de la unidad de GlcNAc
del núcleo interno o de otras unidades, lo que indica que pueden
encontrarse muchas estructuras posibles en la estructura del
núcleo. El documento US-A-5.705.161
también sugiere que una parte del núcleo de un LPS meningocócico
puede ser adecuada para su uso en una vacuna, aunque no se dan a
conocer epítopos inmunogénicos específicos ni datos de apoyo.
En segundo lugar, dada la presencia de la
estructura del LPS del núcleo externo y de otras estructuras
distintas al LPS expuestas en la superficie, incluyendo la cápsula,
no se sabe si la estructura del núcleo interno es accesible al
sistema inmunitario para permitir que se genere una respuesta
inmunitaria bactericida. Además, sería necesario que cualquier
vacuna contuviera estructuras inmunogénicas que provocaran una
respuesta inmunitaria frente a la variedad completa de cepas
patogénicas de Neisseria meningitidis. Sin embargo, no se
conoce el grado de variación mostrado por la estructura del núcleo
interno de las cepas virulentas y no se ha emprendido una
investigación rigurosa del problema.
Además, en la publicación New Generation
Vaccines [1997, Ed. M. M. Levine, publ. Marcel Deker Inc, Nueva
York, Capítulo 34, página 481], se establece que, con respecto al
desarrollo de vacunas, "incluir LPS que está constituido sólo por
la región del núcleo interno común del oligosacárido puede no dar
como resultado la inducción de anticuerpos bactericidas...".
Además, otras especies del género
Neisseria plantean problemas de salud globales. Por ejemplo,
Neisseria gonorrhoeae está implicada en enfermedades
transmitidas sexualmente tales como uretritis, salpingitis,
cervicitis, proctitis y faringitis, y es una causa principal de la
enfermedad inflamatoria pélvica en mujeres.
En consecuencia, todavía existe una necesidad en
la técnica de una vacuna eficaz contra la infección por
Neisseria, tal como la infección por Neisseria
meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.
La presente invención se ha propuesto tratar
esta necesidad.
La invención se refiere a una vacuna para el
tratamiento de una enfermedad producida por infección por
Neisseria comprendiendo la vacuna un componente inmunogénico
de cepas de Neisseria. La vacuna presenta un epítopo
conservado y accesible que a su vez potencia una respuesta funcional
y protectora. Por tanto, en un primer aspecto, la presente
invención proporciona una vacuna para el tratamiento de una
enfermedad producida por Neisseria patogénica, comprendiendo
la vacuna un componente inmunogénico basado en el núcleo interno de
un lipopolisacárido, LPS, de Neisseria y que puede provocar
anticuerpos funcionales contra al menos el 50% de las cepas dentro
de las especies de la Neisseria patogénica, en la que el
componente inmunogénico es un epítopo en el núcleo interno de LPS
caracterizado por la presencia de un resto de fosfoetanolamina unido
a la posición 3 en HepII del núcleo interno.
Ahora se ha descubierto que el núcleo interno de
LPS de Neisseria puede usarse para generar una respuesta
inmunitaria protectora frente a infecciones por Neisseria,
por ejemplo, frente a las infecciones por Neisseria
meningitidis. Por simplicidad, la presente invención se
ejemplifica en el presente documento principalmente mediante la
discusión de vacunas y tratamientos contra infecciones por
Neisseria meningitidis, pero la invención se extiende a
enfermedades producidas por otras especies patogénicas de
Neisseria.
Usando una variedad de anticuerpos monoclonales
novedosos, se han identificado epítopos que pertenecen al núcleo
interno de Neisseria meningitidis que se ha encontrado que
son accesibles al sistema inmunitario, y que pueden estimular la
producción de anticuerpos funcionales, protectores. Además, el
análisis de las cepas de Neisseria meningitidis usando las
nuevas herramientas de anticuerpos indica que ciertos epítopos son
comunes a una variedad de aislados de enfermedad por Neisseria
meningitidis, y en ocasiones se producen en una mayoría de
tales cepas. En consecuencia, una vacuna que comprende sólo una
variedad limitada de epítopos del núcleo interno de Neisseria
meningitidis puede proporcionar inmunoprofilaxis eficaz contra
la variedad completa de cepas que producen la infección por
Neisseria meningitidis. Consideraciones similares se aplican
a otras especies patogénicas.
En un aspecto relacionado, la invención
proporciona una vacuna eficaz contra cepas de las bacterias del
género Neisseria, especialmente cepas de la especie
Neisseria meningitidis. Particularmente en este último caso,
la vacuna comprende uno o más inmunógenos que pueden generar
anticuerpos que reconocen epítopos en cepas encapsuladas. El uno o
más inmunógenos representan uno o más epítopos del núcleo interno
accesibles. Por tanto, los inmunógenos pueden dar lugar a
anticuerpos que reconocen una mayoría de cepas.
Se usa la palabra "principal" para
referirse a una mayoría. Por tanto, un componente inmunogénico
principal provoca anticuerpos frente a una mayoría de cepas.
Arumugham et al (documento EP 0941 738
A1) da a conocer el uso de proteínas portadoras conjugadas con
lipopolisacáridos (LPS) conservados de bacterias Gram negativas,
tales como Haemophilus y Neisseria, en provocar una
respuesta de anticuerpo. Se da a conocer el uso de la parte
conservada del núcleo interno, pero no se usa el resto de PEtn
unido en la posición 3 de HepII del núcleo interno.
En este enfoque, se generaron anticuerpos
mediante la inmunización de ratones usando mutantes galE de
Neisseria meningitidis. Los anticuerpos producidos eran
específicos para el núcleo interno de LPS porque los mutantes galE
carecen de estructuras del núcleo externo. Se investigó la
reactividad de estos anticuerpos contra un panel de cepas de
Neisseria meningitidis representativas de la diversidad
encontrada en las poblaciones naturales de aislados de enfermedad.
Un anticuerpo monoclonal reaccionó con el 70% de todas las cepas de
Neisseria meningitidis sometidas a prueba, lo que sugiere
una fuerte conservación del epítopo del núcleo interno reconocido
por este anticuerpo, denominado anticuerpo B5. Se ha caracterizado
el epítopo contra el que reacciona B5 y puede usarse para
constituir la base de una vacuna para evitar infecciones por
Neisseria.
Se ha depositado un hibridoma que produce el
anticuerpo monoclonal B5, denominado hibridoma NmL3B5, según el
Tratado de Budapest el 26 de septiembre de 2000 con la Autoridad
Depositaria Internacional de Canadá en Winnipeg, Canadá, y se le ha
dado el número de acceso IDAC 260900-1.
De esta forma, se ha obtenido una prueba en
principio de que uno o más de los epítopos del núcleo interno de
LPS están conservados y son accesibles a los anticuerpos, que una
respuesta inmunitaria específica a estos epítopos puede
proporcionar protección y que los oligosacáridos del núcleo interno
de LPS pueden ser vacunas candidatas. El LPS del núcleo interno
está constituido normalmente por un oligosacárido del núcleo interno
unido al lípido A, con la fórmula general tal como se muestra:
en la que R1 es un sustituyente en
la posición 3 de HepII y es hidrógeno o
Glc-\alpha-(1, o fosfoetanolamina; R2 es un
sustituyente en la posición 6 de HepII y es hidrógeno o
fosfoetanolamina; R3 es un sustituyente en la posición 7 de HepII y
es hidrógeno o fosfoetanolamina, y R4 es acetilo o hidrógeno en la
posición 3, la posición 4 o la posición 6 del residuo de GlcNAc, o
cualquier combinación de los mismos; y en la que Glc es
D-glucopiranosa; Kdo es ácido
3-desoxi-D-mano-2-octulosónico;
Hep es
L-glicero-D-mano-heptosa y
GlcNAc es
2-acetamido-2-desoxi-D-glucopiranosa.
El principal componente inmunogénico para las
cepas de Neisseria meningitidis es preferiblemente un único
componente inmunogénico encontrado en al menos el 50% de las cepas
de Neisseria meningitidis, es decir, en la mayoría de las
cepas de Neisseria meningitidis que se producen de
manera natural. El principal componente inmunogénico constituye un
inmunógeno de vacuna candidata. El componente inmunogénico de la
vacuna de la presente invención es de Neisseria meningitidis
o de otras especies de Neisseria y puede provocar una
respuesta inmunitaria, o bien solo o bien en combinación con otro
agente tal como un vehículo. La estructura del LPS del núcleo
interno de Neisseria meningitidis se define generalmente como
la mostrada en la figura 1 y tal como se explica en la leyenda de
la figura. El componente inmunogénico es adecuadamente uno que
provoca una respuesta inmunitaria en presencia y en ausencia de LPS
del núcleo externo.
El principal componente inmunogénico está
conservado en al menos el 50% de las cepas de Neisseria
dentro de las especies, preferiblemente al menos en el 60%, y más
preferiblemente al menos en el 70%. La reactividad con el 100% de
las cepas es un objetivo idealizado, y por tanto el componente
inmunogénico normalmente reconoce como máximo el 95% o el 85% de
las cepas. La conservación se evalúa adecuadamente de manera
funcional, en lo que se refiere a la reactividad cruzada del
anticuerpo. Se prefiere que el componente inmunogénico esté
presente en al menos el 5% de las cepas del serogrupo B,
preferiblemente en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos
el 70%, incluso más preferiblemente en al menos el 76%.
Adecuadamente, la evaluación de la reactividad cruzada del
componente inmunogénico se realiza usando una colección
representativa de cepas, tales como las explicadas en Maiden
[Maiden M-C. J., et al. 1998, P.N.A.S. 95,
3140-3415].
El principal componente inmunogénico se
encuentra en el inmunotipo L3 de Neisseria meningitidis, y
preferiblemente no está en L2. Más específicamente, se prefiere que
el inmunógeno se encuentre en los inmunotipos L1, L3, L7, L8 y L9,
pero no en L2, L4, L5, L6. En otras palabras, se prefiere que el
inmunógeno, particularmente el principal componente inmunogénico,
genere anticuerpos que sean reactivos con al menos el inmunotipo L3
inmunogénico y habitualmente los inmunotipos L1, L3, L7, L8 y L9,
pero no con L2, y habitualmente no con los inmunotipos L2, L4, L5 y
L6. Hay diferencias conformacionales forzadas en el núcleo interno
de los inmunotipos L2 y L3 por diferentes disposiciones en HepII,
concretamente el resto de PEtn en la posición 6 en L2 o en la
posición 3 en L3, y el residuo de Glc en la posición 3 en L2.
Actualmente, no se concibe la posibilidad de un único epítopo para
ambos inmunotipos L2 y L3. En otras palabras, sin descartar la
posibilidad de un único epítopo, se espera que se requieran
diferentes inmunógenos para provocar anticuerpos para L2 y L3.
Preferiblemente, el principal componente
inmunogénico es un epítopo conservado en el núcleo interno de LPS
reconocido por un anticuerpo denominado B5 en el presente documento.
Por tanto, el epítopo preferido de la invención es cualquier
epítopo reconocido por el anticuerpo B5.
El componente inmunogénico es un epítopo
conservado en el núcleo interno de LPS definido por la presencia de
un resto de fosfoetanolamina (PEtn) unido a la posición 3 de HepII,
la heptosa de cadena \beta, del núcleo interno, o es un
equivalente funcional del mismo. A este respecto, cuando el contexto
lo permita, HepI y HepII se refieren a los residuos de heptosa del
oligosacárido del núcleo interno que respectivamente son proximales
y distales al resto de lípido A del LPS de Neisseria, sin
estar relacionado necesariamente con la fórmula general facilitada
anteriormente.
Preferiblemente, este epítopo comprende un
residuo de glucosa en HepI, el residuo de heptosa de cadena
\alpha. Aunque esta glucosa no es necesaria para la unión a B5,
se requiere para el reconocimiento óptimo.
El principal componente inmunogénico
preferiblemente también comprende un epítopo en el núcleo interno de
LPS que comprende una N-acetilglucosamina en HepII.
Se requiere la presencia de N-acetilglucosamina para
el reconocimiento óptimo por B5.
Preferiblemente, el principal componente
inmunogénico comprende tanto la N-acetilglucosamina
en HepII como un residuo de glucosa en HepI.
El componente inmunogénico de la presente
invención sólo está limitado por el requisito de un resto de
fosfoetanolamina (PEtn) unido a la posición 3 de HepII del núcleo
interno, lo que se requiere para la reactividad con B5. La
estructura del núcleo interno puede modificarse, reemplazarse o
eliminarse según sea necesario, hasta el grado en que no se
necesitan. De manera similar, cualquier estructura del núcleo
externo puede modificarse o delecionarse, hasta el grado en que no
se necesitan elementos estructurales. No se requiere que el
componente inmunogénico carezca de la parte del núcleo externo, o
equivalente, del LPS. El componente inmunogénico puede comprender
elementos del núcleo externo que tienen un componente de galactosa,
por ejemplo el residuo de galactosa terminal de la
lacto-N-netoetraosa. En una
realización adecuada, el componente inmunogénico se deriva de LPS y
está libre de otro material celular.
Alternativamente, puede estar presente material celular y puede adoptar la forma de bacterias vivas o inactivadas.
Alternativamente, puede estar presente material celular y puede adoptar la forma de bacterias vivas o inactivadas.
En un aspecto relacionado, la vacuna de esta
invención tiene un epítopo inmunogénico reconocido por un anticuerpo
frente a un mutante galE de Neisseria meningitidis.
En una realización adicional, la vacuna
adecuadamente comprende elementos inmunogénicos adicionales del
núcleo interno con un objetivo de lograr hasta el 100% de
cobertura. Preferiblemente, la vacuna comprende sólo un número
limitado (4-6, o menos) de elementos inmunogénicos,
más preferiblemente sólo aquellas glicoformas que son
representativas de todas las posibles posiciones de la PEtn en
HepII, la heptosa de cadena \beta, del núcleo interno, es decir,
en las que la PEtn está en la posición 3 y preferiblemente es
exocíclica (posición 6 o posición 7) también, con o sin una glucosa
con enlace \alpha-1-3 en HepII, o
una combinación de los mismos. No se requiere la presencia de
sustituyentes de PEtn para la generación de anticuerpos por un
componente inmunogénico de esta invención.
Además, tal como se detalla en el presente
documento, los epítopos de esta invención son inmunogénicos y
accesibles, y por tanto pueden usarse para desarrollar una vacuna
eficaz. Además, tal como se detalla en el presente documento, una
vacuna que contiene sólo un número limitado de glicoformas
(representando todas las posibles posiciones de PEtn en HepII,
concretamente la posición 3, y preferiblemente las posiciones 6 ó 7,
y combinaciones de las mismas) puede proporcionar protección
eficazmente contra la diversa variedad de aislados meningocócicos
que producen la enfermedad invasiva.
