CN101238144B

CN101238144B - 登革血清型1减毒株

Info

Publication number: CN101238144B
Application number: CN2006800284986A
Authority: CN
Inventors: R·奇尼; C·黄; V·巴班; J·朗; B·盖伊
Original assignee: Sanofi Pasteur SA; Centers of Disease Control and Prevention CDC
Current assignee: Sanofi Pasteur SA; Centers of Disease Control and Prevention CDC
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-05-18
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2026-05-18
Also published as: AU2006257610A1; TWI414605B; JP2008546382A; US7641907B2; CN101238144A; IL188041A0; US20060292172A1; KR101464649B1; KR101536612B1; WO2006134433A1; US20100137571A1; EP1893637A1; AU2006257610B2; KR20080027356A; US9169298B2; US8067565B2; JP5197362B2; ZA200710714B; BRPI0613328A2; MX2007015873A

Abstract

本发明涉及活的减毒VDV1(VERO来源的登革血清型1病毒)毒株，其通过在PDK上传代并在Vero细胞上消毒而衍生自野生型登革1型毒株16007。本发明进一步涉及包含VDV1毒株的疫苗组合物。

Description

登革血清型1减毒株

本发明涉及新型活的减毒VDV1(VERO来源的登革血清型1病毒)毒株，其通过在PDK和Vero细胞上传代并进行消毒(sanitization)而衍生自野生型登革1型毒株16007。本发明进一步涉及包含此类VDV1毒株的疫苗组合物。

登革病由黄病毒属(Gubler，1988)的4种紧密相关但抗原不同的病毒血清学类型(Gubler，1988；Kautner等人，1997；Rigau-Pérez等人，1998；Vaughn等人，1997)引起。登革病毒血清型感染可以产生一系列临床疾病，从非特异的病毒综合征到严重的致命的出血性疾病。蚊虫叮咬后登革热(DF)的潜伏期平均为4天(范围为3-14天)。DF的特征在于双相热、头痛、身体各个部分的疼痛、衰竭、疹、淋巴结病和白细胞减少(Kautner等人，1997；Rigau-Pérez等人，1998)。病毒血症期与热性疾病相同(Vaughn等人，1997)。从DF恢复通常在7-10天中完成，但长时间的虚弱是常见的。白细胞和血小板计数减少是时常发生的。

登革出血热(DHF)是特征在于稳态异常和血管渗透性增加的严重热性疾病，所述血管渗透性增加可以导致血容量减少和低血压(登革休克综合征，DSS)，这通常并发严重内出血。如果不治疗，DHF的病死率可以高达10％，但在大多数具有治疗经验的中心低于1％(WHOTechnical Guide，1986)。

登革热感染的常规实验室诊断基于病毒的分离和/或登革热病毒特异性抗体的检测。

登革病是仅次于疟疾的第二种最重要的热带传染病，全世界有超过一半的人口(25亿)生活在处于流行传播危险中的区域。估计每年发生50,000,000-100,000,000例登革热、500,000位住院的DHF患者和25,000例死亡。登革热是亚洲、太平洋、非洲、拉丁美洲和加勒比海的地方流行病。超过100个热带国家具有地方流行的登革热病毒感染，并且DHF已在超过60个这些国家中得到证实(Gubler，2002；Monath，1994)。许多充分描述的因素似乎涉及登革热感染：人口增长，特别是与贫困相关的无计划和不受控制的都市化，空中旅行增加，缺乏有效的蚊虫控制，以及卫生和公共卫生基础恶化(Gubler，2002)。在旅行者和移居国外者中对于登革热的认识渐增(Shirtcliffe等人，1998)。登革热已证明是在具有登革热地方流行的热带区域部署期间美国军队中热性疾病的主要原因(DeFraites等人，1994)。

所述病毒在涉及人和埃及伊蚊(Aedes aegypti)的周期中维持，所述埃及伊蚊是更喜欢以人为食的、家里的、白天叮咬的蚊子。人感染由在受感染埃及伊蚊的血液饲喂过程中的病毒注射起始。唾液病毒主要储存于脉管外组织中。在接种后被感染的主要细胞亚群是树突状细胞，它随后迁移至引流淋巴结(Wu等人，2000)。在皮肤和引流淋巴结中进行初期复制后，病毒在急性发热期期间出现在血液中，一般持续3-5天。

单核细胞和巨噬细胞与树突状细胞一起在登革热病毒的主要靶中。针对同型再感染的保护是完全的并且可能是终身的，但登革热类型之间的交叉保护持续小于12周(Sabin，1952)。因此，受试者可以经历不同血清型的第二次感染。第二次登革热感染是形成严重登革病的理论上的危险因素。然而，DHF是多因素的，包括：所涉及的病毒株，以及患者的年龄、免疫状态和遗传素质。两种因素在DHF的发生中起主要作用：伴随高病毒血症(该疾病的严重度与病毒血症水平相关(Vaughn等人，2000))的快速病毒复制，和伴随炎症介质高水平释放的重要炎症应答(Rothman和Ennis，1999)。

没有针对登革病的特异疗法。DF的处理由卧床休息、用退热药和镇痛药控制发热和疼痛、以及足够的流体摄入来支持。DHF的治疗需要流体丧失的校正、凝血因子的替换和肝素输注。

预防措施目前依赖于媒介控制和个人防护措施，这难以执行并且昂贵。目前没有注册针对登革热的疫苗。因为登革的4个血清型在全世界流通，并且因为它们被报告涉及DHF病例，所以疫苗接种应理想地给予针对所有4种登革热病毒血清型的保护。

再现天然免疫性的活的减毒疫苗(LAVs)已用于开发针对许多疾病的疫苗，包括属于与登革相同的属的几种病毒(商购可得的黄病毒活减毒疫苗的例子包括黄热病和日本脑炎疫苗)。活减毒病毒疫苗的优点是它们的复制能力以及诱导体液和细胞免疫应答的能力。此外，由针对病毒不同组分(结构和非结构蛋白)的完整病毒粒子疫苗诱导的免疫应答再现了由天然感染诱导的那些。

登革热疫苗计划在泰国于Centre for Vaccine Development，Institute of Sciences and Technology for Development，MahidolUniversity开始。在实验室规模上成功开发了候选活减毒疫苗，其对于在原代犬肾(PDK)细胞中的登革血清型1(毒株16007，第13代＝LAV1)、血清型2(毒株16681，第53代)和血清型4(毒株1036，第48代)病毒，以及对于在原代绿猴肾(PGMK)细胞(第30代)和胎恒河猴肺(FRhL)细胞(第3代)中的血清型3(毒株16562)。这些疫苗已在泰国志愿者中作为单价(单种血清型)、二价(两种血清型)、三价(三种血清型)和四价(所有四种血清型)疫苗进行了测试。这些疫苗被发现在儿童和成人中是安全并具有免疫原性(Gubler，1997)。这些LAV1-4毒株已在Mahidol University的EP 1159968中进行描述，并保藏于CNCM(分别为CNCM I-2480；CNCM I-2481；CNCMI-2482和CNCM I-2483)。

登革1型活减毒病毒株(LAV1)的完整序列由R.Kinney等人(CDC，Fort Collins)确定。亲本DEN-1毒株16007(SEQ ID No.2)和LAV1(SEQ ID No.3)毒株之间的序列差异描述在表1中。因此，野生型病毒株16007和LAV1毒株的遗传比较显示了一组14个点突变，所述点突变可以与LAV1减毒相关联。

