KR100721745B1 - 다가 뎅기 바이러스 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약독화된 뎅기 바이러스의 백신 조성물을 제공한다. 더욱 구체적으로는, 약독화된 바이러스는 PDK 세포내에서 연속 계대에 의해 생산된다. 또한, 본 발명은 약독화된 뎅기-1, 뎅기-2, 뎅기-3 및 뎅기-4 바이러스의 투여에 의해 개체의 면역 시스템을 자극하여, 모든 4 개의 뎅기 바이러스 혈청형에 대항하는 보호를 유도하는 방법을 제공한다.

Description

다가 뎅기 바이러스 백신{MULTIVALENT DENGUE VIRUS VACCINE}

본 출원은 출원중인 미국 출원 일련 번호 60/126,313 (1999.3.26 출원), 및 출원중인 미국 출원 일련 번호 60/181,724 (2000.2.11 출원)의 35 U.S.C. §119(e) 하 우선권의 내용을 청구한다.

뎅기열 (Dengue fever) 은 모기에 의해 인간에게 옮겨지는 뎅기 바이러스, 뎅기-1, 뎅기-2, 뎅기-3 및 뎅기-4 의 4 개의 혈청형중 어느 하나에 의해 유발된다. 성인에 있어서, 뎅기 감염은 통상적으로 열, 근육통, 두통 및 간헐적 발진을 수반하는 자가한정적이나 행동불능케하는 급성질환을 유발한다. 이 질환은 양성 지혈대 시험, 자연적 점상출혈, 명확한 출혈 및/또는 쇼크에 의해서 입증될 수 있는 출혈성 열병에 의해서 악화될 수 있다. 출혈성 뎅기열은 해당 경우 중 약 0.5 %의 치사율을 갖는다. 조기 뎅기 감염에 의해서 항체가 형성된후 또 다른 뎅기 균주에 의해 감염된 감염자는 출혈성 뎅기에 더 높은 위험에 처해질 수 있음이 밝혀졌다.

뎅기 바이러스의 모기 매개체는 세계의 모든 열대 및 아열대 지역 및 미국, 유럽, 아프리카 및 중앙아시아의 일부 온대 지역에서 발견된다. 최근에, 풍토성 및 유행성 뎅기 감염이 중앙 및 남아메리카, 동남아시아, 인디아, 아프리카, 카리 브 및 태평양 지역에서 발생하였다. 매개체 방제는 비실용적이다.

뎅기의 4 가지의 혈청형 모두에 대해 보호할 수 있는 효과적인 백신이 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 전술한 필요를 만족시킨다. 본 발명은 4 가지의 혈청형 모두로부터 유래한 약독화된 뎅기 바이러스를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 약독화된 바이러스는 생리학적으로 허용가능한 부형제와 함께 인간 숙주에서 면역반응을 유도하기에 충분한 양으로 제공되며, 선택적으로 숙주의 면역 반응을 강화시키는 보강제를 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적 중의 하나는 임의의 조합으로, 뎅기-1, 뎅기-2, 뎅기-3 및 뎅기-4 로 구성된 군에서 선택된 약독화된 하나 초과의 뎅기 바이러스를 포함하는 약독화된 뎅기 바이러스 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 뎅기 바이러스에 대한 보호를 유도하기 위하여 개체의 면역체계를 자극시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 연속 계대배양에 의해 약독화된 4 가지의 혈청형 모두로부터 유래된 면역학적으로 충분한 양의 뎅기 바이러스를 개체에 투여하는 것을 포함한다.

도 1: 백신 투여 결과로서의 > 등급 1 증상의 발생.

도 2: 혈청형에 의한 반응원성 (reactogenicity) 지수의 분포의 빈도.

도 3: 투여량 범위에 따른 (dose-ranging) 4 가 뎅기 백신 연구의 결과를 보 여주는 표.

도 4: 10 명의 피험자중 전-투여 (full-dose) 가 4 가인 뎅기 백신의 면역원성을 보여주는 표.

도 5: 4 가 백신 연구의 선택된 제제의 세부사항을 보여주는 표.

도 6, A-H: 백신 지원자로부터 수집되고, 바이러스에 특이적인 혈청형으로 자극된 PBMC 에 의한 인터페론 γ생산. 모든 지원자는 단지 1 종의 혈청형의 백신만을 접종받는다. 그래프 (A-D) 는 32 일경 2차 투여량이 주어진 지원자의 결과를 보여준다. 그래프는 (E-H) 는 92 일경 2 차 투여량이 주어진 지원자의 결과를 보여준다. 1000 pg/ml 이상의 반응이 대부분의 지원자에서 2 차 투여 직전에 나타났다. 단지 4 명의 지원자만이 1 차 백신 투여량이 주어진 최초 15 일내 1000pg/ml 이상의 반응을 보였다.

도 7, A-D: 4 가 백신이 접종된 백신 지원자로부터 수집한 PBMC 의 인터페론 γ생산. PBMC 는 바이러스의 각 혈청형으로 개별적으로 자극시켰다. 각 그래프내 개별적 라인은 바이러스의 각각의 혈청형에 대한 지원자 1 인의 PBMC 의 반응을 나타낸다. 1 가 백신 접종자의 경우에는 더딘 반응이 관찰되었다.

도 8, A 및 B: 1 및 4 가 백신 지원자로부터 수집된 PBMC 의 그랜자임 B mRNA 제조. 세포는 PBMC 가 항상 ≥1000pg IFNγ/ml 로 분비되는 모든 개체로부터 수집하였다. 이것은 RTPCR 에 의해 검출되는 mRNA 의 양의 반정량적 표시이다. 상부 차트 (A) 는 모든 시료에 대하여 보여지는 밴드의 강도를 나타낸다. 하부 겔 (B) 는 양성 및 음성 RTPCR 분석의 예를 보여주는 선택된 지원자로부터 유 래한다.

본 발명은 인간에서 백신으로 사용하기에 적합한 4 가지 혈청형 모두의 약독화된 뎅기 바이러스를 제공한다. 여기에 기술된 뎅기 바이러스는 1 차 개 신장 세포와 같은 적합한 숙주 세포주에서 감염성의 뎅기 바이러스 단리체를 연속 계대배양하여 단리체를 약독화시키는 돌연변이가 축적되도록하여 제조한다. 연속 계대배양은 바이러스 단리체에 의한 세포주의 감염, 숙주세포로부터 바이러스 자손의 회수 및 다음 계대를 발생시키기 위한 바이러스에 의한 숙주세포의 후속감염을 의미한다.

바람직하게는, 약독화된 또는 불활성화되었는지와 무관하게, 혈청형중 임의 혈청형의 다른 바이러스 조성물이 본 발명에 기재된 약독화된 균주와 함께 사용될 수 있더라도, 본 발명의 조성물에서는 하기의 약독화된 바이러스를 사용한다. 45AZ5 단리체로부터 유래된 약독화된 뎅기-1 바이러스는 부다페스트 조약하 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A) 에 VR-2648 의 수탁번호로 기탁되었다.

S16803 단리체로부터 유래된 약독화된 뎅기-2 바이러스는 부다페스트 조약하 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A) 에 VR-2653 의 수탁번호로 기탁되었다.

CH53489 단리체로부터 유래된 약독화된 뎅기-3 바이러스는 부다페스트 조약하 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A) 에 VR-2647 의 수탁번호로 기탁되었다.

341750 단리체로부터 유래된 약독화된 뎅기-4 바이러스는 부다페스트조약하 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A) 에 VR-2652 의 수탁번호로 기탁되었다.

뎅기의 유독성(질병유발성) 균주의 연속 계대배양으로 약독화될 수 있는, 즉, 감염성이나 질병은 유발시킬 수 없는 개질된 바이러스가 단리되었다. 이러한 개질된 바이러스를 원숭이에서 감소된 감염성에 대하여 시험하였다. 이어서 감소된 감염성을 갖는 바이러스를 인간에서 시험하였다. 인간은 임상적 질환의 징후를 보이는 유일한 영장류이다. 임상적 반응성을 최소한 내지 전혀 보이지 않으나 여전히 면역반응을 유도하는 바이러스를 약독화시켰다.

본 발명의 하나의 구현예로서, 4 가지의 뎅기 혈청형 모두로부터 유래된 유독성 뎅기 단리체를 1 차 개 신장 (PDK)세포에서 연속 계대배양하여 약독화된 균주를 유도하였다. 연속 계대배양은 PDK 세포를 유독성 균주로 감염시키고, 수 일동안 감염된 세포를 인큐베이션하고, 바이러스를 함유하는 상층 배양액을 수거하는 것으로 실행된다. 이어서 수확된 바이러스를 신선한 PDK 세포에 적용하여 다음 계대를 발생시킨다.

일련의 다양한 계대배양을 태아 붉은털 원숭이 (Rhesus monkey) 허파세포 (FRhL)에서 최종 계대배양한후 임상적 효과에 대하여 시험하였다. FRhL 세포를 사용하여, 일반적으로, 계대 1 은 마스터 씨드 (master seed) 로 간주되고, 계대 2 는 생산 씨드 (production seed) 로 간주되며, 계대 3 은 백신 로트 (lot) 로 간주 되는 바이러스 역가를 최적화시켰다. 백신을 다양한 PDK 계대 레벨에서 제조하고, 백신 생성물을 원숭이 및 인간에서 약독화에 대하여 시험하였다. 계대배양된 바이러스의 유독성, 즉, 질병을 유발할 수 있는 능력은 온도(발열), 두통, 발진과 같은 증상을 매일 모니터닝하여 평가하여 일부에 명칭을 부여하였다. 백신접종자에서 뎅기열의 임상적 증후를 유도하는 상기 바이러스의 불능성 (inability) 으로 판단시, 상기 계대는 약독화된 것으로 여겨진다.

본 발명의 약독화된 바이러스의 증식은 뎅기 바이러스 성장이 가능한 수 많은 세포주에서 가능하다. 뎅기 바이러스는 다양한 인간 및 동물 세포에서 성장한다. 백신용도를 위한 약독화된 뎅기 바이러스의 증식을 위한 바람직한 세포주에는 DBS-FRhL-2, Vero 세포 및 기타 원숭이 세포가 포함된다. 가장 높은 바이러스 수율은 통상적으로 Vero 세포와 같은 이수체 (heteroploid) 세포주에 의해 얻어진다. 세포는 통상적으로 약 0.01 내지 0.005 범위의 다수의 감염에서 접종되며, 바이러스의 복제가 허용되는 조건하, 예컨대, 약 30-37℃ 및 약 3-5 일, 또는 바이러스가 적절한 역가에 도달하는데 필요한 시간 만큼 배양시킨다. 바이러스를 세포 배양물로부터 제거하고, 통상적으로 공지된 정제방법, 예컨대, 원심분리로 세포 성분으로부터 분리시키고, 추가로 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 원하는 바대로 정제시킬 수 있다.

약독화된 바이러스의 단리후 이의 게놈의 서열 분석을 실시하여 약독화된 표현형에 대한 기초를 구할 수 있다. 이는 바이러스 DNA 를 시퀀싱하여, 대조군 바이러스의 게놈 서열과 비교하여 약독화된 단리체에서 뉴클레오티드의 변화를 동정 함으로써 달성된다. 따라서, 약독화를 유독성 균주에 부여하는 분자 변화를 특징화시킬 수 있다.

여기에 제공된 본 발명의 하나의 구현예에는 상기 표에서 열거된 임의의 위치에서 서열변화를 단독 또는 조합하여 도입하여, 약독화된 바이러스 자손을 발생시키는 것이 포함된다. 이러한 변화를 갖는 바이러스 게놈은 뉴클레오티드 변화를 클론된 DNA 에 도입시키기 위하여 당업자에게 공지된 임의의 표준 재조합 DNA 기술로 제조할 수 있다(Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, 뉴욕, 1989). 이어서 게놈은 바이러스 자손의 생산용 숙주세포의 트랜스펙션을 위한 적당한 벡터에 결찰시킬 수 있다.

또한 바이러스 게놈의 플라스미드-매개 도입을 통한 바이러스 자손의 발생능력을 사용하여 제한된 분자 변화를 갖는 바이러스를 제조할 수 있다. 본 발명의 상기 구현예에서, 바이러스상에 원하는 특성, 예컨대, 감소된 유독성을 부여하는 변경된 서열을 포함하는 안정된 바이러스 원료를 제조할 수 있다. 이러한 접근법을 또한 사용하여 바이러스의 다양한 특성에 대한 분자변화의 영향, 즉, 항원형태, 유독성, 또는 목적하는 서열변화를 바이러스 게놈에 도입하고, 이 게놈으로부터 바이러스 자손을 생산한후, 특징화를 위해 바이러스 자손을 회수하는 약독화를 평가할 수 있다. 또한, 이러한 접근법을 사용하여 기타 질병에 대해 면역 반응을 발생시키는 바이러스에 의해 동시에 전달되는 바이러스 게놈에 삽입된 이질성 서열로 바이러스를 구축할 수 있다.

제한된 분자 변화를 갖는 바이러스 게놈의 구축은 당업자에게 공지된 올리고뉴클레오티드-지시성 (nucleotide-directed), 링커-스캐닝 또는 중합효소 연쇄 반응을 기초로하는 돌연변이유발 기술과 같은 표준기술을 이용하여 달성할 수 있다 (Zoller 및 Smith, 1984, DNA 3, 479-488; Botstein 및 Shortle, 1985, Science 229, 1193). 전달에 적합한 벡터로의 게놈의 결찰은 당업자에게 공지된 표준 기술을 통해 달성될 수 있다. 바이러스 자손의 제조를 위한 숙주세포로의 벡터의 트랜스펙션은 당업자에게 공지된 칼슘-포스페이트 또는 DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 전기천공, 원형체융합 및 기타 기술과 같은 임의의 표준 기술을 이용하여 수행할 수 있다. (Sambrook 등, Molecular Cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

백신용도를 위해, 본 발명의 약독화된 바이러스는 백신 제제에 직접적으로 사용하거나, 또는 당업자에게 공지된 냉동건조 프로토콜을 이용하여, 필요에 따라, 바람직하게는 안정화제내에서 냉동건조시켜(Hoke, 1990, Am J Trop Med Hyg 43, 219-226) 사용할 수 있다. 냉동건조된 바이러스는 통상적으로 약 4℃에서 유지된다. 사용시, 냉동건조된 바이러스는, 추가로 후술되는 바와 같이, 수중에서 재구성하거나, 또는 필요에 따라 안정화 용액, 예컨대, 식염수 또는 Mg⁺⁺ 및 HEPES 를 포함하는 안정화 용액에서, 보강제와 함께 또는 없이 재구성될 수 있다. 여기에서 인용된 모든 참고문헌은 여기에 그의 전내용이 참고로 포함되어 있다.

따라서, 본 발명의 뎅기 바이러스 백신은 활성성분으로서 여기에 기술된 바 와 같은 뎅기-1, 뎅기-2, 뎅기-3 및 뎅기-4로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 약독화된 뎅기 바이러스를 면역학적으로 유효한 양으로 포함한다. 약독화된 바이러스 조성물은 약리학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보강제와 함께 피험자, 특히 인간에게 도입될 수 있다. 유용한 부형제에는 당 업계에 주지되어 있고, 예컨대, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산등이 포함된다. 생성된 수용액은 용도에 따라 포장 또는 냉동건조되며, 냉동건조된 제제는 전술한 바와 같이 투여전에 재수화시킨다. 이 조성물은 필요에 따라 생리학적 조건을 최적화시키기 위하여 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대, pH 조정 및 완충제, 강장 조정제, 습윤제등, 예컨대, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트등을 포함할 수 있다.

여기에 개시된 생약독화된 바이러스의 투여는 비경구 주사(예컨대, 복강내, 피하 또는 근육내 주사), 조류에서의 오보(ovo) 주사, 경구적 주사 및 기도표면에 바이러스(통상적으로 약제 수반됨)를 국부적용하는 것을 포함한 임의의 적합한 수단으로 수행할 수 있다. 기도 표면에 바이러스의 국부 적용은 비강내 투여(예컨대, 약제를 비강내로 침적시키는 드로퍼, 면봉 또는 흡입기를 이용함에 의함)를 수행할 수 있다. 또한 기도 표면에 바이러스의 국부 적용은 흡입 투여에 의해, 예컨대 에어로졸 현탁액으로써 바이러스를 포함하는 약제 (고형물 입자 및 액체 입자 포함)의 호흡에 알맞은 입자를 생성시킨 후, 피험자가 호흡에 알맞은 입자를 흡입케함으로써 수행할 수 있다. 약제의 호흡에 알맞은 입자의 투여방법 및 기구는 공지되어 있고, 임의의 통상적 기술이 사용될 수 있다. 백신접종 결과로서 숙주는 투여된 혈청형의 뎅기 바이러스 감염에 대해 적어도 부분적으로 또는 완전히 면역되거나, 또는 진전중인 온건한 또는 심각한 뎅기 바이러스 감염에 내성이 된다.

본 발명의 약독화된 뎅기 바이러스를 포함하는 백신 조성물은 뎅기 바이러스 감염에 약하거나 그렇지 않으면 이의 위험에 노출된 사람에게 투여하여 개체의 자가 면역 반응 능력을 향상시킨다. 이러한 양은 "면역학적으로 유효한 양"으로 정의한다. 이러한 용도에서, 다시 정확한 양은 피험자의 건강 상태 및 체중, 투여방식, 제제의 성질등에 좌우되나, 통상적으로 피험자당 뎅기 바이러스의 각 혈청형의 약 10² 내지 10⁶ pfu 범위이다. 각 혈청형의 바이러스 백신의 양은 조정, 즉, 증가시키거나 감소시켜, 목적하는 뎅기 바이러스로 감염으로부터 충분한 보호를 제공하는 제제를 수득할 수 있도록 한다. 4 개의 혈청형을 결합시키는 경우, 바람직한 조성물은 동량의 각 뎅기 혈청형을 포함한다. 어느 경우에서든, 백신 제제는 백신 제제내 하나의 혈청형의 심각하거나 생명에 위협적인 뎅기 바이러스 감염에 대해 환자를 효과적으로 보호하기에 충분한 각 혈청형의 약독화된 뎅기 바이러스의 양이 제공되어야 하며, 교차보호를 원한다면 기타 혈청형도 가능하다.

하나의 특정 혈청형의 본 발명의 약독화된 뎅기 바이러스는 뎅기 바이러스의 기타 혈청형의 약독화된 바이러스와 함께 병용하여 다중 뎅기 바이러스에 대해 보호할 수 있다. 통상적으로 상이한 개질된 바이러스는 혼합 및 동시에 투여되나, 또한 별도로 투여될 수 있다.

일부 경우에서, 본 발명의 약독화된 뎅기 바이러스 백신과 기타 병원체에 보호반응을 유도하는 백신을 결합시키는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 단일 또는 다중 투여할 수 있다. 다중 투여가 면역성의 충분한 레벨을 이끌어 내기 위해 필요할 수 있다. 유도된 면역성의 레벨은 중성화 분비성의 혈청 항체의 양의 측정, 및 원하는 수준의 보호를 유지하기 위하여 필요에 따라 반복되는 백신접종 또는 조정된 투여량으로 모니터할 수 있다.

하기의 실시예는 제한이 아닌 설명을 위해 제공된다.

하기의 재료 및 방법은 뒤이은 실시예에서 이용된다.

백신 제조를 위한 재료 및 방법

바이러스 균주.