En consecuencia, la vacuna de la presente
invención comprende un epítopo que está definido por la presencia
de un resto de fosfoetanolamina (PEtn) unido a la posición 3 de
HepII del núcleo interno, y preferiblemente comprende
adicionalmente un epítopo definido por la presencia de PEtn en la
posición 6 de HepII del núcleo interno, y/o un epítopo definido por
PEtn en la posición 7 de HepII del núcleo interno, o en la que no
hay adición de PEtn adicional. Preferiblemente, la vacuna contiene
sólo componentes inmunogénicos que son estas variantes de
glicoforma del núcleo interno.
El anticuerpo B5 de la presente invención
también reconoce las estructuras del núcleo interno de Neisseria
gonorrhoeae y Neisseria lactamica. Como tal, la invención
se extiende a cualquier especie de Neisseria, y cualquier
referencia a Neisseria meningitidis puede extenderse según
sea apropiado a otras especies de Neisseria, preferiblemente
a Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae y
Neisseria lactamica, más preferiblemente a Neisseria
meningitidis. La invención también se extiende a componentes
inmunogénicos en otras especies de Neisseria que están
relacionadas con las identificadas en Neisseria meningitidis,
o bien por la función, la reactividad con el anticuerpo o la
estructura. La invención no se limita a las cepas patogénicas de
Neisseria. La vacuna de esta invención puede derivarse de una
cepa comensal de Neisseria, especialmente una cepa de
Neisseria lactamica. La especie Neisseria lactamica
normalmente es fuertemente inmunogénica y, por tanto, se prefiere
que el componente inmunogénico del núcleo interno de LPS se derive
de esta especie.
Por tanto, la vacuna puede ser homóloga o
heteróloga y estar basada por tanto en un componente inmunogénico
del microorganismo objetivo, homóloga, o de un microorganismo
diferente, heteróloga. El microorganismo puede producirse de manera
natural o no, tal como puede producirse por técnicas recombinantes.
En particular, el microorganismo puede modificarse por ingeniería
genética para modificar el epítopo o para modificar otros
componentes.
También se ha determinado que un segundo
anticuerpo monoclonal, denominado en el presente documento A4, puede
reaccionar con epítopos del núcleo interno de casi todas las cepas
de Neisseria meningitidis que no reaccionan con el
anticuerpo B5. Por tanto, de las 100 cepas de Neisseria
meningitidis sometidas a prueba, el 30% no fueron reactivas con
B5 y se encontró que carecían de un resto de PEtn en la posición 3
de HepII. De estas 30 cepas, 27 fueron reactivas con A4. En
consecuencia, una vacuna que comprende sólo 2 epítopos del núcleo
interno, correspondientes a los epítopos definidos por la
reactividad cruzada con A4 y B5, proporciona un 97% de cobertura de
una colección representativa de cepas de Neisseria
meningitidis, preferiblemente tal como se evalúa mediante el
uso de la colección de cepas explicadas en Maiden et al.
[citado anteriormente].
Se ha depositado un hibridoma que produce el
anticuerpo monoclonal A4, denominado hibridoma NmL4galEA4, según el
Tratado de Budapest el 26 de septiembre de 2000 con la Autoridad
Depositaria Internacional de Canadá en Winnipeg, Canadá, y se le ha
dado el número de acceso IDAC 260900-2.
Por tanto, la presente invención también se
refiere a una vacuna que comprende algunos componentes
inmunogénicos, en la que al menos el 70% de las cepas de
Neisseria meningitidis de la especie presentan al menos uno
de los componentes inmunogénicos, preferiblemente el 80%,
preferiblemente el 90% y lo más preferiblemente el 97%. De esta
forma, la vacuna puede dar cobertura de protección contra la
infección por Neisseria en el 70%, preferiblemente en el
80%, el 90% o incluso en el 97% o más de los casos.
Algunos componentes inmunogénicos significa
adecuadamente al menos dos componentes inmunogénicos,
preferiblemente sólo 2. Más generalmente, los pocos componentes
comprenden de 2 a 6 componentes, tal como 2, 3, 4, 5 ó 6
componentes, más adecuadamente 2, 3 ó 4 componentes.
Preferiblemente, los componentes inmunogénicos son algunas
glicoformas del núcleo interno, representativas de todas las cepas
naturales de Neisseria meningitidis. De esta forma, una
vacuna que contiene un número limitado de glicoformas puede dar una
cobertura que se aproxima al 100% de las cepas de Neisseria
meningitidis.
En la figura 3 se muestra una representación de
las estructuras 3D del núcleo interno de LPS que tiene un resto de
PEtn en la posición 3, la posición 6 o está ausente en HepII. En
consecuencia, la presente invención también se extiende a elementos
inmunogénicos que tienen estructuras iguales o similares a las
estructuras del núcleo interno de la posición 3, y preferiblemente
de la posición 6, tal como se define por su geometría 3D y a
anticuerpos que pueden interaccionar con tales estructuras, tal como
se evalúa in vitro, in vivo o in silico.
Los elementos inmunogénicos de la invención son
preferiblemente los que se muestra que provocan anticuerpos que
tienen actividad opsónica y bactericida y que se muestra que generan
anticuerpos que confieren protección pasiva en modos in
vivo.
La invención también se extiende al uso de
cualquier elemento inmunogénico tal como se definió anteriormente
en la preparación de un medicamento para la prevención, el
tratamiento del diagnóstico de infección por Neisseria.
Los inmunógenos de la vacuna candidata de la
presente invención pueden ser adecuados para la prevención de
infecciones por Neisseria. Sin embargo, se prefiere una
vacuna para el tratamiento de Neisseria meningitidis, siendo
especialmente preferida una vacuna para las cepas del grupo B.
Preferiblemente, el elemento inmunogénico de la
vacuna es accesible en presencia de cápsula bacteriana. En
consecuencia, los anticuerpos generados por un individuo que se
vacuna podrán acceder al mismo epítopo en las cepas invasoras de
Neisseria y, por tanto, proteger al individuo de la
infección. Los anticuerpos administrados directamente a un paciente
para el tratamiento, también pueden, por tanto, acceder directamente
a las cepas objetivo de
Neisseria.
Neisseria.
Preferiblemente la vacuna de la presente
invención comprende epítopos que pueden estimular anticuerpos que
son opsónicos. Además se prefiere que estos anticuerpos puedan
unirse a cepas de Neisseria de tipo natural para conferir
protección contra la infección y que sean bactericidas.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para tratar Neisseria patogénica. El
procedimiento emplea uno o algunos componentes inmunogénicos que
dan lugar a anticuerpos eficaces y que se basan en un epítopo del
núcleo interno para estimular la respuesta inmunitaria. La respuesta
inmunitaria normalmente está mediada por células B, pero se puede
incluir inmunidad mediada por células T. Los anticuerpos generados
por la vacuna de esta invención se unen a elementos del núcleo
interno de la bacteria objetivo patogénica.
Las enfermedades producidas por Neisseria
meningitidis incluyen principalmente meningitis, septicemia y
neumonía, y en la presente invención se prefiere especialmente la
prevención y el tratamiento de estas enfermedades. Las enfermedades
producidas por Neisseria gonorrhoeae incluyen enfermedades
transmitidas sexualmente tales como uretritis, cervicitis,
proctitis, faringitis, salpingitis, epididimitis y
bacteriemia/artritis. Adicionalmente, la invención se extiende al
tratamiento y la prevención de cualquier otra enfermedad que resulta
de la infección por Neisseria, especialmente a enfermedades
en las que la infección por Neisseria podría debilitar el
sistema inmunitario tal como otra enfermedad o patógeno podrían ser
dañinos para un individuo. El tratamiento puede ser preventivo
o
curativo.
curativo.
La vacuna de la presente invención es una
formulación adecuada para su administración segura a un sujeto,
permitiendo que el sujeto desarrolle una respuesta inmunitaria a la
infección futura por Neisseria. Las vacunas de la presente
invención son preferiblemente vacunas formuladas en las que puede
conjugarse cualquiera de los componentes inmunogénicos de la vacuna
y puede usarse cualquier agente adecuado para la conjugación. La
conjugación permite la modificación de la presentación del antígeno
y puede lograrse mediante técnicas convencionales. Ejemplos de
agentes para la conjugación incluyen proteínas de especies homólogas
o heterólogas. De esta forma, el componente inmunogénico de la
presente invención forma un conjugado de
sacárido-péptido. Preferiblemente, la parte de
péptido comprende un epítopo de activación de células T.
Las vacunas de la presente invención pueden
administrarse con un adyuvante, para mejorar la respuesta
inmunitaria a los componentes inmunogénicos. Los adyuvantes
adecuados incluyen sales de aluminio, aceites en combinación con
macromoléculas bacterianas, liposomas, dipéptido de muramilo,
ISCOMS, toxinas bacterianas tales como pertúsica, colérica y las
derivadas de E. coli y citoquinas tales como
IL-1, IL-2 e IFN\gamma.
La vacuna de la invención puede administrarse
mediante medios adecuados, tales como mediante administración oral
o administración parenteral, inyección, medios nutracéuticos u otros
medios de administración, y puede proporcionarse en cualquier forma
de administración adecuada tal como comprimidos, píldoras, cápsulas,
gránulos, soluciones, suspensiones o emulsiones. Adecuadamente los
componentes de la vacuna se preparan en forma de una solución
estéril, isotónica.
La presente invención también se extiende a los
anticuerpos monoclonales derivados de los conceptos y las
metodologías descritos en el presente documento, incluyendo pero sin
limitarse a B5, y al uso de estos anticuerpos en el tratamiento de
infección por Neisseria. La invención también se refiere a
preparaciones farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales
preparaciones pueden administrarse mediante medios adecuados, tales
como los ejemplificados anteriormente para la administración de
vacunas, y pueden usarse en combinación con otros agentes activos o
adyuvantes.
La dosificación correcta del anticuerpo o de la
vacuna variará según la formulación, el modo de aplicación
particulares y el huésped particular que se está tratando. Es
adecuado tener en cuenta factores tales como la edad, el peso
corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de
excreción, el estado del huésped, las combinaciones de fármacos y
las sensibilidades de reacción.
Las composiciones de vacunas y anticuerpos de la
presente invención pueden usarse con otros fármacos para
proporcionar tratamientos de combinación. Los otros fármacos pueden
formar parte de la misma composición o pueden proporcionarse como
una composición separada para la administración al mismo tiempo o en
un momento diferente.
Además de los propios anticuerpos, la invención
también se refiere a los hibridomas que producen tales
anticuerpos.
Los anticuerpos contra los componentes
inmunogénicos de la invención pueden generarse administrando los
componentes inmunogénicos a un animal, preferiblemente a un animal
no humano, usando protocolos convencionales. Para la preparación de
anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica adecuada.
Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena única
(documento US 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos
de cadena única apropiados. Además, pueden usarse ratones
transgénicos u otros organismos u animales para expresar anticuerpos
humanizados inmunoespecíficos frente a los componentes
inmunogénicos de la invención.
Alternativamente, pueden usarse otros
procedimientos, por ejemplo tecnología de presentación en fago para
seleccionar genes de anticuerpo para proteínas con actividades de
unión hacia los componentes inmunogénicos de la presente
invención.
Los anticuerpos de la invención pueden ser
anticuerpos o bien monoclonales o bien policlonales, según sea
apropiado.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para la prevención de infección por Neisseria,
comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto que necesita
tal tratamiento una cantidad eficaz de una vacuna tal como se
describió anteriormente.
Preferiblemente, la administración es adecuada
para producir un anticuerpo de larga duración y/o una respuesta
inmunitaria de células T para proteger al sujeto de la infección,
particularmente de la infección por Neisseria
meningitidis.
La invención también se refiere a un
procedimiento para el tratamiento de infección por Neisseria,
comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto que necesita
tal tratamiento una cantidad eficaz de un anticuerpo frente al
núcleo interno de Neisseria meningitidis. Preferiblemente, el
anticuerpo es B5 o A4 o un anticuerpo que reconoce el mismo epítopo
que B5 o A4, o un anticuerpo derivado de los conceptos y
metodologías descritos en el presente documento, o es una
combinación de los mismos.
Además, los procedimientos de la invención
pueden extenderse a la identificación de epítopos en cualquier cepa
bacteriana. Los epítopos así identificados pueden someterse a prueba
tanto para determinar su accesibilidad, conservación a través de la
población como para determinar su actividad funcional, usando
procedimientos tal como se explica en los ejemplos adjuntos. Por
tanto, la presente invención se refiere adicionalmente a un
procedimiento para la identificación de un elemento inmunogénico,
que comprende producir un anticuerpo frente a una estructura
bacteriana, preferiblemente una estructura de LPS bacteriana, más
preferiblemente una estructura de LPS bacteriana del núcleo
interno, y someter a prueba el epítopo reconocido por el anticuerpo
para determinar la accesibilidad al anticuerpo en la cepa de tipo
natural, que comprende también opcionalmente someter a prueba el
epítopo para determinar su conservación a través de la población
bacteriana y someter a prueba para determinar la actividad
funcional frente al epítopo in vivo.
Preferiblemente, las especies bacterianas son
especies de Neisseria, preferiblemente Neisseria
meningitidis, Neisseria gonorrhoeae o Neisseria
lactamica.
Específicamente, la presente invención
proporciona un procedimiento para generar anticuerpos frente al
núcleo interno de Neisseria meningitidis. Por primera vez ha
sido posible examinar una población de cepas de Neisseria
meningitidis para identificar características de población
completa que son independientes de inmunotipo.
En consecuencia, la presente invención también
se refiere a un procedimiento para la identificación de epítopos
inmunogénicos de Neisseria meningitidis, comprendiendo el
procedimiento las etapas de:
- 1
- generar anticuerpos frente al núcleo interno de Neisseria meningitidis, mediante la inoculación de un microorganismo huésped con una cepa mutante galE de Neisseria meningitidis, y
- 2
- someter a prueba tales anticuerpos contra una cepa de Neisseria meningitidis de tipo natural para identificar aquellos anticuerpos que son reactivos y para los que los epítopos son por tanto accesibles.
\vskip1.000000\baselineskip
La utilidad potencial de los epítopos así
identificados puede evaluarse adicionalmente examinando anticuerpos
que reaccionan con el núcleo interno de la cepa de galE de
Neisseria meningitidis contra un panel de cepas que son
representativas de una diversidad de cepas. Preferiblemente, el
panel de cepas se selecciona usando un enfoque basado en un
análisis de población. Los epítopos así identificados pueden
someterse entonces a prueba en ensayos funcionales, tal como se
explica en el ejemplo 3.
