JP2002540166A - 弱毒化デング熱３型ウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、弱毒化デング熱１型ウイルスのワクチン組成物を提供する。より明細には、弱毒化ウイルスはＰＤＫ細胞における連続継代によって生成される。本発明はまた、弱毒化デング熱１型ウイルスの投与によってデング熱１型ウイルスに対する防護を誘発するために個体の免疫系を刺激するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、現在も審理中の、１９９９年３月２６日に出願された米国特許願通
し番号第６０／１２６，３１１号、及び現在も審理中の、２０００年２月１１日
に出願された米国特許願通し番号第６０／１８２，０６３号から、３５Ｕ．Ｓ．
Ｃ．§１１９（ｅ）の下に優先権を主張する。

【０００２】 （導入） デング熱は、カによってヒトに伝播される４つの血清型のデング熱ウイルス、
デング熱１型、デング熱２型、デング熱３型及びデング熱４型のいずれかによっ
て引き起こされる。成人においては、デング熱感染は典型的には、発熱、筋肉痛
、頭痛、そして時には発疹を伴う、自己限定性であるが無能力化をもたらす急性
疾病である。この疾病は出血熱を合併することがあり、駆血帯試験陽性、突発性
点状出血、明白な出血、及び／又はショックとして発現しうる。デング出血熱は
、約０．５％のケースにおいて致命的である。以前のデング熱感染からの抗体を
有する患者が、その後もう１つ別のデング熱ウイルス株に感染した場合、デング
出血熱の危険性がより高いことが示されている。

【０００３】 デング熱ウイルスのカベクターは、世界のすべての熱帯及び亜熱帯地域、なら
びに米国、ヨーロッパ、アフリカ及び中東の一部の温帯地域において認められる
。近年、中南米、東南アジア、インド、アフリカ、カリブ海及び太平洋領域で地
方病性及び流行性デング熱感染が発生した。ベクターの駆除は現実的ではない。

【０００４】 各血清型について１つずつ、４つの弱毒化デング熱ワクチンの候補を選択する
ためにＷＲＡＩＲにおいて共同調査が実施された。成功を収めた他のヒトワクチ
ンの場合と同様に、継代したウイルスを入手しうる最高と最低の継代レベルで試
験することが計画された。これらの両端のいずれかが適当と認められるであろう
と考えられた。必要に応じて、さらなる中間継代レベルを試験のために開発する
ことができる。このアプローチでは、もしあるとすれば、どのような生物学的マ
ーカがヒトにおけるウイルスのビルレンスと相関するかを予測することは意図さ
れていなかった。１つのＤＥＮ型について成功したヒトワクチンは、弱毒化の生
物学的マーカの有効性を確認し、他の弱毒化ウイルスの選択を改善することがで
きる。多数の継代レベルの評価を分離するための経験的アプローチは近代的な弱
毒化ウイルスワクチンの先例に基づく；例えば、ふ化鴨卵の数継代だけが異なる
風疹ウイルス株は、ヒトのビルレンスにおいては著しく相違していた（Ｈａｌｓ
ｔｅａｄら、１９７０、ＪＡＭＡ ２１１，９１１−９１６）。

【０００５】 初期ワクチン候補物を細胞において増殖した。デング熱ウイルス複製に関して
非許容性細胞を一次イヌ腎（ＰＤＫ）細胞での増殖に馴化させることによって弱
毒化ワクチンを調製した（Ｈａｌｓｔｅａｄ １９７８，Ａｓｉａｎ Ｊ．Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．９７８，１１２−１１７）。予備臨床試験は、デング熱ウイ
ルス株がＰＤＫ細胞での継代によってヒト用に弱毒化できることを明らかにした
（Ｅｃｋｅｌｓ，１９８４，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ３３，６７
９−６８３；Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ，１９８７，Ｂｕｌｌ ＷＨＯ ６
５，１８９−１９５）。それ故ＰＤＫ継代は、選択的弱毒化の経験的プロセスを
検討しようとするものにとって卓越したモデルを提供する。しかし、ちょうどＰ
ＤＫ連続継代が累積的選択プロセスを及ぼすように、もう１つ別の細胞基質での
継代はそれ自体の選択圧をもたらす。ＦＲｈＬ継代がヒトに対するウイルスのビ
ルレンスを上昇させる又は低下させるかどうかは不明である。十分に特性付けら
れねばならない安定な細胞系統の一度だけの使用は興味深い。しかし、ＦＲｈＬ
細胞に関して公表されている経験は、これらの細胞がＰＤＫでの連続継代の間に
獲得された生物学的特性を逆転しうる又は不安定化しうることを示唆している（
Ｈａｌｓｔｅａｄら、１９８４，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ３３，
６５４−６６５；Ｈａｌｓｔｅａｄら、１９８４，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ
Ｈｙｇ ３３，６６６−６７１；Ｈａｌｓｔｅａｄら、１９８４，Ａｍ Ｊ
Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ３３，６７２−６７８；Ｈａｌｓｔｅａｄら、１９
８４，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ３３，６７９−６８３；Ｅｃｋｅ
ｌｓら、１９８４，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ３３，６７９−６８
３）。

【０００６】 ＰＤＫ細胞での多数の継代レベルでデング熱ウイルスの各候補株から実験的ワ
クチンを調製した；ワクチンの調製のために経験的に選択した継代は、約１０、
２０、３０、４０、及び５０であった。次に１又はそれ以上の継代レベルで種々
の血清型のデング熱ワクチン系統の安全性と免疫原性をボランティアにおいて試
験した。これらの臨床試験の目的は、単価ワクチンとして及び多成分系ワクチン
への可能な組合せとしての開発のために候補弱毒化デング熱ワクチンを選択する
ことであった。この出願では、デング熱２、３、及び４型ワクチンの試験と選択
を述べる。デング熱１型候補ワクチンの選択は既に他所で詳細に記述されている
（Ｅｄｅｌｍａｎ，１９９４，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７０，１４４８−
１４５５）。

【０００７】 （発明の開示） 本発明は、弱毒化デング熱３型ウイルスを含むワクチン組成物に関する。弱毒
化ウイルスは、生理的に許容される担体と共に、ヒト宿主において免疫応答を誘
発するのに十分な量で提供され、任意に宿主の免疫応答を高めるためのアジュバ
ントを含みうる。

【０００８】 それ故、ビルレントデング熱３型分離株の連続継代から誘導される弱毒化デン
グ熱３型ウイルスを提供することが本発明の１つの目的である。

【０００９】 デング熱３型ウイルスに対する防護を誘導するために個体の免疫系を刺激する
ための方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。これらの方法は、
連続継代によって弱毒化した免疫学的に十分な量のデング熱３型株を個体に投与
することを含む。本発明の弱毒化デング熱３型ウイルスはＣＨ５３４８９分離株
から誘導され、ブタペスト条約の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ｏｆ １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０
−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託され、ＶＲ−２６４７のアクセス番号を与えら
れた。

【００１０】 弱毒化デング熱３型ウイルスの純粋培養を提供することが本発明のさらにもう
１つの目的である。弱毒化ウイルスは、培養から単離された、あるいは部分的又
は完全に精製された細胞培養上清中に存在しうる。ウイルスはまた凍結乾燥する
こともでき、所望に応じて、貯蔵あるいは宿主への送達のために様々な他の成分
と組み合わせることができる。

【００１１】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ヒトにおけるワクチンの使用に適したデング熱３型ウイルスを提供
する。ここで述べるデング熱３型ウイルスは、分離株に弱毒化をもたらす突然変
異が累積するように、一次イヌ腎細胞のような適当な宿主細胞系統において感染
性デング熱３型ウイルス分離株を連続継代することによって生成される。連続継
代とは、ウイルス分離株による細胞系統の感染、宿主細胞からのウイルス子孫の
回収、そしてそれに続く、次の継代を生じさせるためのウイルス子孫による新鮮
宿主細胞の感染を指す。

【００１２】 １９７３年にタイにおいて、１名の患者からデング熱３型ＣＨ５３４８９分離
株を分離し、蚊の細胞系統において一度、一次ミドリザル腎臓（ＰＧＭＫ）細胞
系統において四度継代した。デング熱３型のビルレント（疾患を引き起こす）株
は、変株が単離されるまで継代され、弱毒化された、すなわち感染性であるが疾
患を引き起こすことはできない改変されたウイルスの分離をもたらす。これらの
修飾ウイルスを感染性の低下に関してサルで試験する。感染性の低いものをその
後ヒトにおいて試験する。ヒトは、臨床疾患の徴候を示す唯一の霊長類である。
引き起こす臨床反応性は極小から皆無であるが、まだ感染し、免疫応答を誘発す
るウイルスは、弱毒化されている。

【００１３】 本発明の１つの実施形態では、弱毒化株を誘導するためにビルレントデング熱
３型分離株を一次イヌ腎（ＰＤＫ）細胞において連続継代した。連続継代は、Ｐ
ＤＫ細胞をビルレント株に感染させ、感染細胞を数日間インキュベーションして
、ウイルスを含む上清培養液を採集することによって実施した。次に採集したウ
イルスを新鮮ＰＤＫ細胞に適用して次の継代を作製した。

【００１４】 アカゲザル胎児肺細胞（ＦＲｈＬ）での最終継代後、一連の異なる継代をサル
において、次いでヒトにおいて臨床作用に関して試験した。ウイルス力価を至適
にするためＦＲｈＬ細胞を使用し、残りの菌株は、弱毒化を逆転させない、又は
感染性を減少させるＰＤＫ弱毒菌株を保証するために試験された。ＦＲｈＬ継代
１をマスターシードとみなし、ＦＲｈＬ継代２を生産シード、そしてＦＲｈＬ継
代３をワクチンロットとみなす。ウイルスの弱毒化は、サルとヒトの試験によっ
てのみ判定することができた。継代したウイルスのビルレンス、すなわち疾患を
引き起こす能力は、体温、頭痛、発疹等を含む症状を毎日監視して評価した。こ
のウイルスがデング熱３型疾患の臨床徴候を誘発することができないと判断され
たとき、継代は弱毒化された。

【００１５】 本発明の弱毒化ウイルスの増殖は、デング熱３型ウイルスの増殖を可能にする
多くの細胞系統で行われうる。デング熱３型ウイルスは様々なヒト及び動物細胞
において増殖する。ワクチン用の弱毒化デング熱３型ウイルスの増殖のための好
ましい細胞系統は、ＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２、ベロ細胞、及び他のサル細胞を含む
。最も高いウイルス収量は、経験的に決定されているが、通常ベロ細胞のような
異数体細胞系で達成される。細胞は典型的には約０．００５〜０．０１の範囲の
感染多重度で接種し、ウイルスの複製を許容する条件下で、例えば約３０〜３７
℃で約５〜７日間、又はウイルスが適切な力価に達するのに必要な期間、培養す
る。ウイルスを細胞培養から取り出し、典型的には既知の清澄化方法、例えば傾
斜遠心分離やコラムクロマトグラフィーによって細胞成分から分離して、所望す
る場合には当業者に周知の方法を用いてさらに精製することができる。好ましく
は、ウイルスの生存性を維持するため、精製の間は２〜１０℃の温度を保持する
ように注意しなければならない。

【００１６】 弱毒化ウイルスの分離に続いて、弱毒化表現型についての基礎を調べるため、
そのゲノムの塩基配列分析を実施することができる。これは、ウイルスＤＮＡま
たはＲＮＡを塩基配列決定し、対照ウイルスのゲノム配列と比較して弱毒化分離
株におけるヌクレオチドの変化を同定することによって実施される。それ故、ビ
ルレント株に弱毒化をもたらす分子変化を特性付けることができる。

【００１７】 本発明の１つの実施形態では、弱毒化ウイルスから分離したＲＮＡゲノムの配
列を決定し、基本型株又は親株のいずれかの対照配列と比較する。ビルレント株
と弱毒化株の間でのヌクレオチド配列の相違を同定することができる。

【００１８】 本発明は、対照野生型デング熱３型の配列と比較して１又はそれ以上に配列変
化を有する弱毒化デング熱３型ウイルスを提供する。

【００１９】 ここで提供する本発明の１つの実施形態は、弱毒化ウイルス子孫を作製するた
めに、配列変化を導入することを含む。そのような変化を有するウイルスゲノム
は、クローニングしたＤＮＡにヌクレオチド変化を導入するための、当業者に既
知の標準的組換えＤＮＡ手法（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）によって作製することができる。次にウ
イルス子孫の産生のために宿主細胞にトランスフェクションするための適切なベ
クターにゲノムをライゲーションすることができる。

【００２０】 プラスミドを介したウイルスゲノムの導入を通してウイルス子孫を生成する能
力はまた、定められた分子変化を持つウイルスを産生するためにも使用できる。
本発明のこの実施形態では、ウイルスに所望する特性、例えば低いビルレンスを
与える、変化した配列を含む安定なウイルス株を生成することができる。このア
プローチはまた、ウイルスゲノムに所望する配列変化を導入し、ゲノムからウイ
ルス子孫を作製して、特性指摘のためにウイルス子孫を回収することにより、ウ
イルスの様々な特性、すなわち抗原型、ビルレンス、又は弱毒化への分子変化の
影響を評価するためにも使用できる。さらに、このアプローチを使用して、他の
疾患に対する免疫応答を生じさせるためにウイルスによって同時に送達される、
ウイルスゲノムに挿入された異種配列を持つウイルスを構築することができる。

【００２１】 規定された分子変化を持つウイルスゲノムの構築は、当業者に既知のオリゴヌ
クレオチド指定、リンカースキャニング又はポリメラーゼ連鎖反応ベースの突然
変異誘発手法のような標準的手法を用いて実施できる（ＺｏｌｌｅｒとＳｍｉｔ
ｈ，１９８４，ＤＮＡ ３，４７９−４８８；ＢｏｔｓｔｅｉｎとＳｈｏｒｔｌ
ｅ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，１１９３）。移入のために適当なベク
ターにゲノムをライゲーションすることは、当業者に既知の標準的手法を通して
実施しうる。ウイルス子孫を作製するための宿主細胞へのベクターのトランスフ
ェクションは、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥ−デキストランを介したトランス
フェクション、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、及び当業者に既
知の他の手法のような標準的手法のいずれかを用いて実施しうる（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。

【００２２】 ワクチン用には、本発明の弱毒化ウイルスをワクチン製剤として直接使用する
か、又は、所望するときには当業者に周知のリオフィリゼーション標準方法を使
用して、好ましくは安定剤中で凍結乾燥することができる（Ｈｏｋｅ，１９９０
，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ４３，２１９−２２６）。凍結乾燥し
たウイルスは、典型的には約４℃に保持する。使用するときには、凍結乾燥ウイ
ルスを水又はその代わりに安定化溶液、例えば、下記でさらに述べるようにアジ
ュバントと共に又はアジュバントなしで、食塩水又はＭｇ^＋＋とＨＥＰＥＳを含
む溶液中に還元する。

【００２３】 それ故、本発明のデング熱３型ウイルスワクチンは、ここで述べるような弱毒
化デング熱３型ウイルスの免疫学的に有効な量を有効成分として含有する。弱毒
化ウイルスは、生理的に許容される賦形剤及び／又はアジュバントと共に被験者
、特にヒトに導入されうる。有用な賦形剤は当業者において周知であり、例えば
水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を含む。生じ
た水溶液をそのまま又は凍結乾燥して包装することができ、凍結乾燥製剤は上述
したように投与の前に再水和する。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整
剤、湿潤剤等のような、生理的条件に近付けるために必要な製薬上許容される補
助物質、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールア
ミン等を含みうる。

【００２４】 ここで開示する生弱毒化ウイルスの投与は、非経口注射（腹腔内、皮下、又は
筋肉内注射など）、鳥類における卵注射、経口的、及び気道表面へのウイルスの
局所適用（典型的には製薬製剤中で運搬される）を含めた何らかの適当な手段に
よって実施されうる。気道表面へのウイルスの局所適用は、鼻腔内投与によって
（例えば点滴注入器、綿棒、又は製薬製剤を鼻腔内に沈着させる吸入器を使用し
て）実施できる。気道表面へのウイルスの局所適用はまた、ウイルスをエーロゾ
ル懸濁液として含有する製薬製剤の呼吸用粒子（固体粒子と液体粒子の両方を含
む）を作製して、被験者に呼吸用粒子を吸入させることなどにより、吸入投与に
よっても実施できる。製薬製剤の呼吸用粒子を投与するための方法と装置は周知
であり、従来の何らかの手法が使用できる。ワクチン接種の結果として、宿主は
少なくとも部分的に又は完全に、デング熱３型ウイルス感染に対して免疫となる
、若しくは中等度から重症のデング熱３型ウイルス感染の発現に対して抵抗性と
なる。

【００２５】 本発明の弱毒化デング熱３型ウイルスを含有するワクチン組成物は、デング熱
３型ウイルス感染を生じやすい、若しくは感染の危険度が高い個人に対して、そ
の個人自体の免疫応答能力を高めるために投与される。そのような量は、「免疫
学的に有効な量」と定義される。この用途においては、その正確な量はやはり、
被験者の健康状態と体重、投与様式、製剤の性質、等々に依存するが、一般には
被験者につき約１０^４〜１０^５ｐｆｕウイルスの範囲である。いずれの場合も、
ワクチン製剤は、重篤なあるいは生命を脅かすデング熱３型ウイルス感染に対し
て被験者を有効に防護するのに十分な量の本発明の弱毒化デング熱３型ウイルス
を提供すべきである。

【００２６】 複数のデング熱ウイルスに対する防護を実現するために、ある特定の血清型の
本発明の弱毒化デング熱３型ウイルスを他の血清型のデング熱ウイルスの弱毒化
ウイルスと組み合わせることができる。典型的には、異なる改変ウイルスを混合
して同時に投与するが、別々に投与することもできる。