DEN 바이러스를 1 차 개 신장 (PDK) 세포 배양물에서 계대배양후 인간 및 모기 원으로부터 단리시켰다. 표 1 에는 PDK 세포에서 채택 및 계대배양된 균주가 열거되어 있다. PDK 세포에서 계대배양후, 바이러스 균주는 추가로 씨드 및 백신 제조를 위한 FRhL 세포로 순응시켰다. 이것은 최종 백신 로트 제제를 위해 추가의 3-4 계대로 구성된다. 또한 표 1 에 열거된 모 바이러스 균주는 DEN 바이러스 복제가 가능한 세포에서 낮은 세포 배양 계대로부터 유래하였다.

백신 제조

4개의 혈청형 모두에 대한 DEN 백신을 유사한 절차를 이용하여 FRhL 세포 배양물에서 제조하였다. 모아지고, 예비시험된 (시험 결과에 대한 표 2 참조) FRhL 세포를 액체 질소 저장소에서 꺼내어, 150cm² 플라스크내 이글 최소 필수 배지 (EMEM) (Biowhittaker, Waldersville, MD) 비필수 아미노산, 소태아혈청, FBS(2%)(Biowhittaker, Waldersville, MD) 및 항생제가 보충된 세포 배지에 플레이트시켰다. 플라스크가 컨플루언시에 도달된후, 배지를 제거하고, 0.01 MOI 을 넣어 희석시킨 DEN 생산 씨드로 플라스크를 접종시키고 32℃에서 1 시간동안 흡착시켰다. 흡착 및 신선한 EMEM 배지로 공급후, 플라스크를 32℃로 전환시켜 4 일간 유지시켰다. 접종후 4 일째, 모든 플라스크로부터 배지를 버리고 세포 단일층을 100 ml 의 Hanks BSS (Biowhittaker, Waldersville, MD)로 3 회 세정시켰다. 세정후, 플라스크를 FBS 대신에 0.25% 인간 혈청 알부민 (HSA, Alpha Therapeutic Corp, Los Angeles, CA)를 함유하는 EMEM 배지를 공급하였다. 32℃ 에서 추가로 2 일간 인큐베이션후, 상층 배양액을 모든 플라스크에서 제거하여 합쳤다. 안전 시험을 위한 샘플링후, 나머지 배양액을 합쳐 0.45 미크론의 비단백질 결합 막필터로 여과하여 정제하였다. 여과된 액체를 합쳐 15% 락토오스 및 5% HSA 를 포함하는 동량의 안정화제와 혼합하였다. 완정화된 전 액체를 -70℃ 에서 저장하여 냉동건조시켰다. 최종의 바이알링 (vialing) 을 위해서, 안정화된 전 액체를 41℃ 에서 신속하게 해빙시켜 혈청 바이알에 3ml 씩 분주하였다. 바이알의 트레이를 Hull 냉동건조기에서 -40℃ 의 온도로 냉동시킨후, 1 일간 건조시켰다. 캡핑후, 바이알을 모니터되는 냉동기에서 -20℃ 로 저장시켰다.

백신 시험

씨드 및 백신 로트 뿐만아니라 바이러스 제조용으로 사용되는 모든 세포 뱅크를 오염제의 존재에 대하여 시험하였다. 시험 물품 및 결과를 표 2 에 열거하였다. 생성물의 어느 것에도 오염물은 검출되지 않았다.

붉은털 원숭이 접종

숙성한 암컷 및 수컷 붉은털 원숭이 (6-15kg)를 DEN 백신 로트 또는 모 바이러스로 상박에 0.5ml 피하접종하여 면역시켰다. 바이러스 단리 및 항체 시험용 혈액을 접종전 및 접종후 14 일동안 매일 대퇴부 정맥에서 채취하였다. 또한 혈액을 면역후 30 및 60 일째 채취하였다. 바이러스 항원투여를 유사하게 실시하였다.

C6/36 세포에서 증폭에 의한 바이러스 단리

C6/36 세포 배양 증폭에 의한 바이러스 단리는 [Putnak 등, 1996 (J. Infect Dis 174, 1176-1184)] 에 기재되어 있다. 간략히는, 원숭이의 접종후, 매일 혈액 표본을 1 내지 14 일간 수득하였다. 혈청을 분리하여 -80℃ 에서 냉동시켰다. 혈청으로부터 바이러스를 회수하기 위해서, 해빙된 혈청을 세포 배양 배지에 1:3 으로 희석시킨 후, 이를 사용하여 C6/36 모기 세포의 단일층을 포함하는 25cm² 플라스크에 접종시켰다. 바이러스의 흡착후, 플라스크에 EMEM 유지 배지를 넣어 28℃에서 유지시켰다. 7 일후, 배지를 바꾸고, 플라스크를 추가로 7 일간 인큐베이션하였다. 접종후 14 일째, 상층 배양액을 버리고 -80℃에서 냉동시킨후 동량의 열불활성화 소태아 혈청(FBS)과 혼합시켰다. 냉동된 표본은 플라크 분석으로 감 염성 바이러스에 대하여 후에 분석하였다.

생약독화된 백신의 개발을 위해 사용된 뎅기 바이러스 균주

혈청형	원(原)단리체	백신균주:인간단리체로부터의 계대	백신제조를위해 선택된 PDK계대	씨드 및 백신 제조를 위한 FRhL계대	모균주:인간단리체로부터의계대
DEN-1 (West Pac 74; 45AZ5)	인간 단리체, 나우루,1974	20xFRhL(플라크선별 및 5AZ에의한 돌연변이);뎅기열을 유발하는 p-20에서 제조된 백신(2vols)	10,20,27	1:마스터씨드 2:생산씨드 3:백신로트	9 x FRhL
DEN-2 (S16803)	인간 단리체, 태국,1974	1x모기;4xPGMK	10,20,30,40,50	1:마스터씨드 2:생산씨드 3:백신로트	4 x PGMK;2xC6/36
DEN-3 (CH53489)	인간 단리체, 태국, 1973	4xPGMK;5xC6/36	10,20,30	1:마스터씨드 2:생산씨드 3:백신로트	4xPGMK
DEN-4 (341750)	인간 단리체, 콜롬비아, 1982	1x모기	6,10,15,20	1:예비-마스터씨드(PDK-20 만) 2:마스터씨드 3:생산씨드 4:백신로트	1x모기;5xPGMK;4xFRhL

FRhl 세포 뱅크 및 DEN LAV 씨드 및 백신 로트의 예비임상 시험

시험	FRhl세포뱅크	마스터 씨드	생산씨드	백신(벌크)	백신(최종용기)
무균성	x	x	x	x	x
마이코플라스마	x		x	x
RT	x		x
혈구흡착	x		x	x
세포배양안전성 (4세포주)	x			x
수정란안전성	x
동물안전성:성장마우스	x			x
동물안전성:젖먹이마우스	x			x
동물안전성: 기니아피그	x			x
동물안전성: 토끼	x
발암성	x	NA	NA	NA	NA
세포핵학	x	NA	NA	NA	NA
원숭이안전성: 신경독성	NA		x(DEN-4)
원숭이 감염성/면역원성	NA		x
원숭이 효능	NA				x(DEN-2,DEN-4)
감염성 (플라크 분석)	NA	x	x	x	x
종합 안전성	NA			x	x
잔류 수분	NA				x
재구성 pH	NA				x
재구성 삼투성	NA				x
내독소	NA				x
동일성 (DEN)	NA	x	x		x

붉은털 원숭이의 접종에 사용되며, PDK 세포에 적응시킨 DEN 바이러스 균주 세트

DEN 바이러스 균주	바이러스	접종: PFU/0.5 ml	Mks 바이러스 혈증/전체 (바이러스 혈증 평균 일수)	Mk 혈청전환/전체 (접종 후 1-2 mo에서의 GMT PRNT50)
DEN-1, 45AZ5	PDK-0(모)	3.3 x 104	4/4 (6.8)	4/4 (760)
	PDK-10 (생성 씨드)*	7.0 x 104	4/4 (4.75)	4/4 (1030)
	PDK-20 (생성 씨드)	1.7 x 104	4/4(4.5)	4/4 (640)
	PDK-27 (생성 씨드	1.8 x 104	0/4(0)	4/4 (50)
DEN-2, S16803	PDK-0 (모)	5.0 x 106	4/4(5)	4/4 (600)
	PDK-10 (생성 씨드)	3.8 x 105	4/4(4.75)	4/4 (570)
	PDK-20 (생성 씨드)	2.2 x 105	4/4(6.5)	4/4 (920)
	PDK-30 (생성 씨드1)	4.4 x 105	2/3(3.3)	4/4 (640)
	PDK-30 (생성 씨드2)	2.1 x 105	3/3(6.0)	3/3 (640)
	PDK-40 (생성 씨드)	1.0 x 104	2/4(1)	3/4 (90)
	PDK-50 (생성 씨드1)	2.6 x 106	2/4(1)	4/4 (310)

[표 3 계속]

	PDK-50 (생성 씨드2)	5.9 x 105	3/4 (3.25)	4/4 (280)
	PDK-50 (백신)	1 x 106	ND	4/4 (270)
DEN-3, CH53489	PDK-0 (부모)	8.0 x 103	3/3 (3)	3/3 (660)
	PDK-10 (생성 씨드)	2.5 x 106@	2/3 (1.3)	3/3 (150)
	PDK-20 (생성 씨드)	1.0 x 106@	0/3	3/3 (130)
	PDK-30 (생성 씨드)	9.3 x 105@	0/3	0/3 (<10)
DEN-4, 341750	PDK-0 (부모)	1.0 x 103	3/3 (4.7)	3/3 (420)
	PDK-6 (생성 씨드)	1.7 x 105	1/4 (0.5)	4/4 (250)
	PDK-10 (생성 씨드)	2.9 x 105	1/4 (1.3)	2/4 (90)
	PDK-15 (생성 씨드)	5.5 x 104	1/4 (0.25)	2/4 (40)
	PDK-20 (생성 씨드)	5.5 x 104	1/4 (0.25)	2/4 (70)
	PDK-20 (백신)	1.2 x 105	1/3 (0.3)	3/3 (50)
1,2: 2개의 개별적인 원숭이 실험군
@ C6/36 세포에서 수행한 플라크 분석

플라크 분석. Sukhavachana 등 (1966)의 문헌 (Bull WHO 35, 65-66)의 방법에 따라 붉은털 (Rhesus) 원숭이 신장 (LLC-Mk₂, ATCC CCL7) 세포에 있어서, 플라크 분석에 의해 원숭이 혈청으로부터 직접, 또는 증폭 바이러스혈증 단리체로부터 감염성 바이러스를 적정하였다. C6/36 세포에서의 분석을 Putnak 등 (1996)의 상기 문헌에 기술된 바와 같이 수행하였다.

중화 시험. Russell 등 (1967)의 문헌 (J Immunol 99, 285-290)에 의해 사용된 것과 유사한 플라크 감소 중화 시험을 사용하여 원숭이 혈청으로부터 DEN 중화 항체를 측정하였다. 표 1에 열거한 모 바이러스를 사용하여 혈청 표본에 있어서 플라크 감소 50% 종료점 (PRNT50)을 측정하였다.

실시예 1

PDK 세포에서의 DEN 바이러스 변형 및 백신 로트 생성.

백신 개발을 위하여 선발한 DEN 바이러스 균주는 PDK 계대 이전에 다양한 계대 역사를 가진다. DEN-4 341750의 경우, PDK 세포 배양물의 접종 전 단지 1회의 모기 계대가 있었으며, 반면, DEN-1 West Pac 74 균주는 PDK 계대 이전에 20회의 FRhL 세포 계대의 역사를 가진다 (표 1). DEN-3을 제외하고, 모든 균주는 작은 PDK 계대 횟수 후에 적응되었다. DEN-3에 있어서, 상기 균주를 PDK 세포에 적응시키기 위하여 초기 계대에 있어서 바이러스 공급을 증가시키는 추가의 노력이 필요하였다. PDK 세포로의 적응 후의 일반적인 경우로서, DEN 바이러스 역가는 10⁴-10⁵ PFU/ml 범위인 것으로 밝혀졌다. 역가를 증가시키기 위한 시도는 성공적이지 못하였으며, 백신 생성을 위하여 대안적인 세포 기재를 찾게 되었다. DBS-FRhL-2 (FRhL) 세포를 상기 목적을 위하여 하기와 같은 여러 이유로 선택하였다: 1) 상기 세포에 있어서, DEN 바이러스는 약 10⁶ PFU/ml의 역가로 복제하여 DEN 백신의 제조를 가능하게 하고; 2) 백신 세포 기재와 관련될 수 있는 부작용 없이 제I기 임상 시험에서 시험한 여러 DEN 백신의 제조에 상기 세포를 사용하여 왔으며; 3) FRhL 세포는 종양생성 잠재력을 가지고 있지 않으며 역전사효소 활성 및 오염체가 없는 붉은털 원숭이 폐 2배체 정상 세포이고; 4) 세포가 "정상" 2배체 세포이기 때문에 백신의 정제에 조절 또는 기타 요건이 없으며; 5) FRhL 세포 뱅크가 이용가능한 낮 은 계대수의 세포로 시작하여 백신 제조에 사용가능한 세포 세대에서 확립될 수 있다. 따라서, PDK 계대는 선택적 약독화의 경험적 공정을 연구하기를 원하는 사람들에게 탁월한 모델을 제공한다. 그러나, PDK 연속 계대는 누적성 선택 공정을 나타내기 때문에, 다른 세포 기재에서의 추가의 계대는 그 자신의 선택 압력을 제공한다. FRhL 계대가 인간에 있어서의 바이러스 독성을 증가시키는지 또는 감소시키는지의 여부는 알려져 있지 않다. 완전히 특성화되어야 하는 안정한 세포의 사용은 단지 한때 매력적일 뿐이다. 그러나, FRhL 세포를 사용한 공표된 경험에 의하면, 상기 세포가 PDK에서의 연속 계대 동안 획득되는 생물학적 특성을 완전히 바꾸거나 탈안정화할 수 있다는 것이 나타났다 (Halstead 등, 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 654-665; Halstead 등, 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 666-671; Halstead 등, 1984, Am Trop Med Hyg 33, 672-678; Halstead 등, 1984, Am Trop Med Hyg 33, 679-683; Eckels 등, 1984, Am J Trop Med Hyg 33, 679-683).

PDK-계대 바이러스를 FRhL에 적응시키는 것은 DEN 바이러스의 모든 균주에서 균일하게 성공적이었으며 PDK 계대에 의존적이지 않았다. FRhL 계대 1-4의 수확체로부터의 바이러스 역가는 10⁵-10⁶ PFU/ml 범위였다. 제3-제4 FRhL 계대에 의해, 모든 DEN 균주 세트 바이러스의 백신 로트를 제조하였으며, 표 2에 나타낸 바와 같이 시험하였다. FRhL 세포 뱅크 시험, 및 마스터 및 생산 씨드 시험에 대한 데이터를 표 2에 또한 제공하였다. 안전성 및 오염물이 없는 것을 보증하는 데 필요한 상기 시험 결과는 부정적이거나, 용인가능한 내역 이내에 존재하였다. DEN-4 341750 PDK-20 생성 씨드에 있어서, 원숭이 신경독성 시험을 수행하였다. 상기 연구의 결과는 Hoke (1990)의 문헌 [Am J Trop Med Hyg 43, 219-226] 에서 찾을 수 있다. 비교를 위하여 사용한 DEN-4 생성 씨드, 및 DEN-4 모 바이러스는 신경병원성이 아니었다. 나머지 후보 DEN 백신에 있어서, 신경독성에 대하여 평가할 필요가 있는지의 여부는 상기 경험, 및 기타 DEN 원숭이 신경독성 시험으로부터의 데이터에 기초하여 의문인 채로 남아있다 (개인적 통신).

실시예 2

PDK-계대 DEN 바이러스를 접종한 붉은털 원숭이.

PDK 세포에서 계대되고 "주 세트"로 나타내어진 DEN 바이러스의 감염성을, 각각의 혈청형에 있어서의 비변형 모 바이러스와 비교하였다. 표 3에는, 접종한지 2주 후에 순차적으로 취한 혈청에서 발견될 수 있는 바이러스 혈증 일수에 의해 원숭이에 대한 감염도를 측정하는 상기 연구의 결과를 열거하였다. DEN-1, DEN-2, DEN-3, 및 DEN-4로 접종한 3-4 마리의 원숭이 군에 있어서, 원숭이를 모 바이러스로 접종하면 바이러스 혈증 평균 일수가 각각 6.8일, 5일, 3일, 및 4.7이었다. DEN-2 모에 있어서, 유사한 원숭이 및 단리 기술을 사용하여 측정가능한 바이러스 혈증을 포함하는 감염이 시간이 지나도 매우 재현가능하다는 추가의 데이터 (나타내지 않음)가 구체화되었다. 불행하게도, 원숭이 혈청에서의 바이러스 역가에 대한 단지 부분적인 데이터만이 존재한다. 존재하는 대부분의 데이터는 원숭이 바이러스 혈증 혈액을 모기 세포 배양물에서 적정한 DEN-2 모 바이러스를 사용한 경험 으로부터 나온다. 접종 후 4 - 8일에서의 피크 바이러스 역가는 혈청 1 ml 당 10⁵ PFU에 이르렀다 (Putnak 등, 1996, 상기 문헌).

각각의 균주 세트에 있어서, PDK 계대는 원숭이를 감염시키는 바이러스의 능력이 감소되는 것에 의해 나타나는 바와 같이 DEN 바이러스를 변형시킨다. 여러 균주 세트에 있어서, 상기는 가장 높은 PDK 계대에서의 바이러스 혈증의 완전한 결여에 의해 명확하게 입증된다. PDK 계대 27에서 DEN-1을 원숭이에 접종하면, 4마리의 원숭이에서 제0일에 바이러스 혈증이 생겼다. 이는 시험한 전체 56 출혈체로부터의 0 단리로 번역된다. 유사한 결과가 DEN-3 PDK-20 및 PDK-30에서 나타났다. 상기 바이러스를 위한 PDK-30에서, 원숭이 감염성의 모든 증거는 손실되었다 (즉, 10⁶ PFU의 바이러스를 접종한 원숭이에서 바이러스 혈증이 없었으며, 혈청전환의 증거가 없음). DEN-2 균주는 원숭이 감염성의 변형을 획득하기 위하여 가장 큰 PDK 계대 횟수를 필요로 하였다. 상기 바이러스에 있어서, PDK 세포 배양물에서의 40회 이상의 계대가 바이러스 혈증 감소에 필요하였다. 상기 경험과는 반대로, DEN-4 균주 341750은 단지 원숭이 감염 변형을 위하여 PDK 세포에서의 6회의 계대만을 필요로 하였다. 다른 DEN-1 균주, 1009에 있어서, 심지어 50회의 PDK 계대 후에도, 모 바이러스와 비교시 원숭이 감염 변형의 증거가 없었다 (데이터는 나타내지 않음). 결론적으로, PDK 세포 계대는 다양한 DEN 단리체의 변형 및 약독화를 위한 효과적인 경험적 방법인 것으로 나타났다. 이는, 원숭이 및 인간에 있어서, 아마도 PDK 복제에는 적합하지만 표적 세포에서의 복제에는 적합할 필요가 없는 바이러 스 집단에 대한 선발 압력을 두는 DEN을 위한 비자연적 숙주이다.