表1：DEN-1 16007和DEN-1 16007/PDK13(LAV1)的序列差异

修改相应密码子的核苷酸变化以斜体指出。

最初于1983年建立的LAV1毒株进一步被迅速鉴定为潜在的疫苗候选物(Bhamarapravati和Yoksan，1997)。

然而，在那时，没有意识到通过哺乳动物培养物向具有海绵状脑炎的人的传播是一种危险，并且病毒常规地维持在原代犬肾细胞(PDK)中。此外，这种LAV1毒株相应于异质群体。由于在所述组合物中存在的毒株之一的潜在体外或体内选择，这种异质性代表了另外的危险。

考虑到这些渐增的担心，申请人决定建立消毒(sanitization)过程以便消除任何此类危险。通过首先将LAV1疫苗毒株从PDK中转移到VERO细胞，然后用纯化的LAV1基因组RNA转染Vero细胞，随后为病毒噬斑纯化的两个顺次步骤，申请人生产了新型Vero来源的血清型1病毒(VDV1)。

通过转移至VERO细胞和生物学克隆而如此获得的这种新型VDV1毒株，在序列、同质噬斑大小(homogenous plaque size)和温度敏感性方面不同于LAV1毒株，但重要的是保留了LAV1的某些表型和基因型特征，例如减毒点(attenuation spot)、小噬斑表型、在高温时的生长限制，并且保留了LAV1毒株的免疫原性特征。这些特征使得这种新型毒株成为用于在人中进行预防性免疫接种的有价值的疫苗候选物。

定义

“登革热病毒”是属于黄病毒科黄病毒属的正义单链RNA病毒。在登革血清型1(DEN-1)毒株16007的情况下，整个序列长度为10735个核苷酸(SEQ ID No.2)。RNA基因组在5′末端处包含I型帽，但没有3′末端poly(A)尾。基因结构是5′-非编码区(NCR)、结构蛋白(衣壳(C)、前膜/膜(prM/M)、包膜(E))和非结构蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)以及3′NCR。病毒RNA基因组与C蛋白结合从而形成核壳体(二十面体对称)。如同其他黄病毒一样，DEN病毒基因组编码翻译成单个多蛋白的不间断开放读码框(ORF)。

登革1型的强毒(致病)株的连续传代导致分离出经修饰的病毒，其是“活的且减毒的”，即有传染性但不能引起疾病。这些经修饰的病毒通常在猴中进行测试以评估其减毒。然而，人是唯一显示出临床疾病体征的灵长类。这样的病毒称为“活的且减毒的”，即其在大多数受试人中引起轻度(即就调节目的而言是可接受的，因为呈现出正的利益/风险比)至低的次级效应或者不引起次级效应(即全身事件和/或生物学异常和/或局部反应)，但仍进行感染并诱导免疫应答。

术语“LAV”指活的减毒登革热病毒株。在本发明的情况下，“LAVs”是通过在原代犬肾(PDK)细胞中传代例如传10、11、12或13代而最初来源于登革血清型1(DEN-1)毒株16007的活的减毒株。例如，“LAV1/PDK13”是毒株16007在PDK细胞中传代13次后建立的减毒株(也称为DEN-1 16007/PDK13)。LAV1/PDK13核苷酸序列显示于SEQ IDNo.3中。

“VDV1”意指通过本申请中公开的消毒过程可获得的LAV。因此，VDV1是生物学克隆(均质的)VERO-适应的登革血清型1病毒，其能够在灵长类特别是人中诱导特异性体液免疫应答，包括中和抗体。本发明的VDV1毒株可以容易地直接从本文公开的VDV1序列开始重建。特异性体液免疫应答的诱导可以通过ELISA测定法容易地进行测定。在已接种疫苗者血清中的中和抗体的存在通过如4.1.2.2节中所述的噬斑减少中和测试来进行评估。当如此测定的中和抗体滴度为至少大于或等于1∶10时，血清被视为对于中和抗体的存在是阳性的。

术语“突变”意指遗传材料例如DNA、RNA、cDNA中任何可检测的变化，或者此类变化的任何过程、机制或结果。突变包括一个或多个核苷酸的置换。在本申请的情况下，在登革1型病毒基因组序列或多蛋白中鉴定的突变依照Dunnen和Antonarakis(2000)的命名法进行命名。如由Dunnen和Antonarakis限定的，在核酸水平上，置换由“＞”指明，例如“31A＞G”表示参考序列第31位处的核苷酸A变成G。

在蛋白质水平上的变异描述了突变结果且如下报告。终止密码子由X指明(例如，R97X表示Arg96变成终止密码子)。氨基酸置换例如由“S9G”指明，这意指第9位处的Ser被Gly替换。

VERO来源的登革血清型1病毒(VDV1)

先前开发的登革1型疫苗候选物LAV1的组成通过消毒过程得到改善。

本文公开的VERO来源的登革血清型1病毒(VDV1)使用通过在PDK细胞上连续传代而减毒的DEN-1 16007病毒。VDV1包含活减毒DEN-1病毒的完整基因组序列，并且具有与在人中测试的原始LAV1毒株相同的与减毒相关联的点。

LAV1疫苗候选物的消毒通过去除蛋白质并只将纯化的病毒基因组材料导入Vero细胞中来进行。更具体而言，毒株的消毒在2个步骤中进行：

1)于32℃在Vero细胞上扩增DEN16007/PDK11(LAV1/PDK11)；

2)纯化病毒RNA并转染到Vero细胞中。

步骤1通过LAV1/PDK11在Vero细胞上传代1次来进行。为了那个目的，Vero细胞用LAV1/PDK11以0.01的moi进行感染，并于32℃孵育5天。

对于步骤2，利用病毒基因组是感染性RNA这一事实，这意味着，当引入细胞中时，它能够重构出完整的传染性病毒。因此，第二个纯化和转染步骤包括下列步骤：

a)从噬斑-纯化的病毒中提取和纯化病毒RNA；

b)有利地使纯化的RNA与阳离子脂质结合；

c)转染Vero细胞，特别是Vero细胞LS10；

d)回收新合成的病毒；和

e)通过噬斑纯化来纯化VDV毒株，和任选地使其在宿主细胞特别是Vero细胞中扩增。

Vero细胞技术是众所周知的技术，其已用于不同的商业产品(可注射的和口服的脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗)。在本发明中，限定的Vero细胞有利地用于保证不存在可能与外来因子存在相关的任何危险。“限定的VERO细胞”意指这样的细胞或细胞系，即关于其的培养条件是已知的，并且所述细胞不含任何外来因子。这些包括例如Sanofi Pasteur的VERO细胞LS10。

如此分离的VDV毒株通常以冷冻组合物形式或冻干产品形式贮存。为了那个目的，VDV可以与稀释剂相混合，所述稀释剂通常是包含冷冻防护化合物例如糖醇和稳定剂的缓冲水溶液。如通过pH计于RT测定的，在冷冻或冻干前的pH有利地设定为6-9，例如约7，例如pH7.5+/-0.2。使用前，将冻干产品与药学稀释剂或赋形剂例如无菌NaCl 4‰溶液相混合，以重构液体免疫原性组合物或疫苗。

