WO2007073706A2 - Péptidos miméticos de carbohidratos y su empleo en formulaciones farmacéuticas - Google Patents

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Hilda Elisa GARAY PÉREZ
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
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Nelson Francisco Santiago Vispo
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Definitions

  • the present invention is related to the branch of medicine, particularly with the development of new vaccine formulations, of preventive or therapeutic application, which allow inducing or increasing the immune response against specific antigens to combat diseases of diverse origin.
  • Prior art is related to the branch of medicine, particularly with the development of new vaccine formulations, of preventive or therapeutic application, which allow inducing or increasing the immune response against specific antigens to combat diseases of diverse origin.
  • Carbohydrates with chemical structure of repeated units of N-substituted neuraminic acid, linked by ⁇ 2-8 bond, are found, for example, as constituents of the polysaccharide capsule of bacteria N. meningitidis of serogroup B.
  • the polysaccharide constituting Ia This bacterium capsule is specifically constituted by repeated units of N-acetylated neuraminic acid, linked by ⁇ 2-8 bond (Bhattacharjee AK et al. 1975. Structural determination of the sialic acid polysaccharide antigens of Neisseria meningitidis serogroups B and C with carbon 13 nuclear magnetic resonance J. Biol. Chem. 250: 1926-1932).
  • Neisseria meningitidis is a Gram negative bacterium whose only host is the human being and constitutes the causative agent of the meningococcal disease. Usually this bacterium is part of the transient natural microbiota of the upper respiratory tract of healthy individuals known as carriers and this is the most common route for its microbiological isolation. Children under 2 years of age are the population most susceptible to contracting meningococcal meningitis, the most common clinical complication of meningococcal disease. However, adolescents and the elderly population can also be affected. Meningococcal disease without treatment is fatal in most affected individuals, and vaccination could prevent this situation by avoiding even early stages such as bacterial colonization. The clinical isolates of N.
  • meningitidis generally have a polysaccharide capsule. Structural differences in the capsule of different isolates, which generate antigenic differences, form the basis of the classification of the bacterium in several serogroups (Rosenstein NE and Perkins BA. 2000. Update on Haemophilus influenzae serotype b and meningococcal vaccines. Pediatr. Clin. North. Am., 47: 337-352) . Of the 13 serogroups of N. meningitidis reported so far, the most important clinically are the A, B, C, Y and W-135. Serogroup A is primarily responsible for epidemics in sub-Saharan Africa. Serogroups B and C are associated with most of the cases that occur in developed countries.
  • Serogroups Y and W135 are present in most of the remaining cases of the disease and infection prevalent in some regions of the United States, with a marked increase in recent years (Rosenstein N. et al. 2001. Meningococcal disease. N Engl. J. Med, 344, 1378-1388). Serogroup B is responsible for 50-70% of cases of bacterial meningitis reported in infants and children. In infected adolescents it can cause fatal sepsis (Romero JD and Outschoorn IM 1997. The immune response to the capsular polysaccharide of Neisser ⁇ a meningitidis group B. Zentralbl. Bakteriol. 285: 331-340).
  • VME The outer membrane
  • LOS lipooligosaccharides
  • the Cuban vaccine commercially called VA-MENGOC-BC ® , manufactured from the most frequent clinical isolation of Cuba, of serological classification B: 4: P1.19,15, showed an efficiency of 83% in field studies and as a result of its massive application in Cuba the incidence of meningococcal disease decreased from 14.4 infected per 100 000 inhabitants in 1983 to 0.45 cases per 100,000 inhabitants in 1994 (Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meninqitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann 14: 195-207; Diaz RJ. And Outschoorn IM 1994. Current status of meningococcal group B vaccine candidates: capsular or noncapsular? Clin. Microbio !. Rev.
  • conjugate vaccines allow to overcome the main difficulties associated with the use as immunogens of unconjugated polysaccharides, such as the induction of thymus-independent and short-lived immune response, the absence of stimulation of immune memory response with maturation of affinity and The generation of a phenomenon of hyporesponse, well documented in the case of serogroup C, in individuals repeatedly immunized with said vaccines, as occurs for example in areas of high incidence of the disease (Jennings H. and Lugowski C. 1981. Immunochemistry of groups A, B and C meningococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugates. J Immunol 127: 1011-1018; GoId R. and Lepow ML 1975.
  • meningitidis consists of sialic acid, specifically a linear homopolymer of approximately 200 repeated units of N-acetylated neuroamine acid residues linked by ⁇ (2-8) bonds (Bhattacharjee AK et al. 1975 Structural determination of the sialic acid polysaccharide antigens of Neisseria meningitidis serogroups B and C with carbon 13 nuclear magnetic resonance J. Biol. Chem. 250: 1926-1932; Frosch M. and Edwards U. 1993. Molecular mechanism of capsule expression in Neisseria menin ⁇ itidis serogroup B. p 49-57 in J. Roth, U.
  • Sialic acid is also found on the surface of some tissues of the human host. Homopolymers of repeated units of N-acetylated neuroamine acid residues linked by ⁇ (2-8) bonds, constitute the only glycosylation of adhesion proteins of mammalian neuronal cells (N-CAM), but unlike the capsular polysaccharide of serogroup B of N. meningitidis, the carbohydrate chains on human cells are shorter, approximately 10-50 repeated units (Chuong CM et al. 1984. Alterations in neural cell adhesion molecules dur ⁇ ng development of different regions of the nervous system. J. Neurosci. 4: 2354-2368).
  • the immunization with glycoconjugates of a derivative of polysaccharide B of the menningococcus, in which the N-acetyl groups thereof were replaced by N-propionyl groups induced the production of two antibody populations: a minority, which was adsorbed with solutions of polysaccharide B purified from the bacterium, which did not show bactericidal or protective activity and a majority, which was not adsorbed to the purified polysaccharide B, characterized by being of an IgG isotype, which showed bactericidal activity against several strains of serogroup B of N Meningitidis was able to reduce or eliminate bacteremia in mice challenged with lethal doses of meningococcus and did not recognize human tissues (Jennings HJ et al.
  • N-propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique epitope on group B Neisser ⁇ a meningitidis. J Exp Med 165: 1207-1211; Jennings HJ et al. 1986. Induction of meningococcal group B polysaccharide-specific IgG antibodies in mice by using an N-propionylated B polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. J Immunol 137: 1708-1713; Ashton FE et al. 1989. Protective efficacy of mouse serum to the N-propionyl derivative of meningococcal group B polysaccharide.
  • Microb Pathog 6 455-458; Michon F. et al. 1987. Conformational differences between linear alpha (2 - 8) -linked homosialooligosaccharides and the epitope of the group B meningococcal polysaccharide. Biochemistry 26: 8399-8405; Put RA et al. 1997. N-Propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidal capsular epitope in-group B Neisser ⁇ a meningitidis. J. Exp. Med. 185: 1929-1938).
  • the second epitope is detectable only when the native polysaccharide retains its high molecular size and is wound in the form of a helix, as it is disposed on the surface of the bacterium.
  • This second epitope of a conformational nature, is responsible for the production of bactericidal and protective antibodies, which do not recognize human tissues.
  • the literature describes the isolation of monoclonal antibodies that have been grouped according to their specificity and properties in two populations that correspond exactly to those previously explained (Pon RA et al. 1997. N-Propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique Bactericidal capsular epitope In-group B Neisser ⁇ a meningitidis J. Exp. Med.
  • Ia constitutes the use as Immunogens of peptide sequences that constitute specific molecular mimetics of the conformational epitope responsible for protection, present in polysaccharide B when it is in its native conformation on the surface of the bacterium.
  • One of the ways to identify mimotopes of the capsular polysaccharides is through the screening, with antibodies, of libraries of peptides exposed in filamentous phages. The development of this technology is based on the ability of the filamentous phages to expose on their surface foreign peptide sequences fused to the viral capsid proteins.
  • the peptide sequences exposed on the surface of the viral particle are easily accessible and potentially capable of specifically binding to the molecules used for the selection, and therefore can be selected based on said affinity.
  • the sequence of a peptide from a library chosen by a certain property can be easily deduced from the nucleotide sequence of the phage that it exposes (Parmley SF et al. 1988. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene 73 : 305-318; Smith GP et al. 1993. Free them of peptides and proteins displayed on filamentous phage. Methods Enzymol. 217: 228-257; Cwirla SE et al. 1990.
  • Peptides on phage a vast librar / of peptides for identifying ligands Proc. Nati. Acad. Sci. USA; 87: 6378-6382).
  • Said peptides to be considered as possible vaccine candidates must first be able to bind specific antibodies against the original antigen, and inhibit the binding of said antibodies to said antigen and secondly they must induce an immune response characterized by the presence of antibodies that recognize the pathogen and protect against the infection caused by it.
  • These peptides which are reproducible and well-defined structures, can substitute for the natural antigen in the process of making vaccines with the additional advantage that since the target of the antibodies induced by them is well defined, the possibility of inducing auto-antibodies is eliminated.
  • Filamentous phage have been shown to be potent carrier proteins, capable of presenting peptides to the immune system effectively [Meóla A. e ⁇ al. 1995. Derivation of vaccines from mimotopes: Immunologic properties of human Hepatitis B virus surface antigen mimotopes displayed on filamentous phage. J. Immunol. 154: 3162-3172: de la Cruz VF e ⁇ al. 1988. Immunogenicity and epitope mapping of foreign sequences via genetically engineered filamentous phage. J. Biol. Chem. 263: 4318-4322; Greenwood J. et al. 1991. Multiple display of foreign peptides on a filamentous bacteriophage.
  • Peptide librarles defines the fine specificity of anti-polysaccharide antibodies to Cryptococcus neoformans J. Mol. Biol. 261: 11-22; Harris S. L et al. 1997. Exploring the basis of peptide-carbohydrate crossreactivity: evidence for discrimination by peptides between closely related anti- carbohydrate antibodies Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 2454-2459; Pincus SH ei al. 1998. Peptides that mimic the group B Streptococcal type III capsular polysaccharide antigen J. Immunol. 160: 293-298; Phalipon A ei al. 1997. Induction of anti-carbohydrate antibodies by phage library-selected pep ⁇ de mimics. Eur. J. Immunol. 27: 2620-2625).
  • Granoff DM and Moe G. R in USP 6,642,354 B2 protected the use in vaccine formulations of 67 peptide sequences, which were selected from libraries of phage-exposed peptides, based on their ability to bind anti-monoclonal antibodies.
  • Polysaccharide B Two of them were selected for immunological studies and for this they were synthesized and VME conjugated peptides of N. meningitidis obtained from a strain of meningococcus serogroup B, capsule mutant. In said patent they report that immunization with one of these conjugates induced the production of antibodies that showed bactericidal activity against N. meningitidis of serogroup B.
  • VME bactericidal activity
  • the antibodies generated by these peptides do not have cross-reactivity with the epitope formed by the short chains of polysalic acid present on certain human tissues, the possibility of leading to the triggering of an autoimmune response is eliminated. They constitute, therefore, an alternative source of antigens that allow the development of new generation reagents, of potential use in diagnosis, therapy or disease prevention.
  • the peptides NMGBPS1, NMGBPS2, NMGBPS3, NMGBPS4 are reported for the first time, as components of reagents for diagnosis or of a vaccine formulation of a therapeutic or preventive nature against meningococcal disease or any infection caused by a member of the Neisseria genus or by other bacteria, viruses or parasites.
  • the novel character of this invention resides in the description for the first time of peptides NMGBPS1, NMGBPS2, NMGBPS3, NMGBPS4, as molecular mimotopes of epitopes present in the capsular polysaccharide of serogroup B of Neisseria meningitidis, capable of inducing the production of bactericidal antibodies against Meningococcal strains belonging to this serogroup.
  • peptides can be used as reagents for diagnosis and / or in vaccine formulations to treat or prevent the disease caused by
  • FIG. 1 The phages selected after the screening with the anti-polysaccharide B monoclonal antibody, from the library of peptides exposed in phages, they were applied on a nitrocellulose membrane and faced the selector antibody. At each point 30 ⁇ g of each of the selected individual phages were applied. In G5 and 15 the control phage was applied.
  • FIG. 1 Evaluation of the ELISA reactivity of the phages adsorbed to the selector antibody after the third cycle of the research carried out in the library.
  • the phages were purified individually and used to coat the ELISA plates.
  • the graph shows the Absorbance at 492 nm (at 492 nm) obtained in the ELISAs for 13 of the phages evaluated.
  • FIG. 3 Evaluation of the reactivity by ELISA of the phages adsorbed to the selector antibody after the second cycle of the research conducted to the library.
  • the phages were purified individually and used to coat the ELISA plates.
  • the graph shows the Absorbance at 492 nm (at 4 g 2 nm) obtained in the ELISAs for 16 of the phages evaluated.
  • FIG. 4 Evaluation of the reactivity, using 3 ELISA systems: conventional, sandwich and inhibition, as explained in the text, in Example 9, of the phages that express on their surface the peptides selected from the research of Ia library of peptides exposed in phages with the monoclonal antibody anti-polysaccharide B.
  • FIG. 1 Antibody levels (IgG) induced after immunization of Balb / c mice with the NMGBPS1-NMGBPS4 peptides exposed in filamentous phages, evaluated by ELISA.