인간에 있어서의 후보 백신 연구의 재료 및 방법

지원자. 연령이 18-45세인 건강한 남성 및 여성 지원자를, 혈액 화학, 혈액학, 프로트롬빈 시간, 부분 트롬보플라스틴 시간, 검뇨, 신속 혈장 리아진 항체, 및 B형 간염바이러스 표면 항원과 HIV에 대한 항체에 있어서의 혈청학을 포함한 시험 패널에 의해 조사 및 스크리닝하였다. 영속적이며 상당한 이상 또는 양성 시험을 근거로 지원자를 배제하였다. 여성 지원자는, 백신접종 48시간 이내에 임신 검사에서 음성일 경우 참가 적격이었으며, 백신접종 후 3개월 동안은 통상의 피임법을 사용하여 임신을 회피할 것이라는 동의서에 기꺼이 서명하였다. 또한, 지원자는 뎅기 백신에 대한 응답에 영향을 줄 수 있는 플라비바이러스 면역성을 이미 가지고 있을 경우 [Scott, 1983, J Infect Dis 148, 1055-1060), 또는 네오마이신, 스트렙토마이신, 또는 젠타마이신에 대한 알러지의 역사를 이미 가질 경우 배제하였다. 이전 플라비바이러스 면역성은, 뎅기 제 1-4 형, 일본 뇌염, 또는 황열에 대한 검출가능한 헤마글루틴화 저해 항체 (1:10의 혈청 희석) 를 전혀 보유하지 않거나, 황열 백신 또는 플라비바이러스 감염의 역사를 전혀 가지지 않는 것으로 정의되었다.

지원자는 모든 측면의 임상 시험에 대한 지식을 시험하도록 고안된 서면 시험에서 ≥70% 의 점수를 받았다. 그 후, [US 21 CFR Part 50-Protection of Human Subjects] 에 따라 지원자 각자로부터 통지된 합의서를 수득하였다. 임상 프로토콜은 Declaration of Helsinki (Protocol), 및 Army Regulations 70-25-Use of Volunteeers as Subjects of Research, 및 40-7-Use of Investigational Drugs in Humans and the Use of Schedule I Controlled Substances를 포함하여 모든 관련 규정 요건에 따랐다. 연구는 Human Subject Research Review Board, Office of the Surgeon General, U.S. Army, the WRAIR Human Use Research Committee, 및 Institutional Review Board, University of Maryland (Baltimore) 에 의해 승인되었다.

연구 백신. 연구 백신을 표 4에 열거하였다. 백신 바이러스를, 1차 개 신장 세포, 이어서 3회의 최종 계대로서 태아 붉은털 원숭이 폐 (FRhL) 연속성 2배체 세포 배양물에서 반복적으로 계대하여 씨드 및 백신을 제조하였다. 각각의 후보는, 지원자에게 있어서의 시도 전에, 백신 접종 붉은털 원숭이에 있어서 그의 야생형 모 바이러스와 비교하여 실질적으로 바이러스 혈증을 감소시키는 것을 확인하였다. 붉은털 원숭이의 감염에 의해 측정되는 적당한 약독화에 의하면, 뎅기 백신 균주는 인간 시험에 있어서 적합한 백신임이 나타났다.

면역화 직전에 동결건조 백신 바이알을 주사용 살균수 (USP) 로 재구성하였다. 면역화 후, 재수화 백신의 미사용 부분은 얼음 상에서 유지하였으며, LLC-MK₂ 세포 단일층에서 4시간 이내에 적정하였다 (Sukhavachana 등, 1966, Bull WHO 35, 65-66). 주사할 후보 백신에 따라 지원자 각자에게 1.0 x 10⁵ 내지 4.5 x 10⁶ pfu의 바이러스를 수여하였다 (표 4). 개개의 연구 백신의 계대 역사를 이하에 요약하였다.

WRAIR 생 약독화된 뎅기 백신

백신	PDK 계대*	연도	연구 장소	지원자의 수	투여량 (x 105 pfu)
뎅기 1 (45AZ5)	27	1991	CVD	10	4.4 - 45
	20	1991 1992	CVD#	10	7.7 - 38
	10	1991 1992	CVD	9	2.8 - 3.5
	0	1984	USAMRIID##	2	?
뎅기 2 (S16803)	50	1991	CVD	3	6.8
	40	1996	USAMRIID	3	5
	30	1991 1992	CVD	10	5.6 - 10
뎅기 3 (CH53489)	20	1992	CVD	6	1.0 - 1.4
	10	1992	CVD	3	3.8
	0	1986	USAMRIID	2	?
뎅기 4 (341750)	20	1989	USAMRIID	8	1.0
	15	1991	CVD	3	4.8
전체	10	-	-	69	-
* 1차 개 신장 계대 수준
# Center for Vaccine Development, University of Maryland, Baltimore
## United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, Frederick, MD

뎅기 1 45AZ5 백신: DEN-1 균주 West Pac 74를 Nairu 섬 (서 태평양) 상의 DEN 열의 인간 사례로부터 1974년에 단리하였다. 단리체를 FrhL 세포 배양물에서 20회 계대하고, 백신 로트를 제조하였다. 계대는, 인간 백신접종에 적합하며 약독화된 바이러스를 회수하기 위한 돌연변이 유발 및 플라크 선발을 포함하였다.

2명의 인간 지원자의 백신 접종 후, 지원자 중 1명에서의 DEN 병으로 인하여 백신의 사용을 중지하기로 결정하였다. 백신을 PDK 및 FrhL 세포 배양물에서 계대하여 추가로 약독화하였다. 현재의 후보 백신은 DEN-1 45AZ5 PDK-20이다.

뎅기 2 S16803 백신: 뎅기 2 균주 S16803 바이러스는 뎅기열에 걸린 환자로 부터의 타이 바이러스 단리체로부터 유래되었다. 씨드 및 백신 제조를 위하여, 상기 바이러스는 총 50회 PDK 계대하며, 태아 붉은털 원숭이 폐 2배체 세포 (DBS-FRhL-2)에서 최종적으로 계대하였다. 처음에, 2종의 백신 후보를 30번째 및 50번째 PDK 계대 수준에서 제조하였으며, 시험을 위하여 선발하였다. 다른 백신 후보는 동일한 뎅기 2 부모 균주 S16803 바이러스로부터의 WRAIR에서 개발되었으며, Salk Institute (Swiftwater, PA)에 의해 40번째 계대 수준에서 제조되었다.

제3형 뎅기 CH53489 백신: 제3형 뎅기 균주 CH53489 바이러스는 타이 균주로부터 유래한 것으로서 1차 그린 원숭이 신장 (PGMK) 및 C6/36 곤충 세포에서 초기 계대 후 1차 개 신장 (PDK) 세포에서 30회 계대하였다. 10, 20 및 30회의 PDK 계대로부터의 바이러스를 사용하여 태아 붉은털 원숭이 폐 2배체 세포 배양물에 접종하였다.

뎅기 4 341750 카리브 (Carib) 백신: 뎅기 4 백신 후보는 뎅기 4의 카리브 균주로부터 유래하였으며 (Columbia, 1982), University of Hawaii에서 계대되었고, WRAIR에서 제조되었다 [Marchette, 1990, Am J Trop Med Hyg 43, 212-218]. 모 바이러스에 대한 항체는 원형 균주인 H-241을 포함하여 다른 뎅기 4 바이러스 균주를 중화시킨다. 인간 단리체의 약독화는 1차 개 신장 (PDK) 세포 배양물에서의 20회의 계대에 의해 성취되었다.

연구 고안. 표준의 랜덤화한 단일-블라인드 입원환자 임상 프로토콜을 모든 파일럿 연구에 사용하였다. 연구의 대부분은 미국 매릴랜드주 볼티모어 소재의 Center for Vaccine Development, University of Maryland에서 수행하였다. 뎅기 2 S16803 PDK 40 백신 및 뎅기 4 CH341750 PDK 20 백신의 파일럿 연구는 미국 매릴랜드주 Ft 덴트릭 소재의 Medical Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID)에서 수행하였다.

백신의 처음의 임상 연구에서는, 먼저 3명의 지원자에 있어서 특정 균주에 대한 이용가능한 가장 큰 계대를 시험하였다. 3주 동안 증상을 면밀하게 모니터링하였으며, 지원자들이 여전히 양호하면, 다음의 더 낮은 계대를 시험하였다. 1명 이상의 지원자가 앓게 되면, 백신 균주의 더 낮은 계대 시험은 수행하지 않았는데, 이는 더 낮은 계대가 덜 약독화되었으리라 생각하였기 때문이다. 3명의 지원자에 있어서 모든 허용가능한 계대 수준을 시험한 후, 병을 야기하지 않는 가장 낮은 수준을, 7명의 추가의 지원자까지 추가로 시험하기 위하여 선택하였다.

신중한 관찰을 가능하게 하기 위하여, 외래의 감염성 질환에 노출되는 것을 방지하기 위하여, 그리고 가능한 벡터 모기 감염을 방지하기 위하여, 접종 전 3일부터 면역화 후 20일까지 지원자를 연구 병동에 제한하였다. 심각성과는 상관없이, 또는 모든 불리한 경험이 면역접종과 관련되었는지의 여부와 상관없이, 각각의 백신의 투여 후에 상기 기간 동안 발생하는 모든 불리한 경험을 기록하였다. 백신의 허용가능한 안전성은 먼저 하기의 심각한 부작용의 부재로서 정의하였다: 백신접종과 관련되지 않은 진단에 의해 설명되지 않는 임의의 심각한 임상적 병; 지속적 열 (24시간에 걸친 4회의 측정시 구강 온도가 ≥38.5℃, 연속적인 3일에 최대 일일 구강 온도가 ≥38.5℃, 또는 임의의 개개의 측정시 온도가 40℃ 초과); 2회의 연속 측정시 혈소판 감소증 (<100,000 개 혈소판/mm³), 백혈구감소증 (절대적 호중구 카운트 < 1000); 또는 3 이상의 연속일에 정상의 4배 초과의 혈청 아미노 알라닌 트랜스퍼라제 (ALT) 수준 (이는 다르게는 설명되지 않음). 또한, 본 백신의 사용과 결부될 수 있는 상당한 부작용을 암시하는 경험을 심각한 사건으로 기록하였다.

제0일에 0.5 ml의 미희석 백신을 지원자에게 피하 접종하였다. 면역화 후, 매 6시간마다 바이탈 사인을 기록하였다. 주사 부위를 조사하여 홍반의 최대 직경 및 경화성을 측정하여 매일 기록하였다. 임상 징후 (열 [>37.8℃], 발진, 구토, 점상출혈, 및 간과 비장 확장) 및 증상 (권태, 두통, 근육통, 관절통, 메스꺼움, 및 안구통 또는 광공포증 (photophobia))을 면역화한지 처음 20일 동안 매일 평가하였다. 증상은 온화함 (증상은 알아차렸지만 감시 활동은 계속함) 또는 심각함 (증상에 의해 침대를 강요함)으로서 등급화하였다. 지원자가 요청할 경우, 통증성 증상은 프로폭시펜 히드로클로라이드로 치료하였으며; 해열제는 사용하지 않았다. 증상 및 신체적 발견의 정상적인 체크리스트 상에 관찰결과를 기록하였다. 제21일에 지원자를 연구 감시로부터 해방되게 하였으며, 접종한지 1, 6, 12 및 24개월 후에 혈청학적 연구를 위하여 되돌아오도록 요청하였다.

2명의 건강한 플라비바이러스-면역 지원자를, USAMRIID에서 뎅기 1 45AZ5 백신의 부모 균주로 면역화하고, 2년 후 뎅기 3 CH53489 백신의 부모 균주로 면역화하였다. 연구로부터의 의학적 기록을 하기 징후 및 증상의 존재 또는 부재에 대하 여 검토하였다: 열, 발진, 권태, 두통, 근육통, 관절통, 및 안구통 또는 광공포증. 바이러스 혈증을 매일 측정하였다. 본 발명의 시도와는 반대로, 증상은 체계적으로 기록하지 않았으며, 증상의 강도를 등급화하지 않았다. 또한, 후기 연구 동안 USAMRIID에서 8명의 지원자에게 주어진, 뎅기 4 341750 Carib PDK 20을 사용한 임상 경험을 추출 요약하여 현재의 예방접종을 마친 사람의 것과 비교하였다 [Hoke, 1990, 상기 문헌].

실험실 평가. 헤모글로빈 및 헤마토크릿, 차별적 카운트를 이용한 백혈구 세포 카운트, 혈소판 카운트, 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 수준에 있어서의 일상적으로 이용가능한 의학적 시험을 위하여 격일마다, 그리고 제31일에 혈액을 지원자로부터 수집하였다. 또한, 바이러스 단리 및 항체 연구를 위하여 20일 동안 격일로 혈액을 수집하였다. 혈액 (20 ml)을 4℃에서 ≤2 시간 응혈되게 하고, 혈청을 1- ml 분취량으로 따라내어, 연구할 때까지 -70℃에서 동결 보관하였다.

바이러스 단리. 뎅기 바이러스 혈증의 측정을 위하여, 혈청을 해동시켜 C6/36 모기 세포 단일층 상에 접종하고, 28℃에서 14일 동안 배양하였다. LLC-MK₂ 세포 상에서의 플라크 분석에 의해 (Sukhavachana 등, 1966, Bull WHO 35, 65-66) 상청 배양액 수확물에 있어서 바이러스에 대하여 분석하였다. 혈청 중 바이러스의 양을 정량하기 위하여, 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) 모기 세포의 C6/36 클론 상에서 플라크 분석을 수행하였다 [Hoke, 1990, 상기 문헌]. 세포 배 양 플라스크에 혈장 희석물을 접종하고 35℃에서 1-2시간 동안 흡착시켰다. 행크 균형 염 용액 (Hank's Balanced Salt Solution) 및 0.75% 아가로스, 5% 락트알부민 가수분해물, 0.12 M NaHCO₃, 및 항생제로 구성된 오버레이 배지를 첨가하고, 모든 플라스크를 35℃에서 인큐베이션하였다. 7일 후, 플라스크를 5% 액체 뉴트럴 레드로 3-5시간 동안 착색시켰다. 18시간 후에 여분의 착색을 제거하고 플라크를 판독하였다.

혈청학. 항체 테스트에는 테스트되는 백신 중 균주로서 동일한 혈청형의 뎅기 바이러스를 사용하여 수행되는 ELISA, HAI, 및 플라크 감소 중화 테스트 (PRNT) 가 포함된다. 항-뎅기 IgM 항체의 검출은, 0.10 OD 단위를 초과하는 값이 양성인 것으로 간주되는, ELISA 의 변형에 의해 수행된다 [Innis, 1989]. HAI 테스트는, 억제제를 제거하기 위해 아세톤으로 추출된 혈청을 사용하여, 4-8 단위의 독립적인 항원을 사용한 마이크로부피로 변형된 표준 기술에 의해 수행된다 [Clarke and Casals, 1958, Am J Trop Med Hyg 7, 561-573]. Russell 등에 의해 기재된 방법 [Russell, 1967, 상기 문헌] 에 의해 PRNT 분석을 수행하였다.

통계 분석. 경향에 대한 Cochran-Armitage 테스트 및 Spearman 의 상관관계를 각각 사용하여 뎅기 2 백신 S16803 (PDK 30, 40 및 50) 및 뎅기 3 백신 CH53489 (PDK 10 및 20) 에 대한, 반응원성의 빈도와 정도 및 계대간의 관계를 분석하였다. 독립적으로 분석된 증상 및 징후는 안 증상, 두통, 권태, 근육통, 관절통, 발진 및 발열 (체온 > 37.8 ℃) 을 겪은 날짜 수 및 그의 존재 또는 부재를 포함하였다. 더욱 높은 PDK 수준이 더욱 낮은 반응원성과 관계가 없다는 귀무 가설을 5 % 의 확률로 평가하였다. 데이터를 조사하여, 각 바이러스에 대한 최적 계대를 각 지원자의 임상 및 면역학적 반응을 토대로 결정하였다. U.S. Army Medical Research and Development Command's Flavivirus Vaccine Steering Committee 에 의하여, 허용불가능한 부작용을 일으키지 않으나, 약 80 % 의 지원자를 면역시킨 계대가, 발전을 도모하기 위하여 선택되었다.

백신에 의한 감염의 정의

백신에 의한 감염은, 면역후 혈청 형태-특이성 중화 항체 또는 IgM 항-뎅기 항체의 존재에 의해 검출되는, 지원자에서의 뎅기 바이러스의 복제로서 정의된다. 바이러스혈증은, 항체 반응의 부재 하에 결코 검출되지 않기 때문에 감염 진단에 필수적인 것으로 포함되지 않는다. 백신 실패는 허용불가능한 역 임상 반응 또는 회복기의 IgM 또는 PRNT 항체의 발생에 대한 실패로서 정의된다.

실시예 3

약독화된 뎅기 백신에 대한 임상 반응

뎅기 2 S16803 백신

PDK 세포 중 50 번째 계대로부터 생성된 뎅기 2 균주 S16803 바이러스를 3 명의 지원자에서 테스트하였다. 지원자들은 구강 온도가 38.0 ℃ 를 초과하지 않고, 건강하였다. 3 명의 지원자 중 두 명은 권태, 두통, 및 안 증상 (안구통 또는 광공포증) 의 일과성 경미한 증상을 나타내었다. 실험적 발견은 3 명의 지원자 중 두 명에게서 경미한 ALT 상승 (< 2 ×정상) 을, 3 명의 지원자 중 한 명에게 서 경미한 백혈구감소증을 포함한다. PDK 50 백신의 허용가능한 안전성 프로필로 인하여, 임상 평가를 위해 그 다음으로 낮은 허용가능한 계대, PDK 30 이 선택되었다.

10 명의 환자에게 시험된 PDK 30 백신이 하약독화 (underattenuated) 되었고, 경미 내지 어느 정도의 적당한 뎅기과 혼화가능한 증상을 일으켰다. 4 명의 지원자 (40 %) 가, 백신접종 후 9 내지 14 일에 걸쳐 (평균 12 일) 최대 온도 38.5 ℃ 까지, 저등급 발열하였다. 80 % 가 발진을 일으켰다. 대부분의 지원자가 안 증상 (10/10), 두통 (9/10), 및 권태감을 경험함과 동시에, 70 퍼센트가 1 가지 이상의 두통, 안구통 및 광공포증, 권태 또는 근육통의 심각한 증상을 앓았다. 3 명의 지원자는 그들의 알라닌 아미노트랜스페라제 (ALT), 간 병리학의 측정치가 경미하게 상승하였다.

PDK 30 백신은 매우 반응원성이어서 지원자에게 더 테스트할 수 없었으므로, PDK 40 백신을 마스터 씨드로부터 생성하였다. PDK 40 으로 접종된 3 명의 지원자 중 두 명은 백신접종 후 저등급 체온 (< 38.1 ℃), 발진, 근육통, 및 두통과 함께 9-10 일간 경미한 뎅기성 증후군을 앓았다. 증상은 의약의 요구 또는 불능성 (disability) 없이 수일에 걸쳐 자발적으로 해결되었다. 수반하는 증상은, 한 명은 199 IU/ml 의 최대 ALT 수준으로 (정상의 4 배), 다른 한 명은 77 IU/ml 최대 ALT (정상에서 1.5 배 상승) 로의, 혈청 간 효소의 뜻하지 않은 상승이었다. 세 번째 지원자는 증상이 없었지만 ALT 가 또한 두 배 상승하였다 (최대 10² 까지). 모든 실험적 이상은 중재 없이 수일 내로 해결되고, 모든 지원자들은 백신 수령 후 21 일 내로 건강을 되찾았다. PDK 40 백신과 연관된 간염 발병의 비정상적인 빈도로 인하여, 이 제품에 대한 더 이상의 개발이 계획되지 않는다.

