BRPI0613328A2 - cepa do vìrus da dengue-1 vivo atenuado, composição imunogênica, composição de vacina, ácido nucléico isolado, poliproteìna isolada e fragmento de poliproteìna - Google Patents

Abstract

CEPA DO VìRUS DA DENGUE-1 VIVO ATENUADO, COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, COMPOSIçãO DE VACINA, áCIDO NUCLéICO ISOLADO POLIPROTEìNA ISOLADA E FRAGMENTO DE POLIPROTEìNA. A presente invenção refere-se às cepas de vírus VDV1 vivos atenuados (vírus da dengue sorotipo-1 derivado de células VERO) que foram obtidas a partir de cepas 16007 do vírus da dengue-1 tipo selvagem pela passagem em células PDK e sanitização em células VERO. A presente invenção refere-se também a composição de uma vacina que inclui uma cepa do VDV1.

Description

"CEPA DO VÍRUS DA DENGUE-1 VIVO ATENUADO, COMPOSIÇÃOIMUNOGÊNICA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO,POLIPROTEÍNA ISOLADA E FRAGMENTO DE POLIPROTEÍNA"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a novas cepas vivas de VDV1atenuadas (vírus da dengue sorotipo-1 derivado de células VERO) que sãoobtidas a partir da dengue-1 tipo selvagem cepa 16007 pela passagem sobrecélulas PDK e células Vero, e sanitização. A presente invenção refere-setambém a uma composição de vacina que compreende tais cepas VDV1.

Antecedentes da Invenção

A dengue é causada por quatro tipos sorológicos viraisestreitamente relacionados, mas antigenicamente distintos, (Gubler, 1988;Kautner et ai., 1997; Rigau-Pérez et a/., 1998; Vaughn et ai., 1997), do gêneroFlavivirus (Gubler, 1988). A infecção por um sorotipo do vírus da dengue podeproduzir um espectro de doenças clínicas que podem variar de uma síndromeviral não específica á uma severa, doença hemorrágica fatal. O período deincubação da febre da dengue (DF), após as picadas de mosquitos dura emmédia 4 dias (variação de 3-14 dias). DF caracteriza-se por febre bifásica, dorde cabeça, dores em várias partes do corpo, prostração, erupção cutânea,Iinfodenopatia e Ieucopenia (Kautner et ai, 1997; Rigau-Pérez et ai., 1998). Operíodo virulento é o mesmo que o da doença febril (Vaughn et ai., 1997). Arecuperação da DF é geralmente concluída em 7 a 10 dias, mas a asteniaprolongada é comum. A diminuição na contagem de leucócitos e plaquetas sãofreqüentes.

A dengue hemorrágica (FHD) é uma doença febril gravecaracterizada por anormalidades da homeostase e aumento da permeabilidadevascular que pode levar a hipovolemia e hipotensão (Síndrome de choque pordengue, DSS) muitas vezes complicada por grave hemorragia interna. A taxade mortalidade do caso FHD pode ser tão alta quanto 10%, sem tratamento,mas inferior a 1% na maioria dos centros com experiência terapêutica (WHOTechnical Guide, 1986).

O diagnóstico laboratorial de rotina das infecções por dengue ébaseado no isolamento do vírus e/ou na detecção de anticorpos específicos dovírus da dengue.

A doença da dengue é a segunda doença infecciosa tropical maisimportante após malária, com mais da metade da população mundial (2,5bilhões) vivendo nas áreas de risco de epidemia. Há uma estimativa de que 50a 100 milhões de casos de dengue, 500.000 pacientes hospitalizados com FHDe 25.000 mortes por dengue ocorrem todos os anos. A dengue é endêmica naÁsia, no Pacífico, África, América Latina e Caribe. Mais de 100 países tropicaistêm endemias de infecções virais de dengue, e FHD têm sido documentadosem mais de 60 destes países (Gubler, 2002; Monath, 1994). Um número defatores bem descritos parecem estar envolvidos nas infecções por dengue:crescimento populacional, urbanização descontrolada e não planejada eparticularmente associado com a pobreza, aumento do tráfego aéreo, a falta decontrole efetivo dos mosquitos, bem como a deterioração das infra-estruturassanitárias e de saúde pública (Gubler, 2002 ). A conscientização da denguepelos viajantes e estrangeiros está aumentando (Shirtcliffe et al., 1998). Adengue provou ser uma das principais causas de doença febril nas tropasnorte-americanas durante o posicionamento estratégico em áreas tropicaisonde a dengue é endêmica (DeFraites etal., 1994).

Os vírus são mantidos em um ciclo que envolve os humanos e oAedes aegypti, um mosquito doméstico, que pica durante o dia e que preferese alimentar nos seres humanos. A infecção no humano é iniciada através dainjeção do vírus durante a alimentação de sangue por um mosquito Aedesaegypti infectado. O vírus na saliva é depositado principalmente nos tecidosextravasculares. O principal tipo celular infectado após inoculação são ascélulas dendríticas, que posteriormente migram para drenagem dos gângliosIinUticos (Iinfonodos) (Wu et ai, 2000). Após a replicação inicial na pele e adrenagem para os gânglios linfáticos, o vírus aparece no sangue durante a faseaguda febril, geralmente por 3 a 5 dias.

Monócitos e macrófagos estão juntamente com as célulasdendríticas entre os alvos principais do vírus da dengue. A proteção contra areinfecção homotípica é completa e provavelmente para a vida toda, mas aproteção cruzada entre os tipos de dengue dura menos de 12 semanas (Sabin,1952). Conseqüentemente, um paciente pode experimentar uma segundainfecção com um sorotipo diferente. Uma segunda infecção por dengue éteoricamente um fator de risco para desenvolver uma doença severa. Noentanto, a FHD é multifatorial, incluindo: a cepa do vírus envolvido, bem comoa idade, o estado imune e predisposição genética do paciente. Dois fatores têmum papel importante na ocorrência da FHD: uma rápida replicação viral comalta viremia (a gravidade da doença está relacionada com o nível de viremia(Vaughn et ai, 2000) e uma importante resposta inflamatória com liberação dealtos níveis de mediadores inflamatórios (Rothman e Ennis1 1999).

Não existe um tratamento específico contra a dengue. Otratamento da DF se baseia no repouso na cama, controle da febre e dorescom o uso de analgésicos e antipiréticos, e adequada ingestão de fluidos. Otratamento da FHD necessita da correção da perda de fluidos, substituição dosfatores de coagulação, e infusão de heparina.

As medidas preventivas contam atualmente com o controle dovetor e medidas de proteção pessoal, que são medidas caras e difíceis de seaplicar. Nenhuma vacina contra a dengue está atualmente registrada. Desde os4 sorotipos de dengue que estão em circulação no mundo e uma vez que sãorelatados por estarem envolvidos nos casos de FHD1 a vacinação deveráidealmente conferir proteção contra todos os 4 sorotipos do vírus da dengue.

Vacinas vivas atenuadas (LAVs), que reproduzem a imunidadenatural, foram utilizadas para o desenvolvimento de vacinas contra muitasdoenças, incluindo alguns vírus pertencentes ao mesmo gênero da dengue(exemplos de vacinas de flavivírus vivos atenuados comercialmente disponíveisincluem vacinas da febre amarela e da encefalite japonesa). As vantagens devacinas de vírus vivos atenuados estão na sua capacidade de replicação eindução tanto de respostas humorais quanto de respostas imune-celulares.Além disso, a resposta imune induzida por um conjunto de Vírion da vacinacontra os diferentes componentes do vírus (proteínas estruturais e nãoestruturais) reproduz as respostas induzidas pelas infecções naturais.

O projeto vacina da dengue foi iniciado na Tailândia, no Centro deDesenvolvimento de Vacinas, Instituto de Ciências e Tecnologia para oDesenvolvimento Mahidol University. Vacinas candidatas com vírus vivosatenuados foram desenvolvidos com êxito, a uma escala laboratorial, para ovírus da dengue sorotipo-1 (cepa 16007, passagem 13 = LAV1), sorotipo-2(cepa 16681, passagem 53), e sorotipo-4 (cepa 1036, passagem 48) emcélulas primárias de rim de cachorro (PDK), e para o sorotipo-3 (cepa 16562),em células primárias de rim de macaco verde (PGMK) (passagem 30) e célulasfetais de pulmão de macaco Rhesus (FRhL) (passagem 3). Essas vacinasforam testadas como vacinas monovalente (sorotipo único), bivalente (doissorotipos), trivalente (três sorotipos) e tetravalente (todos os quatro sorotipos)em voluntários tailandeses. Essas vacinas demonstraram ser seguras eimunogênicas em crianças e adultos (Gubler, 1997). Estas cepas de LAV 1-4foram descritas na patente EP 1.159.968, em nome de Mahidol University eforam depositados perante a CNCM (CNCM I-2480; CNCM 1-2481; CNCM I-2482 e CNCM I-2483, respectivamente).

A seqüência completa da cepa do vírus da dengue-1 vivoatenuado (LAV1), que foi criada por R. Kinney et al. (CDC, Fort Collins).Diferenças na seqüência entre as cepas de origem DEN-1 cepa 16007 (SEQ IDN0 % e cepa LAV1 (SEQ ID N0 3) estão descritas na Tabela 1. Assim, acomparação genética do vírus tipo selvagem cepa 16007 e da cepa LAV-1demonstrou um conjunto de 14 mutações pontuais que podem estar ligados àatenuação da LAV1.

Tabela 1: Diferenças Na Seqüência DEN-1 16007 E DEN-1 16007/PPK13(LAV1)

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Alterações de nucleotídeos que modificam o códoncorrespondente são indicadas em negrito.

A cepa LAV1, que foi inicialmente estabelecida em 1983 foirapidamente identificada como candidata à vacina em potencial(Bhamarapravati e Yoksan1 1997).

Entretanto, nesse momento, a transmissão ao homem daencefalite espongiforme através de culturas de mamíferos não foi encaradocomo um risco e rotineiramente o vírus foi mantido em células primárias de rimde cachorro (PDK). Além disso, esta cepa LAV1 corresponde a uma populaçãoheterogênea. Esta heterogeneidade representa um risco adicional devido auma potencial seleção in vitro ou in vivo de uma das cepas presentes nacomposição.

Descrição Resumida da Invenção

Em face destas preocupações crescentes, o depositante decidiucriar um processo de sanitização, a fim de se livrar de tais riscos. Primeirotransferindo a vacina com LAV1 das células PDK para células VERO e, emseguida, transfectando células Vero com RNA genômico purificado de LAV1,seguida por duas etapas sucessivas de purificação da placa de vírus, odepositante elaborou um novo vírus sorotipo-1 derivado de Vero (VDV1).

Esta nova cepa VDV1, a qual tem sido, portanto, derivada pelatransferência para células VERO e clonagem biológica, difere da cepa LAV1pela seqüência, homogeneidade de tamanho na placa e sensibilidade atemperatura, mas, sobretudo conserva algumas características fenotípicas egenotípicas do LAV1, como por exemplo, pontos de atenuação, fenótipo depequenas placas, restrição de crescimento a alta temperatura, e foramconservadas as características imunogênicas das cepas LAV1. Estascaracterísticas tornam esta nova cepa uma valiosa vacina candidata àvacinação profilática em seres humanos.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições

"Vírus da dengue" são vírus de senso positivo, de RNA de fitasimples pertencente ao gênero Flavivirus da família flaviridae. No caso dadengue, sorotipo-1 (DEN-1) cepa 16007, a seqüência completa tem ocomprimento de 10735 nucleotídeos (SEQ ID N0 2). O genoma RNA contémum *Cap tipo-l no final 5'-, mas necessita de uma cauda poli(A) na extremidade3'-. A organização dos genes é 5'- região não codificadora (NCR), proteínasestruturais ((C), pré-membrana / membrana (prM/M), envelope (E)) e proteínasnão estruturais (NS1-NS2A - NS2B - NS3 - NS4A - NS4B - NS5) e 3 'NCR. Ogenoma RNA viral está associada à proteína C para formar o núcleocápside(de simetria icosaedral). Tal como acontece com outros flavivirus, o genomaDEN viral codifica uma fase de leitura aberta (ORF) ininterrupta, que étraduzido para uma única poliproteína.

Passagens seriais de cepas virulentas (causadoras de doença) dedengue-1 resultam no isolamento do vírus modificado que são "vivosatenuados", ou seja, infecciosos, ainda não capazes de causar doença. Estesvírus modificados são geralmente testados em macacos para avaliar a suaatenuação. No entanto, seres humanos são os únicos primatas queapresentam sinais clínicos da doença. Os vírus que causam de moderado (ouseja, aceitável em termos de fins regulatórios como apresentam uma relaçãorisco/benefício positiva), a baixo ou nenhum efeito secundário (ou seja,manifestações sistêmicas e/ou anormalidades biológicas e/ou reações locais)na maioria dos seres humanos testados, mas que continuam a infectar einduzir uma resposta imunológica, são chamados de "vivo atenuado".

O termo "LAV" denota cepas virais vivas atenuadas da dengue.No contexto da presente invenção "LAVs" são cepas de vírus vivos atenuadosinicialmente derivados do vírus da dengue sorotipo-1 (DEN-1) cepa 16007 porpassagens, por exemplo, 10, 11, 12 ou 13 passagens, em células primárias derim de cachorro (PDK). Por exemplo, "LAV1/PDK13" é a cepa atenuadaestabelecida após 13 passagens da cepa 16007 em células PDK (tambémchamado DEN-1 16007/PDK13). A seqüência de nucleotídeos LAV1/PDK13 émostrada na SEQ ID N0 3.

"VDV1" quer dizer uma LAV obtida pelo processo de sanitizaçãodivulgado no presente pedido. Uma VDV1 é, assim, um clone biológico(homogêneo) do vírus da dengue sorotipo-1 adaptado em células VERO capazde induzir uma resposta imune humoral incluindo neutralização de anticorposem primatas especialmente no ser humano. As cepas de VDV1 da presenteinvenção podem ser facilmente reconstruídas iniciando diretamente a partir dasseqüências de VDV1 aqui divulgadas. A indução de uma resposta imunehumoral pode ser facilmente determinada por um teste de ELISA. A presençade anticorpos neutralizantes no soro de uma vacina é avaliada pelos testes deneutralização por redução de placa, conforme descrito na seção 4.1.2.2. Umsoro é considerado como positivo para a presença de anticorpos neutralizantesquando o grau de anticorpo neutralizante assim determinado é, pelo menos,superior ou igual a 1:10.

O termo "mutação" significa quaisquer mudanças detectáveis dematerial genético, por exemplo, DNA, RNA1 cDNA, ou a qualquer processo,mecanismo, ou resultado de tal mudança. Mutações incluem substituições deum ou mais nucleotídeos. No contexto do atual pedido, mutações identificadasna seqüência genômica ou poliprotéica do vírus da dengue-1 são designadosao abrigo da nomenclatura de Dunnen e Antonarakis (2000). Conforme definidopor Dunnen e Antonarakis no nível de ácidos nucléicos, substituições sãodesignadas por ">", por exemplo, "31 A>G" denota que uma A é alterada parauma G no nucleotídeo 31 da seqüência de referência.

As variações no nível da proteína descrevem a conseqüência damutação e são apresentados como se segue. Códons de parada sãodesignados por X (ex: R97X denota uma mudança de Arg96 a um códon determinação). Substituições de aminoácido são designados por "S9G", o quesignifica que uma Ser na posição 9 é substituída pela Gly.Vírus da Dengue Sorotipo-1 Derivadas de VERO (VDV1)

A composição da vacina candidata LAV1 da dengue-1anteriormente desenvolvida foi aperfeiçoada por um processo de sanitização.

O vírus da dengue sorotipo-1 derivadas de vero (VDV1) divulgadano presente pedido utiliza o vírus atenuado DEN-1 16007 por passagens emsérie por células PDK. O VDV1 contém toda a seqüência genômica dos vírusvivos atenuados DEN-1, e produzem os mesmos sítios que foram ligados aatenuação como a cepa original LAV1, que foram testadas em seres humanos.

A sanitização da vacina candidata LAV1 foi feita através daremoção de proteínas e introduzindo apenas o material viral genômicopurificado nas células Vero. Mais especificamente, a sanitização da cepa foirealizada em 2 etapas:

1) Amplificação do DEN16007/PDK11 (LAV1/PDK11) em célulasVero, a 32 °C.

2) Purificação e transfecção de RNA viral nas células Vero.

A etapa 1, foi realizada por uma passagem de LAV1/PDK11 emcélulas Vero. Para esse propósito, células Vero foram infectadas comLAV1/PDK11 a uma multiplicidade da infecção de 0,01 e incubadas a 32 0Cdurante 5 dias.

