JP2008259503A - 機能活性抗体を誘発する髄膜炎菌性bエピトープの分子模倣物 - Google Patents
機能活性抗体を誘発する髄膜炎菌性bエピトープの分子模倣物 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】N.meningitidis血清型B(MenB)P1.2血清亜型のPorAのループ4に対する表面に露出したエピトープの分子模倣物。この模倣物に対して産生される抗体。アミノ酸配列QTPを含むGNA33ペプチドであって、このペプチドが、N.meningitidis血清型B細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および/またはオプソニン活性を示す抗体の産生を誘発し得る。このような分子模倣物またはこれに対する抗体を含有する組成物は、MenB疾患を予防するため、およびMenB感染の診断のために使用され得る。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般的には、細菌性病原体に関する。特に、本発明は、Neisseria
meningitidis血清型B(MenB)P1.2血清亜型のPorAのループ4に対する表面に露出したエピトープの分子模倣物およびこの模倣物に対して産生される抗体に関する。
Neisseria meningitidisは、細菌性の髄膜炎および敗血症の原因物質である。髄膜炎菌は、莢膜抗原および細胞壁抗原の免疫学的特徴に基づいて血清学的な群に分類される。現在認識されている血清型は、A、B、C、W−135、X、Y、Zおよび29Eを含む。血清型特異性の原因である多糖類は、これらの群のいくつかから精製され、A、B、C、W−135およびYが挙げられる。
5:1207。この結合体によって誘発される防御性抗体と反応する、細菌性表面エピトープの同一性は、未知のままである。さらに、このワクチンによって誘発される抗体の部分集合は、宿主のポリシアル酸と自己反応性を有するので(Granoffら、(1998)J.Immunol.160:5028)、ヒトにおけるこのワクチンの安全性は、不確かなままである。
本発明は、GNA33が、P1.2血清型亜型を有する株のPorAのループ4において、表面に露出したエピトープを模倣することによってMenBに対する保護抗体を誘発するという、思いがけない発見に基づく。このような抗体の機能活性は、本明細書中に記載されるように、ヒトにおける髄膜炎菌性疾患に対して保護する分子因子の能力を予測する
インビトロおよびインビボでの機能アッセイを用いることによって評価されている。
(a)MenBのエピトープの推定分子模倣物を含む分子集団を提供する工程;
(b)存在する場合、複合体を提供するために、抗体および分子模倣物の間の免疫学的結合を可能にする条件下で、この分子集団を、本明細書中に記載される抗体と接触させる工程;および
(c)非結合分子から複合体を分離する工程。
(a)生物学的サンプルを提供する工程;
(b)Neisseria meningitidis血清型B抗体を、上記生物学的サンプル中に存在する場合、GNA33ポリペプチドに結合し得る条件下で、生物学的サンプルをGNA33ポリペプチドと反応させ、抗体/GNA33ポリペプチド複合体を形成する工程;および
(c)この複合体の存在または非存在を検出し、
これによって、サンプル中のNeisseria meningitidis血清型B抗体の存在または非存在を検出する工程。
(1)アミノ酸配列QTPを含むGNA33ペプチドであって、該ペプチドが、Neisseria meningitidis血清型B細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および/またはオプソニン活性を示す抗体の産生を誘発し得る、GNA33ペプチド。
(2)項目1に記載のGNA33ペプチドであって、該ペプチドが、FQTPV(配列番号2)、FQTPVHS(配列番号3)、AFQTPVHS(配列番号4)、QAFQTPVHS(配列番号5)、AQAFQTPVHS(配列番号6)、AQAFQTPVH(配列番号7)、AQAFQTPV(配列番号8)、QAFQTPVHSF(配列番号9)、AFQTPVHSFQ(配列番号10)、FQTPVHSFQA(配列番号11)、QTPVHSFQAK(配列番号12)、DVSAQAFQTP(配列番号12)、VSAQAFQTPV(配列番号13)およびSAQAFQTPVH(配列番号14)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、GNA33ペプチド。
(3)前記ペプチドが、アミノ酸配列FQTPV(配列番号2)を含む、項目2に記載のGNA33ペプチド。
(4)項目1〜3のいずれか1項に記載のGNA33ペプチド、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組成物。
(5)哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清型B細菌に対する免疫応答を誘発するための方法における、項目4に記載の組成物の使用。
(6)哺乳動物被験体においてNeisseria meningitidis血清型B細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該被験体に有効量の項目4に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
(7)項目1〜3のいずれか1項に記載のGNA33ペプチドに対して指向されるモノクローナル抗体であって、該抗体が、Neisseria meningitidis血清型B細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および/またはオプソニン活性を示す、モノクローナル抗体。
(8)項目7に記載のモノクローナル抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組成物。
(9)GNA33ポリペプチドに対する抗体を含む組成物であって、該抗体が、Neisseria meningitidis血清型B細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および/またはオプソニン活性を示す、組成物。
(10)前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目9に記載の組成物。
(11)哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清型B細菌に対する免疫応答を誘発するための方法における、項目8〜10のいずれか1項に記載の組成物の使用。