En particular, la invención se extiende a un
procedimiento para el análisis de la unión de anticuerpos a
bacterias, en el que se estudian aislados naturales cuando se hacen
crecer y son adherentes a células en cultivos tisulares, tales como
HUVEC. Este ensayo proporciona una monocapa de células a las que se
adhieren las bacterias en un entorno biológicamente relevante.
Intentos anteriores usando Neisseria, por ejemplo,
directamente adherente a cubreobjetos revestidos de gelatina o
Matrigel dieron como resultado bajos números de bacterias adherentes
tras lavados repetidos y alta tinción de fondo no específica. En
particular, se prefiere que se analice la unión de anticuerpos
usando microscopía confocal.
Este procedimiento también identifica
anticuerpos adecuados para el uso terapéutico y la invención se
extiende a tales anticuerpos.
Además, se han identificado genes biosintéticos
clave para cada etapa en la síntesis de LPS (Preston et al.,
1996, Crit. Rev. Microbiol. 22, 139 - 180) y esto permite la
construcción de una serie de mutantes de los que pueden hacerse
disponibles glicoformas de LPS de tamaño y complejidades variables
para facilitar la identificación de los epítopos conservados (van
der Ley et al., 1997, FEMS Microbiol. Letter 146, 247 - 253,
Jennings et al 1993, Mol. Microbiol. 10 361 - 369, Jennings
et al., 1995, Microb Pathog 19, 391 - 407, van der Ley et
al., 1996, Mol Microbiol 19, 1117 - 1125).
La presente invención también se refiere al gen
encontrado en Neisseria meningitidis que está implicado en
la sustitución de PEtn en la posición 3 en HepII, y a los genes
relacionados en estructura y función. Todavía no se han
identificado genes en ninguna bacteria que estén implicados en la
adición de PEtn a estructuras de LPS. Usando B5, específico para un
epítopo de LPS del núcleo interno que contiene una PEtn, se ha
identificado un supuesto gen de fosfoetanolamina transferasa de LPS
(denominado hypo3) en Neisseria meningitidis.
Hypo3 se nombró arbitrariamente, ya que es el 3^{er} marco
de lectura en un fragmento de ADN seleccionado mediante
experimentación, de la secuencia genómica de MC58. El hypo3
original procede por tanto de MC58. Este ORF se denomina NMB2010 en
la base de datos TIGR (secuencia genómica de MC58) y aunque se
designa como una proteína de función desconocida, se clasifica como
una "proteína de la familia YhbX/YhjW/YijP/YjdB". Esto indica
que se han deducido homólogos en otros microorganismos, pero no se
desconoce su función. El homólogo en la secuencia del serogrupo A
en el Centro Sanger se denomina NMA0431, aunque este gen es más
pequeño que hypo3. Hypo3 está implicado en la
sustitución de PEtn en la posición 3 en HepII. Además, se requiere
la presencia del gen completo para la expresión del fenotipo
reactivo con B5 en Neisseria meningitidis así como en otras
especies patogénicas y comensales de Neisseria.
La identificación del gen permite que se creen
mutantes que son isogénicos aparte de hypo3, y que sólo
difieren en la presencia o ausencia de PEtn en la posición 3 de
HepII en el núcleo interno de LPS. Tales cepas pueden usarse en
estudios comparativos. Además, pueden modificarse por ingeniería
genética cepas apropiadas para la producción de vacunas de modo que
comprendan la estructura de PEtn preferida en la posición 3, o
pueden modificarse por ingeniería genética de modo que esta PEtn no
pueda estar presente.
En consecuencia, la invención se refiere al uso
del gen hypo3, o un homólogo del mismo, en la producción de
una cepa de Neisseria para la evaluación, el tratamiento o la
prevención de infección por Neisseria. El homólogo puede
tener un 60%, 70%, 80%, 90% o más de homología o identidad con
hypo3, tal como se evalúa a nivel del ADN. El uso del gen
incluye los procedimientos explicados anteriormente, para preparar
cepas modificadas genéticamente para la vacunación, el aislamiento
de epítopos apropiados y la generación de cepas para estudios
comparativos. Más generalmente, se concibe la identificación y el
uso de cualquier gen que desempeñe un papel en la ruta biosintética
y que tenga un efecto sobre la conservación, la accesibilidad o la
función del inmunógeno.
La presente invención se ilustra ahora mediante
las siguientes figuras y ejemplos que no son limitantes de la
presente invención, en los que:
la figura 1 ilustra la estructura de LPS de
diversos inmunotipos de Neisseria meningitidis;
la figura 2 ilustra la reactividad cruzada de B5
con inmunotipos y mutantes seleccionados de LPS de Neisseria
meningitidis;
la figura 3 ilustra modelos moleculares de los
estados de mínima energía (MMC) calculados del oligosacárido del
núcleo de mutantes galE de L3, L4 y L8 desfosforilado;
la figura 4 ilustra la reactividad cruzada de B5
con LPS de L3 modificado genéticamente y LPS de L8 modificado
químicamente de Neisseria meningitidis;
la figura 5 ilustra la microscopía confocal de
inmunofluorescencia de la cepa MC58 de microorganismos de
Neisseria meningitidis adherente a HUVEC;
la figura 6 ilustra geles de tricina teñidos con
plata de preparaciones de LPS de cepas del grupo B de Neisseria
meningitidis no reactivas con B5;
la figura 7 ilustra la accesibilidad del epítopo
de LPS a A4 en células completas de Neisseria
meningitidis;
la figura 8 ilustra la conservación del epítopo
de LPS a través de serogrupos de Neisseria meningitidis;
la figura 9 ilustra la estrategia para el
ejemplo 2;
la figura 10 ilustra títulos de ELISA de
anticuerpos frente a LPS de galE de L3 (IgG) en sueros
emparejados tomados de manera temprana y tardía de niños con
enfermedad meningocócica invasiva, y el % medio de fagocitosis de
MC58 de Neisseria meningitidis con sueros emparejados tomados
de manera temprana y tardía de niños con enfermedad meningocócica
invasiva con células mononucleares de sangre periférica humana y
complemento humano;
la figura 11a ilustra el % medio de fagocitosis
de MC58 de Neisseria meningitidis con el AcM B5 preincubado
con concentraciones crecientes de LPS de galE o bien (i)
reactivo con B5 o bien (ii) no reactivo con B5 con células
polimorfonucleares de sangre periférica humana y complemento
humano;
la figura 11b ilustra el % medio de fagocitosis
del par de cepas isogénicas de tipo natural de Neisseria
meningitidis (Neisseria meningitidis BZ157) que son o
bien reactivas con el AcM B5 o bien no reactivas con B5 con AcM B5
como la opsonina con células mononucleares de sangre periférica
humana y complemento humano;
la figura 11c ilustra el % medio de fagocitosis
de perlas de látex fluorescentes revestidas o bien con LPS
purificado a partir del mutante galE de L3 (10 \mug/ml) o
bien no revestidas, en presencia del AcM B5 o de tampón final, con
células mononucleares de sangre periférica humana y complemento
humano;
la figura 12 ilustra el % medio de supervivencia
del mutante galE de Neisseria meningitidis en
presencia y ausencia del AcM B5 contra diluciones en serie de dos
veces de suero reunido humano comenzando en el 40% tal como se
detecta usando un ensayo bactericida en suero;
la figura 13 ilustra la bacteriemia en media
geométrica en la sangre de grupos de ratas lactantes de 5 días de
edad 24 h tras la infección con 1 x 10^{8} ufc/ml de mutante
galE administrado simultáneamente con: (i) ausencia de
anticuerpo; (ii) AcM B5 (dosis de 10 \mug); (iii) AcM B5 (dosis de
100 \mug); o (iv) AcM 735, un anticuerpo
anti-capsular control positivo (dosis de 2
\mug);
la figura 14 ilustra una inmunotransferencia de
tipo Western que muestra un LPS purificado a partir de MC58 y
mutante galE de Neisseria meningitidis sondado con AcM
B5 (líquido ascítico 1:2000) detectado usando IgG
anti-ratón - fosfatasa alcalina y sustrato BCIP/NBT;
y
la figura 15 ilustra un perfil de FACS que
compara el marcaje en superficie de MC58 y mutante galE de
Neisseria meningitidis vivas (5 x 108 microorg./ml) con AcM
B5 (sobrenadante de cultivo 1:50) detectado usando IgG
anti-ratón (marcado con FITC).
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó la conservación y la accesibilidad
a anticuerpos de epítopos del núcleo interno de lipopolisacárido
(LPS) de Neisseria meningitidis debido a su potencial como
candidatos de vacuna. Se obtuvo un anticuerpo monoclonal (AcM)
murino IgG3, denominado AcM B5, inmunizando ratones con un mutante
galE de H44/76 de Neisseria meningitidis (inmunotipo
L3 de B.15.P. 1.7.16). Se ha demostrado que el AcM B5 puede unirse
al LPS del núcleo de microorganismos MC85 encapsulados de tipo
natural (inmunotipo L3 de B.15.P1.7.16) in vitro y ex
vivo. Una estructura del núcleo interno reconocida por el AcM B5
está conservada y es accesible en 26/34 (76%) cepas del grupo B y
en 78/112 (70%) cepas de los grupos A, C, W, X, Y y Z. Las cepas de
Neisseria meningitidis que presentan este epítopo son
inmunotipos en los que la fosfoetanolamina (PEtn) está unida a la
posición 3 de la heptosa de cadena \beta (HepII) del núcleo
interno. En contraposición, las cepas de Neisseria
meningitidis que carecen de reactividad con el AcM B5 tienen una
estructura de núcleo alternativa en la que la PEtn está unida a una
posición exocíclica (es decir, la posición 6 ó 7) de HepII
(inmunotipos L2, L4 y L6) o está ausente (inmunotipo L5). Se
concluye que el AcM B5 define una o más de las glicoformas
principales del núcleo interno del LPS de Neisseria
meningitidis.
Estos hallazgos fomentan la posibilidad de que
inmunógenos que pueden provocar anticuerpos funcionales específicos
para las estructuras del núcleo interno podrían constituir la base
de una vacuna contra infecciones invasivas producidas por
Neisseria meningitidis.
En resumen, se notifica que un anticuerpo
monoclonal, denominado B5, ha identificado un epítopo en reacción
cruzada en el LPS de la mayoría de las cepas que se producen de
manera natural, pero genéticamente diversas, de Neisseria
meningitidis. Una fosfoetanolamina (PEtn) en la posición 3 de la
heptosa de cadena P (HepII) (figura 1) es crítica para el epítopo
de las cepas reconocidas por el anticuerpo monoclonal B5. En
contraposición, todas las cepas de Neisseria meningitidis
que carecen de reactividad con AcM B5 son inmunotipos caracterizados
por la ausencia de sustitución de PEtn o por la sustitución de PEtn
en una posición exocíclica (es decir, la posición 6 ó 7) de HepII
(figura 1). Por tanto, se encuentra un repertorio limitado de
variantes de LPS del núcleo interno entre los aislados naturales de
las cepas de Neisseria meningitidis y estos hallazgos
fomentan la posibilidad de que pudiera desarrollarse una vacuna que
contenga algunas glicoformas representativas de todas las cepas
naturales de Neisseria meningitidis.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas MC58 y H44/76 de Neisseria
meningitidis (ambas inmunotipo L3 de B:15:P1.7.16) se han
descrito anteriormente (Virji, M., H. Kayhty, D. J. P. Ferguson, J.
E. Heckels y E. R. Moxon, 1991. Mol Microbiol 5:
1831-1841, Holten, E. 1979. J Clin Microbiol 9:
186-188). Se obtuvieron derivados de MC58 y H44/76
con alteraciones definidas en el LPS inactivando los genes
galE (Jennings, M. P., P. van der Ley, K. E. Wilks, D. J.
Maskell, J. T. Poolman y E. R. Moxon. 1993. Mol Microbiol 10:
361-369), lsi (Jennings, M. P., M. Bisercic,
K. L. Dunn, M. Virji, A. Martin, K. E. Wilks, J. C. Richards y E.
R. Moxon. 1995. Microb Pathog 19: 391-407), lgtA,
lgtB (Jennings, M. P., D. W Hood, I. R. Peak, M. Virji y E. R.
Moxon. 1995. Mol Microbiol 18: 729-740),
rfaC (Stoiljkovic, I., V. Hwa, J. Larson, L. Lin, M. So y X.
Nassif. 1997. FEMS Microbiol Lett 151: 41-49),
icsA e icsB (van der Ley, P., M. Kramer, A. Martin, J.
C. Richards y J. T. Poolman, 1997. FEMS Microbiol Lett 146:
247-253) (tabla 1). Otras cepas de tipo natural de
Neisseria meningitidis usadas en el estudio procedieron de
tres colecciones: 1) representativas de los inmunotipos
L1-L12 (Poolman, J. T., C. T. P. Hopman y H. C.
Zanen. 1982. FEMS Microbiol Lett 13: 339-348); 2)
colección global de 34 cepas representativas del grupo B de
Neisseria meningitidis (Seiler, A., R. Reinhardt, J. Sakari,
D. A. Caugant y M. Achtman. 1996. Mol Microbiol 19:
841-856); 3) colección global de 100 cepas de 107
cepas representativas de Neisseria meningitidis de todos los
serogrupos principales (A, B, C, W, X, Y, Z) (Maiden, M. C. J., J.
A. Bygraves, E. Feil, G. Morelli, J. E. Russell, R. Urwin, Q.
Zhang, J. Zhou, K. Zurth, D. A. Caugant, I. M. Feavers, M. Achtman y
G. B. Spratt. 1998. PNAS 95: 3140-3145).
Se construyeron mutantes galE y
deficientes en cápsula en seis cepas del grupo B de Neisseria
meningitidis obtenidas de la colección tal como se describe en
(Seiler, A., et al., 1996. Mol Microbiol 19:
841-856) (tabla 1). Otras cepas relacionadas de
Neisseria estudiadas incluyeron 10 cepas de Neisseria
gonorrhoeae y cepas comensales de lactamica (8 cepas),
polysaccharea (1 cepa), mucosa (1 cepa),
cinerea (1 cepa), elongata (1 cepa), sicca (1
cepa) y subflava (1 cepa). Otros microorganismos Gram
negativos incluyeron: Haemophilus influenzae tipo b (7
cepas), Haemophilus somnus (1 cepa), Haemophilus
influenzae no tipificable (8 cepas), Escherichia coli (1
cepa) y Salmonella typhimurium (1 cepa) y sus mutantes
isogénicos de LPS (rfaC, rfaP, rfa1) (tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer todas las cepas durante la
noche a 37ºC en base de medio BHI convencional (Oxoid) en una
atmósfera de CO_{2} al 5%.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la accesibilidad de los epítopos
del núcleo interno de Neisseria meningitidis hecha crecer
in vivo, se usó el modelo de embrión de pollo (Buddingh, G.
