KR20080081198A - 단백질 ｎｍａ0939를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 의약 분야, 특히 NMA0939 단백질을 포함하는 약학적 제형의 개발에 관한 것이다. 본 발명에 기술된 제형은 병원성 제제에 의해 야기되거나 야기되지 않는 다른 질환에 대한 보호 또한 가능하다. NMA0939 단백질은 네이세리아 메닝기티디스 외부 막 소포 성분으로서 확인되며 이는 동물 모델에서 평가된 이의 면역원성 및 보호 활성을 갖는 재조합 DNA 기술을 통해 수득된다. 높은 수준의 보존에 기인하여 NMA0939 코딩 유전자는 이 단백질을 포함하는 약학적 조성물이 교차-반응성 면역 반응의 유도제로서 높은 가치를 가짐을 보여준다. 본 발명에서 나타낸 제형은 인간 의약의 범위에 적용가능하다.

NMA0939, 네이세리아 메닝기티디스, 수막구균성 질환

Description

단백질 ＮＭＡ0939를 포함하는 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING PROTEIN NMA0939}

본 발명은 다른 원천으로부터의 질환의 백신 항원에 대한 면역 반응의 질을 증가시키는 의약 분야, 특히 예방 또는 치료학적으로 적용되는 신규한 백신 제형의 개발에 관한 것이다.

숙주가 인간인 것으로만 알려진 그람-음성 상구균인 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)는 수막구균성 수막염의 병원이다. 일반적으로 이 박테리아는 이의 적소는 이의 미생물학적 분리를 위한 가장 일반적인 원천인, 일반 집단 중에서 무증후성 운반체 상태로 발견된다.

세계적으로, 2세 미만의 소아들이 수막구균성 수막염에 더 잘 걸리는 집단이나, 아동 및 일반 성인 집단 또한 많은 영향을 받을 수 있다.

치료되지 않은 수막구균성 질환은 감염된 대부분의 개체에게 치명적인 경과를 보이며 백신화는 박테리아 집락형성 단계 이전에 중지시켜 이러한 상황을 예방할 수 있다.

일반 집단에서 이 질환에 대한 예방을 위해 필요한 요구조건을 이행할 수 있는 백신을 얻기 위한 목적으로 여러 전략이 전개되었다. 이러한 목적을 위해 캡슐 화 항원이 고려되었으며, 이는 이들의 면역학적 특이성이 이 미생물의 혈청군으로 분류되기 때문이다. 5가지의 이러한 혈청군이 세계 도처에서의 수막구균성 질환의 임상 학적 경우들의 대부분의 원인으로서 정의되었다. 혈청군 A는 사하라 이남 아프리카에서의 유행병의 주요 원인이다. 혈청군 B 및 C는 선진국에서 발병하는 대부분의 경우에 관련되어 있다. 혈청군 Y 및 W135는 질환의 재발성 케이스의 대부분에서 일반적이며 이들은 최근 몇 년간 미국의 일부 지역에서 급격히 증가하고 있다. 이러한 데이터로부터 백신 후보제로서 캡슐화 다당류의 사용, 연구 및 평가의 이유가 명백해진다. 캡슐화 다당류에 기초한, 혈청형 A, C, Y, 및 W-135에 대한 예방을 부여하는 4가 백신이 미국에서 허가되었다. 백신화 후에 유도된 항체는 혈청군-특이성을 갖는다(Rosenstein N. et al. 2001. Meningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344, 1378-1388).

나머지와 다른 혈청군 B는 지역적 및 유행성 수막구균성 질환의 상당한 원인으로 유지되며 이는 주로 이에 대한 효과적인 백신이 전혀 없음에 의한 것이다. B 캡슐화 다당류가 적은 면역원성을 가지며, 백신에 대한 이론적 위험성의 존재는 인간 태아 신경 구조에 존재하는 올리고당과 유사한 구조 때문에 면역-내성 및 자가면역성을 유도하는 이 화합물에 기초함이 알려졌다(Finne J. et al . 1987. An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross - reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tissues. J. Immunol, 138: 4402-4407). 그러므로, 혈청형 B에 대한 백신의 개발은 피막하 항원의 사용에 집중되어 있다.

외부 막 단백질 및 소포 백신

외부 막 단백질에 기초한 백신을 생성하기 위한 70년대의 초기 시도는 세정제에 의한 외부 막 단백질 제제의 LPS 결실에 기초하였다(Frasch CE and Robbins JD. 1978. Protection against group B meningococcal disease . III . Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in a guinea pig model. J Exp Med 147(3):629-44). 외부 막 단백질(OMPs)은 염화나트륨에 현탁된 응집체를 제조하기 위해 침전되었다. 동물 실험에서의 유망한 결과에도 불구하고, 이러한 백신은 성인 또는 아동에서 살균 항체를 유도하는데 실패하였으며(Zollinger WD, et al . 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animals and humans . J. Infect. Dis. 137(6):728-39), 이러한 백신의 낮은 실행성은 침전을 수반하는 4차 구조의 결실에 의한 것이다. 그러므로, 다음 논리학적 단계는 외부 막의 소포의 형태인 자연적 구성으로 나타나는 단백질을 갖는 백신을 생성하는 것이다(Zollinger WD, et al. 1979. complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48, Wang LY and Frasch CE. 1984. Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model . Infect Immun. 46(2):408-14136).

이러한 외부 막 소포 백신은 OMP 응집체보다 상당히 더 면역원성을 나타내며 면역원성은 수산화나트륨 아쥬반트에 흡착됨에 의해 더 증강됨을 보인다 (Wang LY and Frasch CE. 1984. Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model . Infect Immun. 46(2):408-14136).

많은 효과적인 시도들이 다른 제형의 수용성 외부 막 소포 백신을 사용하여 실행되었다. 가장 광범위하게 연구된 두 백신은 쿠바 (Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis : protection trial and mass vaccination results in Cuba . NIPH Ann Dis. 14(2):195-210) 및 노르웨이(Bjune G, et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway . Lancet. 338(8775):1093-6)에서 각각 에서 질환의 발병에 대한 반응으로 1980년대에 개발되었다. 쿠바의 핀레이 인스티튜트(Finlay Institute)에 의해 생성된 OMV 백신(VA-MENGOC-BC로 상업적으로 명명됨)은 혈청군 C 다당류 및 고분자량 OMP의 제제와 함께 균주 B:4:P1.19,15로부터 생성되었으며 수산화알루미늄에 흡착된다(Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis : protection trial and mass vaccination results in Cuba . NIPH Ann Dis. 14(2):195-210). 이 백신은 쿠바에서 유행병의 급격한 쇠퇴에 기여하였다(Rodriguez AP, et al. The epidemiological impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba .1999. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94(4):433-40).

노르위젠 네셔널 인스티튜트 포 퍼블릭 헬스(Norwegian National Institute for Public Health; NIPH)에 의해 생산된 백신은 ET-5 클론 (B:15:P1.7,16)으로부터의 다른 유기체에 의해 생성되는 초 유행성 질환의 기간 동안에 사용하는 것으로 초기에 유사하게 의도되었다. 이는 또한수산화알루미늄에 흡착되는 정제된 외부 막 소포로부터 생성된 단가 백신이다(BjuneG, et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway . Lancet. 338(8775):1093-6).