Para a etapa 2, vantagem foi levada em conta pelo fato de que ogenoma viral é um RNA infeccioso, o que significa que ele é capaz, quandointroduzida em uma célula, de reconstituir um vírus infeccioso completo. Asegunda etapa de purificação e transfecção compreendiam assim as etapasque consistem em:

a) extração e purificação de RNA viral de vírus purificados daplaca;

b) associação vantajosa do RNA purificado com lipídioscatiônicos;c) transfecção de célula Vero, em particular células Vero LS10;

d) recuperação dos vírus neo-sintetizados; e

e) purificação de uma cepa VDV por purificação de placas e,opcionalmente, amplificação em células hospedeiras, especialmente célulasVero.

A tecnologia das células Vero é uma tecnologia bem conhecida,que tem sido utilizada para diferentes produtos comerciais (vacinas injetáveis eorais contra a poliomielite e contra raiva). Na presente invenção células Veroqualificadas foram vantajosamente utilizadas para garantir a ausência dequaisquer riscos potenciais ligados à presença de agentes adventícios. Por"células VERO qualificadas" se entende células ou linhagens celulares para oqual as condições da cultura são conhecidas, e é tal, que as referidas célulassão isentas de quaisquer agentes adventícios. Estes incluem, por exemplo:células VERO LS10 da Sanofi Pasteur.

As cepas VDV assim isoladas são classicamente armazenadasquer sob a forma de uma composição congelada ou sob a forma de um produtoliofilizado. Para esse efeito, a VDV pode ser misturada com um diluenteclássico, uma solução aquosa tamponada composta que compreendecompostos crioprotetores tal como, açúcar, álcool e estabilizadores. O pH antesdo congelamento ou liofilização é vantajosamente estabelecido entre 6 a 9, porexemplo, em torno de 7, como um pH de 7,5 +/- 0,2 conforme determinado porum ρHmetro em RT. Antes da utilização, o produto liofilizado é misturado a umsolvente farmacêutico ou excipiente como um NaCI a 4% estéril parareconstituir um composto líquido imunogênico ou vacina.

No seqüenciamento, a atenuação Loci específicas, dos vírusrecuperados após a transfecção, não revelou qualquer mutação, emcomparação com a cepa LAV1/PDK13. Os vírus VDV1 biologicamenteclonados exibem um fenótipo de placa homogênea e uma notável estabilidadegenética no que diz respeito à sua cepa de origem LAV1 como esta pode serdeduzida principalmente a partir da conservação da atenuação genotípica.

A cepa VDV1 foi seqüenciada e, em comparação com a cepa dovírus da dengue sorotipo-1 vivo atenuado (LAV1/PDK13) seqüência (SEQ IDN0 3). Uma diferença no conjunto de 3 nucleotídeos foi encontrada no que dizrespeito à referência da seqüência LAV1. Um deles é um aminoácidosilenciado (posição 2719). Os outros dois (posições 5962 e 7947) situam-se empeptídeos não-estruturais codificando as seqüências (NS3-481 e NS5-125,respectivamente). Nenhuma destas diferenças corresponde a qualquer umadas posições de atenuação da LAV1.

A presente invenção fornece assim cepas do vírus da dengue-1vivos atenuados que foram obtidos a partir de vírus DEN-1 16007 tiposelvagem atenuados por passagens seriais em células PDK e, em seguida,pela passagem e sanitização em células VERO. Em particular, as cepasatenuadas da presente invenção compreendem, pelo menos, as mutaçõesidentificadas de seqüência (não-silenciosa e opcionalmente silenciosa) emrelação à seqüência nucleotídica ou seqüência poliprotéica das cepas DEN-116007 tipo selvagem e LAV1/PDK13.

Conseqüentemente, a presente invenção está relacionada a umacepa isolada de vírus da dengue-1 vivo atenuado, que compreende, ou éconstituído por uma seqüência da cepa LAV1/PDK13 (SEQ ID N0 3) onde pelomenos nucleotídeos nas posições 5962 e 7947, e, opcionalmente, 2719, estãomutados, com a condição de que os seguintes nucleotídeos não estãomutados: 1323, 1541, 1543, 1545, 1567, 1608, 2363, 2695, 2782, 5063, 6048,6806, 7330, e 9445. De preferência, as mutações são substituições. Depreferência, o nucleotídeo na posição 5962 é A, o nucleotídeo na posição 7947é G. Ainda preferencialmente, a cepa isolada, de acordo com a presenteinvenção contém seqüência SEQ ID N0 3 que compreende as mutações 2719G>A, 5962 OA1 e 7947 A>G.

Portanto, um vírus da dengue-1 vivo atenuado, de acordo com apresente invenção compreende a seqüência da cepa da dengue-1 16007 tiposelvagem (SEQ ID N0 2) onde a dita seqüência contém, pelo menos, asmutações 1323 T>C, 1541 G> A , 1543 A> G, 1545 G> A, 1567 A> G1 1608 C>T1 2363 A> G, 2695 T> C1 2782 C> T, 5063 G> A, 5962 C> A, 6048 A> T , 6806A> G1 7330 A> G, 7947 A> G, e 9445 C> T. De preferência, uma cepa vivaatenuada, de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente amutação 2719 G> A por referência à seqüência de nucleotídeos da cepa 16007tipo selvagem (SEQ ID N0 2).

As cepas do vírus da dengue-1 vivos atenuados, de acordo com apresente invenção abrange cepas variantes que compreende uma seqüênciaSEQ ID N0 3 mutada nas posições 5962 e 7947, conforme acima definido, eque ainda incluem a substituição de um ou mais nucleotídeos em determinadaposição dos códons que resulta em qualquer alteração no aminoácidocodificado nesta posição.

Vantajosamente, as cepas do vírus da dengue-1 vivos atenuados,de acordo com a presente invenção compreendem uma seqüência que sediferencia por um número limitado de mutações, por exemplo: Não mais que 5,ainda preferencialmente não superior a 2, a partir SEQ ID N01.

De preferência, a seqüência genômica do vírus da dengue-1, deacordo com a presente invenção consiste da seqüência de nucleotídeo SEQ IDN0 1.

A presente invenção refere-se também as cepas de vírus dadengue-1 vivo atenuado que podem ser obtidas a partir da cepa VDV1 daseqüência SEQ ID N0 1 por outras passagens em células, em particular emcélulas Vero.

A presente invenção também diz respeito a um ácido nucléicoisolado.que compreende, ou é constituído pela seqüência de DNA SEQ ID N01ou sua seqüência de RNA equivalente.

Uma "molécula de ácido nucléico" refere-se ao fosfato ésterpolimérico formado por ribonucleosídeos (adenosina, guanosina, uridina oucitidina; "moléculas RNA") ou deoxirribonucleosídeos (deoxiadenosina,deoxiguanosina, deoxitimidina, ou deoxicitidina; "moléculas DNA"), ou qualquerfosfoéster análogo, tais como fosforotioatos e tioésteres, em ambos a forma defita simples, ou uma fita dupla-hélice.

Como utilizado na presente invenção, por seqüência RNA"equivalente" a SEQ ID N01 se entende uma seqüência SEQ ID N0 1 onde asdeoxitimidinas foram substituídas por uridinas. Como a SEQ ID N0 1 constitui aseqüência cDNA VDV1, a seqüência RNA equivalente corresponde assim à fitaRNA positiva do VDV1.

A presente invenção refere-se adicionalmente a poliproteínas daseqüência SEQ ID N0 41 e aos fragmentos desta. A SEQ ID N0 41 é aseqüência da poliproteína codificada pela SEQ ID N01.

Um "fragmento" de uma proteína de referência significa umaseqüência polipeptídica que compreende uma cadeia de aminoácidosconsecutivos na proteína de referência. Um fragmento pode ter o comprimentode, pelo menos, 8, pelo menos 12, pelo menos 20, aminoácidos.

Os ditos fragmentos de poliproteínas da seqüência SEQ ID N0 41compreendem, pelo menos, uma Iisina na posição 481 da proteína NS3(posição 1956 da SEQ ID N0 41), e/ou de uma arginina na posição 125 daproteína NS5 (posição 2618 da SEQ ID N041).

Segundo um exemplo de realização o fragmento da poliproteínacodificada pela SEQ ID N0 1 é ou compreende a proteína NS3 e/ou proteínaNS5.

Composições Imunogênicas ε VacinasA presente invenção também diz respeito a uma composiçãoimunogênica, adequada para ser utilizada como uma vacina, que compreendeuma cepa VDV1, de acordo com a presente invenção.

As composições imunogênicas, de acordo com a presenteinvenção produzem uma resposta imune humoral em direção ao vírus dadengue compreendendo a neutralização de anticorpos.

Preferivelmente, a composição imunogênica é uma vacina.

De acordo com um exemplo de realização, a composiçãoimunogênica é uma composição monovalente, ou seja, produz uma respostaimunológica e/ou confere proteção apenas contra o vírus da dengue-1.

De acordo com outro exemplo de realização, a presente invençãorelaciona-se com uma composição imunogênica multivalente para dengue. Talcomposição imunogênica ou vacina multivalente podem ser obtidas pelacombinação de vacinas para dengue monovalentes individuais. A vacina oucomposição imunogênica pode ainda incluir, pelo menos, um vírus da denguevivo atenuado de outro sorotipo. Em particular, a vacina imunogênica oucomposição pode incluir um VDV1 de acordo com a presente invenção emcombinação com, pelo menos, um vírus da dengue vivo atenuado selecionadodo grupo constituído pelo sorotipo-2, sorotipo-3, e sorotipo-4.

Preferivelmente, a composição imunogênica ou vacina pode seruma composição de vacina tetravalente da dengue, ou seja, a composição deuma vacina que inclui um VDV1 de acordo com a presente invenção emcombinação com uma cepa de vírus da dengue-2 vivo atenuado, uma cepa devírus da dengue-3 vivo atenuado e uma cepa de vírus da dengue-4 vivoatenuado.

Cepas de vírus vivos atenuados da dengue-2, dengue-3, dengue-4 foram descritas anteriormente. Pode ser feita referência às vacinas vivasatenuadas, que foram desenvolvidos na Mahidol University pela passagem dosvírus da dengue sorotipo-2 (cepa 16681, passagem 53; LAV2), e sorotipo-4(cepa 1036, passagem 48, LAV4) em células primárias de rim de cachorro(PDK), e para o sorotipo-3 (cepa 16562), em células primárias de rim demacaco verde (PGMK) (passagem 30) e células de pulmão fetal de Rhesus(FRhL) (passagem 3) (LAV3). As seqüências nucleotídicas da LAV2 (SEQ IDN0 42), LAV3 (SEQ ID N0 43), e LAV4 (SEQ ID N0 44) estão demonstradas nalista de seqüência anexa.

Vantajosamente, uma cepa de vírus da dengue-2 vivo atenuadopode corresponder a uma cepa VDV2, que foi obtida a partir da cepa LAV2desenvolvida pela Mahidol por um processo de sanitização em células Vero.Em especial, uma cepa de vírus da dengue-2 viva atenuada (VDV2) podecompreender, e vantajosamente consistir da seqüência SEQ ID N0 40.

Composições imunogênicas incluindo vacinas podem serpreparadas como injetáveis que podem corresponder a soluções líquidas,emulsões ou suspensões. Os ingredientes imunogênicos ativos podem sermisturados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis que são compatíveiscom estes.

As composições imunogênicas ou vacinas, de acordo com apresente invenção podem ser preparadas utilizando qualquer métodoconvencional conhecido pelo técnico no assunto. Convencionalmente osantígenos, de acordo com a presente invenção são misturados com umsolvente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, como a água ou soluçãosalina tamponada com fosfato, agentes umidificantes, material de enchimento,emulsificantes estabilizadores. O excipiente ou diluente serão selecionados emfunção da forma farmacêutica escolhida, do método e da via de administraçãoe também da prática farmacêutica. Excipientes ou diluentes adequados etambém as exigências em termos de formulações farmacêuticas, estãodescritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, que representa um livro dereferênçia neste domínio.

Preferencialmente, a composição imunogênica ou vacinacorresponde a uma composição injetável que inclui uma solução aquosatamponada para manter, por exemplo, o pH (conforme determinado pelo RTcom um pHmetro) entre 6 a 9.

A composição, de acordo com a presente invenção podeadicionalmente conter um adjuvante, ou seja, uma substância que melhora, ouaumenta, a resposta imune produzida pela cepa VDV1. Qualquer adjuvante oumistura de adjuvantes farmaceuticamente aceitável convencionalmenteutilizado no campo das vacinas humanas podem ser utilizadas para estafinalidade.

As composições imunogênicas ou vacinas, de acordo com apresente invenção podem ser administradas por qualquer via convencionalnormalmente utilizada no campo das vacinas humanas, tais como a viaparenteral (por exemplo, via intradérmica, subcutânea, intramuscular) nocontexto da presente invenção as composições imunogênicas ou vacinas sãocomposições de preferência injetáveis administradas por via subcutânea naregião deltóide.

Método de Imunização

A presente invenção fornece ainda um método de imunizar umhospedeiro em tal necessidade contra a infecção pelo vírus dengue quecompreende a administração ao hospedeiro de uma quantidade imunoefetivade uma composição imunogênica ou vacina, de acordo com a presenteinvenção.

Um "hospedeiro com tal necessidade" denota uma pessoa emsituação de risco de infecção por dengue, ou seja, pessoas que viajam pararegiões onde a infecção pelo vírus da dengue está presente, e também doshabitantes destas regiões.A via de administração é qualquer via convencional utilizada nocampo da vacinação. A escolha da via administração depende da formulaçãoque' é selecionada. De preferência, a composição imunogênica ou vacinacorresponde a uma composição injetável administrada por via subcutânea,vantajosamente na região deltóide.

A quantidade de LAV ou VDV em particular VDV1 nascomposições imunogênicas ou vacinas podem ser convenientementeexpressas em unidade virais formadoras de placas (PFU) ou unidade de dosesinfectantes de cultura celular 50% (CCID50) e preparadas utilizando técnicasfarmacêuticas convencionais. Por exemplo, a composição, de acordo com apresente invenção pode ser preparada na forma de dosagem contendo 10 a106 CCID50, ou de 103 a 105 CCID50 de LAV ou VDV, por exemplo 4 ± 0,5 Iogi0CCID50 de cepa VDV1 de uma composição monovalente. Quando acomposição é multivalente, para reduzir a possibilidade de interferência viral e,assim, de conseguir um equilíbrio na resposta imune (ou seja, uma respostaimunológica contra todos os sorotipos contidos na composição), asquantidades de cada uma dos diferentes sorotipos de dengue presente nasvacinas administradas podem não ser iguais.

Uma "quantidade imunoefetiva" é uma quantidade que é capaz deinduzir uma resposta imune humoral compreendendo anticorpos neutralizantesno soro de uma vacina, como avaliado pelo teste de neutralização com reduçãoem placa, conforme descrito na seção 4.1.2.2; um soro é considerado comopositivos para a presença de anticorpos neutralizante quando o título doanticorpo neutralizante assim determinado é pelo menos, superior ou igual a1:10.

O volume de administração pode variar, dependendo da via deadministração. Injeções subcutâneas podem variar em termos de volume decerca de 0,1 ml a 1,0 ml, de preferência 0,5 ml.O tempo ótimo para a administração da composição é cerca deum a três meses antes da primeira exposição ao vírus da dengue. As vacinasda presente invenção podem ser administradas como agentes profiláticos emadultos ou crianças com risco de infecção por dengue. A populaçãodirecionada abrange pessoas que são nativas bem como as não-nativas comrelação ao vírus da dengue. As vacinas da presente invenção podem seradministradas em dose única ou, opcionalmente, a administração podeenvolver o uso de uma dose primária seguida de uma dose de reforço que éadministrada, por exemplo, de 2-6 meses mais tarde, conforme determinadocomo apropriado pelo técnico no assunto.

A presente invenção poderá ser adicionalmente descrita tendo emvista as seguintes figuras e exemplos.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 é um resumo da história da semente pré-mãe ("pre-master seed") do VDV1.

A Figura 2 é um fluxograma que resume o processo de produçãodesenvolvido que dá origem ao Produto Completo (monovalente), dose "prontapara o uso".

A Figura 3 é uma representação diagramática do mapa genômicodo VDV1. A seta acima representa a codificação da seqüência poliprotéica. Assetas abaixo representam a seqüência codificadora de peptídeos maduros. Asbarras verticais simbolizam as variações nucleotídicas entre as cepas dadengue-1 tipo selvagem 16007 e a cepa LAV1. Os asteriscos designam asvariações nucleotídicas entre LAV1 e VDV1.

A Figura 4 mostra a análise do tamanho da placa após 7 dias deincubação a 37 0C para o vírus da dengue-1 LAV1, VDV1, e cepa 16007.