표 5 는 WRAIR 뎅기 2 백신을 사용한 초기 임상 경험을 요약한다. 발열 및 발진의 징후의 감소된 빈도가 계대 30 및 50 백신간에 명백하다. 또한, 계대가 증가하면서 최대 38.5 ℃ 로부터 정상으로 구강 온도가 하강하지만, 1 일을 초과하는 발열 기간에는 변함이 없다. 뎅기 2 백신에 대하여, 안 증상, 발진, 두통, 권태 및 근육통의 빈도 및 기간이 계대와 상당한 연관이 있었다.

뎅기 2 S16803 바이러스 백신 수령자에서의 임상 반응

계대	권태	두통	근육통	관절통	안 sx	발진	발열 T>37.8℃	발열 일수 (평균)	최대 발열
2-S16803-30	9/10	9/10	7/10	4/10	10/10	8/10	4/10	9-14 (12)	38.5
2-S16803-40	2/3	2/3	2/3	1/3	1/3	2/3	1/3	8,9	38.0
2-S16803-50	2/3	2/3	0/3	1/3	2/3	0/3	0/3	-	-

증상-일수

계대	권태	두통	근육통	관절통	안 sx	발진	발열 T>37.8℃
2-S16803-30	2.2	3.6	2.4	1.7	3.3	5.4	0.5
2-S16803-40	2.0	1.7	2.0	1.0	5.7	1.7	0.7
2-S16803-50	0.6	0.7	0.0	0.3	1.0	0.0	0.0

뎅기 3 CH53489 바이러스 백신 수령자에서의 임상 반응

A: 반응을 보이는 환자의 수
백신	권태	두통	근육통	관절통	안 sx	발진	T>37.8 ℃ (일수)	최대 발열
3-CH53489-0	2/2	2/2	2/2	1/2	2/2	2/2	2/2 (5-9)	40.6
3-CH53489-10	1/3	2/3	2/3	1/3	1/3	2/3	1/3 (10,11)	38.2
3-CH53489-20	3/6	5/6	3/6	4/6	4/6	1/6	1/6 (3)	38.7

B: 증상 일수
백신	권태	두통	근육통	관절통	안 sx	발진	T>37.8 ℃ (일수)
3-CH53489-0	3.5	4.0	4.5	2.0	3.5	7.5	5.0
3-CH53489-10	0.3	3.3	2.3	1.0	1.3	6.3	0.7
3-CH53489-20	1.7	2.8	1.0	2.0	1.3	0.8	0.2

a: 1차 개 신장 계대

b: 항-뎅기 IgM 양성 또는 PRNT50 혈청전환율로서 정의됨

c: 중화 항체 역가 > 1:10 (PRNT50) 로서 정의됨

[ ] 확대된 임상 연구에 제안된 균주

뎅기 3 CH53489 백신. WRAIR 에서 개발된 뎅기 3 백신 (CH53489, PDK 0) 을 바이러스 2 ×10⁴ pfu 의 0.5 ml 피하 접종으로서 두 명의 건강한 황열병-면역 남성 지원자에게 투여하였다. 즉각적인 후 면역 과정은 일어나지 않았다. 6 일까지, 두 지원자 모두 고열, 오한, 근육통, 두통, 권태, 및 미만성 홍반성 발진을 특징으로 하는 어느 정도 심각한 뎅기열을 앓았다. 두 지원자 모두 혈소판감소증 및 백혈구감소증을 앓았지만, 출혈열의 징후는 없었다. 5 일간 지속된 발열 기간 후, 두 남성들은 빠르게 회복되었고, 21 일경 완쾌하였다. 두 환자에 의해 경험한 중병으로 인하여, 더이상의 상기 계대의 테스트는 이루어지지 않았다. 이어서, PDK 10 및 PDK 20 계대가 백신 후보로서 제조되었다.

PDK 20 백신을 6 명의 지원자에게 제공하여 경미한 반응원성을 일으켰다. 한 환자는 일과성 발열 (최대 38.2 ℃), 인두염, 및 경관 림프절병증과 함께 3 일에 조기 열병을 경험하였다. 지원자의 혈청으로부터 뎅기 바이러스가 단리되지 않았다. 상기 환자는 백신접종과 직접적인 관련이 없는, 열병과 함께 병발성 병을 앓은 것으로 생각되었다. 6 명의 지원자 중 4 명이 발진 없이 단생의 (short-lived) 경미한 뎅기 증상을 앓았고; 관절통, 안구통, 및 두통을 가장 빈번히 호소하였다. 그러나, 한 지원자는 3 일간 더욱 심각한 증상의 두통, 권태, 및 안구통 을 앓았다. 또한, 그는 백혈구감소증을 앓고, ALT 수준의 상승을 유지하였다; 상기 실험실적 이상은 31 일째에 해결되었다. 또 다른 지원자는 2 ×정상 미만으로, 경미하고 가역성으로 ALT 가 단독 상승하였다. PDK 20 백신은 한계적으로 허용가능한 반응원성과 함께 안전하므로, 그 다음으로 최저인 사용가능한 계대 백신 바이러스 (PDK 10) 을 테스트하였다.

PDK 10 바이러스는 수령자에게 너무 반응원성인 것으로 증명되었다. 3 명의 지원자 중 한명은 10 및 11 일째에 저등급 발열되었고 (최대 38.3 ℃), 13 일째에 개화성 발진되었다. 또 다른 지원자는 백신접종 후 6 내지 9 일째에 왁싱 (waxing) 및 와닝 (wanning) 발진과 관계된 계속적인 가려움증, 및 약한 경관 및 겨드랑 림프 결절을 앓았다. 이어서, 그는 10 내지 12 일에 권태, 두통 및 근육통과 함께 반점구진성 발진을 앓았다. 상기 지원자는 백신에 대한 특이체질성 알레르기 반응을 보인 후, 전형적인 뎅기성 병을 앓았다. 상기 두 지원자들은 또한 < 2 ×정상의 ALT 수준 상승 및 백혈구감소증의 실험실적 이상을 나타내었는데, 이는 31 일째에 해결되었다.

표 6 은 뎅기 3 CH53489 백신에 대한 반응을 요약한다. 계대와 함께 덜 빈번하고 더욱 짧은 기간의 징후 및 증상의 경향에도 불구하고, 어느 분석에서도 계대가 통계적 유의성에 도달하지 않았다.

뎅기 4 341750 백신. 8 명의 지원자가 PDK 20 백신 [Hoke, 1990, 상기 문헌] 10⁵ PFU 를 제공받았다. 5 명의 지원자들은 거의 식별되지 않는 반점, 표백성 발진 및 극미한 온도 상승을 겪었다 (최대 38.1 ℃). 바이러스혈증 및 항체 반응은 또한 상기 5 명의 지원자에게 나타났다 (63 %).

더욱 낮은 계대가 더욱 감염성일 수 있는 것으로 예상하여, 새로운 DEN-4 341750 후보 백신을 PDK 계대 15 로부터 제조하였다. 3 명의 지원자가 상기 백신을 제공받고, 두 명이 극미한 증상을 경험하였다. 세 번째 지원자가 8 일째에 갑자기 발열, 얼굴 및 사지의 부종, 심각한 피로, 발진, 안구통, 광공포증, 및 관절통과 함께 앓았다. 그 다음 3 일에 걸쳐, 최대 39.6 ℃ 로 발열이 지속되었으나, 징후 및 증상은 자발적으로 해소되었다. 백신접종에 대한 상기 심각한 부작용으로 인하여, 더이상의 PDK-15 백신의 사용을 종료하고, PDK-20 을 선택하여 더욱 평가하였다.

실시예 4

바이러스혈증 및 약독화된 뎅기 백신에 대한 면역 반응

표 7 은 바이러스혈증 및 WRAIR 뎅기 백신을 사용한 면역 반응을 기재한다. 각 백신의 전염성을 하기 요약한다.

뎅기 2 S16803 백신. PDK 50 백신의 수령자 모두가 바이러스혈증이 없었지만, 3 명중 두 명은 60 일까지 저-적정 중화 항체가 발생되었다. 상기 발견은 백신 바이러스의 인간에 대한 전염성이 감소되었다는 것을 제안한다. 반대로, 3 명의 뎅기 2 PDK 40 백신접종자 중 2 명이 명백한 바이러스혈증을 앓았고, 모두 백신접종 후 고적정 항체가 발생되었다. 바라는 바와 같이, 뎅기 2 PDK 30 백신의 감염성이 최고였다: 바이러스혈증이 모든 10 명의 지원자에게서 검출되고, 모든 지원 자들은 60 일까지 >1:60 의 항체 적정을 중화시키는 것으로 혈정전환하였다.

뎅기 3 CH53489 백신. 백신 바이러스의 소형 플라크 표현형 및 온도 민감성을 유지하는 뎅기-3 바이러스가 뎅기 3 PDK 0 백신의 2 명의 황열병 면역 수령자에게서 6 일 및 7 일간 회수되었다. 이어서, 2 차-전염성 교차 반응성을 갖는 고적정 PRNT50 및 적혈구응집억제 (HAI) 항체를 두 지원자에게서 30 일 및 60 일째에 수합한 혈청에서 측정하였다. 전염성은 뎅기 3 PDK 10 약독화된 백신을 제공받은 환자들에게서 유사하였다: 3 명 중 2 명이 바이러스혈증을 앓고, 모두에게서 백신접종 유도 중화 항체가 발생되었다. 반대로, 뎅기 3 PDK 20 백신접종자 6 명 중 2 명이 검출가능한 바이러스혈증을 앓고, 이어서 3 명의 지원자가 혈청전환되어, 감소된 전염성을 반영하였다.

뎅기 4 341750 백신. 8 명의 지원자가 PDK 20 백신 10⁵ PFU 을 제공받고, 5 명에게서 바이러스혈증 및 항체 반응이 일어났다 (63 %). 상기 후보의 저계대로부터 제조된 백신, PDK 15 가 더욱 감염성이었다. 최대 적정 15 pfu/ml 로 하여, 백신접종 후 8 및 10 일째에 단일 지원자로부터 바이러스를 단리하였다. 이어서, 상기 지원자는 2 차 HAI 반응과 함께 항체 적정 450 을 중화시켰고, St. Louis 뇌염 바이러스에 예비 노출된 것이 발견되었다 (백신접종 전 PRNT 적정 1:20). 검출가능한 바이러스혈증이 없는 두 명의 지원자가 백신접종 후 30 일까지 1:10 및 1:40 중화 적정시켰다.

실시예 5

후보 백신의 선택

WRAIR PDK-약독화된 백신의 안전성을 테스트하는 확장 프로그램을, 각 혈청형에 대한 백신의 현저한 특징을 나열하는 표 8 에 나타낸다. 증가하는 PDK 계대의 결과 평균 병 스코어가 감소되고, 이는 지원자 당 증후의 수 및 기간을 평가한다. 또한, PDK 계대의 상승은 뎅기 4 백신을 제외하고 바이러스혈증의 감소된 평균 일수와도 관계된다. 테스트된 뎅기 2, 3, 및 4 백신 중에서, 단지 하나의 계대만 안전하고 허용가능하게 반응원성이고, 확장된 임상 연구에 적절한 것으로 판단되었다: 뎅기 2 PDK 50, 뎅기 3 PDK 20, 및 뎅기 4 PDK 20. 그러나, 감염된 수령자의 백분율은 증가하는 PDK 계대와 함께 하락하였다. 중화 항체 적정 ≥1:10 인 백분율로서 정의되는 혈청 전환은 넓은 신뢰 구간 안에서 유사하게 하락하였다.

논의

WRAIR 은 약독화된 뎅기 생백신의 개발에 오랫동안 참여해왔다. WRAIR 및 Mahidol 뎅기 백신 프로그램 모두는 개의 신장 세포 중 몇 계대 (PDK) (조직 배양에서의 반복된 성장) 를 통한 약독화에 의해 몇 가지 생백신을 개발해왔다. 소수의 지원자에게서의 예비 검사 결과는 WRAIR 후보 백신의 안전성을 구축하였다. 65 명의 수령자 중 어떠한 지원자도 응급 치료를 필요로 하지 않고 심각한 손상을 유지하지 않았다. 세 명의 지원자가 뎅기 백신접종과 관계된 일과성 특이 반응을 겪은 결과, 그 이상의 임상적 진전으로부터 수령한 백신이 회수되었다. 불편함에도 불구하고, 하약독화된 백신을 사용한 실험적 감염은 수용가능하였다.

임상 실험은 백신 바이러스의 PDK 계대의 증가가 지원자들에 대한 약독화를 증가시켰다는 것을 나타내었다. 상기 효과는 모 (parental) 비계대 비아러스가 비변형 뎅기열 및 뒤이은 20 PDK 계대 허용가능한 반응원성을 초래하는, 뎅기 1 및 뎅기 3 바이러스로 가장 잘 나타난다. 그러나, 증가하는 PDK 계대는 백신 바이러스의 감염성을 감소시켰고, 이는 면역원성을 감소시켰다. 또한, 인간에서의 백신 바이러스와의 감소된 바이러스혈증은 붉은털 원숭이에서의 것과 상관관계 있는 것으로 나타난다 (뎅기 4 PDK 15 는 예외). 상기 발견은 지원자에서의 약독화된 뎅기 바이러스 백신의 전염성이 면역원성에 동등한 것으로 증명되었음을 제안한다. 계대와 반응원성간의 관계는 주의깊에 이해되어야 하는데, 이는 하나의 증상을 경험한 환자가 몇 가지 증상을 경험하게 되기 때문이다. 우리의 분석법은 상기 증상들의 독립성을 가정하므로, 독립적인 p-값에 기재한 이해는 빈약할 수 있다. 또한, 우리는 발진이 계대와 강한 연관을 나타내었다고 생각한다 (존재에 대하여 독립적 p = 0.009, 기간에 대하여 p = 0.01). 이는 뎅기 2 또는 3 백신에 대하여, 발진 및 다른 증상간에 유의한 상관관계가 결여됨으로써 지지된다 (Spearman 의 테스트).

허용가능한 안전성 프로필을 갖는 백신만이 확장된 임상 테스트에 선택된다: 뎅기 1 45AZ5 PDK 20, 뎅기 2 S16803 PDK 50, 뎅기 3 CH53489 PDK 20, 및 뎅기 4 341750 PDK 20. 소수의 지원자들로 인한 혈청전환에서의 넓은 신뢰 구간으로 인하여, 뒤이은 연구는 4 개의 선택된 백신 각각의 수령자의 수를 증가시켰다. 또한, 또 다른 테스트는 상기 약독화된 백신의 면역원성이 상기 연구에 사용되는 단일 투여량 대신 두 가지 투여량의 투여를 통하여 상승될 수 있는지의 여부를 결정 할 것이다.

실시예 6

1 가 백신의 확장 연구; 두 가지 투여량으로서 제공되는 1 가 백신; 및 1 및 2 가지 투여량으로서 제공되는 4 가 제제로서 혼합된 1 가 백신

연구 고안: 단일 투여, 이어서 2 가지-투여량 백신접종 스케쥴로 제공된 4 개의 1 가 백신의 안전성 및 면역원성을 평가하는 것이 목적이었다. 이어서 조합 4 가 백신의 안전성 및 면역원성을 평가하였다. 환자를 두 곳, Baltimore 에 있는 University of Maryland 및 Washington DC 의 WRAIR 으로부터 분리하여 채용하였다. 22 명의 환자의 첫 번째 군을, 각각 일가 뎅기의 단일 투여량 또는 황열병 17D 바이러스 (Connaught) 를 제공받은 4 또는 5 명의 4 군으로 나누었다. 17 D 황열병 백신은 반응원성에 대한 대조구 및 기준점으로 작용하였다. 또 다른 31 명의 환자를, 1 달에 절반 및 3 달에 다른 절반으로, 하나의 1 가 백신을 2 가지 투여량으로 제공한 7 내지 8 명의 4 개 군으로 나누었다. 최종적으로, 10 명의 지원자에게 4 가 백신을 2 또는 3 가지 투여량으로 제공하였다. 제 1 의 4 명의 4 가 수령자들은 0 및 1 달에 백신접종 받았다. 후자의 6 명의 4 가 수령인들은 0, 1 및 4 달에 백신접종 받았다. 10 명의 4 가 백신 수령자를 제외한 모든 환자가 무작위로, 그리고 이중-맹검 방식으로 백신 혈청형을 제공받았다.

환자: 환자들은 18 내지 50 세의 정상적인 건강한 성인이었다. 모든 환자들은 간염 B, C 및 HIV 에 대해 혈청음성이었다. 모든 환자들은 연구 시작 전 적혈구응집 억제 분석법에 의해 뎅기 1-4, JE, SLE, 및 YF 에 대해 혈청음성이었다.

백신: 4 명의 혈청형 백신 후보를 임상적인 질병을 앓는 사람들로부터 처음부터 단리하였다. 이어서, 상기 기재한 바와 같이 각각을 1차 개 신장 (PDK), 이어서 태아 붉은털 원숭이 폐 세포에서의 연속적 계대에 의해 변형시켰다. 상기 지원자들을 인간 지원자에서의 예비 실험을 기준으로 선별하였다. 각 동결건조된 1 가 백신을 멸균수와 함께 재구성하고, 0.5 cc 의 부피에 제공하였다. 혈청형 1-4 의 투여량이 각각 뎅기 1, 2, 3, 및 4 의 10⁶, 10⁶, 10⁵ 및 10⁵ pfu 였다. 4 가 백신 투여량은 각 재구성된 1 가의 0.25 cc 를 혼합하여 제조되고, 최종 부피 1 cc 로 제공되었다. 4 가 백신의 투여량은 1.1-2.8 ×10⁶ pfu 였다. 모든 백신접종은 팔의 상부에 피하 제공되었다.

임상 안전성: 백신접종에 대한 반응을 각 백신접종 후 3 주 동안의 매일 증상 기록 및 주기적인 의사의 평가의 조합에 의해 평가하였다. 그 기간중 반응 및 바이러스 혈증이 가장 근접하였던 기간인, 백신접종 후 1 주의 인큐베이션 기간 후 5 내지 7 일 동안의 세밀한 관찰을 위해, 환자를 연구기간에 숙박시켰다. 환자를 진찰하고, 열, 오한, 두통, 안와후통, 근육통, 관절통, 발진 및 기타의 증상에 대해 구체적으로 질문하였다. 각 증상은 0 (없음), 1 (정상 활동에 영향을 미치지 않음; 의약을 요구하지 않음), 2 (의약을 요구 또는 활동의 변화), 또는 3 (병상안정 요구 또는 의약에 의한 경감) 의 단계로 등급되었다. 가장 일반적인 증상을 4 개의 카테고리로 분류하였다. 이러한 카테고리는 하기와 같다: 1) 주관적 열 및 오한, 2) 두통 및 안와후통, 3) 근육통 및 관절통, 및 4) 메스꺼움, 구토 및 복통 을 포함하는 위장 장애. 각 카테고리의 증상 지수를 매일의 가장 높은 증상 등급의 및 수일 후 발현된 증상의 기간을 곱하여 계산하였다. 증상이 24 시간 동안 발생되었다면, 1 일의 기간에 해당된다. 반응원성 지수 (RI) 는 간단하게는 각 카테고리에 대한 증상 지수의 합이다. RI 는 각 환자의 백신 반응을 요약한다. 증상 카테고리 지수 및 RI 는 환자간 백신 반응 및 백신 혈청형의 반-정량적 비교를 가능하게 한다.

연구 동안 일련의 CBC, 혈소판 카운트, AST 및 ALT로써 환자들의 혈액 및 간 독성이 조사되었다.