  • the graph shows the increases in specific antibodies detected in the immune sera, extracted after the 3rd dose with respect to the preimmune sera, extracted before immunizations for the groups immunized with each phage.
  • Figure 6 Fragments of peptides synthesized on cellulose membrane for the determination of epitopes recognized by the anti-polysaccharide B monoclonal antibody and by murine sera induced against the NMGBPS1 peptide.
  • FIG. 7 Reactivity of the anti-polysaccharide B monoclonal antibody (left panel) and of the murine sera induced against the NMGBPS1 peptide (right panel) when faced with a collection of peptide fragments derived from the NMGBPS1 peptide.
  • the design of the peptide fragment collection is shown in Figure 6.
  • Figure 8. Collection of peptides synthesized on pins, derived from modifications introduced to the NMGBPS1 peptide consisting of a) the simultaneous replacement of Pro in positions 7 and 8 with a Wing in each position and b) introduction of 1 to 3 specific changes in Ia anti-polysaccharide B monoclonal antibody binding sequence.
  • Peptide 1 corresponds to the NMGBPS1 sequence.
  • Figure 9 Reactivity of the collection of peptides synthesized on pins and presented in Figure 8, when faced with the anti-polysaccharide monoclonal antibody B.
  • the numbers of the peptides correspond to the list shown in Figure 8.
  • Bar 1 corresponds with the reactivity with the NMGBPSl peptide
  • FIG. 10 Reactivity with the anti-polysaccharide B monoclonal antibody of the peptides, based on the sequence of NMGBPS1, in which in each case Vi 2 was substituted by A (peptide 5), Vi 2 by S (peptide 11), Vi 2 by E (peptide 12), V 9 by A (peptide 16), Yn by E (peptide 14) or Yn by I (peptide 2). In all cases, P 7 and P 8 were replaced simultaneously with an A in each position. The numbers of the peptides correspond to the list shown in Figure 8. Bar 1 (peptide 7) corresponds to the reactivity with the NMGBPS1 peptide to which the P 7 and P 8 were simultaneously replaced by an A in each position . Figure 11.
  • FIG. 12 Collection of peptides synthesized on pins, derived from modifications introduced to the NMGBPS1 peptide consisting of a) the replacement of Vi 2 by Ai 2 , Si 2 and Ei 2 and b) the replacement of P 7 by A 7 or P 8 by To 8 .
  • Peptide 1 corresponds to the sequence of NMGBPS1 Figure 13. Reactivity of the collection of peptides synthesized on pins and presented in Figure 12 when faced with the monoclonal antibody anti-polysaccharide B.
  • Figure 14 Reactivity with the anti-polysaccharide B monoclonal antibody of peptides based on the NMGBPS1 sequence (bar 1), in which modifications 1) substitution of W 10 by F 10 and 2) the substitution of P 7 by A were introduced. 7 or P 8 by AB.
  • the graph shows the sequence of each peptide evaluated.
  • Figure 15 Inhibition of the binding of the anti-polysaccharide B monoclonal antibody to the capsular polysaccharide of serogroup B of Neisser ⁇ a meningitidis, using as ligands a) peptide containing 3 copies of the minimum sequence necessary for the binding of the NMGBPS1 peptide to the anti-monoclonal antibody polysaccharide B; b) NMGBPS1 peptide and c) control peptide.
  • Example 1 Research of the library of peptides exposed in phages with a monoclonal anti-polysaccharide B antibody from Neisser ⁇ a meningitidis.
  • a library of linear peptides of 15 amino acids expressed in the P8 region of filamentous phages was constructed and the screening thereof was carried out using as a selector molecule a murine monoclonal antibody with bactericidal activity against N . serogroup B meningitidis and that does not recognize human tissues (Pon RA e ⁇ al. 1997. N-Propionylat ⁇ d group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidal capsular epitope in-group B Neisser ⁇ a meningitidis. J. Exp. Med. 185: 1929-1938 ).
  • Fraction A1 was amplified and faced with anti-polysaccharide B monoclonal antibody and again the adsorbed and non-adsorbed fractions to the antibody were collected and titrated. This process in the form of cycles was repeated until the ratio N / title A gave less than 10 3 . In total, four research cycles were carried out. Table 1 shows the values obtained from the holder of fractions A and N obtained after each research cycle. The table also shows the title of fraction A obtained in each research cycle after being amplified and purified to be used in the next cycle.
  • the phage adsorbed to the selector antibody after the fourth research cycle of the library were used to infect XL-1 blue cells and several dilutions were poured onto agar plates with 2XYT culture medium. Individual phage plates were selected and amplified in liquid cultures. The phages were purified by precipitation with polyethylene glycol.
  • Example 2 Reactivity with the antibody selected from the selected phages after the fourth research cycle of the library.
  • Example 3 Purification and sequencing of the DNA of the selected phages after the fourth research cycle of the library with the anti-polysaccharide B monoclonal antibody.
  • the DNA was purified from 25 of the phages that were positive in the immunoidentification experiment and the nucleotide sequence was determined. Phage DNA purification was carried out as described (Sambrook J. et al. 1989. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edn, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, USA).
  • Viral DNA sequencing was performed using the automatic sequencer ALFexpressIl (Thermo Sequenase TM Cy TM 5 Dye Terminator Kit, Amersham Biosciences) and oligonucleotides M13 / pUC Sequencing primer (-47) # 1224, New England Biolabs Inc., USA) and M13 / pUC Reverse sequencing primer (-48) # 1233, New England Biolabs Inc., USA). In all clones the same sequence was obtained, which is shown in the sequence list (No. Sequence identification: 1). The peptide corresponding to the translation of this DNA sequence into a protein sequence is shown in the sequence list (No. Sequence identification: 5).
  • Example 4 Characterization of the sequence of the peptide expressed in the selected phages after the fourth research cycle of the library with the anti-polysaccharide monoclonal antibody B.
  • the sequence exposed in the selected phages after the fourth research cycle of The library was aligned with other sequences of mimetic structures of the polysaccharide B of N. meningitidis reported (Shin JS et al. 2001. Monoclonal antibodies specific for Neisseria meningitidis group B polysaccharide and their peptide mimotopes. Infect. Immun. 69 : 3335-3342; Park I. et al. 2004.
  • meningitidis polysaccharide B phage adsorbed to the anti-polysaccharide B antibody was evaluated by ELISA after the third cycle of the research conducted to the library.
  • the phages were individually purified and used to coat ELISA plates.
  • the control phage and the phage that exposes the NMGBPS1 peptide were included in the experiment.
  • OPD chromogen o-phenylene diamine
  • FIG. 1 shows the results obtained for several of the purified phages. Twenty corresponding phages with those that gave signals of greater intensity in the ELISA, with respect to the signal obtained for the control, were selected to continue the work.
  • Example 6 Purification and sequencing of the DNA of the selected phages after the third research cycle of the library with the anti-polysaccharide B monoclonal antibody.
  • Example 7 Reactivity with the antibody selected from the selected phages after the second research cycle of the library.
  • the phages adsorbed to the anti-polysaccharide antibody B were evaluated by ELISA after the second cycle of the research conducted to the library.
  • the phages were purified individually and used to coat ELISA plates.
  • the control phage and the phage that exposes the NMGBPS1 peptide were included in the experiment.
  • the anti-polysaccharide B antibody was incubated with the monoclonal antibody.
  • the reactivity was revealed, after incubating with antibodies that recognize mouse IgG conjugated to the horseradish peroxidase enzyme, with a solution containing H 2 O 2 and the chromogen o-phenylene diamine (OPD). The reaction was stopped with 2.5 N sulfuric acid and A 492nm was read in an ELISA plate reader.
  • OPD chromogen o-phenylene diamine
  • Figure 3 shows the results obtained for several of the purified phages. Fifteen corresponding phages with those that gave signals of greater intensity in the ELISA, with respect to the control phage, were selected to continue the work.
  • Example 8 Purification and sequencing of the DNA of the selected phages after the second research cycle of the library with the anti-polysaccharide B monoclonal antibody.
  • Example 9 Characterization by ELISAs of the reactivity of the peptides exposed in the filamentous phages selected after the library screening. A phage that expressed each of the unique sequences identified in Example 8 was selected to conduct a more extensive study of its reactivity with the anti-polysaccharide B monoclonal antibody.
  • the DNA sequences corresponding to phage NMGBPS2, NMGBPS3 and NMGBPS4 are shown in the sequence list (No. Sequence identification: 2, 3 and 4, respectively).
  • the peptides corresponding to the translation of these DNA sequences to protein sequences are shown in the sequence list (No. Sequence identification: 6, 7 and 8 respectively).
  • Table 2 shows the correspondence between the identified phages and the sequence identification numbers.
  • sequences obtained were also characterized by a similarity search in the NCBl database using the BLASTP 2.2.10 program (Altschul SF ef al. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein data base search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
  • the search was subscribed to the gene and protein sequences of bacteria contained in the SwissProt databases (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) and NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih .gov /).
  • the results of this procedure indicated that there were no similarities against the sequences deposited in these databases greater than 30% for NMGBPS 2 and 4 peptides, nor greater than 35% for NMGBPS3 peptide.
  • an immunization scheme was designed in Balb / c mice, in which the animals were inoculated directly with the phages exhibiting said peptides.
  • the phages were purified by cesium chloride gradients, following a modification of the purification procedure 1 (Lin TC e ⁇ al. 1980. Isolation and characterization of the C and D proteins coded by gene IX and gene Vl in the filamentous bacteriophage fl and fd J. Biol. Chem. 255: 10331-10337), described by de la Cruz et al. (De la Cruz FV ef al. 1988. Immunogenicity and epitope mapping of foreign sequences via genetically engineered filamentous phage. J. Biol. Chem. 25: 4318-4322).
  • mice A group of 7 Balb / c mice (H-2 d , female sex, 7-8 weeks of age) was immunized with each phage. 10 11 viral particles were administered per mouse in each inoculation.
  • a group of mice was immunized with 5 ug per mouse in each inoculation of N-propionylated N meningitidis B polysaccharide (pPSC-B) (Jennings HJ et al. 1986. Induction of meningococcal group B polysaccharide-specific IgG antibodies in mice by using an N-propionylated B polysaccharidetetanus toxoid conjugate vaccine.
  • pPSC-B N-propionylated N meningitidis B polysaccharide
  • HSA human serum albumin protein
  • Antibody levels (IgG) induced by NMGBPS1-NMGBPS4 peptides exposed in filamentous phage were evaluated by ELISA.
  • the sera of the animals, obtained after the third inoculation, were evaluated using synthetic peptides with coating antigens. the sequences of the identified peptides.
  • Figure 5 shows that the levels of specific IgG antibodies against the peptides exposed in the phages, after three immunizations with them increased significantly.
  • the non-parametric method of analysis of variance of simple classification by ranges of Kruskal-Wallis was used, because the variances between the groups were not homogeneous according to the Bartlett Test. To make the multiple non-parametric comparisons, the Dunns test was performed.
  • Example 13 Evaluation by bactericidal activity of the antibodies induced by the peptides selected from the screening of the library of peptides exposed in phages with the anti-polysaccharide B monoclonal antibody.
  • Serum mixtures of mice from each group inoculated with each immunogen were evaluated by bactericidal activity assay.
  • the test used by Ashton et al. Ashton FE et al. 1989. Protective efficacy ofmouse serum to the N-propionyl derivative of meningococcal group B polysaccharide. Microb. Pathog. 6: 455-458) was applied for the evaluation of targeted antibodies against meningococcal B polysaccharide, but instead of using the buffer solution recommended by these researchers, Veronal solution supplemented with BSA was used, which is recommended to increase the sensitivity of the bactericidal activity assay when antibodies directed against serogroup B of N are evaluated.
  • Meningitidis (Mandrell RE et al. 1995. Complement-mediated bactericidal activity of human antibodies to poly alpha 2-> 8 N-acetylneuraminic acid, the capsular polysaccharide of Neisser ⁇ a menin ⁇ itidis serogroup BJ Infec ⁇ . Dis. 172: 1279-1289).
  • the bactericidal antibody titer was expressed as the reciprocal of the highest antibody dilution evaluated, capable of killing at least 50% of the bacteria. Table 4 shows the results of the evaluation.
  • Example 14 Mapping of the regions of the peptides recognized by the anti-polysaccharide B monoclonal antibody and by murine sera.
  • Figure 7 shows the results obtained by incubating the cellulose membrane with the anti-polysaccharide monoclonal antibody B.
  • the anti-polysaccharide monoclonal antibody B Of the 5 amino acid peptides, those corresponding to the VWYVE and WYVEG sequences were recognized. This result and the analysis of the reactivity pattern obtained with the rest of the peptides allows us to conclude that the minimum sequence within the NMGBPS1 peptide, necessary for the binding of the anti-polysaccharide B monoclonal antibody is the WYVE tetrapeptide.
  • Figure 7 shows that when performing a similar experiment, but incubating the collection of peptides synthesized on paper with a mixture of the sera from mice immunized with the NMGBPS1 peptide exposed on filamentous phage, recognition of the peptide fragment with the WYVEG sequence was obtained, which corresponds to the results obtained for the monoclonal antibody.
  • the points corresponding to the RPPVW and PPVWY sequence peptide fragments were also recognized by the mixture of the sera, which indicated the formation of a second epitope in the NMGBPS1 peptide, capable of inducing the production of antibodies.