외부 막 소포 백신은 적어도 십대 및 성인에서 기능적 살균 항체의 발생을 가능하게 하는 충분한 천연 구조로 외부 막 단백질이 효과적으로 존재함을 나탄내다. 발생된 항체 반응은 또한 수막구균의 옵소닌식균작용(opsonophagocytosis)을 증가시킴을 보여준다. 백신의 정확한 제형(즉 OMP 함량, LPS 함량 및 아쥬반트의 존재 및 결여)은 면역원성에서 상당한 영향력을 갖는다(Lehmann AK, et al. 1991. Immunization against serogroup B meningococci . Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence .APMIS. 99(8):769-72, Gomez JA, et al. 1998. Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferrin - binding proteins of Neisseria meningitidis . Vaccine.16(17):1633-9, Steeghs L, et al. 1999. Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopolysaccharide - Deficient Mutant of Neisseria meningitidis: Influence of Adjuvants on the Immune Response. Infect Immun. 67(10):4988-93).

질환 격리집단의 항원 프로필은 또한 급격하게 변화하며 제한된 수의 선택된 균주의 적용범위를 갖는 백신은 백신 조성물이 지역 역학을 반영하기 위해 변화되지 않는 한은 몇 년 내에 유효하지 않게 될 것이다.

현재 OMV 백신은 다른 혈청군 B 백신보다 더 광범위하게 사용되며 단일 PorA 유형에 의해 생기는 질환의 발병에 관하여 사용하는 것이 가능하다.

균주 사이에 교차-반응성을 발생시키는 면역원은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 핀레이 인스티튜트 및 NIPH 백신 실험 둘 다로부터의 백신화 후 혈청의 연구는 (P1, 클래스 1 혈청형 단백질) 및 OpcA (다른 주요 OMP, Opc로 이미 알려짐) (Wedege E, et al. 1998. Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infect Immun. 66(7): 3223-31) 둘 다에 대한 항체가 이러한 항원들 둘 다가 변이성으로 주목할만한 균주를 보이는 혈청 살균 활성(좀 더 면역원성을 나타내는 PorA을 갖는)의 조정에서 중요함을 제안한다.

PorA 단백질의 프로미넌스(prominence) 및 백신화 후(및 질병 후)에 살균 활성의 대부분이 향하는 에피토프에서의 발생 사이 및 동안에 지속되는 변이가 일어난 이 단백질에서의 상당한 수준의 변이 성은 단일 균주(단가) OMV-기저 백신에 의한 예방이 제한된 혈청아형에 국한될 것이라는 걱정을 증가시킨다(Jelfs J, et al . 2000. Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemic Spread . Clin Diagn Lab Immunol. 7(3):390-5).

이러한 잠재적 문제점을 극복하기 위한 시도에서, OMV 백신이 네덜란드에서 5개의 다른 유행성 병원균 분리체로부터의 PorA 단백질을 포함하는 RIVM로 개발되었다 (Van Der Ley P and Poolman JT. 1992. Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein . Infect Immun. 60(8):3156-61, Claassen I, et al. 1996. Production , characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine . Vaccine. 14(10):1001-8). 이 경우에서 백신 소포는 3개의 분리된 PorA 단백질을 발현하도록 일반적으로 유전조작된 널리 특성화된 H44/76 균주의 두 변이체로부터 추출되었다.

일반적인 항원의 탐색

외부 막 단백질(OMP)이 혈청군 B 질환에 대한 기능적 면역 반응을 유도할 수 있지만 현재까지 개발된 백신 중 어느 것도 외부 막 단백질의 영역이 드러난 표면의 상당한 이질성에 기인한 일반적인 예방성을 나타내지 못함이 분명하다. 외부 막 소포(OMV) 백신에 의해 유도되는 적당한 교차-반응 면역성은 기능성 항체를 유도하고 모든 수막구균성 균주에 에 존재하는, 외부 막 항원(또는 항원의 그룹)의 탐색을 불러일으킨다. 이러한 항원들은, 이들이 혈청군에 상관없이 모든 균주에 존재한다면, 다당류 백신화 이후에 병원균 균주에서의 캡슐화 스위칭(capsular switching)의 잠재적 문제점을 제거하는, 실제로 일반적인 수막구균성 백신의 기초를 형성할 것이다.

면역우성의 PorA 단백질의 가변성이 일반적 백신으로서 사용되는 것으로 한정될 것임이 명백해지면, 많은 주요 외부 막 단백질이 이들의 백신 잠재성에 대해 고려되며 몇몇 단백질들은 추가 개발되지 않았다. 고려된 단백질들은 클래스 5 단백질(OpcA), NspA 및 철 조절 단백질(iron regulated proteins)(TbpA 및 B, FbpA, FetA)을 포함한다. TbpB는 TbpA를 갖는 복합체에 결합하는 트랜스페린의 일부를 형성한다. 최근 연구는 TbpA가 철 결합에서 더 우수한 기능적 역할을 가지며(Pintor M, et al. 1998. Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis . J Med. Microbiol. 47(9): 757-60) TbpB보다 더 효과적인 면역원임을 제시하였다.

고도로 보존된 소수의 외부 막 단백질이 마우스를 면역화시키기 위한 다른 수막구균성 균주로부터의 외부 막 단백질 제제의 조합을 사용하는 신규한 기술을 통해 발견되었다(Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). 마우스로부터의 B 세포를 수막구균의 다중 균주에 대한 교차-반응성을 스크리닝하기 위한 혼성세포를 생산하기 위해 사용하였다. 하나의 높은 교차-반응성 모노클로날 항체가 NspA를 설계한 22 kDa 외부 막 단백질에 결합함이 발견되었다. 재조합 NspA 단백질로의 면역화는 마우스에서 혈청군 A-C로부터의 균주에 대한 교차-반응성 살균 반응을 유도함을 보여준다. 백신화는 또한 치명적인 수막구균 감염에 대해 마우스를 보호한다 (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). 유전적으로 다른 수막구균 균주 중에서 NspA 서열의 비교는 단백질이 고도로 보존되었음을 증명한다(97% 상동성) (Cadieux N, et al. 1999. Bactericidal and Cross -Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein . Infect Immun. 67 (9): 4955-9).

NspA의 존재는 항-NspA 모노클로날 항체를 사용하여 혈청군 A-C로부터의 시험된 균주의 99.2%에서 ELISA에 의해 검출되었다(Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). 이러한 모노클로날 항체는 수막구균의 많은 균주에 대한 살균작용이 있음이 보여졌으며 마우스 모델에서 수막구균성 균혈증을 감소시킬 수 있다(Cadieux N, et al. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein . Infect Immun 67 (9): 4955-9). 이 데이터가 NspA가 혈청군 한계에 걸쳐 보호할 수 있는 유망한 백신 후보제임을 제시하기 위한 것이지만, 마우스로부터의 폴리클로날 항-재조합 NspA 혈청은 이 유기체에 nspA 유전자가 존재함에도 불구하고 약 35%의 병원성 혈청군 B 수막구균 균주의 표면에 결합하지 않는다 (Moe GR et al. 1999. Differences in Surface Expression of NspA among Neisseria meningitidis Group B Strains. Infect Immun. 67 (11): 5664-75).