심각한 유해사례는 다른 가능성 있는 원인이 부족한 심각한 질병으로 정의되는데, 이는 발열이 24 시간 이상 연속적으로 38.5℃ 초과 또는 3일 연속 Tmax 가 38.5℃ 초과 또는 하루 구강 온도 104℃ 초과, 호중구감소증 1,000/ml 미만 또는 2회 연속 측정시 혈소판감소증 90,000/ml 미만, 또는 혈청 ALT 또는 AST가 정상의 5배 초과인 경우를 말한다.

면역원성: 혈구응집억제분석은 Clarke 및 Cassals, 1958 (Am J Trop Hyg 7, 561-573) 방법이 사용되었고, 뎅기 IgM 및 IgG 는 거의 마지막 6명의 4가 환자를 대상으로 포획 ELISA 로써 측정하였다. 뎅기 및 황열 중화 항체는 각 백신접종 후 0일 및 30일에 플라크 감소중화시험으로 측정하였다. 종말점 정량 연구는 최종 백신접종 후 30일의 중화 항체를 측정하는 것이다. 중화 항체 혈청전환은 혈청 희석비율이 최소 1:5에서 플라크의 50% 감소로서 정의한다. 바이러스혈증은 초기 및 2차 백신접종 후 7-14일의 혈청으로 측정된다. 바이러스 단리에 사용되 는 방법은 증폭용으로는 LLC-MK₂ 또는 C6/36 세포 및 플라크 형성용으로는 Vero를 이용하고 Yuill, 1968 (Am J Trop Med Hyg 17, 441-448)에서 채택된 지연 플라크 방법이었다.

1회 및 2회 투여 연구자료들이 이 보고를 위하여 결합되었다. 환자 특징은 표 9에 나타낸다. 전체 59명의 정상 환자들에게 뎅기 바이러스 백신이 투여되었다; 49명은 1가 시험물질을 받았고 10명은 4가 백신을 받았다. 4명은 인증된 17D 황열 백신접종 (Connaught)을 받았다.

환자 특징

백 신	환자수 (2회 투여자 수)	성	인 종	평균 연령
Den-1	12 (8)	7M/5F	6W/6B	32
Den-2	12 (8)	7M/5F	7W/5B	36
Den-3	13 (8)	9M/4F	8W/5B	36
Den-4	12 (7)	6M/6F	4W/6B/1H/1AmI	33
4가	4 (4)	3M/1F	4W	26
YF 17D	4 (0)	3M/1F	3W/1B	30

실시예 7

반응원성

국부 반응. 59명의 뎅기 백신 수용자 중에서 19명 (32%)이 주사부위에서 경미한 팔 통증이 나타났다. 이 중에서 7명이 DEN-1, 4명이 DEN-2, 1명이 DEN-3, 1명이 DEN-4 및 5명이 4가를 받았다. 단지 5명이 24 시간 후에 주사부위에서 통증이 나타났다. 어느 것도 팔의 사용에는 영향을 주지 않았다.

전신 반응. 59명의 뎅기 수용자 중에서 20%가 첫 번째 백신접종에서 전혀 증세가 없었으나 2차 백신접종에서는 환자의 70%가 무증상이었다. 3차 투여를 받은 4명의 환자들은 그것과 관련된 어떠한 증세도 없었다. 뎅기 백신접종에서 가장 흔히 보고되는 반응은 두통 및 근육통이다. 그들은 심각성에 있어서 다양하다. 도 1 은 1차 백신접종에서 1등급 이상 증상의 발생인데, 이는 매일 활동에서 변화를 일으키거나 안정을 위한 약물치료를 받게 된다. 1차 백신 투여 후에, 5명의 환자 (8%), 1명의 혈청형 1, 1명의 혈청형 4 및 3명의 4가는 1일 미만 지속되는 한기, 근육통, 두통 또는 메스꺼움의 심한 3등급 증상을 나타내었다. 어떤 환자도 재백신접종의 3등급 증상은 없었다.

RI 는 0 내지 35의 범위에 있다. 표 10은 각 백신의 보고된 반응원성를 비교한다. DEN-1 1가 및 4가 백신은 더 많은 반응원성과 연관이 있다. 모든 뎅기 백신의 2차 또는 3차 투여로 초기 백신접종에서 중등도내지 심한 증상을 가진 그러한 환자에서조차 일정하게 반응이 거의 없었다.

평균 반응원성 지수

백 신	총 환자수	1차 투여 RI (n)	2차 투여 RI (n)	3차 투여 RI (n)
Den-1	12	7.4 (12)	0.5 (8)	-
Den-2	12	3.8 (12)	0.3 (8)	-
Den-3	13	2.9 (13)	0.8 (8)	-
Den-4	12	3.7 (12)	0.5 (6)	-
4가	10	9.3 (10)	1.9 (10)	0.0 (4)
YF 17D	4	3.8 (4)	-	-
- = 미실시

도 2는 혈청에 의한 RI의 빈도 분포를 나타낸다. 8명의 환자 (14%)는 발열 (>100.4℉)이 생겼다. 8명 중에서 4명이 DEN-1, 1명이 DEN-2, 1명이 DEN-3, 2명이 4가를 받았다. 최고 및 최장 발열은 DEN-1 수용자에서 Tmax 103.3℉ 및 3일 동안 나타났다. DEN-1을 받은 단지 한명의 다른 환자는 1일 이상의 발열이 있었다. 8명의 발열 발작중에서 7명이 1차 백신접종에 이어 일어났다.

16명의 환자 (27%) 가 1차 백신접종에서 몸통 및 사지를 포함하여 일반화된 발진을 나타냈다. 발진은 통상 홍반성, 반점상구진 및 유소양성이다. 일반화된 발진을 가진 16명 중에서 단지 7명이 발열이 있었다. 발진을 가진 16명 중에서 5명이 DEN-1, 2명이 DEN-2, 1명이 DEN-3, 3명이 DEN-4 및 5명이 4가를 받았다. 발진은 전형적으로 백신접종후 8-10일에 뚜렷해지고 3-4일 후에 해결된다. 어떤 환자도 점상출혈, 자반증 또는 흉터형성이 생기지 않았다. 어떤 환자도 재백신접종에서 발진이 생기지 않았다.

위장관 증상은 비교적 흔하며, 환자의 1/3에서 일어나지만, 부드럽고 간단하여 24 시간 이상이 지속되지 않았다. 한 명의 DEN-4 수용자는 1일 동안 경련성 복부 통증과 관련된 심한 메스꺼움이 생겼다.

6명의 환자 (10%), 즉 5명 뎅기 및 1명 황열 17D 수용자는 절대 호중구 수가 1000/ml 이하의 일시적인 호중구 감소증이 생겼다. 최저치는 DEN-1 환자에서 288 이었다. 호중구 감소증은 전형적으로 2-3일 후에 해결된다. 어떤 환자도 혈소판 감소증이 생기지는 않았다. AST 또는 ALT에 있어서 임상학적으로 유의적인 증가는 없었다.

1차 뎅기 바이러스 노출을 받은 비면역 성인의 군에서 예상되는 것처럼 어떤 사람도 뎅기 출혈열의 임상학적인 증거가 생기지 않았다.

실시예 8

면역원성

바이러스혈증은 10명의 환자 (17%)에서 검출되었는데, 1명은 DEN-2, 4명은 DEN-3, 1명은 DEN-4 및 4명은 4가를 받았다. 어떤 DEN-1 바이러스혈증도 검출되지 않았다. 4가 환자에서 단리된 바이러스의 혈청형은 아직 동정되지 않았다. 모든 검출된 바이러스혈증은 바이러스 1차 투여 후에 나타났다. 이상하게도 발열은 3명의 4가 수용자에서 단지 바이러스혈증과 함께 나타났다. 모든 바이러스혈증 환자들은 중화 항체가 생겼다. 1명은 바이러스혈증에서조차 IgM 또는 IgG 반응이 생기지 않았다.

표 11은 1가 백신접종에 대한 항체 반응을 요약한다. 중화 항체는 IgM 및 IgG 보다 더 자주 검출되었다. 어떤 혈청전환도 IgM 또는 IgG에 의해 검출되지 않았는데, 그것은 또한 혈청 희석비 1:10의 PRNT₅₀에 의해 발견되지 않았다. 존재할 때에는, IgM은 백신접종후 14일 까지 41%, 21일 까지 17%, 30일 까지 42%로 양성이었다. IgM은 전형적으로 1차 백신접종후 30일 까지 정점이었다. 하나의 예외는 4가 수용자에서 나타났는데, 이것의 IgM은 2차 백신접종후 3일에 정점이었다. IgM은 3개월 이상 지속될 수 있다. 중화 항체에 의한 혈청전환율은 1가 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각에 대해 100%, 92%, 54% 및 58% 이었다. 존재할 때에는, 중화 항체는 전형적으로 1차 백신접종후 30일 까지 검출되었다. 0 내지 30 사이의 어떤 시간대도 중화 항체에 대해 평가되지 않았다. 백신의 2차 투여로 4배 이상의 DEN-2 GMT 가 증가되었는데, 이는 다른 혈청형에서는 관찰되지 않았다. 두명의 DEN-3 환자는 백신의 2차 투여후에 혈청이 전환되었는데, 한명은 1개월에 다른 한명은 3개월에 전환되었다. 그들은 1회 투여후에 중화 항체가 생기지는 않았다. 흥미롭게도 이러한 두 환자의 IgM/IgG 패턴은 2차 투여후에 2차 반응을 제시하며 이는 1차 투여로 면역학적으로 민감하게 되었다는 것을 암시한다.

Dengue, SLE, JE 및 YF의 예비 음성 혈구응집억제분석에도 불구하고, 시험한 53명중 5명 (9%)은 IgM/IgG 비율 <1.8의 2차 항체 반응 패턴이 생겼다. 5명 모두 백신접종 전에 동일원인 뎅기 중화 항체에 대해 음성이었다. 이것은 플라비바이러스에 대해 이전의 잠재 노출을 암시한다. 우리는 이차 및 1차 항체 응답자의 평균 RI 사이에 어떤 유의적인 차이를 발견하지 못하였다(9.6 vs 5.8, p=0.19).

IgM/IgG 또는 중화 항체가 생기지 않는 12명의 1가 환자가 있었다. 1명은 DEN-2, 6명은 DEN-3 및 5명은 DEN-4를 받았다. 항체 비응답자군의 평균 반응원성 지수는 1이하였는데, 이는 형태 2, 3 및 4 중화 항체 응답자의 평균 RI (0.9 vs 4.9, p<0.003) 와 유의적으로 차이가 있었다.

우리의 연구는 25명의 흑인 및 31명의 백인 환자로 구성되어 있다. 이러한 두 인종군의 평균 RI 사이에는 중요한 차이가 없었다. 이것은 흑인들 중에 더 순한 뎅기 질병 심각성을 암시하는 어떤 역학적 증거가 있기 때문에 흥미롭다.

IgM 및 PRNT₅₀ 에 의한 1가 백신 혈청전환율

백 신	1차 투여후의 혈청전환		1차 투여 GMT-1*	2차 투여후의 혈청전환		2차 투여 GMT-1	누적 혈청전환
	IgM(+) PRNT50			IgM(+) PRNT50			IgM	PRNT50
DEN-1	10/12	12/12(100%)	668	0/2	-	513	10/12	12/12(100%)
DEN-2	9/12	11/12(92%)	112	0/3	0/1	559	9/12	11/12(92%)
DEN-3	4/13	6/13(53%)	15	2/9	1/7	16	6/13	7/13(54%)
DEN-4	5/12	7/12(58%)	17	0/7	0/5	9	5/12	7/12(58%)
YF 17D	0/4	4/4(100%)	2935	-	-	-	0/4	4/4(100%)
* 백신접종후 30일 경과의 역가 사용; 계산상 음성 역가에 대해 1을 사용함 - = 미실시

4가 백신 수용자의 반응원성 및 면역원성

지원자	백신 계획 (개월)	반응원성 지수			후 30일에 측정된 혈청형 중화 항체
		투여 1	투여 2	투여 3	투여 1	투여 2	투여 3
33	0,1	16	0	-	1,2,3,4	1,2,3,4	-
34	0,1	0	0	-	2	1,2	-
35	0,1	4	0	-	1,2,3,4	1,2,3,4	-
36	0,1	15	3	-	1	1,3	-
37	0,1,4	2	0	0	1	1	1,2,3
38	0,4	35	14	-	1,2	1,2,3	-
39	0,1,4	18	0	0	1,3,4	1,3	1,2,3,4
40	0,1,4	2	0	0	1	1	1,3
41	0,1,4	1	2	0	2	2	1,2,3,4
42	0,1	0	0	-	2	1,2	-

1가의 혈청전환율 및 4가의 다중투여

백 신	DEN-1 Ab	DEN-2 Ab	DEN-3 Ab	DEN-4 Ab
1가 1회 투여	12/12	11/12	6/13	7/12
4가 1회 투여	7/10 p<.05	6/10 p>.07	3/10 p>.4	3/10 p>.18
4가 2회 투여	9/10	6/10	5/10	2/10
4가 3회 투여	4/4	3/4	4/4	2/4

연령, 성별

표 12 는 10 명의 4 가 백신 피험자에서의 PRNT 혈청전환 결과를 보여준다. 첫 4 명의 피험자는 0 및 일개월에 2 번의 백신접종을 받았다. 한 피험자는 30 일에 두 번째 백신 접종을 놓치고, 60 일에 백신접종 받았다. 다른 6 명의 피험 자는 0 및 일개월에 백신접종을 받고, 반응이 불완전한 경우 4 개월째에 3차 백신 접종을 받았다. 두 피험자는 단일 투여후 4 개 모두 혈청형에 중화 항체를 생성하였다. 또 다른 두 4 가 수용체는 4 개월째 백신접종후 4 개 모두 혈청형으로 혈청전환되었다. 다른 두 개는 3 가 반응을 보였다. 1 또는 2 개월째의 주어진 4 가의 2차 투여는 혈청전환을 두드러지게 증가시키지는 않았다. 이러한 10 명의 4 가 피험자 중에서 전체 혈청전환율은 DEN-1,2,3 및 4 에 각각 100 %, 80 %, 80 % 및 40 % 였다.

실시예 9

한 연구가 2-레벨 2⁴ 펙토리알(factorial) 고안으로, 4 가 백신에서 각 혈청형 구성의 상호작용을 측정하기 위해 고안되었다.

54명의 피험자가 각 혈청형의 2 투여 수준의 15 순열로 주어졌다. 결과는 도 3 에 도시된다. 고 투여 H 는 10⁵ 내지 10⁶ pfu/ml 의 범위의 희석되지 않은 백신을 나타내며; 낮은 투여 L 은 약 10^3.5 내지 10^4.5 pfu/ml 으로되는 희석되지 않은 백신의 1:30 희석을 나타낸다.

0 및 1 개월 째에 6 개 피험자를 전-투여 4 가 백신접종하였다. 피험자가 4 가 중화 항체 반응을 하지 않는다면, 4 개월 째에 3차 투여를 한다. 결과는 도 4 에 도시된다.

0 및 1 개월 째에 4 명의 인간 피험자에 혼합 전-투여 (full-dose) 4 가 백신을 주사 투여하였다. 종말점은 두 번째 백신접종후 1 개월에서의 임상 안정성 및 중화 항체이었다. T-세포 반응이 첫 4 피험자에서 측정되었다. 결과는 도 5 에 도시된다.

결과는 4 가 백신(16 제제)이 64명의 비 면역 미국 지원자중에 안전한 것으로 나타났음을 보여준다. 반응원성은 다양하였다. 4 개 제제는 3 가 또는 4 가 중화 항체 반응을 모든 지원자에게서 이끌어 내었다. 1 가 실험에 따라, 1 개월째에서 4 가 백신의 2차 투여는 두드러진 반응원성를 유도하지 못했을 뿐만아니라, 중화 항체 반응을 증가시키지 못했다. 중화 항체 반응의 종말 적정은 진행중이다. T-세포중 기억 인터페론-감마 반응은 중화 항체가 없었을 때 측정될 수 있다. 4 개월 이상의 투여간격이 향상된 4 가 혈청전환을 야기할 수 있다.

토의

상기 백신들은 야생형 뎅기의 감염실험의 전통적 설명과 비교시, 인간에서 약화된 것으로 나타난다(Simmons 등, 1931, Manila Bureau of Printing). 반응원성을 정량하기위해 자기 보고된 증상의 기간 및 심각성에 기초한 분수 스케일(numeric scale)을 이용하였다. 상기 방법은 백신-관련 반응을 과대 평가하는 경향이 있다. 이상적으로는 천연 뎅기 감염의 경우로 확인되어야 한다. 그러나, 부정확한 RI 도 개인과 그룹간의 증상을 타당하게 비교하게 한다. 1 가 백신 테스트의 결과는 약화의 정도가 4 개의 뎅기 백신 후보중 다양할 수 있음을 보여주었다. 45AZ5 PDK20가 가장 약하게 약화되고, 최고의 역가 및 균일한 혈청전환을 야기하였다. DEN-2 후보, S16803 PDK50 는 유사하게 양성 반응원성 프로파일과 함께 거의 100 %의 혈청전환을 야기하였다. 상기 Den-3 및 Den-4 는 낮은 반응원성 프로파일을 가지나, 혈청전환율은 단지 50 내지 60 % 였다. 유형 3 및 4, 더 낮은 면역원성 종의 투여는 유형 1 및 2 보다 10 배 이하임을 주목해야한다.

바이러스의 2차 투여는 현저하게 거의 반응에 관여되지 않는다. 그러나, 1 또는 3 개월에 1 가 백신의 2차 투여의 잇점은 적다. Den-1 및 2 는 이미 균일하게 면역원이라서 추가 투여가 불필요할 수 있다. 그럼에도 불구하고, Den-2의 GMT는 4 배 이상 증가되었다. 이는 2차 투여후 낮은 수준의 바이러스의 복제, 또는 증폭 반응을 이끌어내는 충분한 항원 질량을 함유하는 투여의 증거일 수 있다. 이 중화 항체 반응의 패턴은 또한 17D YF로 두 번째 백신접종으로 보여질 수 있다(Wisseman, 1962, Am J Trop Med Hyg 11, 570-575). Den-3의 1차 투여는 이차 항체 반응 패턴으로, 2차 투여후 혈청전환된 두 1 가 피험자를 민감하게 할 수 있다. 이것은 중화항체 평가가 유형 3 백신 후보의 적당한 면역 반응을 감지할만큼 민감하지 않을 수 있다는 것을 암시한다. 2차 투여는 유형 4 에 어떤 새로운 혈청전환자를 추가시키지 않았다. 1 가 DEN-1 또는 DEN-4의 2차 투여를 부여하는 데에서 투여 및 시험된 스케줄으로 어떤 명확한 추가 효과가 없었다.

1 가 백신에 중화 항체 반응을 하지 않은 12 개의 1 가 피험자들은 또한 측정가능한 뎅기 IgM 또는 IgG와 반응하지 않았다. 이러한 모든 비-반응자는 분명히 다른 피험자에서 복제되었던 동일한 바이알에서 존속 가능한 바이러스를 수득하였다. 이들은 백신접종에 어떤 반응도 생성하지 않았다. 따라서, 모든 징후로 보아, 이들 피험자들 중에 바이러스 복제의 어떤 증거도 없었다. 이러한 비 반응성에 대한 메카니즘은 알려지지 않았다. 감염에 필요한 숙주 기질의 부족 또는 효과적인 선천적 면역의 결과일 수 있다.