  • Example 15 Synthesis of peptide collections in which point mutations are introduced to the NMGBPS1-4 peptides and reactivity with the anti-polysaccharide B monoclonal antibody.
  • Figure 8 shows the collection of synthesized peptides for the optimization of the NMGBPS1 peptide.
  • Peptide 1 corresponds to the sequence of NMGBPS1.
  • the Pro of positions 7 and 8 were simultaneously replaced by Ala in both positions.
  • positions corresponding to amino acids necessary for the binding of the anti-polysaccharide B antibody were introduced from one to three specific changes, taking into account the criteria explained in the previous paragraph.
  • Figure 9 shows the reactivity obtained when facing the collection of peptides shown in Figure 8 to the anti-polysaccharide monoclonal antibody B.
  • Figure 12 shows the second collection of peptides that were synthesized to continue optimizing the sequence of the NMGBPS1 peptide.
  • Sequence 1 corresponds to the NMGBPS1 peptide.
  • Peptides were synthesized in which the binding sequence of the anti-polysaccharide B antibody only contained changes in V 12 by Ai 2 , Si 2 and Ei 2 and each of these peptide variants was synthesized containing in turn changes in any of the P for A.
  • similar peptides were synthesized but containing all the P of the original peptide or all the P changed by A.
  • Figure 13 shows the reactivity obtained when facing the collection of peptides presented in Figure 12 to the monoclonal antibody anti-polysaccharide B.
  • Figure 14 shows the reactivity with the antibody monoclonal anti-polysaccharide B of peptides based on the NMGBPS1 sequence, in which the change Wi 0 for Fi 0 was introduced , and additionally changes in P 7 for A 7 or in Ps for As.
  • Figure 10 shows the sequences of the synthesized peptides. 86% of the reactivity with the antibody, with respect to the NMGBPS1 peptide, was retained in the peptide where P 7 was substituted by A 7, when W-io was replaced by Fio (peptide 2, Figure 14). The sequences corresponding to the peptides shown at the bottom of bars 2, 3 and 4 of Figure 14 are shown in the sequence list as SeqID 27, SeqID 28 and SeqID 29.
  • Example 16 Synthesis of peptides containing several copies of the sequence necessary for the binding of the anti-polysaccharide B monoclonal antibody to the NMGBPS1-4 peptides.
  • the peptides were synthesized and ELISAs were performed where the ability of the new peptides, with respect to the original peptides, to inhibit the binding of the anti-polysaccharide monoclonal antibody B to the polysaccharide B of the meningococcus was evaluated.
  • the polystyrene plates were coated with a solution of polysaccharide B purified from the bacterium and mixtures of the anti-polysaccharide B monoclonal antibody were added, at a fixed concentration (5ug / ml), with solutions of different concentrations of the peptides.
  • Figure 15 shows the results obtained with the multicopy peptide synthesized from the repetition 3 times of the sequence necessary for the binding of the anti-polysaccharide B monoclonal antibody to the NMGBPS1 peptide.
  • the multicopy peptide was able to inhibit the binding of the anti-polysaccharide B monoclonal antibody to polysaccharide B more effectively than the NMGBPS1 peptide.

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Abstract

La presente invención esta relacionada con la industria farmacéutica y la biotecnología, mas específicamente con antígenos vacunales aplicados contra enfermedades bacterianas, virales, cancerosas, o de otro origen. Desarrollo de formulaciones capaces de proteger o de elevar el espectro protector de vacunas ya existentes y extenderlo contra diferentes patógenos, empleando como blanco para la respuesta inmune, carbohidratos formados por unidades repetidas de (α 2-8) ácido neuramínico N-sustituidas. Se aislaron e identificaron péptidos como miméticos moleculares del polisacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo B, formado por unidades repetidas de (α 2-8) ácido neuramínico N-acetilado. La inmunogenicidad de los péptidos se evaluó en biomodelos animales, demostrando su valor como antígenos inductores de anticuerpos capaces de reconocer específicamente a N. meningitidis del serogrupo B y de mostrar actividad bactericida contra la misma. Las formulaciones resultantes de esta invención son aplicables en la industria farmacéutica como formulaciones vacunales para uso humano.

Description

PÉPTIDOS MIMÉTICOS DE CARBOHIDRATOS Y SU EMPLEO EN FORMULACIONES FARMACÉUTICAS.
Campo de Ia técnica La presente invención está relacionada con Ia rama de Ia medicina, particularmente con el desarrollo de nuevas formulaciones vacunales, de aplicación preventiva o terapéutica, que permitan inducir o aumentar Ia respuesta inmune contra antígenos específicos para combatir enfermedades de origen diverso. Arte previo
Los carbohidratos con estructura química de unidades repetidas de ácido neuramínico N-sustituidas, unidas por enlace α 2-8, se encuentran, por ejemplo, como constituyentes de Ia cápsula polisacarídica de Ia bacteria N. meningitidis del serogrupo B. El polisacárido que constituye Ia cápsula de esta bacteria esta constituido específicamente por unidades repetidas de ácido neuramínico N- acetilado, unidas por enlace α 2-8 (Bhattacharjee A. K. et al. 1975. Structural determination of the sialic acid polysaccharide antigens of Neisseria meningitidis serogroups B and C with carbón 13 nuclear magnetic resonance. J. Biol. Chem. 250: 1926-1932). Neisseria meningitidis es una bacteria Gram negativa cuyo único hospedero es el ser humano y constituye el agente causal de Ia enfermedad meningocóccica. Usualmente esta bacteria se encuentra formando parte de Ia microbiota natural transitoria del tracto respiratorio superior de individuos sanos conocidos como portadores y esta es Ia vía más común para su aislamiento microbiológico. Los niños menores de 2 años de edad son la población más susceptible a contraer Ia meningitis meningocóccica, Ia complicación clínica más habitual de Ia enfermedad meningocóccica. Sin embargo, los adolescentes y Ia población de adultos mayores también pueden ser afectados. La enfermedad meningocóccica sin tratamiento es fatal en Ia mayoría de los individuos afectados, y Ia vacunación podría prevenir esta situación evitando incluso etapas tan tempranas como Ia colonización bacteriana. Los aislamientos clínicos de N. meningitidis generalmente poseen una cápsula de polisacárido. Diferencias estructurales en Ia cápsula de diferentes aislamientos, que generan diferencias antigénicas, forman Ia base de Ia clasificación de Ia bacteria en varios serogrupos (Rosenstein N. E. and Perkins B. A. .2000. Update on Haemophilus influenzae serotype b and meningococcal vaccines. Pediatr. Clin. North. Am., 47: 337- 352). De los 13 serogrupos de N. meningitidis reportados hasta ahora, los más importantes desde el punto de vista clínico son el A, B, C, Y y W-135. El serogrupo A es el principal responsable de las epidemias en África subsahariana. Los serogrupos B y C están asociados con Ia mayor parte de los casos que ocurren en los países desarrollados. Los serogrupos Y y W135 están presentes en Ia mayoría de los casos remanentes de Ia enfermedad y de infección prevalente en algunas regiones de los Estados Unidos, con un marcado incremento en los últimos años (Rosenstein N. et al. 2001. Meningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344, 1378-1388). El serogrupo B es responsable del 50-70% de los casos de meningitis bacteriana que se reportan en infantes y niños. En los adolescentes infectados puede causar sepsis fatal (Romero J. D. and Outschoorn I. M. 1997. The immune response to the capsular polysaccharide of Neissería meningitidis group B. Zentralbl. Bakteriol. 285: 331-340). Una de las estrategias que se ha ensayado para combatir Ia enfermedad producida por el serogrupo B del meningococo, ha sido el empleo como inmunógeno, del producto de las evaginaciones de Ia membrana externa bacteriana que ocurren durante Ia fase de crecimiento exponencial, conocidas como vesículas de Ia membrana externa (VME). Para su empleo como vacunas estas vesículas son purificadas y despojadas de los lipooligosacáridos (LOS) por tratamientos con detergentes. Los antígenos que constituyen estas VME son fundamentalmente las proteínas que se encuentran presentes en Ia membrana externa de Ia bacteria (Frasch CE. et al. 1988. Antibody response of adults to an aluminum hydroxide-adsorbed Neissería meningitidis serotype 2b protein-group B polysaccharide vaccine. J. Infect. Dis. 158: 710-718). Varias vacunas basadas en VME han sido ensayadas en estudios de campo (Rosenqvist E. et al. 1991. Human antibody responses after vaccination with the Norwegian group B meningococcal outer membrane vesicle vaccine: results from ELISA studies. NIPH Ann. 14: 169-79; Sierra G.V. et al. 1991. Vaccine against group B Neissería meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann. 14: 195-207). La vacuna cubana, comercialmente denominada VA-MENGOC-BC®, fabricada a partir del aislamiento clínico mas frecuente de Cuba, de clasificación serológica B:4:P1.19,15, mostró una eficacia del 83 % en estudios de campo y como resultado de su aplicación masiva en Cuba Ia incidencia de Ia enfermedad meningocóccica disminuyó desde 14,4 infectados por cada 100 000 habitantes en 1983 hasta 0,45 casos por cada 100 000 habitantes en 1994 (Sierra G. V. et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meninqitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann. 14: 195-207; Diaz RJ. and Outschoorn I. M. 1994. Current status of meningococcal group B vaccine candidates: capsular or noncapsular? Clin. Microbio!. Rev. 7: 559-575). La aplicación de esta vacuna en San Paulo, Brasil, desde 1989 a 1990, controló los brotes epidémicos en esa región (de Moraes J. C. et al. 1992. Protective efficacy of a serogroup B meningococcal vaccine in Sao Paulo, Brazil. Lancet 340:1074- 1078). Sin embargo, estas vacunas se elaboran a partir de una sola cepa Io cual hace que su rango de protección se limite principalmente a Ia cepa con Ia cual se produce, por Io que Ia protección inducida es serotipo- o subtipo-específica. Por otro lado, Ia circulación de cepas especificas del serogrupo B de N. meningitidis, está sujeta a variaciones geográficas y temporales. Esto limita el empleo de este tipo de vacunas a regiones geográficas aisladas donde Ia circulación de cepas es limitada, o a regiones con brotes epidémicos donde se identifique Ia o las cepas responsables de los aislamientos clínicos y se elabore una vacuna específica para detener Ia epidemia (Holst J. et al. 2005. The concept of Tailor-made, protein-based, outer membrane vesicle vaccine against meningococcal disease. Vaccine 23: 2202-2205). La simple combinación de diferentes preparaciones de VME no es una alternativa efectiva ya que estas pudieran rendir altos niveles de LOS por dosis de vacunas con riesgos de provocar efectos secundarios (Diaz RJ. and Outschoorn I. M. 1994. Current status of meningococcal group B vaccine candidates: capsular or noncapsular? Clin. Microbiol. Rev. 7: 559-575). Empleando como componentes para Ia elaboración de vacunas contra Ia enfermedad meningocóccica, los polisacáridos capsulares purificados de Ia bacteria, se han elaborado formulaciones que protegen de Ia infección producida por los serogrupos A, C, Y y W-135. Estas vacunas han demostrado su capacidad de inducción de anticuerpos bactericidas y protectores en adultos y su efectividad en el control de brotes epidémicos (Rosenstein N. eí al. 2001. Menningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344: 1378-1388). Una nueva generación de vacunas, basadas en el polisacárído capsular de Ia bacteria del serogrupo C conjugado a proteínas portadoras, se encuentra actualmente disponible en el mercado, las que, en estudios de campo en Inglaterra, demostraron su capacidad de inducción de anticuerpos bactericidas y protectores no solo en adultos, sino además en niños pequeños (Miller E. et al. 2002. Planning, registration and implementation of an immunisation campaign against meningococcal serogroup C disease in the UK: a success story. Vaccine 20; s58-s67). Adicionalmente, las vacunas conjugadas permiten superar las principales dificultades asociadas al empleo como inmunógenos de polisacáridos no conjugados, como son Ia inducción de respuesta inmune timo-independiente y de corta duración, Ia ausencia de estimulación de respuesta inmune de memoria con maduración de Ia afinidad y Ia generación de un fenómeno de hiporrespuesta, bien documentado en el caso del serogrupo C, en los individuos inmunizados repetidamente con dichas vacunas, como ocurre por ejemplo en las zonas de alta incidencia de Ia enfermedad (Jennings H. and Lugowski C. 1981. Immunochemistry of groups A, B and C meningococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugates. J Immunol 127: 1011- 1018; GoId R. and Lepow M. L. 1975. Clinical evaluation of group A and C meningococcal polysaccharide vaccines in infants. J. Clin Invest 56: 1536-47; Borrow R. et al. 2001. Influence of prior meningococcal C polysaccharide vaccination on the response and generation of memory añer meningococcal C conjúgate vaccination in young children. J Infect Dis 184: 377-380). Contra el serogrupo A se encuentran en fase de ensayos clínicos varias vacunas conjugadas, las que han demostrado ser seguras, inmunogénicas y capaces de inducir memoria inmunológica (World Health Organisation. 1999. Standardization and validation of serological assays for the evaluation of immune responses to Neisseria meninpitidis serogroup A/C vaccines. Vaccine Development Team of the Department of Vaccine and Biologicals. Ginebra, www.who.int/gpv- documents/; Campagne G. et al. 2000. Safety and immunogenicity of three doses of a Neisseria meningitidis A + C diphthería conjúgate vaccine in infants from Niger. Pediatr. Infect. Dis. J. 19: 144-150; Borrow R. et al. 2000. Induction of immunological memory in UK infants by a meningococcal A/C conjúgate vaccine. Epidemiol. Infect. 124: 427- 432; Choo S. eí al. 2000. Immunogenicity and reactogenicity of a group C meningococcal conjúgate vaccine compared with a group A+C meningococcal polysaccharide vaccine in adolescents in a randomised observer-blind controlled trial. Vaccine 18: 2686- 2692). En el caso del serogrupo B no ha sido posible Ia formulación de vacunas basadas en el polisacárido, ya que este es poco inmunogénico (Colino J. and Outschoorn I. 1998. Dynamics of the murine humoral immune response to Neisseria meningitidis group B capsular polysaccharide. Infecí. Immun. 66: 505-513). La cápsula polisacarídica del serogrupo B de N. meningitidis está constituida por ácido siálico, específicamente por un homopolímero lineal de aproximadamente 200 unidades repetidas de residuos de ácido neuroamínico N-acetilados unidos por enlaces α(2-8) (Bhattacharjee A. K. et al. 1975. Structural determination of the sialic acid polysaccharide antigens of Neisseria meningitidis serogroups B and C with carbón 13 nuclear magnetic resonance. J. Biol. Chem. 250: 1926-1932; Frosch M. and Edwards U. 1993. Molecular mechanism of capsule expression in Neisseria meninαitidis serogroup B. p 49-57 in J. Roth, U. Rutishauser and F. A. Troy (ed), Polysialic acid, from microbes to man. Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland). Estas largas cadenas de carbohidrato se arrollan en forma de hélice sobre Ia superficie de Ia bacteria, adoptando una estructura tridimensional característica en cuya formación también influyen las proteínas y otros componentes de Ia membrana externa de Ia bacteria (Colino J. and Outschoorn I. 1998. Dynamics of the murine humoral immune response to Neisseria meningitis group B capsular polysaccharide. Infect Immun 66: 505-513). Este homopolímero no está restringido a N. meninigitidis del serogrupo B ya que está presente también en Ia cápsula de Escherichia coli K1, un patógeno causante de meningitis en niños recién nacidos, en Pasteurella haemolytica A2, un importante patógeno veterinario y en Moraxella non-liquefaciens, microorganismo no patogénico común en las fosas nasales (Kasper D. L. et al. 1973. Immunochemical similarity between polysaccharide antigens of Escherichia coli 07: K1 (L): NM and group B Neisseria meninαitidis. J. Immunol. 110: 262-268; Adlam C. et al. 1986. Purification, characterization and immunological properties ofthe serotype-specific capsular polysaccharide of Pasteurella haemolvtica serotype Al organisms. J. Gen. Microbiol. 132:1079-1087; Devi S. J. et al. 1991. Identity between polysaccharide antigens of Moraxella non-liquefaciens, group B Neisseria meningitidis and Escheríchia coli K1 (non-0 acetylated) . Infecí. Immun. 59: 732- 736).