(12)哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清型B細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該被験体に有効量の項目8〜10のいずれか1項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
(13)
項目1〜3のいずれか1項に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
(14)組換えベクターであって、以下:
(a)項目13に記載のポリヌクレオチド;および
(b)該ポリヌクレオチドに作動可能に連結される、少なくとも1つの異種制御エレメント、
を含む、組換えベクターであって、該組換えベクターによって、該ポリヌクレオチドが、宿主細胞中で転写および翻訳され得、そして該制御エレメントの少なくとも1つが、該ポリヌクレオチドに対して異種である、組換えベクター。
(15)項目14に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
(16)GNA33ペプチドを産生するための方法であって、該方法が、タンパク質を産生するための条件下で、項目15に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
(17)Neisseria meningitidis血清型B細菌のエピトープの分子模倣物を単離するための方法であって、該方法が、以下:
(a)Neisseria meningitidis血清型B細菌のエピトープの推定上の分子模倣物を含む分子の集団を提供する工程;
(b)該分子の集団を抗GNA33抗体と接触させる工程であって、該抗体と該分子模倣物(存在する場合)との間の免疫学的結合を可能にして、複合体を提供する条件下で接触させる工程;および
(c)非結合分子から該複合体を分離する工程、
を包含する、方法。
(18)生物学的サンプル中でNeisseria meningitidis血清型B抗体を検出するための方法における、GNA33ポリペプチドの使用。
(19)生物学的サンプル中でNeisseria meningitidis血清型B抗体を検出するための方法における、項目1〜3のいずれか1項に記載のGNA33ペプチドの使用。
(20)生物学的サンプル中でNeisseria meningitidis血清型B抗体を検出するための方法であって、該方法が、以下:
(a)生物学的サンプルを提供する工程;
(b)該生物学的サンプルをGNA33ポリペプチドと反応させる工程であって、該生物学的サンプル中に存在する場合、Neisseria meningitidis血清型B抗体を、該GNA33ポリペプチドと結合させて、抗体/GNA33ポリペプチド複合体を形成する条件下で反応させる工程、および
(c)該複合体の存在または非存在を検出する工程であって、それによって、該サンプル中のNeisseria meningitidis血清型B抗体の存在または非存在を検出する工程、
を包含する、方法。
(21)生物学的サンプル中のNeisseria meningitidis血清型B抗体を検出するための方法であって、該方法が、以下:
(a)生物学的サンプルを提供する工程;
(b)該生物学的サンプルを項目1〜3に記載のいずれか1項に記載のGNA33ペプチドと反応させる工程であって、該生物学的サンプル中に存在する場合、Neisseria meningitidis血清型B抗体を、該GNA33ポリペプチドと結合さ
せて、抗体/GNA33ポリペプチド複合体を形成する条件下で反応させる工程;および
(c)該複合体の存在または非存在を検出する工程であって、それによって、該サンプル中のNeisseria meningitidis血清型B抗体の存在または非存在を検出する工程、
を包含する、方法。
本発明の実施は、他に示されなければ、免疫学、微生物学および分子生物学の慣習的な
技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989);SambrookおよびRussell、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2001);MorrisonおよびBoyd、Organic Chemistry(第3版、1973);CareyおよびSundberg、Advanced Organic Chemistry(第2版、1985);Smith,M.B.,Organic Synthesis(1994);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);およびHandbook of Experimental Immunology,第I巻−第IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1986,Blackwell Scientific Publications)を参照のこと。
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
aeruginosa(PAO1株);AF300471、Zymomonas mobilis;AAK85834、Agrobacterium tumefaciens;CAC41396、Sinorhizobium meliloti;AAK25702、Caulobacter crescentus;S76334、Synechocystis sp.(PCC 6803株);AAK03012、Pasteurella multocida;Q9KPQ4、Vibrio cholerae;AAB40463、AAC45723、P46885、Escherichia coli;P57531、Buchnera aphidicola(Acyrthosiphon pisum);NP143714、Pyrococcus horikoshiiを参照のこと。
ドの構造的特徴および機能的特徴を保持している));ピロリジン;ペプトイドおよびオリゴペプトイド(これらはN置換グリシン(例えば、Simonら、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9367により記載されるN置換グリシン)を含む分子である)ならびに抗体(抗イディオタイプ抗体を含む)が挙げられるが、これらに限定されない。分子模倣物を同定および産生するための方法が、以下により詳細に記載される。
