KR20080090477A - 탄수화물-유사 펩티드 및 약학적 제형에서의 이의 용도 - Google Patents
탄수화물-유사 펩티드 및 약학적 제형에서의 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 약학 산업 및 생명공학, 특히 박테리아, 바이러스, 암 또는 다른 기원 질한에 대해 적용되는 백신 항체에 관한 것이다. 약학적 제형의 개선은 이미 개발된 백신의 보호 스펙트럼을 보호하거나 증가시키거나 면역 반응을 위한 표적으로서 사용되는 (α 2-8) 링크 N-치환 뉴라민산의 반복된 구조로 구성된 탄수화물인 여러 병원체에 대해 연장될 수 있다. 여러 펩티드를 분리하고 (α 2-8) 링크 N-아세틸 뉴라민산의 반복 유닛으로 구성된 네이세리아 메닝기티디스의 혈청군 B로부터 캡슐화 다당류의 분자성 유사체로서 확인하였다. 펩티드의 면역원성을 동물 생모델에서 평가하여 혈청군 B로부터 박테리아 N. 메닝기티디스를 특이적으로 인식할 수 있는 항체의 생성을 유도하기 위한 항체의 생성을 유도할 수 있으며 같은 것에 대한 박테리아 활성을 보임을 증명한다. 제형의 결과를 인간에게 사용하기 위한 백신 제형으로서 약학 산업에서 적용될 수 있다.
(α 2-8) 링크 N-치환 뉴라민산, NMGBPS 1, 네이세리아 메닝기티디스
Description
본 발명은 약학 분야, 특히 다양한 기원의 질환과 싸우기 위한 특이 항원에 대한 면역 반응의 유도 또는 증가를 가능하게 하는 예방 또는 치료학적 적용을 위한 새로운 백신 제형에 관한 것이다.
(α 2-8)-링크 N-대체 뉴라민산[(α 2-8)-linked N-replaced neuraminic acid]의 반복 유닛으로 구성된 화학 구조를 갖는 탄수화물은 혈청군 B의 박테리아 N. 메닝기티디스(N. meningitidis)의 다당류 캡슐의 구성요소로서 발생한다(Bhattacharjee A. K. et al. 1975. Structural determination of the sialic acid polysaccharide antigens of Neisseria meningitidis serogroups B and C with carbon 13 nuclear magnetic resonance . J. Biol. Chem. 250: 1926-1932).
네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitides)는 숙주가 오직 인간이며 수막구균성 질환(meningococcal disease)의 병원을 구성하는 그람 네거티브 박테리아이다. 일반적으로, 이 박테리아는 담체로서 언급된다고 알려진 건강한 개체의 상부 호흡기에 이식하는 천연의 일시적인 미생물 집단에서 발견된다. 이는 분리체의 가장 흔한 소스이다.
2세 미만의 어린이는 수막구균성 질환의 가장 빈번한 임상 합병증인 수막구균성 수막염에 접촉시 가장 감염되기 쉽다. 그럼에도 불구하고, 10세 아동 및 성인도 또한 영향을 받는다.
치료되지 않는 수막구균성 질환은 발병된 개체 대부분에서 치명적이며 백신화에 의해 예방될 수 있고 심지어는 박테리아 정착으로서 초기 단계에서와 같이 예방되는 결과이다.
N. 메닝기티디스 임상 분리체는 일반적으로 캡슐화되어 있다. 분리체의 캡슐에서의 구조적 차이는 항원적 차이를 야기하며 여러 혈청형으로 박테리아의 분류를 위한 기초이다(Rosenstein N. E. and Perkins B. A. 2000. Update on Haemophilus influenzae serotype b and meningococcal vaccines. Pediatr. Clin. North. Am., 47: 337- 352).
혈청형 A, B, C, Y 및 W-135은 지금까지 보고된 13개 메닝기티디스 혈청형 중 임상학적 관점에서 가장 중요하다. 혈청형 A는 사하라-이남 아프리카에서 유행하는 질환의 주요 원인이다. 혈청형 B 및 C는 선진국에서 발생하는 질환의 원인의 대부분에 관련되어 있다. 혈청형 Y 및 W-135은 최근 상당한 증가율을 나타내는 미국에서의 일부 지역에서 보고된 질환 및 감염의 남아있는 경우의 대부분의 원인이다(Rosenstein N. et al. 2001. Meningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344, 1378-1388).
혈청형 B는 유아 및 아동에서 보고된 박테리아성 수막염의 50-70%의 원인이며, 이는 감염된 청소년에서도 치명적인 패혈증을 야기할 수 있다 (Romero J.D. and Outschoorn I.M. 1997. The immune response to the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis group B. Zentralbl. Bakteriol. 285: 331-340). 수막구균성 혈청형 B에 의해 야기된 질환을 치료하기 위해 시도된 전략 중 하나는 면역원으로서 급격한 성장기 동안 박테리아 외부 막으로부터 방출된 수포의 사용이었다. 이러한 수포들은 외부 막 소포(outer membrane vesicles; OMV)로서 알려졌다. 백신에 사용하기 위하여, 세정제 처리에 의해 제거되는 지질다당류(lipopolysaccharides; LPS)로 수포를 정제하였다. 이러한 수포에서의 항원은 주로 박테리아 외부 막 단백질이다(rasch C.E. et al. 1988. Antibody response of adults to an aluminum hydroxide - adsorbed Neisseria meningitidis serotype 2b protein - group B polysaccharide vaccine . J. Infect. Dis. 158: 710-718). OMV를 기초로 하는 여러 백신이 임상 실험에서 검정되었다(Rosenqvist E. et al . 1991. Human antibody responses after vaccination with the Norwegian group B meningococcal outer membrane vesicle vaccine: results from ELISA studies . NIPH Ann. 14: 169-79; Sierra G.V. et al . 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis : protection trial and mass vaccination results in Cuba . NIPH Ann. 14: 195-207). 혈청학적 분류 B:4:P1.19,15의 균주에 기초하며 쿠바에서의 증상으로부터 가장 빈번한 분리체인, VA-MENGOC-BC로서 상업적으로 알려진 쿠바 백신은 임상 실험에서 83%의 효능을 나타낸다. 수막구균성 질환의 발병률은 쿠바에서 백신의 적용 결과로서 1983년 100,000명의 거주만 당 14.4명의 감염에서 1994년 100,000명의 거주만 당 0.45명의 감염으로 감소하였다(Sierra G. V. et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis : protection trial and mass vaccination results in Cuba . NIPH Ann. 14: 195-207; Diaz R.J. and Outschoorn I. M. 1994. Current status of meningococcal group B vaccine candidates : capsular or noncapsular? Clin. Microbiol. Rev. 7: 559-575). 1989년부터 1990년까지 브라질 상파울로에서 이 백신의 적용은 이 지역에서의 유행병 발병을 제어하였다 (de Moraes J.C. et al. 1992. Protective efficacy of a serogroup B meningococcal vaccine in Sao Paulo , Brazil. Lancet 340:1074- 1078). 그러나, 이러한 백신은 근원 균주에 의해 주로 제한되는, 혈청형 또는 서브타입-특이적일 수 있는 보호를 야기하는 오직 하나의 균주로부터만 생성된다. 반면에, N. 메닝기티디스 혈청형 B 균주의 유포는 일시적 및 지역학적으로 다양하다. 그러므로 이러한 유형의 백신의 사용은 균주의 유포가 제한되는 분리된 지역학적 지역으로 한정되거나 균주 또는 발병의 원인인 균주가 잘 특성화되고 특이 백신이 이러한 유행병을 중단시키기 위해 생성되는 유행병 발병 지역에 한정된다(olst J. et al. 2005. The concept of Tailor - made , protein - based , outer membrane vesicle vaccine against meningococcal disease. Vaccine 23: 2202-2205). 여러 균주로부터 OMV의 다른 제제의 단순 조합은 부작용을 발생시킬 위험성을 갖는 백신의 투여량 당 LPS 함량의 높은 수준을 이루므로 효과적인 대체제가 아니다(Diaz R.J. and Outschoorn I. M. 1994. Current status of meningococcal group B vaccine candidates : capsular or noncapsular ? Clin. Microbiol. Rev. 7: 559-575).
N. 메닝기티디스의 세포로부터 정제된 삭과 다당류를 기초한 백신은 혈청형 A, C, Y 및 W135에 의해 발생되는 수막구균성 질환에 대해 보호할 수 있다. 이러한 백신은 성인에게서 살균 및 보호적 항체를 유발할 수 있으며 유전병 발생의 제어에 효과적이다(Rosenstein N. et al. 2001. Menningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344: 1378-1388). 담체 단백질에 접합되는 혈청형 C 박테리아로부터 정제된 다당류에 기초한 백신의 새로운 발생은 시장에서 입수할 수 있다. 이러한 백신은 영국에서의 임상 실험 분야에서 성인 뿐만 아니라 소아에서 살균 및 보호 항체의 유도의 이들의 능력이 증명되었다(iller E. et al. 2002. Planning , registration and implementation of an immunisation campaign against meningococcal serogroup C disease in the UK : a success story. Vaccine 20; s58-s67). 게다가, 접합된 백신은 면역원으로서 단순 다당류의 사용에 관한 주요 어려움인, 티무스(tymus)-독립 및 단기간 면역 반응의 유도와 같은, 친화성의 성숙기를 갖는 기억 면역 반응의 자극의 부재를 해결할 수 있게 한다. 또한 혈청형 C의 경우에 널리 알려진, 이러한 백신들로 반복적으로 백신화된 개체, 예를 들어, 질환의 높은 발병률을 나타내는 부분에서 반응저하(hyporesponsiveness) 현상의 유도가 기술되었다(Jennings H. and Lugowski C. 1981. Immunochemistry of groups A, B and C meningococcal polysaccharide - tetanus toxoid conjugates. J Immunol 127: 1011-1018; Gold R. and Lepow M. L. 1975. Clinical evaluation of group A and C meningococcal polysaccharide vaccines in infants. J. Clin Invest 56: 1536-47; Borrow R. et al. 2001. Influence of prior meningococcal C polysaccharide vaccination on the response and generation of memory after meningococcal C conjugate vaccination in young children. J Infect Dis 184: 377-380). 혈청형 A에 대한 여러 접합 백신들은 면역학적 기억 반응을 지키고, 면역원성이며 유도할 수 있음이 증명되었다(World Health Organisation. 1999. Standardization and validation of serological assays for the evaluation of immune responses to Neisseria meningitidis serogroup A/C vaccines. Vaccine Development Team of the Department of Vaccine and Biologicals. Ginebra, www.who.int/gpv-documents/; Campagne G. et al. 2000. Safety and immunogenicity of three doses of a Neisseria meningitidis A + C diphtheria conjugate vaccine in infants from Niger . Pediatr. Infect. Dis. J. 19: 144-150; Borrow R. et al. 2000. Induction of immunological memory in UK infants by a meningococcal A/C conjugate vaccine . Epidemiol. Infect. 124: 427- 432; Choo S. et al. 2000. Immunogenicity and reactogenicity of a group C meningococcal conjugate vaccine compared with a group A+C meningococcal polysaccharide vaccine in adolescents in a randomised observer -blind controlled trial . Vaccine 18: 2686- 2692).
