ES2864635T3

ES2864635T3 - Variantes no lipidadas de antígenos ORF2086 de Neisseria meningitidis

Info

Publication number: ES2864635T3
Application number: ES19166124T
Authority: ES
Inventors: Annaliesa Sybil Anderson; Susan Kay Hoiseth; Kathrin Ute Jansen; Justin Keith Moran; Mark Edward Ruppen
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2011-09-08
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2031-09-08
Also published as: HK1188385A1; US10512681B2; EP3549601A1; PE20140173A1; IL225126A; ES2585328T3; US11077180B2; US20120093852A1; RU2013109167A; EP3549601B1; JP5976652B2; EP3056212B1; CN103096920B; CO6690760A2; KR20130079536A; MX2013001997A; EP3056212A1; NZ607224A; EP2613806A1; RU2546873C2

Abstract

Un procedimiento para producir un polipéptido ORF2086 no piruvilado no lipidado que comprende expresar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 21, en la que la cisteína en la posición 1 se deleciona y en la que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un sistema de expresión que es capaz de ser expresado en una célula bacteriana.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes no lipidadas de antígenos ORF2086 de Neisseria meningitidis

La presente solicitud otorga prioridad a la Solicitud Provisional de EE.UU. de N.° de serie 61/381.837, presentada el 10 de septiembre de 2010.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para producir variantes no lipidadas no piruviladas de ORF2086 de Neisseria meningitidis según se describe en el presente documento.

Antecedentes de la invención

rLP2086 es una lipoproteína recombinante de 28 kDa que induce anticuerpos bacterianos de reacción cruzada contra una serie de cepas de Neisseria meningitidis, incluidas las cepas del serotipo B de Neisseria meningitidis (MnB) o, con más exactitud, cepas del serogrupo B (MnB). En base a una homología de secuencia de aminoácidos deducida se identificaron dos subfamilias diferentes de rLP2086, A y B. Estas dos subfamilias se usaron en la formulación de las muestras de la vacuna MnB-rLP2086 que contienen 20, 60,120 y 200 pg/ml cada una en histidina 10 mM (pH 6,0), NaCl 150 mM y 0,5 mg/ml de aluminio con niveles variables de polisorbato 80 (PS-80). La LP2086 nativa es una lipoproteína. Fletcher y col. Infection & Immunity. vol. 72(4):2088-2100 (2004) demostraron que rLP2086 con un lípido en el amino terminal era más inmunógena que las versiones no lipidadas de la misma proteína en ratones. En estudios preclínicos y clínicos adicionales se ha demostrado que la combinación de estas dos proteínas lipidadas puede proporcionar una amplia cobertura en la familia de fHBP. El documento WO2007060548 desvela 2086 proteínas (llamadas NMB 1870) para aumentar la capacidad de generar anticuerpos que son de reacción cruzada entre las familias. La meningitis meningocócica es una enfermedad devastadora que puede matar a niños y adultos jóvenes en horas a pesar de la disponibilidad de antibióticos. Sigue existiendo la necesidad de composiciones inmunógenas adecuadas para el meningococo del serogrupo B.

Sumario de la divulgación

Para cumplir estas y otras necesidades de una vacuna meningocócica se han evaluado composiciones adicionales para proporcionar cobertura para el uso de variantes no lipidadas de polipéptidos ORF2086 de N. meningitidis. La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. Un primer aspecto de la presente divulgación proporciona una composición inmunógena que comprende una proteína ORF2086 no lipidada, en la que la proteína ORF2086 es una variante B44, una B02, una B03, una B22, una B24, una B09, una A05, una A12 o una A22. En algunos casos, la proteína ORF2086 es una variante B44, una B22, una B09, una A05, una A12 o una A22.

Otro aspecto de la presente divulgación proporciona una composición inmunógena que comprende una variante de la subfamilia B de la proteína ORF2086 no lipidada (polipéptido P2086 de la subfamilia B). En algunos casos, el polipéptido P2086 de la subfamilia B es una variante B44, una B02, una B03, una B22, una B24 o una B09. En algunos casos, la composición inmunógena comprende además una variante de la subfamilia A de la proteína ORF2086 no lipidada (polipéptido P2086 de la subfamilia A). En algunos casos, el polipéptido P2086 de la subfamilia A es una variante A05, una A04, una A12 o una A22.

En algunos casos, la composición inmunógena comprende además un adyuvante. En algunos casos, el adyuvante es un adyuvante de aluminio, una saponina, una secuencia de nucleótidos CpG o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el adyuvante de aluminio es AlPO4, Al(OH)3, Ah(SO4)3 o alumbre. En algunos casos, la concentración de aluminio en la composición inmunógena está entre 0,125 pg/ml y 0,5 pg/ml. En algunos casos, la concentración de aluminio en la composición inmunógena es de 0,25 pg/ml. En un caso preferido, la concentración de aluminio en la composición inmunógena está entre 0,125 mg/ml y 0,5 mg/ml. En algunos casos preferidos la concentración de aluminio en la composición inmunógena es 0,25 mg/ml.

En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena está entre 1 pg/ml y 250 pg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena está entre 10 pg/ml y 100 pg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena es de 10 pg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena es de 100 pg/ml. En algunos casos, la saponina es QS-21 Stimulon® (Agenus, Lexington, Ma ) o ISCOMATRIX® (CSL Limited, Parkville, Australia).

En algunos casos, la composición inmunógena confiere la capacidad de producir una respuesta inmunógena a Neisseria meningitidis tras la administración de múltiples dosis de la composición inmunógena a un sujeto. En algunos casos, la respuesta inmunógena se confiere tras la administración de dos dosis al sujeto. En algunos casos, la respuesta inmunógena se confiere tras la administración de tres dosis al sujeto.

Otro aspecto de la divulgación proporciona una composición que confiere un incremento de la inmunogenicidad de un antígeno P2086 no lipidado, en el que la composición comprende una saponina y al menos un antígeno P2086 no lipidado. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena está entre 1 pg/ml y 250 pg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena está entre 10 pg/ml y 100 |jg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena es de 10 |jg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena es de 100 jg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena es 100 jg/ml. En algunos casos, la saponina es QS-21 o ISCOMATRIX.

En algunos casos, la composición comprende además aluminio. En algunos casos, el aluminio está presente como AlPO4, Al(OH)3, Ah(SO4)3 o alumbre. En algunos casos, la concentración de aluminio en la composición está entre 0,125 jg/ml y 0,5 jg/ml. En algunos casos, la concentración de aluminio en la composición es de 0,25 jg/ml. En un caso preferido, la concentración de aluminio en la composición inmunógena está entre 0,125 mg/ml y 0,5 mg/ml. En algunos casos preferidos la concentración de aluminio en la composición inmunógena es 0,25 mg/ml.

En algunos casos, el antígeno P2086 no lipidado es un polipéptido P2086 no lipidado de la subfamilia B. En algunos casos, el polipéptido P2086 de la subfamilia B es una variante B44, una B02, una B22, una B24 o una B09. En algunos casos, el antígeno P2086 no lipidado es un polipéptido P2086 de la subfamilia A. En algún caso, el polipéptido P2086 de la subfamilia A es una variante A05, una A04, una A12 o una A22.

En algunos casos, la composición comprende al menos dos antígenos P2086 no lipidados, en la que los dos antígenos P2086 no lipidados son al menos un polipéptido P2086 no lipidado de la subfamilia A y al menos un polipéptido P2086 no lipidado de la subfamilia B. En algunos casos, el polipéptido P2086 no lipidado de la subfamilia A es una variante A05, y el polipéptido P2086 no lipidado de la subfamilia B es una variante B44. En algunos casos, el polipéptido no lipidado P2086 de la subfamilia A es una variante A05 y el polipéptido no lipidado P2086 de la subfamilia B es una variante B22. En algunos casos, el polipéptido P2086 no lipidado de la subfamilia A es una variante A05 y el polipéptido P2086 no lipidado de la subfamilia B es una variante de B09.

Otro aspecto de la invención, la invención proporciona un procedimiento para conferir inmunidad a un sujeto contra una bacteria Neisseria meningitidis, en el que el procedimiento comprende la etapa de administrar al sujeto una composición inmunógena que comprende un polipéptido P2086 no lipidado de la subfamilia B. En algunos casos, el polipéptido P2086 de la subfamilia B es una variante B44, una B02, una B03, una B22, una B24 o una B09. En algunos casos, la composición inmunógena comprende además un polipéptido P2086 de la subfamilia A. En algunos casos, el polipéptido P2086 de la subfamilia A es una variante A05, una A04, una A12 o una A22.

En algunos casos, la composición inmunógena comprende además un adyuvante. En algunos casos, el adyuvante es un adyuvante de aluminio, una saponina, una secuencia de nucleótidos CpG o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, el adyuvante de aluminio es APO4, Al(OH)3, Ah(SO4)3 o alumbre. En algunos casos, la concentración de aluminio en la composición inmunógena está entre 0,125 jg/ml y 0,5 jg/ml. En algunos casos, la concentración de aluminio en la composición inmunógena es de 0,25 jg/ml. En un caso preferido, la concentración de aluminio en la composición inmunógena está entre 0,125 mg/ml y 0,5 mg/ml. En algunos casos, la concentración de aluminio en la composición inmunógena es de 0,25 mg/ml.

En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena está entre 1 jg/ml y 250 jg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena está entre 10 jg/ml y 100 jg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena es de 10 jg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina en la composición inmunógena es de 100 jg/ml. En algunos casos, la saponina es QS-21 o ISCOMATRIX.

En algunos casos, la composición inmunógena se administra al sujeto en múltiples dosis en un programa de dosificación. En algunos casos, la composición inmunógena se administra al sujeto en dos dosis en un programa de dosificación. En algunos casos, la composición inmunógena se administra al sujeto en tres dosis en un programa de dosificación.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un procedimiento para producir una variante de P2086 no lipidada que comprende las etapas de (a) clonar un ácido nucleico variante de ORF2086 en un vector de expresión para generar un vector de expresión de ORF2086; (b) transformar bacterias con el vector de expresión de ORF2086; (c) inducir la expresión de la variante de P2086 a partir del vector de expresión de ORF2086; y (d) aislar la proteína variante de P2086 expresada; en el que el vector de expresión de ORF2086 no comprende una secuencia de control de la lipidación. En algunos casos, la bacteria es E. coli. En algunos casos, la expresión se induce mediante adición de IPTG.

En algunos casos, el codón que codifica la Cys en N-terminal de la variante de P2086 está delecionado. En algunos casos, el codón que codifica la Cys en N-terminal de la variante de P2086 está mutado para generar un codón Ala, Gly o Val. En algunos casos, la variante de P2086 es una variante A05, B01 o B44. En algunos casos, la variante de P2086 es una variante B09.

En algunos casos, la cola N-terminal está mutada para añadir residuos de Ser y Gly para extender el tallo Gly/Ser inmediatamente aguas abajo de la Cys en N-terminal. En algunos casos, el número total de residuos de Gly y Ser en el tallo Gly/Ser es al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11o al menos 12.

En algunos casos, los codones de la cola N-terminal de la variante P2086 se optimizan mediante mutagénesis puntual. En algunos casos, los codones de la cola N-terminal de la variante de ORF2086 se optimizan mediante mutagénesis puntual de modo que el codón que codifica el quinto aminoácido de la variante de ORF2086 es 100 % idéntico a los nucleótidos 13-15 de la SEQ ID NO: 8 y el codón que codifica el decimotercer aminoácido de la variante de ORF2086 es 100 % idéntico a los nucleótidos 37-39 de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante de ORF2086 no lipidada se optimiza de manera que los ácidos nucleicos 5'45 son 100 % idénticos a los ácidos nucleicos 1-45 de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante de ORF2086 no lipidada se optimiza de manera que los ácidos nucleicos 5'42 son 100 % idénticos a los ácidos nucleicos 4-45 de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante de ORF2086 no lipidada se optimiza de manera que los ácidos nucleicos 5 '39 son 100 % idénticos a los ácidos nucleicos 4-42 de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante de P2086 no lipidada comprende al menos una primera sustitución de un aminoácido en comparación con los aminoácidos 1-15 de la SEQ ID NO: 18. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante P2086 no lipidada comprende dos sustituciones de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1-15 de la SEQ ID. NO: 18. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante de P2086 no lipidada comprende al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 2-15 de la SEQ ID NO: 18. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante de P2086 no lipidada comprende dos sustituciones de aminoácidos en comparación con los aminoácidos 2-15 de la SEQ ID NO: 18. En algunos casos, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas.

En un caso, la presente divulgación se refiere a formulaciones estables de antígenos ORF2086 de la subfamilia B de Neisseria meningitidis en composiciones inmunógenas. La presente divulgación también se refiere a procedimientos para conservar la conformación de los antígenos ORF2086 de Neisseria meningitidis y a procedimientos para determinar la potencia de los antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis.

En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición que incluye un polipéptido ORF2086 no lipidado aislado y no piruvilado. En un caso, la composición es inmunógena. En otro caso, el polipéptido incluye una deleción de una Cys en N-terminal en comparación con el correspondiente polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo silvestre. En un caso, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20, y la SEQ ID NO: 21, en el que la cisteína en la posición 1 está delecionada. En otro caso, el polipéptido incluye la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50 y la SEQ ID NO: 55.

En otro caso más, el polipéptido está codificado por una secuencia nucleotídica que está operativamente unida a un sistema de expresión, en el que dicho sistema de expresión se puede expresar en una célula bacteriana. En un caso, el sistema de expresión es un sistema de expresión plasmídico. En un caso, la célula bacteriana es una célula de E. coli. En otro caso, la secuencia de nucleótidos está unida a una secuencia reguladora que controla la expresión de dicha secuencia nucleotídica.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una composición que incluye un polipéptido ORF2086 no lipidado no piruvilado que se puede obtener mediante un procedimiento. El procedimiento incluye expresar una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 21, en el que la cisteína en la posición 1 está delecionada, en el que la secuencia nucleotídica que está operativamente unida a un sistema de expresión que se puede expresar en una célula bacteriana. En un caso, la célula bacteriana es E. coli.

En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición que incluye un polipéptido aislado, que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49 y un polipéptido aislado, que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID NO: 44. En un caso, las composiciones descritas en el presente documento son inmunógenas. En otro caso, las composiciones descritas en el presente documento incluyen además un polipéptido ORF2086 de la subfamilia A de N. meningitidis del serogrupo B. En otro caso, la composición descrita en el presente documento produce una respuesta inmunológica bactericida en un mamífero contra un polipéptido ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis del serogrupo B.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49. En otro aspecto, la divulgación se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que incluye la SEQ ID NO: 46. En un aspecto, la divulgación se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que incluye la SEQ ID NO: 47. En un aspecto, la divulgación se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que incluye la SEQ ID NO: 48. En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50. En un aspecto, la divulgación se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que incluye la SEQ ID NO: 45. En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 44.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un plásmido que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y la SEQ ID NO: 45, en el que el plásmido se puede expresar en una célula bacteriana. En un caso, la célula bacteriana es E. coli.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para obtener anticuerpos bactericidas específicos de un ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis de serogrupo B en un mamífero. El procedimiento incluye administrar al mamífero una cantidad de un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44 y ^sE^qID NO: 49 o una combinación de los mismos.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para producir un polipéptido. El procedimiento incluye expresar en una célula bacteriana un polipéptido, que incluye una secuencia que tiene una identidad superior al 90 % con la SEQ ID NO: 21, incluyendo dicha secuencia al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 13-18 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 21-34 de SEQ ID NO: 21 y los aminoácidos 70-80 de la SEQ ID NO: 21 o una combinación de los mismos, en el que la secuencia carece de una cisteína en N-terminal. El procedimiento incluye además purificar el polipéptido. En un caso, la secuencia incluye además al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 96-116 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 158-170 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 172-185 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 187 199 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 213-224 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 226-237 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 239-248 de la SEQ ID NO: 21 o una combinación de los mismos. En un caso, la célula bacteriana es E. coli.

En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado producido por un procedimiento que incluye el procedimiento descrito en el presente documento. En otro aspecto, la divulgación se refiere a una composición inmunógena producida por un procedimiento que incluye el procedimiento descrito en el presente documento.

En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición inmunógena que incluye un polipéptido ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis de serogrupo B, en el que el polipéptido es un B44 no lipidado no piruvilado. En un caso, la composición incluye además un segundo polipéptido ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis de serogrupo B, en la que el segundo polipéptido es un B09 no lipidado no piruvilado. En un caso, la composición incluye no más de tres polipéptidos ORF2086 de la subfamilia B. En otro caso, la composición incluye no más de 2 polipéptidos ORF2086 de la subfamilia B. En un caso, la composición incluye además un polipéptido ORF2086 de la subfamilia A. En otro caso, la composición incluye un polipéptido A05 de la subfamilia A.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: secuencias de ácidos nucleicos de la variante de P2086.

Figura 2: secuencias de aminoácidos de la variante de P2086. El tallo Gly/Ser en la cola N-terminal en cada variante está subrayado.

Figura 3: estructura de la proteína ORF2086

Figura 4: eliminación de la Cys en N-terminal tiene como resultado la pérdida de expresión en E. coli.

Figura 5: efecto de la longitud del tallo Gly/Ser en la expresión de la variante de ORF2086 no lipidada. La secuencia asociada con la variante proteica denominada B01 se expone en la SEQ ID NO: 35. La secuencia asociada con la variante proteica denominada B44 se expone en la SEQ ID NO: 36. La secuencia asociada con la variante proteica denominada A05 se expone en la SEQ ID NO: 37. La secuencia asociada con la variante proteica denominada A22 se expone en la SEQ ID NO: 38. La secuencia asociada con la variante proteica denominada B22 se expone en la SEQ ID NO: 39. La secuencia asociada con la variante proteica denominada A19 se expone en la SEQ ID NO: 40.

Figura 6: niveles elevados de expresión de B09 no lipidada a pesar de un tallo corto de Gly/Ser. Las dos calles de la izquierda demostraron expresión de la variante B09 con deleción de Cys en N-terminal antes y después de inducción. Las calles tercera y cuarta demuestran expresión de la variante B09 positiva para Cys en N-terminal antes y después de inducción. La calle de más a la derecha es un patrón del peso molecular. La secuencia de aminoácidos mostrada bajo la imagen se expone en la SEQ ID NO: 41. La secuencia de nucleótidos representativa de la variante A22 con deleción de Cys en N-terminal, denominada en la figura “A22_001”, se expone en la SEQ ID NO: 42, lo que se muestra en la SEQ ID NO: 41 en la figura. La secuencia de nucleótidos representativa de la variante B22 con deleción de Cys en N-terminal, denominada en la figura “BA22_001”, se expone en la SEQ ID NO: 52. La secuencia de nucleótidos representativa de la variante B09 con deleción de Cys en N-terminal, denominada en la figura “B09_004”, se expone en la SEQ ID NO: 53.