J. y A. Polk. 1937. Science 86: 20-21, Buddingh, G.
J. y A. Polk. 1939. J Exp Med 70: 485-498, Schroten,
H., M. Deadman y E. R. Moxon. 1995. Pediar. Grenzgeb. 34:
319-324). Se modificó el procedimiento usando un
inóculo de 10^{4} y 10^{5} microorganismos de Neisseria
meningitidis en un volumen final de 0,1 ml, para infectar el
líquido corioalantoideo de huevos de pollo Pure Sussex de 10 días
de edad (obtenidos de la Poultry Unit, Institute of Animal Health,
Compton, Berks). Tras una incubación durante la noche (37ºC), se
extrajo el líquido alantoideo (aproximadamente 3-5
ml) de los huevos y se recuperaron las bacterias tras
centrifugación a 350 x g durante 15 minutos. Se lavaron los
microorganismos en solución salina tamponada con fosfato estéril
(PBS) y se almacenaron en solución de Greaves (5% de BSA, 5% de
glutamato de sodio, 10% de glicerol) a -70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron las muestras de LPS de un
crecimiento durante la noche de Neisseria meningitidis
sembrada en placa en 5 placas con BHI de la que los microorganismos
se rasparon y se suspendieron en 30 ml de fenol al 0,05% en PBS y
se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Alternativamente, se prepararon cultivos por lotes en fermentadores
usando bacterias de un crecimiento durante la noche (6 placas) en 50
ml de caldo Difco Bacto Todd Hewitt (Difco) para inocular 2,5 l del
mismo medio. Para la inserción de las cepas mutantes, el medio
contenía 50 \mug/ml de kanamicina. Tras la incubación a 37ºC
durante 6-8 h se inoculó el cultivo en 60 l de
caldo Bacto Todd Hewitt en un fermentador New Brunswick Scientific
1F-75. Tras el crecimiento durante la noche (17 h a
37ºC), se inactivó el cultivo mediante la adición de fenol (1%) y se
enfrío hasta 15ºC y se recogieron las bacterias mediante
centrifugación (13.000 g durante 20 min.) (Wakarchuk, W., et
al., 1996. J Biol. Chem. 271: 19166-19173). En
cualquier caso, se extrajo el LPS bruto del sedimento bacteriano
usando el procedimiento convencional de fenol-agua
en caliente (Westphal, O. y J. K. Jann. 1965. Meth. Carbohydr.
Chem. 5:83-91) y se purificó a partir de la fase
acuosa mediante ultracentrifugación repetida (105.000 x g. 4ºC, 2 x
5 h) (Masoud, H., E. R. Moxon, A. Martin, D. Krajcarski y J. C.
Richards. 1997. biochemistry 36: 2091-2103).
\vskip1.000000\baselineskip
Se hirvieron cantidades equivalentes de lisados
de células completas de cepas de Neisseria meningitidis o
LPS purificado en tampón de disociación y se separaron en geles de
tricina convencionales (30 mA durante 18 h) (Lesse, A. J., A. A.
Campagnari, W. E. Bittner y M. A. Apicella. 1990. J Immunol Methods
126: 109-117). Se fijaron los geles y se tiñeron
con plata según las instrucciones de los fabricantes (BioRad). Para
determinar la presencia de ácido siálico, se incubaron los lisados
de células completas con 2,5 \mul de neuraminidasa a 37ºC durante
18-20 h (4 U/ml Boehringer 1585886) y luego con 5
\mul de proteinasa K a 60ºC durante 2-3 h para
eliminar las proteínas (Boehringer 1373196) antes de la separación
en geles de tricina (16,5%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió a O-desacilación el
LPS procedente de cepas negativas para AcM B5 de tipo natural y
mutantes galE, cap- con hidrazina anhidra tal como se
describió anteriormente (Masoud, H., E. R. Moxon, A. Martin, D.
Krajcarski y J. C. Richards. 1997. Biochemistry 36:
2091-2103). Se analizó el LPS
O-desacilado mediante espectrometría de masas por
electrospray (EM-ES) en el modo de iones negativos
en un espectrómetro de masas triple cuádruple VG Quattro (Fisons
Instruments) o API 300 (Perkin-Elmer/Sciex). Se
disolvieron las muestras en agua que se diluyó en un 50% con
acetonitrilo:agua:metanol:1% de amoniaco (4:4:1:1) y se mejoró la
mezcla mediante infusión directa a 4 \mul/min. Se preparó LPS
desacilado y desfosforilado (L8 odA HF) según el procedimiento
siguiente. Se trató el LPS (160 mg) con hidrazina anhidra (15 ml)
con agitación a 37ºC durante 30 minutos. Se enfrió la reacción
(0ºC), se añadió acetona fría (-70ºC, 50 ml) gradualmente para
destruir la hidrazina en exceso y se obtuvo LPS
O-desacilado precipitado (L8 odA) mediante
centrifugación. Se lavó L8 odA dos veces con acetona fría y se
redisolvió en agua y se liofilizó. Se confirmó la estructura de L8
odA mediante EM-ES de iones negativos antes de
continuar con la desfosforilación. Se desfosforiló L8 odA mediante
el tratamiento con fluoruro de hidrógeno acuoso al 48% (10 ml) a
0ºC durante 48 h. Se dializó el producto frente a agua y se
liofilizó la muestra de LPS O-desacilado,
desfosforilado (L8 odA HF) (50 mg). Se confirmó la pérdida de
fosfato mediante EM-ES.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la modelización molecular de los
epítopos de LPS tal como se describió anteriormente por Brisson, J.
R., S. Uhrinova, R. J. Woods, M. van der Zwan, H. C. Jarrell, L. C.
Paoletti, D. L. Kasper y H. Jennings. 1997. Biochemistry 36:
3278-3292). Se presentó la geometría de partida para
todos los azúcares para un refinamiento completo de longitudes de
enlaces, valencia y ángulos de torsión mediante el uso del programa
de mecánica molecular MM3(92) (QPCE). Se realizaron todos
los cálculos utilizando las coordenadas minimizadas para el
metilglicósido. Se generaron los grupos de fósforo a partir de
coordenadas convencionales (Alchemy, software de Tripos) y
conformaciones de mínima energía encontradas en estructuras
cristalinas. Se realizaron los cálculos usando el procedimiento
Metropolis Monte Carlo (MMC). Se trataron todos los grupos colgantes
como invariables excepto los grupos de fósforo que se permitió que
rotasen alrededor de los enlaces Cx-Ox y
Ox-P. Se tomaron los ángulos de partida para el
oligosacárido de los conformadores de mínima energía calculados para
cada unidad de disacárido presente en la molécula. Se llevaron a
cabo cálculos de MMC de 24 dimensiones de los hexasacáridos con o
sin grupos de PEtn unidos con 5000 movimientos de macro. Se
generaron los gráficos usando el software Schakal (Egbert Keller,
Kristallographisches Institut der Universität, Freibury,
Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un anticuerpo policlonal de conejo
específico para el polisacárido capsular de Neisseria
meningitidis del grupo B obtenido inmunizando un conejo seis
veces por vía subcutánea con lisados de MC58 a intervalos de 2
semanas. Las inmunizaciones primera y segunda contenían adyuvante
completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund,
respectivamente. Se obtuvo suero del sangrado 6.
Para aumentar la especificidad del polisacárido
capsular del grupo B, se incubó anticuerpo policlonal de conejo (1
ml) durante la noche a 4ºC con MC58 deficiente en cápsula fijado con
etanol (5x10^{9} microorg./ml). Este anticuerpo policlonal
preadsorbido no reaccionó con un mutante deficiente en cápsula de
MC58 usando microscopía de inmunofluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon anticuerpos monoclonales murinos
frente a LPS de galE de H44/76 mediante procedimientos
convencionales. En resumen, se inmunizaron ratones Balb/c de
6-8 semanas de edad tres veces por vía
intraperitoneal seguido por una inyección intravenosa con células
completas de mutante galE inactivadas con formalina. Se
prepararon hibridomas mediante la fusión de células del bazo con
SP2/O-Ag 14 (Shulman, M., C. D. Wilde y G. Kohler.
1978. Nature 276: 269-270) tal como se describe
(Carlin, N. I., M. A. Gidney, A. A. Lindberg y D. R. Bundle. 1986.
J Immunol 137: 2361-2366). Se seleccionaron
supuestos hibridomas que secretaban anticuerpos específicos para
galE mediante ELISA empleando LPS purificado a partir de L3 y
su mutante galE y L2. Se determinaron la clase, la subclase
y la cadena ligera de la Ig mediante el uso de un kit de
isotipificación (Amersham Canada Ltd, Oakville, Ontario). Se
expandieron clones en ratones Balb/c tras el tratamiento con
pristano para generar líquido ascítico. Se recogió el sobrenadante
del cultivo gastado tras el cultivo in vitro de líneas
celulares de hibridoma. Se llevaron a cabo pruebas adicionales de
AcM frente a galE seleccionando contra LPS purificado de las
cepas de mutante IgtA, IgtB e IgtE de L3 de
Neisseria meningitidis (figura 1), y los mutantes Ra
y Re de Salmonella typhimurium. Se seleccionó uno de
los AcM, AcM B5 (IgG_{3}), para un estudio más detallado.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar los inmunotipos de estudios de
cepas de Neisseria meningitidis, especialmente L2 y
L4-L6, se usaron los siguientes AcM murinos en
transferencias puntuales y ELISA de células completas: MN42F12.32
(L2, 5), MN4A8B2 (L3, 7, 9), MN4C1B (L4, 6, 9), MN40G11.7 (L6),
MN3A8C (L5) (Scholten, R. J., et al., J Med Microbiol 41:
236-243).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon células endoteliales de vena
umbilical humana (HUVEC) en cultivo tal como se describió
anteriormente (Virji, M., et al., 1991. Microb Pathog 10:
231-245) y se infectaron con cepas de Neisseria
meningitidis durante 3 h a 37ºC. Se hicieron crecer cepas de
Neisseria meningitidis in vitro o in vivo usando el
modelo de embrión de pollo (tal como se describió anteriormente). Se
determinó la accesibilidad de los epítopos del LPS del núcleo
interno de Neisseria meningitidis en células completas a AcM
B5 específico usando microscopía confocal y de inmunofluorescencia.
Se infectaron cubreobjetos de vidrio revestidos de gelatina con
HUVEC con Neisseria meningitidis de tipo natural, tal como
se describió anteriormente (Virji, M., et al., 1991. Mol
Microbiol 5: 1831-1841), excepto en que las
bacterias se fijaron con el 0,5% de paraformaldehído durante 20
min. en lugar de con metanol. Para los estudios de accesibilidad, se
lavaron los cubreobjetos con PBS, se bloquearon en BSA al 3%-PBS y
se incubaron con sobrenadante de cultivo de AcM B5 y anticuerpo
policlonal anti-capsular de conejo preadsorbido. Se
detectó la unión del anticuerpo a las cepas de Neisseria
meningitidis de tipo natural mediante IgG
anti-ratón - rodamina (TRITC) (Dako) e IgG
anti-conejo - fluoresceína (FITC) (Sigma). Se
tiñeron HUVEC usando diaminofenilamina DAPI (1 \mug/ml) (Sigma).
Se observaron los cubreobjetos montados para detectar la
inmunofluorescencia usando filtros apropiados (Microscopio Zeiss con
Fluorograbber, Adobe Photoshop o microscopio confocal (Nikon
Model).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un ELISA indirecto en fase sólida
empleando LPS purificado para determinar las especificidades de
unión de los AcM. Se revistieron placas Nunc maxisorp durante la
noche con 1,0 \mug/pocillo de LPS purificado derivado del tipo
natural y de mutantes. Se diluyó el LPS (10 \mug/ml) en tampón
carbonato 0,05 M que contenía MgCl_{2} 0,02 M, pH 9,8. Se
bloquearon sitios de unión no específicos durante 1 h con BSA al
1%-PBS (Sigma) y se lavaron tres veces con PBS Tween 20 (0,05% v/v)
(PBS-T). Se incubaron las placas durante 1 h con
sobrenadante de cultivo de AcM B5 y se lavaron tres veces en
PBS-T. Se detectó el anticuerpo primario usando IgG
anti-ratón - fosfatasa alcalina (Sigma: Cedarlane
Laboratories Ltd.) se incubó durante 1 h, se lavó tres veces en
PBS-T y se detectó usando el sistema de sustrato de
fosfato de p-nitrofenilo AP (Sigma: Kirkegaard &
Perry Laboratories). Se detuvo la reacción tras 1 h con 50 \mul
de NaOH 3 M y se determinó la absorbancia a DO
A_{405-410 \ nm} (lector de placas de EIA
Dynatech).
Dynatech).
\vskip1.000000\baselineskip
Para los estudios de ELISA de inhibición, se
incubó AcM B5 con muestras de LPS purificado antes de la adición a
placas revestidas de LPS de galE de L3 y se sometió a ensayo
tal como se describió anteriormente.
\newpage
Se llevó a cabo ELISA de células completas (WC)
usando lisados inactivados por calor de microorganismos de
Neisseria meningitidis tal como se describió anteriormente
(Abdillahi, H. y J. T. Poolman. 1988. J Med Microbiol
26:177-180). Se revistieron placas de 96 pocillos
Nunc Maxisorp con 100 \mul de suspensión bacteriana (DO de 0,1 a
A_{820 \ nm}) durante la noche a 37ºC, se bloquearon con BSA
1%-PBS y se siguió un protocolo idéntico que para ELISA de LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aplicaron suspensiones bacterianas preparadas
como antes (2 \mul) a un filtro de nitrocelulosa (45 micrómetros,
Schleicher y Schueller) y se dejaron secar al aire. Se siguió el
mismo procedimiento que el descrito para ELISA de WC, excepto en
que el sustrato de detección fue
5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato/nitro-azul
de tetrazolio (BCIP/NBT) (2 mg/ml; Sigma). Se detuvo la reacción de
color tras 30 min. mediante varios lavados con PBS y se secaron al
aire las transferencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar el potencial de las estructuras
del LPS del núcleo interno de Neisseria meningitidis como
vacunas, se ha estudiado la reactividad de un anticuerpo monoclonal
(AcM) murino de isotipo IgG_{3}, denominado B5, producido contra
el mutante galE de inmunotipo L3 de la cepa H44/76 de
Neisseria meningitidis. El AcM B5 fue uno de los siete
anticuerpos monoclonales frente al núcleo interno de LPS producido
contra galE de inmunotipo L3 de Neisseria
meningitidis mediante procedimientos inmunológicos
convencionales (véase Procedimientos). Las pruebas de ELISA
preliminares demostraron reacción cruzada de B5 con LPS de la cepa
original de L3 y con los mutantes galE (/gtE),
lgtA e lgtB, pero no produjo reacción cruzada con LPS
de Ra o Re de Salmonella typhimurium.