혈청형 B 캡슐화 다당류의 약학 면역원성은 이러한 화합물에 기초한 백신의 제형화를 방해한다(Colino J. and Outschoorn I. 1998. Dynamics of the murine humoral immune response to Neisseria meningitidis group B capsular polysaccharide. Infect. Immun. 66: 505-513). 수막구균성 혈청형 B 캡슐화 다당 류는 α(2-8)-링크 N-아세틸 뉴라민산의 대략 200개의 반복 유닛으로 구성된 시알산의 선형 동종중합체이다(Bhattacharjee A. K. et al. 1975. Structural determination of the sialic acid polysaccharide antigens of Neisseria meningitidis serogroups B and C with carbon 13 nuclear magnetic resonance . J. Biol. Chem. 250: 1926-1932; Frosch M. and Edwards U. 1993. Molecular mechanism of capsule expression in Neisseria meningitidis serogroup B. p 49-57 in J. Roth, U. Rutishauser and F. A. Troy (ed), Polysialic acid, from microbes to man. Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland). 이러한 긴 탄수화물 사슬은 특정 삼차원 구조를 채택하며 형성이 박테리아의 외부막의 단백질 또는 그외 성분에 기여하는 박테리아의 표면상의 헬릭스 형태에서 공간 배치를 채택하였다(Colino J. and Outschoorn I. 1998. Dynamics of the murine humoral immune response to Neisseria meningitis group B capsular polysaccharide. Infect Immun 66: 505-513). 이러한 동종중합체는 N. 메닝기티디스 혈청형 B에 한정되지 않으며, 이는 또한 신생아 아동에서 수막염을 발생시키는 병원균인 E. coli K1의 캡슐, 수의학적 병원균인 파스테우렐라 해몰리티카(Pasteurella haemolytica ) A2 및 또한 비강에서 일반적인 비-병원성 미생물인 모락셀라 비-리쿠에파시엔스(Moraxella non-liquefaciens)에서도 나타나기 때문이다(Kasper D. L. et al. 1973. Immunochemical similarity between polysaccharide antigens of Escherichia coli 07: K1 (L): NM and group B Neisseria meningitidis . J. Immunol. 110: 262-268; Adlam C. et al. 1986. Purification , characterization and immunological properties of the serotype - specific capsular polysaccharide of Pasteurella haemolytica serotype A7 organisms. J. Gen. Microbiol. 132:1079-1087; Devi S. J. et al. 1991. Identity between polysaccharide antigens of Moraxella non -liquefaciens, group B Neisseria meningitidis and Escherichia coli K1 ( non -O acetylated). Infect. Immun. 59: 732-736).
시알산의 잔기 또한 인간 숙주의 몇몇 조직 표면에서 발견된다. α(2-8)-링크 N-아세틸 뉴라민산의 반복된 유닛의 동종중합체는 오직 포유동물 신경 세포 부착 분자(neural cell adhesion molecule; NCAM)의 글리코실화를 구성하나, 수막구균성 혈청형 B 캡슐화 다당류와 비교시, 인간 세포에 걸친 탄수화물 사슬이 단지 대략 10-50 반복 유닛으로 더 짧다(Chuong C. M. et al. 1984. Alterations in neural cell adhesion molecules during development of different regions of the nervous system. J. Neurosci. 4: 2354-2368). 높은 함량의 시알산을 갖는 세포는 배아 및 신생아 아동의 뇌에 존재하나, 시알산의 함량은 나이가 들수록 감소한다. 결과로서, 성인에서 고도로 시알산화된 조직의 존재는 몇몇 조직의 분리된 부분으로만 한정되어 있다. 특정 병리학에서, 예를 들어 신경-외배엽 기원의 공격적인 종양에서, 시알산은 세포 표면에서 과-발현된다(Romero J. D. and Outschoorn I. M. 1997. The immune response to the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis group B. Zentralbl Bakteriol 285: 331-340; Colino J. and Outschoorn I. 1998. Dynamics of the murine humoral immune response to Neisseria meningitis group B capsular polysaccharide . Infect Immun 66: 505- 513).
생체외 실험은 수막구균성 혈청형 B의 캡슐에 대한 항체가 인간 조직의 폴리시알신과 반응함을 나타낸다(Finne J. et al . 1987. An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross - reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisues . J. Immunol, 138: 4402-4407). 이러한 교차-반응은 면역학적 내성의 가능한 발달에 의한, 수막구균성 혈청형 B 캡슐화 다당류의 낮은 면역원성을 설명할 수 있으며 이는 숙주 조직에 존재하는 다당류와의 이의 동종성에 기인한다. 생체외에서 인간 조직의 인식을 보이는, 항-수막구균성 다당류 B 항체가 자가면역 질환의 발병을 잠재적으로 유도할 수 있음을 경고하였다. 그럼에도 불구하고, 현재까지 생체내에서 인간 조직에 대한 항-다당류 B 항체의 효과적인 결합을 증명하는 것이 불가능하였으며, 인간 혈청 내에서 순환하는 높은 수준의 항-수막구균성 다당류 B 항체의 존재를 갖는 어떤 병리학에 관한 것도 불가능하였다. 여러 연구는 일반적으로 좋은 건강상태를 갖는 개체의 혈청에서 건강한 아동을 갖는 모체를 포함하는, 수막구균성 다당류 B를 인식하는 항체가 순환함을 보고하였다. 게다가, 남아프리카의 연구에서 500명 이상의 성인 및 2000명의 아동의 단백질-수막구균성 다당류 B 조합 백신으로의 면역화한 후에 부작용이 보고되지 않았다(andrell R. E. and Zollinger W. D. 1982. Measurement of antibodies to meningococcal group B polysaccharide : low avidity binding and equilibrium binding constants. J. Immunol 129: 2172-2178; Zollinger W. D. et al. 1984. Safety of vaccines containing meningococcal group B polysaccharide . Lancet 2: 166; Devi S. J. et al . 1991. Antibodies to poly [(2----8)- alpha -N- acetylneuraminic acid ] and poly[(2----9)- alpha -N-acetylneuraminic acid ] are elicited by immunization of mice with Escherichia coli K92 conjugates: potential vaccines for groups B and C meningococci and E. coli K1. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 88: 7175-7179; abat E. A. et al . 1988. The epitope associated with the binding of the capsular polysaccharide of the group B meningococcus and of Escherichia coli K1 to a human monoclonal macroglobulin , IgMNOV . J. Exp. Med. 168: 699-711; Granoff D. M. et al . 1995. Antibody responses to the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis serogroup B in patients with meningococcal disease . Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2: 574-582; Romero J. D. and Outschoorn I. M. 1997. The immune response to the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis group B. Zentralbl. Bakteriol. 285: 331-340; Stein D. M. et al . 2005. Are antibodies to the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis group B and Escherichia coli K1 associated with immunopathology ?. Vaccine. Article in press).
백신 제형에서 면역 반응에 대한 표적으로서 N. 메닝기티디스 혈청형 B 캡슐화 다당류의 사용에 대한 연구를 지속하는 두 가지 주요 이유가 있다. 첫 번째로, 이는 혈청형 B 내의 가장 보존된 구조이므로, 다당류-기저 백신이 다른 균주와의 제한된 교차-반응성의 항체를 유도하는 박테리아 외막 단백질에 기초한 백신에 의 해 커버될 수 있는 경우의 수보다 매우 많은 수의 경우에서 감염에 대해 보호할 수 있다. 두 번째로, 상기 언급된 바와 같이, 혈청에서 순환하는 항-수막구균성 다당류 B 항체를 갖는 개체에서 면역병리학적 부작용이 나타나지 않는다.
