KR101695800B1 - 항원보강제 함유 백신 조성물의 안정화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항원 또는 항원 제제를 포함하는 액체 벌크 조성물을 안정화제를 포함하는 수용액에 의해 희석하고, 상기 희석된 조성물에 대략적으로 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 형성시키기 위한 공정을 가하고, 상기 고른 소적에 대해 동결 매질에서의 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키는 단계들을 포함하는 항원보강제 함유 백신 조성물의 안정화 방법을 제공한다.

Description

항원보강제 함유 백신 조성물의 안정화 방법 {PROCESS FOR STABILIZING AN ADJUVANT CONTAINING VACCINE COMPOSITION}
본 발명은 항원보강제 함유 백신 조성물의 안정화 방법, 건조한 형태의 항원보강된 백신 조성물, 및 특히 인플루엔자 백신 조성물, 특히 건조한 형태의 항원보강된 인플루엔자 백신 조성물의 안정화 방법에 관한 것이다.
US 3,655,838은 미세입자, 구형 비드 또는 동결건조구를 함유하는 동결-건조된 시약을 수득하기 위해서 동결 매질, 예를 들어 액체 질소에서 용액의 소적을 동결시키고, 후속적으로 동결 건조시킴으로써 분석 시약 또는 면역학적 시약을 펠릿화하는 방법을 개시한다. EP 0 081 913 B1은 소적을 상기 소적보다 더 높은 밀도를 갖는 불활성 액체 동결 매질에서 동결시키고 상기 액체 동결 매질의 표면으로부터 상기 동결된 입자를 제거함으로써 구형의 동결된 입자를 제조하는 방법을 개시한다. WO 94/25005는 동결건조구 중의 고나도트로핀의 안정화, 상기와 같은 동결건조구의 제조 방법, 및 이를 포함하는 약학 제제를 개시한다. EP 0 799 613(US 5,897,852)은 백신 성분을 함유하는 하나 이상의 동결-건조된 바디를 함유하는 백신 용기를 포함하는 백신 팩을 개시하며, 상기 바디 중 하나 이상은 0.2 ㎜ 이상의 직경을 갖는 동결건조구 또는 미세입자이다. WO 2006/008006(US 2008/0060213)은 동결-건조된 생성물로 충전된 용기의 제조 방법을 개시하며, 여기에서 상기 생성물의 소적을 동결시켜 펠릿을 형성시키고, 상기 펠릿을 동결 건조시키며, 분석하고 상기 용기에 적재한다. 동결된 입자 또는 펠릿을 수득하기 위한 다른 기법들이 식품 산업용으로 공지되어 있다(예를 들어 US 5,036,673 또는 US 2007/0281067 A1).
상기 동결 건조 기술은 항원보강제가 있거나 없는 백신일 수 있는 다수의 생성물의 안정성을 개선시킨다. 예를 들어 EP 0 475 409는 완충제 및 임의로 미시적인 생물학적 물질의 냉동보호제 함유 현탁액을 미세소적에 분무하고, 상기 소적을 회전하는 극저온 표면 상에서 동결시키고 상기 미세소적을 건조시킴으로써 상기 현탁액을 보존하는 방법을 개시한다. 바람직하게는 상기 소적은 약 200 ㎛ 미만의 직경을 갖는다.
독감 항원의 동결-건조가 문헌에 연구되어 있으며 상세한 고찰을 입수할 수 있다(Amorij et al. 2008: 안정한 인플루엔자 백신 분말 제형의 개발: 도전 및 가능성. Pharmaceutical Research, Vol 25, 1256-1273). US 3 674 864는 필수적으로 인플루엔자 바이러스를 수성 슈크로스 함유 용액에 현탁하고 상기 현탁액을 동결-건조시킴으로써 상기 바이러스 백신을 안정화시키는 방법을 개시한다. 또한 파상풍 및 디프테리아 독소의 안정화가 문헌에 논의되어 있다(예를 들어 문헌[S.P. Schwendeman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp. 11234-11238, 1995]을 참조하시오). 매우 최근에, 파상풍 독소의 동결건조에 최적화된 제형이 제안되었다(P. Matejtschuk et al. Biologicals 37(2009) 1-7).
대개 상기 동결 건조는 바이알, 주사기 또는 보다 큰 용기에의 충전 단계 다음에 오는, 약학 산업에서 최종 단계이다. 이 경우 상기 건조된 생성물을 사용 전에 재수화시켜야 한다(본 문서에서 동의어: 재조성하다 또는 용해시키다).
미세펠릿 형태로의 동결 건조는 상기 건조된 백신 생성물을 단지 동결-건조에 관하여 동일하게 안정화시키거나 또는 보관을 위한 안정성을 개선시킨다. 더욱 또한, 상기 미세펠릿 기술은
-충전 전에(또는 후속 충전에 의해) 상기 건조된 생성물의 혼합
-충전 전에 역가 조절(저장의 경우 사용될 수 있다)
-생성물들 간의 상호작용의 최소화(재수화 후 오직 생성물 상호작용만이 존재한다), 및
-일부의 경우 상기 안정성의 개선
을 허용하므로, 현행 동결 건조에 비해 여러 가지 이점을 제공한다.
이러한 이유로 인해 상기 미세펠릿 기술의 이점은 항원보강된 백신의 건조를 위해 여러 가지 접근법을 허용한다:
-항원보강제와 함께 항원의 건조(동일 상 중에 존재함): 상기 둘(항원 및 항원보강제)을 안정화시키고 유리질 매트릭스(여기에서 모든 분자 운동 및 화학 반응들이 크게 방해된다) 중에 이들을 포집함으로써 이들 간의 상호작용을 안정화시킨다. 상기 고체 상태는 전체 저장(보다 고온에서조차)을 통해서 상기 항원의 효능, 상기 항원보강제의 물리적 및 면역학적 성질, 상기 둘 간의 상호작용의 성질 및 힘이 유지되게 한다.
-상기 항원의 건조 및 상기 항원보강제의 별도의 건조(항원과 항원보강제가 상이한 상 중에 존재한다), 이어서 충전 전에 또는 연속 충전에 의해 상기 둘을 혼합시킨다. 일부의 경우, 상기 항원보강제 단독의 안정성은 +5 ℃ 이상 또는 보다 저온에서 장기간 보관 시 액체 상태에서 문제가 될 수 있다(유화액의 화학 안정성, 알루미늄 젤, 리포솜 및 다른 것들의 물리적 안정성...). 상기 미세펠릿 기술은 항원과 항원보강제의 별도의 미세펠릿을 발생시킴으로써 상기 항원보강된 백신의 안정성을 개선시킨다. 상기 안정화 제형을 각각의 항원 및 항원보강제에 대해 독립적으로 최적화할 수 있다. 이어서 상기 항원 및 항원보강제의 미세펠릿을 상기 바이알에 연속적으로 충전하거나 또는 상기 바이알에 충전하기 전에 혼합할 수 있다. 상기 분리된 고체 상태는 보관 기간 전체를 통해(보다 고온에서조차) 항원과 항원보강제 간의 상호작용을 피할 수 있게 하여 상기 항원의 효능과 상기 항원보강제의 물리적 및 면역학적 성질을 유지시킨다. 상기와 같은 형태에서, 상기 바이알의 내용물은 항원이나 항원보강제 중 어느 하나가 액체 상태로 있는 임의의 다른 형태 또는 항원과 항원보강제를 동일한 펠릿 내에서 건조시키는 경우보다 더 안정할 수 있다. 항원과 항원보강제 간의 상호작용은 이들이 주사용 수, 완충제 및 안정화 부형제를 포함할 수 있는 선택된 희석제로 상기 건조한 조합을 재수화시킨 후에만 일어날 수 있으므로 상기 방식으로 표준화된다. 따라서 상호작용은 상기 백신의 재수화 및 주사 사이의 짧은 기간 동안에만 억제하면 된다.
따라서 상기 두 생성물의 전체적인 안정성을 개선시킬 수 있으며(각 생성물에 대한 상기 제형의 최적화이며 상기 둘이 함께 절충한 것이 아님) 상기 백신 자체가 상기 보관 후 및 충전 전에 상기 둘 중 어느 하나의 역가를 조절할 수 있고, 상기 두 생성물 건조의 분리에 의해 상기 제조 공정을 용이하게 할 수 있다.
본 발명은 항원 또는 항원 제제를 포함하는 액체 벌크 조성물을 안정화제를 포함하는 수용액에 의해 희석하고, 상기 희석된 조성물에 대략적으로 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 형성시키기 위한 공정을 가하고, 상기 고른 소적에 대해 동결 매질에서의 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키는 단계들을 포함하는 항원보강제 함유 백신 조성물의 안정화 방법을 제공한다.
본 발명은 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함하는 액체 벌크 조성물을 탄수화물 및/또는 당 알콜 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액에 의해, 2%(w/v) 내지 생성되는 희석된 조성물의 탄수화물 및/또는 당 알콜 함량의 용해도 한계를 획득하도록 희석하고, 상기 희석된 조성물에 대략적으로 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적이 형성되도록 하는 공정을 가하고, 상기 고른 소적에 대해 동결 매질에서의 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키는 단계들을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물의 안정화 방법에 관한 것이다.
본 발명은 항원보강제 함유 백신 조성물의 안정화 방법을 제공한다.
도 1은 일반적인 제형 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
도 2는 제형 SG1 및 SG2의 건조한 미세펠릿의 생성에 사용된 공정을 나타낸다.
도 3은 항원보강제를 포함하는 제형화 및 건조 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 4는 항원 함유 미세펠릿을 생성시키기 위한 제형화 및 건조 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 5는 항원보강제 함유 미세펠릿을 생성시키기 위한 제형화 및 건조 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 6은 건조 백신을 완성하기 위한 상이한 미세펠릿들의 조합을 나타낸다.
도 7은 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
도 8은 펠릿화 및 건조 기술에 의해 획득된 매우 좁은 크기 분포의 개념을 제공한다.
도 9의 그래프는 탄수화물의 존재 하에서 미세펠릿 기술을 사용하여 알루미늄 포스페이트 젤 건조 후의 크기 분포 결과를 나타낸다.
도 10은 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
도 11은 미세펠릿 가공 전 및 후의 알루미늄 옥시하이드록사이드 젤 입자 크기를 나타낸다.
도 12는 37 ℃, 45 ℃ 및 55 ℃에서 열안정성 배양 7일 및 WFI로 용해 후 알루미늄 옥시하이드록사이드 젤 입자 크기를 나타낸다.
도 13은 SG1 안정화제를 사용한 제형 및 건조 과정의 원리에 대한 흐름도를 나타낸다.
도 14는 미세펠릿의 재수화 전 및 용해 후 유화액의 크기 비교를 나타낸다.
도 15는 미세펠릿의 용해 후 실온에서 유화액의 크기의 안정성/용해 직후 및 용해 후 7, 15, 30, 45 및 60 분째의 유화액의 크기 분포 곡선들의 정확한 중첩/입자 크기를 나타낸다.
도 16은 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
도 17은 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
도 18은 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
도 19는 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
본 발명은 항원 또는 항원 제제를 포함하는 액체 벌크 조성물을 안정화제를 포함하는 수용액에 의해 희석하고, 상기 희석된 조성물에 대략적으로 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 형성시키기 위한 공정을 가하고, 상기 고른 소적에 대해 동결 매질에서의 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키는 단계들을 포함하는 항원보강제 함유 백신 조성물의 안정화 방법을 제공한다.
적합한 백신 조성물은 예를 들어 완전 바이러스 또는 항원, 예를 들어 인플루엔자, 로타바이러스, 거대세포바이러스, A형 및 B형 간염, 완전 세균 또는 세균 단백질 또는 다당류 항원(접합 또는 비-접합), 예를 들어 헤모필루스 인플루엔자에, 수막염균성 다당류, 파상풍, 디프테리아, 세포 및 비세포성 백일해, 보툴리눔 식중독, 탄저병 또는 클로스트리듐 디피실리를 포함하는 조성물이다.