N. 메닝기티디스 게놈 서열 및 백신 설계에서의 이의 효과

MC58 (혈청군 B 수막구균) (Tettelin H, et al. 2000. complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58 . Science 287 (5459): 1809-15172) 및 Z2491 (혈청군 A 균주) (Parkhill J, et al. 2000. complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404 (6777):502-6173)의 게놈 서열을 2000년 동안에 밝혀지고 공개되었다. 주석달린 유전자 서열의 유효성은 수막구균성 백신 탐구에서 극적인 영향력을 가질 것이다. MC58 게놈 서열결정이 진행되는 동안, Pizza 등은 노출된 표면 또는 수출된 단백질 중 하나에 결합하는 외부 막을 코드하는 것으로 예상되는 오픈 리딩 프레임을 확인하기 시작했다. 이들은 폴리머라제 사슬 반응을 통해 증폭시키고 His-표지 또는 S-트랜스퍼라제 융합 단백질 중 하나로써 코드된 단백질의 발현을 가능하게 하는 E. coli 내로 클로닝한, ORF와 같은 570 이다(Pizza M, et al. 2000. Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole - Genome Sequencing . Science 287 (5459): 1816-20). 선택된 ORF의 61% (350)가 성공적으로 발현되었으며, 발현에 실패한 것들은 대개 하나 이상의 소수성 트랜스-막 도메인(가능하게는 많은 외부 막 결합 단백질을 배재함)을 포함한 것이다. 재조합 단백질을 정제하고 마우스를 백신화하기 위해 사용하였다. 그런 다음 면역 혈청을 효소 링크 면역흡착 검정(enzyme linked immunosorbent as-say; ELISA) 및 유동 세포계수법에 의해 다중 수막구균 균주에 결합하는 균주를 평가하고 혈청 살균 검정을 사용하여 두 균주에 대한 살균 활성을 측정하였다. 마지막으로 7개 단백질을 모든 세 가지 검정에서 양성 반응을 기초로 하는 추가 연구를 위해 선택하였다. 아쥬반트와 조합된 이러한 많은 단백질을 사용한 시험적인 백신 제형이 마우스에서 상동성 수막구균 균주(MC58)에 대한 상당한 살균 역가를 유도하지만, MC58 외부 막 수포 백신만큼 높은 SBA 역가를 유도하는 단백질은 없었다(Giuliani MM, et al. 2000. Proceedings 12th IPNC. p. 22). On the other hand, there is some evidence that combinations of these pro-teins may exhibit higher immunogenicity in mice than sin-gle proteins (Santini L. et al . 2000. Proceedings 12th IPNC. p. 25). 이 연구 동안에 배재된 많은 오픈 리딩 프레임은, 아마도 단백질 발현의 실패 또는 이들의 면역학적 특성의 변이에 의해, 또한 백신 잠재성을 가지며 추가 연구가 요구된다.

백신 성분은 N. 메닝기티디스의 발병과정에서 개별적인 항원들의 기여의 이해가 이뤄지면 좀더 효과적으로 선택될 수 있을 것이다. 항원 스스로 효과적인 백신 후보제를 만들거나, 대안적으로 약해진 돌연변이체가 백신 구성물로서 고려될 수 있다.

수막구균성 질환 예방 및/또는 치료의 중요한 문제는 현재까지 백신으로서 사용된 항원의 이질성에 기인한 일반적 보호성을 수여하는 날짜에 대한 혀용가능한 백신이 없다는 것이다.

본 발명은 상기 언급된 문제점을 서열이 다른 병원성 박테리아 속에서조차 고도로 보존된 단백질을 포함하는 약학적 제형을 제공함에 의해 해결하는데 기여한다. 본 발명이 추구하는 기술적 목적은 다른 새로운 병원균 또는 더 넓은 범위의 존재하는 병원균에 대한 전신성 및 점막성 숙주 면역 반응을 증가시키는 능력을 갖는 제형의 개발이다. 본 발명의 연구 목적에서 처음으로 많은 네이세리아 속에 의해 발생하는 수막구균성 질환 또는 어떤 감염에 대해 치료 또는 예방 특성을 갖는 백신 제형의 성분으로서 NMA0939 단백질의 사용을 보고하였다.

본 발명의 새로운 특성은 새로운 특성을 갖는 제형에서 NMA0939 단백질의 이전에 보고되지 않은 사용을 구성하며, 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 및 네이세리아 고노르호에(Neisseria gonorrhoeae)의 다른 분리체에서 이 단백질의 보존된 특성에 기인한 광범위 보호의 전신성 및 점막성 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 다른 구현인 약학적 조성물은 합성, 재조합 또는 천연 기원인 하나 또는 여러 항원을 포함할 것이다. 본 발명의 다른 구현에서, 조합된 약학적 조성물은 박테리아 다당류 및 좀더 특별하게, N. 메닝기티디스 다당류를 포함하는 다당류 항원을 포함할 것이다. 본 발명의 제형은 박테리아 기원의 다당류인, 접합된 단백질-다당류를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현에서, NMA0939를 포함하는 약학적 제형은 또한 상기 조성물로부터 유도된 보호 범위를 연장시키는 목적으로 펩티드 성질의 항원을 포함한다.

본원에 기술된 약학적 제형은 경구 경로를 포함하는, 비경구적 또는 점막 경로로 투여된다.

본 발명의 다른 바람직한 구현에서, 상기 요소의 면역원성을 증기시키기 위한 목적으로 NMA0939 단백질을 아쥬반트 또는 펩티드, 다당류의 담체 또는 더 적은 면역원성을 갖는 다른 어떤 항원으로서 사용할 수 있다. 실시예 11은 NMA0939 단백질이 바이러스-유래 펩티드가 NMA0939에 접합했을 때 상기 펩티드에 대한 항체 수준을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 주어진 단백질 항원에 대한 보호성 결정기가 이러한 결정기에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한 목적으로 NMA0939 아미노산 서열에 삽입되어 약학적 조성물에 존재하는 새로운 혼성 단백질의 일부를 이룸이 상기 결정기의 사용을 포함하는 본 발명의 범주에 또한 포함된다.

본 발명의 다른 바람직한 구현에서, 본 발명의 약학적 조성물은 수막구균 또는 네이세리아 속의 다른 어떤 박테리아에 대한 보호 반응을 유도할 수 있는 nma0939 단백질 단편을 포함할 것 이다. 본 발명의 특별한 구현에서, 약학적 조성물은 합성 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 NMA0939 미모토프(mimotope) 또는 NMA0939 유사 펩티드를 포함한다. 용어 "미모토프(mimotope)" 항체를 유도할 수 있는 모든 펩티드로 네이세리아에 대한 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 NMA0939 단백질과 결합된 것을 의미한다.

NMA0939 또는 NMA0939 코딩 유전자를 포함하는 약학적 성분을 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 사용함을 통한 수막구균성 질환의 검출 또한 본 발명의 일부이다.

도 1. 단백질 NMA0939의 클로닝 및 발현에 사용되는 클로닝 벡터 pM238.