Con el fin de determinar el epítopo del núcleo
interno específico reconocido por AcM B5, se examinaron diversas
cepas de Neisseria meningitidis de estructura conocida en
ELISA para determinar reactividad cruzada (figura 2). El hallazgo
más significativo de este análisis fue que el LPS del inmunotipo L4
de Neisseria meningitidis no se reconoció por AcM B5. La
única diferencia estructural entre los inmunotipos L4 y L3 (que se
reconoce por el AcM B5) es la posición de unión del grupo de PEtn
(figura 3). En el LPS de inmunotipo L3, la PEtn está unida en la
posición 3 de HepII, mientras que en el LPS de inmunotipo L4, la
PEtn está unida en la posición 6 ó 7 de HepII (figura 3). Además,
el LPS del inmunotipo L2 y su mutante galE (en los que el
grupo de PEtn está unido en la posición 6 y está presente un
residuo de glucosa en la posición 3 de HepII) no se reconocen por
el AcM B5. El inmunotipo L5, que no tiene PEtn en el núcleo interno,
no se reconoce por B5, mientras que se reconocen el inmunotipo L8 y
su mutante galE que tienen PEtn en la posición 3 de HepII.
Estos resultados sugieren que el AcM B5 reconoce específicamente
PEtn cuando está unida en la posición 3 de HepII.
Con el fin de demostrar la inclusión esencial de
PEtn en el epítopo reconocido por el AcM B5, se desfosforiló el LPS
O-desacilado (odA) de inmunotipo L8 (HF al 48%, 4ºC,
48 h) (figura 3). Se confirmó la ausencia de PEtn tras la
desfosforilación mediante análisis de EM-ES. Tal
como se indica en la figura 4, la desfosforilación del LPS de L8
odA suprimió la reactividad con AcM B5. Para caracterizar
adicionalmente el epítopo reconocido por el AcM B5, se
seleccionaron varios mutantes genéticos definidos estructuralmente
del inmunotipo L3 para determinar la reactividad cruzada (figura
4). El LPS altamente truncado de la cepa de mutante icsB sólo
se reconoció débilmente, mientras que el LPS de la cepa mutante
icsA no se reconoció por el AcM B5. Estos resultados
sugieren que la presencia de glucosa en el residuo de heptosa
proximal (HepI) no es absolutamente necesaria para la unión por B5
pero se requiere para el reconocimiento óptimo (figura 1). Además,
el AcM B5 no se une al LPS en el que están ausentes tanto el
residuo de glucosa en la cadena \alpha, HepI, como el residuo de
N-acetilglucosamina en la cadena \beta, HepII.
Esto sugiere que se requiere la presencia de
N-acetilglucosamina para presentar el residuo de
PEtn en la conformación correcta para su unión por el AcM B5.
También se examinaron las modificaciones genéticas que producen
glicoformas de LPS gravemente truncados para determinar su
reactividad con el AcM B5. El LPS de lsi de inmunotipo L3
que tiene un trisacárido de
Hep-Kdo-Kdo unido al lípido A, y el
PB4 de L3 que sólo contiene el disacárido Kdo y el lípido A no se
reconocieron por el AcM B5 (figura 4). Los estudios de ELISA de
inhibición (datos no mostrados) estuvieron de acuerdo con este
resultado, confirmando por tanto la especificidad del AcM B5 para
la molécula de PEtn unida en la posición 3 de HepII.
Para demostrar la capacidad del AcM B5 para
reconocer este epítopo del núcleo interno en las cepas encapsuladas,
se concibió un ensayo en el que se estudiaron aislados naturales de
Neisseria meningitidis cuando se hicieron crecer y llegaron
a ser adherentes a células cultivadas tisulares (HUVEC).
Inicialmente, se desarrolló esta metodología usando la cepa MC58
completamente encapsulada. Las ventajas de usar el ensayo de HUVEC
fueron que proporcionaron una monocapa de células endoteliales a la
que podrían adherirse las bacterias y que proporcionaron un entorno
biológicamente relevante. Los intentos anteriores usando
Neisseria meningitidis directamente adherente a cubreobjetos
revestidos de gelatina o Matrigel dieron como resultado números
bajos de bacterias adherentes tras lavados repetidos y alta tinción
de fondo no específica.
\newpage
Se detectaron los anticuerpos primarios, el AcM
B5 y un anticuerpo policlonal anti-capsular mediante
anticuerpo anti-ratón - TRITC y anticuerpo
anti-conejo - FITC, respectivamente. Esto demostró
que un epítopo de LPS del núcleo interno de la cepa completamente
encapsulada (MC58) era accesible al AcM B5 (figura 5a). La
microscopía confocal demostró que el AcM B5 y los anticuerpos
anti-capsulares se localizaban conjuntamente. Además
de esta demostración in vitro de la accesibilidad del AcM B5
al LPS del núcleo interno, también se investigó el crecimiento de
microorganismos in vivo usando el modelo de embrión de pollo.
Se inoculó la cepa MC58 (10^{4} microorg./ml) en líquido
corioalantoideo de embriones de pollo de 10 días de edad y se
recogió al día siguiente para proporcionar microorganismos ex
vivo. Los resultados de la microscopía confocal fueron
idénticos a los observados in vitro, es decir el AcM B5 y los
anticuerpos anti-capsulares se localizaban
conjuntamente (figura 5b). Esto demostró que los epítopos del LPS
del núcleo interno también eran accesibles in vivo en
Neisseria meningitidis de tipo natural completamente
encapsulada.
La observación de la tinción doble del epítopo
de LPS del núcleo interno en presencia de cápsula es clave para el
concepto de este enfoque y por tanto, se usaron varios controles
para confirmar el hallazgo de validez. Estos incluyeron: (i)
tinción doble de una cepa negativa para AcM B5, por ejemplo de
inmunotipo L4, con AcM B5 y anticuerpo
anti-capsular. Esto dio como resultado ausencia de
reactividad de AcM B5 en filtro de rodamina pero reactividad
positiva con el anticuerpo anti-capsular. Esto
descarta un efecto de paso de banda durante el registro de las
imágenes; (ii) tinción simple de cepas encapsuladas positivas para
AcM B5 o bien con AcM B5 sólo o bien con anticuerpo
anti-capsular solo seguido por tinción con rodamina
o FITC, respectivamente. Cuando se observó a una longitud de onda
apropiada, no hubo reactividad cruzada durante la tinción
inmunofluorescente ni ningún efecto de paso de banda; (iii) la
tinción doble de una cepa positiva o negativa para AcM B5 sin
cápsula con AcM B5 y anticuerpo anti-capsular no dio
como resultado tinción capsular sino reactividad o bien positiva o
bien negativa con AcM B5 cuando se observó en el filtro de rodamina.
Esto excluyó la reactividad cruzada durante la tinción o el efecto
de paso de banda dando como resultado una tinción del núcleo interno
artefactual.
Para estudiar el grado de reactividad del AcM B5
con otras cepas de Neisseria meningitidis, se investigaron
tres colecciones.
- i)
- 12 cepas representativas de los inmunotipos L1-L12 de LPS
- ii)
- 34 cepas del grupo B seleccionadas para representar aislados genéticamente diversos de muchos países diferentes obtenidos entre los años 1940-1988 (Seiler, A., R. Reinhardt, J. Sakari, D. A. Caugant y M. Achtman. 1996. Mol Microbiol 19: 841-856)
- iii)
- una colección global de 107 cepas genéticamente diversas que representan todos los serogrupos capsulares, también obtenida de diferentes países desde 1940-1994 (Maiden, M. C. J., J. A. Bygraves, E. Feil, G. Morelli, J. E. Russell, R. Urwin, Q. Zhang, J. Zhou, K. Zurth, D. A. Caugant, I. M. Feavers, M. Achtman y G. B. Spratt. 1998. PNAS 95: 3140-3145).
De los 12 inmunotipos, el AcM B5 reconoció el
LPS de cepas en las que el oligosacárido del núcleo interno tiene
una PEtn unida a la posición 3 de HepII (tabla 2 y figura 1). Por
tanto, los inmunotipos L2, L4, L6 no reaccionaron con el AcM B5,
mientras que los inmunotipos L1, L3, L7-L12 se
reconocieron por el AcM B5. Esto confirmó que es necesaria la
presencia de PEtn en la posición 3 de la HepII para conferir
reactividad con el AcM B5 (figura 3).
Para investigar adicionalmente la reactividad
del AcM B5 con otras cepas del grupo B, se estudió una colección de
cepas genéticamente diversas (Seiler, A., R. Reinhardt, J. Sakari,
D. A. Caugant y M. Achtman. 1996. Mol Microbiol 19:
841-856). Se detectó reactividad con el AcM B5 en
26/34 (76%) cepas del grupo B de Neisseria meningitidis
sometidas a prueba. Esto incluyó cepas representativas de
ET-5, ET-37, A4 y linaje 3. Esto
representa la colección disponible más completa de linajes
hiperinvasivos de cepas del grupo B de Neisseria
meningitidis.
Se obtuvieron mutantes deficientes en cápsula y
galE de seis de ocho de las cepas del grupo B negativas para
AcM B5 (las transformaciones no fueron satisfactorias en las otras
dos cepas). Éstas también fueron negativas con el AcM B5 usando
transferencia puntual, ELISA de células completas o
inmunofluorescencia, con la excepción de un mutante BZ157
galE cap- que tenía reactividad de bajo nivel tanto mediante
inmunofluorescencia como mediante transferencia puntual. Las cepas
con AcM B5 se caracterizaron usando una batería de AcM de
inmunotipificación. Se determinó el inmunotipo de las ocho cepas
negativas para AcM B5 usando combinaciones de los AcM apropiados
(véase Procedimientos) y transferencias puntuales de lisados de WC
(obtenidos de Peter van der Ley) (tabla 3). Además, se obtuvo la
huella estructural de la región del núcleo interno de las cepas
negativas para AcM B5 mediante EM-ES en LPS
O-desacilado de cinco de los mutantes galE
deficientes en cápsula respectivos (1000, NGE30, EG327, BZ157,
NGH38) (tabla 4). Las cepas 1000, NGE30, EG327 no eran típicas
mediante AcM y el LPS de estas cepas carecía de PEtn en HepII del
núcleo interno. BZ157, que correspondía al inmunotipo L2 mediante
los AcM contenía PEtn en el núcleo interno, y por analogía a L2 en
la posición 6/7 de HepII (tabla 3). NGH38 era el inmunotipo L2, L5
y se observó que era análogo a L2 mediante análisis estructural.
Aquellas cepas no tipificables no reaccionaron con los AcM que
reconocen L3, 7, 9, L6, L2, 5, L4, 6, 9. Sin embargo, 15/17 cepas
de Neisseria meningitidis negativas para AcM B5 (todos los
serogrupos) fueron positivas para L2, 5 y toda las cepas positivas
para AcM B5 fueron positivas para L3, 7, 9. No se observó ninguna
reacción con ningún AcM de inmunotipificación con 8/32 cepas
negativas para AcM B5 y 24/68 cepas positivas para AcM B5.
Para determinar si el grado de sialilación del
LPS era un factor en la capacidad del AcM B5 para reconocer su
epítopo del núcleo interno, se examinaron cepas negativas para AcM
B5 mediante geles de LPS. La reactividad del AcM B5 no se veía
afectada variando el estado de sialilación a través de la exposición
a neuraminidasa tal como se describe en los procedimientos (figura
6). Además, se encontró que la cepa MC58, con la que el AcM B5
reaccionaba fuertemente, estaba altamente sialilada (figura 6) y
esto se confirmó mediante EM-ES de LPS
O-desacilado purificado (datos no mostrados). Por
tanto, estos datos no apoyan una contribución de la sialilación a
la falta de reactividad del AcM B5.
Con respecto a las otras especies de
Neisseria, el AcM B5 reconocía también el LPS del núcleo
interno de cinco cepas de Neisseria gonorrhoeae (F62, MS11,
FA19, 179008, 150002) (dos eran negativas) y (al menos) dos cepas
de Neisseria lactamica (L19, L22). Sin embargo, el AcM B5 no
reaccionaba con una cepa de cada una de Neisseria
polysaccharea (M7), Neisseria mucosa (F1),
Neisseria cinerea (Griffiss, J. M., J. P. O'Brien, R.
Yamensaki, G. D. Williams, P. A. Rice y H. Schneider. 1987. Infect
Immun 55: 1792-1800), Neisseria
elongata (Q29), Neisseria sicca (Q39) y
Neisseria subflava (U37). Además, el AcM B5 no
reaccionaba con Escherichia coli (DH5 alfa), Salmonella
typhimurium (LT2) o sus mutantes isogénicos de LPS
(rfaC, rfaI, rfaP).
Finalmente, se investigó la reactividad del AcM
B5 con 100 cepas que incluían representantes de los serogrupos A,
B, C, W, X, Y y Z (Maiden, M. C. J., et al., 1998. PNAS 95:
3140-3145). De estas cepas, el 70% eran positivas
para AcM B5. La agrupación según la relación genética era evidente.
Por ejemplo, ninguna de las cepas negativas para AcM B5 estaba en
el complejo ET5. Entre las cepas del grupo A, las cepas positivas y
negativas para AcM B5 entraron también en distintas agrupaciones.
Por ejemplo, los linajes I-III y el linaje A4 eran
positivos y el linaje IV-I era negativo. Esta
colección, junto con la descrita en (Seiler, A., et al.,
1996. Mol Microbiol 19: 841-856) representa el
conjunto más completo disponible para linajes hiperinvasivos
conocidos en todos los serogrupos principales de cepas de
Neisseria meningitidis.
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Los requisitos previos para cualquier vacuna
candidata del grupo B de Neisseria meningitidis serían que
contiene un(os) epítopo(s) altamente conservados que
se encuentra(n) en todas las cepas del grupo B y es/son
accesibles a anticuerpos en presencia de la cápsula. Este enfoque ha
combinado genética, análisis estructural e inmunobiología para
definir epítopos candidatos en el LPS del núcleo interno del grupo B
del grupo B de Neisseria meningitidis. Este estudio usa AcM
B5 murino, isotipo IgG3, que se produjo frente a un mutante
galE de inmunotipo L3 definido genéticamente con el fin de
dirigirse específicamente a los epítopos de LPS del núcleo interno.