여러 전략이 다당류 B의 면역원성을 증가시키기 위한 목적으로 사용되었다(Bartoloni A. et al. 1995. Immunogenicity of meningococcal B polysaccharide conjugated to tetanus toxoid or CRM197 via adipic acid dihydrazide. Vaccine, 13: 463- 470; Devi S. J. et al. 1997. Preclinical evaluation of group B Neisseria meningitidis and Escherichia coli K92 capsular polysaccharide - protein conjugate vaccines in juvenile rhesus monkeys . Infect. Immun. 65: 1045-1052). 예를 들어, N-아세틸기가 N-프로피오닐로 치환된 변이된 혈청형 B 캡슐화 다당류의 글리코접합체로의 면역화는 항체의 두 집합을 유도한다: 박테리아로부터 정제된 다당류 B의 용액에 흡착될 수 있는 하나의 소수파 및 결여된 살균성 및 보호 활성. 유도된 항체의 주요 집합은 IgG 이소타입에 속하는, 정제된 수막구균성 다당류 B와 흡착될 수 없으며, N. 메닝기티디스 혈청형 B로부터의 여러 균주에 대한 살균 활성을 보이고, 수막구균의 치사 투여량을 투여한 마우스에서 균혈증을 감소시키거나 심지어는 제거할 수 있으며, 인간 조직은 인식하지 않는다(Jennings H. J. et al. 1987. N- propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique epitope on group B Neisseria meningitidis . J Exp Med 165: 1207- 1211; Jennings H. J. et al . 1986. Induction of meningococcal group B polysaccharide - specific IgG antibodies in mice by using an N-propionylated B polysaccharide - tetanus toxoid conjugate vaccine. J Immunol 137: 1708-1713; Ashton F. E. et al. 1989. Protective efficacy of mouse serum to the N- propionyl derivative of meningococcal group B polysaccharide . Microb Pathog 6: 455-458; Michon F. et al. 1987. Conformational differences between linear alpha (2----8)- linked homosialooligosaccharides and the epitope of the group B meningococcal polysaccharide. Biochemistry 26: 8399- 8405; Pon R. A. et al . 1997. N- Propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidal capsular epitope in-group B Neisseria meningitidis . J. Exp. Med. 185: 1929-1938). 이러한 결과는 N. 메닝기티디스로부터의 다당류 B에서의 두 주요 에피토프의 존재를 나타낸다: 다당류가 인간 세포의 표면에서 나타나는 바와 같이, 짧은 사슬의 형태일 때 첫 번째 발견될 수 있는 것은 정제된 다당류의 용액에서 발견되는 것과 공통이다(iaz R. J. and Outschoorn I. M. 1994. Current status of meningococcal group B vaccine candidates : capsular or noncapsular ? Clin. Microbiol. Rev. 7: 559-575). 이 에피토프는 살균성이 아닌 자가-항체를 생성한다. 두 번째 에피토프는 오직 천연 다당류가 이의 더 높은 분자량을 보존하며 박테리아 표면에서와 같이 헬릭스 형태로 공간적으로 위치할 때만 검출될 수 있다. 구조적 성질의 이 두 번째 에피토프는 인간 조직을 인식하지 않는 살균 및 보호 항체의 생성을 초래한다. 상기 기재된 두 가지에 정확하게 상응하는 두 집합에서의 이들의 특이성 및 특성에 따라 그룹으로 분류된 모노클로날 항체의 분리가 보고되었 다(Pon R. A. et al. 1997. N- Propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidal capsular epitope in - group B Neisseria meningitidis . J. Exp. Med. 185: 1929-1938; Granoff D. M. et al. 1998. Bactericidal monoclonal antibodies that define unique meningococcal B polysaccharide epitopes that do not cross - react with human polysialic acid. J Immunol 160: 5028- 5036).
박테리아로부터 정제된 다당류 B의 용액에서 비-구조적이고 인간 N-CAM 에피토프와 공유함이 주로 발견되었으며, 이는 다당류 B 의 낮은 면역원성 및 면역화 후에 유도되는 항체에서 검출되는 적은 살균 활성을 설명한다. N-아세틸기를 N-프로피오닐기로 치환함에 의해 다당류에서 도입된 구조적 변화는 비-자가반응성, 살균성 및 보호성 항체의 주요 집단의 생성을 유도한다. 그럼에도 불구하고, N-프로피오닐화 다당류 B는 또한 낮은 비율에도 불구하고 백신으로서 사용시 주의를 요하는, 심지어는 최근 연구에서 면역원으로서 인간에게 사용시 안전함을 보일 때, 자가-항체의 분획을 유도한다 (Bruge J. et al. 2004. Clinical evaluation of a group B meningococcal N- propionylated polysaccharide conjugate vaccine in adult , male volunteers. Vaccine. 22: 1087-1096).
수막구균성 혈청형에 대한 백신을 설계하기 위해B, 면역 반응에 대한 표적으로서 캡슐 탄수화물의 사용의 대안은 다당류 B에 존재하는 구조적 에피토프에 대해 특이적인 분자 유사체(미모토프(mimotope))를 구성하는 펩티드 서열의 면역원으로서의 사용이며, 이는 보호성을 야기하며 탄수화물이 박테리아의 표면 상에서 천연 구조로 존재할 때 존재한다.
캡슐화 다당류의 미모토프를 확인하기 위한 접근은 섬유상 파지에서 나타나는 항체 무작위-펩티드 라이브러리를 갖는 패닝(panning)이다. 이 기술은 바이러스 캡슐의 단백질에 융합한 이의 표면 외래 펩티드 서열에 드러나는 섬유상 파지의 능력에 기초한 것이다. 바이러스 입자의 표면에 나타나는 펩티드 서열은 쉽게 접근할 수 있으며 선별을 위해 사용되는 분자에 잠재적으로 결합할 수 있으므로, 이들은 이의 친화성을 기초로 하여 선택될 수 있다. 특정 성질에 의해 선택된 파지-라이브러리로부터의 펩티드 서열은 선택된 파지의 게놈의 누클레오티드 서열로부터 쉽게 추론할 수 있다(Parmley S. F. et al. 1988. Antibody - selectable filamentous fd phage vectors : affinity purification of target genes. Gene 73:305-318; Smith G. P. et al. 1993. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage . Methods Enzymol. 217: 228-257; Cwirla S. E. et al. 1990. Peptides on phage : a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A; 87: 6378-6382). 가능한 백신 후보제를 고려하기 위해 이러한 펩티드는 우선 원래 항원에 특이 항체가 결합하고 항원에 대한 이러한 항체의 결합을 저해해야 한다. 둘째로, 이들은 병원체를 인지하고 이를 야기하는 감염에 대해 보호하는 항체의 존재에 의해 특징지어지는 면역 반응을 유도해야 한다. 이러한 펩티드들은 정의되고 재생가능한 구조이며 백신 동화작용에서 천연 항원을 대체할 수 있고, 항체의 표적이 유도되는 추가 이점을 가지고 자가-항체의 가능성은 인간 조직을 인지할 수 있고 제거하므로 자가면역 질환의 발병 가능성을 피할 수 있 다(Monzavi-Karbassi B. et al. 2002. Peptide mimotopes as surrogate antigens of carbohydrates in vaccine discovery. Trends. Biotechnol. 20:207-214). 이는 N. 메닝기티디스의 혈청형 B로부터의 캡슐화 다당류의 경우에서 특히 중요할 것이다.
반면에, 실험 동물의 파지-노출 펩티드로의 직접적 면역화를 가능하게 한다. 이는 가능한 백신 후보제의 면역학적 평가의 과정을 촉진하며, 이는 펩티드 합성의 전형적인 방식 및 단백질 담체로의 접합을 피하는 것이 가능하기 때문이다. 섬유상 파지는 효능 있는 담체 단백질이며 면역계로 펩티드가 효과적으로 존재할 수 있음이 증명되었다(Meola A. et al. 1995. Derivation of vaccines from mimotopes : Immunologic properties of human Hepatitis B virus surface antigen mimotopes displayed on filamentous phage. J. Immunol. 154: 3162-3172: de la Cruz V. F. et al. 1988. Immunogenicity and epitope mapping of foreign sequences via genetically engineered filamentous phage. J. Biol. Chem. 263: 4318-4322; Greenwood J. et al. 1991. Multiple display of foreign peptides on a filamentous bacteriophage . Peptides from Plasmodium falciparum circumsporozoite protein as antigens . J. Mol. Biol. 220: 821-827: Willis A. E. et al. 1993. Immunological properties of foreign peptides in multiple display on a filamentous bacteriophage. Gene 128: 79-83; Galfre G. et al. 1996. Immunization with phage - displayed mimotopes . Methods Enzymol. 267: 109-115; Bastien N. et al. 1997. Protective immune responses induced by the immunization of mice with a recombinant bacteriophage displaying an epitope of the human respiratory syncytial virus. Virology 234:118-122; Menendez T. et al. 2001. Immunisation with phage-displayed variable region 2 from meningococcal PorA outer membrane protein induces bactericidal antibodies against Neisseria meningitidis . Immunol. Lett. 39: 143-148).
이러한 방법을 사용하여, 다른 것 중에서도 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans ), 스트렙토코쿠스 그룹 A( Streptococcus group A), 스트렙토코쿠스 그룹 B(Streptococcus group B) 및 시겔라 플렉네리(Shigella flexneri)로부터의 리포올리고사카라이드(lipooligosaccharide)으로부터의 캡슐화 다당류의 분자 유사체를 구성하는 여러 펩티드를 확인하였다(aladon P. et al. 1996. Peptide libraries define the fine specificity of anti -polysaccharide antibodies to Cryptococcus neoformans . J. Mol. Biol. 261: 11-22; Harris S. L. et al. 1997. Exploring the basis of peptide - carbohydrate crossreactivity : evidence for discrimination by peptides between closely related anti - carbohydrate antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2454-2459; Pincus S. H. et al. 1998. Peptides that mimic the group B Streptococcal type III capsular polysaccharide antigen . J. Immunol. 160: 293-298; Phalipon A. et al. 1997. Induction of anti - carbohydrate antibodies by phage library - selected peptide mimics. Eur. J. Immunol. 27: 2620-2625).
N. 메닝기티디스에 대한 백신 개발 분야에서, 또한 박테리아의 분자 유사체 의 확인에 관한 연구가 있었다. 예를 들어, 이 다당류에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 갖는, 섬유상 파지에 나타나는 무작위 펩티드 라이브러리로부터 선택된 혈청형 A로부터의 캡슐화 다당류의 분자 유사체의 확인이 보고되었다. 미모토프는 천연 항원으로 인간 혈청의 결합을 저해하고 실험 동물의 면역화 후에 높은 수준의 항-다당류 항체의 생성을 유도할 수 있다(Grothaus M. C. et al. 2000. Selection of an immunogenic peptide mimic of the capsular polysaccharide of N. meningitidis serogroup A using a peptide display library. Vaccine 18: 1253-1263). 수막구균성 혈청형 C의 경우, 수막구균성 다당류 C와 유사한 항-유전형 항체의 경쇄 및 중쇄의 과가변(hypervariable) 영역에 상응하는 서열을 갖는 펩티드의 합성 및 상기 합성 펩티드로의 면역화는 면역화된 동물의 혈청에서 검출되는 높은 수준의 보호성 항-수막구균성 다당류 C를 야기한다(Westerink M. A. et al. 1995. Peptide mimicry of the meningococcal group C capsular polysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92: 4021-4025).