A Figura 5 é uma análise gráfica que mostra o tamanho dadistribuição na placa para o vírus da dengue-1 LAV1, VDV1, e cepa 16007.A Figura 6 é um resumo do desenho experimental para aavaliação da segurança do VDV1 monovalente, em adultos saudáveis semprecedentes de tratamento para flavivirus (flavivirus-naive).

Exemplos

Exemplo 1: Sanitização

1.1 Purificação de RNA Viral

Foi inicialmente planejado realizar a sanitização da LAV1 pelapurificação e transfecção do RNA viral diretamente extraída de uma dassementes das cepas da vacina, DEN-16007/PDK10 ou DEN-16007/PDK11(produzidos pela Sanofi Pasteur. Título: 4,60 logTCID50/ml) . Foram realizadosdessa maneira oito ensaios sem sucesso, com quantidades de RNA variandode 103 a 107 cópias. Em seguida, decidiu-se realizar uma passagem deadaptação em células Vero, antes da extração e transfecção do RNA.

Células Vero (VERO LS10 p142 to145) foram infectadas com umaamostra da semente mãe ("master seecf') DEN-1/PDK11, em umamultiplicidade da infecção de 0,01, e incubada a 32 0C durante 5 dias. O meiode cultura foi então substituído por meio de infecção (contendo 10mM MgSO4).Efeitos citopáticos claros foram visíveis no dia seguinte, e a presença de RNAviral no sobrenadante da cultura foi confirmada por RT-PCR. O meio de culturafoi recolhido ao dia 8 pós-infecção, diluído em um volume equivalente de umasolução aquosa tamponada contendo agentes crioprotetores (pH= 7,5) emantidos congelados a -70 0C até serem utilizados. Este vírus amplificado emVero foi denominado DEN-1/V100. Seu título infeccioso foi determinado emcélulas Vero e foi de 6,9 logTCID50/ml.

O processo de purificação e transfecção de RNA foi realizado daseguinte forma. Uma suspensão de DEN-1 V100 foi diluída, a fim de conter,pelo menos, 3 χ 104 e até 3 χ 107 TCID50 ou PFU de vírus por mililitro. Umaunidade de benzonase diluída em 0,01 ml de meio de William foi adicionada em0,5 ml cie vírus, a fim de digerir moléculas de DNA ou RNA de origem celular, ea solução foi incubada durante 2 horas a 4 0C em um agitador. No final daetapa de incubação, 0,65 ml de tampão desnaturante contendo cloreto deguanidina, detergente (SDS), e β mercaptoetanol (tampão RTL- βmercaptoetanol, fornecidos no kit RNeasy Mini Kit, Qiagen Ref. 74104), foramadicionados e proteínas foram extraída uma vez com fenol/clorofórmio (1/1)vol/vol e uma vez com clorofórmio vol/vol, seguido por centrifugação por 5minutos a 14000 rpm, à temperatura ambiente. Após cada extração, a faseaquosa foi coletada, tendo o cuidado de não coletar materiais (precipitadobranco), na interface, e transferidos para um tubo de Eppendorf de 1 ml limpo.A solução de RNA foi então aplicada em uma coluna QIAgen seguindo asrecomendações do fabricante (RNeasy minikit, QIAgen), a fim de eliminarvestígios de solvente, e eluído em 0,06 ml de água livre de nuclease. Apresença de RNA viral foi confirmada por RT-PCR quantitativo, utilizando umacurva padrão estabelecido com quantidades conhecidas do vírus em TCID50/ml.

1.2 Transfecção de Células Vero Com RNA Purificado

A transfecção foi realizada utilizando Iipofectamina (ReagenteLF2000, Life Technologies), uma mistura de lipídios catiônicos que associamosao RNA através de interações de carga e permitindo a transferência decomplexos no citoplasma das células pela fusão com a membrana celular. Aquantidade ótima de reagente LF2000 foi determinada em uma experiênciapreliminar pela incubação de células Vero, plaqueadas 16 a 24 horas antes (0,3- 0,5 χ 106 células por poço em um placa de 6 poços), com doses crescentes (5a 20 μί) de lipofectamina. As células foram então incubadas por 4 a 5 horas a32°C, 5% CO2, antes de substituir o meio por meio de cultura fresco, semFCS1 e a incubação continuou overnight a 32 °C. A toxicidade (célulasredondas, refringência ou células flutuantes, homogeneidade das células emmonocamada) foi verificada regularmente durante 48 horas, sob ummicroscópio invertido. A dose mais elevada de Iipofectamina que não foi tóxicanestas condições foi de 10 μΙ_ e foi escolhida para a transfecção de RNA.

Quatro transfecções foram realizadas em paralelo, utilizando 1/10da preparação do RNA purificado (o que corresponde à cerca de 4 χ 105TCID50). Foram diluídos doze microlitros da solução de RNA em 500 μΙ_ demeio OptiMEM (GIBCO) contendo 10 pL de reagente LF2000 (uma mistura delipídios catiônicos que associado ao RNA através interações de cargas epermitem a transferência de complexos no citoplasma das células por fusãocom a membrana celular). 200 ng de levedura tRNA foram adicionados comotransportadora em 2 das 4 reações.

Foi permitido que as 4 misturas de transfecções se precipitassemdurante 10 minutos à temperatura ambiente antes da adição à 6 poços emplacas confluentes de células Vero. Após 4 horas de incubação a 32 0C1 amistura de transfecções foi removida e as células foram lavadas uma vez emPBS. Três mililitros de meio pós-transfecção (Williams, GIBCO) foramadicionados, e a incubação foi mantida durante 5 dias a 32 °C. O meio decultura foi então substituído por 3 ml de meio de infecção da dengue (Williamscomplementada com 10 mM MgSO4).

Os efeitos citotóxicos moderados foram observados 24 horasapós a transfecção e desapareceram no dia 3. Efeitos citopáticos típicos(células redondas, células refringentes) foram detectados cerca de 6 a 8 diasapós a transfecção em todos os ensaios de transfecção. A liberação do vírusno sobrenadante dessas células foi confirmada por qRT - PCR. Os fluídos dasculturas (3 ml) foram coletadas no dia 6 e no dia 8 após a transfecção, eagregadas. Os vírus foram diluídos em 6 ml de uma solução aquosatamponada contendo agentes crioprotetores (pH = 7,5) e congelada até novaamplificação.

As quatro soluções virais obtidas após a transfecção foramnomeadas de TV (para transfecções em células Vero) 100, TV200, TV300,TV400, e exibiram títulos de infecção semelhantes (vide abaixo):

TV100: 6.95 Iog TCID50

7V200: 6.80 Iog TCID50

TV300: 6.80 Iog TCID50

TV400: 6.85 Iog TCID50

De nota, a eficiência da transfecção não estava aumentadasignificativamente nas amostras transfectadas na presença do tRNA (TV300 eTV400).

1.3 Caracterização dos Vírus Recuperados Após a Transfecção

O tamanho das placas de DEN1-V100 e TV100 a 400 foramdeterminados. Resumidamente, células Vero foram plaqueadas na cultura auma densidade de 1.000.000 células/cm2, contendo 4% de FBS. Após aincubação overnight, o meio foi removido e as células foram infectadas comdiluições seriais duplicadas e quintuplicadas do vírus. Após 1,5 horas a 37 °C,5% CO2, o inóculo foi removido e as células foram incubadas a 37 0C 5% CO2em meio mínimo de Eagle (MEM), contendo 1,26% de metilcelulose e 10% deFBS. Após 11 dias de incubação, as placas foram fixadas por 20 minutos emacetona a -20 0C e revelada por imuno-coloração com um mAb específico paraflavivirus, diluído em 2,5 pg/ml. Placas virais foram mensuradas utilizando umsoftware de análise de imagem (Saisam / Microvision).

Como controle, vírus DEN-1 16007 e LAV1 foram plaqueados emparalelo. Os dados são demonstrados na Tabela 1.

Tabela 1: Tamanho Das Placas Do DEN-1 16007, LAV1. V100 (Antes daTransfecção! E TVXOO (Após a Transfecção).<table>table see original document page 24</column></row><table>

O vírus V100, amplificado em células Vero, exibe um fenótipo emplaca pequena homogênea (SP). Placas são um pouco maiores do queobservado nas diferentes amostras de LAV1 (2-3 mm de diâmetro, em vez de<2 milímetros). Este fenótipo SP é mantido nos vírus recuperados após atransfecções. Uma placa grande (LP)1 entre 90 vírus plaqueados, foi detectadana amostra TV200. No entanto, esta proporção deslocou de 10 LP para 82 SPplaqueadas após apenas uma passagem de amplificação em células VEROsugerindo que a população LP era dominante.

De nota, o seqüenciamento de posições de atenuaçãoimportantes realizado em paralelo não revelou qualquer mutação no vírustransfectado, em comparação com o LAV1.

1.4 Purificações de Placas

A amostra do vírus DEN-1/TV100, apresentando um fenótipo SPhomogêneo foi escolhido para a purificação da placa. Resumidamente, célulasVero foram plaqueadas em placas de 6 poços e infectadas com o vírus emdiluições seriadas, a fim de obter entre 1 e 20 placas por placas (de cultura).Após 1,5 horas a 37 °C 5% CO2, o inoculo foi removido e as células foramincubadas em 3 ml de meio sólido composto de MEM - 10% FCS pré-aquecidoa 42 °C e misturado extemporaneamente com 2% de agarose derretidaequilibrada a 42 °C. Foi permitido que o meio solidifica-se à temperaturaambiente durante 30 minutos; sob a capela de fluxo, e as placas foramincubadas em posição invertida por 10 dias a 32 °C - 5% CO2. A segundacamada do mesmo meio suplementado com 0,01% de vermelho neutro foi emseguida, adicionada e placas foram incubadas por mais uma noite a 32 °C.Quatro poços isolado de placas pequenas foram colhidos sob condiçõesestéreis usando uma micropipeta equipada com uma ponteira de 0,1 ml, etransferidas para tubos estéreis contendo 0,2 ml de MEM - 4% FCS. Asuspensão foi homogeneizada em um vortex, diluída serialmente no mesmomeio, e utilizada imediatamente para infectar 6 poços em placas de célulasVero. O protocolo foi repetido e uma segunda coleta de seis SP foi realizada.Cada placa foi coletada e diluída em 1 ml de meio, antes da amplificação emcélulas Vero, em frascos T25 cm2. O meio de cultura foi colhido no dia 6 após ainfecção, diluído com o mesmo volume de uma solução aquosa tamponadacontendo agente crioprotetor (pH 7,5) e congelados a -70 °C. Todas estasetapas foram realizadas a 32 °C.

Vírus de placas purificadas foram denominados de DEN-1/TV111,DEN-1/TV112, DEN-1/TV121, DEN-1/TV131, DNE-im/132 e DEN-1/TV141,respectivamente. O títulos de infecção foram determinados em células Vero(vide abaixo):

TV111 = 6,85 LogCCIDso/ml TV112 = 6,80 LogCCID50/ml

TV121 = 6,80 LogCCIDso/ml TV131 = 6,70 LogCCID50/mlTV132 = 6,45 LogCCID50/ml TV141 = 5,70 LogCCID50/mlUma segunda amplificação em células Vero foi realizada por trêsClorfagens: TV111, TV112, TV121.

1.5 Caracterização do Vírus Clonado

Placas de tamanho DEN-im/111, DEN-1/TV112, DEN-1/TV121,DEN-1/TV131, DEN-1 TV132 e DEN-im/141 candidatas foram determinados.Os seqüenciamentos do Ioci específico da atenuação também foram realizadose não revelaram qualquer mutação (Tabela 2).

Tabela 2: Seqüenciamento De Locais Específicos De Atenuação Dos VírusDEN-1

<table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table>

A posição dos nucleotídeos está indicada abaixo de cada gene e referida dacepa DEN-1 16007 SEQ ID N0 2.

Na ausência de qualquer outro critério capaz de diferenciar entreestes clones, o TV121 foi arbitrariamente escolhido como "pré-mãe" paraVDV1.

Em conclusão, um número total de 6 passagens em célulasVERO foram realizadas para adaptar e clonar as primeiras cepas DEN-116007/PDK11 atenuadas. O RNA viral foi purificado e transfectado em célulasVERO qualificadas, em condições montagem, com uma aplicação industrial(controle ambiental, rastreabilidade das matérias primas e experimentos,certificado de análise para produtos derivados de animais). A cepa VEROadaptada foi clonada por purificação em placa para gerar semente pré-mãe davacina VDV1 candidata, na passagem número 6 em células VERO.

Contrariamente ao LAV1, o VDV1 apresenta um fenótipo dotamanho de placa pequena homogênea. Além disso, não foi identificadanenhuma mutação nas posições específicas de atenuação. Outrascaracterizações foram realizadas, em seguida, pela determinação em largaescala da seqüência completa e de testes fenotípicos de VDV1.

Exemplo 2

Seqüenciamento

A seqüência completa do vírus foi gerada, de acordo com aseguinte estratégia. Partindo de uma amostra contendo VDV1, o RNAgenômico foi extraído e purificado, e foi realizada transcrição reversa emcDNA. Então todas as amplificações de PCR sobrepostas foram realizadasa partir do cDNA, com a adição de marcadores de seqüenciamento emambas as extremidades de cada produto de PCR. Todas as seqüênciasindividuais foram geradas e analisadas em aparelhos automatizados. Aetapa seguinte consistiu da reconstrução do genoma por váriosalinhamentos de todas as seqüências individuais. Neste ponto, cadamodificação inesperada no nucleotídeo, em relação à seqüência dereferência, foi cuidadosamente re-analisada voltando aos dados brutos. Talmodificação foi sistematicamente confirmada por outra seqüenciamentorealizado a partir de um novo produto de PCR. Depois que todas asambigüidades foram resolvidos, o seqüenciamento do genoma viral foiconcluído, assim como a nova molécula foi criada em um vetor de bancode dados NTi. Este pode ser utilizado para uma análise entre genomas, pormúltiplos alinhamento de seqüências.

2.1 Materiais

2.1.1 Vírus

Os vírus aos quais estão aqui mencionados são DEN-1 16007;LAV-1/PDK13; VDV1, as seqüências das quais são dadas na lista deseqüência anexa. O texto completo da seqüência genômica destes vírus é de10735 nucleotídeos de comprimento.

2.1.2 Primers

Todos os primers foram projetados no uSeqweb bioinformaticspackage" (AcceIrys), módulo de desenho de primers (Tabela 3).

Tabela 3: Lista do RT-PCT ε Primers de Seqüenciamento

<table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table><table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table>

2.2 métodos

2.2.1 Purificação do RNA Viral

A partir de experiências anteriores, um mínimo de 1000 DICC5O énecessário para obter uma reação de RT-PCR positiva nas próximas etapas.

Isto significa que um título mínimo de 104 DICC5o/mL de vírus é necessário. ORNA genômico viral foi purificado utilizando o kit QIAamp viral RNA mini(Qiagen), de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente,um volume de 140 pL de uma amostra viral bruta foi incubada na presença deuma solução de lise, e carregados em um kit de coluna. Após a etapa de lavagem,o RNA viral foi purificado e eluídos em 60 pL de água estéril livre de nucleasecontendo 1 pL de inibidor de RNAse (40 unidades) (RNAse Out1 Sigma).

2.2.2 Transcrição Reversa

O RNA viral foi reversamente transcrito em cDNA por umatranscriptase reversa (reverse iT) da ABGene. Novamente, foram aplicadascondições padrão de uso, utilizando 10 pL de RNA purificado, em uma volumefinal de reação de 20 pL. A reação foi iniciada por hibridização sem os primers.Uma reação de RT foi realizada por PCR (Tabela 1). A síntese de cDNA foiobtida pela incubação de 45 minutos a 47 °C.

2.2.3 PCR

Todas as reações de PCR foram realizadas com o sistemaExpand High Fidelity PCR (Roche Diagnostics), utilizando todos os 16 pares deprimers (+) e (-) da Tabela 1. As condições de PCR foram as seguintes:

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Todos os produtos do PCR foram controlados pela eletroforese em gel deagarose.

2.2.4 Seqüenciamento

A maior parte das reações de seqüenciamento foi terceirizadapela Genome Express. As extremidades genômicas, ambigüidades, algunscruzamentos inter-PCR, e regiões não seqüenciadas pela Genome Express,por razões técnicas, foram realizados "in-house".

Seqüenciamento da Genome Express: Os produtos de PCR foramenviados a +4 °C, e os resultados do seqüenciamento foram recebidos comoarquivos de seqüências informatizadas. O arquivo texto, cromatogramas dequalidade e arquivos estão disponíveis para cada seqüência. Após oalinhamento da seqüência, todas as discrepâncias foram verificadas nocromatograma, e corrigidas se fossem identificados erros no método de cálculoda seqüência.