상기 소적의 동결은 예를 들어 상기 희석된 조성물, 즉 제형화된 액체 생성물을, 200 ㎛ 내지 1500 ㎛ 범위의 직경과 매우 좁은 크기 분포를 갖는 눈금화된 소적을 생성시키기 위해 프릴링시켜(prilled) 성취할 수 있다. 상기 소적을 온도가 액체 질소의 직접적인 주입/분무에 의해 또는 질소, CO2 또는 공기와 같은 매우 저온(T°<- 110 ℃) 기체의 역류에 의한 동결 매질에 의해 -110 ℃ 이하에서 유지되는 극저온 챔버에 떨어뜨린다. 상기 소적은 눈금화된 동결된 입자의 형성을 위해 그의 낙하 도중 동결된다.
눈금화된 소적, 및 후속적으로 눈금화된 동결된 입자를 획득하기 위한 다른 기법들, 예를 들어 초음파 분무(Sindayihebura D., Dobre M., Bolle L., 1997 - 박막 액체 초음파 분무의 실험 연구. ExHFT'97, Bruxelles), 또는 식품 산업으로부터 공지된 앞서 언급된 바와 같이, US 5,036,673에 개시된 바와 같은 특정 동결 드럼의 사용이 당해 분야에 공지되어 있다.
상기 방법은 하나 이상의 항원보강제, 및 임의로 안정화제를 포함하는 수용액을 상기 액체 벌크 항원 조성물에 첨가함을 추가로 포함할 수 있다.
한편으로, 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 항원보강제의 별도의 액체 벌크 용액 또는 유화액을 안정화제를 포함하는 수용액에 의해 희석하고, 상기 희석된 항원보강된 용액 또는 유화액에 대략적으로 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 형성시키기 위한 공정을 가하고, 상기 고른 소적에 대해 동결 매질에서의 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 항원을 함유하는 건조한 고른 구형 미세펠릿과 함께 혼합하여 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 추가로 포함한다.
상기 액체 벌크 조성물은, 각각 2 개 이상의 상이한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 2 개 이상의 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하기 위해서, 각각 상이한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 하나 이상의 추가의 항원 또는 항원 제제를 추가로 포함할 수 있다.
한편으로, 상기 액체 벌크 조성물은 각각 동일한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하기 위해서, 하나의 단일 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함한다. 이 경우 상기 방법은 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자의 2 개 이상의 유형을 1 회분으로 조제하고, 혼합하고 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 임의로 추가로 포함할 수 있으며, 각 유형의 미세펠릿이 2 개 이상의 상이한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함함을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 상기 건조가 동결건조(즉 얼음의 승화 및 결합 수의 수착)에 의해 발생함을 추가의 특징으로 할 수 있다. 적합한 건조 방법은 또한 대기압 동결-건조, 유동 층 건조, 진공 회전 드럼 건조, 교반식 동결-건조, 진동식 동결-건조 및 마이크로웨이브 동결-건조이다.
유리하게는, 상기 안정화제는 단당류, 예를 들어 만노오스, 올리고당류, 예를 들어 슈크로스, 락토오스, 트레할로스, 말토오스 또는 당 알콜, 예를 들어 솔비톨, 만니톨 또는 이노시톨, 또는 이들 앞서 언급한 2 개 이상의 상이한 안정제들의 혼합물, 예를 들어 슈크로스와 트레할로스의 혼합물을 포함한다.
유리하게는, 탄수화물, 당 알콜 및 안정화 부형제의 농도는 2%(w/v) 내지 상기 제형화된 액체 생성물의 용해도 한계의 범위이다. 일반적으로, 탄수화물, 당 알콜 및 안정화 부형제의 농도 범위는 5%(w/v) 내지 40%(w/v), 5%(w/v) 내지 20%(w/v), 또는 20%(w/v) 내지 40%(w/v)이다. 예를 들어 파상풍 또는 디프테리아 독소 및 알루미늄 젤(AlOOH)을 포함하는 제형화된 액체 생성물 중의 슈크로스와 트레할로스의 1:1 혼합물의 농도에 대한 예는 각각 18.1%(w/v) 및 17.5%(w/v)이다.
본 발명은 특히 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함하는 액체 벌크 조성물을 탄수화물 및/또는 당 알콜 또는 2 개 이상의 상이한 탄수화물 및/또는 당 알콜의 혼합물을 포함하는 수용액에 의해, 2%(w/v) 내지 생성되는 희석된 조성물의 탄수화물 및/또는 당 알콜 함량의 용해도 한계를 획득하도록 희석하고, 상기 희석된 조성물에 대략적으로 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적이 형성되도록 하는 공정을 가하고, 상기 고른 펠릿에 동결 매질에서의 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키는 단계들을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물의 안정화 방법에 관한 것이다.
계절성, 대유행전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함하는 액체 벌크 조성물을 US 6,048,537(WO 96/05294)에 개시된 바와 같은 방법에 의해 수득할 수 있다.
상기 건조는 유리하게는 동결건조(즉 얼음의 승화 및 결합 수의 수착)의 방법에 의해 발생한다. 상기 동결된 미세펠릿에 대한 추가의 적합한 건조 방법은 대기압 동결-건조, 유동 층 건조, 진공 회전 드럼 건조, 교반식 동결-건조, 진동식 동결-건조 및 마이크로웨이브 동결-건조이다.
유리하게는, 상기 탄수화물은 이당류, 특히 슈크로스이다. 또한 적합한 이당류는 예를 들어 락토오스, 말토오스 또는 트레할로스이다. 상기 인플루엔자 백신 조성물의 안정화에 또한 적합한 것은 단당류, 예를 들어 만노오스, 또는 당 알콜, 예를 들어 솔비톨, 이노시톨 또는 만니톨이다.
유리하게는, 탄수화물 또는 당 알콜의 농도는 상기 제형화된 액체 생성물 중의 5%(w/v) 내지 40%(w/v), 한편으로 5%(w/v) 내지 20%(w/v), 또는 20%(w/v) 내지 40%(w/v)이다. 상기 제형화된 액체 생성물 중의 예를 들어 슈크로스의 농도에 대한 예는 2%(w/v), 10%(w/v) 또는 15.4%(w/v)이다.
상기 액체 벌크 조성물은 각각 2 개 이상의 상이한 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 2 개 이상의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하기 위해서, 각각 상이한 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 하나 이상의 추가적인 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 상기 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 1 회분으로 조제하고 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 임의로 추가로 포함한다.
한편으로, 상기 액체 벌크 조성물은 각각 하나의 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하기 위해서, 상기 동일한 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 하나 이상의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함한다. 이 경우, 상기 방법은 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자의 2 개 이상의 유형을 1 회분으로 조제하고, 혼합하고 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 임의로 추가로 포함할 수 있으며, 각 유형의 미세펠릿이 다른 유형과 상이한 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함함을 특징으로 한다.
상기 방법은 하나 이상의 항원보강제, 및 임의로 안정화제를 포함하는 수용액을 액체 벌크 항원 조성물에 첨가함을 임의로 추가로 포함한다.
한편으로, 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 항원보강제의 별도의 액체 벌크 용액 또는 유화액을 안정화제를 포함하는 수용액에 의해 희석하고, 상기 희석된 항원보강제 용액 또는 유화액에 대략적으로 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 형성시키기 위한 공정을 가하고, 상기 고른 소적에 대해 동결 매질에서의 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 항원을 함유하는 건조한 고른 구형 미세펠릿과 함께 혼합하여 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 추가로 포함한다.
특히 적합한 항원보강제는 예를 들어 리포솜, 지질 또는 세정 마이셀 또는 다른 지질 입자, 중합체 나노입자 또는 미세입자, 용해성 중합체, 단백질 입자, 무기물 젤, 무기물 미세- 또는 나노입자, 중합체/알루미늄 나노하이브리드, 수중 유적형 또는 유중 수적형 유화액, 사포닌 추출물, 세균 세포 벽 추출물, 고유 면역 수용체의 자극제, 특히 천연 또는 합성 TLR 작용물질, 천연 또는 합성 NOD 작용물질 및 천연 또는 합성 RIG 작용물질이다. 본 발명에 따른 방법에 적합한 항원보강제는 예를 들어 WO 2007/006939에 개시된 것이다.
상기 인플루엔자 바이러스 균주는 예를 들어 H5N1, H9N2, H7N7, H2N2, H7N1 및 H1N1이다(홍콩 SAR에서 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스의 다수의 유전자형의 출현: Y Guan et al., 8950 - 8955, PNAS - June 25, 2002 - vol 99 n°13; 아시아에서 가금류로부터의 H9N2 인플루엔자 A 바이러스는 인간 바이러스-형 수용체 특이성을 갖는다: MN Matrosovich, S Krauss and R Webster, Virology 281, 156-162(2001); 인플루엔자 A 바이러스의 진화 및 생태학: R Webster et al., Microbiological ReviewsMar 1992, p. 152 - 179). 한편으로, 상기는 상기 계절성 인플루엔자 바이러스 균주의 그룹으로부터 선택된 인플루엔자 균주일 수 있다.
상기 인플루엔자 항원은 정제된 완전 인플루엔자 바이러스, 불활성화된 인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스의 서브유닛 성분, 또는 분열된 인플루엔자 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택된 형태일 수 있다.
상기 인플루엔자 항원은 세포 배양물로부터 유래될 수 있다. 한편으로, 상기 인플루엔자 항원은 수정란에서 생산된다.
본 발명은 또한 안정화된 건조한 백신 조성물, 특히 안정화된 건조한 인플루엔자 백신 조성물, 또는 다른 항원, 예를 들어 불활성화된 완전 바이러스 또는 바이러스의 항원 성분, 인플루엔자, 로타바이러스, 거대세포 바이러스 및 A형 및 B형 간염, 및 완전 세균 또는 세균 단백질 또는 접합 또는 비-접합된 다당류 항원, 예를 들어 헤모필루스 인플루엔자에, 수막염균성 다당류, 파상풍, 디프테리아, 세포 및 비세포성 백일해, 보툴리눔 식중독, 탄저병, 클로스트리듐 디피실리를 함유하는, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태의 안정화된 건조한 백신 조성물에 관한 것이다.
유리하게는, 각각의 고른 비드 또는 입자는 단지 한 가지 유형의 항원, 예를 들어 단지 하나의 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 하나 이상의 인플루엔자 항원 또는 예를 들어 오직 파상풍 또는 오직 디프테리아 항원만을 포함한다. 한편으로, 각각의 고른 비드 또는 입자는 하나 이상의 유형의 항원, 예를 들어 하나 이상의 상이한 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 예를 들어 파상풍 및 디프테리아 항원을 포함한다.
상기 조성물은 별도의 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 중에 임의로 함유된 항원보강제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 안정화된 건조한 백신 조성물, 예를 들어 앞서 언급한 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태의 안정화된 건조한 인플루엔자 백신 조성물을 수용액 중에서 재조성하는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 수용액은 항원보강제를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 안정화된 건조한 백신 조성물, 예를 들어 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태의 안정화된 고른 인플루엔자 백신 조성물을 함유하는 제 1 용기, 및 상기 백신의 재조성용 수용액을 함유하는 제 2 용기를 포함하는 백신 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 항원보강제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 함유하는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 상기 수용액은 항원보강제를 포함한다.
본 발명은 또한 안정한 건조한 항원 벌크의 저장(stockpiling) 방법에 관한 것으로서, 여기에서 상기 항원 또는 항원들을 앞서 개시한 방법에 의해 안정화하고 생성되는 안정화된 건조한 백신 조성물(예를 들어 인플루엔자, 디프테리아 또는 파상풍 백신 조성물)을 약 200 ㎛ 내지 약 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태로 보관 후 바이알 또는 주사기에 액체 충전하기 전에 적합한 용매로 재조성하고 임의로 제형화한다.
본 발명에 따른 미세펠릿 형태의 건조한 백신의 열-안정화 방법을 하기에 보다 상세히 설명한다.
상기 미세펠릿 기술에 의해 가공하기 위해서, 항원과 같은 생물학적 물질을, 상기 공정 전체를 통해 겪는 물리적 및 화학적 스트레스에 대한 그의 보호를 위해 제형화할 필요가 있다.