Figura 7: la optimización por codón incrementa la expresión de las variantes B22 y A22 no lipidadas. El panel de la izquierda demuestra expresión de la variante B22 con deleción de Cys en N-terminal antes (calles 1 y 3) y después (calles 2 y 4) de la inducción con IPTG. El panel de la derecha demuestra expresión de la variante A22 con deleción de Cys en N-terminal antes (calle 7) y después (calle 8) de la inducción con IPTG. Las calles 5 y 6 son patrones de peso molecular.

Figura 8: secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la variante P2086.

Identificadores de secuencia

La SEQ ID NO: 1 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante A04 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

La SEQ ID NO: 2 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante A05 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

La SEQ ID NO: 3 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante A12 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

La SEQ ID NO: 4 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante A12-2 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

La SEQ ID NO: 5 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante A22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

La SEQ ID NO: 6 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante B02 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

La SEQ ID NO: 7 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante B03 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

La SEQ ID NO: 8 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante B09 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

La SEQ ID NO: 9 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante B22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys N-terminal.

La SEQ ID NO: 10 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante B24 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

La SEQ ID NO: 11 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante B44 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en N-terminal.

SEQ ID NO: 12 expone una secuencia de ADN para la variante A04 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

SEQ ID NO: 13 expone una secuencia de ADN para la variante A05 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

SEQ ID NO: 14 expone una secuencia de ADN para la variante A12 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

SEQ ID NO: 15 expone una secuencia de ADN para la variante A22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

SEQ ID NO: 16 expone una secuencia de ADN para la variante B02 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

SEQ ID NO: 17 expone una secuencia de ADN para la variante B03 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

SEQ ID NO: 18 expone una secuencia de ADN para la variante B09 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

SEQ ID NO: 19 expone una secuencia de ADN para la variante B22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

SEQ ID NO: 20 expone una secuencia de ADN para la variante B24 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

SEQ ID NO: 21 expone una secuencia de ADN para la variante B44 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

La SEQ ID NO: 22 expone una secuencia de ADN para un cebador directo, mostrado en el Ejemplo 2.

La SEQ ID NO: 23 expone una secuencia de ADN para un cebador inverso, mostrado en el Ejemplo 2.

La SEQ ID NO: 24 expone una secuencia de ADN para un cebador directo, mostrado en el Ejemplo 2, Tabla 1. La SEQ ID NO: 25 expone una secuencia de ADN para un cebador inverso, mostrado en el Ejemplo 2, Tabla 1.

La SEQ ID NO: 26 expone una secuencia

e ADN para un cebador directo, mostrado en el Ejemplo 2, Tabla 1. La SEQ ID NO: 27 expone una secuencia

e ADN para un cebador inverso, mostrado en el Ejemplo 2, Tabla 1. La SEQ ID NO: 28 expone una secuencia de ADN para un tallo de Gly/Ser, mostrado en el Ejemplo 4.

La SEQ ID NO: 29 expone la secuencia de aminoácidos para un tallo de Gly/Ser, mostrado en el Ejemplo 4, que está codificado por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 28.

La SEQ ID NO: 30 expone una secuencia de ADN para un tallo de Gly/Ser, mostrado en el Ejemplo 4.

La SEQ ID NO: 31 expone la secuencia de aminoácidos para un tallo de Gly/Ser, mostrado en el Ejemplo 4, que está codificado por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 30.

La SEQ ID NO: 32 expone una secuencia de ADN para un tallo de Gly/Ser, mostrado en el Ejemplo 4.

La SEQ ID NO: 33 expone la secuencia de aminoácidos para un tallo de Gly/Ser, que está codificado por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 32 y la SEQ ID NO: 34.

La SEQ ID NO: 34 expone una secuencia de ADN para un tallo de Gly/Ser, mostrado en el Ejemplo 4.

La SEQ ID NO: 35 expone una secuencia de ADN para el extremo N de la variante B01 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 5.

La SEQ ID NO: 36 expone una secuencia de ADN para el extremo N de la variante B44 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 5.

La SEQ ID NO: 37 expone una secuencia de ADN para el extremo N de la variante A05 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 5.

La SEQ ID NO: 38 expone una secuencia de ADN para el extremo N de la variante A22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 5.

La SEQ ID NO: 39 expone una secuencia de ADN para el extremo N de la variante B22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 5.

La SEQ ID NO: 40 expone una secuencia de ADN para el extremo N de la variante A19 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 5.

La SEQ ID NO: 41 expone una secuencia de ADN para el extremo N de una variante de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 6.

La SEQ ID NO: 42 expone una secuencia de ADN para el extremo N de la variante A22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 6.

La SEQ ID NO: 43 expone una secuencia de ADN sometida a optimización de codones para el gen B44 de la variante de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón que codifica una cisteína en N-terminal está delecionado, en comparación con la SEQ ID NO: 11. El plásmido pDK087 incluye la SEQ ID NO: 43.

La SEQ ID NO: 44 expone la secuencia de aminoácidos para una variante B44 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, no lipidada. La SEQ ID NO: 44 es idéntica a la SEQ ID NO: 21, en la que la cisteína en N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 21 se ha delecionado. La SEC ID 44 está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 43.

La SEQ ID NO: 45 expone una secuencia de ADN sometida a optimización de codones para el gen B09 de la variante de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón que codifica una cisteína en N-terminal está delecionado y en la que la secuencia incluye codones que codifican una región de Gly/Ser adicional, en comparación con la SEQ ID NO: 8. El plásmido pEB063 incluye la SEQ ID NO: 45.

La SEQ ID NO: 46 expone una secuencia de ADN sometida a optimización de codones para el gen B09 de la variante de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón que codifica una cisteína en N-terminal está delecionado, en comparación con la SEQ ID NO: 8. El plásmido pEB064 incluye la SEQ ID NO: 46.

La SEQ ID NO: 47 expone una secuencia de ADN sometida a optimización de codones para el gen B09 de la variante de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón que codifica una cisteína en N-terminal está delecionado, en comparación con la SEQ ID NO: 8. El plásmido pEB065 incluye la SEQ ID NO: 47.

La SEQ ID NO: 48 expone una secuencia de ADN para el gen B09 de la variante de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón que codifica una cisteína en N-terminal está delecionado, en comparación con la SEQ ID NO: 8. El plásmido pLa134 incluye la SEQ ID NO: 48.

La SEQ ID NO: 49 expone la secuencia de aminoácidos para la variante B09 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, no lipidada. La SEQ ID NO: 49 es idéntica a la SEQ ID NO: 18 en la que la cisteína en N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 18 está delecionada. La SEC ID 49 está codificada por, por ejemplo, una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y la SeQ ID NO: 48.

La SEC ID 50 expone la secuencia de aminoácidos para la variante B09 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón que codifica una cisteína en N-terminal está delecionado y en la que la secuencia incluye codones que codifican una región de Gly/Ser adicional, en comparación con la SEQ ID NO: 18. La SEC ID 50 está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 45.

La SEQ ID NO: 51 expone una secuencia de ADN para el gen de la variante B44 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón que codifica una cisteína en N-terminal está delecionado, en comparación con la SEQ ID NO: 11. El plásmido pLN056 incluye la SEQ ID NO: 51.

La SEQ ID NO: 52 expone una secuencia de ADN para el extremo N de la variante B22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 6.

La SEQ ID NO: 53 expone una secuencia de ADN para el extremo N de la variante B09 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que se muestra en la Figura 6.

La SEQ ID NO: 54 expone una secuencia de ADN para un gen de la variante A05 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón que codifica una cisteína en N-terminal está delecionado, en comparación con la SEQ ID NO: 2.

La SEQ ID NO: 55 expone la secuencia de aminoácidos para una variante A05 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, no lipidada. La SEQ ID NO: 55 es idéntica a la SEQ ID NO: 13 en la que la cisteína en N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 13 está delecionada. La SEC ID 55 está codificada por, por ejemplo, la SEQ ID NO: 54.

La SEQ ID NO: 56 expone la secuencia de aminoácidos de una secuencia de repetición serina-glicina, mostrada en el Ejemplo 7.

La SEQ ID NO: 57 expone la secuencia de aminoácidos para una variante B01 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, no lipidada. La SEQ ID NO: 57 es idéntica a la SEQ ID NO: 58 en la que la cisteína en N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 58 está delecionada.

La SEQ ID NO: 58 expone la secuencia de aminoácidos para la variante B01 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

La SEQ ID NO: 59 expone una secuencia de aminoácidos para la variante B15 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

La SEQ ID NO: 60 expone una secuencia de aminoácidos para la variante B16 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, que incluye una Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1.

La SEQ ID NO: 61 expone una secuencia de ADN para la variante B22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón para la Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1 de la SEQ ID NO: 19 está reemplazado por un codón para una glicina.

La SEQ ID NO: 62 expone la secuencia de aminoácidos para la variante B22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que la Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1 de la SEQ ID NO: 19 está reemplazada por una glicina.

La SEQ ID NO: 63 expone una secuencia de ADN para la variante B22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que el codón para la Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1 de la SEQ ID NO: 15 está reemplazado por un codón para una glicina.

La SEQ ID NO: 64 expone la secuencia de aminoácidos para la variante B22 de 2086 de N. meningitidis, serogrupo B, en la que la Cys en N-terminal en la posición aminoacídica 1 de la SEQ ID NO: 15 está reemplazada por una glicina.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que los que se entienden habitualmente por un experto en la técnica a la que esta invención pertenece. Aunque en la práctica o prueba de la presente invención se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, más adelante se describen procedimientos y materiales adecuados. Los materiales, procedimientos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no están destinados a ser limitantes.

Cabe señalar que en la presente divulgación, términos como "comprende", "comprendido", "comprende", "contiene", "contener" y similares se refieren a la inclusión de un ingrediente particular o conjunto de ingredientes sin excluir ningún otro ingrediente. Expresiones como "consistiendo esencialmente en" y "consiste esencialmente en" permiten la inclusión de ingredientes o etapas adicionales que no restan valor a las características de la invención, las expresiones "consistiendo en" y "consiste en" se refieren a la inclusión de un ingrediente o conjunto de ingredientes en particular y la exclusión de todos los demás ingredientes.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, las formas del singular “un”, “uno” y “el/la” incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, referencias al “procedimiento” incluyen uno o más procedimientos, y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o que llegarán a ser evidentes para el experto en la técnica tras la lectura de esta divulgación etc.

Como se usa en el presente documento, las formas en plural incluyen referencias en singular, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, referencias a “los procedimientos” incluyen uno o más procedimientos y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o que serán evidentes para un experto en la técnica tras la lectura de esta divulgación y así sucesivamente.

Como se usa en el presente documento, “aproximadamente” significa dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor tal como un intervalo de concentración indicado, de un marco de tiempo, de peso molecular, de temperatura o de pH. Dicho intervalo puede estar dentro de un orden de magnitud, normalmente, dentro del 20 %, más normalmente todavía dentro del 10 % e incluso más normalmente dentro del 5 % de un valor o intervalo dado. La variación permitida abarcada por el término “aproximadamente” dependerá del sistema en concreto en estudio y un experto en la técnica lo apreciará fácilmente. Siempre que se cite un intervalo en esta solicitud, cada número entero dentro del intervalo también se contempla como una realización de la invención.

El término “adyuvante” se refiere a un compuesto o mezcla que potencia la respuesta inmunitaria a un antígeno como se describe y pone de ejemplo adicionalmente en el presente documento. Ejemplos no limitantes de adyuvantes que se pueden usar en la vacuna de la presente invención incluyen el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), alumbre, geles minerales tales como gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, tales como, por ejemplo, adyuvantes completos o incompletos de Freund, copolímero de bloque (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif ), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A u otra fracción de saponina, monofosforil lípido A y adyuvante de lípido avridina-amina.

Un “anticuerpo” es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, tal como un hidrato de carbono, polinucleótido etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, a menos que el contexto indique lo contrario, con el término se pretende abarcar no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también anticuerpos sometidos a manipulación (p. ej., quiméricos, humanizados y/o derivatizados para alterar las funciones efectoras, la estabilidad y otras actividades biológicas) y fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), anticuerpos de cadena simple (ScFv) y anticuerpos de dominio, incluidos los anticuerpos de tiburón y de camélido) y proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos siempre que exhiban la actividad biológica deseada) y fragmentos de anticuerpos como se han descrito en el presente documento y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento antigénico. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA o IgM (o una subclase de las mismas) y el anticuerpo no tiene que ser de ninguna clase concreta. En función de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden además dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2 en seres humanos. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien.

“Fragmentos de anticuerpo” comprenden solo una porción de un anticuerpo intacto, en el que la porción retiene preferentemente, al menos una, preferentemente la mayoría o todas, de las funciones asociadas normalmente con dicha porción cuando está presente en un anticuerpo intacto.

El término “antígeno” generalmente se refiere a una molécula biológica, normalmente una proteína, péptido, polisacárido, lípido o conjugado que contiene al menos un epítopo al que un anticuerpo afín se pueden unir de forma selectiva; o en algunos casos a una sustancia inmunógena que puede estimular la producción de anticuerpos o respuestas de linfocitos T, o ambos, en un animal, incluidas las composiciones que se inyectan o absorben en un animal. La respuesta inmunitaria se puede generar a la molécula completa o a una o diversas porciones de la molécula (p. ej., un epítopo o hapteno). El término se puede usar para hacer referencia a una molécula individual o a una población homogénea o heterogénea de moléculas antigénicas. Un antígeno se reconoce por los anticuerpos, receptores de linfocitos T u otros elementos de inmunidad humoral y/o celular específica. El término “antígeno” incluye todos los epítopos antigénicos relacionados. Epítopos de un antígeno dado se pueden identificar usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J. Por ejemplo, los epítopos lineales se pueden determinar mediante, por ejemplo, síntesis concurrente de un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, en los que los péptidos corresponden a las porciones de la molécula proteica y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos siguen unidos a los soportes. Dichas técnicas se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.°: 4.08.871; Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De forma similar, los epítopos conformacionales se pueden identificar determinando la conformación espacial de los aminoácidos tal como por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Además, para los fines de la presente invención un “antígeno” también se puede usar para hacer referencia a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (en general de naturaleza conservadora, pero que pueden ser no conservadoras), en la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la capacidad de provocar una respuesta inmunológica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como por medio de mutagénesis dirigida de sitio, o mediante procedimientos sintéticos concretos o mediante un enfoque de ingeniería genérica, o pueden ser accidentales, tal como mediante mutaciones de huéspedes, que producen los antígenos. Además, el antígeno se puede derivar, obtener o aislar de un microbio, por ejemplo una bacteria, o puede ser un organismo entero. De forma similar, en la definición también se incluye un oligonucleótido o polinucleótido, que expresa un antígeno, tal como en aplicaciones de inmunización con ácido nucleico. Los antígenos sintéticos también están incluidos, por ejemplo poliepítopos, epítopos flanqueantes y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente (Bergmann y col. (1993) Eur. J. Immunol. 23:27772781; Bergmann y col. (1996) J. Immunol. 157:3242 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402 408; Gardner y col. (1998) Duodécima Conferencia Mundial del SIDA, Ginebra, Suiza, 28 de junio-3 de julio de 1998).

La expresión sustituciones “conservadoras” de aminoácidos puede realizarse sobre la base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, triptófano y metionina; aminoácidos polares/neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; (c) aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas realizaciones, los cambios de aminoácidos conservadores alteran la secuencia primaria de los polipéptidos ORF2086, pero no alteran la función de la molécula. Al generar estos mutantes se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. Generalmente en la técnica se entiende la importancia del índice hidropático de los aminoácidos a la hora de conferir la función biológica interactiva en un polipéptido (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157(1):105-32). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y seguir dando como resultado un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y características de carga. Dichos índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina ( 0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Se cree que el carácter hidropático relativo del residuo de aminoácido determina la estructura secundaria y terciaria del polipéptido resultante, que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos y similares. En la técnica se sabe que un aminoácido se puede sustituir por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y seguir dando como resultado un polipéptido funcionalmente equivalente. Al realizar dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de 2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de 1 y se prefieren todavía más particularmente aquellos dentro de 0,5.

También se pueden realizar sustituciones o inserciones conservadoras de aminoácidos sobre la base de la hidrofilicidad. Como se ha descrito en la patente de EE.UU. N.°: 4.554.101 la mayor hidrofilicidad media local de un polipéptido, según se dirige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica del polipéptido. La patente de EE.UU. N.°: 4.554.101 cita que los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 3); glutamato (+3 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina ( 1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse con otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y aún obtener un polipéptido biológicamente equivalente y en particular, inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de 2; se prefieren particularmente aquellos que están dentro de 1; y se prefieren todavía más particularmente aquellos dentro de 0,5. Sustituciones ejemplares que tienen en cuenta diversas de las características anteriores se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen, sin limitación: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

La expresión "cantidad inmunógena eficaz” como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad de un polipéptido o composición que comprende un polipéptido que es eficaz en la producción de una respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado. Por ejemplo, una cantidad inmunógena eficaz de una proteína rLP2086 de la presente invención es una cantidad que es eficaz en la producción de una respuesta inmunitaria en un huésped vertebrado. La “dosis o cantidad inmunógena eficaz” concreta dependerá de la edad, el peso y el estado médico del huésped, así como del procedimiento de administración. Las dosis adecuadas se determinan fácilmente por los expertos en la técnica.

El término “tallo de Gly/Ser”, como se usa en el presente documento se refiere a la serie de residuos de Gly y Ser inmediatamente aguas abajo del residuo de Cys en N-terminal de una proteína codificada por ORF2086. Puede haber entre 5 y 12 residuos de Gly y Ser en el tallo de Gly/Ser. De acuerdo con ello, el tallo de Gly/Ser consiste en los aminoácidos 2 a entre 7 y 13 de la proteína codificada por ORF2086. Preferentemente, el tallo de Gly/Ser consiste en los aminoácidos 2 y hasta entre 7 y 13 de la proteína codificada por ORF2086. Los tallos de Gly/Ser de las variantes de P0286 de la presente invención están representados por las secuencias subrayadas en la Figura 2 (SEQ ID NO: 12-21). Como se muestra en el presente documento, la longitud del tallo de Gly/Ser puede afectar a la estabilidad o al nivel de expresión de una variante de P2086 no lipidada. En una realización de ejemplo, los efectos de afectar a la longitud del tallo de Gly/Ser se comparan con los de la variante de tipo silvestre correspondiente. El término "inmunógeno” se refiere a la capacidad de un antígeno o una vacuna para producir una respuesta inmunitaria humoral o celular, o ambas.