【００２７】 一部の場合には、本発明の弱毒化デング熱３型ウイルスワクチンを、他の薬剤
に対する防護応答を誘発するワクチンと組み合わせることが望ましいと考えられ
る。

【００２８】 本発明のワクチン組成物の単回又は多回投与が実施できる。十分なレベルの免
疫を誘発するためには多回投与が必要と考えられる。血清抗体を中和する量を測
定することによって誘発される免疫のレベルを監視し、所望するレベルの防護を
維持するために必要に応じて用量を調節する又はワクチン接種を反復することが
できる。例えば、０ヶ月目と６ヶ月目にワクチンを接種することができる。

【００２９】 さらにもう１つの実施形態では、本発明は、サンプル中のデング熱３型感染の
存在を検出するための方法に関する。当業者において周知の標準的な方法を用い
て、表面（すなわち保持体）、例えばマイクロタイトレーションプレート又は膜
（例えばニトロセルロース膜）にデング熱３型の全部又は一部を被覆することに
より、診断アッセイを構築することができる。デング熱３型感染を有する疑いの
ある被験者からのサンプルをプレート又は膜と接触させる。ウイルスと、サンプ
ル中のウイルスに特異的な抗原との間で形成される、生じた複合体の存在を、蛍
光抗体分光法又は比色定量のような、当業者において一般的な既知の方法のいず
れかによって検出することができる。この検出方法は、例えばデング熱３型感染
の診断のために使用できる。

【００３０】 以下の実施例は例示として提供するものであり、限定ではない。

【００３１】 以下の「材料と方法」を下記の実施例において使用した。

【００３２】 ワクチン製造のための材料と方法。 ウイルス株。ＤＥＮウイルスをヒト及びカソースから分離したあと、一次イヌ
腎（ＰＤＫ）細胞培養において継代した。表１は、ＰＤＫ細胞において馴化させ
、継代した株を列記している。ＰＤＫ細胞での継代後、シードとワクチンの製造
のためにウイルス株をＦＲｈＬ細胞にさらに馴化させた。これは、最終ワクチン
ロットの調製のためのさらなる３〜４継代から成った。やはり表１に列記してい
る非経口ウイルス株は、ＤＥＮウイルス複製を許容する細胞での低い細胞培養継
代から誘導した。

【００３３】 ワクチンの製造。同様の手順を用いて、ＦＲｈＬ細胞培養において４つの血清
型すべてについてＤＥＮワクチンを調製した。貯蔵して予備試験した（試験結果
については表２参照）ＦＲｈｌ細胞を液体窒素貯蔵から取り出して、１５０ｃｍ ^２ フラスコにおいて可欠アミノ酸、ウシ胎児血清、ＦＢＳ（２％）（Ｂｉｏｗｈ
ｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｄｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）及び抗生物質を補足したイ
ーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｄｅｒｓ
ｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の細胞培養基中で平板培養した。フラスコが集密に達したあ
と、培地を取り出し、０．０１ＭＯＩの投入用に希釈したＤＥＮ生産シードをフ
ラスコに接種して、３２℃で１時間吸着させた。吸着と新鮮ＥＭＥＭ培地の供給
後、フラスコを４日間３２℃に戻した。接種後４日目に、すべてのフラスコから
の培地を廃棄し、細胞単層をハンクスＢＳＳ １００ｍｌ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ，Ｗａｌｄｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で３回洗浄した。洗浄後、ＦＢＳの
代わりに０．２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃ Ｃｏｒｐ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を含むＥＭＥＭ培地をフ
ラスコに供給した。さらに２日間３２℃でインキュベーションしたあと、すべて
のフラスコから上清培養液を取り出してプールした。安全性試験のためのサンプ
リング後、残りの培養液をプールし、０．４５ミクロンの非蛋白結合膜フィルタ
ーで濾過して清澄化した。濾過した液をプールし、１５％ラクトースと５％ＨＳ
Ａを含む等量の安定剤と混合した。バルクの安定化した液体を凍結乾燥まで−７
０℃で保存した。最終的なバイアル注入のために、安定化液を４１℃で急速解凍
し、血清バイアル中に３ｍｌ容量で分配した。バイアルのトレーをＨｕｌｌ凍結
乾燥器で−４０℃に冷凍し、その後１日乾燥した。キャップしたあと、バイアル
をモニター付き冷凍庫において−２０℃で貯蔵した。

【００３４】 ワクチン試験。ウイルスの調製ならびにシードとワクチンロットのために使用
したすべての細胞バンクを汚染物質の存在に関して試験した。試験項目と結果を
表２に列挙する。いずれの生成物においても検出可能な夾雑物は認められなかっ
た。

【００３５】 アカゲザルの接種。成熟雄性及び雌性アカゲザル（６〜１５ｋｇ）を、上腕に
０．５ｍｌを皮下接種してＤＥＮワクチンロット又は親ウイルスで免疫した。ウ
イルスの分離と抗体試験のための血液を、接種前と接種後１４日間毎日大腿静脈
から採取した。また免疫後３０日目と６０日目にも採血した。ウイルス攻撃誘発
を同様に実施した。

【００３６】 Ｃ６／３６細胞での増幅によるウイルスの分離。Ｃ６／３６細胞培養増幅によ
るウイルスの分離はＰｕｔｎａｋら、１９９６（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １
７４，１１７６−１１８４）によって記述されている。簡単に述べると、サルの
接種後、１日目から１４日目まで毎日血液標本を採取した。血清を分離して−８
０℃で冷凍した。血清からウイルスを回収するため、解凍した血清を細胞培地中
で１：３に希釈し、これを使用してＣ６／３６カ細胞の単層を含む２５ｃｍ^２フ
ラスコに接種した。ウイルスの吸着後、フラスコをＥＭＥＭ維持培地中で２８℃
に保持した。７日後、培地を交換し、フラスコをさらに７日間インキュベーショ
ンした。接種後１４日目に、上清培養液を傾瀉し、等量の熱不活化ウシ胎児血清
（ＦＢＳ）と混合したあと−８０℃で冷凍した。その後凍結標本をプラークアッ
セイによって感染性ウイルスに関して検定した。

【００３７】 ここで上記又は下記において引用する資料はすべて、その全体が参照してここ
に組み込まれる。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【表２】

【表２の続き】

【００４０】

【表３】

【表３の続き】

【００４１】 プラークアッセイ。Ｓｕｋｈａｖａｃｈａｎａら、１９６６（Ｂｕｌｌ ＷＨ
Ｏ ３５，６５−６６）の手順に従ったアカゲザル腎（ＬＬＣ−Ｍｋ_２，ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ７）細胞でのプラークアッセイにより、増幅したウイルス血性分離物
から又はサル血清から直接に感染性ウイルスの力価を測定した。Ｃ６／３６細胞
でのアッセイは、Ｐｕｔｎａｋら、１９９６、前出が述べたように実施した。

【００４２】 中和試験。Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９６７（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９９，２８５
−２９０）が使用したのと同様のプラーク減少中和試験を用いて、サル血清から
ＤＥＮ中和抗体を測定した。表１に列記した親ウイルスを使用して、血清標本に
おけるプラーク減少５０％エンドポイント（ＰＲＮＴ５０）を測定した。

【００４３】 実施例１ ＰＤＫ細胞におけるＤＥＮウイルスの修飾及びワクチンロットの生産。ワ
クチン開発のために選択したＤＥＮウイルス株は、ＰＤＫ継代に先立って様々な
継代歴を有していた。ＤＥＮ−４ ３４１７５０の場合は、ＰＤＫ細胞培養の接
種前に一度だけカでの継代があり、ＤＥＮ−１ Ｗｅｓｔ Ｐａｃ ７４株はＰ
ＤＫ継代の前に２０のＦＲｈＬ細胞継代歴があった（表１）。ＤＥＮ−３を除い
て、すべての株が少ない回数のＰＤＫ継代後に馴化した。ＤＥＮ−３については
、この株をＰＤＫ細胞に馴化させるために初期継代でウイルス投入量を増加する
という付加的な作業が必要であった。ＰＤＫ細胞への馴化後一般的なケースとし
て、ＤＥＮウイルス力価は１０^４−１０^５ＰＦＵ／ｍｌの範囲内と認められた。
力価を高める試みは成功せず、ワクチン産生のために代替的な細胞基質を探索し
た。このために、いくつかの理由からＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２（ＦＲｈＬ）細胞を
選択した：１）ＤＥＮウイルスは、これらの細胞においてＤＥＮワクチンの製造
を可能にする約１０^６ＰＦＵ／ｍｌの力価まで複製する；２）これらの細胞は、
ワクチン細胞基質に関連すると考えられる有害反応を伴わずに第Ｉ相臨床試験で
試験された、いくつかのＤＥＮワクチンの調製のために使用されている；３）Ｆ
ＲｈＬ細胞は、潜在的腫瘍形成作用を持たず、逆転写酵素活性や夾雑物を含まな
い正常なアカゲザル肺二倍体細胞である；４）細胞が「正常な」二倍体細胞であ
るので、ワクチンを精製するために規制上やその他の必要条件がない；５）入手
可能な低い継代細胞から出発してワクチン製造のために使用しうる細胞世代でＦ
ＲｈＬ細胞バンクを確立することができる。それ故ＰＤＫ継代は、選択的弱毒化
の実験的プロセスを検討しようとするものにとって優れたモデルを提供する。し
かし、ＰＤＫ連続継代が累積的選択プロセスを及ぼすように、もう１つ別の細胞
基質でのさらなる継代はそれ自体の選択圧をもたらす。ＦＲｈＬ継代がヒトに対
するウイルスのビルレンスを上昇させる又は低下させるかどうかは不明である。
十分に特性付けられねばならない安定な細胞系統の一度だけの使用は興味深い。
しかし、ＦＲｈＬ細胞に関して公表されている経験は、これらの細胞がＰＤＫで
の連続継代の間に獲得された生物学的特性を逆転しうる又は不安定化しうること
を示唆している（Ｈａｌｓｔｅａｄら、１９８４，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ
Ｈｙｇ ３３，６５４−６６５；Ｈａｌｓｔｅａｄら、１９８４，Ａｍ Ｊ
Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ３３，６６６−６７１；Ｈａｌｓｔｅａｄら、１９
８４，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ３３，６７２−６７８；Ｈａｌｓ
ｔｅａｄら、１９８４，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ３３，６７９−
６８３；Ｅｃｋｅｌｓら、１９８４，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ３
３，６７９−６８３）。

【００４４】 ＰＤＫ継代したウイルスのＦＲｈＬへの馴化は、ＤＥＮウイルスのすべての株
について一様に成功し、ＰＤＫ継代には依存しなかった。ＦＲｈＬ継代１−４の
採集物からのウイルス力価は１０^５−１０^６ＰＦＵ／ｍｌの範囲であった。第三
−第四ＦＲｈＬ継代までに、すべてのＤＥＮ株セットウイルスのワクチンロット
を調製し、表２に列記されているように試験した。ＦＲｈＬ細胞バンク試験なら
びにマスターシードと生産シード試験についてのデータも表２に示している。安
全性と汚染がないことを確認するために必要なこれらの試験の結果は、陰性若し
くは許容される規格内であった。ＤＥＮ−４ ３４１７５０ ＰＤＫ−２０生産
シードについては、サルの神経ビルレンス試験を実施した。この試験の結果はＨ
ｏｋｅ，１９９０（Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ４３，２１９−２２
６）に認められる。比較のために使用したＤＥＮ−４生産シードならびにＤＥＮ
−４親ウイルスは神経病発生性ではなかった。残りの候補ＤＥＮワクチンが神経
ビルレンスについて評価する必要があるかどうかは、この実験ならびにＤＥＮサ
ル神経ビルレンスの他の試験（個人的通信）からのデータに基づき、疑わしいま
まである。

【００４５】 実施例２ ＰＤＫ継代したＤＥＮウイルスを接種したアカゲザル。ＰＤＫ細胞で継代した
、「株セット」と称されるＤＥＮウイルスの感染性を、各々の血清型について修
飾していない親ウイルスと比較した。表３はこれらの試験の結果を列記したもの
で、接種後２週間連続的に採取した血清においてウイルス血が認められた日数に
よってサルの感染性の度合を測定した。サルの親ウイルス接種は、それぞれＤＥ
Ｎ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３及びＤＥＮ−４で接種した３〜４匹のサルの群
において６．８、５、３、及び４．７の平均日数を生じた。ＤＥＮ−２親ウイル
スについては、付加的なデータ（示していない）により、同様のサルと分離手法
を使用して測定可能なウイルス血を有する感染が経時的に極めて再現可能である
ことが実証された。残念ながら、サル血清におけるウイルス力価に関しては部分
的なデータしか存在しない。存在するデータの大部分が、サルのウイルス血をカ
の細胞培養で力価測定したＤＥＮ−２親ウイルスに関する経験からのものである
。接種後４〜８日目のピークウイルス力価は、１０^５ＰＦＵ／ｍｌ血清に達する
力価を示した（Ｐｕｔｎａｋら、１９９６、前出）。

【００４６】 各々の株セットに関して、ＰＤＫ継代は、サルに感染するウイルスの能力低下
が示すようにＤＥＮウイルスの修飾をもたらす。株セットのいくつかについては
、最も高いＰＤＫ継代でウイルス血が全く存在しないことにより、これが明瞭に
実証された。ＰＤＫ継代２７のＤＥＮ−１によるサルの接種は、４匹のサルにお
いてウイルス血０日との結果を生じた。これは、試験した合計５６の血液からの
分離物が０であることを意味する。ＤＥＮ−３ ＰＤＫ−２０及びＰＤＫ−３０
についても同様の結果を認めた。このウイルスに関してＰＤＫ−３０で、サルの
感染性のすべての証拠が喪失した、すなわち１０^６ＰＦＵのウイルスで接種した
サルにおいてウイルス血及びセロコンバージョンが全く存在しなかった。ＤＥＮ
−２株はサル感染性の改変に達するまでに最大数のＰＤＫ継代を必要とした。こ
のウイルスに関しては、ウイルス血低下のためにＰＤＫ細胞培養で少なくとも４
０の継代が必要であった。この経験と対照的に、ＤＥＮ−４株３４１７５０は、
サル感染の改変のためにＰＤＫ細胞での６継代しか必要としなかった。もう１つ
のＤＥＮ−１株、１００９については、５０ＰＤＫ継代後でも、親ウイルスと比
較してサル感染の改変の証拠を認めなかった（データは示していない）。結論と
して、ＰＤＫ細胞継代は様々なＤＥＮ分離物の修飾と弱毒化のための有効な経験
的方法であると思われる。これは、ＰＤＫ複製には適するが、サル及びヒトにお
ける標的細胞での複製には必ずしも適さないウイルス個体群にとって、おそらく
選択圧を及ぼすＤＥＮのためには不自然な宿主である。

【００４７】 ヒトにおける候補ワクチン試験のための材料と方法 ボランティア。１８−４５歳の健常男性及び女性ボランティアを、血液化学、
血液学、プロトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間、検尿、急速血漿レ
アギン試験、及びＢ型肝炎表面抗原とＨＩＶに対する抗体についての血清学を含
めて、一連の試験によって検査し、スクリーニングした。持続性の有意の異常又
は試験陽性に基づいてボランティアを除外した。女性ボランティアは、ワクチン
接種前４８時間以内に妊娠試験陰性であり、ワクチン接種後３ヵ月間従来の避妊
法を使用して妊娠を避けることを言明した同意書に署名することに異存がなけれ
ば、参加に適格とした。さらに、ボランティアが、デング熱ワクチンへの応答に
影響を及ぼす可能性のあるフラビウイルス（Ｓｃｏｔｔ，１９８３，Ｊ Ｉｎｆ
ｅｃｔ Ｄｉｓ １４８，１０５５−１０６０）の免疫を以前に獲得している場
合、あるいはネオマイシン、ストレプトマイシン又はゲンタマイシンに対するア
レルギーの既往歴がある場合には除外した。以前のフラビウイルス免疫は、デン
グ熱１−４型、日本脳炎、又は黄熱病に対する検出可能な赤血球凝集反応阻害抗
体を有しておらず（１：１０の血清希釈で）、黄熱病ワクチン又はフラビウイル
ス感染の経歴がないことと定義した。

【００４８】 臨床試験のすべての局面についての知識を調べるためにデザインされた筆記試
験でボランティアは≧７０％と採点された。その後ＵＳ ２１ ＣＦＲパート５
０−「ヒト被験者の保護」に従って各ボランティアからインフォームドコンセン
トを得た。臨床プロトコールは、ヘルシンキ宣言（プロトコール）、及び陸軍規
制７０−２５−「研究の被験者としてのボランティアの使用」及び４０−７−「
人体における治験薬の使用及びスケジュールＩ規制物質の使用」を含めて、すべ
ての関連規制条件に適合した。試験は、ヒト被験者試験審査委員会、公衆衛生局
、合衆国陸軍、ＷＲＡＩＲ人体用研究委員会、及び試験薬審査委員会、バルチモ
アのメリーランド大学によって承認された。

【００４９】 試験ワクチン。試験ワクチンは表４に列挙されている。ワクチンウイルスは、
シードとワクチンを調製するため、一次イヌ腎細胞において繰り返し継代し、次
いで３回の最終継代としてアカゲザル胎児肺（ＦＲｈＬ）連続二倍体細胞培養に
おいて継代した。ボランティアでの治験の前に、各候補物が、ワクチン接種した
アカゲザルにおいてその野生型親ウイルスに比べて実質的に低いウイルス血を誘
発することを確認した。アカゲザルの感染によって測定した十分な弱毒化は、デ
ング熱ワクチン株がヒトでの試験のために適切なワクチンであることを示唆した
。