미메토프의 확인 기술의 적용은 N. 메닝기티디스의 혈청형 B에 대한 백신 후보제의 조사에서 생체 중요성을 고려하였으며 이는 인간 N-CAM과 공유하지 않는 상기 혈청형의 다당류에 존재하는 구조적 및 보호제 에피토프에 대해 정확하게 나타나는 면역 반응을 가리키는 가능성에 기인한 것이다. 4개의 모노클로날 항체 및 선형 및 사이클릭 7개-아미노산 길이 펩티드의 두 라이브러리을 사용하는 이러한 구조가 보고되었으나, 이러한 구조의 면역학적 평가는 문헌에 반영되지 않았다(Shin J. S. et al. 2001. Monoclonal antibodies specific for Neisseria meningitidis group B polysaccharide and their peptide mimotopes. Infect. Immun. 69: 3335-3342). 이후에, 2004년의 문헌에서, 이전 연구의 모노클로날 항체 중 하나 및 선형의 12개 아미노산-길이 펩티드를 나타내는 파지-라이브러리를 사용하여 세 개의 새로운 구조의 확인을 보고하였으며 면역학적 평가를 동물 모델에서 실시하였다. 혈청은 혈청형 B 수막구균을 매우 잘 인식하나, 이들 항체의 기능적 활성의 평가는 문헌에 반영되지 않았다(Park I. et al. 2004. Peptide mimotopes of Neisseria meningitidis serogroup B capsular polysaccharide. Yonsei Medical Journal. 45: 755-758). Granoff 및 Moe의 문헌(Granoff D. M. and Moe G. R. 2003. Molecular mimetics of unique Neisseria meningitidis serogroup B epitopes . US Pat. 6,642,354 B2)에서, 67개 펩티드 서열의 백신 제형에서의 사용을 보호하며, 이는 혈청형 B 캡슐화 다당류에 대하여 모노클로날 항체가 결합하는 이들의 능력에 기초하여 파지에서 나타나는 펩티드 항체로부터 선택된 것이다. 면역학적 연구를 위해 선택된, 이들 중 두 개를 합성하고 N. 메닝기티디스로부터 외부막 소포에 접합시키고 캡슐의 수막구균성 혈청형 B 균주 돌연변이로부터 정제하였다. 이 접합체 중 하나로의 면역화는 혈청형 B 수막구균의 N. 메닝기티디스에 대한 살균 활성을 보이는 항체의 생성을 유도함을 본 특허에서 나타내었다. 이러한 펩티드가 주요 성분이 박테리아의 외부막으로부터의 단백질인, N. 메닝기티디스로부터의 외부 막 소포에 접합되고 이는 수막구균에 대한 살균 활성을 갖는 항체의 이러한 능력이 널리 증명되었음을 고려하여, 이러한 결과의 해석은 어렵다. 이 연구에서 담체로서 OMV의 사용은 살균 활성을 갖는 항체를 유도하기 위한 이 펩티드의 능력의 직접적 평가를 방 해한다. 저자는 이러한 혈청에서 검출되는 살균 활성의 분획이 항-펩티드 항체의 존재에 의한 것으로, 이는 비접합 펩티드와 상기 혈청의 항온이 검정에서 박테리아 생존을 증가시키기 때문임을 밝혔다. 그럼에도 불구하고, 이러한 결과를 반영하는 과학 문헌에서 이들은 원래 항원에 의해 약하게 인지되는 접합체 펩티드-OMV로의 면역화 후에 항원이 유도됨을 나타냈으며 혈청에서의 살균 활성의 평가는 기재되지 않았다(Moe G. R. et al. 1999,Molecular mimetics of polysaccharide epitopes as vaccine candidates for prevention of Neisseria meningitidis serogroup B disease. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26: 209-269;.Moe G. R and Granoff D. M. 2001. Molecular mimetics of Neisseria meningitidis serogroup B polysaccharide. Int. Rev .Immunol. 20:201-20).
특히 혈청형 B의 N. 메닝기티디스에 대한 백신 분야에서 미메토프의 확인의 대안책은 원래 항원에 대해 완전히 다를 때에도 이 방법에 따라 선택된 펩티드가 이들의 천연 관계에 대한 항체의 생성을 유도할 수 있으므로 중요하며, 이는 B 다당류의 구조적 및 보호 에피토프가 형성되는 박테리아의 표면 상에서 이루어진다. 이러한 펩티드는 N. 메닝기티디스에 대한 살균 및 보호 활성을 갖는 항체의 생성을 유도한다. 게다가, 이러한 펩티드들을 유도하는 항체들이 특정 인간 조직에 존재하는 폴리-시알신의 단쇄에 의해 형성된 에피토프와는 교차-반응하지 않으므로, 자가면역 반응을 야기할 가능성이 제거된다. 그러므로, 이들은 질환의 진단, 치료 또는 예방에 잠재적으로 사용되는 새로운 세대의 시약의 개발을 가능하게 하는 항원의 대안적인 원천을 구성한다.
본 발명에서 펩티드 NMGBps1, NMGBps2, NMGBps3 및 NMGBps4는 수막구균성 질환 또는 네이세리아 속 맴버 또는 그외 박테리아, 바잉러스 또는 기생충에 의해 발생하는 모든 감염에 대해 치료 또는 예방적 특성의 진단용 시약 또는 백신용 시약의 성분으로서 최초로 보고되었다.
본 발명의 신규성은 네이세리아 메닝기티디스 혈청형 B의 캡슐화 다당류에 존재하는 에피토프의 분자 미모토프로서 최초의 펩티드 NMGBps1, NMGBps2, NMGBps3 및 NMGBps4에 대하여 발명의 상세한 설명에 나타내었으며, 이는 이러한 혈청형의 수막구균 균주에 대한 살균성 항체의 생성을 유도할 수 있다. 상기 펩티드는 네이세리아 속 또는 그외 박테리아, 바이러스 또는 기생충에 의해 발생하는 질환을 치료하거나 예방하기 위한 진단용 및/또는 백신 제형에서의 시약으로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 아미노산은 한 문자 코드(the one-letter code)(예를 들어 A-알라닌, W-트립토판, S-세린, E- 글루탐산, Y-티로신, K-리신, F-페닐알라닌, I-이소루신, V-발린, P-프롤린, 등)로 나타냈다.
도 1. 모노클로날 항체 항-다당류 B를 갖는, 파지에서 나타나는 펩티드 라이브러리의 패닝 후 선택된 파지를 니트로셀룰로스 막 상에 적용시켜 선별 항체와 반응하도록 하였다. 각 점은 30 ㎍의 선택된 개별 파지 클론에 상응한다. 대조 파지를 위치 G5 및 I5에 적용시켰다.
도 2. 라이브러리의 3회 패닝 이후에 선택 항체에 흡착되는 파지의 ELISA 반응성의. 파지를 개별적으로 정제하고 ELISA 플레이트에 코팅하기 위해 사용하였다. 그래프는 13개의 평가된 파지에 대한 492 nm에서의 ELISA 흡광도를 나타낸다.
도 3. 라이브러리의 2회 패닝 이후에 선택 항체에 흡착되는 파지의 ELISA 반응성 평가. 파지를 개별적으로 정제하고 ELISA 플레이트에 코팅하기 위해 사용하였다. 그래프는 16개의 평가된 파지에 대한 492 nm(A492nm)에서의 ELISA 흡광도를 나타낸다.
도 4. 세 ELISA 시스템을 사용한 반응성의 평가: 모노클로날 항체 항-다당류 B를 갖는 파지에 나타난 펩티드 라이브러리를 패닝함에 의해 선택된 펩티드가 표지에 나타나는 파지의 실시예 9에 따른, 통상적인 샌드위치 및 저해.
도 5. ELISA에 의해 평가된, 섬유상 파지에서 나타나는 펩티드 NMGBPS1-NMGBPS4로의 Balb/c 마우스의 면역화 후에 유도되는 IgG의 수준. 그래프는 파지들 중 하나로 각각 면역화시킨 그룹에서 면역화 전 및 상응하는 면역전 혈청에 대한 세 투여 후에 수집된 면역 혈청에서 검출된 특이 항체의 증가를 나타낸다.
도 6. 모노클로날 항체 항-다당류 B 및 펩티드 NMGBPS1에 대해 유도된 마우스 혈청에 의해 인식되는 에피토프의 결정에서 셀룰로스 막 상에서 합성되는 펩티드 단편.
도 7. 펩티드 NMGBPS1로부터 유도된 펩티드 단편의 수집을 갖는 펩티드 NMGBPS1에 대해 유도된 마우스 혈청(우측 패널) 및 모노클로날 항체 항-다당류 B(좌측 패널)의 반응성. 펩티드 단편의 수집의 설계는 도 6에 나타나 있다.
도 8. 다음으로 구성된 펩티드 NMGBPS1에 도입되는 변이로부터 유도된, 핀(pin) 상에서 합성된 펩티드의 수집: a) 각 위치에서 Ala에 의한 위치 7 및 8의 동시 치환, 및 b) 모노클로날 항체 항-다당류 B와 결합하는 서열에서의 1-3 위치 치환의 도입. 펩티드 1은 NMGBPS1의 서열에 상응한다.
도 9. 모노클로날 항체 항-다당류 B와, 도 8에 나타난 핀 상에서 합성된 펩티드의 수집과의 반응성. 바 1은 펩티드 NMGBPS1와의 반응성을 나타낸다.