다중 투여의 가치는 우회적 바이러스 방해에 전략으로서, 생-약독화된 백신 배합중에서 좀더 명확할 수 있다. 여기서 투여 간격뿐만 아니라 각 구성 성분의 투여가 중요할 수 있다. 방해 및 증진이 뎅기 바이러스들이 배합되어 주어질 때, 잠재적으로 일어날 수 있다. 4 개의 피험자는 1차 투여후 2 개, 4 개월째 3차 투여후 2 개로 모든 4 혈청형에 중화항체를 발생시켰다. 4 개월째 재 백신접종 받은 5 명의 지원자중 4 명이 3 이상의 혈청형을 전환 시켰다. 이러한 차이의 설명은 각 백신접종후 일개월에 백신중 헤테로형 바이러스의 복제를 억제하는 충분한 교차-반응 중화 항체가 있다는 것이다. 사빈은 인간 피험자에 한 혈청형 바이러스가 주어질 때, 3 달이하로 지속되는 이러한 일시적 교차 보호가 있다는 것을 발견하였다(Sabin, 1959, Vira and Rickettsial Infections of Man. 필라델피아: JB Lippioncott Company). 본 발명자들의 앞으로의 4 가연구는 0.6 개월 백진접종 스케줄을 사용할 것이다.

DEN-3 및 4 의 저열한 면역원성은 10⁵ pfu/ml Den-3 및 4 투여가 DEN-1 및 2 (둘다 4 가 제제로 10⁶ pfu/ml 인)에 비교하여 복제적 불이익이 있는 것일 수 있다. DEN-3 및 DEN-4 의 적가를 증가시키위한 택일적 제조 전략이 조사되고 있다.

4 가 반응자중 모든 4 바이러스의 바이러스 감염을 확인없이, 중화 항체의 존재는 필연적으로 모든 4 혈청형의 복제를 암시한다는 것은 확신될 수 없다. 측정된 중화 항체는 교차 반응성일 수 있고, 결합활성이 낮을 수 있다. 이 문제는 각 혈청형에 대해 항체의 장기적 지속성을 조사하여 제기되어야 한다. 민감도 및 혈청형 특유 RT-PCR 조사는 바이러스 복제의 증거로서 다원 바이러스 감염을 측정하기 위해 유용할 수 있다.

4 가 백신접종자 중 단지 2 명만이 첫 백신접종후 모든 4 혈청형에 중화 항체를 발생시켰다. 4 가 항체에 대한 이러한 불완전한 반응은 유독한 이종성 혈청형에 노출의 세팅에서 뎅기 출혈열의 위험에 대한 의문을 제기한다. 항체 의존 증식이 DHF의 병원 생리적 메카니즘이면, 모든 4 개의 혈청형 항체가 백신에 의해 유도된 때에도 위험이 존재할 수 있다(그러나, 하나이상의 혈청형 항체가 중화점 이하에서 미분적으로 감소한다). 이하에서, TH1 T-세포반응이 중화 항체가 없는 경우에도 상기 4가 백신접종자 중에서 측정될 수 있다는 것을 보고한다. 그것은 보호하기에 충분한 것일까? 이러한 질문들은 지역구내에서 4 가 백신의 주의 깊은 장기간의 필드 테스트에 의해서만 대답되어질 수 있다.

결론적으로, 우리의 결과는, 4 개의 혈청형이 1 가 백신으로서, 혈청형 2, 3, 4 보다 유형 1의 경우 다양한 반응원성이라는 것을 보여준다. 혈청형 1 및 2 는 중화항체를 90 % 초과로 이끌어 내지만, 혈청형 3 및 4 는 덜 면역원성이다. 4 가 배합은 안전하고, 합당하게 잘 허용되며, 10 명의 피험자중 4 명에서 모든 4 혈청형에 중화 항체를 유도하였다. 4 가 백신의 2 번 투여는 시험된 한달 또는 두 달의 투여 기간에서 혈청 전환율을 향상시키지 않았다. 4 개월에 걸친 좀더 긴 투여기간이 혈청 전환율을 향상시킬 수 있다.

실시예 10

뎅기 백신에 대한 T-세포 반응을 위한 물질 및 방법

피험자. 18 - 50 연령의 35 명의 건강한 성인 지원자(남성 21 명, 여성 14 명)이 후보 뎅기 바이러스 백신을 포함하는 월터 리드 아미 인스터튜트 오브 리서치에 의해 수행되는 단계 I 의 임상 시험에 참가하였다. 참가자들은 순환하는 항-플라비바이러스(flavivirus) 항체가 없는 지원자들의 그룹에서 선택되었다. 추가적인 선택 기준은 HIV 음성 상태 및 물리적 실험 및 질문서에 대한 반응을 기재로한 우수한 건강이었다.

백신 그룹. 30 명은 개별적으로 무작위로 생-약독화된 1 가 백신의 2 회 투여를 받았다; 4 명은 생-약독화된 4 가 백신의 2 회 투여를 받았다. 한명의 1 가 수용자(지원자 ID 1)는 단지 1차 투여를 받은 후 연구를 그만 두었다. 백신 접종전에, 지원자중 어떤 사람에게도 뎅기 바이러스 유형 1 ~ 4, 일본 뇌염 바이러스, St. Louis 뇌염 바이러스, 또는 황열병 바이러스에 검출가능한 혈구응집반응-억제 혈청 항체가 없었다. 각 투여는 0.5 ml 희석되지 않은 바이러스(들)의 피하주사로 주어졌다.

PBMC 수합. 말초 혈액(8 ml)이 0 일 및 1차 투여후 2차 투여전의 5 번(3, 7, 9, 14, 28/ 30/ 31/ 60 또는 91 일) 각 지원자에게서 정맥 천자에 의해 Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT)[Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ] 으로 수합된다. 혈액은 또한 2차 투여일 및 그후 4 번(두번째 투여후 3, 7, 9 및 14 일) 수합된다. 2차 투여의 시행 시간은 지원자에 따라 1차 투여후 대략 1 ~ 3 개월이었다. 약 한달의 수합시간에서 다양함은 지원자의 스케줄의 다양함 때문에 일어났 다. 세포들은 1000 xg에서 30 분동안의 원심분리에 의해 전체 혈액에서 분리되었다. PBMC가 수합되고 (CPT 튜브중 겔위의 세포층), 500 xg의 원심분리와 함께 Hank's 균형 염 용액으로 두 번 세척되었다 (Life Technologies, Rockville, MD). 분리된 PBMC는 4 ml (CPT 튜브당) 의 세포 응결 배지/DMSO (Sigma, St. Louis, MO) 내에 재현탁되고, 1ml 의 분취량 내에서 하룻밤동안 - 70 ℃에서 응결된다. 상기 PBMC는 그후 장기간 보관을 위해 증기상 액체 질소로 수송된다.

백신 바이러스. 다음의 상술된 생-약독화된 뎅기 바이러스 종족이 1 가 백신에 사용된다: 45AZ5PDK20(DEN 1), S16803PDK50(DEN 2), CH53489(DEN 3), 341750PDK20(DEN 4). 상기 4 가 백신은 이들 종족의 4 개 모두의 동량 혼합물이었다.

세포 배양 바이러스들. Vero 세포에서 증식된, 다음의 뎅기 바이러스들이 배양에서 PBMC 자극에 사용되었다: Westpac 74(DEN 1), S16803(DEN 2), CH53489(DEN 3), 및 TVP360(DEN 4). 4 개 혈청형 모두 Dr. Robert Putnak 에 의해, 사용 전까지 -70 ℃로 보관되고 1 ml 분취량으로 제공되었다. 바이러스의 적가는 .30 - 2.4 x 10⁶ pfu/ml 의 범위이다.

PBMC 의 벌크 배양 및 생-바이러스로 자극. PBMC의 응결된 바이알을 액체 질소 저장소에서 꺼내어 37 ℃에서 서서히 녹인다. PBMC는 RPMI 배지 1640(Life Technologies, Rockville, MD)으로 두 번 세척되고, 10 % 인간 남성 AB 혈청(Sigma)에 더하여 보충물[페니실린(100 U/ml)-스트렙토마이신(0.1 mg/ml)-펑기 손(fungisone)(0.25 mg/ml)[Sigma], 2 mM L-글루타민(Life Technologies), 및 0.5 mM 2-머캅토에탄올(Sigma)]을 함유하는 완전 배지에 현탁된다. 세포는 2백 5십만 세포/ml 의 농도로 현탁된다. 몇몇 조사는 3백 2십 5만 세포/ml을 요구한다. 상기 PBMC(100ml)이 96-웰 V-바닥 플레이트(Costar, Action, MA)의 개별 웰에 첨가된다. 3000 내지 24000 pfu/100ml의 농도에서 10 % 완전 배지 중에 희석된 동일한 부피의 뎅기 바이러스 1, 2, 3 또는 4 이 각 웰에 첨가된다. 대조군 웰은 바이러스 없는 동일 부피의 배지를 받았다. 세포들은 그후 4 일동안 5 % CO₂에서 37 ℃에서 배양된다.

면역분석.

화학 발광 면역 조사가 배양의 4 일의 마지막에서 조직 배양 상층액에서 분비된 림포카인의 양을 측정하기 위해서 행해졌다. 96 웰 면역분석 플레이트, Microlite 2(Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, Virginia)가 하룻밤동안 0.1 M 이탄산수소칼륨 완충액중에서 라벨되지 않은 항-림포킨(IL-4, IL-10 또는 인터페론 γ) 항체(Pharmingin San Diego, CA) 10 mg/ml 의 50 ul/웰 으로 코팅되었다. 상기 플레이트는 세척되고, 100 ul I-블럭 완충액(Tropix, Bedford, MA)이 한시간 동안 첨가되었다. 표준군(재조합 IL-4, IL-10 및 인터페론 γ, Pharmingen, San Didego, CA)는 10 ng/ml 의 농도로 시작하는 I-블럭 중에 미리 희석되었다. 표준군는 8 - 3 배 희석되었다. 샘플들, 대조군 및 표준군들을 동일한 부피의 I-블럭 완충액중에 희석하였다. 50 ul 의 분취량을 각 분석 플레이트 에 첨가하였다. 샘플들은 상온에서 1 시간동안 배양하였다. 플레이트는 세척되었다. 2 차 비오틴화된(biotinlyated) 항체는 I-블럭으로 1:1000로 희석되었고, 50 ul/웰이 조사 플레이트에 첨가되었다. 플레이트는 세척되고, 아비딘-알카리성 포스파타아제(Avidix AP, Tropix, Bedford, MA)의 50 ul/웰이 조사 플레이트에 첨가되었다. 상기 플레이트들은 상온에서 한시간 동안 배양되었다. 세척된 플레이트들은 조사 완충액(Tropix)으로 일분동안 두 번 배양되었다. 상기 CDP-Star 기질(Tropix)이 각 웰에 첨가되었다(100 ul/웰). 10 분후, 플레이트들은 MD2250 발광계(luminometer)(Dyatech, Chantilly, VA)상에서 읽혀진다. 첫 번째 견본은 변형된 프로토콜을 사용하여 조사된다. 아비딘-알카리성 포스포타아제을 사용한 검출기 단계 대신에 아비딘-에쿼린(Sealite Sciences, Atlanta, GA)이 사용되었다. 상기 물질은 연구도중에 이용할 수 없게 되어, 프로토콜이 변경되었다. 표준군 및 대조군 견본을 사용한 결과는 상기 두 조사 포맷에 동일하였다.

혈청형 교차-반응성. 혈청형 고유성을 시험하기 위해, 1 가 약독화된 백신(결과 참조)의 선택된 수용체에서 42, 45 또는 105 일에서 수합된 PBMC는 독립 배양에서 각 혈청형의 바이러스로 250,000 세포/웰에서 4 일동안 자극되었다. 배양 상층액은 그후 화학발광 림포카인 ELISA를 사용하여 분석되었다.

T-세포 부분 결핍. 림포카인 제조의 고유 세포원을 시험하기 위해서, PBMC는 CD 3+ 또는 CD 8+ T 림포사이트가 자극 전에 결핍되었다. 선택된 PBMC는 RPMI 배지 1640 으로 두 번 세척되었고, 5 % 완전 배지(30 % 이상의 PBMC 가 결핍 과정중 세포손실을 보상하기 위한 공급으로서 사용되었다)중 3 백 2십 5 만 세포/ml에 서 현탁 되었다. 음성 결핍을 위해, 세포들(650,000 PBMC)이 자기 비드로 코팅된 세척된 항체와 함께 배양되었다. M-450 항 CD3 및 항 CD8 비드(Dynal, Oslo, Norway)의 두가지 종류의 비드가 사용되었다. 항 CD3 비드는 대략 20:1 비드를 목적 세포 비율에 주는 5백 2 십만 입자/튜브의 농도로 사용되었다. 항 CD8 비드는 대략 31:1 비드(DYNABEADS^TM(Dynal))를 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브중 목적 세포 비율에 주는 튜브당 4백만 입자의 농도로 사용되었다. 세포들은 온건한 교반과 함께 30 분동안 4 ℃에서 배양되었다. 비-결핍된 PBMC는 대조군으로 사용되었다. MPC-2 자기 입자 농축기(Dynal)를 사용하여, 라벨된 세포들을 세포 혼합물에서 제거하였다. CD3+ 및 CD8+ 음성적으로 선택된 PBMC는 신선한 마이크로원심분리기 튜브에 전송되었다. 모든 잔류 결합되지 않은 세포의 결핍을 위해서, 농축된 Dynabead는 200 ul 완전 배지로 한번 세척되었다. 전송후, 최종 부피(400 ul)는 동일하게 96-웰 V-바닥 배양 플레이트의 두 웰속으로 나누어졌다. 결핍 및 대조군 PBMC 배양 상층액은 화학발광 림포카인 ELISA를 사용하여 4 일후에 분석되었다. 또한, 배양된 PBMC는 세포안 그랜자임 B mRNA(하기 참조)를 위해 조사되었다. CD4+ 결핍은 M-450 CD4+ (28.6 ml/4.004 백만 입자, 목적 세포 비율에 대략 31:1 비드)dynabead를 사용하는 자극 후에 분리가 행해지는 것을 제외하고 유사하게 행해진다. CD4+ 음성 선택된 PBMC는 세포내 그랜자임 B mRNA를 위해서만 조사된다.

유세포 분석법. 무작위로 선택한, 비자극 PBMC 개체군 (비결핍 대조군 및 CD3+ 또는 CD8+ 결핍된 세트 둘 다) 을 2 중 염색한 후, FACS 분석을 이용하여 결핍 효율 (% 결핍로 측정) 을 측정하였다. 세포를 PE 라벨된 항-CD4+ 또는 항-CD8+ 항체 및 FITC 라벨된 항-CD3+ 항체 (Becton-Dickinson) 와 함께 4℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 라벨된 PBMC 를 형광 완충제 [PBS (Sigma), 0.05% Na 아지드, 1% 소 태아 혈청 (Summit Biotechnology, Boulder, CO)] 로 세 번 세척하고, 분석 전에 형광 고정액 [PBS, 1% 포르말린, 0.05% Na 아지드] 중에서 보존시켰다. CD4+ 다이나비드 (Dynabeads) 를 이용한 결핍 효율은 측정하지 않았다.

그랜자임 B 분석. 비결핍된 대조군 PBMC 및 T 세포 서브세트가 결핍된 PBMC 를 야생형 바이러스로 4 일 동안 자극한 후, 세포내 그랜자임 B mRNA 에 대해 분석하였다. 96-웰 플레이트 상의 역전사효소 연쇄 중합 반응 (RT-PCR) 분석 포맷을 이용하였다.

"Straight A's" mRNA Isolation System (Novagen, Madison, WI) 을 이용하여 mRNA 정제를 수행하였다. 림포카인 ELISA 분석을 위해 원심분리 및 PBMC 배양 상층액을 제거한 후, 펠렛화된 PBMC 를 10 mM 디티오트레이톨을 함유하는 용해 완충제 200 ul/웰 을 이용하여 용해시키고, 세척된 올리고 dT 마그네틱 비드 200 mg/웰 와 함께 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. DNA, 단백질 및 세포 파편을 제거하기 위해, MPC-96 (Dynal) 마그네틱 입자 농축기를 이용하여 비드를 8 배 부피의 세척 완충제로 완전히 세척한 후, mRNA 를 H₂O 200 ul/웰 로 20 분 동안 70℃ 에서 용리시킨다. 용리액을 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 추가적인 H₂O 200 ml/웰 로 2 차 용리를 수행한다. 이어서, 3M 소듐 아세테이트 (pH 5.2) 50 ul, 글리코겐 (Novagen) 20 mg, 및 이소프로판올 300 ul 을 이용하여, 용리액 400 ul 을 침전시켰다. 70% 냉 에탄올로 최종 세척한 후, mRNA 펠렛을 H₂O 30 ul 중에 현탁시켰다.

96-웰 플레이트에서 RT-PCR 단계를 수행하였다. 인간 그랜자임 B (CTLA-1) 의 엑손에 해당하고 120 bp 영역을 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머 (22 bp) 는 월터 리드 아미 인스티튜트 오브 리서치의 Stuart Cohen 박사가 합성하였다. 이 프라이머는 하기 서열을 갖는다: grb2a (센스) 5'AGC CGA CCC AGC AGT TTA TCC C (서열번호 1 번), grb2b (안티센스) 5'C TCT GGT CCG CTT GGC CTT TCT (서열번호 2 번).

각각의 역전사효소 반응에서, 총 반응물 부피는 40 ul 이었고, 하기를 함유하였다: MgCl₂ (5mM), 10X 완충제 II (10mM Tris-HCL, 50 mM KCL, pH 8.3), dNTPs (각각 1 mM), 및 RNase 억제제 (40 유닛) [Perkin Elmer, Norwalk, CT] AMV 역전사효소 (10 유닛) [Siekagaku], grb2b 프라이머 (3 pmoles), sH₂O 및 mRNA 주형 4 ml. RT 반응 단계는 42℃ (90 분), 99℃ (5 분), 4℃ (무한정) 로 맞춰진 파라미터를 가지고 9600 열순환기 (Perkin Elmer) 로 수행하였다. 각각의 PCR 을 위해, 총 반응물 부피는 50 ul 였고, 하기를 함유하였다: MgCl₂ (2mM), 10X 완충제 II (상기와 동일), dNTPs (각각 .4 mM), amplitaq gold (1.25 유닛), grb2a 및 grb2b 프라이머 (각각 1 pmoles), sH₂O 및 cDNA 주형 5 ul. 또한, PCR 인큐베이션 단계는 95℃ 초기 변성/효소 활성화 (10 분), 30 사이클: [95℃ 변성 (10 초의 램프와 함께 30 초)/ 60℃ 어닐링 (30 초의 램프와 함께 30 초)/ 72℃ 확장 (30 초의 램프와 함께 30 초)], 72℃ 최종 확장 (7 분), 4℃ (무한정) 로 맞춰진 파라미터를 가지고 9600 열순환기 (Perkin Elmer) 로 수행하였다.

전기영동을 이용하여, 최종 증폭된 PCR 산물 (10 ul) 을 에티디움 브로마이드 염색된 2% 아가로오스 (SeaKem)/ 1X TAE (트리스-아세테이트-EDTA) 겔 상에서 분리하고, 디지탈 카메라 (Scientific Imagine Systems, New Haven, CT) 를 이용하여 분석하였다.

생백신의 부스터 투여에 대한 부스터 반응이 나타날 수 있다면, 보다 약독화된 생백신을 사용할 수 있을 것으로 추정되었다. 항체 및 T 세포 반응에 대한 부스터 반응을 찾아보았다.