Methods in Molecular Biology、Vol.66(Glenn E. Morris編、1996)Humana Press、Totowa、New Jerseyを参照のこと。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上に多数のペプチドを同時に合成し(これらのペプチドは、タンパク質分子の部分に対応する)そしてこれらのペプチドがなお、支持体に付着されている状態で、これらのペプチドと抗体とを反応させることによって決定される。そのような技術は、当該分野において公知であり、例えば、米国特許第4,708,871号;Geysenら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998−4002;Geysenら、(1986)Molec.Immunol.23:709−715(これらのすべては、その全体が本明細書中に参考として援用される)に記載される。同様に、コンフォメーショナルエピトープは、例えば、X線結晶学および二次元核磁気共鳴分光法により、アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することによって容易に同定される。例えば、
Epitope Mapping Protocols(前出)を参照のこと。例えば、Kyteら、J.Mol.Biol.(1982)157:105−132;ならびにHoppおよびWoods、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:3824−3828に記載されるように、20のアミノ酸の各々の疎水特性および親水特性を利用して、タンパク質のアミノ酸配列からヒドロパシー(hydropathy)スケールを公式化するコンピュータープログラムもまた用いられて、所定の分子の抗原性部分を決定し得る。例えば、HoppおよびWoodの技術は、各々のアミノ酸に複数の親水性値を割り当て、次いでペプチド鎖に沿って、反復的にこれらの値を平均する。局所的平均親水性の最も高い点は、その分子の抗原性部分を示す。
より「形質転換される」。この外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み込まれても(共有結合されても)よいし、されなくてもよい。原核生物細胞および酵母において、例えば、外因性DNAは、エピソームエレメント(例えば、プラスミド)上で維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、外因性DNAが染色体複製を通じて娘細胞により遺伝されるように染色体へと組み込まれた細胞である。この安定性は、真核生物細胞が、この外因性DNAを含む細胞株または娘細胞の集団から構成されるクローンを樹立する能力により示される。
分であり得る。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験法を使用して、当業者により決定され得る。
本発明は、GNA33(E.coli ムレイントランスグリコシラーゼと相同性を有するリポタンパク質)が、血清型P1.2の株においてPorAのループ4上のエピトープを模倣する結果として、防御抗体を惹起するという発見に基づく。GNA33は、生細菌では表面に露出していないが、細胞質周辺腔に位置する。重複ペプチドを使用した殺菌性抗GNA33 mAbのエピトープマッピングにより、このmAbがGNA33由来のペプチドおよびPorA(結合に必要なQTP配列を共有する)由来のペプチドを認識することが示される。フローサイトメトリーにより、抗GNA33 mAbは、コントロール抗PorA(P1.2)mAbと同様に、P1.2血清型の大部分のMenB株の細菌表面に結合する。抗GNA33抗体は、P1.2株でチャレンジした新生仔ラットにおいて受動性防御を付与する。従って、GNA33は、PorAに対する防御抗体を惹起する
新規な模倣物である。PorAとは異なり、GNA33は、投与された場合、タンパク質を再生する必要性なくして防御抗体を惹起する。本明細書中において本発明者らは、GNA33が今日までに同定されたもっとも強力な模倣抗原のうちの1つであることを発見した。
、フェノール抽出およびcDNAまたはゲノムDNAのPCR)を使用して、直接単離され得る。例えば、DNAを獲得および単離するために使用される技術の記載については、Sambrookら(前出)を参照のこと。目的の遺伝子はまた、クローニングされるよりむしろ、合成により生成され得る。この分子は、特定の配列についての適切なコドンを使用して設計され得る。次いで、完全な配列は、標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Edge(1981)Nature 292:756;Nambairら(1984)Science 223:1299;およびJayら(1984)J.Biol.Chem.259:6311を参照のこと。
88:4084−4088を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成(Jonesら(1986)Nature 54:75−82)、すでに存在するヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発(Riechmannら(1988)Nature 332:323−327およびVerhoeyenら(1988)Science 239:1534−1536)、およびギャップ形成されたオリゴヌクレオチド(gapped oligonucleotide)のT4 DNAポリメラーゼを使用した酵素的充填(Queenら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86:10029−10033)は、改変された抗原結合能力または増強された抗原結合能力を有する分子を提供するために、本発明にて使用され得る。
めに本明細書中で使用され得る。例としては、SV40初期遺伝子エンハンサー(Dijkemaら(1985)EMBO J.4:761)、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復(LTR)に由来するエンハンサー/プロモーター(Gormanら(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)およびヒトCMVに由来するエレメント(Boshartら(1985)Cell 41:521)(例えば、CMVイントロンA配列に含まれるエレメント(米国特許第5,688,688))が挙げられる。発現カセットはさらに、適切な宿主細胞において自律的に複製するための複製起点、1つ以上の選択マーカー、1つ以上の制限部位、高いコピー数についての可能性および強力なプロモーターを含む。
n Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な不死化細胞株を含む。同様に、E.coli、Bacillus subtilis、およびStreptococcus spp.のような細菌宿主は、本発明の発現構築物を用いる用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては特に、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans、Candida maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis、Kluyveromyces lactis、Pichia guillerimondii、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombeおよびYarrowia lipolyticaが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターを用いる使用のための昆虫細胞としては特に、Aedes aegypti、Autographa californica、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperdaおよびTrichoplusia niが挙げられる。
ポリペプチドを用いて免疫され、追加免疫され、そして脾臓(および必要であれば、いくつかの大きさのリンパ節)は、除去されそして単一細胞へと分離される。所望である場合、脾臓細胞は、(非特異性接着細胞の除去後)抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。抗原に対して特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するB細胞は、プレートに結合し、そして残りの懸濁液で洗い流されない。得られたB細胞または全ての分離された脾臓細胞は、次いで、骨髄腫細胞と融合するように誘導され、ハイブリドーマを形成する。ハイブリダイゼーションでの使用のための代表的なマウス骨髄腫株は、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能なものを含む。
らの結果を使用して、殺菌データを追加し、そして保護を与え得る抗体の選択を助ける。オプソニン活性の評価はまた、IgG1アイソタイプを有する本発明のマウスモノクローナル抗体の評価のために本明細書中で特に有用である。マウスIgG1(ヒトIgG1とは著しく異なる)は、補体の活性化において効果がない。従って、マウスIgG1抗体は、上記のアッセイにおいてMenBの補体媒介溶菌を活性化しない。しかし、IgG1抗GNA33モノクローナル抗体の機能的活性は、補体の非存在下でオプソニン作用によって評価され得る。
tonらに対する米国特許第5,091,513号および同第5,132,405号;およびLadnerらに対する同第4,946,778号)。
Enzymol 8:94;Barbas,IIIら(1991)Proc Natl
Acad Sci USA 88:7978。
nellら(1988)Gene 73:409、Maedaら(1985)Nature 315:592〜594、Lebacq−Verheydenら(1988)Mol.Cell.Biol.8:3129、Smithら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8404、Miyajimaら(1987)Gene
58:273、ならびにMartinら(1988)DNA 7:99。多くのバキュロウイルスの株および改変体、ならびに宿主由来の対応の許容な昆虫宿主細胞は、以下に記載される:Luckowら(1988)Bio/Technology 6:47〜55,Millerら(1986)GENERIC ENGINEERING、Setlow,J.K.ら編、Vol.8,Plenum Publishing,277〜279頁、およびMaedaら(1985)Nature 315:592〜594。
これらのアプローチとしては、以下が挙げられる:フォトリトグラフのチップ上のアドレス可能な位置(オリゴカルバメート)、部分的に合成された(ペプトイド、ピロリジン、ペプチド)ライブラリーおよびヌクレオチドの分離合成によるコードのコンビナトリアルライブラリー(Nielsenら(1993)J.Am.Chem.Soc.115:9812)または他の有機部分の分離合成によるコードのコンビナトリアルライブラリー(Ohlmeyerら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922)(「タグ(tag)」)へのモノマーの再帰的な付加により「ヒット」を同定する脱回旋(deconvolution)ストラテジー。次いで、模倣物を選択した後、各々のライブラリーのメンバーと結合するコードされるタグを、解読し得る。例えば、核酸タグを、DNA配列決定法によって解読し得る。
Res.40:498;およびZuckermannら(1996)Methods in Enzymology 267:437を参照のこと。代替的には、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(hexafluorphosphate)またはブロモトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートのどちらかによるインサイチュ活性化によって、ペプトイドモノマーのオリゴマー化を実施し得る。この代替の方法において、その他は、a−(9−フルオレニルメトキシカルボニル)アミノ酸を使用して従来のペプチド合成と同じである(例えば、Simonら、(1992)、上述を参照のこと)。
によって分画する工程を包含する(Nedved M.L.ら(1996)Anal.Chem.68:4228)。
記載されるアッセイ)を、これらのキットを使用して行い得る。
