JP2002539821A

JP2002539821A - 脊椎動物細胞へのウイルスの適用

Info

Publication number: JP2002539821A
Application number: JP2000608725A
Authority: JP
Inventors: ケネス，エイチ．エッケルス，; ジョゼフ，アール．プトナク，; ブルース，エル．イニス，
Original assignee: ウォルターリードアーミーインスティテュートオブリサーチ
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2002-11-26
Also published as: EP1165756A2; AU776638B2; AU4040300A; CA2365415A1; WO2000058444A2; US6613556B1; WO2000058444A9; WO2000058444A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、感染細胞、特に血清型１、２、３、及び４の弱毒化デング熱ウイルス株を得るために、高力価ウイルス株を哺乳類培養細胞に感染させることによって高力価にウイルスを複製するための方法を提供する。結果として得られる複製したウイルスは、本発明によって同様に提供されるワクチン及びワクチン接種方法での使用に適している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９９年３月２６日に提出された米国特許出願番号６０／１２６
，３１６（係属中）および２０００年２月１１日に提出された米国特許出願番号
６０／１８２，０６５（係属中）についての合衆国法典第３５巻１１９条（ｅ）
項の優先権の利益を主張する。

【０００２】

【発明の分野】

本発明は、ワクチン産生に有用な、脊椎動物細胞培養中で複製されるウイルス
に関する。ワクチンとして有用なウイルス株を、ワクチン株の連続継代および複
製の最適化によって脊椎動物細胞に適用することができる。脊椎動物細胞での増
殖に適応させたワクチン株は、多くの利点を付与する。本発明はまた、ワクチン
用などのこのような複製ウイルスの作製法および使用法に関する。

【０００３】

【発明の背景】

培養脊椎動物細胞は、ウイルス複製に使用され、少なくとも３つの異なる群に
分類されている。正常な組織由来の初代細胞、種の起源に依存して限られた寿命
の二倍体細胞株、および無制限に複製し、懸濁培養で増殖することができる連続
細胞株の培養細胞。Ｈａｙｆｌｉｃｋ， "ＣｏｎｔｉｎｏｕｓＣｅｌｌＬ
ｉｎｅｓａｓＳｕｂｓｔｒａｔｅｓｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（
生物学的製剤の基質としての連続細胞株）"、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖａ．，
ｐ２（１９８８）。

【０００４】現在、ほとんどのウイルスワクチンは、初代細胞または二倍体細胞株を使用し
て産生されている。起源となる種には、サル、ニワトリ、胚、およびハムスター
が含まれる。これらの細胞培養物は、単純な培地およびウシ血清を使用する調製
の容易さおよび広範な種々のウイルスに対する感受性などの一定の利点を有する
。しかし、初代細胞は、種々の偶発因子、質および感受性の変化、細胞培養用の
適切な組織を得る困難さ、低ウイルス力価、ならびにこのような細胞培養物の獲
得および調製費用の高さなどの不都合がある。二倍体細胞株は同様な多数の不利
益ならびに細胞の拡大が制限される制限された寿命を有する。

【０００５】アフリカミドリザル腎臓（ベロ）細胞は、非腫瘍形成性で、ヒトワクチン産生
において安定で有利な連続細胞株である。実際、現在いくつかの特許ワクチンが
これらのワクチン中で製造されている。ベロ細胞および可能な他の連続細胞株は
、デング熱ウイルスワクチン産生に有用であり得る。しかし、連続細胞株の継代
後にワクチンウイルス株の抗原特性が変化するかどうかは未知である。

【０００６】

【発明の要旨】

本発明は、デング熱ウイルスの高増殖株を使用した方法、組換えウイルス、お
よびワクチン組成物に関する。

【０００７】したがって、本発明は、連続脊椎動物細胞における所望のウイルス株の継代お
よび種株として高力価で複製するウイルス株の選択によって培養液中でデング熱
ウイルス複製を増加させるための方法を提供する。デング熱株を弱毒化する場合
、得られた種株は、ワクチン産生に適切であり得る。

【０００８】好ましくは、脊椎動物宿主細胞または線維芽細胞培養物は、１０〜２５０回継
代の哺乳動物細胞株としての上皮細胞または線維芽細胞由来の連続細胞培養物で
ある。好ましくは、ワクチン産生に使用されるのは、現在利用可能で（例えば、
ＷＨＯで）証明されている約２０〜２５０回継代の連続株としてのベロ細胞であ
る。

【０００９】本発明の単離、精製、または濃縮形態のデング熱ウイルスは、約１０^６〜１０^９（１０^６〜１０^７、１０^７、および１０^８〜１０^９またはその任意の範囲もし
くは値など）のプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌの感染力価を有することが好
ましい。

【００１０】本発明はまた、不活性または弱毒形態の、本発明のデング熱の４つの任意の抗
原型のデングウイルスの少なくとも１つの株を含み、任意選択的に（ａ）少なく
とも１つの薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤、（ｂ）少なくとも１つン
アジュバントおよび／または（ｃ）少なくとも１つの治療薬の少なくとも１つを
含む組成物を提供する。

【００１１】本発明はまた、デング熱ウイルス感染に予防的または治療的である哺乳動物に
おける少なくとも１つのデング熱ウイルス株に対する免疫応答の惹起法を提供す
る。この方法は、本発明の不活化および／または弱毒化デング熱ウイルスを含む
ワクチン組成物を哺乳動物に投与することを包含する。デング熱ウイルスの感染
によって生じるデングウイルス病に対して哺乳動物を予防または治療する量の組
成物を投与する。

【００１２】本発明の他の目的、特徴、利点、有用性、および実施形態は、本発明に関する
以下の詳細な説明および実施例によって当業者に明白である。

【００１３】

【詳細な説明】

本発明は、連続哺乳動物細胞株を使用したデング熱ウイルスを提供する。複製
ウイルス産生用のウイルスは、少なくとも１つのデング熱ウイルス抗原型の病原
性または弱毒化された高力価株である。デング熱ウイルスは、４つの抗原型（抗
原型１〜４類される。弱毒化株を使用する場合、ワクチン産生には複製デング熱
ウイルスが適切である。

【００１４】本明細書中で使用される、用語「高力価ウイルス」は、インビトロ組織培養複
製系において高い産生力価、例えば１０^５〜１０^１０ＰＦＵ／ｍｌ、好ましくは
１０^６〜１０^９ＰＦＵ／ｍｌを生じるものと定義される。

【００１５】複製またはワクチン産生用のデング熱ウイルスのスクリーニングを、当該分野
で公知のように、任意の公知および／または適切なアッセイを使用してアッセイ
することができる。スクリーニングに適切なこのようなアッセイ（単独または組
み合わせ）には、逆遺伝学、相補性、および／または感染などの方法を使用した
ウイルス複製、抗原の定量的および／または定性的測定、転写、複製、翻訳、ビ
リオン組み込み、毒性、ウイルス収量が含まれるが、これらに限定されない。例
えば、ウイルス複製アッセイを使用して、ウイルス弱毒化または不活化をスクリ
ーニングすることができる。これらのアッセイの例として、Ｓｕｋｈａｖａｃｈ
ａｎａら，１９９６，ＢｕｌｌＷＨＯ３５，６５-６６を参照のこと。本明
細書中で引用した前出または以下の全ての文献は、その全体が本明細書中で参考
として援用される。

【００１６】本発明によれば、本発明の複製デング熱ウイルスを得るために、任意の抗原型
の任意のデング熱単離物を使用して、脊椎動物宿主細胞における複製に適切な高
力価の株を得ることができる。連続脊椎動物細胞株における高力価変異体の選択
による臨床単離物の複数回継代によって、臨床単離物から高増殖株を作製するこ
とができる。

【００１７】本発明のウイルス複製法によれば、好ましくはワクチン産生についてＷＨＯの
要件を証明することができる適切な継代数のベロ細胞または外来性因子に関して
適切な他の脊椎動物細胞を含む適切な脊椎動物宿主細胞を使用することができる
（Ｍｉｚｒａｈｉ，ｅｄ．，ＶｉｒａｌＶａｃｃｉｎｅｓ，Ｗｉｌｅｙ
-Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９０），ｐｐ．３９〜６０）。本
明細書中で使用される方法、ウイルス、および組成物に適切であり得る細胞株の
非限定的例には、連続細胞株としての哺乳動物線維芽細胞または上皮細胞が含ま
れるが、これらに限定されない。さらなる非限定的例には、紫斑の供給源（例え
ば、ＡＴＣＣ、Ｖａ）から容易に利用可能なベロ、ＭＤＢＫ、ＢＫ−２１、ＭＤ
ＣＫ（ＭａｄｉｎＤａｒｂｙイヌ腎臓）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵
巣）、およびＣＶ−１細胞が含まれる。１９１回未満の継代またはその任意の範
囲もしくは値のベロ細胞が好ましい。