건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물은 상기 수득된 제형화된 액체 생성물이 ㎖ 당 표적 량의 안정화 부형제 및 항원을 함유하도록 상기 농축된 백신 벌크(항원 함유) 및 하나 이상의 탄수화물 및/또는 당 알콜을 포함하는 안정화 제형을 혼합함으로써 수득된다. 상기 탄수화물, 당 알콜 및 안정화 부형제의 농도 범위는 2%(w/v)에서부터 상기 제형화된 액체 생성물에 대한 용해도 한계까지이다. 예를 들어, 20 ℃에서 슈크로스의 수 용해도 한계에서의 농도는 약 66.7%(w/v)이다.
도 1은 일반적인 제형 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
도 2에 도시된 공정을 사용하여 건조한 미세펠릿을 생성시킨다.
프릴링(또한 층류 제트 파괴 기법으로서도 공지됨)은 생물촉매 및 살아있는 세포 고정화 분야에 통상적으로 사용되는 액체의 눈금화된 소적을 생성시키는 널리 공지된 기법이다(Hulst et al., 1985. 고정화된 생물촉매 및 다량의 생산을 위한 신규 기법. Biotechnol. Bioeng. 27, 870-876; Gotoh et al., 1993. 강제 진동 방법에 의한 생물촉매-포집 알기네이트 젤 입자의 대량 생산. Chem. Eng. Commun. 120, 73-84; Seifert and Philips, 1997. 세포 고정화를 위한 작은, 단분산된 알기네이트 비드의 생산. Biotechnol. Prog. 13, 562-568). 레일리 경(Lord Rayleigh)은 뉴튼 유체에 대해 노즐 밖으로 나오는 모세관 제트의 불안정성을 분석하고 이를 묘사하는 모델을 제안한 최초의 인물이었다(Rayleigh L, 1978, On the stability of jets. Proc. London Math. Soc. 10, 4-13). 웨버(Weber C, 1931, Zum Zerfall eines Flussigkeitsstrahles. Z. Angew. Math. Mech. 11, 136-154)는 점도의 효과를 포함하여 상기 분석을 확장시켰다. 가장 빨리 성장하는 장애 및 제트 파괴에 대한 최적 파장은 하기에 의해 제공된다:
Figure 112010058485814-pct00001
상기 식에서,
λopt는 제트 파괴에 최적인 파장이고,
dj는 상기 제트의 직경이고,
η는 상기 유체의 점도이고,
ρ는 상기 유체의 밀도이고,
σ는 상기 유체의 표면 장력이다.
상기 형성된 소적의 직경 d를 하기에 의해 계산할 수 있다:
Figure 112010058485814-pct00002
목적하는 결과를 성취하기 위해 상기 유체에 적용하기 위한 진동수 f는 제트 속도(및 따라서 상기 유체의 유속) uj 및 파장과 관련이 있다:
Figure 112010058485814-pct00003
따라서, 알고 있는 공정 매개변수 및 유체 특성으로부터 최적 조건을 계산할 수 있다. 그러나, 진동수 및 제트 속도의 범위는 노즐 직경, 유체의 물성 및 표면 장력에 따라 균일한 소적을 형성하도록 존재한다(Meesters G., 1992, Mechanisms of droplet formation. Delft University Press, Delft, NL). 적합한 작용 진동수를 또한 상기 소적 형성의 안정성에 대한 가시적인 평가에 의해 실험적으로 측정할 수 있다. 표준 프릴링 장비는 상기 소적 형성을 관찰하기 위해 광 스트로보를 갖추고 있으며: 주어진 생성물 및 주어진 작용 조건에 대해서, 상기 스트로보 빛에 의해 안정하고 여전히 소적인 쇄가 관찰될 때까지 상기 진동수를 수동으로 조절할 수 있다.
더욱이, 다중노즐 시스템이 무균 프릴링 용도를 위해 개발되었다(Brandenberger H. et al. 1998. 알기네이트의 균일한 비드를 생성시키기 위한 신규의 다중노즐 캡슐화/고정화 시스템. J. Biotechnol. 63, 73-80).
결론적으로, 이용 가능한 도구 및 생성물에 대한 지식에 따라 작용 진동수를 이론 및 실험 모두에 의해 측정할 수 있다.
상기 프릴링 방법은 점성 액체 및 포화된 당 용액에 적합하다. 현재 공급자에 따라 최대로 허용 가능한 점도는 대략 300 mPa.s이다. 따라서, 제형 함량은 실온 또는 공정 온도에서 매우 낮은 농도에서부터 선택된 부형제의 용해도 한계까지의 범위일 수 있다. 더욱이, 소적 형성 전에 당 또는 용매 결정화를 피하기 위해서 공정 배관 및 노즐 중의 온도를 조절해야 한다. 제형화 분야의 숙련가는 조절되지 않은 결정화 및 상기 주어진 한계를 넘는 점도를 피하기 위해서, 부형제들 간의 최종적인 상호작용을 고려하면서 생성물 중의 상이한 부형제 농도를 조절할 것이다.
상기 제형화된 액체 생성물을 200 ㎛ 내지 1500 ㎛ 범위의 직경과 매우 좁은 크기 분포를 갖는 눈금화된 소적을 생성시키기 위해서 프릴링한다. 이들 소적을 온도가 액체 질소의 직접 주입/분무에 의해 또는 질소, CO2 또는 공기와 같은 매우 저온(T° <- 110 ℃) 기체의 역류에 의해 -110 ℃ 이하에서 유지되는 극저온 챔버에 떨어뜨린다. 상기 소적은 눈금화된 동결된 입자의 형성을 위해 그의 낙하 도중 동결된다. 상기 소적을 동결(즉 상기 펠릿을 고화시키는 빙정 형성)시키기 위한 최소 낙하 높이를 과냉각의 제한에 의해 최소화할 수 있다. 과냉각은 액체 질소 포그 또는 소적(상기 챔버에서 액체 질소의 직접 주입) 또는 미시적인 빙정(상기 저온 챔버 중의 물 또는 과열된 증기의 직접 분무)과의 접촉에 의해 상기 소적 중에 빙정 핵을 시딩함으로써 감소시킬 수 있다.
이어서 상기 동결된 입자를 모으고, 상기 동결된 소적을 그의 극저온 농축된 상의 유리 전이 Tg(Tg 값은 -10 내지 -45 ℃의 범위일 수 있다) 아래에서 항상 유지시키고 상기 입자의 임의의 용융 또는 응집을 피하기 위해 -50 ℃에서 예비 냉각된 트레이로 옮기고 동결-건조기(-50 ℃)의 예비 냉각된 선반 상에 적재한다. 일단 상기 동결-건조기가 적재되었으면, 현재 기술 수준으로 공지된 바와 같이 상기 동결-건조 챔버에 진공을 당겨 상기 펠릿의 통상적인 동결-건조(얼음의 승화)를 개시시킨다. 하기의 동결 건조 매개변수들은 Tg의 범위가 -30 내지 -45 ℃인 제형에 사용될 수 있는 예이다:
1 차 건조: 10 시간 동안 -35 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력.
2 차 건조: 3 시간 동안 20 ℃와 동일한 저장 온도, 50 μ바와 동일한 압력.
동결-건조 주기를 우선적으로 3% 미만의 잔류 수분이 획득되도록 디자인해야 한다. 그러나, 상기 수분 함량은 경우에 따라, 상기 건조 항원의 안정성이 필요로 하는 경우 보다 높은 값에서 최적화될 수 있다.
다른 건조 기술들, 예를 들어 대기압 동결-건조, 유동층 건조, 진공 회전 드럼 건조, 교반식 동결-건조, 진동식 동결-건조, 마이크로웨이브 동결-건조를 사용하여 상기 펠릿을 건조시킬 수 있다.
이어서 건조 펠릿을 벌크로 수거하여 분석 및 보관한다. 보관 조건은 건조하고, 무른 흡습성 입자에 적합하다. 건조한 샘플을 주사용 수, 완충제, 안정화 부형제 및 항원보강제를 함유할 수 있는 희석제를 사용하여 분석 전에 재수화시킨다. 용해는 즉각적이다.
이어서 벌크한 건조 펠릿을 현재 시중에 있는 건조 분말 충전 기술을 사용하여 바이알에 충전한다.
또한, 항원의 안정한 건조 벌크의 저장의 견지에서, 상기 펠릿을 바이알 또는 주사기에 액체 충전하기 전에 적합한 용매로 재조성하고 제형화(필요에 따라)할 수 있다. 상기와 같은 펠릿의 안정성 덕분에, 상기 저장원료의 보관을 +5 ℃ 이상의 온도에서 수행할 수 있으며, 이는 동결된 액체 물질(-20 ℃ 이하)의 경우보다 더 편리하다. 최종적으로, 건조한 벌크 물질의 저장은 상기 물질의 최종 용기 중에서 충전된 건조 생성물을 저장하는 것보다 훨씬 덜 공간 소모적이다.
항원보강된 백신의 경우에, +5 ℃ 이상 및 이하(동결) 온도에서 보관하는 동안의 안정성은 항원 및 항원보강제가 동일한 액체 상태로 있을 때 종종 문제가 된다. 일례로서, 하기 표는 동적인 광 산란에 의해 측정된 옥시하이드록실 알루미늄 젤 상에서 -20 ℃에서 동결-해동 주기의 영향을 개시한다:
Figure 112010058485814-pct00004
상기 미세펠릿 기술은 경우에 따라 3 개의 상이한 전략을 선택하여 안정성 문제를 극복할 수 있게 한다:
1. 미세펠릿 형태 하에서 항원 단독의 건조 및 희석제 중에서 항원보강제(알루미늄 젤, 유화액 등)와 함께 용해. 상기 전략은 상기 항원 안정성이 미세펠릿 형태 하에서 증가하고 상기 항원보강제가 단독으로 매우 열안정한 경우 적합하다
-> 저장 수명 중 상호작용 없음
-> 독립적으로 보관 시 각 상의 증가된 안정성
-> 상기 건조 항원의 상기 액체 항원보강제에 의한 즉석 용해에 의한 흡착 양상의 표준화
2. 상기 항원을 항원보강제와 건조시켜 이들 모두를 동일한 펠릿 내에서 안정화시키고 이들을 모든 분자 운동 및 화학 반응이 크게 방해되는 유리질 매트릭스에서 포집함으로써 이들 간의 상호작용을 안정화시킨다. 상기 고체 상태는 보관 기간 전체를 통해(보다 고온에서조차) 상기 항원의 효능, 상기 항원보강제의 물리적 및 면역학적 성질 및 이들 둘 간의 상호작용의 성질 및 힘을 유지시킨다.
3. 상기 항원을 건조시키고 상기 항원보강제를 별도로 건조시킨 다음, 이들 둘을 충전 전에 혼합하거나 또는 연속적으로 충전한다. 일부의 경우, 상기 항원보강제 단독의 안정성은 +5 ℃ 이상에서의 온도 장기 보관 시 액체 상태에서 문제가 될 수 있다(유화액의 화학적 안정성, 알루미늄 젤, 리포솜 및 다른 것들의 물리적 안정성...). 상기 미세펠릿 기술은 항원과 항원보강제의 별도의 미세펠릿을 생성시킴으로써 상기 항원보강된 백신의 안정성을 개선시킨다. 안정화 제형을 항원 및 항원보강제 각각에 대해 독립적으로 최적화할 수 있다. 이어서 항원 및 항원보강제의 미세펠릿을 바이알들에 연속적으로 충전할 수 있다. 상기 분리된 고체 상태는 보관 기간 전체를 통해(보다 고온에서조차) 항원과 항원보강제 간의 상호작용을 피할 수 있게 하고, 상기 항원의 효능, 및 상기 항원보강제의 물리적 및 면역학적 성질을 유지시킨다. 상기와 같은 형태에서, 상기 바이알의 내용물은 상기 항원 및 항원보강제 중 어느 하나가 액체 상태이거나 또는 항원과 항원보강제를 동일한 펠릿 내에서 건조시키는 경우의 임의의 다른 형태보다 더 안정하다. 항원과 항원보강제간의 상호작용은 이들이 주사용 수, 완충액 및 안정화 부형제를 포함할 수 있는 선택된 희석제로 상기 건조한 조합을 재수화시킨 후에만 일어날 수 있으므로 상기 방식으로 표준화된다. 따라서 상호작용은 상기 백신의 재수화 및 주사 사이의 짧은 기간 동안에만 존재한다(빠른 상호작용 및 매우 짧은 숙성 시간). 따라서 상기 두 생성물의 전체적인 안정성을 개선시킬 수 있으며(각 생성물에 대한 제형의 최적화이며 상기 둘이 함께 절충한 것이 아님) 상기 백신 자체가 상기 보관 후 상기 둘 중 어느 하나의 역가를 조절할 수 있고, 상기 두 생성물 건조의 분리에 의해 상기 제조 공정을 용이하게 할 수 있다.