Una “cantidad inmunógena” o una “cantidad inmunológicamente eficaz” o “dosis”, cada uno de los cuales se usa de forma intercambiable en el presente documento, se refiere generalmente a la cantidad de antígeno o composición inmunógena suficiente para producir una respuesta inmunitaria, bien una respuesta celular (linfocito T) o bien humoral (linfocito B o anticuerpo), o bien ambas, según se mide medida mediante ensayos estándar conocidos por el experto en la técnica.

El término “composición inmunógena” se refiere a cualquier composición farmacéutica que contiene un antígeno, por ejemplo un microorganismo, o un componente del mismo, composición que se puede usar para producir una respuesta inmunitaria en un sujeto. Las composiciones inmunógenas de la presente invención se pueden usar para tratar a un ser humano susceptible a la infección por N. meningitidis, administrando las composiciones inmunógenas por medio de una vía transdérmica sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), intradérmica (i.d.) o subcutánea; aplicación mediante un parche u otro dispositivo de liberación transdérmica; o mediante administración mucosa en los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. En una realización, la composición inmunógena se puede usar en la fabricación de una vacuna o en la provocación de anticuerpos policlonales o monoclonales que se podrían usar para proteger de forma pasiva o para tratar a un sujeto.

Cantidades óptimas de componentes para una composición inmunógena concreta se pueden determinar mediante estudios convencionales que implican observación de respuestas inmunitarias adecuadas en los sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente. El término “aislado" significa que el material se elimina de su entorno original (p. ej., el entorno natural si se da en la naturaleza o del organismo huésped si es una entidad recombinante, o tomado de un entorno a un entorno diferente). Por ejemplo, una proteína o péptido “aislado” está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que la proteína deriva o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente o, de otro modo, están presentes en una mezcla como parte de una reacción química. En la presente invención, las proteínas pueden aislarse de la célula bacteriana o de residuos celulares, de modo que se proporcionan en una forma útil en la fabricación de una composición inmunógena. El término “aislado” o “que aísla” puede incluir purificar, o purificación, incluyendo por ejemplo, los procedimientos de purificación de las proteínas, como se describen en el presente documento. La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de un polipéptido o proteína en la que el polipéptido o proteína está separado de los componentes celulares de las células de las que se aísla o produce de forma recombinante. Por tanto, una proteína o péptido sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones del polisacárido, proteína o péptido de la cápsula que tiene menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2,5 % o 1 % (en peso seco) de proteína o polisacárido u otro material celular contaminante. Cuando el polipéptido/proteína se produce de forma recombinante, está también preferentemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparación proteica. Cuando el polipéptido o proteína se produce mediante síntesis química, preferentemente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir está separado de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína o polisacárido. De acuerdo con ello, dichas preparaciones del polipéptido o la proteína tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (en peso seco) de precursores químicos u otros compuestos distintos al polipéptido/proteína o fragmento polisacarídico de interés.

La expresión “cola N-terminal” tal como se usa en el presente documento se refiere a la porción N-terminal de una proteína codificada por ORF2086, que fija la proteína a la membrana celular. En la parte inferior de la estructura en vista lateral de la Figura 3 se muestra una cola N-terminal. Normalmente una cola N-terminal comprende 16 aminoácidos N-terminales de la proteína codificada por ORF2086. En algunas realizaciones, la cola N-terminal está formada por los aminoácidos 1-16 de una cualquiera de las SEQ ID NO: 12-21. El término "ORF2086" como se usa en el presente documento se refiere al marco de lectura abierto 2086 de una bacteria de la especie Neisseria. El ORF2086 de Neisseria, las proteínas codificadas por el mismo, los fragmentos de dichas proteínas y las composiciones inmunógenas que comprenden dichas proteínas se conocen en la técnica y se describen en por ejemplo el documento WO2003/063766 y en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. N.°: US 20060257413 y US 20090202593.

El término “P2086” se refiere en general a la proteína codificada por ORF2086. La “P” antes de “2086” es una abreviatura de “proteína”. Las proteínas P2086 de la divulgación pueden ser lipidadas o no lipidadas. “LP2086” y “P2086” se refieren normalmente a formas lipidadas y no lipidadas de una proteína 2086, respectivamente. La proteína P2086 de la divulgación puede ser recombinante. “rLp2086” y “rP2086” se refieren, normalmente, a formas lipidadas y no lipidadas de una proteína 2086 recombinante, respectivamente. “2086” también se conoce como proteína de unión al factor H (fHBp) debido a su capacidad para unirse al factor H.

Como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluya todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, compatibles con la administración a seres humanos u otros huéspedes vertebrados. Normalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable es un vehículo autorizado por una agencia reguladora de un gobierno estatal, un gobierno federal, u otra agencia reguladora o indicada en la Farmacopea de EE.UU. o en otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales, incluidos seres humanos así como mamíferos no humanos. El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, conservante o vehículo con el que se administra la composición farmacéutica. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen en petróleo, animal, vegetal o sintético. Como vehículos líquidos se pueden emplear agua, soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada desecada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede también contener cantidades menores de agentes humectantes, voluminizadores, emulsionantes o tamponadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, formulaciones de liberación sostenida y similares. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. La formulación deberá adaptarse al modo de administración. El vehículo adecuado será evidente para los expertos en la técnica y dependerá en gran parte de la vía de administración.

Una respuesta inmunológica "protectora" se refiere a la capacidad de una composición inmunógena para provocar una respuesta inmunológica, bien humoral o bien celular, que sirve para proteger al sujeto de una infección. La protección proporcionada no tiene que ser absoluta, es decir, no se tiene que evitar o erradicar totalmente la infección, si hay una mejora estadísticamente significativa en comparación con una población control de sujetos, por ejemplo animales infectados a los que no se ha administrado la vacuna o la composición inmunógena. La protección se puede limitar a mitigar la gravedad o la rapidez del inicio de los síntomas de la infección. En general, una “respuesta inmunitaria protectora” incluiría la inducción de un incremento de los niveles de anticuerpos específicos de un antígeno concreto en al menos el 50 % de los sujetos, incluido algún nivel de respuestas de anticuerpos funcionales medibles a cada antígeno. En situaciones concretas, una “respuesta inmunitaria protectora” podría incluir la inducción de un incremento por dos de los niveles de anticuerpos o un incremento por cuatro de los niveles de anticuerpos específicos para un antígeno concreto en al menos el 50 % de los sujetos, incluido algún nivel de respuestas de anticuerpos funcionales medibles a cada antígeno. En ciertas realizaciones, los anticuerpos opsonizantes se correlacionan con una respuesta inmunitaria protectora. Por tanto, la respuesta inmunitaria protectora se puede analizar midiendo la disminución en porcentaje del recuento bacteriano en un ensayo de actividad bactericida en suero (ABS) o un ensayo de opsonofagocitosis, por ejemplo como los descritos más adelante. Dichos ensayos también se conocen en la técnica. Por ejemplo, para las vacunas meningocócicas el ensayo de ABS es un sustituto establecido para la protección. En algunas realizaciones existe una disminución del recuento bacteriano de al menos 10 %, 25 %, 50 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más, en comparación con el recuento bacteriano en ausencia de la composición inmunógena.

Los términos “proteína”, “polipéptido” y “péptido” se refieren a un polímero de residuos aminoacídicos y no están limitados a una longitud mínima del producto. Por tanto, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares están incluidos dentro de la definición. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas están dentro de la definición. Los términos también incluyen modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (en general de naturaleza conservadora, pero que pueden ser no conservadoras), en una secuencia nativa, preferentemente tales que la proteína mantiene la capacidad de provocar una respuesta inmunológica dentro de un animal al que se administra la proteína. También se incluyen las modificaciones postexpresión, por ejemplo glucosilación, acetilación, lipidación, fosforilación y similares.

El término “recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteína polipéptido o célula que expresa un gen de interés producido por procedimientos de ingeniería genética. El término “recombinante”, como se usa con respecto a una proteína o polipéptido quiere decir un polipéptido producido mediante la expresión de un polinucleótido recombinante. Las proteínas de la presente divulgación se pueden aislar de una fuente natural o producirse mediante procedimientos de ingeniería genética. “Recombinante”, como se usa en el presente documento, describe además una molécula de ácido nucleico, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociada con nada o con una porción del polinucleótido con el que está asociada en la naturaleza. El término “recombinante”, como se usa con respecto a una célula huésped quiere decir una célula huésped que incluye un polinucleótido recombinante.

El término “estabilizante” se refiere a un compuesto que se une a un antígeno y mantiene los epítopos o la inmunorreactividad del antígeno durante un periodo de tiempo. Los estabilizantes se conocen en la técnica. Ejemplos de estabilizantes incluyen cationes multivalentes, por ejemplo de calcio o aluminio.

El término "sujeto" se refiere a un mamífero, ave, pez, reptil o cualquier otro animal. El término “sujeto” también incluye seres humanos. El término “sujeto” también incluye mascotas domésticas. Ejemplos no limitantes de mascotas domésticas incluyen: perros, gatos, cerdos, conejos, ratas, ratones, jerbos, hámsters, cobayas, hurones, aves, serpientes, lagartijas, peces, tortugas y ranas. El término “sujeto” también incluye animales de ganado. Ejemplos no limitantes de animales de ganado incluyen: alpacas, bisontes, camellos, ganado vacuno, ciervos, cerdos, caballos, llamas, mulas, burros, ovejas, cabras, conejos, renos, yaks, pollos, gansos y pavos.

El término “mamíferos”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier mamífero, tal como, por ejemplo, seres humanos ratones, conejos, primates no humanos. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.

Los términos "vacuna" o "composición de vacuna", que se usan de forma intercambiable, se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una composición inmunógena que induce una respuesta inmunitaria en un sujeto.

Descripción general

La presente invención surge del descubrimiento novedoso de que formulaciones y programas de dosificación concretos de variantes no lipidadas de P2086 producen mayores valoraciones de anticuerpos bactericidas que formulaciones anteriores de P2086, tal como se describe en, por ejemplo, Fletcher y col., Infection & Immunity. Vol.

72(4):2088-2100 (2004). Como alternativa, la presente invención surge del descubrimiento novedoso de que formulaciones y programas de dosificación concretos de variantes no lipidadas de P2086 producen mayores valoraciones de anticuerpos bactericidas que las formulaciones disponibles comercialmente de variantes de LP2086 lipidadas. No obstante, cabe destacar que las formulaciones comerciales de LP2086 lipidada pueden no estar disponibles en la actualidad. Se observaron mayores tasas de respuesta (definida por un incremento de cuatro veces o más de las valoraciones de ABS sobre el valor basal) para la vacuna que contiene la variante de rP2086 no lipidada en comparación con la vacuna de rLP2086 lipidada. La formulación de la variante de P2086 no lipidada produjo anticuerpos bactericidas contra un espectro más amplio de cepas, incluidas las cepas con secuencias tanto similares (ID > 92 %) como diferentes (ID < 92 %) de LP2086.

La presente invención también identifica dificultades previamente no identificadas que expresan variantes de P2086 no lipidadas y proporciona procedimientos para superar estas dificultades y composiciones novedosas de las mismas. Aunque construcciones de plásmidos que codifican variantes de P2086 no lipidadas proporcionaban expresión fuerte de las variantes no lipidadas, estas variantes estaban piruviladas en la Cys N-terminal. La piruvilación previene o reduce la probabilidad de fabricar consistencia o uniformidad de los polipéptidos. Los inventores descubrieron además que la deleción de la Cys N-terminal de las secuencias variantes de P2086 no lipidada evitaba la piruvilación de las variantes de P2086 no lipidadas. Los intentos de superar la piruvilación mediante deleción del codón para la Cys N-terminal anularon la expresión o dieron como resultado la expresión de variantes insolubles. Como alternativa, la eliminación de la Cys N-terminal de las variantes de P2086 no lipidadas disminuyó la expresión en algunas variantes. No obstante, sorprendentemente, los inventores descubrieron que al menos las variantes A05, B01, B09 y B44 no lipidadas no piruviladas se pueden expresar a pesar de la deleción del residuo de Cys en N-terminal. En general, estos polipéptidos se podían expresar sin modificaciones adicionales aparte de la deleción de Cys, en comparación con la correspondiente secuencia no lipidada de tipo silvestre. Véanse, por ejemplo, los ejemplos 2 y 4. Además, los inventores descubrieron que las variantes no lipidadas no piruviladas eran sorprendentemente inmunógenas e inesperadamente producían anticuerpos bactericidas.

De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación proporciona dos procedimientos para superar o reducir la probabilidad de estas dificultades a la hora de expresar variantes no lipidadas. No obstante, en la presente divulgación se contemplan procedimientos adicionales. El primer procedimiento era variar la longitud del tallo de Gly/Ser en la cola N-terminal inmediatamente aguas abajo de la Cys N-terminal. El segundo procedimiento era la optimización por codón dentro de la cola N-terminal. No obstante, en la presente divulgación se contempla la optimización de codones adicionales. Estos procedimientos proporcionan expresión potenciada de las variantes de P2086 no lipidadas solubles. Por ejemplo, en una realización, la expresión potenciada de las variantes de P2086 no lipidadas solubles se compara con la expresión de las variantes no lipidadas de tipo silvestre correspondientes. Polipéptidos aislados

Sorprendentemente, los inventores han descubierto polipéptidos de ORF2086 no lipidados, no piruvilados aislados. Los inventores han descubierto además que los polipéptidos son, inesperadamente, inmunógenos y capaces de producir una respuesta inmunitaria bactericida.

Como se usa en el presente documento, el término “no piruvilado” se refiere a un polipéptido que no tiene contenido de piruvato. Los polipéptidos de ORF2086 no lipidados que tienen un contenido de piruvato normalmente exhibían un desplazamiento de la masa de 70, en comparación con el correspondiente polipéptido de tipo silvestre. En un caso, el polipéptido de la invención no exhibe un desplazamiento de la masa de 70 en comparación con el correspondiente polipéptido no lipidado de tipo silvestre cuando se mide mediante espectrometría de masas. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 10.

En otro caso, el polipéptido de ORF2086 no lipidado, no piruvilado, aislado incluye una deleción de un residuo de cisteína N-terminal en comparación con el correspondiente polipéptido de ORF2086 no lipidado de tipo silvestre. El término “cisteína en N-terminal” se refiere a una cisteína (Cys) en el extremo N-terminal o en la cola N-terminal de un polipéptido. Más específicamente, “cisteína en N-terminal”, como se usa en el presente documento, se refiere a una cisteína en el extremo N-terminal en la que están lipidadas las lipoproteínas LP2086 con una cola del lípido tripalmitoílo, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, cuando se hace referencia a una cualquiera de las SEC ID N.°s: 12-21 como secuencia de referencia, la cisteína en N-terminal está localizada en la posición 1.

La expresión “polipéptido de ORF2086 no lipidado de tipo silvestre” o “polipéptido de 2086 no lipidado de tipo silvestre” o “polipéptido no lipidado de tipo silvestre” se refiere a un polipéptido de ORF2086 que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ORF2086 lipidado maduro correspondiente que se encuentra en la naturaleza. La única diferencia entre las moléculas no lipidadas y lipidadas es que el polipéptido de ORF2086 no lipidado de tipo silvestre no está lipidado con una cola del lípido tripalmitoílo en la cisteína en N-terminal.

Como se conoce en la técnica, la forma 2086 no lipidada se produce mediante una proteína que carece de la secuencia líder original o mediante una secuencia líder que está sustituida con una porción de secuencia que no especifica un sitio para la acilación de ácidos grasos en una célula huésped. Véase, por ejemplo, el documento WO2003/063766.

Ejemplos de ORF2086 no lipidados incluyen no solo un polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo silvestre recién descrito sino también polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de una cualquiera de SEC ID N.°s: 12-21 en las que la cisteína en N-terminal está delecionada y los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de SEC ID N.°s: 12-21 en las que la cisteína en N-terminal está sustituida. Ejemplos adicionales de un polipéptido de ORF2086 no lipidado incluyen secuencias aminoacídicas seleccionadas de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 64.

Ejemplos de un polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo silvestre incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de SEC ID N.°s: 12-21, mostradas en la Figura 2, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60. Estos polipéptidos de ORF2086 no lipidados de tipo silvestre incluyen una Cys en N-terminal.

Como se usa en el presente documento, por ejemplo, un polipéptido B44 “no lipidado” incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 21 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada y SEQ ID NO: 44. Un polipéptido B44 “no lipidado de tipo silvestre” incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21. Un polipéptido B44 “no lipidado no piruvilado” incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 21 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada y SEQ ID NO: 44.

Como otro ejemplo, como se usa en el presente documento, un polipéptido B09 “no lipidado” incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 18 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50. Un polipéptido B09 “no lipidado de tipo silvestre” incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18. Un polipéptido B09 “no lipidado no piruvilado” incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 18 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50.

Como otro ejemplo adicional, como se usa en el presente documento, un polipéptido A05 “no lipidado” incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada y SEQ ID NO: 55. Un polipéptido A05 “no lipidado de tipo silvestre” incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13. Un polipéptido A05 “no lipidado no piruvilado” incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada y SEQ ID NO: 55.

El término “deleción” de la Cys en N-terminal como se usa en el presente documento incluye una mutación que deleciona la Cys en N-terminal, en comparación con una secuencia polipeptídica no lipidada de tipo silvestre. Por ejemplo, una “deleción” de la Cys en N-terminal se refiere a una eliminación del aminoácido Cys a partir de una secuencia de referencia, por ejemplo, a partir de la secuencia de tipo silvestre correspondiente, dando como resultado de este modo un decrecimiento de un residuo aminoacídico según se compara con la secuencia de referencia.

En otra realización, la Cys en N-terminal está sustituida por un aminoácido que no es un residuo de Cys. Por ejemplo, en una realización ejemplar, la Cys N-terminal en la posición 1 de SEC ID N.°s: 12-21 incluye una sustitución C^-G en la posición 1. Véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 62 según se compara con SEQ ID NO: 19 (tipo silvestre de B22) y SEQ ID NO: 64 según se compara con SEQ ID NO: 15 (tipo silvestre de A22). Los aminoácidos de ejemplo para reemplazar la Cys en N-terminal incluyen cualquier aminoácido que no sea Cys, preferentemente un aminoácido no cargado polar tal como, por ejemplo, glicina. En una realización preferida, la sustitución se hace con residuo no conservador para Cys.