与LAV1/PDK13毒株相比较，在转染后回收的病毒的减毒特异性基因座处进行的测序没有显示任何突变。经生物学克隆的VDV1病毒显示出同质噬斑表型和相对于其LAV1亲本的显著遗传稳定性，因为它尤其可以由减毒基因型的保守性中推导出来。

对VDV1毒株进行测序，并且与血清型1登革活减毒病毒(LAV1/PDK13)毒株序列(SEQ ID No 3)进行比较。发现关于参考LAV1序列的一组3个核苷酸差异。它们中的一个在氨基酸水平上是沉默的(第2719位)。另2个(第5962和7947位)位于非结构肽的编码序列(分别为NS3-481和NS5-125)中。这些差异无一相应于任何所述LAV1减毒位置。

本发明因此提供了活的减毒登革1型病毒株，其由野生型病毒DEN-1 16007获得，DEN-1 16007通过在PDK细胞上连续传代并随后通过在VERO细胞上传代和消毒来进行减毒。特别地，本发明的减毒株至少包含相对于野生型DEN-1 16007和LAV1/PDK13毒株的核苷酸序列或多蛋白序列的鉴定出的序列突变(非沉默的和任选地沉默的)。

因此，本发明涉及分离的活的减毒登革1型病毒株，其包含LAV1/PDK13毒株的序列(SEQ ID No.3)，或由LAV1/PDK13毒株的序列(SEQ ID No.3)组成，其中至少第5962和7947位的核苷酸，以及任选地第2719位的核苷酸被突变，条件是下列核苷酸不被突变：1323、1541、1543、1545、1567、1608、2363、2695、2782、5063、6048、6806、7330和9445。优选地，所述突变是置换。优选地，第5962位的核苷酸是A，第7947位的核苷酸是G。更加优选地，根据本发明的分离株包含序列SEQ ID No.3，其包含突变2719 G＞A、5962 C＞A和7947A＞G。

因此，根据本发明的活的减毒登革1型病毒株包含野生型登革1型毒株16007的序列(SEQ ID No.2)，其中所述序列至少包含突变1323 T＞C、1541 G＞A、1543 A＞G、1545 G＞A、1567 A＞G、1608 C＞T、2363 A＞G、2695 T＞C、2782 C＞T、5063 G＞A、5962 C＞A、6048 A＞T、6806 A＞G、7330 A＞G、7947 A＞G和9445 C＞T。优选地，相对于野生型毒株16007的核苷酸序列(SEQ ID No.2)，根据本发明的活的减毒株进一步包含突变2719 G＞A。

根据本发明的活的减毒登革1型病毒株包括变异株，所述变异株包含如上文限定的在第5962和7947位处突变的序列SEQ ID No.3，并且进一步包含给定密码子位置中的一个或多个核苷酸置换，所述核苷酸置换不导致那个位置处编码的氨基酸的改变。

有利地，根据本发明的活的减毒登革1型病毒株包含这样的序列，其通过数目有限的突变，例如不超过5个、更加优选地不超过2个突变，而不同于SEQ ID No.1。

优选地，根据本发明的登革1型病毒株的基因组序列由核苷酸序列SEQ ID No.1组成。

本发明还涉及活的减毒登革1型毒株，其可以通过在细胞特别是Vero细胞上进一步传代而衍生自序列SEQ ID No.1的VDV1毒株。

本发明还涉及分离的核酸，其包含DNA序列SEQ ID No.1或其等价RNA序列，或由DNA序列SEQ ID No.1或其等价RNA序列组成。

“核酸分子”指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯类似物例如硫代磷酸酯和硫酯，其为单链形式或双链螺旋。

如本文使用的，与SEQ ID No.1“等价”的RNA序列意指其中脱氧胸苷已被尿苷替换的序列SEQ ID No.1。因为SEQ ID No.1构成VDV1cDNA序列，因此等价的RNA序列相应于VDV1的正链RNA。

本发明进一步涉及序列SEQ ID No.41的多蛋白及其片段。SEQ IDNo.41是由SEQ ID No.1编码的多蛋白的序列。

参考蛋白质的“片段”意指其序列包含参考蛋白质的相邻氨基酸链的多肽。片段的长度可以是至少8个、至少12个、至少20个氨基酸。

序列SEQ ID No.41的多蛋白的所述片段至少包含NS3蛋白第481位(SEQ ID No.41的第1956位)的赖氨酸，和/或NS5蛋白第125位(SEQ ID No.41的第2618位)的精氨酸。

根据一个实施方案，由SEQ ID No.1编码的多蛋白的片段是NS3蛋白和/或NS5蛋白，或者包含NS3蛋白和/或NS5蛋白。

免疫原性和疫苗组合物

本发明还涉及包含根据本发明的VDV1毒株的免疫原性组合物，其适合于用作疫苗。

根据本发明的免疫原性组合物引发针对登革热病毒的特异性体液免疫应答，包括中和抗体。

优选地，免疫原性组合物是疫苗。

根据一个实施方案，免疫原性组合物是单价组合物，即，它引发只针对登革1型病毒的特异性免疫应答和/或给予只针对登革1型病毒的保护。

根据另一实施方案，本发明涉及多价登革免疫原性组合物。此类多价免疫原性组合物或疫苗可以通过将单个单价登革疫苗相组合来获得。免疫原性或疫苗组合物可以进一步包含至少另一种血清型的活减毒登革热病毒。特别地，免疫原性或疫苗组合物可以包含与选自血清型2、血清型3和血清型4的至少一种活减毒登革热病毒相组合的根据本发明的VDV1。

优选地，免疫原性或疫苗组合物可以是四价登革疫苗组合物，即包含与活的减毒登革2型病毒株、活的减毒登革3型病毒株和活的减毒登革4型病毒株相组合的根据本发明的VDV1的疫苗组合物。

活的减毒登革2型、登革3型、登革4型病毒株先前已得到描述。可以参考由Mahidol University开发的活减毒疫苗，通过在原代犬肾(PDK)细胞中传代登革血清型2(毒株16681，第53代；LAV2)和血清型4(毒株1036，第48代，LAV4)病毒，以及在原代绿猴肾(PGMK)细胞(第30代)和胎恒河猴肺(FRhL)细胞(第3代)中传代血清型3(毒株16562)(LAV3)。LAV2(SEQ ID No.42)、LAV3(SEQ ID No.43)和LAV4(SEQ ID No.44)的核苷酸序列显示于所附序列表中。

有利地，活的减毒登革2型毒株可以相应于VDV2毒株，其通过在Vero细胞上的消毒过程而从由Mahidol开发的LAV2毒株获得。特别地，活的减毒登革2型毒株(VDV2)可以包含序列SEQ ID No.40，和有利地由序列SEQ ID No.40组成。

免疫原性组合物(包括疫苗)可以制备为为注射剂，其可以相应于液体溶液、悬浮液或乳状液。活性免疫原性成分可以和与之相容的药学上可接受的赋形剂相混合。

根据本发明的免疫原性组合物或疫苗可以使用本领域技术人员已知的任何常规方法进行制备。常规地，将根据本发明的抗原与药学上可接受的稀释剂或赋形剂例如水或磷酸盐缓冲盐水溶液、湿润剂、填充剂、乳化剂、稳定剂相混合。赋形剂或稀释剂将根据所选药物形式、施用方法和途径以及药学实践来进行选择。合适的赋形剂或稀释剂以及关于药物制剂的要求在Remington’s Pharmaceutical Sciences中得到描述，所述参考文献是这个领域中的参考书的例子。