【００１８】連続細胞株中で産生した複製ウイルスを本発明のワクチン処方前に高度に精製
することが好ましい。一般に、精製により細胞ＤＮＡ、他の細胞成分、および外
来因子が広範に除去される。ＤＮＡを広範に分解するか変性させる手順もまた使
用することができる。例えば、Ｍｉｚｒａｈｉ、１９９０、上掲を参照のこと。

【００１９】ヒトにおけるワクチン使用に適切な４つの抗原型を実施例に記載する。本明細
書中に記載のデング熱ウイルスを、単離物に弱毒化を付与する変異を蓄積するよ
うに、初代イヌ腎臓細胞などの適切な宿主細胞株における感染性デング熱ウイル
ス単離物の連続継代によって産生させた。連続継代とは、ウイルス単離物での細
胞感染、宿主細胞由来のウイルス子孫の回収、および次の世代を得るためのウイ
ルス子孫での宿主細部の次の感染をいう。

【００２０】任意の抗原型の他のウイルス組成物を使用することができるとしても、以下の
弱毒化ウイルスを本発明の方法に使用して、連続細胞培養において複製ウイルス
を産生させることが好ましい。１）ブダペスト条約に従って１０８０１，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌ
ｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０-２２０９
Ｕ．Ｓ．Ａ．のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託
され、ＶＲ−２６４８の信託番号を付与された弱毒化デング熱１型ウイルス４５
ＡＺ５株。２）ブダペスト条約に従って１０８０１，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌ
ｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０-２２０９
Ｕ．Ｓ．Ａ．のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託さ
れ、ＶＲ−２６５３の信託番号を付与された弱毒化デング熱２型ウイルスＳ１６
８０３株。３）ブダペスト条約に従って１０８０１，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌ
ｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０-２２０９
Ｕ．Ｓ．Ａ．のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託さ
れ、ＶＲ−２６４７の信託番号を付与された弱毒化デング熱３型ウイルスＣＨ５
３４８９株。４）ブダペスト条約に従って１０８０１，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌ
ｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０-２２０９
Ｕ．Ｓ．Ａ．のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託さ
れ、ＶＲ−２６５２の信託番号を付与された弱毒化デング熱４型ウイルス３４１
７５０株。

【００２１】デング熱の病原性（疾患を引き起こす）株の連続継代により、弱毒化されうる
（すなわち、感染するが疾患を引き起こすことができない）修飾ウイルスが単離
される。これらの修飾ウイルスを、感染性の減少についてサルで試験する。次い
で、感染性が減少したものを、ヒトで試験する。ヒトは、臨床的疾患の徴候を示
す唯一の霊長類である。臨床的反応性が最小か全く示さないが感染して免疫応答
を誘導するウイルスを選択する。

【００２２】上記の弱毒化デング熱ウイルス抗原型１〜４の調製のために、種々の一連の継
代を、アカゲザル胎児胚細胞（ＦＲｈＬ）の最終継代後の臨床効果について試験
した。ＦＲｈＬ細胞を使用して、ウイルス力価を最適化した。一般に、第１継代
はマスターシードと考えられ、第２継代は産生シードと考えられ、第３継代はワ
クチンロットと考えられる。ワクチンを、種々のＰＤＫ継代レベルで調製し、ワ
クチン産物をサルおよびヒトにおける弱毒化について試験した。継代ウイルスの
病原性（すなわち、疾患を起こす能力）を、２、３例をあげると温度（熱）、頭
痛、発疹などの症状の毎日の監視によって評価した。このワクチンのワクチン接
種者におけるデング熱疾患の惹起能力によって判断したところ、継代により弱毒
化されていると考えられた。

【００２３】本発明の弱毒化ウイルスの増殖は、高力価デング熱ウイルス増殖を可能にする
多数の細胞株で存在し得る。通常、最も高いウイルス収量は、ベロ細胞で達成さ
れた。典型的には、細胞を約０．０１〜０．００５の範囲の感染多重度で接種し
、ウイルスの複製を許容される条件下（例えば、約３０〜３７℃で約３〜５日）
または必要ならばウイルスが適切な力価に達成するまで培養した。ウイルスを、
細胞培養から取り出し、典型的には周知の清澄化手順、例えば、勾配遠心分離お
よびカラムクロマトグラフィーによって細胞成分から分離し、当業者に周知の手
順を用いて所望のようにさらに精製することができる。好ましくは、ウイルスの
生存度を維持するため、精製中での２〜１０℃の温度維持に注意を払わなければ
ならない。

【００２４】高力価ウイルスの単離後、高力価表現型の根拠を同定するためにそのゲノムを
配列分析を行うことができる。これを、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定
およびコンロトールウイルスのゲノム配列と比較した高力価単離物のヌクレオチ
ドの変化の同定によって行う。したがって、株に高力価増殖を付与する分子の変
化を特徴づけることができる。

【００２５】本明細書中で得られた本発明の１つの実施形態には、高力価のウイルス子孫を
産生させるために上記の表に列挙した任意の位置での（単独または組み合わせた
）配列の変化の移入が含まれる。このような変化を有するウイルスゲノムを、ク
ローン化ＤＮＡにヌクレオチド変化を移入するための任意の標準的な組換えＤＮ
Ａ技術（Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ＆ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８９）によって産生することができる。次いで、ゲノムをウイ
ルス子孫の産生用の宿主細胞へのトランスフェクション用の適切なベクターに結
合することができる。

【００２６】ウイルスゲノムのプラスミド媒介移入によるウイルス子孫の産生能力を使用し
て、限定された分子変化を有するウイルスを産生させることもできる。本発明の
この実施形態では、ウイルスの所望の性質（例えば、高力価増殖）を付与する配
列変化を含むウイルスストックを産生することができる。このアプローチを使用
して、ウイルスの種々の特性（すなわち、ウイルスゲノムへの所望の配列変化の
移入、ゲノムからウイルス子孫の産生、および特徴づけのためのウイルス子孫の
回収による抗原型、病原性または弱毒化）に対する分子変化の効果を評価するこ
ともできる。さらに、このアプローチを使用して、他の疾患に対する免疫応答を
得るためにウイルスによって同時に送達されたウイルスゲノムに挿入された異種
配列を有するウイルスを構築することができる。

【００２７】限定された分子変化を有するウイルスゲノムの構築を、当業者に公知の標準的
技術（オリゴヌクレオチド特異的、リンカースキャニング、またはポリメラーゼ
連鎖反応ベースの変異誘発技術など）を用いて行うことができる（Ｚｏｌｌｅｒ
ａｎｄＳｍｉｔｈ，１９８４，ＤＮＡ３，４７９〜４８８，Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎａｎｄＳｈｏｒｔｌｅ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２
９、１１９３）。導入用の適切なベクターへのゲノムの結合を、当業者に公知の
標準的な技術によって行うことができる。ウイルス子孫産生用の宿主細胞へのベ
クターのトランスフェクションを、標準的な任意の技術（リン酸カルシウムまた
はＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション
、プロトプラスト融合、及び当業者に公知の他の技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅ
ｓｓ，１９８９）を使用して行うことができる。

【００２８】ワクチン用に、本発明の弱毒化高力価デング熱ウイルスを、ワクチン処方に直
接使用するか、所望であれば当業者に周知の凍結乾燥プロトコールを使用して、
好ましくは安定剤中で凍結乾燥することができる（Ｈｏｋｅ，１９９０，Ａ
ｍＪＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ４３，２１９-２２６）。典型的には、凍
結乾燥ウイルスを約４℃で維持する。使用できる状態である場合、凍結乾燥ウイ
ルスを、水中または必要であれば安定化溶液（例えば、アジュバントを含むか含
まない生理食塩水、またはＭｇ^＋＋およびＨＥＰＥＳを含む水（以下にさらに記
載））中で再構成する。