【００５０】 免疫の直前に、凍結乾燥ワクチンのバイアルを注射用滅菌水（ＵＳＰ）で還元
した。免疫後、再水和したワクチンの未使用部分を氷上に保持し、４時間以内に
ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞単層において力価測定した（Ｓｕｋｈａｖａｃｈａｎａら、
１９６６、Ｂｕｌｌ ＷＨＯ ３５，６５−６６）。各々のボランティアは、注
射した候補ワクチンに応じて１．０×１０^５及び４．５×１０^６ｐｆｕのウイル
スを摂取した（表４）。個々の試験ワクチンの継代歴を下記に要約する。

【００５１】

【表４】

【００５２】 デング熱１型４５ＡＺ５ワクチン： １９７４年にナイル島（Ｎａｉｒｕ Ｉ
ｓｌａｎｄ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐａｃｉｆｉｃ））でのＤＥＮ熱のヒト患者より
ＤＥＮ−１株Ｗｅｓｔ Ｐａｃ ７４が単離された。単離物をＦｒｈＬ細胞培養
液中で２０回継代培養し、ワクチンロットを調製した。継代培養には、弱毒化さ
れ、ヒトワクチン接種に好適であったウイルスを回収するための、変異促進およ
びプラーク選別が含まれた。２人のヒトボランティアへのワクチン接種に続き、
ボランティアのうち１人におけるＤＥＮ疾患のためにワクチンの使用を中止する
決定をした。ワクチンをさらに、ＰＤＫおよびＦｒｈＬ細胞培養液中での継代に
よって弱毒化した。現在の候補ワクチンはＤＥＮ−１ ４５ＡＺ５ ＰＤＫ−２
０である。

【００５３】 デング熱２型Ｓ１６８０３ワクチン： デング熱２株Ｓ１６８０３ウイルスは
デング熱の患者からのタイウイルス単離物に由来した。ウイルスを、合計５０Ｐ
ＤＫ継代し、最終継代は、接種およびワクチン産出のためにアカゲザル胎児肺二
倍体細胞（ＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２）中で行った。２つのワクチン候補を最初に３
０回目および５０回目ＰＤＫ継代レベルで調製し、試験のために選別した。他の
ワクチン候補は、同様のデング熱２親株Ｓ１６８０３ウイルスからＷＲＡＩＲに
て作り出され、サルク研究所（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓｗｉｆｔｗａ
ｔｅｒ，ＰＡ）による４０回継代レベルにて産出された。

【００５４】 デング熱３型ＣＨ５３４８９ワクチン： デング熱３型株ＣＨ５３４８９ウイ
ルスはタイ株より由来し、初代緑色サル腎臓（ＰＧＭＫ）およびＣ６／３６昆虫
細胞中での初期継代の後、初代イヌ腎臓（ＰＤＫ）細胞中で３０回継代した。Ｐ
ＤＫ継代１０、２０および３０からのウイルスを、胎児アカゲザル肺二倍体細胞
培養を接種するのに使用した。

【００５５】 デング熱４型３４１７５０カリブワクチン： デング熱 ４ワクチン候補は、
デング熱４のカリブ株（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，１９８２）より由来し、ハワイ大学
にて継代され、ＷＲＡＩＲ（Ｍａｒｃｈｅｔｔｅ，１９９０，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏ
ｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ４３，２１２−２１８）にて製造された。親ウイルスに対
する抗体は、始原型Ｈ−２４１を含む他のデング熱４ウイルス株を中和する。ヒ
ト単離物の弱毒化は初代イヌ腎臓（ＰＤＫ）細胞培養液中で２０回継代すること
で実施した。

【００５６】 研究設計 標準の無作為化した、単一盲検入院患者臨床プロトコールをすべて
のパイロット研究のために使用した。大部分の研究はメリーランド大学のワクチ
ン発展センター（ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｂａｌｔｉｍ
ｏｒｅ ＭＤ）で実施した。デング熱２ Ｓ１６８０３ ＰＤＫ ４０ワクチン
およびデング熱４ ＣＨ３４１７５０ ＰＤＫ ２０ワクチンのパイロット研究
は感染疾患米軍医学調査機関（ＵＳＡＭＲＩＩＤ）の医学部門（Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓ Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｆｔ Ｄｅｔｒｉｃｋ
，ＭＤ）にて実施した。

【００５７】 ワクチンの初期臨床研究において、特定の株に関する最も高い入手可能な継代
を３人のボランティアでまず試験した。症状をほぼ３週間モニタし、もしボラン
ティアが良好なままであったならば、次により低継代を試験した。１人またはそ
れ以上のボランティアが病気になった場合、より低い継代がより弱毒化される可
能性があったことが推定されたときにはワクチン株のより低い継代を試験するこ
とは実施しなかった。３人のボランティアにおいてすべての許容可能な継代レベ
ルを試験した後に、疾患を引き起こさなかった最も低いレベルを、７人までのさ
らなるボランティアでの試験のために選択した。

【００５８】 注意深い観察を可能にし、外来感染性疾患への曝露を防ぎ、可能性のあるベク
ター蚊の感染を防ぐために、ボランティアを、接種前３日間より免疫化の後２０
日間まで調査棟に閉じこめた。ひどさ、またこれらがワクチン接種に関連したと
考えられるか、考えられなくいかに関わらずに、それぞれのワクチンの投与に続
くこの期間内に起こったすべての副作用を記録した。ワクチンの許容可能な安全
性を以下の深刻な副作用のない状態としてあらかじめ定義した。ワクチン接種に
関連しない診断によって示されない任意の深刻な臨床疾病、持続性熱（２４時間
にわたる４回の測定で口内温度が≧３８．５℃である、最大日口内温度が３連続
日にて≧３８．５℃である、または任意の別々の測定で４０℃を超える温度であ
る）、２連続測定における、血小板減少症（１００，０００血小板／ｍｍ^３より
少ない）または白血球減少症（絶対的好中球数＜１０００）、または別な方法で
説明できない３またはそれ以上の連続日での正常の４倍以上の血漿アミノアラニ
ン変換酵素（ＡＬＴ）濃度。さらに、ワクチンの使用に関連する可能性ある任意
の明らかな副作用を示唆していたであろう事柄を深刻な事象として詳細に記録し
た。

【００５９】 ボランティアに、第０日に希釈していないワクチン、０．５ｍｌを皮下に接種
した。免疫後、生存兆候を６時間毎に記録した。注射部位を試験し、紅斑の最大
直径および硬化を毎日測定し、記録した。臨床的な兆候（熱［＞３７．８℃］、
発疹、嘔吐、点状出血および肝臓、脾臓肥大）および症状（倦怠感、頭痛、筋肉
痛、関節痛、悪心、目の痛みまたは光恐怖症）を、免疫後最初の２０日間毎日査
定した。症状は中度（症状に気づくが、棟で活動を続けた）または重度（症状に
よりベットでの生活）として等級化した。ボランティアによって要求された場合
、いたみの症状はプロポキシフェン ヒドロクロライドで処置し、解熱剤は使用
しなかった。観察を症状および身体的な発見の標準のチェックリストで記録した
。ボランティアを２１日目に試験棟より出し、接種の後１、６、１２および２４
ヶ月の連続研究のために戻ってもらうことを要求した。

【００６０】 ２人の健康なフラビウイルス免疫ボランティアを、デング熱１ ４５ＡＺ５ワ
クチンの親株にてＵＳＡＭＲＩＩＤにて免役し、２年後デング熱３ ＣＨ５３４
８９ワクチンの親株で免役した。本研究からの医学的記録を、以下の兆候および
症状、熱、発疹、倦怠感、頭痛、筋肉痛、関節痛および目の痛みまたは光恐怖症
が存在するか存在しないかに関して吟味した。ウイルス血症を毎日測定した。本
試験と対照的に、症状を体系的に記録はせず、症状の程度を等級化しなかった。
さらに、後の研究の間にＵＳＡＭＲＩＩＤにて８人のボランティアに与えたデン
グ熱４ ３４１７５０カリブＰＤＫ ２０での臨床的な事象を抜粋し、要約して
、現在のワクチンのそれと比較した（上記Ｈｏｋｅ，１９９０）。

【００６１】 研究室評価 血液をボランティアより定時的に入手可能なヘモグロビンおよび
ヘマトクリット、示差計数での白血球数計数、血小板計数およびアスパラギンア
ミノ転移酵素（ＡＳＴ）およびアラニンアミノ転移酵素（ＡＬＴ）濃度に関する
医学的試験のために一日おき、および第３１日に回収した。さらに、血液をウイ
ルス単離および抗体研究のために１日おきに第２０日まで回収した。血液（２０
ｍｌ）を≦２時間、４℃にて凝血させ、血漿を１ｍｌ分液でデカントし、冷凍し
、研究まで−７０℃にて保存した。

【００６２】 ウイルス単離 デング熱ウイルス血症の決定のために、血清を融解し、Ｃ６／
３６蚊細胞単層上に植え付け、１４日間２８℃にてインキュベートした。上清培
養液回収液を、ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞でのプラークアッセイによってウイルスに関
してアッセイした（Ｓｕｋｈａｖａｃｈａｎａら １９６６，Ｂｕｌｌ ＷＨＯ
３５，６５−６６）。血清中のウイルスの量を定量するために、プラークアッ
セイをヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）蚊細胞のＣ６／３
６クローン上で実施した（上記Ｈｏｋｅ，１９９０）。細胞培養フラスコを血漿
の希釈物で接種させ、１〜２時間３５℃にて吸収させた。ハンクスの平衡塩溶液
（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）および０．
７５％アガロース、５％ラクトアルブミンヒドロライセート、０．１２Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ_３からなるオーバーレイ培地および抗生物質を加え、すべてのフラスコを
３５℃にてインキュベートした。７日後、フラスコを５％液体ニュートラルレッ
ドにて３〜５時間染色した。過剰の染料を取り除き、プラークを１８時間後に読
んだ。

【００６３】 血清学 抗体試験には、試験しているワクチンでの株と同一の血清型のデング
熱ウイルスを用いて行うＥＬＩＳＡ、ＨＡＩおよびプラーク減少中和試験（ＰＲ
ＮＴ）が含まれる。抗デングＩｇＭ抗体の検出はＥＬＩＳＡを改変して実施し、
値＞０．１０ ＯＤ単位を陽性と見なした（上記Ｉｎｎｉｓ，１９８９）。ＨＡ
Ｉ試験を、アセトンで抽出した血清を使用して、４〜８ユニットの個々の抗原を
用いてマイクロ容量まで改変した標準技術によって実施し、阻害剤、９Ｃｌａｒ
ｋｅとＣａｓａｌｓ，１９５８，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ ７，５
６１−５７３を取り除いた。ＰＲＮＴアッセイはＲｕｓｓｅｌｌら （上記Ｒｕ
ｓｓｅｌｌ，１９６７）によって記載された方法にて実施した。

【００６４】 統計学的解析 継代レベルと反応性の頻度および厳格さの間の関係を、それぞ
れ傾向およびスペアマン相関に関するコクラン−アーミティッジ（Ｃｏｃｈｒａ
ｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅ）試験を用いて、デング熱２ワクチンＳ１６８０３（ＰＤ
Ｋ ３０、４０および５０）とデング熱３ワクチンＣＨ５３４８９（ＰＤＫ １
０および２０）に関して解析した。症状および兆候は独立的に、存在または非存
在、目症状、頭痛、倦怠感、筋肉痛、関節痛、発疹および熱（体温＞３７．８℃
）を経験した日数を含めて解析した。より高いＰＤＫ濃度がより低い反応性に関
連しないという無益な仮説を、５パーセントの確率で評価した。データの観察に
より、それぞれのウイルスに関する最適な継代レベルを、それぞれのボランティ
アの臨床的および免疫学的応答に基づいて決定した。許容できない副作用を引き
起こさず、しかし約８０％のボランティアを免役した継代レベルを、Ｕ．Ｓ．
Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ Ｃｏｍｍａｎｄ’ｓ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓｔｅｅｒ
ｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによるさらなる発展のために選択した。

【００６５】 ワクチンによる感染の定義 ワクチンによる感染は、ボランティアにおけるデング熱ウイルスの複製として
定義し、免疫後での血清型特異的中和抗体またはＩｇＭ抗デング熱抗体の存在に
よって検出した。ウイルス血症には、抗体応答がない状態では検出されないよう
な感染の診断に必要なものとしては含まれない。ワクチン失敗は、許容不可能な
逆臨床的応答または回復期ＩｇＭまたはＰＲＮＴ抗体の発達の失敗として定義す
る。

【００６６】 実施例３ 弱毒化デング熱ワクチンに対する臨床的応答 デング熱２ Ｓ１６８０３ワクチン ＰＤＫ細胞中での第５０回継代より産出したデング熱２株Ｓ１６８０３ウイル
スを、３人のボランティアで検査した。ボランティアは健在であり、口内温度は
＞３８．０℃にはならなかった。３人のボランティアのうち２人が、一過性の中
程度の症状、嫌悪感、頭痛および目症状（目の痛みまたは光恐怖症）を経験した
。研究室での発見には、３人のうち２人で中程度ＡＬＴ上昇（＜２×正常）、そ
して３人のボランティアのうち１人での中程度の白血球減少症が含まれた。ＰＤ
Ｋ５０ワクチンが許容可能な安全特性であったので、次のより低い入手可能継代
、ＰＤＫ３０を臨床的評価に関して選択した。

【００６７】 １０人の被験者にて試験したＰＤＫ３０ワクチンは弱毒化されており、デング
熱を和らげるために穏やかに適合性のある症状を起こした。４人のボランティア
（４０％）は、ワクチン後９〜１４日にわたりＴｍａｘ３８．５℃の低程度の熱
を持った（中央日１２）。８０％が発疹を起こした。大部分のボランティアが目
の症状（１０／１０）、頭痛（９／１０）および倦怠感（９／１０）を経験し、
一方７０％が＞１の頭痛、目の痛みおよび光恐怖症、倦怠感、または筋肉痛の重
度の症状であった。３人のボランティアがそのアラニンアミノ転移酵素（ＡＬＴ
）および肝臓病理の程度が中程度上昇した。

【００６８】 ＰＤＫ３０ワクチンはとても反応原性であるので、さらにボランティアにおい
て試験することができないと考えられたので、ＰＤＫ４０ワクチンをマスターシ
ードより産出した。ＰＤＫ４０を接種した３人のボランティアのうち２人は、ワ
クチン後９〜１０日に、低程度体温（＜３８．１℃）、発疹、倦怠感および頭痛
を伴う中程度のデング熱様症候群を示した。症状は薬物療法に対する無能性また
は必要性なしに数日にわたって自発的に解決した。症状に伴って、血清肝臓酵素
の予期しない上昇があり、１人において１９９ ＩＵ／ｍｌの最大ＡＬＴ濃度（
正常の４倍）、他において７７ ＩＵ／ｍｌの最大ＡＬＴ（正常から１．５倍上
昇）であった。三人目のボランティアは無症候性のままであったが、しかしまた
ＡＬＴが２倍上昇した（〜最大１０^２）。すべての研究室での異常は干渉なしに
数日以内に解決し、すべてのボランティアはワクチンの受容後２１日には良好な
健康で解放した。ＰＤＫ４０に関連した肝炎事象の異常な頻度のために、この産
物に対するさらなる発展は計画しなかった。

【００６９】 表５は、ＷＲＡＩＲデング熱２ワクチンでの初期臨床的実験を要約している。
熱および発疹の兆候の頻度の減少が、継代レベル３０と５０ワクチンの間で見ら
れる。さらに、継代を増加させるにしたがって、Ｔｍａｘ ３８．５℃から正常
までの口内温度の下落があり、しかし１日を超えての熱の期間の変化はない。デ
ング熱２ワクチンに関して、目の症状、発疹、頭痛、倦怠感および筋肉痛の頻度
および期間は明らかに継代レベルと相関した。

【００７０】

【表５】

【００７１】

【表６】

【００７２】

【表７】

【００７３】

【表８】

【００７４】 デング熱３ＣＨ５３４８９ワクチン ＷＲＡＩＲにて開発されたデング熱３
ワクチン（ＣＨ５３４８９、ＰＤＫ ０）を、２人の健康な黄色熱−免疫男ボラ
ンティアに、２×１０^４ｐｆｕのウイルスの皮下接種０．５ｍｌとして投与した
。即時免疫後経路は普通であった。６日まで、両ボランティアは、高熱、悪寒、
筋肉痛、頭痛、倦怠感および散在性紅斑発疹によって特性化される適度に重度な
デング熱の病気であった。両ボランティアは血小板減少症および白血球減少症を
発生させたが、出血性熱の兆候はなかった。５日間持続した熱の期間の後、両人
はすぐに回復し、２１日までにはよくなった。両方の被験者によって重症疾患が
経験されたために、本継代レベルのさらなる試験は実施しなかった。続いて、Ｐ
ＤＫ１０およびＰＤＫ２０継代レベルをワクチン候補として調製した。

【００７５】 ＰＤＫ２０ワクチンを６人のボランティアに与え、結果として穏やかな反応原
性となった。１人の被験者が、３日目に一過性熱（Ｔｍａｘ ３８．２℃）、咽
頭炎および頭部リンパ節症を伴う早期熱疾患を経験した。デング熱ウイルスはボ
ランティアの血清からは単離されなかった。本被験者は熱を伴う介入疾患を持っ
ていたことが考えられたが、これは直接的にワクチン接種に関連しなかった。６
人のボランティアのうち４人が、発疹のない短期間の穏やかなデング熱症状を起
こし、関節炎、目の痛みおよび頭痛が最も頻度のある病気であった。しかしなが
ら、１人のボランティアは、３日間さらに重度な頭痛、倦怠感および目の痛みの
症状を示した。彼はまた白血球減少症を発生させ、ＡＬＴ濃度の上昇が維持し、
これらの研究所での異常は、３１日時点での追跡で解決した。他のボランティア
は、２×正常より少ないところまで、穏やかで逆転可能なＡＬＴの上昇のみを持
った。ＰＤＫ２０ワクチンはわずかに許容可能である反応原性をもち安全であっ
たので、次に最も低い入手可能継代ワクチンウイルス（ＰＤＫ１０）を試験した
。