도 2. pM238 벡터에서 유전자 NMA0939 의 누클레오티드 서열의 최종 구성.

도 3. 세포성 분열로부터 수득된 분획의 SDS-PAGE 분석: 1 레인, 총 세포; 2 레인, 분열 후 세포 펠렛; 3 레인, 분열 후 상청액; PM: 분자량 마커.

도 4. 분열 펠렛으로부터 시작된 재조합 단백질 NMA0939의 정제 과정 및 용해화 과정의 다른 분획의 SDS-PAGE 분석: 1 레인, 탄산염-중탄산염 완충용액 내의 2M 요소와 용해화한 후의 펠렛; 2 레인, 용해화의 상청액; 3 레인, 정제 매트릭스 로부터 나타난 결합되지 않은 분획; 3 레인, 다른 용출 피크에서 매트릭스로부터 방출된 저분자량 오염물; 5 레인, 정제된 단백질. PM: 분자량 마커.

도 5. 복강내 경로에 의한 프로인트 아쥬반트(프로인트), 수산화알루미늄(Alum) 또는 N. 메닝기티디스 C 다당류로 보조화된 동일한 항원으로 마우스를 면역화시킨 후 수득한 재조합 단백질 NMA0939에 대한 항체 수준(IgG). ELISA 결과는 면역전 혈청의 수치를 두 배로 하는 가장 높은 희석의 역수로서 나타내어진다.

도 6. N. 메닝기티디스, 균주 CU385, 복강내 경로에 의한 프로인트 아쥬반트(프로인트), 수산화알루미늄(Alum) 또는 N. 메닝기티디스 C 다당류로 보조화된 동일한 항원으로 마우스를 면역화시킨 후 수득한 마우스 혈청을 사용한 N. 메닝기티디스, 균주 CU385, OMVs에서 존재하는 항원 결정기의 인식. 결과는 면역전 혈청의 수치를 두 배로 하는 가장 높은 희석의 역수로서 나타내어진다.

도 7a 및 7b. BLAST 프로그램을 사용한 NMA0939 단백질 ("query") 및 N. 메닝기티디스("Sbjct")의 다른 혈청군으로부터의 게놈에서의 주석달린 서열 사이의 상동성 검색 결과.

도 8. 복강내 경로에 의한 N. 메닝기티디스 C 다당류로 보조화된 재조합 항원에 대해 유도된 혈청에 의한, N. 메닝기티디스의 5개의 다른 균주에서의 NMA0939 단백질의 인식. 다른 아쥬반트로 유도된 혈청도 유사한 프로필을 갖는다. 결과는 면역전 혈청의 수치를 두 배로 하는 가장 높은 희석의 역수로서 나타내어진다.

도 9a 및 9b. 프로인트 아쥬반트(프로인트), 수산화알루미늄(Alum) 또는 N. 메닝기티디스 C 다당류(PsC)로 보조화된 재조합 항원에 대해 유도된 혈청을 사용한 유아 랫 모델에서의 수막구균성 감염 수동 보호 실험. A: CU385 균주로의 감염, 및 B: 균주 233로의 감염 (C: 2a: P1.5). C-: 비처리 동물의 풀, C+: 실험에 따른 CU385 또는 233 중 하나의 외부 막 수포에 대한 과면역 마우스 혈청. 기호 * 는 음성 대조(C-)에 대한 통계학적 유의차를 나타낸다. 박테리아의 수준에 대하여 이들은 mL 당 콜로니 형성 유닛(cfu/mL)로서 나타낸다.

도 10: 단백질 NMA0939 및 mAbs (mAbs H10/67, 3H3/24 y 7D6/18)에 의해 생성된 비-관련 항원의 패널의 인식. P1, 클래스 1 단백질 네이세리아 메닝기티디스 균주 B:4:P1.15; P64k, 네이세리아 메닝기티디스로부터의 피루브산염 탈수소효소의 E3 서브유닛; T.T, 파상풍 독소; HBsAg, B형 간염 표면 항원. 이러한 결과를 ELISA-유형 검정에서 흡광도 수치(492 nm)로 나타냈다.

도 11. 수막구균성 질환의 생존자로부터의 인간 회복기 혈청에 의한 NMA0939 단백질의 인식. 음성 대조로서 건강한 기증자의 혈청을 사용하였다. 결과를 ELISA-유형 검정에서 흡광도 수치(492 nm)로 나타냈다.

도 12. 유리 펩티드(JY1), 재조합 단백질(NMA0939) 또는 접합체 JY1- NMA0939 중 하나로 면역화시킨 동물의 혈청으로부터의 JY1 항-펩티드 역가.

도 13. 재조합체 NMA0939 N. 메닝기티디스 C 다당류(NMA0939+PsC) 또는 리포솜 내로 삽입된 단백질(NMA0939_Lip)로 비강내 면역화시킨 마우스로부터의 폐 세척 시료에서 재조합체 NMA0939에 대한 항체 수준(IgA).

실시예 1. 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스 외부 막 소포 제형에서 NMA0939 단백질의 검출

혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스(균주 B:4:P1.19,15) 외부막 소포에서 존재하는 단백질을 연구하기 위한 목적으로, 이차원 전자현미경을 다른 경우에 기재된 방법(Gorg A, et al. 1985. Electrophoresis 6:599-604)에 따라 사용하였다. 그 후에 효소 절단을 티로신(Promega, Madison, WI, U.S.)을 사용하여 겔 추출 단백질에 실시하였다. 효소 절단 후 생성된 펩티드를 마이크로 컬럼(ZipTips, Millipore, MA, U.S.)을 사용하여 용액내로 추출시켰다. 질량 분광법 분석에서 펩티드를 아세토니트릴 60% 및 포름산 1%의 사용하여 마이크로 컬럼으로부터 용출시킨 후 나노팁 (Protana, Denmark) 내로 바로 적용시켰다.

이온화 소스(nanoESI)가 장착된, 사중극자(quadrupole ) 및 비행 시간(time of flight)을 갖는 혼성 질량 분광기(QTof-2^TM, Manchester, United Kingdom)에서 측정을 실시하였다. 질량 분광기 데이터를 0.98초에서 400-2000의 w/z 범위로 및 스캐닝 사이에서 0.02초를 사용하여 수득하였다. 데이터 획득 및 데이터 프로세싱을 MassLynx program (버전 3.5, Micromass)을 사용하여 실행하였다.

질량 스펙트럼 데이터에 기초한 단백질 확인을 ProFound 프로그램(Zhang W and Chait BT. 2000. ProFound : an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information . Anal Chem 72:2482-2489. http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)을 사용하여 실행하였다. 검색은 교전하게될 가능한 변이로서 메티오닌의 산화, 아미드분해 및 시스테인의 카르복시 아미도메틸화를 고려하여, SwissProt 데이타베이스(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) 및 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 포함된 유전자 및 유도된 단백질 서열에 따른다.

질량 스펙트럼에 기초한 단백질의 확인은 MASCOT 프로그램(Perkins DN, et al. 1999. Probability - based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data . Electrophoresis 20:3551-3567. http://www.matrixscience.com/)으로 실행하였다. 검색 파라미터는 산화 및 아미드분해 뿐만 아니라 시스테인 변이를 포함한다.