También se encuentra ácido siálico sobre Ia superficie de algunos tejidos del hospedero humano. Homopolímeros de unidades repetidas de residuos de ácido neuroamínico N-acetilados unidos por enlaces α(2-8), constituyen Ia única glicosilación de las proteínas de adhesión de las células neuronales (N-CAM) de mamíferos, pero a diferencia del polisacárido capsular del serogrupo B de N. meningitidis, las cadenas del carbohidrato sobre las células humanas son mas cortas, de aproximadamente 10-50 unidades repetidas (Chuong C. M. et al. 1984. Alterations in neural cell adhesión molecules duríng development of different regions of the nervous system. J. Neurosci. 4: 2354-2368). Células con alto contenido de ácido siálico prevalecen en embriones y cerebros de recién nacidos, pero el contenido de ácido siálico de estas disminuye durante el desarrollo del individuo encontrándose en el adulto que las células altamente sialiladas se limitan solamente a regiones discretas de algunos tejidos. En determinadas situaciones patológicas, como por ejemplo en tumores agresivos de origen neuroectodérmico, aparece sobreexpresado el ácido siálico en Ia superficie de las células tumorales (Romero J. D. and Outschoorn I. M. 1997. The immune response to the capsular polysaccharide of Neissería meningitidis group B. Zentralbl Bakteriol 285: 331-340; Colino J. and Outschoorn I. 1998. Dynamics of the murine humoral immune response to Neissería meningitis group B capsular polysaccharide. Infect Immun 66: 505-513).
Hay experimentos in vitro que indican que anticuerpos dirigidos contra Ia cápsula del serogrupo B de N. meningitidis reconocen el ácido polisiálico presente en algunos tejidos del hospedero humano (Finne J. et al. 1987. An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisúes.
J. Immunol, 138: 4402-4407). Este reconocimiento cruzado permitiría explicar Ia baja inmunogenicidad del polisacárido del meningococo del serogrupo B, dada por un mecanismo de tolerancia debido a Ia homología que tiene con los polisacáridos presentes en tejidos propios. Se ha alertado sobre Ia posibilidad de que estos anticuerpos anti-polisacárido B, que en experimentos in vitro han mostrado reconocimiento de tejidos humanos, sean potencialmente capaces de conducir al desarrollo de enfermedades autoinmunes.
Sin embargo, no ha sido posible demostrar mediante experimentos que in vivo ocurra unión efectiva de los anticuerpos anti-polisacárido B a tejidos humanos. Adicionalmente, no se ha podido asociar ninguna patología con Ia presencia de altos niveles de anticuerpos anti-polisacárido B circulando en el suero de humanos. Varias investigaciones reportan que individuos que gozan de buena salud tienen normalmente circulando anticuerpos que reconocen el polisacárido B, incluidas madres que luego han tenido hijos saludables. Tampoco se reportaron efectos adversos luego de Ia administración de una vacuna conjugada de polisacárido B con proteínas a mas de 500 adultos y 2000 niños en un estudio en Sudáfrica (Mandrell R. E. and Zollinger W. D. 1982. Measurement of antibodies to meningococcal group B polysaccharide: low avidity binding and equilibrium binding constants. J. Immunol 129: 2172-2178; Zollinger W. D. et al. 1984. Safety of vaccines containing meningococcal group B polysaccharide. Lancet 2: 166; Devi S. J. et al. 1991. Antibodies to poly [(2 — 8)-alpha-N- acetylneuraminic acid] and poly[(2 — 9)-alpha-N-acetylneuraminic acid] are elicited by immunization of mice with Escheríchia coli K92 conjugates: potential vaccines forgroups B and C meningococci and E. coli K1. Proc. Nati. Acad. ScL U S A 88: 7175-7179; Kabat E. A. et al. 1988. The epitope associated with the binding of the capsular polysaccharide of the group B meningococcus and of Escheríchia coli K1 to a human monoclonal macroglobulin, IgMNOV. J. Exp. Med. 168: 699-711 ; Granoff D. M. et al. 1995. Antibody responses to the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis serogroup B in patients with meningococcal disease. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2: 574-582; Romero J. D. and Outschoorn I. M. 1997. The immune response to the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis group B. Zentralbl. Bakteriol. 285: 331-340; Stein D. M. et al. 2005. Are antibodies to the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis group B and Escheríchia coli Kt associated with immunopathology?. Vaccine. Article in press).
Los estudios encaminados a lograr que el blanco de Ia respuesta inmune en una vacuna formulada para combatir Ia enfermedad meningocóccica causada por el serogrupo B sea el polisacárido capsular tienen su base en dos razones fundamentales, en primer lugar esta es Ia estructura más conservada dentro del serogrupo por lo que una vacuna basada en él protegería de Ia infección a un elevado número de casos, mucho mayor que los casos que serían cubiertos por vacunas basadas en proteínas de Ia membrana externa que inducen anticuerpos de limitada reactividad cruzada con otras cepas, y Ia segunda razón es Ia ausencia de efectos ¡nmunopatológicos en individuos con anticuerpos anti-polisacárido B circulantes en suero como se ejemplificó anteriormente.
Varias estrategias se han empleado con el objetivo de incrementar Ia inmunogenicidad del polisacárido B (Bartoloni A. et al. 1995. Immunogenicity of meningococcal B polysaccharide conjugated to tetan us toxoid or CRM 197 vía adipic acid dihydrazide. Vaccine, 13: 463- 470; Devi S. J. et al. 1997. Preclinical evaluation of group B Neissería meningitidis and Escherichia coli K92 capsular polysaccharíde-protein conjúgate vaccines in juvenile rhesus monkeys. Infect. Immun. 65: 1045-1052). Por ejemplo, Ia inmunización con glicoconjugados de un derivado del polisacárido B del menningococo, en el que los grupos N-acetilo del mismo se sustituyeron por grupos N-propionilo, indujo Ia producción de dos poblaciones de anticuerpos: una minoritaria, que se adsorbió con soluciones de polisacárido B purificado a partir de Ia bacteria, que no mostró actividad bactericida ni protectora y una mayoritaria, que no se adsorbió al polisacárido B purificado, caracterizada por ser de isotipo IgG, que mostró actividad bactericida contra varias cepas del serogrupo B de N. meningitidis, fue capaz de reducir o eliminar Ia bacteremia en ratones retados con dosis letales del meningococo y no reconoció tejidos humanos (Jennings H. J. et al. 1987. N-propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique epitope on group B Neissería meningitidis. J Exp Med 165: 1207- 1211 ; Jennings H. J. et al. 1986. Induction of meningococcal group B polysaccharide-specific IgG antibodies in mice by using an N-propionylated B polysaccharide-tetanus toxoid conjúgate vaccine. J Immunol 137: 1708-1713; Ashton F. E. et al. 1989. Protective efficacy of mouse serum to the N-propionyl derivative of meningococcal group B polysaccharide. Microb Pathog 6: 455-458; Michon F. et al. 1987. Conformational differences between linear alpha (2 — 8)-linked homosialooligosaccharides and the epitope of the group B meningococcal polysaccharide. Biochemistry 26: 8399- 8405; Pon R. A. et al. 1997. N-Propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidal capsular epitope in-group B Neissería meningitidis. J. Exp. Med. 185: 1929-1938). Estos resultados indican Ia presencia de dos epitopos fundamentales en el polisacárido B de Neissería meningitidis: el primero detectable cuando el polisacárido se encuentra en forma de cadenas cortas, tal como se presenta en Ia superficie de las células humanas, o arrollado al azar, como es común encontrarlo en las soluciones del polisacárido purificado (Díaz R. J. and Outschoorn I. M. 1994. Current status of meningococcal group B vaccine candidates: capsular or noncapsular? Clin. Microbiol. Rev. 7: 559-575). Este epitopo genera autoanticuerpos que no son bactericidas. El segundo epitopo es detectable solamente cuando el polisacárido nativo conserva su alta talla molecular y se encuentra arrollado en forma de hélice, tal como se dispone sobre Ia superficie de Ia bacteria. Este segundo epitopo, de naturaleza conformacional, es el responsable de Ia producción de anticuerpos bactericidas y protectores, que no reconocen tejidos humanos. En Ia literatura se describe el aislamiento de anticuerpos monoclonales que se han agrupado de acuerdo a su especificidad y propiedades en dos poblaciones que se corresponden exactamente con las anteriormente explicadas (Pon R. A. et al. 1997. N-Propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bacterícidal capsular epitope In- group B Neissería meningitidis. J. Exp. Med. 185: 1929-1938; Granoff D. M. et al. 1998. Bacterícidal monoclonal antibodies that define unique meningococcal B polysaccharide epitopes that do not cross-react with human polysialic acid. J Immunol 160: 5028- 5036).
En las soluciones de polisacárido B purificado a partir de Ia bacteria, se encuentra presente de forma mayoritaria el epitope no conformacional, compartido con las N- CAM humanas, Io que permitiría explicar Ia baja inmunogenicidad del mismo y Ia escasa actividad bactericida detectada en ios anticuerpos que induce. El cambio conformacional que introduce en este polisacárido Ia sustitución de los grupos N- acetilo por grupos N-propionilo induce Ia producción mayoritaria de anticuerpos no- autoreactivos, bactericidas y protectores. Pero el polisacárido B N-propionilado induce, aunque en baja proporción, una fracción de auto-anticuerpos, Io que provoca cautela en su empleo como vacuna, aun cuando un estudio reciente mostró Ia seguridad de su empleo en humanos como inmunógeno (Buge J. et al. 2004. Clinical evaluation of a group B meningococcal N-propionylated polysaccharide conjúgate vaccine in adult, male volunteers. Vaccine. 22: 1087-1096).