【００７６】 ＰＤＫ１０ウイルスは、レシピエントにおいてとても反応原性であることが判
明した。３人のボランティアのうち１人が第１０日および第１１日にて低級熱（
Ｔｍａｘ ３８．３℃）を、そして１３日間鮮紅色発疹を発生させた。他のボラ
ンティアは、ワクチン後６〜９日での歯肉形成および減衰蕁麻疹、および過敏頸
部および腋窩リンパ節に関連したかゆみを発生させた。彼は続いて、１０〜１２
日に、倦怠感、頭痛および筋肉痛を伴った斑点状丘疹発疹をおこした。このボラ
ンティアは、ワクチンに対する特異体質アレルギー応答、続いて典型的なデング
熱様疾患をおこした可能性がある。これらの２人のボランティアはまた、白血球
減少および＜２×正常までのＡＬＴ濃度の上昇の研究所異常を起こし、これらは
３１日目での追跡で解決した。

【００７７】 表６は、デング熱３ ＣＨ５３４８９ワクチンに対する応答を要約している。
継代を経ての兆候および症状が少ない頻度およびより短い期間の傾向があったけ
れども、継代はどちらの解析でも統計学的に有意にまでは到達していない。

【００７８】 デング熱４ ３４１７５０ワクチン ８人のボランティアに１０^５ ＰＦＵの
ＰＤＫ ２０ワクチン（上記Ｈｏｋｅ，１９９０）を与えた。５人のボランティ
アがかろうじて気づくことのできる斑点、分岐発疹および最低温度上昇（最大３
８．１℃）をおこした。ウイルス血症および抗体応答がまたこれらの５人のボラ
ンティアで起こった（６３％）。

【００７９】 新規ＤＥＮ−４ ３４１７５０候補ワクチンをＰＤＫ継代１５より調製し、こ
れはより低継代がより伝染性である可能性を予想した。３人のボランティアにこ
のワクチンを与え、２人は最小症状を経験した。三人目のボランティアは、熱、
顔面および四肢の浮腫性肥大、重度の倦怠、発疹、目の痛み、光恐怖症および関
節炎を伴い、８日目に突然病気になった。続く３日間にわたり、熱がＴｍａｘ
３９．６℃で維持したが、兆候および症状は自発的に解決した。ワクチンに対す
るこの連続的な副作用のために、ＰＤＫ−１５ワクチンのさらなる使用を終了し
、ＰＤＫ−２０をさらなる評価のために選択した。

【００８０】 実施例４ ウイルス血症および弱毒化デング熱ワクチンに対する免疫応答 表７はＷＲＡＩＲデング熱ワクチンでのウイルス血症および免疫応答を記述し
ている。個々のワクチンの感染性を以下に要約する。

【００８１】 デング熱２ Ｓ１６８０３ワクチン ＰＤＫ５０ワクチンのレシピエントはウ
イルス血症をおこし、３人のうち２人までが、６０日までに低タイター中和抗体
を産出した。これらの発見は、ワクチンウイルスがヒトに対する感染性を減少さ
せたことを示唆していた。反対に３人のうち２人のデング２ＰＤＫ４０ワクチン
接種者はあきらかなウイルス血症を持ち、すべてがワクチン接種後に高タイター
抗体を産出した。予想したように、デング熱２ ＰＤＫ３０ワクチンの感染性は
最も高く、ウイルス血症がすべての１０人のボランティアにて検出され、すべて
の被験者は６０日までに＞１：６０の中和抗体力価でセロコンバートした。

【００８２】 デング熱３ ＣＨ５３４８９ワクチン ワクチンの温度感受性および小プラー
ク表現型を残しているデング熱−３ウイルスが、デング熱３ ＰＤＫ０ワクチン
の２人の黄熱病免疫レシピエントで６および７日間回収された。続いて、第二感
染様交差反応性を持つ高力価化ＰＲＮＴ５０および凝血阻害（ＨＡＩ）抗体を、
両方のボランティアから３０および６０日に回収した血清中で測定した。感染性
はデング熱３ ＰＤＫ１０弱毒化ワクチンを与えた被験者で同様であり、３人の
うち２人がウイルス血症を起こし、ワクチン接種がすべてにおいて中和抗体を誘
導した。対照的に、６人のデング熱３ ＰＤＫ２０ワクチンの内２人が、検出可
能なウイルス血症をもち、３人のボランティアが続いてセロコンバートし、これ
が感染性の減少を反映している。

【００８３】 デング熱４ ３４１７５０ワクチン ８人のボランティアに１０^５ ＰＦＵの
ＰＤＫ２０ワクチンを与え、５人（６３％）でウイルス血症および抗体応答が起
こった。この候補のより低い継代より調製したワクチンであるＰＤＫ１５はより
感染性である。ウイルスを、ワクチン接種の後８および１０日に、一人のボラン
ティアより単離し、最大力価は１５ ｐｆｕ／ｍｌであった。このボランティア
は続いて、第二ＨＡＩ応答を伴う４５０の中和抗体力価をおこし、すでにセント
ルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）脳炎ウイルス（ワクチン接種の前、ＰＲＮＴタイタ
ー１：２０）に曝露されていたことがわかった。検出可能なウイルス血症を持た
ない２人のボランティアが、ワクチン接種後３０日までに１：１０および１：４
０の中和力価をおこした。

【００８４】 実施例５ 候補ワクチンの選択 ＷＲＡＩＲ ＰＤＫ−弱毒化ワクチンの安全性試験の長期プログラムを表８に
示し、それぞれの血清型に対するワクチンの顕著な特性を列記している。ＰＤＫ
継代を増加させることにより、結果としてボランティアあたりの症状の期間およ
び数を査定した平均疾病スコアが減少した。さらに、ＰＤＫ継代の増加はまた、
デング熱４ワクチンを除いて、ウイルス血症の平均日数の減少に関連した。試験
したデング熱２、３および４のワクチンのうち、ただ１つの継代レベル、デング
熱２ ＰＤＫ５０、デング熱３ ＰＤＫ２０およびデング熱４ ＰＤＫ２０が安
全であり、許容可能に反応原性であり、長期臨床試験に好適であると判断された
。しかしながら、感染したレシピエントの割合は、ＰＤＫ継代レベルの増加と共
に減少した。中和抗体力価≧１：１０の割合として定義したセロコンバートは同
様に、明白な信頼区間内で減少した。

【００８５】 討議 ＷＲＡＩＲは生弱毒化デング熱ワクチンの発展に長年にわたって関わってきた
。ＷＲＡＩＲとＭａｈｉｄｏｌデング熱ワクチンプログラム両方が、イヌ腎臓（
ＰＤＫ）細胞での（細胞培養液中で成長を繰り返した）いくらかの継代を介して
弱毒化することで、さまざまな生ワクチンを発展させてきた。少数のボランティ
アでのパイロット試験の結果は、ＷＲＡＩＲ候補ワクチンの安全性を確立した。
６５人のレシピエント内のボランティアはだれも、継続した深刻な傷の緊急の処
置を必要としなかった。３人のボランティアが、デング熱ワクチン接種に関連し
た一過性の特異体質的応答を患い、結果として彼らが受けたワクチンのさらなる
臨床的発達離脱となった。やっかいである中での弱毒中のワクチンの実験的感染
は許容可能であった。

【００８６】 臨床的経験は、ワクチンウイルスのＰＤＫ継代の増加が、ボランティアに対す
る弱毒化を増加させることを示した。この効果は、デング熱１およびデング熱３
ウイルスで最もよく見られ、そこで親非継代ウイルスは結果として、改変してい
ないデング熱および続く２０ ＰＤＫ継代許容可能反応原性となる。しかしなが
ら、ＰＤＫ継代の増加はワクチンウイルスの感染性を減少させ、結果として免疫
原性の減少となる。さらに、ヒトでのワクチンウイルスのウイルス血症の減少は
、（デング熱４ ＰＤＫ１５を除いて）アカゲザルでのそれと相関するように見
える。これらの発見は、ボランティアでの弱毒化デング熱ウイルスワクチンの感
染性が免疫原性と同等であることを証明した。継代レベルと反応原性の間の関係
は、１つの症状を経験した被験者が、いくつかの症状を経験する可能性があるの
で、用心して説明されるべきである。本発明者らの解析方法は、これらの症状の
独立性を仮定しているので、独立Ｐ−値に基づいた解釈は不明確であり得る。ま
た、本発明者らは、発疹が、継代レベルとの強い関連を示していると信じている
（存在に関して独立Ｐ＝０．００９、期間に関してＰ＝０．０１）。これは、デ
ング熱２または３ワクチンいずれかに関して、発疹と他の症状の間の有意な相関
の欠如によって支持される(Ｓｐｅａｒｍａｎの試験)。

【００８７】 許容可能な安全性特性を持つワクチンのみ、デング熱１ ４５ＡＺ５ ＰＤＫ
２０、デング熱２ Ｓ１６８０３ ＰＤＫ５０、デング熱３ ＣＨ５３４８９
ＰＤＫ２０およびデング熱４ ３４１７５０ ＰＤＫ２０を、長期臨床試験に関
して選択した。少数のボランティアのためのセロコンバートでの明白な信頼区間
のために、続く試験は、それぞれの４つの選択したワクチンのレシピエントの数
を増加するように探索した。さらに、さらなる試験は、これらの弱毒化ワクチン
の免疫原性を、これらの試験のために使用した単一用量の代わりに２つの用量で
の投与を介して押し上げることができるかどうかを決定するために探索する可能
性がある。

【００８８】 実施例６ 一価ワクチンの長期研究；２用量で与えた一価ワクチン、１および２用量として
与えた四価形式として混合した一価ワクチン

【００８９】 研究設計： これらの目的は、単一投与として、続いて２用量ワクチン接種ス
ケジュールによって与えた４つの一価ワクチンの安全性および免疫原性を評価す
ることであった。続いて、組合せ四価ワクチンの安全性および免疫原性を評価し
た。被験者は、２つの場所、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅのメリーランド大学およびＷＲ
ＡＩＲ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣから別々に採用した。２２人の被験者の最
初の集団を、４または５人の４群に分けそれぞれ単一用量の一価デング熱または
黄熱病１７Ｄウイルス（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ）どちらかを与えた。１７Ｄ黄熱病
ワクチンを反応原性の対照およびベンチマークとして利用した。他の３１人の被
験者を、１つの一価ワクチンの２用量、１ヶ月の時点で半分と３ヶ月の時点で残
りの半分を与えた７〜８人の４群に分けた。最後に１０人のボランティアに２ま
たは３用量の四価ワクチンを与えた。最初の４人の四価レシピエントには０およ
び１ヶ月の時点でワクチン接種を行った。残りの６人の四価レシピエントには０
、１および４ヶ月の時点でワクチン接種した。１０人の四価ワクチンレシピエン
トを除くすべての被験者に、無作為に、二重盲検形式でワクチン血清型を与えた
。

【００９０】 被験者： 被験者は正常な健康な成人で、年齢１８〜５０歳であった。すべて
の被験者はＢ、Ｃ型肝炎およびＨＩＶに関して血清陰性であった。すべての被験
者は、研究に入る前の凝血阻害アッセイによってデング熱１〜４、ＪＥ、ＳＬＥ
およびＹＦに対して血清陰性であった。

【００９１】 ワクチン： ４つの血清型ワクチン候補はもともと臨床疾患であるヒトから単
離した。次いでそれぞれを、上述したように、初代イヌ腎臓（ＰＤＫ）内、次い
で胎児アカゲザル肺細胞内での連続的な継代によって改変した。これらの候補は
、ヒトボランティアでの先行小パオロット研究に基づいて選択した。それぞれ凍
結乾燥した一価ワクチンを、滅菌水で元に戻し、０．５ｃｃの容量で与えた。血
清型１〜４の用量は、それぞれデング１、２、３および４の１０^６、１０^６、１
０^５および１０^５ ｐｆｕであった。四価ワクチン用量は、それぞれ再構築一価
物の０．２５ｃｃを混合することで調整し、最終容量１ｃｃで与えた。四価ワク
チンの用量は１．１〜２．８×１０^６ ｐｆｕであった。すべてのワクチンは上
腕の皮下に与えた。

【００９２】 臨床安全性： ワクチンに対する応答を、それぞれのワクチン接種の後３週間
の間、毎日の症状日記と定期的な医者の評価の組合せで査定した。応答およびワ
クチン血症が最もおきそうであった期間である、ワクチン後の１週間のインキュ
ベーション期間後、５〜７日間の密閉観察のために被験者を試験宿舎内に収容し
た。被験者をとりわけ熱病、悪寒、頭痛、逆行眼窩痛、筋肉痛、関節痛、発疹な
どに関して試験し、尋ねた。それぞれの症状を、０（なし）、１（正常活性に影
響を与えない、薬物療法を必要としない）、２（薬物療法または活動の変化を必
要とする）、３（ベットでの療法または薬物療法による救済を必要とする）のス
ケールで等級化した。最も共通の症状は４つの分類に分けられる。これらの分類
は、１）自発的な熱および悪寒、２）頭痛および逆行眼窩痛、３）筋肉痛および
関節痛、および４）悪心、嘔吐、腹痛を含んだ胃腸管病訴であった。それぞれの
分類の症状指標を、それぞれの日での最も高い症状等級の産物および日で表した
症状の期間によって計算した。症状が２４時間中ずっと起こった場合、１日の期
間と指定した。応答原性指標（ＲＩ）は、単純にそれぞれの分類に関する症状指
標の合計である。ＲＩはそれぞれの被験者のワクチン応答を要約した。症状分類
指標およびＲＩにより、被験者とワクチン血清型との間のワクチン応答の半定量
性比較が可能である。

【００９３】 被験者を、研究中の連続ＣＢＣ、血小板計数、ＡＳＴおよびＡＬＴによって血
液学的および肝臓毒性に関してモニタした。

【００９４】 深刻な副作用を、他の可能性のある原因のない重症疾患、２４時間にわたって
連続的に＞３８．５℃ であるか、または３連続日間Ｔｍａｘ ＞３８．５℃で
ある熱、または単一口内温度＞１０４℃、２連続測定において＜１，０００／ｍ
ｌの好中球減少症または＜９０，０００／ｍｌの血小板減少症、または血清ＡＬ
ＴまたはＡＳＴ ＞５倍正常値として定義した。

【００９５】 免疫原性： 血球凝集阻害アッセイの方法を、Ｃｌａｒｋｅ ａｎｄ Ｃａｓ
ｓａｌｓ，１９５８（Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｈｙｇ ７， ５６１−５７３）の
方法にて実施した。デング熱ＩｇＭおよびＩｇＧを、すべて、ただし最後の６人
の四価被験者において、捕獲ＥＬＩＳＡによって測定した。デング熱および黄熱
病中和抗体を、プラーク減少中和試験によってそれぞれのワクチン接種の後第０
日目および第３０日目に測定した。研究の終了点決定は、最後のワクチン接種後
３０日間の任意の中和抗体の測定である。中和抗体セロコンバートを、１：５血
清希釈の最低点でのプラークの５０％減少として定義した。ウイルス血症を、第
一および第二ワクチン接種の後７〜１４日からの血清で決定した。ウイルス単離
のために使用した方法は、増幅のためにＬＬＣ−ＭＫ_２またはＣ６／３６細胞を
、そしてプラーク形成にためにＶｅｒｏを使用したＹｕｉｌｌ，１９６８（Ａｍ
Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ １７，４４１−４４８）より適合させた遅延
プラーク方法であった。

【００９６】 単一用量および二用量研究からのデータを本報告のために結合させた。被験者
の特徴を表９に示している。合計５９人の正常な被験者に、デング熱ウイルスワ
クチンを与え、４９人には一価試験物を、１０人には四価ワクチンを与えた。４
人には許可された１７Ｄ黄熱病ワクチン（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ）を与えた。

【００９７】

【表９】

【００９８】 実施例７ 反応原性 局所反応 ５９人のうちの１９人（３２％）のデング熱ワクチンレシピエント
が、注射部位での軽い腕の痛みを報告した。これらのうち７人はＤＥＮ−１を、
４人はＤＥＮ−２を、１人はＤＥＮ−３を、１人はＤＥＮ−４を、そして５人は
四価ワクチンをうけた。５人のみが２４時間後に注射部位の痛みを報告した。１
人も腕の使用に影響しなかった。

【００９９】 全身性反応 ５９人のデング熱レシピエントのうち２０％が、その最初のワク
チン接種でなにも症状を報告せず、一方で、７０％の被験者が第二ワクチン接種
にて同一ではなかった。第三の用量を与えた４人の被験者は、それに関連した症
状を報告しなかった。デング熱ワクチン接種より最も共通に報告された応答は頭
痛と筋肉痛であった。これらは様々なひどさで起こった。図１は、日常活動での
変化を引き起こすか、または除去のための薬物治療をとる最初のワクチン接種か
らの＞等級１症状の発生を示している。ワクチンの第一投与後、５人（８％）の
被験者、１人は血清型１、１人は血清型４、そして３人は四価を与えた人が、１
日期間より少ない間、悪寒、筋肉痛、頭痛または悪心のいずれかの重症等級３症
状の１つを報告した。どの被験者も再ワクチン接種で等級３症状を報告はしなか
った。