【００２９】従って、本発明のデング熱ウイルスワクチンは、本明細書中に記載のように有
効成分としてデング１型、デング２型、デング３型、およびデング４型からなる
群から選択される免疫学的有効量の１つをこえる弱毒化高力価デング熱ウイルス
を含む。弱毒化高力価ウイルス組成物を、任意選択的に生理学的に受容可能なベ
ヒクルおよび／またはアジュバントと共に被験体（特に、ヒト）に移入すること
ができる。有用なベヒクルは当該分野で周知であり、水、緩衝化水、生理食塩水
、グリシン、ヒアルロン酸などが含まれる。得られた水溶液を、そのままで使用
するために封入するか、凍結乾燥し、上記のように凍結乾燥した調製物は投与前
に再水和する。組成物は、適切な生理学的条件に必要な薬学的に受容可能な補助
物質（ｐＨ調整剤および干渉化剤、張度調整剤、湿潤剤（例えば、酢酸ナトリウ
ム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビ
タンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなど）など）を含むもの
であってもよい。

【００３０】本明細書中に開示の高力価の生きている弱毒化ウイルスの投与を、非経口投与
（腹腔内、皮下、または筋肉内注射等）、トリにおけるｉｎｏｖｏ注射、経口
およびウイルス（典型的には薬学的処方物中に含まれる）の気道表面への局所適
用を含む任意の適切な手段によって行うことができる。ウイルスの気道表面への
局所適用を、鼻腔内投与（例えば、薬学的処方物を鼻腔内に沈着させるドロッパ
ー、塗布、または吸入器の使用）によって行うことができる。ウイルスの気道表
面への局所適用を、エアゾール懸濁液としてのウイルスを含む薬学的処方物の呼
吸可能な粒子（固体粒子および液体粒子の両方を含む）の作製および呼吸可能な
粒子の被験体の吸入などによる吸入投与によって行うこともできる。呼吸可能な
薬学的処方物粒子の投与法および装置は周知であり、任意の従来技術を使用する
ことができる。ワクチン化の結果、宿主は、投与した抗原型のデング熱ウイルス
感染に対して少なくとも部分的または完全に免疫されるか、中程度または重症デ
ング熱ウイルス感染に対して耐性を示す。

【００３１】個体自身の免疫応答能力を惹起させるために、本発明の弱毒化デング熱ウイル
スを含むワクチン組成物を、デング熱ウイルス感染に感受性を示すかその危険性
を有する個体に投与する。このような量を、「免疫学的有効量」と定義する。こ
の用途では、正確な量は、患者の健康状態および体重、投与様式、処方物の性質
などに依存するが、一般に、被験体当たり約１０^４〜１０^５ｐｆｕの範囲である
。４つの抗原型を組み合わせる場合、好ましい組成物は、各抗原型の最適な処方
物を含む。任意の事象では、ワクチン処方物は、重症または生命を脅かすデング
熱ウイルス感染に対して被験体を効果的に保護するために十分な量の各抗原型の
弱毒化デング熱ウイルスが提供されるべきである。

【００３２】複数のデング熱ウイルスに対する防御を達成するために、１つの特定の抗原型
の本発明の弱毒化デング熱ウイルスをデング熱ウイルスの他の抗原型の弱毒化ウ
イルスと組み合わせることができる。典型的には、異なる修飾ウイルスを混合し
て同時投与するが、別で投与することもできる。

【００３３】いくつかの例では、本発明の弱毒化デング熱ウイルスワクチンと他の因子に対
して防御応答を誘導するワクチンとを組み合わせることが望ましい。

【００３４】本発明のワクチン組成物の単回または複数回投与を行うことができる。十分な
免疫レベルを惹起するためには複数回投与が必要であり得る。免疫の誘導レベル
を、分泌性抗体および血清抗体の中和量の測定ならびに所望の防御レベルの維持
するために調整した投薬量または必要に応じて反復したワクチン接種によって監
視することができる。

【００３５】以下の実施例は、例示を目的として提供するが、制限を目的としない。

【００３６】以下の材料と方法を、以下の実施例で使用した。

【００３７】ワクチン産生についての材料と方法。ウイルス株。ヒトおよび蚊から単離後のＤＥＮウイルスを、初代イヌ腎臓（ＰＤ
Ｋ）細胞培養で継代した。表１は、適合しＰＤＫ細胞中で継代した株を列挙する
。ＰＤＫ細胞での継代後、ウイルス株を、播種およびワクチン産生のためにＦＲ
ｈＬ細胞にさらに適合させた。これは、最終ワクチンロット調製用のさらなる３
〜４代継代物からなる。表１にも列挙した親ウイルス株は、ＤＥＮウイルス複製
許容細胞中での少ない継代数の細胞培養継代物由来であった。

【００３８】ワクチン産生。４つ全ての抗原型用のＤＥＮワクチンを、類似の手順を使用し
てＦＲｈＬ細胞培養において調製した。保存し、予備試験したＦＲｈＬ細胞（試
験結果については表２を参照のこと）を、液体窒素保存から取り出し、１５０ｃ
ｍ^２フラスコ中のイーグル最少培地（ＥＭＥＭ）（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ
Ｗａｌｄｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）（非必須アミノ酸、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、
２％）（ＢｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒＷａｌｄｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、お
よび抗生物質を補足した細胞培地）中にプレートした。フラスコがコンフルエン
トに達した後、培地を取り出し、フラスコに０．０１のＭＯＩに希釈したＤＥＮ
産生種菌を接種して、３２℃で１時間吸着させた。吸着および新鮮なＥＭＥＭ培
地の供給後、フラスコを４日間３２℃に戻した。接種から４日後、全てのフラス
コ由来の培地を捨て、細胞単層を１００ｍｌのハンクスＢＳＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒＷａｌｄｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で３回洗浄した。洗浄後、フ
ラスコを、ＦＢＳの代わりに０．２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ａｌｐｈ
ａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＣｏｒｐ．、ＬｏｓＡｎｇｅｌｓ、ＣＡ）を含
むＥＭＥＭ培地を満たした。３２℃でさらに２日間のインキュベーション後、全
てのフラスコから上清培養液を取り出し、プールした。安全性試験用のサンプリ
ング後、残りの培養培地をプールして、０．４５ミクロンの非タンパク質結合メ
ンブレンフィルターでのろ過によって清澄化した。濾過した液体をプールし、１
５％ラクトースおよび５％ＨＳＡを含む同体積の安定剤と混合した。大量の安定
化した液体を凍結乾燥するまで−７０℃で保存した。最終的なバイアル充填のた
めに、大量の安定化液体を４１℃に急速解凍し、血清バイアルに３ｍｌの体積に
等分した。バイアルのトレイを、Ｈｕｌｌ凍結乾燥機中で−４０℃に凍結し後１
日乾燥させた。キャッピング後、バイアルを管理冷凍室中で−２０℃で保存した
。

【００３９】ワクチン試験。ウイルス調製ならびに種菌およびワクチンロットに使用する全
ての細胞保存物を汚染物質の存在について試験した。試験項目および結果を表２
に列挙する。いかなる産物にも検出可能な汚染物質は見出されなかった。

【００４０】アカゲザルへの接種。雄および雌の成体アカゲザル（６〜１５ｋｇ）を、上腕
への０．５ｍｌの皮下接種によってＤＥＮワクチンロットまたは親ウイルスで免
疫化した。ウイルス単離および抗体試験用の血液を、接種前および接種後毎日１
４日間大腿静脈から採血した。免疫化から３０日後および６０日後にも採血した
。ウイルス攻撃を同様に行った。

【００４１】Ｃ６／３６細胞中での増幅によるウイルスの単離。Ｃ６／３６細胞培養増幅に
よるウイルス単離は、Ｐｕｔｎａｋら，１９９６（Ｊ．ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，
１７４，１１７６-１１８４）に記載されている。簡単に述べれば、サルへ
の接種後、１〜１４日目に毎日血液標本を得た。血清を分離し、−８０℃に凍結
した。血清からウイルスを回収するために、融解血清を細胞培養培地で１：３に
希釈し、これを使用してＣ６／３６蚊細胞の単層を含む２５ｃｍ^２フラスコに接
種した。ウイルスの吸着後、フラスコを、２８℃のＥＭＥＭ維持培地中で維持し
た。７日後、培地を交換し、さらに７日間フラスコに接種した。接種から１４日
後、培養液上清をデカントし、同体積の不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と混合後
に−８０℃で凍結した。その後、凍結標本をプラークアッセイによって接種ウイ
ルスについてアッセイした。