Una alternativa en el diseño de vacunas contra el serogrupo B tomando como blanco de Ia respuesta inmune Ia cápsula de carbohidratos, Ia constituye el empleo como ¡nmunógenos de secuencias peptídicas que constituyan miméticos moleculares específicos del epitopo conformacional responsable de Ia protección, presente en el polisacárido B cuando este se encuentra en su conformación nativa sobre Ia superficie de Ia bacteria. Una de las vías para identificar mimotopos de los polisacáridos capsulares es mediante Ia pesquisa, con anticuerpos, de bibliotecas de péptidos expuestos en fagos filamentosos. El desarrollo de esta tecnología se basa en Ia capacidad de los fagos filamentosos de exponer en su superficie secuencias peptídicas foráneas fusionadas a las proteínas de Ia cápsida viral. Las secuencias peptídicas expuestas en Ia superficie de Ia partícula viral son fácilmente accesibles y potencialmente capaces de unirse de manera específica a las moléculas usadas para Ia selección, y por Io tanto pueden ser seleccionados en base a dicha afinidad. La secuencia de un péptido de una biblioteca escogido por una determinada propiedad puede ser fácilmente deducida de Ia secuencia nucleotídica del fago que Io expone (Parmley S. F. et al. 1988. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purífication of target genes. Gene 73:305-318; Smith G. P. et al. 1993. Librarles ofpeptides and proteins displayed on filamentous phage. Methods Enzymol. 217: 228-257; Cwirla S. E. et al. 1990. Peptides on phage: a vast librar/ of peptides for identifying ligands. Proc. Nati. Acad. Sci. U S A; 87: 6378-6382). Dichos péptidos para poder ser considerados como posibles candidatos vacunales deben ser capaces en primer lugar de unirse a anticuerpos específicos contra el antígeno original, y de inhibir Ia unión de dichos anticuerpos a dicho antígeno y en segundo lugar deben inducir una respuesta inmune caracterizada por Ia presencia de anticuerpos que reconozcan al patógeno y que protejan de Ia infección causada por el mismo. Estos péptidos, que son estructuras reproducibles y bien definidas pueden sustituir al antígeno natural en el proceso de elaboración de vacunas con Ia ventaja adicional de que al estar bien definido el blanco de los anticuerpos inducidos por ellos se elimina Ia posibilidad de inducción de auto-anticuerpos, o sea de anticuerpos que reconozcan tejidos del hospedero humano, evadiéndose por Io tanto Ia posibilidad de desarrollo de enfermedades autoinmunes (Monzavi-Karbassi B. et al. 2002. Peptide mimotopes as surrogate antigens of carbohydrates in vaccine discovery. Trenes. Biotechnol. 20:207-214), Io que sería particularmente importante en el caso del polisacárido capsular del serogrupo B de N. meningitidis. Por otro lado, es posible Ia inmunización directa de animales de experimentación con fagos que exponen péptidos. Esto acelera el proceso de evaluación inmunológica de los posibles candidatos vacunales, ya que se puede evadir el procedimiento tradicional de síntesis de los péptidos y Ia posterior conjugación de los mismos a proteínas portadoras. Se ha demostrado que los fagos filamentosos son proteínas portadoras potentes, capaces de presentar péptidos al sistema inmune de manera efectiva [Meóla A. eí al. 1995. Derivation of vaccines from mimotopes: Immunologic properties of human Hepatitis B virus surface antigen mimotopes displayed on filamentous phage. J. Immunol. 154: 3162-3172: de Ia Cruz V. F. eí al. 1988. Immunogenicity and epitope mapping of foreign sequences vía genetically engineered filamentous phage. J. Biol. Chem. 263: 4318-4322; Greenwood J. et al. 1991. Múltiple display of foreign peptides on a filamentous bacteriophage. Peptides from Plasmodium falciparum circumsporozoite protein as antigens. J. Mol. Biol. 220: 821-827: Willis A. E. eí al. 1993. Immunological properties of foreign peptides In múltiple display on a filamentous bacteriophage. Gene 128: 79-83; Galfré G. eí al. 1996. Immunization with phage-displayed mimotopes. Methods Enzymol. 267: 109-115; Bastien N. et al. 1997. Protective immune responses induced by the immunization of mice with a recombinant bacteriophage displaying an epitope of the human respiratory syncytial virus. Virology 234:118-122; Menéndez T. eí al. 2001. Immunisation with phage- displayed variable región 2 from meningococcal PorA outer membrane protein induces bactericidal antibodies against Neissería meningitidis. Immunol. Lett. 39: 143-148]. Empleando esta metodología se han sido identificados varios péptidos que constituyen miméticos moleculares de las cápsulas polisacarídicas de Cryptococcus neoformans, Streptococcus grupo A, Streptococcus grupo B y el lipooligosacárido de Shigella flexneri entre otros (Valadon P. eí al. 1996. Peptide librarles define the fine specificity of anti-polysaccharide antibodies to Cryptococcus neoformans. J. Mol. Biol. 261 : 11-22; Harris S. L eí al. 1997. Exploring the basis of peptide-carbohydrate crossreactivity: evidence for discrimination by peptides between closely related anti-carbohydrate antibodies. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 2454-2459; Pincus S. H. eí al. 1998. Peptides that mimic the group B Streptococcal type III capsular polysaccharide antigen. J. Immunol. 160: 293-298; Phalipon A. eí al. 1997. Induction of anti-carbohydrate antibodies by phage library-selected pepϋde mimics. Eur. J. Immunol. 27: 2620- 2625).
En el campo de las vacunas contra N. meningitidis también se ha trabajado en Ia identificación de mimotopos de los polisacáridos capsulares de Ia bacteria. Por ejemplo, se reportó el aislamiento de péptidos miméticos del polisacárido capsular del serogrupo A, mediante una selección en una biblioteca de péptidos expuestos en fagos filamentosos, con un anticuerpo monoclonal específico para dicho polisacárido. Los mimotopos identificados fueron capaces de inhibir Ia unión de sueros humanos hiperinmunes al antígeno natural y de inducir altos títulos de anticuerpos anti-polisacárido al inmunizar animales de experimentación (Grothaus M. C. et al. 2000. Selection of an immunogenic peptide mimic of the capsular polysaccharíde of N. meningitidis serogroup A using a peptide display library. Vaccine 18: 1253-1263). En el caso del serogrupo C del meningococo, se sintetizó un péptido cuya secuencia se basaba en la de las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo anti-idiotipo, mimético del PSC-C. Al inmunizar ratones con el péptido sintetizado se obtuvo una elevada respuesta de anticuerpos anti-polisacárido C protectores en modelos animales (Westerink M. A. et al. 1995. Peptide mimicry of the meningococcal group C capsular polysaccharíde. Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 92: 4021-4025). La aplicación de Ia tecnología de identificación de mimotopos se ha considerado de vital importancia en Ia búsqueda de un candidato vacunal contra el serogrupo B de N. meningitidis, por las posibilidades que ofrece de dirigir Ia respuesta inmune exactamente contra el epitope conformacional, protector presente en el polisacárido de dicho serogrupo y que no es compartido con las N-CAM humanas. En un trabajo se informó Ia identificación de tales estructuras, empleando 4 anticuerpos monoclonales y 2 bibliotecas de heptapéptidos lineales y cíclicos, pero no se reflejó en Ia publicación Ia evaluación ¡nmunológica de las mismas [Shin J. S. et al. 2001. Monoclonal antibodies specific for Neissería meningitidis group B polysaccharíde and their peptide mimotopes. Infect. Immun. 69: 3335-3342). Posteriormente, en una publicación del año 2004, empleando uno de los anticuerpos monoclonales del trabajo anterior y una biblioteca de dodecapéptidos lineales se informó Ia identificación de 3 nuevas estructuras y se llevó a cabo Ia evaluación inmunológica de los mismos en modelos animales; los sueros reconocieron al meningococo del serogrupo B, pero no se reflejó en Ia publicación Ia evaluación de Ia actividad funcional de dichos anticuerpos (Park I. et al. 2004. Peptide mimotopes of Neisseria meningitidis serogroup B capsular polysaccharíde. Yonsei Medical Journal. 45: 755- 758). Granoff D. M. and Moe G. R, en Ia patente USP 6,642,354 B2 protegieron el empleo en formulaciones vacunales de 67 secuencias peptídicas, que fueron seleccionados a partir de bibliotecas de péptidos expuestos en fagos, en base a su capacidad de unirse a anticuerpos monoclonales anti-polisacárido B. Dos de ellos se seleccionaron para estudios inmunológicos y para ello fueron sintetizados y los péptidos conjugados a VME de N. meningitidis obtenidas a partir de una cepa del meningococo serogrupo B, mutante de cápsula. En dicha patente informan que Ia inmunización con uno de estos conjugados indujo Ia producción de anticuerpos que mostraron actividad bactericida contra N. meningitidis del serogrupo B. Teniendo en cuenta que este péptido estaba conjugado a VME, cuyos componentes fundamentales son las proteínas de Ia membrana externa de Ia bacteria, que esta bien documentada su capacidad de inducción de anticuerpos con actividad bactericida contra el meningococo, se hace difícil Ia interpretación de estos resultados. El empleo de VME como proteína portadora en este estudio dificulta Ia evaluación directa de Ia capacidad de inducción de actividad bactericida por parte del péptido en cuestión. Los autores plantean que una fracción de Ia actividad bactericida detectada en los sueros se debe a los anticuerpos anti-péptido presentes en los mismos ya que al incubarlos con el péptido sin conjugar aumentó Ia sobrevivencia bacteriana (Granoff D. M. and Moe G. R. 2003. Molecular mimetics of unique Neisseria meningitidis serogroup B epítopes. USP 6,642,354 B2). Sin embargo, en las publicaciones en revistas científicas que reflejan estos resultados, informaron que los anticuerpos inducidos por los conjugados péptido-VME, después de Ia inmunización de animales de experimentación, reconocieron solo débilmente el antígeno original y no se refleja Ia evaluación de Ia actividad bactericida de los mismos (Moe G. R. eí al. 1999. Molecular mimetics of polysaccharíde epitopes as vaccine candidates for prevention of Neisseria meningitidis serogroup B disease. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26: 209-269;. Moe G. R and Granoff D. M. 2001. Molecular mimetics of Neisseria meningitidis serogroup B polysaccharíde. Int. Rev .Immunol. 20:201-20),
La alternativa que se ofrece con Ia identificación de mimotopos, específicamente en el campo de las vacunas contra N. meningitidis del serogrupo B, es importante ya que los péptidos que se seleccionan de acuerdo con esta metodología, aún cuando sean completamente distintos del antígeno original, son capaces de conducir a Ia producción de anticuerpos que Io reconocen en su contexto natural, o sea sobre Ia superficie de Ia bacteria, que es donde se forma el epitope conformacional, protector, presente en el polisacárido B. Estos péptidos generan Ia producción de anticuerpos con actividad bactericida y protectora frente a N. meningitidis. También, dado que los anticuerpos que generan estos péptidos no tienen reactividad cruzada con el epitope formado por las cadenas cortas de ácido polisiálico presentes sobre ciertos tejidos humanos, se elimina Ia posibilidad de conducir al desencadenamiento de una respuesta autoinmune. Ellos constituyen, por Io tanto, una fuente alternativa de antígenos que permiten el desarrollo de reactivos de nueva generación, de uso potencial en el diagnóstico, Ia terapia o Ia prevención de enfermedades.
Descripción detallada de Ia invención
En el trabajo objeto de Ia presente invención se reportan por primera vez los péptidos NMGBPS1 , NMGBPS2, NMGBPS3, NMGBPS4, como componentes de reactivos para el diagnóstico o de una formulación vacunal de carácter terapéutico o preventivo contra Ia enfermedad meningocóccica o cualquier infección provocada por un miembro del género Neisseria o por otras bacterias, virus o parásitos.
El carácter novedoso de esta invención reside en el descripción por primera vez de los péptidos NMGBPS1 , NMGBPS2, NMGBPS3, NMGBPS4, como mimotopos moleculares de epitopes presentes en el polisacárido capsular del serogrupo B de Neisseria meningitidis, capaces de inducir Ia producción de anticuerpos bactericidas contra cepas del meningococo pertenecientes a este serogrupo. Estos péptidos pueden emplearse como reactivos para el diagnóstico y/o en formulaciones vacunales para tratar o prevenir Ia enfermedad causada por
' miembros del género Neisseria o por otras bacterias, virus o parásitos.
En Ia presente invención se hace referencia a los aminoácidos empleando el código de una letra (Ej: A-Alanina, W-Triptofano, S-Serina, E-Acido Glutamico, Y-
Tirosina, K-Lisina, F-Fenilalanina, l-lsoleucina, V-Valina, P-Prolina, etc). DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Los fagos seleccionados luego de Ia pesquisa con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B, de Ia biblioteca de péptidos expuestos en fagos, se aplicaron en una membrana de nitrocelulosa y se enfrentaron al anticuerpo selector. En cada punto se aplicaron 30μg de cada uno de los fagos individuales seleccionados. En G5 y en 15 se aplicó el fago control.
Figura 2. Evaluación de Ia reactividad por ELISA de los fagos adsorbidos al anticuerpo selector luego del tercer ciclo de Ia pesquisa realizada a Ia biblioteca. Los fagos fueron purificados individualmente y empleados para recubrir las placas de ELISA. El gráfico muestra Ia Absorbancia a 492nm (A492nm) obtenida en los ELISA para 13 de los fagos evaluados.
Figura 3. Evaluación de Ia reactividad por ELISA de los fagos adsorbidos al anticuerpo selector luego del segundo ciclo de Ia pesquisa realizada a Ia biblioteca. Los fagos fueron purificados individualmente y empleados para recubrir las placas de ELISA. El gráfico muestra Ia Absorbancia a 492nm (A4g2nm) obtenida en los ELISA para 16 de los fagos evaluados.