【０１００】 ＲＩは０〜３５の範囲であった。表１０は、それぞれのワクチンの、報告のあ
った反応原性を比較している。ＤＥＮ−１一価および四価ワクチンは、より大き
い反応原性に関連した。すべてのデング熱ワクチンの第二または第三投与は、第
一ワクチン接種からの重度の症状を和らげる被験者においてさえも、ほとんど応
答を引き起こさなかった。

【０１０１】

【表２】

【０１０２】 図２は血清型によるＲＩの頻度分布を示している。８人の被験者（１４％）が
熱を発した（＞１００．４°Ｆ）。８人のうち４人にはＤＥＮ−１を、１人には
ＤＥＮ−２を、１人にはＤＥＮ−３を、そして２人には四価を与えた。最も高い
熱および最も低い熱は、１０３．３°ＦのＴ_ｍａｘおよび３日間の熱としてＤＥ
Ｎ−１レシピエントで起こった。たった１人の他の被験者、この人もＤＥＮ−１
を与えた被験者であるが、１日以上の熱を持った。８人のうち７人で熱の症状が
第一ワクチン接種の後に起こった。

【０１０３】 １６人の被験者（２７％）が、その第一ワクチン接種より体幹および先端を含
む全身化発疹をおこした。発疹は通常紅斑性の、斑点丘疹状であり、少しかゆみ
があった。全身化発疹であった１６人のうち７人のみが熱を持った。発疹を持っ
た１６人の被験者のうち、５人がＤＥＮ−１を与えられた人であり、２人がＤＥ
Ｎ−２を、１人がＤＥＮ−３を、３人がＤＥＮ−４をそして５人が四価を与えら
れた人であった。発疹は典型的に、ワクチン接種の８〜１０日までに顕著になり
、３？４日で解決する。被験者は誰も点状出血、紫斑または瘢痕をおこさなかっ
た。どの被験者も再ワクチン接種で発疹をおこさなかった。

【０１０４】 胃腸管症状は比較的共通であり、被験者の３分の１で起こったが、しかしそれ
らは穏やかであり、短時間であり、２４時間以内に終了した。１人のＤＥＮ−４
レシピエントが、１日の間の神経性異常痛に関連した重度の悪心をおこした。

【０１０５】 ６人の被験者（１０％）、５人のデング熱および１人の黄熱病１７Ｄレシピエ
ントが、絶対的好中球数が１０００／ｍｌより少ない持続的な好中球減少症を引
き起こした。最も低いのはＤＥＮ−１患者での２８８であった。好中球減少症は
一般的には２〜３日で解決した。どの被験者も血小板減少症はおこさなかった。
ＡＳＴまたはＡＬＴにおける臨床的に有意な上昇はなかった。

【０１０６】 その最初のデング熱ウイルス曝露を受けた非免疫成人の本集団で予想したよう
に、だれもデング熱出血性熱の臨床的な証拠は示さなかった。

【０１０７】 実施例８ 免疫原性 ウイルス血症を１０人の被験者（１７％）、１人はＤＥＮ−２を受けており、
４人はＤＥＮ−３を、１人はＤＥＮ−４をそして４人は四価を受けた被験者で検
出した。ＤＥＮ−１ウイルス血症は検出されなかった。四価被験者から単離した
ウイルスの血清型はいまだ同定されるべきままである。すべての検出されたウイ
ルス血症はウイルスの最初の投与後に起こった。奇妙にも、熱はたった３人の四
価レシピエントで、ウイルス血症と共に起こった。すべてのウイルス血症被験者
は中和抗体を発生した。１人はウイルス血症と共でさえＩｇＭまたはＩｇＧ応答
はおこさなかった。

【０１０８】 表１１は一価ワクチン接種に対する抗体応答を要約している。中和抗体は、Ｉ
ｇＭまたはＩｇＧよりも頻繁に検出された。セロコンバートは、１：１０血清希
釈のＰＲＮＴ_５０によっても発見されなかったＩｇＭまたはＩｇＧによっては検
出されなかった。存在する場合、ＩｇＭはワクチン後１４日まで、４１％で陽性
であり、２１日までに１７％、３０日までに４２％で陽性であった。ＩｇＭは典
型的には最初のワクチン接種の後３０日までにピークであった。唯一の例外は、
そのＩｇＭが第二ワクチン接種の後３日間ピークであった四価レシピエントでの
ものであった。ＩｇＭは３か月以上の間、持続可能である。中和抗体によるセロ
コンバート率は、血清型１、２、３および４でそれぞれ１００％、９２％、５４
％および５８％であった。存在する場合、中和抗体は典型的には最初のワクチン
接種後３０日までに検出可能であった。０日目と３０日目の間の時間点は中和抗
体に関して査定しなかった。ワクチンの第二投与は、４倍以上までＤＥＮ−２
ＧＭＴを押し上げたが、これは他の血清型では見られなかった。２人のＤＥＮ−
３被験者はワクチンの第二投与後にセロコンバートし、１人は１ヶ月の時点であ
り、他は３ヶ月の時点であった。彼らは１投与後に中和抗体を発生しなかった。
興味深いことに、これらの２人の被験者のＩｇＭ／ＩｇＧパターンは、その第二
投与後の二次応答を示唆し、免疫学的に第一投与にて感作されていたことを示唆
している。

【０１０９】 デング熱、ＳＬＥ、ＪＥおよびＹＦに関する開始前陰性血球凝血阻害アッセイ
にもかかわらず、５３人中５人（９％）の試験した被験者はＩｇＭ対ＩｇＧ比＜
１．８を持つ第二抗体応答パターンをおこした。５人すべてが、ワクチン接種の
前に同一源デング熱中和抗体に関して陰性であった。このことは、先に起こった
フラビウイルス属への曝露を示唆している。本発明者らは、第二および初期抗体
応答者の平均ＲＩｓ間の有意な差は発見しなかった（９．６対５．８、ｐ＝０．
１９）。

【０１１０】 ＩｇＭ／ＩｇＧまたは中和抗体を発生しなかった１２人の一価被験者が存在し
た。１人はＤＥＮ−２を与えた被験者であり、６人はＤＥＮ−３を、５人はＤＥ
Ｎ−４を与えた被験者であった。抗体非応答者のこの群に関する平均反応源性指
数は、２、３および４型中和抗体応答者の平均ＲＩと有意に異なり１より少なか
った（０．９対４．９、ｐ＜０．００３）。

【０１１１】 本発明者らの研究には２５のブランクおよび３１のコウカシアン（Ｃａｕｃａ
ｓｉａｎ）被験者が含まれた。これらの２つの人種の平均ＲＩｓ間に有意な差異
はなかった。このことは、ブラックにおける穏やかなデング熱疾患のひどさを示
唆しているいくつかの疫学的証拠が存在するので興味深い。

【０１１２】

【表１１】

【０１１３】

【表１２】

【０１１４】

【表１３】

【０１１５】 年齢、性別 表１２は、１０人の四価ワクチン被験者からのＰＲＮＴセロコンバート結果を
示している。最初の４人の被験者には０ヶ月および１ヶ月の時点で２回のワクチ
ンを与えた。１人の被験者は３０日目における第二ワクチン接種をし損ない、６
０日目にワクチン接種した。さらに６人の被験者に０および１ヶ月の時点でワク
チン接種すべきであり、もし反応が不十分であった場合、４ヶ月の時点での第三
のワクチン接種を実施した。２人の被験者は単一投与の後、４つすべての血清型
に対する中和抗体を発現させた。他の２人の四価レシピエントは、４ヶ月の時点
でのワクチン接種の後に４つの血清型すべてに対してセロコンバートした。２人
の他の被験者は三価の応答を示した。１または２ヶ月時点で与えた四価の第二の
投与は、セロコンバートを有意に増加させなかった。これらの１０人の四価被験
者での全セロコンバート率は、ＤＥＮ−１、２、３および４に対してそれぞれ１
００％、８０％、８０％および４０％であった。

【０１１６】 実施例９ 研究を、２−レベル２^４階乗設計によって、四価ワクチンでのそれぞれの血清
型成分の相互作用を評価するために設計した。

【０１１７】 ５４人の被験者に、１５順列のそれぞれの血清型の２用量レベルを与えた。結
果は図３に示している。高用量であるＨは、希釈していないワクチンを示し、１
０^５〜１０^６ ｐｆｕ／ｍｌの範囲であり、低容量であるＬは、結果として１０ ^３．５ 〜１０^４．５ ｐｆｕ／ｍｌとなる希釈していないワクチンの１：３０希
釈を示している。

【０１１８】 ６人の被験者には０および１ヶ月の時点で全用量四価ワクチンを与えた。被験
者が四価中和抗体応答を示さなかった場合、４ヶ月の時点で三回目の投与を行っ
た。結果は図４に示している。

【０１１９】 ４人の被験者に、シリンジ混合全容量四価ワクチンを０および１ヶ月の時点で
与えた。終了点は、二回目のワクチン接種後１ヶ月の時点での臨床的な安全性お
よび中和抗体であった。Ｔ細胞応答を最初の４人の被験者で測定した。結果は図
５に示している。

【０１２０】 結果は、四価ワクチン（１６処方）が、６４人の非免疫アメリカ人ボランティ
アで安全であったことがわかったことを示唆している。反応原性は変化した。４
処方はすべてのボランティアにおいて三価または四価中和抗体を誘発した。一価
の実験にしたがって、１ヶ月の時点での四価ワクチンの第二投与は有意な反応原
性を誘導しなかったが、また中和抗体応答も増加させなかった。中和抗体応答の
最終滴定が進行中である。Ｔ細胞中での記憶インターフェロンガンマ応答を、中
和抗体のない状態で測定できる。≧４ヶ月の投与期間は、結果として四価セロコ
ンバートの改善となった可能性がある。

【０１２１】 討議 これらのワクチンは、野生型デング熱の実験的感染の歴史的記述と比較した場
合、ヒトにおいて弱毒化されることが明らかである（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９３１，Ｍａｎｉｌａ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ）。本
発明者らは、反応原性を定量するために、自己報告症状期間およびひどさに基づ
いた数的スケールを使用した。そのような方法は、ワクチン関連反応を過剰に見
積もる傾向にある。理想的には、天然のデング熱感染で検証すべきである。しか
しながら、不正確なＲＩにより、本発明者らは個人と集団の間の症状を理にかな
って比較することが可能である。一価ワクチンを試験することからの結果は、４
つのデング熱ワクチン候補の間で変化可能である弱毒化の程度を示した。４５Ａ
Ｚ５ ＰＤＫ２０は最も弱く弱毒化、最も高い力価であり、結果として一律のセ
ロコンバートとなった。ＤＥＮ−２候補、Ｓ１６８０３ ＰＤＫ５０は同様に結
果として良性の反応原性性質を伴い、ほぼ１００％のセロコンバートとなった。
Ｄｅｎ−３およびＤｅｎ−４は低反応原性性質を持ったが、セロコンバート率は
たった５０〜６０％であった。免疫原性のほとんどない株である３および４型の
投与は、１および２型のそれと比べて１０倍低いことに注意すべきである。

【０１２２】 ウイルスの第二投与は明らかに少ない反応と関連した。しかしながら、１また
は３ヶ月の時点での一価ワクチンの第二投与の利点は小さい。Ｄｅｎ−１および
２は、追加的投与が余分である可能性があるように、すでにほぼ一様に免疫原性
であった。それにも関わらず、Ｄｅｎ−２のＧＭＴは４倍に押し上げられた。こ
のことは、第二投与後の低濃度のウイルス複製の証拠である可能性があり、また
効果促進応答を誘発するために、投与には十分な抗原性量が含まれる。この中和
抗体反応のパターンはまた、１７Ｄ ＹＦでの第二ワクチン接種でも見られた（
Ｗｉｓｓｅｍａｎ，１９６２，Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ １１，５
７０−５７５）。Ｄｅｎ−３の第一投与は、二次抗体反応パターンを伴う第二投
与の後にセロコンバートした２人の一価被験者を感作した可能性がある。このこ
とは、本発明者らの中和抗体アッセイが、３型ワクチン候補に対する好ましい免
疫応答を検出するのに十分感受性ではない可能性があることを示唆している。第
二投与は４型に対する新規のセロコンバートを加えなかった。試験した投与およ
びスケジュールと共に、一価ＤＥＮ−１またはＤＥＮ−４の第二投与を行うこと
の明らかに追加的な利益はなかった。

【０１２３】 一価ワクチンに対する中和抗体応答をおこさなかった１２人の一価被験者もま
た測定可能なデング熱ＩｇＭまたはＩｇＧと応答しなかった。すべてのこれらの
非応答者に、明らかに他の被験者において複製した同様のバイアルからの生ウイ
ルスを与えた。彼らはワクチン接種に対する応答をおこさなかった。したがって
、すべての兆候により、これらの被験者におけるウイルス複製の証拠は存在しな
かった。この非応答性に関する機構はわからない。感染のための宿主基質必要性
の欠如または効果的な先天性免疫の結果である可能性がある。

【０１２４】 多重投与の価値は、ウイルスの干渉を回避するための戦略として生弱毒化ワク
チンの組合せでより明らかになる可能性がある。ここでそれぞれの成分の用量お
よび投与間隔が重要である可能性がある。干渉および増強は、デング熱ウイルス
を組合せで与えた場合に潜在的に起こる。４人の被験者は４つすべての血清型に
対して中和抗体を作り、２人は第一投与の後、そして２人は４ヶ月の時点での第
三投与の後であった。４ヶ月間ワクチン再接種を受けた５人中４人のボランティ
アは、３つ以上の血清型に対してセロコンバートされた。この差異の説明は、ワ
クチン接種後１ヶ月の時点で、ワクチン内での鋳型ウイルスの増殖を抑制するた
めに十分な交差反応性中和抗体が存在することである可能性がある。Ｓａｂｉｎ
は、ヒト患者に１つの血清型ウイルスを与えた場合、３ヶ月までで終了するその
ような一過性の交差保護が存在したことを発見した（Ｓａｂｉｎ，１９５９，Ｖ
ｉｒａｌ ａｎｄ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍ
ａｎ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＪＢ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ）。本発明者らの将来の四価試験では、０．６ヶ月ワクチン接種スケジュール
を使用する予定である。

【０１２５】 ＤＥＮ−３および４の貧弱な免疫原性は、１０^５ ｐｆｕ／ｍｌでのものであ
り得る。Ｄｅｎ−３およびＤｅｎ−４投与は、ＤＥＮ−１および２と比較して複
製的不利である可能性があり、そのどちらも四価処方では１０^６ ｐｆｕである
。本発明者らはＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の力価を増加させるために他の産出
戦略を調査している。

【０１２６】 四価反応被験者での４つすべてのウイルスのウイルス血症を検出することなし
に、中和抗体の存在が４つすべての血清型の複製を必然的に意味することを確か
にすることはできない。測定した中和抗体は、交差反応する可能性があり、また
低親和力である可能性がある。この問題は、それぞれの血清型に対する抗体の長
期抵抗性を見ることによって記述すべきである。鋭敏な、血清型特異的ＲＴ−Ｐ
ＣＲアッセイは、ウイルス複製の証拠として、多価ウイルス血症を測定するのに
有用である可能性があった。

【０１２７】 ただ２人の四価ワクチン接種被験者が、１回のワクチン接種後に４つすべての
血清型に対する中和抗体を産出した。四価ワクチンに対するそのような不確かな
応答は、有毒な異種血清型に対する曝露の設定における、デング熱出血性熱のリ
スクに関する疑問を発生させる。もし抗体依存的増強がＤＨＦリスクに対する病
態生理学的機構である場合、すべての４血清型抗体がワクチン化によって誘発さ
れ、しかし１つまたはそれ以上の血清型抗体が中和閾値以下で異なって減少する
場合に、リスクが存在する可能性がある。本発明者らは以下で、ＴＨ１ Ｔ細胞
応答を、これらの四価ワクチン接種者が、中和抗体がない状態でさえも測定でき
ることを報告する。これは保護するのに十分であろうか。これらの疑問は、特定
領域での四価ワクチンの注意深い長期領域試験によってのみ解答されるものであ
る可能性がある。

【０１２８】 結論として、本発明者らの結果は、４つの血清型が、２、３および４型よりも
１型での一価ワクチンとして、変化しやすく反応原性であることを示唆している
。血清型１および２は＞９０％で中和抗体を誘発し、一方で血清型３および４は
ほとんど免疫原性ではない。四価組合せは安全であり、正当によく耐性であり、
１０人の被験者のうち４人で４つすべての血清型に対して中和抗体を誘導した。
四価ワクチンの２回投与は、試験した１または２ヶ月投与間隔で、セロコンバー
トを改善はしなかった。４ヶ月を超えるより長い投与間隔ではセロコンバートが
改善される可能性がある。

【０１２９】 実施例１０ デング・ワクチンに対するＴ細胞応答についての材料および方法 対象。年齢１８〜５０歳の３５名の健康な成人のボランティア（２１名の男性
、１４名の女性）が、候補デングウイルスのワクチンに関与する、ウォルターリ
ード陸軍研究所によって行われたフェーズＩの治験に参加した。参加者は、循環
性抗フラビウイルス抗体の不在に基づいたボランティアの群から選択された。さ
らなる選択条件は、ＨＩＶ陰性の状態であり、そして物理的試験および質問票に
対する応答に基づいて優れた健康であった。