优选地，免疫原性组合物或疫苗相应于可注射组合物，其包含缓冲水溶液以维持例如6-9的pH(于RT用pH计测定的)。

根据本发明的组合物可以进一步包含佐剂，即改善或增强由VDV1毒株引发的免疫应答的物质。在人疫苗领域中常用的任何药学上可接受的佐剂或佐剂混合物可以用于这个目的。

根据本发明的免疫原性组合物或疫苗可以通过在人疫苗领域中常用的任何常规途径进行施用，例如肠胃外(例如皮内、皮下、肌内)途径。在本发明的情况下，免疫原性组合物或疫苗优选是在三角肌区中皮下施用的可注射组合物。

用于免疫接种的方法

本发明进一步提供了针对登革感染对有此需要的宿主进行免疫接种的方法，其包括给宿主施用免疫有效量的根据本发明的免疫原性组合物或疫苗。

“有此需要的宿主”指处于登革感染危险中的人，即去存在登革热病毒感染的地区旅行的个体，以及那些地区的居民。

施用途径是疫苗领域中使用的任何常规途径。施用途径的选择取决于所选择的制剂。优选地，免疫原性组合物或疫苗相应于有利地在三角肌区中经由皮下途径施用的可注射组合物。

免疫原性组合物或疫苗中的LAV或VDV特别是VDV1的量可以方便地表示为病毒噬斑形成单位(PFU)单位或细胞培养半感染剂量(CCID₅₀)剂型，并且通过使用常规药学技术来进行制备。例如，对于单价组合物，根据本发明的组合物可以以包含10-10⁶ CCID₅₀，或10³-10⁵ CCID₅₀LAV或VDV，例如4±0.5 log₁₀ CCID₅₀ VDV1毒株的剂型进行制备。当组合物是多价的时，为了减少病毒干扰的可能性并因此达到平衡的免疫应答(即针对组合物中包含的所有血清型的免疫应答)，在所施用的疫苗中存在的每种不同登革血清型的量可以是不相等的。

“免疫有效量”是能够诱导特异性体液免疫应答(包括在已接种疫苗者血清中的中和抗体)的量，如通过如4.1.2.2节中所述的噬斑减少中和测试所评估的；当如此测定的中和抗体滴度为至少大于或等于1∶10时，血清被视为对于中和抗体的存在是阳性的。

施用体积可以依施用途径而变。皮下注射可以为约0.1ml-1.0ml，优选0.5ml的体积。

关于组合物施用的最佳时间是在最初暴露于登革热病毒之前约1-3个月。本发明的疫苗可以作为预防剂在处于登革感染危险中的成人或儿童中施用。因此，所靶向的群体包括未接触过登革热病毒的人以及接触过登革热病毒的人。本发明的疫苗可以以单次剂量进行施用，或者任选地，施用可以涉及使用致敏剂量，随后为加强剂量，所述加强剂量例如在2-6个月后施用，这由本领域技术人员确定为适当的。

本发明将根据下列附图和实施例进一步进行描述。

附图

图1是VDV1前主种子(pre-master seed)的历史概括。

图2是流程图，其概述了所开发的产生填充产品(单价)，“即用型”剂量的制备过程。

图3是VDV1基因组图谱的图示。上方的箭头是多蛋白的编码序列。

下方的箭头表示成熟肽的编码序列。直条表示野生型登革1型毒株16007和LAV1毒株之间的核苷酸变化。星号标明LAV1和VDV1之间的核苷酸变化。

图4显示于37℃孵育7天后，对登革1型病毒LAV1、VDV1和毒株16007的噬斑大小分析。

图5是图形分析，其显示了关于登革1型病毒LAV1、VDV1和毒株16007的噬斑大小分布。

图6是用于在未接触过黄病毒的健康成人中评估VDV1单价疫苗的安全性的实验设计的概括。

实施例

实施例1：消毒

1.1病毒RNA的纯化

最初希望通过纯化和转染从疫苗毒株DEN-16007/PDK10或DEN-16007/PDK11(由Sanofi Pasteur生产，滴度：4.60 logTCID₅₀/ml)的早期种子中直接提取的病毒RAN来进行LAV1的消毒。以那种方式进行了8种不成功的测定法，RNA量从10³到10⁷个拷贝变化。然后决定在RNA提取和转染前在Vero细胞上进行1次适应传代。

Vero细胞(VERO LS10 p142至145)用主种子(master seed)DEN-1/PDK11的样品以0.01的m.o.i.进行感染，并于32℃孵育5天。然后，培养基用感染培养基(包含10mM MgSO₄)替换。第二天可见清晰的致细胞病变效应，并且通过RT-PCR证实了培养物上清液中病毒RNA的存在。在感染后第8天收集培养基，用等体积的包含冷冻保护剂的缓冲水溶液(pH-7.5)进行稀释，并保持于-70℃冷冻直至使用。这种Vero-扩增的病毒命名为DEN-1/V100。它的感染滴度在Vero细胞上进行测定，并且为6.9 logTCID₅₀/ml。

RNA纯化和转染过程如下进行。将DEN-1 V100悬浮液进行稀释，以便包含至少3×10⁴和直至3×10⁷ TCID₅₀或PFU的病毒/毫升。向0.5ml病毒中加入在0.01ml William’s培养基中稀释的1个单位benzonase，以便消化来自细胞来源的DNA或RNA分子，并使溶液于4℃在搅拌器上孵育2小时。在孵育步骤结束时，加入0.65ml包含氯化胍、去污剂(SDS)和β巯基乙醇的变性缓冲液(RTL-β巯基乙醇缓冲液，在试剂盒RNeasy Mini kit，Qiagen Ref.74104中提供)，并且蛋白质用苯酚/氯仿(1/1，体积/体积)提取1次，再用氯仿(体积/体积)提取1次，随后于室温在14,000rpm下离心5分钟。每次提取后，收集水相，注意不要收集界面处的材料(白色沉淀)，并且转移到干净的1ml Eppendorf管中。随后根据制造商(RNeasy minikit，QIAgen)的建议将RNA溶液施加到QIAgen柱上，以便去除痕量溶剂，并用0.06ml不含核酸酶的H2O水洗脱。病毒RNA的存在通过定量RT-PCR，使用用已知量的病毒建立的参考曲线进行证实，单位为TCID₅₀/ml。

1.2用纯化的RNA转染Vero细胞

转染使用lipofectamine(LF2000 Reagent，Life Technologies)来进行，所述lipofectamine是通过电荷相互作用与RNA结合并且允许通过与细胞膜融合而将复合物转移到细胞的细胞质内的阳离子脂质混合物。LF2000试剂的最佳量在预备实验中通过下述过程来测定：使在16-24小时前铺板(在6孔平板中，0.3-0.5×10⁶细胞/孔)的Vero细胞与剂量渐增的(5-20μl)lipofectamine一起孵育。细胞随后于32℃和5％CO₂下孵育4-5小时，之后用不含FCS的新鲜培养基替换该培养基，并于32℃继续孵育过夜。在倒置显微镜下定期检查毒性(圆形、有折射力或漂浮的细胞，细胞单层的同质性)，共48小时。在这些条件下无毒的lipofectamine的最高剂量是10μl，并且被选择用于RNA转染。