외부 막 소포의 제형에 존재하는 단백질의 확인으로부터 수득된 결과의 분석으로부터 시작하여 펩티드 그룹을 추가 서열결정을 위해 선택하였다.

하나의 펩티드로부터 수득된 서열 데이타로부터, 혈청군 B에서 NMA0930 단백질 상동체의 존재를 미리 공개된 게놈에서 예상되거나 확인되지 않은 것으로 확인하였다. NMA0939에 대한 이러한 혈청군 B 단백질을 전체 문헌내에서 NMA0939로 명명하였다.

실시예 2. 데이터베이스에서 보고된 유전자 산물과 NMA0939 단백질의 상동성 -기저 분석.

NMA0939 단백질의 확인에서, 서열 상동성 검색을 BLAST 프로그램(Altschul SF, et al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 사용하여 NCBI 데이터베이스에서 실시하였다. 이 과정으로 N. 고노르호에 상동체 및 혈청군 A N. 메닝기티디스 유전자를 확 인할 수 있었으며, 이 경우에서 MC58 혈청군 B에 대해서는 같지 않았다. 그러나, NMA0939 DNA 코딩 서열인 nma0939을 사용한 실행된 검색은 MC58 보고된 게놈에서 이러한 유전자의 존재를 확인하도록 하므로 이 게놈의 주석에서의 오류를 지적한다. 검출된 혈청군 B 유전자 또한 N. 고노르호에 (NGO0306) nma0939-상동체에 상동성을 갖는다. 혈청군 B에서, 이 연구에서 검출된 보고된 유전자가 위치 761673 및 762295 사이의 DNA 영역, 다운스트림 nmb0729 유전자 및 업스트림 nmb0730 유전자에서 위치한다. 그러므로, 이는 현재까지 혈청군 B 수막구균에서 NMA0939 단백질 상동체의 존재에 대한 최초 보고이다. 다른 미생물에서 상동체 단백질이 성공적으로 검출되지 않아 NMA0939이 네이세리아-특이 항원임을 나타내었다.

실시예 3. E. coli 에서 N. 메닝기티디스로부터의 NMA0939 단백질을 코드하는 , nma0939 유전자의 클로닝 및 발현.

NMA0939 유전자를 클로닝하고 발현시키기, pM-100 클로닝 벡터를 사용하였다. 이 벡터는 다른 제한 효소를 사용하여 실행될 클로닝 및 E. coli에서 봉입체의 형태로 이질성 단백질의 고발현 수준의 생성을 가능하게 한다.

pM-100 벡터(Figure 1)는 다음 요소를 갖는다: 트립토판 프로모터, N. 메닝기티디스 균주 B:4:P1.19,15의 P64kDa의 Nt-단편으로부터의 47개 아미노산 안정화 서열을 코드하는 유전자, 박테리오파지 T4 전사 말단자의 서열 및 선별자 마커로서 암피실린에 내성을 부여한 유전자의 서열. 이 클로닝 벡터 또한 베타-갈락토시다제 lacZ 알파 서브유닛의 존재에 기인한, 형질전환된 콜로니의 청색/백색 염색에 의한 재조합체 선별을 가능하게 한다.

유전자 누클레오티드 서열을 코드하는 NMA0939(실시예 1)로부터 올리고누클레오티드 프라이머 쌍(704467U 및 704467L)을 균주 CU385 (B:4:P1.19,15) 게놈 DNA로부터의, 시그널 펩티드 코딩 영역을 피하는, 상기 유전자 세그먼트의 증폭을 위해 설계하였다.

시그널 펩티드의 예상을 위해 SignalP 월드 와이드 웹 서버(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0)를 사용하였다.

프라이머 7740 및 7741을 사용한 NMA0939-코딩 유전자의 PCR 증폭 후에(Saiki R K, et al . (1988). S Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491), PCR 산물을 Bgl-II 및 Bam-HI 제한 효소를 사용하여 절단하고, 미리 절단한 pM238 클로닝 벡터 내로 클로닝시켰다. 최종 구성은 도 2에 보여지며, NMA0939 단백질이 P64 kDa 단백질의 Nt-세그먼트로의 융합 단백질로서 발현된다. 클로닝된 유전자 nma0939 의 서열결정을 ALFexpress II 자동 서열결정기(Termo Sequenase^TM Cy^TM 5 Dye Terminador Kit, Amersham Biosciences) 및 각각 P64 안정화제 및 T4 전사 종결기의 서열에 결합하는 올리고누클레오티드 1573 (Seq. ID. No. 8) 및 6795 (Seq. ID. No. 9)를 사용하여 실행하였다. 본원에서 생성된 플라스미드를 나중에 사용하기 위해 pM-NMA0939로 설계하였다.

NMA0939 유전자의 발현을 위해 GC366 E. coli 균주를 pM-NMA0939 플라스미드(Figure 2)를 갖는 화학적 방법을 통해 변환시켰다. 실험의 발현을 1% 글리세롤, 1% 가수분해된 카제인, 0.1 mM MgSO₄ 및50ug/mL 암피실린을 보충한 최소 배지(M9) (Miller JH. 1972. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NEW York, USA)에서 실행하였다. 박테리아 배양물을 37 ℃ 및 250 rpm에서 12시간 동안 항온하였다. 성장한 배양물을 원심분리하고 세포 펠렛의 초음파 분쇄를 실행하였다(IKA LABORTECHNIK). 펠렛 및 상청액으로부터의 분획들을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250을 갖는 균주가 첨가된 SDS-PAGE (Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 . Nature 277:680)로 분석하였다. 발현 백분율을 겔 밀도계(LKB Bromma 2202 Ultrascan laser densitometer; Amersham Pharmacia Biotech, United Kingdom)로 결정하였다. NMA0939 단백질을 펠렛 분획으로부터 이 분획의 총 단백질 함량의 약 20%로 수득하였다(도 3). 세포 펠렛 시료를 다른 몰 농도(2M, 4M, 6M 및 8M)의 요소를 포함하는 탄산염-중탄산염 완충용액(탄산나트륨 0.1M, 수소-탄산 나트륨 0.1M) 내에 용해시켰다. 2M 요소를 갖는 이전 완충용액이 사용됐을 때, NMA0939 단백질이 용해되었다. 용해시킨 후 상청액을 대상 단백질의 정제를 위해 금속 친화성 크로마토그래피를 통해 통과시켰다. 결과로서 80%의 순도를 갖는 시료가 도 4에 나타난 바와 같이 수득됐다. 투석의 마지막 단계를 연구실 동물에서 이의 평가 전에 실행하였다.

실시예 4. 복강내 경로에 의한 NMA0939 단백질로의 면역화 후에 유도되는 면역 반응의 평가.

단백질 NMA0939의 면역원성을 평가하기 위해, NMA0939 단백질을 수산화알루미늄, 프로인트 아쥬반트 또는 N. 메닝기티디스 C 다당류로 보조화하여 투여하는 면역화 실험을 설계하고 마우스에서 구성하였다.