Figura 4. Evaluación de Ia reactividad, empleando 3 sistemas de ELISA: convencional, sandwich y de inhibición, según se explica en el texto, en el Ejemplo 9, de los fagos que expresan en su superficie los péptidos seleccionados a partir de Ia pesquisa de Ia biblioteca de péptidos expuestos en fagos con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B.
Figura 5. Niveles de anticuerpos (IgG) inducidos después de Ia inmunización de ratones Balb/c con los péptidos NMGBPS1-NMGBPS4 expuestos en fagos filamentosos, evaluados por ELISA. El gráfico muestra los incrementos de anticuerpos específicos detectados en los sueros inmunes, extraídos después de Ia 3ra dosis con respecto a los sueros preinmunes, extraídos antes de las inmunizaciones para los grupos inmunizados con cada uno de los fagos. Figura 6. Fragmentos de péptidos sintetizados sobre membrana de celulosa para Ia determinación de los epitopos reconocidos por el anticuerpo monoclonal anti- polisacárido B y por los sueros murinos inducidos contra el péptido NMGBPS1.
Figura 7. Reactividad del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B (panel izquierdo) y de los sueros murinos inducidos contra el péptido NMGBPS1 (panel derecho) al enfrentarse a una colección de fragmentos de péptidos derivados del péptido NMGBPS1. El diseño de Ia colección de fragmentos del péptido se muestra en Ia Figura 6. Figura 8. Colección de péptidos sintetizados sobre pines, derivados de modificaciones introducidas al péptido NMGBPS1 consistentes en a) Ia sustitución simultánea de las Pro en las posiciones 7 y 8 por una Ala en cada posición y b) introducción de 1 a 3 cambios puntuales en Ia secuencia de unión al anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. El péptido 1 se corresponde con Ia secuencia de NMGBPS1.
Figura 9. Reactividad de Ia colección de péptidos sintetizados sobre pines y presentados en Ia Figura 8, al enfrentarse al anticuerpo monoclonal anti- polisacárido B. Los números de los péptidos se corresponden con Ia lista mostrada en Ia Figura 8. La barra 1 se corresponde con Ia reactividad con el péptido NMGBPSl
Figura 10. Reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B de los péptidos, basados en Ia secuencia de NMGBPS1 , en los que sustituyó en cada caso Vi2 por A (péptido 5), Vi2 por S (péptido 11), Vi2 por E (péptido 12), V9 por A (péptido 16), Yn por E (péptido 14) ó Yn por I (péptido 2). En todos los casos se sustituyeron simultáneamente P7 y P8 por una A en cada posición. Los números de los péptidos se corresponden con Ia lista mostrada en Ia Figura 8. La barra 1 (péptido 7) se corresponde con Ia reactividad con el péptido NMGBPS1 al que se Ie sustituyeron simultáneamente las P7 y P8 por una A en cada posición. Figura 11. Reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B de los péptidos, basados en Ia secuencia NMGBPS1 , en los que se sustituyó el aminoácido E13 y adicionalmente se sustituyeron aminoácidos en otras posiciones, según muestra Ia Figura 8. En todos los casos se sustituyeron simultáneamente P7 y P8 por una A en cada posición. Los números de los péptidos se corresponden con Ia lista mostrada en Ia Figura 8. La barra 1 (péptido 7) se corresponde con Ia reactividad con el péptido NMGBPS1 al que se Ie sustituyeron simultáneamente las P7 y P8 por una A en cada posición.
Figura 12. Colección de péptidos sintetizados sobre pines, derivados de modificaciones introducidas al péptido NMGBPS1 consistentes en a) Ia sustitución de Vi2 por Ai2, Si2 y Ei2 y b) Ia sustitución de P7 por A7 o de P8 por A8. El péptido 1 se corresponde con Ia secuencia de NMGBPS1 Figura 13. Reactividad de Ia colección de péptidos sintetizados sobre pines y presentados en Ia Figura 12 al enfrentarse al anticuerpo monoclonal anti- polisacárido B.
Figura 14. Reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B de péptidos basados en Ia secuencia NMGBPS1 (barra 1), en los que se introdujeron las modificaciones 1) sustitución de W10 por F10 y 2) Ia sustitución de P7 por A7 o de P8 por AB. En el gráfico se muestra Ia secuencia de cada péptido evaluado.
Figura 15. Inhibición de Ia unión del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B al polisacárido capsular del serogrupo B de Neissería meningitidis, empleando como ligandos a) péptido que contiene 3 copias de Ia secuencia mínima necesaria para la unión del péptido NMGBPS1 al anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B; b) péptido NMGBPS1 y c) péptido control.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1. Pesquisa de Ia biblioteca de péptidos expuestos en fagos con un anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B de Neissería meningitidis.
Para Ia definición de los péptidos descritos en Ia presente invención se construyó una biblioteca de péptidos lineales de 15 aminoácidos expresados en Ia región P8 de fagos filamentosos y se realizó el pesquizaje de Ia misma usando como molécula selectora un anticuerpo monoclonal murino con actividad bactericida contra N. meningitidis del serogrupo B y que no reconoce tejidos humanos (Pon R. A. eí al. 1997. N-Propionylatθd group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidal capsular epitope in-group B Neissería meningitidis. J. Exp. Med. 185: 1929-1938). La pesquisa de Ia biblioteca se llevó a cabo en forma de ciclos según se describe en la literatura (Smith G. P. et al. 1993. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. Methods Enzymol. 217: 228-257), excepto que el anticuerpo se adsorbieron directamente al soporte sólido. Después de enfrentar los fagos al anticuerpo, se recogió y tituló Ia fracción de fagos que no se adsorbió al anticuerpo (fracción N1). También se recogió y tituló Ia fracción de fagos que se adsorbió al anticuerpo (fracción A1). Se calculó el cociente título N1/ título A1. La fracción A1 fue amplificada y enfrentada al anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B y nuevamente se recogieron y titularon las fracciones adsorbida y no adsorbida al anticuerpo. Este proceso en forma de ciclos se repitió hasta que el cociente titulo N/ titulo A dio menor que 103. En total se realizaron cuatro ciclos de pesquisa. La Tabla 1 muestra los valores obtenidos al titular las fracciones A y N obtenidas después de cada ciclo de pesquisa. La tabla también muestra el título de Ia fracción A obtenida en cada ciclo de pesquisa después de amplificada y purificada para ser empleada en el siguiente ciclo.
Tabla 1. Títulos, expresados como Unidades de Transducción de resistencia a ampicillina Uta/mL, de las fracciones A y N obtenidas en cada ciclo de pesquisa y los cocientes de los títulos de N/A correspondientes a cada caso. AamP: fracción A amplificada y purificada.
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Los fagos adsorbidos al anticuerpo selector luego del cuarto ciclo de pesquisa de Ia biblioteca fueron empleados para infectar células XL-1 blue y varias diluciones se vertieron sobre placas de agar con medio de cultivo 2XYT. Las placas de fagos individuales se seleccionaron y amplificaron en cultivos líquidos. Los fagos se purificaron mediante precipitación con polietilenglicol.
Ejemplo 2. Reactividad con el anticuerpo selector de los fagos seleccionados después del cuarto ciclo de pesquisa de Ia biblioteca.
Se aplicaron sobre membrana de nitrocelulosa 30 ug de los fagos purificados. Se aplicó igual cantidad del fago control negativo. La membrana luego de bloqueada con leche descremada, se incubó con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. La reactividad se reveló, luego de incubar con anticuerpos que reconocen IgG de ratón conjugados a Ia enzima peroxidasa de rábano picante, con una solución que contenía H2O2 y el cromógeno diaminobencidina. La Figura 1 muestra los resultados obtenidos. Veinticinco de los fagos correspondientes a los puntos donde se obtuvieron señales de mayor intensidad fueron seleccionados para continuar el trabajo.
Ejemplo 3 Purificación y secuenciación del ADN de los fagos seleccionados después del cuarto ciclo de pesquisa de Ia biblioteca con el anticuerpo monoclonal anti-polϊsacárido B.
Se purificó el ADN de 25 de los fagos que resultaron positivos en el experimento de inmunoidentificación y se les determinó Ia secuencia nucleotídica. La purificación del ADN de los fagos se llevó a cabo según se describe (Sambrook J. et al. 1989. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edn, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, USA). La secuenciación del ADN viral se realizó empleando el secuenciador automático ALFexpressIl (Termo Sequenase™ Cy™ 5 Dye Terminador Kit, Amersham Biosciences) y los oligonucleotidos M13/pUC Sequencing primer (-47) #1224, New England Biolabs Inc., USA) y M13/pUC Reverse sequencing primer (-48) #1233, New England Biolabs Inc., USA). En todos los clones se obtuvo Ia misma secuencia, Ia cual se muestra en Ia lista de secuencias (No. Identificación de secuencia: 1). El péptido correspondiente a Ia traducción de esta secuencia de ADN a secuencia de proteína se muestra en Ia lista de secuencias (No. Identificación de secuencia: 5).
Ejemplo 4. Caracterización de Ia secuencia del péptido expresado en los fagos seleccionados después del cuarto ciclo de pesquisa de Ia biblioteca con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. Para el análisis de Ia secuencia expuesta en los fagos seleccionados después del cuarto ciclo de pesquisa de Ia biblioteca se realizó un alineamiento de Ia misma con otras secuencias de estructuras miméticas del polisacárido B de N. meningitidis reportadas (Shin J. S. et al. 2001. Monoclonal antibodies specific for Neisseria meningitidis group B polysaccharide and their peptide mimotopes. Infect. Immun. 69: 3335-3342; Park I. et al. 2004. Peptide mimotopes of Neisseria meningitidis serogroup B capsular polysaccharide. Yonsei Medical Journal. 45: 755-758; Moe G. R. et al. 1999. Molecular mimetics of polysaccharide epitopes as vaccine candidates for prevention of Neisseria meninαitidis serogroup B disease. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26: 209-269; Moe G. R and Granoff D. M. 2001. Molecular mimetics of Neisseria meninαitidis serogroup B polysaccharide. Int. Rev .Immunol. 20:201-20; Granoff D. M. and Moe G. R. 2003. Molecular mimetics of unique Neisseria meninαitidis serogroup B epítopes. USP 6,642,354 B2), no encontrándose en ningún caso porcientos de similaridad mayores del 29 %. Para realizar el alineamiento se empleó el programa Clustal W (Thompson J. D. et al. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix chotee. Nucleic Acids Res. 22:4673-80). La secuencia obtenida también se caracterizó mediante una búsqueda de similitud en Ia base de datos del NCBI empleando el programa BLASTP 2.2.10 (Altschul S. F. et al. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). La búsqueda se subscribió a las secuencias de genes y proteínas de bacterias contenidas en las bases de datos SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) y NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los resultados de este procedimiento indicaron que no existían porcientos de similaridad del péptido NMGBPS 1 contra las secuencias depositadas en estas bases de datos mayores del 30%. Ejemplo 5 Reactividad con el anticuerpo selector de los fagos seleccionados después del tercer ciclo de pesquisa de Ia biblioteca. Con el objetivo de identificar otras estructuras miméticas del polisacárido B de N. meningitidis, se evaluaron por ELISA los fagos adsorbidos al anticuerpo anti- polisacárido B luego del tercer ciclo de Ia pesquisa realizada a Ia biblioteca. Los fagos fueron purificados individualmente y empleados recubrir placas de ELISA. Se incluyeron en el experimento el fago control y el fago que expone el péptido NMGBPS1. Luego de bloquear con leche descremada, se incubó con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. La reactividad se reveló, luego de incubar con anticuerpos que reconocen IgG de ratón conjugados a Ia enzima peroxidasa de rábano picante, con una solución que contenía H2O2 y el cromógeno o-fenilen diamina (OPD). La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2.5 N y Ia A492nm se leyó en un lector de placas de ELISA. La Figura 2 muestra los resultados obtenidos para varios de los fagos purificados. Veinte fagos correspondientes con los que dieron señales de mayor intensidad en el ELISA, con respecto a Ia señal obtenida para el control, fueron seleccionados para continuar el trabajo. Ejemplo 6 Purificación y secuenciación del ADN de los fagos seleccionados después del tercer ciclo de pesquisa de Ia biblioteca con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B.
Se purificó y secuenció el ADN de 20 de los fagos que resultaron positivos en el experimento de inmunoidentificación por ELISA, siguiendo idéntico procedimiento al descrito en el Ejemplo 3.
En todos los clones se obtuvo Ia misma secuencia que se había obtenido para los fagos aislados del cuarto ciclo de pesquisa y que se muestra en Ia lista de secuencias con el No. Identificación de secuencia 1 y cuya secuencia de aminoácidos correspondiente a Ia traducción de esta secuencia de ADN se muestra en Ia lista de secuencias con el No. Identificación de secuencia 5.
Ejemplo 7 Reactividad con el anticuerpo selector de los fagos seleccionados después del segundo ciclo de pesquisa de Ia biblioteca. Para continuar Ia búsqueda de otras estructuras miméticas del polisacárido B de N. meningitidis, se evaluaron por ELISA los fagos adsorbidos al anticuerpo anti- polisacárido B luego del segundo ciclo de Ia pesquisa realizada a Ia biblioteca. Los fagos fueron purificados individualmente y empleados para recubrir placas de ELISA. Se incluyeron en el experimento el fago control y el fago que expone el péptido NMGBPS1. Luego de bloquear con leche descremada, se incubó con el anticuerpo monoclonal anticuerpo anti-polisacárido B.