뎅기 백신에 대한 T 세포 반응은 측정되었으나, 항체 반응에 비해 더 적은 양의 T 세포 반응이 측정되었다. 따라서, 뎅기 생백신의 투여에 대한 T 세포 반응은 잘 특징지워지지 못했다. 본 연구의 목적의 하나는 T 세포 반응의 성질, 즉 T 헬퍼 반응, 혈청형 특이성 및 세포독성 잠재력을 결정하는 것이다.

이들 백신에 대해 우세한 T 세포 반응은 Th1 반응이었다. 이는 4 일간의 배양 동안, 뎅기 생바이러스에 의해 자극된 말초 혈액 단핵구 (PBMC) 에 의한 인터페론 γ의 분비로 결정되었다. 인터페론 γ는 CD3+CD8- T 세포에서 분비되었다. T 세포 반응은 약간의 교차반응성을 가지고, 뎅기 바이러스 혈청형에 특이적이었다. 개체들 일부에서 기왕 반응이 나타났으며, 나머지에서는 나타나지 않았다.

뎅기 자극 세포에 의한 림포카인 분비.

뎅기 생바이러스를 이용하여 PBMC 배양물을 자극하였다. 배양에 사용된 자극 바이러스의 혈청형은 백신 바이러스의 혈청형과 동일하였다. 4 일 후, 조직 배양 상층액을 인터페론 γ, IL-4 및 IL-10 의 존재에 대해 분석하였다. 모든 배양물에서, IL-4 및 IL-10 은 지속적으로 음성이었다. 두 개의 분석 대조군을 이용하여, 분석이 제대로 이루어지고 있음을 확인하였다. 첫번째로, 표준 곡선에 재조합 림포카인을 사용하였고, 두번째로, 대조 표본을 사용하여, 림포카인이 조직 배양 상층액의 존재 하에서도 측정될 수 있음을 확인하였다.

IL-4 및 IL-10 의 음성적 발현에도 불구하고, 일부 배양 상층액에서 고수준의 인터페론 γ 가 측정되었다. 도 6 은 1가 백신을 투여받은 지원자들로부터 수합된 세포의 인터페론 γ발현 동력학을 나타낸다. 전체적으로, 가장 높은 인터페론 γ반응은 뎅기 1 및 뎅기 2 후보 백신의 수여자들에서 수합된 PBMC 에서 나타났지만, 뎅기 3 및 4 수여자들에서도 일부 높은 반응이 나타났다. 때때로, 인터페론 γ는 1차 접종의 14 일 까지 때때로 검출되었지만, 종종 2 차 투여의 직전 또는 직후 까지 발현이 검출되었다. 따라서, 분비의 동력학은 기대보다 훨씬 더 느렸다. 이러한 연구의 1가 수여자들의 부스터 반응에 대해서는, 일관된 패턴이 없었다. 개인에 따라, 2 차 투여 후, 인터페론 γ수준이 증가하거나 또는 감소하였다.

모든 수합점에서의 모든 지원자들의 비자극 PBMC 에서는 인터페론 γ수준이 측정불가능하게 나타났다. 자극 0 일에서의 평균 발현은 표준 편차가 230 pg/ml 인 127 pg/ml 이었다.

1가 백신 수여자들에서는, 16 명의 양성 및 14 명의 음성 인터페론 γ반응자가 나타났다 (평균 ±3 표준 편차). 30 명의 1가 백신 수여자 중 16 명은 한 시점 이상에서 PBMC 배양물의 인터페론 g 결과가 >1000 pg/ml 이었다. 12 명은 두 시점 이상에서 인터페론 g 분비가 >1000 pg/ml 으로 지속되었다. 또한, 30 명 중 12 명은 최종 분석 시점에서 >1000 pg/ml 인 분비를 나타내었다.

4 명의 지원자들은 4 가 백신 (4 개의 1가 균주 전체의 동일 혼합물) 을 투여받았다. 도 7 은 이들 4 가 수여자들에서 수합된 PBMC 에 이한 인터페론 γ생성을 나타낸다. PBMC 는 뎅기 바이러스의 4 가지 혈청형 각각 중 하나를 이용하여, 분리된 배양물에서 자극시켰다. 지원자 #33 및 #36 의 PBMC 는, 각각의 4 가지 혈청형으로 자극한 후 한 시점 이상에서, >1000 pg/ml 인, 상당량의 인터페론 γ를 분비하였다. 지원자 #35 의 PBMC 는, 4 가지 혈청형 중 3 개 (뎅기 3 제외) 에 대해 상당량의 인터페론 γ를 분비하였다. 지원자 #34 의 PBMC 는, 오직 뎅기 2 바이러스에 대해서만 상당량의 인터페론 γ를 분비하였다. 가장 높은 반응은 우세하게는 DEN 1 및 2 에 대해 일어났다. 1가 지원자의 경우에서와 같이, 4 가 백신 지원자에서도 인터페론 γ생성 동력학이 지연되었다. 고수준의 인터페론 γ는 2 차 접종 직전 및 후에 검출되었다. 부스터 반응에 대해서는, 1가 수여자와 마찬가지로, 2 차 투여 후에는 일터페론 γ분비의 패턴에 일관성이 없었다.

응집물에서, 상기의 결과는 1가 및 4가 백신 수용자 양자에서의 주된 T 임파 구 반응이 항원 특이적 Th1 반응인 것임을 나타낸다.

실시예 11

혈청형 교차반응성

1가 백신 수용자 12명으로부터의 PBMC를 뎅기 혈청형-특이적 반응 및 교차반응성 유무에 대하여 검사한다. 동력학에 기초하여, 최종 시점(최종 수합일에서 2일째)에 PBMC 배양 상층액 중의 인터페론 γ를 1000pg/ml 이상 분비하는 개체를 선택한다. 최종 수합일로부터 PBMC를 각 뎅기 혈청형으로 독립 배양물중에서 4일 동안 자극한 후 배양 상층액 중 분비된 인터페론 γ를 분석한다. 비록 몇몇 혈청형 교차반응성이 있었지만, 항상 본래의 백신접종과 동일한 혈청형 바이러스로 자극된 PBMC에서 가장 높은 반응이 나타났다 (표 14). 그러므로, 선택된 1가 백신 수용자로부터의 PBMC에 나타나는 인터페론 γ 반응은 뎅기 혈청형-특이적이다.

교차반응성은 혈청형-특이적 반응의 절반 이하이다. 뎅기 2 백신 수용자의 경우, 뎅기 4 바이러스와 가장 교차반응성이 높았다. 뎅기 4 백신 수용자의 경우, 뎅기 2 바이러스와 가장 교차반응성이 높았다. 뎅기 1 백신 수용자의 경우, 교차반응성이 다양하였다. 이 그룹 중에서 뎅기 3 백신 수용자는 단지 한명이 있었고 반응은 혈청형 특이적이었다.

실시예 12

T 세포 서브세트 결핍

상기가 Th1 반응임을 입증하기 위해 인터페론 γ를 분비하는 세포의 동정한다. 이는 배양에 앞서 T 세포 또는 T 세포 서브세트를 결핍시킴으로써 수행된다. 이 연구에서 사용된 세포를 밀도 구배 원심분리를 사용하여 전혈 (whole blood)로부터 분리된 PBMC와 혼합된다. PBMC 집단 중 주된 세포는 T 세포, B 세포, 단구(monocyte) 및 NK 세포이다. 상기 평가를 위해, 13명의 1가 및 3명의 4가 지원자에서의 동력학에 기초하여 인터페론 γ가 가장 높은 시점을 선택하였다.

면역 자기 세포 분리법을 사용하여 PBMC로부터 세포를 제거한다. 결핍 효능 은 시험 결핍에서 유세포분석법(flow cytometry)를 사용하여 평가한다. 배양된 PBMC의 분석은 소수만 접근가능하기 때문에 수행하지 아니한다. 시험 결핍법에서, CD3 1가항체를 사용하여 CD3＋ 세포를 제거하면 비-결핍된 PBMC 대조군에 비하여 CD3＋ 세포가 92% 감소하는 결과를 낳는다. CD3 결핍을 CD3 및 CD4 에 대한 이중 표지, CD3 및 CD8 에 대한 이중 표지 및 CD3에 대한 단일 표지를 사용하여 모니터한다. CD3 결핍은 CD3 결핍된 그룹에서 CD3/CD4 T 세포의 98%가 결핍되고 CD3/CD8 T 세포의 90%가 결핍됨으로써 CD8＋ 세포 보다 CD4＋ 세포를 통해서 더욱 완전하다. CD8 1가항체를 사용하여 CD8＋ 세포를 제거하면 CD8＋ 세포가 99.9% 감소하는 결과를 낳는다.

선별된 PBMC에서 CD3＋ 또는 CD8＋ T 임파구를 결핍시키고, 4일동안 뎅기 바이러스로 배양액 중에서 자극한 후, 분비된 인터페론 γ를 검사한다. 결과를 동시에 배양된 비-결핍된 PBMC 대조군으로부터 수득된 것과 비교한다. CD4＋ T 임파구는 기타 세포 집단이 인터페론 γ의 생산을 위해 CD4＋ T 헬퍼세포를 필요로 하기 때문에 자극 전에 결핍되지 않는다.

배양전에 CD3＋ 세포를 제거하면 표 15에서 보이는 바와 같이 인터페론 γ의 생산이 실질적으로 감소한다. CD3＋ 결핍 후 인터페론 γ의 감소 범위는 59-100%이다. CD3＋ 결핍된 배양액에서 감소되기는 하나 상당한 양의 인터페론 γ가 생산된다. 이러한 잔여 생산은 면역자기 세포 분리 후 남아있는 소량의 잔여 CD3＋ 세포가 인터페론 γ를 분비하거나 및/또는 또 다른 세포 집단이 또한 인터페론 γ를 분비하는 것을 나타낸다.

한 개체만 제외하고, 배양전 CD8＋ 세포의 제거는 인터페론 γ의 생산을 감소시키지 않는다. 16 배양액 중 9개에서, CD8＋ 세포를 제거하면 이들 세포에 의한 억제의 제거로 인해 또는 CD8＋ 세포독성 임파구에 의한 감염된 항원 제시 세포의 사멸의 감소에 의해 실제로 그의 생산이 증가된다.

이와 함께, 상기 결과는 PBMC 배양물중에 보이는 인터페론 γ는 CD4＋ T 임파구 및/또는 CD4＋ T 임파구에 의해 영향을 받는 세포를 분비한다는 것을 의미한 다. 이러한 사실은 Th1 반응을 밝힘으로써 또한 뒷받침된다.

실시예 13

그랜자임 B. Th1 반응은 다른 것들 중, 세포 독성 임파구 반응과 관련된다. 세포 매개 사살이 가능한 세포가 이러한 백신 지원자에 존재하는지를 알아보기 위한 노력 중, 그랜자임 B mRNA 가 결핍 실험을 위해 배양된 PBMC 에서 측정되었다. 림포카인 분석용 배양 상층액의 제거 후, mRNA 의 추출을 위해 세포를 펠렛화하고, 용해시켰다. 그랜자임 B 특이성 프라이머를 RT-PCR 을 위해 사용하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 겔 밴드 강도를 비교용 참조 사진 (도 8) 을 사용하여 +, - 스케일로 전환시켰다. 지원자 중 7 명으로부터의 여분의 세포를 바이러스 없이 배양하였다. 상기 7 명의 지원자로부터의, 무자극 PBMC 는 거의 (- 또는 +) 그랜자임 B mRNA 발현을 나타내지 않았다. 항원 특이성 자극으로, 선택된 백신 수여자의 전체 16 명에서 발현이 실질적으로 상승조절되었다 (도 8). CD8 단일클론성 항체를 사용하는 T 세포 서브셋 (subset) 결핍은 대조 PBMC 에 비해 유의성있게 그랜자임 B 발현을 감소시키지 않았다. 그랜자임 B 발현이 CD8 결핍된 군에서 감소되는 3 개체 (ID 16, 22 및 33) 가 있었다. 하나에서 (ID 33), 감소는 실질적이었다. 이와는 대조적으로, CD3 단일클론성 항체를 사용하는 T 세포 서브셋 결핍은 지원자 중 14 명에서 발현을 감소시켰다. 1가 지원자 중 8 명에서, 그리고 4가 지원자 중 전체 3 명에서, 감소가 실질적이었다. 인터페론 γ무응답자 중 4 명을 또한 그랜자임 B mRNA 에 대해 시험하였다. 모두가 낮은 수준의 발현을 나타내었다 (데이타가 나타나지 않음).

지원자 중 7 명으로부터의 세포에서, 배양 4 일 후 CD4 단일클론성 항체를 사용하는 T 세포 서브셋 결핍을 수행하였다. 배양 중 도움을 필요로 하는 모든 세포에 T 헬퍼 활성을 제공하기 위해, 배양 후 결핍을 행하였다. 자극 후 CD4+ 세포의 제거는 분석한 7 명의 지원자 중 비결핍된 대조군에 비해 그랜자임 B 발현에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 비록 CD4+ Th1 세포에 의해 매개되는 그랜자임 B 의 항원 의존성 생성이 있을지라도, 그랜자임 B 를 생성하는 실제 세포는 T 세포 이외의 세포인 것으로 나타났다. 이것은 NK 세포에 의한 생성인지 대식세포에 의한 생성인지는 알려지지 않았다.

토의

이 연구의 2 가지 목적은 백신 수여자에서 측정가능한 T 세포 반응이 있는지와, 백신의 2 차 투여에 대한 세포 매개 반응이 관찰되는지를 측정하는 것이었다. 상기 목적들을 위해, 2 회의 투여 간격에서 수집되는 세포의 재자극에 의해 T 세포 반응 동력학을 측정하였다. 연구 중 수집된 PBMC 의 벌크 배양액 중 생 바이러스로 재자극을 수행하였다.

이 연구의 세 번째 목적은 1. 림포카인 목록에 의해 제한되는 세포 유형, 2. 뎅기 혈청형 특이성 및 교차 반응성 반응, 및 3. 세포 독성 잠재성, 그랜자임 B 생성의 측정의 관점에서 T 세포 반응의 성질을 측정하는 것이었다. 이러한 반응을 1가 및 4가 백신 수여자 모두로부터의 PBMC 에서 측정하였다. 4가 백신 수여자에 있어서, 반응이 뎅기 바이러스의 모든 4 개의 혈청형에 대해 측정될 수 있는지를 측정하는 것이 중요했다.

인간 및 마우스 T 헬퍼 반응은 그것들의 림포카인 발현 5 의 패턴에 기초한 2 개의 군으로 분류될 수 있다. T 헬퍼 1 (Th1) 세포는 IL-2 및 인터페론 γ의 분비를 특징으로 한다. 상기 2 개의 림포카인 중, 인터페론 γ는 Th1 세포를 확인하는데 있어서 가장 중요하다. T 헬퍼 2 (Th2) 세포는 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10 의 분비를 특징으로 한다. 세포 또는 PBMC 벌크 배양물의 혼합 개체군 중, 2 개의 분비 패턴 중 하나가 일반적으로 우세하다.

Th1 대 Th2 반응에 영향을 주는 하나의 요인은 공격성 인터페론의 성질이다. 바이러스 감염, 및 일부 박테리아 감염, 예컨대 리스테리아 및 마이코박테리움 (Peters, 1996, Hepatology 23, 909-916) 은 종종 Th1 반응을 유도하는 한편, 일부 기생충 감염은 Th2 반응을 유도할 것이다 (Conrad 등, 1990, J Exp Med 171, 1497-1508). 2 개의 반응의 비율은 감염의 과정 중 변화할 수 있다. 예컨대, 비록 바이러스 감염이 일반적으로 Th1 반응과 함께 시작할지라도, Th2 반응이 감염 이후에 생성될 수 있다. 초기 Th1 반응은 CTL 반응 및 직접 면역글로불린 이소타입 (isotype) 스위칭 (switching) 을 증대시킬 수 있는 한편, 이후 Th2 반응은 B 세포에 의한 항체 생성을 증대시킬 수 있다.

자연 뎅기 감염시, 한 연구는 대부분의 개체에서 Th1 반응을 나타내었다. Th1 반응은 관련된 심한 병원성 없이 효과적인 면역 반응과 관련되었다. 이와는 대조적으로, 일부 개체에서는 더 심한 병원성과 관련된 Th2 반응이 발달되었다.

효과적인 항-뎅기 면역 반응을 갖는 Th1 반응과의 관련성에도 불구하고, Th1 반응의 핵심 림포카인인 인터페론 γ는 면역 반응에 대한 양성 및 음성 효과 모두 를 갖는다. 태국에서, Kurane 은 DF 환자의 혈청에서의 낮은 수준과 비교하여, DHF 환자의 혈청에서 높은 수준의 인터페론 γ를 발견하였다 (Kurane 등, 1991, J Clin Invest 88, 1473-1480). 증가한 인터페론 γ는 면역 활성의 측정일 수 있다. 인터페론 γ는 세포독성 세포 (CD4+ T 세포, CD8+ 세포 및 NK 세포) 를 활성화하고 활성을 유지하기 위해 필요하다. 이러한 메카니즘은 심각한 감염시 병원성에 기여할 수 있는 한편, 동일한 반응은 항원 특이성 세포용해를 통해 바이러스 감염된 세포의 수를 감소시킴으로써 더 약한 감염에서 유리할 수 있다. 뎅기 바이러스 감염을 제어하는데 있어서 인터페론 γ의 긍정적인 역할은 인터페론 α, β및 γ가 부족한 최근의 마우스 넉아웃 (knockout) 모델에서 입증된다. 감염에 내성인 정상 어른 대조군과 대조적으로, 넉아웃 마우스는 뎅기 바이러스에 의해 치명적인 감염에 감수성이다 (Johnson 및 Roehrig, 1999, J Virol 73, 783-786).

대안적으로, 인터페론 γ는 뎅기 바이러스 감염의 병원성에 기여할 수 있다. 병원성에 대한 한가지 메카니즘은 하나의 주요 표적 세포인 대식세포의 감염을 증가시킴으로 인한 면역 증강에 의한 것일 수 있다. 배양시, 인터페론 γ는 세포의 표면에 Fc 수용체의 수를 증가시킴으로써 대식세포주 U937 의 항체 매개 감염을 증가시켰다 (Kontny 등, 1988, J Virol 62, 3928-3933). 그러나, 정상 배양된 대식세포를 사용하는 다른 연구는 감염을 감소시키는 반대 효과를 나타내었다 (Sittisombut 등, 1995, J Med Virol 45, 43-49). 이러한 상충하는 결과를 통해, 인터페론 γ가 대식세포의 감염의 증가에 기여하는지 아닌지는 분명하지 않다.

이러한 연구에서, Th1 반응은 우세한 반응이었다. IL-4 및 IL-10 에 대한 분석은 TH2 반응의 결핍을 나타내면서 일관되게 음성이었다. 높은 수준의 인터페론 γ가 배양액 중 Th1 반응의 존재를 나타내면서, 많은 배양액의 상층액에서 검출되었다.