Sorprendentemente, los inventores han descubierto que la expresión de polipéptidos de ORF2086 no lipidados que tienen una deleción de un residuo de Cys en N-terminal tuvo como resultado una piruvilación no detectable cuando se midió mediante espectrometría de masas, en comparación con el correspondiente polipéptido de ORF2086 no lipidado de tipo silvestre. Ejemplos de polipéptidos de ORF2086 no lipidados no piruvilados incluyen los que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12 (A04), SEQ ID NO: 13 (A05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24) y la SEQ ID NO: 21 (B44), en las que la cisteína en la posición 1 está delecionada. Ejemplos adicionales de polipéptidos de ORF2086 no lipidados no piruvilados aislados incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44, la S^eQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50 y la SEQ ID NO: 55. Preferentemente, el polipéptido 2086 no lipidado no piruvilado incluye al menos aproximadamente 250, 255, o 260 aminoácidos consecutivos y como máximo, aproximadamente 270, 269, 268, 267, 266, 265, 264, 263, 260, 259, 258, 257, 256 o 255 aminoácidos consecutivos. Cualquier valor mínimo se puede combinar con un valor máximo para definir un intervalo. Más preferentemente, el polipéptido tiene al menos 254 o 262 aminoácidos consecutivos.

En una realización, el polipéptido de ORF2086 no lipidado no piruvilado aislado está codificado por una secuencia nucleotídica que está operativamente unida a un sistema de expresión, en el que el sistema de expresión se puede expresar en una célula bacteriana. En una realización de ejemplo, la secuencia de nucleótidos está unida a una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia nucleotídica.

En la técnica se conocen sistemas de expresión adecuados, secuencias reguladoras y células bacterianas. Por ejemplo, se puede usar cualquier vector de expresión plasmídico, por ejemplo, PET™ (Novogen, Madison Wis.) o PMAL™ (New England Biolabs, Beverly, Mass.), siempre que el polipéptido pueda expresarse en una célula bacteriana. Preferentemente, se usa el vector PET™ para clonación y expresión de proteínas recombinantes en E. coli en el sistema PET™, el gen clonado se puede expresar sometido al control de un promotor del fago T7. Células bacterianas de ejemplo incluyen Pseudomonas fluorescens y preferentemente, E. coli.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido de ORF2086 no lipidado no piruvilado que se puede obtener mediante un procedimiento. Preferentemente el polipéptido está aislado. La divulgación se refiere además a composiciones que incluyen un polipéptido de ORF2086 no lipidado no piruvilado que se puede obtener mediante un procedimiento. Preferentemente la composición es una composición inmunógena. El procedimiento incluye expresar una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19, la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 21, en el que la cisteína en la posición 1 está delecionada. La secuencia nucleotídica que está operativamente unida a un sistema de expresión que se puede expresar en una célula bacteriana. En un caso, el procedimiento incluye expresar una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 44, la SeQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50 y la SEQ ID NO: 55. En otro caso, la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 51, la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 48, la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 54. Preferentemente, la célula bacteriana es E. coli.

En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición que incluye un primer polipéptido aislado, que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49 y un segundo polipéptido aislado, que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 44. En un caso preferido, los polipéptidos son inmunógenos. En otro caso preferido, la composición incluye además un polipéptido de ORF2086 de la subfamilia A de N. meningitidis del serogrupo B. Preferentemente, el polipéptido de ORF2086 de la subfamilia A es un polipéptido de ORF2086 de la subfamilia A no piruvilado y no lipidado. En un caso de ejemplo, el polipéptido de ORF2086 de la subfamilia A es A05, ejemplos del cual incluyen, por ejemplo, la SEQ ID NO: 13, en la que la cisteína en N-terminal en la posición 1 está delecionada y la SEQ ID NO: 55.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para producir un polipéptido aislado. El procedimiento incluye expresar en una célula bacteriana un polipéptido, que incluye una secuencia que tiene una identidad superior al 90 % con la SEC ID N 21, incluyendo dicha secuencia al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 13-18 de la s Eq ID NO: 21, los aminoácidos 21-34 de SEQ ID NO: 21 y los aminoácidos 70-80 de SEQ ID NO: 21 o una combinación de los mismos, en el que la secuencia carece de una cisteína en N-terminal. El procedimiento incluye además purificar el polipéptido. El polipéptido producido en este procedimiento incluye un polipéptido de ORF2086 no piruvilado no lipidado. Preferentemente, el polipéptido es inmunógeno. En un caso preferido, la célula bacteriana es E. coli.

Ejemplos de polipéptidos que incluyen al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 13-18 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 21-34 de SEQ ID NO: 21 y los aminoácidos 70-80 de SEQ ID NO: 21, o una combinación de los mismos, incluyen la SEQ ID NO: 12 (A04), la SEQ ID NO: 13 (A05), la SEQ ID NO: 14 (A12), la SEQ ID NO: 15 (A22), la SEQ ID NO: 16 (B02), la SEQ ID NO: 17 (B03), la SEQ ID NO: 18 (B09), la SEQ ID NO: 19 (B22), la SEQ ID nO: 20 (B24) y la SEQ ID NO: 21 (B44). Preferentemente la cisteína en la posición 1 de estos polipéptidos está delecionada. Otros ejemplos de polipéptidos incluyen la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50 y la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 62 y la SEQ ID NO: 64.

En un caso de ejemplo, la secuencia polipeptídica aislada incluye además al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 96-116 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 158-170 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 172-185 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 187-199 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 213-224 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 226-237 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 239-248 de SEQ ID NO: 21 o una combinación de los mismos. Ejemplos de polipéptidos que incluyen al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 13-18 de la S^eQ ID N^o: 21, los aminoácidos 21-34 de SEQ ID NO: 21 y los aminoácidos 70-80 de SEQ ID NO: 21, o una combinación de los mismos e incluyen además al menos un dominio seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 96-116 de la SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 158-170 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 172-185 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 187-199 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 213-224 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 226-237 de SEQ ID NO: 21, los aminoácidos 239-248 de SEQ ID NO: 21, o una combinación de las mismas, incluyen la SEQ ID NO: 16 (B02), la SEQ ID NO: 17 (B03), la SEQ ID NO: 18 (B09), la SEQ ID NO: 19 (B22), la SEQ ID NO: 20 (B24) y la SEQ ID NO: 21 (B44). Preferentemente la cisteína en la posición 1 de estos polipéptidos está delecionada. Otros ejemplos de polipéptidos incluyen un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 44, la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50 y la SEQ ID NO: 55 y la SEQ ID NO: 62.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado producido por un procedimiento descrito en el presente documento. En un caso, el polipéptido aislado es un polipéptido no lipidado no piruvilado. En otro aspecto, la divulgación se refiere a una composición inmunógena producida por un procedimiento descrito en el presente documento.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18 en la que la cisteína en N-terminal en la posición 1 está delecionada o la SEQ ID NO: 49. Las secuencias nucleotídicas de ejemplo que codifican la SEQ ID NO: 49 incluyen secuencias seleccionadas de la SEQ ID NO: 46, la SEQ ID NO: 47 y la SeQ ID NO: 48. Preferentemente, la secuencia nucleotídica es la SEQ ID NO: 46. En un aspecto, la divulgación se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que incluye la SEQ ID NO: 46. En un aspecto, la divulgación se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que incluye la SEQ ID NO: 47. En un aspecto, la divulgación se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que incluye la SEQ ID NO: 48.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un plásmido que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada de la SEQ ID N^o: 46, la SEQ ID NO: 47, la SEQ ⁱD NO: 48 y la SEQ ID NO: 45, en el que el plásmido se puede expresar en una célula bacteriana. En la técnica se conocen sistemas de expresión adecuados, secuencias reguladoras y células bacterianas, como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, la célula bacteriana es E. coli.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50. En un caso de ejemplo, la SeQ ID NO: 50 está codificada por la SEQ ID NO: 45.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21, en la que la Cys en N-terminal está delecionada o la SEQ ID NO: 44. Las secuencias nucleotídicas de ejemplo que codifican la SEQ ID NO: 44 incluyen secuencias seleccionadas de la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 51. Preferentemente, la secuencia nucleotídica es la SEQ ID NO: 43. En un aspecto, la divulgación se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que incluye la SEQ ID NO: 43.

Composiciones inmunógenas

En un caso preferido, las composiciones descritas en el presente documento que incluyen un polipéptido ORF2086 no lipidado no piruvilado aislado son inmunógenas. Las composiciones inmunógenas que incluyen una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria meningitidis ORF2086 se conocen en la técnica. Las composiciones inmunógenas ejemplares incluyen las descritas en el documento WO2003/063766 y los números de publicaciones de solicitud de patente US 20060257413 y US 20090202593. Tales composiciones inmunógenas descritas aquí incluyen una proteína que muestra actividad bactericida identificada como proteína ORF2086, sus partes inmunógenas, y/o sus equivalentes biológicos. La proteína ORF2086 se refiere a una proteína codificada por un marco abierto de lectura 2086 de Neisseria species.

La proteína puede ser una proteína recombinante o una proteína aislada de la especie nativa de Neisseria. Por ejemplo, proteínas ORF2086 de Neisseria se pueden aislar de cepas bacterianas, tales como las especies de Neisseria, que incluyen cepas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E), Neisseria gonorrhoeae y Neisseria lactamica, así como partes inmunógenas y/o equivalentes biológicos de dichas proteínas. Las proteínas ORF2086 incluyen proteínas 2086 de la subfamilia A y proteínas de la subfamilia B, sus partes inmunógenas, y/o sus equivalentes biológicos. Las proteínas 2086 de la subfamilia A y las proteínas de la subfamilia B 2086 se conocen en la técnica, véase, por ejemplo Fletcher y col., 2004 citado anteriormente y Murphy y col., J Infect Dis. 1 de agosto de 2009; 200(3):379-89. Véase también el documento WO2003/063766, que divulga las SEC ID N.°s: 260 a 278 en este documento como representantes de las secuencias de secuencias de aminoácidos asociadas a las proteínas de la Subfamilia A 2086. Además, se describen en el documento WO2003/063766 las SEC ID N.°s: 279 a 299 en este documento como representantes de las secuencias de aminoácidos asociadas a las proteínas de la Subfamilia 2086 B. El documento WO2003/063766 se incorpora en el presente documento por referencia. Las proteínas ORF2086 o sus equivalentes, etc. pueden estar lipidadas o no lipidadas. Preferiblemente, la proteína ORF2086 de Neisseria está no lipidada. De manera alternativa, las composiciones inmunógenas pueden ser combinaciones de proteínas ORF2086 lipidadas y no lipidadas.

En un caso, la composición inmunógena incluye una proteína aislada que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos a una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086. En un caso, la composición inmunógena incluye una proteína aislada que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína de la Subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086. Preferiblemente, la composición inmunógena incluye una proteína de la Subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086. En algunos casos, el polipéptido de la Subfamilia A ORF2086 es una variante A05, una A04, una A12, o una A22.

En algunas realizaciones, el Polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A es una variante A05, una A12, o una A22. En otro caso, la composición inmunógena incluye una proteína aislada que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína de la Subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086. Preferiblemente, la composición inmunógena incluye una proteína de la Subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086. En algunos casos, la proteína ORF2086 de la Subfamilia B es una variante B44, una B02, una B03, una B22, una B24 o una B09. En algunos casos, la proteína ORF2086 de la Subfamilia B es una variante B44, una B22, o una B09.

En un caso preferido, la composición inmunógena incluye un polipéptido no lipidado no piruvilado aislado que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína de la Subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086. Por ejemplo, en algunos casos, la proteína ORF2086 de la Subfamilia B es una B44 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 21; una B02 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 16; una B03 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 17; a B22 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 19; una B24 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 20; o una variante B09 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:18, en la que la Cys N-terminal está suprimida, o una combinación de las mismas.

Más preferiblemente, la composición inmunógena incluye un polipéptido B09 no lipidado no piruvilado, un polipéptido B44 no lipidado no piruvilado, o combinaciones de los mismos. En un caso, la composición incluye una variante B09 no lipidada no piruvilada que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:18, en la que Cys N-terminal está delecionada, una B44 no lipidada no piruvilada que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 21, en la que la Cys N-terminal está delecionada, o una combinación de las mismas. En otro caso, la composición inmunógena incluye una B09 no lipidada no piruvilada que tiene la SEQ ID NO: 49, una B44 no lipidada no piruvilada que tiene SEQ ID NO: 44, o una combinación de las mismas.

En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición inmunógena que incluye un polipéptido ORF2086 de subfamilia B del serogrupo B de N. meningitidis, en el que el polipéptido es un B44 no lipidado no piruvilado. EL B44 puede incluir la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 21, en la que la Cys N-terminal está delecionada o la SEQ ID NO: 44. En un caso, la composición además incluye un segundo polipéptido ORF2086 de la subfamilia B de N. meningitidis del serogrupo B, en el que el segundo polipéptido es un B09 no lipidado no piruvilado. El B09 puede incluir la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 18, en la que Cys N-terminal está suprimida, o la SEQ ID NO: 49. En un caso, la composición inmunógena es una vacuna.

En otro caso, la composición incluye no más de 3 polipéptidos ORF2086 de subfamilia B. En un caso adicional, la composición incluye no más de 2 polipéptidos ORF2086 de subfamilia B.

En un caso, la composición incluye además uno o más polipéptidos ORF2086 de subfamilia A. En un caso preferido, la composición incluye un polipéptido A05 de subfamilia A.

En aún otro caso, la composición inmunógena incluye una proteína aislada que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína de la subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086 y una proteína aislada que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína de la Subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086.

Preferiblemente, la composición inmunógena incluye una proteína aislada de la subfamilia A codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086 y una proteína aislada de la Subfamilia B codificada por una secuencia de nucleótidos de Neisseria ORF2086. Más preferiblemente, la composición inmunógena incluye un polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A no lipidado no piruvilado aislado y un polipéptido ORF2086 de la Subfamilia B no lipidado no piruvilado aislado. En algunos casos, el polipéptido ORF2086 de la subfamilia A es una variante A05, una A04, una A12, o una A22. En un caso preferido, el Polipéptido ORF2086 de la Subfamilia A es un A05 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la s Eq ID NO: 13; un A04 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 12; un A12 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 14; o una variante A22 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 15, en la que la Cys N-terminal está delecionada, o cualquiera de sus combinaciones. En algunos casos, la proteína ORF2086 de la Subfamilia B es una variante B44, una B02, una B03, una B22, una B24 o una B09. En un caso preferido, la proteína ORF2086 de la Subfamilia B es una B44 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 21; una B02 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 16; una B03 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 17; una B22 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:19; un B24 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 20; o una variante B09 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:18, en la que la Cys N-terminal está suprimida, o una combinación de las mismas.

En un caso, la composición inmunógena incluye una relación 1:1 de una proteína de la subfamilia A a una proteína de la Subfamilia B.

En otro aspecto, los polipéptidos aislados y las composiciones descritas en el presente documento inducen una respuesta inmune en un mamífero contra polipéptido ORF2086 de N. meningitidis de serogrupo B. Las composiciones tienen la capacidad de inducir los anticuerpos anti meningocócicos bactericidas después de la administración a un mamífero y en casos preferidos pueden inducir anticuerpos que son bactericidas contra cepas con las subfamilias respectivas. Información adicional sobre respuestas bactericidas se proporciona más adelante. Véase, por ejemplo, Ejemplos 6, 11, 12 y 13. Los anticuerpos bactericidas son un indicador de la protección en seres humanos y los estudios preclínicos sirven como un sustituto y cualquier candidata a composición inmunógena nueva debe inducir estos anticuerpos funcionales.

En un caso ejemplar, el polipéptido B09 no lipidado no piruvilado que tiene SEQ ID NO: 18 en el que Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada o SEQ ID NO: 49 y sus composiciones inmunógenas, induce anticuerpos bactericidas contra (por ejemplo, que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 de N. meningitidis de serogrupo B, subfamilia A o preferiblemente subfamilia B. Preferiblemente, el polipéptido B09 no lipidado no piruvilado y sus composiciones inmunógenas, induce los anticuerpos bactericidas contra la variante A05 (SEQ ID NO: 13); variante B44 (SEQ ID NO: 21); variante B16 (SEQ ID NO: 60); variante B24 (SEQ ID NO: 20); variante B09 (SEQ ID NO: 18), o una combinación de las mismas. En un caso ejemplar, el polipéptido el polipéptido B09 no lipidado no piruvilado y composiciones inmunógenas del mismo, inducen los anticuerpos bactericidas contra variante B44 (SEQ ID NO: 21); variante B16 (SEQ ID NO: 60); variante B24 (SEQ ID NO: 20); variante B09 (SEQ ID NO: 18), o una combinación de las mismas. Véanse, por ejemplo, Ejemplo 11, Ejemplo 12 y Ejemplo 13.

En otro caso ejemplar, el polipéptido B44 no lipidado no piruvilado que tiene SEQ ID NO: 21 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada o SEQ ID NO: 44 y sus composiciones inmunógenas, induce anticuerpos bactericidas contra (por ejemplo, que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 de N. meningitidis del serogrupo B, subfamilia B. Preferiblemente, el polipéptido B44 no lipidado no piruvilado B44 y sus composiciones inmunógenas, induce los anticuerpos bactericidas contra la variante B44 (SEQ ID NO: 21); variante B16 (SEQ ID NO: 60); variante B24 (SEQ ID NO: 20); variante B09 (SEQ ID NO: 18), o una combinación de las mismas. Véase, por ejemplo, Ejemplo 11. Adicionalmente el polipéptido B44 no lipidado no piruvilado y sus composiciones inmunógenas también pueden inducir anticuerpos bactericidas que se unen a la variante B02 (SEQ ID NO: 16). Véanse, por ejemplo, Ejemplo 12 y Ejemplo 13. Además, el polipéptido B44 no lipidado no piruvilado y sus condiciones inmunógenas también pueden inducir anticuerpos bactericidas que se unen a la variante B03 (SEQ ID NO: 17) y la variante B15 (SEQ ID NO: 59). Véase, por ejemplo, Ejemplo 6.

En un caso ejemplar adicional, el polipéptido B22 no lipidado no piruvilado aislado que tiene SEC I N.° 19 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada y sus composiciones inmunógenas, induce anticuerpos bactericidas contra (por ejemplo, que se pueden unir a) un polipéptido ORF2086 de Neisseria meningitidis del serogrupo B, subfamilia B. Preferentemente, el polipéptido B22 no lipidado no piruvilado induce anticuerpos bactericidas contra la variante B44 (SEQ ID NO: 21); la variante B16 (S^eQ ID NO: 60); la variante B24 (SEQ ID N^o: 20); la variante B09 (SEQ ID NO: 18) o una combinación de las mismas. Véase, por ejemplo, Ejemplo 13.