使用1/10的经纯化的RNA制备物(相应于大约4×10⁵ TCID₅₀)平行地进行4次转染。将12微升的病毒RNA溶液在500μl包含10μlLF2000 Reagent(通过电荷相互作用与RNA结合并且允许通过与细胞膜融合而将复合物转移到细胞的细胞质内的阳离子脂质混合物)的OptiMEM培养基(GIBCO)中进行稀释。在4次反应的2次中加入200ng酵母tRNA作为载体。

在加入至6孔平板的汇合Vero细胞之前，允许4种转染混合物于室温沉淀10分钟。于32℃孵育4小时后，去除转染混合物并将细胞在PBS中漂洗1次。加入3毫升转染后培养基(Williams，GIBCO)，并于32℃继续孵育5天。该培养基随后用3ml登革感染培养基(补充有10mM MgSO₄的Williams)替换。

转染后24小时观察到中等毒性效应并在第3天时消失。在所有转染测定法中，在转染后6-8天检测到典型的致细胞病变效应(圆形、有折射力的细胞)。在这些细胞的上清液中病毒的释放通过qRT-PCR来证实。在转染后第6天和第8天收集培养液(3ml)，并汇集在一起。病毒用6ml包含冷冻保护剂的缓冲水溶液(pH＝7.5)进行稀释，并进行冷冻直至进一步扩增。

将在转染后这样获得的4种病毒溶液命名为TV(即在Vero细胞中的转染(Transfection in Vero cells)的缩写)100、TV200、TV300和TV400，并且显示出相似的感染滴度(参见下文)：

TV100：6.95 log TCID₅₀

TV200：6.80 log TCID₅₀

TV300：6.80 log TCID₅₀

TV400：6.85 log TCID₅₀。

值得注意的是，转染效率在tRNA存在下进行转染的样品(TV300和TV400)中并未显著增加。

1.3转染后回收的病毒的表征

测定DEN1-V100和TV100至400的噬斑大小。简而言之，Vero细胞以1,000,000细胞/cm²的密度在包含4％FBS的培养基中进行铺板。过夜孵育后，去除培养基，并用系列2倍或5倍稀释的病毒感染细胞。于37℃和5％CO₂下1.5小时后，去除接种物，并将细胞在包含1.26％甲基纤维素和10％FBS的极限Eagle培养基(Mimimal EagleMedium，MEM)中于37℃和5％CO₂下进行孵育。孵育11天后，平板于-20℃在冷丙酮中固定20分钟，并通过使用稀释至2.5μg/ml的黄病毒特异性mAb的免疫染色来显示。病毒噬斑使用图像分析软件(Saisam/Microvision)来测量。

作为对照，平行地将DEN-116007和LAVl进行铺板。数据呈现于表1中。

表1：DEN-116007、LAVl、V100(转染前)和TVX00(转染后)的噬斑大小

在Vero细胞上扩增的V100病毒显示出均质的小噬斑(SP)表型。噬斑略微大于在LAVl的不同样品中观察到的(直径2-3m，而不是<2mm)。这种SP表型在转染后回收的病毒中保留。在TV200样品中检测到，在铺板的90个病毒中具有1个大噬斑(LP)。然而，仅在VERO细胞上进行1次扩增传代后这个比例变成铺板的10个LP对82个SP，这暗示LP群体是占优势的。

值得注意的是，与LAMl相比较，平行进行的减毒关键位置的测序并未揭示出转染的病毒中的任何突变。

1.4噬斑纯化

呈现同质SP表型的DEN-1/TV100病毒的样品被选择用于噬斑纯化。简而言之，Vero细胞在6孔平板中进行铺板，并用系列稀释的病毒进行感染，以便获得每板1-20个噬斑。于37℃和5％CO₂下1.5小时后，去除接种物并使细胞在3ml固体培养基中进行孵育，所述固体培养基由在42℃预加热的MEM-10％FCS组成，并与在42℃进行平衡的2％熔化琼脂糖即时混合。允许培养基于室温凝固30分钟；在流动通风橱(flow hood)中，并将板以倒置位置于32℃-5％CO₂孵育10天。随后加入补充有0.01％中性红的第二层相同培养基，并使板于32℃再孵育1夜。在无菌条件下使用配备有0.1ml尖头(tip)的微量移液管(micro-pipet)挑取4个良好分离的小噬斑，并转移到包含0.2ml MEM-4％FCS的无菌管内。该悬浮液通过涡旋振荡进行均质化，在相同培养基中进行系列稀释，并立即用于感染Vero细胞的6孔平板。重复该方案，并进行第二次6个SP的挑取。在Vero细胞上扩增之前，在T25cm²烧瓶中将每个被挑取的噬斑在1ml培养基中进行稀释。在感染后第6天收集培养基，用相同体积的包含冷冻保护剂的缓冲水溶液(pH7.5)进行稀释，并冷冻于-70℃。所有这些步骤于32℃进行。

经噬斑纯化的病毒分别命名为DEN-1/TV111、DEN-1/TV112、DEN-1/TV121、DEN-1/TV131、DNE-1/TV132和DEN-1/TV141。感染滴度在Vero细胞上进行测定(参见下文)：

TV111＝6.85 LogCCID₅₀/ml TV112＝6.80 LogCCID₅₀/ml

TV121＝6.80 LogCCID₅₀/ml TV131＝6.70 LogCCID₅₀/ml

TV132＝6.45 LogCCID₅₀/ml TV141＝5.70 LogCCID₅₀/ml。

对于下列3个克隆进行在Vero细胞上的第二次扩增：TV111、TV112和TV121。

1.5经克隆的病毒的表征

测定DEN-1/TV111、DEN-1/TV112、DEN-1/TV121、DEN-1/TV131、DEN-1 TV132和DEN-1/TV141候选物的噬斑大小。还进行特异性减毒基因座的点测序，并且没有揭示出突变(表2)。

表2：在DEN-1病毒的减毒特异性点处的测序

核苷酸位置在各自基因下指明，并且参考DEN-1 16007毒株SEQ ID No 2。

在不存在能够区分这些克隆的任何其他标准的情况下，TV121被任意选择作为VDV1的前主(pre-master)。

总之，在VERO细胞上进行了总共6次传代以调整和克隆最初的DEN-1 16007/PDK11减毒株。在适合于工业应用(环境控制、原料和实验的可溯性、动物来源产品的分析证明)的条件下，将病毒RNA进行纯化并转染到限定的VERO细胞中。VERO适应的毒株通过噬斑纯化进行克隆以在VERO传代数为6时产生VDV1疫苗候选物的前主种子。

与LAV1相反，VDV1呈现出同质小噬斑大小表型。此外，在减毒特异性位置处没有鉴定出突变。进一步的表征随后通过测定批量(bulk)VDV1全序列和表型测试来进行。

实施例2：测序

病毒全序列根据下述策略来产生。从包含VDV1的样品开始，提取基因组RNA并进行纯化，反转录成cDNA。然后由cDNA进行所有重叠的PCR扩增，在每个PCR产物的2个末端添加测序标签。在自动化装置中产生所有单个序列并进行分析。下一个步骤由通过所有单个序列的多重比对的基因组重建组成。在这点上，关于参考序列的每个意外的核苷酸变化通过回到原始数据而谨慎地进行重新分析。此类变化通过由新PCR产物进行的另一个序列系统地进行证实。一旦解决了所有错读(ambiguities)，就完成了经测序的病毒基因组，并且在VectorNTi数据库中形成了新分子。它可以通过多重序列比对用于内部基因组分析。