이러한 제형으로, 암컷 Balb/C 마우스(8-10 주령)를 8마리 마우스의 4군으로 각각 나누어 면역화시켰다. 세 면역화를 복강내 경로로 중간에 7일 간격으로 적용시켰다. 대조군을 사용하고 결과적으로 PBS로 면역화시켰으나 실험의 다른 군과 같이, 수산화알루미늄으로 보조화된 추가자극 투여량을 45일에 투여하였다. 표 1은 군의 조성을 나타낸다:

박테리아에 존재하는 재조합 단백질 및 상동성 단백질에 대한 항체 역가(IgG)를 추가자극 투여 후에 수득한 혈청 시료에서 ELISA로 측정하였다. 도 5에서, 개별 동물의 재조합 단백질에 대한 항체 역가를 나타낸다. 특이 항체 수준을 이차 접종 후에 검출하였으나(데이터는 나타내지 않음) 이들은 지난 접종 후에 더 높았다. 게다가, 웨스턴 블롯팅에 의한 면역확인을 실생하였으며 대표적인 단백질 밴드가 인식되었다(데이터는 나타내지 않음). 복강내 경로에 의해 면역화된 군은 비강내 경로에 의해 면역화된 군보다 상당히 더 높다.

재조합 단백질로 면역화된 후에 수득한 혈청은 균주 CU385의 외부 막 단백질(outer membrane protein; OMP)의 제형에 존재하는 천연 단백질을 인식한다. 이러한 결과는 도 6에 나타나 있다.

결과의 통계학적 분석에서, 항체 역가의 로그 형질전환을 변화의 일반 분배 및 이의 상동성을 갖기 위해 실행하였다. 일반적으로, 군 평균 중 보고된 차이의 통계학적 의미는 단순 ANOVA 및 뒤이은 뉴만 칼스(Neuman Keuls)의 다중 랭크 실험을 통해 실행된 것이다.

실시예 5. N. 메닝기티디스 및 네이세리아 고노르호에의 다른 균주에서의 단백질 NMA0939 를 코드하는 유전자 서열의 특성화.

네이세리아 속의 병원체 종에서 NMA0939 단백질을 코드하는 유전자의 서열의 보존을 분석하기 위해, NCBI 데이터베이스에서 주석이 달린 네이세리아 메닝기티디스(혈청군 A, B 및 C) 및 네이세리아 고노르호에의 게놈과의 유사성 검색을 BLAST 프로그램(Altschul SF, et al. 1990. Basic local alignment search tool . J Mol Biol 215:403-410. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 사용하여 실행하였다(NC _003116.1, NC _003112.1, NC _003221, NC _002946). 도 7은 분석된 게놈의 각 의미있는 정렬을 생성하는 이러한 서열에 대한 서열 비교 결과를 보인다. 이러한 서열들은 NMA0939 단백질(Seq. ID. No. 3)을 코드하는 유전자에 대해 수득된 서열과 혈청군 B에서 99%의 동일성을 가지며, 혈청군 A에서는 100% 동일성 및 네이세리아 고노르호에와는 96% 동일성을 갖는다. 게다가, 언급된 유전자의 서열을 혈청군 B (B:4:P1.19,15)에 속하며 서열 정렬이 ClustalX 프로그램(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)을 사용하여 실행되는, 3개 쿠바 분리체(Seq ID. No. 5-7)에 대하여 결정하였다. 정렬의 결과는 분석된 균주 중에서 및 일반적으로 네이세리아 종류에서 유전자 NMA0939의 누클레오티드 서열에서의 우수한 보존이 있음을 보여준다.

이전에 언급된 서열 중에서 존재하는 유사성의 높은 정도를 고려하여, 백신 후보제로서 단백질 NMA0939의 사용은 수막구균성 질환에 대한 광범위한 보호(교차 반응에 기인함)를 나타내는 효과적인 면역 반응의 생성을 허용할 것이다.

실시예 6. 단백질 NMA0939 로의 Balb /C 마우스의 면역화에 의해 유도되는 광범위 작용을 갖는 면역 반응의 특성화.

단백질 NMA0939로의 면역화가 네이세리아의 다른 균주와 광범위하게 교차-반응하는 반응을 유도하였는지를 평가하기 위해, ELISA를 실행하였다. 폴리스티렌 플레이트를 다른 혈청형 및 혈청아형엥 속하는 네이세리아의 7개 균주의 총 세포로 코팅하였다. 플레이트를 실시예 4에 기재된 바와 같이 두 경로의 면역화에 의해 단백질 NMA0939에 대해 수득된 풀과 항온하였다.

도 8은 C 다당류로 보조화된 재조합 NMA0939로 면역화한 후에 나타난 혈청에 의한 N. 메닝기티디스로부터의 혈청군 A, B 및 C로부터의 균주에서 존재하는 항원의 인식을 나탄내다. 관찰된 바와 같이, 면역 혈청은 균주 CU385에서 발견된 것과 유사한 수준으로 다른 균주에서 존재하는 단백질을 인식한다. 나머지 혈청은 이 검정에서 필적할만한 습성을 갖는다.

실시예 7. 유아 랫 모델에서, 상동성 및 이종성 균주에 대한, 단백질 NMA0939에 특이적인 마우스 혈청에 의해 유도된 단백질.

수득된 항-혈청의 기능적 활성을 결정하기 위해, 보호 검정을 수막구균 감염에 대한 유아 랫 모델에서 실시하였다. 24마리 랫(5-6 일령)을 6마리 랫으로 각각 나누었다.

혈청을 복강내 경로로 투여하였다면 한 시간 후에 같은 경로로 접종된 박테리아(균주 CU385)에 의해 야기되는 감염으로부터 랫을 보호함이 측정되었다. 각 군의 혈청을 풀링하고 이들을 유아 랫에 접종시키기 전에 1/10으로 희석(멸균 PBS 내에)시켰다. 4시간 후에, 동물들에게 시료를 채취하고 이들의 혈액내 생존가능한 박테리아를 계수하였다.

결과를 해석하기 위해 각 그룹을 음성 대조군(비-처리 동물로부터의 풀)과 비교하는 단일 테일 스튜던트 t 테스트(single tail student t test)를 실시하였다. 도 9a에서 관찰된 바와 같이C 다당류로 보조화된 NMA0939로 면역화된 마우스로부터의 혈청을 투여받은 군은 음성 대조군과 비교시 통계학적 유의차를 보이므로 항체 역가는 유아 랫 모델에서 보호적이다. 수산화알루미늄으로 보조화된 단백질로 면역화한 후 생성된 항체 반응 또한 이 동물 모델에서 보호적이다(데이터를 나타내지 않음).

유사한 검정을 균주 233(C:2a:P1.5)로 유아 랫을 감염시켜 실행하였으며 이전 실험에서와 같이 수산화알루미늄이니 C 다당류 중 하나로 보조화된 표적 NMS0939 단백질로 유도된 항체가 수막구균 감염에 대해 랫을 보호할 수 있음을 발견하고 그 결과를 도 9b에 나타냈다.