Seqüenciamento realizado internamente "in-house": As reaçõesde seqüenciamento foram realizadas no termociclador PTC-200 (MJResearch), com o kit Sequitherm Excel Il LC (Epicentre). Cada produto de PCRfoi seqüenciado em ambas as fitas independente em uma única reação. Asreações foram carregadas em um seqüenciamento em gel de eletroforese. Aexecução e a análise da seqüência foram realizadas no seqüenciadorautomatizado Gene ReadIR 4200 (Li-Cor).

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Adição de 3 μL de tampão desnaturante/carregamento.Desnaturação das amostras 3 minutos a 95 0C e resfriamento emgelo pouco antes do carregamento das amostras.

<table>table see original document page 34</column></row><table>2.3 Resultados

Todos PCR fragmentos foram seqüenciados de ambas asextremidades usando PCR comum acrescentado a cauda, ou seja, um motivoespecífico, que foi acrescentada no 5' terminal de todos os primers:

5' primers: M13SEQ-GTTTTCCCAGTCACGAC (SEQ ID N0 38)

3' primers: M13REV-AACAGCTATGACCATG (SEQ ID N0 39)

Seqüências M13-SEQ e REV correspondem aos primers demotivo M13 universal (New England Biolabs references).

Para o contíguo de montagem, uma rápida análise foi realizada noVector NTi, no módulo ContigExpress (Informax). A seqüência referência dacepa LAV1 foi comparada com todos os resultados de seqüenciamentoindividuais. Em tais condições, todos os resultados poderiam ser alinhados aolugar correto no genoma completo, mesmo quando algumas regiões aindaestavam sem o contíguo de montagem, dando uma rápida visualização de todoo alinhamento genômico.

2.3.1 Montagem da Seqüência Completa de VDV1

A seqüência de alinhamento final foi realizada no módulo VectorNTi, AIignX (Informax). O algoritmo clássico de alinhamento de seqüênciasmúltiplas CIustaIW (Thompson et ai, 1994) foi usado pelo software paraconstruir o alinhamento global. Todos os resultados foram alinhados aseqüência juntamente com a seqüência referência de LAV1, permitindo assimuma melhor reconstrução do genoma. Qualquer discrepância na seqüência emrelação à referência exigiu uma confirmação independente sobre outra reação deseqüenciamento. A seqüência completa de VDV1 é demonstrada na SEQ ID N01.

Algumas ambigüidades são freqüentemente encontrados emseqüências únicas, especialmente próximas as extremidades das seqüências.Isto é algo inerente à má qualidade da reação em ambas as extremidades dequalquer fragmento de PCR. Estas seqüências de má qualidade foramexcluídas do alinhamento, enquanto outras duas reações de seqüenciamentoindependentes eram disponíveis a partir de outros produtos de PCR. Adiscrepância sobre as seqüências de referência não foram levadas em contano alinhamento final quando não estas não foram confirmadas por pelo menosduas outras seqüências independentes de PCR de consenso compatível.Inversamente, qualquer discrepância confirmada em duas seqüênciasindependente foram mantidas no último seqüenciamento.

A Tabela 4 sumariza as características de cada reação deseqüenciamento, indicando o início, fim e a duração. As sobreposições entrePCR adjacentes também estão indicados, assim como as diferenças emrelação à seqüência de referência na última coluna.

Tabela 4 Características Individuais da Reação de Seqüenciamento doVírus da Dengue VDV1

<table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>

As duas extremidades do genoma não poderiam serseqüenciadas a partir da amplificação por PCR1 porque a síntese de cDNA e areação de PCR DNA necessitam de oligonucleotídeos complementares para asextremidades do genoma. Durante a etapa de amplificação, estesoligonucleotídeos são incorporadas ao fragmento de PCR. O resultado daseqüência é da seqüência de oligonucleotídeo sintético, e não a do própriovírus. O PCR em ambas as extremidades do genoma do vírus não funcionamcorretamente, o que sugere que a seqüência do vírus não foi significativamentediferente da seqüência de oligonucleotídeo (se tivesse sido o caso, aamplificação por PCR deveria ter fracassado ou, pelo menos, deveria ter sidode má qualidade). As duas extremidades do genoma não poderiam serdistinguidas de todas as outras amplificações por PCR. Portanto, no genomareconstruído (SEQ ID N0 1), ambas as extremidades do genoma foramconsideradas como idênticas ás seqüências de oligonucleotídeos (e tambémidênticas a seqüência de referência). No 5' terminal, é a seqüência dosnucleotídeos de 1 a 34. No 3' terminal, é a seqüência dos nucleotídeos de10707 a 10735.

2.3.2 Comparação das Seqüências

A comparação direta da seqüência entre as cepas VDV1 e LAV1de referência mostra uma série de 3 diferenças de nucleotídeos. A Tabela 5mostra a lista completa dessas posições.

Tabela 5: Comparação das Seqüências Entre as Cepas LAV1 ε VDV1.

<table>table see original document page 39</column></row><table>

A mudança de nucleotídeo na posição 2719 é silenciosa nonível do aminoácido. A segunda diferença na posição 5962 desencadeiauma mudança de aminoácido NS3-481 (lisina para aspargina). Ambos sãohidrofílicos, mas lisina é carregada positivamente, enquanto que aaspargina não é. A última diferença está localizado no peptídeo NS5,substituindo lisina por arginina na posição NS5-125. Tais substituições deaminoácidos são relativamente conservadoras do ponto de vista químico,tanto os resíduos de arginina quanto de lisina são hidrofílicas e carregadaspositivamente.

Tabela 6: Pesquisa de Discrepàncias Sobre Outras Cepas de Dengue-1

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Ao realizar o alinhamento da seqüência entre todos as seqüênciasgenômicas do sorotipo-1 da dengue disponíveis no Genbank1 parece que, amaior parte das diferenças identificadas também estão presentes em outras cepas(vide Tabela 6). Uma posição é única na cepa VDV1 (posição 7947; NS5 -125).

Assim, a seqüência genômica completa da cepa VDV1 do vírusda dengue foi estabelecida.

Três diferenças de nucleotídeos foram detectadas em relação àseqüência genômica LAV1 de origem. A cepa VDV1 vacinai é derivada daLAV1, através da "sanitização " viral e da passagem de células de cão paracélulas de macaco.

As diferenças entre LAV1 e VDV1 podem ter várias origens.Primeiro, as etapas de clonagem podem eleger uma sub-população viral quenão é 100% idêntica à seqüência maior anteriormente detectada no LAV1. Emsegundo lugar, LAV1 foi produzida em células PDK, enquanto VDV1 foiproduzida em células Vero. Essa passagem de células de cão para células demacaco induz potencialmente a mudanças virais que refletem a adaptação ànova linhagem celular. Em terceiro lugar, como para todos os vírus RNA1 amenor fidelidade da RNA polimerase viral desencadeia uma maior taxa demutação genômica do que o que a DNA polimerase.

Em termos de seqüências apenas 3 diferenças entre LAV1 eVDV1 foram observadas, o que corresponde a apenas 2 substituições deaminoácidos. Todos 14 posições de nucleotídeos que foram associadas aatenuação viral do LAV1 estão conservadas no VDV1. Além disso, aseqüências da cepa VDV1 "mãe" e "em massa" foram comparadas (Tabela 7).

Tabela 7: Diferenças de Nucleotídeos Entre a Cepa 16007do Vírus da

Dengue-1 Tipo Selvagem ε As Cepas LAV1/PDK13 ε VDV1 Atenuadas.

A seqüência completa da matriz inicial semente mãe da VDV1 foialinhada com a seqüência em massa. Nenhuma diferença entre as duasseqüências foi observada, indicando estabilidade genética através depassagens.

VDV1 mostra uma notável estabilidade genética no que dizrespeito à seu progenitor LAV1.

Exemplo 3

Caracterização

O objetivo destes estudos foi avaliar se mudanças nosmarcadores de atenuação ocorreu através das passagens.

O fluxograma mostrado na Figura 2 sumariza o aperfeiçoamentodo processo de manufatura que dá origem ao Produto Completo(monovalente), em dose "pronta para o uso".

Resumidamente, após 2 passagens sucessivas da semente pré-mãe em células Vero cedida pelo Departamento de Pesquisa, as respectivassementes de trabalho foram obtidas. Os cultivos finais dos vírus também foramconduzidos por infecção de uma suspensão de células Vero. Os vírusproduzidos são em seguida colhidos. O ácido desoxirribonucléico (DNA) foidigerido, de acordo com um tratamento enzimático. As impurezas foramremovidas por ultrafiltração. Títulos de Infecção foram aumentados por umaetapa de concentração. Uma solução aquosa tamponada contendo agentescrioprotetor (pH = 7,5) é adicionado e esta mistura é filtrada em 0,22 μιτι eentão diluída na dose desejada dentro da mesma solução. A substância ativaé, então, colocada em frascos de vidro, congeladas à seco, e armazenadaantes de ser utilizada.

3.1 Marcadores Fenotípicos

Os resultados são apresentados na Tabela 8. Os testes devalidação realizados para a semente mãe e semente em massa são:

Tamanho da Placa: O ensaio foi realizado em células Vero a 37°C, após 7 dias de incubação. A classificação por tamanho das placas foirealizada pelo software dedicado Saisam v.5.2.0 (Microvision Instruments),após a ,.captação da imagem com uma câmera de vídeo. Duas populações (0,3mm e 0,8 mm) foram detectadas na LAV1. A maior população foi a de tamanhomeiíor. Após a adaptação às células Vero e a clonagem biológica, o tamanhodas placas VDV1 mostrou-se de distribuição homogênea, com mais de 98% dapopulação mostrando um único pico, centrado em 0,8 mm de diâmetro. Estasplacas são claramente distintas das obtidas com o vírus DEN-1 16007 (videfiguras 4 e 5).

Sensibilidade à temperatura: o monovalente 1 exibe clararestrição de crescimento a 39 0C comparado as não-sensíveis à temperatura(Ts), tipo selvagem (WT) D1-16007. Isto foi demonstrado tanto por ensaios detitulação de infecção quanto por quantificação de RNA viral. A passagem 18,"mãe" e "em massa", (10 passagens após a passagem em massa) dassementes monovalentes 1 exibiram 90% ou mais de redução no título a 39 °C,comparado a 37 °C.

Tabela 8: Resumo dos Fenótipos Virais de DEN-1

<table>table see original document page 43</column></row><table>*n: núrnero de animais

3.2 Marcadores Fenotípicos

A vacina VDV1 pode distinguir-se das cepas precursoras ao nívelgenômico. A atenuação Ioci específicas foi identificada. Estes Ioci estãoconservados nas matrizes iniciais semente mãe e semente em massa

Exemplo 4

Imunogenicidade. Viremia. ε Toxicologia em Macacos

Dados mais sólidos e numerosos que podem ser obtidos emmacacos referem-se a imunogenicidade e viremia. A viremia, em particular, temsido identificada como um dos fatores associados à virulência e a gravidade dadoença nos seres humanos e, assim, constitui um parâmetro importante a serconsiderado. Obviamente, a imunogenicidade é um parâmetro essencial aotestar vacinas.

Inventores estabeleceram os valores mínimo/máximo para viremiae imunogenicidade.

Tabela 9: Requisitos Mínimos Para as Respostas Induzidas Pelas Vacinas

Candidatas da Dengue Em Macacos. Conforme Mensuradas em CélulasVero ou LLC-MK2 Pelo Ensaio em Placas (Sendo Estas CélulasConsideradas Equivalentes Neste Tipo De Ensaio)

<table>table see original document page 44</column></row><table>

pfu: Unidades formadoras de placa

PRNT 50: Neutralização com Redução de Placas Título 50 (títulocorrespondente a uma redução de 50% do número de placas)4.1 Material ε Métodos

4.1.1 Experimentos em macacos

Experimentos em macacos foram efetuados de acordo com asdiretrizes européias relativas à experimentação animal.

As Imunizações foram realizadas em macacos cinomolgos(Macaca fascicularis) originários das Ilhas Maurício (CRP Le Vallon). Osmacacos permaneceram de quarentena durante 6 semanas no biotério daSanofi Pasteur antes da imunização.

Os macacos foram imunizados com as vacinas por viasubcutânea (SC) no braço em um volume de 0,5 ml (vide cada seçãorespectiva). Após anestesia leve com cetamina (Imalgene, Merial), o sangue foicolhido por punção das veias inguinal e safena. Aos dias 0 e 28, foram colhidosamostras de 5 ml de sangue para avaliar as respostas ao anticorpo enquantoque entre os dias 2 e 10 apenas 1 ml de sangue foi coletado para avaliar aviremia. O sangue foi coletado e mantido no gelo até a separação do soro.Para isso, sangue foi centrifugado durante 20 minutos a 4 °C, e soro retirado earmazenados a -80 0C até os testes no laboratório Rich Kinney. O transportepara os EUA foi realizado em gelo seco.

4.1.2 Viremia ε Respostas por Anticorpos Neutralizantes (Teste deNeutralização por Redução de Placas. PRNT)

Todas as análises foram realizadas no laboratório de R. Kinney noCDC, Fort Collins, EUA. As amostras séricas foram transferidas earmazenadas a -80 0C até o momento do ensaio. No instante do primeirodescongelamento, as amostras foram testadas para viremia, e uma diluição de1:5 do soro foi realizada. As diluições de 1:5 do soro foram inativadas por 30minutos a 56 0C antes do teste de neutralização do anticorpo.

4.1.2.1 Viremia

0,125 ml de soro foi adicionado a 0,125 ml de solvente (meioRPMh no primeiro poço da placa de 96 poços e diluições seriais de 10 vezesforam feitas, transferindo de 0,025 ml em 0,225 ml do diluente para cadadiluição] Diluições seriadas de 0,2 ml de IO03-IO53 foram plaqueadas em 6poços de placas com células Vero (o vírus foi adsorvido a 37 0C durante 1,5horas, e coberto com 4 ml de agarose sem vermelho neutro, por 6-7 diascobertos adicionalmente com 2 ml de Agarose contendo vermelho neutro, eentão placas foram contadas). O limite de detecção do vírus foi = 10 PFU / ml.Para o controle de estoque vacinas DEN-16007 PDK-13 (LAV1) foramplaqueadas.

4.1.2.2 PRNT (Teste de Neutralização por Redução de Placas)

Anticorpos neutralizantes foram quantificados como descrito emHuang et aí. (2000). Resumidamente, 0,2 ml de soro inativado pelo calor,diluído 1:5 foram adicionados ao primeiro poço de placas de 96 poços ediluições seriais de 2 vezes foram feitas, transferindo de 0,1 ml em 0,1 ml desolvente (meio RPMI) para cada diluição. Isto resultou em uma diluição serialsérica de 1:10 - 1:320. 0,1 ml do vírus DEN (60-160 PFU; o vírus parentalDEN1 16007) foi adicionado a cada poço de diluição sérica, com um total de0,2 ml de mistura soro-vírus. As placas de 96 poços foram incubadas overnighta 4 0C. 0,1 ml de mistura soro-vírus (contendo 30-80 PFU da entrada do vírus)foram plaqueadas em 6 poços de placas com células Vero (conforme indicadoacima na seção da Viremia) e as placas foram contadas após coloração comvermelho neutro.

Múltiplas titulações da entrada viral em testes de concentraçõesde 2 vezes, 1-vez, e 0,5 vez fornecidos por determinação experimental diretada PFU de entrada, que foi a base para a determinação do título final de 50%(PRNT50) e 70% (PRNT70) de anticorpo. Um resultado soro negativo deve terum título de anticorpos neutralizantes <1:10. Soros demonstrando um título deneutralização de 320 foram re-analisados em diluições de 1:80 a 1:2560 para adeterminação do final título.

4.2 Avaliação Dos VDV Candidatos

4.2.1 VDV-1/pré-mãe

A purificação/seleção do candidato D1 foi realizado conformedescrito no exemplo 1. Os clones selecionados (com base nas seqüência emarcadores fenotípicos) foram testados na sanofi pasteur como descrito emMaterial e Métodos (Biotério Marcy TEtoiIe1 115), em macacos cinomolgosmachos (Macaca fascicularis, peso médio 3,1 kg), originárias da CRP LeVallon, Ilhas Maurício.

Após a imunização em DO, a viremia foi seguida do D2 ao D10, ea imunogenicidade medida no DO e D28. Todas as vacinas e vírus, quando naforma líquida, foram mantidos a -70 °C.

LAV1: título: 103'9 DICC50/ml, liofilizado, ressuspendido em 0,5 mlde PBS (contendo Ca2+ e Mg2+; CaCI2.2H20 0,133 g/L.; MgCI2.6H20, 0,1 g/L) eadministrado na totalidade.