S109(ここで、109位の野生型アミノ酸がセリンで置換される)、およびPT−K9/G129(ここで、9位の野生型アミノ酸がリジンで置換され、そして129位の野生型アミノ酸がグリシンで置換される))(例えば、国際特許公開番号第WO93/13202号および同第WO92/19265号を参照のこと);(7)MPLまたは3−O−脱アセチル化MPL(3dMPL)(例えば、GB 2220221を参照のこと)、EP−A−0689454、肺炎球菌のサッカライドで使用される場合、必要に応じて、alumの実質的非存在下である、(例えば、国際特許公開第WO 00/56358号を参照のこと);(8)3dMPLと、例えばQS21および/またはO/Wエマルジョンの組み合わせ(例えば、EP−A−0835318、EP−A−0735898、EP−A−0761231を参照こと);(9)CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチド(例えば、Romanら(1997)Nat.Med.3:849−854;Weinerら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:10833−10837;Davisら(1998)J.Immunol.160:870−876;Chuら(1997)J.Exp.Med.186:1623−1631;Lipfordら(1997)Eur.J.Immunol.27:2340−2344;Moldoveanuら(1988)Vaccine 16:1216−1224;Kriegら(1995)Nature 374:546−549;Klinmanら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2879−2883;Ballasら(1996)J.Immunol.157:1840−1845;Cowderyら(1996)J.Immunol.156:4570−4575;Halpernら(1996)Cell Immunol.167:72−78;Yamamotoら(1988)Jpn.J.Cancer Res.79:866−873;Staceyら(1996)J.Immunol.157:2116−2122;Messinaら(1991)J.Immunol.147:1759−1764;Yiら(1996)J.Immunol.157:4918−4925;Yiら(1996)J.Immunol.157:5394−5402;Yiら(1998)J.Immunol.160:4755−4761;Yiら(1998)J.Immunol.160:5898−5906;国際公開第WO 96/02555号,同第WO 98/16247号,同第WO 98/18810号、同第WO 98/40100同,同第WO 98/55495号,同第WO 98/37919号および同第WO 98/52581号)、(例えば、これらを少なくともCGジヌクレオチド上に含み、シトシンは必要に応じて5−メチルシトシンで置換される);(10)ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル(例えば、国際公開第WO 99/52549号を参照のこと);(11)オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(例えば、国際公開第WO 01/21207号)、または少なくとも1つのさらなる非イオン性界面活性剤(例えば、オクトキシノール)と組み合わせた、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはエステル界面活性剤(例えば、国際公開第WO 01/21152号);(12)CpGオリゴヌクレオチドのような、サポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド(例えば、国際公開第WO 00/62800号);(13)免疫刺激剤および金属塩の粒子(例えば、国際公開第WO 00/23105号を参照のこと);ならびに(14)組成物の有効性を増強させるための免疫刺激因子として作用する他の物質。
であり得る。このようなキャリア分子は、それ自体は有害な抗体の産生を誘導しない。適切なキャリアは、代表的に大きく、代謝の遅い巨大分子(例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体(例えば、油滴またはリポソーム)、不活性化ウイルス粒子、CRM197(無毒な変異ジフテリア毒素)など)である。このようなキャリアは、当業者に周知である。
本発明を実施する為の具体的な実施形態の例を以下である。これらの例は、例示目的のみのために、提供され、そして、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
(細菌株)
本研究に含まれるN.meningitidis血清型B株を、異なる国に滞在する、髄膜炎菌性疾患を有する患者から単離し、36年の期間にわたって収集した。21株が、血清型B株であり、1株が血清型C株であった。これらの株を、表1に要約する。電気泳動分類(ET)に基づいて、これらの収集物は、疾患を引き起こすMenB株についての広範な遺伝的多様性を表す。
およびermC遺伝子(エリスロマイシン耐性)を含む。簡潔には、−867から+75の上流隣接領域(開始コドンを含む)、および+1268から+1744の下流隣接領域(終止コドンを含む)を、以下のプライマーを使用して、MC58から増幅した:
フローサイトメトリー、殺菌剤、およびインビボ保護実験(in vivo protection experiment)に使用される抗体としては、以下が挙げられた:Rijksinstituut Voor Volksgezondheid en Mileu,Bilthoven,The Netherlands、またはWendell Zollinger,Walter Reed Army Institute of Research,Washington DCから得られる髄膜炎菌Por A P 1.2特異的サブタイプmAb(MN 16C 13F4、サブクラスIgG2a);カプセル化した、血清型B,SEAM 12およびSEAM 3(Granoffら、J.Immunol.(1998)160:5028−5036),サブクラスIgG2a)ならびに、血清型C(mAb 181.1(Garcia−Ojedaら、Infect.Immun.(2000)68:239−246,サブクラスIgG3)に特異的である抗ポリサッカリドmAb。MAb 181.1は、Kathryn Stein,
U.S.Food and Drug Administrationによって提供された。このネガティブコントロールは、関連のない特異性のマウスIgG mAb(VIG10)、またはrGNA33を発現するのに使用された株由来のE.coliタンパク質に対して調製されたマウスポリクローナル抗血清からなった。
gna33 ORFを、プライマーとして使用される合成オリゴヌクレオチドを用いて、2996株(P.van der Ley and J.T.Poolman,Infect.Immun.(1992)60:3156,1992)由来の染色体DNAにおけるPCRによって増幅された。増幅されたDNAフラグメントを、Hisタグ化(HT−GNA33)されたタンパク質またはシグナル配列または脂質改変配列のない可溶性タンパク質(rGNA33)として、タンパク質を発現するためにpET−21b+ベクター(Novagen,Madison,WI)にクローニングした。組換えタンパク質の発現を、上述のように実施されたSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価した。このHisタグ化タンパク質は、Ni2+結合体化キレートファーストフローSepharose(Amersham−Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)のアフィニティクロマトグラグフィによって精製し、そして非タグ化形態を、モノSイオン交換樹脂(Amersham−Pharmacia)を使用するFPLCによって精製した。