El/los epítopo(s) reconocido(s) por el AcM B5 se
definió/definieron mediante estudios de reactividad cruzada con
glicoformas de LPS purificadas de estructura conocida. El AcM B5
reconocía todas las glicoformas de LPS en las que la PEtn está en
la posición 3 de HepII (inmunotipos L1, L3, L7, L8 y L9) y no
reaccionaba con inmunotipos en los que PEtn está en la posición 6 ó
7 (L2, L4 y L6) o está ausente de HepII (L5) (figura 1). El AcM B5
reaccionaba con el 70% de las cepas de Neisseria meningitidis
sometidas a prueba a partir de los dos conjuntos más completos de
cepas de Neisseria meningitidis disponibles en todo el mundo
(Seiler, A., et al., 1996. Mol Microbiol 19:
841-856, 35). De estas cepas, el 76% de las cepas
del grupo B de Neisseria meningitidis sometidas a prueba eran
positivas con AcM B5 y el 70% de una colección que incluía todos
los serogrupos de Neisseria meningitidis sometidos a prueba
era positivo con AcM B5. Por tanto, puede preverse que una vacuna
que contiene un número limitado de glicoformas, representando todas
las posibles posiciones de PEtn (ninguna, 3 y 6/7) en HepII en el
núcleo interno, cubriría el 100% de las cepas del grupo B de
Neisseria meningitidis.
Las estructuras de LPS de cepas negativas para
AcM B5 se confirmaron mediante análisis estructural. Se reconocieron
dos variantes estructurales. Una variante sin PEtn en el LPS del
núcleo interno (por ejemplo NGE30, EG327, 1000); y la otra, con un
grupo PEtn de HepII (por ejemplo BZ157, NGH38) en la posición 6 ó 7
en lugar de en la posición 3.
Con vistas a desarrollar epítopos de LPS del
núcleo interno como candidatos de vacuna, es significativo que no
había ningún efecto de la cápsula sobre la accesibilidad al AcM B5,
tal como se muestra mediante la localización conjunta del
anticuerpo anti-cápsula y el AcM B5 en
microorganismos de tipo natural (MC58) hechos crecer in
vitro e in vivo mediante microscopía confocal (figuras 5a
y b). Ni la presencia ni la ausencia de ácido siálico tuvo un
efecto puesto que las cepas tanto positivas como negativas para AcM
B5 tenían estados de alta sialilación tal como se muestra mediante
geles de tricina (figura 6) y se confirma mediante
EM-ES (datos no mostrados).
En este estudio no hubo ninguna evidencia de la
variación de fase en las cepas positivas o negativas para AcM B5,
con la excepción de una cepa (BZ157) que tenía un nivel muy bajo de
cepas positivas para AcM B5 en el original y el mutante galE
(0,06%) (datos no mostrados). Actualmente se está investigando el
análisis estructural de LPS extraído de estas dos variantes.
Modelos de llenado de espacios tridimensionales
del LPS del núcleo interno de los inmunotipos L3 y L4 muestran que
la posición de la PEtn, posición o bien 3 o bien 6 respectivamente
(mostrada en marrón), altera la accesibilidad y la conformación de
PEtn en el epítopo del núcleo interno (figura 3). El ejemplo más
sorprendente de la importancia de PEtn para la reactividad del AcM
B5 se observó cuando se eliminaba PEtn del inmunotipo L8 (positivo
para AcM B5) mediante tratamiento con fluoruro de hidrógeno (HF) lo
que suprimía totalmente la reactividad del AcM B5.
Estudios previos con conjugados de oligosacárido
en ratones y conejos han demostrado que la PEtn es importante en la
inmunogenicidad y la actividad funcional de los anticuerpos
policlonales (Verheul, A. F., et al., 1991. Infect Immun 59:
843-851). Estos estudios identificaron dos conjuntos
de anticuerpos policlonales. Un conjunto que resulta de
oligosacáridos de L1 y L3, 7, 9 tenía PEtn en la posición 3 de
HepII, era inmunogénico, tenía actividad opsonofagocítica (OP) y
quimioluminiscencia en una reacción de explosión oxidativa, pero no
tenía actividad bactericida en suero. El otro conjunto de
anticuerpos que resulta de conjugados de L2 (posición 6 ó 7 o sin
PEtn en HepII) era escasamente inmunogénico y tenía una
quimioluminiscencia y una actividad de OP enormemente reducidas
(Verheul, A. F., A. K. Braat, J. M. Leenhouts, P. Hoogerhout, J. T.
Poolman, H. Snippe y J. Verhoef. 1991. Infect Immun 59:
843-851). Estudios futuros considerarán la seguridad
y la inmunogenicidad de conjugados de LPS del núcleo interno (PEtn
en la posición 3 de HepII y glicoformas alternativas) y la capacidad
funcional de estos anticuerpos policlonales en ensayos opsónicos y
bacterianos en suero, inicialmente en ratones y conejos. Estudios
preliminares que usan AcM B5 en un ensayo de opsonofagocitosis con
la cepa MC58 de Neisseria meningitidis y células
polimorfonucleares humanas de donante sugieren que AcM B5 es
opsónico en presencia del complemento y que la captación de
bacterias de Neisseria meningitidis está correlacionada con
una reacción de explosión oxidativa dentro del neutrófilo. El AcM
B5 no parece tener ninguna actividad bactericida en suero
significativa con la cepa MC58 de Neisseria meningitidis, sin
embargo esto no se espera en vista de su isotipo (IgG3).
Actualmente se está investigando adicionalmente la funcionalidad del
AcM B5.
En conclusión, el AcM B5 reconoce un epítopo
conservado del núcleo interno en el que la PEtn está en la posición
3 de HepII. Este epítopo estaba presente en el 76% de las cepas del
grupo B de Neisseria meningitidis y en el 70% de todos los
serogrupos de Neisseria meningitidis, y era accesible en
presencia de la cápsula. Se ha identificado un número limitado de
glicoformas alternativas que no se reconocen por el AcM B5 en las
que la PEtn está o bien ausente o bien en una posición exocíclica de
HepII. Por tanto, una vacuna que contiene un número limitado de
glicoformas podría proporcionar un 100% de cobertura de todas las
cepas del grupo B de Neisseria meningitidis.
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Representación de la estructura de
oligosacáridos de LPS meningocócicos de los inmunotipos
L1-L9. Los inmunotipos están indicados en el
extremo izquierdo. La línea de puntos vertical marca la unión entre
las estructuras del núcleo interno a la derecha y estructuras del
núcleo externo a la izquierda. El epítopo reconocido por AcM B5 se
indica en negrita (positivo para AcM B5). Los números arábigos
indican el enlace entre azúcares o amino-azúcares.
Alfa y beta indican el enlace en el carbono 1 en el extremo no
reductor del azúcar. Los genes para incorporar cada uno de los
azúcares o amino-azúcares clave en el oligosacárido
de LPS en la ruta biosintética se indican con flechas que indican
en qué parte de la ruta se requiere el producto génico. Las
abreviaturas incluyen: Kdo, ácido
2-ceto-2-desoxioctulosónico;
PEtn, fosfoetanolamina; Gal, galactosa: GLcNAc,
N-acetilglucosamina; Glc, glucosa; Hep, heptosa. El
inmunotipo L5 no tiene ninguna PEtn en la segunda heptosa. El gen
que añade la glucosa a la segunda heptosa (lgtG) es variable
con respecto a la fase.
\newpage
Reactividad cruzada de AcM B5 con inmunotipos y
mutantes seleccionados de LPS O-desacilado (odA) y
LPS de Neisseria meningitidis tal como se determina mediante
ELISA en fase sólida. Glicoformas de LPS de los inmunotipos L2
(35E) (barras en negro), L3 (H44/76) (barras en blanco), L4 (891)
(barras sombreadas con líneas diagonales), L5 (M981), L8 (M978)
(barras sombreadas con líneas horizontales), mutantes de tipo
natural y respectivos (galE, lgtA o lgtB), en
una forma nativa u O-desacilada, se aplicaron sobre
placas de ELISA (véase Procedimientos) y se determinó la
reactividad del AcM B5 mediante ELISA convencional (DO A_{410 \
nm}).
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Modelos moleculares en 3-D del
llenado de espacios de los estados de mínima energía calculados
(MMC) del oligosacárido del núcleo de mutantes galE de (a)
L3, (b) L4 y (c) L8-desfosforilado. El resto de Kdo
indicado en gris está sustituido en la posición O-5
con la unidad del núcleo interno de disacárido de heptosa (rojo),
HepI proporciona el punto a través de un residuo de glucosa (verde
oscuro) para la extensión para dar epítopos de cadena \alpha,
mientras que HepII está sustituido con residuo de
N-acetilglucosamina (verde más claro) en
O-2. PEtn (marrón) se muestra en la posición
O-3 en el inmunotipo L3 y O-6 en el
inmunotipo L4. Las versiones en color de esta y las otras figuras
para el ejemplo 1 pueden encontrarse en Plested et al., 1999
Infect. Immunity 67, 5417 - 5426.
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Reactividad cruzada de AcM B5 con LPS de L3
modificado genéticamente y LPS de L8 modificado químicamente de
Neisseria meningitidis tal como se determina mediante ELISA
en fase sólida. Se aplicaron glicoformas de LPS del inmunotipo L8
(M978) (barras sombreadas con líneas horizontales) modificado
químicamente mediante O-desacilación y tratamiento
con HF y de los mutantes (O-desacilados)
galE, icsB, icsA, lsi, PB4 del
inmunotipo L3 (H44/76) (barras en blanco) sobre placas de ELISA
(véase Procedimientos) y se determinó la reactividad del AcM B5
mediante ELISA convencional (DO_{A410 \ nm}).
\vskip1.000000\baselineskip
Microscopía confocal de inmunofluorescencia de
microorganismos de Neisseria meningitidis, cepa MC58
adherente a células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC).
(a) Marcaje con fluoresceína con anticuerpo policlonal de conejo
específico para la cápsula de Neisseria meningitidis del
grupo B. (b) Marcaje con rodamina del AcM B5, específico para LPS
de galE (ampliación x2400). Microscopía confocal de
inmunofluorescencia de micoorganismos MC58 hechos crecer in
vivo teñidos tal como se describe en Plested et al., 1999
Infect. Immunity 67, 5417-5426. (c) Anticuerpo
anti-capsular (verde). (d) AcM B5 (rojo) (ampliación
x2400).
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Geles de tricina teñidos con plata de
preparaciones de LPS (10 \mug/carril) de cepas del grupo B de
Neisseria meningitidis que no eran reactivas con el AcM B5.
Estas preparaciones de LPS o bien no se trataron (-) o se trataron
con (+) neuraminidasa para mostrar la presencia de ácido siálico: a)
cepas negativas para AcM B5: carriles 1, 2 = NGE30; carriles 3, 4 =
BZ157; carriles 5, 6 = EG328; carriles 7, 8 = 1000; carriles 9, 10
= 3906. b) Cepas negativas para AcM B5: carriles 1, 2 = EG327;
carriles 3, 4 = NGH38; carriles 5, 6 = NGH15; cepas positivas para
AcM B5: carriles 7, 8 = MC58. Presencia de ácido siálico (AcNeu)
indicada mediante ®. Esta banda se observó en
preparaciones de neuraminidasa sin tratar (-) y se eliminó en
preparaciones de neuraminidasa tratadas (+).
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El ejemplo 1 identifica un epítopo de LPS del
núcleo interno que era accesible y que se conservaba en el 70% de
una colección global de 104 cepas de Neisseria meningitidis
representativas de todos los serogrupos principales (Plested et
al., 1999, Infect. Immunity 67, 5417 - 5426). El epítopo
reconocido por AcM B5 se identificó en todos los inmunotipos de LPS
con fosfoetanolamina (PEtn) en la posición 3 de heptosa de cadena
\beta (HepII) del LPS del núcleo interno. Se llevó a cabo trabajo
adicional para identificar epítopos adicionales, con los fines
explicados en la figura 4.
En resumen:
Se desarrolló una serie de doce anticuerpos
monoclonales (AcM) murinos en el NRC, usando un procedimiento
descrito previamente (Plested et al., 1999 Infect. immunity
67, 5417 - 5426), excepto por el uso de células completas de
galE de L4 (cepa 891) de Neisseria meningitidis
fijadas con formalina. Se examinaron extensamente los doce AcM
mediante ELISA usando LPS purificado a partir de cepas de tipo
natural y mutantes de Neisseria meningitidis y se
seleccionaron tres AcM B2 (IgG2b), A4 (IgG2a) y A2 IgG2a para su
investigación adicional. Se evaluó la conservación del epítopo de
LPS del núcleo interno en Oxford usando lisados de células
completas de tipo natural de una colección global de 104 aislados de
enfermedad por Neisseria meningitidis (Maiden, M. C. J., J.
A. Bygraves, E. Feil, G. Morelli, J. E. Russell, R. Urwin, Q. Zhang,
J. Zhou, K. Zurth, D. A. Caugant, I. M. Feavers, M. Achtman y G. B.
Spratt. 1998. PNAS 95: 3140-3145). Se evaluó la
accesibilidad del epítopo de LPS del núcleo interno usando
microscopía de inmunofluorescencia con células completas de
Neisseria meningitidis fijadas con etanol de tipo natural y
mutantes adherentes a células epiteliales en monocapa (Plested
et al. 1999).
Cada uno de los tres AcM reaccionaba con LPS de
galE de L4 de Neisseria meningitidis purificado
mediante ELISA. Excepto por el AcM B2 que tenía una baja
reactividad con el LPS de L4 de Neisseria meningitidis,
ninguno de la serie de AcM frente a L4 de Neisseria
meningitidis podía reconocer LPS purificado a partir de L4 o L2
de tipo natural mediante ELISA. Ninguno de los AcM frente a L4 de
Neisseria meningitidis reconocía células completas de L2 o
L4 de tipo natural de Neisseria meningitidis mediante
microscopía de inmunofluorescencia.
AcM B2 reaccionaba con 15/32 cepas de
Neisseria meningitidis negativas para AcM B5 de Neisseria
meningitidis y 9/68 cepas de Neisseria meningitidis
positivas para AcM B5 de Neisseria meningitidis mediante
análisis de transferencia puntual de células completas. AcM 2
reaccionaba con LPS de galE de L4, de galE de tipo
natural de L4 (reactividad muy baja) pero no galE de L3, de
galE de L2 (nativo/O-desacilado (odA)), de
tipo natural de L2 (nativo-odA), de tipo natural de
L5, L6.
AcM A2 reconocía 28/32 cepas de Neisseria
meningitidis negativas para AcM B5 de Neisseria
meningitidis y 20/68 cepas de Neisseria meningitidis
positivas para AcM B5 de Neisseria meningitidis mediante
análisis de transferencia puntual de células completas. AcM A2
reaccionaba con LPS de galE de L4 (nativo/odA), de
galE de L2 (nativo) pero no de galE de L3, de
galE de L2 (odA), de tipo natural de L2 (nativo/odA), de
tipo natural de L4, L5, L6.