유사 검정을 혈청학적 분류가 균주 B385에 상동성이 있는, 쿠바 환자로부터 분리한 균주 H44/48 및 120/90으로 유아 랫을 감염시켜 실행하였다. 게다가, 항원투여 실험을 혈청군B의 균주 H44/76 (B:15:P1.7,16)로 실행하였다. 모든 경우에서, 수산화알루미늄 또는 C 다당류 중 하나로 보조화된 표적 NMA0939 단백질로 유도된 항체를 포함하는 항혈청은 수막구균 감염에 대해 랫을 보호할 수 있다.

실시예 8. 네이세리아 메닝기티디스에 대한 살균 활성을 매개할 수 있는 단백질 NMA0939 에 대한 모노클로날 항체의 생성

단백질 NMA0939에 대해 특이적인 모노클로날 항체(mAbs)를 생성하기 위해 그리고 N. 메닝기티디스의 상동성 및 이종성 균주에 대한 살균 활성의 기능적 능력을 연구하기 위해, 면역 스케줄을 80% 순도를 갖는 단백질 NMA0939(실시예 3)의 제제로 실시하였다. 면역화를 Balb/C (H-2^d , 암컷, 5-6 주령)에서 실행하고 4회 투여량을 다음과 같이 적용하였다: 0, 15 및 30일의 면역화 경로, 마우스 당 10 mg의 항원 NMA0939(총 부피 100 ml), 프로인트 아쥬반트로 에멀젼화하여 피하 경로로 투여함; 50일, 인산염 완충 식염수(140 mM NaCl, 270 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 6.5 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O, pH 7.2) 내에서 마우스 당 10 μg의 항원을 복강내 경로로 투여함. 혈액 추출물을 0일 및 45일에 수득하였다.

코팅 항원으로서 단백질 NMA0939(실시예 3)을 사용하는 간접 ELISA에 의해 측정된, 가장 높은 역가를 갖는 동물로부터의 비장세포를 X63 Ag8 653 마우스 골수종 세포와 융합하였다. 결과적으로 생성된 혼성세포를 표준 방법에 따라 분리하고 스크리닝하였다(Gavilondo JV. 1995. Anticuerpos Monoclonales: Teoria y Practica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba).

단백질 NMA0939으로 향하는 혼성세포에 의해 분비되는 항체의 반응성 뿐만 아니라 비관련 항원과의 교차-반응성을 5 ㎍/ml 의 각 항원 및 같은 농도의 검정할 각 mAb를 사용하여 간접 ELISA로 시험하였다. 도 10은 단백질 NMA0939를 특이적으로 인식하며P64k의 N-말단에 상응하는 아미노산 서열 및 검정될 비-관련 항원의 나머지와도 작용하지 않는 전부 2개의 양성 클론 mAbs H10/67, 3H3/24 and 7D6/18)을 수득한 결과를 나타낸 것이다.

네이세리아 메닝기티디스의 상동성 및 이종성 균주에 대한 살균 반응을 매개하는 단백질 NMA0939에 대해 생성된 mAb의 능력을 결정하기 위해 살균 실험을 실시하였다. 살균 항체 역가를 50% 또는 그 이상의 박테리아를 죽일 수 있는 시험 항체의 가장 높은 희석의 역수로서 표현했다; 두 mAbs (3H3/24 y 7D6/18)는 상동성 균주 B:4:P1.19,15에 대해 1:128 이상의 살균 역가를 이루었으며 한 mAb(H10/67)는 1:80 이상의 역가를 이루었다. 이들은 또한 이종성 균주 B:15:P1.7,16 및 C:2a:P1.5 각각에 대해 1:64 이상의 역가를 보인다.

실시예 9. 단백질 NMA0939 에 대한 마우스 면역 반응의 표적 영역의 특성화

재조합 항체에 대해 생성된 마우스 항-혈청에 의해 좀더 자주 인식되는, 단백질내 영역을 확인하기 위해 SPOTScan 검정을 실시하였다. 단백질의 서열을 파악하는 오버랩핑 펩티드 세트를 1:100으로 희석된 풀링 혈청과 함께 항온한 셀룰로스 막 상에서 합성하였다. 항원-항체 반응을 접합체 항-마우스 면역글로불린 G-알칼리성 포스파타제와 항온한 후 기질 브로모-클로로-인돌일-인산염을 포함하는 용액을 첨가하여 검출하였다.

면역화에 사용되는 제제라고 해도 단백질 내에서 일반적인 여러 항원성 영역이 관찰되었다. 그러나, 프로인트 아쥬반트로 보조화된 단백질로 면역화시킨 군에서 더 넓은 패턴의 인식이 존재한다.

실시예 10. 인간 혈청에 의한 NMA0939 단백질의 인식.

회복기 개체로부터 수득한 인간 혈청의 수집물을 ELISA에 의해 실행되는 이 연구에 사용하였다. 플레이트를 예비 전기영동에 의해 수득된(5 ㎍/ml) 단백질 NMA0939로 코팅하였다. 트윈-20을 포함하는 PBS 내의 3% 탈지유 분말로 플레이트를 차단한 후, 혈청을 동일한 용액 내에서 희석하고(1:50) 플레이트에서 항온하였다. 면역검정을 널리 보고된 바와 같이 지속하였다. 건강한 기증자의 혈청을 음성 대조로서 사용하였다. 게다가, B형 간염에 대한 재조합 백신으로 백신화된 개체로부터의 풀링한 혈청을 비-관련 대조로 사용하였다(데이터를 나타내지 않음).

도 11은 이 검정에서 5개의 회복기 환자의 혈청에서 수득된 결과를 나타낸다. 이는 인간 혈청이 단백질을 인식함을 보여줄 수 있으며, 이는 수막구균 감염 동안에 발현되고 면역원성이 있음을 나타낸다.

실시예 11. 펩티드에 대한 담체로서 단백질 NMA0939 .

재조합 단백질 NMA0939의 담체 능력을 측정하기 위해, HIV-1로부터의 단백질 gp120의 V3 영역으로부터 유래된 15개 합성 펩티드, 분리체 JY1에 접합시켰다. 접합은 글루타르알데히드 방법으로 실시하였다. 유리 JY1 펩티드, 재조합 단백질 NMA0939 및 접합체 JY1-NMA0939를 프로인트 아쥬반트로 면역원을 에멀젼화한 3-투여량 스케줄로 성인 마우스에 투여하였다. 3차 투여 후 2주째에 혈청 시료를 면역화된 동물로부터 수득하고 시료를 항-펩티드 항체 역가를 측정하기 위해 ELISA로 분석하였다. 이를 위해, 플레이트를 유리 펩티드(20㎍/ml)로 코팅하고 면역검정을 상기 기술된 바와 같이 지속하였다. 실험 결과(도 12)는 이들의 접합 후에 JY1에 대한 항체 반응을 상당히 증가시킬 수 있는 단백질 NMA0939의 담체 능력을 보인다.

실시예 12. 점막 경로에 의한 NMA0939 단백질로의 면역화 후에 유도된 면역 반응의 평가.