En un caso, el polipéptido A05 no lipidado no piruvilado aislado que tiene SEQ ID NO: 13 en la que Cys N-terminal está delecionada o SEQ ID NO: 55 y sus composiciones inmunógenas, induce anticuerpos bactericidas contra (por ejemplo, que se puede unir a) un polipéptido ORF2086 de N. meningitidis de serogrupo B, subfamilia A. Preferiblemente, el A05 no lipidado no piruvilado y sus composiciones inmunógenas, inducen anticuerpos bactericidas contra la variante A05 (SEQ ID NO: 13), variante A22 (SEQ ID NO: 15), variante A12 (SEQ ID NO: 14), o una combinación de las mismas. Véase, por ejemplo, Ejemplo 6 y 13.

En un caso, la divulgación se refiere a un procedimiento de inducir anticuerpos bactericidas específicos para N. meningitidis de serogrupo B en un mamífero. En un caso ejemplar, el procedimiento incluye anticuerpos que inducen bactericidas específicos para un ORF2086 de N. meningitidis de serogrupo B de subfamilia B, ORF2086 de N. meningitidis de serogrupo B de subfamilia A, o una combinación de los mismos. El procedimiento incluye la administración al mamífero de una cantidad eficaz de un polipéptido 2086 no lipidado no piruvilado o composición inmunógena del mismo, como se ha descrito anteriormente.

En un caso preferido, el procedimiento incluye la inducción de anticuerpos bactericidas específicos para un ORF2086 de N. meningitidis de serogrupo B de subfamilia B. El polipéptido aislado o composición inmunógena incluye un polipéptido B4 no lipidado no piruvilado. En otro caso preferido, la composición además incluye un polipéptido no piruvilado no lipidado B09. En un caso ejemplar el polipéptido aislado o composición inmunógena incluye SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 44, o una combinación de los mismos. En un caso preferido, el polipéptido aislado o composición inmunógena incluye SEQ ID NO: 18, en la que la Cys en N-terminal en la posición 1 está delecionada, SEQ ID NO: 21, en la que la Cys en N-terminal en la posición 1 está delecionada, o una combinación de las mismas. En todavía otro caso preferido, el polipéptido aislado o composición inmunógena incluye SEQ ID NO: 19, en la que la Cys en N-terminal en la posición 1 está delecionada.

En un caso preferido, el procedimiento incluye la inducción de anticuerpos bactericidas específicos para un ORF2086 de N. meningitidis de serogrupo B de subfamilia A. El polipéptido aislado o composición inmunógena incluye un polipéptido A05 no lipidado no piruvilado. En un caso preferido, el polipéptido aislado o composición inmunógena incluye SEQ ID NO: 13, en el que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada. En otro caso preferido, la composición además incluye un polipéptido B44 no lipidado no piruvilado. Veánse, por ejemplo, ejemplo 6 y 13. En un caso ejemplar, el polipéptido aislado o composición inmunógena incluye la SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 44, o una combinación de las mismas. En un caso preferido, el polipéptido aislado o composición inmunógena incluye SEQ ID NO: 13, en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida, SEQ ID NO: 21, en la que Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida una combinación de las mismas.

La composición inmunógena puede incluir una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de polinucleótidos ORF2086 de Neisseria, o sus equivalentes como el único inmunógeno activo en la composición inmunógena. De manera alternativa, la composición inmunógena puede además incluir inmunógenos activos, incluyendo otros polipéptidos inmunógenos de Neisseria sp., o proteínas inmunológicamente activas de uno o más patógenos diferentes microbianos (por ejemplo, virus, prion, bacteria, u hongo, sin limitación) o polisacárido capsular. Las composiciones pueden comprender una o más proteínas, fragmentos o compuestos farmacéuticos deseados según se desee para la indicación elegida.

Cualquier multi-antígeno o composición inmunógena multi-valente está contemplado por la presente divulgación. Por ejemplo, la composición inmunógena puede incluir combinaciones de dos o más proteínas ORF2086, una combinación de proteína ORF2086 con una o más proteínas Por A, una combinación de proteína ORF2086 con polisacáridos y/o conjugados de polisacáridos C, Y y W135 de meningococos de serogrupo A, una combinación de proteína ORF2086 con combinaciones de meningococos y neumococos, o una combinación de cualquiera de los anteriores en una forma adecuada para una administración deseada, por ejemplo, para distribución mucosal. Los expertos en la técnica serán capaces fácilmente de formular tales composiciones inmunológicas multi-antígeno o multi-valentes.

La presente divulgación también contempla regímenes multi-inmunización en los que cualquier composición útil contra un patógeno se puede combinar en ella o con las composiciones de la presente divulgación. Por ejemplo, sin limitación, a un paciente se le puede administrar la composición inmunógena de la presente divulgación y otra composición inmunológica para inmunizar contra el virus papilomavirus humano (HPV), tal como la vacuna HPV GARDASIL®, como parte de un régimen de multi-inmunización. Los expertos en la técnica serían capaces fácilmente de seleccionar composiciones inmunógenas para uso junto con composiciones inmunógenas de la presente divulgación con el propósito de desarrollar e implementar regímenes de multi-inmunización.

Los polipéptidos ORF2086, fragmentos y equivalentes se pueden usar como parte de una composición inmunógena conjugada; en la que una o más proteínas o polipéptidos se conjugan con un vehículo con el fin de generar una composición que tiene propiedades inmunógenas contra varios serotipos, o más exactamente, serogrupos de N. meningitidis, específicamente serogrupos de meningococos y/o contra varias enfermedades. De manera alternativa, uno de los polipéptidos ORF2086 se puede usar como una proteína vehículo para otros polipéptidos inmunógenos. La formulación de tales composiciones inmunógenas se conoce bien por los expertos en la técnica.

Las composiciones inmunógenas de la divulgación preferiblemente incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen cualquiera y todos los disolventes convencionales, medios de dispersión, cargas, vehículos sólidos, soluciones acuosas, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como sus combinaciones.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden además incluir cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o eficacia del anticuerpo. La preparación y uso de los vehículos farmacéuticamente aceptables se conoce bien en la técnica. Salvo en la medida en que el medio convencional o el agente sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones inmunógenas de la presente divulgación.

Composiciones inmunógenas se pueden administrar por vía parenteral, por ejemplo, por inyección, o bien por vía subcutánea o intramuscular, así como por vía oral o intranasal. Procedimientos para la inmunización intramuscular se describen por Wolff y col. Biotechniques;11 (4): 474 - 85, (1991) y por Sedegah y col. PNAS Vol. 91, p. 9866 -9870, (1994). Otros modos de administración emplean formulaciones orales, formulaciones pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas, por ejemplo, sin limitación. Las formulaciones orales, por ejemplo, incluyen excipientes normalmente empleados tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares, sin limitación. Preferiblemente, la composición inmunógena se administra por vía intramuscular.

Las composiciones inmunógenas de la presente divulgación pueden además comprender uno o más "inmunomoduladores" adicionales, que son agentes que perturban o alteran el sistema inmune, de manera que se observa bien la regulación hacia arriba o bien regulación hacia abajo de la inmunidad humoral y/o mediada por células. En un caso particular, se prefiere la regulación hacia arriba de los brazos humoral y/o mediado por células del sistema inmune. Ejemplos de ciertos inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, un adyuvante o citocina, o ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descrito en la patente de Estados Unidos N.°: 5.254.339 entre otros.

Ejemplos no limitantes de adyuvantes que se pueden usar en la vacuna de la presente divulgación incluyen el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), alumbre, geles minerales tales como gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tal como, por ejemplo, adyuvantes completos e incompletos de Freund, copolímero de bloque (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A u otra fracción de saponina, monofosforil lípido A y adyuvante lípido Avridina -amina. Los ejemplos no limitantes de emulsiones de aceite en agua útiles en la vacuna de la divulgación incluyen formulaciones modificadas de SEAM62 y SEAM 1/2. SEAM62 modificada es una emulsión de aceite en agua que contiene escualeno al 5 % (v/v) (Sigma), (v/v) detergente SPAN® 85 al 1 % (v/v) (ICI Surfactants), detergente polisorbato ® 80 al 0,7 % (ICI Tensioactivos), etanol al 2,5 % (v/v), 200 |jg/ml de Quil A, 100 jg/ml de colesterol y lecitina al 0,5 % (v/v). SEAM 1/2 modificado es una emulsión de aceite en agua que comprende escualeno al 5 % (v/v), detergente SPAN® 85 al 1 % (v/v), detergente polisorbato ® 80 al 0,7 % (v/v), etanol al 2,5 % (v/v), 100 jg/ml de Quil A y 50 jg/ml de colesterol.

Otros "inmunomoduladores" que se pueden incluir en la vacuna incluyen, por ejemplo, una o más interleucinas, interferones, u otras citocinas o quimiocinas conocidas. En un caso, el adyuvante puede ser un derivado de ciclodextrina o un polímero polianiónico, tal como los descritos en las Patentes de Estados Unidos números 6.165.995 y 6.610.310, respectivamente. Se ha de entender que el inmunomodulador y/o adyuvante a usar dependerá del sujeto al que la vacuna o composición inmunógena se administrará, de la vía de inyección y del número de inyecciones a proporcionar.

En algunos casos, el adyuvante es saponina. En algunos casos, la concentración de saponina está entre 1 jg/ml y 250 jg/ml; entre 5 jg/ml y 150 jg/ml; o entre 10 jg/ml y 100 jg/ml. En algunos casos, la concentración de saponina es aproximadamente 1 jg/ml; aproximadamente 5 jg/ml; aproximadamente 10 jg/ml; aproximadamente 20 jg/ml; aproximadamente 30 jg/ml; aproximadamente 40 jg/ml; aproximadamente 50 jg/ml; aproximadamente 60 jg/ml; aproximadamente 70 jg/ml; aproximadamente 80 jg/ml; aproximadamente 90 jg/ml; aproximadamente 100 jg/ml; aproximadamente 110 jg/ml; aproximadamente 120 jg/ml; aproximadamente 130 jg/ml; aproximadamente 140 jg/ml; aproximadamente 150 jg/ml; aproximadamente 160 jg/ml; aproximadamente 170 jg/ml; aproximadamente 180 jg/ml; aproximadamente 190 jg/ml; aproximadamente 200 jg/ml; aproximadamente 210 jg/ml; aproximadamente 220 jg/ml; aproximadamente 230 jg/ml; aproximadamente 240 jg/ml; o aproximadamente 250 jg/ml.

En ciertos casos preferidos, las proteínas de esta divulgación se usan en una composición inmunógena para la administración oral que incluye un adyuvante mucosal y se usa para el tratamiento o prevención de infección por N. meningitidis en un huésped humano. El adyuvante mucosal puede ser una toxina de cólera; sin embargo, preferiblemente, adyuvantes mucosales diferentes de la toxina de cólera que se puede usar de acuerdo con la presente divulgación incluyen derivados no tóxicos de una holotoxina de cólera, en la que la subunidad A es toxina de cólera mutagenizada, modificada químicamente, o proteínas relacionadas producidas por modificación de la secuencia de aminoácidos de la toxina de cólera. Para una toxina de cólera específica que puede ser particularmente útil en la preparación de composiciones inmunógenas de esta divulgación, véase la holotoxina de cólera mutante E29H, como se describe en la Solicitud Internacional Publicada WO 00/18434, que se incorpora por la presente en este documento en su totalidad. Estas se pueden añadir a, o conjugar con, los polipéptidos de esta divulgación. Se pueden aplicar las mismas técnicas a otras moléculas con adyuvante mucosal o propiedades de administración tales como toxina termolábil de Escherichia coli (LT).

Otros compuestos con adyuvante mucosal o actividad de administración se pueden usar tales como bilis; policationes tales como DEAE-dextrano y poliornitina; detergentes tales como dodecil benceno sulfato de sodio; materiales conjugados de lípidos; antibióticos tales como estreptomicina; vitamina A; y otros compuestos que alteran la integridad estructural o funcional de las superficies mucosales. También se pueden usar otros compuestos mucosalmente activos que incluyen derivados de estructuras microbianas tales como MDP; acridina y cimetidina. STIMULON™ QS-21, MPL e IL-12, como se ha descrito anteriormente.

Las composiciones inmunógenas de esta divulgación se pueden administrar en la forma de ISCOMS (complejos estimuladores inmunes), ISCOMS que contienen CTB, liposomas o encapsulados en compuestos tales como acrilatos o poli(DL-lactida-co-glucósido) para formar microesferas de un tamaño adecuado a la adsorción. Las proteínas de esta divulgación también se pueden incorporar en emulsiones oleosas.

Una cantidad (es decir, dosis) de composición inmunógena que se administra al paciente se puede determinar de acuerdo con técnicas convencionales para los expertos en la técnica, teniendo en consideración factores tales como el antígeno particular, el adyuvante (si está presente), la edad, sexo, peso, especie, condición del paciente particular y la vía de administración.

Por ejemplo, una dosificación para un paciente adolescente humano puede incluir al menos 0,1 |jg, 1 |jg, 10 |jg, o 50 |jg de una proteína ORF2086 de Neisseria y al menos 80 jg, 100 jg, 150 jg, o 200 jg de una proteína ORF2086 de Neisseria. Cualquier valor mínimo y cualquier valor máximo se puede combinar para definir un intervalo adecuado. Adyuvantes

Composiciones inmunógenas como se describen en el presente documento comprenden, en ciertos casos, uno o más adyuvantes. Un adyuvante es una sustancia que potencia la respuesta inmune cuando se administra conjuntamente con un inmunógeno o antígeno. Se ha mostrado que un número de citocinas o linfocinas tienen actividad moduladora inmune y de este modo son útiles como adyuvantes, incluyendo, pero sin limitación, las interleucinas 1-a, 1-p, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Número: 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes); los interferones-a, p y y; factor estimulante de la colonia de macrófagos - granulocitos (GM-CSF) (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.°: 5.078.996 y Número de acceso de ATCC 39900); factor estimulante de la colonia de macrófagos (M-CSF); factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF); y los factores de necrosis tumoral a y p.

Aún otros adyuvantes que son útiles con las composiciones inmunógenas descritas en el presente documento incluyen quimiocinas, incluyendo sin limitación, MCP-1, MIP-1a, MIP-1p y RANTES; moléculas de adhesión, tales como una selectina, por ejemplo, L-selectina, P-selectina y E-selectina; moléculas del tipo mucina, por ejemplo, CD34, GliCAM-1 y MadCAM-1; un miembro de la familia de integrinas tal como LFA-1, VlA-1, Mac-1 y p150.95; un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas tal como PECAM, ICAM, por ejemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3; moléculas coestimuladoras tales como B7-1, B7-2, CD40 y CD40L; factores de crecimiento que incluyen factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, PDGF, BL-1 y factor de crecimiento vascular endotelial; moléculas receptoras que incluyen Fas, receptor TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6; y Caspasa (ICE).

Otros adyuvantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a hidróxido de aluminio; fosfato de aluminio; STIMULON™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.); MPL™ (monofosforil lípido A 3-O-desacilatdo; Corixa, Hamilton, Mont.), 529 (un compuesto amino alquil glucosamina fosfato, Corixa, Hamilton, Mont.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.); GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Wash.); N-acetil-muramil-L-teronil-D-isoglutamina (thr-MDP); N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, denominada como nor-MDP); N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi-etilamina) (CGP 19835A, denominada MTP-PE); y toxina de cólera. En ciertos casos preferidos, el adyuvante es QS-21.

Los adyuvantes ejemplares adicionales incluyen derivados no tóxicos de la toxina de cólera, incluyendo su subunidad A, y/o conjugados o fusiones modificadas por ingeniería genética del polipéptido de N. meningitidis con toxina de cólera o su subunidad B (“CTB”), procoleragenoide, polisacáridos fúngicos, incluyendo esquizofilano, muramil dipéptido, derivados de muramil dipéptido (“MDP”), ésteres de forbol, la toxina termolábil de E. coli, polímeros de bloque o saponinas.

Se ha usado fosfato de aluminio como adyuvante en un ensayo clínico de fase 1 hasta una concentración de 0,125 mg/dosis, mucho menor que el límite de 0,85 mg/dosis especificado por el Código de Estados Unidos de las Regulaciones Federales [610.15(a)]. Los adyuvantes que contienen aluminio se usan ampliamente en seres humanos para potenciar la respuesta inmune de antígenos cuando se administran por vía intramuscular o subcutánea. En algunos casos, la concentración de aluminio en la composición inmunógena está entre 0,125 pg/ml y 0,5 |jg/ml; entre 0,20 |jg/ml y 0,40 |jg/ml; o entre 0,20 |jg/ml y 0.30 |jg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de aluminio en la composición inmunógena es aproximadamente 0,125 jig/ml; aproximadamente 0,15 jig/ml; aproximadamente 0,175 jig/ml; aproximadamente 0,20 jig/ml; aproximadamente 0,225 jig/ml; aproximadamente 0,25 jig/ml; aproximadamente 0,275 jig/ml; aproximadamente 0,30 jig/ml; aproximadamente 0,325 jig/ml; aproximadamente 0,35 jig/ml; aproximadamente 0,375 jig/ml; aproximadamente 0,40 jig/ml; aproximadamente 0,425 jig/ml; aproximadamente 0,45 jig/ml; aproximadamente 0,475 jig/ml; o aproximadamente 0,50 jig/ml.

En un caso preferido, la concentración de aluminio en la composición inmunógena está entre 0,125 jig/ml y 0,5 jig/ml; entre 0,20 jig/ml y 0,40 jig/ml; o entre 0,20 jig/ml y 0.30 jig/ml. En algunas realizaciones, la concentración de aluminio en la composición inmunógena es aproximadamente 0,125 jig/ml; aproximadamente 0,15 jig/ml; aproximadamente 0,175 jig/ml; aproximadamente 0,20 jig/ml; aproximadamente 0,225 jig/ml; aproximadamente 0,25 jig/ml; aproximadamente 0,275 jig/ml; aproximadamente 0,30 jig/ml; aproximadamente 0,325 jig/ml; aproximadamente 0,35 jig/ml; aproximadamente 0,375 jig/ml; aproximadamente 0,40 jig/ml; aproximadamente 0,425 jig/ml; aproximadamente 0,45 jig/ml; aproximadamente 0,475 jig/ml; o aproximadamente 0,50 jig/ml.

Los adyuvantes adecuados usados para potenciar una respuesta inmune incluyen además, sin limitación, MPL™ (monofosforil lípido A 3-O-desacilado, Corixa, Hamilton, MT), que se describe en la patente de Estados Unidos N.°: 4.912.094. También adecuados para uso como adyuvantes son análogos sintéticos de lípido A compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), o sus derivados o análogos, que están disponibles de Corixa (Hamilton, MT) y que se describen en la patente de Estados Unidos N.°: 6.113.918. Tal AGP es 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoioxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glu-copiranósido, que también se conoce como 529 (anteriormente conocido como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa (AF) o como una emulsión estable (SE).