2.1材料

2.1.1病毒

此处涉及的病毒是DEN-1 16007；LAV-1/PDK13；VDV1，其序列在所附的序列表中给出。这些病毒的完整基因组序列长度为10735个核苷酸。

2.1.2引物

所有引物已在Seqweb生物信息学软件包(Accelrys)，引物设计模块中进行了设计(表3)。

表3：RT-PCR和测序引物的列表

2.2方法

2.2.1病毒RNA的纯化

根据以前的经验，需要最低限度1000 DICC₅₀以在接下来的步骤中获得阳性RT-PCR反应。这意味着需要最低限度10⁴ DICC₅₀/mL的病毒滴度。病毒基因组RNA使用QIAamp病毒RNA小试剂盒(Qiagen)根据制造商的建议进行纯化。简而言之，将来自粗制病毒样品的140μl体积在裂解溶液存在下进行孵育，并加载到试剂盒柱上。洗涤步骤后，纯化的病毒RNA通过60μl包含1μl(40个单位)RNA酶抑制剂(RNAse Out，Sigma)的、不含核酸酶的无菌水进行洗脱。

2.2.2反转录

病毒RNA通过来自ABGene的反转录酶(反向iT)反转录成cDNA。再次应用标准操作条件，在20μl的最终反应体积中使用10μl纯化的RNA。反应通过负链引物的杂交来起始。每次PCR进行1次RT反应(表1)。cDNA合成通过于47℃孵育45分钟来获得。

2.2.3 PCR

所有PCR采用Expand High Fidelity PCR系统(Rochediagnostics)，使用来自表1的所有16对引物(+)和(-)来进行。PCR条件如下：

所有PCR产物通过在琼脂糖凝胶上进行电泳来检查。

2.2.4测序

测序反应的主要部分已外包给Genome Express。基因组末端、错读、某些内部PCR接头以及用于技术原因而未由Genome Express测序的区域在机构内部(in-house)进行。

·在Genome Express的测序：PCR产物于+4℃进行运输，并且测序结果作为信息序列文件被接受。关于每个单个序列，可获得文本文件、质量文件(quality file)和色谱图。序列比对后，在色谱图上检查所有差异，并且如果鉴定为序列算法误差则进行校正。

·机构内部测序：测序反应使用Sequitherm Excell II LC试剂盒(Epicentre)在热循环仪PTC-200(MJ Research)上进行。每种PCR产物在单个反应中独立地对2条链进行测序。将反应体系加载到测序电泳凝胶上。测序运行和分析在自动化测序仪Gene ReadIR 4200(Li-Cor)上进行。

·测序反应

添加3μl变性/加样缓冲液。

样品于95℃变性3分钟，并紧在样品加载前用冰冷却。

·测序电泳

2.3结果

所有PCR片段使用共同的PCR添加尾从2个末端开始进行测序，所述PCR添加尾即在所有引物的5′末端处添加的特异性基序：

5′引物：M13SEQ-GTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID No.38)

3′引物：M13REV-AACAGCTATGACCATG(SEQ ID No.39)。

M13-SEQ和M13-REV序列相应于通用M13引物基序(New EnglandBiolabs标准)。

对于最终重叠群装配，在Vector NTi中，在ContigExpress模块(Informax)中进行快速分析。将LAV1参考序列与所有单个测序结果进行比较。在此类条件下，所有结果可以在完整基因组上的右侧位置处进行比对，甚至当某些区域仍缺少重叠群装配时，从而产生总基因组比对的快速显现。

2.3.1完整的VDV1序列的装配

最终序列比对在Vector NTi，AlignX模块(Informax)中进行。通过软件将常规多重序列比对算法ClustalW(Thompson等人，1994)用于建立总体比对。所有序列结果连同LAV1参考序列一起比对，从而允许更好地重建基因组。关于参考而言在序列中的任何差异需要在另一次独立测序反应上进行证实。VDV1的完整序列显示于SEQ ID No.1中。

通常在单个序列中发现某些错读，特别是在序列末端附近。这是在任何PCR片段的2个末端处一定程度的反应质量差的内在原因。此类质量差的序列被排除在比对之外，直至可从其他PCR产物获得2个其他独立的测序反应。当在至少2个独立的与共有序列相匹配的其他PCR序列中未得到证实时，相对于参考的差异在最终比对中不加以考虑。相反地，在2个独立序列上证实的任何差异在最终序列中保留。

表4概括了每个单独测序反应的特征，指出了起点、终点和长度。还指出了邻近PCR之间的重叠，以及指出了在最后一列中与参考序列的差异。

表4：登革VDV1单独序列的特征

基因组的2个末端不能由PCR扩增进行测序，因为cDNA合成和PCR DNA反应需要与基因组末端互补的寡核苷酸。在扩增步骤过程中，这些寡核苷酸被掺入PCR片段中。序列结果是合成的寡核苷酸的序列，而不是病毒自身的序列。来自病毒基因组2个末端的PCR确实正确地运转，这暗示病毒序列与所述寡核苷酸序列并无显著不同(如果有显著不同，那么PCR扩增应当已失败或至少应当具有差的质量)。基因组的2个末端不能与所有其他PCR扩增区分开。因此，在重建的基因组(SEQ ID No.1)中，2个基因组末端被视为等同于寡核苷酸序列(并且还等同于参考)。在5′末端，所述序列是核苷酸1-34的序列。在3′末端，所述序列是核苷酸10707-10735的序列。

2.3.2序列比较

VDV1毒株和LAV1参考之间的直接序列比较显示了一连串的3个核苷酸差异。表5给出了这些位置的全部列表。

表5：LAV1和VDV1毒株之间的序列比较

第2719位处的核苷酸变化在氨基酸水平上是沉默的。第5962位处的第二个差异引发了在NS3-481处的氨基酸变化(天冬酰胺至赖氨酸)。两者都是亲水的，但赖氨酸带正电，而天冬酰胺则不是。最后一个差异位于NS5肽中，将位置NS5-125处的赖氨酸置换成精氨酸。这样的氨基酸置换从化学观点来看是相对保守的，精氨酸和赖氨酸残基是亲水的和带正电的。

表6：在其他登革1毒株上的差异的搜索

当在所有可获得的Genbank血清型1登革基因组序列之间进行序列比对时，看起来大部分鉴定的差异也存在于其他毒株上(参见表6)。1个位置在VDV1毒株中是独特的(第7947位；NS5-125)。

因此，登革热病毒的VDV1毒株的全部基因组序列已确定。

已检测到相对于亲本LAV1基因组序列的3个核苷酸差异。VDV1疫苗毒株通过病毒“消毒”和从犬到猴细胞的传代而衍生自LAV1。

LAV1和VDV1之间的差异可以具有几个来源。首先，克隆步骤可以选出与LAV1中先前检测的主要序列并非100％一致的病毒亚群。其次，LAV1在PDK细胞上产生，而VDV1在Vero细胞上制备。此类从犬到猴细胞的传代可能诱导病毒变化，其反映了对新细胞系的适应。第三，对于所有RNA病毒，较低的病毒RNA聚合酶保真度触发了比DNA聚合酶更高的基因组突变率。