상기 미세펠릿 기술에 의해 가공하기 위해서, 항원 및 항원보강제와 같은 생물학적 물질을, 상기 공정 전체를 통해 상기 물질이 겪는 물리적 및 화학적 스트레스에 대한 그의 보호를 위해 제형화할 필요가 있다.
항원보강제의 경우, 상기 안정화 제형은 가공(제형화, 펠릿화, 건조, 보관, 충전 및 재수화) 도중 그의 품질을 유지해야 한다.
상기 전략이 동일한 미세-펠릿 중에서 항원과 항원보강제를 모두 건조시키는 것인 경우, 건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물은 상기 수득된 제형화된 액체 생성물이 ㎖ 당 표적 량의 안정화 부형제, 항원보강제 및 항원을 함유하도록 상기 농축된 백신 벌크(항원 함유), 농축된 항원보강제 벌크, 및 하나 이상의 탄수화물 및/또는 당 알콜을 포함하는 안정화 제형을 혼합함으로써 수득된다. 상기 안정화 부형제의 농도 범위는 2%(w/v)에서부터 상기 제형화된 액체 생성물에 대한 용해도 한계까지이다.
도 3은 항원보강제를 포함하는 제형화 및 건조 과정을 나타내는 흐름도이다.
상기 전략이 별도의 미세펠릿에서 항원과 항원보강제를 건조시키는 것인 경우, 건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물(항원 포함)은 상기 수득된 제형화된 액체 생성물이 ㎖ 당 표적 량의 안정화 부형제 및 항원을 함유하도록 상기 농축된 백신 벌크(항원 함유) 및 안정화 제형을 혼합함으로써 수득된다. 상기 탄수화물 및 안정화 부형제의 농도 범위는 2%(w/v) 내지 상기 제형화된 액체 생성물에 대한 용해도 한계까지이다.
상기 항원보강제의 경우와 동일한 방식으로, 건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물은 상기 수득된 제형화된 액체 생성물이 ㎖ 당 표적 량의 안정화 부형제 및 항원보강제를 함유하도록 상기 농축된 항원보강제 벌크와 안정화 제형을 혼합함으로써 수득된다. 상기 탄수화물 및 안정화 부형제의 농도 범위는 2%(w/v) 내지 상기 제형화된 액체 생성물에 대한 용해도 한계까지이다.
도 4는 항원 함유 미세펠릿을 생성시키기 위한 제형화 및 건조 과정을 나타내는 흐름도이다. 도 5는 항원보강제 함유 미세펠릿을 생성시키기 위한 제형화 및 건조 과정을 나타내는 흐름도이다. 도 6은 건조 백신을 완성하기 위한 상이한 미세펠릿들의 조합을 나타낸다.
상기 건조한 미세펠릿의 생성을 위한 일반적인 방법을 도 2에 나타낸다. 이를 상기 항원보강된 백신에 대해 선택된 전략과 별개로 적용할 수 있다.
상기 미세펠릿 기술의 고속 동결 동역학은 또한 항원보강제의 건조에 적합하다. 일례로서, 도 9의 그래프는 탄수화물의 존재 하에서 미세펠릿 기술을 사용하여 알루미늄 포스페이트 젤 건조 후의 크기 분포 결과를 나타낸다. 건조 및 재수화가 항원보강제 입자의 크기 분포에 현저한 부정적인 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
고려될 수 있는 적합한 항원보강제를 하기에 예시한다:
1) 미립자 항원보강제, 예를 들어 리포솜 및 특히 양이온성 리포솜(예를 들어 DC-Chol, 예를 들어 US 2006/0165717, DOTAP, DDAB 및 1,2-다이알카노일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(에틸PC) 리포솜, US 7,344,720 참조), 지질 또는 세정성 마이셀 또는 다른 지질 입자(예를 들어 CSL 또는 Isconova로부터의 아이스코매트릭스(Iscomatrix), 바이로솜 및 프로테오코킬레이트), 중합체 나노입자 또는 미세입자(예를 들어 PLGA 및 PLA 나노- 또는 미세입자, PCPP 입자, 알기네이트/키토산 입자) 또는 용해성 중합체(예를 들어 PCPP, 키토산), 단백질 입자, 예를 들어 나이세리아 메닌지티디스 프로테오솜, 무기물 젤(표준 알루미늄 항원보강제: AlOOH, AlPO4), 미세입자 또는 나노입자(예를 들어 Ca3(PO4)2), 중합체/알루미늄 나노하이브리드(예를 들어 PMAA-PEG/AlOOH 및 PMAA-PEG/AlPO4 나노입자) O/W 유화액(예를 들어 Novartis로부터 MF59, GlaxoSmithKline Biologicals로부터 AS03) 및 W/O 유화액(예를 들어 Seppic으로부터의 ISA51 및 ISA720, 또는 WO 2008/009309에 개시된 바와 같은). 예를 들어, 본 발명에 따른 방법에 적합한 항원보강제 유화액은 WO 2007/006939에 개시된 것이다.
2) 천연 추출물, 예를 들어 사포닌 추출물 QS21 및 그의 반-합성 유도체, 예를 들어 아반토젠(Avantogen)에 의해 개발된 것들, 세균 세포 벽 추출물(예를 들어 Corixa/GSK에 의해 개발된 마이크로박테리움 세포 벽 골격 및 마이코박테리움 코드 인자 및 그의 합성 유도체, 트레할로스 다이마이콜레이트).
3) 고유 면역 수용체의 자극제, 예를 들어 천연 또는 합성 TLR 작용물질(예를 들어 TLR2/1 또는 TLR2/6 이종이량체를 자극하는 합성 리포펩타이드, TLR3를 자극하는 이중 가닥 RNA, TLR4를 자극하는 LPS 및 그의 유도체 MPL, TLR4를 자극하는 E6020 및 RC-529, TLR5를 자극하는 플라젤린, TLR7 및/또는 TLR8을 자극하는 단일 가닥 RNA 및 3M의 합성 이미다조퀴놀린, TLR9를 자극하는 CpG DNA, 천연 또는 합성 NOD 작용물질(예를 들어 뮤라밀 다이펩타이드), 천연 또는 합성 RIG 작용물질(예를 들어 바이러스 핵산 및 특히 3' 포스페이트 RNA).
이들 항원보강제를 또한 함께 사용할 수 있다. 바람직한 조합은 미립자 항원보강제와 천연 추출물 간의 조합 및 미립자 항원보강제와 고유 면역 수용체의 자극제 간의 조합이다.
하기 실시예들의 경우, 프릴링 장치 IE-50R 엔캡슐레이터 리써치(Encapsulator Research, Inotech(CH)로부터) 및 300 ㎛ 노즐 헤드를 사용하여 미세펠릿을 생성시켰다.
실시예 1: 독감 항원을 함유하는 미세펠릿 형태 하의 열-안정성 건조 백신의 제조
본 연구는 현행 액체 3가 독감 백신의 열-안정성을 상기 미세펠릿 기술로 가공한 동일 백신의 건조 제형과 비교하였다. 3가 독감 백신은 백신 완충액 중에 각각 30 ㎍/㎖의 A/살로몬, B/말레이시아 및 A/위스콘신 균주를 함유한다. 건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물은 1 부피의 3가 독감 백신을 1 부피의, 4%(w/v) 내지 용해도 한계 범위의 농도로 하나 이상의 탄수화물을 포함하는 안정화 제형과 혼합하여 수득하였다. 이는 상기 건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물 중의 2% 내지 32%(중량/부피) 범위의 농도에 상응한다. 2 개의 제형을 평가하였다: SG1 및 SG2(조성을 표 1 및 2에 제공한다):
SG1
성분
양 1000 Ml
슈크로스 200 G
조절 pH @ 7.0 +/- 0.2, (NaOH, HCl)
수 PPI 1000 Ml
SG2
성분
양 1000 ml
슈크로스 200 g
글루타민 2 g
유레아 10 g
덱스트란 70 10 g
조절 pH @ 7.0 +/- 0.2, (NaOH, HCl)
수 PPI 1000 ml
도 7은 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
도 2는 제형 SG1 및 SG2의 건조한 미세펠릿의 생성에 사용된 공정을 나타낸다.
제형화된 액체 생성물 SG1 및 SG2를 눈금화된 소적의 생성을 위해 프릴링하였다. 상기 제형 및 300 ㎛ 노즐 헤드에 대한 프릴링 매개변수는 하기와 같았다:
-생성물 유속: 8 ㎖/분
-노즐 진동수: 954 Hz
상기 소적을 액체 질소의 직접 주입에 의해서 또는 매우 저온 기체(t°<-110 ℃)의 역류에 의해서 온도가 -110 ℃ 아래로 유지되는 극저온 챔버에 떨어뜨렸다. 상기 낙하 도중 상기 소적이 동결되고 눈금화된 동결 입자가 형성되었다.
이어서 상기 동결된 입자를, 상기 동결된 소적을 그의 유리 전이(-30 내지 -40 ℃로 평가되었다) 아래에서 항상 유지시키고 상기 입자의 임의의 용융 또는 응집을 피하기 위해서 -50 ℃에서 예비-냉각된 트레이로 옮기고 동결-건조기(-50 ℃)의 예비 냉각된 선반 상에 적재하였다. 일단 상기 동결-건조기가 적재되었으면, 현재 기술 수준으로 공지된 바와 같이 상기 동결-건조 챔버에 진공을 당겨 상기 펠릿의 통상적인 동결-건조를 개시시켰다. 이들 제형에 대해서, 하기의 동결 건조 매개변수들을 사용하였다: 1 차 건조: 10 시간 동안 -35 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 2 차 건조: 3 시간 동안 20 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 상기 미세펠릿의 잔류 수분은 SG1 및 SG2 제형 모두에 대해 2% 이하였다.
도 8은 상기 펠릿화 및 건조 기술에 의해 획득된 매우 좁은 크기 분포의 개념을 제공한다.
따라서, 3 개의 생성물을 열-안정성 연구에 이용할 수 있었다: 시판되는 3가 독감 백신(VAXIGRIP(등록상표), Sanofi Pasteur), 건조한 미세펠릿 SG1 제형(3가 독감 백신) 및 건조한 미세펠릿 SG2 제형(3가 독감 백신).
상기 3 개 제형 각각의 샘플을 37 ℃ 및 45 ℃에서 상이한 시간으로 노출시켰다. 이어서 효능(항원 ㎍/㎖)을 SRD(SRID) 방법(M.S. Williams, Veterinary Microbiology, 37(1993) 253-262)에 의해 각 샘플에 대해 측정하였다. 건조한 샘플들을 분석 전에 주사용 수로 재수화시켰다. 용해는 즉각적이었다. 표 3, 4 및 5는 획득된 결과를 요약한다. 결과를 항원의 평균값 ㎍/㎖로 나타낸다.