GNA33に対する抗血清を調製するために、20μgの精製した、HT−GNA33または非タグ化rGNA33を、6週齢のCD1雌性マウス(1グループ当たり4〜10のマウス)を免疫するために使用された。これらのマウスを、Charles River(Italia S.P.A.,Calco,Italy,またはHollister,California)から入手した。組換えタンパク質は、初回投薬について完全フロイントアジュバント(CFA)と共にi.p.で投与し、第2回追加免疫投薬(第21日目)および第3回投薬(第35日目)について不完全フロイントアジュバント(IFA)と共にi.p.で投与した。血液サンプルを第34日目および第49日目に採取した。
4〜6週齢の雌性CD1マウスを、第3回目の投薬はアジュバントなしで投与した以外、上述のように免疫した。3日後に、マウスを屠殺し、そして、それらの肝細胞を、1黒色腫細胞に対して5脾臓細胞の比で黒色腫細胞P3X63−Ag8.653と融合した。HAT選択培地中での2週間のインキュベーション後に、ハイブリドーマ上清は、ELISAによって抗体結合活性についてスクリーニングした。このELISAを、このN.meningitidis M7株は、0.025%パラホルムアルデヒドで処理することによって不活性化されているナノカプセル化したN.meningitidis M7株(Stephensら、Infect.Immun.(1991)59:4097−4102)でコートされたマイクロタイタープレート上で実施した。GNA33特異的抗体を分泌するハイブリドーマを、限界希釈によって2回クローン化し、次いで、増殖し、組織培養における次なる使用またはBALB/cマウスにおける腹水産生の為に凍結した。
,Italy)を使用して決定した。mAb 25結合の特異性を、MC58株、BZ232株およびNMB株ならびにそれぞれのGNA33ノックアウト体(MC58ΔGNA33,BZ232ΔGNA33およびNMBΔGNA33;以下を参照のこと)から調製された膜タンパク質を使用するウェスタンブロットによって決定された。
ポリクローナル抗GNA33抗血清およびmAb 25の、生NmB株の表面に結合する能力は、以前に記載されたように実行される(Moeら,Infect.Immun.(1999)67:5664−5675)、間接蛍光アッセイのフローサイトメトリー検出を使用して決定された。図1Aは、代表的な4つのNmB株、親株2996(P1.5,2)および他の3つの株である、M3735(P1.5,2)、M4207(P1.5)およびMC58(P1.7,16)に対するポリクローナル抗rGNA33抗血清の結合を示す。抗GNA33ポリクローナル抗血清は、2996株およびM3735株とのみ反応した。この抗カプセルポジティブコントロールmAbは、4つ全ての株に結合した一方、E.coliのタンパク質で免疫された動物から調製されたネガティブコントロール抗血清は、バックグラウンド結合のみを示した。図lBは、3つの株(M3735[P1.5,2],M4207[P1.5]およびMC58[P1.7,16])の細菌細胞表面への抗GNA33 mAb 25の結合を測定する類似の実験の結果を示す。このmAbは、M3735(P1.5,2)株にのみ結合した。
殺菌活性を、以前に説明されたように測定された(Moeら,Infect.Immun.(2001)69:3762−3771)。述べない限り、この補体供給源は、ELISAで試験した場合に、血清型Bまたは血清型Cのポリサッカリドに対して検出可能な抗カプセル抗体も、20%または40%の最終血清濃度で、標的株に対する検出可能な内因性の殺菌活性を有さない健康な成人(MAS)に由来するヒト血清であった。以下のようないくつかの実施形態において、未処置の無ガンマグロブリン血症の患者に由来する血清(Steeleら,Infect.Immun.(1984)44:452−458)、仔ウサギ血清、または成体ラット血清を補体供給源として使用して、殺菌活性は測定した。
抗GNA33抗体が、N.meningitidis血清型B菌血症に対する受動的防御を付与する能力を、腹腔内チャレンジした乳児ラットにおいて試験した。このアッセイを、以前に記載されるように実行した(Moeら、Infect.Immun.(1999)67:5664−5675)。簡潔には、チャレンジの開始時にコロニーを取り、ブロス培養物中に接種し、そして増殖させ、殺菌アッセイについて上記したように調製した。感受性を最大化するために株M986を用いて、その動物に、0時点で、約5×103
のチャレンジMenB試験株と混合した試験抗血清およびコントロール抗血清の異なる希釈物100μlを、腹腔内注射した。他の試験株を用いた実験において、この抗体を、0時点で腹腔内投与し、そして細菌チャレンジを2時間後に腹腔内で行った。使用したポジティブコントロール抗莢膜mAbは、SEAM3であった。細菌チャレンジの18時間後に、針と約10μlのヘパリン(1000単位/ml;Fujisawa USA、Deerfield、IL)(保存料なし)を含むシリンジとを用いて、心臓穿刺によって血液試料を獲得した。1μL、10μLおよび100μLの血液アリコートを、チョコレート寒天上に配置した。血液1ml当たりのCFUを、このプレートを37℃で5%CO2中にて一晩インキュベートした後に決定した。相乗平均CFR/mlの計算のために、滅菌培養物を受けた動物に、1CFR/mlという値を割り当てた。
髄膜炎菌株の総細胞抽出物を、以下のように調製した。シングルコロニーを、0.25%グルコースを補充したMueller−Hintonブロス(Difco、Detroit、MI)7ml中で、0.5〜0.7のA620nmまで増殖させた。その細菌を、5000×gで15分間遠心分離することによって収集し、そしてPBS中に再懸濁した。凍結−解凍後、細菌懸濁物をサンプル緩衝液(0.06M Tris−HCl(pH6.8)、10%(V/V)グリセロール、2%(W/V)SDS、5%(V/V)2−メル