就序列而言，在LAV1和VDV1之间只观察到3个差异，相应于只有2个氨基酸置换。与LAV1病毒减毒相关的所有14个核苷酸位置在VDV1中被保留。此外，还比较了主和批量VDV1的序列(表7)。

表7：野生型16007毒株以及减毒的LAV1/PDK13和VDV1毒株之间的登革1核苷酸差异

将VDV1主种子的全序列与批量序列进行比对。在这两个序列之间没有观察到差异，这表明经过传代的遗传稳定性。

VDV1显示了相对于其LAV1亲本的显著的遗传稳定性。

实施例3：表征

这些研究的目的是评估减毒标记中的变化是否通过传代而出现。

图2中显示的流程图概述了所开发的产生填充产品(单价)，“即用型”剂量的制备过程。

简而言之，由研究部门递送的病毒前主种子在Vero细胞上2次连续传代后，获得各自的工作种子(working seed)。最终病毒培养也通过感染Vero细胞悬浮液来实施。随后收获产生的病毒。脱氧核糖核酸(DNA)根据酶处理进行消化。杂质通过超滤来去除。感染滴度通过浓缩步骤而得到增强。加入包含冷冻保护剂的缓冲水溶液(pH＝7.5)，并且随后将这种经0.22-μm过滤的混合物在相同溶液内稀释至靶定的剂量。然后将活性物质填充到玻璃管形瓶内，冷冻干燥，并在使用前进行贮存。

3.1表型标记

结果显示于表8中。对主种子和批量种子进行的验证测试是：

噬斑大小：该测定法在孵育7天后于37℃在Vero细胞中进行。噬斑的大小测定在用摄像机捕获图像后通过Saisam v.5.2.0(Microvision Instruments)专用软件来进行。在LAV1中检测到2种群体(0.3mm和0.8mm)。主要群体是最小的。在适应Vero细胞和生物学克隆后，VDV1噬斑大小分布看起来是同质的，群体的超过98％显示出集中至直径0.8mm的单个峰。这些噬斑明显不同于用DEN-116007病毒获得的噬斑(参见图4和5)。

温度敏感性：相对于非温度敏感(Ts)的野生型(WT)D1-16007，单价1显示出于39℃的明显受限制的生长。这通过感染滴度测定法和通过病毒RNA定量进行证明。与37℃相比较，于39℃单价1种子的主种子、批量种子和第18代(在批量传代物后10代)展示出90％或更多的滴度减少。

表8：DEN-1病毒表型的概括

^*n：动物数目

3.2基因型标记

VDV1疫苗毒株可以在基因组水平上与亲本毒株区分开。已鉴定了减毒特异性基因座。这些基因座在主和批量种子中被保留。

实施例4：在猴中的免疫原性、病毒血症和毒理学

可以在猴中获得的最可靠和众多的数据涉及免疫原性和病毒血症。特别地，病毒血症已被鉴定为与人中的毒力和疾病严重度有关的因素之一，并随后构成了所考虑的重要参数。很显然，免疫原性是测试疫苗时的关键参数。

发明人已确定了关于病毒血症和免疫原性的最小/最大值。表9：对于在猴中由登革疫苗候选物诱导的应答的最低要求，如在Vero或LLC-MK2细胞(这些细胞在此类测定法中视为等价的)中通过噬斑测定法测量的

pfu：噬斑形成单位

PRNT 50：噬斑减少中和滴度50(相应于噬斑数目减少50％的滴度)

4.1材料和方法

4.1.1猴实验

猴实验根据关于动物实验的欧洲指南来进行。

对来自毛里求斯(CRP Le Vallon)的恒河猴(食蟹猴(Macacafascicularis))进行免疫接种。在免疫接种前，猴在Sanofi Pasteur的动物研究所隔离检疫6周。

猴通过皮下(SC)途径在臂中用体积0.5ml的疫苗进行免疫(参见各个分别的部分)。在用氯胺酮(Imalgene，Merial)轻度麻醉后，通过刺破腹股沟静脉或隐静脉来收集血液。在第0和28天，抽取5ml血液用于评估抗体应答，而在第2和10天之间只抽取1ml血液用于评估病毒血症。在冰上收集血液并保持在冰上直至血清分离。为了做到这点，血液于4℃离心20分钟，并且收集血清并贮存于-80℃直至在Rich Kinney’s实验室中进行测试。在干冰中装运到美国。

4.1.2病毒血症和中和抗体应答(噬斑减少中和测试，PRNT)

所有分析在CDC，Fort Collins，USA的R.Kinney实验室中进行。装运血清样品并贮存于-80℃直至测试时。在第一次解冻时，就病毒血症测试样品，并对血清作1∶5稀释。在就中和抗体进行测试之前，使1∶5血清稀释物于56℃灭活30分钟。

4.1.2.1病毒血症

将0.125ml血清加入至在96孔平板的第1个孔中的0.125ml稀释剂(RPMI培养基)之中，并进行10倍系列稀释，对于每次稀释将0.025ml转移到0.225ml稀释剂中。将0.2ml 10^0.3-10^5.3稀释系列在Vero细胞的6孔平板中进行铺板(病毒于37℃吸附1.5小时，用4ml不含中性红的琼脂糖覆盖，6-7天后用2ml包含中性红的琼脂糖覆盖，并计数噬斑)。病毒检测极限是＝10PFU/ml。关于对照，将原液DEN-16007 PDK-13(LAV1)疫苗进行铺板。

4.1.2.2PRNT(噬斑减少中和测试)

中和抗体如Huang等人(2000)中所述进行定量。简而言之，将0.2ml热灭活的经1∶5稀释的血清加入96孔平板的第一个孔中，并进行2倍系列稀释，对于每次稀释将0.1ml转移到0.1ml稀释剂(RPMI培养基)中。这导致产生1∶10-1∶320的血清稀释系列。将0.1ml DEN病毒(60-160 PFU；亲本DEN1 16007病毒)加入至每个血清稀释孔中，得到总共0.2ml血清-病毒混合物。96孔平板于4℃孵育过夜。将0.1ml血清-病毒混合物(包含30-80 PFU的输入病毒)在6孔Vero平板中进行铺板(如上文在“病毒血症”部分所指明的)，并且在用中性红染色后计数噬斑。在2倍、1倍和0.5倍测试浓度下输入病毒的多次反向滴定(back titration)提供了输入PFU的直接实验测定，这是用于测定50％(PRNT₅₀)和70％(PRNT₇₀)终点抗体滴度的基础。阴性血清结果应当具有＜1∶10的中和抗体滴度。显示出320的中和滴度的血清在1∶80-1∶2560的稀释度进行再次测试，以确定终点滴度。

4.2 VDV候选物的评估

4.2.1 VDV1/前主

VDV1候选物的纯化/选择已如实施例1中所述进行。所选克隆(基于表型标记和序列)已如在“材料和方法”中所述的在sanofi pasteur(Marcy l’Etoile动物研究所，I15)中对来自CRP Le Vallon，毛里求斯的雄性恒河猴(食蟹猴，平均重量3.1kg)进行了测试。