A/살로몬
 37 ℃에서 안정성(일수) 45 ℃에서 안정성(일수)
0 7 30 90 0 7
액체 제형 29.8 24.3 12.1 29.8 16.4
미세펠릿 SG1 23.2 22.5 24.9 27 23.2 24.3
미세펠릿 SG2 26.5 24.7 28.2 29.4 26.5 25.8
B/말레이시아 37 ℃에서 안정성(일수) 45 ℃에서 안정성(일수)
0 7 30 90 0 7
액체 제형 30 21.4 14.4 30 16.3
미세펠릿 SG1 25.4 25.7 24.9 28.2 25.4 24
미세펠릿 SG2 26.6 25.4 27.2 30.4 26.6 26.7
A/위스콘신 37 ℃에서 안정성(일수) 45 ℃에서 안정성(일수)
0 7 30 90 0 7
액체 제형 30 24.7 13.2 30 16
미세펠릿 SG1 25.4 24.6 25.5 26.8 25.4 25
미세펠릿 SG2 28.7 26 28.4 30.7 28.7 27.8
상기 결과는 미세펠릿 형태의 건조된 제형 SG1 및 SG2가 현행 액체 제형보다 훨씬 더 안정함을 보인다. 37 ℃에서 3 개월 이하 및 45 ℃에서 1 주일 후에 현저한 항원성 손실은 측정되지 않았다.
실시예 2: 알루미늄 옥시하이드록사이드 젤로 항원보강된 독감 H5N1(인도네시아) 항원을 함유하는 미세펠릿 형태 하의 열-안정성 건조 백신의 제조
본 연구는 액체 H5N1 인도네시아 독감 백신의 열 안정성을 본 발명에 따른 미세펠릿 기술로 가공된 동일 백신의 건조 제형과 비교하였다.
상기 백신은 알루미늄 옥시하이드록사이드 젤에 의해 항원보강된, 백신 완충액 중의 H5N1 인도네시아 균주 65.4 ㎍/㎖을 함유한다.
건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물을, 1 부피의 H5N1 백신과 1 부피의 안정화 제형 SG1(SG1 조성물에 대해 실시예 1 참조)을 혼합하여 수득하였다.
도 10은 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
제형화된 액체 생성물 SG1을 눈금화된 소적의 생성을 위해 프릴링하였다. 상기 제형 및 300 ㎛ 노즐 헤드에 대한 프릴링 매개변수는 하기와 같았다:
-생성물 유속: 8 ㎖/분
-노즐 진동수: 916 Hz
상기 소적을 액체 질소의 직접 주입에 의해서 또는 매우 저온 기체(t°<-110 ℃)의 역류에 의해서 온도가 -110 ℃ 아래로 유지되는 극저온 챔버에 떨어뜨렸다. 상기 낙하 도중 상기 소적이 동결되고 눈금화된 동결 입자가 형성되었다.
이어서 상기 동결된 입자를, 상기 동결된 소적을 그의 유리 전이(-30 내지 -40 ℃로 평가되었다) 아래에서 항상 유지시키고 상기 입자의 임의의 용융 또는 응집을 피하기 위해서 -50 ℃에서 예비-냉각된 트레이로 옮기고 동결-건조기(-50 ℃)의 예비 냉각된 선반 상에 적재한다. 일단 상기 동결-건조기가 적재되었으면, 현재 기술 수준으로 공지된 바와 같이 상기 동결-건조 챔버에 진공을 당겨 상기 펠릿의 통상적인 동결-건조를 개시시켰다. 이들 제형에 대해서, 하기의 동결 건조 매개변수들을 사용하였다: 1 차 건조: 10 시간 동안 -35 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 2 차 건조: 3 시간 동안 20 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 상기 미세펠릿의 잔류 수분은 2% 이하였다.
상기 미세펠릿 샘플을 37 ℃ 및 45 ℃에서 7일 노출시켰다. 이어서 효능(항원 ㎍/㎖)을 SRD 방법에 의해 각 샘플에 대해 측정하였다. 건조한 샘플들을 분석 전에 주사용 수로 재수화시켰다. 용해는 즉각적이었다. 표 6은 획득된 결과를 요약한다. 결과를 항원의 평균값 ㎍/㎖로 나타낸다. N.D.은 "검출 가능한 항원성이 없음"을 나타낸다.
SRD 역가
㎍/㎖		 액체 제형 미세펠릿 SG1
T0 65.4 53.6
7d @ 37 ℃ 52.5 51.4
7d @ 45 ℃ <7.0 47.9
7d @ 55 ℃ N.D. 44.9
상기 결과는 상기 미세펠릿 형태의 건조된 제형 SG1이 현행 액체 제형보다 훨씬 더 안정함을 보인다. 37 ℃ 및 45 ℃에서 1 주일 후 현저한 항원성 손실은 측정되지 않았다. 대략 15%의 손실이 55 ℃에서 1 주일 후 관찰되었으며, 이는 상기 분석 자체의 정밀도에 가깝다.
상기 건조 공정 및 항원보강제 성질에 대한 상기 펠릿의 재수화의 영향을 상기 펠릿의 건조 전, 및 용해 후 입자 크기 분석기 맬버른 마스터사이저(Malvern MasterSizer) 2000을 사용하여 상기 제형화된 벌크 중의 알루미늄 옥시하이드록사이드 입자 크기 분포를 측정함으로써 평가하였다. 결과를 도 11에 제공한다. 상기 공정이 상기 젤의 응집을 유도하지 않은 것으로 관찰되었다.
도 12는 또한 상기 젤의 크기가 37 ℃, 45 ℃ 및 55 ℃에서 7일 이상 열안정성 배양 후 유지됨을 보이며, 미세펠릿 형태의 알룸 젤 항원보강제의 안정성을 입증한다.
본 실시예는 알룸 젤 항원보강된 독감 항원에 대한 상기 기술의 적용성, 및 가장 일반적으로는 상기 미세펠릿 기술을 사용하여 알룸 젤로 항원보강된 건조 항원에 대한 실행가능성을 입증한다.
실시예 3: 항원보강되지 않은 독감 H5N1(인도네시아)을 함유하는 미세펠릿 형태 하의 열-안정성 건조 백신의 제조 및 항원보강제 유화액에 의한 재수화
본 연구는 액체 H5N1 인도네시아 독감 백신의 열 안정성을 상기 미세펠릿 기술로 가공된 동일 백신의 건조 제형과 비교하였다.
상기 백신은 백신 완충액 중의 H5N1 인도네시아 균주 176 ㎍/㎖을 함유한다.
건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물을 목적하는 항원 농도 및 안정화제 함량을 표적으로, H5N1 백신과 안정화 제형 SG1을 혼합하여 수득하였다. 제형 SG1을 평가하였다(SG1 조성물에 대해 실시예 1 참조).
도 13은 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
제형화된 액체 생성물을 눈금화된 소적의 생성을 위해 프릴링하였다. 상기 제형 및 300 ㎛ 노즐 헤드에 대한 프릴링 매개변수는 하기와 같았다:
-생성물 유속: 8 ㎖/분
-노즐 진동수: 997 Hz
상기 소적을 액체 질소의 직접 주입에 의해서 또는 매우 저온 기체(t°<-110 ℃)의 역류에 의해서 온도가 -110 ℃ 아래로 유지되는 극저온 챔버에 떨어뜨렸다. 상기 낙하 도중 상기 소적이 동결되고 눈금화된 동결 입자가 형성되었다.
이어서 상기 동결된 입자를, 상기 동결된 소적을 그의 유리 전이(-30 내지 -40 ℃로 평가되었다) 아래에서 항상 유지시키고 상기 입자의 임의의 용융 또는 응집을 피하기 위해서 -50 ℃에서 예비-냉각된 트레이로 옮기고 동결-건조기(-50 ℃)의 예비 냉각된 선반 상에 적재한다. 일단 상기 동결-건조기가 적재되었으면, 현재 기술 수준으로 공지된 바와 같이 상기 동결-건조 챔버에 진공을 당겨 상기 펠릿의 통상적인 동결-건조를 개시시켰다. 이들 제형에 대해서, 하기의 동결 건조 매개변수들을 사용하였다: 1 차 건조: 10 시간 동안 -35 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 2 차 건조: 3 시간 동안 20 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 상기 미세펠릿의 잔류 수분은 2% 이하였다.
병행하여, 동일한 제형화된 생성물을 생성시키고, 바이알에 충전하고 표준 동결-건조기에서 통상적으로 동결 건조시켰다. 충전된 바이알을 5 ℃에서 예비-냉각된 선반에 적재하고; 이어서 상기 생성물을 1 ℃/분으로 -50 ℃로 동결시키고 진공을 당겨 승화를 개시시켰다. 1 차 건조 매개변수는 16 시간 동안 선반 온도가 -18 ℃와 같고, 압력은 50 μ바와 같았다. 2 차 건조 매개변수는 2 시간 동안 선반 온도가 37 ℃와 같고 압력은 50 μ바와 같았다.
상기 동결-건조된 생성물의 잔류 수분도 또한 2% 이하였다.
상기 미세펠릿 및 액체 샘플을 37 ℃, 45 ℃ 및 55 ℃에서 상이한 시간으로 노출시켰다. 동결-건조된 샘플을 37 ℃ 및 55 ℃에서 노출시켰다. 이어서 효능(항원 ㎍/㎖)을 SRD 방법에 의해 각 샘플에 대해 측정하였다. 건조한 샘플들을 분석 전에 주사용 수(WFI)로 재수화시켰다. 용해는 즉각적이었다. 표 7, 8 및 9는 각각 표준 액체 제형, 건조된 미세펠릿 및 동결-건조된 생성물에 대한 결과들을 요약한다. 결과를 항원의 평균값 ㎍/㎖로 나타낸다. T0에서 초기 SRD 역가는 가공 후 상기 미세펠릿의 재조성 후 측정된 역가에 상응한다.
초기 SRD 역가: T0 = 14.1 ㎍/㎖
액체 H5N1 안정성 연구 SRD 역가 ㎍/㎖ 시간
7 일 1 개월 3 개월
37 ℃에서 열안정성 11.6 5 <5
45 ℃에서 열안정성 3.4 <5 <5
55 ℃에서 열안정성 <5 <5 <5
초기 SRD 역가: T0 = 47.2 ㎍/㎖
건조한 미세펠릿 H5N1 안정성 연구 SRD 역가 ㎍/㎖,
WFI 재수화		 시간
7 일 1 개월 3 개월
37 ℃에서 열안정성 53 47.3 50.1
45 ℃에서 열안정성 51.6 47 41.1
55 ℃에서 열안정성 49.5 45.4 47.3
초기 SRD 역가: T0 = 39.4 ㎍/㎖
동결 건조된 H5N1 안정성 연구
SRD 역가 ㎍/㎖,
WFI 재수화		 시간
14 일 1 개월
37 ℃에서 열안정성 36.9 38.1
55 ℃에서 열안정성 35.6 35.1
상기 결과는 상기 미세펠릿 형태의 건조된 제형 SG1이 현행 액체 제형보다 훨씬 더 안정함을 보인다. 37 ℃, 45 ℃ 및 55 ℃에서 3 개월 후 현저한 항원성 손실은 측정되지 않았다. 표 9에 제공된 결과는 표준 동결-건조가 또한 양호한 열안정성을 제공함을 입증한다.
더욱이, 표 10에 제공된 데이터는 +5 ℃에서 9 개월 후 항원성 손실이 측정되지 않았음을 보인다. 이러한 결과는 수년의 기간 동안 +5 ℃ 및 실온에서 장기 안정성에 매우 유망하다.
상기 H5N1 미세펠릿을 유화액으로 재수화시킬 가능성이 연구되었다. 상기 연구에 사용된 유화액은 특허 출원 WO 2007/006939에 개시된 것이다. 표 8과 동일한 실험 계획을 수행하였으나 샘플들을 주사용 수보다는 상기 유화액으로 재수화시켰다. 결과를 표 10 및 표 11에 제공한다.