도 10. NMGBPS1의 서열로부터 유래된 펩티드의 모노클로날 항체 항-다당류 B와의 반응성. 각 펩티드에서의 치환은 다음과 같다: A에 의한 V12 (펩티드 5), S에 의한 V12 (펩티드 11), E에 의한 V12 (펩티드 12), A에 의한 V9 (펩티드 16), E에 의한 Y11 (펩티드 14), I에 의한 Y11 (펩티드 2). 모든 경우에서 P7 및 P8 은 각 위치에서 A에 의해 동시에 치환되었다. 펩티드의 확인 수는 도 8에 나타난 바와 같다. 바 1(펩티드 7)은 각 위치에서 A에 의해 동시에 치환된 P7 and P8을 갖는 펩티드 NMGBPS1의 반응성을 나타낸다.
도 11. 서열 NMGBPS1에 기초한 펩티드와 항-다당류 B 모노클로날 항체의 반응성, 여기에서 잔기 E13 및 추가 잔기는 도 8에서와 같이 치환되었다. 모든 경우에서 P7 및 P8 은 각 위치에서 A에 의해 동시에 치환되었다. 펩티드의 수는 도 8에서 나타난 바에 상응한다. 바 1 (펩티드 7)은 각 위치에서 A에 의해 동시에 치환된 P7 및 P8을 갖는 펩티드 NMGBPS1의 반응성을 나타낸다 .
도 12. a) A12, S12 및 E12에 의한 V12의 치환 및 b) A7 에 의한 P7 또는 A8 에 의한 P8의 치환으로 구성된 펩티드 NMGBPS1으로 도입된 변이로부터 유도된, 핀 상에서 합성된 펩티드 수집. 펩티드 1은 NMGBPS1의 서열에 상응한다.
도 13. 모노클로날 항체 항-다당류 B와, 도 12에 나타난 핀 상에서 합성된 펩티드 수집의 반응성.
도 14. 1) F10 에 의한 W10의 치환 및 2) the substitution of A7 에 의한 P7 또는A8 에 의한 P8의 치환이 도입된 변이를 갖는 서열 NMGBP 1(바 1)에 기초한 펩티드와 항-다당류 B 모노클로날 항체의 반응성. 그래프는 각 펩티드의 서열을 나타낸 것이다.
도 15. 리간드 a) 항-다당류 B 모노클로날 항체로의 펩티드 NMGBPS1의 결합에 필수적인 최소 서열의 직렬로 3개 카피를 포함한 펩티드, b) 펩티드 NMGBPS1 및 c) 대조 펩티드를 사용하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청형 B의 캡슐화 다당류로의 항-다당류 B 모노클로날 항체의 결합의 저해.
실시예
1.
네이세리아
메닝기티디스의
모노클로날
항체 항-다당류 B와 파지 상에 나타나는 펩티드 라이브러리의
패닝
.
본 발명에서 기술된 펩티드의 선별을 위해 섬유상 파지의P8 영역에서 발현되 는, 15개 아미노산 잔기의 선형 무작위 펩티드 라이브러리를 구성하였다. 상기 라이브러리를 인간 조직을 인식하지 않는 N. 메닝기티디스에 대한 살균 활성을 갖는 선택적 분자인 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 패닝하였다(Pon R. A. et al. 1997. N-Propionylated group B meningococcal polysaccharide mimics a unique bactericidal capsular epitope in - group B Neisseria meningitidis . J. Exp. Med. 185: 1929-1938).
라이브러리의 패닝을 고형 지지체를 코팅하기 위해 직접적으로 사용되는 항체를 제외하고는 문헌(Smith G. P. et al. 1993. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage . Methods Enzymol. 217: 228-257)에 기재된 바와 같이 필수적으로 사이클 내에서 실행하였다(Smith G. P. et al. 1993. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. Methods Enzymol. 217: 228-257).
파지 및 모노클로날 항체의 반응 후에, 항체에 흡착되지 않는 파지 절편(절편 N1)을 수집하고 역가를 측정하였다. 또한 항체에 흡착된 파지 절편(절편 A1)을 수집하고 파지의 역가를 측정하였다. 비율 역가 N1/역가 A1을 계산하였다. 절편 A1을 증폭시키고 항-다당류 B 모노클로날 항체와 반응시켰으며 항체에 흡착된 파지 절편 및 흡착되지 않는 파지 절편을 수집하고 역가를 다시 측정하였다. 이러한 사이클을 역가 N/역가 A 비율이 103 미만이 될 때까지 반복하였다. 패닝의 네 사이클을 실시하였다. 표 1은 패닝의 각 사이클 후에 수집된 절편 A 및 N의 역가측정하여 수득된 수치를 나타낸다. 표는 또한 다음 사이클에 사용하기 위해 증폭하고 정제한 후 패닝의 각 사이클에서 수득한 절편 A의 역가를 나타낸다.
네 라이브러리 패닝 사이클 후 선별 항체에 흡착된 파지를 E. coli XL-1 블루세포에 감염시키기 위해 사용하고 여러 희석물을 배양 배지 2XYT를 포함하는 아가 플레이트 상에 놓았다. 개별 파지를 선택하고 액상 배양으로 증폭시켰다. 파지를 폴리에틸렌 글리콜로 침전시켜 정제하였다.
실시예
2. 네 라이브러리
패닝
사이클 수에 선택된 파지와 선별 항체의 반응성.
정제된 파지(30 ㎍)를 니트로셀룰로스 막 상에 적용시켰다. 동량의 대조 파지 또한 적용시켰다. 탈지유로 차단한 후에, 막을 항-다당류 B 모노클로날 항체와 함께 항온하였다. 반응성을 H2O2 및 색원체 디아미노벤시딘을 함유하는 용액과 함께, 효소 고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 마우스 IgG를 특이적으로 인식하는 항체와 항온함에 의해 검출하였다. 도 1은 결과를 나타낸다. 더 높은 강도에 상응하는 25개 파지를 추가 연구를 위해 선택하였다.
실시예
3. 항-다당류 B
모노클로날
항체와 함께 네 사이클의 라이브러리
패닝
후 선택된 파지로부터의
DNA
의 정제 및 서열결정.
면역확인 실험에서 양성인 25개 파지의 DNA를 정제하고 누클레오티드 서열을 결정하였다. 파지 DNA의 정제는 문헌(Sambrook J. et al. 1989. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA)에 이미 기재된 바와 같이 실행하였다. 바이러스 DNA를 올리고누클레오티드 M13/pUC 서열결정 프라이머(-47) #1224, 미국 뉴잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 M13/pUC 역 서열결정 프라이머(-48) #1233, 미국 뉴잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드)를 사용하여 자동 서열결정기 ALFexpressII (Termo SequenaseTM CyTM 5 Dye Terminador Kit, 아메샴 바이오사이언스)로 서열결정하였다. 모든 클론은 서열목록에 나타난 바와 같이 동일한 서열을 갖는다(서열 번호 1). 이 DNA 서열의 번역에 상응하는 펩티드는 서열 목록에 나타냈다(서열 번호 5).
실시예
4. 항-다당류 B
모노클로날
항체와 함께 4 사이클의 라이브러리
패닝
후에 선택된 파지에서 나타나는 펩티드 서열의 특성화.
네 사이클의 라이브러리 패닝 후에 선택된 파지에서 나타나는 서열의 분석에서, 이미 보고된 N. 메닝기티디스 혈청군 B로부터의 캡슐화 다당류의 분자 유사체의 다른 서열로 정렬을 만들었으며(Shin J. S. et al. 2001. Monoclonal antibodies specific for Neisseria meningitidis group B polysaccharide and their peptide mimotopes. Infect. Immun. 69: 3335-3342; Park I. et al. 2004. Peptide mimotopes of Neisseria meningitidis serogroup B capsular polysaccharide . Yonsei Medical Journal. 45: 755-758; Moe G. R. et al. 1999. Molecular mimetics of polysaccharide epitopes as vaccine candidates for prevention of Neisseria meningitidis serogroup B disease. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26: 209-269; Moe G. R and Granoff D. M. 2001. Molecular mimetics of Neisseria meningitidis serogroup B polysaccharide . Int. Rev .Immunol. 20:201-20; Granoff D. M. and Moe G. R. 2003. Molecular mimetics of unique Neisseria meningitidis serogroup B epitopes . USP 6,642,354 B2), 어떤 경우에서는 29% 이상의 유사성 비율을 나타내지 않는다. 정렬을 소프트웨어 Clustal W 로 실행하였다(Thompson J. D. et al. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting , position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-80).
서열은 또한 소프트웨어 BLASTP 2.2.10 을 사용하는 NCBI의 데이터베이스에서 유사성 검색에 의해 특성화하였다(Altschul S. F. et al . 1997. Gapped BLAST and PSI - BLAST : a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). The search was limited to sequences of bacterial genes and proteins contained in the databases SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) and NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 결과는 이러한 데이터베이스에서 기탁된 서열과 펩티드 NMGBPS1의 유사성 비율은 30% 이상이다.
실시예
5. 세 사이클의 라이브러리
패닝
후에 선택된 파지와
선택자
항체의 반응성.
N. 메닝기티디스 혈청군 B로부터의 캡슐화 다당류의 다른 유사체 구조를 확인하기 위해, 세 사이클의 라이브러리 패닝 후에 항-다당류 B 항체에 흡착된 파지를 ELISA로 평가하였다. 파지를 개별적으로 정제하고 ELISA 플레이트를 코팅하기 위해 사용하였다. 실험에서 또한 대조 파지 및 펩티드 NMGBPS1을 나타내는 파지를 포함한다. 탈지유로 차단한 후에, 플레이트를 항-다당류 B 모노클로날 항체와 함께 항온하였다. H2O2 및 색원체 o-페닐렌-디아민(OPD)을 포함하는 용액과 함께, 고추냉이 퍼옥시다제 효소에 접합된 마우스 IgG에 특이적인 항체와 함께 항온한 후에 반응성이 나타났다. 황산 2.5N으로 반응을 중단시키고 A492nm 을 ELISA 플레이트 판독기에서 판독하였다. 도 2는 여러 정제된 파지에서 얻은 결과를 나타낸다. 대조 파지에서보다 더 우수한 강도의 ELISA 시그널을 갖는 20개 파지를 추가 연구를 위해 선택하였다.