【００４２】

【表１】

【００４３】

【表２】

【表２の続き】

【００４４】

【表３】

【表３の続き】

【００４５】プラークアッセイ。増幅ウイルス血症単離物または直接的なサル血清由来の感
染ウイルスを、Ｓｕｋｈａｖａｃｈａｎａら，１９６６（ＢｕｌｌＷＨＯ
３５、６５-６６）の手順後のアカゲザル腎臓（ＬＬＣ−Ｍｋ_２、ＡＴＣＣＣ
ＣＬ７）細胞におけるプラークアッセイによって滴定した。Ｐｕｔｎａｋら，１
９９６上掲に記載のように、Ｃ６／３６細胞でのアッセイを行った。

【００４６】中和試験。サル血清由来のＤＥＮ中和抗体を、Ｒｕｓｓｅｌｌら，１９６７（
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ９９，２８５-２９０）と類似のプラーク減少中和試験を
用いて測定した。表１に列挙した親ウイルスを使用して、血清標本中のプラーク
５０％減少点（ＰＲＮＴ５０）を測定した。

【００４７】実施例１ＰＤＫ細胞におけるＤＥＮウイルス改変およびワクチンロット産生ワクチン開発用に選択したＤＥＮウイルス株は、ＰＤＫ継代前に種々の継代歴
を有していた。ＤＥＮ−４３４１７５０の場合、ＰＤＫ細胞培養への接種前に
１回のみの蚊での継代である一方で、ＤＥＮ−１ＷｅｓｔＰａｃ７４株は
、ＰＤＫ継代前に２０回のＦＲｈＬ細胞継代歴を有していた（表１）。ＤＥＮ−
３は例外として、全ての株を、少ないＰＤＫ継代数の後に適合させた。ＤＥＮ−
３について、ＰＤＫ細胞にこの株を適合させるために早い継代でウイルス投入量
を増加させるさらなる努力が必要であった。一般的な場合、ＰＤＫ細胞への適合
後、ＤＥＮウイルス力価は１０^４〜１０^５ＰＦＵ／ｍｌの範囲であることが見出
された。力価を増加させる試みは成功しなかったので、ワクチン産生に別の細胞
基質を考慮した。ＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２（ＦＲｈＬ）細胞を、以下のいくつかの
理由によりこの目的に選択した：１）ＤＥＮウイルスはこれらの細胞中でのＤＥ
Ｎワクチンの製造を可能にする約１０^６ＰＦＵ／ｍｌの力価で複製すること、２
）ワクチン細胞基質に関連し得る有害反応を起こすことなく第Ｉ相臨床試験で試
験されたいくつかのＤＥＮワクチン調製用にこの細胞が使用されていること、３
）ＦＲｈＬ細胞（腫瘍形成力を有さないアカゲザル肺二倍体細胞）は正常であり
、逆転写酵素活性および汚染因子が存在しないこと、４）細胞が「正常な」二倍
体細胞であるので、調節性またはワクチン精製の他の要件が存在しないこと、５
）ＦＲｈＬ細胞保存物を、利用可能で低継代細胞から開始するワクチン製造に有
用な細胞世代で確立することができること。従って、ＰＤＫ継代により、選択的
弱毒化の経験的工程を研究する者にとって優れたモデルが得られる。しかし、Ｐ
ＤＫ連続継代を累積する選択工程に使用した途端に、別の細胞基質中でのさらな
る継代によりそれ自身の選択圧が得られる。ＦＲｈＬ継代によりヒトに対してウ
イルスの病原性が増加するのか減少するのかどうかは知られていない。１度だけ
完全に特徴づけられたはずの安定な細胞株の使用が魅力的である。しかし、ＦＲ
ｈＬ細胞を用いた公開実験により、これらの細胞はＰＤＫにおける連続継代中に
獲得される生物学的性質を無効にするか不安定にすることができることが示唆さ
れる（Ｈａｌｓｔｅａｄら，１９８４，ＡｍＪＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ
３３，６５４-６６５；Ｈａｌｓｔｅａｄら，１９８４，ＡｍＪＴｒｏｐ
ＭｅｄＨｙｇ３３，６６６-６７１；Ｈａｌｓｔｅａｄら，１９８４，
ＡｍＪＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ３３，６７２-６７８；Ｈａｌｓｔｅ
ａｄら，１９８４，ＡｍＪＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ３３，６７９-６８
３；Ｅｃｋｅｌｓら，１９８４，ＡｍＪＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ３３
，６７９-６８３）。

【００４８】ＦＲｈＬへのＰＤＫ継代ウイルスの適合は、ＤＥＮウイルスの全ての株で一様
に成功し、ＰＤＫ継代に依存しなかった。ＦＲｈＬの第１回〜第４回継代の回収
物由来のウイルス力価は、１０^５〜１０^６ＰＦＵ／ｍｌの範囲であった。第３回
〜第４回ＦＲｈＬ継代までに、全てのＤＥＮ株セットウイルスのワクチンロット
を調製し、表２に列挙のように試験した。また、ＦＲｈＬ細胞保存物試験ならび
にマスターシードおよび産生種菌試験についてのデータを表２に示す。安全性お
よび汚染していないことを保証するために必要なこれらの試験結果は負であるか
、許容される規格内で低下する。ＤＥＮ−４３４１７５０ＰＤＫ−２０産生
種菌については、サル神経毒性試験を行った。この研究の結果は、Ｈｏｋｅ，１
９９０（ＡｍＪＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ４３，２１９-２２６）に見出す
ことができる。ＤＥＮ−４産生種菌ならびに比較に使用したＤＥＮ−４親ウイル
スは神経病理性ではなかった。この実験ならびにＤＥＮサル神経毒性の他の試験
に基づくと、残存する候補ＤＥＮワクチンが神経毒性について評価する必要があ
るかどうか疑わしい（私信）。

【００４９】実施例２ＰＤＫ継代ＤＥＮウイルスを接種されたアカゲザルＰＤＫ細胞中で継代され、「株セット」と示したＤＥＮウイルスの感染力を、
各抗原型の改変されていない親ウイルスと比較した。表３は、サルの感染力の程
度を接種から２週間後に連続的に採取した血清に認められるウイルス血症の日数
によって測定するこれらの研究の結果を列挙する。サルへの親ウイルスの接種に
より、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、およびＤＥＮ−４を接種した３〜
４匹のサルの群でそれぞれ平均６．８、５、３、および４．７日目にウイルス血
症に罹患した。ＤＥＮ−２親については、測定可能なウイルス血症の感染は類似
のサルおよび単離技術を用いて非常に長期間再生可能であるというさらなるデー
タ（示さず）を実証した。不運にも、サル血清におけるウイルス力価についての
データは一部しか存在しない。存在するデータのほとんどは、サルウイルス血症
の血液を蚊の細胞培養で滴定したＤＥＮ−２親ウイルスを用いた実験由来である
。接種から４〜８日目後のウイルス力価のピークは、血清の１０^５ＰＦＵ／ｍｌ
に達する力価であった（Ｐｕｔｎａｋら，１９９６、上掲）。

【００５０】各株セットについて、ウイルスのサルへの感染能力の減少に示されるように、
ＰＤＫ継代によりＤＥＮウイルスが改変される。いくつかの株セットについて、
これは、最も多数のＰＤＫ継代でのウイルス血症の完全な喪失によって明確に証
明された。ＰＤＫの第２７回継代のＤＥＮ−１でのサルの接種により、４匹のサ
ルが０日目にウイルス血症を罹患した。これは、試験した全部で５６の出血由来
の単離物に翻訳されなかった。ＤＥＮ−３ＰＤＫ−２０およびＰＤＫ−３０で
類似の結果が認められた。このウイルスのＰＤＫ−３０では、サルの感染力の証
拠は喪失していた。すなわち、１０^６ＰＦＵのウイルスで接種したサルにおいて
ウイルス血症および抗体陽転の証拠も認められなかった。ＤＥＮ−２株は、サル
の感染力の改変を達成するために多数回のＰＤＫ継代を必要とした。このウイル
スでは、ウイルス血症を低減させるためにＰＤＫ細胞培養で少なくとも４０回の
継代が必要であった。この実験と対照的に、ＤＥＮ−４３４１７５０株は、サ
ル感染の改変に６回のＰＤＫ細胞での継代しか必要ではなかった。別のＤＥＮ−
１株である１００９では、親ウイルスと比較した場合、５０回のＰＤＫでの継代
でさえサル感染の改変の証拠は認められなかった（データ示さず）。結論として
、ＰＤＫ細胞継代は、ウイルスＤＥＮ単離物の改変および弱毒化の有効な経験的
方法であるようである。これは、ＰＤＫ複製に適切であるがマウスおよびヒトに
おける標的細胞の複製に必ずしも適切ではないウイルス集団についての選択圧が
おそらく存在するＤＥＮの不自然な宿主である。