在第0天免疫接种后，从第2天到第10天追踪病毒血症，并且在第0天和第28天测量免疫原性。当以液体形式时，所有病毒和疫苗保存于-70℃。

LAV1：滴度：10^3.9DICC₅₀/ml；冻干的，重悬浮于0.5ml PBS(包含Ca²⁺和Mg²⁺；CaCl₂.2H₂O 0.133g/l；MgCl₂.6H₂O，0.1g/l)中，并且全部施用。

前主VDV1 DEN1-TV111：滴度：10^5.9DICC₅₀/ml；液体，在PBS(包含Ca²⁺和Mg²⁺；CaCl₂.2H₂O 0.133g/l；MgCl₂.6H₂O，0.1g/l)中稀释至10^5.3pfu/ml；施用0.5ml。

通过SC途径在臂中用23G1针进行注射，对于VDV1采用10⁵DICC₅₀的剂量。

结果呈现于表10中。第28天时的滴定一式三份(PRNT₇₀)或一式两份(PRNT₅₀)地进行。

简而言之，应答在每个组中是相当均一的，并且对于每个构建体可以鉴定出某些清晰的趋势。在VDV1和LAV1之间没有发现显著差异：在某些LAV1猴中观察到低且晚的病毒血症。VDV1看起来是令人满意的，并且特别是没有呈现病毒血症。

4.2.2 VDV 1批量

因为在前主(Premaster)阶段已测试了疫苗的免疫原性，所以在批量阶段设计了进一步的实验以测试每个单价疫苗。

如前面一样使用来自C.R.P.Le Vallon，Ile Maurice的雄性食蟹猴(24只猴，平均重量3.4kg)。

VDV1：批次：滴度：8.37 log10 DICC₅₀/ml

安慰剂：含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS

疫苗在PBS(包含Ca²⁺和Mg²⁺；CaCl₂.2H₂O 0.133g/l；MgCl₂.6H₂O，0.1g/l)中稀释至10^5.3DICC₅₀/ml；通过SC途径在臂中用23G1针施用0.5ml，相应于10⁵ DICC₅₀的剂量。

病毒血症和免疫原性已照例在CDC中由R Kinney进行测量。结果显示于表11中。

VDV1单价疫苗诱导了显著的免疫应答而不存在病毒血症。因此，这种单价VDV1满足在猴中最初限定的成功标准。

4.3在猴中的神经毒力测试

对于每个病毒类型，10只来自毛里求斯的恒河猴通过大脑内途径(在每个半球的丘脑中10^7.23CCID₅₀/mL)用VDV1主种子进行接种。在测试结束时，将猴处死并用福尔马林溶液灌注。组织样品取自每只猴的脑(延髓、脑桥和小脑、中脑、丘脑(包括左和右部)、大脑皮层的左和右侧)。切下厚度为8μm的切片并通过曙红和桔花青进行染色。

在用VDV1种子注射的猴脑中没有观察到病原性的组织病理学征兆。

实施例5：单价VDV1在未接触过黄病毒的年龄为18-40岁的健康成人中的安全性

这个1期试验的目的是证明在未接触过黄病毒的成人中与Stamaril

(用作对照组)相比较，单价VDV1在10⁴ CCID₅₀的病毒浓度下的安全性、病毒血症和免疫原性特性。给予单次注射，在6和12个月时随访。对于安全预防措施，在研究中进行顺次包括。

参与和疫苗接种因此是交错的：第1个群组(n＝4/组，总数n＝12)进行了疫苗接种。在决定继续对剩余受试者(n＝8/组，总数n＝16)进行疫苗接种之前，一直到第28天收集的安全性数据由独立数据监察委员会(Independent Data Monitoring Committee)(IDMC)和皇家阿德雷德医院研究药物小组委员会(Royal Adelaide HospitalInvestigational Drugs Subcommittee)(IDSC)进行评审。试验设计的图示在图6中提供。

施用疫苗后，患者定期接受各种临床检查和测试。这个随访的概括在下表12中给出。

参与的群体由在入选当天时年龄为18-40岁(即18岁生日那一天至41岁生日前那一天)的成人组成，所述成人是未接触过黄病毒的[存在针对黄病毒疾病(例如黄热病、日本脑炎、登革热)的疫苗接种；或黄病毒感染史(经临床、血清学或微生物学证实)，或以前居住在具有高度的登革感染地方流行性的地区或去具有高度的登革感染地方流行性的地区旅行(无论持续时间多长)，或居住在North Queensland2周或更长时间或去North Queensland旅行2周或更长时间的人被排除]

表12：关于随访的流程图

v：就诊-D：天

就诊之间的时间间隔将由研究疫苗接种日期进行计算，所述研究疫苗接种日期可能不同于就诊日期(例如在符合临时排除标准的情况下)。V06和V07必须以至少1天的间隔进行。

测试的产品是：

评估的疫苗是管形瓶中的冻干产品，所述冻干产品用分开提供的稀释剂即时重构：

活性成分：4±0.5 log₁₀CCID₅₀的单价Vero登革热病毒血清型1(VDV1)/0.5mL剂量；

稀释剂：无菌NaCl 4‰溶液，用于疫苗重构。

重构的疫苗，即0.5mL单价VDV1的NaCl 4‰溶液，应当立即使用或维持于+2℃-+8℃直至使用。

在三角肌区中皮下施用0.5mL疫苗剂量。

对照疫苗Stamaril

是由Aventis Pasteur生产的黄热病疫苗。Stamaril

表现为冻干的、不含禽白血病的、稳定化的产品，其紧在使用前用稀释剂进行重构。(活性成分：活的减毒黄热病病毒(17D毒株)：≥1,000小鼠半致死剂量(LD₅₀)/稀释剂：无菌NaCl 4‰溶液)。

在三角肌区中皮下施用对照疫苗。

试验的初步结果报告在下表13中。

表13：初步的安全性数据

表13显示，生物学异常(WCC减少、血小板计数减少)都是轻微的。症状主要是不适、恶心、腹泻和偶然呕吐。它们具有中等严重性。1个显著的疹-典型的“病毒”斑丘疹，在第12天发作，90％覆盖度(coverage)。

第2个群组的安全性数据也是令人满意的，没有报告生物学异常。所有受试者在针对登革1进行疫苗接种后28天具有抗体应答(滴度为1315-13150)。

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Claims

1.活的减毒登革1型病毒株，其完整基因组序列由下列构成：SEQID No.1；或者含有在给定密码子位置中的一个或多个核苷酸的置换的SEQ ID No.1，所述置换不导致那个位置处所编码的氨基酸的改变。

2.免疫原性组合物，其在药学上可接受的载体中包含根据权利要求1的活的减毒登革1型病毒株。

3.疫苗组合物，其在药学上可接受的载体中包含根据权利要求1的活的减毒登革1型病毒株。

4.根据权利要求3的疫苗组合物，其是单价疫苗组合物。

5.根据权利要求3的疫苗组合物，其是多价登革疫苗组合物。

6.根据权利要求5的疫苗组合物，其包含活的减毒登革2型病毒株，所述活的减毒登革2型病毒株的基因组序列由序列SEQ ID No.40构成。

7.根据权利要求3-6中任一项的疫苗组合物，其包含10³-10⁶CCID₅₀的根据权利要求1的活的减毒登革1型病毒株。

8.分离的核酸，其由DNA序列SEQ ID No.1组成或由RNA序列组成，所述RNA序列由其中脱氧胸苷已被尿苷替换的序列SEQ ID No.1组成。

9.由SEQ ID No.1编码的分离的多蛋白。