실시예
6. 항-다당류 B
모노클로날
항체와 세 번째 사이클의 라이브러리
패닝
후에 선택된 파지로부터의
DNA
의 정제 및 서열결정.
면역확인 ELISA 실험에서 20개의 선택된 파지로부터의 DNA를 실시예 3에 기재된 바와 동일한 방법에 따라 정제하고 서열결정하였다. 모든 클론은 네 사이클의 라이브러리 패닝 이후에 분리된 파지로부터의 서열과 동일한 서열을 갖는다. 이 서열은 서열 목록에서 서열 번호 1로 나타내어진다. 단백질 서열로의 이 DNA 서열의 번역에 상응하는 아미노산 서열은 서열 목록에서 서열 번호 5로 나타내어진다.
실시예
7. 라이브러리
패닝의
두 번째 사이클 후에 선택된 파지와
선택자
항체의 반응성.
N. 메닝기티디스 혈청군 B로부터의 캡슐화 다당류의 다른 유사체 구조의 탐색을 계속하기 위해, 라이브러리 패닝의 두 번째 사이클 후에 항-다당류 B 항체에 흡착되는 파지를 ELISA에 의해 평가하였다. 파지를 개별적으로 정제하고 ELISA 플레이트를 코팅하기 위해 사용하였다. 실험에서 또한 대조 파지 및 펩티드 NMGBPS1을 나타내는 파지를 포함한다. 탈지유로 차단한 후에, 플레이트를 항-다당류 B 모노클로날 항체와 함께 항온하였다. H2O2 및 색원체 o-페닐렌-디아민(OPD)을 포함하는 용액과 함께, 고추냉이 퍼옥시다제 효소에 접합된 마우스 IgG에 특이적인 항체와 함께 항온한 후에 반응성이 검출되었다. 황산 2.5N으로 반응을 중단시키고 A492nm 을 ELISA 플레이트 판독기에서 판독하였다. 도 3은 여러 정제된 파지에서 얻은 결과를 나타낸다. 대조 파지에서보다 더 우수한 강도의 ELISA 시그널을 갖는 15개 파지를 추가 연구를 위해 선택하였다.
실시예
8. 항-다당류 B
모노클로날
항체와 함께 두 번째 사이클의 라이브러리
패닝
후에 선택된 파지로부터의
DNA
의 정제 및 서열결정.
면역확인 ELISA 실험에서 선택된 15개 파지로부터의 DNA를 실시예 3에서 기재한 바와 동일한 방법에 따라 정제하고 서열결정하였다. 총 5개의 독특한 서열이 확인되었다. 표 2는 파지에서 나타난 모든 서열의 등장 빈도를 나타낸 것이다. 서열 1은 펩티드 NMGBPS1에 상응한다.
실시예
9. 라이브러리
패닝에
의해 선택된 파지에서 나타나는 펩티드의 반응성의
ELISA
특성화.
실시예 8에서 확인된 독특한 서열 각각을 발현하는 파지를 정제하고 항-다당류 B 모노클로날 항체와의 이의 반응성을 연구하였다. 세 ELISA 실험을 실행하였다: 1) 파지를 폴리프로필렌 플레이트로 직접적으로 적용시키고 추가로 항-다당류 B 모노클로날 항체를 첨가하고 마지막으로 마우스 IgG에 대해 특이적인 면역글로불린을 첨가한 통상적인 ELISA; 2) 항-다당류 B 모노클로날 항체를 ELISA 플레이트로 직접적으로 적용시킨 후 파지를 첨가하고 그 후 토끼에서 수득한 항 야생형 M13-파지 혈청을 첨가하고 마지막으로 토끼 IgG에 특이적인 면역글로불린을 첨가하는 ELISA 샌드위치; 3) 플레이트를 박테리아로부터 정제된 다당류 B의 용액으로 코팅하는 저해 ELISA. 모든 경우에 마지막에 첨가된 면역글로불린이 효소 고추냉이 퍼옥시다제에 결합하며 반응성은 H2O2 및 색원체 0-페닐렌-디아민(o-phenylene-diamine; OPD)을 포함하는 용액으로 나타났다. 반응을 황산 2.5 N으로 중지시키고 A492nm 을 ELISA 플레이트 판독기에서 판독하였다. 도 4는 수득된 결과를 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같은 독특한 서열 2, 3 및 5를 발현하는 파지 클론은 검정된 세 ELISA에서 펩티드 NMGBPS1과 유사한 방식으로 작용하며, 표 2에 나타낸 바와 같이 독특한 서열 4를 발현하는 파지는 검정된 세 ELISA에서 대조 파지에서와 유사한 방식으로 작용한다. 추가 연구를 위해 선택한 펩티드 2, 3 및 5를 각각 NMGBPS2, NMGBPS3 및 NMGBPS4으로 명명하였다.
NMGBPS2, NMGBPS3 및 NMGBPS4에 상응하는 DNA 서열은 각각 서열목록의 서열 번호 2, 3 및 4로 나타냈다. 단백질 서열로의 DNA 서열의 번역에 상응하는 펩티드는 각각 서열목록에서 서열 번호 6, 7 및 8로 나타냈다. 표 2는 확인된 파지 및 서열의 확인 수 사이의 상응을 보인다
실시예
10. 항-다당류 B
모노클로날
항체의 두 번째 사이클 후에 선택된 파지에서 발현되는 펩티드 서열의 특성화
라이브러리 패닝의 두 번째 사이클 후에 선택된 파지에서 드러나는 서열의 분석을 위해, 정렬을 펩티드 NMGSP2에 대해 30% 이상의 유사성 비율을 갖고 펩티드 NMGBPS3에 대해 33% 이상도 펩티드 NMGBPS4에 대해 40% 이상도 아닌 유사성 비율을 갖는 모든 경우의 결과를 나타내는, 이미 보고된 N. 메닝기티디스 다당류 B의 유사체 구조의 다른 서열로 만들어진다(Shin J. S. et al. 2001. Monoclonal antibodies specific for Neisseria meningitidis group B polysaccharide and their peptide mimotopes. Infect. Immun. 69: 3335-3342; Park I. et al. 2004. Peptide mimotopes of Neisseria meningitidis serogroup B capsular polysaccharide . Yonsei Medical Journal. 45: 755-758; Moe G. R. et al. 1999. Molecular mimetics of polysaccharide epitopes as vaccine candidates for prevention of Neisseria meningitidis serogroup B disease. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26: 209-269; Moe G. R and Granoff D. M. 2001. Molecular mimetics of Neisseria meningitidis serogroup B polysaccharide. Int. Rev .Immunol. 20:201-20; Granoff D. M. and Moe G. R. 2003. Molecular mimetics of unique Neisseria meningitidis serogroup B epitopes . USP 6,642,354 B2). 정렬을 Clustal W 프로그램으로 실행하였다 (Thompson J. D. et al. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-80).
수득된 서열을 또한 프로그램 BLASTP 2,2,10을 사용한 NCBI의 데이터베이스에서 유사성 검색으로 특성화하였다(Altschul S. F. et al. 1997. Gapped BLAST and PSI - BLAST : a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). 검색은 데이타베이스 SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot /) 및 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /)에 포함된 박테리아 유전자 및 단백질의 서열로 한정하였다. 이 과정의 결과는 이러한 데이터베이스에 기탁된 서열에 대해 검출된 유사성의 비율이 펩티드 NMGBPS 2 및 4에 대해 30% 미만이고 펩티드 NMGBPS3에 대해 35% 미만임을 나타낸다.
실시예
11. 펩티드
NMGBPS1
-
NMGBPS4
의 표면에 나타나는 파지로의
복강내
경로를 통한
Balb
/c 마우스의 면역화
펩티드 NMGBPS1-NMGBPS4의 면역원성을 평가하기 위해, Balb/c 마우스에서의 면역화 스케줄을 상기 펩티드를 나타내는 파지로 동물에 직접적으로 접종시키도록 구성하였다. 파지를 de la Cruz 및 협력자에 의해 기술된(de la Cruz F.V. et al. 1988. Immunogenicity and epitope mapping of foreign sequences via genetically engineered filamentous phage. J. Biol. Chem. 25: 4318-4322) 정제 과정 1의 변형에 이어 세슘 클로라이드 기울기로 정제하였다.
7마리 Balb/c 마우스(H-2d 암컷, 7-8 주령) 그룹을 각 파지로 면역화하였다. 각 마우스는 각 접종에서 1011 바이러스성 입자를 투여받았다. 추가 그룹의 마우스를 각 접종시 마우스 당 5 ug의 단백질 인간 혈청 알부민(HAS)에 접합된 N.메닝기티디스로부터의 N-프로피닐화 다당류 B(pPSC-B)로 면역화시켰다(Jennings H. J. et al . 1986. Induction of meningococcal group B polysaccharide-specific IgG antibodies in mice by using an N- propionylated B polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. J Immunol 137: 1708-1713). 복강내 경로에 의한 세 면역화가 15일 간격으로 분리되어 이루어졌다. 모든 면역원을 일차 투여에서 완전 프로인트 아쥬반트로 에멀전화하고 연속 투여시 불완전 프로인트 아쥬반트로 에멀전화하였다. 표 3은 각 그룹에 투여한 면역원을 나타낸 것이다.