【００５１】ヒトにおける候補ワクチン研究用の材料と方法。ボランティア。１８〜４５歳の健常な男性および女性のボランティアを試験し、
試験パネル（血液化学、血液学、プロトロンビン時間、部分的トロンボプラスチ
ン時間、尿検査、急速レアギン血漿抗体、ならびにＢ型肝炎表面抗原およびＨＩ
Ｖ抗体の血清学を含む）によってスクリーニングした。ボランティアを、持続的
で有意な異常性またはポジティブ試験に基づいて排除した。女性のボランティア
は、ワクチン接種の４８時間以内に妊娠検査が陰性で、ワクチン接種から３ヶ月
間従来の避妊法を用いて妊娠を回避するという同意書に快く署名した場合に参加
資格がある。さらに、デング熱ワクチンに応答に影響を与え得るフラビウイルス
免疫を以前に有するか（Ｓｃｏｔｔ、１９８３、ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ、１４
８、１０５５〜１０６０）、ネオマイシン、ストレプトマイシン、またはゲンタ
マイシンに対するアレルギー歴を有する場合、ボランティアを排除した。以前の
フラビウイルス免疫を、デング熱１〜４型、日本脳炎、または黄熱病に対する検
出可能な血液凝集阻害抗体を有さないか（１：１０血清希釈で）、黄熱病ワクチ
ンまたはフラビウイルス感染歴を有さないと定義する。

【００５２】ボランティアは臨床試験の全ての態様の知識を試験するように設計された筆記
試験で７０％以上の点数を取った。その後、米国連邦法施行規則第２１巻パート
５０（ヒト被験体の保護）に従って各ボランティアからインフォームドコンセン
トを得た。臨床プロトコールは、関連する全ての規制要件（ヘルシンキ宣言（プ
ロトコール）、ならびに陸軍規則７０−２５（研究被験体ボランティアの使用）
および４０−７（ヒトにおける治験薬の使用）およびスケジュールＩ規制物質の
使用を含む）に準拠する。この研究は、ヒト被験体研究検閲局、一般外科医事務
局、米国陸軍、ＷＲＡＩＲヒト研究委員会、施設内審査委員会、メリーランド大
学バルチモア校に承認されている。

【００５３】研究ワクチン。研究ワクチンを、表４に列挙する。ワクチンウイルスを、初代
イヌ腎臓細胞で繰り返し継代し、最後の３継代をアカゲザル胎児肺（ＦＲｈＬ）
連続二倍体細胞培養物で継代して、種菌およびワクチンを調製した。ボランティ
アでの試験前に、各候補を、ワクチン接種アカゲザルにおいて野生型親ウイルス
と比較して実質的に減少したウイルス血症惹起することを確認した。アカゲザル
の感染によって測定された適切な弱毒化は、デング熱ウイルス株がヒト試験用の
適切なワクチンであることを示した。

【００５４】免疫化の直前に、注射用に凍結乾燥ワクチンのバイアルを滅菌水で再構成した
（ＵＳＰ）。免疫化後、再水和ワクチンの未使用部分を氷上で保存し、４時間以
内にＬＬＣ−ＭＫ_２（細胞単層）において滴定した（Ｓｕｋｈａｖａｃｈａｎａ
ら，１９６６，ＢｕｌｌＷＨＯ３５，６５〜６６）。注射する候補ワクチン
に依存して、１．０×１０^５と４．５×１０^６ｐｆｕとの間のウイルスを各ボラ
ンティアに投与した（表４）。各研究ワクチンの継代歴を以下にまとめる。

【００５５】

【表４】

【００５６】デング熱１型４５ＡＺ５ワクチン。ＤＥＮ−１ＷｅｓｔＰａｃ７４株を
、１９７４のナイル島でのヒトのＤＥＮ熱から単離した。単離物をＦｒｈＬ細胞
培養において２０回継代し、ワクチンロットを調製した。継代には、弱毒化して
ヒトワクチン接種に適切なウイルスを回収するための変異誘発およびプラーク選
択が含まれる。２人のヒトボランティアのワクチン接種後、ボランティアの１人
のＤＥＮ疾患により、ワクチン使用の中止を決定した。ワクチンを、ＰＤＫおよ
びＦｒｈＬ細胞培養における継代によってさらに弱毒化した。現在の候補ワクチ
ンは、ＤＥＮ−１４５ＡＺ５ＰＤＫ−２０である。

【００５７】デング熱２型Ｓ１６８０３ワクチン。デング熱２型Ｓ１６８０３ウイルス株は
、デング熱患者由来のタイウイルス単離物由来であった。ウイルスを全部で５０
回のＰＤＫ継代に供し、種菌およびワクチン産生用に最後の継代をアカゲザル胎
児肺二倍体細胞（ＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２）において行った。２つのワクチン候補
を最初に調製して試験について選択した。同一のデング熱２型患者のＳ１６８０
３ウイルス株由来の別のワクチン候補をＷＲＡＩＲで開発し、ＳｌａｋＩｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ（Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ、ＰＡ）によって第４０回継代レベルで産
生した。

【００５８】デング熱３型ＣＨ５３４８９ワクチン。デング熱３型ＣＨ５３４８９ウイルス
株は、初代ミドリザル腎臓（ＰＧＭＫ）での最初の継代後に初代イヌ腎臓（ＰＤ
Ｋ）細胞で３０回継代したタイ株由来である。１０回、２０回、および３０回の
ＰＤＫ継代由来のウイルスを使用して、アカゲザル胎児肺二倍体細胞培養物に接
種した。

【００５９】デング熱４型３４１７５０カリブワクチン。デング熱４型ワクチン候補は、ハ
ワイ大学で継代され、ＷＲＡＩＲで生産したデング熱４型のカリブ株（Ｃｏｌｕ
ｍｂｉａ，１９８２）由来である（Ｍａｒｃｈｅｔｔｅ，１９９０，Ａｍ
ＪＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ４３、２１２-２１８）。親ウイルスに対する
抗体は、Ｈ−２４１（プロトタイプ株）を含む他のデング熱４型株を中和する。
ヒト単離物の弱毒化を、初代イヌ腎臓（ＰＤＫ）細胞培養における２０回継代に
よって行った。

【００６０】研究デザイン。標準的な無作為単純盲検入院患者臨床プロトコールを予備実験
に使用した。研究の大部分を、メリーランド大学バルチモア校（ＭＤ）のワクチ
ン開発センターで行った。デング熱２型Ｓ１６８０３ＰＤＫ４０ワクチンおよ
びデング熱４型ＣＨ３４１７５０ＰＤＫ２０ワクチンの予備研究を、米国陸
軍感染症研究所（ＵＳＡＭＲＩＩＤ）の医薬部門で行った。

【００６１】ワクチンの最初の臨床研究では、特定の株の最も利用可能な継代を３人のボラ
ンティアで最初に試験した。症状を３週間綿密に監視し、ボランティアが健康を
維持している場合、次に少ない継代数で試験した。１人または複数のボランティ
アが発症した場合、より少ない継代数ほどより弱毒化されていないと推定される
ので、より少ない継代数のワクチン株での試験を行わなかった。３人のボランテ
ィアでの許容継代レベルの試験後、発症しない最も少ないレベルを、７人までの
さらなるボランティアにおけるさらなる試験用に選択した。

【００６２】注意深く観察し、外部からの感染症への暴露を予防し、病毒媒介昆虫である蚊
の感染可能性を防止するために、接種３日前から免疫化から２０日後までボラン
ティアを研究病棟に監禁した。重症度またはワクチン接種に関連すると考えられ
るかどうかにかかわらず、各ワクチン投与後のこの期間内に起こった全ての有害
事象を記録した。ワクチンの許容可能な安全性を、以下の重篤な有害事象が存在
しないことと事前に定義した：ワクチン接種と無関係の診断によって説明されな
い任意の重篤な臨床疾患；持続的発熱（測定した４人の舌下温度が２４時間３８
．５℃以上、さらに最大日中舌下温度が３日間連続して３８．５℃以上、または
任意の測定個体の体温が４０℃を超える）；２連続測定において、血小板減少症
（１００，０００血小板／ｍｍ^３未満）または白血球減少症（全体好中球数が１
０００個未満）；または説明できない３日以上連続して正常レベルよりも４倍を
超える血清アミノアラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル。さらに、ワク
チン使用に関連し得る任意の有意な副作用が示唆される任意の経験を重症事象と
して記録した。