【０１３０】 ワクチン群。３０名の個人は、任意に生の弱毒化一価ワクチンの２回用量を受
けた；４名は、生の弱毒化４価のワクチンの２回用量を受けた。１名の一価受容
者（ボランティア認識番号１）は、最初の投与を受けただけの後に、研究を中止
する。ワクチン接種の前に、ボランティアの内のいずれかに、デングウイルス１
−４型、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、または黄熱病ウイルス
に対する検出可能な血球凝集反応阻害血清抗体はなかった。各用量は、未希釈ウ
イルス（類）の０．５ｍｌ皮下注射として付与された。

【０１３１】 ＰＢＭＣ収集。末梢血（８ｍｌ）は、０日目、および最初の投与の後であるが
、第二の投与の前の５つの時点（３、７、９、１４、２８／３０／３１／６０ま
たは９１日目）で、バキュテーニア・細胞標品管（ＣＰＴ）（ベクトン−ディキ
ンソン、ニュージャージー州フランクリン・レークス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａ
ｋｅｓ、ＮＪ））への静脈注射によって各ボランティアから収集された。血液も
、第二の投与の日に、そしてその後４つの時点で（第二の投与の後の３、７、９
および１４日目）、収集された。したがって、ボランティアによって、第二の用
量の投与の時間は、第一の用量の後のおよそ１−３カ月であった。１カ月周辺の
収集時間における変動は、ボランティアの日程における変動により起こった。細
胞を、３０分間、１０００×ｇで遠心分離することによって、全血から分離した
。ＰＢＭＣが、収集（ＣＰＴ管上のゲルの上の細胞層）され、そして５００×ｇ
で遠心分離しながらハンクの平衡塩溶液（ライフ・テクノロジーズ、メリーラン
ド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））で２回洗浄した。単離したＰＢ
ＭＣは、４ｍｌ（ＣＰＴ管当たり）の細胞凍結培地／ＤＭＳＯ（シグマ、ミズー
リー州セントルイス）に再浮遊させ、そして一夜、−７０℃で、１ｍｌアリコー
ト量で凍結させた。その後、長期保存の間、ＰＢＭＣを、蒸気相液体窒素に移行
させた。

【０１３２】 ワクチンウイルス。上に記述した以下の生の弱毒化デングウイルス株を、一価
ワクチンで使用した：４５ＡＺ５ＰＤＫ２０（ＤＥＮ１）、Ｓ１６８０３ＰＤＫ
５０（ＤＥＮ２）、ＣＨ５３４８９（ＤＥＮ３）、３４１７５０ＰＤＫ２０（Ｄ
ＥＮ４）。四価ワクチンは、これらの株の４つ全ての等しい混合物であった。

【０１３３】 細胞培養ウイルス。ベロ細胞で繁殖された以下のデングウイルスを、培養物中
のＰＢＭＣ刺激のために使用した：ウエストパック７４（ＤＥＮ１）、Ｓ１６８
０３（ＤＥＮ２）、ＣＨ５３４８９（ＤＥＮ３）、およびＴＶＰ３６０（ＤＥＮ
４）。４つ全てのセロタイプは、１ｍｌアリコート量でＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｐ
ｕｔｎａｋによって供され、そして使用するまで−７０℃で保存した。ウイルス
力価は、．３０−２．４×１０ ６ｐｆｕ／ｍｌの範囲内であった。

【０１３４】 ＰＢＭＣの粗培養物および生のウイルスでの刺激。ＰＢＭＣの凍結バイアルを
、液体窒素保存から取り出し、そして穏やかに３７℃で解凍させた。ＰＢＭＣを
、ＲＰＭＩ培地１６４０（ライフ・テクノロジーズ、メリーランド州ロックビル
）で二回洗浄し、そして１０％ヒト男性ＡＢ血清（シグマ）足す補足物［ペニシ
リン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）−フンギソ
ン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）［シグマ］、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ライフ・テク
ノロジーズ）、および０．５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（シグマ）］を含
む完全培地中に浮遊させた。細胞を、２５０万個の細胞／ｍｌの濃度で浮遊させ
た。ある種のアッセイは、３２５万個の細胞／ｍｌを必要とした。ＰＢＭＣ（１
００ｍｌ）を、９６穴Ｖ底プレート（コスター、マサチューセッツ州アクトン）
の個々のウエルに添加した。１０％完全培地に、３０００から２４０００ｐｆｕ
／１００ｍｌの濃度で希釈した等量のデングウイルス１、２、３または４の等量
を、各ウエルに添加した。対照ウエルは、ウイルスなしの等量の培地を受けた。
その後、細胞を、３７℃で、５％ＣＯ_２で、４日間培養した。

【０１３５】 免疫アッセイ。 化学ルミネッセンスの免疫アッセイを、４日の培養の終わりに組織培養上清で
分泌されるリンホカインの量を測定するために行った。９６穴免疫アッセイプレ
ートであるマイクロライト２（ダイナテック・ラボラトリーズ，インク．（Ｄｙ
ｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、バージニア州チャンチ
リー（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ））を、０．１Ｍ重炭酸カリウム
緩衝液中の５０ｕｌ／ウエルの１０ｍｇ／ｍｌ未標識抗リンホカイン（ＩＬ−４
、ＩＬ−１０またはインターフェロンγ）抗体（ファルミンギン（Ｐｈａｒｍｉ
ｎｇｉｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））で一
夜被覆させた。プレートを洗浄し、そして１００ｕｌ Ｉ−ブロック緩衝液（ト
ロピックス（Ｔｒｏｐｉｘ）、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏ
ｒｄ、ＭＡ））を、１時間添加した。標準（レコンビナントＩＬ−４、ＩＬ−１
０およびインターフェロンγ、ファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カリ
フォルニア州サンディエゴ）を、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、Ｉ−ブロック開始中
に予備希釈した。標準の８−３倍希釈を行った。サンプル、対照および標準を、
等量のＩ−ブロック緩衝液中に希釈させた。アリコート量の５０ｕｌを、各アッ
セイプレートに添加した。サンプルを、室温で、１時間インキュベートした。プ
レートを洗浄した。二次ビオチン化抗体を、Ｉ−ブロック中で１：１０００に希
釈し、そして５０ｕｌ／ウエルを、アッセイプレートに添加した。プレートを洗
浄し、そして５０ｕｌ／ウエルのアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（アビジ
ックスＡＰ（Ａｖｉｄｉｘ ＡＰ）、トロピックス（Ｔｒｏｐｉｘ）、マサチュ
ーセッツ州ベッドフォード）を、アッセイプレートに添加した。プレートを、１
時間、室温でインキュベートした。洗浄プレートを、アッセイ緩衝液（トロピッ
クス）を用いて、１分間、２回インキュベートした。ＣＤＰ−スター基質（トロ
ピックス）を、各ウエルに添加した（１００ｕｌ／ウエル）。１０分後、プレー
トを、ＭＤ２２５０ルミノメーター（ダイナテック、バージニア州チャンチリー
）で読取った。第一の試料を、修飾プロトコールを使用して分析した。アビジン
−アルカリ性ホスファターゼを使用する検出器の代わりに、アビジン−エクオリ
ン（シーライト・サイエンシズ（Ｓｅａｌｉｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ジョー
ジア州アトランタ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ））を使用した。この材料は、研究の
間に利用できなくなり、その結果プロトコールを改質した。標準および対照試料
を使用した結果は、２つのアッセイフォーマットについて同一であった。

【０１３６】 セロタイプ交差反応性。セロタイプ特異性を試験するために、一価弱毒化ワク
チン（結果参照）の選択受容者から４２、４５、または１０５日目に収集したＰ
ＢＭＣを、４日間、独立の培養物中の各セロタイプのウイルスで、単価２５０，
０００細胞／ウエルで刺激した。その後、培養上清を、化学ルミネッセインスの
リンホカインＥＬＩＳＡを用いて分析した。

【０１３７】 Ｔ細胞小集合の枯渇。リンホカイン産生の特別の細胞の源を試験するために、
ＰＢＭＣに、刺激の前に、ＣＤ３＋またはＣＤ８＋Ｔリンパ球を枯渇させた。選
択されたＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ培地１６４０で二回洗浄し、そして５％完全培地
中で３２５万個の細胞／ｍｌで浮遊させた（３０％以上のＰＢＭＣを、枯渇手段
の間の細胞損失について補償するための投入量として使用した）。消極的枯渇に
ついては、細胞（６５０，０００ＰＢＭＣ）を、洗浄した抗体を被覆した磁性ビ
ーズとインキュベートした。２つの型のビーズ、Ｍ−４５０抗ＣＤ３および抗Ｃ
Ｄ８ビーズ（ダイナル、ノルウエー国オスロー）を使用した。およそ２０：１ビ
ーズ対標的細胞比を示す５２０万個の粒子／管の濃度で、抗ＣＤ３ビーズを使用
した。抗ＣＤ８ビーズを、およそ３１：１ビーズ対標的細胞比を示す管当たり４
００万個の粒子の濃度で使用した。１．５ｍｌ微小遠心管中の商標ダイナビーズ
（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ^ＴＭ）（ダイナル）。細胞を、４℃で、３０分間、中程度
の通気をしながらインキュベートした。非枯渇ＰＢＭＣを、対照として使用した
。ＭＰＣ−２磁性粒子濃度測定器（ダイナル）を用いて、標識細胞を、細胞混合
物から除去した。ＣＤ３＋およびＣＤ８＋陰性で選択したＰＢＭＣを、新たな微
小遠心管に移した。任意の残渣未結合細胞を除去するために、濃縮ダイナビーズ
を、２００ｕｌ完全培地で１回洗浄した。移行後、最終容積（４００ｕｌ）を、
９６穴Ｖ底培養プレートの２つのウエルに等しく分けた。枯渇および対照ＰＢＭ
Ｃ培養上清を、化学ルミネッセンスのリンホカインＥＬＩＳＡを用いて、４日後
に分析した。さらに、培養ＰＢＭＣを、細胞内のグランザイムＢ ｍＲＮＡ（下
を参照）について分析した。ＣＤ４＋枯渇を、同様に行ったが、しかし分離は、
Ｍ−４５０ ＣＤ４＋（２８．６ｍｌ／４００万４千個の粒子、およそ３１：１
ビーズ対標的細胞比）ダイナビーズを用いて刺激の後に行った。ＣＤ４＋で陰性
に選択したＰＢＭＣを、細胞内グランザイムＢ ｍＲＮＡについてのみ分析した
。

【０１３８】 フローサイトメトリー。枯渇効率（枯渇率（％）として測定された）を、任意
に選択され、未刺激のＰＢＭＣ集団（非枯渇対照およびＣＤ３＋またはＣＤ８＋
枯渇集合の両方）の二重染色の後にＦＡＣＳ分析を使用して測定した。細胞を、
３０分間、４℃で、ＰＥ標識抗−ＣＤ４＋または抗−ＣＤ８＋、およびＦＩＴＣ
標識抗−ＣＤ３＋抗体（ベクトン−ディキンソン）とインキュベートした。その
後、標識ＰＢＭＣを、蛍光緩衝液（ＰＢＳ（シグマ）、０．０５％Ｎａアジド、
１％胎仔ウシ血清（スミット・バイオテクノロジー（Ｓｕｍｍｉｔ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）、コロラド州ボーダー（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ））で３回洗
浄し、そして分析する前に、蛍光固定液（ＰＢＳ、１％ホルマリン、０．０５％
Ｎａアジド）中で保存した。ＣＤ４＋ダイナビーズを用いて、枯渇効率は、測定
されなかった。

【０１３９】 グランザイムＢアッセイ。非枯渇対照ＰＢＭＣおよびＴ細胞小集合で枯渇され
たＰＢＭＣを、野生型ウイルスを用いた４日間の刺激の後、細胞内グランザイム
Ｂ ｍＲＮＡについてアッセイした。９６穴プレートフォーマットでの逆転写酵
素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを使用した。

【０１４０】 「ストレートＡ」のｍＲＮＡ単離システム（ノバゲン、ウイスコンシン州マデ
ィソン）を用いて、ｍＲＮＡ精製を行った。リホカインＥＬＩＳＡ分析について
のＰＢＭＣ培養上清の遠心分離および除去の後、ペレット化ＰＢＭＣを、１０ｍ
Ｍジチオスレイトールを含む２００ｕｌ／ウエルの溶解緩衝液を用いて溶解させ
、そしてその後、３０分間、室温で、２００ｍｇ／ウエルの洗浄したオリゴｄＴ
磁性ビーズとインキュベートした。ＭＰＣ−９６（ダイナル）磁性粒子濃縮装置
を用いて８容積の洗浄緩衝液でビーズを十分に洗浄して、ＤＮＡ、タンパク質お
よび細胞の残骸を除去した後、ｍＲＮＡを、７０℃で、２０分間、２００ｕｌ／
ウエルのＨ_２Ｏで溶出させた。溶出液を、１．５ｍｌ微小遠心管に移し、そして
二回目の溶出を、さらなる２００ｍｌ／ウエルのＨ_２Ｏで行った。次に、４００
ｕｌの溶出液を、５０ｕｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、２０ｍｇのグ
リコーゲン（ノバゲン）、および３００ｕｌのイソプロパノールを用いて沈殿さ
せた。７０％冷エタノールでの最終洗浄の後、ｍＲＮＡペレットを、３０ｕｌの
Ｈ_２Ｏ中で浮遊させた。

【０１４１】 ９６穴プレート中でＲＴ−ＰＣＲ段階を行った。ヒト・グランザイムＢ（ＣＴ
ＬＡ−１）のエキソンに対応し、そして１２０ｂｐ領域を増幅するオリゴヌクレ
オチドプライマー（２２ｂｐ）が、ウォルター・リード陸軍研究所でＤｒ．Ｓｔ
ｕａｒｔ Ｃｏｈｅｎによって合成された。プライマーは、以下の配列を示した
：ｇｒｂ２ａ（センス）５’ＡＧＣ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＧＴ ＴＴＡ
ＴＣＣ Ｃ（配列番号：１）、ｇｒｂ２ｂ（アンチセンス）５’Ｃ ＴＣＴ
ＧＧＴ ＣＣＧ ＣＴＴ ＧＧＣ ＣＴＴ ＴＣＴ（配列番号：２）。

【０１４２】 各逆転写酵素反応について、総反応容積は、４０ｕｌであり、そして以下のも
のを含んだ：ＭｇＣｌ_２（５ｍＭ）、１０×緩衝液ＩＩ（１０ｍＭトリス−ＨＣ
Ｌ、５０ｍＭ ＫＣＬ、ｐＨ８．３）、ｄＮＴＰｓ（各１ｍＭ）、およびＲＮエ
ース阻害剤（４０単位）［パーキン・エルマー、コネチカット州ノーウォーク（
Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）］，ＡＭＶ逆転写酵素（１０単位）［シエカガク（Ｓｉ
ｅｋａｇａｋｕ）］、ｇｒｂ２ｂプライマー（３ピコモル）、ｓＨ_２Ｏ、および
４ｍｌのｍＲＮＡテンプレート。４２℃（９０分）、９９℃（５分）、４℃（不
確かに）で、パラメーターの組を用いて、９６００サーモサイクラー（パーキン
・エルマー）で、ＲＴインキュベーション段階を行った。各ＰＣＲについては、
総反応容積は、５０ｕｌであり、そして以下のものを包含した：ＭｇＣｌ_２（２
ｍＭ）、１０×緩衝液ＩＩ（上と同じ）、ｄＮＴＰ（各．４ｍＭ）、アンプリタ
ック金（１．２５単位）、ｇｒｂ２ａおよびｇｒｂ２ｂプライマー（各１ピコモ
ル）、ｓＨ_２Ｏ、および５ｕｌのｃＤＮＡテンプレート。ＰＣＲインキュベーシ
ョン段階も、９５℃の最初の変性／酵素活性化（１０分）、３０サイクル：［９
５℃の変性（１０秒のランプで３０秒）／６０℃アニーリング（３０秒のランプ
で３０秒）／７２℃伸長（３０秒のランプで３０秒）］、７２℃最終伸長（７分
）、４℃（無期限に）］のパラメーター設定で、９６００サーモサイクラーで行
った。

【０１４３】 電気泳動を用いて、最終増幅ＰＣＲ産物（１０ｕｌ）を、エチジウムブロミド
で染色した２％アガロース（シーケム（ＳｅａＫｅｍ））／１×ＴＡＥ（トリス
−アセテート−ＥＤＴＡ）ゲル上で分離し、そしてデジタルカメラ（サイエンテ
ィフィック・イメージング・システムズ、コネチカット州ニューヘブン）を用い
て解析した。

【０１４４】 生ワクチンの追加抗原刺激投与に対する追加抗原刺激応答が、示されうる場合
、さらに弱毒化された生のウイルスワクチンを使用できうることが考えられる。
求められる追加抗原刺激応答は、抗体およびＴ細胞応答の両方である。

【０１４５】 デングワクチンに対するＴ細胞応答が、測定されたとき、Ｔ細胞応答の測定は
、抗原応答より少なかった。したがって、生のデングワクチンの投与に対するＴ
細胞応答は、ほとんど十分に特徴づけられない。この研究の１つの目標は、Ｔヘ
ルパー応答、セロタイプ特異性および強力な細胞毒性の点でワクチンに対するＴ
細胞応答の特性を決定することである。

【０１４６】 これらのワクチンに対する優性なＴ細胞応答は、Ｔｈ１応答であった。これは
、４日培養中に生のデングウイルスによって刺激される末梢血単核細胞（ＰＢＭ
Ｃ）によるインターフェロンγの分泌によって測定された。インターフェロンγ
は、ＣＤ３＋ＣＤ８−Ｔ細胞によって分泌された。Ｔ細胞応答は、ある種の交差
反応性応答を伴うデングウイルスのセロタイプであった。既往の応答は、個人の
数名で記録されたが、他ではなかった。