단백질 NMA0939의 면역원성을 평가하기 위해, 면역화 실험을 설계하고 마우스에서 실행하였으며 여기에서 NMA0939 단백질을 리포솜 내로 캡슐화시키거나 N. 메닝기티디스 C 다당류로 보조화하여 투여하였다. 리포솜을 이미 기술된 바와 같이 탈수-재수화에 의해 수득하였다(Carmenate T, et al. (2001). Recombinant Opc protein from Neisseria meningitidis reconstituted into liposomes elicits opsonic antibodies following immunization. Biotechnol . Appl . Biochem. 34: 63-69). 이러한 두 제제로, 암컷 Balb/C 마우스(8-10 주령)를 면역화시켰다. 비강내 경로를 통한 50 ㎍의 세 투여량을 중간에 15일 간격으로 적용시켰다. 점막 수준에서 면역 반응을 분석하기 위해, IgA 항체 수준을 면역화 동물의 폐 세척액에서 측정하였다. 도 13에서 검출된 IgA 항체 수준을 평가된 두 군에 대하여 나타냈다.

SEQUENCE LIST <110> Center for Genetic Engineering and Biotechnology <120> Pharmaceutical formulations containing NMA0939 protein <130> Pharmaceutical formulations containing NMA0939 protein <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: Oligo 704467U <400> 1 gtggtatcta gatctgccag ccagaaactc 30 <210> 2 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description:Oligo 704467L <400> 2 caacccggga tccttccttg tccaaatc 28 <210> 3 <211> 348 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 3 atgccagcca gaaactcaaa agcatggtgg aacactacta tgacaaacaa cgttgatttg 60 aaggttcccg caaaacgcta tttcacgctg gacgagttgt gcggactgtt gcaaatcagc 120 ccctatggtt ttgcgcaatg gcagcatgat tatggtgtgg ttgtcggtta cggcggcgaa 180 cgctacaccc gtttggatgt ggtgaaactg ttgaaattgc agagcacgtt tgcaccgtat 240 gcagaaggtg cggagtcggg ttcggacggc aaccgtccgg ttacgcttca ggaaatcgga 300 gacggtctga aagagctgtt ggcggatttg gataaggaat tgtgctga 348 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 4 Met Pro Ala Arg Asn Ser Lys Ala Trp Trp Asn Thr Thr Met Thr Asn 1 5 10 15 Asn Val Asp Leu Lys Val Pro Ala Lys Arg Tyr Phe Thr Leu Asp Glu 20 25 30 Leu Cys Gly Leu Leu Gln Ile Ser Pro Tyr Gly Phe Ala Gln Trp Gln 35 40 45 His Asp Tyr Gly Val Val Val Gly Tyr Gly Gly Glu Arg Tyr Thr Arg 50 55 60 Leu Asp Val Val Lys Leu Leu Lys Leu Gln Ser Thr Phe Ala Pro Tyr 65 70 75 80 Ala Glu Gly Ala Glu Ser Gly Ser Asp Gly Asn Arg Pro Val Thr Leu 85 90 95 Gln Glu Ile Gly Asp Gly Leu Lys Glu Leu Leu Ala Asp Leu Asp Lys 100 105 110 Glu Leu Cys 115 <210> 5 <211> 348 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 5 atgccagcca gaaactcaaa agcatggtgg aacactacta tgacaaacaa cgttgatttg 60 aaggttcccg caaaacgcta tttcacgctg gacgagttgt gcggactgtt gcaaatcagc 120 ccctatggtt ttgcgcaatg gcagcatgat tatggtgtgg ttgtcggtta cggcggcgaa 180 cgctacaccc gtttggatgt ggtgaaactg ttgaaattgc agagcacgtt tgcaccgtat 240 gcagaaggtg cggagtcggg ttcggacggc aaccgtccgg ttacgcttca ggaaatcgga 300 gacggtctga aagagctgtt ggcggatttg gataaggaat tgtgctga 348 <210> 6 <211> 348 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 6 atgccagcca gaaactcaaa agcatggtgg aacactacta tgacaaacaa cgttgatttg 60 aaggttcccg caaaacgcta tttcacgctg gacgagttgt gcggactgtt gcaaatcagc 120 ccctatggtt ttgcgcaatg gcagcatgat tatggtgtgg ttgtcggtta cggcggcgaa 180 cgctacaccc gtttggatgt ggtgaaactg ttgaaattgc agagcacgtt tgcaccgtat 240 gcagaaggtg cggagtcggg ttcggacggc aaccgtccgg ttacgcttca ggaaatcgga 300 gacggtctga aagagctgtt ggcggatttg gataaggaat tgtgctga 348 <210> 7 <211> 348 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 7 atgccagcca gaaactcaaa agcatggtgg aacactacta tgacaaacaa cgttgatttg 60 aaggttcccg caaaacgcta tttcacgctg gacgagttgt gcggactgtt gcaaatcagc 120 ccctatggtt ttgcgcaatg gcagcatgat tatggtgtgg ttgtcggtta cggcggcgaa 180 cgctacaccc gtttggatgt ggtgaaactg ttgaaattgc agagcacgtt tgcaccgtat 240 gcagaaggtg cggagtcggg ttcggacggc aaccgtccgg ttacgcttca ggaaatcgga 300 gacggtctga aagagctgtt ggcggatttg gataaggaat tgtgctga 348 <210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description:Oligo 1573 <400> 8 ttccatggta gataaaagaa tggctttag 29 <210> 9 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description:Oligo 6795 <400> 9 aactgcaggc ttgtaaaccg ttttgtg 27

Claims (13)

1. Seq. ID. No 4로서 확인되는 단백질 NMA0939를 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
2. 제1항에 있어서, 네이세리아 속으로부터 야기되는 감염에 대한 보호 반응을 투여받은 유기체에 생성시킬 수 있는 백신임을 특징으로 하는 약학적 제형.
3. 제1항에 있어서, 네이세리아 메닝기티디스 또는 네이세리아 고노르호에에 의해 야기되는 감염에 대한 보호 반응을 투여받은 유기체에 생성시킬 수 있는 백신임을 특징으로 하는 약학적 제형.
4. 제1항에 있어서, 재조합, 합성 또는 천연 수단에 의해 수득되는 다른 성질의 하나 또는 여러 항원을 첨가함을 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
5. 제4항에 있어서, 박테리아 다당류를 포함하는 다당류 항원을 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
6. 제5항에 있어서, 네이세리아 메닝기티디스 캡슐화 다당류를 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
7. 제4항에 있어서, 다당류 성분이 박테리아 다당류인 단백질-다당류 접합체를 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
8. 제4항에 있어서, 펩티드 항원을 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
9. 제1항에 있어서, 비경구 또는 점막 경로로 투여함을 특징으로 하는 약학적 제형.
10. 제1항에 있어서, 다른 성질의 항원에 대한 아쥬반트 또는 항체로서 NMA0939 단백질을 사용함을 특징으로 하는 약학적 제형.
11. NMA0939 단백질 항원의 펩티드 단편 또는 유사 펩티드를 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
12. 인간의 수막구균성 질환의 검출을 위해 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 사용되는, Seq. ID. No 4로서 확인되는 NMA0939 단백질을 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.
13. 인간의 수막구균성 질환의 검출을 위해 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 사용되는, Seq. ID. No 3로서 확인되는, NMA0939 코딩 유전자를 포함함을 특징으로 하는 약학적 제형.

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