【００６３】０日目に０．５ｍｌのワクチン原液をボランティアに皮下接種した。免疫化後
、６時間ごとに生命徴候を記録した。注射部位を試験し、紅斑の最大直径および
硬結を毎日測定および記録した。免疫化から最初の２０日間、臨床徴候（発熱（
３７．８℃以上）、発疹、嘔吐、点状出血、ならびに肝臓および脾臓肥大）およ
び症状（倦怠感、頭痛、筋肉痛、関節痛、悪心、眼痛または輝所恐怖症）を評価
した。症状を軽症（症状を示すが病棟での活動を継続できる）または重症（症状
によって病床に就かされる）の等級をつけた。ボランティアからの要求があれば
、有痛性症状を塩酸プロポキシフェンで治療したが、解熱剤を使用しなかった。
標準的な症状のチェックリストおよび身体所見によって、所見を記録した。２１
日目に、ボランティアを研究病棟から退院させ、血清学的研究のために接種から
１、６、１２、および２４ヶ月後に帰ってくるように要求した。

【００６４】２人の健常なフラビウイルス免疫ボランティアを、ＵＳＡＭＲＩＩＤにてデン
グ熱１型４５ＡＺ５ワクチンの親株で免疫化し、２年後にデング熱３型ＣＨ５３
４８９ワクチンの親株で免疫化した。研究の診療記録を、以下の徴候および症状
の有無について再調査した：発熱、発疹、倦怠感、頭痛、筋肉痛、関節痛、およ
び眼痛または輝所恐怖症。ウイルス血症を毎日測定した。この試験と対照的に、
症状を系統的に記録せず、症状の強度を等級付けなかった。さらに、後の研究中
にＵＳＡＭＲＩＩＤにて８人のボランティアに投与したデング熱４型３４１７５
０カリブＰＤＫ２０での臨床経験を抽出し、現在のワクチン接種者と比較してま
とめた（Ｈｏｋｅ、１９９０、前出）。

【００６５】実験室評価。一日おきにボランティアから採血し、３１日目に日常的に利用可
能な医学的試験（ヘモグロビンおよびヘマトクリット、微分計数による白血球数
、血小板数、ならびにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およ
びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度）を行った。さらに、ウイ
ルス単離および抗体研究用に２０日間一日おきに採血した。血液（２０ｍｌ）は
４℃で２時間以内に凝血し、血清を１ｍｌアリクオットにデカントし、凍結して
研究するまで−７０℃で保存した。

【００６６】ウイルスの単離。デング熱ウイルス血症を定量するために、血清を解凍し、Ｃ
６／３６蚊細胞単層上に接種し、２８℃で１４日間にわたりインキュベートした
。上清培養液採取物をＬＬＣ−ＭＫ_２細胞上でのプラーク・アッセイ（Ｓｕｋｈ
ａｖａｃｈａｎａら，１９６６，ＢｕｌｌＷＨＯ３５，６５-６６）によっ
てウイルスのアッセイを行った。血清中のウイルス量を定量するために、プラー
ク・アッセイをヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）蚊細胞（
Ｈｏｋｅ，１９９０、上掲）。細胞培養フラスコに血漿の希釈溶液を接種し、
３５℃、１〜２時間にわたって吸着させた。ハンクスの平行塩類溶液と、０．７
５％アガロース、５％ラクトアルブミン加水分解産物、０．１２ＭＮａＨＣＯ_３、及び抗体とからなるオーバレイ・メジウムを添加し、さらに全フラスコを３５
℃でインキュベートした。７日後、フラスコを５％液体ニュートラルレッドで３
〜５時間染色した。過剰の染料を除去し、１８時間後にプラークを読み取った。

【００６７】血清学。ＥＬＩＳＡ、ＨＡＩ、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を含む抗体
試験を、試験しているワクチンの株と同一の血清型のデング熱ウイルスを用いて
行った。抗デング熱ＩｇＭ抗体の検出は、ＥＬＩＳＡに変更を加えたものによっ
て実施し、ＯＤ単位が０．１０未満の場合を陽性と見なした（Ｉｎｎｉｓ，１
９８９、上掲）。ＨＡＩ試験は、阻害剤を取り除くためにアセトン抽出した血清
を用い、個々の抗体を４〜８単位使用する微小容量に修正した標準的な技術によ
って実施した（ＣｌａｒｋｅａｎｄＣａｓａｌｓ，１９５８，ＡｍＪ
ＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ７，５６１-５７３）。ＰＲＮＴアッセイは、
Ｒｕｓｓｅｌ他によって記載された方法（Ｒｕｓｓｅｌｌ，１９６７、上掲）
によって実施した。

【００６８】統計学的分析。デング熱２ワクチンＳ１６８０３（ＰＤＫ３０、４０及び５０
）及びデング３ワクチンＣＨ５３４８９（ＰＤＫ１０及び２０）について、トレ
ンド及びスピアマンの相関についてのコクラン−アルミタージュ検定を用い、継
代レベルと反応遺伝性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の頻度及び苛酷性との
関係をそれぞれ分析した。個々に分析した症状及び徴候には、眼症状、頭痛、倦
怠感、筋肉痛、関節痛、発疹及び熱（温度＞３７．８℃）の有無及び日数が含ま
れていた。より高いＰＤＫレベルはより低い反応遺伝性には関連していなかった
いう帰無仮説は、５％の確率で評価された。データの検査によって、各ウイルス
に対する最適な継代レベルが各ボランティアの臨床的及び免疫学的応答に基づい
て決定される。米国陸軍研究及び開発指令のフラビウイルス・ワクチン運営委員
会（Ｕ．Ｓ．ＡｒｍｙＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｍｍａｎｄ'ｓＦｌａｖｉｖｉｒｕｓＶａｃｃｉ
ｎｅＳｔｅｅｒｉｎｇＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）によってさらに開発するために
、許容できないような副作用を生ずることはないがボランティアの約８０％を免
疫する継代レベルが選択された。

【００６９】ワクチンによる感染の定義。ワクチンによる感染は、ボランティアでのデング熱ウイルスの複製として定義
され、免疫後の血清型特異的中和抗体又はＩｇＭ抗デング抗体の存在によって検
出される。ウイルス血症は、抗体応答がない場合には決して検出されないことか
ら、感染診断にとって必須のものとして含まれなかった。ワクチン失敗は、許容
できない臨床上の副作用、或いは回復期ＩｇＭ又はＰＲＮＴ抗体産生不良として
定義される。

【００７０】実施例３弱毒化デング熱ワクチンに対する臨床応答デング熱２型Ｓ１６８０３ワクチンＰＤＫ細胞の継代５０回目から産生されたデング熱２株Ｓ１６８０３ウイルス
を３人のボランティアで試験した。ボランティアは健康であって、口腔温が３８
．０℃を超えなかった。３人のボランティアのうち２人は、倦怠感、頭痛、及び
眼症状（眼痛又は輝所恐怖症）を有していた。研究室で得られた知見として、ボ
ランティア３人のうち２人に軽いＡＬＴ上昇（＜２×正常値）と３人のうち１人
に軽い白血球減少症が含まれた。ＰＤＫ５０ワクチンの許容安全安全プロフィー
ルを理由として、利用可能性が次に低い継代、ＰＤＫ３０が臨床評価のために選
択された。

【００７１】１０人の被験者で試験されたＰＤＫ３０ワクチンは、弱毒化が不十分であり、
かつデング熱の緩和と両立する症状を生じた。４人のボランティア（４０％）で
、ワクチン後９〜１４日間、Ｔｍａｘ３８．５℃までの低度の発熱が生じた（中
央日１２）。８０％が発疹が生じた。ボランティアの過半数が眼症状（１０／１
０）、頭痛（９／１０）、及び倦怠感（９／１０）を経験し、７０パーセントが
頭痛、眼痛及び輝所恐怖症、倦怠感、又は筋肉痛の重度の症状を１つ以上有した
。３人のボランティアは、肝臓病理学の尺度、アラニンアミノトランスフェラー
ゼ（ＡＬＴ）の軽い上昇を呈した。