Además, otros adyuvantes incluyen muramil péptidos, tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1'-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforil-oxi)-etilamina (MTP-PE); emulsiones aceite en agua, tales como MF59 (Patente de Estados Unidos N.°: 6.299.884) (que contiene 5 % de Escualeno, 0,5 % de polisorbato 80 y 0,5 % de Span 85 (que opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP-PE) formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidificador tal como microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA)) y SAF (que contiene 10 % de Escualeno, 0,4 % de polisorbato 80, 5 % de polímero bloqueado por plurónico L121 y thr-MDP, bien microfluidificados en una emulsión de partículas submicrométricas o bien agitados en aparato de vórtex para generar una emulsión de tamaño de partículas mayor); adyuvante incompleto de Freund (IFA); sales de aluminio (alumbre), tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio; Anfígeno; Avridina; L121/escualeno; D-lactida-poliláctido/glucósido; polioles plurónicos; Bordetella muerta; saponinas, tales como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descritas en la Patente de Estados Unidos N.°: 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descritas en la Patente de Estados Unidos N.°: 5.254.339 y complejos inmunoestimulantes (ISCOMATRIX); Mycobacterium tuberculosis; lipopolisacáridos bacterianos; polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.°: 6.207.646); IC-31 (Intercell AG, Viena, Austria), descritos en las Patentes Europeas números. 1.296.713 y 1.326.634; una toxina pertúsica (PT) o mutante de la misma, una toxina de cólera o mutante de la misma (por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos números 7.285.281, 7.332.174, 7.361.355 y 7.384.640); o una toxina termolábil de E. coli (LT) o su mutante, particularmente LT-K63, LT-R72 (por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos números 6.149.919, 7.115.730 y 7.291.588).

Procedimientos de producción de antígenos no lipidados P2086

En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de producción de un polipéptido ORF2086 no piruvilado no lipidado. El procedimiento incluye la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ORF2086 en el que la cisteína N-terminal está delecionada según se compara con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre correspondiente y en el que la secuencia de nucleótidos está unida de manera operativa a un sistema de expresión que es capaz de expresarse en una célula bacteriana. Polisacáridos ejemplares producidos por el procedimiento incluyen cualquier polipéptido descrito en el presente documento. Por ejemplo, preferiblemente, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12; la SEQ ID NO: 13; la SEQ ID NO: 14; la SEQ ID NO: 15; la SEQ ID NO: 16; la SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; la SEQ ID NO: 19; la SEQ ID NO: 20; la SEQ ID NO: 21, en el que la cisteína en la posición 1 está delecionada, según se compara con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre correspondiente. Polipeptidos adicionales ejemplares incluyen un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos ejemplares seleccionadas de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, S^eQ ⁱD NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SeQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 64. El procedimiento incluye adicionalmente purificar el polipéptido.

En algunos casos, la divulgación proporciona un procedimiento para producir antígenos P2086 solubles no lipidados que comprende las etapas de clonación de la secuencia de ácidos nucleicos de la variante de ORF2086 en un vector de expresión de E. coli sin una secuencia de lipidación de control, que transforma las bacterias E. coli con el vector de expresión de ORF2086, que induce la expresión y aislamiento de la proteína P2086 expresada. En algunos casos, la expresión se induce con IPTG.

En algunos casos, el codón para la Cys N-terminal de la variante ORF2086 está delecionada. Ejemplos de tales codones incluyen TGC. En algunos casos, el codón para la Cys N-terminal de la variante ORF2086 se muta mediante mutagénesis puntual para generar un codón de Ala, Gly, o Val. En algunos casos, los codones Ser y Gly se añaden a la cola N-terminal de la variante ORF2086 para extender el tallo Gly/Ser inmediatamente aguas abajo de la Cys N-terminal. En algunos casos, el número total de restos Gly y Ser dentro del tallo Gly/Ser es al menos 7, 8, 9, 10, 11, o 12. En algunos casos, el codón para la Cys N-terminal está suprimido. En algunos casos, los restos N-terminales 7, 8, 9, 10, 11, o 12 son bien Gly o bien Ser.

En algunos casos, los codones de la cola N-terminal de la variante de ORF2086 no lipidada se optimizan mediante mutagénesis puntual. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante de ORF2086 no lipidada se optimiza para estar pareja con la cola N-terminal de la variante B09. En algunos casos, los codones de la cola N-terminal de la variante ORF2086 se optimizan mediante mutagénesis puntual tal que el codón que codifica el quinto aminoácido de la variante ORF2086 es 100 % idéntico a los nucleótidos 13-15 de la SEQ ID NO: 8 y el codón que codifica el decimotercero aminoácido de la variante ORF2086 es 100 % idéntico a los nucleótidos 37 - 39 de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante no lipidada de ORF2086 se optimiza de manera que los 45 ácidos nucleicos en 5' son 100 % idénticos a los ácidos nucleicos 1-45 de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante no lipidada de ORF2086 se optimiza de manera que los 39 ácidos nucleicos 5' son 100 % idénticos a los ácidos nucleicos 4-42 de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante no lipidada de ORF2086 se optimiza de manera que los 39 ácidos nucleicos en 5' son 100 % idénticos a los ácidos nucleicos 4-42 de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante no lipidada de P2086 comprende al menos una sustitución de aminoácido comparada con los aminoácidos 1 -15 de la SEQ ID NO: 18. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante no lipidada de P2086 comprende dos sustituciones de aminoácidos comparado con los aminoácidos 1-15 de la SEQ ID NO: 18. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante no lipidada de P2086 comprende al menos una sustitución de aminoácidos comparada con los aminoácidos 2 - 15 de la SEQ ID NO: 18. En algunos casos, la cola N-terminal de la variante no lipidada de P2086 comprende dos sustituciones de aminoácidos comparada con los aminoácidos 2-15 de la SEQ ID NO: 18. En algunos casos, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas.

En algunos casos, los codones de la variante no lipidada se han optimizado para incrementar la expresión. La optimización de codón se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Sastalla y col., Applied and Environmental Microbiology, vol. 75(7): 2099 - 2110 (2009) y Coleman y col., Science, vol. 320: 1784 (2008). En algunos casos, la optimización de codón incluye el emparejamiento de la utilización de una secuencia de aminoácidos con la frecuencia de codón del organismo huésped elegido aunque se incluyen y/o excluyen secuencias de ADN específicas. En algunos casos, la optimización de codón además incluye la minimización de la estructura de ARNm secundaria correspondiente para reducir los impedimentos de traducción. En algunas realizaciones, la cola N-terminal se ha optimizado por codón para que comprenda cualquiera de las SEQ ID NO: 28, 30, 32 y 34. En algunos casos, el tallo Gly/Ser se ha optimizado por codón para que comprenda cualquiera de las SEQ ID NO: 28, 30, 32 y 34.

Con el fin de que esta invención se pueda entender mejor, se establecen los siguientes ejemplos. Los ejemplos son solamente para el propósito de ilustración y no se consideran como limitantes del alcance de la invención.

Formulaciones de composiciones inmunógenas

En determinados casos, las composiciones inmunógenas de la divulgación comprenden además al menos uno de un coadyuvante, un tampón, un crioprotector, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un inhibidor de oxidación de radicales libres, un diluyente o un vehículo.

Las composiciones inmunógenas de la divulgación pueden comprender además uno o más conservantes además de una pluralidad de antígenos de proteínas meningocócicos y conjugados de proteínas con polisacáridos capsulares. La FDA requiere que los productos biológicos en viales de dosis múltiple (multidosis) contengan un conservante, solo con unas pocas excepciones. Los productos de vacuna que contienen conservantes incluyen vacunas que contienen cloruro de bencetonio (ántrax), 2-fenoxietanol (DTaP, HepA, Lyme, Polio (parenteral)), fenol (Pneumo, Typhoid (parenteral), Vaccinia) y timerosal (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Rabia). Los conservantes aprobados para su uso en fármacos inyectables incluyen, por ejemplo, clorobutanol, m-cresol, metilparabeno, propilparabeno, 2-fenoxietanol, cloruro de bencetonio, cloruro de benzalconio, ácido benzoico, alcohol bencílico, fenol, timerosal y nitrato de fenilmercurio.

Las formulaciones de la divulgación pueden comprender además uno o más de un tampón, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un crioprotector tal como un azúcar y un antioxidante tal como un eliminador de radicales libres o un agente quelante, o cualquier combinación múltiple de los mismos. La elección de un componente cualquiera, por ejemplo, un quelante, puede determinar si es deseable o no otro componente (por ejemplo, un eliminador de radicales). La composición final formulada para administración debe ser estéril y/o estar libre de pirógenos. El experto puede determinar empíricamente qué combinaciones de estos y de otros componentes serán óptimas para su inclusión en el conservante que contiene composiciones inmunógenas de la divulgación dependiendo de una diversidad de factores tales como el almacenamiento particular y las condiciones de administración requeridas.

En determinados casos, una formulación de la divulgación que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más tampones fisiológicamente aceptables seleccionados de, pero sin limitarse a, Tris (trimetamina), fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidina y succinato. En determinados casos, la formulación se tampona dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0, preferentemente desde aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,4.

En determinados casos, puede ser deseable ajustar el pH de la composición inmunógena o de la formulación de la divulgación. El pH de una formulación de la divulgación se puede ajustar usando técnicas estándar en la técnica. El pH de la formulación se puede ajustar para que esté entre 3,0 y 8,0. En determinados casos, el pH de la formulación puede estar, o se puede ajustar para que esté, entre 3,0 y 6,0, 4,0 y 6,0, o 5,0 y 8,0. En otros casos, el pH de la formulación puede estar, o se puede ajustar para que sea, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,8, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,5, o aproximadamente 8,0. En determinados casos, el pH puede estar, o se puede ajustar para que esté, en un intervalo desde 4,5 hasta 7,5, o desde 4,5 hasta 6,5, desde 5,0 hasta 5,4, desde 5,4 hasta 5,5, desde 5,5 hasta 5,6, desde 5,6 hasta 5,7, desde 5,7 hasta 5,8, desde 5,8 hasta 5,9, desde 5,9 hasta 6,0, desde 6,0 hasta 6,1, desde 6,1 hasta 6,2, desde 6,2 hasta 6,3, desde 6,3 hasta 6,5, desde 6,5 hasta 7,0, desde 7,0 hasta 7,5 o desde 7,5 hasta 8,0. En un caso específico, el pH de la formulación es aproximadamente de 5,8.

En determinados casos, una formulación de la divulgación que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más cationes divalentes, incluyendo pero sin limitarse a MgCh, CaCh y MnCh, a una concentración que varía desde aproximadamente 0,1 mM hasta aproximadamente 10 mM, siendo preferida de hasta aproximadamente 5 mM.

En determinados casos, una formulación de la divulgación que es compatible con la administración parenteral comprende una o más sales, incluyendo pero sin limitarse a cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio y sulfato de potasio, presentes a una fuerza iónica que es fisiológicamente aceptable para el sujeto sobre la administración parenteral e incluidas en una concentración final para producir una fuerza iónica u osmolaridad seleccionada en la formulación final. La fuerza iónica u osmolalidad final de la formulación se determinará por múltiples componentes (por ejemplo, iones de compuesto(s) de tamponación y otras sales no tamponantes. Una sal preferida, NaCl, está presente en un intervalo de hasta aproximadamente 250 mM, seleccionándose las concentraciones de sal para complementar otros componentes (por ejemplo, azúcares) de modo que la osmolaridad total final de la formulación sea compatible con la administración parenteral (por ejemplo, inyección intramuscular o subcutánea) y promoverá la estabilidad a largo plazo de los componentes inmunógenos de la formulación de composición inmunógena sobre diversos intervalos de temperatura. Las formulaciones libres de sal tolerarán un incremento en los intervalos del uno o más crioprotectores seleccionados hasta mantener los niveles de osmolaridad final deseada.

En determinados casos, una formulación de la divulgación que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más crioprotectores seleccionados de pero sin limitarse a disacáridos (por ejemplo, lactosa, maltosa, sacarosa o trehalosa) y polihidroxihidrocarburos (por ejemplo, dulcitol, glicerol, manitol y sorbitol).

En determinados casos, la osmolaridad de la formulación está en un intervalo de desde aproximadamente 200 mOs/l hasta aproximadamente 800 mOs/l, con un intervalo preferido de desde aproximadamente 250 mOs/l hasta aproximadamente 500 mOs/l, o de aproximadamente 300 mOs/l - aproximadamente 400 mOs/l. Una formulación libre de sal puede contener, por ejemplo, desde aproximadamente un 5 % hasta aproximadamente un 25 % de sacarosa y preferentemente desde aproximadamente un 7 % hasta aproximadamente un 15 %, o de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 12 % de sacarosa. De forma alternativa, una formulación libre de sal puede contener, por ejemplo, desde aproximadamente un 3 % hasta aproximadamente un 12 % de sorbitol y preferentemente desde aproximadamente un 4 % hasta un 7 %, o de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 6 % de sorbitol. Si se añade una sal, tal como cloruro de sodio, entonces se disminuye relativamente el intervalo efectivo de sacarosa o sorbitol. Estas y otras consideraciones de osmolalidad y osmolaridad se conocen bien en la técnica.

En determinados casos, una formulación de la divulgación que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más inhibidores de oxidación de radicales libres y/o agentes quelantes. En la técnica se conoce una diversidad de eliminadores y quelantes de radicales libres y se aplican a las formulaciones y a los procedimientos de uso descritos en el presente documento. Ejemplos incluyen pero no se limitan a etanol, EDTA, una combinación de EDTA/etanol, trietanolamina, manitol, histidina, glicerol, citrato de sodio, hexafosfato de inositol, tripolifosfato, ácido ascórbico/ascorbato, ácido succínico/succinato, ácido málico/maleato, Desferal, EDDHA y DTPA y diversas combinaciones de dos o más de los anteriores. En determinados casos, se puede añadir al menos un eliminador de radicales libres no reductor a una concentración que potencie eficazmente la estabilidad a largo plazo de la formulación. También se pueden añadir uno o más inhibidores de oxidación de radicales libres/quelantes en diversas combinaciones, tales como un eliminador de radicales y un catión divalente. La elección del quelante determinará si se necesita o no la adición de un eliminador de radicales.

En determinados casos, una formulación de la divulgación que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más tensioactivos no iónicos, incluyendo pero sin limitarse a ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitán, Polioxisorbato-80 (Tween 80), Polioxisorbato-60 (Tween 60), Polioxisorbato-40 (Tween 40) y Polioxisorbato-20 (Tween 20), alquil éteres de polioxietileno, incluyendo pero sin limitarse a Brij 58, Brij 35, así como otros tales como Tritón X-100; Tritón X-114, NP40, Span 85 y la serie Pluronic de tensioactivos no iónicos (por ejemplo, Pluronic 121), con componentes preferidos Polioxisorbato-80 a una concentración desde aproximadamente un 0,001 % hasta aproximadamente un 2 % (siendo preferido hasta aproximadamente un 0,25 %) o Polioxisorbato-40 a una concentración desde aproximadamente un 0,001 % hasta un 1 % (siendo preferido hasta aproximadamente un 0,5 %).

En determinados casos, una formulación de la divulgación comprende uno o más agentes estabilizadores adicionales adecuados para la administración parenteral, por ejemplo, un agente reductor que comprende al menos un grupo tiol (-SH) (por ejemplo, cisteína, N-acetilcisteína, glutatión reducido, tioglucolato de sodio, tiosulfato, monotioglicerol, o mezclas de los mismos). De forma alternativa u opcionalmente, formulaciones de composiciones inmunógenas que contienen conservantes de la divulgación se pueden estabilizar además retirando el oxígeno de los recipientes de almacenamiento, protegiendo la formulación de la luz (por ejemplo, usando recipientes de vidrio ámbar).

Las formulaciones de composiciones inmunógenas que contienen conservantes de la divulgación pueden comprender uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, lo que incluye cualquier excipiente que no induzca por sí mismo una respuesta inmunitaria. Los excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a macromoléculas tales como proteínas, sacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa (Paoletti y col., 2001, Vacuna, 19:2118), trehalosa, lactosa y agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas). Tales vehículos se conocen bien por los expertos en la técnica. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se discuten, por ejemplo, en Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, ISBN:0683306472.

Las composiciones de la divulgación pueden ser liofilizadas o en forma acuosa, es decir soluciones o suspensiones. Las formulaciones líquidas se pueden administrar de forma ventajosa directamente desde su forma envasada y por tanto son ideales para la inyección sin la necesidad de su reconstrucción en medio acuoso como se requiere en cambio para composiciones liofilizadas de la divulgación.

Se puede llevar a cabo la administración directa de composiciones inmunógenas de la presente divulgación a un sujeto por administración parenteral (por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, o en el espacio intersticial de un tejido); o por administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auricular, pulmonar o mucosal diferente. En un caso preferido, la administración parenteral es por inyección intramuscular, por ejemplo, en el muslo o en la parte superior del brazo del sujeto. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero alternativamente se puede usar una inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml. Las composiciones de la divulgación se pueden preparar de varias formas, por ejemplo, para inyección como soluciones o bien suspensiones líquidas. En determinados casos, la composición se puede preparar como un polvo o una pulverización para administración pulmonar, por ejemplo, en un inhalador. En otros casos, la composición se puede preparar como un supositorio o pesario, o para administración nasal, auricular u ocular, por ejemplo, como una pulverización, gotas, gel o polvo.

Las cantidades óptimas de los componentes para una composición inmunógena particular se pueden establecer por estudios estándar que implican la observación de respuestas inmunitarias apropiadas en sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente. Envasado y formas de dosificación

Las composiciones inmunógenas de la divulgación se pueden envasar en forma de dosis unitaria o de multidosis (por ejemplo 2 dosis, 4 dosis o más). Para las formas multidosis, normalmente se prefieren los viales pero no necesariamente, sobre las jeringuillas pre-cargadas. Los formatos multidosis adecuados incluyen pero no se limitan a: de 2 a 10 dosis por recipiente a 0,1 a 2 ml por dosis. En determinados casos, la dosis es una dosis de 0,5 ml. Véase, por ejemplo, la solicitud internacional de patente WO2007/127668.

Las composiciones se pueden presentar en viales u otros recipientes de almacenamiento adecuados, o se pueden presentar en dispositivos de administración pre-cargados, por ejemplo, jeringuillas con componente individual o múltiple, que se puede suministrar con o sin agujas. Normalmente aunque no necesariamente, una jeringuilla contiene una dosis individual de la composición inmunógena que contiene conservante de la divulgación, aunque también se prevén las jeringuillas pre-cargadas, multidosis. Asimismo, un vial puede incluir una dosis individual aunque de forma alternativa puede incluir dosis múltiple.