AcM A4 reaccionaba con 29/32 cepas de
Neisseria meningitidis negativas para AcM B5 de Neisseria
meningitidis y 24/68 cepas de Neisseria meningitidis
positivas para AcM B5 de Neisseria meningitidis mediante
análisis de transferencia puntual de lisados de células completas.
AcM A4 reaccionaba con LPS de galE de L4, de galE de
L2 (nativo/odA), pero no de galE de L3, de tipo natural de
L2, de tipo natural de L4, L5, L6, L8.
Basándose en estos resultados, se seleccionó AcM
A4 (IgG2a) para un estudio adicional ya que demostraba especificidad
tanto por LPS de galE de L4 como por LPS de galE de
L2 mediante ELISA y reconocía todas menos 3 cepas de Neisseria
meningitidis negativas para B5 de Neisseria meningitidis
(BZ232 serogrupo B; NGH38 serogrupo B; F1576 serogrupo C). Los AcM
B5 y A4 juntos podían reconocer 97/100 aislados de Neisseria
meningitidis. La microscopía de inmunofluorescencia demostró
que AcM A4 podía acceder al epítopo del núcleo interno en un
mutante galE de L4 en presencia de la cápsula.
Se han identificado epítopos del núcleo interno
de LPS con PEtn en la posición 3 de HepII (AcM B5) o no en la
posición 3 (AcM A4). Sigue habiendo 3 cepas de 100 (BZ232, NGH38 y
F1576) que no muestran reactividad ni con AcM A4 ni con AcM B5. Se
está investigando la base estructural para esta no reactividad. Una
vez que se conocen todas las glicoformas variantes del núcleo
interno, de las que se han identificado al menos 3, existirán
fundamentos para incluir epítopos, representativos de todas las
cepas de Neisseria meningitidis que provocan una enfermedad
invasiva, en una vacuna conjugada. Ésta se someterá a prueba en
principio usando estudios en animales antes proceder a ensayos en
seres humanos.
Se usaron las siguientes técnicas:
- (1)
- Se produjo AcM A4 murino (IgG2a) frente a galE (89I, inmunotipo L4) y se seleccionó basándose en la reactividad en ELISA y microscopía de inmunofluorescencia (IF) de LPS.
- (2)
- ELISA de LPS (Plested et al., 2000 J. Immunol. Meth. 237:73-84): se lavaron placas de microtitulación (Nunc) revestidas de LPS (galE) purificado (10 \mug/ml) durante la noche, se bloquearon, se incubaron con AcM durante 1 h, se lavaron y se detectaron con IgG anti-ratón - fosfatasa alcalina y p-NPP (DO_{A405 \ nm}).
- (3)
- Inmunotransferencia usando lisados de células completas de 104 cepas de Neisseria meningitidis (Plested et al., 1999 IAI 67: 5417-5426). Se detectó AcM A4 usando IgG anti-ratón - fosfatasa alcalina y BCIP/NBT.
- (4)
- Microscopía de inmunofluorescencia: tal como anteriormente (Plested et al., 1999 IAI 67:5417-5426) o Neisseria meningitidis eran adherentes a la línea celular epitelial bucal humana en cultivo (16HBE140) en lugar de a HUVEC; se fijaron, se bloquearon, se incubaron con AcM A4 y entonces se detectó anticuerpo de serogrupo B anti-capsular usando anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (TRITC o FITC).
- (5)
- Análisis estructural fino de muestras de LPS O-desacilado purificado mediante EM-ES de iones negativos y RMN (Plested et al., 1999 IAI 67:5417-5426).
Véase la figura 7.
AcM A4 accede al epítopo de LPS del núcleo
interno en el mutante galE de L4 de Neisseria
meningitidis en presencia de la cápsula (ampliación x 100).
galE de L4 de Neisseria meningitidis adherente a
células epiteliales (16HBE140) teñido con:
a. AcM A4 (anticuerpo anti-ratón
- TRITC rojo);
b. anticuerpo anti-capsular B
(anticuerpo anti-conejo - FITC verde);
c. tinción triple con AcM A4 (anticuerpo
anti-ratón - TRITC rojo), anticuerpo
anti-capsular B (anticuerpo
anti-conejo - FITC verde) y células epiteliales
teñidas con DAPI (azul).
AcM B5 accede a epítopos del LPS del núcleo
interno en MC58 de L3 de Neisseria meningitidis (ampliación
x 2400). MC58 de L3 de Neisseria meningitidis adherente a
HUVEC teñidas con d. AcM B5 (anticuerpo anti-ratón
- TRITC rojo), e. anticuerpo anti-capsular B
(anticuerpo anti-conejo - FITC verde) usando
microscopía confocal de inmunofluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Véase la figura 8.
El AcM A4 (sombreado en diagonal) y el AcM B5
(líneas horizontales) reconocen juntos todas las cepas de
Neisseria meningitidis mediante inmunotransferencia con
lisados de células completas, excepto 3 cepas (flechas negras) que
se están analizando adicionalmente. Se construyó el dendrograma de
la relación genética de las cepas de Neisseria meningitidis
de una colección global mediante un análisis de conglomerados
siguiendo tipificación de secuencias multilocus (MLST) (Maiden
et al., 1998 PNAS 95:3140-3145).
\vskip1.000000\baselineskip
Véase la figura 3.
Los detalles de la estructura de LPS fina
demuestran efectos conformacionales de PEtn sobre el epítopo
presentado. Modelos moleculares en 3-D del llenado
de espacios de (Metropolis Monte Carlo) los estados de mínima
energía calculados del LPS del núcleo de mutantes galE a.
L3; b. L4; c. L8 (desfosforilado). Kdo en gris, heptosa (Hep) en
rojo, glucosa (Glc) y glucosamina (GlcNAc) en verde claro y más
oscuro, (PEtn) en marrón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han identificado glicoformas del núcleo
interno con PEtn en la posición 3 de HepII, una posición exocíclica
de Hep II o ausente. Este estudio ha indicado que la utilización de
AcM A4 junto con AcM B5 permite que se reconozca el 97% de las
cepas meningocócicas. Estos estudios indican por tanto que el LPS
del núcleo interno puede tener potencial como vacuna de serogrupo B
de Neisseria meningitidis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha generado un anticuerpo monoclonal, AcM B5.
Este anticuerpo puede acceder a las estructuras del LPS del núcleo
interno en Neisseria meningitidis en presencia de la cápsula
y está conservado en el 70% de una colección representativa de
Neisseria meningitidis de todas las cepas y el 76% de las
cepas del serogrupo B (Plested, J. S. et al. (1999) Infect.
& Immun. 67 (10): 5417-5426).
Hasta ahora no se sabía si los anticuerpos en
una infección humana natural pueden ser específicos para el epítopo
para el AcM B5 y tienen actividad funcional.
Se ha demostrado que el AcM B5 tiene actividad
opsónica y bactericida contra el mutante galE y capacidad
para proteger de manera pasiva a las ratas lactantes frente a la
exposición al mutante galE de Neisseria meningitidis
usando un modelo in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
- (1)
- Ensayo de opsonofagocitosis (OP) (Plested et al., 2000b): En resumen, se opsonizaron el mutante galE o MC58 de Neisseria meningitidis fijado con etanol marcado con fluorescencia o perlas revestidas de LPS de galE purificado (10 \mug/ml) con el AcM B5 y se diluyó la fuente del complemento humano en tampón final durante 10 min./37ºC/500 rpm en una placa de microtitulación. Entonces se diluyeron células polimorfonucleares de sangre periférica humana (PMN) preparadas a partir de sangre heparinizada de un donante en tampón final y se añadieron a cada pocillo (1 x 10^{7} células/ml) y se incubaron durante otros 10 min./37ºC/500 rpm. Se detuvo la mezcla de reacción sobre hielo mediante la adición de 150 \mul de PBS-EDTA y se añadió a un tubo de FACS que contenía 50 \mul de azul trípano. Se mezcló la mezcla y se analizaron y 10.000 linfocitos en un FACScan y con software Cellquest. Se analizaron las PMN mediante FSC frente a los canales apropiados para determinar el % de captación de bacterias fluorescentes por los granulocitos y monocitos (% de actividad de OP).
- (2)
- El procedimiento de ensayo bactericida en suero (SB) se adaptó del protocolo de CDC excepto en que se añadió AcM B5 a diluciones de sueros reunidos humanos y 1000 ufc de la cepa de Neisseria meningitidis y el tiempo de incubación fue de 40-45 min. a 37ºC. En resumen, se hicieron crecer bacterias en agar BHI durante la noche a partir de disoluciones madre congeladas. Se midió una suspensión de bacterias en PBS-B a DO_{260} (1:50 en SDS al 1%, NaOH al 0,1%). Usando una placa de microtitulación de 96 pocillos, se añadieron 50 \mul de tampón a los pocillos en las columnas 2-7. Se añadieron 50 \mul de sueros reunidos humanos sin complemento al 80% a los pocillos de la columna 8. Se añadieron 100 \mul de los sueros reunidos al 80% a los pocillos en la columna 1. Se añadieron diluciones en serie de dos veces del anticuerpo a las columnas 1-7 (desechando los últimos 50 \mul de la columna 7). Se añadieron 50 ul de la suspensión bacteriana diluida para dar 1000 ufc en 50 \mul a los pocillos de las columnas 1-8. Se incubó la mezcla durante 40-45 minutos y se sembró en placa en agar BHI para su incubación durante la noche. Se contó el número de colonias en cada placa y se expresaron los resultados como un % de ufc/ml en el pocillo control sin complemento.
- (3)
- Modelo de protección pasiva \underbar{in \ vivo} usando el modelo de ratas lactantes Wistar de 5 días de edad. Este modelo era tal como se describe por Moe, G. R., et al., 1999. Infect. Immun. 67: 5664-5675, excepto en que se usaron dosis más altas de bacterias de Neisseria meningitidis y se usó una cepa diferente de Neisseria meningitidis. En resumen, se aleatorizaron grupos de ratas lactantes de 5 días de edad con las madres, se pesaron y se les administró un inóculo de mutante de galE de Neisseria meningitidis 1 x 10^{8} ufc/ml mezclado 1:1 o bien con (i) ausencia de anticuerpo (PBS) (ii) AcM B5 purificado por afinidad (10 \mug) (iii) AcM B5 purificado por afinidad (100 \mug) (iv) AcM 735 (anticuerpo del grupo B anti-capsular) (2 \mug). Se controlaron las ratas lactantes para detectar signos de infección y se tomaron muestras mediante sangrado de la vena de la cola a las 6 horas tras la infección. Se pesaron los animales y se tomó un sangrado terminal tras 24 h mediante punción cardiaca siguiendo una inyección de pentobarbital. Se sembraron en placa sangre pura y diluida inmediatamente sobre placas de BHI y se incubaron durante la noche. Se hizo un recuento de las placas al día siguiente para determinar la bacteriemia (ufc/ml) a las- 6 h y 24 h.
- (4)
- ELISA de LPS (Plested et al., 2000a). Se lavaron placas de microtitulación (Nunc) revestidas de LPS (galE) purificado (10 \mug/ml) durante la noche, se bloquearon y se incubaron con AcM o sueros humanos durante 1 h, se lavaron y detectaron con IgG anti-ratón o anti-ser humano - fosfatasa alcalina y p-NPP (DO _{A405 \ nm}).
- (5)
- AcM B5 purificado por afinidad. Se purificó el sobrenadante del cultivo usado del AcM B5 en una columna de proteína A-Sepharose y se eluyó con glicina pH 4,0, se neutralizó con Tris-HCl pH 9,0. Se sometieron a prueba las fracciones para detectar la reactividad en ELISA de LPS, se reunieron y se concentraron usando un filtro de Amicon. Se determinó la pureza mediante gel de SDS-PAGE y se determinó la concentración de proteína mediante DO y ensayo de proteínas.
- (6)
- Marcaje en superficie mediante FACS de bacterias de \underbar{Neisseria \ meningitidis}
- \quad
- El procedimiento se adaptó de Moe et al, (Moe, G. R., et al., 1999. Infect Immun. 67: 5664-5675) excepto en que no se incluyó azida sódica en la etapa de tampón de bloqueo (Plested et al., 2000b). Para preparar bacterias de Neisseria meningitidis marcadas (cepa MC58, galE), se hicieron crecer los microorganismos durante la noche mediante condiciones convencionales a 37ºC sobre placas de agar BHI y se suspendieron con cuidado en PBS. Se ajustó la DO_{A260 \ nm} para dar la concentración requerida, por ejemplo 5 x 10^{9} microorg./ml. Se añadieron 100 \mul de células bacterianas a cada tubo de FACS (5 x 10^{8} microorg.) y se añadió un volumen igual de sueros diluidos (1/100 AcM B5 en BSA al 1%/PBS). Se incubaron los tubos durante 2 horas a 4ºC y se centrifugaron las células durante 5 minutos a 13.000 g. Se desechó el sobrenadante y se lavaron las células con 200 \mul de BSA al 1%/PBS. Se añadieron 100 \mul de anticuerpo de cabra anti-ratón F(ab)_{2} conjugado con FITC (Sigma F2772), se diluyeron 1:100 en BSA al 1%/PBS y se incubaron los tubos durante 1 hora a 4ºC. Se centrifugaron las células a 13.000 g durante 5 minutos y se lavaron mediante la adición de 200 \mul de BSA al 1%/PBS. Se desechó el sobrenadante y se suspendieron las células en formaldehído al 1% v/v. Se transfirieron las muestras a tubos de FACScan y se analizaron en el FACS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se presentan datos sobre los tres sueros
emparejados tomados de lactantes temprano (agudos) y más tarde
(convalecientes) durante la enfermedad meningocócica invasiva (IMD)
confirmada mediante cultivo que resultaba de la infección con
aislados de Neisseria meningitidis de los inmunotipos L1, L3
(reactivos con el AcM B5) (pacientes 1 y 2) y el inmunotipo L2 (no
reactivo con el AcM B5) (paciente 3) (figura 10). Los aislados de
Neisseria meningitidis para los pacientes 1, 2, 3 eran L1 (B
nt p1.14), L3 (B 15 p1.7) y L2 (C2a p1.5) respectivamente. Los
sueros emparejados del paciente 2 infectado con una cepa de
Neisseria meningitidis que era reactiva con el AcM B5
mostraron un aumento en anticuerpos frente a LPS del núcleo interno
específicos mediante ELISA entre la infección temprana y la tardía
(p = 0,03, prueba de la t para datos emparejados de dos colas no
significativa, IC del 95%, 0,09-90,8)) (figura
10a). Los sueros del paciente 1 no mostraron ninguna diferencia
significativa en el título de anticuerpos tomado de manera temprana
y tardía durante IMD, pero el título de la muestra temprana estaba
ya a un nivel alto (figura 10a). La falta de aumento puede reflejar
un anticuerpo de afinidad más alta en la muestra del paciente
convaleciente que no se detectaría en este ELISA. Sin embargo, en
los sueros tanto del paciente 1 como del paciente 2 hubo un aumento
casi significativo en la actividad funcional en los sueros de
pacientes convalecientes en un ensayo de opsonofagocitosis con la
cepa MC58 de tipo natural de L3 y células polimorfonucleares
periféricas humanas (p = 0,06, prueba de la t para datos emparejados
de dos colas, IC del 95%, 0,90-5,96) (figura 10b)
(Plested et al., 2000b). No hubo un aumento significativo en
el título de anticuerpos específicos entre los sueros de pacientes
agudos y convalecientes tomados del paciente 3 infectado con una
cepa del inmunotipo L2 (no reactiva con el AcM B5) tal como se mide
mediante ELISA (figura 10a). No hubo actividad funcional
significativa en el ensayo de OP contra una cepa de tipo natural de
L3 con sueros tomados del paciente 3 de manera temprana o tardía
durante la IMD (figura 10b). Esto demuestra la relevancia clínica
del epítopo para el AcM B5 in vivo y que los anticuerpos
frente a LPS del núcleo interno específicos son funcionales in
vivo. Figura 10. A. Títulos de anticuerpos mediante ELISA frente
a LPS de galE de L3 (IgG) en sueros emparejados tomados de
manera temprana y tardía de niños con enfermedad
meningocócica
invasiva.
invasiva.