カプトエタノール)と混合し、そして10分間煮沸した。髄膜炎菌株由来の精製タンパク質(0.5μg/レーン)または総細胞抽出物(25μg)を、12.5%のSDS−ポリアクリルアミドゲル上(Laemmli、U.K、Nature(1970)227:680−685)にロードし、そしてニトロセルロース膜上に移した(Towbinら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1979)76:4350−4354)。トランスファー緩衝液(0.3% Tris塩基、1.44%グリシン、20%(v/v)メタノール)を使用して、4℃にて150mAで2時間トランスファーを実行した。このニトロセルロース膜を、飽和緩衝液(PBS中10%スキムミルク、0.1% Triton X100)中で4℃で一晩インキュベートすることによって飽和した。この膜を洗浄緩衝液(PBS中の3%スキムミルク、0.1%Triton X100)で2回洗浄し、洗浄緩衝液で200倍希釈されたマウス抗血清、最終濃度が6μg/mlのmAb 25、または抗PorA P1.2mAbの100倍希釈希物と共にその後、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識された抗マウスIg(Dako、Glostrup、Denmark)の2000倍希釈物と共に37℃で2時間インキュベートした。膜を、PBS中の0.1%Triton X100で2回洗浄し、Opti−4CN Substrate Kit(Bio−Rad)を用いて発色させた。水を加えることによって反応を停止させた。
ペプチドスポット合成を、モデルASP 222自動スポット合成機(ABIMED)およびジイソプロピルカーボジイミド(DIC)/N−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)活性化(FrankおよびOverwin、Methods Mol.Biol.(1996)66:149−169)を用いて、アミノ−PEGセルロース膜(ABIMED、Langerfeld,Germany)上で行なった。インサイチュ調製された、フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)−アミノ酸誘導体のHOBtエステル(0.2M)をカップリング反応にした。スポット上の遊離アミノ官能基を、ジメチルホルムアミド中のブロモフェノールブルーの溶液で処理した。これにより、青色染色を生じる、この染色により、全ての合成工程を可視的に観察することができた。最終サイクルの後、全てのペプチドを2%無水酢酸でN末端をアセチル化した。合成の最後に、トリフルオロ酢酸/トリイソブチルシラン/水/ジクロロメタン(50/3/2/45)の混合物を用いて、側鎖保護基を取り除いた。
セルロース結合ペプチドを、ペプチド間の疎水性相互作用を防ぐためにエタノールに浸した。非特異性結合を、0.05%のTween 20を含むTris緩衝化生理食塩水(TBS:50mM Tris−HCl、137mM NaCl、27mM KCl、pH7.0)(T−TBS)中の2%カゼイン(10ml)と共に、4℃で一晩セルロースシートをインキュベートすることによって、ブロックした。このシートを、T−TBSブロッキング緩衝液で100倍希釈した、抗GNA33mAb25(6μg/ml)または抗PorA 1.2mAbと共に37℃で2時間インキュベートした。次にアルカリホスフォターゼ結合体化ヤギ抗マウスIgG(BioRad)を、37℃で1時間、T−TBSブロッキング緩衝液中3000倍希釈で加えた。シートをT−TBSで3回洗浄し、基質緩衝液(100mM Tris、pH8.9、100mM NaCl、2mM MgCl2)中のブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ホスフェート(BCIP)(Sigma、Steinheim、Germany)および3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5ジフェニル−テトラゾリウムブロミド(MTT;Sigma)と共にそのシートをインキュベートすることにより、結合の検出を達成した。シグナルの定量評価を、Umax Speedy II 2200オプティカルスキャナを用いて行なった。
(間接蛍光フローサイトメトリーにより測定される、細菌細胞表面への抗GNA33抗体の結合)
CD1マウスをrGNA33(2996株由来の遺伝子によってコードされる)を用いて免疫化した。得られたポリクローナル抗体含有抗血清を、間接免疫蛍光結合アッセイのフローサイトメトリー検出により測定される、様々なMenB株の生細菌細胞への結合能力について試験した。図1Aは、4つの代表的なMenB株、親2996株(P1.5,2)および3つの他の株(M3735株(P1.5,2)、M4207株(P1.5)およびMC58株(P1.7,16))へのポリクローナル抗rGNA33抗血清の結合を示す。抗GNA33ポリクロナール抗血清は、2996株およびM3735株のみと反応した。抗莢膜ポジティブコントロールmAbは4つの株全てと結合したが、E.coliタンパク質で免疫化された動物から調製されたネガティブコントロール抗血清は、バックグラウンド結合のみを示した。図1Bは、3つの株(M3735株(P1.5,2)、M4207株(P1.5)およびMC58株(P1.7,16)の細菌細胞表面への抗GNA33mAb25の結合を測定する、同様の実験の結果を示す。mAbはM3735株(P1.5,2)のみと結合した。
(異なるN.meningitidis B群株から調製された総膜画分のウェスタンブロット)
細菌表面への抗GNA33抗体の結合とP1.2血清亜型の明らか関係は、予想外であった。この関係を代表的な株から調製した総タンパク質のウェスタンブロットによりさらに研究し、そしてSDS−PAGEにより解決した。4つの血清亜型B株(フローサイトメトリーで抗GNA33表面結合についてネガティブであった2つの株(NG3/88株(P1.7,1)およびMC58株(P1.17,16)、およびポジティブであった2つの株(BZ232株およびNMB株(共にP1.5,2))からの結果を図2に示す。データはまた、GNA33をコードする遺伝子が不活性化された3つの株(MC58株、BZ232株およびNMB株)からの総膜調製物について示す。
(抗GNA33 mAb25によって認識される表面露出したPorAエピトープのペプチドマッピング)
抗P1.2 mAbは、ループ4上に存在するPorA上のエピトープを認識することが知られている。表2は、本研究に含まれる選択されたMenB株についてのループ4可変領域(VR2)アミノ酸配列の比較を示す(最近改訂されたPorA VR命名の慣例会議についてSacchiら、Infect.Dis.(2000)182:1169−1176、またはhttp://mlst.zoo.ox.ac.uk/Meningococcusを参照のこと)。表2中に、抗GNA33mAbによる表面結合についてネガティブであった、2つの密接に関連するVR2型(それぞれ、BZ83株(P1.10)からのP1.10およびM4207株(P1.10−1)からのP1.10−1)の配列を含む。2つのネガティブ株のループ4配列は、6個のアミノ酸ペプチドで抗GNA3