【０１４７】 デングで刺激された細胞によるリンホカイン分泌。 生のデングウイルスは、ＰＢＭＣ培養物を刺激するために使用された。培養物
中に使用される刺激ウイルスのセロタイプは、ワクチンウイルスのセロタイプと
同じであった。４日後、組織培養上清を、インターフェロンγ、ＩＬ−４および
ＩＬ−１０の存在について分析した。全ての培養で、ＩＬ−４およびＩＬ−１０
は、首尾一貫して陰性であった。２つのアッセイ対照は、アッセイが、適切に働
いていることを保証するために使用された。最初に、標準曲線を使用した組換え
リンホカインおよび第二の対照サンプルは、リンホカインが、組織培養上清の存
在下で検出されうることを保証するために使用された。

【０１４８】 ＩＬ−４およびＩＬ−１０の陰性発現と対照的に、高いレベルのインターフェ
ロンγが、数種の培養上清で検出された。図６は、一価ワクチンを受けているボ
ランティアから収集された細胞のインターフェロンγ発現の速度論を示す。全体
的に、デング３および４受容者で少数の高応答があったが、最高のインターフェ
ロンγ応答は、デング１およびデング２候補ワクチンの受容者から収集されたＰ
ＢＭＣによった。インターフェロンγは、第一の接種の後１４日目までに偶然に
検出されたが、しかしその発現は、第二の用量の投与直前または直後まで検出さ
れなかった。したがって、分泌の速度論は、予測されたものよりいっそう遅かっ
た。この研究での一価受容者についての追加抗原刺激応答に関して、首尾一貫し
たパターンはなかった。個人により、インターフェロンγレベルは、第二用量の
投与後、増加または減少のいずれかをした。

【０１４９】 全ての収集点での全てのボランティアから得た未刺激ＰＢＭＣは、検出不可能
なレベルのインターフェロンγを示した。刺激０日目の細胞から得た平均発現は
、２３０ｐｇ／ｍｌの標準偏差で１２７ｐｇ／ｍｌであった。

【０１５０】 一価ワクチン受容者については、１６名の陽性および１４名の陰性のインター
フェロンγ応答者（平均±３標準偏差）があった。３０名の一価ワクチン受容者
の１６名は、少なくとも１つの時点について、＞１０００ｐｇ／ｍｌのインター
フェロンｇの結果を示すＰＢＭＣ培養を示した。１２名は、２つまたはそれ以上
の連続的時点の間、＞１０００ｐｇ／ｍｌで、インターフェロンｇ分泌を持続し
た。さらに、３０名の内１２名は、分析された最後の時点で＞１０００ｐｇ／ｍ
ｌの分泌を示した。

【０１５１】 ４名のボランティアは、四価のワクチン（４つ全ての一価株の等混合物）を受
けた。図７は、これらの四価受容者から収集されるＰＢＭＣによるインターフェ
ロンγ産生を示す。ＰＢＭＣは、デングウイルスの４つのセロタイプの各々の内
の１つを使用した別々の培養で刺激された。ボランティア番号３３および３６番
から得たＰＢＭＣは、セロタイプの４つの各々で刺激した後、少なくとも１つの
時点の間、有為な量のインターフェロンγ、＞１０００ｐｇ／ｍｌを分泌した。
ボランティア番号３５番から得たＰＢＭＣは、４つのセロタイプの内の３つ（デ
ング３でない）に応答して有為な量のインターフェロンγを分泌した。ボランテ
ィア番号３４番から得たＰＢＭＣは、デング２ウイルスに応答して有為な量のイ
ンターフェロンガンマのみを分泌した。最高の応答は、ＤＥＮ１および２に対し
て優勢であった。インターフェロンγ産生の速度論は、一価の受容者でそうであ
ったとおり四価ワクチン受容者で遅延された。高レベルのインターフェロンγは
、第二の用量の接種の直前および後に検出された。追加抗原刺激応答に関して、
一価受容者を用いた場合、第二の用量の投与後に首尾一貫したインターロイキン
分泌γパターンはなかった。

【０１５２】 凝集する上で、これらの結果は、一価および四価ワクチン受容者の両方におけ
る優勢なＴリンパ球応答が、抗原特異的Ｔｈ１応答であったことを示す。

【０１５３】 実施例１１ セロタイプ交差反応性。一価ワクチン受容者の内の１２名から得たＰＢＭＣを
、デングセロタイプ特異的および交差反応性応答の存在について試験した。速度
論に基づいて、最後の時点（最後の収集日に対して第二）でＰＢＭＣ培養上清中
に＞１０００ｐｇ／ｍｌのインターフェロンγを分泌した個人が選択された。最
後の収集日から得たＰＢＭＣは、各デングセロタイプを用いて４日間、独立の培
養で刺激され、続いて培養上清中に分泌されたインターフェロンγの分析を行っ
た。ある程度のセロタイプの交差反応性があったが、最高の応答は、元来のワク
チン接種と同じセロタイプウイルスで刺激したＰＢＭＣで常に見られた（表１４
）。したがって、これらの選択された一価ワクチン受容者から得られるＰＢＭＣ
で見られるインターフェロンγ応答は、デングセロタイプ特異的であった。

【０１５４】 交差反応性応答は、セロタイプ特異的応答の半分（またはそれ未満）であった
。デング２ワクチン受容者については、最高の交差反応性応答は、デング４ウイ
ルスとであった。デング４ワクチン受容者については、最高の交差反応性応答は
、デング２ウイルスとであった。デング１ワクチン受容者については、交差反応
性応答は変化した。この群でただ１名のデング３ワクチン受容者があり、そして
その応答は、セロタイプ特異的であった。

【０１５５】

【表１４】

【０１５６】 実施例１２ Ｔ細胞小集合枯渇。これが、Ｔｈ１応答であったことを確証するために、イン
ターフェロンγを分泌する細胞の同一性を、測定した。これは、培養の前に、Ｔ
細胞またはＴ細胞小集合を枯渇させることによって行われた。この研究に使用さ
れた細胞は、密度勾配遠心分離を用いて全血から分離された混合ＰＢＭＣであっ
た。ＰＢＭＣ集団における優勢な細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単細胞、およ
びＮＫ細胞が挙げられる。これらの評価については、我々は、１３名の一価およ
び３名の四価のボランティアでの速度論に基づいて、最高のインターフェロンγ
応答の時点を選択した。

【０１５７】 細胞を、免疫磁性細胞分離を用いてＰＢＭＣから取り出した。枯渇効率は、試
験枯渇でのフローサイトメトリーを用いて評価された。培養されたＰＢＭＣの分
析は、利用できるのが少数のために行われなかった。試験枯渇で、ＣＤ３モノク
ローナル抗体を用いたＣＤ３＋細胞の除去は、非枯渇ＰＢＭＣ対照に比較してＣ
Ｄ３＋細胞の９２％減少を生じた。ＣＤ３枯渇を、ＣＤ３およびＣＤ４について
の二重標識、ＣＤ３およびＣＤ８についての二重標識、およびＣＤ３についての
単独標識を使用して監視した。ＣＤ３枯渇は、ＣＤ３枯渇群中において、枯渇さ
れるべきＣＤ３／ＣＤ４Ｔ細胞の９８％、および枯渇されるべきＣＤ３／ＣＤ８
細胞を伴う、ＣＤ８＋細胞よりも、ＣＤ４＋細胞についていっそう十分であった
。ＣＤ８モノクローナル抗体を用いたＣＤ８＋細胞の除去は、ＣＤ８＋細胞の９
９．９％減少を生じた。

【０１５８】 選択されたＰＢＭＣは、４日間、デングウイルスとの培養で刺激され、そして
その後分泌したインターフェロンγについて試験したＣＤ３＋またはＣＤ８＋Ｔ
リンパ球を枯渇された。結果は、同時に培養された非枯渇ＰＢＭＣ対照から得ら
れたものに比較された。他の細胞集団が、インターフェロンγの産生についてＣ
Ｄ４＋Ｔヘルパーを必要とするので、ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、刺激の前に枯渇さ
れなかった。

【０１５９】 培養の前にＣＤ３＋細胞を除去することは、表１５に示されるとおりインター
フェロンγの産生を実質的に減少させた。ＣＤ３＋枯渇後のインターフェロンγ
での減少についての範囲は、５９−１００％であった。減少したが、有為なイン
ターフェロンγ産生は、ある程度のＣＤ３＋枯渇培養で見られた。この残渣の産
生は、免疫磁性細胞分離の後に残る少量の残渣ＣＤ３＋細胞が、インターフェロ
ンγを分泌しているか、および／または細胞の別の集団も、インターフェロンγ
を分泌しているかのいずれかを示す。

【０１６０】

【表１５】

【０１６１】 １名の個人を除き、培養の前のＣＤ８＋細胞の除去は、インターフェロンγの
産生を減じなかった。１６の培養物のうち９つで、ＣＤ８＋細胞の除去は、おそ
らく、これらの細胞による抑制の除去により、またはＣＤ８＋細胞毒性リンパ球
により感染した抗原表在細胞の死滅を減じることにより、その産生を実際に増加
させた。

【０１６２】 同時に、これらの結果は、これらのＰＢＭＣ培養で見られたインターフェロン
γが、ＣＤ４＋Ｔリンパ球によるか、および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球による
かのいずれかで影響された細胞により分泌されることを示す。これは、Ｔｈ１応
答の知見を支持する。

【０１６３】 実施例１３ グランザイムＢ。Ｔｈ１応答は、中でも、細胞毒性リンパ球応答に関連する。
細胞が介在した死滅の能力のある細胞が、これらのワクチンボランティアに存在
したかどうかを理解する努力で、グランザイムＢ ｍＲＮＡは、枯渇実験のため
に培養されたＰＢＭＣで測定された。リンホカイン分析のための培養上清を除去
した後、細胞をペレット化させ、そしてｍＲＮＡの抽出のために溶解させた。グ
ランザイムＢ特異的プライマーは、ＲＴ−ＰＣＲのために使用された。ＰＣＲ産
物は、アガロースゲル電気泳動によって分析された。ゲルのバンド強度を、比較
のために参考写真（図８）を使用して、＋、−規模に変換した。７名のボランテ
ィアから得た余剰細胞を、ウイルスなしで培養した。これらの７名のボランティ
アから得た未刺激ＰＢＭＣは、ほとんど（−または＋）グラムザイムＢ ｍＲＮ
Ａ発現を示さなかった。抗原特異的刺激で、発現は、選択されたワクチン受容者
の内の１６全てで実質的に上方制御された（図８）。ＣＤ８モノクローナル抗体
を用いたＴ細胞小集合の枯渇は、対照ＰＢＭＣに比較してグランザイムＢ発現を
明らかには減じなかった。そのグランザイムＢ発現が、ＣＤ８枯渇群で減じられ
る３名の個人（認識番号１６、２２および３３番）があった。１名（認識番号３
３）で、減少は実質的であった。対照的に、ＣＤ３モノクローナル抗体を用いた
Ｔ細胞小集合の枯渇は、１４名のボランティアにおける発現を減じた。一価のボ
ランティアの内８名で、そして３名全ての四価のボランティアで、減少は、実質
的であった。インターフェロンγ非応答者の内の４名は、グランザイムＢ ｍＲ
ＮＡについても試験した。全ては、低レベルの発現を示した（データは示されず
）。

【０１６４】 ボランティアの７名から得られた細胞で、ＣＤ４モノクローナル抗体を用いた
Ｔ細胞小集合の枯渇は、培養の４日後に行われた。枯渇は、培養中助けを必要と
する全ての細胞にＴヘルパー活性を供するために培養後に行われた。刺激の後の
ＣＤ４＋細胞の除去は、分析された７名のボランティアでの非枯渇対照に比べて
グランザイムＢ発現に影響を及ぼさなかった。したがって、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞
により介在されたグランザイムＢの抗原依存性産生があるが、グランザイムＢを
産生する実際の細胞は、Ｔ細胞以外の細胞であるようである。これが、ＮＫ細胞
によるか、またはマクロファージによる産生であるのかは、知られていない。

【０１６５】 検討 この研究の２つの目的は、ワクチン受容者に測定可能なＴ細胞応答があるかど
うか、およびワクチンの第二の用量に対する細胞介在応答が見られうるかどうか
を決定することである。そのような目的のために、Ｔ細胞応答速度論は、２回の
用量の周辺の間隔で収集される再刺激細胞によって測定された。再刺激は、本研
究の間に収集されたＰＢＭＣの粗培養物中の生ウイルスで行われた。

【０１６６】 この研究の第三の目的は、１．リンホカインレパートリーによって定義された
細胞型、２．デングセロタイプ特異性および交差反応性応答、および３．強力な
細胞毒性のグランザイムＢ産生の測定値の点で、Ｔ細胞応答の特性を決定するこ
とである。これらの応答は、一価および四価ワクチン受容者の両方から得られた
ＰＢＭＣで測定された。四価のワクチン受容者に関して、応答が、４つ全てのセ
ロタイプのデングウイルスに検出されうるかどうかを決定することが重要であっ
た。

【０１６７】 ヒトおよびマウスＴヘルパー応答は、リンホカイン発現５のそれらのパターン
に基づいて２つの群に分割されうる。Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞は、ＩＬ−２
およびインターフェロンγの分泌によって特徴づけられる。それらの２つのリン
ホカインの中でも、インターフェロンγは、Ｔｈ１細胞を同定する点で、最も重
要である。Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およ
びＩＬ−１０の分泌によって特徴づけられる。細胞またはＰＢＭＣ粗培養の混合
集団で、２つの分泌の内１つが、通常優勢である。

【０１６８】 Ｔｈ１対Ｔｈ２応答に影響する１つの因子は、襲撃感染の特性である。ウイル
ス性感染、およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）およびマイコバクテリウム（
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のようなある種の細菌感染（Ｐｅｔｅｒｓ、１９
９６年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２３巻、９０９−９１６）は、しばしば、Ｔｈ１
応答を誘導する一方で、ある種の寄生的感染は、Ｔｈ２応答を誘導する（Ｃｏｎ
ｒａｄら、１９９０年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７１巻、１４９７−１５０８）
。２つの応答の比率は、感染の過程の間変化しうる。例えば、ウイルス性感染が
、通常、Ｔｈ１応答で始まる場合でさえ、Ｔｈ２応答は、感染中の後半に産生さ
れうる。当初のＴｈ１応答は、ＣＴＬ応答を増大する可能性があり、そして免疫
グロブリンのイソタイプに切り替えさせる一方で、以下のＴｈ２応答は、Ｂ細胞
による抗体産生を増大させる可能性がある。

【０１６９】 自然のデング感染で、ある研究は、ほとんどの個人でＴｈ１応答を示した。Ｔ
ｈ１応答は、重篤な病因に関連せずに、有効な免疫応答に関連した。対照的に、
ある程度の個人は、より多くの病因に関連したＴｈ２応答を発生した。

【０１７０】 有効な抗デング免疫応答とのＴｈ１応答の関連の代わりに、Ｔｈ１応答の重要
なリンホカインであるインターフェロンγは、免疫応答において陽性および陰性
の影響の両方を示す。タイ国では、Ｋｕｒａｎｅが、ＤＦ患者の血清中の低レベ
ルに対する比較においてＤＨＦ患者の血清中のインターフェロンγの高レベルを
見出した（Ｋｕｒａｎｅら、１９９１年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８８巻
、１４７３−１４８０）。増加したインターフェロンγは、免疫活性化の測定値
でありうる。インターフェロンγは、細胞毒性細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋
Ｔ細胞、およびＮＫ細胞）の活性化を活性化および維持することが必要とされる
。この機構が、重篤な感染における病因に寄与しうる一方で、同じ応答は、抗原
特異的細胞溶解を通してウイルスで感染した細胞の数を減少させることによって
、より穏やかな感染で有益でありうる。デングウイルス感染を制御する上でのイ
ンターフェロンγの陽性の役割は、インターフェロンα、βおよびγにおける最
近のマウスノックアウトモデルで示される。ノックアウトマウスは、感染に耐性
がある正常な成体対照と対照的に、デングウイルスによって致命的な感染の疑い
があった（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＲｏｅｈｒｉｇ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３巻、７
８３−７８６頁、１９９９年）。

【０１７１】 あるいはまた、インターフェロンγは、デングウイルス感染の病因に寄与しう
る。病因についての１つの機構は、１つの主要な標的細胞、マクロファージの感
染を増加させることにより、免疫増強による可能性がある。培養で、インターフ
ェロンγは、細胞の表面でＦｃレセプターの数を増加させることによって、マク
ロファージ・セルラインＵ９３７の抗体介在感染を増加させた（Ｋｏｎｔｎｙら
、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２巻、３９２８−３９３３頁、１９８８年）。であるが、
正常に培養されたマクロファージを使用した別の研究は、感染を減少させる反対
の効果を示した（Ｓｉｔｔｉｓｏｍｂｕｔら、１９９５年、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒ
ｏｌ ４５巻、４３−４９）。これらの矛盾している結果を付与して、インター
フェロンγが、マクロファージの感染が増加したことに寄与するかどうかは不明
瞭である。

【０１７２】 この研究で、Ｔｈ１応答は、優勢な応答であった。ＩＬ−４およびＩＬ−１０
についてのアッセイは、ＴＨ２応答の欠乏を首尾一貫して消極的に示していた。
高レベルのインターフェロンγが、多くの培養物の上清で検出され、それにより
それらの培養物でのＴｈ１応答の存在が示された。