B. % medio de fagocitosis de MC58 de
Neisseria meningitidis con sueros emparejados tomados de
manera temprana y tardía de niños con enfermedad meningocócica
invasiva con células mononucleares de sangre periférica humana y
complemento humano.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de OP proporciona pruebas de que el
AcM B5 tiene actividad opsónica contra el mutante galE y de
tipo natural de Neisseria meningitidis y de que la actividad
de OP es específica para el epítopo para el AcM B5.
Se demostró la especificidad de la reactividad
del AcM B5 usando el MC58 de Neisseria meningitidis de tipo
natural mediante estudios de inhibición. Se incubó previamente el
AcM B5 con diferentes concentraciones de LPS purificado. Hubo una
inhibición de respuesta a la dosis en la actividad de OP con MC58 de
Neisseria meningitidis con concentraciones crecientes de LPS
de galE añadido a AcM B5 (véase la figura 11 a).
Figura 11a. % medio de fagocitosis de MC58 de
Neisseria meningitidis con el AcM B5 preincubado con
concentraciones crecientes de LPS de galE o bien (i)
reactivo con B5 o bien (ii) no reactivo con B5 con células
polimorfonucleares de sangre periférica humana y complemento
humano.
El AcM B5 tiene actividad de OP específica para
cepas reactivas con el AcM B5 usando un par isogénico de cepas de
tipo natural de Neisseria meningitidis (Neisseria
meningitidis BZ157, serogrupo B) que son reactivas con el AcM
B5 o no reactivas con el AcM B5. El AcM B5 tiene actividad opsónica
con la cepa reactiva con el AcM B5 pero no con la cepa no reactiva
con el AcM B5 (véase la figura 11b).
Figura 11b. % medio de fagocitosis del par de
cepas isogénicas de tipo natural de Neisseria meningitidis
(Neisseria meningitidis BZ157) que son o bien reactivas con
el AcM B5 o bien no reactivas con B5 con AcM B5 como la opsonina
con células mononucleares de sangre periférica humana y complemento
humano.
El ensayo de OP demostró que la captación de las
perlas revestidas de LPS de galE de L3 purificado opsonizado
con el AcM B5 era significativamente mayor que la captación con
perlas no revestidas. Esto demuestra la especificidad del AcM B5
por LPS de galE revestido sobre perlas (véase la figura
11c).
Figura 11c. % medio de fagocitosis de perlas de
látex fluorescentes revestidas o bien de LPS purificado a partir
del mutante galE de L3 (10 \mug/ml) o bien no revestidas,
en presencia del AcM B5 o de tampón final, con células
mononucleares de sangre periférica humana y complemento humano.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo SB proporciona pruebas de que el AcM
B5 tiene actividad bactericida contra el mutante galE de
Neisseria meningitidis en el ensayo SB en presencia de una
fuente de complemento humano (véase Procedimiento).
Se comparó la sensibilidad del suero del mutante
galE o bien sin anticuerpo o bien en presencia del AcM B5
(figura 12). Hubo un aumento de respuesta a la dosis en la actividad
bactericida del mutante galE mostrado mediante el % de
supervivencia en disminución, con un % de suero en disminución en
presencia del AcM B5 en comparación con ausencia de anticuerpo.
Figura 12. % medio de supervivencia del mutante galE de
Neisseria meningitidis en presencia y ausencia del AcM B5
contra diluciones en serie de dos veces de suero reunido humano
comenzando en el 40% tal como se detecta usando un ensayo
bactericida en suero (véase Procedimientos).
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el modelo de ratas lactantes de 5 días de
edad se ha demostrado que dos dosis del AcM B5 pueden reducir la
bacteriemia frente a la exposición a 1 x 10^{8} ufc/ml de mutante
galE de MC58 de Neisseria meningitidis por vía i.p.
en comparación con controles sin anticuerpos. Estos datos demuestran
la capacidad del AcM B5 para proteger de manera pasiva frente a la
exposición al mutante galE de MC58 de Neisseria
meningitidis y están correlacionados con la actividad funcional
del AcM B5 en los ensayos de OP y SB contra la misma cepa de
Neisseria meningitidis.
Figura 13. Bacteriemia en media geométrica en la
sangre de grupos de ratas lactantes de 5 días de edad 24 h tras la
infección con 1 x 10^{8} ufc/ml de mutante galE
administrado simultáneamente con cualquiera de: (i) ausencia de
anticuerpo (ii) AcM B5 (dosis de 10 \mug); (iii) AcM B5 (dosis de
100 \mug); (iv) AcM 735, un anticuerpo
anti-capsular control positivo (dosis de 2
\mug).
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestran pruebas adicionales de que AcM B5
reconoce tanto LPS de mutante galE como de tipo natural en
los siguientes estudios de unión:
\vskip1.000000\baselineskip
Se separó LPS purificado a partir de MC58 y
mutante galE de Neisseria meningitidis de tipo natural
en gel de tricina convencional y se sometió a inmunotransferencia
en nitrocelulosa mediante procedimientos convencionales. Se sondó
la inmunotransferencia con líquidos ascíticos de cultivo de AcM B5
(1:2000) durante la noche y se detectó usando IgG
anti-ratón y sustrato BCIP/NBT. La
inmunotransferencia demuestra la unión del AcM B5 a una banda de
LPS de tipo natural de mayor peso molecular y una banda de LPS de
galE de menor peso molecular en LPS de tipo natural. Esto
demuestra que el AcM B5 puede acceder y unirse al LPS de tipo
natural así como al LPS de galE truncado.
Figura 14. Inmunotransferencia de tipo Western
que muestra LPS purificado a partir de MC58 y mutante galE
de Neisseria meningitidis sondado con AcM B5 (fluido ascítico
1:2000) detectado usando IgG anti-ratón - fosfatasa
alcalina y sustrato BCIP/NBT.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comparó cuantitativamente la unión del AcM B5
a la cepa MC58 de tipo natural y al mutante galE (1 x 108
ufc/ml) usando marcaje en superficie con anticuerpo
anti-ratón - FITC y se analizó mediante FACS.
La unión relativa del AcM B5 a MC58 de
Neisseria meningitidis fue del 82,5% y al mutante galE
de Neisseria meningitidis fue del 96,9%, lo que demuestra
que, tal como se esperaba, la mayor unión era al mutante galE
pero había todavía una unión significativa a la cepa MC58 de tipo
natural.
Figura 15. Perfil de FACS que compara el marcaje
en superficie de MC58 y mutante galE de Neisseria
meningitidis vivas (5 x 108 microorg./ml) con AcM B5
(sobrenadante del cultivo 1:50) detectado usando IgG
anti-ratón (marcado con FITC).
Claims (34)
1. Una vacuna para el tratamiento de una
enfermedad producida por Neisseria patogénica, comprendiendo
la vacuna un componente inmunogénico basado en el núcleo interno de
un lipopolisacárido, LPS, de Neisseria y que puede provocar
anticuerpos funcionales contra al menos el 50% de las cepas dentro
de las especies de la Neisseria patogénica, en la que el
componente inmunogénico es un epítopo en el núcleo interno de LPS,
caracterizada por la presencia de un resto de
fosfoetanolamina unido a la posición 3 en HepII del núcleo
interno.
2. Una vacuna según la reivindicación 1, en la
que dicho componente inmunogénico puede provocar anticuerpos
funcionales contra al menos el 60% de las cepas dentro de las
especies de la Neisseria patogénica.
3. Una vacuna según la reivindicación 2, en la
que dicho componente inmunogénico puede provocar anticuerpos
funcionales contra al menos el 70% de las cepas dentro de las
especies de la Neisseria patogénica.
4. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, en la que el componente inmunogénico está libre de
lipopolisacárido del núcleo externo.
5. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, en la que la especie de la Neisseria patogénica es
Neisseria meningitidis.
6. Una vacuna según la reivindicación 5, en la
que los anticuerpos se provocan por el componente inmunogénico en
al menos el 50% de las cepas del grupo B de Neisseria
meningitidis.
7. Una vacuna según la reivindicación 5, en la
que los anticuerpos se provocan por el componente inmunogénico en
al menos el 60% de las cepas del grupo B de Neisseria
meningitidis.
8. Una vacuna según la reivindicación 5, en la
que los anticuerpos se provocan por el componente inmunogénico en
al menos el 70% de las cepas del grupo B de Neisseria
meningitidis.
9. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, en la que el componente inmunogénico comprende o está
constituido por un epítopo que es una parte o la totalidad de la
estructura del núcleo interno de un LPS de Neisseria, se
deriva de este núcleo interno o es una versión sintética del núcleo
interno.
10. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, en la que el componente inmunogénico es un epítopo en el
núcleo interno de LPS que comprende un residuo de glucosa en
HepI.
11. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, en la que el componente inmunogénico es un epítopo en el
núcleo interno de LPS que comprende una
N-acetilglucosamina en HepII del LPS del núcleo
interno.
12. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, en la que el LPS del núcleo interno está constituido por
un oligosacárido del núcleo interno unido al lípido A, con la
fórmula general tal como se muestra:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R1 es un sustituyente en
la posición 3 de HepII y es hidrógeno o
Glc-\alpha-(1, o fosfoetanolamina; R2 es un
sustituyente en la posición 6 de HepII y es hidrógeno o
fosfoetanolamina; R3 es un sustituyente en la posición 7 de HepII y
es hidrógeno o fosfoetanolamina, y R4 es acetilo o hidrógeno en la
posición 3, la posición 4 o la posición 6 del residuo de GlcNAc, o
cualquier combinación de los mismos; y en la que Glc es
D-glucopiranosa; Kdo es ácido
3-desoxi-D-mano-2-octulosónico;
Hep es L-glicero-D-mano-heptosa y GlcNAc es
2-acetamido-2-desoxi-D-glucopiranosa.
13. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, en la que el componente inmunogénico es reactivo con el
anticuerpo B5 producido por el hibridoma depositado con el número de
acceso IDAC 260900-1.
14. Una vacuna que comprende al menos dos
componentes inmunogénicos basados en el núcleo interno de un
lipopolisacárido, LPS, de Neisseria y que puede provocar
anticuerpos funcionales contra al menos el 50% de las cepas dentro
de las especies de la Neisseria patogénica, incluyendo la
vacuna un componente inmunogénico tal como se define en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Una vacuna según la reivindicación 14, en la
que dichos componentes inmunogénicos provocan anticuerpos
funcionales en al menos el 85% de las cepas dentro de las especies
de la Neisseria patogénica.
16. Una vacuna según la reivindicación 15, en la
que dichos componentes inmunogénicos provocan anticuerpos
funcionales en al menos el 95% de las cepas dentro de las especies
de la Neisseria patogénica.
17. Una vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, en la que un componente inmunogénico es
reactivo con el anticuerpo A4 producido por el hibridoma depositado
con el número de acceso IDAC 260900-2.
18. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, en la que el elemento inmunogénico de la vacuna es un
epítopo accesible en la bacteria en presencia de cápsula
bacteriana.
19. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, que comprende uno o más componentes inmunogénicos que
pueden estimular anticuerpos que son opsónicos.
20. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior para el tratamiento de Neisseria meningitidis.
21. Una vacuna según la reivindicación 20 para
el tratamiento del grupo B de Neisseria meningitidis.
22. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior para la prevención de meningitis, septicemia o neumonía u
otra manifestación de enfermedad sistémica o local producida por
Neisseria meningitidis.
23. Una vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20 para el tratamiento de uretritis,
salpingitis, cervicitis, proctitis, faringitis, enfermedad
inflamatoria pélvica u otra manifestación de enfermedad sistémica o
local producida por Neisseria gonorrhoeae.
24. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior que es una vacuna conjugada.
25. Una vacuna según cualquier reivindicación
anterior, que se deriva de una Neisseria comensal.
26. Una vacuna según la reivindicación 25, en la
que la Neisseria comensal es Neisseria lactamica.
27. Un anticuerpo reactivo con un componente
inmunogénico tal como se define en cualquier reivindicación
anterior.
28. Un anticuerpo según la reivindicación 27,
estando el anticuerpo humanizado o adaptado de otra forma para
mejorar la idoneidad para su administración a un ser humano.
29. Un anticuerpo según la reivindicación 27,
que puede obtenerse a partir del hibridoma depositado con el número
de acceso IDAC 260900-1 que produce el anticuerpo
B5.
30. Un hibridoma depositado con el número de
acceso IDAC 260900-1 que produce el anticuerpo
B5.
31. Una preparación farmacéutica que comprende
un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29 en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
32. El uso de una vacuna según cualquiera de la
reivindicación 1 a 26 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de infección por Neisseria.
33. El uso de un anticuerpo según cualquiera de
las reivindicaciones 27 a 29 en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de infección por Neisseria.
34. Un procedimiento para la identificación de
epítopos inmunogénicos de cepas de una especie de Neisseria,
comprendiendo el procedimiento las etapas de generar anticuerpos
frente al núcleo interno de LPS de una bacteria de
Neisseria, mediante la inoculación de un organismo huésped
con una cepa de mutante galE de Neisseria
meningitidis, y someter a prueba tales anticuerpos contra una
cepa de Neisseria meningitidis de tipo natural para
identificar aquellos anticuerpos que son reactivos y para los que
los epítopos son por tanto accesibles, en el que epítopo en el
núcleo interno de LPS está caracterizado por la presencia de
un resto de fosfoetanolamina unido a la posición 3 en HepII del
núcleo interno.
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