3ポジティブ株と異なる。ポジティブP1.2株は、ヘキサペプチドQTPKSQ(配列番号16)またはQTPQSQ(配列番号17)を含むが、ネガティブP1.10株またはP1.10−1株は、ヘキサペプチドNKQNQR(配列番号18)またはNKQNQP(配列番号19)をそれぞれ含む(表2)。
(抗GNA33抗体および抗PorA P1.2抗体のP1.2 NmB株への比較結合)
抗rGNA33抗体がPorA P1.2エピトープと交差反応するという予想外の発見は、PorA血清亜型P1.2.によって惹起された抗体の活性とrGNA33によって産出された抗体の活性を比較する機会を与えた。1つの例外を除いて、試験した9個のP1.2株について、抗GNA33mAbの濃度依存結合は、コントロール抗PorA P1.2mAbの濃度依存結合と類似していた(図5Aの8047株およびBZ232株についての代表的なデータを参照のこと)。例外のM986株は、他のP1.2株への結合と比較した場合に、相対的に弱い抗GNA33抗体結合を示した(表5B)。対照的に、抗PorA P1.2mAbによる結合は、M986を含む全てのP1.2株について同様であった。
ピトープのアミノ酸配列に基づく。VR2配列型P1.2(M3735株およびM5682株)を有することが報告されている他の2つの株は、それぞれの株中に、コントロール抗PorA P1.2mAbのそれぞれの結合と匹敵した、強い抗GNA33抗体結合を示した(例えば、M3735株(図1A)およびM5682(図5B)を用いた結合のデータ)。M986株、M3735株およびM5682株中のPorAループ4のVR2配列型は、2回目のヌクレオチド配列決定によってP1.2であることが確証された。従って、配列の差異(Qに対するK)は、M986株との減少した抗GNA33結合活性を説明するために十分であることが明らかではない。
(殺菌活性)
PorA P1.2(rGNA33)に対するマウスmAb(mAb25)ならびに血清B型に対するマウスmAb(SEAM12)および血清C型に対するマウスmAb(mAB181.1)多糖莢膜に対するマウスmAbの補体依存殺菌活性を比較した。NmC株M5954を試験するために使用した血清C型抗莢膜mAb(サブクラスIgG3)を除いて、他のmAbの全サブクラスはIgG2aであった。ヒト補体の存在下において抗PorA P1.2mAbのBC50は、全ての9株について0.5μg/ml未満であった。血清B型抗莢膜mAbの対応するBC50値は高く(5〜12μg/mlの範囲)、そして血清C型mAb(株M5954)については1μg/ml未満であった。表5にまとめたように、抗GNA33mAbの殺菌活性は多様であり、そして使用した補体供給源に依存した。3つの株(8047、NMBおよびM3735)について、ヒト補体の存在下において抗GNA33mAbのBC50値は、7〜15μg/mlの範囲であった。これらの株の値は、抗莢膜抗体の値と類似した。残りの6つの株(2996、BZ232、M5545、M5682、M5954およびM986)について、ヒト補体の存在下において、抗GNA33mAbを用いて観察された殺傷は存在しなかった(内在性殺菌活性のない正常成体由来の血清を用いて試験した場合、BC50は60μg/ml未満(表5)であり、そして無γグロブリン血症を有する患者由来の血清を用いて試験した場合、30μg/ml未満であった)。胎仔ウサギ血清を補体供給源として使用した場合、6株のうち1つを除いて全てが、抗GNA33誘導溶解に対して感受性であった。感受性株のBC50値は、1μg/ml以上8μg/mlの範囲であった(表5)。一方、例外は株M986であり、ここで、ヒトおよびウサギ補体で試験した場合、抗GNA33mAbを用いて観察された殺傷は存在しなかった(BC50値は、それぞれ150μg/ml超および30μg/ml超である)。この株に対する細菌溶解の欠如は、フローサイトメトリーによって測定されるように、mAbのより低い表面結合に関連し得る(図5B)。試験した5株に対して、ヒト補体を用いたポリクローナルマウス抗rGNA33抗血清のそれぞれの殺菌力価は、抗GNA33mAb25を用いて測定した結果と一致した(表5)。
(抗GNA33抗血清による受動性防御)
MenB菌血症に対する受動性防御を与えるポリクローナルマウス抗GNA33抗体の能力を、胎仔ラットモデルにおいて評価した。3株を使用した:8047、ヒトまたはウサギの補体の存在下で抗GNA33細菌溶解に感受性である株;BZ232、すなわちヒト補体での抗GNA33細菌溶解に耐性であるが、ウサギまたはラットの補体に感受性である株;およびM986、すなわちヒト、ウサギまたはラットの補体の存在下で抗GNA33細菌溶解に耐性である株。このモデルにおいて試験する受動性防御の結果を、表6にまとめる。
実験において、株M986(抗GNA33細菌溶解に対して耐性の株)の6.5×103CFUと混合した抗GNA33抗血清の1:5または1:25(100μl)を与えた全ての動物は、細菌血症を発症した。殺菌活性の欠如にかかわらず、抗GNA33抗血清で処理し、そして株M986でチャレンジした動物血液の幾何平均CFU/mlは、E.coliタンパク質に対して調製したネガティブコントロール抗血清を用いて試験したコントロール動物よりも、10〜20培低かった(P=0.02)。同様の結果は、抗GNA33mAb25を用いた第2の実験(実験2)において観察された。全6匹のラットを、i.p.によりmAb25の20μgで前処理し(時点0)、2時間後に株M986の3.5×103CFUでチャレンジし、チャレンジの18時間後に採集した血液サンプルには細菌が存在した。しかし、幾何平均CFU/mlは、無関係のmAbを用いて前処理したコントロール動物の幾何平均CFU/mlの0.3%よりも少なかった(p<0.02)。同様の実験において、ラット1匹あたり20μgの抗P1.2mAbは、株M986に対して完全な防御であり、そしてラット1匹あたり2μgは部分的防御であった(試験した6匹のうち1匹のみが菌血症を発症した)。
る組換えGNA33タンパク質が、組換え分子の再生についての必要性を有さず、フロイントのアジュバントと単に混合される場合に、これが生じる。
B幾何平均のCFU/mlの計算のために、滅菌培地を用いた動物に、1CFU/mlの値を割り当てた。実験1において、抗GNA33抗血清の1:5または1.25希釈を与えそして、株M986(28.8×103)でチャレンジした動物の組み合わせ群の幾何平均CFU/mlは、無関係なmAbまたはE.coli抗血清(350×103、P=0.02)を与えたコントロールの組み合わせた群のものよりも低かった。実験2、3および4において、抗GNA33 mAbで処置された動物の幾何平均CFU/mlは、無
関係なmAbを与えたコントロールの物より低かった(P<0.02)。
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