【００７２】ＰＤＫ３０ワクチンがボランティアでさらに試験するにはあまりにも反応遺伝
的であると思われたことから、ＰＤＫ４０ワクチンはマスターシードから生成し
た。ＰＤＫ４０を接種した３人のボランティアのうち２人にワクチン後、低度の
発熱（＜３８．１℃）、発疹、筋肉痛、及び頭痛を伴った穏やかなデング熱様の
症状が９〜１０日間生じた。症状は、障害や投薬の必要性が無く数日間にわたっ
て自然に解消された。症状に伴ったものは、血清肝臓酵素の思いも寄らない上昇
であり、１人は最大ＡＬＴ値が１９９ＩＵ／ｍｌ（正常値の４倍）であり、他は
最大ＡＬＴ値が７７ＩＵ／ｍｌ（正常値の１．５倍上昇）であった。第３のボラ
ンティアは、無症状のままではあったが、ＡＬＴが２倍に上昇した（最大１０^２まで）。実験上の異常の全ては、インターベンションを生ずることなく数日で解
消し、全てのボランティアがワクチン接種後２１日で良好な健康状態で退院した
。ＰＤＫ４０ワクチンに関連した肝炎現象の異常な頻度のため、製品に対するさ
らなる開発は何ら計画されていない。

【００７３】

【表５】

【００７４】

【表６】

【００７５】

【表７】

【００７６】

【表８】

【００７７】表５は、ＷＲＡＩＲデング熱２ワクチンによる初期臨床体験をまとめたもので
ある。

【００７８】発熱及び発疹の徴候の頻度が減少したことは、継代レベル３０及び５０のワク
チンの間で明らかである。さらに、継代が増加するのに伴って口腔温度がＴｍａ
ｘ３８．５℃から正常に向けて減少しているが、１日を超える発熱の持続期間に
変化はない。デング熱２ワクチンでは、眼症状、発疹、頭痛、倦怠感、及び筋肉
痛の頻度及び持続時間は継代レベルに著しく関連していた。

【００７９】デング熱３型ＣＨ５３４８９ワクチン。ＷＲＡＩＲで開発されたデング３ワク
チン（ＣＨ５３４８９、ＰＤＫ０）を２人の健康な黄熱免疫男性ボランティアに
対して２×１０４ｐｆｕのウイルスの０．５ｍｌ皮下接種による投与を行った。
免疫接種直後の経過は、何ら問題が生じなかった。６日目まで、両方のボランテ
ィアとも高熱、寒気、筋肉痛、頭痛、倦怠感、及び紅斑性湿疹によって特徴付け
られる中等度に重症なデング熱にかかった。両方のボランティアは、血小板減少
及び白血球減少が生じたが、出血熱の徴候はなかった。５日間で終わった発熱期
後、両方の男性ともに急激に回復し、２１日目まで健康であった。両被験者によ
って体験された重症疾患であることから、この継代レベルでのさらなる試験は行
わなかった。続いて、ＰＤＫ１０及びＰＤＫ２０継代レベルをワクチン候補とし
て準備した。

【００８０】ＰＤＫ２０ワクチンを６人のボランティアに与えたところ、穏やかな反応遺伝
性が得られた。１人の被験者は、３日目で一過性の発熱（Ｔｍａｘ３８．２℃）
による初期熱病、咽頭炎、及び頚部リンパ管炎を経験した。デング熱ウイルスは
ボランティアの血清からは単離されなかった。この被験者は、ワクチン接種とは
直接関係していない発熱による介入疾患にかかったように感じた。発疹無しの短
期間の軽度デング熱症状が生じた６人のボランティアのうち４人にとって、関節
痛、眼痛、及び頭痛が最も頻繁な病訴であった。しかし、１人のボランティアは
、３日間にわたって頭痛、筋肉痛、及び眼痛の症状がよりいっそう重かった。彼
はまた白血病減少を生じ、ＡＬＴレベルの上昇が持続し、これらの実験上の異常
は３１日目での経過観察では解消した。別のボランティアは、ＡＬＴのみが正常
値の２倍よりも少なく、穏やかに、かつ可逆的に増大した。ＰＤＫ２０ワクチン
は、かろうじて許容される反応遺伝性によって安全であることから、次に最も低
い利用可能な継代ワクチンウイルス（ＰＤＫ１０）を試験した。

【００８１】ＰＤＫ１０ウイルスは、レシピエントにおいてかなり反応遺伝的であることが
わかった。３人のボランティアのうちの１人は、低度の発熱を１０日目及び１１
日目に生じ（Ｔｍａｘ３８．３℃）、また１３日目に鮮紅色の発疹を生じた。他
のボランティアは、ワクチン接種後６乃至９日目に漸増−漸減じんま疹に関連し
た持続性のそう痒を生じ、さらに敏感な頚部リンパ節及び腋窩リンパ節を生じた
。続いて、彼は１０乃至１２日目に倦怠感、頭痛、及び筋肉痛を生じた。このボ
ランティアは、ワクチンに対して特異体質性アレルギー反応を有したかもしれず
、その後に典型的なデング熱様の疾患が生じた。これら２人のボランティアもま
た白血球減少及び＜２×正常値のＡＬＴレベルの上昇という実験上の異常を示し
、３１日目での経過観察で解消した。

【００８２】表６は、デング熱３ＣＨ５３４８９ワクチンに対する応答をまとめたものであ
る。継代に伴って徴候及び症状がより少ない頻度、かつより短い持続期間となる
傾向にあったが、いずれの分析においても統計的有意性に達した継代は無かった
。

【００８３】デング熱４型３４１７５０ワクチン。８人のボランティアが１０^５ＰＦＵのＰ
ＤＫ２０ワクチン（Ｈｏｋｅ、１９９０上掲）を受けた。５人のボランティアに
かろうじて目につく黄斑、白化発疹、及び最小限の体温上昇（最大３８．１℃）
が生じた。ウイルス血症及び抗体応答もまたこれら５人のボランティアで生じた
（６３％）。

【００８４】新規のＤＥＮ−４３４１７５０候補ワクチンをＰＤＫ継代１５から調製し、
継代が少なければそれだけ感染性が高いと予想された。３人のボランティアがこ
のワクチンを受け、２人が最小限の症状を体験した。３人目のボランティアは８
日目に突如、発熱、顔及び四肢の浮腫、重度の倦怠、発疹、眼痛、輝所恐怖症、
及び関節痛となった。次の３日間にわたって、発熱が３９．６℃のＴｍａｘで続
いたが、徴候及び症状は自然に消えた。ワクチンのこのような重い副作用のため
、ＰＤＫ−１５ワクチンのさらなる使用を終えて、ＰＤＫ−２０をさらなる評価
のために選択した。

【００８５】実施例４ウイルス血症及び弱毒化デング熱ワクチンに対する免疫応答表７は、ＷＲＡＩＲデング熱ウイルスによるウイルス血症及び免疫応答を示す
。個々のワクチンの感染性を以下にまとめる。

【００８６】デング熱２型Ｓ１６８０３ワクチン。ＰＤＫ５０ワクチンのレシピエントでは
ウイルス血症を生ずるものがなかったが、３つのうちの２つは６０日目まで力価
の低い中和抗体を生じた。これらの知見によれば、ワクチンウイルスはヒトに対
する感染性が減少した。それに対して、３つのデング熱２型ＰＤＫ４０ワクチン
は明確なウイルス血症を示し、ワクチン接種後に全てが高力価の抗体が生じた。
予想通り、デング熱２ＰＤＫ３０ワクチンの感染性が最も高かった。すなわち、
１０人のボランティア全員にウイルス血症が検出され、全被験者が６０日目まで
＞１：６０の中和抗体力価による血清変換した。

【００８７】デング熱３型ＣＨ５３４８９ワクチン。温度感受性を保持し、かつワクチンウ
イルスの小プラーク表現型を保持するデング熱３ウイルスは、デング熱３ＰＤＫ
０ワクチンの２人の黄熱病免疫レシピエントにおいて６及び７日間で回収された
。続いて、高力価の二次感染様交叉反応性を持つ赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）抗体
とＰＲＮＴ５０とを両方のボランティアから３０日目及び６０日目に採取された
血清で測定した。感染性は、デング熱３ＰＤＫ１０弱毒化ワクチンを受けた被験
者の場合と類似した。すなわち、３人のうち２人がウイルス血症を生じ、ワクチ
ンによって中和抗体が全ての場合において誘導された。それとは対照的に、デン
グ熱３ＰＤＫ２０ワクチンを接種した６人のうち２人が検出可能なウイルス血症
を示し、３人のボランティアがその後血清変換し、感染性の減少が反映された。