자극된 세포가 전체 PBMC 이었으므로, 인터페론 γ의 분비의 원인인 세포를 측정할 필요가 있었다. 면역자기 (immunomagnetic) 절차를 사용하여 T 세포 서브셋을 결핍시킴으로써 이를 수행하여다. CD3 또는 CD8 중 어느 하나를 인식하는 항체를 사용하여, 배양하기 전 음성 결핍을 수행하였다. CD3 결핍은 인터페론 γ분비의 중단을 가져왔고, CD8 결핍은 그렇지 않았으므로, CD3+ CD8- 임파구는 인터페론 γ를 분비하거나, 적어도 인터페론 γ의 분비를 제어하는 세포 개체군이라고 결론지었다. 이것은 인터페론 γ가 Th1 반응의 결과인 것을 입증하였다. 결핍 후 일부 배양액 중 잔류 인터페론 γ는 배양액 중 결핍 후 일부 남아있는 CD4+ T 임파구 또는 다른 세포, 가능하게는 NK 세포 또는 대식세포로 인한 것일 수 있다.

피크 인터페론 γ반응은 혈청형 특이적이었다. 1가 백신 수여자로부터의 세포가 뎅기 바이러스의 4 개의 혈청형 각각에 의해 별도로 자극되었을 때, 피크 인터페론 γ생성은 백신 바이러스와 균질한 뎅기 바이러스에 의한 자극에 대한 반응이었다. 다른 뎅기 바이러스에 대한 더 적은 교차 반응성 반응이 여러가지 배양액에서 주목되엇다. 이것은 상이한 측정을 사용하여 다른 것들에 의해 수득한 결과들, 임파구 증식과 유사하다. 한가지 연구에서, 뎅기 2 백신을 투여한 개체로부터의 세포들은 뎅기 2 바이러스에 대한 가장 큰 반응을 나타내었으나, 교차 반응성 반응이 주목되었다 (Dharakul, J Infect Dis 170, 27-33). 뎅기 3 백신 수 여자로부터 수득한 다수의 클론이 뎅기 3 항원에 가장 잘 반응하였으나, 다른 3 개의 뎅기 항원에 대한 교차 반응성 반응을 가진 것이 클론 수준에서 입증되었다 (Kurane 등, 1989, J Exp Med 170, 763-775). 후자의 연구의 결론은 1 차 뎅기 바이러스 감염은 주로 교차 반응성 CD4+ 임파구 반응 (증식 및 인터페론 γ생성) 을 일으킨다는 것이었다.

이 연구에서, 1가 백신 수여자의 PBMC 의 교차 반응성 반응은 일반적으로 혈청형 특이성 반응의 절반 이하였다. 4가 백신 수여자에서, 뎅기 바이러스의 각각의 혈청형에 반응하는 인터페론 γ분비는 4 명의 4가 백신 수여자 중 3 명에서 유의성이 있었다. 그 반응은 개개의 백신 수여자 내에서 충분히 변화하여, 더 낮은 반응이 혈청형 특이성 반응인지 교차 반응성 반응인지를 측정할 수 없었다.

인터페론 γ분비에 의해 나타난 T 세포 활성의 동력학은 기대되는 것보다 더 느렸다. 몇몇 예에서, 반응은 14 일까지 검출될 수 있었다. 그러나 대개의 경우, 반응은 두 번째 백신 용량의 투여 직전 까지 검출되지 않았다. 지연된 동력학의 이유가 무엇인지는 분명하지 않다. 한가지 설명은, 백신 바이러스 감염 세포에 의한 항원 생성이 느리고 지속적일 수 있다는 것이다. 그러나, 동일하게 그 방법이 선택적으로 급성 반응보다는 기억 반응을 검출할 수도 있다. 예컨대, 활성 CD8+ 세포가 초기 감염 중 수집된 PBMC 중 CD4+ 반응을 억제한다면, 측정가능한 반응은 약화될 수 있다. CD8+ 임파구가 결핍된 배양액 내에, 남아있는 임파구에 의한 인터페론 γ분비는 배양액의 절반 이상에서 증가하였다. 이러한 억제는 초기 감염 중 더 커질 수 있다.

다른 이들은 더욱 급성인 림포카인 생성 동력학을 관찰하였다. 약독화 뎅기 백신의 접종 후 17 일 동안, 혈청 인터페론 γ를 포함하는 혈청 림포카인이 측정되었다. 상기 연구에서, 바이러스 혈증시 피크된 급성 반응이 주목되었다 (Kurane 등, 1995, J Clin Lab Immunol 46, 35-40).

2 차 투여에 대한 반응을 혼합하였다. 일부 개체는 인터페론 γ 생성의 증가를 나타낸 반면, 다른 개체들은 감소를 나타내었다. 2 차 투여 직전 백신 수여자로부터 수집한 세포에 의한 인터페론 γ생성은 충분히 커서, 2 차 투여에 대한 임의의 기억 (anamnestic) 반응을 마스킹할 수 있다. 또한, 후기 인터페론 γ반응은 기억 T 세포 반응의 측정을 더 어렵게 만들 수 있다. 일부 개체가 2 차 투여에 반응했다는 것은 분명하다. 이것은 활성 면역 반응의 존재 하에 일부 국소화된 바이러스 성장이 존재한다는 것을 나타낼 수 있다.

요약하여, 상기 생 약독화 뎅기 바이러스의 투여에 대한 우세한 T 세포 반응은 Th1 반응이었다. 이것은 백신 수여자로부터 수집한 재자극된 PBMC 에 의한 인터페론 γ의 분비에 의해 입증되었다. 백신 수여자의 세포로부터 PBMC 배양액 중 어떤 것도, 재자극 후 배양 상층액 내로의 유의성 있는 IL-4 또는 IL-10 분비를 나타내지 않았다. Th1 반응은 CD3+ CD8- 임파구가 인터페론 γ를 분비하는 것을 나타냄으로써 입증되었다. Th1 반응은 주로 뎅기 혈청형 특이성이나, 더 적은 교차 반응성 반응이 주목되었다.

실시예 14

면역성 및 감수성 지원자 내의 챌린지 균주로서 4 개의 뎅기 바이러스의 임 상적 및 면역학적 평가

이 연구의 주 목적은 인간 백신 효능 연구를 위한 챌린지 균주로서, 그것들의 적합성을 평가하기 위한 감수성 및 면역성 지원자에서 4 개의 후보 뎅기 챌린지 바이러스 각각에 대한 임상적 반응을 특징지우기 위한 것이다. 연구의 두 번째 목적은 뎅기열에 대한 보호의 면역 상관성에 관한 가설을 세우기 위한 것이다.

용량, 스케쥴 및 경로: 모든 지원자들에게 연구일 0 일에 삼각근 영역에서 피하에 0.5 ml 의 단일 용량으로 4 개의 뎅기 챌린지 바이러스 또는 플라시보 중 하나를 투여할 것이다.

연구 군:

지원자 세트 #1 (감수성): DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 또는 플라시보 중 하나를 투여함.

지원자 세트 #2 (면역성): DEN 바이러스 (이전에 투여한 백신에 상응하는 혈청형) 또는 플라시보 중 하나를 투여함.

일반 자격 규준: 나이 18 - 35 세, 어떠한 만성 의학적 상태를 갖지 않는 우수한 건강, 연구 이해 필기 시험에 대해 75 % 초과의 점수, 주지된 동의, 연구 기간에 대한 가능성, 명령 계통으로부터의 참가에 대한 승인 편지 (군인의 경우에만), 이전의 뎅기 백신 접종에 대한 혈청학적 전환 (지원자 세트 #2 에서만).

통계: 데이타 분석은 각 시험 표본 군에서 소수의 지원자가 받은 이 파일럿 (pilot) 시험에서 주로 설명될 것이다. 주 관심은 플라시보와 비교한 4 개의 연 구 군 내에 (미리 구체화되고 예기치 않은) 임상적 사건의 빈도를 문서로 기록하는 것일 것이다.

뎅기열이 발생한 모든 챌린징한 지원자들의 챌린지 전 면역 측정 및 챌린지 후 면역 반응을, 양호하게 유지되고 있는 챌린징한 모든 지원자의 것과 비교하여, 보호의 면역 상관성에 대한 가설을 개발하였다.

인간 뎅기 챌린지 모델의 적용: 생 백신 후보의 약독화를 평가하거나, 뎅기 질환을 특징화하기 위해 고안된 대부분의 조직학적 인간 뎅기 챌린지 실험과 반대로, 이러한 챌린지 연구는 1) 플라비바이러스-비면역 (flavivirus-naive) 지원자 중 챌린지 균주로서 4 개의 뎅기 바이러스를 유효화하고 (지원자 세트 #1), 2) 상동형 뎅기 바이러스로 후속적으로 챌리징하는 경우 단일형 뎅기 백신의 수여자에서 면역성의 상관성을 확인하기 위한 (지원자 세트 #2) 것일 것이다.

지원자 세트 #1 에서의 임상적 반응이, 상기 균주가 이후의 제어 실험시 챌리지에 적절하다고 제시하는 경우, 더 나아간 개발을 위한 가장 유망한 백신 후보를 선택하기 위해 상기 챌린지 균주를 뎅기 백신 후보 또는 플라시보의 수여자에 투여할 것이다.

지원자 세트 #2 에서의 면역학적 반응이 챌린지 전 면역성 (항체 및/또는 T 세포 기억) 의 일부 측면이 보호와 상관성이 있다고 제시하는 경우, 이러한 보호의 상관성은 뎅기 백신 개발을 단순화할 수 있다.

챌린지 균주로서 시험되는 뎅기 바이러스의 범주 제한: 적절한 뎅기 챌린지 바이러스는 1) 지원자 세트 #1 에서 3-7 일 동안 지속되는 비복합성 뎅기열을 재생 적으로 일으키고, 2) 적정 제조 기준 (GMP) 에 따라 제조되고, 부수 제제 또는 반응원성 비-바이러스 성분이 없고, 3) 충분한 양 (> 100 용량) 으로 동결건조된 바이러스로 이용가능할 것이다. 챌린지 바이러스로는 불활성화된 DEN-1 45AZ5 (PDK-0), DEN-2 S16803 (PDK-10), DEN-3 cl 24/28 (PDK-0), DEN-4 341750 (PDK-6) (PDK = primary dog kidney cells: 1 차 개 신장 세포) 를 들 수 있다.

플라크 형성 단위 (pfu.) 중 각각의 챌린지 바이러스의 용량은 0.5 ×역가일 것이다.

연구 챌린지 바이러스들은 후자의 2 개의 범주에 든다. 이 연구는 연구 후보 챌린지 균주가 제 1 범주에 드는 것을 입증하기 위한 것이다. 본 출원인은 이 연구에서 시험된 4 개의 챌린지 바이러스가 적당히 병원성이라는 몇몇 증거를 갖는다. DEN-1 및 DEN-3 챌린지 바이러스는 이미 지원자 중에 비복합성 열성 질환을 일으킨 것으로 보였다. 비록 이 연구에서 투여될 DEN-2 및 DEN-4 챌린지 바이러스는 지원자에 시험되지 않았으나, 이들은 지원자 중 열성 질환을 일으켰으므로 거부된 뎅기 바이러스 백신 후보의 전구체이므로, 병원성인 것으로 여겨진다. 4 개의 연구 후보 뎅기 챌린지 바이러스 중 어떤 것을 거부하는 유일한 이유는, 이들이 플라비바이러스-비감염 지원자 (지원자 세트 #1) 에서 어떠한 질환도 일으키지 않거나, 임의의 지원자 (지원자 세트 #1 또는 #2) 에서 과도한 질환을 일으키는 것이다.

지원자 세트 #1: 10 명의 건강한 플라비바이러스-비감염 지원자는 4 개의 혈청형 중 하나 (혈청형 당 2 명의 지원자) 또는 플라시보로 뎅기 바이러스 챌린지를 받도록 무작위화될 것이다. 지원자 및 연구자는 접종에 대해 맹검 상태일 것이다. 본 출원인은, 뎅기 챌린지 바이러스를 받은 8 명의 지원자가 3 - 7 일의 발열, 심한 두통 및 근육통으로 중등도로 아플 것을 예상한다. 충분한 회복을 위해서는 질환의 발현 후 14 일 정도의 긴 시간이 걸릴 수 있다. 각각의 챌린지 바이러스는 2 명의 수여자의 임상적 반응에 기초하여 적절하다고 여겨질 것이고, 이는 뎅기 열의 연구 정의를 만족시켜야 한다. 뎅기열은 다음과 같이 정의된다: 하기의 2 개 이상을 갖는 질환: 두통, 근육통, 홍반성 발진, 안와후 통증, 관절통, 및 아세트아미노펜 사용으로 인해 체온 감소가 가능하게 되는, 48 시간 이상 동안 지속되는 열, 및 호중구 감소증 또는 혈소판 감소증 또는 간 손상에 의해 제시되는 발열 기간 및 그 후의 조직 반응, 및 발열 기간 중 뎅기 바이러스 혈증의 증거.

지원자 세트 #2: 12 세 이하의 젊고 건강한 지원자들은 상동형 뎅기 챌린지 바이러스 (N=10, 혈청형에 무관함) 또는 플라시보 (N=2) 를 투여받을 것이다. 면역성 지원자는 1 차 중화 항체 반응을 갖는 1가 생 약독화 뎅기 백신의 이전 수여자이다. 면역성 지원자는 양호하게 유지될 것으로 예상된다. 챌린지 전 면역 상태 또는 면역 활성화 챌린지 간의 측정으로 보호의 상관성을 확인할 수 있다.

<110> WALTER REED ARMY INSTITUTE OF RESEARCH <120> MULTIVALENT DENGUE VIRUS VACCINE <150> US 60/126,313 <151> 1999-03-26 <150> US 60/181,724 <151> 2000-02-11 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agccgaccca gcagtttatc cc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctctggtccg cttggccttt ct 22

Claims (24)

1. 생리학적으로 허용가능한 부형제 중에, 뎅기-1, 뎅기-2, 뎅기-3, 뎅기-4 로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 초과의 약독화된 뎅기 바이러스를 함유하는 면역원성 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 면역 반응을 강화하는 보강제 (adjuvant) 를 더 함유하는 면역원성 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 10² 내지 10⁶ PFU 용량의 약독화된 바이러스로 제제화된 면역원성 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 뎅기 1, 뎅기 2, 뎅기 3 및 뎅기 4 로 구성되는 군으로부터 선택된 뎅기 바이러스 혈청형의 임의 조합물을 함유하는 다가의 생 약독화된 뎅기 바이러스 백신.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 뎅기 1 이 45AZ5 PDK20 (ATCC No. VR-2648) 인 백신.
9. 제 7 항에 있어서, 상기 뎅기 2 가 S16803 PDK50 (ATCC No. VR-2653) 인 백신.
10. 제 7 항에 있어서, 상기 뎅기 3 이 CH5389 PDK20 (ATCC No. VR-2647) 인 백신.
11. 제 7 항에 있어서, 상기 뎅기 4 가 341750 PDK20 (ATCC No. VR-2652) 인 백신.
12. 제 7 항에 있어서, 상기 뎅기 1 이 45AZ5 PDK20 (ATCC No. VR-2648) 이고, 뎅기 2 가 S16803 PDK50 (ATCC No. VR-2653) 이고, 뎅기 3 이 CH5389 PDK20 (ATCC No. VR-2647) 이고, 뎅기 4 가 341750 PDK20 (ATCC No. VR-2652) 인 백신.
13. 제 7 항에 있어서, 상기 뎅기 바이러스가 척추동물 세포주에서 생산되는 뎅기 바이러스 백신.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 세포가 Vero 세포인 뎅기 바이러스 백신.
15. 제 7 항에 있어서, 상기 뎅기-1 바이러스가 10² 내지 10⁷ pfu/ml 의 양이고, 상기 뎅기-2 바이러스가 10² 내지 10⁷ pfu 의 양이고, 상기 뎅기-3 바이러스가 10² 내지 10⁷ pfu 의 양이고, 상기 뎅기-4 바이러스가 10² 내지 10⁷ pfu/ml 의 양인 뎅기 바이러스 백신.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 백신이 피하로 투여되는 뎅기 바이러스 백신.
17. 개의 신장 세포를 27 회 계대한 뎅기-1 (DEN-1) 바이러스, 개의 신장 세포를 50 회 계대한 뎅기-2 (DEN-2) 바이러스, 개의 신장 세포를 20 회 계대한 뎅기-3 (DEN-3) 바이러스 및 개의 신장 세포를 6 회 계대한 뎅기-4 (DEN-4) 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상의 약독화된 뎅기 바이러스 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
18. 개의 신장 세포를 27 회 계대한 뎅기-1 (DEN-1) 바이러스, 개의 신장 세포를 50 회 계대한 뎅기-2 (DEN-2) 바이러스, 개의 신장 세포를 20 회 계대한 뎅기-3 (DEN-3) 바이러스 및 개의 신장 세포를 6 회 계대한 뎅기-4 (DEN-4) 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 뎅기 바이러스 혈청형의 임의의 조합물 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 다가의 생 약독화된 뎅기 바이러스 백신.
19. DEN-1 종 45AZ5 PDK-27 의 뎅기-1 (DEN-1) 바이러스, DEN-2 종 S16803 PDK-50 의 뎅기-2 (DEN-2) 바이러스, DEN-3 종 CH53489 PDK-20 의 뎅기-3 (DEN-3) 바이러스 및 DEN-4 종 341750 PDK-6 의 뎅기-4 (DEN-4) 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상의 약독화된 뎅기 바이러스 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
20. DEN-1 종 45AZ5 PDK-27 의 뎅기-1 (DEN-1) 바이러스, DEN-2 종 S16803 PDK-50 의 뎅기-2 (DEN-2) 바이러스, DEN-3 종 CH53489 PDK-20 의 뎅기-3 (DEN-3) 바이러스 및 DEN-4 종 341750 PDK-6 의 뎅기-4 (DEN-4) 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 뎅기 바이러스 혈청형의 임의의 조합물을 포함하는 다가의 생 약독화된 뎅기 바이러스 백신.
21. 개의 신장 세포를 20 회 계대한 뎅기-1 (DEN-1) 바이러스, 개의 신장 세포를 50 회 계대한 뎅기-2 (DEN-2) 바이러스, 개의 신장 세포를 20 회 계대한 뎅기-3 (DEN-3) 바이러스 및 개의 신장 세포를 6 회 계대한 뎅기-4 (DEN-4) 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상의 약독화된 뎅기 바이러스 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
22. 개의 신장 세포를 20 회 계대한 뎅기-1 (DEN-1) 바이러스, 개의 신장 세포를 50 회 계대한 뎅기-2 (DEN-2) 바이러스, 개의 신장 세포를 20 회 계대한 뎅기-3 (DEN-3) 바이러스 및 개의 신장 세포를 6 회 계대한 뎅기-4 (DEN-4) 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 뎅기 바이러스 혈청형의 임의의 조합물 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 다가의 생 약독화된 뎅기 바이러스 백신.
23. DEN-1 종 45AZ5 PDK-20 의 뎅기-1 (DEN-1) 바이러스, DEN-2 종 S16803 PDK-50 의 뎅기-2 (DEN-2) 바이러스, DEN-3 종 CH53489 PDK-20 의 뎅기-3 (DEN-3) 바이러스 및 DEN-4 종 341750 PDK-6 의 뎅기-4 (DEN-4) 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상의 약독화된 뎅기 바이러스 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
24. DEN-1 종 45AZ5 PDK-20 의 뎅기-1 (DEN-1) 바이러스, DEN-2 종 S16803 PDK-50 의 뎅기-2 (DEN-2) 바이러스, DEN-3 종 CH53489 PDK-20 의 뎅기-3 (DEN-3) 바이러스 및 DEN-4 종 341750 PDK-6 의 뎅기-4 (DEN-4) 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 뎅기 바이러스 혈청형의 임의의 조합물을 포함하는 다가의 생 약독화된 뎅기 바이러스 백신.

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