T0에서 H5N1 미세펠릿 제형
(㎍/㎖)		 T0 + 5 ℃에서 9개월에서 H5N1 미세펠릿 제형
(㎍/㎖)
건조 후. WFI 재수화 47.2 54.8
건조 후. 유화액 재수화 49.2 51
초기 SRD 역가: T0 = 49.2 ㎍/㎖
건조한 H5N1 안정성 연구
SRD 역가 ㎍/㎖,
유화액 재수화		 시간
7 일 1 개월 3 개월
37 ℃에서 열안정성 46.5 42.6 47.8
45 ℃에서 열안정성 43.1 46.1 46.5
55 ℃에서 열안정성 41.8 42.7 41.7
표 10은 항원보강제로서 유화액으로 상기 미세펠릿을 용해시키는 것이 상기 항원의 안정성에 영향을 주지 못하며 따라서 그의 회수에도 영향을 미치지 못함을 입증한다. 표 11은 측정된 모든 역가가 주사용 수에 의한 용해 후 측정된 역가에 필적할만하므로 상기 진술이 상기 미세펠릿의 열안정성 배양 후에도 또한 입증됨을 확인한다.
도 14는 이들 미세펠릿의 재수화 전 및 용해 후 상기 유화액의 크기 비교를 나타낸다. 상기 두 크기 분포의 중첩은 상기 유화액의 크기, 및 따라서 그의 보전이 동결-건조된 매트릭스의 재수화에 의해 현저하게 변경되지 않음을 보인다. 상기 크기 분포는 단정상이고 100 ㎚ 상에 집중된 채로 있다. 더욱이, 도 15는 상기 미세펠릿의 용해 후 및 실온에서 1 시간 보관 기간에 걸쳐 상기 유화액의 크기 안정성을 입증한다.
본 연구는 상기 미세펠릿 기술 덕분에, 상기 항원보강제를 용해 완충액으로서 사용할 수 있고 상기 생성물의 저장 수명 동안 상기 항원보강제와 항원 간의 모든 상호작용을 피할 수 있음을 확인한다.
실시예 4a: 안정화제로서 사용된 상이한 당과 함께 항원보강되지 않은 독감 H5N1(인도네시아)을 함유하는 미세펠릿 형태 하의 열 안정성 건조 백신의 제조
본 연구는 상이한 이당류들(각각 트레할로스, 락토오스 및 말토오스)을 각각 포함하는 3 개의 안정화된 건조한 인플루엔자 백신 조성물의 제조 및 상기 미세펠릿 기술에 의해 가공된 상기와 같은 건조한 조성물의 열 안정성을 나타낸다.
상기 백신은 백신 완충액 중의 H5N1 인도네시아 균주 131 ㎍/㎖을 함유한다.
건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물을 목적하는 항원 농도 및 2%(w/v)의 안정화제 함량을 표적으로, H5N1 백신과 안정화 제형 SG5, SG6 및 SG7 각각(표 12, 13 및 14 참조)을 혼합하여 수득하였다.
SG5
성분
양 1000 ml
트레할로스 200 g
조절 pH @ 7.0 +/- 0.2, (NaOH, HCl)
수 PPI 1000 ml
SG6
성분
양 1000 ml
락토오스 200 g
조절 pH @ 7.0 +/- 0.2, (NaOH, HCl)
수 PPI 1000 ml
SG7
성분
양 1000 ml
말토오스 200 g
조절 pH @ 7.0 +/- 0.2, (NaOH, HCl)
수 PPI 1000 ml
도 13은 예로서 SG1 안정화제를 사용한 상기 제형 및 건조 과정의 원리에 대한 흐름도를 나타낸다. 프릴링에 앞서 상기 제형화된 생성물 중에 15.4%(w/v)의 이당류 농도를 획득하기 위해 SG5, SG6 및 SG7에 대해 동일한 흐름도를 사용하였다.
상기 3 개의 제형화된 액체 생성물들 각각을 눈금화된 소적의 생성을 위해 프릴링하였다. 상기 제형 및 300 ㎛ 노즐 헤드에 대한 프릴링 매개변수는 하기와 같았다:
-생성물 유속: 8 ㎖/분
-노즐 진동수: 상기 제형에 따라 994 Hz 및 1001 Hz의 범위
상기 소적들을 액체 질소의 직접 주입에 의해서 또는 매우 저온 기체(t°<-110 ℃)의 역류에 의해서 온도가 -110 ℃ 아래로 유지되는 극저온 챔버에 떨어뜨렸다. 상기 낙하 도중 상기 소적이 동결되고 눈금화된 동결 입자가 형성되었다.
이어서 상기 동결된 입자들을, 상기 동결된 소적들이 그들의 유리 전이(-30 내지 -40 ℃로 평가되었다) 아래에서 항상 유지시키고 상기 입자들의 임의의 용융 또는 응집을 피하기 위해서 -50 ℃에서 예비-냉각된 트레이로 옮기고 동결-건조기(-50 ℃)의 예비 냉각된 선반 상에 적재한다. 일단 상기 동결-건조기가 적재되었으면, 현재 기술 수준으로 공지된 바와 같이 상기 동결-건조 챔버에 진공을 당겨 상기 펠릿의 통상적인 동결-건조를 개시시켰다. 이들 제형에 대해서, 하기의 동결 건조 매개변수들을 사용하였다: 1 차 건조: 10 시간 동안 -35 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 2 차 건조: 3 시간 동안 20 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 상기 미세펠릿들의 잔류 수분은 2% 이하였다.
상기 미세펠릿 샘플들을 37 ℃ 및 55 ℃에서 상이한 시간으로 노출시켰다. 이어서 효능(항원 ㎍/㎖)을 SRD 방법에 의해 각 샘플에 대해 측정하였다. 건조한 샘플들을 분석 전에 주사용 수(WFI)로 재수화시켰다. 용해는 즉각적이었다. 표 15, 16 및 17은 건조된 미세펠릿 형태의 상기 3 개 조성물들 각각에 대해 획득된 열안정성 결과를 각각 요약한다. 결과를 항원의 평균값 ㎍/㎖로 나타낸다. T0에서 초기 SRD 역가는 가공 후 상기 미세펠릿들의 재조성 후 측정된 역가에 상응한다.
초기 SRD 역가: T0 = 61.5 ㎍/㎖
건조한 미세펠릿 H5N1 + SG5 안정성 연구
SRD 역가 ㎍/㎖,
WFI 재수화		 시간
14 일 1 개월
37 ℃에서 열안정성 57.7 58.7
55 ℃에서 열안정성 57.2 58.9
초기 SRD 역가: T0 = 60.2 ㎍/㎖
건조한 미세펠릿 H5N1 + SG6 안정성 연구
SRD 역가 ㎍/㎖,
WFI 재수화		 시간
14 일 1 개월
37 ℃에서 열안정성 53.0 50.5
55 ℃에서 열안정성 52.4 53.1
초기 SRD 역가: T0 = 61.5 ㎍/㎖
건조한 미세펠릿 H5N1 + SG7 안정성 연구
SRD 역가 ㎍/㎖,
WFI 재수화		 시간
14 일 1 개월
37 ℃에서 열안정성 52.8 49.6
55 ℃에서 열안정성 50.4 51.2
이들 결과는 안정화제로서 사용된 광범위한 사카라이드 부형제들에 대한 유사한 안정성 프로파일을 입증한다.
실시예 4b: 가공할 준비가 된 제형화된 벌크 중에 2%(w/v) 슈크로스와 함께 항원보강되지 않은 독감 H5N1(인도네시아)을 함유하는 미세펠릿 형태 하의 열 안정성 건조 백신의 제조
상기 백신은 백신 완충액 중의 H5N1 인도네시아 균주 176 ㎍/㎖을 함유한다.
건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물을 목적하는 항원 농도 및 2%(w/v)의 안정화제 함량을 표적으로, H5N1 백신과 안정화 제형 SG8을 혼합하여 수득하였다. 표 18은 상기 안정화 제형 SG8의 조성을 나타낸다.
SG8
성분
양 1000 ml
슈크로스 26 g
조절 pH @ 7.0 +/- 0.2, (NaOH, HCl)
수 PPI 1000 ml
2% w/v 슈크로스를 함유하는 제형화된 액체 벌크(SG8과 함께 제형화된 액체 벌크)로부터 제조된 미세펠릿을 실시예 4a에 개시된 바와 같이 수득하였다. 도 16은 상기 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
상기 미세펠릿 샘플들을 37 ℃ 및 55 ℃에서 상이한 시간으로 노출시켰다. 이어서 효능(항원 ㎍/㎖)을 SRD 방법에 의해 각 샘플에 대해 측정하였다. 건조한 샘플들을 분석 전에 주사용 수(WFI)로 재수화시켰다. 용해는 즉각적이었다. 표 19는 상기 건조된 미세펠릿에 대해 획득된 결과를 나타낸다. 결과를 항원의 평균값 ㎍/㎖로 나타낸다. T0에서 초기 SRD 역가는 가공 후 상기 미세펠릿들의 재조성 후 측정된 역가에 상응한다.
초기 SRD 역가: T0 = 39.6 ㎍/㎖
건조한 미세펠릿 H5N1 + SG8 안정성 연구
SRD 역가 ㎍/㎖,
WFI 재수화		 시간
14 일 1 개월
37 ℃에서 열안정성 32.9 33.6
55 ℃에서 열안정성 34.71 34.0
실시예 5: 항원보강된 디프테리아 독소(Dt) 및 파상풍 독소(Tt) 백신에 대한 미세펠릿 가공의 영향에 대한 연구
본 연구의 첫 번째 부분은 알루미늄 젤 ALOOH 상에의 예비 흡착과 함께 또는 상기 없이 미세펠릿 형태로 동결 건조시킨 파상풍 Tt 및 Dt 항원의 안정성을 평가하였다. 5 개의 제형들을 하기 개시된 바와 같이 제조하였다.
알루미늄 젤의 존재 하에서 디프테리아 Dt 또는 파상풍 Tt를 함유하는 건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물을, 하기의 조성물을 수득하기 위해 주어진 부피의 디프테리아 또는 파상풍 독소 농축된 벌크와 알루미늄 젤 및 안정화제를 혼합하여 수득하였다:
-Dt(디프테리아 독소) 제형화된 생성물: 항원 200 Lf/㎖ 및 알루미늄 젤 0.8㎎/㎖
-Tt(파상풍 독소) 제형화된 생성물: 항원 40 Lf/㎖ 및 알루미늄 젤 0.8㎎/㎖
도 17은 이들 두 제형의 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
알루미늄 젤 없이 디프테리아 Dt 또는 파상풍 Tt를 함유하는 건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물을, 하기의 조성물을 수득하기 위해 주어진 부피의 디프테리아 또는 파상풍 독소 농축된 벌크와 안정화제를 혼합하여 수득하였다:
-Dt(디프테리아 독소) 제형화된 생성물: 항원 500 Lf/㎖
-Tt(파상풍 독소) 제형화된 생성물: 항원 100 Lf/㎖
도 18은 이들 두 제형의 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
디프테리아 독소 및 파상풍 독소에 대한 항원 함량을 현재 기술 수준에 의해 수행되는 바와 같은 로켓 면역-전기영동 시험을 사용하여 측정하였다.
오직 알루미늄 젤만을 함유하는 건조시키고자 하는 제형화된 액체 생성물을, 하기의 조성물을 수득하기 위해서 주어진 부피의 알루미늄 젤과 안정화제를 혼합하여 수득한다:
-알루미늄 젤 ALOOH 제형화된 생성물: 2.4 ㎎/㎖
도 19는 상기 제형의 제형화 및 건조 과정의 흐름도를 나타낸다.
본 실험에 사용된 안정화제(SDT-1이라 칭함)의 조성을 하기 표에 제공한다:
SDT-1
1000 ㎖에 대한 양
슈크로스 100 G
트레할로스 100 G
50 mM 트리스 6.055 G
pH 조절, 7.0+/-0.2(NaOH, HCl)
주사용 수 1000 ㎖
제형화된 액체 생성물을 눈금화된 소적의 생성을 위해 프릴링하였다. 상기 제형 및 300 ㎛ 노즐 헤드에 대한 프릴링 매개변수를 하기 표에 요약한다:
디프테리아 독소 파상풍 독소 디프테리아 독소 + Al 젤 파상풍 독소 + Al 젤 Al 젤
유속 8 ㎖/분 8 ㎖/분 8 ㎖/분 8 ㎖/분 8 ㎖/분
진동수(Hz) 1487 1543 1223 1282 1479
상기 소적들을 액체 질소의 직접 주입에 의해서 또는 매우 저온 기체(t°<-110 ℃)의 역류에 의해서 온도가 -110 ℃ 아래로 유지되는 극저온 챔버에 떨어뜨렸다. 상기 낙하 도중 상기 소적이 동결되고 눈금화된 동결 입자가 형성되었다.