Se pueden establecer rutinariamente volúmenes de dosificación efectiva, aunque una dosis típica de la composición para inyección tiene un volumen de 0,5 ml. En determinados casos, la dosis se formula para la administración a un sujeto humano. En determinados casos, la dosis se formula para la administración a un sujeto humano adulto, joven, adolescente, niño o infante (es decir, no más de un año de edad) y en casos preferidos se puede administrar por inyección.

Las composiciones inmunógenas líquidas de la divulgación también son adecuadas para reconstituir otras composiciones inmunógenas que se presentan en forma liofilizada. Cuando una composición inmunógena se va a usar para reconstitución extemporánea de este tipo, la divulgación proporciona un kit con dos o más viales, dos o más jeringuillas listas para cargar, o uno o más de cada uno, usándose los contenidos de la jeringuilla para reconstituir los contenidos del vial antes de la inyección, o viceversa.

De forma alternativa, las composiciones inmunógenas de la presente divulgación se pueden liofilizar y reconstituir usando, por ejemplo, uno de una multitud de procedimientos para el secado por congelación muy conocidos en la técnica para formar partículas conformadas (por ejemplo, esféricas) regulares secas, tales como microgránulos o microesferas, que tienen características de partícula tales como tamaños de diámetro que se pueden seleccionar y controlar variando los procedimientos exactos usados para prepararlos. Las composiciones inmunógenas pueden comprender además un coadyuvante que opcionalmente se puede preparar con o contener en partículas conformadas (por ejemplo, esféricas) regulares, secas, separadas tales como microgránulos o microesferas. En tales casos, la presente divulgación proporciona además un kit de composición inmunógena que comprende un primer componente que incluye una composición inmunógena seca, estabilizada, que comprende opcionalmente además uno o más conservantes de la divulgación y un segundo componente que comprende una solución acuosa estéril para la reconstitución del primer componente. En determinados casos, la solución acuosa comprende uno o más conservantes y opcionalmente puede comprender al menos un coadyuvante (véase, por ejemplo, el documento WO2009/109550).

En otro caso más, un recipiente del formato multidosis se selecciona de uno o más del grupo que consiste en, pero no se limita a, artículos de vidrio de laboratorio generales, matraces, vasos de precipitados, cilindros graduados, fermentadores, biorreactores, conductos, tubos, bolsas, frascos, viales, cierres para viales (por ejemplo, un tapón de goma, un tapón de rosca), ampollas, jeringuillas, jeringuillas duales o multicámara, tapones para jeringuillas, émbolos para jeringuilla, cierres de goma, cierres de plástico, cierres de vidrio, cartuchos y plumas desechables y similares. El recipiente de la presente divulgación no está limitado por el material de fabricación e incluye materiales tales como vidrio, metales (por ejemplo, acero, acero inoxidable, aluminio, etc.) y polímeros (por ejemplo, termoplásticos, elastómeros, termoplástico-elastómeros). En un caso particular, el recipiente del formato es un vial de vidrio de Schott Tipo 1 de 5 ml con un tapón de butilo. El experto en la técnica apreciará que el formato descrito anteriormente no es de ningún modo una lista exhaustiva, sino que sirve simplemente como una orientación para el trabajador con respecto a la variedad de formatos disponibles para la presente divulgación. Se pueden encontrar otros formatos contemplados para su uso en la presente divulgación en catálogos publicados de proveedores y fabricantes de equipo de laboratorio tales como United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR.

Ejemplos

Ejemplo 1: procedimientos experimentales

Ensayo bactericida del suero

Se inmunizaron macacos cangrejeros (n = 5/grupo) por vía intramuscular con proteínas rLP2086 o rP2086 (A B) adsorbidas en APO4. Los macacos cangrejeros son un ejemplo de primates no humanos. Se vacunaron los animales a las semanas 0, 4 y 24 y se determinaron IgG específica para ORF2086 y valoraciones de anticuerpos funcionales a las semanas 0, 4, 6 y 26. Se determinaron valoraciones de IgG específica para ORF2086 del suero frente a rLP2086A y B.

Se examinaron valoraciones de anticuerpos funcionales por ensayo bactericida del suero (SBA) frente a cepas de Neisseria meningitidis que expresaban LP2086 con secuencias homólogas o bien heterólogas a las contenidas en la vacuna.

Se determinaron anticuerpos bactericidas del suero en macacos o conejos inmunizados con vacuna de ORF2086 usando SBA con complemento humano. Se inactivaron con calor los sueros inmunitarios de conejo o los sueros inmunitarios de macacos para eliminar la actividad del complemento intrínseca y posteriormente se diluyeron en serie 1:2 en PBS de Dulbecco con Ca2+ y Mg2+ (D-PBS) en una placa de microvaloración de 96 pocillos para someter a prueba para determinar la actividad bactericida del suero frente a cepas de N. meningitidis. Se hicieron crecer las bacterias usadas en el ensayo en medio de GC complementado con complemento de Kellogg (GCK) y se monitorizaron por densidad óptica a 650 nm. Se cosecharon las bacterias para su uso en el ensayo a una DO650 final de 0,50-0,55, se diluyeron en D-PBS y se añadieron 1000-3000 de UFC a la mezcla de ensayo con un 20 % de complemento humano.

Se usó suero humano con actividad bactericida no detectable como fuente de complemento exógeno. Se sometieron a prueba las fuentes de complemento para determinar la idoneidad frente a cada cepa de prueba individual. Se usó una fuente de complemento solo si el número de bacterias que sobrevivieron en los controles sin sueros inmunitarios añadidos era >75 %. Se requirieron diez fuentes de complemento únicas para llevar a cabo los SBA descritos en este estudio.

Después de incubación de 30 min de incubación a 37oC con CO2 al 5 %, se añadió D-PBS a la mezcla de reacción y se transfirieron alícuotas a placas de microfiltro con medio GCK 50 %. Se filtraron las placas de microfiltro, se incubaron durante toda una noche a 37oC con CO2 al 5 % y se tiñeron y se cuantificaron microcolonias. Se definieron las valoraciones bactericidas séricas como las diluciones séricas recíprocas interpoladas que dieron una reducción del 50 % en UFC en comparación con la UFC en pocillos de control sin sueros inmunitarios. Se define la valoración de SBA como el recíproco de la dilución interpolada del suero de prueba que provoca una reducción del 50 % en recuentos de bacterias después de 30min de incubación a 37oC. Se estableció la susceptibilidad a la destrucción con sueros inmunitarios de ORF2086 si había un aumento de 4 veces o más en la valoración de SBA para sueros inmunitarios de ORF2086 en comparación con los sueros pre-inmunitarios correspondientes. Los sueros que fueron negativos frente a la cepa de ensayo en la dilución inicial se asignaron a una valoración de la mitad del límite de detección para el ensayo (es decir, 4).

Ejemplo 2: clonación y expresión de variantes de ORF2086 no lipidadas

Se derivó originalmente la secuencia de aminoácidos de P2086 madura correspondiente a los residuos 27-286 de la cepa N. meningitidis M98250771 (A05) de la amplificación de PCR a partir de ADN genómico. El cebador directo, con una secuencia de TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG (SEQ ID NO: 22), se fusionó a la secuencia 5' y contenía un sitio para la clonación. El cebador inverso, con una secuencia de CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC (SEQ ID NO: 23), se fusionó al extremo 3' del gen y contenía un codón de terminación TAG seguido del sitio de restricción BamHI. En primer lugar se clonó el fragmento amplificado de 799 pb en un vector intermedio PCR2.1 (Invitrogen, Carlesbac, CA) Se escindió este plásmido con NdeI y BamHI y se unió en el vector de expresión pET9a (Novagen, Madison, WI) que se había escindido con NdeI y BamHI. El vector resultante pLA100 (que incluye la SEQ ID NO: 54), expresó la subfamilia A05 de P2086 madura de la cepa M98250771 sin la cisteína del extremo N-terminal (véase la SEQ ID NO: 13 en la que la Cys del extremo N-terminal en la posición 1 está delecionada o la SEQ ID NO: 55) que estaría presente en la proteína lipidada. Se usó la cepa de huésped de E. coli BLR(DE3) [F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm A(srl-recA)306::Tn10 (TetR) (DE3)] (Novagen) para obtener la expresión de fHBP.

Se usaron las mismas etapas de clonación para preparar las variantes B02, B03, B09, B22, B24, B44, A04, A12 y A22 con Cys delecionada en el extremo N-terminal. También se prepararon las variantes que contienen Cys en el extremo N-terminal por el mismo procedimiento usando cebadores directos que también incluían el codón de Cys (por ejemplo, el primer codón de las SEC ID N.°s: 1-11). Basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento, el experto podría diseñar cebadores directos e inversos para cada una de estas variantes. Por ejemplo, se usaron los siguientes cebadores para amplificar la variante no lipidada B44 seguida de la clonación en pET9a usando NdeI y BlpI.

Tabla 1

Resultados

Las construcciones de plásmidos no lipidados se expresaron fuertemente, pero las variantes de proteínas no lipidadas estaban piruviladas en el residuo de Cys N-terminal. Véanse los ejemplos 8 y 9, que describen, por ejemplo, un procedimiento para expresar las construcciones. Para obtener esta piruvilación, se delecionó el codón Cys N-terminal. Véase, por ejemplo, el ejemplo 10. La deleción del Cys N-terminal, sin embargo, dejó sin efecto la expresión de las variantes A22 y B22. Véase, por ejemplo, la Figura 4. Sin embargo, las variantes A05, B01 y B44, aún se expresan a pesar de la deleción del residuo Cys N-terminal. Véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 13 (A05), en la que el Cys N-terminal en la posición 1 está suprimido, SEQ ID NO: 35 (extremo N-terminal de B01) y SeQ ID NO: 21 (B44), en las que el N-terminal en la posición 1 está delecionado. Véase, por ejemplo, la Figura 5. Además, la expresión de la variante B09 no lipidada no se vio afectada por la deleción del residuo de Cys en N-terminal. Véase, por ejemplo, el ejemplo 4.

Ejemplo 3: efecto del tallo Gly/Ser sobre la expresión de la variante no lipidada

Para determinar por qué las variantes A05, B01 y B44 se expresaron en ausencia de Cys N-terminal y las variantes A22 y B22 no, se alinearon las secuencias de estas variantes. Las variantes A05, B01 y B44 poseen todas una serie extendida de 10 u 11 residuos Gly y Ser siguiendo inmediatamente la Cys N-terminal (es decir, un tallo Gly/Ser). Sin embargo, las variantes A22 y b22, solo tenían un tallo Gly/Ser que consiste en 6 residuos Gly y Ser. En consecuencia, se expandió el tallo Gly/Ser de las variantes A22 y B22 por inserción de residuos Gly y Ser adicionales.

Se prepararon variantes de tallo Gly/Ser largo por los procedimientos descritos en el ejemplo 2 usando cebadores directos que codifican un tallo Gly/Ser con 10 o bien 11 residuos Gly y Ser.

Las variantes A22 y B22 de tallo Gly/Ser largo (10-11 residuos Gly/Ser) con Cys N-terminal delecionada mostraron un incremento en la expresión sobre las variantes de tallo Gly/Ser corto (6 residuos Gly/Ser) con Cys N-terminal suprimida. Sin embargo, estos niveles de expresión, todavía eran reducidos en comparación con los niveles de expresión de las variantes A05, B01 y B44.

Ejemplo 4: optimización de codones

La expresión de la variante B09 no lipidada no se vio afectada por la deleción del residuo Cys N-terminal (véase, SEQ ID NO: 18, en la que la cisteína en la posición 1 está suprimida, o SEQ ID NO: 49). Véase, por ejemplo, la Figura 6. La evaluación de la secuencia de la variante B09 demostró que la variante B09 tiene un tallo Gly/Ser que consiste en 6 residuos Gly y Ser, similar al tallo Gly/Ser de las variantes A22 y B22. En efecto, las colas N-terminales de las variantes B09 y ^a22 son idénticas en el nivel de aminoácidos. Las colas N-terminales de las variantes B09 y A22 (SEQ ID NO: 53 y 42, respectivamente), sin embargo, varían en el nivel de aminoácidos en 2 ácidos nucleicos: ácidos nucleicos 15 y 39 de ^sE^qID NO: 8. Véase, por ejemplo, la Figura 6. Los 14 primeros aminoácidos de la cola N-terminal de la variante B22 son idénticos a los de las variantes B09 y A22 y la cola N-terminal de la variante B22 solo difiere en el 15° aminoácido. Los ácidos nucleicos 1-42 de la variante B22 son idénticos a los ácidos nucleicos 1-42 de la variante A22. Los ácidos nucleicos 1-42 de la variante B22 (véase SEQ ID NO: 52) son idénticos a los ácidos nucleicos 1-42 de B09 (véase SEQ ID NO: 53) salvo por las diferencias en los ácidos nucleicos 15 y 39, cuando se alinean de forma óptima. En consecuencia, la variante B22 difiere de la variante B09 en los aminoácidos 15 y 39 de la SEQ ID NO: 8. Esta última frase contiene un error tipográfico y debería indicar que la variante B22 difiere de la variante B09 en los ácidos nucleicos 15 y 39 de la SEQ ID NO: 8.

Para determinar si las diferencias en los ácidos nucleicos afectaron al nivel de expresión de la variante B09 en comparación con las variantes A22 y B22, las variantes A22 y B22 se mutaron por mutación puntual para incorporar los ácidos nucleicos 15 y 39 en los codones correspondientes para Gly5 y Gly13. La incorporación de estas mutaciones de ácidos nucleicos inactivados incrementó significativamente la expresión de las variantes con Cys en N-terminal delecionada A22 y B22 a niveles similares a la variante B09 con Cys en N-terminal delecionada. Véase, por ejemplo, la Figura 7. En consecuencia, la optimización de codones para hacer pareja la variante B09 puede incrementar la expresión de las variantes P2086 no lipidadas con Cys N-terminal delecionada.

Otro análisis de las secuencias de las variantes no lipidadas sugirió optimizaciones de codones adicionales en el tallo Gly/Ser para mejorar la expresión. En consecuencia, se construyeron variantes no lipidadas adicionales por el procedimiento del ejemplo 2 usando cebadores directos que comprenden tales secuencias optimizadas de codones. Los cebadores directos usados para generar tallos Gly/Ser optimizados incluyen cualquiera de las siguientes secuencias:

ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGAAGCGGGGGCGGTGGA (SEQ ID NO: 28)

M S S G G G G S G G G G (SEQ ID NO: 29)

ATGAGCTCTGGAAGCGGAAGCGGGGGCGGTGGA (SEQ ID NO: 30)

M S S G S G S G G G G (SEQ ID NO: 31)

ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGA (SEQ ID NO: 32)

M S S G G G G (SEQ ID NO: 33)

ATGAGCAGCGGGGGCGGTGGA (SEQ ID NO: 34)

M S S G G G G (SEQ ID NO: 33)

Ejemplo 5: optimización de la formulación de composición inmunógena

Las vacunas formuladas con ISCOMATRIX generan una respuesta inmunitaria rápida dando como resultado una reducción en el número de dosificaciones requeridas para lograr una tasa de respuesta de más de 4 veces como se mide en un ensayo bactericida del suero. Se inmunizaron grupos de cinco macacos rhesus con diferentes formulaciones de una vacuna de rP2086 no lipidada bivalente. La vacuna incluyó una variante A05 no lipidada no piruvilada (SEQ ID NO: 13, en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o SEQ ID NO: 55 codificada por SEQ ID NO:54) y una variante B44 no lipidada no piruvilada (SEQ ID NO: 21, en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o SEQ ID NO: 44 codificada por SEQ ID NO: 51). Las unidades de coadyuvante son como sigue: APO4 es de 250 mcg, ISCOMATRIX está entre 10 y 100 mcg. Las unidades de coadyuvante para AlPO4 mostradas en las tablas 2-5 se muestras como unidades en miligramos y por lo tanto se muestran como 0,25 (miligramos) en lugar de 250 mcg.

El programa de inmunización fue de 0, 4 y 24 semanas con extracciones en las semanas 0, 4, 6 y 26. No hubo incrementos en las valoraciones de SBA en la postdosis uno para cualquiera de los grupos. En la postdosis dos, se observó un incremento en las valoraciones de SBA y en el número de respondedores según se definió por un incremento de 4 veces por encima del valor de referencia de la valoración de SBA anterior para formulaciones que contenían el coadyuvante ISCOMATRIX. Las tablas 2 y 3 proporcionan las GMT de SBA observadas para una cepa de subfamilia A y B de fHBP, respectivamente. Las GMT de SBA para las formulaciones con ISCOMATRIX fueron 3-19 y 4-24 veces mayores que las observadas para la formulación con AIPO4 para las cepas de subfamilias A y B, respectivamente. También se observaron valoraciones potenciadas en la postdosis tres para las formulaciones con ISCOMATRIX en 13-95 y 2-10 para la cepa de subfamilia Ay B de fHBP respectivamente en comparación con la formulación con AIPO4. El análisis de las tasas de respondedores, según se define por un incremento de cuatro veces o mayor en la valoración de SBA sobre el valor de referencia reveló una tendencia similar (tablas 4 y 5).

Ejemplo 6: inmunoprotección conferida por variantes lipidadas y no lipidadas

Una variante de P2086 no lipidada expresada recombinantemente (B44) induce una protección amplia como se mide por SBA frente a cepas que representan diversas variantes de las fHBP (desde aproximadamente un 85 % hasta aproximadamente un <92 % de ID) de secuencias de LP2086. Estas tasas de respuesta se obtuvieron para una vacuna no lipidada formulada con AlPO4. Véase la tabla 6, que muestra tasas de respuesta de SBA para una cepa de MnB de subfamilia B de fHBP generada por una vacuna de fHBP bivalente. La vacuna no lipidada (representada por un “-“ bajo la columna “lipidación”) incluyó una variante A05 no lipidada no piruvilada (SEQ ID NO: 13 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada) y una variante B44 no lipidada, no piruvilada (SEQ ID NO: 21, en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está delecionada).

De forma alternativa, una variante de P2086 no lipidada expresada recombinantemente (B44) induce mayores respuestas inmunitarias como se mide por la valoración de SBA que una variante lipidada (B01) frente a cepas que portan secuencias de LP2086 similares (>92 % de ID) y diversas (<92 % de ID). Las tasas de respuesta más altas (según se definen por un incremento de cuatro veces o mayor en las valoraciones de SBA sobre el valor de referencia) se observaron para la vacuna que contenía B44 de rP2086 no lipidada en comparación con la vacuna B01 de rLP2086 lipidada (tabla 6).

De acuerdo con la tabla 6, B44 no lipidada es un componente de subfamilia B preferido de fHBP en una composición para proporcionar amplia cobertura frente a (por ejemplo, provocar anticuerpos bactericidas frente a) cepas de variantes de LP2086 múltiples.