La reactividad se reveló, luego de incubar con anticuerpos que reconocen IgG de ratón conjugados a Ia enzima peroxidasa de rábano picante, con una solución que contenía H2O2 y el cromógeno o-fenilen diamina (OPD). La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2.5 N y Ia A492nm se leyó en un lector de placas de ELISA.
La Figura 3 muestra los resultados obtenidos para varios de los fagos purificados. Quince fagos correspondientes con los que dieron señales de mayor intensidad en el ELISA, con respecto al fago control, fueron seleccionados para continuar el trabajo. Ejemplo 8 Purificación y secuenciación del ADN de los fagos seleccionados después del segundo ciclo de pesquisa de Ia biblioteca con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B.
Se purificó y secuenció el ADN de 15 de los fagos que resultaron positivos en el experimento de inmunoidentificación, siguiendo idéntico procedimiento al descrito en el Ejemplo 3. Un total de 5 secuencias únicas fueron identificadas. La Tabla 2 refleja Ia frecuencia con que apareció cada secuencia expuesta en los fagos. La secuencia 1 se correspondió con Ia del péptido NMGBPS1.
Tabla 2. Cinco secuencias únicas fueron identificadas como expuestas en los fagos filamentosos luego de dos ciclos de pesquisa de Ia biblioteca de péptidos con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. La secuencia 1 , idéntica a Ia del péptido NMGBPS1 , fue Ia que apareció con mas frecuencia.
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Ejemplo 9 Caracterización mediante ELISAs de Ia reactividad de los péptidos expuestos en los fagos filamentosos seleccionados luego de Ia pesquisa de Ia biblioteca. Se seleccionó un fago que expresara cada una de las secuencias únicas identificadas en el Ejemplo 8 para realizar un estudio más amplio de su reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. Se llevaron a cabo 3 experimentos de ELISA: 1) tipo convencional donde los fagos fueron aplicados directamente sobre las placas de polipropileno, luego se añadió el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B y finalmente inmunoglobulinas anti-lgG de ratón; 2) tipo sandwich donde se aplicó directamente a Ia placa de ELISA el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B, luego los fagos, después un suero anti-fago M13 obtenido en conejos y finalmente inmunoglobulinas anti-lgG de conejo; 3) de inhibición donde se recubrieron las placas con una solución de polisacárido B purificado a partir de Ia bacteria y se añadieron mezclas del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B con los fagos, finalmente se añadieron inmunoglobulinas anti-lgG de ratón. En todos los casos las últimas inmunoglobulinas añadidas estaban conjugadas a Ia enzima peroxidasa de rábano picante y ja reactividad se reveló con una solución que contenía H2O2 y el cromógeno o-fenilen diamina (OPD). La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2.5 N y Ia A492nm se leyó en un lector de placas de ELISA. La Figura 4 muestra los resultados obtenidos. Los clones de fagos que expresaban las secuencias únicas 2, 3 y 5, mostradas en Ia Tabla 2, se comportaron de manera similar al péptido NMGBPS1 en los 3 ELISAs, mientras que el clon de fagos que expresaba Ia secuencia única 4, mostrada en Ia Tabla 2, se comportó de manera similar al fago control en los 3 ELISAs. Los péptidos 2, 3 y 5, seleccionados para continuar el trabajo, se renombraron como NMGBPS2, NMGBPS3 y NMGBPS4, respectivamente.
Las secuencias de ADN correspondientes a los fagos NMGBPS2, NMGBPS3 y NMGBPS4 se muestran en Ia lista de secuencias (No. Identificación de secuencia: 2, 3 y 4, respectivamente). Los péptidos correspondientes a Ia traducción de estas secuencias de ADN a secuencias de proteínas se muestran en Ia lista de secuencias (No. Identificación de secuencia: 6, 7 y 8 respectivamente). La Tabla 2 muestra Ia correspondencia entre los fagos identificados y los números de identificación de secuencias.
Ejemplo 10 Caracterización de las secuencias de los péptidos expresados en los fagos seleccionados después del segundo ciclo de pesquisa de Ia biblioteca con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B
Para el análisis de las secuencias expuestas en los fagos seleccionados después del segundo ciclo de pesquisa de Ia biblioteca se realizó un alineamiento de las mismas con otras secuencias de estructuras miméticas del polisacárido B de N. meningitidis reportadas en publicaciones (Shin J. S. et al. 2001. Monoclonal antihodies specific for Neissería meningitidis group B polysaccharide and their peptide mimotopes. Infect. Immun. 69: 3335-3342; Park I. et al. 2004. Peptide mimotopes of Neissería meningitidis serogroup B capsular polysaccharide. Yonsei Medical Journal. 45: 755-758; Moe G. R. eí al. 1999. Molecular mimetics of polysaccharide epitopes as vaccine candidates for prevention of Neisseria meningitidis serogroup B disease. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26: 209-269;
Moe G. R and Granoff D. M. 2001. Molecular mimetics of Neisseria meningitidis serogroup B polysaccharide. Int. Rev .Immunol. 20:201-20; Granoff D. M. and
Moe G. R. 2003. Molecular mimetics of unique Neisseria meningitidis serogroup B epitopes. USP 6,642,354 B2), no encontrándose en ningún caso porcientos de similaridad mayores del 30 % para el péptido NMGBPS2, ni mayores del 33 % para el péptido NMGBPS3, ni mayores del 40 % para el péptido NMGBPS4. Para realizar el alineamiento se empleó el programa Clustal W (Thompson J. D. et al. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-80). Las secuencias obtenidas también se caracterizaron mediante una búsqueda de similitud en Ia base de datos del NCBl empleando el programa BLASTP 2.2.10 (Altschul S. F. ef al. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). La búsqueda se subscribió a las secuencias de genes y proteínas de bacterias contenidas en las bases de datos SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) y NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los resultados de este procedimiento indicaron que no existían porcientos de similaridad contra las secuencias depositadas en estas bases de datos mayores del 30% para los péptidos NMGBPS 2 y 4, ni mayores del 35% para el péptido NMGBPS3.
Ejemplo 11 Inmunización de ratones Balb/c por vía intraperitoneal con los fagos que expresan en su superficie los péptidos NMGBPS1-NMGBPS4
Para evaluar Ia inmunogenicidad de los péptidos NMGB&S1-NMGBPS4, se diseñó un esquema de inmunización en ratones Balb/c, en el que se inocularon los animales directamente con los fagos que exponen dichos péptidos. Los fagos fueron purificados mediante gradientes de cloruro de cesio, siguiendo una modificación del procedimiento de purificación 1 (Lin T.C. eí al. 1980. Isolation and characterization of the C and D proteins coded by gene IX and gene Vl in the filamentous bacteriophage fl and fd. J. Biol. Chem. 255: 10331-10337), descrito por de Ia Cruz y colaboradores (de Ia Cruz F.V. ef al. 1988. Immunogenicity and epitope mapping of foreign sequences via genetically engineered filamentous phage. J. Biol. Chem. 25: 4318-4322).
Con cada fago se inmunizó un grupo de 7 ratones Balb/c (H-2d, sexo femenino, 7- 8 semanas de edad). Se administraron 1011 partículas virales por ratón en cada inoculación. Un grupo de ratones se inmunizó con 5 ug por ratón en cada inoculación de polisacárido B de N. meningitidis N-propionilado (pPSC-B) (Jennings H. J. et al. 1986. Induction of meningococcal group B polysaccharide- specific IgG antibodies in mice by using an N-propionylated B polysaccharide- tetanus toxoid conjúgate vaccine. J Immunol 137: 1708-1713) conjugado a Ia proteína Albúmina de suero humano (HSA) (pPSC-B/HSA). Se realizaron 3 inmunizaciones por vía intraperitoneal, separadas por un intervalo de 15 días. Todos los inmunógenos fueron emulsificados con adyuvante completo de Freund en Ia primera dosis y con adyuvante incompleto de Freund en las dosis sucesivas. En Ia Tabla 3 se describe Ia composición de los grupos:
Tabla 3. Grupos de ratones e ¡nmunógenos empleados para Ia evaluación inmunológica de los péptidos seleccionados a partir de Ia pesquisa, con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B, de Ia biblioteca de péptidos expuestos en fagos.
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Ejemplo 12 Evaluación mediante ELISA de Ia inmunogenicidad de los péptidos NMGBPS1-NMGBPS4
Los niveles de anticuerpos (IgG) inducidos por los péptidos NMGBPS1- NMGBPS4 expuestos en fagos filamentosos fueron evaluados mediante ELISA. Los sueros de los animales, obtenidos luego de Ia tercera inoculación, fueron evaluados empleando como antígenos de recubrimiento péptidos sintéticos con las secuencias de los péptidos identificados. La Figura 5 muestra que los niveles de anticuerpos IgG específicos contra los péptidos expuestos en los fagos, después de tres inmunizaciones con los mismos incrementaron significativamente. Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el método no paramétrico de análisis de varianza de clasificación simple por rangos de Kruskal-Wallis, debido a que las varianzas entre los grupos no eran homogéneas según Ia Prueba de Bartlett. Para hacer las comparaciones múltiples no paramétricas se realizó Ia prueba Dunns.
Ejemplo 13 Evaluación mediante ensayo de actividad bactericida de los anticuerpos inducidos por los péptidos seleccionados a partir de Ia pesquisa de Ia biblioteca de péptidos expuestos en fagos con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B.
Mezclas de sueros de los ratones de cada grupo inoculados con cada inmunógeno fueron evaluados mediante ensayo de actividad bactericida. Se aplicó el ensayo empleado por Ashton y colaboradores (Ashton F. E. et al. 1989. Protective efficacy ofmouse serum to the N-propionyl derívative of meningococcal group B polysaccharíde. Microb. Pathog. 6: 455-458), para Ia evaluación de anticuerpos dirigidos contra el polisacárido B del meningococo, pero en lugar de emplear Ia solución tampón recomendada por estos investigadores, se empleó solución Veronal suplementada con BSA que se recomienda para incrementar Ia sensibilidad del ensayo de actividad bactericida cuando se evalúan anticuerpos dirigidos contra el serogrupo B de N. meningitidis (Mandrell R. E. et al. 1995. Complement-mediated bactericidal activity of human antibodies to poly alpha 2- >8 N-acetylneuraminic acid, the capsular polysaccharíde of Neissería meninαitidis serogroup B. J. Infecí. Dis. 172: 1279- 1289). Se empleó para el ensayo Ia cepa de N. meningitidis CU385, de clasificación serológica B:4:P1.19,15. El título de anticuerpos bactericidas fue expresado como el recíproco de Ia mayor dilución de anticuerpos evaluada, capaz de matar al menos el 50% de las bacterias. La Tabla 4 muestra los resultados de Ia evaluación.
Tabla 4. Resultados de Ia evaluación de Ia actividad bactericida en los sueros de los ratones inmunizados con los fagos que exponen los péptidos seleccionados a partir de Ia pesquisa de Ia biblioteca de péptidos expuestos en fagos con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. Se evaluaron mezclas de los sueros de los ratones inoculados con cada inmunógeno contra Ia cepa CU385 de N. meningitidis perteneciente al serogrupo B. TAB: Títulos de actividad bactericida detectados en las mezclas de sueros. NT: No título.
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Ejemplo 14. Mapeo de las regiones de los péptidos reconocidas por el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B y por los sueros murinos.
La síntesis sobre membranas de celulosa de colecciones de fragmentos de péptidos de cinco residuos solapados en cuatro que cubrieran las secuencias enteras de los péptidos NMGBPS 1-4, y de fragmentos de dichos péptidos que contenían deleciones sucesivas de aminoácidos a partir del extremo amino terminal y del extremo carboxilo terminal y de ambos extremos simultáneamente, se seleccionó como metodología para el estudio de las regiones de los mismos reconocidas por el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B y por los sueros de los ratones inmunizados con dichos péptidos expuestos en fagos filamentosos. La Figura 6 se muestra el diseño de los fragmentos de péptidos sintetizados para el mapeo de las regiones del péptido NMGBPS1. La Figura 7 (panel izquierdo) muestra los resultados obtenidos al incubar Ia membrana de celulosa con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. De los péptidos de 5 aminoácidos se reconocieron los correspondientes con las secuencias VWYVE y WYVEG. Este resultado y el análisis del patrón de reactividad obtenido con el resto de los péptidos permite concluir que Ia secuencia mínima dentro del péptido NMGBPS1 , necesaria para Ia unión del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B es el tetrapéptido WYVE. La Figura 7 (panel derecho) muestra que al realizar similar experimento, pero incubando Ia colección de péptidos sintetizados sobre papel con una mezcla de los sueros de los ratones inmunizados con el péptido NMGBPS1 expuesto sobre fagos filamentosos, se obtuvo reconocimiento del fragmento de péptido con Ia secuencia WYVEG, Io que se corresponde con los resultados obtenidos para el anticuerpo monoclonal. También se reconoció por Ia mezcla de los sueros los puntos correspondientes a los fragmentos de péptidos de secuencia RPPVW y PPVWY, Io cual indicó Ia formación de un segundo epitopo en el péptido NMGBPS1 , capaz de inducir Ia producción de anticuerpos. Mediante estudios de predicción de Ia estructura del péptido NMGBPS1 se pudo determinar que para Ia formación de este segundo epitopo es fundamental Ia presencia de las P, ya que introducen giros en Ia estructura del péptido que hacen que se expongan los residuos adyacentes a las mismas, Io cual favorecería Ia presentación de esta región del péptido al sistema inmune.