이어서 상기 동결된 입자들을, 상기 동결된 소적들이 그들의 유리 전이(-30 내지 -40 ℃로 평가되었다) 아래에서 항상 유지시키고 상기 입자들의 임의의 용융 또는 응집을 피하기 위해서 -50 ℃에서 예비-냉각된 트레이로 옮기고 동결-건조기(-50 ℃)의 예비 냉각된 선반 상에 적재한다. 일단 상기 동결-건조기가 적재되었으면, 현재 기술 수준으로 공지된 바와 같이 상기 동결-건조 챔버에 진공을 당겨 상기 펠릿의 통상적인 동결-건조를 개시시켰다. 이들 제형에 대해서, 하기의 동결 건조 매개변수들을 사용하였다: 1 차 건조: 10 시간 동안 -35 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 2 차 건조: 3 시간 동안 20 ℃와 동일한 선반 온도, 50 μ바와 동일한 압력. 상기 미세펠릿들의 잔류 수분은 2% 이하였다.
미세펠릿 샘플들을 37 ℃ 및 55 ℃에서 노출시켰다. 효능(Lf/㎖)을 로켓 면역-전기영동 시험에 의해 각 샘플에 대해 측정하였다. 건조한 샘플들을 분석 전에 주사용 수로 재수화시켰다. 용해는 즉각적이었다.
디프테리아 독소 안정성 결과:
디프테리아 독소
표적=100Lf/㎖		 시간(일수)
0 14 30 90
37 ℃에서 안정성(Lf/㎖) 98.5 100.3 100 86.7
55 ℃에서 안정성(Lf/㎖) 98.5 102.2 104 87.6
상기 결과는 37 ℃ 및 55 ℃에서 1 개월 후에 현저한 손실이 없고 3 개월 후에 단지 약 13%의 손실(유의수준의 한계에 있다)만이 있음을 입증한다. 더욱이, 디프테리아 독소 및 알룸 젤을 함유하는 미세펠릿의 배양은 모든 시점 및 모든 시험 온도에서, 상기 항원의 100%가 용해 후 상기 젤에 흡착된 채로 있음을 보였다. 상기 용해 후 젤 크기 분포의 관찰된 안정성 및 열 안정성 연구는 알룸 젤로 항원보강된 독감 H5N1에 대한 것(실시예 2 참조)과 유사한 결과를 보였다.
파상풍 독소 안정성 결과:
파상풍 독소
표적 = 20 Lf/㎖		 시간(일수)
0 14 30 90
37 ℃에서 안정성(Lf/㎖) 18.1 21.8 20.1 17.1
55 ℃에서 안정성(Lf/㎖) 18.1 21.8 20.9 18
상기 결과는 37 ℃ 및 55 ℃에서 3 개월 후에 현저한 손실이 없음을 입증한다. 더욱이, 파상풍 독소 및 알룸 젤을 함유하는 미세펠릿의 배양은 모든 시점 및 모든 시험 온도에서, 상기 항원의 100%가 용해 후 상기 젤에 흡착된 채로 있음을 보였다. 상기 용해 후 젤 크기 분포의 관찰된 안정성 및 열 안정성 연구는 알룸 젤로 항원보강된 독감 H5N1에 대한 것(실시예 2 참조)과 유사한 결과를 보였다.
이들 데이터는 상기 미세펠릿 방법이 적합하게 제형화된 경우, 현저한 분해 없이 55 ℃에서 3 개월까지, 효능, 흡착 상태 및 항원보강제 품질의 면에서, 열안정성의 항원보강되거나 항원보강되지 않은 건조한 디프테리아 및 파상풍 독소 백신을 수득할 수 있게 함을 입증한다. 더욱이, 알루미늄 젤을, 상기 미세펠릿 기술을 사용하여 필적할만한 크기 분포를 유지하고 대량 응집을 피하면서 성공적으로 동결 건조시킬 수 있었다.
실시예 6: 알루미늄 젤 특성에 대한 미세펠릿 가공의 영향에 대한 연구: T(파상풍 독소)와의 상호작용
본 실시예에서, 실시예 5에서 생성된 미세펠릿을 사용하였다. 본 연구의 목적은 알루미늄 젤 AlOOH 흡착 능력에 대한 상기 미세펠릿 가공의 영향을 평가하는 것이었다.
3 ㎖ 바이알에서, 초기에 액체 또는 미세펠릿 형태의, 0.3 ㎎의 일정한 양의 알루미늄 젤 AlOOH를 초기에 또한 액체 또는 미세펠릿 형태의 상이한 양의 파상풍 독소(총 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 및 0.75 ㎎)와 혼합하였다.
5 회의 실험을 수행하였다:
-시리즈 1: 안정화제 부재 하의, 액체 알루미늄 젤 AlOOH 및 벌크 파상풍 독소 항원의 액체 혼합
-시리즈 2: 용해된 알루미늄 젤 AlOOH 미세펠릿 및 벌크 파상풍 독소 항원의 액체 혼합
-시리즈 3: 액체 알루미늄 젤 AlOOH, 벌크 파상풍 독소 항원 및 안정화제의 액체 혼합
-시리즈 4: 액체 알루미늄 젤 AlOOH 및 용해된 파상풍 독소 미세펠릿의 액체 혼합
-시리즈 5: 용해된 알루미늄 젤 AlOOH 미세펠릿 및 용해된 파상풍 독소 미세펠릿의 액체 혼합
물 및 안정화제 함량을, 모든 안정화제 함유 제형들 중에 엄격하게 동일한 재수화된 용액을 수득하기 위해서 상기 미세펠릿의 용해 전에 조절하였다(시리즈 2 내지 5).
상기 액체 생성물들을 혼합한 후에, 바이알들을 2 시간 동안 휠 교반기에서 실온에서 배양하고 이어서 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리시켰다.
흡착되지 않은 파상풍 독소를 마이크로브래드포드(MicroBradford) 기법(Bio Rad 단백질 분석)에 의해 상등액 중에서 정량분석하였다. 파상풍 독소 기준을 정량적인 분석을 위해 일련의 샘플들 각각에 대해 시험하였다. 상기 획득된 결과들을 하기 표에 요약한다:
안정화제의 존재 파상풍 독소
흡착 능력
독소 ㎎/젤 ㎎		 평균
독소 ㎎/젤 ㎎
시리즈 1 부재 0.49
0.72		 0.61±0.12
시리즈 2 존재 0.67
0.54		 0.60±0.07
시리즈 3 존재 0.82
0.54
0.92		 0.76±0.22
시리즈 4 존재 0.57
0.72		 0.64±0.08
시리즈 5 존재 0.59
1.06
0.91		 0.86±0.26
상기 결과는 안정화제의 존재가 상기 젤의 흡착 능력에 어떠한 현저한 부정적인 영향도 미치지 않음을 입증한다. 더욱이, 미세펠릿 가공은 파상풍 독소 및/또는 알룸 젤에 적용 시 상기 방법의 가변성을 고려하여, 알룸 젤의 흡착 능력에 현저한 영향을 미치지 않는다.

Claims (122)

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  45. 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함하는 액체 벌크 조성물을 탄수화물, 당 알콜 또는 이들의 혼합물을 포함하는 수용액으로 희석하되, 상기 희석된 조성물의 탄수화물, 당 알콜 또는 이들의 혼합물의 함량이 2 %(w/v) 내지 상기 탄수화물, 당 알콜 또는 이들의 혼합물의 용해도 한계에 이를 때까지 희석하고,
    상기 희석된 조성물을 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 생성시키기 위해 프릴링하고,
    상기 고른 소적에 대해 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고,
    상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키는 단계들을 포함하는 인플루엔자 백신 조성물의 안정화 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    상기 건조가 동결건조의 방법에 의해 발생함을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 45 항에 있어서,
    상기 건조가 대기압 동결-건조, 유동층 건조, 진공 회전 드럼 건조, 교반식 동결-건조, 진동식 동결-건조, 마이크로웨이브 동결-건조로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법에 의해 발생함을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 45 항에 있어서,
    상기 탄수화물이 이당류임을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서,
    상기 탄수화물이 슈크로스임을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 45 항에 있어서,
    상기 액체 벌크 조성물이, 각각 2 개 이상의 상이한 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 2 개 이상의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하기 위해서, 각각 상이한 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 하나 이상의 추가적인 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 또한 포함하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서,
    상기 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 1 회분으로 조제하고 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 또한 포함하는 방법.
  52. 제 45 항에 있어서,
    상기 액체 벌크 조성물이, 각각 하나의 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하기 위해서, 상기 동일한 계절성, 대유행 전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 하나 이상의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자의 2 개 이상의 유형을 1 회분으로 조제하고, 혼합하고 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 또한 포함하며, 각 유형의 미세펠릿이 다른 유형과 상이한 계절성, 대유행전 또는 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 항원 제제를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 45 항에 있어서,
    하나 이상의 항원보강제를 포함하는 수용액을 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  55. 제 45 항에 있어서,
    하나 이상의 항원보강제의 별도의 액체 벌크 용액 또는 유화액을 안정화제를 포함하는 수용액으로 희석하고, 상기 희석된 항원보강제 용액 또는 유화액을 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 생성시키기 위해 프릴링하고, 상기 고른 소적에 대해 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 항원을 함유하는 건조한 고른 구형 미세펠릿과 함께 혼합하여 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 또한 포함하는 방법.
  56. 제 54 항에 있어서,
    상기 항원보강제가 리포솜, 지질 또는 세정 마이셀 또는 다른 지질 입자, 중합체 나노입자 또는 미세입자, 용해성 중합체, 단백질 입자, 무기물 젤, 무기물 미세- 또는 나노입자, 중합체/알루미늄 나노하이브리드, 수중 유적형 또는 유중 수적형 유화액, 사포닌 추출물, 세균 세포 벽 추출물, 고유 면역 수용체의 자극제, 천연 또는 합성 Toll-like receptor(TLR) 작용물질, 천연 또는 합성 Nucleotide-binding Oligomerisation Domain(NOD) 작용물질 및 천연 또는 합성 Retinoic acid-inducible gene(RIG) 작용물질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  57. 제 55 항에 있어서,
    상기 항원보강제가 리포솜, 지질 또는 세정 마이셀 또는 다른 지질 입자, 중합체 나노입자 또는 미세입자, 용해성 중합체, 단백질 입자, 무기물 젤, 무기물 미세- 또는 나노입자, 중합체/알루미늄 나노하이브리드, 수중 유적형 또는 유중 수적형 유화액, 사포닌 추출물, 세균 세포 벽 추출물, 고유 면역 수용체의 자극제, 천연 또는 합성 Toll-like receptor(TLR) 작용물질, 천연 또는 합성 Nucleotide-binding Oligomerisation Domain(NOD) 작용물질 및 천연 또는 합성 Retinoic acid-inducible gene(RIG) 작용물질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  58. 제 45 항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스 균주가 H5N1, H9N2, H7N7, H2N2, H7N1 및 H1N1으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  59. 제 45 항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스 균주가 상기 계절성 인플루엔자 바이러스 균주의 그룹으로부터 선택되는 방법.
  60. 제 45 항에 있어서,
    상기 인플루엔자 항원이 정제된 완전 인플루엔자 바이러스, 불활성화된 인플루엔자 바이러스 및 인플루엔자 바이러스의 서브유닛 성분으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 형태로 존재하는 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    상기 불활성화된 인플루엔자 바이러스가 분열된 인플루엔자 바이러스인 방법.
  62. 제 45 항에 있어서,
    상기 인플루엔자 항원이 세포 배양물로부터 유래하는 방법.
  63. 제 45 항에 있어서,
    상기 인플루엔자 항원이 수정란에서 생산되는 방법.