VDV1 pré-mãe: DEN1-TV111: Título: 105·9 DICC50/ml, líquido,diluído em 105·3 pfu/ml em PBS (contendo Ca2+ e Mg2+; CaCI2.2H20 0,133 g/L,MgCI2.6H20, 0,1 g/L); administrado 0,5 ml.

A injeção foi feita por via SC no braço com uma agulha 23G1, auma dose 105 DICC50 para VDV1.

Os resultados estão apresentados na Tabela 10. Titulações no dia28 foram realizadas em triplicata (PRNT70) ou em duplicata (PRNT50).

Tabela 10: Imunogenicidade do VDV1 Pré-Mãe

AvP monovalente VDV1 (Exp A) Estudo em Macacos DEN (F. Mi.DEN003.Si): PRNT e Resultados da Viremia <table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table> Vírus Exp#1 Exp#2 Exp#3

DEN- 1 112PFU 45PFU 101PF U

Resumidamente, as respostas foram bastante homogêneasdentro de cada grupo, e algumas tendências claras puderam ser identificadaspara cada construção. Não foram encontradas diferenças discrepantes entreVDV1 e LAV1: viremia baixa e tardia foi observada em alguns macacos LAV1.VDV1 s_e mostrou satisfatório e, em particular não apresentou viremia.

4.2.2 VDV-1 em massa

Como a imunogenicidade das vacinas haviam sido testadas noestado pré-mãe, um novo experimento foi concebido para testar cadamonovalentes no estado em massa.

Macacos machos Macaca fascicularis foram usados como antes,originários da CRP Le Vallon1 Ilhas Maurício (24 macacos, peso médio 3,4 kg).VDV1; Lote0: Título: 8,37 Iog10 DICC50/mLPlacebo: PBS com Ca2+ e Mg2+

As vacinas foram diluídas em PBS a 1053 DICC50 /ml (contendoCa2+ e Mg2+; CaCl2-2H20 0,133 g/L; MgCl2.6H20, 0,1g/l); 0,5 ml administradopor via SC no braço com uma agulha 23G1, correspondendo a uma dose de105 DICC50.

Viremia e imunogenicidade foram medidos, como é habitual noCDC por R Kinney. Os resultados são apresentados na Tabela 11.

A vacina monovalente VDV1 induziu uma resposta imunesignificativa enquanto que a viremia esteve ausente. Assim, este VDV1monovalente cumpriu com sucesso os critérios inicialmente definidos nosmacacos.

Tabela 11: Imunogenicidade ε Viremia do VDV em massa VDV1

Estudo em macacos(F.MI.DEN004.Mk): VDV1 Monovalente e Tetravalente

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>

4.3 Testes de Neurovirulência em Macacos

Para cada tipo de vírus, 10 macacos cinomolgo das ilhas Maurícioforam inoculadas com semente mãe da VDV1 pela via intracerebral (107,23CCID50/mL no tálamo de cada hemisfério). No final do ensaio, os macacosforam sacrificados e perfundidos com solução de formalina. Foram colhidasamostras de tecido do cérebro de cada macaco (medula oblongata, ponte ecerebelo, mesencéfalo, tálamo incluindo a parte esquerda e direita, córtexcerebral à esquerda e à direita). Foram feitas seções com uma espessura de 8μm. e coradas pela eosina e galocianina.

Nenhum sinal histopatológico de patogenicidade foi observado nocérebro dos macacos injetados com VDV1 mãe.

Exemplo 5

Segurança Do VDV1 Monovalente Em Adultos Saudáveis. Flavivirus-NaiveCom Idade Entre 18 E 40 Anos

O propósito deste estudo fase 1 é documentar os perfis desegurança, viremia, e imunogenicidade do VDV1 monovalente em umaconcentração de vírus de 104 CCID50 comparado com Stamaril® (usados comogrupo controle), em adultos sem precedentes de tratamento para flavivirus(naive). Injeções únicas são dadas, dando o seguimento a 6 e 12 meses. Porprecaução da segurança, são realizadas no estudo inclusões seqüenciais.

O registro e as vacinações são então escalonados; um 1o coorte(n = 4 por grupo, η total = 12) foram vacinados. A segurança dos dadoscoletados até o dia 28 foi analisada por um Comitê de Acompanhamento deDados Independente (IDMC) e pela Royal Adelaide Hospital InvestigationalDrugs Subcommittee (IDSC) antes de se tomar a decisão de continuar com avacinação dos indivíduos restantes (n = 8 por grupo, η total = 16). Arepresentação esquemática do desenho do estudo é fornecida na figura 6.

Após a administração da vacina o paciente são regularmentesubmetidos a vários testes e exames clínicos. Um resumo deste seguimento éindicado na tabela 12 abaixo.

A população incluída é constituída de adultos com idadescompreendidas entre 18 e 40 anos (ou seja, do dia do 18° aniversário àsvésperas do 41° aniversário), no dia da inclusão que não possuem precedentesde tratamento para o flavivirus (naive) (pessoas apresentando vacinação contradoenças causadas por flavivirus (por exemplo, febre amarela, encefalitejaponesa, dengue); ou história de infecção por flavivirus (confirmadoclinicamente, sorologicamente ou microbiologicamente) ou residir previamenteou viajar para áreas com elevada endemicidade de infecção por dengue(independentemente da duração), ou ter residência ou viajar para o norte deQueensland durante 2 semanas ou mais) foram excluídos)

Tabela 12: Fluxograma De Acompanhamento

<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>

V: visita - D: dia

O tempo de intervalo entre as visitas serão calculados a partir dadata de vacinação do estudo, que pode ser diferente da data da visita (porexemplo, no caso que o critério de exclusão temporária é cumprido). V06 e V07deve ser feita com pelo menos 1 dia de intervalo.

Os produtos testados são:

A vacina avaliada é um produto Iiofilizado em um frasco que éreconstituído extemporaneamente com o solvente fornecidoseparadamente:

- Ingrediente ativo: 4 ±0.5 Iog10 CCID50 de cada vírus da denguemonovalente sorotipo-1 (VDV1) por dose de 0,5 mL;- Diluente: Solução de NaCI 4% estéril para a reconstituição davacina.

- A vacina reconstituída, ou seja, 0,5 mL de solução de NaCI 4%de VDV monovalentes VDV1, deve ser usada imediatamente ou ser mantidasentre +2 0C e +8 0C até o uso.

- A dose de 0,5 mL da vacina é administrada por via subcutâneana região deltóide.

- A vacina controle Stamaril®, é uma vacina contra a febreamarela produzida pela Aventis Pasteur. Stamaril® é apresentado como umpó liofilizado, livre de Ieucose aviária, produto estabelecido para serreconstituído com um solvente imediatamente antes da utilização.(Ingrediente ativo: vírus da febre amarela vivo atenuado (cepa 17D): Doseletal em camundongo 50% (DL50) ^ 1000/Diluente: solução de NaCI4 %estéril).

A vacina controle é administrada por via subcutânea na regiãodeltóide.

Os resultados preliminares do estudo são indicados na Tabela 13abaixo.

Tabela 13: Dados Preliminares De Segurança

<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table>

A Tabela 13 mostra que anormalidades biológicas (reduções deWCC, diminuição na contagem de plaquetas) foram brandas. Os sintomasforam principalmente mal-estar, náuseas, diarréia e vômitos ocasionais. Elesforam de gravidade moderada. Uma erupção cutânea significativa típica deerupção cutânea maculopapular "viral" se iniciou no dia 12, 90% deacometimento.

A segurança dos dados da segunda coorte também foisatisfatória, sem nenhuma anormalidade biológica registrada. Todos osindivíduos apresentam uma resposta de anticorpos 28 dias após a vacinaçãocontra a dengue-1 (título entre 1315 e 13150).

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Centers for Disease Control and Prevention

<120> Cepa Atenuada do Virus da Dengue Sorotipo 1

<130> BET 06P0285

<150> US 60/691.243

<151> 17-06-2005

<160> 44

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10735

<212> DNA

<213> V^rus da Dengue<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(10654)

<223> VDVl

<400> 1

agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag 60ttctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgatc aaccaacgaa aaaagacggg 120tcgaccgtct ttcaatatgc tgaaacgcgc gagaaaccgc gtgtcaactg tttcacagtt 180ggcgaagaga ttctcaaaag gattgctctc aggccaagga cccatgaaat tggtgatggc 240tttcatagca ttcttaagat ttctagccat acccccaaca gcaggaattt tggctagatg 300gggctcattc aagaagaatg gagcgattaa agtgttacgg ggtttcaaga gagaaatctc 360aaacatgcta aacataatga acaggaggaa aagatccgtg accatgctcc ttatgctgct 420gcccacagcc ctggcgttcc atctgacgac acgaggggga gagccgcata tgatagttag 480caagcaggaa agaggaaagt cacttttgtt caagacctct gcaggtgtca acatgtgcac 540cctcattgcg atggatttgg gagagttgtg tgaggacacg atgacctaca aatgcccccg 600gatcactgag gcggaaccag atgacgttga ctgttggtgc aatgccacgg acacatgggt 660gacctatgga acgtgctctc aaactggcga acaccgacga gacaaacgtt ccgtcgcatt 720ggccccacac gtggggcttg gcctagaaac aagagccgaa acgtggatgt cctctgaagg 780tgcttggaaa cagatacaaa aagtagagac ttgggctctg agacatccag gattcacggt 840gatagccctt tttctagcac atgccatagg 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2580gtgtggaatc cgatcagcca ctcgtctcga gaacatcatg tggaaacaaa tatcaaatga 2640attgaaccac atcctacttg aaaatgacat gaaatttaca gtggtcgtgg gagacgttag 2700tggaatcttg gcccaaggaa aaaaaatgat taggccacaa cccatggaac acaaatactc 2760gtggaaaagc tggggaaaag ctaaaatcat aggagcggat gtacagaaca ccaccttcat 2820catcgacggc ccaaacaccc cagaatgccc tgacaatcaa agagcatgga atatttggga 2880agtagaggac tatggatttg ggattttcac gacaaacata tggttgaaat tgcgtgactc 2940ctacacccaa gtatgtgacc accggctgat gtcagctgcc attaaggaca gcaaggcagt 3000ccatgctgac atggggtact ggatagaaag tgaaaagaac gagacatgga agttggcgag 3060agcctccttt atagaagtta agacatgcat ctggccaaaa tcccacactc tatggagcaa 3120tggagttctg gaaagtgaaa tgataattcc aaagatatat ggaggaccaa tatctcagca 3180caactacaga ccaggatatt tcacacaaac agcagggccg tggcacctag gcaagttgga 3240actagatttc gatttttgtg aaggtaccac agttgttgtg gatgaacatt gtggaaatcg 3 BOOaggaccatct ctcagaacca caacagtcac aggaaagata atccatgaat ggtgctgcag 3360atcttgtacg ctaccccccc tacgtttcaa aggggaagac gggtgttggt acggcatgga 3420aatcagacca 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tatcactgga gaaagcggct gaggtctcct gggaggaaga 4320agcagaacac tcaggcgcct cacacaacat actagtagag gttcaagatg atggaaccat 4380gaagataaaa gatgaagaga gagatgacac gctcaccatt ctccttaaag caactctgct 4440ggcagtctca ggggtgtacc caatgtcaat accagcgacc ctttttgtgt ggtatttttg 4500gcagaaaaag aaacagagat caggagtgct atgggacaca cccagccccc cagaagtgga 4560aagagcagtt cttgatgatg gcatctatag aattttgcaa agaggactgt tgggcaggtc 4620ccaagtagga gtaggagttt tccaagaagg cgtgttccac acaatgtggc acgtcactag 4680gggagctgtc ctcatgtatc aaggaaaaag gctggaacca agctgggcca gtgtcaaaaa 4740agacttgatc tcatatggag gaggttggag gtttcaagga tcctggaaca cgggagaaga 4800agtacaggtg attgctgttg aaccgggaaa aaaccccaaa aatgtacaaa caacgccggg 4860taccttcaag acccctgaag gcgaagttgg agccatagcc ttagacttta aacctggcac 4920atctggatct cccatcgtaa acagagaggg aaaaatagta ggtctttatg gaaatggagt 4980ggtgacaaca agcggaactt acgttagtgc catagctcaa gctaaggcat cacaagaagg 5040gcctctacca gagattgagg acaaggtgtt taggaaaaga aacttaacaa taatggacct 5100acatccagga tcgggaaaaa caagaagata ccttccagcc atagtccgtg aggccataaa 5160aaggaagctg cgcacgctaa tcctagctcc cacaagagtt gtcgcttctg aaatggcaga 5220ggcactcaag ggagtgccaa taaggtatca gacaacagca gtgaagagtg aacacacagg 5280aaaggagata gttgacctta tgtgccacgc cactttcacc atgcgcctcc tgtctcccgt 5340gagagttccc aattataaca tgattatcat ggatgaagca cacttcaccg atccagccag 5400catagcagcc agagggtaca tctcaacccg agtgggtatg ggtgaagcag ctgcgatctt 5460tattjacagcc actcccccag gatcggtgga ggcctttcca cagagcaatg caattatcca 5520agatgaggaa agagacattc ctgagagatc atggaactca ggctatgact ggatcactga 5580ttttccaggt aaaacagtct ggtttgttcc aagcatcaaa tcaggaaatg acattgccaa 5640ctgtttaaga aaaaacggga aacgggtgat ccaattgagc agaaaaacct ttgacactga 5700gtaccagaaa acaaaaaaca acgactggga ctatgtcgtc acaacagaca tttccgaaat 5760gggagcaaat ttccgggccg acagggtaat agacccaagg cggtgtctga aaccggtaat 5820actaaaagat ggtccagagc gcgtcattct agccggaccg atgccagtga ctgtggccag 5880tgccgcccag aggagaggaa gaattggaag gaaccaaaac aaggaaggtg atcagtatat 5940ttacatggga cagcctttaa aaaatgatga ggaccacgct cattggacag aagcaaagat 6000gctccttgac aatataaaca caccagaagg gattatccca gccctctttg agccggagag 6060agaaaagagt gcagctatag acggggaata cagactgcgg ggtgaagcaa ggaaaacgtt 6120cgtggagctc atgagaagag gggatctacc agtctggcta tcctacaaag ttgcctcaga 6180aggcttccag tactccgaca gaaggtggtg cttcgatggg gaaaggaaca accaggtgtt 6240ggaggagaac atggacgtgg agatctggac aaaagaagga gaaagaaaga aactacgacc 6300tcgctggttg gacgccagaa catactctga cccactggct ctgcgcgagt ttaaagagtt 6360tgcagcagga agaagaagcg tctcaggtga cctaatatta gaaataggga aacttccaca 6420acatttgacg caaagggccc agaatgcttt ggacaacttg gtcatgttgc acaattccga 6480acaaggagga aaagcctata gacatgctat ggaagaactg ccagacacaa tagaaacgtt 6540gatgctccta gccttgatag ctgtgttgac tggtggagtg acgctgttct tcctatcagg 6600aagaggtcta ggaaaaacat ctatcggctt actctgcgtg atggcctcaa gcgcactgtt 6660atggatggcc agtgtggagc cccattggat agcggcctcc atcatactgg agttctttct 6720gatggtactg cttattccag agccagacag acagcgcact ccacaggaca accagctagc 6780atatgtggtg ataggtctgt tattcgtgat attgacagtg gcagccaatg agatgggatt 6840attggaaacc acaaagaaag acctggggat tggccatgta gctgctgaaa accaccacca 6900tgctacaatg ctggacgtag acctacatcc agcttcagcc tggaccctct atgcagtggc 6960cacaacaatc atcactccta tgatgagaca cacaattgaa aacacaacgg caaatatttc 7020cctgacagcc atcgcaaacc aagcagctat attgatggga cttgacaagg gatggccaat 7080atcgaagatg gacataggag ttccacttct cgccttgggg tgctattccc aagtgaatcc 7140gctgacactg atagcggcag tattgatgct agtagctcat tacgccataa ttggacctgg 7200actgcaagca aaagctacta gagaagctca aaaaagaaca gcggctggaa taatgaaaaa 7260tccaactgtc gacgggattg ttgcaataga cttagatccc gtggtttacg atgcaaaatt 7320tgaaaaacag ctaggccaaa taatgttgtt gatactttgc acatcacaga ttcttttgat 7380gcggactaca tgggccttgt gtgaatccat cacattggct actggacctc tgaccactct 7440ttgggaggga tctccaggaa aattctggaa caccacaata gcggtatcca tggcaaacat 7500tttcaggggg agttatctag caggagcagg tctggccttc tcattaatga aatctctagg 7560aggaggtagg agaggcacgg gagcccaagg ggaaacactg ggagaaaaat ggaaaagaca 7620actaaaccaa ctgagcaagt cagaattcaa tacttacaag aggagtggga ttatggaggt 7680ggatagatcc gaagccaaag agggactgaa aagaggagaa acaaccaaac acgcagtatc 7740gagaggaacg gccaaactga ggtggttcgt ggagaggaac cttgtgaaac cagaagggaa 7800agtcatagac ctcggttgtg gaagaggtgg ctggtcatat tattgcgctg ggctgaagaa 7860agtcacagaa gtgaaaggat acacaaaagg aggacctgga catgaggaac caatcccaat 7920ggcgacctat ggatggaacc tagtaaggct gcactccgga aaagatgtat tttttatacc 7980acctgagaaa tgtgacaccc ttttgtgtga tattggtgag tcctctccga acccaactat 8040agaggaagga agaacgttac gtgttctgaa aatggtggaa ccatggctca gaggaaacca 8100attttgcata aaaattctaa atccctatat gccgagcgtg gtagaaactc tggaacaaat 8160gcaaagaaaa catggaggaa tgctagtgcg aaacccactc tcaagaaatt ccacccatga 8220aatgtactgg gtttcatgtg gaacaggaaa cattgtgtca gcagtaaaca tgacatctag 8280aatgttgcta aatcggttca caatggctca caggaagcca acatatgaaa gagacgtgga 8340cttaggcgct ggaacaagac atgtggcagt agaaccagag gtagccaacc tagatatcat 8400tggccagagg atagagaata taaaaaatga acataagtca acatggcatt atgatgagga 8460caatccatac aaaacatggg cctatcatgg atcatatgag gttaagccat caggatcggc 8520ctcatccatg gtcaatggcg tggtgagatt gctcaccaaa ccatgggatg ttatccccat 8580ggtcacacaa atagccatga ctgataccac accctttgga caacagaggg tgtttaaaga 8640gaaagttgac acgcgcacac caaaagcaaa acgtggcaca gcacaaatta tggaagtgac 8700agccaggtgg ttatggggtt tcctttctag aaacaaaaaa cccagaattt gcacaagaga 8760ggagtttaca agaaaagtta ggtcaaacgc agctattgga gcagtgttcg ttgatgaaaa 8820tcaatggaac tcggcaaaag aagcagtgga agacgaacgg ttctgggaac ttgtccacag 8880agagagggag cttcataaac aggggaaatg tgccacgtgt gtctacaata tgatggggaa 8940gagagagaaa aaattaggag agttcggaaa ggcaaaagga agtcgtgcaa tatggtacat 9000gtggttggga gcacgcttcc tagagtttga agcccttggt ttcatgaatg aagatcactg 9060gttcagtaga gagaattcac tcagtggagt ggaaggagaa ggactccaca aacttggata 9120catactcaga gacatatcaa ggattccagg ggggaacatg tatgcagatg acacagccgg 9180atgggacaca agaataacag aggatgatct ccagaatgag gctaaaatca ctgacatcat 9240ggagcccgaa catgccctgc tggctacgtc aatctttaag ctgacctacc aaaataaggt 9300ggtaagggtg cagagaccag caaaaaatgg aaccgtgatg gatgttatat ccagacgtga 9360ccagagaggc agtggacagg ttggaactta tggcttaaac actttcacca acatggaggc 9420(é ccaactgata agacaaatgg agtctgaggg aatcttttta cccagcgaat tggaaacccc 9480aaatctagcc ggaagagttc tcgactggtt ggaaaaatat ggtgtcgaaa ggctgaaaag 9540aatggcaatc agcggagatg actgtgtggt gaaaccaatt gatgacaggt tcgcaacagc 9600cttaacagct ttgaatgaca tgggaaaagt aagaaaagac ataccacaat gggaaccttc 9660aaaaggatgg aatgattggc aacaagtgcc tttctgttca caccacttcc accagctaat 9720tatgaaggat gggagggaga tagtggtgcc atgccgcaac caagatgaac ttgtggggag 9780ggccagagta tcacaaggcg ccggatggag cctgagagaa accgcatgcc taggcaagtc 9840atatgcacaa atgtggcagc tgatgtattt ccacaggaga gacctgagac tggcggctaa 9900cgctatttgt tcagccgttc cagttgattg ggtcccaacc agccgcacca cctggtcgat 9960ccatgcccat caccaatgga tgacaacaga agacatgtta tcagtatgga atagggtctg 10020gatagaggaa aacccatgga tggaggataa gactcatgtg tccagttggg aagaagttcc 10080atacctagga aagagggaag atcagtggtg tggatccctg ataggcttaa cagcaagggc 10140cacctgggcc actaatatac aagtggccat aaaccaagtg agaaggctca ttgggaatga 10200gaattatcta gattacatga catcaatgaa gagattcaag aatgagagtg atcccgaagg 10260ggcactctgg taagtcaaca cattcacaaa ataaaggaaa ataaaaaatc aaatgaggca 10320agaagtcagg ccagattaag ccatagtacg gtaagagcta tgctgcctgt gagccccgtc 10380caaggacgta aaatgaagtc aggccgaaag ccacggtttg agcaagccgt gctgcctgtg 10440gctccatcgt ggggatgtaa aaacccggga ggctgcaacc catggaagct gtacgcatgg 10500ggtagcagac tagtggttag aggagacccc tcccaagaca caacgcagca gcggggccca 10560acaccagggg aagctgtacc ctggtggtaa ggactagagg ttagaggaga ccccccgcgt 10620aacaataaac agcatattga cgctgggaga gaccagagat cctgctgtct ctacagcatc 10680attccaggca cagaacgcca gaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttct 10735