Ejemplo 15 Síntesis de colecciones de péptidos en los que se introducen mutaciones puntuales a los péptidos NMGBPS1-4 y reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B.
Tomando en consideración los resultados derivados de los experimentos realizados de acuerdo al Ejemplo 14 nos planteamos Ia búsqueda de variantes de los péptidos NMGBPS1-4 que 1) no contuvieran regiones adicionales a Ia región de unión del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B, con Ia capacidad de inducción de respuesta inmune y/o 2) que tuvieran mayor afinidad por el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. Para lograr este objetivo seleccionamos como metodología, Ia síntesis de colecciones de péptidos en los que las P fueron sustituidas por A y se introdujeron de 1 a 3 cambios puntuales en los aminoácidos correspondientes a Ia secuencia de unión del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. Los aminoácidos originales se sustituyeron por otros teniendo en cuenta similitud en cuanto a carga, hidrofobicidad e hidrofilicidad, polaridad, homología estructural y volumen de las cadenas laterales de los residuos. También se sintetizaron péptidos en los que en cada posición fue introducida una A.
La Figura 8 muestra Ia colección de péptidos sintetizados para Ia optimización del péptido NMGBPS1. El péptido 1 se corresponde con Ia secuencia de NMGBPS1. En todos los péptidos se sustituyeron simultáneamente las Pro de las posiciones 7 y 8 por Ala en ambas posiciones. En las posiciones correspondientes a los aminoácidos necesarios para Ia unión del anticuerpo anti-polisacárido B se introdujeron de uno a tres cambios puntuales, tomando en cuenta los criterios explicados en el párrafo anterior. La Figura 9 muestra Ia reactividad obtenida al enfrentar Ia colección de péptidos mostrados en Ia Figura 8 al anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. La sustitución simultánea de P7 por A7 y de Pa por A8 (péptido 7, Figura 9) disminuyó Ia afinidad de Ia unión del péptido NMGBPS1 (péptido 1 , Figura 9) por el anticuerpo anti-polisacárido B. Teniendo esto en cuenta, al analizar Ia reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B de los demás péptidos sintetizados se tomó como control positivo Ia reactividad del péptido que conservaba intacto el epitope de unión del anticuerpo monoclonal, pero que en cada posición 7 y 8 tenía una A (péptido 7, Figura 9). Esto nos permitió identificar que Ia posición 12, donde en el péptido original se encuentra una V, es una posición favorable para Ia introducción de cambios. Por ejemplo, el cambio de Ia Vi2 por Ai2 (péptido 5, Figura 10) incrementó Ia afinidad de Ia unión al anticuerpo monoclonal con respecto al control positivo (péptido 7, Figura 10), mientras que Ia sustitución por Si2 (péptido 11 , Figura 10) ó por Ei2 (péptido 12, Figura 10), permitió que se conservara mas del 85% de Ia reactividad con el anticuerpo monoclonal con respecto al control positivo (péptido 7, Figura 10). En los péptidos con las sustituciones Vg por A9 (péptido 16, Figura 10), Yn por En (péptido 14, Figura 10) o Yn por In (péptido 2, Figura 10) se conservó mas del 75% de Ia reactividad hacia el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B con respecto al control positivo ((péptido 7, Figura 10). Al introducir cambios en otras posiciones se detectó que Ia reactividad de los péptidos con el anticuerpo monoclonal estuvo por debajo del 75% de Ia reactividad con respecto al control positivo. Las secuencias correspondientes a los péptidos mostrados en Ia Figura 8 como 2, 5, 7, 11 , 12, 14 y 16 se muestran en Ia lista de secuencias como Seq ID 9, Seq ID 10, Seq ID 11 , Seq ID 12, Seq ID 13, Seq ID 14 y Seq ID 15. En Ia Figura 11 se muestran los péptidos en los que en Ia posición 13 se realizaron sustituciones. Se observa que esta posición, donde en el péptido original se encuentra un E, no es favorable para Ia introducción de cambios, ya que al sustituir este aminoácido Ia reactividad con el anticuerpo monoclonal que se detecta es muy baja comparada con Ia reactividad con el control positivo (péptido 7, Figura 11) y ningún otro cambio que se introdujo en otro aminoácido mejoró Ia reactividad con el anticuerpo cuando el aminoácido Ei3 fue cambiado. Por Io que se muestra que el ácido glutamico presente en Ia secuencia peptidica es esencial para el reconocimiento.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se diseñaron y sintetizaron nuevos péptidos, en los que solamente se sustituía una de las P por A y se tomaron en cuenta solamente las sustituciones en Ia secuencia de unión del anticuerpo anti- polisacárido B que permitían conservar mas del 85% del total de Ia reactividad con el anticuerpo detectada para el péptido control.
La Figura 12 muestra Ia segunda colección de péptidos que se sintetizó para continuar Ia optimización de Ia secuencia del péptido NMGBPS1. La secuencia 1 se corresponde con el péptido NMGBPS1. Se sintetizaron péptidos en los que Ia secuencia de unión del anticuerpo anti-polisacárido B solamente contenía cambios en Ia V12 por Ai2, Si2 y Ei2 y cada una de estas variantes de péptidos fue sintetizada conteniendo a su vez cambios en alguna de las P por A. Como controles del experimento se sintetizaron péptidos similares pero conteniendo todas las P del péptido original o todas las P cambiadas por A. La Figura 13 muestra Ia reactividad obtenida al enfrentar Ia colección de péptidos presentados en Ia Figura 12 al anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B. La sustitución de P7 por A7 permite que se recupere el 97% de Ia reactividad con el anticuerpo si se conserva intacto el epitope de unión del anticuerpo anti-polisacárido B y el 81 % de Ia reactividad cuando se introdujo el cambio Vi2 por Ai2. Las secuencias correspondientes a los péptidos mostrados en Ia Figura 8 como 2-12 se muestran en Ia lista de secuencias como SeqID 16, SeqID 17, SeqID 18, SeqID 19, SeqID 20, SeqID 21 , SeqID 22, SeqID 23, SeqID 24, SeqID 25 y SeqID 26. En otro experimento se evaluó Ia reactividad de péptidos en los que el aminoácido W se sustituyó por F. La Figura 14 muestra Ia reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B de péptidos basados en Ia secuencia NMGBPS1 , en los que se introdujo el cambio Wi0 por Fi0, y adicionalmente cambios en P7 por A7 o en Ps por As. En Ia Figura 10 se muestran las secuencias de los péptidos sintetizados. Se conservó un 86% de Ia reactividad con el anticuerpo, con respecto al péptido NMGBPS1 , en el péptido donde se sustituyó P7 por A7, al sustituir W-io por Fio (péptido 2, Figura 14). Las secuencias correspondientes a los péptidos mostrados al pie de las barras 2, 3 y 4 de Ia Figura 14 se muestran en Ia lista de secuencias como SeqID 27, SeqID 28 y SeqID 29. Ejemplo 16 Síntesis de péptidos que contienen varias copias de Ia secuencia necesaria para Ia unión del anticuerpo monoclonal anti- polisacárido B a los péptidos NMGBPS1-4.
Otra estrategia que nos propusimos para definir péptidos con mayor afinidad por el anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B, fue Ia síntesis de péptidos con varias copias, una a continuación de Ia otra, de Ia secuencia mínima necesaria para Ia unión del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B de los péptidos NMGBPS1-4. Esta estrategia, adicionalmente, limitaría Ia respuesta inmune contra los péptidos NMGBPS1-4 solamente a Ia región necesaria para Ia unión del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B.
Se sintetizaron los péptidos y se realizaron ELISAs donde se evaluó Ia capacidad de los nuevos péptidos, con respecto a los péptidos originales, de inhibir Ia unión del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B al polisacárido B del meningococo. Las placas de poliestireno se recubrieron con una solución de polisacárido B purificado a partir de Ia bacteria y se añadieron mezclas del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B, a una concentración fija (5ug/ml), con soluciones de diferentes concentraciones de los péptidos. A continuación se añadieron inmunoglobulinas anti-lgG de ratón conjugadas a Ia enzima peroxidasa de rábano picante y Ia reactividad se reveló con una solución que contenía H2O2 y el cromógeno o-fenilen diamina (OPD). La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2.5 N y Ia A492nm se leyó en un lector de placas de ELISA.
La Figura 15 muestra los resultados obtenidos con el péptido multicopia sintetizado a partir de Ia repetición 3 veces de Ia secuencia necesaria para Ia unión del anticuerpo monoclonal anti-polisacárido B al péptido NMGBPS1. El péptido multicopia fue capaz de inhibir Ia unión del anticuerpo monoclonal anti- polisacárido B al polisacárido B con mas efectividad que el péptido NMGBPS1.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Péptidos denominados NMGBPS 1-25, caracterizados por ser antígenos capaces de generar en el organismo receptor una respuesta dirigida contra carbohidratos con Ia estructura química de unidades repetidas de ácido neuramínico, n-sustituidas, unidas por enlace α 2-8 y tener las secuencias de aminoácidos identificadas en el listado de secuencias como Seq ID 5 - Seq ID 29.
2. Péptidos denominados NMGBPS1 , NMGBPS2, NMGBPS3 y NMGBPS4, de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizados por estar codificados por los fragmentos de ADN nombrados ADN-NMGBPS1 , ADN-NMGBPS2, ADN- NMGBPS3 y ADN-NMGBPS4 identificados en el listado de secuencias como Seq ID 1 , Seq ID 2, Seq ID 3 y Seq ID 4.
3. Fragmentos de ADN nombrados ADN-NMGBPS1 , ADN-NMGBPS2, ADN- NMGBPS3 y ADN-NMGBPS4, caracterizados por tener las secuencias de bases identificadas en el listado de secuencias como Seq ID 1 , Seq ID 2, Seq ID 3 y Seq ID 4 y codificar para los péptidos NMGBPS1-4 caracterizados por tener las secuencias de aminoácidos identificadas en el listado de secuencias como Seq ID
5, Seq ID 6, Seq ID 7 y Seq ID 8.
4. Péptidos denominados NMGBPS 1-25 o fragmentos de estos, caracterizados por ser el componente activo de una formulación farmacéutica capaz de generar en el organismo receptor una respuesta dirigida contra carbohidratos con Ia estructura química de unidades repetidas de ácido neuramínico, n-sustituidas, unidas por enlace α 2-8 de acuerdo con Ia reivindicación 1.
5. Formulación farmacéutica de acuerdo con Ia reivindicación 4, caracterizada porque contiene antígenos polisacáridicos.
6. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 4 y 5, caracterizada porque uno de los componentes de Ia formulación es un polisacárido capsular de N. meningitidis.
7. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 4, 5 y 6, caracterizada porque contiene un conjugado proteína-polisacárido.
8. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 4, 5, 6 y 7 caracterizada porque es una formulación para ser administrada por vía parenteral, mucosal u oral.
9. Formulación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 4, 5, 6, 7 y 8 caracterizada porque contiene estructuras miméticas o mimotopos de al menos uno de los péptidos NMGBPS 1 - 25.
10. Péptidos denominados NMGBPS Seq IDs 5 - 8, 16 - 26 y 27 - 29, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 8, caracterizados porque las Prolinas son sustituidas por Alanina.
11. Péptidos denominados NMGBPS Seq IDs 7 - 26, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 9, caracterizados porque los triptofano son sustituidos por Fenilalanina.
12. Péptidos denominados NMGBPS Seq IDs 5 - 6, 8 - 29, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 9, caracterizados porque las Valina son sustituidas por Alanina.
13. Péptidos denominados NMGBPS Seq IDs 5 - 6, 8 - 29, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 9, caracterizados porque las Valina son sustituidas por Serina.
14. Péptidos denominados NMGBPS Seq IDs 5 - 6, 8 - 29, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 9, caracterizados porque las Valina son sustituidas por Acido Glutamico.
15. Péptidos denominados NMGBPS Seq IDs 5, 9 - 13 y 16 - 29, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 9, caracterizados porque las Tirosina son sustituidas por Ácido Glutamico.
16. Péptidos denominados NMGBPS Seq IDs 5, 9 - 13 y 16 - 29, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 9, caracterizados porque las Tirosina son sustituidas por Isoleucina.
17. Péptidos denominados NMGBPS 1-25, de acuerdo con Ia reivindicación 1 y 9, caracterizados porque cualquiera de los ácidos glutámicos presentes en las secuencias peptidicas es esencial para el reconocimiento de anticuerpos protectores contra Ia Neissería meningitidis, inducidos por ellos.
18. Formulación farmacéutica caracterizada porque contiene al menos uno de los péptidos o al menos una de las proteínas de las reivindicaciones 4, 5, 6, 7, 8 y 9, como portadores de antígenos de diversa naturaleza. <
19. Péptidos denominados NMGBPS 1-25 de acuerdo con Ia reivindicación 1 , o fragmentos de estos, caracterizados por ser un componente para el diagnostico de enfermedades en las que el blanco de Ia respuesta inmune sean carbohidratos con Ia estructura química de unidades repetidas de ácido neuramínico, n- sustituidas, unidas por enlace α 2-8.
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