Sorprendentemente, los inventores anotaron que es poco probable que las cepas de variante B09 de LP2086 tengan tasas de respuesta de SBA positivas con respecto a polipéptidos ORF2086 heterólogos (no B09). En particular, los inventores encontraron que B09 de LP2086 es una excepción en términos de una cepa de ensayo frente a la que la composición inmunógena de A05/B44 descrita en la tabla 6 provoca anticuerpos bactericidas. Por lo tanto, en una realización preferida, una composición inmunógena de la invención incluye un polipéptido B09, en particular en el contexto de una composición que incluye más de un polipéptido de subfamilia B de ORF2086. En una realización preferida, una composición inmunógena que incluye B44 no lipidada también puede incluir también un polipéptido B09 no lipidado.

Tabla 6: Tasas de respuesta de SBA para cepas de MnB de una subfamilia B de fHBP generadas por suero inmunitario de vacunas de fHBP bivalentes de macacos rhesus.

% de ID para

Variante de subfamilia _{% de}Coadyuvante ^{LP2086 de ra}

_{cepa de}Vacuna lipidación ^{apareada pa}

_{componente de}respondedores ensayo vacuna no PD3 sem. 26

lipidado

^{B02 A05/B01 +}

_5/B44- 99,6 ⁸⁰

_A0 ₁₀₀

___________________________________(continuación)___________________________________ Tabla 6: Tasas de respuesta de SBA para cepas de MnB de una subfamilia B de fHBP generadas por suero inmunitario de vacunas de fHBP bivalentes de macacos rhesus.

% de ID para

Variante de subfamilia _{% de}Coadyuvante ^{LP2086 de}Vacuna lipidación ^{apareada para}respondedores _{cepa de componente de}

ensayo vacuna no PD3 sem. 26

lipidado

^{AIPO4 B03 A05/B01}86,7 ⁵⁰

_{0,25mg A05/B44 - 80}

^{B09 A05/B01}86,3 ⁰

_A05/B44 _{- 0}

^{B15 A05/B01}86,7 ²⁵

_A05/B44 _{- 80}

^{B16 A05/B01}87,1 ⁰

_A05/B44 _{- 50}

^{B16 A05/B01}87,1 ⁰

_A05/B44 _{- 60}

^{B24 A05/B01}85,9 ⁰

_A05/B44 _{- 60}

^{B44 A05/B01}100 ¹⁰⁰

_A05/B44 _{- 100}ISCOMATRIX® (10 A05 A05/B44 _mcg)- 100 100 ISCOMATRIX®

_{(100 mcg)}A05 A05/B44 - 100 80 ISCOMATRIX® (10

_mcg)A22 A05/B44 - 88,9 80 ISCOMATRIX®

_{(100 mcg)}A22 A05/B44 - 88,9 100

Cinco monos por grupo; programa de inmunización: semanas 0, 4, 24; programa de extracción de sangre:

semanas 0, 4, 6 y 26.

Ejemplo 7: optimización de codones de las variantes B44 y B09

Aunque los niveles de expresión logrados en los ejemplos precedentes eran adecuados para muchas aplicaciones, fue deseable otra optimización y se prepararon y se sometieron a prueba construcciones de expresión de E. coli que contenían optimización de codones adicional sobre la longitud total de la proteína. Se encontró que una secuencia mejorada de este tipo para la expresión de una proteína B44 sin Cys era la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en SEQ ID NO: 43. Como se muestra en el ejemplo 9, la construcción de expresión que contenía SEQ ID NO: 43 mostró una expresión potenciada en comparación con la secuencia de tipo silvestre no optimizada.

Se mejoró la expresión de la proteína B09 con la Cys en N-terminal delecionada aplicando cambios de codones de la construcción de B44 optimizada anteriormente (SEQ ID NO: 43) a la B09 (SEQ ID NO: 48). Para generar secuencias de B09 optimizadas, en primer lugar se alineó la secuencia de ADN optimizada de B44 (SEQ ID NO: 43) con la secuencia de ADN del alelo de B09 (SEQ ID NO: 48). Se optimizó la secuencia de codificación no lipidada completa del alelo de B09 (SEQ ID NO: 48) para reflejar los cambios de codones observados en el alelo optimizado de B44 (SEQ ID NO: 43) siempre que los aminoácidos entre B44 (SEQ ID NO: 44) y B09 (SEQ ID NO: 49) sean idénticos. Las secuencias de codones en el alelo de B09 que corresponden a los aminoácidos idénticos entre el alelo de B09 y el alelo de B44 se cambiaron para reflejar el codón usado en la secuencia optimizada de B44 (SEQ ID NO: 43). Las secuencias de codones para aminoácidos que diferían entre B09 (SEQ ID NO: 49) y B44 (SeQ ID NO: 44) no se cambiaron en la secuencia de ADN de B09.

Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de B44 no lipidada (SEQ ID NO: 44) contiene dos secuencias de repetición serina-glicina secuenciales (S-G-G-G-G) (SEQ ID NO: 56) (véanse también los aminoácidos de 2 a 6 de s Eq ID NO: 44) en su extremo N-terminal, mientras que el alelo de B09 solo contiene una repetición serina-glicina en el extremo N-terminal (véanse los aminoácidos de 2 a 6 y los aminoácidos de 7 a 11 de SEQ ID NO: 49). Las dos repeticiones serina-glicina en el extremo N-terminal de B44 (aminoácidos de 2 a 6 y aminoácidos de 7 a 11 de SEQ ID NO: 44) también tenían usos de codones diferentes (véanse los nucleótidos de 4 a 18 y los nucleótidos de 19 a 33 de SEQ ID NO: 43) y diferentes combinaciones de la repetición serina-glicina de B44 optimizada (por ejemplo, nucleótidos de 4 a 18 de SEQ ID NO: 43, o bien nucleótidos de 19 a 33 de SEQ ID NO: 43, o bien una combinación de los mismos) se aplicaron a la secuencia de ADN de B09 (SEQ ID NO: 48, por ejemplo, aplicada a los nucleótidos de 4 a 18 de SEQ ID NO: 48) para examinar el efecto sobre la expresión de proteínas recombinantes.

Se construyeron tres versiones diferentes de B09 optimizada: La SEQ ID NO: 45 contiene ambas repeticiones serina-glicina (GS1 y GS2) (ácidos nucleicos de 4 a 33 de SEQ ID NO: 43) de la B44 optimizada, la SEQ ID NO: 46 contiene GS1 (ácidos nucleicos de 4 a 18 de SEQ ID NO: 43) y la SEQ ID N^o: 47 contiene GS2 (ácidos nucleicos de 19 a 33 de SEQ ID NO: 43). Se sintetizó químicamente el ADN para todas las secuencias optimizadas de codones anteriores usando un estándar en la técnica de la química. Se clonó el ADN resultante en vectores de expresión de plásmidos apropiados y se sometió a prueba para determinar la expresión en células huésped de E. coli como se describe en los ejemplos 8 y 9.

Ejemplo 8: procedimiento para la expresión de una variante B09, de ORF2086

Se transformaron células de la cepa K-12 de E. coli (derivados de W3110 de tipo silvestre (CGSC4474) que tenían deleciones en recA, fhuA y araA) con el plásmido pEB063, que incluye la SEQ ID NO: 45, pEB064, que incluye SEQ ID NO: 46, el plásmido pEB065, que incluye la SEQ ID NO: 47, o el plásmido pLA134, que incluye la SEQ ID NO: 48. Las modificaciones preferidas para la cepa K-12 son útiles para los fines de fermentación pero no se requieren para la expresión de las proteínas.

Se inocularon células en un medio definido de glucosa-sales. Después de 8 horas de incubación a 37 °C, se aplicó un alimento de glucosa lineal y se continuó con la incubación durante tres 3 horas adicionales. Se añadió p-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) al cultivo hasta una concentración final de 0,1 mM seguido de 12 horas de incubación a 37°C. Se recogieron las células por centrifugación a 16.000 x g durante 10 minutos y se lisaron por adición de “Easy-Lyse™ Cell Lysing Kit” de Lienco Technologies (St. Louis, MO) y un tampón de carga. Se analizaron los lisados aclarados para determinar la expresión de B09 por tinción Coomassie de geles de SDS-PAGE y/o análisis de transferencia de bandas tipo Western con cuantificación por un densitómetro de rastreo. Los resultados de la densitometría de rastreo están a continuación en la tabla 7:

Ejemplo 9: procedimiento para la expresión de la variante B44, de ORF2086

Se transformaron células de la cepa B de E. coli (BLR(DE3), Novagen) con plásmido pLN056, que incluye la SEQ ID NO: 51. Se transformaron células de la cepa K-12 de E. coli (derivada de W3110 de tipo silvestre) con el plásmido pDK087, que incluye la SEQ ID NO: 43. Se inocularon las células en un medio definido de glucosa-sales. Después de 8 horas de incubación a 37 °C se aplicó un alimento de glucosa lineal y se continuó con la incubación durante 3 horas adicionales. Se añadió p-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) al cultivo hasta una concentración final de 0,1 mM seguido de 12 horas de incubación a 37 °C. Se recogieron las células por centrifugación a 16.000 x g durante 10 minutos y se lisaron por adición de “Easy-Lyse™ Cell Lysing Kit” de Lienco Technologies (St. Louis, MO) y tampón de carga. Se analizaron los sobrenadantes para determinar la expresión de B09 por tinción Coomassie de geles de SDS-PAGE y/o análisis de transferencia de bandas tipo Western, con cuantificación por densitómetro de rastreo. Los resultados de la densitometría de rastreo están a continuación en la tabla 8:

Ejemplo 10: piruvilación

El presente ejemplo demuestra que el residuo Cys N-terminal de proteínas ORF2086 no lipidadas se puede piruvilar cuando se expresa, por ejemplo, en E. coli.

Se monitorizó la acumulación de proteínas heterólogas durante la producción de variantes A05 (SEQ ID NO: 13) y B44 (SEQ ID NO: 21) usando cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC). Esta separación se interconectó con un espectrómetro de masas de dispersión de cuadrupolo (QTOF-MS) para proporcionar un medio de monitorizar la formación de las variantes relacionadas con el producto.

Después de expresarse en las células huésped de B y/o K-12 de E. coli, los productos derivados de estas fermentaciones sufrieron un procedimiento de purificación durante el que se observó una modificación del producto. La deconvolución de los espectros de masas caracterizó las variantes por exhibir cambios de masa de 70 Da, en comparación con los productos naturales de 27640 y 27572 Da para A05 y B44, respectivamente.

La literatura publicada indicó que se había observado previamente un cambio de masa de 70 Da en proteínas y se había atribuido a la piruvilación del residuo amino-terminal.

Se confirmó la presencia y la ubicación del piruvato usando los datos de fragmentación de espectros de masa (EM/EM). Los datos indicaron que la modificación se dio en el residuo de cisteína amino-terminal, es decir, el aminoácido en la posición 1, de acuerdo con A05 y B44. Para A05, el porcentaje de polipéptidos piruvilados era aproximadamente de un 30 %, en comparación con el número total de polipéptidos de A05 (SEQ ID NO: 13). Para B44, el porcentaje de polipéptidos piruvilados era aproximadamente de un 25 %, en comparación con el número total de polipéptidos de B44 (SeQ ID nO: 21).

Cuando se purificaron las variantes de A05 (SEQ ID NO: 13 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o SEQ ID NO: 55) y de B44 (SEQ ID NO: 21 en la que la Cys N-terminal en la posición 1 está suprimida o SEQ ID NO: 44), que no contienen una cisteína amino-terminal, no hubo piruvilación detectable (+70 Da).

Ejemplo 11: inmunogenicidad de B09 y B44, individualmente y en combinación

Se inmunizaron 5-10 grupos de monos macacos rhesus con variante de B09 (SEQ ID NO: 49 codificada por SEQ ID NO: 48) o variante de B44 (SEQ ID NO: 44 codificada por SEQ ID NO: 43), o A05, B09 y B44 (SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 49 codificada por SEQ ID NO: 48 y SEQ ⁱD NO: 44 codificada por SEQ ⁱD NO: 43, respectivamente) formuladas con 250 mcg de APO4 por dosis. Se vacunaron los monos por medio de la vía intramuscular a las semanas 0, 4 y 8 con 10 mcg cada uno de fHBP no lipidada sola o en combinación como se enumera en la tabla 9 y 10. Se analizaron las muestras séricas de ambas semanas 0 y 12 en SBA frente a cepas de MnB con las variantes de subfamilia A o bien de subfamilia B de fHBP. Se registraron respondedores como animales con un aumento de 4 x en la valoración. La variante de B44 sometida a prueba fue la construcción optimizada (SEQ ID NO: 43) y se mantuvieron las tasas de respuesta amplias que se observaron es estudios anteriores (tabla anterior) para la construcción optimizada (Tabla 9) la vacuna de B44 sola o en combinación con B09. La vacuna de B09 sola (Tabla 10) también pudo generar respuestas inmunitarias ampliamente reactivas de forma cruzada (Tabla 10).

Tabla 9: Tasas de respuesta obtenidas para vacunes de fHBP no lipidada en macacos rhesus

Se inmunizaron i.m. macacos rhesus (n= 10) a las semanas 0, 4 y 8 con 10 mcg cada uno de fHBP no lipidada sola o en combinación como se enumeró en la columna Vacuna en la formulación con 250 mcg de APO4. Se analizaron las muestras séricas de ambas semanas 0 y 10 en SBA frente a las cepas de MnB enumeradas en la tabla. Se registran los respondedores como los animales con un aumento de 4 x en la valoración.

La tabla 9 indica, por ejemplo, que una composición que incluye una combinación de B44, B09 y A05 no lipidadas, no piruviladas mostraba una cobertura cruzada mayor frente a las variantes de prueba en comparación con la cobertura cruzada de una composición que incluía B44 sola. En vista de los resultados mostrados en la presente solicitud, incluyendo en particular la tabla 6 y la tabla 9 juntas, las composiciones que incluyen B44, B09 y A05 sola o en combinación son realizaciones preferidas de la presente invención. En particular, se dan a conocer las composiciones que incluyen tanto B44 como B09. Tal composición incluye además preferentemente un polipéptido de subfamilia A, tal como en particular A05.

Tabla 10: Tasas de respuesta obtenidas para vacuna de B09 de fHBP no lipidada en macacos rhesus

Se inmunizaron i.m. macacos rhesus (n=5) a las semanas 0, 4 y 8 con 10 mcg cada uno de fHBP no lipidada sola o en combinación como se enumeró en la columna Vacuna en la formulación con 250 mcg de AlPO4. Se analizaron las muestras séricas de ambas semanas 0 y 10 en SBA frente a las cepas de MnB enumeradas en la tabla. Se registran los respondedores como los animales con un aumento de 4 x en la valoración.

Ejemplo 12: inmunoprotección conferida por construcción de variantes lipidadas y no lipidadas

Se rastrearon previamente veinte conejos hembra New Zealand white, de 2,5-3,5 kg, obtenidos de Charles River Canadá, por ELISA celular completo y se seleccionaron 10 animales para este estudio basándose en sus valoraciones de fondo bajas frente a las cepas de prueba que representan variantes de fHBP B02 (SEQ ID NO: 16) y B44 (SEQ ID NO: 21) (Tabla 11). Se inmunizaron i.m. un grupo de tres animales con 100 |jg de cada proteína formulada con 50 jg de ISCOMATRIX por 0,5 ml de dosis a las semanas 0, 4 y 9 (Tabla 12). Se vacunó el grupo 1 con B44 no lipidada (SEQ ID NO: 44). Se incluyó un grupo de control que se vacunó con B01 lipidada formulada con AlP04 (250 mcg) Se sometieron a extracción los conejos a las semanas 0, 4, 9 y 10. Se prepararon sueros individuales de la semana 10 y se analizaron por ensayo bactericida del suero frente a cepas meningocócicas de serogrupo B múltiples de la subfamilia B de fHBP.

Tabla 11: Conejos usados en el estudio

Especie: Conejo

Raza: New Zealand white

Fuente:3 Laboratorio Charles River

N.° de animales por grupo: 3

N.° total de animales: 9

Edad y sexo: Hembra

Peso: 2,5-3,5 kg

Tabla 12

rfHBP ISCOMATRIX Fosfato de aluminio Grupo ^{N.° de}

_animalesVariante lipidada (jg/0,5 ml

dosis) (jg/0,5 ml dosis) (jg/0,5 ml dosis) 1 3 B44 - 100 50

2 3 B01 - 100 50

3 3 B01 100 - 100

Programa de inmunización, semanas 0, 4, 9; Programa de extracción, semanas 0, 4, 9,10

Ensayo bactericida del suero (SBA): se realizó un ensayo bactericida del suero (SBA) basado en microcolonias frente a cepas meningocócicas de serogrupo B múltiples (tabla 13) sobre muestras séricas individuales. Se cualificaron los sueros humanos de donantes como la fuente de complemento para la cepa sometida a prueba en el ensayo. Se interpolaron valoraciones bactericidas dependientes de anticuerpos mediadas por complemento y se expresaron como el recíproco de la dilución del suero de prueba que destruyó el 50 % de las células meningocócicas en el ensayo. El límite de detección del ensayo era de una valoración de s Ba de 4. Una valoración de SBA de <4 se asignó a un número de 2. Se calculó y se comparó un aumento de > 4 veces de las valoraciones de SBA en sueros de la semana 10 en comparación con las valoraciones en las pre-extraídas.

La actividad de anticuerpos bactericida sérica como se mide en el SBA es el subrogado inmunológico de protección frente a la enfermedad meningocócica. Se determinó la capacidad de inmunización con rfHBP no lipidado para obtener anticuerpos bactericidas en conejos por SBA. SBA mide el nivel de anticuerpos en una muestra sérica mimetizando la lisis bacteriana mediada por complemento que se produce de forma natural. Se analizaron las muestras séricas de conejo recogidas en la semana 10 por SBA frente a cepas con una fHBP de B44 y con una fHBP de B02. Como se muestra en la tabla 13, una semana después de la tercera inmunización (semana 10), todas las muestras séricas mostraron actividad bactericida frente a ambas cepas de prueba (tabla 13). La B44 no lipidada

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir un polipéptido ORF2086 no piruvilado no lipidado que comprende expresar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 21, en la que la cisteína en la posición 1 se deleciona y en la que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un sistema de expresión que es capaz de ser expresado en una célula bacteriana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento incluye expresar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 55 y la SEQ ID NO: 44.

3. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho sistema de expresión es un sistema de expresión de plásmido.

4. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicación 1 a 3, en el que la célula bacteriana es E. coli.

5. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicación 1 a 4, que además comprende purificar el polipéptido.