【０１７３】 刺激された細胞が、全ＰＢＭＣであったので、インターフェロンγの分泌に起
因する細胞が決定されることが必要であった。これは、免疫磁性手段を用いて、
Ｔ細胞小集合を枯渇させることによって行われた。消極的枯渇は、培養の前に、
ＣＤ３またはＣＤ８のいずれかを認識する抗体で行われた。ＣＤ３枯渇が、イン
ターフェロンγ分泌の廃止を生じ、そしてＣＤ８枯渇は、生じなかったので、Ｃ
Ｄ３＋ＣＤ８−リンパ球は、インターフェロンγを分泌するか、または少なくと
も、インターフェロンγの分泌を制御する細胞集団であったと判断された。これ
は、インターフェロンγが、Ｔｈ１応答の結果であったことを確認する。枯渇の
後にある程度の培養物中の残りのインターフェロンγは、培養物中の枯渇、枯渇
の後のある程度の残りのＣＤ４＋Ｔリンパ球、または他の細胞、おそらくナチュ
ラルキラー細胞またはマクロファージに依った可能性があった。

【０１７４】 頂点のインターフェロンγ応答は、セロタイプ特異的であった。一価ワクチン
受容者から得られる細胞は、４つのセロタイプのデングウイルスの各々によって
別々に刺激された場合、頂点のインターフェロンγ産生は、ワクチンウイルスに
相同なデングウイルスによる刺激に応答していた。他のデングウイルスに対する
より低い交差反応性応答は、培養のいくつかで記録された。これは、異なる測定
、リンパ球増殖を使用してその他によって得られた結果に類似する。１つの研究
では、デング２ワクチンを受ける個人から得られる細胞は、デング２ウイルスに
対してより大きな応答を示したが、しかし交差反応性応答が、記録された（Ｄｈ
ａｒａｋｕｌ、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７０巻、２７−３３）。これは、
デング３ワクチン受容者から得られたクローンの大半が、デング３抗原に最高に
応答したが、他の３つのデング抗原に対して交差反応性応答を示したクローンの
レベルで確認された（Ｋｕｒａｎｅら、１９８９年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７
０巻、７６３−７７５）。後の研究の結論は、一次デングウイルス感染が、優勢
に交差反応性ＣＤ４＋リンパ球応答（増殖およびインターフェロンγ産生）を生
じることであった。

【０１７５】 この研究で、一価のワクチン受容者のＰＢＭＣの交差反応性応答は、通常、セ
ロタイプ特異的応答の半分またはそれ未満であった。四価のワクチン受容者では
、デングウイルスの個々のセロタイプに応答したインターフェロンγ分泌は、４
つの四価のワクチン受容者の内３つで明らかであった。応答は、低い応答が、セ
ロタイプ特異的応答または交差反応性応答であるかどうかを決定する可能性がな
かったことに十分な個々のワクチン受容者で変化した。

【０１７６】 インターフェロンγ分泌によって示されるとおりＴ細胞活性化の速度論は、予
測されるより遅かった。少数の例で、応答は、１４日目までに検出され得た。し
かし、ほとんどの場合に、応答は、第二のワクチン用量の投与の直前まで検出さ
れなかった。遅延した速度論についての理由がなにであるかは不明である。ワク
チンウイルスに感染した細胞による抗原産生が、低く、そして頻発するという１
つの説明が可能である。しかし、その方法は、急な応答よりむしろ記憶応答を優
勢に検出したことは等しく可能である。例えば、活性なＣＤ８＋細胞は、初期の
感染の間に収集されたＰＢＭＣでのＣＤ４＋応答を阻害していた場合、測定可能
な応答は、弱毒化されうる。ＣＤ８＋リンパ球が枯渇される培養で、残りのリン
パ球によるインターフェロンγ分泌は、培養の半分より多くで増加された。この
阻害は、初期の感染の間に多くなり得た。

【０１７７】 他方は、より急性のリンホカイン産生の速度論を観察した。血清インターフェ
ロンγを含めた血清リンホカインは、弱毒化デングワクチンを用いた接種の後、
１７日間測定された。急性応答は、ウイルス血症の時間じゅう頂点に達したその
研究で注目された（Ｋｕｒａｎｅら、１９９５年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ ４６巻、３５−４０）。

【０１７８】 第二の用量に対する応答が混ぜられた。ある程度の個人は、インターフェロン
γ産生における増加を示した一方で、他方は、減少を示した。第二の用量の直前
にワクチン受容者から収集された細胞によるインターフェロンγ産生は、第二の
用量に対する任意の既往の応答を消しうるのに十分高かった。さらに、後半のイ
ンターフェロンγ応答は、既往のＴ細胞応答の測定を、いっそう困難にさせえた
。数名の個人が、第二の用量に応答したことは明かである。これは、活性な免疫
応答の存在下である程度の局在ウイルス成長があったことを示す可能性がある。

【０１７９】 要約すると、これらの生の弱毒化デングウイルスの投与に対する優勢なＴ細胞
応答は、Ｔｈ１応答であった。これは、ワクチン受容者から収集された再刺激Ｐ
ＢＭＣによるインターフェロンγの分泌によって示された。ワクチン受容者の細
胞から得られるＰＢＭＣ培養物で、再刺激の後に培養上清への明らかなＩＬ−４
またはＩＬ−１０分泌を示したものはなかった。Ｔｈ１応答は、ＣＤ３＋ＣＤ８
−リンパ球が、インターフェロンγを分泌していることを示すことによって立証
された。Ｔｈ１応答は、優勢にデングセロタイプ特異的であったが、しかしより
小さな交差反応性応答が、認められた。

【０１８０】 実施例１４ 免疫および疑わしいボランティアでの誘発株として４つのデングウイルスの臨
床および免疫学的評価 この研究の第一の目的は、疑わしいおよび免疫のボランティアでの４つの候補
のデング誘発ウイルスの各々に対する臨床応答を特徴づけて、ヒトのワクチン効
力の研究についての誘発株としてそれらの安定性を判断した。その研究の第二の
目的は、デング熱についての保護の免疫相互関係に関する仮説を生じることであ
る。

【０１８１】 用量、日程および経路：全てのボランティアは、研究の０日目に三角筋領域で
皮下に、０．５ｍｇの単回用量で、４つのデング誘発ウイルスまたはプラセボの
内のいずれか１つを受ける。

【０１８２】 研究グループ： ボランティア集合番号１（疑わしい）：ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３
、ＤＥＮ−４またはプラセボのいずれかを受けること。ボランティア集合番号２
（免疫）：ＤＥＮウイルス（先に受けたワクチンに応答するセロタイプ）または
プラセボのいずれかを受けること。

【０１８３】 一般的適格条件：年齢１８−３５歳、なんら慢性の医療条件なしに素晴らしく
健康、書き取り理解力試験で＞７５％のスコアー、インフォームドコンセント、
研究期間の間の利用性、連隊からの参加の承認の文書（軍のみ）、先のデングワ
クチン接種に応じた血清学的変換（ボランティア集合番号２番のみ）。

【０１８４】 統計：データ解析は、各試験物の群で少数のボランティアに付与された、この
先行研究で最初に説明できる。第一の考慮は、プラセボに比較したとき、４つの
研究群内の医療事象（予め特定され、そして予測されない）の頻度を詳細に記述
することである。

【０１８５】 デング熱を発生する全ての誘発されたボランティアの予備誘発免疫測定および
後誘発免疫応答は、健康なままである全ての誘発されたボランティアのものと比
較して、保護の免疫相関関係について仮説を生じる。

【０１８６】 ヒトデングの誘発モデルの使用： デング病を特徴づけるか、または生のワクチン候補の弱毒化を評価するかのい
ずれかのために設計されたほとんどの歴代のヒトデング誘発実験と対照的に、こ
の誘発研究は、１）フラビウイルスを受けたことがないボランティア（ボランテ
ィア集合番号１）で誘発株として４種のデングウイルスを有効とすること、およ
び２）順次、相同器官のデングウイルスで誘発されたときにモノ型のデングワク
チンの受容者（ボランティア集合番号２）で免疫性の関連のあるものを同定する
ことを助長する。

【０１８７】 ボランティア集合番号１での医療上の応答が、これらの株が、誘発に適してい
ることを示唆する場合、それによりさらなる制御実験で、これらの誘発株は、デ
ングワクチン候補またはプラセボの受容者に投与されて、さらなる開発のための
最も有望なワクチン候補を選択する。

【０１８８】 ボランティア集合番号２での免疫学上の応答は、予備誘発免疫性のある種の態
様（抗体および／またはＴ細胞記憶）が、保護と関連があることを示唆する場合
、保護のこのような関連のあるものは、デングワクチン開発を簡便にしうる。

【０１８９】 誘発株として試験されるべきデングウイルスについての条件を定義すること：
適切なデング誘発ウイルスは、１）ボランティア集合番号１で３−７日間続く未
合併デング熱を再現可能に引起し、２）優良製造規則（ＧＭＰ）と合せて製造さ
れ、そして偶発的剤または反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）の非ウイルス性
成分を含まず、および３）十分な量（＞１００用量）で凍結乾燥ウイルスとして
入手可能である。誘発ウイルスとしては、不活性化ＤＥＮ−１ ４５ＡＺ５（Ｐ
ＤＫ−０）、ＤＥＮ−２ Ｓ１６８０３（ＰＤＫ−１０）、ＤＥＮ−３ ｃｌ
２４／２８（ＰＤＫ−０），ＤＥＮ−４ ３４１７５０（ＰＤＫ−６）（ＰＤＫ
＝一次イヌ腎臓細胞）が挙げられる。

【０１９０】 プラーク形成単位（ｐｆｕ．）での誘発ウイルスの用量は、０．５×力価であ
る。

【０１９１】 研究誘発ウイルスは、後の２つの条件に合致する。この研究は、研究の候補の
誘発株が、第一の条件に合致することを示すことを助長する。我々は、この研究
で試験されるべき４種の誘発ウイルスが、適切に病因性があることのある程度の
証拠を有する。ＤＥＮ−１およびＤＥＮ−３誘発ウイルスは、ボランティアでの
未合併で熱病の病気を引起すことがすでに示されている。この研究で投与される
べきＤＥＮ−２およびＤＥＮ−４誘発ウイルスは、ボランティアで試験されなか
ったが、それらは、ボランティアで熱病の病気を引起したので拒絶されたデング
ウイルスワクチン候補の前駆体である場合、それらは、病原性であると考えられ
る。４つの研究の候補のデング誘発ウイルスのいずれかを拒絶する唯一の理由は
、それらが、フラビウイルスを受けたことがないボランティア（ボランティア集
合番号１）でなんら病気を引起さないか、または任意のボランティア（ボランテ
ィア集合番号１および２）で過剰の病気を引起すかのいずれであるかである。

【０１９２】 ボランティア集合番号１：１０名の健康なフラビウイルスを受けたことがない
ボランティアは、任意に、４つのセロタイプ（セロタイプ当たり２名のボランテ
ィア）またはプラセボの内１つでデングウイルス誘発を受ける。ボランティアお
よび調査者は、接種まで目隠ししたままである。我々は、デング誘発ウイルスを
受ける８名のボランティアが、３〜７日の発熱、ひどい頭痛および筋痛を示す中
程度な病気になることを予測する。完全な回復は、病気の発生から１４日と同じ
だけ長く要しうる。各誘発ウイルスは、２名の受容者の医療的応答に基づいて適
切と見なされ、そしてデング熱の研究定義を満足しなければならない。デング熱
は、以下のもの：頭痛、筋痛、紅潮、眼窩後部痛、関節痛、およびアセトアミノ
フェン使用による温度の減少した期間に対処する４８時間またはそれ以上の間の
持続的発熱、および発熱の期間中、そしてその後好中球減少症または血小板減少
症または肝臓損傷により明白であり、そして発熱のデングウイルス血症で明らか
な日の間の組織応答の内の２つまたはそれ以上を示す病気と定義される。

【０１９３】 ボランティア集合番号２：１２歳までの若く健康な免疫のボランティアは、ホ
モ型デング誘発ウイルス（Ｎ＝１０、セロタイプに関わらず）またはプラセボ（
Ｎ＝２）を受ける。免疫ボランティアは、一次中和抗体応答を示した一価の生の
弱毒化デングワクチンの先の受容者である。セクション２３．３は、これらの一
価のデングワクチン受容者に関する医療および免疫学上のデータを要約する。免
疫ボランティアは、健康なままであると予測される。彼らの予備誘発免疫状態ま
たは免疫活性化内部誘発の測定は、保護の関連のものを同定しうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ワクチン接種の結果としての＞１度の症状の発生である。

【図２】 血清型別の反応誘発性指数の分布頻度である。

【図３】 種々の投与量での四価デング熱ワクチン試験の結果を示す表である。

【図４】 １０名の被験者における完全投与量での四価デング熱ワクチンの免疫原性を示
す表である。

【図５】 四価ワクチン試験の選択した製剤についての詳細を示す表である。

【図６Ａ〜Ｈ】 ワクチンボランティアから採集し、血清型特異的ウイルスで刺激したＰＢＭＣ
によるインターフェロンγの産生。すべてのボランティアが１種類だけの血清型
のワクチンを接種された。左側のグラフ（Ａ−Ｄ）は、３２日目頃に２回目の投
与量を接種されたボランティアからの結果を示す。右側のグラフ（Ｅ−Ｈ）は、
９２日目頃に２回目の投与量を接種されたボランティアからの結果を示す。大部
分のボランティアにおいて２回目の投与の直前に１０００ｐｇ／ｍｌを越える応
答が認められた。４名のボランティアだけが、１回目のワクチン接種を受けてか
ら最初の１５日以内に１０００ｐｇ／ｍｌ以上の応答があった。

【図７Ａ〜Ｄ】 四価ワクチンを接種されたワクチンボランティアから採集したＰＢＭＣのイン
ターフェロンγの産生。ＰＢＭＣは、個別に各血清型のウイルスで刺激した。各
々のグラフ中の個々の線は、個々の血清型のウイルスに対する１名のボランティ
アのＰＢＭＣの応答を表わす。単価ワクチンのレシピエントに関しては、遅延反
応が認められた。

【図８ＡおよびＢ】 単価及び四価ワクチンボランティアから採集したＰＢＭＣのグランザイムＢ
ｍＲＮＡ産生。いずれかの時点で分泌されたＰＢＭＣが≧１０００ｐｇ ＩＦＮ
γ／ｍｌであった個人全員から細胞を採集した。これは、ＲＴＰＣＲによって検
出されるｍＲＮＡの量の半定量的表示である。上の図（Ａ）は、すべてのサンプ
ルについて認められたバンドの強さを示す。下のゲル（Ｂ）は、陽性と陰性ＲＴ
ＰＣＲアッセイの例を示すために選択したボランティアからのものである。

【手続補正書】特許協力条約第１９条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１１月２７日（２０００．１１．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 プトナク， ジョゼフ， アール． アメリカ合衆国 メリーランド州 20910， シルバー スプリング， 16番 ストリ ート 8201 (72)発明者 デュボイス， ドリア， アール． アメリカ合衆国 メリーランド州 20902， ウェアトン， ジュドソン ロード 11908 (72)発明者 イニス， ブルース， エル． アメリカ合衆国 20012 ワシントン デ ィーシー， エヌ．ダブリュー．， シダ ー ストリート 532 (72)発明者 ホーク， チャールス， エイチ． アメリカ合衆国 メリーランド州 21044， コロンビア， カーディナル レイン 6409 (72)発明者 ヴァウン， デイビッド アメリカ合衆国 メリーランド州 20905， シルバー スプリング， レッドゲイト ドライヴ 15108 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA01 GA18 4B065 AA90X AA95X AC20 BB32 BC50 CA45 4C085 AA03 BA51 CC08 DD06 DD86 EE06 FF24

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生理的に許容される賦形剤中に少なくとも１つの弱毒化デン
   グ熱１型ウイルスを含む免疫原性組成物。
2. 【請求項２】 個体においてデング熱１型特異的免疫応答を誘発する、請求
   項１に記載の免疫原性組成物。
3. 【請求項３】 免疫応答を高めるアジュバントをさらに含む、請求項１に記
   載の免疫原性組成物。
4. 【請求項４】 弱毒化ウイルスが、ＡＴＣＣアクセス番号ＶＲ−２６４８の
   デング熱１型ウイルスである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
5. 【請求項５】 １０^４−１０^５ＰＦＵの弱毒化ウイルスの用量で製剤される
   、請求項１に記載の免疫原性組成物。
6. 【請求項６】 生理的に許容される賦形剤において、デング熱１型ウイルス
   である少なくとも１つの弱毒化ウイルスの免疫学的に十分な量を個体に投与する
   ことを含む、デング熱１型ウイルス特異的免疫応答を刺激するための方法。
7. 【請求項７】 弱毒化ウイルスを１０^４−１０^５ＰＦＵの量で個体に投与す
   る、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 弱毒化ウイルスを非経口的に投与する、請求項６に記載の方
   法。
9. 【請求項９】 弱毒化ウイルスを鼻腔内に投与する、請求項６に記載の方法
   。
10. 【請求項１０】 前記投与が多回投与である、請求項６に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記多回投与が０ヶ月目と６ヶ月目である、請求項１０に
    記載の方法。
12. 【請求項１２】 ＡＴＣＣアクセス番号ＶＲ−２６４８のデング熱１型ウイ
    ルスのヌクレオチド配列を含む、弱毒化デング熱１型ウイルスゲノムをコードす
    るＤＮＡ分子。
13. 【請求項１３】 デング熱１型ウイルスをイヌ腎細胞において継代して、各
    継代後にウイルスが哺乳類において疾患を引き起こす能力を試験することを含み
    、前記哺乳類において疾患を引き起こすことができないときウイルスが弱毒化さ
    れている、デング熱１型ウイルスを弱毒化するための方法。
14. 【請求項１４】 弱毒化ウイルスをアカゲザル胎児肺細胞において継代する
    、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 ウイルスの前記継代が無血清培地中で行われる、請求項１
    ３に記載の方法。