【００８８】デング熱４型３４１７５０ワクチン。８人のボランティアが１０^５ＰＦＵのＰ
ＤＫ２０ワクチンを受け、さらにウイルス血症及び抗体応答が５人（６３％）に
生じた。この候補、ＰＤＫ１５の下位継代から調製したワクチンは、よりいっそ
う感染性が高かった。ウイルスは、１５ｐｆｕ／ｍｌの最大力価でワクチン接種
後８及び１０日目に１人のボランティアから単離した。このボランティアでは、
引き続いて二次ＨＡＩ応答による４５０の中和抗体力価が生じ、以前にセントル
イス脳炎ウイルスに曝されたことがわかった（ワクチン接種前のＰＲＮＴ力価１
：２０）。検出可能なウイルス血症が認められない２人のボランティアは、ワク
チン接種後３０日目で中和力価１：１０及び１：４０を生じた。

【００８９】実施例５候補ワクチンの選択各血清型に対するワクチンの顕著な特徴を列挙した表８に、ＷＲＡＩＲＰＤ
Ｋ弱毒化ワクチンの安全試験の拡大プログラムが示されている。ＰＤＫ継代の増
加は、ボランティアあたりの症状の持続期間及び数を推定する平均罹病スコアの
減少をもたらす。また、デング熱４ワクチンを除いて、ＰＤＫ継代の増加はウイ
ルス血症の平均日数の減少にも関連した。試験したデング熱２、３、及び４ワク
チン、すなわちデング熱２ＰＤＫ５０、デング熱３ＰＤＫ２０、及びデング熱４
ＰＤＫ２０の場合、１つの継代レベルが安全と判断され、かつ許容可能に反応遺
伝的であり、さらに拡大した臨床研究に適した。しかし、感染したレシピエント
の比率は、ＰＤＫ継代レベルの増加に伴って減少した。中和抗体力価≧１：１０
として定義された血清変換は、範囲の広い信頼区間内で同様に減少した。

【００９０】議論ＷＲＡＩＲは、弱毒化デング熱生ワクチンの開発に長年関わっている。ＷＲＡ
ＩＲ及びマヒドール（Ｍａｈｉｄｏｌ）デング熱ワクチンプログラムは両方とも
イヌ腎臓（ＰＤＫ）細胞でのいくつかの継代（組織培養における繰り返し増殖）
によっていくつかの生ワクチンを開発した。少数のボランティアによるパイロッ
ト試験の結果は、ＷＲＡＩＲ候補ワクチンの安全性を確立した。６５人のレシピ
エントの中で、重大な損傷を受けて緊急治療を要するボランティアはいなかった
。３人のボランティアがデング熱ワクチンに関連した一過性の特異体質的反応を
被ったことから、彼らが受けたワクチンのさらなる臨床開発を取りやめた。低弱
毒化ワクチンによる実験的感染は、不快感がある一方で、許容できるものであっ
た。

【００９１】臨床実験は、ワクチンウイルスのＰＤＫ継代の増加によって、ボランティアに
対する弱毒化が高まることを示した。この効果はデング熱１及びデング熱３ウイ
ルスで最も良く視られ、親の継代していないウイルスは変更されていないデング
熱、及びさらにそれに続く２０ＰＤＫ継代許容性反応遺伝性をもたらす。しかし
、ＰＤＫの継代が増加するとワクチンウイルスの感染性が減少し、免疫原性の低
下をもたらした。さらに、ヒトにおけるワクチンウイルスによるウイルス血症の
減少は、アカゲザルにおけるそれらのものと関連しているように見える（デング
熱４ＰＤＫ１５を除く）。これらの知見は、ボランティアにおける弱毒化デング
熱ウイルスワクチンの感染性が免疫原性と等価であることを示唆している。継代
レベルと反応遺伝性との関係は、注意して解釈されなければならず、なぜなら１
つの症状を経験した被験者はいくつかの症状を経験する可能性が高かったからで
ある。我々の分析方法がこれらの症状の独立性を仮定するので、独立ｐ値に基づ
いた解釈は取るに足りない。さらに、我々は発疹が継代レベルと強い関連を示し
たと信じる（存在に対して独立ｐ＝０．００９、持続時間に対してｐ＝０．０１
）。このことは、デング熱２又は３ワクチンのいずれかについて、発疹と他の症
状との間の顕著な相関の欠如によって増強される（スピアマンの試験）。

【００９２】許容可能な安全性プロフィールを持つワクチン、すなわちデング熱１４５Ａ
Ｚ５ＰＤＫ２０、デング２Ｓ１６８０３ＰＤＫ５０、デング熱３ＣＨ５３４
８９ＰＤＫ２０、及びデング４３４１７５０ＰＤＫ２０のみが拡張臨床試
験に対して選択される。ボランティアが少数であることによって血清変換におけ
る信頼区間が幅広くなるため、次の研究は４つの選択されたワクチンの各々のレ
シピエントの数を増すことが求められた。また、さらなる試験は、それらの弱毒
化ワクチンの免疫原性がそれらの研究で使用された単一用量のかわりに２用量の
投与によって追加免疫するかどうかを決定することが求められよう。

【図面の簡単な説明】

【図１】ワクチン投与の結果としての１度を超える症状の発生を示す図で
ある。

【図２】抗原型による反応遺伝性の分布頻度を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者プトナク，ジョゼフ，アール．アメリカ合衆国メリーランド州 20910，シルバースプリング， 16番ストリート 8201 (72)発明者イニス，ブルース，エル．アメリカ合衆国ペンシルヴェニア州 19041，ハーヴァーフォード，ニューガルフロード 516 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA95X BA14 BA24 CA45 4C085 AA03 BA61 CC01 DD01 DD21 EE01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】デング熱ウイルスを複製して高力価増殖にするための方法で
あって、前記高力価増殖株によって連続細胞株からの細胞を感染させるステップ
を有し、前記細胞株は前記細胞がほ乳類ウイルスワクチン産生について証明され
るのに適した範囲で外来因子が欠けていることを特徴とする方法。
【請求項２】前記デング熱ウイルスは、デング熱１、デング熱２、デング
熱３、及びデング熱４からなる群から選択されることを特徴とする請求項１の方
法。
【請求項３】前記細胞は上皮細胞又は線維芽細胞であることを特徴とする
請求項１の方法。
【請求項４】前記細胞はベロ細胞であることを特徴とする請求項３の方法
。
【請求項５】前記ベロ細胞は継代回数が２０〜１９０であることを特徴と
する請求項４の方法。
【請求項６】前記デング熱ウイルスは弱毒化されていることを特徴とする
請求項２の方法。
【請求項７】免疫原性組成物であって、生理学的に許容されるベヒクル内
に、請求項１の方法によって産生されたデング熱１、デング熱２、デング熱３、
及びデング熱４からなる群から選択される１つの弱毒化デング熱ウイルスを含む
ことを特徴とする組成物。
【請求項８】弱毒化デング熱ウイルス生ワクチンであって、請求項１の方
法によって産生されたデング熱１、デング熱２、デング熱３、及びデング熱４か
らなる群から選択されるデング熱ウイルス血清型の任意の組み合わせを有するこ
とを特徴とするワクチン。
【請求項９】前記デング熱１がＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６４８の４５ＡＺ５
であることを特徴とする請求項８のワクチン。
【請求項１０】前記デング熱２がＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６５３のＳ１６８
０３であることを特徴とする請求項８のワクチン。
【請求項１１】前記デング熱３がＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６４７のＣＨ５３
８９であることを特徴とする請求項８のワクチン。
【請求項１２】前記デング熱４がＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６５２の３４１７
５０ＰＤＫ２０であることを特徴とする請求項８のワクチン。
【請求項１３】デング熱１がＡＴＣＣ番号ＶＲ２６４８の４５ＡＺ５Ｐ
ＤＫ２０、デング熱２がＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６５３のＳ１６８０３ＰＤＫ５
０、デング熱３がＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６４７のＣＨ５３８９ＰＤＫ２０、及
びデング熱４がＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６５２の３４１７５０ＰＤＫ２０である
ことを特徴とする請求項８のワクチン。
【請求項１４】前記デング熱ウイルスは、脊椎動物細胞で産生されること
を特徴とする請求項８のデング熱ウイルスワクチン。
【請求項１５】前記細胞はベロ細胞であることを特徴とする請求項１４の
デング熱ウイルスワクチン。