  64. 제 45 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태의 안정화된 건조한 인플루엔자 백신 조성물.
  65. 제 64 항에 있어서,
    각각의 고른 구형 미세펠릿 또는 입자가 단지 하나의 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 하나 이상의 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물.
  66. 제 64 항에 있어서,
    각각의 고른 구형 미세펠릿 또는 입자가 하나 이상의 상이한 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 하나 이상의 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물.
  67. 제 64 항에 있어서,
    항원보강제를 또한 포함하는 조성물.
  68. 제 67 항에 있어서,
    상기 항원보강제가 별도의 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 중에 함유되는 조성물.
  69. 항원 또는 항원 제제를 포함하는 액체 벌크 조성물을 안정화제를 포함하는 수용액으로 희석하고, 상기 희석된 조성물을 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 생성시키기 위해 프릴링하고, 상기 고른 소적에 대해 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키는 단계들을 포함하는 항원보강제 함유 백신 조성물의 안정화 방법.
  70. 제 69 항에 있어서,
    하나 이상의 항원보강제를 포함하는 수용액을 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  71. 제 69 항에 있어서,
    하나 이상의 항원보강제의 별도의 액체 벌크 용액 또는 유화액을 안정화제를 포함하는 수용액으로 희석하고, 상기 희석된 항원보강제 용액 또는 유화액을 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 생성시키기 위해 프릴링하고, 상기 고른 소적에 대해 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 항원을 함유하는 건조한 고른 구형 미세펠릿과 함께 혼합하여 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 또한 포함하는 방법.
  72. 제 69 항에 있어서, 상기 항원보강제를 포함하는 수용액에 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 재조성하는 단계를 포함하는 방법.
  73. 제 69 항에 있어서,
    상기 액체 벌크 조성물이, 각각 2 개 이상의 상이한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 2 개 이상의 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하기 위해서, 각각 상이한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 하나 이상의 추가적인 항원 또는 항원 제제를 또한 포함하는 방법.
  74. 제 69 항에 있어서,
    상기 액체 벌크 조성물이 하나의 단일 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함하여, 각각 상기 단일 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하는 방법.
  75. 청구항 75은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 74 항에 있어서,
    건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자의 2 개 이상의 유형을 1 회분으로 조제하고, 혼합하고 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 또한 포함하며, 각 유형의 미세펠릿이 2 개 이상의 상이한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 69 항에 있어서,
    상기 건조가 동결건조의 방법에 의해 발생함을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 69 항에 있어서,
    상기 건조가 대기압 동결-건조, 유동층 건조, 진공 회전 드럼 건조, 교반식 동결-건조, 진동식 동결-건조, 마이크로웨이브 동결-건조로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법에 의해 발생함을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 69 항에 있어서,
    상기 안정화제가 단당류, 올리고당류 또는 당 알콜 또는 이들의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 69 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태의, 하나 이상의 항원을 포함하는 안정화된 건조한 백신 조성물.
  80. 제 79 항에 있어서,
    각각의 고른 구형 미세펠릿 또는 입자가 단지 한 가지 유형의 항원을 포함하는 조성물.
  81. 제 79 항에 있어서,
    각각의 고른 구형 미세펠릿 또는 입자가 하나 이상의 상이한 유형의 항원을 포함하는 조성물.
  82. 제 79 항에 있어서,
    항원보강제를 또한 포함하는 조성물.
  83. 제 79 항에 있어서,
    상기 항원보강제가 별도의 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 중에 함유되는 조성물.
  84. 제 79 항에 있어서,
    상기 항원이 생 약독화 및 불활성화된 완전 바이러스, 상기 바이러스의 항원 성분, 완전 세균, 세균 단백질 또는 접합 또는 비-접합된 다당류 항원으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 바이러스는 폴리오바이러스, 인플루엔자 바이러스, 로타바이러스, 거대세포바이러스, A형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  86. 제 84 항에 있어서, 상기 항원이 완전 세균, 세균 단백질 또는 헤모필루스 인플루엔자, 수막염균성 다당류, 파상풍, 디프테리아, 세포 및 비세포성 백일해, 보툴리눔 식중독, 탄저병 또는 클로스트리듐 디피실리로부터 선택되는 접합 또는 비-접합된 다당류 항원을 포함하는 조성물.
  87. 제 64 항에 따른 조성물을 수용액 중에서 재조성하는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법.
  88. 제 87 항에 있어서,
    상기 수용액이 항원보강제를 포함하는 방법.
  89. 제 79 항에 따른 조성물을 수용액 중에서 재조성하는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법.
  90. 제 89 항에 있어서,
    상기 수용액이 항원보강제를 포함하는 방법.
  91. 제 64 항에 따른 조성물을 함유하는 제 1 용기 및 상기 백신의 재조성을 위한 수용액을 함유하는 제 2 용기를 포함하는 백신 키트.
  92. 제 91 항에 있어서,
    상기 수용액이 항원보강제를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  93. 제 91 항에 있어서,
    건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태의 안정화된 건조한 항원보강제 조성물을 함유하는 제 3 용기를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  94. 제 79 항에 따른 조성물을 함유하는 제 1 용기 및 상기 백신의 재조성을 위한 수용액을 함유하는 제 2 용기를 포함하는 백신 키트.
  95. 제 94 항에 있어서,
    상기 수용액이 항원보강제를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  96. 제 94 항에 있어서,
    건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태의 안정화된 건조한 항원보강제 조성물을 함유하는 제 3 용기를 포함함을 특징으로 하는 키트.
  97. 항원을 제 45 항 및 제 69 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 안정화하고 상기 생성되는 안정화된 백신 조성물을 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태로 보관 후 바이알 또는 주사기에 액체 충전하기 전에 적합한 용매로 재조성하고 제형화하는 안정한 건조한 항원 벌크의 저장(stockpiling) 방법.
  98. 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 항원보강제를 포함하여 제형화하는 방법:
    a. 안정화제를 포함하는 수용액에 하나 이상의 항원보강제를 포함하는 액체 벌크 항원보강제 용액 또는 유화액을 혼합하는 단계;
    b. 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 상기 항원보강제 용액 또는 유화액의 고른 소적을 생성시키기 위해 혼합된 항원보강제 용액 또는 유화액을 프릴링하는 단계;
    c. 상기 항원보강제의 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키기 위해 항원보강제의 고른 소적에 대해 동결을 수행하는 단계; 및
    d. 상기 항원보강제의 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 상기 항원보강제의 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키는 단계.
  99. 제 98 항에 있어서,
    상기 항원보강제가 리포솜, 지질 또는 세정 마이셀 또는 다른 지질 입자, 중합체 나노입자 또는 미세입자, 용해성 중합체, 단백질 입자, 무기물 젤, 무기물 미세- 또는 나노입자, 중합체/알루미늄 나노하이브리드, 수중 유적형 또는 유중 수적형 유화액, 사포닌 추출물, 세균 세포 벽 추출물, 고유 면역 수용체의 자극제, 천연 또는 합성 Toll-like receptor(TLR) 작용물질, 천연 또는 합성 Nucleotide-binding Oligomerisation Domain(NOD) 작용물질 및 천연 또는 합성 Retinoic acid-inducible gene(RIG) 작용물질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  100. 제 98 항에 있어서,
    상기 항원보강제는 알루미늄 하이드로옥사이드 또는 알루미늄 포스페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제 98 항에 있어서,
    상기 안정화제는 탄수화물을 2 %(w/v) 내지 상기 혼합된 항원보강제 용액에 대한 용해도 한계의 농도로 포함하는 수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제 98 항에 있어서,
    상기 안정화제가 단당류, 올리고당류, 당 알콜 또는 이들의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  103. 제 98 항에 있어서,
    상기 항원보강제의 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 바이알 또는 다른 적합한 용기안에 충전함을 포함하는 방법.
  104. 제 98 항 내지 제 103 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 항원보강제의 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태로 하나 이상의 항원보강제를 포함하는 안정화된 건조한 항원보강제 조성물.
  105. 제 104 항의 안정화된 건조한 항원보강제 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 것을 특징으로 한 키트.
  106. 항원 또는 항원 제제를 포함하는 액체 벌크 조성물을 안정화제를 포함하는 수용액으로 희석하고, 상기 희석된 조성물을 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 고른 소적을 생성시키기 위해 프릴링하고, 상기 고른 소적에 대해 동결을 수행하여 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키고 상기 동결된 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 건조시켜 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 형성시키는 단계들을 포함하는 백신 조성물의 안정화 방법.
  107. 제 106 항에 있어서, 상기 액체 벌크 조성물이, 각각 2 개 이상의 상이한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 2 개 이상의 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하기 위해서, 각각 상이한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 하나 이상의 추가적인 항원 또는 항원 제제를 또한 포함하는 방법.
  108. 제 106 항에 있어서,
    상기 액체 벌크 조성물이 하나의 단일 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함하여, 각각 상기 단일 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함하는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자를 수득하는 방법.
  109. 청구항 109은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 108 항에 있어서, 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자의 2 개 이상의 유형을 1 회분으로 조제하고, 혼합하고 바이알 또는 다른 적합한 용기에 충전함을 또한 포함하며, 각 유형의 미세펠릿이 2 개 이상의 상이한 병원체 또는 병원체의 혈청형으로부터의 항원 또는 항원 제제를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  110. 제 106 항에 있어서,
    상기 건조가 동결건조의 방법에 의해 발생함을 특징으로 하는 방법.
  111. 제 106 항에 있어서,
    상기 건조가 대기압 동결-건조, 유동층 건조, 진공 회전 드럼 건조, 교반식 동결-건조, 진동식 동결-건조, 마이크로웨이브 동결-건조로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법에 의해 발생함을 특징으로 하는 방법.
  112. 제 106 항에 있어서,
    상기 안정화제가 단당류, 올리고당류 또는 당 알콜 또는 이들의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  113. 제 106 항에 있어서,
    상기 안정화제는 탄수화물을 2 %(w/v) 내지 상기 희석된 조성물에 대한 용해도 한계의 농도로 포함하는 수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 제 106 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태의, 하나 이상의 항원을 포함하는 안정화된 건조한 백신 조성물.
  115. 제 114 항에 있어서,
    각각의 고른 구형 미세펠릿 또는 입자가 단지 한 가지 유형의 항원을 포함하는 조성물.
  116. 제 114 항에 있어서,
    각각의 고른 구형 미세펠릿 또는 입자가 하나 이상의 상이한 유형의 항원을 포함하는 조성물.
  117. 제 114 항에 있어서,
    상기 항원이 생 약독화 및 불활성화된 완전 바이러스, 상기 바이러스의 항원 성분, 완전 세균, 세균 단백질 또는 접합 또는 비-접합된 다당류 항원으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  118. 제 117 항에 있어서, 상기 바이러스는 폴리오바이러스, 인플루엔자 바이러스, 로타바이러스, 거대세포바이러스, A형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  119. 제 117 항에 있어서, 상기 항원이 완전 세균, 세균 단백질 또는 헤모필루스 인플루엔자, 수막염균성 다당류, 파상풍, 디프테리아, 세포 및 비세포성 백일해, 보툴리눔 식중독, 탄저병 또는 클로스트리듐 디피실리로부터 선택되는 접합 또는 비-접합된 다당류 항원을 포함하는 조성물.
  120. 제 114항에 따른 조성물을 수용액 중에서 재조성하는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법.
  121. 제 114 항에 따른 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태의 안정화된 건조한 백신 조성물을 함유하는 제 1 용기 및 상기 백신의 재조성을 위한 수용액을 함유하는 제 2 용기를 포함하는 백신 키트.
  122. 제 106 항 내지 제 113 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 안정화된 백신 조성물을 준비하여 항원을 안정화시키고,
    상기 생성되는 안정화된 백신 조성물을 200 ㎛ 내지 1500 ㎛의 직경을 갖는 건조한 고른 구형 미세펠릿 또는 입자 형태로 보관 후 바이알 또는 주사기에 액체 충전하기 전에 적합한 용매로 재조성하고 제형화하는 안정한 건조한 항원 벌크의 저장(stockpiling) 방법.
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