<210> 2<211> 10735<212> DNA

<21Β> vírus da Dengue<220>

<221> misc_feature<222> Cl)·-(10735)

<223> vírus da Dengue de tipo 1 de caráter 16007 precursor de

poliprotileno, completo cds<400> 2

agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag 60ttctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgatc aaccaacgaa aaaagacggg 120tcgaccgtct ttcaatatgc tgaaacgcgc gagaaaccgc gtgtcaactg tttcacagtt 180ggcgaagaga ttctcaaaag gattgctctc aggccaagga cccatgaaat tggtgatggc 240tttcatagca ttcttaagat ttctagccat acccccaaca gcaggaattt tggctagatg 300gggctcattc aagaagaatg gagcgattaa agtgttacgg ggtttcaaga gagaaatctc 360aaacatgcta aacataatga acaggaggaa aagatccgtg accatgctcc ttatgctgct 420gcfccacagcc ctggcgttcc atctgacgac acgaggggga gagccgcata tgatagttag 480caagcaggaa agaggaaagt cacttttgtt caagacctct gcaggtgtca acatgtgcac 540cctcattgcg atggatttgg gagagttgtg tgaggacacg atgacctaca aatgcccccg 600gatcactgag gcggaaccag atgacgttga ctgttggtgc aatgccacgg acacatgggt 660gacctatgga acgtgctctc aaactggcga acaccgacga gacaaacgtt ccgtcgcatt 720ggccccacac gtggggcttg gcctagaaac aagagccgaa acgtggatgt cctctgaagg 780tgcttggaaa cagatacaaa aagtagagac ttgggctctg agacatccag gattcacggt 840gatagccctt tttctagcac atgccatagg aacatccatc acccagaaag ggatcatttt 900cattttgctg atgctggtaa caccatctat ggccatgcga tgcgtgggaa taggcaacag 960agacttcgtg gaaggactgt caggagcaac atgggtggat gtggtactgg agcatggaag 1020ttgcgtcacc accatggcaa aaaacaaacc aacactggac attgaactct tgaagacgga 1080ggtcacaaac cctgcagttc tgcgtaaatt gtgcattgaa gctaaaatat caaacaccac 1140caccgattcg agatgtccaa cacaaggaga agccacactg gtggaagaac aagacgcgaa 1200ctttgtgtgc cgacgaacgt tcgtggacag aggctggggc aatggctgtg ggctattcgg 1260aaaaggtagt ctaataacgt gtgccaagtt taagtgtgtg acaaaactag aaggaaagat 1320agttcaatat gaaaacctaa aatattcagt gatagtcacc gtccacactg gagatcagca 1380ccaggtggga aatgagacta cagaacatgg aacaactgca accataacac ctcaagctcc 1440tacgtcggaa atacagctga ccgactacgg aacccttaca ttagattgtt cacctaggac 1500agggctagat tttaacgaga tggtgttgct gacaatgaaa gaaagatcat ggcttgtcca 1560caaacaatgg tttctagact taccactgcc ttggacctct ggggcttcaa catcccaaga 1620gacttggaac agacaagatt tactggtcac atttaagaca gctcatgcaa agaagcagga 1680agtagtcgta ctaggatcac aagaaggagc aatgcacact gcgctgactg gagcgacaga 1740aatccaaacg tcaggaacga caacaatttt cgcaggacac ctaaaatgca gactaaaaat 1800ggacaaacta actttaaaag ggatgtcata tgtgatgtgc acaggctcat tcaagttaga 1860gaaagaagtg gctgagaccc agcatggaac tgttctggtg caggttaaat atgaaggaac 1920agacgcacca tgcaagattc ccttttcgac ccaagatgag aaaggagcaa cccagaatgg 1980gagattaata acagccaacc ccatagtcac tgacaaagaa aaaccagtca atattgaggc 2040agaaccaccc tttggtgaga gctacatcgt ggtaggagca ggtgaaaaag ctttgaaact 2100aagctggttc aagaaaggaa gcagcatagg gaaaatgttt gaagcaactg cccgaggagc 2160acgaaggatg gccattctgg gagacaccgc atgggacttc ggttctatag gaggagtgtt 2220cacgtctatg ggaaaactgg tacaccaggt ttttggaact gcatatggag ttttgtttag 2280cggagtttct tggaccatga aaataggaat agggattctg ctgacatggc taggattaaa 2340ttcaaggaac acgtcccttt cgatgatgtg catcgcagtt ggcatggtca cactgtacct 2400aggagtcatg gttcaggcag attcgggatg tgtaatcaac tggaaaggca gagaacttaa 2460atgtggaagc ggcatttttg tcactaatga agttcacact tggacagagc aatacaaatt 2520ccaggctgac tcccccaaga gactatcagc agccattggg aaggcatggg aggagggtgt 2580gtgtggaatc cgatcagcca ctcgtctcga gaacatcatg tggaaacaaa tatcaaatga 2640attgaaccac atcctacttg aaaatgacat gaaatttaca gtggtcgtgg gagatgttag 2700tggaatcttg gcccaaggga aaaaaatgat taggccacaa cccatggaac acaaatactc 2760gtggaaaagc tggggaaaag ccaaaatcat aggagcggat gtacagaaca ccaccttcat 2820catcgacggc ccaaacaccc cagaatgccc tgacaatcaa agagcatgga atatttggga 2880agtagaggac tatggatttg ggattttcac gacaaacata tggttgaaat tgcgtgactc 2940ctacacccaa gtatgtgacc accggctgat gtcagctgcc attaaggaca gcaaggcagt 3000ccatgctgac atggggtact ggatagaaag tgaaaagaac gagacatgga agttggcgag 3060agcctccttt atagaagtta agacatgcat ctggccaaaa tcccacactc tatggagcaa 3120tggagttctg gaaagtgaaa tgataattcc aaagatatat ggaggaccaa tatctcagca 3180caactacaga ccaggatatt tcacacaaac agcagggccg tggcacctag gcaagttgga 3240actagatttc gatttttgtg aaggtaccac agttgttgtg gatgaacatt gtggaaatcg 3300aggaccatct ctcagaacca caacagtcac aggaaagata atccatgaat ggtgctgcag 3360atcttgtacg ctaccccccc tacgtttcaa aggggaagac gggtgttggt acggcatgga 3420aatcagacca gtgaaggaca aggaagagaa cctggtcaag tcaatggtct ctgcagggtc 3480aggagaagtg gacagctttt cactaggact gctatgcata tcaataatga ttgaagaagt 3540gatgagatcc agatggagca aaaaaatgct gatgactgga acactggctg tgttcctcct 3600tcttataatg ggacaattga catggagtga tctgatcagg ttatgtatta tggttggagc 3660caacgcttca gacaagatgg ggatgggaac aacgtaccta gctttaatgg ccactttcaa 3720aatgagacca atgttcgccg tcgggctatt atttcgcaga ctaacatcta gagaagttct 3780tcttcttaca attggcttga gcctggtggc atccgtggag ctaccaagtt ccctagagga 3840gctgggggat ggacttgcaa taggcatcat gatgttgaaa ttattgactg attttcagtc 3900acaccagcta tgggctactc tgctatcctt gacatttatt aaaaçaactt tttcattgca 3960ctatgcatgg aagacaatgg ctatggtact gtcaattgta tctctcttcc ctttatgcct 4020gtccacgacc tctcaaaaaa caacatggct tccggtgctg ttgggatctc ttggatgcaa 4080accactaccc atgtttctta taacagaaaa caaaatctgg ggaaggaaga gttggcccct 4140caatgaagga attatggctg ttggaatagt tagtattcta ctaagttcac ttttaaaaaa 4200tgatgtgccg ctagccggcc cattaatagc tggaggcatg ctaatagcat gttatgtcat 4260atccggaagc tcagctgatt tatcactgga gaaagcggct gaggtctcct gggaggaaga 4320agcagaacac tcaggcgcct cacacaacat actagtagag gttcaagatg atggaaccat 4380gaa-gataaaa gatgaagaga gagatgacac gctcaccatt ctccttaaag caactctgct 4440ggcagtctca ggggtgtacc caatgtcaat accagcgacc ctttttgtgt ggtatttttg 4500gcàgaaaaag aaacagagat caggagtgct atgggacaca cccagccccc cagaagtgga 4560aagagcagtt cttgatgatg gcatctatag aattttgcaa agaggactgt tgggcaggtc 4620ccaagtagga gtaggagttt tccaagaagg cgtgttccac acaatgtggc acgtcactag 4680gggagctgtc ctcatgtatc aaggaaaaag gctggaacca agctgggcca gtgtcaaaaa 4740agacttgatc tcatatggag gaggttggag gtttcaagga tcctggaaca cgggagaaga 4800agtacaggtg attgctgttg aaccgggaaa aaaccccaaa aatgtacaaa caacgccggg 4860taccttcaag acccctgaag gcgaagttgg agccatagcc ttagacttta aacctggcac 4920atctggatct cccatcgtaa acagagaggg aaaaatagta ggtctttatg gaaatggagt 4980ggtgacaaca agcggaactt acgttagtgc catagctcaa gctaaggcat cacaagaagg 5040gcctctacca gagattgagg acgaggtgtt taggaaaaga aacttaacaa taatggacct 5100acatccagga tcgggaaaaa caagaagata ccttccagcc atagtccgtg aggccataaa 5160aaggaagctg cgcacgctaa tcctagctcc cacaagagtt gtcgcttctg aaatggcaga 5220ggcactcaag ggagtgccaa taaggtatca gacaacagca gtgaagagtg aacacacagg 5280aaaggagata gttgacctta tgtgccacgc cactttcacc atgcgcctcc tgtctcccgt 5340gagagttccc aiattataaca tgattatcat ggatgaagca cacttcaccg atccagccag 5400catagcagcc agagggtaca tctcaacccg agtgggtatg ggtgaagcag ctgcgatctt 5460tatgacagcc actcccccag gatcggtgga ggcctttcca cagagcaatg caattatcca 5520agatgaggaa agagacattc ctgagagatc atggaactca ggctatgact ggatcactga 5580ttttccaggt aaaacagtct ggtttgttcc aagcatcaaa tcaggaaatg acattgccaa 5640ctgtttaaga aaaaacggga aacgggtgat ccaattgagc agaaaaacct ttgacactga 5700gtaccagaaa acaaaaaaca acgactggga ctatgtcgtc acaacagaca tttccgaaat 5760gggagcaaat ttccgggccg acagggtaat agacccaagg cggtgtctga aaccggtaat 5820actaaaagat ggtccagagc gcgtcattct agccggaccg atgccagtga ctgtggccag 5880tgccgcccag aggagaggaa gaattggaag gaáccaaaac aaggaaggtg atcagtatat 5940ttacatggga cagcctttaa acaatgatga ggaccacgct cattggacag aagcaaagat 6000gctccttgac aatataaaca caccagaagg gattatccca gccctctatg agccggagag 6060agaaaagagt gcagctatag acggggaata cagactgcgg ggtgaagcaa ggaaaacgtt 6120cgtggagctc atgagaagag gggatctacc agtctggcta tcctacaaag ttgcctcaga 6180aggcttccag tactccgaca gaaggtggtg cttcgatggg gaaaggaaca accaggtgtt 6240ggaggagaac atggacgtgg agatctggac aaaagaagga gaaagaaaga aactacgacc 6300tcgctggttg gacgccagaa catactctga cccactggct ctgcgcgagt ttaaagagtt 6360tgcagcagga agaagaagcg tctcaggtga cctaatatta gaaataggga aacttccaca 6420aca£ttgacg caaagggccc agaatgcttt ggacaacttg gtcatgttgc acaattccga 6480acaaggagga aaagcctata gacatgctat ggaagaactg ccagacacaa tagaaacgtt 6540gatgctccta gccttgatag ctgtgttgac tggtggagtg acgctgttct tcctatcagg 6600aagaggtcta ggaaaaacat ctatcggctt actctgcgtg atggcctcaa gcgcactgtt 6660atggatggcc agtgtggagc cccattggat agcggcctcc atcatactgg agttctttct 6720gatggtactg cttattccag agccagacag acagcgcact ccacaggaca accagctagc 6780atatgtggtg ataggtctgt tattcatgat attgacagtg gcagccaatg 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attccaggca cagaacgcca gaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttct 10735