실시예
12. 펩티드
NMGBPS1
-
NMGBPS4 의
면역원성의 ELISA 평가
섬유상 파지에서 드러나는 펩티드 NMGBPS1-NMGBPS4에 의해 유도되는 항체(IgG)의 수준을 ELISA로 측정하였다. 삼차 접종 후 수득한 동물로부터의 혈청을 ELISA 플레이트를 코팅하기 위한 항원으로서 확인된 펩티드의 서열을 갖는 합성 펩티드를 사용하여 평가하였다. 도 5는 상당히 증가한 3회 면역화 후에 파지에서 나타나는 펩티드에 대한 특이 IgG 항체의 수준을 보여준다. 결과를 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis)의 등급에 의한 간단한 분류의 변화의 분석의 비-파라미터 방법으로 분석하였으며, 이는 군들 사이의 변화가 바틀렛 테스트(Bartlett Test)에 따라 균질하지 않기 때문이다. 비-파라미터 다중 비교를 하기 위해 둔스 테스트(Dunns Test)를 사용하였다.
실시예
13. 항-다당류 B
모노클로날
항체와
패닝한
후 파지에서 나타난 펩티드 라이브러리 중에서 선택된 펩티드에 의해 유도되는 항체의 혈청 살균 활성의 평가.
각 면역원을 접종시킨 마우스의 각 군으로부터의 혈청 혼합물을 Ashton 및 협력자들의 문헌(Ashton F. E. et al. 1989. Protective efficacy of mouse serum to the N- propionyl derivative of meningococcal group B polysaccharide. Microb. Pathog. 6: 455-458)에 의한 혈청 살균 검정을 사용하여 수막구균 다당류 B에 직접적으로 대항하는 항체의 평가를 위해 평가하였으나, 이러한 연구자들에 의해 추천된 완충용액을 사용하는 대신에 BSA를 보충한 베로날 용액(Veronal solution)을 사용하였다. 이 용액은 N. 메닝기티디스 혈청군 B의 캡슐에 대항하는 항체를 평가할 때 살균 검정의 감수성을 증가시켜 추천되었다(Mandrell R. E. et al. 1995. Complement -mediated bactericidal activity of human antibodies to poly alpha 2-->8 N-acetylneuraminic acid , the capsular polysaccharide of Neisseria meningitidis serogroup B. J. Infect. Dis. 172: 1279- 1289). 혈청학 분류 B:4:P1.19,15을 갖는 N. 메닝기티드스 균주 CU385을 검정에 사용하였다. 살균 항체의 역가를 대조에 대해 박테리아의 적어도 50%를 죽일 수 있는 평가된 항체의 많은 희석의 역수로서 표현하였다. 표 4는 결과를 나타낸다.
실시예
14. 항-다당류 B
모노클로날
항체에 의해 및 마우스 혈청에 의해 인식되는 펩티드 영역의
맵핑
.
펩티드 NMGBPS 1-4의 영역을 연구하기 위해, 항-다당류 B 모노클로날 항체 및 이러한 펩티드를 나타내는 섬유상 파지로 면역화시킨 마우스의 혈청에 의해서 인식시키고, 4개 잔기에 의해 오버랩핑되고 펩티드 NMGBPS 1-4의 총 서열을 커버하는 5개-잔기 펩티드 단편의 집합을 셀롤로스 막 상에서 합성하고 1) 아미노 말단으로부터, 2) 카르복시 말단으로부터 및 3)두 말단 모두로부터 동시에 아미노산 잔기의 연속적인 결실을 포함하는 이러한 펩티드의 단편 또한 합성하였다.
도 6은 펩티드 NMGBPS1의 영역을 맵핑하기 위해 합성된 펩티드 단편의 설계를 나타낸다. 도 7(왼쪽 패널)은 셀룰로스 막을 항-다당류 B 모노클로날 항체와 함께 항온했을 때 수득된 결과를 나타낸다. 5개-아미노산-잔기 펩티드 중에서, VWYVE 및 WYVEG를 갖는 것들이 인식되었다. 이 결과 및 펩티드의 나머지로 수득된 반응성의 패턴의 분석은 항-다당류 B 모노클로날 항체의 결합에 필수적인 펩티드 NMGBPS1 내의 최소 서열이 테트라펩티드 WYVE 이라는 결론을 가능하게 한다. 도 7 (오른쪽 패널)은 섬유상 파지에 나타나는 펩티드 NMGBPS1로 면역화시킨 마우스의 혈청의 혼합물과 함께 페이퍼 상에서 합성된 펩티드 수집물의 항온은 모노클로날 항체에 대해서 수득된 결과와 동일한 서열 WYVEG를 갖는 펩티드 단편의 인식을 가능하게 함을 나타낸다. 혈청 혼합물은 또한 펩티드 NMGBPS1에서의 이차 에피토프의 형성을 나타내는 서열 RPPVW 및 PPVWY의 펩티드 단편에 상응하는 지점을 인식하며, 항체의 생성을 유도할 수 있다. 펩티드 NMGBPS1의 구조 예상으로부터, 이러한 이차 에피토프의 형성에서 두 P의 존재를 기초로 함이 결론지어졌으며 이는 이들이 면역계로 펩티드의 이 영역이 제시되는 것이 우세한 펩티드의 구조 내로의 전환을 유도하기 때문이다.
실시예
15. 펩티드
NMGBPS1
-4로의 점 돌연변이로부터
유래된
펩티드
수집물의
합성 및 항-다당류 B 모노클로날 항체와 상기 펩티드의 반응성.
실시예 14에서 설명된 실험으로부터 유래된 결과를 고려하여 1) 면역 반응의 도입 능력을 갖는 항-다당류 B 모노클로날 항체로 결합하는 영역으로 어떤 추가 영역을 포함하지 않는, 및/또는 2) 항-다당류 B 모노클로날 항체와 더 우수한 친화성을 갖는 펩티드 NMGBPS1-4의 변이체 탐색을 고려하였다. 이를 이루기 위해 펩티드의 각 P(위치 7 및 8)가 A에 의해 치환되는 펩티드 수집물의 합성 방법을 선택하였으며 1 내지 3 지점의 원래 아미노산에 대한 변화가 항-다당류 B 모노클로날 항체의 결합에 필수적인 서열에 상응하는 위치에서 도입되었다. 원래 아미노산이 전하, 소수성 및 친수성, 극성, 구조적 상동성 및 아미노산 측면 잔기와 같은 이러한 기준들을 고려하여 변화시켰다. 또한, 펩티드를 각 위치에서 하나의 A가 도입되도록 합성하였다.
도 8은 펩티드 NMGBPS1의 최적화를 위해 합성된 펩티드 수집물이다. 펩티드 1은 NMGBPS1 서열에 상응한다. 모든 펩티드에서 위치 7 및 8의 Pro를 동시에 Ala Ala로 치환하였다. 항-다당류 B 모노클로날 항체에 결합하는데 필수적인 아미노산에 상응하는 위치에서 상기에 설명된 기준을 고려하여 1-3개 위치의 변화를 도입하였다. 도 9는 항-다당류 B 모노클로날 항체와 도 8에 나타난 펩티드 수집물의 반응성을 나타낸다. P7 by A7 에 의한 P7 및 A8 에 의한 P8의 동시 치환(펩티드 7, 도 9)은 항-다당류 B 항체와 펩티드 NMGBPS1(펩티드 1, 도 9)의 결합의 친화성을 감소시킨다. 이를 고려하여 다른 합성 펩티드와 항-다당류 B 모노클로날 항체의 반응성 분석에서, 위치 7 및 8 각각에서 Ala를 갖는 것을 제외하고는 모노클로날 항체의 결합에서 필수적인 에피토프를 순수하게 보존하고 있는 펩티드를 양성 대조(펩티드 7, 도 9)로 선택하였다. 이는 변화를 도입하기 위한 유리한 위치로서 원래 펩티드에서 V를 갖는, 위치 12의 확인을 가능하게 한다. 예를 들어, A12 에 의한 V12의 변화(펩티드 5, 도 10)는 양성 대조(펩티드 7, 도 10)에 비해 모노클로날 항체와의 친화성을 증가시키며, S12에 의한 V12의 치환(펩티드 11, 도 10) 또는 E12에 의한 V12의 치환(펩티드 12, 도 10)은 양성 대조(펩티드 7, 도 10)에 비해 모노클로날 항체와의 반응성을 85% 이상 보존하는 펩티드를 생성한다. A9 에 의한 V9의 변화(펩티드 16, 도 10) 및 E11 에 의한 Y11의 변화(펩티드 14, 도 10) 또는 I11 에 의한 Y11 의 변화(펩티드 14, 도 10) 를 갖는 펩티드에서 양성 대조에 비해 항-다당류 B 모노클로날 항체에 대한 반응성의 75% 이상이 보존되었다(펩티드 7, 도 10). 다른 위치에서의 변화는 양성 대조에 비해 75% 이하로 모노클로날 항체에 대한 반응성을 낮춘다. 2, 5, 7, 11, 12, 14 및 16으로서 도 8에 나타난 펩티드에 상응하는 서열들은 Seq. ID No. No. 9, Seq. ID No. No. 10, Seq. ID No. No. 11, Seq. ID No. No.12, Seq. ID No.13, Seq. ID No. 14 및 Seq. ID No. No. 15로서 서열목록에 나타나 있다.
도 11은 위치 13에서의 치환을 갖는 펩티드를 나타낸다. 이는 원래 펩티드에서 E를 갖는 이 위치가 돌연변이의 도입에 적절하지 않음을 나타내는데 이는 이 아미노산의 치환이 모노클로날 항체와의 반응성을 양성 대조(펩티드 7, 도11)에 비해 반응성을 매우 낮추기 때문이다. 다른 아미노산의 다른 변화의 도입은 아미노산 13이 변화했을 때 항체와의 반응성을 증가시키지 않는다. 그러므로 펩티드 서열에서 존재하는 글루탐산은 인식에 필수적이다.
이전 결과를 고려하여, 두 개의 P 중 하나만이 A로 치환되고 양성 대조 펩티드에 비해 항-다당류 B 항체와의 반응성의 85% 이상을 보존하는 동시 치환으로서 펩티드의 새로운 수집물을 합성하였다.