<210> 3<211> 10735<212> DNA

<213> vírus da Dengue<220>

<221> misc_feature<222> Cl)■·(10735)<223> LAV-I

Vírus da Dengue de tipo 1 de caráter (PDK-13) precursor depoliprotileno, completo cds

<400> 3 agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag 60ttctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgatc aaccaacgaa aaaagacggg 120tcgaccgtct ttcaatatgc tgaaacgcgc gagaaaccgc gtgtcaactg tttcacagtt 180ggcgaagaga ttctcaaaag gattgctctc aggccaagga cccatgaaat tggtgatggc 240tttcatagca ttcttaagat ttctagccat acccccaaca gcaggaattt tggctagatg 300gggctcattc aagaagaatg gagcgattaa agtgttacgg ggtttcaaga gagaaatctc 360aaacatgcta aacataatga acaggaggaa aagatccgtg accatgctcc ttatgctgct 420gcccacagcc ctggcgttcc atctgacgac acgaggggga gagccgcata tgatagttag 480caagcaggaa agaggaaagt cacttttgtt caagacctct gcaggtgtca acatgtgcac 540cctcattgcg atggatttgg gagagttgtg tgaggacacg atgacctaca aatgcccccg 600gatcactgag gcggaaccag atgacgttga ctgttggtgc aatgccacgg acacatgggt 660gacctatgga acgtgctctc aaactggcga acaccgacga gacaaacgtt ccgtcgcatt 720ggccccacac gtggggcttg gcctagaaac aagagccgaa acgtggatgt cctctgaagg 780tgcttggaaa cagatacaaa aagtagagac ttgggctctg agacatccag gattcacggt 840gatagccctt tttctagcac 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gcgctgactg gagcgacaga 1740aatccaaacg tcaggaacga caacaatttt cgcaggacac ctaaaatgca gactaaaaat 1800ggacaaacta actttaaaag ggatgtcata tgtgatgtgc acaggctcat tcaagttaga 1860gaaagaagtg gctgagaccc agcatggaac tgttctggtg caggttaaat atgaaggaac 1920agacgcacca tgcaagattc ccttttcgac ccaagatgag aaaggagcaa cccagaatgg 1980gagattaata acagccaacc ccatagtcac tgacaaagaa aaaccagtca atattgaggc 2040agaaccaccc tttggtgaga gctacatcgt ggtaggagca ggtgaaaaag ctttgaaact 2100aagctggttc aagaaaggaa gcagcatagg gaaaatgttt gaagcaactg cccgaggagc 2160acgaaggatg gccattctgg gagacaccgc atgggacttc ggttctatag gaggagtgtt 2220cacgtctatg ggaaaactgg tacaccaggt ttttggaact gcatatggag ttttgtttag 2280cggagtttct tggaccatga aaataggaat agggattctg ctgacatggc taggattaaa 2340ttcaaggaac acgtcccttt cggtgatgtg catcgcagtt ggcatggtca cactgtacct 2400aggagtcatg gttcaggcag attcgggatg tgtaatcaac tggaaaggca gagaacttaa 2460atgtggaagc ggcatttttg tcactaatga agttcacact tggacagagc aatacaaatt 2520ccaggctgac tcccccaaga gactatcagc agccattggg aaggcatggg 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gatgggtttc 6840ctagaaaaaa cgaagaaaga tctcggattg ggaagcattg caacccagca acccgagagc 6900aacatcctgg acatagatct acgtcctgca tcagcatgga cgctgtatgc cgtggccaca 6960acatttgtta caccaatgtt gagacatagc attgaaaatt cctcagtgaa tgtgtcccta 7020acagctatag ccaaccaagc cacagtgtta atgggtctcg ggaaaggatg gccattgtca 7080aagatggaca tcggagttcc ccttctcgcc attggatgct actcacaagt caaccccata 7140actctcacag cagctctttt cttattggta gcacattatg ccatcatagg gccaggactc 7200caagcaaaag caaccagaga agctcagaaa agagcagcgg cgggcatcat gaaaaaccca 7260actgtcgatg gaataacagt gattgaccta gatccaatac cttatgatcc aaagtttgaa 7320aagcagttgg gacaagtaat gctcctagtc ctctgcgtga ctcaagtatt gatgatgagg 7380actacatggg ctctgtgtga ggctttaacc ttagctaccg ggcccatctc cacattgtgg 7440gaaggaaatc cagggaggtt ttggaacact accattgcgg tgtcaatggc taacattttt 7500agagggagtt acttggccgg agctggactt ctcttttcta ttatgaagaa cacaaccaac 7560acaagaaggg gaactggcaa cataggagag acgcttggag agaaatggaa aagccgattg 7620aacgcattgg gaaaaagtga attccagatc tacaagaaaa gtggaatcca ggaagtggat 7680agaaccttag caaaagaagg cattaaaaga ggagaaacgg accatcacgc tgtgtcgcga 7740ggctcagcaa aactgagatg gttcgttgag agaaacatgg tcacaccaga agggaaagta 7800gtggacctcg gttgtggcag aggaggctgg tcatactatt gtggaggact aaagaatgta 7860agagáagtca aaggcctaac aaaaggagga ccaggacacg aagaacccat ccccatgtca 7920acatatgggt ggaatctagt gcgtcttcaa agtggagttg acgttttctt catcccgcca 7980gãaaagtgtg acacattatt gtgtgacata ggggagtcat caccaaatcc cacagtggaa 8040gcaggacgaa cactcagagt ccttaactta gtagaaaatt ggttgaacaa caacactcaa 8100ttttgcataa aggttctcaa cccatatatg ccctcagtca tagaaaaaat ggaagcacta 8160caaaggaaat atggaggagc cttagtgagg aatccactct cacgaaactc cacacatgag 8220atgtactggg tatccaatgc ttccgggaac atagtgtcat cagtgaacat gatttcaagg 8280atgttgatca acagatttac aatgagatac aagaaagcca cttacgagcc ggatgttgac 8340ctcggaagcg gaacccgtaa catcgggatt gaaagtgaga taccaaacct agatataatt 8400gggaaaagaa tagaaaaaat aaagcaagag catgaaacat catggcacta tgaccaagac 8460cacccataca aaacgtgggc ataccatggt agctatgaaa caaaacagac tggatcagca 8520tcatccatgg tcaacggagt ggtcaggctg ctgacaaaac cttgggacgt tgtccccatg 8580gtgacacaga tggcaatgac agacacgact ccatttggac aacagcgcgt ttttaaagag 8640aaagtggaca cgagaaccca agaaccgaaa gaaggcacga agaaactaat gaaaataaca 8700gcagagtggc tttggaaaga attagggaag aaaaagacac ccaggatgtg caccagagaa 8760gaattcacaa gaaaggtgag aagcaatgca gccttggggg ccatattcac tgatgagaac 8820aagtggaagt cggcacgtga ggctgttgaa gatagtaggt tttgggagct ggttgacaag 8880gaaaggaatc tccatcttga aggaaagtgt gaaacatgtg tgtacaacat gatgggaaaa 8940agagagaaga agctagggga attcggcaag gcaaaaggca gcagagccat atggtacatg 9000tggcttggag cacgcttctt agagtttgaa gccctaggat tcttaaatga agatcactgg 9060ttctccagag agaactccct gagtggagtg gaaggagaag ggctgcacaa gctaggttac 9120attctaagag acgtgagcaa gaaagaggga ggagcaatgt atgccgatga caccgcagga 9180tgggatacaa aaatcacact agaagaccta aaaaatgaag agatggtaac aaaccacatg 9240gaaggagaac acaagaaact agccgaggcc attttcaaac taacgtacca aaacaaggtg 9300gtgcgtgtgc aaagaccaac accaagaggc acagtaatgg acatcatatc gagaagagac 9360caaagaggta gtggacaagt tggcacctat ggactcaata ctttcaccaa tatggaagcc 9420caactaatca gacagatgga gggagaagga gtctttaaaa gcattcagca cctaacaatc 9480acagaagaaa tcgctgtgca aaactggtta gcaagagtgg ggcgcgaaag gttatcaaga 9540atggccatca gtggagatga ttgtgttgtg aaacctttag atgacaggtt cgcaagcgct 9600ttaacagctc taaatgacat gggaaagatt aggaaagaca tacaacaatg ggaaccttca 9660agaggatgga atgattggac acaagtgccc ttctgttcac accatttcca tgagttaatc 9720atgaaagacg gtcgcgtact cgttgttcca tgtagaaacc aagatgaact gattggcaga 9780gcccgaatct cccaaggagc agggtggtct ttgcgggaga cggcctgttt ggggaagtct 9840tacgcccaaa tgtggagctt gatgtacttc cacagacgcg acctcaggct ggcggcaaat 9900gctatttgct cggcagtacc atcacattgg gttccaacaa gtcgaacaac ctggtccata 9960catgctaaac atgaatggat gacaacggaa gacatgctga cagtctggaa cagggtgtgg 10020attcaagaaa acccatggat ggaagacaaa actccagtgg aaacatggga ggaaatccca 10080tacttgggga aaagagaaga ccaatggtgc ggctcattga ttgggttaac aagcagggcc 10140acctgggcaa agaacatcca agcagcaata aatcaagtta gatcccttat aggcaatgaa 10200gaatacacag attacatgcc atccatgaaa agattcagaa gagaagagga agaagcagga 10260gttctgtggt agaaagcaaa actaacatga aacaaggcta gaagtcaggt cggattaagc 10320catagtacgg aaaaaactat gctacctgtg agccccgtcc naggacgtta aaagaagtca 10380ggccatcata aatgccatag cttgagtaaa ctatgcagcc tgtagctcca cctgagaagg 10440tgtaaaaaat ccgggaggcc acaaaccatg gaagctgtac gcatggcgta gtggactagc 10500ggttagggga gacccctccc ttacaaatcg cagcaacaat gggggcccaa ggcgagatga 10560agctgtagtc tcgctggaag gactagaggt tagaggagac ccccccgaaa caaaaaacag 10620catattgacg ctgggaaaga ccagagatcc tgctgtctcc tcagcatcat tccaggcaca 10680gaacgccaga aaatggaatg gtgctgttga atcaacaggt tct 10723

41

3392

PRT

Vírus da Dengue

Cadeia

(1)..(114)

Proteína Cápside

Cadeia

(115)..(280)Premembrana protéico

Cadeia(281)..(775)

Glicoprotéina do envelope

Cadeia(776)..(1127)

Proteína 1 não estruturalCadeia

(1128)..(1345)

Proteína 2A não estruturalCadeia

(1346)..(1475)

Proteína 2B não estrutural

<210><211><212><213>

<220><221><222><223>

<220><221><222><223>

<220><221><222><223>

<220><221><222><223>

<220><221><222><223>

<220><221><222><223><220>

<221> Cadeia

<Τ22> (1476)..(2094)

<223> proteína 3 não estrutural

<220> Cadeia<221>

<222> C2095)..(2244)

Proteína 4A não estrutural

<220> Cadeia<221>

<222> (2245)..(2493)

<223> proteína 4B não estrutural

Cadeia

<220><221>

<222> (2494)..(3392)

<223> Proteína 5 não estrutural

<400> 41

Met Ile Asn Gln Arq Lys Lys Thr Gly Arg Pro Ser Phe Asn Met Leu15 10 15

Lys Arq Ala Arq Asn Arg Val Ser Thr Val Ser Gln Leu Ala Lys Arg20 25 30

Phe Ser Lys Gly Leu Leu Ser Gly Gln Gly Pro Met Lys Leu Val Met35 40 45

Ala Phe Ile Ala Phe Leu Arg Phe Leu Ala Ile Pro Pro Thr Ala Gly50 55 60

Ile Leu Ala Arq Trp Gly Ser Phe Lys Lys Asn Gly Ala Ile Lys Val65 70 75 80

Leu Arg Gly Phe Lys Arg Glu Ile Ser Asn Met Leu Asn Ile Met Asn85 90 95

Arq Arq Lys Arq ser Val Thr Met Leu Leu Met Leu Leu Pro Thr Alay 100 105 HO

Leu Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Gly Gly Glu Pro His Met Ile Val115 120 125

Ser Lys Gln Glu Arg Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Ser Ala Gly130 135 140

Val Asn Met Cys Thr Leu Ile Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu145 150 155 160

Asp Thr Met Thr Tyr Lys Cys Pro Arg Ile Thr Glu Ala Glu Pro Asp165 170 175

Asp vai Asp Cys Trp Cys Asn Ala Thr Asp Thr Trp Val Thr Tyr Gly180 185 190Thr Cys Ser Gln Thr Gly Glu His Arg Arg Asp Lys Arg Ser Val Ala195 200 205

Leu Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Ala Glu Thr Trp210 215 220

Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys Gln Ile Gln Lys Val Glu Thr Trp225 230 235 240

Ala Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Val Ile Ala Leu Phe Leu Ala His245 250 255

Ala Ile Gly Thr Ser Ile Thr Gln Lys Gly Ile Ile Phe Ile Leu Leu260 265 270

Met Leu Val Thr Pro Ser Met Ala Met Arg Cys Val Gly lie Gly Asn275 280 285

Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val290 295 300

Leu Glu His Gly ser Cys vai Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr305 310 315 320

Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu325 330 335

Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser340 345 350

Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala355 360 365

Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe vai Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly370 375 380

Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys385 390 395 400

Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys Ile Ala Gln Tyr Glu Asn Leu Lys405 410 415

Tyr Ser Val Ile Val Thr vai His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly420 425 430

Asn Glu Thr Thr Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala435 440 445

Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu Thr Asp Tyr Gly Thr Leu Thr Leu Asp450 455 460Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr465 470 475 480

Met Lys Lys Lys Ser Trp Leu Val His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu485 490 495

Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn500 505 510

Arq Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln515 520 525

Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu530 535 540

Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala545 550 555 560

Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly565 570 575

Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val580 585 590

Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly595 600 605

Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly610 615 620

Ala Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp625 630 635 640

Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser645 650 655

Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe660 665 670

Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly675 680 685

Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser690 695 700

Ile Gly Gly Val Phe Thr Ser Met Gly Lys Leu Val His Gln Val Phe705 710 715 720

Gly Thr Ala Tyr Gly Val Leu Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys725 730 735Ile Gly Ile Gly Ile Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Asn740 745 750

Thr Ser Leu Ser Val Met Cys Ile Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr75 5 760 765

Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys Val Ile Asn Trp Lys770 775 780

Gly Arg Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe Val Thr Asn Glu Val785 790 795 800

His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Ala Asp Ser Pro Lys Arg805 810 815

Leu Ser Ala Ala Ile Gly Lys Ala Trp Glu Glu Gly Val Cys Gly Ile820 825 830

Arg Ser Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Met Trp Lys Gln Ile Ser Asn835 840 845

Glu Leu Asn His Ile Leu Leu Glu Asn Asp Met Lys Phe Thr Val Val850 855 860

Val Gly Asp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg865 870 875 880

Pro Gln Pro Met Glu His Lys Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys Ala885 890 895

Lys Ile Ile Gly Ala Asp Val Gln Asn Thr Thr Phe Ile Ile Asp Gly900 905 910

Pro Asn Thr Pro Glu Cys Pro Asp Asn Gln Arg Ala Trp Asn Ile Trp915 920 925

Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Ile Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu930 935 940

Lys Leu Arg Asp ser Tyr Thr Gln Val Cys Asp His Arg Leu Met ser945 950 955 960

Ala Ala Ile Lys Asp Ser Lys Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp965 970 975

Ile Glu Ser Glu Lys Asn Glu Thr Trp Lys Leu Ala Arg Ala Ser Phe980 985 990

Ile Glu Val Lys Thr Cys Ile Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser995 1000 1005Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro Lys Ile Tyr Gly1010 1015 1020

Gly Pro Ile Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr Phe Thr Gln1025 1030 1035

Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Leu Asp Phe Asp1040 1045 1050

Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val vai Val Asp Glu His Cys Gly Asn1055 1060 1065

Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Val Thr Gly Lys Ile Ile1070 1075 1080

His Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Phe1085 1090 1095

Lys Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Val1100 1105 1110

Lys Asp Lys Glu Glu Asn Leu Val Lys Ser Met Val Ser Ala Gly1115 1120 1125

ser Gly Glu Val Asp Ser Phe Ser Leu Gly Leu Leu Cys Ile Ser1130 1135 1140

Ile Met Ile Glu Glu Val Met Arg Ser Arg Trp Ser Lys Lys Met1145 1150 1155

Leu Met Thr Gly Thr Leu Ala Val Phe Leu Leu Leu Ile Met Gly1160 1165 1170

Gln Leu Thr Trp Ser Asp Leu Ile Arg Leu Cys Ile Met Val Gly1175 1180 1185

Ala Asn Ala Ser Asp Lys Met Gly Met Gly Thr Thr Tyr Leu Ala1190 1195 1200

Leu Met Ala Thr Phe Lys Met Arg Pro Met Phe Ala Val Gly Leu1205 1210 1215

Leu Phe Arg Arg Leu Thr Ser Arg Glu Val Leu Leu Leu Thr Ile1220 1225 1230

Gly Leu Ser Leu Val Ala Ser Val Glu Leu Pro ser ser Leu Glu1235 1240 1245

Glu Leu Gly Asp Gly Leu Ala Ile Gly Ile Met Met Leu Lys Leu1250 1255 1260Leu Thr Asp Phe Gln Ser His Gln Leu Trp Ala Thr Leu Leu Ser1265 1270 1275

Leu Thr Phe Ile Lys Thr Thr Phe Ser Leu His Tyr Ala Trp Lys1280 1285 1290

Thr Met Ala Met Val Leu Ser Ile Val Ser Leu Phe Pro Leu Cys1295 1300 1305

Leu Ser Thr Thr Ser Gln Lys Thr Thr Trp Leu Pro Val Leu Leu1310 1315 1320

Gly Ser Leu Gly Cys Lys Pro Leu Pro Met Phe Leu Ile Thr Glu1325 1330 1335

Asn Lys Ile Trp Gly Arg Lys Ser Trp Pro Leu Asn Glu Gly Ile1340 1345 1350

Met Ala Val Gly Ile Val Ser Ile Leu Leu ser Ser Leu Leu Lys1355 1360 1365

Asn Asp Val Pro Leu Ala Gly Pro Leu Ile Ala Gly Gly Met Leu1370 1375 1380

Ile Ala Cys Tyr Val Ile Ser Gly Ser Ser Ala Asp Leu Ser Leu1385 1390 1395

Glu Lys Ala Ala Glu Val Ser Trp Glu Glu Glu Ala Glu His Ser1400 1405 1410

Gly Ala Ser His Asn Ile Leu Val Glu Val Gln Asp Asp Gly Thr1415 1420 1425

Met Lys Ile Lys Asp Glu Glu Arg Asp Asp Thr Leu Thr lie Leu1430 1435 1440

Leu Lys Ala Thr Leu Leu Ala Val Ser Gly Val Tyr Pro Met Ser1445 1450 1455

Ile Pro Ala Thr Leu Phe Val Trp Tyr Phe Trp Gln Lys Lys Lys1460 1465 1470

Gln Arg Ser Gly Val Leu Trp Asp Thr Pro Ser Pro Pro Glu Val1475 1480 1485

Glu Arg Ala Val Leu Asp Asp Gly Ile Tyr Arg Ile Leu Gln Arg1490 1495 1500

Gly Leu Leu Gly Arg Ser Gln Val Gly Val Gly Val Phe Gln Glu1505 1510 1515Gly Val Phe His Thr Met Trp His Val Thr Arg Gly Ala Val Leu1520 1525 1530

Met Tyr Gln Gly Lys Arg Leu Glu Pro Ser Trp Ala Ser Val Lys1535 1540 1545

Lys Asp Leu Ile Ser Tyr Gly Gly Gly Trp Arg Phe Gln Gly Ser1550 1555 1560

Trp Asn Thr Gly Glu Glu Val Gln vai Ile Ala Val Glu Pro Gly1565 1570 1575

Lys Asn Pro Lys Asn Val Gln Thr Thr Pro Gly Thr Phe Lys Thr1580 1585 1590

Pro Glu Gly Glu vai Gly Ala Ile Ala Leu Asp Phe Lys Pro Gly1595 1600 1605

Thr Ser Gly Ser Pro Ile vai Asn Arg Glu Gly Lys Ile Val Gly1610 1615 1620

Leu Tyr Gly Asn Gly Val Val Thr Thr ser Gly Thr Tyr Val Ser1625 1630 1635

Ala Ile Ala Gln Ala Lys Ala ser Gln Glu Gly Pro Leu Pro Glu1640 1645 1650

Ile Glu Asp Lys Val Phe Arg Lys Arg Asn Leu Thr Ile Met Asp1655 1660 1665

Leu His Pro Gly ser Gly Lys Thr Arg Arg Tyr Leu Pro Ala Ile1670 1675 1680

vai Arg Glu Ala Ile Lys Arg Lys Leu Arg Thr Leu Ile Leu Ala1685 1690 1695

Pro Thr Arg Val Val Ala ser Glu Met Ala Glu Ala Leu Lys Gly1700 1705 1710

Val Pro Ile Arg Tyr Gln Thr Thr Ala Val Lys ser Glu His Thr1715 1720 1725

Gly Lys Glu Ile Val Asp Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Met1730 1735 1740

Arg Leu Leu Ser Pro Val Arg vai Pro Asn Tyr Asn Met Ile Ile1745 1750 1755

Met Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ala ser Ile Ala Ala Arg1760 1765 1770Gly Tyr Ile Ser Thr Arg Val Gly Met Gly Glu Ala Ala Ala Ile1775 1780 1785

Phe Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Glu Ala Phe Pro Gln1790 1795 1800

Ser Asn Ala Ile Ile Gln Asp Glu Glu Arg Asp Ile Pro Glu Arg

1805 1810 1815

Ser Trp Asn Ser Gly Tyr Asp Trp Ile Thr Asp Phe Pro Gly Lys

1820 1825 1830

Thr Val Trp Phe Val Pro Ser Ile Lys Ser Gly Asn Asp Ile Ala

1835 1840 1845

Asn Cys Leu Arg Lys Asn Gly Lys Arg Val Ile Gln Leu Ser Arg

1850 1855 1860

Lys Thr Phe Asp Thr Glu Tyr Gln Lys Thr Lys Asn Asn Asp Trp

1865 1870 1875

Asp Tyr Val Val Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe

1880 1885 1890

Arg Ala Asp Arg Val Ile Asp Pro Arg Arg Cys Leu Lys Pro Val

1895 1900 1905

Ile Leu Lys Asp Gly Pro Glu Arg Val Ile Leu Ala Gly Pro Met

1910 1915 1920

Pro Val Thr Val Ala Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly

1925 1930 1935

Arg Asn Gln Asn Lys Glu Gly Asp Gln Tyr Ile Tyr Met Gly Gln

1940 1945 1950

Pro Leu Lys Asn Asp Glu Asp His Ala His Trp Thr Glu Ala Lys

1955 1960 1965

Met Leu Leu Asp Asn Ile Asn Thr Pro Glu Gly Ile Ile Pro Ala

1970 1975 1980

Leu Phe Glu Pro Glu Arg Glu Lys Ser Ala Ala Ile Asp Gly Glu

1985 1990 1995

Tyr Arg Leu Arg Gly Glu Ala Arg Lys Thr Phe Val Glu Leu Met

2000 2005 2010

Arg Arg Gly Asp Leu Pro Val Trp Leu Ser Tyr Lys Val Ala Ser

2015 2020 2025Glu Gly Phe Gln Tyr Ser Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Glu2030 2035 2040

Acg Asn Asn Gln Val Leu Glu Glu Asn Met Asp vai Glu Ile Trp2045 2050 2055

Thr Lys Glu Gly Glu Arg Lys Lys Leu Arg Pro Arg Trp Leu Asp2060 2065 2070

Ala Arg Thr Tyr Ser Asp Pro Leu Ala Leu Arg Glu Phe Lys Glu2075 2080 2085

Phe Ala Ala Gly Arg Arg Ser Val Ser Gly Asp Leu Ile Leu Glu2090 2095 2100

Ile Gly Lys Leu Pro Gln His Leu Thr Gln Arg Ala Gln Asn Ala2105 2110 2115

Leu Asp Asn Leu Val Met Leu His Asn Ser Glu Gln Gly Gly Lys2120 2125 2130

Ala Tyr Arg His Ala Met Glu Glu Leu Pro Asp Thr Ile Glu Thr2135 2140 2145

Leu Met Leu Leu Ala Leu Ile Ala Val Leu Thr Gly Gly Val Thr2150 2155 2160

Leu Phe Phe Leu Ser Gly Arg Gly Leu Gly Lys Thr Ser Ile Gly2165 2170 2175

Leu Leu Cys Val Met Ala Ser Ser Ala Leu Leu Trp Met Ala Ser2180 2185 2190

vai Glu Pro His Trp Ile Ala Ala Ser Ile Ile Leu Glu Phe Phe2195 2200 2205

Leu Met Val Leu Leu Ile Pro Glu Pro Asp Arg Gln Arg Thr Pro2210 2215 2220

Gln Asp Asn Gln Leu Ala Tyr vai vai Ile Gly Leu Leu Phe Val2225 2230 2235

Ile Leu Thr Val Ala Ala Asn Glu Met Gly Leu Leu Glu Thr Thr2240 2245 2250

Lvs Lys Asp Leu Gly Ile Gly His Val Ala Ala Glu Asn His His2255 2260 2265

His Ala Thr Met Leu Asp Val Asp Leu His Pro Ala Ser Ala Trp2270 2275 2280Thr Leu Tyr Ala Val Ala Thr Thr Ile Ile Thr Pro Met Met Arg2285 2290 2295

His Thr Ile Glu Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser Leu Thr Ala Ile2300 2305 2310

Ala Asn Gln Ala Ala Ile Leu Met Gly Leu Asp Lys Gly Trp Pro2315 2320 2325

Ile Ser Lys Met Asp Ile Gly Val Pro Leu Leu Ala Leu Gly Cys2330 2335 2340

Tyr Ser Gln vai Asn Pro Leu Thr Leu Ile Ala Ala Val Leu Met2345 2350 2355

Leu Val Ala His Tyr Ala Ile Ile Gly Pro Gly Leu Gln Ala Lys2360 2365 2370

Ala Thr Arg Glu Ala Gln Lys Arg Thr Ala Ala Gly Ile Met Lys2375 2380 2385

Asn Pro Thr vai Asp Gly Ile Val Ala Ile Asp Leu Asp Pro Val2390 2395 2400

Val Tyr Asp Ala Lys Phe Glu Lys Gln Leu Gly Gln Ile Met Leu2405 2410 2415

Leu Ile Leu Cys Thr Ser Gln Ile Leu Leu Met Arg Thr Thr Trp2420 2425 2430

Ala Leu Cys Glu Ser Ile Thr Leu Ala Thr Gly Pro Leu Thr Thr2435 2440 2445

Leu Trp Glu Gly ser Pro Gly Lys Phe Trp Asn Thr Thr Ile Ala2450 2455 2460

Val Ser Met Ala Asn Ile Phe Arg Gly ser Tyr Leu Ala Gly Ala2465 2470 2475

Gly Leu Ala Phe Ser Leu Met Lys Ser Leu Gly Gly Gly Arg Arg2480 2485 2490

Gly Thr Gly Ala Gln Gly Glu Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys Arg2495 2500 2505

Gln Leu Asn Gln Leu Ser Lys Ser Glu Phe Asn Thr Tyr Lys Arg2510 2515 2520

Ser Gly Ile Met Glu Val Asp Arg Ser Glu Ala Lys Glu Gly Leu2525 2530 2535Lys Arq Gly Glu Thr Thr Lys His Ala Val Ser Arg Gly Thr Ala

2540 2545 2550

Lys Leu Arq Trp Phe Val Glu Arg Asn Leu Val Lys Pro Glu Gly

2555 2560 2565

Lys vai Ile Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr2570 2575 2580

Cys Ala Gly Leu Lys Lys vai Thr Glu Val Lys Gly Tyr Thr Lys2585 2590 2595

Gly Gly Pro Gly His Glu Glu Pro Ile Pro Met Ala Thr Tyr Gly2600 2605 2610

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Pro Pro Glu Lys Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser2630 2635 2640

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Ala Ser Ser Met Val Asn Gly Val Val Arg Leu Leu Thr Lys Pro2810 2815 2820

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2825 28B0 2835

Thr Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr

2840 2845 2850

Arg Thr Pro Lys Ala Lys Arg Gly Thr Ala Gln Ile Met Glu Val

2855 2860 2865

Thr Ala Arg Trp Leu Trp Gly Phe Leu Ser Arg Asn Lys Lys Pro

2870 2875 2880

Arg Ile Cys Thr Arg Glu Glu Phe Thr Arg Lys Val Arg Ser Asn

2885 2890 2895

Ala Ala Ile Gly Ala Val Phe Val Asp Glu Asn Gln Trp Asn Ser

2900 2905 2910

Ala Lys Glu Ala Val Glu Asp Glu Arg Phe Trp Glu Leu Val His

2915 2920 2925

Arg Glu Arg Glu Leu His Lys Gln Gly Lys Cys Ala Thr Cys Val

2930 2935 2940

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2945 2950 2955

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2960 2965 2970

Arg Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Met Asn Glu Asp His

2975 2980 2985

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2990 2995 3000

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3005 3010 3015

Gly Gly Asn Met Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg

3020 3025 3030

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3035 3040 3045Met Glu Pro Glu His Ala Leu Leu Ala Thr Ser Ile Phe Lys Leu3050 3055 3060

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Gly Thr Val Met Asp Val Ile Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly Ser3080 3085 3090

Gly Gln Val Gly Thr Tyr Gly Leu Asn Thr Phe Thr Asn Met Glu3095 3100 3105

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Leu Glu Lys Tyr Gly Val Glu Arg Leu Lys Arg Met Ala Ile Ser3140 3145 3150

Gly Asp Asp Cys Val Val Lys Pro Ile Asp Asp Arg Phe Ala Thr3155 3160 3165

Ala Leu Thr Ala Leu Asn Asp Met Gly Lys Val Arg Lys Asp Ile3170 3175 3180

Pro Gln Trp Glu Pro Ser Lys Gly Trp Asn Asp Trp Gln Gln Val3185 3190 3195

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<223> LAV3<400> 43

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Claims (14)

1. GEPA DO VÍRUS DA DENGUE-1 VIVO ATENUADO,caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência SEQ ID N0 3, em quepelo menos os nucleotídeos nas posições 5962 e 7947 estão mutados, com acondição de que os seguintes nucleotídeos não estão mutados: 1323, 1541, - 1543, 1545, 1567, 1608, 2363, 2695, 2782, 5063, 6048, 6806, 7330, e 9445.

2. CEPA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que o nucleotídeo na posição 2719 também está mutado.

3. CEPA, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2,caracterizada pelo fato de que a SEQ ID N0 3 compreende as mutações 2719G>A, 5962 C>A, e 7947 A>G.

4. CEPA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3,caracterizada pelo fato de que inclui também uma substituição de um ou maisnucleotídeos em uma determinada posição do códon que não resulta emalteração no aminoácido codificado naquela posição.

5. CEPA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4,caracterizada pelo fato de que compreende a SEQ ID N0 1.

6. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada pelo fato deque compreende uma cepa do vírus da dengue-1 vivo atenuado, conformedefinido em uma das reivindicações de 1 a 5, em um veículofarmaceuticamente aceitável.

7. COMPOSIÇÃO DE VACINA, caracterizada pelo fato de quecompreende uma cepa do vírus da dengue-1 vivo atenuado, conforme definidoem uma das reivindicações de 1 a 5, em um veículo farmaceuticamenteaceitável.

8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que é uma composição de vacina monovalente.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que é uma composição de vacina para denguemultivalente.

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que compreende um vírus da dengue-2 vivoatenuado que compreende a seqüência SEQ ID N0 40.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que contém de 103 a 106 CCID50 de cepa dovírus da dengue-1 vivo atenuado conforme definido em uma das reivindicaçõesde 1 a 4.

12. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, caracterizado pelo fato deque compreende a seqüência de DNA SEQ ID N0 1 ou sua seqüência de RNAequivalente.

13. POLIPROTEÍNA ISOLADA, caracterizada pelo fato de queé codificada pela SEQ ID N0 1 ou fragmentos desta, que compreende pelomenos uma Iisina na posição 481 da proteína NS3, e/ou de uma arginina naposição 125 da proteína NS5.

14. FRAGMENTO DE POLIPROTEÍNA, conforme definida nareivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende as proteínas NS3e/ou NS5.