도 12는 펩티드 NMGBPS1의 서열의 최적화를 유지시키기 위해 합성한 이차 펩티드 수집물이다. 서열 1은 펩티드 NMGBPS1에 상응한다. 항-다당류 B 항체와 결합을 위한 서열은 A12 에 의해 치환된 V12 , S12 에 의해 치환된 V12 및 E12 에 의해 치환된 V12의 변화만을 포함하고 P의 일부를 A로 치환하는 것도 마찬가지로 포함하는 펩티드를 합성하였다. 실험의 대조로서 원래 펩티드의 모든 P를 포함하거나 모든 P를 A로 동시에 치환한 유사 펩티드를 합성하였다. 도 13은 항-다당류 B 모노클로날 항체와 도 12에 나타난 펩티드 수집물의 반응성을 나타낸다. A7 에 의한 P7 의 치환은 항-다당류 B 항체에 결합하는 에피토프가 손상되지 않고 보존되었을 때 및 A12 에 의한 P12 의 치환이 펩티드 NMGBPS1에 대해 도입되었을 때 항체와의 반응성의 97%를 회복하도록 한다. 도 8에서 2-12로서 나타낸 펩티드에 상응하는 서열은 서열목록에서 Seq. ID No. 16, Seq. ID No. 17, Seq. ID No. 18, Seq. ID No. 19, Seq. ID No. 20, Seq. ID No. 21, Seq. ID No. 22, Seq. ID No. 23, Seq. ID No. 24, 25 Seq. ID No. 및 Seq. ID No. 26이다.
다른 실험에서 아미노산 W가 F에 의해 치환된 펩티드와의 반응성을 평가하였다. 도 14는 W10이 F10으로 변화된, 그리고 추가적으로 P7 이 A7 에 의해 치환되거나 P8 이 A8로 치환된 NMGBPS1로부터 유래된 펩티드와 항-다당류 B 모노클로날 항체와의 반응성을 보여준다. 도 10은 합성 펩티드의 서열을 보여준다. 펩티드 NMGBPS1에 비해 항체와의 반응성의 86%가 A7 에 의한 P7 의 치환 및 F10 에 의한 W10 의 치환이 동시에 도입된 펩티드에서 보존되었다(펩티드 2, 도 14). 도 14에서 바 2, 3 및 4의 아래 부분에 나타난 펩티드에 상응하는 서열은 서열목록에서 Seq. ID No. 27, Seq. ID No. 28 및 Seq. ID No. 29로 나타나 있다.
실시예 16. 펩티드 NMGBPS1 -4로의 항-다당류 B 모노클로날 항체의 결합에 필수적인 최소 서열의 여러 카피를 포함하는 펩티드의 합성.
항-다당류 B 모노클로날 항체로의 우수한 친화성을 갖는 정의된 펩티드에 따른 다른 전략은 펩티드 NMGBPS1-4로의 항-다당류 B 모노클로날 항체의 결합에 필수적인 최소 서열의 직렬의 여러 카피를 포함하는 펩티드의 합성이다. 이 전략은 추가적으로, 펩티드 NMGBPS1-4로의 항-다당류 B 모노클로날 항체의 결합에 필수적인 영역에 대해서만 대항하는 면역 반응을 한정할 것이다.
합성 펩티드는 수막구균성 다당류 B와 항-다당류 B 모노클로날 항체의 결합의 저해에 대해 원래 펩티드와 비교하여 ELISA로 평가하였다. 폴리스티렌 플레이트를 박테리아성 다당류 B로 코팅하였다. 고정된 농도(5ug/ml)에서 펩티드의 다른 농도를 갖는 항-다당류 B 모노클로날 항체의 혼합물을 ELISA에 첨가하였다. 그런 다음, 효소 고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 마우스 IgG에 특이적인 면역글로불린을 첨가하고 반응성을 H2O2 및 색원체 o-페닐렌-디아민(OPD)을 포함하는 용액으로 나타냈다. 반응을 항산 2.5 N으로 중단시키고 A492nm를 ELISA 플레이트 판독기에서 판독하였다.
도 15는 펩티드 NMGBPS1-4로의 항-다당류 B 모노클로날 항체의 결합에 필수적인 최소 서열의 세 카피를 포함하는 합성된 펩티드로 수득된 결과를 보인다. 이 펩티드는 펩티드 NMGBPS1보다 더 효과적으로 다당류 B에 항-다당류 B 모노클로날 항체가 결합하는 것을 저해할 수 있다.
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Combination at random of 15 amino acids
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< 223 > Peptide NMGBPS19
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Arg Gly Asp Lys Ser Arg Ala Pro Val Trp Tyr Ser Glu Gly Glu
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< 223 > Peptide NMGBPS22
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< 223 > Description of the Artificial Sequence:
Combination at random of 15 amino acids
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< 223 > Peptide NMGBPS23
< 400 > 27
Arg Gly Asp Lys Ser Arg Pro Pro Val Phe Tyr Val Glu Gly Glu
1 5 10 15
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< 212 > PRT
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< 220 >
< 223 > Description of the Artificial Sequence:
Combination at random of 15 amino acids
< 220 >
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< 222 > (1)..(15)
< 223 > Peptide NMGBPS24
< 400 > 28
Arg Gly Asp Lys Ser Arg Pro Ala Val Phe Tyr Val Glu Gly Glu
1 5 10 15
< 210 > 29
< 211 > 15
< 212 > PRT
< 213 > Artificial Sequence
< 220 >
< 223 > Description of the Artificial Sequence:
Combination at random of 15 amino acids
< 220 >
< 221 > PEPTIDE
< 222 > (1)..(15)
< 223 > Peptide NMGBPS25
< 400 > 29
Arg Gly Asp Lys Ser Arg Ala Pro Val Phe Tyr Val Glu Gly Glu
1 5 10 15
Claims (19)
- (α 2-8) 링크 N-치환 뉴라민산의 반복 유닛의 화학 구조를 갖는 탄수화물에 직접적으로 대항하는 면역 반응을 투여받은 유기체에 생성시키는 항원이며 Seq. ID No.5 - Seq. ID No.29의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 NMGBPS 1-25로 명명된 펩티드.
- 제1항에 있어서, Seq. ID No.1, Seq. ID No.2, Seq. ID No.3 및 Seq. ID No.4와 동일한, ADN-NMGBPS1, ADN-NMGBPS2, ADN-NMGBPS3 및 ADN-NMGBPS4로 명명된 DNA 단편에 의해 코드됨을 특징으로 하는 NMGBPS1, NMGBPS2, NMGBPS3 및 NMGBPS4로 명명된 펩티드.
- Seq. ID No.1, Seq. ID No.2, Seq. ID No.3 및 Seq. ID No.4와 동일한 염기 서열을 가지며 Seq. ID No.5, Seq. ID No.6, Seq. ID No.7 및 Seq. ID No.8과 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코드함을 특징으로 하는 ADN-NMGBPS1, ADN-NMGBPS2, ADN-NMGBPS3 및 ADN-NMGBPS4로 명명된 DNA 단편.
- 제1항에 있어서, (α 2-8) 링크 N-치환 뉴라민산의 반복 유닛의 화학 구조를 갖는 탄수화물에 직접적으로 대항하는 면역 반응을 투여받은 유기체에 생성시킬 수 있는 약학적 제형의 유효성분임을 특징으로 하는 NMGBPS 1-25로 명명된 펩티드.
- 다당류 항원을 포함함을 특징으로 하는 제4항에 따른 약학적 제형.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 제형의 성분 중 하나는 N. 메닝기티디스로부터의 캡슐화 다당류임을 특징으로 하는 약학적 제형.
- 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질-다당류 접합체를 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
- 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제형을 비경구적, 점막 또는 경구 경로로 투여함을 특징으로 하는 약학적 제형.
- 제4항, 제5항, 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 NMGBPS 1-25 중 적어도 하나의 유사 구조 또는 유사체를 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
- 제1항 또는 제8항에 있어서, 프롤린이 알라님으로 치환됨을 특징으로 하는 Seq. ID No.s 5-8, 16-26 및 27-29의 NMGBPS로 명명된 펩티드.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 트립토판이 페닐알라닌으로 치환됨을 특징으로 하는Seq. ID No.s 7-26의 NMGBPS로 명명된 펩티드.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 발린이 알라닌으로 치환됨을 특징으로 하는 Seq. ID Nos. 5-6, 8-29 의 NMGBPS로 명명된 펩티드.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 발린이 세린으로 치환됨을 특징으로 하는 Seq. ID Nos. 5-6, 8-29의 NMGBPS로 명명된 펩티드.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 발린이 글루탐산으로 치환됨을 특징으로 하는 Seq. ID Nos. 5-6, 8-29 의 NMGBPS로 명명된 펩티드.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 티로신이 글루탐산으로 치환됨을 특징으로 하는 Seq. ID Nos. 5, 9-13 및 16-29 의 NMGBPS로 명명된 펩티드.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 티로신이 이소루신으로 치환됨을 특징으로 하는 Seq. ID Nos. 5, 9-13 및 16-29 의 NMGBPS로 명명된 펩티드.
- 제1항 또는 제9항에 있어서, 펩티드 서열의 어느 글루탐산이 네이세리아 메닝기티디스에 대한 보호 항체의 인식에 필수적인 것임을 특징으로 하는 NMGBPS 1-25로 명명된 펩티드.
- 다양한 성질의 항원의 담체로서 사용되는 제4항, 제5항, 제6항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 단백질 중 적어도 하나를 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
- 제1항에 있어서, 면역 반응의 표적이 (α 2-8) 링크 N-치환 뉴라민산의 반복된 유닛의 화학 구조를 갖는 탄수화물인 질환의 진단을 위한 성분임을 특징으로 하는 NMGBPS1-25로 명명된 펩티드.
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